ES2574055T3 - Métodos y aparatos para la reducción de errores en el ADN basada en un chip - Google Patents

Abstract

Un metodo para producir oligonucleotidos de alta fidelidad en un soporte solido, comprendiendo el metodo: a) exponer una pluralidad de oligonucleotidos monocatenarios unidos al soporte que comprenden una secuencia predefinida a una enzima polimerasa en condiciones adecuadas para una reaccion de sintesis dependiente de molde, con lo que para producir una pluralidad de oligonucleotidos bicatenarios, cada uno de los cuales comprende un oligonucleotido unido a soporte y un oligonucleotido complementario sintetizado; b) desnaturalizar la pluralidad de oligonucleotidos bicatenarios de manera que los oligonucleotidos sintetizados se liberan en una solucion desde los oligonucleotidos unidos al soporte; c) renaturalizar los oligonucleotidos sintetizados a los oligonucleotidos unidos al soporte, con lo que se producen oligonucleotidos bicatenarios renaturalizados; y d) exponer los oligonucleotidos bicatenarios renaturalizados a un componente de reconocimiento y escision de apareamientos erroneos en condiciones adecuadas para la escision de oligonucleotidos bicatenarios renaturalizados que contienen un apareamiento erroneo.

Description

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DESCRIPCION

Metodos y aparatos para la reduccion de errores en el ADN basada en un chip Campo de la invencion

Los metodos y aparatos proporcionados en el presente documento se refieren a la sintesis y ensamblaje de acidos nucleicos de alta fidelidad y a bibliotecas de acidos nucleicos que tienen una secuencia predefinida utilizando reacciones en microvolumen. Mas particularmente, se proporcionan metodos y aparatos para la sintesis de polinucleotidos, la reduccion de errores, el ensamblaje jerarquico y/o la verificacion de la secuencia sobre un soporte solido. En algunas realizaciones se aplican tecnologias de dispensacion de picolitros y subpicolitros y de movimiento de gotas para acceder y manipular los oligonucleotidos en micromatrices de ADN.

Antecedentes

Utilizando las tecnicas de la qmmica de ADN recombinante, ahora es habitual replicar y amplificar las secuencias de ADN de la naturaleza y despues desmontarlas en sus partes componentes. Como partes componentes, a continuacion las secuencias se recombinan o vuelven a montar en nuevas secuencias de ADN. Sin embargo, la dependencia de las secuencias disponibles de forma natural limita significativamente las posibilidades que pueden explorar los investigadores. A pesar de que ahora es posible sintetizar directamente secuencias cortas de ADN a partir de nucleosidos individuales, en general ha sido poco practico construir directamente segmentos grandes o conjuntos de polinucleotidos, es decir, secuencias de polinucleotidos mas largos que aproximadamente 400 pares de bases.

La sintesis de oligonucleotidos se puede realizar a traves de sintesis personalizadas masivamente paralelas en microchips (Zhou et al. (2004) Nucleic Acids Res. 32:5409; Fodor et al. (1991) Science 251:767). Sin embargo, los microchips actuales tienen areas de superficie muy bajas y, por lo tanto, solo se pueden producir pequenas cantidades de oligonucleotidos. Cuando se liberan a la solucion, los oligonucleotidos estan presentes en concentraciones picomolares o mas bajas por secuencia, concentraciones que no son suficientemente altas como para dirigir las reacciones biomoleculares de cebado de manera eficiente. Los metodos actuales para ensamblar un pequeno numero de acidos nucleicos variantes no se pueden ampliar de una manera rentable para generar un numero grande de variantes especificadas. Como tal, sigue existiendo la necesidad de metodos y dispositivos mejorados y para el ensamblaje de genes de alta fidelidad y similares.

Ademas, los oligonucleotidos en microchips se sintetizan generalmente por medio de reacciones quimicas. Las reacciones quimicas falsas causan errores aleatorios en las bases en los oligonucleotidos. Una de las limitaciones importantes en la sintesis quimica de acidos nucleicos es la tasa de errores. La tasa de errores de los oligonucleotidos sintetizados quimicamente (deleciones una velocidad de 1 en 100 bases y apareamientos erroneos e inserciones en aproximadamente 1 de cada 400 bases) supera la tasa de error que se puede obtener a traves de medios enzimaticos de replicacion de un acido nucleico existente (por ejemplo, PCR). Por lo tanto, existe una necesidad urgente de nuevas tecnologias para producir polinucleotidos de alta fidelidad.

Sumario

Los aspectos de la divulgacion se refieren a metodos y aparatos para la preparacion y/o el ensamblaje de polimeros de alta fidelidad. Tambien se proporcionan en el presente documento dispositivos y metodos para el procesamiento de reacciones de ensamblaje de acidos nucleicos y el ensamblaje de acidos nucleicos. Es un objetivo de la presente invencion proporcionar metodos practicos y economicos de sintetizar polinucleotidos personalizados. Es un objetivo adicional proporcionar un metodo de produccion de polinucleotidos sinteticos que tienen tasas de error mas bajas que los polinucleotidos sinteticos producidos mediante metodos conocidos en la tecnica.

De acuerdo con una realizacion, la invencion proporciona un metodo para la produccion de oligonucleotidos de alta fidelidad en un soporte solido, que comprende las etapas de exponer una pluralidad de oligonucleotidos monocatenarios unidos a un soporte que comprenden una secuencia predefinida a una enzima polimerasa en condiciones adecuadas para una reaccion de sintesis dependiente de molde, para producir de este modo una pluralidad de oligonucleotidos bicatenarios, cada uno de los cuales comprende un oligonucleotido unido a un soporte y un oligonucleotido complementario sintetizado; la desnaturalizacion de la pluralidad de oligonucleotidos bicatenarios tal que los oligonucleotidos sintetizados se liberan desde los oligonucleotidos unidos al soporte a una solucion; la rehibridacion de los oligonucleotidos sintetizados a los oligonucleotidos unidos al soporte, con lo que se producen oligonucleotidos bicatenarios rehibridados; y la exposicion de los oligonucleotidos bicatenarios rehibridados a un componente de reconocimiento de apareamientos erroneos y de escision en condiciones adecuadas para la escision de oligonucleotidos bicatenarios rehibridados que contienen un apareamiento erroneo.

En un aspecto, la divulgacion se refiere a un metodo para la produccion de oligonucleotidos de alta fidelidad en un soporte solido. El metodo incluye la sintesis de una primera pluralidad de oligonucleotidos en una reaccion de extension de la cadena usando una segunda pluralidad de oligonucleotidos como moldes. La segunda pluralidad de

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oligonucleotidos se inmoviliza sobre un soporte solido y comprende un oligonucleotido que contiene error que tiene un error de secuencia en una posicion que contiene errores. La reaccion de extension de cadena produce una primera pluralidad de duplex. El metodo tambien incluye la fusion de la primera pluralidad de duplex para liberar la primera pluralidad de oligonucleotidos de la segunda pluralidad de oligonucleotidos, en el que la primera pluralidad de oligonucleotidos comprende oligonucleotidos sin errores que estan libres de error en la posicion que contiene errores del oligonucleotido que contiene errores. El metodo incluye adicionalmente poner en contacto la primera pluralidad de oligonucleotidos con la segunda pluralidad de oligonucleotidos en condiciones de hibridacion para formar una segunda pluralidad de duplex. La segunda pluralidad de duplex comprende un heteroduplex que contiene apareamientos erroneos formado entre el oligonucleotido que contiene errores y uno de los oligonucleotidos sin errores. El metodo tambien incluye la elimination de al menos una parte del heteroduplex que contiene apareamientos erroneos mediante un componente que reconoce apareamientos erroneos y de escision, produciendo de este modo los oligonucleotidos de alta fidelidad. En algunas realizaciones, el metodo incluye ademas despues de la etapa de eliminacion, la desaparicion selectiva de los truncamientos.

En otro aspecto, la invention se refiere a un metodo de ensamblaje de polimeros de acidos nucleicos. El metodo incluye la production de dos o mas conjuntos de oligonucleotidos de alta fidelidad de acuerdo con los metodos descritos en el presente documento. El metodo tambien incluye la fusion de conjuntos deseables de oligonucleotidos de alta fidelidad en una solution, combinando los conjuntos deseables de oligonucleotidos de alta fidelidad en un volumen de reaccion y sometiendo el volumen de reaccion a condiciones adecuadas para una o mas de hibridacion, ligadura y/o extension de la cadena.

En diversas realizaciones, la segunda pluralidad de oligonucleotidos se sintetiza quimicamente sobre el soporte solido y se inmoviliza dentro de una o mas caracteristicas en el soporte solido. La segunda pluralidad de oligonucleotidos puede incluir oligonucleotidos que tienen sustancialmente la misma secuencia. La segunda pluralidad de oligonucleotidos puede depositarse en una caracteristica sobre el soporte solido, o en dos o mas caracteristicas sobre el soporte solido. La segunda pluralidad de oligonucleotidos puede ser de dos o mas secuencias diferentes y cada secuencia se encuentra en una caracteristica diferente en el soporte solido. En algunas realizaciones, el soporte solido es una micromatriz.

En algunas realizaciones, la primera pluralidad de oligonucleotidos se sintetiza enzimaticamente en el soporte solido. Uno o mas de la primera pluralidad de oligonucleotidos pueden difundirse en un fluido cuando se funden y no forman duplex con la segunda pluralidad de oligonucleotidos.

Algunos aspectos de la invencion se refieren a un metodo de produccion de al menos un oligonucleotido que tiene una secuencia predefinida sobre un soporte solido, comprendiendo el metodo (a) sintetizar sobre un soporte solido una primera pluralidad de oligonucleotidos bicatenarios utilizando una segunda pluralidad de oligonucleotidos como moldes; (b) liberar la primera pluralidad de oligonucleotidos de la segunda pluralidad de oligonucleotidos dentro de un microvolumen aislado; (c) poner en contacto la segunda pluralidad de oligonucleotidos con la primera pluralidad de oligonucleotidos en condiciones de hibridacion para formar una segunda pluralidad de oligonucleotidos bicatenarios dentro del volumen aislado; (d) poner en contacto y escindir la segunda pluralidad de oligonucleotidos bicatenarios con un agente de union de apareamiento erroneo, en el que el agente de union al apareamiento erroneo se une de forma selectiva y escinde los oligonucleotidos bicatenarios que comprenden un apareamiento erroneo; y (e) eliminar los oligonucleotidos bicatenarios que comprenden el apareamiento erroneo de modo que se producen oligonucleotidos libres de errores. En algunas realizaciones, la primera pluralidad de oligonucleotidos se libera en condiciones de desnaturalizacion. En algunas realizaciones, el metodo comprende ademas la liberation de oligonucleotidos libres de errores en solucion.

En algunas realizaciones, la segunda pluralidad de oligonucleotidos se une a una caracteristica discreta del soporte solido y la caracteristica se hidrata selectivamente, proporcionando de ese modo la segunda pluralidad de oligonucleotidos dentro del volumen aislado. La caracteristica se puede hidratar selectivamente aplicando una solucion que comprende una polimerasa, dNTP, una solucion de estimulacion de la extension del cebador, al menos un cebador en el que el cebador es complementario a un sitio de union del cebador en la segunda pluralidad de oligonucleotidos.

En ciertas realizaciones, el componente de reconocimiento y escision de apareamientos erroneos comprende una endonucleasa de apareamientos erroneos. En una realization, la endonucleasa de apareamientos erroneos es CEL1. En algunas realizaciones, componente de reconocimiento y escision de apareamientos erroneos realiza la escision quimica. Despues de la escision, ciertas realizaciones tambien pueden incluir la eliminacion del heteroduplex escindido que tiene el apareamiento erroneo mediante intercambio de tampon.

Otras caracteristicas y ventajas de de los dispositivos y metodos proporcionados en el presente documento seran evidentes a partir de la siguiente description detallada y a partir de las reivindicaciones. Las reivindicaciones que figuran a continuation se incorporan en esta section del presente documento por referencia. Las diversas realizaciones descritas en la presente memoria pueden ser complementarias y se pueden combinar o usar juntas de un modo entendido por el experto en la tecnica en vista de las ensenanzas contenidas en el presente documento.

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Breve descripcion de las figuras

La Fig. 1 ilustra un metodo de ejemplo de la produccion de oligonucleotidos de alta fidelidad en una micromatriz de ADN, en el que a la formation de heteroduplex le sigue la escision del apareamiento erroneo.

La Fig. 2 muestra un experimento de escision Surveyor de ejemplo heteroduplex despues del barajado.

La Fig. 3 muestra un grafico de ejemplo que muestra la intensidad en los puntos de la micromatriz (fuerza de la senal) despues del tratamiento Surveyor™.

La Fig. 4 ilustra un metodo de ejemplo para la produccion de oligonucleotidos de alta fidelidad utilizando escision Surveyor: El flujo de reaction molecular, el flujo de proceso, y el flujo de reactivo.

La Fig. 5 muestra metodos de ejemplo para producir microvolumenes depositados adecuados para barajado.

La Fig. 6 ilustra metodos de ejemplo utilizando la difusion local para realizar el barajado sin microvolumenes.

La Fig. 7 muestra metodos de ejemplo que utilizan barajado rapido por evaporation.

Descripcion detallada de la invencion

Los aspectos de la tecnologia proporcionada en el presente documento son utiles para aumentar la exactitud, el rendimiento, el rendimiento y/o la productividad de las reacciones de sintesis y ensamblaje de acidos nucleicos. Tal como se utiliza en el presente documento, los terminos "acido nucleico", "polinucleotido", "oligonucleotido" se usan indistintamente y se refieren a formas polimericas de nucleotidos naturales o sinteticas. Los oligonucleotidos y las moleculas de acido nucleico pueden estar formadas de nucleotidos de origen natural, por ejemplo formando moleculas de acido desoxirribonucleico (ADN) de acido ribonucleico (ARN). Como alternativa, los oligonucleotidos de origen natural pueden incluir modificaciones estructurales que alteren sus propiedades, tales como en acidos nucleicos peptidicos (PNA) o en acidos nucleicos bloqueados (LNA). La sintesis en fase solida de oligonucleotidos y moleculas de acido nucleico con bases de origen natural o artificiales es bien conocida en la tecnica. Debe entenderse que los terminos incluyen equivalentes, analogos de ARN o ADN formados a partir de analogos de nucleotidos y, segun sea aplicable a la realization descrita, polinucleotidos monocatenarios y bicatenarios. Los nucleotidos utiles en la invencion incluyen, por ejemplo, nucleotidos de origen natural (por ejemplo, ribonucleotidos o desoxirribonucleotidos), o modificaciones naturales o sinteticas de nucleotidos, o bases artificiales. Como se usa en el presente documento, el termino monomero se refiere a un miembro de un conjunto de pequenas moleculas que son y pueden unirse a partir de un oligomero, un polimero o un compuesto formado por dos o mas miembros. El orden particular de los monomeros dentro de un polimero se denomina en el presente documento la "secuencia" del polimero. El conjunto de monomeros incluye, pero no se limita al ejemplo, el conjunto de los L-aminoacidos comunes, el conjunto de D-aminoacidos, el conjunto de acidos sinteticos y/o naturales, el conjunto de nucleotidos y el conjunto de pentosas y hexosas. Los aspectos de la invencion se describen en el presente documento principalmente en relation a la preparation de oligonucleotidos, pero facilmente se podrian aplicar a la preparation de otros polimeros tales como peptidos o polipeptidos, polisacaridos, fosfolipidos, heteropolimeros, poliesteres, policarbonatos, poliureas, poliamidas, polietileniminas, sulfuros de poliarileno, polisiloxanos, poliimidas, poliacetatos, o cualquier otros polimero.

Tal como se utiliza en el presente documento, la expresion "secuencia predeterminada" o "predefinida" significa que la secuencia del polimero es conocida y elegida antes de la sintesis o ensamblaje del polimero. En particular, los aspectos de la invencion se describen en el presente documento principalmente en relacion con la preparacion de moleculas de acido nucleico, siendo la secuencia del oligonucleotido o polinucleotido conocida y elegida antes de la sintesis o el ensamblaje de las moleculas de acido nucleico. En algunas realizaciones de la tecnologia proporcionada en el presente documento, los oligonucleotidos o polinucleotidos inmovilizados se utilizan como fuente de material. En diversas realizaciones, los metodos descritos en el presente documento utilizan oligonucleotidos, determinandose sus secuencias basandose en la secuencia de las construcciones polinucleotidicas finales que se van a sintetizar. En una realizacion, los oligonucleotidos son moleculas de acido nucleico cortas. Por ejemplo, los oligonucleotidos pueden tener de 10 a aproximadamente 300 nucleotidos, de 20 a aproximadamente 400 nucleotidos, de 30 a aproximadamente 500 nucleotidos, de 40 a aproximadamente 600 nucleotidos, o mas de aproximadamente 600 nucleotidos de longitud. Sin embargo, se pueden usar oligonucleotidos mas cortos o mas largos. Los oligonucleotidos pueden estar disenados para tener una longitud diferente. En algunas realizaciones, la secuencia de la construction polinucleotidica puede dividirse en una pluralidad de secuencias mas cortas que se pueden sintetizar en paralelo y ensamblar en una sola o una pluralidad de construcciones polinucleotidicas deseadas usando los metodos descritos en el presente documento.

En algunas realizaciones, el procedimiento de ensamblaje puede incluir varias etapas de reaccion en paralelo y/o secuenciales en las que una pluralidad de diferentes acidos nucleicos u oligonucleotidos se sintetizan o inmovilizan, se amplifican y se combinan con el fin de ensamblarse (por ejemplo, mediante extension o ligadura como se describe en el presente documento) para generar un producto de acido nucleico mas largo para utiliza para el ensamblaje posterior, la donation, u otras aplicaciones (vease la solicitud provisional de EE.UU. 61/235.677 y la solicitud de PCT PCT/US09/55267). Las estrategias de amplification y de ensamblaje proporcionadas en el presente documento se pueden utilizar para generar bibliotecas muy grande representativas de muchas secuencias de acido nucleico de interes diferentes.

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En algunas realizaciones, en el presente documento se proporcionan metodos de bibliotecas de ensamblaje que contienen acidos nucleicos que tienen variaciones de secuencias predeterminadas. Las estrategias de ensamblaje proporcionadas en el presente documento se pueden utilizar para generar bibliotecas muy grande representativas de muchas secuencias de acido nucleico de interes diferentes. En algunas realizaciones, las bibliotecas de acido nucleico son bibliotecas de variantes de la secuencia. Las variantes de secuencia pueden ser variantes de una sola secuencia que codifica la proteina de origen natural. Sin embargo, en algunas realizaciones, las variantes de secuencia pueden ser variantes de una pluralidad de diferentes secuencias de codificacion de la proteina.

