ES2588730T3

ES2588730T3 - Preparados celulares agotados en lo que respecta a TCRalfa/beta

Info

Publication number: ES2588730T3
Application number: ES12712611.8T
Authority: ES
Inventors: Rupert Handgretinger; Volker Huppert
Original assignee: Miltenyi Biotec GmbH
Current assignee: Miltenyi Biotec GmbH
Priority date: 2011-03-17
Filing date: 2012-03-19
Publication date: 2016-11-04
Anticipated expiration: 2032-03-19
Also published as: KR101551555B1; US20140308250A1; EP2686417A1; WO2012123590A1; KR20130140139A; JP5955871B2; JP2014512345A; EP2686417B1

Abstract

Una composición farmacéutica, que tiene una población de células obtenible a partir de médula ósea o de sangre, estando la población de células agotada de células positivas para TCR alfa/beta y de células positivas para CD19, y teniendo ella células positivas para TCR gamma/delta.

Description

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Mediante la considerable reducción de las mencionadas complicaciones principales es posible reducir fuertemente

o prescindir casi completamente de los medicamentos, que se emplean usualmente para el tratamiento de estas complicaciones, y que provocan en parte unos considerables efectos secundarios (y causan unos altos costes). Mediante la renuncia de los agentes supresores de inmunidad medicamentosos para la profilaxia de una GvHD se

5 pueden evitar efectos secundarios tales como p.ej. infecciones (sepsis, candidosis, Herpes simplex, etc.), que resultan de la represión medicamentosa del sistema inmunitario.

Como consecuencia de ello, por un lado se puede mejorar considerablemente la calidad de vida del paciente, así como el éxito de la terapia, y simultáneamente se pueden reducir los costos para el tratamiento. A los medicamentos más arriba mencionados pertenecen unos medicamentos para la profilaxia de una GvHD tales como p.ej. el micofenolato mofetilo, que se emplea como profilaxia de una GvHD.

Junto a la reducción de infecciones y de la GvHD, la población agotada de células hace posible la utilización de un regimen de acondicionamiento reducido (RIC). En el caso de un trasplante alógeno, los regímenes de

15 acondicionamiento reducidos pueden disminuir la incidencia de una mortalidad asociada a la terapia y se pueden emplear cuando pueda ser aprovechado el efecto inmunológico del injerto contra el tejido maligno. Este efecto del injerto contra un tumor es mediado en particular por células T y NK del donante, y por ello no es empleable en el caso de unos preparados de células madre que están enriquecidos en lo que respecta a CD34.

En este sentido se presenta una considerable utilidad adicional en comparación con la(s) terapia(s) comparativa(s) conveniente(s), puesto que se alcanza un gran mejoramiento, persistente y no alcanzado hasta ahora en lo que respecta a la terapia comparativa conveniente, de la utilidad relevante para la terapia, en particular una curación de la enfermedad, una considerable prolongación del tiempo de supervivencia, una ausencia a largo plazo de síntomas graves y la amplia evitación de efectos secundarios graves.

25 El aprovechamiento de la estrategia de agotamiento en lo que respecta al TCR alfa/beta da como resultado una más temprana reconstitución de la inmunidad, con unos valores de más que 100 células CD4 /µl en el transcurso de 6 semanas después del trasplante, en comparación con 10 meses, tal como se ha informado por Aversa y colaboradores (Treatment of high-risk acute leukemia with T-cell-depleted stem cells from related donors with one fully mismatched HLA haplotype. [Tratamiento de una leucemia aguda de alto riesgo con células madre agotadas en lo que respecta a células T procedentes de donantes emparentados con un haplotipo HLA plenamente no coincidente] N Engl J Med. 1998 Oct 22;339(17):1186-93.)

Resultados técnicos

35 Los cursos de empobrecimiento llevados a cabo (Depletion runs o respectivamente depletion) con CliniMACS TCRαβ-Biotin (de Miltenyi Biotec GmbH) confirman que es muy robusta la eficiencia del empobrecimiento con un empobrecimiento logarítmico promedio de 4,6 (Figura 1).

