CN103502448B - 核酸合成的方法和设备 - Google Patents
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Abstract
方法和设备涉及在支持物上合成有预定序列的多核苷酸。组装方法包含引物延伸以生成重叠构建寡核苷酸和将所述感兴趣多核苷酸在锚结合于支持物的寡核苷酸上组装。公开了选择有预定序列和/或长度的方法和设备。
Description
相关申请
本申请要求2010年11月12日提交的美国临时申请序列号61/412,937、2010年11月30日提交的美国临时申请序列号61/418,095、2011年3月23日提交的美国临时申请序列号61/466,814、2011年7月01日提交的美国临时申请序列号61/503,722，各通过引用全文纳入本文。
技术领域
本文提供了涉及合成和组装有预定序列的核酸和核酸库的方法和设备。更特别地，提供了在固体支持物上合成靶标多核苷酸和选择靶标多核苷酸的方法和设备。
背景技术
对要从自然复制和扩增并且然后分解成组成部分的DNA序列而言使用重组DNA化学技术目前是常见的。作为组成部分，所述序列然后重新结合或重新组装成新的DNA序列。然而，对天然可用序列的依赖性严重限制了研究者研究的可能性。而现在可能从单个核苷酸直接合成短DNA序列，通常直接构建大的片段或多核苷酸组装（如长于约400碱基对的多核苷酸序列）是不可行的。
寡核苷酸合成能通过微芯片上的大规模平行定制合成进行(Zhou等，(2004)Nucleic Acids Res.32:5409;Fodor等(1991)Science251:767)。然而，当前微芯片有非常低的表面积，并且由此仅能生成小量的寡核苷酸。当释放到溶液中时，所述寡核苷酸存在浓度是每序列皮摩尔或更低,浓度不足以高到有效驱动生物分子活化反应。当前组装核酸的方法需要在组装前从微芯片扩增寡核苷酸。同样，需要用于高保真基因组装的改善、符合成本效益的方法和设备，以及生产大量多核苷酸序列。
发明内容
本发明的内容涉及制备和/或组装高保真聚合物的方法和设备。本文也提供了加工核酸组装反应和组装核酸的设备和方法。本发明的目的是提供合成定制核酸的可行、经济的方法。
本发明的各方面涉及生产在固体支持物上有预定序列的多核苷酸的方法和设备。在一些实施方式中，在固体支持物的不同特征(feature)、有预定序列的寡核苷酸组(plurality)（各结合到支持物的不同不同特征（discrete feature））上提供了结合于支持物的单链寡核苷酸组。在一些实施方式中，寡核苷酸组包含在其3’末端与另一寡核苷酸3’末端序列区域互补的序列区域，并且其中第一组寡核苷酸有与第一锚单链寡核苷酸5’末端互补的5’末端。在一些实施方式中，将结合于支持物的寡核苷酸组固定在支持物上。在一些实施方式中，将结合于支持物的寡核苷酸组在固体支持物上合成。在另一些实施方式中，将结合于支持物的寡核苷酸组点（spot）在固体支持物上。在一些实施方式中，所述支持物是微阵列设备。
根据一些实施方式，提供了至少第一和第二组固体结合的单链寡核苷酸，其中第一和第二组寡核苷酸各自有预定序列，并且结合到所述支持物的不同特征上。在一些实施方式中，第一组寡核苷酸各自在其3’末端包含与第二组寡核苷酸3’末端序列区域互补的序列区域。在一些实施方式中，提供了结合于支持物的锚单链寡核苷酸组，其中，第一锚寡核苷酸组5’末端的序列区域与第一组结合于支持物的寡核苷酸相同。至少与第一和第二组结合于支持物的寡核苷酸互补的第一和第二组构建寡核苷酸是在链延伸反应上生成。所述构建寡核苷酸能在选定特征上水解成锚寡核苷酸组。将所述至少第一和第二组构建寡核苷酸连接，由此生成所述有预定序列的至少一种多核苷酸。在一些实施方式中，所述至少第一和第二组构建寡核苷酸从所述至少第一和第二组结合于支持物的寡核苷酸上解离。在一些实施方式中，所述第一组构建寡核苷酸从第一特征转移到选定特征，并且所述第二组构建寡核苷酸从第二特征转移到所述选定特征，其中所述选定特征包含结合于支持物的锚单链寡核苷酸组。在一些实施方式中，所述选定特征与所述第一和第二特征在同一支持物上。在其他实施方式中，所述选定特征与所述第一和第二特征在不同的支持物上。在一些实施方式中，提供了第三组预定结合于支持物的单链寡核苷酸，其中第三组寡核苷酸各自有预定序列，并且结合到所述支持物的第三不同特征上，第三组寡核苷酸各自在其3’末端有与第二组寡核苷酸3’末端序列区域互补的序列区域。与第三组结合于支持物的寡核苷酸互补的第三组构建寡核苷酸在链延伸反应中使用单链寡核苷酸作为模板生成。所述第一、第二和第三组构建寡核苷酸与锚寡核苷酸组在选定特征上杂交，并且连接生成更长的多核苷酸。在一些实施方式中，构建寡核苷酸组各在不同支持物上生成。在一些实施方式中，结合于支持物的寡核苷酸组在其3’末端有引物结合位点。所述引物结合位点能是通用引物结合位点。在一些实施方式中，所述方法包含使引物与至少第一和第二组结合于支持物的寡核苷酸在促进引物延伸的条件下退火，由此形成延伸产物双链体。在一些实施方式中，所述引物序列包含至少一个尿嘧啶。在一些实施方式中，包含尿嘧啶的引物使用尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)和DNA糖基化酶-裂解酶内切核酸酶VIII的混合物来除去。
在一些实施方式中，所述方法包含提供N组预定结合于支持物的单链寡核苷酸，其中第一组寡核苷酸在其3’末端包含与第二寡核苷酸3’末端序列区域互补的序列区域，其中所述N组寡核苷酸在其3’末端包含所述(N-1)寡核苷酸序列区域互补的序列区域；并且提供了在其5’末端与第一组结合于支持物的寡核苷酸序列区域相同的序列。在一些实施方式中，生成了与结合于支持物的单链寡核苷酸互补的N组构建寡核苷酸，所述多构建寡核苷酸组无缺口地跨越所述多核苷酸的全部序列。在一些实施方式中，第一组结合于支持物的寡核苷酸的3’末端序列区域与所述锚寡核苷酸的5’末端区域相同。在一些实施方式中，所述延伸产物解离，由此释放出至少第一和第二组构建寡核苷酸。