En consecuencia, un aspecto de la tecnologia proporcionada en el presente documento se refiere al diseno de estrategias de ensamblaje para la preparacion de bibliotecas precisas de acidos nucleicos de alta densidad. Otro aspecto de la tecnologia proporcionada en el presente documento se refiere al ensamblaje de bibliotecas precisas de acidos nucleicos de alta densidad. Los aspectos de la tecnologia proporcionada en el presente documento tambien proporcionan bibliotecas precisas de acidos nucleicos de alta densidad. Una biblioteca de acidos nucleicos de alta densidad puede incluir mas que 100 variantes de secuencia diferentes (por ejemplo, de aproximadamente102 a 103; de aproximadamente 103 a 104; de aproximadamente 104 a 105; de aproximadamente 105 a 106; de aproximadamente 106 a 107; de aproximadamente 107 a 108; de aproximadamente 108 a 109; de aproximadamente 109 a 1010; de aproximadamente 1010 a 1011; de aproximadamente 1011 a 1012; de aproximadamente 1012 a 1013; de

aproximadamente 1013 a 1014; de aproximadamente 1014 a 1015; o mas secuencias diferentes) en la que un alto porcentaje de las diferentes secuencias son secuencias especificadas en lugar de secuencias aleatorias (por ejemplo, mas de aproximadamente 50 %, mas de aproximadamente 60 %, mas de aproximadamente 70 %, mas de aproximadamente 75 %, mas de aproximadamente 80 %, mas de aproximadamente 85 %, mas de

aproximadamente 90 %, aproximadamente 91 %, aproximadamente 92 %, aproximadamente 93 %,

aproximadamente 94 %, aproximadamente 95 %, aproximadamente 96 %, aproximadamente 97 %,

aproximadamente 98 %, aproximadamente 99 %, o mas de las secuencias son secuencias de interes

predeterminadas).

Los oligonucleotidos pueden utilizarse como bloques componentes para la sintesis de ADN y se pueden sintetizar en cadenas simples en un soporte solido (por ejemplo, superficie del chip de micromatriz) usando chorro de tinta y otras tecnologias. En el proceso de ensamblaje de acido nucleico, se pueden utilizar oligonucleotidos sinteticos para montar o amplificar el ADN en construcciones de ADN de tamano grande. Durante la amplification enzimatica, el error en la secuencia se replica fielmente. Como resultado, la poblacion de ADN sintetizado por este metodo contiene secuencias tanto libres de errores como propensas a errores. En algunas realizaciones, dado que los oligonucleotidos sinteticos pueden contener secuencias incorrectas debido a los errores introducidos durante la sintesis de oligonucleotidos, puede ser util eliminar fragmentos de acido nucleico que han incorporado uno o mas oligonucleotidos que contienen errores durante el ensamblaje. En algunas realizaciones, uno o mas fragmentos de acido nucleico ensamblados pueden secuenciarse para determinar si contienen la secuencia predeterminada o no. Este procedimiento permite identificar fragmentos con la secuencia correcta. En otras realizaciones, pueden utilizarse otras tecnicas para eliminar fragmentos de acido nucleico que contienen errores. Tales fragmentos de acido nucleico pueden ser oligonucleotidos sintetizados de forma emergente o polimeros de acido nucleico ensamblados. Se debe apreciar que los acidos nucleicos que contienen errores puede ser homoduplex de doble cadena que tienen el error en las dos cadenas (es decir, nucleotido(s) complementario(s) incorrectos), delecion(es) o adicion (es) en ambas cadenas), porque el procedimiento de ensamblaje puede implicar una o mas rondas de extension de la polimerasa (por ejemplo, durante el ensamblaje o despues del ensamblaje para amplificar el producto ensamblado) durante el cual un acido nucleico que contiene un error puede servir como molde, produciendo de este modo una cadena complementaria con el error complementario. En ciertas realizaciones, se puede sospechar que una preparacion de fragmentos de acido nucleico de doble cadena contiene una mezcla de acidos nucleicos que tienen la secuencia correcta y acidos nucleicos que incorporan uno o mas errores de secuencia durante el ensamblaje. En algunas formas de realization, los errores de secuencia pueden eliminarse mediante una tecnica que implica la desnaturalizacion y la rehibridacion de los acidos nucleicos de doble cadena. En algunas realizaciones, puede ser improbable que las cadenas simples de los acidos nucleicos que contienen errores complementarios se rehibriden si los acidos nucleicos que contienen cada error individual estan presentes en la preparacion de acido nucleico a una frecuencia menor que los acidos nucleicos que tienen la secuencia correcta en la misma position. En su lugar, las cadenas simples que contienen errores pueden rehibridarse con una cadena complementaria que no contiene ningun error o que contiene uno o mas errores diferentes (por ejemplo, errores en diferentes posiciones). Como resultado, las cadenas que contienen errores pueden terminar en forma de moleculas de heteroduplex en el producto de la reaction rehibridado. Las cadenas de acido nucleico que carecen de errores pueden rehibridarse con cadenas que contiene errores o con otras cadenas libres de errores. Las cadenas libres de errores rehibridadas forman homoduplex en la muestra rehibridada. De acuerdo con lo anterior, mediante la elimination de moleculas de heteroduplex de la preparacion de fragmentos de acido nucleico rehibridados, la cantidad o la frecuencia de los acidos nucleicos que contienen errores se pueden reducir.

Por tanto, la formation de heteroduplex se lleva a cabo a traves de un proceso que puede entenderse como barajado, por el cual las cadenas de acidos nucleicos a partir de diferentes poblaciones pueden hibridarse entre si de manera que se pueden formar duplex perfectos que contienen apareamientos y apareamientos erroneos. El metodo adecuado para la eliminacion de moleculas de heteroduplex incluye cromatografia, electroforesis, union selectiva de moleculas de heteroduplex, etc. Un requisito para el agente de union selectiva para su uso en este

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proceso es que se une preferentemente a ADN de doble cadena que tiene un apareamiento erroneo de la secuencia entre las dos cadenas. En algunas realizaciones, dicho agente puede ser una endonucleasa de apareamiento erroneo. El termino "endonucleasa" en general se refiere a una enzima que puede escindir el ADN internamente. El termino "apareamiento erroneo" o "apareamiento erroneo de pares de bases" indica una combination de pares de bases, que generalmente no se forma en los acidos nucleicos de acuerdo con las reglas de apareamiento de bases de Watson y Crick. Por ejemplo, al tratar con las bases que se encuentran habitualmente en el ADN, es decir, adenina, guanina, citosina y timidina, los apareamientos erroneos de pares de bases son las combinaciones de bases distintas de los pares A-T y G-C que normalmente se encuentran en el ADN. Como se describe en el presente documento, se puede indicar que un apareamiento erroneo es, por ejemplo, C/C lo que significa que un residuo de citosina se encuentra enfrente de otra citosina, en lugar de la pareja de apareamiento adecuada, guanina. Tal como se usa en el presente documento, oligonucleotido "heteroduplex" se refiere a un oligonucleotido de cadena doble formado mediante hibridacion de oligonucleotidos de cadenas simples en los que las cadenas, cuando se hibridan tienen regiones no apareadas, tales como apareamiento erroneo de pares de bases, bucle(s) de insercion/delecion y/o hueco(s) de nucleotido(s). En un aspecto, la invention se refiere a un metodo para producir oligonucleotidos de alta fidelidad sobre dicho soporte solido. El metodo incluye la sintesis de una primera pluralidad de oligonucleotidos en una reaction de extension de la cadena usando una segunda pluralidad de oligonucleotidos como moldes. La segunda pluralidad de oligonucleotidos se inmoviliza sobre un soporte solido y probablemente comprende oligonucleotidos libres de errores y que contienen errores que tienen un error de secuencia en una posicion que contiene errores. La reaccion de extension de cadena produce una primera pluralidad de oligonucleotidos bicatenarios o duplex (homoduplex y/o heteroduplex). El metodo tambien incluye la desaparicion o desnaturalizacion de la primera pluralidad de duplex para liberar la primera pluralidad de oligonucleotidos de la segunda pluralidad de oligonucleotidos, en el que la primera pluralidad de oligonucleotidos comprende oligonucleotidos sin errores que estan libres de error en la position que contiene errores del oligonucleotido que contiene errores. El metodo incluye adicionalmente poner en contacto la primera pluralidad de oligonucleotidos con la segunda pluralidad de oligonucleotidos en condiciones de hibridacion o apareamiento para formar una segunda pluralidad de duplex. La segunda pluralidad de duplex comprende un heteroduplex que contiene apareamientos erroneos formado entre el oligonucleotido que contiene errores y uno de los oligonucleotidos sin errores. El metodo tambien incluye la eliminacion de al menos una parte del heteroduplex que contiene apareamientos erroneos mediante un componente que reconoce apareamientos erroneos y de escision, produciendo de este modo los oligonucleotidos de alta fidelidad. En algunas realizaciones, el metodo incluye ademas despues de la etapa de eliminacion, la desaparicion selectiva de los truncamientos.

La Figura 1 muestra un metodo de ejemplo de la production de oligonucleotidos de alta fidelidad en una micromatriz de ADN, en el que a la formation de heteroduplex le sigue la escision del apareamiento erroneo. La micromatriz contiene oligonucleotidos sintetizados quimicamente que se inmovilizan sobre la superficie del chip 10. Los oligonucleotidos sintetizados quimicamente, como se ha mencionado anteriormente, probablemente contengan tanto la cadena molde sin errores 11 como la cadena molde propensa a errores 12. A modo de ejemplo, en una reaccion de extension de la cadena (por ejemplo, PCR) usando el cebador 13 (por ejemplo, un cebador de amplification universal), los oligonucleotidos sintetizados quimicamente pueden servir como cadenas molde para la produccion de cadenas complementarias. Los productos resultantes pueden incluir la cadena complementaria sin errores 14 (complementaria de la cadena molde libre de errores 11) y la cadena complementaria amplificada propensa a errores 15 (complementaria a la cadena molde propensa a errores 12). En condiciones de fusion (por ejemplo, un aumento de la temperatura en el soporte solido o la superficie del chip 10), las cadenas complementarias estan separadas de las cadenas molde. Despues del barajado, el heteroduplex 16 se puede formar entre una cadena molde propensa a errores y una cadena complementaria libre de errores. Despues, el heteroduplex 16 puede ser reconocido y escindido por un componente 17 (por ejemplo, la endonucleasa Surveyor™). La elimination posterior de los duplex propensos a errores escindidos puede dar lugar a una superficie de un chip sin errores 18.

El reconocimiento y escision del heteroduplex se puede lograr mediante la aplicacion de un agente de union a apareamiento erroneo a la mezcla de reaccion. En algunas realizaciones, el agente de union al apareamiento erroneo es una endonucleasa especifica del apareamiento de errores. En alguna realization se puede usar una proteina de union a apareamiento de errores unida o fusionada a una nucleasa.

Una endonucleasa de apareamiento de errores preferida es una endonucleasa CEL1 que tiene una alta especificidad por apareamientos erroneos por inserciones, deleciones y sustituciones de bases y puede detectar dos polimorfismos que estan separados por cinco nucleotidos. CEL1 es una glicoproteina extracelular especifica de plantas que puede escindir heteroduplex de ADN en todos los posibles apareamientos erroneos de nucleotidos unicos, en 3' de los apareamientos erroneos (Oleykowski CA et al, 1998, Nucleic Acids Res. 26: 4596-4602). CEL1 es util en ensayos de deteccion de apareamientos erroneos que se basan en mellar y escindir el ADN duplex en apareamientos erroneos por insercion/delecion y sustitucion de bases. En una realizacion de ejemplo se puede anadir una nucleasa ™ Surveyor (Transgenomic Inc.) a un volumen de reaccion que contiene los duplex de oligonucleotidos. La nucleasa Surveyor™ es una endonucleasa especifica de apareamientos erroneos que escinde todos los tipos de apareamientos erroneos, tales como polimorfismos de nucleotido unico, pequenas inserciones o deleciones. La adicion de la endonucleasa tiene como resultado la escision de los oligonucleotidos bicatenarios en el lugar o la region del apareamiento erroneo. La parte restante de los duplex de oligonucleotidos se puede fundir despues a una temperatura mas baja y menos estricta (por ejemplo, fusion estricta) necesaria para distinguir un

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unico apareamiento erroneo de bases. En algunas realizaciones, los oligonucleotidos libres de errores se liberan en solucion.

Los duplex que contienen apareamientos erroneos de la poblacion se pueden escindir preferentemente mediante la endonucleasa CEL1 espedfica de apareamientos erroneos. En algunas realizaciones se pueden usar otras proteinas de union a apareamientos erroneos que se unen selectivamente (por ejemplo, espedficamente) a moleculas de acido nucleico heteroduplex. Un ejemplo incluye el uso de MutS, un homologo de MutS, o una combinacion de los mismos que se unen a moleculas de heteroduplex. MutS de Thermus aquaticus se pueden adquirir comercialmente de Epicenter Corporation, Madison, Wis., n.° de catalogo SP72l0o y SP72250. La secuencia del gen para la proteina tambien se conoce y se ha publicado en Biswas y Hsieh, Jour. Biol. Chem. 271:5040-5048 (1996) y esta disponible en GenBank, numero de acceso U33117. En E. coli, la proteina MutS, que parece funcionar como un homodimero, sirve como un factor de reconocimiento de apareamientos erroneos. En eucariotas, se han identificado al menos tres proteinas MutS homologas (MSH); a saber, MSH2, MSH3, y MSH6, y forman heterodimeros. Por ejemplo, en la levadura, Saccharomyces cerevisiae, el complejo MSH2-MSH6 (tambien conocido como Mutsa) reconoce apareamientos erroneos de bases y bucles de un insercion/delecion de un solo nucleotido, mientras que el complejo MSH2-MSH3 (tambien conocido como MutSp) reconoce inserciones/deleciones de hasta 12-16 nucleotidos, aunque ejercen funciones sustancialmente redundantes. Una proteina de union a apareamientos erroneos se puede obtener a partir de fuentes recombinantes o naturales. Una proteina de union a apareamientos erroneos puede ser estable al calor. En algunas realizaciones, se puede usar una proteina de union a apareamientos erroneos termoestable de un organismo termofilo. Ejemplos de proteinas de union a apareamientos erroneos termoestables incluyen, sin limitaciones: Tth MutS (de Thermus thermophilus); Taq MutS (de Thermus aquaticus); Apy MutS (de Aquifex pyrophilus); Tma MutS (de Thermotoga maritima); cualquier otra MutS adecuada; o cualquier combinacion de dos o mas de las mismas.

En algunas realizaciones, se pueden disenar y sintetizar moleculas pequenas capaces de unirse a apareamientos erroneos de nucleotidos especificos. Por ejemplo, la naftiridina dimerica 1, un ligando sintetico que se une a un apareamiento erroneo G-G. Un coctel de tales ligandos que, en combinacion, reconoce todos los posibles apareamientos erroneos podria reemplazar a CEL1. Tambien pueden usarse otros agentes proteicos que pueden diferenciar entre los duplex apareados y no apareados. Por ejemplo, la endonucleasa de T7 I escindira espedficamente una cadena de ADN en un apareamiento erroneo y seria posible utilizar esta enzima como un destructor catalitico de las secuencias apareadas erroneamente o para inactivar la funcion de escision de esta enzima para su uso en este proceso como agente de union al apareamiento erroneo. La endonucleasa VII de T4 se unira espedficamente y escindira el ADN en apareamientos erroneos del duplex y ya se ha disenado una version mutante de esta enzima que carece de la actividad nucleasa pero retiene la capacidad para unirse a moleculas de ADN duplex mutantes (Golz y Kemper, Nucleic Acids Research, 27:e7 (1999)). La nucleasa SP es una nucleasa altamente activa de espinaca que incide todos los apareamientos erroneos excepto los que contienen un residuo de guanina, y esta enzima tambien podria disenarse para eliminar la actividad de escision o utilizar directamente. Dos o mas de estos agentes de union se pueden combinar para proporcionar mas rigor a la filtracion o para cubrir todos los tipos de errores de secuencia si un agente no se une a todos los apareamientos erroneos posibles.

Algunas realizaciones del dispositivo y metodos proporcionados en el presente documento utilizan oligonucleotidos que se inmovilizan sobre una superficie o sustrato. Tal como se utiliza en el presente documento, el termino "soporte" y "sustrato" se utilizan indistintamente y se refiere a un material insoluble en disolvente poroso o no poroso en el que se sintetizan o inmovilizan polimeros tales como acidos nucleicos. Tal como se usa en el presente documento "poroso" significa que el material contiene poros que tienen diametros sustancialmente uniformes (por ejemplo en el intervalo de nm). Los materiales porosos incluyen papel, filtros sinteticos etc. En este tipo de materiales porosos, la reaccion puede tener lugar dentro de los poros. El soporte puede tener cualquiera de una serie de formas, tales como perno, tira, placa, disco, barra, curvas, estructura cilindrica, particula, incluyendo perlas, nanoparticulas y similares. El soporte puede tener anchuras variables. El soporte puede ser hidrofilo o capaz de hacerse hidrofilo e incluye polvos inorganicos tales como silice, sulfato de magnesio, y alumina; materiales polimericos naturales, en particular materiales celulosicos y materiales derivados de celulosa, tales como papeles que contienen fibra, por ejemplo, papel de filtro, papel cromatografico, etc.; polimeros de origen natural sinteticos o modificados, tales como nitrocelulosa, acetato de celulosa, poli(cloruro de vinilo), poliacrilamida, dextrano reticulado, agarosa, poliacrilato, polietileno, polipropileno, poli(4-metilbuteno), poliestireno, polimetacrilato, poli(tereftalato de etileno), nylon, poli(butirato de vinilo), membrana de difluoruro de polivinilideno (PVDF), vidrio, vidrio de poro controlado, vidrio de poro controlado magnetico, ceramica, metales, y similares etc.; usados por si mismos o en combinacion con otros materiales. En algunas realizaciones, los oligonucleotidos se sintetizan en un formato de matriz. Por ejemplo, los oligonucleotidos de cadena sencilla se sintetizan in situ sobre un soporte comun, en el que cada oligonucleotido se sintetiza en una caracteristica (o mancha) separada o discreta sobre el sustrato. En realizaciones preferidas, los oligonucleotidos de cadena sencilla se unen a la superficie del soporte o caracteristica. Tal como se utiliza en el presente documento, el termino "matriz" se refiere a una disposicion de caracteristicas discretas para almacenamiento, enrutamiento, amplificacion y liberacion de oligonucleotidos u oligonucleotidos complementarios para otras reacciones. En una realizacion preferida, el soporte o la matriz es direccionable: el soporte incluye dos o mas caracteristicas direccionables discretas en un lugar predeterminado concreto (es decir, una "direccion") sobre el soporte. Por lo tanto, cada molecula de oligonucleotido de la matriz se localiza en una ubicacion conocida y definida en el soporte. La secuencia de cada oligonucleotido se puede determinar a partir de su

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posicion sobre el soporte. Ademas, los soportes o matrices direccionables permiten el control directo de los volumenes de aislados individuales, tales como gotas. El tamano de la caracteristica definida se elige para permitir la formacion de una gota de microvolumen en la caracteristica, manteniendose cada gota separadas unas de otras. Como se describe en el presente documento, las caracteristicas estan, normalmente, aunque no es necesario, separadas por espacios intercaracteristicas para asegurar que las gotas entre dos entidades adyacentes no se combinan. Las intercaracteristicas normalmente no llevaran ningun oligonucleotido en su superficie y corresponderan a espacio inerte. En algunas realizaciones, las caracteristicas e intercaracteristicas pueden diferir en sus propiedades de hidrofilicidad o hidrofobicidad. En algunas realizaciones, las caracteristicas e intercaracteristicas pueden comprender un modificador como se describe en el presente documento.