La CD19 es una molécula superficial sobre células T. El concepto de células positivas para CD19 significa, que una molécula que fija al CD19, p.ej. un anticuerpo, al que la molécula de CD19 se puede fijar específicamente sobre la superficie de las células T.

El TCR alfa/beta es una molécula superficial sobre células T. El concepto de “células positivas para TCR

45 alfa/beta” significa que una molécula que fija al TCR alfa/beta, p.ej. un anticuerpo, al que la molécula de TCR alfa/beta se puede fijar específicamente sobre la superficie de las células T.

"Anticuerpo" significa un anticuerpo monoclonal, policlonal (Harlow y Lane, "Antibodies, A Laboratory Manual" [Anticuerpos, un masnual de laboratorio], CSH Press, Cold Spring Harbor, USA) que se fija a una molécula, o un derivado de este anticuerpo, que conserva la capacidad de fijación o que la conserva en lo esencial. Unos derivados preferidos de este anticuerpo son unos anticuerpos quiméricos que comprenden, por ejemplo, unos anticuerpos quiméricos en una región variable del ratón o de la rata y una región constante humana. El concepto de "anticuerpo" comprende asimismo un anticuerpo bifuncional o biespecífico y unas construcciones artificiales de anticuerpos tales como Fvs (scFv) procedentes de cadenas individuales o de proteínas de fusión con anticuerpos.

55 El concepto "scFv" (acrónimo del inglés single chain Fv Fragment = fragmento Fv de cadena individual) es conocido por un experto en la especialidad y preferido puesto que el fragmento puede ser producido recombinantemente.

El anticuerpo puede ser humano o humanizado. El concepto de "anticuerpo humanizado" significa que por lo menos un sitio de fijación al anticuerpo (complementary determining region (CDR), región determinante de complementariedad) tal como p.ej. la CDR3 y de manera preferida todas los 6 CDRs fueron intercambiadas por unas CDRs de un anticuerpo humano con la especificidad deseada. Opcionalmente, la(s) región/regiones no humana(s) constante(s) del anticuerpo se reemplazaron por a) una(s) región/regiones constante(s) de un anticuerpo humano. Unos métodos para la producción de anticuerpos humanizados se han descrito p.ej. en el

65 documento de solicitud de patente europea EP 0239400 A1 y en el documento de solicitud de patente internacional WO 90/07861 A1. 8

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Agotamiento de las células madre TCRα/β+

El agotamiento de TCRα/β+ se ha descrito p.ej. en Chaleff y colaboradores, Cytotherapy, 2007, 9, 746-754 o como en el correspondiente protocolo de la entidad Miltenyi Biotec GmbH. 5

Agotamiento combinado de células TCRα/β+/ CD19+

El producto de la leucoaféresis se diluye con el tampón CliniMACS® PBS/EDTA (con HSA hasta una concentración final de 0,5 % (p/v) antes de una marcación magnética. El producto de la leucoaféresis se diluye hasta un volumen 3 veces mayor que el del producto de la leucoaféresis sin sobrepasar un volumen máximo de 600 ml.

Las células son centrifugadas a 200xg durante 15 min. a la temperatura ambiente (desde +19 °C hasta +25 °C). El material sobrenadante se desecha. El peso óptimo para la marcación es de 88 g (± 5 g). El sedimento se resuspende y se determina el peso. Las células se marcan con CliniMACS® TCRα/β-biotina y con el reactivo

15 CliniMACS® CD19, con un recipiente (con una capacidad de 7,5 ml) CliniMACS® TCRα/β-biotina y con un recipiente (con una capacidad de 7,5 ml) CliniMACS® CD19. Los recipientes se almacenan a +2 °C hasta +8 °C y se utilizan en frío. Las células y los reactivos se mezclan, el período de tiempo de incubación es de 30 min a 25 rpm y a la temperatura ambiente (desde +19 °C hasta +25 °C).