本发明的各方面涉及合成和选择有预定序列的多核苷酸。所述方法包括合成含有游离单链突出端的结合于支持物的双链多核苷酸组，含有预定多核苷酸序列的多核苷酸序列组，其中所述单链突出端包含末端构建寡核苷酸N的序列。在一些实施方式中，提供了茎环寡核苷酸，其中所述茎环寡核苷酸包含单链突出端，并且其中所述单链突出端与末端构建寡核苷酸序列N互补。所述茎环寡核苷酸杂交，并且与有预定序列的多核苷酸的游离突出端连接，由此保护包含所述末端寡核苷酸N的突出端。在一些实施方式中，不包含末端构建寡核苷酸序列N的多核苷酸序列使用单链外切核酸酶降解，所述外切核酸酶例如单链特异性3'外切核酸酶、单链特异性内切核酸酶、和单链特异性5'内切核酸酶。在一些实施方式中，所述方法包含使寡核苷酸库与锚结合于支持物的单链寡核苷酸杂交，所述寡核苷酸库包含N组寡核苷酸，其中所述第一组寡核苷酸在其5’末端包含与所述锚寡核苷酸5’末端序列区域互补的序列区域，并且其中N组寡核苷酸在其3’末端包含与所述(N-1)寡核苷酸序列区域互补的序列区域。在一些实施方式中，所述茎环寡核苷酸包含II型限制性位点，并且所述茎环寡核苷酸使用II型限制性内切核酸酶除去。在一些实施方式中，所述茎环寡核苷酸包含至少一个尿嘧啶核苷酸，并且所述茎环寡核苷酸使用尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)和DNA糖基化酶-裂解酶内切核酸酶VIII的混合物除去。在一些实施方式中，所述锚寡核苷酸和所述多核苷酸使用尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)和DNA糖基化酶-裂解酶内切核酸酶VIII的混合物从支持物上释放。在一些实施方式中，所述多核苷酸使用II型限制性酶从支持物上释放。在一些实施方式中，扩增所述预定多核苷酸序列。
在本发明的一些方面，提供了合成有预定序列和根据其序列和长度选择预定多核苷酸序列的方法。在一些实施方式中，提供具(i)第一组结合于支持物的锚寡核苷酸和(ii)第二组结合于支持物的锚寡核苷酸的支持物，其中所述第一组锚寡核苷酸的5’末端与第一组寡核苷酸5’末端互补，所述第一组锚寡核苷酸的5’末端与末端构建寡核苷酸N互补。在一些实施方式中，合成了包含5’单链突出端的结合于支持物的双链多核苷酸组。多核苷酸序列组包含所述预定多核苷酸序列，其中，所述预定多核苷酸序列的单链5’突出端包含所述末端构建寡核苷酸N序列且所述多核苷酸序列的单链3’末端包含第一寡核苷酸序列。合成的多核苷酸组在杂交条件下与第一组锚寡核苷酸杂交。在一些实施方式中，所述合成的多核苷酸处于杂交条件，例如所述末端寡核苷酸N与第二组锚寡核苷酸的5’末端杂交，由此使用第二锚寡核苷酸选择有预定序列的多核苷酸。在一些实施方式中，有游离3’或5’末端的多核苷酸序列使用单链特异性外切核酸酶降解。在一些实施方式中，有预定序列的多核苷酸从所述支持物上进一步释放，例如使用II型内切核酸酶或使用尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)和DNA糖基化酶-裂解酶内切核酸酶VIII的混合物。在优选的实施方式中，所述第一组锚寡核苷酸与所述第二组锚寡核苷酸分开某一距离，所述距离对应预定多核苷酸的长度。所述支持物能包含结合于支持物的间隔子（spacer）单链寡核苷酸以设定所述第一和第二锚寡核苷酸的距离。在一些实施方式中，所述第一和第二锚寡核苷酸之间的距离是所述第一和第二锚寡核苷酸浓度和所述间隔子寡核苷酸浓度的函数。
本发明的一些方面涉及核酸阵列，所述阵列包含(a)固体支持物；(b)与固体支持物相关的不同特征组，其中各特征包含有预定序列的结合于支持物的寡核苷酸组，其中所述第一组寡核苷酸在其5’末端包含与第二寡核苷酸5’末端序列区域互补的序列区域，其中寡核苷酸N组在其5’末端包含与寡核苷酸(N-1)组5’末端序列区域互补的序列;和(c)至少第一组锚寡核苷酸，在其5’末端包含与第一组结合于支持物的寡核苷酸序列区域相同的序列。在一些实施方式中，所述核酸阵列还包含第二组结合于支持物的锚寡核苷酸，其中所述第二锚寡核苷酸的5’末端与寡核苷酸N组的5’末端相同。在一些实施方式中，所述核酸还包含结合于支持物的寡核苷酸组，所述寡核苷酸有与结合于支持物的寡核苷酸组不相同的序列。
本发明的内容涉及在支持物上生成有预定序列的多核苷酸组的平行和顺序方法。在一些实施方式中，提供了有特征的第一和第二支持物组，其中各支持物上的各特征包含有不同预定序列的不同结合于支持物的寡核苷酸组。第一和第二组有不同预定序列的不同构建寡核苷酸使用结合于支持物的寡核苷酸组作为模板生成，所述第一和第二组构建寡核苷酸在其3’末端有互补序列。在一些实施方式中，提供了包含特征的支持物组，其中各特征包含结合于支持物的锚单链寡核苷酸组。在一些实施方式中，锚寡核苷酸组的5’末端与第一组构建寡核苷酸的5’末端互补。所述第一组构建寡核苷酸能与所述锚寡核苷酸杂交，形成有3’突出端的第一组双链体。然后所述第二组构建寡核苷酸能与所述第一组双链体通过所述3’突出端杂交，由此形成有5’突出端的双链体组。任选地，根据要合成的多核苷酸长度，第三组构建寡核苷酸与所述第二组构建寡核苷酸通过所述5’突出端杂交。所述构建寡核苷酸组可以连接形成双链多核苷酸。在一些实施方式中，生成第一构建寡核苷酸组的步骤包含使具有至少一个尿嘧啶的引物序列与第一组结合于支持物的寡核苷酸退火，所述退化条件促进引物延伸和用尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)及DNA糖基化酶-裂解酶内切核酸酶VIII的混合物除去所述引物。在一些实施方式中，定义多核苷酸的构建寡核苷酸组各在不同支持物上合成。不同多核苷酸组能在包含结合于支持物的锚寡核苷酸的不同支持物特征上组装。
本发明的内容涉及合成有预定序列的多核苷酸组的方法和设备。在一些实施方式中，所述方法包含步骤(a)提供了包含特征组的第一支持物，其中各特征包含结合于支持物的锚单链寡核苷酸组，其中锚寡核苷酸组的5’末端与第一组构建寡核苷酸的5’末端互补;(b)提供了有特征组的第二支持物，其中各特征包含结合于支持物的寡核苷酸组，结合于支持物的寡核苷酸组有不同的预定序列;(c)使用结合于支持物的寡核苷酸组作为模板生成有不同预定序列的第一组构建寡核苷酸;(d)放置所述第一和第二组支持物例如所述第二支持物各特征与所述第一支持物的对应特征对齐;(e)在溶液中释放所述第一组构建寡核苷酸，所述释放条件促进所述第一组寡核苷酸和锚寡核苷酸组的杂交;和(f)用包含第二组构建寡核苷酸的第三支持物、有3’末端互补序列的第二和第三组构建寡核苷酸可选重复步骤b-e。在一些实施方式中，所述第二支持物位于第一支持物的上面并与之相向。在一些实施方式中，所述第三支持物包含通过与锚寡核苷酸组杂交固定的多核苷酸组。
在一些实施方式中，生成第一构建寡核苷酸组的步骤包含使具有至少一个尿嘧啶的引物序列与第一组结合于支持物的寡核苷酸退火，所述退化条件促进引物延伸和用尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)及DNA糖基化酶-裂解酶内切核酸酶VIII的混合物除去所述引物。所述第二支持物能位于第一支持物的上面并与之相向。在一些实施方式中，所述溶液包含使能连接第二和第三组构建寡核苷酸的连接酶。
在一些实施方式中，溶液中释放第一组构建寡核苷酸的步骤使第一组寡核苷酸向锚寡核苷酸扩散。
在一些实施方式中，渗透膜存在下溶液中释放第一组构建寡核苷酸的步骤能使构建寡核苷酸向锚寡核苷酸基本（substantial）垂直扩散。在一些实施方式中，所述渗透膜降低了构建寡核苷酸的横向扩散。