Las matrices se pueden construir, ordenar a medida o comprar a un proveedor comercial (por ejemplo, Agilent, Affymetrix, Nimblegen). Los oligonucleotidos se unen, fijan, inmovilizan, unen al soporte, soportan o sintetizan en las caracteristicas discretas de la superficie o la matriz como se ha descrito anteriormente. Los oligonucleotidos pueden estar unidos covalentemente a la superficie o depositarse en la superficie. Varios metodos de construccion son bien conocidos en la materia, por ejemplo, sintetizadores de matriz sin mascara, metodos dirigidos por luz que usan mascaras, metodos de canales de flujo, metodos de manchado etc.

En algunas realizaciones, la construccion y/o seleccion de oligonucleotidos pueden sintetizarse sobre un soporte solido usando sintetizador de matriz sin mascaras (MAS). Los sintetizadores de matriz sin mascara se describen, por ejemplo, en la solicitud de PCT n.° WO 99/42813 y en la correspondiente patente de Estados Unidos n.° 6.375.903. Otros ejemplos son instrumentos sin mascara conocidos que pueden fabricar una micromatriz de ADN a medida en la que cada una de las caracteristicas de la matriz tiene una molecula de ADN monocatenaria de la secuencia deseada.

Otros metodos para la sintesis de los oligonucleotidos de construccion y/o de seleccion incluyen, por ejemplo, los metodos dirigidos por luz utilizando mascaras, metodos de canales de flujo, metodos de aplicacion de manchas, metodos basados en pasadores, y metodos que utilizan multiples soportes. Los metodos dirigidos por luz usando mascaras (por ejemplo, metodos VLSIPS™) para la sintesis de oligonucleotidos se describen, por ejemplo, en las patentes de Estados Unidos n.° 5.143.854, 5.510.270 y 5.527.681. Estos metodos implican la activacion de regiones predefinidas de un soporte solido y despues poner en contacto el soporte con una solucion monomerica preseleccionada. Las regiones seleccionadas pueden activarse por irradiacion con una fuente de luz a traves de una mascara, gran parte en la forma de tecnicas de fotolitografia usadas en la fabricacion de circuitos integrados. Otras regiones del soporte permanecen inactivas porque la iluminacion es bloqueada por la mascara y permanecen protegidas quimicamente. Por lo tanto, un patron de luz define que regiones del soporte reaccionen con un monomero dado. Al activar repetidas veces diferentes conjuntos de regiones predefinidas y poner en contacto diferentes soluciones monomericas con el soporte, se produce un conjunto diverso de polimeros sobre el soporte. Opcionalmente se pueden usar otras etapas, tales como el lavado de la solucion monomerica sin reaccionar del soporte. Otros metodos aplicables incluyen tecnicas mecanicas, tales como las descritas en la patente de Estados Unidos n.° 5.384.261.

En la patente de Estados Unidos n.° 5.384.261 se describen metodos adicionales aplicables a la sintesis de oligonucleotidos de construccion y/o de seleccion sobre un unico soporte. Por ejemplo, los reactivos pueden liberarse en el soporte mediante (1) flujo dentro de un canal definido en regiones predefinidas o (2) "manchado" en regiones predefinidas. Tambien se pueden usar otros enfoques, asi como combinaciones de las manchas y el flujo. En cada caso, ciertas regiones activadas del soporte se separan mecanicamente de otras regiones cuando las soluciones monomericas se liberan en los diversos sitios de reaccion. Los metodos de canales de flujo implican, por ejemplo, los sistemas de microfluidos para el control de la sintesis de oligonucleotidos en un soporte solido. Por ejemplo, diversas secuencias polimericas pueden sintetizarse en regiones seleccionadas de un soporte solido mediante la formacion de canales de flujo en una superficie del soporte a traves del cual fluyen los reactivos apropiados o en el que se colocan reactivos apropiados. Los metodos de manchado para la preparacion de oligonucleotidos sobre un soporte solido implican la liberacion de reactivos en cantidades relativamente pequenas que se depositan directamente en regiones seleccionadas. En algunos pasos, toda la superficie del soporte se puede rociar, o de otra forma recubrir, con una solucion, si es mas eficiente hacerlo. Alicuotas medidas de forma precisa de las soluciones monomericas pueden depositarse gota a gota mediante un dispensador que se mueve de una region a otra.

Los metodos basados en pasadores para la sintesis de oligonucleotidos sobre un soporte solido se describen en, por ejemplo, la patente de Estados Unidos n.° 5,288,514. Los metodos basados en pasadores utilizan un soporte que tiene una pluralidad de pasadores u otras extensiones. Los pasadores se insertan cada uno simultaneamente en recipientes de reactivos individuales en una bandeja. Una matriz de 96 pasadores se utiliza habitualmente con una bandeja de 96 recipientes tal como una placa de microtitulacion de 96 pocillos. Cada bandeja se llena con un reactivo particular, para el acoplamiento en una reaccion quimica particular, en un pasador individual. En consecuencia, las bandejas a menudo contendran diferentes reactivos. Dado que las reacciones quimicas se han optimizado de tal manera que cada una de las reacciones puede realizarse bajo un conjunto relativamente similar de condiciones de reaccion, se hace posible llevar a cabo multiples etapas de acoplamiento quimico al mismo tiempo.

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En otra realizacion, se puede sintetizar una pluralidad de oligonucleotidos en varios soportes. Un ejemplo es un metodo de smtesis basado en esferas que se describe, por ejemplo, en las patentes de Estados Unidos n.° 5.770.358; 5.639.603; y 5.541.061. Para la sintesis de moleculas, tales como oligonucleotidos sobre esferas, una gran pluralidad de perlas se suspende en un vehiculo adecuado (tal como agua) en un recipiente. Las esferas se proporcionan con moleculas espaciadoras opcionales que tienen un sitio activo al que se une, opcionalmente, un grupo protector. En cada etapa de la sintesis, las esferas dividen para acoplarse en una pluralidad de recipientes. Despues de que las cadenas de oligonucleotido nacientes se desprotegen, se anade una solucion monomerica diferente a cada recipiente, de modo que en todas las esferas en un recipiente dado, se produce la misma reaccion de adicion de nucleotidos. Despues, las esferas se lavan de los reactivos en exceso, se combinan en un unico recipiente, se mezclan y redistribuyen en otra pluralidad de recipientes en preparation para la siguiente ronda de sintesis. Debe tenerse en cuenta que en virtud de la gran cantidad de esferas utilizadas desde el principio, habra, de forma similar, un gran numero de esferas dispersas al azar en el recipiente, teniendo cada una unica secuencia de oligonucleotidos sintetizada en una superficie de la misma despues de numerosas rondas de adicion aleatorizada de bases. Una esfera individual puede marcarse con una secuencia que es unica para el oligonucleotido de doble cadena sobre la misma, para permitir la identification durante el uso.

En otra realizacion mas, una pluralidad de oligonucleotidos se puede unir o sintetizar en nanoparticulas. Las nanoparticulas incluyen, pero no se limitan a, metales (por ejemplo, oro, plata, cobre y platino), semiconductores (por ejemplo, CdSe, CDs y CdS recubiertos con ZnS) y materiales coloidales magneticos (por ejemplo, ferromagnetita). Los metodos para unir oligonucleotidos a las nanoparticulas son conocidos en la materia. En otra realizacion, las nanoparticulas se unen al sustrato. Las nanoparticulas con o sin oligonucleotidos inmovilizados se pueden unir a los sustratos como se describe en, por ejemplo, Grabar et al., Analyt. Chem., 67, 73-743 (1995); Bethell et al., J. Electroanal. Chem., 409, 137 (1996); Bar et al., Langmuir, 12, 1172 (1996); Colvin et al., J. Am. Chem. Soc., 114, 5221 (1992). Las nanoparticulas desnudas se pueden unir primero al sustrato y los oligonucleotidos se pueden unir a las nanoparticulas inmovilizadas.

Las secuencias de oligonucleotidos y/o polinucleotidos presintetizadas se pueden unir a un soporte o sintetizar in situ usando metodos dirigidos por luz, metodos de canales de flujo y de manchado, metodos de chorro de tinta, metodos basados en pasadores y metodos basados en esferas expuestos en las referencias siguientes: McGall et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93:13555; Synthetic DNA Arrays In Genetic Engineering, Vol. 20:111, Plenum Press (1998); Duggan et al. (1999) Nat. Genet. S21:10; Microarrays: Making Them and Using Them In Microarray Bioinformatics, Cambridge University Press, 2003; las publicaciones de solicitud de patentes de Estados Unidos n.° 2003/0068633 y 2002/0081582; las patentes de Estados Unidos n.° 6.833.450, 6.830.890, 6.824.866, 6.800.439, 6.375.903 y 5.700.637; y las publicaciones PCT N° WO 04/031399, WO 04/031351, WO 04/029586, WO 03/100012, WO 03/066212, WO 03/065038, WO 03/064699, WO 03/064027, WO 03/064026, WO 03/046223, WO 03/040410 y WO 02/24597. En algunas realizaciones, los oligonucleotidos previamente sintetizados se unen a un soporte o se sintetizan utilizando una metodologia de manchas en la que las soluciones monomericas se depositan gota a gota mediante dispensador que se mueve de una region a otra (por ejemplo, chorro de tinta). En algunas realizaciones, los oligonucleotidos se aplican en manchas sobre un soporte utilizando, por ejemplo, un dispensador accionado por onda mecanica.

Los metodos y dispositivos proporcionados en el presente documento implican volumenes de reaccion de amplification y/o ensamblaje pequenos, tales como microvolumenes, nanovolumenes, picovolumenes o subpicovolumenes. Por consiguiente, los aspectos de la divulgation se refieren a metodos y dispositivos para la amplificacion y/o ensamblaje de polinucleotidos en gotas de volumen pequeno en caracteristicas separadas y direccionables de un soporte. Por ejemplo, una pluralidad de oligonucleotidos complementarios a los oligonucleotidos de cadena sencilla unidos a la superficie se sintetiza en un microvolumen de reaccion predefinido de la solucion mediante sintesis dependiente de molde. En algunas realizaciones, se pueden usar microvolumenes de reaccion predefinidos de entre aproximadamente 0,5 pl y aproximadamente 100 pl. Sin embargo, pueden utilizarse volumenes mas pequenos o mas grandes. En algunas formas de realizacion, un dispensador accionado por onda mecanica se puede utilizar para la transferencia de volumenes de menos de 100 nl, a menos de 10 nl, menos de 5 nl, menos de 100 pl, menos de 10 pl, o aproximadamente 0,5 pl o menos. En algunas realizaciones, el dispensador accionado por onda mecanica puede ser un dispositivo de chorro de tinta piezoelectrico o un manipulador de liquidos acustico. En una realizacion preferida, se usa un dispositivo de chorro de tinta piezoelectrico y puede liberar soluciones de picolitros de una manera muy precisa sobre un soporte tal como se describe en el presente documento.

Los aspectos de la divulgacion se refieren a la manipulation de la submicrovolumenes sobre un sustrato y al control del movimiento de los microvolumenes sobre un sustrato. Es un fenomeno bien conocido que las superficies de la mayoria de los sustratos normalmente solidos, cuando entran en contacto con una solucion, tienen un grado caracteristico de no humectabilidad. Es decir, las soluciones acuosas no se extienden sobre la superficie solida sino que contactan para formar gotas. consecuencia, los soportes preferibles tienen propiedades de superficie, principalmente propiedades de tension superficial y de humectabilidad, que permiten la formation de gotas cuando se dispensan volumenes pequenos sobre la caracteristica direccionable. En algunas realizaciones, el microvolumen esta delimitado completamente o casi completamente por la superficie libre que forma una gota o microgota. Un experto en la tecnica entendera que la forma de la gota estara gobernada y mantenida por el angulo de contacto de

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la interaction Kquido/isolido, la tension superficial del liquido, asi como por la energia de superficie. Las fuerzas adhesivas entre un Kquido y un solido haran que una gota de liquido se extienda por toda la superficie, mientras que las fuerzas de cohesion dentro del liquido haran que gota caiga y evite contacto con la superficie. Para el liquido, la densidad de energia de la superficie es identica a la tension superficial. La tension superficial es la propiedad de la materia, debido a las fuerzas moleculares, que existe en la pelicula superficial de todos los liquidos y tiende a llevar el volumen contenido en una forma que tiene el menor area superficial posible. En algunas realizaciones, la superficie se divide en regiones discretas, en las que los angulos de contacto de la superficie de la region discreta difieren para el fluido de interes. Tal como se utiliza en el presente documento, la expresion "angulo de contacto" se refiere a una medida cuantitativa de la humectacion de un solido por un liquido. Un angulo de contacto se define como el angulo formado por un liquido en el limite trifasico en el que el vapor (gas, por ejemplo, atmosfera), liquido y solido se cruzan. Por ejemplo, en el caso de una gota de microvolumen dispensada en una superficie plana horizontal, la forma de la gota de microvolumen sera determinada por la ecuacion de equilibrio de Young:

0 = 7SV — 7SL - 7 COS 0c

en la que ysv es la energia interfacial de solido-vapor; ysl es la energia interfacial solido-liquido y y es la energia de liquido-vapor (es decir, la tension superficial) y 0do es el angulo de contacto de equilibrio.

Se entendera que para los valores 0do del angulo de contacto menores de 90 °, el liquido se extiende sobre la superficie solida. Por ejemplo, las superficies muy hidrofilas tienen un angulo de contacto de 0° a aproximadamente 30°. En el caso de soluciones acuosas y soporte altamente hidrofilo, el angulo de contacto 0c estara cerca de 0° y la solution acuosa o gota se extendera completamente sobre la superficie solida (es decir, humectacion completa de la superficie). Si no se produce humectacion completa, el liquido formara una gota. Por el contrario, para el valores del angulo de contacto 0c iguales o mayores que 90°, el liquido descansara sobre la superficie y formara una gota en la superficie solida. La forma de la gota esta determinada por el valor del angulo de contacto. En el caso de soluciones acuosas y superficies altamente hidrofobas, el liquido formara esferas. En algunas realizaciones, el soporte se elige de modo que tenga una energia de superficie y un angulo de contacto de la superficie que no permitan que las gotas se extiendan mas alla del perimetro de la caracteristica. Ademas, en una superficie ideal, las gotas volveran a sus formas originales si son perturbadas, por ejemplo despues de la adicion de una solucion miscible o no miscible. En algunas realizaciones, la superficie se divide en regiones, en las que los angulos de contacto de la superficie de la region discreta difieren para el liquido de interes. En algunas realizaciones, estas regiones corresponden a las caracteristicas discretas del sustrato. En una realization preferida, la superficie se divide en regiones por modificadores. Los modificadores se pueden anadir a localizaciones especificas de la superficie de sustrato. En algunos casos, la superficie se dividira en regiones que comprenden areas de superficie modificadoras y no modificadoras. En algunas realizaciones, las regiones no modificadoras corresponden al sustrato sin modificar. Sin embargo, en otras realizaciones, las regiones no modificadoras corresponden a una superficie de cualquier modification arbitraria o cualquier modificador que es diferente que el modificador en una region que corresponde a una caracteristica de un soporte. En algunas realizaciones, los modificadores son oligomeros. Por ejemplo, los modificadores corresponden a los acidos nucleicos y estan modificando un conjunto de caracteristicas discretas del sustrato. Los modificadores pueden tener forma circular, cuadrada, trapezoidal, o cualquier forma geometrica o cualquier combination de las mismas. En algunas realizaciones, los modificadores estan dispuestos en un patron de rejilla o en otras configuraciones diferentes. El patron no esta limitado a ningun diseno. Por ejemplo, los modificadores pueden estar dispuestos en un patron formado al azar. Los patrones pueden formarse mediante cualquier proceso conocido en la tecnica. Por ejemplo, patrones organizados o patrones al azar se pueden formar por procesos tales como el autoensamblaje de superficie del copolimero de bloque. En otras formas de realizacion, la superficie del sustrato se divide en regiones por al menos dos regiones modificadoras diferentes modificadores como se trata en el presente documento. En algunas realizaciones, el angulo de contacto de la superficie de los modificadores (0m) es diferente al angulo de contacto de la superficie de la region no modificadora (0nm). Por ejemplo, el angulo de contacto de la superficie de los modificadores puede ser mayor que el angulo de contacto de la superficie de las regiones no modificadores (0m>0nm). Como alternativa, el angulo de contacto de la superficie de las regiones no modificadoras es mayor que el angulo de contacto de la superficie de los modificadores (0m<0nm). En el contexto de las soluciones acuosas, las superficies modificadoras pueden ser mas hidrofilas que la superficie de las regiones no modificadoras (es decir, el angulo de contacto de la superficie de los modificadores es menor que el angulo de contacto de la superficie de las regiones no modificadoras). Como alternativa, las superficies modificadoras pueden ser mas hidrofobas que la superficie de las regiones de la superficie no modificadoras (es decir, el angulo de contacto de la superficie de los modificadores es menor que el angulo de contacto de la superficie de las regiones superficie no modificadoras). En un ejemplo de realizacion, los modificadores son oligonucleotidos y la superficie de las regiones modificadoras es mas hidrofila que la superficie de las regiones no modificadoras. En otras realizaciones, la totalidad o una parte sustancial del soporte o superficie estan cubiertas con al menos dos modificadores diferentes. Los al menos dos modificadores diferentes puede tener un patron como se ha descrito anteriormente. Por ejemplo, los diferentes modificadores pueden cubrir la superficie en un patron alternativo. Debe apreciarse que la superficie del soporte puede estar cubierta con una pluralidad de modificadores que estan dispuestos en la superficie para formar un gradiente hidrofilo. En algunas realizaciones, cada modificador tiene un angulo de contacto diferente que el modificador adyacente. En algunas realizaciones, la superficie se divide con una pluralidad de modificadores diferentes, siendo la pluralidad de los primeros modificadores mas hidrofila que el al

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menos un segundo modificador, teniendo la pluralidad de los primeras modificadoras cada uno un angulo de contacto ligeramente diferente al del siguiente primer modificador. Por ejemplo, el angulo de contacto de cada uno de la pluralidad del primera modificador puede diferir en al menos aproximadamente 1°, 2°, 3°, 4°, 5°, 6°, 7°, 8°, 9°, 10° 11°, 12°, 13,° 14°, 15°, 16°, 17°, 18°, 19°, 20°, 25°, 30° o mas del siguiente primer modificador. La pluralidad de los primeros modificadores, por tanto, forma un gradiente hidrofilo y de un camino predeterminado a lo largo de la cual una gota se puede mover mediante la manipulacion de la tension superficial.