El producto de la leucoaféresis y el tampón se mezclan y se sacuden ligeramente, seguido por una centrifugación a 300xg durante 15 min., sin freno, a la temperatura ambiente (desde +19 °C hasta +25 °C). El material sobrenadante se desecha. El sedimento se resuspende y se lava. Se añade un tampón hasta que se haya alcanzado un peso de aproximadamente 190 g para la marcación magnética con las células marcadas con TCRα/β-biotina con el reactivo CliniMACS® anti-biotina. Los reactivos CliniMACS® anti-biotina (7,5 ml) enfriados a

25 +2 °C hasta +8 °C se añaden a las células, se incuban durante 30 min. con un ligero sacudimiento de las células a 25 rpm y a la temperatura ambiente (desde +19 °C hasta +25 °C).

El producto de la leucoaféresis y 500 ml de tampón se sacuden ligeramente y se mezclan, luego se centrifugan a 300xg durante 15 min., sin freno, a la temperatura ambiente (desde +19 °C hasta +25 °C). El material sobrenadante se desecha, el sedimento se resuspende hasta que se hayan alcanzado los 150 g. Se recomienda mantener una concentración máxima de 0,4x109 células por ml.

El programa DEPLETION 3.1 se inicia en el instrumento CliniMACS® plus y se siguen las instrucciones tal como se indican por parte del fabricante Miltenyi Biotec GmbH. Después de que se haya finalizado la separación

35 automática, se determina la concentración de las células. Después de la separación automática, las células se han agotado en lo que respecta a TCR alfa/beta y CD19 en aproximadamente 3 hasta 5 escalones logarítmicos. El preparado celular agotado en lo que respecta a TCR alfa/beta y CD19, que se ha obtenido de esta manera, se puede utilizar para el trasplante, después de que hubiera sido recogido en una solución apropiada para el trasplante. Tales soluciones son conocidas por un experto en la especialidad.

Figuras

Figura 1: Reconstitución de la inmunidad después de un trasplante de células madre hasta alcanzar > 200 células/µl.

45 Se representa la reconstitución de la inmunidad hasta alcanzar > 200 células/µl después del trasplante de unas células madre de sangre periférica agotadas en lo que respecta a TCRαβ/CD19 (N = 11) en comparación con unas células madre de sangre periférica enriquecidas en lo que respecta a CD34 (testigo histórico, N = 13). Los datos acerca de la reconstitución de la inmunidad después del trasplante de células madre con unas células madre enriquecidas en lo que respecta a CD34 se dedujeron de la siguiente publicación: Br J Haematol. 2001;

114: 422-32.

Figura 2: GvHD después del trasplante de células madre

55 Incidencia de la GvHD aguda en el caso de pacientes con unos injertos haploidénticos agotados en lo que respecta a TCR αβ/CD19. Grupos comparativos (testigos históricos): pacientes con unos injertos haploidénticos enriquecidos con CD34 y pacientes con una médula ósea no manipulada de donantes ajenos idénticos y con metotrexato/CsA para la profilaxia de la GvHD. Los datos de los grupos comparativos se dedujeron de la referencia de Lang y colaboradores 2007, Zeitschrift für Regenerative Medizin, Nr.1: 32-39. "Grados" = estadio

Figura 3 (A y B): Análisis de la diversidad del repertorio β del receptor de células T para la confirmación de la reconstitución de células T dependiente del timo

Se muestra a modo de ejemplo el resultado del análisis de la diversidad del repertorio de TCRβ mediante la

65 técnica CDR3 Spectratyping para la medición de la reconstitución de células T dependiente del timo en el caso de un paciente en el día 12 (Figura 3A) y en el día 33 (Figura 3B). La región CDR3 del receptor de células T es la

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Claims

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