在一些实施方式中，第二支持物的各特征包含寡核苷酸组，其中寡核苷酸组包含至少两个有不同预定序列的寡核苷酸群，所述至少两个寡核苷酸群有互补序列。例如，所述两个寡核苷酸群包含3’末端互补序列。在一些实施方式中，所述两个寡核苷酸群在溶液中释放，由此使所述第一构建寡核苷酸群与第二构建寡核苷酸群杂交，并且使所述第一构建寡核苷酸群与锚寡核苷酸杂交。在一些实施方式中，所述溶液包含连接酶。在一些实施方式中，第一组构建寡核苷酸的化学计量高于锚寡核苷酸的化学计量。
在一些实施方式中，合成有预定序列的多核苷酸组的方法还包含使多核苷酸组暴露于错配识别和切割成分，所述暴露条件适于切割包含错配的双链多核苷酸。所述多核苷酸组能是结合于支持物的或在溶液中。所述错配识别和切割成分能包含错配内切核酸酶例如CEL I酶。
附图说明
图1显示了使用第一寡核苷酸生成表面和第二锚寡核苷酸表面的表面连接核酸合成的非限定性示例方法。
图2显示了使用包含寡核苷酸生成序列和锚序列的单个表面的表面连接核酸合成的非限定性示例方法。
图3显示了表面连接的核酸合成和使用单链特异性外切核酸酶筛选全长组装的多核苷酸的非限定性示例方法。
图4显示了表面连接的核酸合成和使用分子标尺筛选全长组装的多核苷酸的非限定性示例方法。
图5显示了包含结合于支持物寡核苷酸的非限定性示例构建阵列和锚阵列。
图6显示了从固定在构建阵列上的结合于支持物寡核苷酸上合成构建寡核苷酸的非限定性方法。
图7显示了用于高度平行序列表面连接的多核苷酸合成的非限定性方法。
图8显示了整体构建阵列和锚阵列。
图9a-d显示了液体培养基中从构建阵列向锚阵列转移第一组和第二组构建寡核苷酸的非限定性方法。
图10显示了液体培养基中多孔膜存在下从构建阵列向锚阵列转移构建寡核苷酸的非限定性方法。
图11显示了液体培养基中和连接酶存在下从构建阵列向锚阵列转移两个不同构建寡核苷酸的非限定性方法。
图12显示了液体培养基中从构建阵列向锚阵列转移两个不同构建寡核苷酸的非限定性方法，其中构建寡核苷酸的数目对各相应锚寡核苷酸在化学计量上过量。
图13显示了从一个锚阵列向另一个锚阵列转移经组装多核苷酸的非限定性方法，所述转移通过使用各锚阵列上组装的多核苷酸之间的重叠连接。
图14显示了使用错配特异性内切核酸酶从双链核酸序列中除去错配错误的非限定性方法。十字指示所述错配核苷酸。
发明详述
本文提供的技术方面对增加核酸合成和组装反应的精确性、产率、通量、和/或成本效益有用。本文使用的术语“核酸”、“多核苷酸”、“寡核苷酸”可互换使用，并且指核苷酸的天然产生或合成的聚合物形式。本发明所述寡核苷酸和核酸分子可以从天然产生的核苷酸中形成，例如形成脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)分子。或者，所述天然产生的寡核苷酸可以包含改变其特征的结构修饰，例如肽核酸(PNA)或锁定核酸(LNA)。有天然产生或人工碱基的寡核苷酸和核酸分子的固相合成为本领域熟知。应该理解所述术语包含从核苷酸类似物中生成的RNA或DNA的等同物、类似物，和应用于要描述的实施方式时的单链或双链多核苷酸。本发明有用的核苷酸包含例如天然产生的核苷酸(例如核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸)、或者核苷酸的天然或合成修饰、或者人工碱基。本文使用的术语单体指小分子组成员，其是并且能结合在一起以形成低聚物、聚合物或由两个或更多个成员构成的化合物。聚合物中所述单体的特定顺序在本文中称为聚合物的"序列"。所述单体组包含但不限于例如常见L-氨基酸组、D-氨基酸组、合成和/或天然氨基酸组、核苷酸组及戊糖和己糖组。本文所述本发明内容主要关于制备寡核苷酸，但是易于应用于制备其他聚合物例如肽或多肽、多糖、磷脂、杂聚物、聚酯、聚碳酸酯、聚脲、聚酰胺、聚乙烯亚胺、聚亚芳基硫醚、聚硅氧烷、聚酰亚胺、聚乙酸酯或任何其他聚合物。
本文使用的术语“预测定序列”或“预定序列”可互换使用，并且指在所述聚合物合成或组装前已知并选择聚合物的序列。特别地，本文所述本发明内容主要关于制备核酸分子，在所述核酸分子合成或组装前已知并选择所述核酸分子的序列。在本文所提供技术的一些实施方式中，固定的寡核苷酸或多核苷酸用作材料来源。在多个实施方式中，本文所述方法使用寡核苷酸，根据要合成的最终多核苷酸构建物的序列测定其序列。在一个实施方式中，寡核苷酸是短的核酸分子。例如，寡核苷酸长度可以是10–约300个核苷酸、20–约400个核苷酸、30–约500个核苷酸、40–约600个核苷酸、或多于约600个核苷酸。然而，可以使用更短或更长的寡核苷酸。寡核苷酸可设计成具有不同长度。在一些实施方式中，多核苷酸构建物序列可以分成更短序列组，所述序列能使用本文所述方法平行合成和组装成单个或多个所需多核苷酸构建物。在一些实施方式中，所述组装过程可以包含数种平行和/或顺序反应步骤，其中不同核酸或寡核苷酸组被合成或固定、引物延伸、并且合并以组装(如通过本文所述延伸或连接)生成更长核酸产物，从而用于进一步组装、克隆或其他应用。
在一些实施方式中，本文提供了组装含有具预定序列变化的核酸库的方法。本文提供的组装方案能用于生成代表很多不同感兴趣核酸序列的非常大的库。在一些实施方式中，核酸库是序列变体库。序列变体可以是单个天然产生蛋白编码序列的变体。然而，在一些实施方式中，序列变体可以是不同蛋白编码序列组的变体。因此，本文提供技术的一方面涉及组装精确的高密度核酸库。本文提供的技术方面也提供了精确的高密度核酸库。高密度核酸库可以包含多于100个不同序列变体(如约102-103;约103-104;约104-105;约105-106;约106-107;约107-108;约108-109;约109-1010;约1010-1011;约1011-1012;约1012-1013;约1013-1014;约1014-1015;或更多不同序列)，其中相对于随机序列，高百分比的不同序列是特异性序列(如，多于约50%、多于约60%、多于约70%、多于约75%、多于约80%、多于约85%、多于约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%、约99%或更多的序列是预测定的感兴趣序列)。