De acuerdo con algunos aspectos de la divulgacion, la diferencia en los angulos de contacto de la superficie entre dos modificadores diferentes o un modificador y la superficie del no modificador crea una "pared" virtual". Tal como se utiliza en el presente documento, el termino angulo de contacto mas pequeno (SCA) se refiere a la superficie o el modificador que tiene el angulo de contacto mas pequeno y el termino angulo de contacto mas grande (HCA) se refiere a la superficie o modificador que tiene un angulo de contacto mayor. En el contexto de las soluciones acuosas, los sCa son mas hidrofilos que los HCA. En algunas realizaciones, los valores de HCA son al menos 20°, al menos 30 °,al menos 35° mayores que los SCA. En consecuencia, los volumenes de liquidos se pueden formar y aislar en tales superficies. Por ejemplo, si el angulo de contacto de la superficie modificadora es mayor que el angulo de contacto de la superficie no modificadora, los volumenes de liquido formaran una gota entre dos regiones modificadoras. Se apreciara que dependiendo del volumen de liquido depositado sobre la superficie y la diferencia de los valores de contacto entre modificadores, la gota puede ocupar una unica region del angulo de contacto pequeno (SCA) o multiples regiones. Por ejemplo, el volumen de liquido puede ocupar 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o mas regiones SCA. De acuerdo con ello, el liquido puede ocupar una huella correspondiente a uno o mas SCA. Por tanto, la huella puede abarcar uno o mas HCA. En algunas realizaciones, para asegurar que dos gotas o volumenes aislados pequenos no se fusionan, los volumenes de liquido se colocan suficientemente separados unos de otros. Por ejemplo, la separacion entre dos volumenes aislados puede comprender al menos una, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis, al menos siete, al menos ocho, al menos nueve, al menos diez o regiones de HC o regiones modificadoras. La colocacion de los volumenes de liquido suficientemente separados tambien permite mantener los volumenes de liquidos aislados durante las fluctuaciones de temperatura, tales como durante el termociclado. Debido a que la tension superficial disminuye generalmente con el aumento de la temperatura, las gotas pueden extenderse o desplazarse sobre la superficie cuando se eleva la temperatura del soporte o del volumen de liquido. Se apreciara que si los volumenes de liquido se mantienen suficientemente separados, los volumenes de liquidos permaneceran aislados y no se fusionaran con volumenes de liquido adyacentes durante la fluctuacion de la temperatura.

En un aspecto de la divulgacion, se proporcionan metodos y dispositivos para el procesamiento de forma independiente uno o mas pluralidad de oligonucleotidos de una manera dependiente de la temperatura en las caracteristicas direccionables en los volumenes de liquido aislados. En algunas realizaciones, el metodo se lleva a cabo de una manera que proporcione un conjunto de oligonucleotidos de cadena simple predefinidos o secuencias de oligonucleotidos complementarios para reacciones o procesamiento especificados adicionales. Se debe apreciar que siendo cada caracteristica independientemente direccionable, cada reaccion se puede procesar de forma independiente dentro de un volumen de liquido aislado predefinido o una gota sobre una caracteristica discreta (por ejemplo, camara virtual). En algunas realizaciones, las matrices se almacenan en seco para las reacciones posteriores. En una realizacion preferida, los oligonucleotidos inmovilizados sobre soporte pueden hidratarse de forma independiente con una solucion acuosa. Las soluciones acuosas incluyen, pero no se limitan a agua, tampon, cebadores, mezcla maestra, productos quimicos de liberacion, enzimas, o cualquier combinacion de los mismos. La solucion acuosa se puede aplicar en forma de mancha o inyectar sobre la o las ubicaciones de la superficie correspondiente(s) a la o las caracteristicas discretas. Posteriormente, la solucion o gel acuoso miscible asi como no miscible pueden depositarse de la misma manera. Como alternativa se puede usar un dispensador accionado por onda mecanico para la transferencia de pequenos volumenes de fluidos (por ejemplo, picolitros o subpicolitros). Un dispensador accionado por onda mecanica puede ser un dispositivo de chorro de tinta piezoelectrico o un manipulador de liquidos acustico. Un dispositivo de chorro de tinta piezoelectrico puede expulsar fluidos mediante el accionamiento de un mecanismo de accionamiento piezoelectrico, que fuerza la expulsion de las gotas de fluido. Los piezoelectricos en general tienen un buen ancho de banda de operation y pueden generar grandes fuerzas en un tamano compacto. Algunos de los instrumentos de micromatriz de chorro de tinta piezoelectricos comercialmente disponibles incluyen los de Perkin Elmer (Wellesley, MA), GeSim (Alemania) y MicroFab (Plano, TX). Los dispensadores piezoelectricos tipicos pueden crear gotas en el intervalo de picolitros y con un coeficiente de variation de 3-7 %. Las tecnologias y dispositivos de chorro de tinta para la expulsion de una pluralidad de gotas de liquido hacia caracteristicas discretas en una superficie de sustrato para la deposition sobre la misma se han descrito en una serie de patentes, tales como las patentes de Estados Unidos n.° 6.511.849; 6.514.704; 6.042.211; 5.658.802.

En una realizacion, el deposito de fluido o solucion se lleva a cabo usando un manipulador o eyector de liquidos acustico. Los dispositivos acusticos son dispositivos de dispensacion sin contacto capaces de dispensar un volumen pequeno de fluido (por ejemplo, de picolitros a microlitros), vease por ejemplo Echo 550 de Labcyte (CA), HTS-01 de EDC Biosystems. Las tecnologias y dispositivos acusticos para expulsar acusticamente una pluralidad de gotas de fluido hacia sitios discretos sobre una superficie de sustrato para el deposito sobre el mismo se han descrito en una serie de patentes, tales como las patentes de Estados Unidos n.° 6.416.164; 6.596.239; 6.802.593; 6.932.097; 7.090.333 y la solicitud de patente de Estados Unidos 2002-0037579. El dispositivo acustico incluye un generador

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de radiacion acustica o transductor que se puede usar para expulsar gotas de fluido desde un deposito (por ejemplo, pocillos de microplacas) a traves de un medio de acoplamiento. La presion de las ondas acusticas focalizadas en la superficie del fluido crea una corriente ascendente, haciendo asi que el Kquido para suba rapido para expulsar una gota, por ejemplo, de un pocillo de una placa fuente, a una placa receptora situada por encima del deposito de fluido. El volumen de la gota eyectada puede determinarse mediante la seleccion de la frecuencia de la onda de sonido apropiada.

En algunas realizaciones, la placa fuente que comprende agua, tampones, cebadores, mezcla maestra, productos quimicos de liberation, enzimas, o cualquier combination de los mismos, y las placas de destino que comprende los oligonucleotidos o polinucleotidos se emparejan para permitir una correcta liberacion o aplicacion en mancha del reactivo en el sitio correcto. El dispensador accionado por onda mecanica puede acoplarse con un microscopio y/o una camara para proporcionar la seleccion de position de las manchas depositadas. Se puede colocar una camara a ambos lados de la placa de destino o sustrato. Se puede usar una camara para registrar la posicion sobre la matriz, especialmente si el acido nucleico esta acoplado con un marcador fluorescente.

Debe apreciarse que cuando se manipulan volumenes de liquido pequenos, tales como picolitros y nanolitros, cuanto mas pequena es la gota, mas rapido se evaporara. Por lo tanto, los aspectos de la divulgation se refieren a metodos y dispositivos para limitar, retardar o evitar la evaporation del agua o el disolvente. En algunas realizaciones, las caracteristicas discretas o un subconjunto de caracteristicas discretas se pueden recubrir con una sustancia capaz de atrapar o capturar agua. En otras realizaciones, el material que atrapa el agua puede recubrirse por centrifugation sobre el soporte. Se pueden usar diferentes materiales o sustancias para atrapar el agua en lugares especificos. Por ejemplo, la sustancia de atrapamiento de agua puede ser una matriz acuosa, un gel, un coloide o cualquier polimero adecuado. En algunas realizaciones, el material se elige para que tenga un punto de fusion que permita que se mantenga solido o semisolido (por ejemplo, gel) a las temperaturas de reaction, tales como la temperaturas de desnaturalizacion o las temperaturas o de termociclado. Los materiales de captura de agua incluyen, pero no se limitan a, silice coloidal, gel peptidico, agarosa, solgel y polidimetilsiloxano. En una realization de ejemplo se pueden usar silice coloidal Snowtex® (Nissan Chemical). La silice coloidal Snowtex se compone de particulas de silice amorfa con carga negativa monodispersadas en agua. La silice coloidal Snowtex se puede aplicar como gel seco o como un gel hidratado sobre la superficie. En una realizacion preferida, la sustancia de atrapamiento de agua se aplica en forma de mancha en caracteristicas discretas que comprenden oligonucleotidos unidos a la superficie. Como alternativa, los oligonucleotidos pueden sintetizarse en las particulas o nanoparticulas (por ejemplo, particulas coloidales, silice coloidal, Snowtex) y las particulas o nanoparticulas se puede dispensar en las caracteristicas discretas de la superficie. En algunas realizaciones, la sustancia de atrapamiento de agua se aplica en forma de mancha en las caracteristicas discretas del soporte utilizando un dispositivo mecanico, un dispositivo de chorro de tinta o un manipulador de liquidos acustico.

Se apreciara que la evaporacion tambien se puede limitar mediante la formation de una barrera fisica entre la superficie de la gota y la atmosfera. Por ejemplo, una solution no miscible puede superponerse para proteger la gota de la evaporacion. En algunas realizaciones, un pequeno volumen de la solucion no miscible se dispensa directamente y de forma selectiva en la localization discreta del sustrato, tales como las caracteristicas que comprenden una gota. En algunas otras realizaciones, la solucion no miscible se dispensa sobre un subconjunto de caracteristicas que comprenden una gota. En otras formas de realizacion, la solucion no miscible se aplica uniformemente sobre la superficie de la matriz de formacion de una bicapa no miscible, en la que estan atrapadas las gotas. La bicapa no miscible puede evaporarse despues para formar una pelicula fina sobre la superficie o sobre una parte sustancial de la superficie de la gota. La solucion no miscible incluye, pero no se limita a, aceite mineral, aceite vegetal, aceite de silicona, aceite de parafina, cera natural o sintetica, un disolvente organico que es inmiscible en agua o cualquier combinacion de los mismos. Un experto en la tecnica apreciara que dependiendo de la composition de los aceites, algunos aceites pueden solidificarse parcial o completamente a o por debajo de la temperatura ambiente. En algunas realizaciones, la solucion no miscible puede ser una cera natural o sintetica, tal como hidrocarburo de parafina. La parafina es un hidrocarburo alcano con la formula general CnH2n+2. dependiendo de la longitud de la molecula, la parafina puede aparecer como un gas, un liquido o un solido a temperatura ambiente. La cera de parafina se refiere a los solidos con 20 < n < 40 y tiene un punto de fusion tipico entre aproximadamente 47 °C a 64 °C. Por consiguiente, en algunas realizaciones, el soporte puede almacenarse tapado con una cera. Antes del uso, se puede aplicar calor al soporte para permitir que la cera se convierta en una cera de fase liquida recubriendo al soporte.

En algunos aspectos de la divulgacion, en etapas posteriores, la solucion acuosa se puede anadir a la gota que tiene una solucion no miscible en su superficie. El disolvente o la solucion acuosa se pueden anadir, por ejemplo, para iniciar una reaccion, para ajustar un volumen, para ajustar un pH, para aumentar o disminuir una concentration de soluto, etc. Se apreciara que el disolvente o la solucion acuosa pueden penetrar en la capa no miscible utilizando diferentes mecanismos. Por ejemplo, si se utiliza un dispositivo de cabeza de chorro de tinta, la solucion acuosa se expulsa y el momento fisico de la gota expulsada permitira que la solucion acuosa cruce la capa no miscible. Otros mecanismos pueden emplear fuerzas adicionales, tales como, por ejemplo,fuerzas magneticas y/o electrostaticas y/o fuerzas opticas. Las fuerzas opticos y magneticos se pueden crear de manera simultanea o independientemente una de otra. Ademas, el mecanismo puede utilizar pinzas magneto-opticas acopladas. En algunas realizaciones, la solucion acuosa que se va a dispensar contiene nanoparticulas magneticas y una fuerza magnetica se puede utilizar

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para ayudar a la penetracion de la capa no miscible. Como alternativa, la solucion acuosa lleva una carga electrostatica y se puede usar un campo electrico aplicado externo para lograr la penetracion de la capa no miscible.

Sin embargo, en otro aspecto de la divulgacion, el tamano de la gota se vigila de forma continua o frecuente. Se apreciara que el tamano de la gota esta determinado por el volumen y por la tension superficial de la solucion. De acuerdo con ello, la perdida de volumen se puede detectar por una disminucion de la huella de la gota o el radio de la huella de las gotas. Por ejemplo, usando un sistema de seguimiento optico, a traves de un sistema de camara y lentes de microscopio, el tamano o la huella de la gota se pueden determinar y el volumen de la gota se puede calcular. En algunas realizaciones, el volumen de la gota o el radio de la gota se controlan cada segundo o cada milisegundo. Se apreciara que la magnitud de la velocidad de evaporacion del agua desde la gota de interes depende en parte de la temperatura y, por lo tanto, aumenta con temperaturas crecientes. Por ejemplo, durante la amplificacion mediante termociclado o durante la desnaturalizacion de los complejos de doble cadena, el aumento de la temperatura dara lugar a la rapida evaporacion de la gota. Por lo tanto, el volumen de la gota se puede controlar con mas frecuencia y el ajuste del volumen de la gota mediante rehidratacion sera mas frecuente. En el caso de la fluctuation de volumen, tal como la perdida de volumen, se pueden dispensar subpico o nanovolumenes de agua o de disolvente sobre la gota o la caracteristica discreta que comprende la gota. De este modo se pueden dispensar volumenes de agua o de disolvente de aproximadamente 0,5 pl, 1 pl, 10pl, de aproximadamente 100 pl, de aproximadamente 1 nl, de aproximadamente 10 nl, de aproximadamente 100 nl. Los volumenes de agua o de disolvente se pueden liberar por cualquier medio de liberation convencional, siempre que los volumenes sean controlados y precisos. En una realization preferida, el agua o el disolvente se dispensan utilizando un dispositivo de chorro de tinta. Por ejemplo, una impresora tipica de chorro de tinta es capaz de producir gotas de de 1,5 a 10 pl, mientras que otras tecnicas de dispensation ultrasonicas comerciales pueden producir gotas de 0,6 pl. En algunas realizaciones se anade agua en una serie rapida de gotas. En algunas realizaciones, el agua se dispensa cuando se registra una perdida de volumen de mas de 10 %, de mas de 25 %, de mas de 35 %, de mas de 50 %.

En otra realizacion, la velocidad de evaporacion se limita mediante el aumento de la tasa de vapor o la humedad que rodea la gota. Esto se puede realizar, por ejemplo, mediante la colocation de gotas "de sacrificio" alrededor o en las proximidades de la gota de interes (por ejemplo, la gota que comprende los oligonucleotidos) (vease, por ejemplo, Berthier E. et al., Lab Chip, 2008, 8(6):852-859). En algunas realizaciones, la superficie o el soporte solido estan encerrados en un recipiente cerrado para limitar la evaporacion.

Sin embargo, en otra realizacion, la velocidad de evaporacion puede limitarse mediante la adicion de un compuesto que tiene un componente de alto punto de ebullition a la o las gotas de interes, siempre que la presencia del compuesto no inhiba las reacciones enzimaticas realizadas sobre el sustrato. El punto de ebullicion de un liquido es la temperatura a la que las fases liquida y de vapor estan en equilibrio entre si a una presion especificada. Cuando se aplica calor a una solucion, la temperatura de la solucion se eleva hasta que la presion de vapor del liquido es igual a la presion de los gases circundantes. En este punto, se produce vaporization o evaporacion en la superficie de la solucion. Mediante la adicion de un liquido de alto punto de ebullicion a la gota de interes, la evaporacion del contenido de agua de una gota se puede reducir sustancialmente (vease la patente de Estados Unidos 6.177.558). En alguna realizacion, la solucion de alto punto de ebullicion es un disolvente. En algunas realizaciones, el liquido de alto punto de ebullicion tiene un punto de ebullicion de al menos 100 °C al menos 150 °C, al menos 200 °C. En algunas realizaciones, se anade glicerol a la solucion, lo que aumenta el punto de ebullicion. En consecuencia, la solucion que contiene el liquido de alto punto de ebullicion se evapora a una velocidad mucho mas lenta a temperatura ambiente o en condiciones de reaccion, tales como en condiciones de termociclado, extension, ligadura y desnaturalizacion.

Los aspectos de la divulgacion proporcionan metodos para la amplificacion de uno o mas oligonucleotidos de cadena simple sobre el soporte. Los oligonucleotidos se pueden amplificar antes o despues de haberse desprendido del soporte y/o de eluir en una gota. Preferiblemente, los oligonucleotidos se amplifican en el soporte solido. Un experto en la tecnica apreciara que los oligonucleotidos que se sintetizan sobre un soporte solido comprenderan un extremo 3' fosforilado o un nucleosido en el extremo 3' adicional (por ejemplo, T). Los oligonucleotidos fosforilados en 3' no son adecuados para el ensamblaje de polinucleotidos, ya que los oligonucleotidos no pueden ser extendidos por la polimerasa. En aspectos preferidos de la divulgacion, los oligonucleotidos se amplifican primero y los productos amplificados se ensamblan en un polinucleotido. Por consiguiente, un aspectos de la divulgacion proporciona metodos en los que un conjunto o subconjunto de oligonucleotidos, que se unen a un conjunto de subconjunto de caracteristicas del soporte, se amplifican mediante la liberacion local de submicrovolumenes a caracteristicas discretas direccionables. El termino "amplificacion" significa que el numero de copias de un fragmento de acido nucleico aumenta. Como se ha indicado anteriormente, los oligonucleotidos pueden sintetizarse primero en caracteristicas discretas de la superficie, se pueden depositar sobre el sustrato o se pueden depositar sobre el sustrato unido a las nanoparticulas. En una realizacion preferida, los oligonucleotidos se unen covalentemente a la superficie o a las nanoparticulas depositadas en la superficie. En una realizacion de ejemplo, las ubicaciones o caracteristicas que comprenden los oligonucleotidos a amplificar se seleccionan primero. En una realizacion preferida, las caracteristicas seleccionadas estan en estrecha proximidad entre si sobre el soporte. La solucion acuosa o disolvente se deposita despues sobre la caracteristica seleccionada, formando de esta manera una gota que comprende oligonucleotidos hidratados. Se apreciara que cada gota esta separada de la otra por la tension superficial. En alguna realizacion la solucion puede ser agua, tampon o una solucion que estimula las reacciones

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enzimaticas. En una realizacion ejemplar, la solucion incluye, pero no se limita a, una solucion que estimula la extension del cebador. Por ejemplo, la solucion puede estar compuesta por cebador(es) oligonucleotidos, nucleotidos (dNTP), tampon, polimerasa y cofactores. En otras formas de realizacion, la solucion es una solucion de desnaturalizacion alcalina. Sin embargo, en otras realizaciones, la solucion puede comprender oligonucleotidos tales como oligonucleotidos complementarios.