在一些实施方式中，本文提供的所述方法和设备使用固定在表面或底物上的寡核苷酸(如结合于支持物的寡核苷酸)。结合于支持物的寡核苷酸包含例如与构建寡核苷酸、锚寡核苷酸和/或间隔子寡核苷酸互补的寡核苷酸。本文使用的术语“支持物”、“底物”和“表面”可互换使用，并且指聚合物例如核酸在上面合成或固定的多孔或非多孔溶剂不溶性材料。本文使用的“多孔”指所述材料包含有基本一致直径(例如nm范围)的孔。多孔材料包含纸、合成过滤器等。在这种多孔材料中，所述反应可以在孔中进行。所述支持物能有很多形状中的任意一种，例如销型、条、板、平盘、杆状、弯曲、圆柱形结构、颗粒（包含珠、纳米颗粒）等。所述支持物能有可变宽度。所述支持物能是亲水性的，或能制成亲水性的，并且包含无机粉末如二氧化硅、硫酸镁、和氧化铝;天然聚合材料，特别是纤维素材料和纤维素衍生材料，例如包含纤维的纸，如滤纸、色谱纸等;合成或改性天然产生的聚合物，如硝酸纤维素、乙酸纤维素、聚(氯乙烯)、聚丙烯酰胺、交联的葡聚糖、琼脂糖、聚丙烯酸酯、聚乙烯、聚丙烯、聚(4-甲基丁烯)、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸酯、聚(对苯二甲酸乙二酯)、尼龙、聚(丁酸乙烯酯)、聚偏二氟乙烯(PVDF)膜、玻璃、可控孔度玻璃、磁性可控孔度玻璃、陶瓷、金属等;或者单独使用或与其他材料联用。在一些实施方式中，以阵列形式合成寡核苷酸。例如，在常见支持物上原位合成单链寡核苷酸，其中各寡核苷酸在底物的分开或不同特征（或点）上合成。在优选实施方式中，单链寡核苷酸结合到所述支持物或特征的表面上。本文所用的术语“阵列”指对存储、扩增和释放寡核苷酸或对进一步反应的互补寡核苷酸而言，不同特征的排列。在优选实施方式中，所述支持物或阵列是可寻址的：所述支持物包含所述支持物上特定预定位点（即“地址”）的两个或更多个分离的可寻址特征。因此，阵列上各寡核苷酸分子位于所述支持物上已知和确定的位点。各寡核苷酸序列能从所述支持物上其位点处测定。所述阵列可以包含特征之间的区域。特征之间可以在其表面载有任何寡核苷酸，并且可以对应惰性空间。
在一些实施方式中，寡核苷酸在表面或阵列的不同特征上连接、点样、固定、表面结合、支持或合成。寡核苷酸可以共价连接到表面或置于表面上。阵列可以构建、定制购买或购自商业销售商(如安捷伦公司(Agilent)、昂飞公司(Affymetrix)、Nimblegen)。各种构建方法为本领域熟知，如无掩膜阵列合成器、利用掩膜的光定向方法、流动通道方法、点样法等。在一些实施方式中，构建和/或选择寡核苷酸可以使用无掩膜阵列合成器(MAS)在固体支持物上合成。无掩膜阵列合成器描述于例如PCT申请号WO99/42813和相应的美国专利号6,375,903。其他示例为已知的无掩膜设备，其能制造定制的DNA微阵列，其中所述阵列上的各特征有所需序列的单链DNA分子。其他合成寡核苷酸的方法包含例如利用掩模的光定向方法、流动通道方法、点样（spotting）法、销型方法、和利用多个支持物的方法。就合成寡核苷酸而言利用掩模的光定向方法(如VLSIPSTM方法)描述于美国专利号5,143,854、5,510,270和5,527,681。这些方法涉及活化固体支持物上的预定区域，并且然后使所述支持物接触预选择的单体溶液。选定区域能用通过掩模的光源辐射来活化，方法大多按照集成电路制造中使用的光刻法技术。所述支持物的其他区域保持失活，因为照射被掩模封闭并且其仍保持化学保护。因此，光模式定义所述支持物上的哪个区域与给定的单体反应。通过重复活化不同预定区域组和使不同单体溶液接触所述支持物，在所述支持物上生产聚合物的多种阵列。能可选使用其他步骤，例如从所述支持物上洗涤未反应的单体溶液。其他可应用方法包含机械技术如描述于美国专利号5,384,261中的那些。可用于在单个支持物上合成寡核苷酸的其他方法描述于例如美国专利号5,384,261。例如，试剂可以通过(1)在预定区域上确定的通道中流动，或者(2)预定区域上的“点样”递送到所述支持物上。也可以使用其他方法以及点样和流动的组合。在各示例中，当所述单体溶液递送到多个反应位点时，所述支持物上的某些活化区域与其他区域机械分开。流动通道方法涉及例如微流体系统以控制固体支持物上的寡核苷酸合成。例如，多种聚合物序列可以在固体支持物的选定区域上合成，所述合成是通过形成合适试剂流过或合适试剂置于其中的所述支持物表面上的流动通道。制备固体支持物上寡核苷酸的点样法涉及通过直接置于选定区域而递送相对少量的反应物。在一些步骤中，所述整体支持物表面能用溶液喷洒或覆盖，如果这样做更有效的话。精确测量的单体溶液等分样品可以通过从区域到区域移动的分配器逐滴置入。在固体支持物上合成寡核苷酸的销型方法描述于例如美国专利号5,288,514。销型方法利用有多个销型或其他延伸的支持物。所述销型各同时插入到浅盘的单个试剂容器中。96销型的阵列通常利用96容器的浅盘，例如96孔微量滴定皿。各个浅盘填充有在单个销型上特定化学反应中偶联的特定试剂。因此，所述浅盘会经常包含不同试剂。由于优化所述化学反应从而各反应能在相对相似的反应条件组下进行，可能同时进行多个化学偶联的步骤。
在另一个实施方式中，可在多个支持物上合成或固定多个寡核苷酸。一个示例是描述于例如美国专利号5,770,358;5,639,603;和5,541,061的基于珠的合成方法。对珠上合成分子例如寡核苷酸而言，大量珠悬于容器中的合适运载体（如水）内。提供了有可选间隔子分子的珠，所述分子有其复合的活性位点，可选为保护基团。在合成的各步骤中，分开所述珠以偶联到多种容器中。新生寡核苷酸链脱保护后，不同单体溶液加入到各容器中，从而在给定容器的所有珠上，发生相同的核苷酸加成反应。所述珠然后用过量试剂洗涤，收集入单个容器中，混合并重新分布到另一种容器以准备下一轮合成。应注意到通过在最初利用的大量珠，相似地在容器内随机分布了大量珠，很多轮随机加入碱基后，各有在其表面合成的独特寡核苷酸序列。可以用序列来标记单个珠，所述序列对其上的双链寡核苷酸独特，从而能在应用中鉴定。预合成的寡核苷酸和/或多核苷酸序列可以连接到支持物上或使用下列方法原位合成：光定向方法、流动通道和点样法、喷墨法、销型方法和珠法，所述方法示于下列参考文献中：McGall等(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.93:13555;SyntheticDNA Arrays In Genetic Engineering（基因工程中的合成DNA阵列）,卷20:111,普莱南出版社（Plenum Press）(1998);Duggan等(1999)Nat.Genet.S21:10;Microarrays:MakingThem and Using Them In Microarray Bioinformatics（微阵列：在微阵列生物信息学中制备和使用）,剑桥大学出版社（Cambridge University Press）,2003;美国专利申请公开号2003/0068633和2002/0081582;美国专利号6,833,450、6,830,890、6,824,866、6,800,439、6,375,903和5,700,637;和PCT公开号WO04/031399、WO04/031351、WO04/029586、WO03/100012、WO03/066212、WO03/065038、WO03/064699、WO03/064027、WO03/064026、WO03/046223、WO03/040410和WO02/24597;所述申请通过引用全文纳入本文以用于所有目的。在一些实施方式中，预合成的寡核苷酸连接到支持物上或使用点样方法合成，其中单体溶液通过从区域到区域移动的分配器(如喷墨)逐滴置入。在一些实施方式中，使用例如机械波驱动的分配器在支持物上点样寡核苷酸。