En algunas realizaciones, los oligonucleotidos o polinucleotidos se amplifican dentro de la gota mediante PCR en fase solida, eluyendo de ese modo las secuencias amplificadas en la gota. En otras realizaciones, los oligonucleotidos o polinucleotidos se separan primero del soporte solido y despues se amplifican. Por ejemplo, los oligonucleotidos unidos covalentemente se traducen en moleculas de ADN soportados en la superficie a traves de un proceso de escision gaseosa con gas de amina. Los oligonucleotidos pueden escindirse con amoniaco, u otras aminas, en la fase de gas mediante el cual el gas reactivo entra en contacto con el oligonucleotido mientras unido a, o en la proximidad de, el soporte solido (vease Boal et al, NAR, 1996 (24 (15):. 3115-7), las patentes de Estados Unidos n.° 5.514.789; 5.738.829 y 6.664.388)). En este proceso, el enlace covalente que une los oligonucleotidos al soporte solido se escinde mediante la exposition del soporte solido para el gas de amina a presion y/o temperatura elevadas. En algunas formas de realizacion, este proceso se puede utilizar para "adelgazar" la densidad de los oligonucleotidos en caracteristicas especificas. Un experto en la tecnica apreciara que las micromatrices de ADN puede tener una densidad muy alta de los oligonucleotidos en la superficie (aproximadamente 108 moleculas por caracteristica), que pueden generar impedimento esterico para las polimerasas necesarias para la PCR. Teoricamente, los oligonucleotidos estan generalmente separados por aproximadamente de 2 nm a aproximadamente 6 nm Para las polimerasas, una enzima tipica de 6 subunidades puede tener un diametro de aproximadamente 12 nm. Por lo tanto puede ser necesario tratar a medida el soporte para abordar la cuestion de la densidad de superficie, de forma que la separation de los oligonucleotidos unidos a la superficie pueda acomodar la dimension fisica de la enzima. Por ejemplo, un subconjunto de los oligonucleotidos puede escindirse quimicamente o enzimaticamente o eliminarse fisicamente de la micromatriz. Tambien se pueden utilizar Otros metodos para modificar los oligonucleotidos de manera que cuando los cebadores se aplican y se hibridan CON los oligonucleotidos, AL menos algunos grupos hidroxilo EN 3 'de los cebadores (inicio de la sintesis de ADN) son accesibles para la polimerasa. El numero de grupos hidroxilo en 3' accesibles por mancha puede ser estocastico o fijo. Por ejemplo, los cebadores, una vez hibridados, se pueden tratar para eliminar algunos grupos hidroxilo en 3' activos, dejando un numero estocastico de grupos hidroxilo en 3' activos que pueden ser objeto de reacciones de extension de cadena. En otro ejemplo, se puede usar una molecula enlazadora de gran tamano (por ejemplo, un concatemero) de tal manera que uno y solo un inicio de la sintesis esta disponible por mancha o en un subconjunto de los oligonucleotidos por mancha.

El termino "cebador" tal como se utiliza en el presente documento se refiere a un oligonucleotido, ya sea ARN o ADN, de cadena sencilla o de cadena doble, ya sea derivado de un sistema biologico, generado por digestion con enzimas de restriction, o producido sinteticamente que, cuando se coloca en el medio ambiente adecuado, es capaz de actuar funcionalmente como un iniciador de la sintesis de acido nucleico dependiente de molde. Cuando se presenta con un molde de acido nucleico adecuado, los precursores de nucleosidos trifosfato adecuados de acidos nucleicos, una enzima polimerasa, cofactores y condiciones adecuadas, tales como una temperatura y un pH adecuados, el cebador pueden extenderse en su extremo 3 ' por la adicion de nucleotidos mediante la action de una polimerasa o actividad similar para producir un producto de extension del cebador. El cebador puede variar en longitud dependiendo de las condiciones concretas y los requisitos de la aplicacion. Por ejemplo, en aplicaciones de diagnostico, el cebador oligonucleotidico tiene normalmente 15-25 o mas nucleotidos de longitud. El cebador debe ser de complementariedad suficiente con el molde deseado para cebar la sintesis del producto de extension deseado, es decir, ser capaz de hibridar con la cadena molde deseada de forma suficiente para proporcionar el resto hidroxilo en 3' del cebador en yuxtaposicion adecuada para su uso en la initiation de la sintesis por una polimerasa o una enzima similar. No es necesario que la secuencia del cebador represente un complemento exacto del molde deseado. Por ejemplo, una secuencia de nucleotidos no complementaria puede estar unida al extremo 5' de un cebador de otra manera complementario. Como alternativa, las bases no complementarias pueden estar intercaladas dentro de la secuencia del cebador de oligonucleotido, siempre que la secuencia del cebador tenga suficiente complementariedad con la secuencia de la cadena molde deseada para proporcionar funcionalmente un complejo molde-cebador para la sintesis del producto de extension.

De acuerdo con aspectos de la divulgation, los oligonucleotidos hidratados se pueden amplificar dentro de la gota, la gota que actua como una camara de reaction virtual. En algunas realizaciones, todo el soporte o matriz que contiene las caracteristicas discretas se somete a amplification. En otras realizaciones, una o mas caracteristicas discretas seleccionadas se someten a la amplificacion.

La amplificacion de caracteristicas independientes seleccionadas (estando separadas entre si) se puede realizar calentando localmente al menos una caracteristica discreta. Las caracteristicas discretas pueden calentarse localmente por cualquier medio conocido en la tecnica. Por ejemplo, las caracteristicas discretas se pueden calentar localmente utilizando una fuente laser de energia que puede controlarse en una dimension x-y precisa, de modo que modula individualmente la temperatura de una gota. En otro ejemplo, la combination de un laser de haz mas amplio con una mascara puede usarse para irradiar caracteristicas especificas. En algunas realizaciones, se proporcionan metodos para controlar la temperatura en el soporte de modo que las reacciones enzimaticas pueden tener lugar en

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un soporte (PCR, ligadura o cualquier otra reaccion sensible a la temperatura). En algunas realizaciones se usa un laser de barrido para controlar el termociclado en caracteristicas distintas en el soporte solido. La longitud de onda utilizada puede elegirse de un espectro amplio (de 100 nm a 100.000 nm, es decir, desde el ultravioleta al infrarrojo). En algunas realizaciones, la funcion sobre la que se aplica la mancha de la gota comprende un absorbente o indicador optico. En alguna otra realization, el material absorbente optico se puede anadir a la superficie de la gota. En algunas realizaciones, el soporte solido se enfria mediante circulation de aire o liquido. La energia que se depositara se puede calcular basandose en el comportamiento de la absorbancia. En algunas realizaciones, la temperatura de la gota puede modelarse utilizando termodinamica. La temperatura se puede medir mediante un material de tipo LCD o cualquier otra tecnologia in situ. En otra realizacion mas, todo el soporte puede calentarse y enfriarse para permitir que se produzcan las reacciones enzimaticas. Un metodo para controlar la temperatura de las gotas de la superficie es mediante el uso de una configuration de deposito de energia optica de barrido. Una fuente de energia puede dirigirse mediante una configuracion de barrido para depositar energia en varios lugares en la superficie del soporte solido que comprende moleculas unidas o fijadas. El material absorbente optico se puede anadir en la superficie del soporte solido o en la superficie de la gota. Puede usarse una fuente de energia optica, tal como una lampara de alta intensidad, laser, u otra fuente de energia electromagnetica (incluyendo microondas). La temperatura de los diferentes sitios de reaccion puede controlarse de forma independiente mediante el control de la energia depositada en cada una de las caracteristicas.

Por ejemplo, se puede usar un dispositivo digital de microespejos (DMD) para el control de la temperatura. El DMD es un semiconductor optico. Vease, por ejemplo, la patente de Estados Unidos n.° 7.498.176. En algunas realizaciones, se puede usar un DMD para calentar precisamente caracteristicas o gotas seleccionadas en el soporte solido. El DMD puede ser un chip que tiene en su superficie varios cientos de miles de espejos microscopicos dispuestos en una matriz rectangular que corresponden a las caracteristicas o gotas que se van a calentar. Los espejos se pueden girar de forma individual (por ejemplo, ± 10-12°), a un estado activado o desactivado. En el estado activado, la luz de una fuente de luz (por ejemplo, una bombilla) se refleja sobre el soporte solido para calentar las manchas o gotas seleccionadas. En el estado desactivado, la luz esta dirigida en otro lugar (por ejemplo, sobre un disipador de calor). En un ejemplo, la DMD puede consistir en una matriz de 1024 * 768 de microespejos de 16 |jm de ancho. Estos espejos pueden abordarse individualmente y se pueden utilizar para crear cualquier patron o disposition dada en el calentamiento de diferentes caracteristicas en el soporte solido. Las caracteristicas tambien se pueden calentar a diferentes temperaturas, por ejemplo, proporcionando una longitud de onda diferente para manchas individuales, y/o controlando el tiempo de irradiation.

Se apreciara que la amplification se produce unicamente en las caracteristicas que comprenden oligonucleotidos molde hidratados (es decir, amplificacion local en las caracteristicas que comprenden una gota). Un conjunto diferente de caracteristicas se puede amplificar de forma paralela o secuencial con rondas paralelas o secuenciales de hidratacion (es decir, dispensation de una gota en una caracteristica especifica), amplificando oligonucleotidos y secando el conjunto de caracteristicas. En algunas realizaciones, el soporte se seca mediante evaporation del liquido al vacio mientras se calienta. Por lo tanto, despues de cada ronda de amplificacion, el soporte comprendera un conjunto de gotas que contienen oligonucleotidos duplex. Los oligonucleotidos complementarios pueden liberarse en solution dentro de la gota y recogerse. Como alternativa, los oligonucleotidos complementarios se pueden secar sobre las caracteristicas discretas para el almacenamiento o procesamiento adicional. Sin embargo, los oligonucleotidos complementarios se pueden someter a otras reacciones tales como filtracion de errores o ensamblaje. En algunas realizaciones, un conjunto o subconjunto diferente de caracteristicas puede hidratarse y un conjunto o subconjunto diferente de oligonucleotidos molde puede amplificarse tal como se describe en el presente documento. Por ejemplo, se puede dispensar una gota (por ejemplo, mediante chorro de tinta) sobre un soporte. La gota puede contener diversos reactivos, tales como enzimas, tampones, dNTP, cebadores, etc. La gota cubre una caracteristica discreta (una caracteristica corresponde a una secuencia predefinida) sobre el soporte. PCR puede llevarse a cabo para sintetizar oligonucleotidos complementarios a los oligonucleotidos molde que se unen a la caracteristica. En el caso de la amplificacion enzimatica, la solucion incluye, pero no se limita a, cebadores, nucleotidos, tampones, cofactores y enzimas. Por ejemplo, una reaccion de amplificacion incluye ADN polimerasa, nucleotidos (por ejemplo, dATP, dCTP, dTTP, dGTP), cebadores y tampon.

En algunas realizaciones, los oligonucleotidos pueden comprender sitios de union para el cebador universales (comunes a todos los oligonucleotidos), semiuniversales (comunes a al menos una parte de los oligonucleotidos) o individuales o unicos (especificos para cada oligonucleotido) en cualquiera de los extremos 5' o 3' o en ambos. Tal como se utiliza en el presente documento, el termino sitio de union al cebador o cebador "universal" significa que una secuencia usada para amplificar el oligonucleotido es comun a todos los oligonucleotidos de forma que dichos oligonucleotidos se pueden amplificar utilizando un unico conjunto de cebadores universales. En otras circunstancias, un oligonucleotido contiene un sitio de union al cebador unico. Tal como se utiliza en el presente documento, el termino "sitio de union al cebador unico" se refiere a un conjunto de secuencias de reconocimiento de cebadores que amplifica selectivamente un subconjunto de oligonucleotidos. En otras circunstancias, un oligonucleotido contiene secuencias de amplificacion tanto universales como unicas, que opcionalmente se pueden utilizar de forma secuencial.

En algunas realizaciones, el sitio de union al cebador/cebadores puede estar disenado para ser temporal. Por ejemplo, los cebadores temporales pueden eliminarse mediante escision quimica, basada en luz o enzimatica. Por

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ejemplo, sitios de union al cebadores/cebadores pueden disenarse para incluir un sitio de escision de endonucleasa de restriccion. En una realization de ejemplo, un sitio de union al cebador/cebador contiene un sitio de union y/o de escision de un tipo de endonucleasa de restriccion. En tal caso, las secuencias de amplification pueden disenarse de manera que una vez que un conjunto deseado de oligonucleotidos se amplifica hasta una cantidad suficiente, se puede escindir mediante el uso de una enzima de restriccion de tipo IIs adecuada que reconoce una secuencia de enzima de restriccion de tipo IIs interna del oligonucleotido. En algunas realizaciones, despues de la amplificacion, el conjunto de los acidos nucleicos puede ponerse en contacto con una o mas endonucleasas para producir roturas de la doble cadena, lo que elimina los sitios de union al cebador/cebadores. En ciertas realizaciones, la cebadores directos e inversos pueden eliminarse mediante las mismas endonucleasas de restriccion o diferentes. Se puede usar cualquier tipo de endonucleasa de restriccion para eliminar los sitios de union al cebador/cebadores de secuencias de acido nucleico. Una amplia variedad de endonucleasas de restriccion que tienen sitios de union y/o escision especificos estan disponibles comercialmente, por ejemplo, de New England Biolabs (Beverly, Mass.). En diversas realizaciones se pueden usar endonucleasas de restriccion que producen salientes en 3', salientes en 5' o extremos romos. Cuando se utiliza una endonucleasa de restriccion que produce un saliente, se puede usar una exonucleasa (por ejemplo, RecJf, Exonucleasa I, Exonucleasa T, Si nucleasa, Pi nucleasa, nucleasa de judia mungo, ADN polimerasa de T4, nucleasa de CEL I, etc.) para producir extremos romos. Como alternativa, los extremos cohesivos formados por la endonucleasa de restriccion especifica se pueden usar para facilitar el ensamblaje de los subconjuntos en una disposition deseada. En una realizacion de ejemplo, un sitio de union al cebador/cebador que contiene un sitio de union y/o de escision de un tipo de endonucleasa de restriccion se puede usar para eliminar el cebador temporal. El termino "endonucleasa de restriccion de tipo IIs" se refiere a una endonucleasa de restriccion que tiene una secuencia de reconocimiento no palindromica y un sitio de escision que se produce fuera del sitio de reconocimiento (por ejemplo, de 0 a aproximadamente 20 nucleotidos distales al sitio de reconocimiento). Las endonucleasas de restriccion de tipo IIs pueden crear una muesca en una molecula de acido nucleico de cadena doble o pueden crear una rotura de doble cadena que produce extremos romos o cohesivos (por ejemplo, salientes en 5 'o 3'). Los ejemplos de endonucleasas de tipo IIS incluyen, por ejemplo, enzimas que producen un saliente en 3', tales como, por ejemplo, Bsr I, Bsm I, BstF5 I, BsrD I, Bts I, Mnl I, BciV I, Hph I, Mbo II, Eci I, Acu I, Bpm I, Mme I, BsaX I, Bcg I, Bae I, Bfi I, TspDT I, TspGW I, Taq II, Eco57 I, Eco57M I, Gsu I, Ppi I, y Psr I; enzimas que producen un saliente en 5' tal como, por ejemplo, BsmA I, Ple I, Fau I, Sap I, BspM I, SfaN I, Hga I, Bvb I, Fok I, BceA I, BsmF I, Ksp632 I, Eco31 I, Esp3 I, Aar I; y enzimas que producen un extremo romo, tal como, por ejemplo, endonucleasas de tipo IIs Mly I y Btr I, estan disponibles comercialmente y son bien conocidos en la tecnica (New England Biolabs, Beverly, Mass.).

En algunas realizaciones, el cebador es un cebador que contiene uracilo multiple (U). El cebador se hibrida primero con un oligonucleotido monocatenario unido al soporte y se extiende con la adicion de dNTP y una polimerasa apropiada y en condiciones y temperatura apropiadas. En una etapa posterior, se retira el cebador. En algunas realizaciones, se puede usar la uracilo ADN glicosilasa (UDG) para hidrolizar un enlace uracil-glicosidico en un acido nucleico, eliminando de este modo el uracilo y creando un sitio basico sensible a alcali en el ADN que pueden hidrolizase despues mediante tratamiento con endonucleasa, calor o alcali. Como resultado, puede eliminarse una portion de una cadena de un acido nucleico biicatenario, exponiendo de este modo la secuencia complementaria en la forma de un saliente monocatenario. Este enfoque requiere la incorporation deliberada de una o mas bases de uracilo en una cadena de un fragmento de acido nucleico de doble cadena. Esto puede conseguirse, por ejemplo, mediante la amplificacion de un fragmento de acido nucleico usando un cebador de amplificacion que contiene uracilo terminal en 3'. Despues del tratamiento con UDG, la region del cebador 5' del uracilo puede liberarse (por ejemplo, despues de la dilution incubation, exposition a condiciones desnaturalizantes suaves, etc.), exponiendo de este modo la secuencia complementaria como un saliente monocatenario. Se debe apreciar que la longitud del saliente puede venir determinada por la position del uracilo en el cebador de amplificacion y por la longitud del cebador de amplificacion. En algunas realizaciones, se usa la mezcla de uracilo ADNA glicosilasa (UDG) y endonucleasa de ADN glicosilasa-liasa VIII, tales como USER™ (reactivo de escision especifico de uracilo). La UDG cataliza la escision de una base uracilo, formando un sitio abasico, dejando intacto el esqueleto de fosfodiester. La actividad liasa de la endonucleasa VIII rompe el esqueleto de fosfodiester en los extremos 3' y 5' lados del sitio abasico de modo que se libera la desoxirribosa libre de base.