一方面，本发明涉及生成在固体支持物上有预定序列的靶标多核苷酸的方法。所述合成多核苷酸长度为至少约1、2、3、4、5、8、10、15、20、25、30、40、50、75、或100千碱基(kb)、或1兆碱基(mb)、或更长。一些方面中，本发明涉及生成高保真多核苷酸的方法。在示例性实施方式中，合成多核苷酸的组合物包含至少约1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或更多的无错误拷贝(如有未从预定序列衍生的序列)。无错误拷贝的百分比是基于相较组合物中旨在有正确（如预定或预测定的）序列的多核苷酸拷贝总数，组合物中无错误拷贝的数目。
在一些实施方式中，所述核酸靶标序列通过混合全部所需重叠寡核苷酸以形成有预定序列的多核苷酸构建物而在单个步骤中获得。或者，一系列组装反应可以平行或顺序进行，从而更大多核苷酸构建物可以从一系列分开的组装反应中组装。
本发明的一些方面涉及用于高保真性多核苷酸组装的寡核苷酸设计。本发明内容可用于增加核酸组装过程的生产率(throughput rate)和/或降低用于生成正确组装核酸序列的步骤数目或试剂用量。在某些实施方式中，本发明各方面可以用于自动核酸组装的环境下以降低各正确核酸序列组装所需的时间、步骤数目、试剂量、和其他因素。因此，本发明的这些和其他方面可以用于降低一个或多个核酸组装过程的成本和时间。
本发明的一些方面涉及多核苷酸组装过程，其中，设计合成的寡核苷酸并且用作引物延伸反应、合成互补寡核苷酸的模板，和组装多核苷酸成为更长多核苷酸构建物。在一些实施方式中，所述方法包含在链延伸反应中使用第一组单链寡核苷酸作为模板合成多个寡核苷酸或多核苷酸。如前所述，寡核苷酸可以首先在表面的不同特征组上合成，或可以置于在所述支持物的多个特征上。所述支持物可以包含至少100、至少1,000、至少104、至少105、至少106、至少107、至少108个特征。在一个优选实施方式中，所述寡核苷酸共价连接到所述支持物上。在优选实施方式中，所述寡核苷酸组固定在固体表面上。在一个优选实施方式中，固体表面的各特征包含有不同预定序列的高密度寡核苷酸(如每个特征约106-108分子)。
在一些实施方式中，不同的单链寡核苷酸组固定在固体支持物的不同特征上。在一些实施方式中，所述结合于支持物的寡核苷酸可以通过其5’末端连接。在一个优选实施方式中，所述结合于支持物的寡核苷酸通过其3’末端连接。在一些实施方式中，所述结合于支持物的寡核苷酸可以通过核苷酸序列(如简并结合序列)、接头或间隔子(如光可切割的连接或化学接头)固定在支持物上。应该理解3’末端是指所述5’末端的下游序列，和5’末端是指所述3’末端的上游序列。例如，寡核苷酸可以通过不参与杂交的核苷酸序列、接头或间隔子固定在支持物上。所述结合于支持物的寡核苷酸的3’末端然后指接头或间隔子的上游序列。
在某些实施方式中，寡核苷酸可以设计成具有与要组装的不同预测定靶标多核苷酸序列部分相同或互补的序列。因此，在一些实施方式中，各寡核苷酸可以具有与双链靶标核酸的两条链之一的部分相同或互补的序列。本文使用的术语"互补"指两个核苷酸之间精确配对的能力。例如，如果在核酸给定位点的核苷酸能与另一核酸的核苷酸形成氢键，则认为两个核酸分子在该位点彼此互补。两条单链核酸间的互补性可以是“部分的”，其中仅有一些核苷酸结合，或者为完全互补，即当单链分子间存在完全互补性时。
在一些实施方式中，设计构建寡核苷酸组，例如构建寡核苷酸组各自在其5’末端有与另一个构建寡核苷酸5’末端互补的序列区域，和在其3’末端有与不同构建寡核苷酸3’末端互补的序列区域。本文使用的“构建”寡核苷酸指用于多核苷酸组装的单链寡核苷酸组或单链寡核苷酸群之一。构建寡核苷酸组包含所述靶标多核苷酸的正义和反义链的寡核苷酸。构建寡核苷酸能有任何长度，设计所述长度以容纳重叠或互补序列。构建寡核苷酸能具有相同大小或不同大小。在优选实施方式中，所述构建寡核苷酸无缺口地跨越靶标多核苷酸的完整序列。在其他实施方式中，所述构建寡核苷酸部分重叠，产生互相杂交时构建寡核苷酸之间的缺口。优选地，构建寡核苷酸的库或群包含有重叠序列的构建寡核苷酸，从而构建寡核苷酸能在合适的杂交条件下互相杂交。应该理解各内部构建寡核苷酸与两个不同的构建寡核苷酸杂交，而所述构建寡核苷酸在其5’和/或3’末端会各自与不同(或相同)的内部寡核苷酸杂交。重叠构建寡核苷酸的杂交和连接会因此产生有3’和/或5’突出端的靶标多核苷酸。在一些实施方式中，所得靶标多核苷酸可包含在其5’或/和3’末端的钝末端。在一些实施方式中，如果所述靶标多核苷酸从N组构建寡核苷酸中组装，设计1–N组不同结合于支持物的单链寡核苷酸，例如第一组构建寡核苷酸在其5’末端包含与锚寡核苷酸5’末端序列区域互补的序列区域，并且其中N组构建寡核苷酸在其3’末端包含与(N-1)构建寡核苷酸3’末端序列区域互补的序列区域。在一些实施方式中，所述第一组寡核苷酸有与结合于支持物的锚单链寡核苷酸5’末端互补的5’末端。本文使用的所述锚寡核苷酸指设计成与至少一部分靶标多核苷酸互补的寡核苷酸，并且可以固定在所述支持物上。在一个示例性实施方式中，所述锚寡核苷酸有与所述靶标多核苷酸5’末端互补的序列，并且可以固定在所述支持物上。
应该理解不同的寡核苷酸可以设计成有重叠序列区域的不同长度。重叠序列区域可以相同(即对应核酸片段的相同链)或互补(即对应核酸片段的互补链)。重叠序列可以具有任何合适的长度。重叠序列可以长约5–约500个核苷酸(如长约10–100、约10-75、约10-50、约20、约25、约30、约35、约40、约45、约50个核苷酸等)。然而，可以使用更短、更长或中间的重叠长度。应该理解用于组装反应的不同输入核酸之间的重叠(5’或3’区域)可以有不同长度。在一些实施方式中，锚结合于支持物的(或固定的)寡核苷酸包含有帮助预测定核酸序列组装的重叠区域的序列区域。在优选实施方式中，锚寡核苷酸包含有与不同寡核苷酸或多核苷酸(例如子组件产物)杂交的互补区域的序列区域。所述互补区域指在固定模板寡核苷酸(如模板寡核苷酸)3’末端或5’末端的序列区域。在优选实施方式中，所述互补区域定位在锚寡核苷酸的5’末端。互补区域指能与第二寡核苷酸或多核苷酸5’末端或3’末端杂交的第一寡核苷酸或多核苷酸3’末端或5’区域