Despues de la amplificacion, la polimerasa puede desactivarse para evitar la interferencia con las etapas siguientes. Una etapa de calentamiento (por ejemplo, de temperatura alta) puede desnaturalizar y desactivar la mayoria de las enzimas que no son termicamente estables. Las enzimas pueden desactivarse en presencia (por ejemplo, dentro de la gota) o en ausencia de liquido (por ejemplo, matriz seca). La desactivacion con calor sobre un soporte seco tiene la ventaja para desactivar las enzimas sin ningun efecto perjudicial sobre los oligonucleotidos. En algunas realizaciones, se puede usar una version no termoestable de la ADN polimerasa para PCR termicamente estable, aunque la enzima esta menos optimizada para la tasa de error y la velocidad. Alternativamente, se puede usar epoxi dATp para inactivar la enzima.

En algunas realizaciones, las caracteristicas discretas pueden contener oligonucleotidos que son sustancialmente complementarios (por ejemplo 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o 100 %). Los oligonucleotidos molde pueden tener errores inherentes, ya que generalmente se sintetizan quimicamente (por ejemplo, deleciones a una velocidad de 1 en 100 bases y apareamientos erroneos e inserciones en aproximadamente 1 de cada 400 bases). Suponiendo una tasa de error promedio de 1 en 300 bases y un tamano medio del oligonucleotido molde de

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70 bases, cada 1 de 4 oligonucleotidos molde contendran un error en comparacion con una secuencia de referencia (por ejemplo, la secuencia de tipo silvestre de un gen de interes). Por ejemplo, un oligonucleotido molde puede contener un error que puede ser un apareamiento erroneo, delecion o insercion. En la smtesis por PCR, el error se mantiene en el oligonucleotido sintetizado. Durante las reacciones de PCR se pueden introducir errores adicionales. En consecuencia, se necesitan metodos para la correction de errores para la sintesis/ensamblaje de genes de alta fidelidad.

En consecuencia, algunos aspectos de la divulgation estan relacionados con el reconocimiento y la elimination local de oligonucleotidos bicatenarios que contienen errores de apareamiento erroneo en la secuencia en caracteristicas especificas. En una realization preferida, el reconocimiento de apareamientos erroneos se puede utilizar para controlar los errores generados durante la sintesis de oligonucleotidos, el ensamblaje de genes, y la construction de polinucleotidos mas largos. Despues de la amplification, la totalidad de las caracteristicas o un conjunto de las caracteristicas que comprenden duplex de oligonucleotidos se someten primero a ronda(s) de fusion e hibridacion como se ha descrito anteriormente. En un aspecto preferido de la divulgacion, los oligonucleotidos que tienen secuencias predefinidas se ensamblan despues amplificarse y filtrarse los errores. En algunas realizaciones, dos gotas adyacentes que contienen dos copias multiples de diferentes oligonucleotidos o polinucleotidos en solution se combinan mediante la fusion de gotas adecuadas en el soporte solido. El soporte solido comprende moleculas diferentes y unicas soportadas o unidos a la superficie, una unica molecula soportada o fijada a la superficie en multiples posiciones, otras moleculas unicas soportadas o unidas a la superficie. En la superficie del soporte solido se puede encontrar un patron existente de moleculas. Diferentes moleculas u oligonucleotidos pueden existir en diferentes posiciones. Sa apreciara que la disposition de estas moleculas unicas puede disenarse para permitir estrategicamente la posterior combination de los contenidos de estos sitios. Por ejemplo, estas moleculas unicas pueden estar dispuestas en un patron de tablero de ajedrez.

Un aspecto de la divulgacion se refiere tambien a metodos para mezclar moleculas dentro de una o mas caracteristicas de una biblioteca de diversidad alta en un soporte solido. Se pueden usar varios metodos de fluidos para lograr el barajado. En algunas realizaciones, el barajado se puede realizar con microvolumenes depositados o sin microvolumenes. Por ejemplo, con referencia a la figura 5, el barajado se puede implementar en microvolumenes individuales (502) creadas en la deposition de uno o mas fluidos. Los miembros de la biblioteca de alta diversidad (504) se pueden inmovilizar en una superficie (501). El barajado se puede lograr por calentamiento y enfriamiento de los microvolumenes (502), provocando la fusion localizada y la renaturalizacion en cada ubicacion en la que se encuentra un miembro de la biblioteca (Figura 5A). Estos microvolumenes se pueden crear de una manera en serie, como se ilustra en la Figura 5B, que muestra un proceso que progresa de derecha a izquierda. Para cada miembro de la biblioteca, primero se deposita un liquido adecuado para la reaction de barajado (505), lo que da lugar a microvolumenes (502); despues del deposito de (505), un segundo fluido (506) que es inmiscible a (505) se deposita sobre los microvolumenes (502), formando una manta (503) a traves de los microvolumenes (502). Este proceso puede llevarse a cabo hasta que todos los miembros deseables de la biblioteca de alta diversidad (504) estan cubiertos por microvolumen (502) y/o una manta (503).

En otro ejemplo, las propiedades de la superficie del sustrato (501) pueden usarse para conseguir la estructura de la figura 5A a escala global. Como se ilustra en la Figura 5C, el sustrato (501) se inicia completamente sumergido en un fluido (511) contenido en un recipiente (510), de manera que todos los miembros de la biblioteca de alta diversidad estan en contacto con el fluido (511), como se muestra en la figura 5C1. liquido (511) es tal que tiene un angulo de contacto bajo con la superficie del sustrato, en la que los miembros de la biblioteca residen. Se anade un segundo fluido (512) al recipiente (510) que es inmiscible con el primer fluido (511), formando una interfaz (513). El segundo fluido (512) es tal que tiene un angulo de contacto diferente (preferentemente mayor) con la superficie del sustrato, en la que residen los miembros de la biblioteca. Sin embargo, entre los miembros de la biblioteca, el segundo fluido (512) puede tener un angulo de contacto inferior con la superficie. Cuando el sustrato se mueve desde totalmente inmerso en (511) a traves de la interfaz (513), los pequenos volumenes del primer fluido (511) se retienen en la superficie del sustrato (510) en la que residen los miembros de la biblioteca de alta diversidad, formando microvolumenes (504). Ademas, una vez que la superficie pasa la interfaz (513), los microvolumenes estan cubiertos por una manta formada por fluido (512). La estructura resultante de las microvolumenes se muestra en la figura 5C2.

El proceso ilustrado en la Figura 5C se puede llevar a cabo sin el recipiente (510) mediante el uso de una disposicion que se muestra en la Figura 5D. Dos cabezas capilares de menisco (520, 512) se bajan hasta casi contactar con el substrato (501). Los fluidos (511) y (512) se suministran a las cabezas capilares del menisco (520, 521) para formar un pequeno volumen (522, 523) que entra en contacto con las cabezas capilares del menisco (520, 521) y el sustrato (501). El movimiento relativo de las cabezas y el sustrato se muestra en la direction de la flecha. Los volumenes (522, 523) pueden colocarse lo suficientemente cerca para formar una interfaz, o separados lo suficiente como para formar un espacio entre los volumenes. Se crean microvolumenes a medida que los miembros de la biblioteca (504) pasan primero por debajo del menisco del fluido de reaccion (522), el menisco del fluido de la manta (523), lo que da lugar a las caracteristicas encapsuladas como se muestra en la Figura 5a.

El barajado tambien puede lograrse sin microvolumenes. En un ejemplo, como se indica en la Figura 6, el control preciso de cortos periodos de tiempo durante el cual la temperatura del sustrato (601) y el liquido (600) se eleva

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para provocar fusion se utiliza para lograr la fusion localizada y renaturalizacion a traves del limite de difusion. La Figura 6A1 muestra el ajuste antes de la fusion, en la que los homoduplex (602, 603) se unen a la superficie a traves de union covalente de la cadena molde. Cuando la temperatura se eleva por encima de la temperatura de fusion de los homoduplex, la fusion se lleva a cabo y las copias de una sola hebra (604, 605) se liberan en el fluido (600). La figura 6B1 muestra la fusion en un momento inmediatamente despues de que la temperatura aumente, y la Figura 6C1 muestra el punto de fusion en un momento posterior al de la figura 6B1, y la Figura 6D1 muestra la fusion en un momento posterior al de la figura 6C1. Las copias de una sola cadena fundidas (604, 605) se difunden fuera de su lugar de origen y la difusion se rige por la ecuacion de difusion. Con las Figuras 6A2, 6B2, 6C2 y 6D2 se pretende ilustrar el proceso de difusion a medida que el tiempo progresa mostrando la concentracion de los duplex (por ejemplo, intensidad de la senal) en dos posiciones adyacentes sobre el sustrato (601). Cuanto mas tiempo se deja para la difusion, mas moleculas viajaran. La distancia de difusion (Ld) caracteristica esta relacionada con el coeficiente de difusion (D) y el tiempo (t):

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El tiempo que se permite para la difusion puede controlarse y, por lo tanto, la distancia de difusion caracteristica se puede controlar tambien, ya que el coeficiente de difusion esta determinado por la especie molecular. Como se muestra en la Figura 6E, cuando se induce la renaturalizacion (mediante la reduccion de la temperatura) despues de un breve periodo de tiempo de fusion, los heteroduplex renaturalzados se recuperan de nuevo a las posiciones originales (606, 607), con lo se consigue una operacion de barajado. Si se permite que el tiempo de fusion proceda durante mas tiempo, mas moleculas (608) se difundiran en la masa del fluido (600) y sera menos probable que se recapturen de nuevo a la posicion original.

En algunas realizaciones, el barajado se puede lograr con una gota que se esta evaporando activamente. En el ejemplo mostrado en la Figura 7, la superficie (701) se eleva primero a una temperatura por encima de la temperatura de fusion de los homoduplex formados por el molde (702) y copias (703). Un volumen (704) se deposita para cubrir los homoduplex, y puesto que la superficie ya esta a la temperatura de fusion elevada, se funden las copias (706) en el liquido (705) que cuyo volumen se esta reduciendo rapidamente debido a la evaporacion. La gota se deja secar completamente depositando las copias (707) sobre la superficie. Despues, el sustrato se enfria hasta por debajo de la temperatura de fusion de la poblacion en particular, y se rehidrata para resuspender las copias (707) en el volumen de fluido (708). La posterior renaturalizacion de las copias (707) en los moldes (702) da como resultado un grupo heteroduplex barajado, completando la operacion de barajado.

Despues de la fusion y renaturalizacion, los heteroduplex pueden eliminarse mediante diversos metodos descritos anteriormente. Despues, los duplex restantes pueden ser objeto de fusion de nuevo para desnaturalizar todos o algunos de los duplex. En algunas realizaciones, algunos duplex (por ejemplo, los duplex escindidos o truncados) se funden selectivamente, dejando a los demas (por ejemplo, los duplex de longitud completa) intactos. Las condiciones para esta fusion estricta (por ejemplo, una temperatura de fusion precisa) se pueden determinar mediante la observacion de una curva de fusion en tiempo real. En un analisis de la curva de fusion a modo de ejemplo, los productos de la PCR se calientan lentamente en presencia de colorantes fluorescentes especificos de ADN de doble cadena (ADNdc) (por ejemplo, SYBR Green, LCGreen, SYTO9 o EvaGreen). Con el aumento de temperatura, el ADNdc se desnaturaliza (funde), liberando el colorante fluorescente con una disminucion resultante de la senal fluorescente. La temperatura a la que se funde el ADNdc se determina mediante factores tales como la secuencia de nucleotidos, la longitud del ADN y la relacion GC/AT. Normalmente, se estima que los pares de bases G-C en un duplex contribuyen en aproximadamente 3 °C. a la Tm, mientras que se estima los pares de bases A-T contribuyen aproximadamente 2 °C., hasta un maximo teorico de aproximadamente 80 a 100 °C. Sin embargo, se dispone de modelos mas sofisticados de Tm y pueden ser en los que se tienen en cuenta las interacciones G-C de apilamiento, los efectos del disolvente, la temperatura de ensayo deseada y similares. El analisis de las curvas de fusion puede detectar una unica diferencia de base. Pueden usarse varios metodos para el control preciso de la temperatura en las caracteristicas individuales, como se ha descrito anteriormente.

Algunos aspectos de la divulgacion se refieren a la seleccion de destino y el enrutamiento de los volumenes aislados y, por lo tanto, para el control de la ubicacion o la huella de los volumenes fusionados. Se apreciara que a medida que las regiones individuales del soporte son direccionables, los volumenes aislados individuales, tales como las gotas, pueden controlarse individualmente. En algunas realizaciones, es preferible colocar volumenes aislados en regiones o caracteristicas adyacentes para permitir la fusion de los volumenes. Sin embargo, en otras realizaciones, los volumenes aislados estan dirigidos o enviados a un destino seleccionado. En algunas realizaciones, el sustrato del soporte es sustancialmente plano y las gotas se dirigen mediante una trayectoria de dos dimensiones (por ejemplo ejes x, y). Se puede mover a las gotas para llevarlas a lugares seleccionados para su posterior procesamiento, para fusionar con un segundo volumen aislado en una gota de secunda etapa en lugares preseleccionados y/o durante el transporte, para eliminar algunos reactivos de la gota denominado proceso de “lavado durante el transporte", tal como se describe en el presente documento), etc.

En algunas realizaciones, el conjunto jerarquico y/o secuencial escalonado se puede utilizar para ensamblar oligonucleotidos y polinucleotidos mas largos. En una realizacion preferida, los metodos utilizan ensamblaje jerarquico de dos o mas oligonucleotidos o dos o mas fragmentos de polinucleotidos de subensamblaje a la vez. La

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gotas vecinas pueden manipularse (mover y/o combinar, como se ha descrito anteriormente) para fusionar siguiendo una estrategia jerarquica, mejorando de este modo la eficiencia del ensamblaje. En algunas realizaciones, cada gota contiene oligonucleotidos con secuencias de acido nucleico predefinidas y diferentes. En algunas realizaciones, dos gotas se mueven siguiendo un camino predefinido hasta una posicion libre de oligonucleotido. En una realization preferida, las moleculas de ensamblaje (por ejemplo oligonucleotidos) estan previamente dispuestas sobre la superficie del soporte en caracteristicas discretas predeterminadas. Debe apreciarse que los volumenes aislados se pueden dirigir independientemente de una manera secuencial o altamente paralela. Las gotas pueden ser dirigidas utilizando tecnicas basadas en electrohumectacion (vease, por ejemplo, la patente de Estados Unidos n.° 6.911.132 y la solicitud de patente de Estados Unidos n.° 2006/0054503). El principio de electrohumectacion se basa en la manipulation de gotas sobre una superficie que comprende una matriz de electrodos y el uso de tension para cambiar la tension interfacial. En algunas realizaciones, las gotas se mueven usando un gradiente de humectabilidad. Se ha demostrado que las gotas colocadas en las superficies del gradiente de humectabilidad normalmente se mueven en la direction de aumentar la capacidad de humectacion (vease Zielke y Szymczyk, Eur. Phys. J. J. Special Topics, 166, 155-158 (2009)).)). En otras realizaciones, las gotas se pueden mover usando un gradiente termico. Cuando se colocan en un gradiente termico, las gotas se mueven desde ubicaciones de mayor temperatura hacia las ubicaciones de temperatura mas baja. El movimiento de las gotas utilizando electrohumectacion, gradientes de temperatura y gradientes de humectabilidad depende del liquido (por ejemplo, concentration de soluto acuoso, no acuoso), el tamano de las gotas y/o la inclination del gradiente.

Otro de los beneficios de la operation de movimiento descrita en el presente documento es la implementation de una operacion de "lavado". El movimiento del liquido lejos de una caracteristica de la superficie permite la separation de las moleculas unidas a la superficie (por ejemplo, oligonucleotidos) de las moleculas en solution. Por lo tanto, se implementa una operacion de lavado. Por ejemplo, el transporte durante el lavado se puede utilizar para eliminar los oligonucleotidos molde forman los oligonucleotidos complementarios despues de la amplification. En algunas realizaciones, las caracteristicas del “transporte durante el lavado" o la aplicacion de manchas del lavado pueden colocarse junto a las caracteristicas cuando se produce el procesamiento del oligonucleotido. Las manchas de lavado se pueden colocar adyacentes a las caracteristicas. Los productos indeseados liberados en la solucion de gotas en las caracteristicas se pueden mover a las manchas de lavado, respectivamente. En algunas realizaciones, el soporte proporciona una mancha de lavado por cada operacion de ensamblaje o una manca de lavado comun para dos o mas operaciones de ensamblaje. El proceso del transporte en lavado tambien se puede utilizar para eliminar los oligonucleotidos que contienen errores no deseados de duplex estables despues de la hibridacion y de fusion estricta. Por ejemplo, las caracteristicas de fusion rigurosas se pueden colocar a lo largo del camino de la progresion de ensamblaje, lo que permite una correction de errores de fusion rigurosa, como se ha descrito anteriormente. Del mismo modo, el soporte puede comprender una mancha SM para cada etapa de ensamblaje o una mancha SM comun para dos o mas operaciones de ensamblaje.

En algunas realizaciones, el contenido de dos microvolumenes tales como gotas se combina para permitir el ensamblaje de polinucleotidos. Por ejemplo, dos gotas de la primera etapa se pueden combinar formando una gota de segunda etapa mas grande. En algunas realizaciones, se anaden gotas "de fusion" o gotas "ancla" que pueden contener o no contener la enzima (por ejemplo, polimerasa, ligasa, etc.), los oligonucleotidos adicionales y todos los reactivos para permitir el ensamblaje por PCR o por ligadura (enzimatica o quimica) o mediante una combination de la reaction enzimatica. Por ejemplo, los oligonucleotidos en una gota dada pueden hibridar entre si y pueden ensamblarse mediante PCR o ligadura. Las gotas fusionadas o gotas de segunda etapa contienen subconjuntos de polinucleotidos y se pueden fusionar posteriormente para formar gotas mas grandes o gotas tercera etapa que contienen fragmentos mas grandes. Tal como se utiliza en el presente documento, el termino subconjunto se refiere a una molecula de acido nucleico que se ha ensamblado a partir de un conjunto de oligonucleotidos. Preferiblemente, un subconjunto es al menos 2 veces mas largo que los oligonucleotidos. Por ejemplo, un subconjunto puede ser de aproximadamente 100, 200, 300, 400, 500, 600, o mas bases de longitud. Debe apreciarse que el uso de gotas como volumen de reaccion aislado permite un sistema altamente paralelo. En algunas realizaciones, al menos 100, al menos 1.000 reacciones pueden tener lugar en paralelo. En algunas realizaciones, los cebadores se inmovilizan sobre el soporte en las proximidades de las manchas que contienen los oligonucleotidos para ensamblar. En algunas realizaciones, los cebadores se escinden in situ. En algunas realizaciones, los cebadores estan soportados sobre el soporte solido. Despues, los cebadores pueden escindirse in situ y se eluyen dentro de una gota que posteriormente se fusiona con una gota que contiene oligonucleotidos eluidos o en un soporte solido.