在一些实施方式中，使用基于连接酶的组装技术来组装核酸，其中设计所述寡核苷酸以提供靶标多核苷酸构建物的全长正义(或正链)和反义(或负链)链。所述正义和反义寡核苷酸的杂交后，连接各链上的所述寡核苷酸以形成所述靶标多核苷酸或子组件产物。参考文献是美国专利号5,942,609，其全文纳入本文。基于连接酶的组装技术可以涉及一种或多种合适的连接酶，所述酶能催化临近3'和5'核酸末端的共价连接(如核酸的5'磷酸和3'羟基在互补模板核酸上退火从而所述3'末端立即临近5'末端)。因此，如果所述第一和第二核酸在模板核酸上互相临近退火，连接酶可以催化第一核酸的5'磷酸和第二核酸的3'羟基之间的连接反应。连接酶可以获自重组或天然来源。连接酶可以是热稳定的连接酶。在一些实施方式中，可以使用来自嗜热微生物的热稳定连接酶。热稳定DNA连接酶的例子包括但不限于：Tth DNA连接酶(来自嗜热栖热菌（Thermus thermophilus），可来自例如友基公司（Eurogentec）和GeneCraft公司);Pfu DNA连接酶(来自激烈火球菌(Pyrococcusfuriosus)的超嗜热连接酶);Taq连接酶(来自水生栖热菌(Thermus aquaticus)),(来自Epicenter生物技术公司)任何其他合适的热稳定连接酶，或其任意组合。在一些实施方式中，可以使用一种或多种更低温度的连接酶(如T4DNA连接酶)。更低温度的连接酶可以用于在更高温度下可能不稳定的更短突出端(如约3、约4、约5、或约6个碱基的突出端)。
非酶技术能用于连接核酸。例如，一个或多个核酸的5'末端(如5'磷酸基团)和3'末端(如3'羟基)可以不用酶(如不使用连接酶)而共价连接在一起。在一些实施方式中，非酶技术可以提供超过酶连接的某些优势。例如，非酶技术可以有核酸底物中非天然核苷酸类似物的高耐受性，可以用于连接短的核酸底物，可以用于连接RNA底物，和/或可以是对某些自动（如高通量）应用而言更便宜和/或合适。
非酶连接可以参与化学连接。在一些实施方式中，两种或更多种不同核酸的核酸末端可以化学连接。在一些实施方式中，单个核酸的核酸末端可以化学连接(如以环化核酸)。应理解第一双链核酸末端的两条链可以与第二双链核酸末端的两条链化学连接。然而，在一些实施方式中，仅第一核酸末端的一条链可以与第二核酸末端的单条链化学连接。例如，第一核酸末端一条链的5'末端可以连接到第二核酸末端一条链的3'末端，而没有化学连接互补链末端。
因此，化学连接可以用于形成第一核酸末端的5'末端和第二核酸末端的3'末端的共价连接，其中所述第一和第二核酸末端可以是单个核酸末端或分核酸末端。一方面，化学连接可以涉及有改末端(如改的5'和/或3'末端)的至少一个核酸底物，包含帮助或连接形成的一种或多种化学反应部分。在一些实施方式中，当使得一个或多个核酸末端紧密相邻时(如由于互补核酸序列之间的退火，使所述末端集合)，发生化学连接。因此，互补3'或5'突出端之间(如由双链核酸的限制性酶剪接生成的突出端)或引起3'末端与5'末端紧密相邻的任意互补核酸组合之间(如当所述核酸与互补模板核酸退火时，3'和5'末端互相临近)的退火可以提高模板定向的化学连接。化学反应的示例可以包含但不限于缩合、还原、和/或光-化学连接反应。应该理解在一些实施方式中，化学连接能用于生成天然产生的磷酸二酯核苷酸间连接、非天然产生的磷酰胺焦磷酸核苷酸间连接、和/或其他非天然产生的核苷酸间连接。
在本发明的一些方面，通过聚合酶链延伸组装寡核苷酸。在一些实施方式中，所述延伸反应的第一步骤使用引物。在一些实施方式中，所述寡核苷酸可以包含5’末端或3’末端或两个末端上的通用(对所有寡核苷酸常见)、半通用(至少对部分寡核苷酸常见)或者单个或独特引物(对各寡核苷酸特异)结合位点。本文使用的术语“通用”引物或引物结合位点指用于扩增所述寡核苷酸的序列对所有寡核苷酸是常见的，从而所有这种寡核苷酸能使用单组通用引物来扩增。在其他环境下，寡核苷酸包含独特引物结合位点。本文使用的术语“独特引物结合位点”指选择性扩增寡核苷酸亚组的一组引物识别序列。在其他环境下，寡核苷酸包含通用和独特扩增序列，其能可选顺序使用。在第一步中，加入引物，并且与固定或结合于支持物的寡核苷酸退火。例如，所述引物能与固定的锚寡核苷酸退火。在一些实施方式中，设计所述引物与结合于支持物的或固定的寡核苷酸序列互补，称为引物结合位点。在第一步中，包含聚合酶、至少一个引物和dNTP的溶液在促进引物延伸的条件下加入到固体支持物的特征上。例如，对图1而言，将引物(50)加入到包含寡核苷酸(1’、2’、3’、和4’)的特征上。所述引物在结合于支持物的寡核苷酸的引物结合位点上杂交并且处于促进引物延伸条件下，所述引物使用结合于支持物的序列(1’、2’、3’或4’)作为模板延伸到互补寡核苷酸(1、2、3或4)。
在一些实施方式中，尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)可以用于水解核酸中的尿嘧啶-糖苷键，由此在DNA中除去尿嘧啶和生成碱性敏感性碱基位点，其能随后通过内切核酸酶、热或碱处理水解。结果，双链核酸的单链部分可以除去，由此在形成单链突出端中暴露互补序列。这个方法需要在双链核酸片段的一条链中有意掺入一个或多个尿嘧啶碱基。这可以通过例如使用包含3'末端尿嘧啶的扩增引物来扩增核酸片段。在一些实施方式中，所述引物是包含多个尿嘧啶(U)的引物。所述引物首先与结合于支持物的单链寡核苷酸退火，加入dNTP和合适的聚合酶在合适的条件和温度下延伸。在后续步骤中，所述引物可以除去。UDG处理后，可以释放尿嘧啶的引物5'区域(如稀释、孵育、暴露于温和变性条件等后)，由此暴露互补序列作为单链突出端。应该理解突出端的长度可以通过扩增引物上尿嘧啶的位点和扩增引物的长度来确定。在一些实施方式中，使用尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)和DNA糖基化酶-裂解酶内切核酸酶的混合物，例如USERTM(尿嘧啶特异性切割试剂，NEB公司（NewEngland Biolabs）)。UDG催化尿嘧啶碱基的切除，形成脱碱基位点，而留下完整的磷酸二酯主链。内切核酸酶VIII的裂解酶活性破坏了在脱碱基位点3′和5′侧的磷酸二酯主链，从而释放了无碱基的脱氧核糖。在后续步骤中，所述引物可以移除。
应该理解延长反应能在涵盖所有可用特征的单个容积中发生，所述特征包含结合于支持物的寡核苷酸(1’、2’、3’和4’)，或者各步骤能在局部单个微容积中发生，所述微容积包含仅发生特异性延伸步骤的感兴趣区域。在一些实施方式中，所述延伸和/或组装反应在微滴中进行(见PCT申请PCT/US2009/55267和PCT申请PCT/US2010/055298，各通过引用全文纳入本文)。