En ciertas realizaciones, los oligonucleotidos estan disenados para proporcionar las cadenas de sentido completo (cadena positiva) y antisentido (cadena menos) de la construction de polinucleotido. Despues de la hibridacion de los oligonucleotidos de cadenas mas y menos, dos oligonucleotidos bicatenarios se someten a ligadura con el fin de formar un primer producto de subensamblaje. Los productos de subensamblaje se someten despues a la ligadura para formar un acido nucleico mas grande o la secuencia de acido nucleico completa.

Las tecnicas de ensamblaje a base de ligasa pueden implicar uno o mas enzimas ligasa adecuadas que pueden catalizar la union covalente de los extremos 3 'y 5' adyacentes del acido nucleico (por ejemplo, un fosfato en 5' y un hidroxilo en 3' del o los acidos nucleicos en una acido nucleico molde complementario de forma que el extremo 3' esta inmediatamente adyacente al extremo 5'). En consecuencia, una ligasa puede catalizar una reaccion de

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ligadura entre el fosfato en 5' de un primer acido nucleico al hidroxilo del extremo 3' de un segundo acido nucleico si el primero y el segundo acidos nucleicos se hibridan uno al lado del otro en un acido nucleico molde). Una ligasa se puede obtener a partir de fuentes recombinantes o naturales. Una ligasa puede ser una ligasa termoestable. En algunas realizaciones, puede usarse una ligasa termoestable de un organismo termofilo. Ejemplos de ADN ligasas termoestables incluyen, pero no se limitan a: Tth ADN ligasa (de Thermus thermophilus, disponible de, por ejemplo, Eurogentec y GeneCraft); ADN ligasa de Pfu (una ligasa hipertermofila de Pyrococcus furiosus); Taq ligasa (de Thermus aquaticus), cualquier otra ligasa termoestable adecuada, o cualquier combinacion de las mismas. En algunas realizaciones, una o mas ligasas de temperatura menor pueden ser utiles (por ejemplo, ADN ligasa de T4). Una ligasa de temperatura mas baja puede ser util para salientes mas cortos (por ejemplo, salientes de aproximadamente 3, aproximadamente 4, aproximadamente 5, o aproximadamente 6 bases) que pueden no ser estables a temperaturas mas altas.

Se pueden usar tecnicas no enzimaticas para ligar los acidos nucleicos. Por ejemplo, un extremo 5' (por ejemplo, el grupo fosfato del extremo 5') y un extremo 3' (por ejemplo, el hidroxilo del extremo 3') de uno o mas acidos nucleicos pueden estar unidos covalentemente entre si sin necesidad de utilizar enzimas (por ejemplo, sin necesidad de utilizar una ligasa). En algunas realizaciones, las tecnicas no enzimaticas pueden ofrecer ciertas ventajas sobre las uniones mediante enzimas. Por ejemplo, las tecnicas no enzimaticas pueden tener una alta tolerancia de analogos de nucleotidos no naturales en sustratos de acido nucleico, pueden usarse para unir sustratos de acidos nucleicos cortos, pueden usarse para unir sustratos de ARN, y/o pueden ser mas baratas y/o mas adecuadas para ciertas aplicaciones automatizadas (por ejemplo, de alto rendimiento).

La ligadura no enzimatica puede implicar una ligadura quimica. En algunas realizaciones, los extremos de acido nucleico de dos o mas acidos nucleicos diferentes pueden unirse quimicamente. En algunas realizaciones, los extremos de acido nucleico de un unico acido nucleico pueden unirse quimicamente(por ejemplo, para circularizar el acido nucleico). Se debe apreciar que las dos cadenas en una primera terminal de acido nucleico de doble cadena se pueden ligar quimicamente a ambas cadenas en un segundo terminal de acido nucleico de doble cadena. Sin embargo, en algunas formas de realizacion solamente una hebra de un primera terminal de acido nucleico se puede ligar quimicamente a un solo filamento de un segundo terminal del acido nucleico. Por ejemplo, el extremo 5 'de una hebra de un primera terminal de acido nucleico se puede ligar a el extremo 3' de una cadena de un segundo terminal de acido nucleico sin los extremos de las hebras complementarias que quimicamente se ligaron.

En consecuencia, se puede usar una ligadura quimica para formar un enlace covalente entre un extremo 5' de un primer acido nucleico y un extremo 3' de un segundo acido nucleico, en el que los extremos de los acidos nucleicos primero y segundo pueden ser extremos de un solo acido nucleico o extremos de acidos nucleicos separados. En un aspecto, la ligadura quimica puede implicar al menos un sustrato de acido nucleico que tiene un extremo modificado (por ejemplo, un extremo 5' y/o 3' modificado) que incluye uno o mas restos quimicamente reactivos que facilitan o estimulan la formacion de la union. En algunas realizaciones, la ligadura quimica se produce cuando uno o mas terminales de acido nucleico se unen en estrecha proximidad (por ejemplo, cuando los extremos se unen debido a la hibridacion entre secuencias de acidos nucleicos complementarios). Por consiguiente, la hibridacion entre salientes en 3' o 5' complementarios (por ejemplo, salientes generados por escision con enzimas de restriction de un acido nucleico de doble cadena) o entre cualquier combinacion de acidos nucleicos complementarios que se traduce en que un extremo 3' se lleva muy cerca de un extremo 5' (por ejemplo, los extremos 3' y 5' son adyacentes entre si cuando los acidos nucleicos se hibridan a un acido nucleico molde complementario) puede estimular una ligadura quimica dirigida por moldes. Ejemplos de reacciones quimicas pueden incluir, pero no se limitan a, reacciones de condensation, reduction y/o de union foto-quimica. Se debe apreciar que en algunas realizaciones, la ligadura quimica se puede utilizar para producir enlaces fosfodiester internucleotidicos de origen natural, enlaces internucleotidicos pirofosfato fosfamida que no son de origen natural y otros enlaces internucleotidicos no naturales.

En algunas realizaciones, el proceso de ligadura quimica puede implicar uno o mas agentes de acoplamiento para catalizar la reaction de ligadura. Un agente de acoplamiento puede estimular una reaction de ligadura entre grupos reactivos en los acidos nucleicos adyacentes (por ejemplo, entre un resto 5' reactivo y un resto reactivo en 3' en los sitios adyacentes a lo largo de un molde complementario). En algunas realizaciones, un agente de acoplamiento puede ser un reactivo reductor (por ejemplo, ferricianuro), un reactivo de condensacion tal (por ejemplo, cianoimidazol, bromuro de cianogeno, carbodiimida etc.), o irradiation (por ejemplo, irradiation UV para la fotoligadura).

En algunas realizaciones, una ligadura quimica puede ser una reaccion de autoligadura que no implica un agente de acoplamiento separado. En la autoligadura, la presencia de un grupo reactivo en uno o mas acidos nucleicos puede ser suficiente para catalizar una ligadura quimica entre extremos de acido nucleico sin la adicion de un agente de acoplamiento (vease, por ejemplo, Xu et al., (1997) Tetrahedron Lett. 38: 5595-8). Los ejemplos no limitantes de estas reacciones de ligadura libres de reactivos pueden implicar desplazamientos nucleofilos de azufre en grupos de bromoacetilo, tosilo, o de yodo de los nucleosidos (ver, por ejemplo, Xu et al., (2001) Nat. Biotech. 19: 148-52). Los acidos nucleicos que contienen grupos reactivos adecuados para autoligadura se pueden preparar directamente en sintetizadores automatizados (vease, por ejemplo, Xu et al., (1999) Nuc. Acids Res. 27: 875-81). En algunas realizaciones, un fosforotioato en un extremo 3' puede reaccionar con un grupo saliente (tal como tosilato o yoduro) en un timidina a un extremo 5' adyacente En algunas realizaciones, dos cadenas de acido nucleico unidas en sitios

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adyacentes en una cadena diana complementaria pueden sufrir autoligadura por el desplazamiento de un resto de yoduro del extremo 5' (o tosilato) con un resto de azufre en el extremo 3'. Por consiguiente, en algunas realizaciones, el producto de una autoligadura puede incluir un enlace internucleotidico que no es de origen natural (por ejemplo, un solo atomo de oxigeno puede ser sustituido con un atomo de azufre en el producto ligado).

En algunas realizaciones, un duplex de acido nucleico sintetico se puede montar a traves de la ligadura quimica en una reaccion de una etapa que implica la ligadura quimica simultanea de acidos nucleicos en ambas hebras del duplex. Por ejemplo, una mezcla de oligonucleotidos fosforilados en 5' correspondientes a ambas cadenas de un acido nucleico diana puede ligarse quimicamente mediante a) exposicion al calor (por ejemplo, a 97 °C) y un enfriamiento lento para formar un complejo de oligonucleotidos hibridados, y b) exposicion a bromuro de cianogeno o a cualquier otro agente de acoplamiento adecuado en condiciones suficientes para ligar quimicamente los extremos 3' y 5' adyacentes en el complejo de acido nucleico.

En algunas realizaciones, se puede ensamblar un duplex de acido nucleico sintetico mediante ligadura quimica en una reaccion de dos etapas que implica la ligadura quimica separada para las cadenas complementarias del duplex. Por ejemplo, cada cadena un acido nucleico diana se puede ligar en una reaccion separada que contiene oligonucleotidos fosforilados correspondientes a la cadena que se va a ligar y oligonucleotidos no fosforilados correspondientes a la cadena complementaria. Los oligonucleotidos no fosforilados pueden servir como molde para los oligonucleotidos fosforilados durante una ligadura quimica (por ejemplo, usando bromuro de cianogeno). El acido nucleico monocatenario ligado resultante puede purificarse e hibridarse con un acido nucleico monocatenario complementario para formar el acido nucleico duplex diana (vease, por ejemplo, Shabarova et al., (1991) Nucl. Acids Res. 19: 4247-51).

En un aspecto, un fragmento de acido nucleico puede ensamblarse en una reaccion de ensamblaje mediada por polimerasa a partir de una pluralidad de oligonucleotidos que se combinan y se extienden en una o mas rondas de extensiones mediadas por polimerasa. En algunas realizaciones, los oligonucleotidos son oligonucleotidos solapantes que cubren la secuencia completa pero dejando huecos de cadena sencilla que pueden rellenarse mediante extension de la cadena. La pluralidad de diferentes oligonucleotidos puede proporcionar cualquiera de las secuencias positivas (cadena positiva), secuencias negativas (de cadena menos), o una combination de secuencias positivas y negativas que corresponden a la secuencia completa del fragmento de acido nucleico que se ha montado. En algunas realizaciones, uno o mas oligonucleotidos diferentes pueden tener regiones de secuencia solapantes (por ejemplo, regiones solapantes en 5' o regiones solapantes en 3'). Las regiones de secuencia solapantes pueden ser identicas (es decir, correspondientes a la misma cadena del fragmento de acido nucleico) o complementaria (es decir, correspondiente a cadenas complementarias del fragmento de acido nucleico). La pluralidad de oligonucleotidos puede incluir uno o mas pares de oligonucleotidos con regiones de secuencia solapantes identicas, uno o mas pares de oligonucleotidos con regiones de secuencia solapantes complementarias, o una combinacion de los mismos. Las secuencias solapantes pueden ser de cualquier longitud adecuada. Por ejemplo, las secuencias solapantes pueden abarcar toda la longitud de uno o mas acidos nucleicos utilizados en una reaccion de ensamblaje. Las secuencias solapantes pueden ser de entre aproximadamente 5 y aproximadamente 500 oligonucleotidos de longitud (por ejemplo, entre aproximadamente 10 y 100, entre aproximadamente 10 y 75, entre aproximadamente 10 y 50, aproximadamente 20, aproximadamente 25, aproximadamente 30, aproximadamente 35, aproximadamente 45, aproximadamente 50, etc.). Sin embargo, se pueden longitudes solapantes mas cortas, mas largas o intermedias. Se debe apreciar que las solapantes entre diferentes acidos nucleicos de entrada utilizados en una reaccion de ensamblaje pueden tener diferentes longitudes.

Las tecnicas de ensamblaje a base de polimerasa pueden implicar una o mas enzimas polimerasas adecuadas que pueden catalizar una extension basada en un molde de un acido nucleico en una direction de 5' a 3' en presencia de los nucleotidos apropiados y un molde hibridado. Una polimerasa puede ser termoestable. Una polimerasa se puede obtener a partir de fuentes recombinantes o naturales. En algunas realizaciones, puede usarse una polimerasa termoestable de un organismo termofilo. En algunas realizaciones, una polimerasa puede incluir una actividad 3'^ 5' exonucleasa/correccion. En algunas realizaciones, una polimerasa puede no tener actividad de correction o que esta sea minima (por ejemplo, una polimerasa puede ser una variante recombinante de una polimerasa natural que ha sido modificada para reducir su actividad correctora). Ejemplos de ADN polimerasas termoestables incluyen, pero no se limitan a: Taq (una ADN polimerasa estable al calor de la bacteria Thermus aquaticus); Pfu (una ADN polimerasa termofila con una actividad 3 '^ 5' exonucleasa/correccion de Pyrococcus furiosus, disponible de, por ejemplo, Promega); ADN polimerasa VentR® y ADN polimerasa VentRO (exo-) (ADN polimerasas termofilas con o sin actividad 3 '^ 5' exonucleasa/Correccion de Thermococcus litoralis, tambien conocida como Th polimerasa); ADN polimerasa Profundo VentR® y Profundo VentR® Deep VentR® (exo-) (ADN polimerasas termofilas, con o sin actividad 3 '^ 5' exonucleasa/correccion de la especie Pyrococcus GB-D, disponible de New England Biolabs); KOD HiFi (una ADN polimerasa KODI de Thermococcus kodakaraensis recombinante con actividad de exonucleasa/correccion 3 '^ 5', disponible en Novagen,); BIO-X-ACT (una mezcla de polimerasas que posee 'actividad de ADN polimerasa y 5'-3' y actividad correctora 3'^ 5); fragmento Klenow (un truncamiento N-terminal de la ADNA polimerasa I, que retiene LA actividad de la polimerasa, pero ha perdido la actividad exonucleasa 5 '^ 3' exonucleasa, disponible en, por ejemplo, Promega y NEB); Sequenase™(ADN polimerasa de T7 deficiente en la actividad de exonucleasa T-5 '); Phi29 (ADN polimerasa del bacteriofago 29, se puede utilizar para la amplification en circulo rodante, por ejemplo, en un kit de amplificacion de molde con secuenciacion de ADN TempliPhi™

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Plantilla, disponible de Amersham Biosciences); TopoTaq (una polimerasa hforida que combina los dominios de union de ADN hiperestable y la actividad de eliminacion de enlace de ADN de la topoisomerasa Methanopyrus, sin actividad exonucleasa, disponible en Sistemas Fidelity); TopoTaq de alta fidelidad que incorpora un dominio de correccion con la actividad exonucleasa; Phusion™ (una enzima de tipo Pyrococcus con un dominio de mejora de procesividad, disponible en New England Biolabs); cualquier otra aDn polimerasa adecuada, o cualquier combinacion de dos o mas de las mismas.

En algunas realizaciones, la polimerasa puede ser un SDP (polimerasa de desplazamiento de hebra; por ejemplo, una SDPe, que es una SDP sin actividad exonucleasa). Esto permite una PCR isotermica (extension isotermica, amplificacion isotermica) a una temperatura uniforme. A medida que la polimerasa (por ejemplo, Phi29, Bst) viaja a lo largo de un molde, desplaza la cadena complementaria (por ejemplo, creada en reacciones de extension anteriores). Dado que los ADN desplazados son de una sola cadena, los cebadores se pueden unir a una temperatura constante, eliminando la necesidad de cualquier termociclado durante la amplificacion, evitando asi o reduciendo la evaporacion de la mezcla de reaccion.

Se debe apreciar que la descripcion de las reacciones de ensamblaje en el contexto de los oligonucleotidos no se pretende que sean limitante. Por ejemplo, otros polinucleotidos (por ejemplo, polinucleotidos de cadena sencilla, de doble cadena, fragmentos de restriction, productos de amplificacion, polinucleotidos de origen natural, etc.) pueden ser incluidos en una reaccion de ensamblaje, junto con uno o mas oligonucleotidos, con el fin de generar un polinucleotido de interes.

Aspectos de los metodos y dispositivos proporcionados en el presente documento pueden incluir la automatization de uno o mas actos descritos en este documento. En algunas realizaciones, una o mas etapas de una reaccion de amplificacion y/o de ensamblaje pueden automatizarse usando uno o mas dispositivos de manipulation de muestras automatizados (por ejemplo, uno o mas dispositivos automatizados de manipulacion de liquido o fluido). Los dispositivos y procedimientos automatizados se pueden utilizar para liberar reactivos de reaccion, incluyendo uno o mas de los siguientes: acidos nucleicos de partida, tampones, enzimas (por ejemplo, una o mas ligasas y/o polimerasas), nucleotidos, sales, y otros agentes adecuados tales como agentes estabilizantes. Los dispositivos y procedimientos tambien automatizados se pueden utilizar para controlar las condiciones de reaccion. Por ejemplo, puede utilizarse un ciclador termico automatizado para controlar las temperaturas de reaccion y cualquier ciclo de temperatura que se pueden utilizar. En algunas realizaciones, un laser de barrido puede automatizarse para proporcionar una o mas temperaturas de reaccion o ciclos de temperatura adecuada para la incubation de polinucleotidos. Del mismo modo, el analisis posterior de los productos de polinucleotidos ensamblados puede automatizarse. Por ejemplo, la secuenciacion puede automatizarse utilizando un dispositivo de secuenciacion y protocolos de secuenciacion automatizados. Las etapas adicionales (por ejemplo, amplificacion, donation, etc.) tambien pueden automatizarse usando uno o mas dispositivos adecuados y protocolos relacionados. Se debe apreciar que uno o mas de los componentes del dispositivo o dispositivos descritos en el presente documento se pueden combinar en un sistema (por ejemplo, un sistema robotico) o en un microentorno (por ejemplo, una camara de reaccion microfluidica). Las mezclas de reaccion de ensamblaje (por ejemplo, muestras de reaccion liquidas) pueden transferirse desde un componente del sistema a otro mediante dispositivos y procedimientos automatizados (por ejemplo, manipulacion y/o transferencia de muestras y/o recipientes de muestras, incluyendo dispositivos de pipeteo automaticos, microsistemas, etc.). El sistema y todos los componentes del mismo pueden controlarse mediante un sistema de control.

En consecuencia, las etapas del metodo y/o aspectos de los dispositivos proporcionados en el presente documento pueden automatizarse usando, por ejemplo, un sistema informatico (por ejemplo, un sistema controlado por ordenador). Un sistema de ordenador en el que los aspectos de la tecnologia proporcionada en el presente documento pueden implementarse pueden incluir un ordenador para cualquier tipo de procesamiento (por ejemplo, analisis de la secuencia y/o de control del dispositivo automatizado como se describe en el presente documento). Sin embargo, se debe apreciar que ciertas etapas de procesamiento pueden ser proporcionadas por uno o mas de los dispositivos automatizados que son parte del sistema de ensamblaje. En algunas realizaciones, un sistema de ordenador puede incluir dos o mas ordenadores. Por ejemplo, un ordenador puede estar acoplado, a traves de una red, a un segundo ordenador. Un ordenador puede llevar a cabo analisis de la secuencia. El segundo equipo puede controlar uno o mas de los dispositivos de sintesis y de ensamblaje automatizados en el sistema. En otros aspectos, los equipos adicionales pueden incluirse en la red para controlar uno o mas de los analisis o procesamiento de actos. Cada equipo puede incluir una memoria y el procesador. Los ordenadores pueden adoptar cualquier forma, ya que los aspectos de la tecnologia proporcionada en el presente documento no se limitan a su implementation en cualquier plataforma informatica en particular. Del mismo modo, la red puede tomar cualquier forma, incluyendo una red privada o una red publica (por ejemplo, internet). Los dispositivos de visualization pueden estar asociados con uno o mas de los dispositivos y ordenadores. Como alternativa, o ademas de, un dispositivo de visualizacion puede estar ubicado en un sitio remoto y conectado para la visualizacion de la salida de un analisis de acuerdo con la tecnologia proporcionada en el presente documento. Las conexiones entre los diferentes componentes del sistema pueden ser a traves de cable, fibra optica, transmision inalambrica, transmision por satelite, cualquier otra transmision adecuada, o cualquier combinacion de dos o mas de los anteriores.

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Cada uno de los diferentes aspectos, realizaciones, o actos de la tecnologia proporcionada en el presente documento se pueden automatizar de forma independiente y aplicarse en cualquiera de numerosas maneras. Por ejemplo, cada aspecto, realizacion, o accion se pueden implementar de forma independiente utilizando hardware, software o una combinacion de los mismos. Cuando se implementa en software, el codigo de software puede ejecutarse en cualquier procesador adecuado o coleccion de procesadores, ya sea proporcionado en un solo ordenador o distribuido entre varios ordenadores. Se debe apreciar que cualquier componente o coleccion de componentes que realizan las funciones descritas anteriormente puede considerarse genericamente como uno o mas controladores que controlan las funciones antes descritas. El uno o mas controladores pueden implementarse de muchas maneras, tal como con hardware exclusivo o con hardware de proposito general (por ejemplo, uno o mas procesadores) que se programa utilizando microcodigo o software para realizar las funciones citadas anteriormente.

A este respecto, se debe apreciar que una aplicacion de las realizaciones de la tecnologia proporcionada en el presente documento comprende al menos un medio legible por ordenador (por ejemplo, una memoria de ordenador, un disco flexible, un disco compacto, una cinta, etc.) codificado con un programa de ordenador (es decir, una pluralidad de instrucciones), que, cuando se ejecuta en un procesador, realiza una o mas de las funciones antes descritas de la tecnologia proporcionada en el presente documento. El medio legible por ordenador puede ser transportable de tal manera que el programa almacenado en el mismo puede cargarse en cualquier recurso del sistema de ordenador para implementar una o mas funciones de la tecnologia proporcionada en el presente documento. Ademas, se debe apreciar que la referencia a un programa de ordenador que, cuando se ejecuta, realiza las funciones antes descritas, no se limita a un programa de aplicacion que se ejecuta en un ordenador huesped. Mas bien, el termino programa de ordenador se utiliza en el presente documento en un sentido generico para hacer referencia a cualquier tipo de codigo informatico (por ejemplo, software o microcodigo) que puede emplearse para programar un procesador para implementar los aspectos anteriormente discutidos de la tecnologia proporcionada en el presente documento.

Se debe apreciar que, de acuerdo con varias realizaciones de la tecnologia proporcionada en el presente documento en el que los procesos estan almacenados en un medio legible por ordenador, los procesos implementados de ordenador pueden, durante el curso de su ejecucion, recibir entradas manuales (por ejemplo, de un usuario).

De acuerdo con lo anterior, el control general a nivel de sistema de los dispositivos o componentes del ensamblaje descritos en el presente documento puede efectuarlo por un controlador de sistema que puede proporcionar senales de control a los sintetizadores de acidos nucleicos asociados, dispositivos de manipulacion de liquidos, termocicladores, dispositivos de secuenciacion, componentes roboticos asociados, asi como otros sistemas adecuados para llevar a cabo las funciones de entrada/salida u otro control deseados. Por lo tanto, el controlador del sistema junto con todos los controladores de dispositivos juntos forman un controlador que controla el funcionamiento de un sistema de ensamblaje de acido nucleico. El controlador puede incluir un sistema de procesamiento de datos de objetivo general, que puede ser un ordenador de proposito general, o la red de ordenadores de proposito general, y otros dispositivos asociados, incluyendo los dispositivos de comunicacion, modems, y/o otros circuitos o componentes para realizar la entrada/salida deseada u otras funciones. El controlador tambien puede implementarse, al menos en parte, como un circuito integrado de proposito especial unico (por ejemplo, ASIC) o una matriz de ASIC, teniendo cada uno una seccion de procesador principal o central para el control general a nivel de sistema, y separar las secciones dedicadas a la realizacion de diversos calculos concretos diferentes, funciones diferentes y otros procesos bajo el control de la seccion de procesador central. El controlador tambien puede implementarse utilizando una pluralidad de circuitos electronicos separados integrados programables dedicados u otros dispositivos, por ejemplo circuitos cableados electronicos o de logica, tales como circuitos de elementos discretos o dispositivos logicos programables. El controlador tambien puede incluir otros componentes o dispositivos, tales como dispositivos de entrada/salida del usuario (monitores, pantallas, impresoras, un teclado, un dispositivo senalador de usuario, pantalla tactil, u otra interfaz de usuario, etc.), dispositivos de almacenamiento de datos, unidad motores, conexiones, controladores de valvulas, dispositivos roboticos, bombas de vacio y de otros tipos, sensores de presion, detectores, fuentes de alimentacion, fuentes de impulsos, dispositivos de comunicacion u otros circuitos o componentes electronicos, y asi sucesivamente. El controlador tambien puede controlar el funcionamiento de otras partes de un sistema, como el procesamiento automatizado de solicitudes al cliente, control de calidad, envasado, envio, facturacion, etc., para realizar otras funciones adecuadas conocidas en la tecnica, pero que no se describen en detalle en este documento.

Varios aspectos de la presente divulgacion se pueden utilizar solos, en combinacion, o en diversas disposiciones no tratadas especificamente en las realizaciones descritas en lo anterior y, por lo tanto, no esta limitada en su aplicacion a los detalles y la disposicion de los componentes expuestos en la anterior descripcion o ilustrados en los dibujos. Por ejemplo, los aspectos descritos en una realizacion se pueden combinar de cualquier manera con los aspectos descritos en otras realizaciones.

El uso de terminos ordinales tales como "primero", "segundo", "tercero", etc., en las reivindicaciones para modificar un elemento de la reivindicacion no por si mismo connota cualquier prioridad, precedencia u orden de un elemento de la reivindicacion sobre otro o el orden temporal orden en el que se realizan actos de un metodo, pero se utilizan simplemente como marcadores para distinguir un elemento reivindicado que tiene un cierto nombre de otro elemento que tiene un mismo nombre (pero para el uso del termino ordinal) para distinguir los elementos reivindicados.

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Asimismo, debe entenderse que las expresiones y la terminologia empleadas en el presente documento se usan con una finalidad descriptiva y no deben considerarse limitantes. El uso de "incluyendo", "que comprende", "que tiene", “que contiene”, “que implica” y variaciones de los mismos en el presente documento pretende abarcar los elementos enumerados a partir de ellos y equivalentes de los mismos, asi como elementos adicionales.

Ejemplos

Ejemplo 1: Escision y elimination de apareamientos erroneos usando Surveyor™

Un ejemplo de escision y eliminacion de de apareamiento erroneo se muestra en las figuras 2 y 3. Con referencia a la figura 2, las manchas de las micromatrices de 20 fueron objeto de marcaje con en 0,005 % de Triton X-100, Tris- HCl 10 mM (pH 7,4), MgCl2 5 mM, ditiotreitol (DTT) 7,5 mM, dATP 0,4 mM, dGTP 0,4 mM, dTTP 0,4 mM, Cy3CdCTP 4jM, 0,4ujM del cebador universal, 0,04U/jl de fragmento Klenow de la ADN polimerasa exo a 37 °C durante 60 minutos. En el experimento de control (panel izquierdo), la micromatriz barajada 21 no recibio tratamiento enzimatico. El panel central muestra la micromatriz barajada 22 que recibio 0,5jl de Surveyor ™ por 20 |jl de volumen de reaction. El panel derecho es la micromatriz barajada 23 que recibio 1,5 jl de Surveyor ™ por 20 jl de volumen de reaccion. 24, 25, y 16 son una representation esquematica de la micromatriz barajada 21, 22, y 23, respectivamente.

La imagen de la micromatriz barajada 21 es la mas brillante, lo que sugiere que la mayor cantidad de pigmento Cy3 permanecio en la micromatriz barajada 21 de 22 y 23. Esto se fundamenta ademas en la medicion directa de la intensidad de la senal de Cy3 en la micromatriz barajada 21, 22 y 23. Con referencia a la figura 3, los numeros de referencia 31, 32, y 33 corresponden a la intensidad media de la mancha de la micromatriz barajada 21, 22, y 23, respectivamente. Por lo tanto, el tratamiento Surveyor™ elimino de forma efectiva los duplex que contienen apareamientos erroneos, lo que resulta en una cantidad menor de senales Cy3.

Ejemplo 2: Produccion de oligonucleotidos de alta fidelidad utilizando la escision Surveyor™

El flujo molecular de reaccion, el flujo de proceso, y el flujo de reactivo de ejemplo para la produccion de oligonucleotidos de alta fidelidad utilizando la escision Surveyor™ se muestran en la Figura 4. Se usaron siete (7) etapas en este ejemplo.

Etapa 1: Prehibridacion en el chip. La micromatriz se prehibrido con 0,005 % de Triton X-100, 0,2 mg/ml de seroalbumina bovina acitilada, Tris-HCl 10 mM (pH 7,4), MgCl2 5 mM, ditiotreitol (DTT) 7,5 mM a 37 ° C durante 30 minutos.

Etapa 2: Extension del cebador. Las cadenas complementarias en el chip se sintetizaron en 0,005 de Triton X- 100, Tris-HCl 10 mM (pH 7,4), MgCl2 5 mM, ditiotreitol (DTT) 7,5 mM, dNTP 0,4 mM, cebador universal 0,4 jM, 0,04U/jl de fragmento Klenow ADN polimerasa exo- a 37 °C durante 60 minutos.

Etapa 3: Lavado Hybe Surveyor ™. Los nucleotidos no incorporados se eliminaron con NaCl 0,9 M, NaH2PO4 60 mM y 0,005 % de Triton X-100. El Chip se lavo en tampon Surveyor ™ Hybe tres veces a temperatura ambiente. Etapa 4: Lavado de reaccion con Surveyor ™. El chip se lavo en tampon de reaccion Surveyor™ tres veces a temperatura ambiente. Composition del tampon de reaccion surveyor™: Tris-HCl 20mM (pH 7,4), MgCl2 10mM y KCl 25mM.

Etapa 5: Barajado. El chip se calento a 94 °C en un tampon de reaccion Surveyor™ durante 3 minutos para la fusion del ADN, seguido de incubation a temperatura ambiente durante 60 minutos para la formation de heteroduplex.

Etapa 6: Tratamiento con Surveyor™. El tampon de reaccion Surveyor™ de la etapa 5 se retiro y el chip se trato con Surveyor™/potenciador en Tris-HCl 20 mM (pH 7,4), MgCl2 10 mM y KCl 25 mM y se incubo a 42 °C durante 20 minutos. Se utilizaron dos concentraciones diferentes de Surveyor ™/potenciador. 1). 0,5 jl/20 jl de reaccion y 1,5 jl /20 jl de reaccion. Surveyor ™ y el potenciador se utilizaron en volumenes iguales.

Etapa 7: Surveyor ™ tras lavado de reaccion. El chip se lavo con NaCl 0,9 M, NaH2PO4 60 mM, 0,005 % de Triton X-100 y EDTA 6 mM tres veces a temperatura ambiente para eliminar los heteroduplex propensos a errores escindidos.

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   REIVINDICACIONES

   1. Un metodo para producir oligonucleotidos de alta fidelidad en un soporte solido, comprendiendo el metodo:

   a) exponer una pluralidad de oligonucleotidos monocatenarios unidos al soporte que comprenden una secuencia predefinida a una enzima polimerasa en condiciones adecuadas para una reaccion de sintesis dependiente de molde, con lo que para producir una pluralidad de oligonucleotidos bicatenarios, cada uno de los cuales comprende un oligonucleotido unido a soporte y un oligonucleotido complementary sintetizado;

   b) desnaturalizar la pluralidad de oligonucleotidos bicatenarios de manera que los oligonucleotidos sintetizados se liberan en una solucion desde los oligonucleotidos unidos al soporte;

   c) renaturalizar los oligonucleotidos sintetizados a los oligonucleotidos unidos al soporte, con lo que se producen oligonucleotidos bicatenarios renaturalizados; y

   d) exponer los oligonucleotidos bicatenarios renaturalizados a un componente de reconocimiento y escision de apareamientos erroneos en condiciones adecuadas para la escision de oligonucleotidos bicatenarios renaturalizados que contienen un apareamiento erroneo.
2. 2. Un metodo para producir oligonucleotidos de alta fidelidad en un soporte solido, comprendiendo el metodo:

   a) sintetizar una primera pluralidad de oligonucleotidos en una reaccion de extension de la cadena usando, como molde, una segunda pluralidad de oligonucleotidos, en donde la segunda pluralidad de oligonucleotidos estan inmovilizados sobre un soporte solido y comprenden oligonucleotidos libres de errores y, opcionalmente, uno o mas oligonucleotidos que contienen errores, en donde la reaccion de extension de la cadena produce una primera pluralidad de duplex;

   b) desnaturalizar la primera pluralidad de duplex para liberar la primera pluralidad de oligonucleotidos de la segunda pluralidad de oligonucleotidos;

   c) poner en contacto la primera pluralidad de oligonucleotidos con la segunda pluralidad de oligonucleotidos en condiciones de hibridacion para formar una segunda pluralidad de duplex, en donde, cuando la segunda pluralidad de oligonucleotidos comprende uno o mas oligonucleotidos que contienen errores que tienen una posicion que contiene errores, la segunda pluralidad de duplex comprende un heteroduplex que contiene apareamientos erroneos;

   d) escindir al menos una parte del heteroduplex que contiene apareamientos erroneos mediante un componente de reconocimiento y escision de apareamientos erroneos, produciendo de este modo oligonucleotidos bicatenarios de alta fidelidad; y

   e) opcionalmente desnaturalizar de forma selectiva los oligonucleotidos bicatenarios de alta fidelidad.
3. 3. Un metodo de ensamblaje de polimeros de acido nucleico, que comprende las etapas de:

   a) producir dos o mas conjuntos de oligonucleotidos bicatenarios de alta fidelidad de acuerdo con el metodo de la reivindicacion 1;

   b) desnaturalizar conjuntos deseables de oligonucleotidos de alta fidelidad, liberando de este modo los oligonucleotidos de cadena simple de alta fidelidad en una solucion;

   c) combinar los conjuntos deseables de oligonucleotidos de cadena simple de alta fidelidad en un volumen de reaccion; y

   d) someter el volumen de reaccion a condiciones adecuadas para una o mas de hibridacion, ligadura y extension de la cadena.
4. 4. El metodo de la reivindicacion 2, en el que la segunda pluralidad de oligonucleotidos se sintetizan quimicamente sobre el soporte solido y se inmovilizan dentro de una o mas caracteristicas en el soporte solido.
5. 5. El metodo de la reivindicacion 2, en el que la segunda pluralidad de oligonucleotidos estan unidos a dos o mas caracteristicas en el soporte solido y en el que despues de la etapa b), uno o mas de la primera pluralidad de oligonucleotidos se difunden lejos de un punto de union.
6. 6. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2 en el que el componente de reconocimiento y escision de apareamientos erroneos comprende una endonucleasa de apareamientos erroneos.
7. 7. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2 en el que el componente de reconocimiento y escision de apareamientos erroneos realiza escision quimica.
8. 8. Un metodo para producir al menos un oligonucleotido que tiene una secuencia predefinida sobre un soporte solido, comprendiendo el metodo:

   a) sintetizar sobre un soporte solido una primera pluralidad de oligonucleotidos bicatenarios utilizando, como molde, una segunda pluralidad de oligonucleotidos;

   b) liberar la primera pluralidad de oligonucleotidos de la segunda pluralidad de oligonucleotidos dentro de un microvolumen aislado;

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   c) poner en contacto la segunda pluralidad de oligonucleotidos con la primera pluralidad de oligonucleotidos en condiciones de hibridacion para formar una segunda pluralidad de oligonucleotidos bicatenarios dentro del microvolumen aislado;

   d) poner en contacto y escindir la segunda pluralidad de oligonucleotidos bicatenarios con un agente de union a apareamientos erroneos, en donde el agente de union a apareamientos erroneos se une de forma selectiva y escinde los oligonucleotidos bicatenarios que comprenden un apareamiento erroneo; y

   e) eliminar los oligonucleotidos bicatenarios que comprenden el apareamiento erroneo, produciendo de este modo oligonucleotidos libres de errores.
9. 9. El metodo de la reivindicacion 8, en el que el agente de union a apareamientos erroneos es una endonucleasa especifica de apareamiento erroneo y escinde en la region de apareamiento erroneo.
10. 10. El metodo de la reivindicacion 9, en el que la endonucleasa especifica de apareamientos erroneos es una enzima CEL.
11. 11. El metodo de la reivindicacion 8, en el que la etapa de liberacion de la primera pluralidad de oligonucleotidos es en condiciones de desnaturalizacion.
12. 12. El metodo de la reivindicacion 8, en el que la segunda pluralidad de oligonucleotidos se une a una caracteristica discreta del soporte solido y en el que la caracteristica se hidrata selectivamente, proporcionando de ese modo la segunda pluralidad de oligonucleotidos dentro del volumen aislado.
13. 13. El metodo de la reivindicacion 12, en el que la caracteristica se hidrata selectivamente aplicando una solucion que comprende una polimerasa, dNTP, una solucion de estimulacion de la extension del cebador, al menos un cebador en donde el cebador es complementario a un sitio de union del cebador en la segunda pluralidad de oligonucleotidos.
14. 14. El metodo de la reivindicacion 8, que libera ademas oligonucleotidos libres de errores en solucion.
15. 15. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 1,2 u 8, en el que el soporte solido es una micromatriz.
16. 16. El metodo de la reivindicacion 2, en el que el heteroduplex que contiene apareamientos erroneos se forma entre el oligonucleotido que contiene errores de la segunda pluralidad de oligonucleotidos y uno de los oligonucleotidos libres de errores de la primera pluralidad de oligonucleotidos.