引物延伸可以涉及一种或多种合适的聚合酶，在合适核苷酸和退火模板存在下，能催化核酸以5’-3’方向进行基于模板的延伸。聚合酶可以是热稳定的。聚合酶可以获自重组或天然来源。在一些实施方式中，可以使用来自嗜热微生物的热稳定聚合酶。在一些实施方式中，聚合酶可以包含3’→5’外切核酸酶/校对活性。在一些实施方式中，聚合酶可以没有或有很少校对活性(如聚合酶可以是天然聚合酶的重组变体，所述变体经改性以降低其校对活性)。热稳定DNA聚合酶的例子包括但不限于：Taq(来自细菌水生栖热菌(Thermusaquaticus)的热稳定DNA聚合酶);Pfu(来自激烈火球菌(Pyrococcus furiosus)的有3’→5’外切核酸酶/校对活性的嗜热DNA聚合酶，可购自例如普洛麦格(Promega)公司);DNA聚合酶和VentRO(外切)DNA聚合酶(来自滨海嗜热球菌(Thermococcuslitoralis)的有或没有3’→5’外切核酸酶/校对活性的嗜热DNA聚合酶;也称为Th聚合酶);DeepDNA聚合酶和Deep(外切)DNA聚合酶(来自古细菌种类GB-D的有或没有3’→5’外切核酸酶/校对活性的嗜热DNA聚合酶；可获自NEB公司);KOD HiFi(有3’→5’外切核酸酶/校对活性的重组鹿儿岛高温球菌(Thermococcus kodakaraensis)KODI DNA聚合酶，可获自诺瓦基公司(Novagen));BIO-X-ACT(有5’-3’DNA聚合酶活性和3’→5’校对活性的酶混合物);克列诺（Klenow）片段(大肠杆菌DNA聚合酶I的N末端截断，保留了聚合酶的活性但丧失了5’→3’外切核酸酶活性，可获自例如普洛麦格和NEB公司);SequenaseTM(缺乏T-5’外切核酸酶活性的T7DNA聚合酶);Phi29(噬菌体29DNA聚合酶可以用于滚环扩增，例如在TempliPhiTMDNA测序模板扩增试剂盒中，所述试剂盒可获自阿莫山生物科学公司（AmershamBiosciences）);TopoTaq(组合甲烷嗜高热菌属(Methanopyrus)拓扑异构酶的超稳定DNA结合域和DNA解联活性的杂交聚合酶，没有外切核酸酶活性，可获自FS公司（FidelitySystems）);纳入有外切核酸酶活性的校对结构域的TopoTaq HiFi;PhusionTM(有加工性增强结构域的古细菌样酶，可获自NEB公司);任意其他合适的DNA聚合酶，或其两种或更多种的任意组合。在一些实施方式中，所述聚合酶能是SDP(链置换聚合酶;如SDPe-，其是没有外切核酸酶活性的SDP)。这使得能在统一温度下进行等温PCR(等温延伸、等温扩增)。当所述聚合酶(例如Phi29、Bst)沿着模板前行，其取代了互补链(如在前面延伸反应中生成)。因为取代的DNA是单链，引物能以恒定温度结合，在扩增中不需要任何热循环。
在一些实施方式中，延伸或扩增后，所述聚合酶可以失活以防止干扰后续步骤。加热步骤(如高温)能变性并灭活非热稳定的大部分酶。酶可以在有或没有脂质的情况下失活。干燥支持物上热失活的优势是使酶灭活而对寡核苷酸没有有害影响。在一些实施方式中，可以使用热稳定的PCR DNA聚合酶的非热稳定形式，尽管所述酶就错误率和速度而言不太优化。或者，Epoxy dATP能用于灭活所述酶。
在一个实施方式中，提供了包含有表面结合单链寡核苷酸组的至少一个特征的支持物。寡核苷酸组结合到支持物的不同特征上，并且连接到所述特征的寡核苷酸组的预测定序列不同于连接到不同特征上的寡核苷酸的预测定序列。通过模板依赖性合成在所述支持物第一特征上的链延伸反应中合成至少一组寡核苷酸。在一些实施方式中，包含所述不同特征的全部支持物或阵列处于热循环、退火温度条件、严谨熔融温度条件、或变性温度条件。加热和冷却所述支持物能在任何热循环仪器中进行。在其他实施方式中，一个或多个不同特征处于特异性温度条件(退火、延伸、洗涤或熔融)。能通过局部加热至少一个不同特征进行选定独立特征(互相分离)的热循环。通过本领域已知的任何方式局部加热不同特征。例如，所述不同特征可以使用激光能量源局部加热，所述激光能量源以精确x-y维度控制，由此单独调节液滴的温度。在另一个示例中，更宽的束激光与掩模的组合能用于辐照特定特征。在一些实施方式中，提供了控制支持物上温度从而酶反应能在支持物上发生(PCR、连接或任何其他温度敏感性反应)的方法。在一些实施方式中，扫描激光用于控制固体支持物上不同特征的热循环。使用的波长能选自广谱(100nm-100,000nm，即紫外-红外)。在一些实施方式中，包含寡核苷酸的特征包含光学吸收器或指示器。在一些实施方式中，所述固体支持物通过空气或液体的循环冷却。要存储的能量能基于吸收表现来计算。在一些实施方式中，液滴温度能使用热动力学建模。所述温度能通过LCD样材料或任何其他原位技术测量。在另一个实施方式中，所述全支持物能加热和冷却以发生酶反应或其他温度敏感性反应。在一些实施方式中，能量来源能通过扫描设置指导以在包含结合于支持物分子的固体支持物表面上多个位点存储能量。能在固体支持物表面加入吸光材料。能使用光能量来源例如高强度灯、激光或其他电磁能量来源(包含微波)。不同反应位点的温度能独立通过控制各特征的存储能量来控制。例如，数字显微镜装置(DMD)能用于温度控制。DMD是显微制造的空间光调制器。例如，参见美国专利号7,498,176。在一些实施方式中，DMD能用于精确加热所述固体支持物上的选定点或液滴。所述DMD能是有其表面的芯片，例如在对应要加热的所述点或液滴的阵列上排列的数十万到数百万的显微镜像。所述镜像在开启或关闭状态下能单独旋转(如±10-12°)。在开启状态下，来自光源的光(如灯泡)反射到固体支持物上以加热选定点或液滴。在关闭状态下，所述光指向其他地方（如散热器）。在一些实施方式中，所述阵列可以是矩形阵列。在一个示例中，所述DMD能由16μm宽微镜的1024×768阵列组成。在另一个示例中，所述DMD能由10μm宽微镜的1920×1080阵列组成。其他阵列大小和微镜宽度的排列也是可能的。这些镜像能单独寻址，并且能用于生成所述固体支持物上不同点加热的任何给定模式或安排。这些点也能加热到不同温度，例如通过对单独点提供不同波长，或/和控制辐射时间。在某些实施方式中，所述DMD能使光指向选定点，并且用于鉴定、选择、熔融或/和切割所选的任何寡核苷酸。
图1显示了在底物或固体支持物上生成有预测定序列的多核苷酸的示例性方法。在一些实施方式中，多核苷酸可以组装以合成最终核酸序列(如靶标核酸)。参照图1(a)，核酸阵列10显示有特征20的排列，其中各特征包含结合于支持物的单链寡核苷酸组30。优选地，结合于支持物的寡核苷酸通过其3’末端连接。在一些实施方式中，结合于支持物的单链寡核苷酸长约20个核苷酸、约40个核苷酸、约50个核苷酸、约60个核苷酸、约70个核苷酸、约80个核苷酸、约100核苷酸或更长。在一些实施方式中，所述寡核苷酸30还包含在3’末端的通用引发位点(如在3’末端的15个碱基引物结合位点)和与构建寡核苷酸互补的序列(也称为结构模块，和表示为1’、2’、3’等)。在一些实施方式中，所述构建寡核苷酸互相毗连，并且一起组成或跨越靶标多核苷酸的序列。在优选实施方式中，所述构建寡核苷酸无缺口地跨越靶标多核苷酸的整体长度。在另一个实施方式中，所述构建寡核苷酸部分重叠，使得在互相杂交时产生构建寡核苷酸之间的缺口。参考图1，所述靶标多核苷酸从构建寡核苷酸群中组装，偶数构建寡核苷酸表示双链靶标多核苷酸的一条链(即正链)和奇数表示双链靶标多核苷酸的互补链(即负链)。优选地，构建寡核苷酸的库包含有重叠序列的构建寡核苷酸，从而构建寡核苷酸能在合适的杂交条件下互相杂交。应该理解各内部构建寡核苷酸会与两个不同的构建寡核苷酸杂交，而所述构建寡核苷酸在其5’和/或3’末端会各与不同(或相同)的内部寡核苷酸杂交。重叠构建寡核苷酸的杂交会因此产生有3’和/或5’突出端的靶标多核苷酸。在一些实施方式中，所得靶标多核苷酸可以包含在其5’或/和3’末端的钝末端。所述构建寡核苷酸可以使用本领域已知的连接组装技术后续连接以形成共价连接的双链核酸构建物(图1(d))。
参考图1(b)，包含结合于支持物的寡核苷酸的支持物10上至少一个特征与引物50一起孵育。在第一步中，所述引物首先与固定的单链寡核苷酸退火，并且在合适聚合酶和dNTP存在时于合适延伸条件下延伸，以形成构建寡核苷酸60(称为1、2、3、4)，其与结合于支持物的寡核苷酸互补(1’、2’、3’、4’)。在一些实施方式中，所述引物是包含多个尿嘧啶(U)的引物。在后续步骤中，所述引物可以移除。优选加入USERTM内切核酸酶以消化引物。消化引物可以在延伸步骤后发生，由此生成包含与结合于支持物的寡核苷酸杂交的构建寡核苷酸的双链体(如1-1’、2-2’等…)。在另一个实施方式中，在溶液中释放构建寡核苷酸后，溶液中发生引物的消化(图1c)。
在第二步骤中(图1c)，新合成的延伸产物(构建寡核苷酸65:1、2、3、或/和4)熔融，并且从支持物10上释放。解离可以平行或顺序进行。所述构建寡核苷酸可以在溶液中释放。在一个实施方式中，所述溶液是包含10mM Tris、50mM氯化钠、和1mM EDTA的缓冲液。熔融双链体可以通过例如在所述阵列特异性位点处增加温度到熔融温度(如95°C)来进行。或者，所述双链体可以通过加入能分离双链核酸的酶来解离。解旋酶可以在所述阵列的特异位点上加入。解旋酶为本领域已知，并且显示了将DNA从双链结构解绕成单链结构。所述单链延伸产物能转化成包含第一组锚结合于支持物的寡核苷酸的第二支持物15，第一组锚寡核苷酸序列包含与第一延伸产物(如构建寡核苷酸1)部分互补的序列。所述第一延伸产物在合适条件下与第一组锚寡核苷酸杂交。在相同反应中或随后，其他延伸产物(或重叠构建寡核苷酸)能在合适条件下与其互补序列杂交，由此形成更长多核苷酸序列。参考图1(d)，构建寡核苷酸65能转移到包含锚结合于支持物的寡核苷酸40的新表面15，所述寡核苷酸40有与第一构建寡核苷酸(构建寡核苷酸1)互补的序列。另外，设计构建寡核苷酸(构建寡核苷酸2、3、4等)以如所示通过其重叠区域互相杂交而形成更长的核酸构建物70。在一些实施方式中，所述锚结合于支持物的寡核苷酸优选单链。在一些实施方式中，所述锚结合于支持物的寡核苷酸包含与第一组寡核苷酸5’末端互补的5’末端。所述一起形成多核苷酸序列的其他构建寡核苷酸包含互补3’末端并且互相杂交。图1(d)的插图显示了寡核苷酸的示例，所述寡核苷酸设计成互相杂交以组装成更长多核苷酸构建物，组成锚寡核苷酸40。连接酶80引入溶液中以连接各个连接，由此形成如图1(e)所示共价连接的更长多核苷酸构建物90。如需要，组装中所述最后寡核苷酸(如构建寡核苷酸4)可以用荧光标记物标记，从而指示发生全长构建。
在某些示例性实施方式中，可检测标记能用于检测本文所述的一种或多种寡核苷酸或多核苷酸。可检测标记物的示例包含各种放射性部分、酶、辅基、荧光标记物、发光标记物、生物发光标记物、金属颗粒、蛋白-蛋白结合对、蛋白-抗体结合对等。荧光蛋白的示例包括但不限于黄色荧光蛋白(YFP)、绿色荧光蛋白(GFP)、青色荧光蛋白(CFP)、伞形酮、荧光素、荧光素异硫氰酸酯、若丹明、二氯三嗪胺荧光素、丹磺酰氯、藻红蛋白等。生物发光标记物的示例包括但不限于萤光素酶(如细菌、萤火虫、叩头虫（click beetle）等)、萤光素、发光蛋白等。有可见检测信号的酶系统示例包括但不限于半乳糖苷酶、葡糖醛酸苷酶（glucorimidase）、磷酸酶、过氧化物酶、乙酰胆碱酯酶等。可识别标记物也包含放射性化合物如125I、35S、14C、或3H。可识别标记物可以从各种来源市售获得。
在一些实施方式中，所述支持物包括含有与构建寡核苷酸互补的结合于支持物的寡核苷酸的特征组，和包含锚结合于支持物的寡核苷酸的至少一个特征。所述锚寡核苷酸优选单链，并且包含与所述靶标多核苷酸的末端序列互补的序列。参考图2(a)，显示了与图1所述相似的寡核苷酸阵列110，除了所述支持物包含相同表面、结合于支持物的寡核苷酸130、和结合于支持物的锚寡核苷酸140。
参考图2(b)，引物150在杂交条件下与所述结合于支持物的寡核苷酸130杂交。在第一步中，所述引物与结合于支持物的单链寡核苷酸退火，并且通过加入dNTP和合适聚合酶在合适条件和温度下延伸，以形成构建寡核苷酸160(寡核苷酸1、2、3、4)，其与结合于支持物的寡核苷酸互补(1’、2’、3’、4’)。在一些实施方式中，所述引物是包含多个尿嘧啶(U)的引物。在后续步骤中，所述引物可以移除。优选加入USERTM内切核酸酶以消化引物。消化引物可以在延伸步骤后发生，由此生成包含与结合于支持物的寡核苷酸杂交的构建寡核苷酸的双链体。在另一个实施方式中，在溶液中释放构建寡核苷酸后，溶液中发生引物的消化(165、图2c)。
在第二步骤中(图2c)，新合成的延伸产物(构建寡核苷酸:1、2、3、或/和4)熔融，并且从所述特征上（构建寡核苷酸165）释放。构建寡核苷酸的解离能平行或顺序进行。所述构建寡核苷酸165可以在溶液中释放。熔融双链体可以通过增加温度到熔融温度(如95°C)进行。再者，所述双链体可以使用能解离双链核酸的酶如解旋酶解离。所述第一延伸产物能在合适条件下与第一组锚寡核苷酸杂交，并且所述其他延伸产物(或重叠寡核苷酸)能在合适条件下与其互补序列杂交。
参考图2(d)，构建寡核苷酸65与锚结合于支持物的寡核苷酸140杂交，所述寡核苷酸140有与第一构建寡核苷酸(构建寡核苷酸1)互补的序列。另外，设计构建寡核苷酸(2、3、4等)以如图2d所示通过其重叠区域互相杂交以形成更长的核酸构建物170。在优选实施方式中，所述锚结合于支持物的寡核苷酸是单链。在一些实施方式中，所述锚结合于支持物的寡核苷酸包含与第一组寡核苷酸5’末端互补的5’末端。所述一起形成多核苷酸序列的其他构建寡核苷酸包含互补3’末端并且互相杂交。图2(d)显示了寡核苷酸的示例，所述寡核苷酸设计成互相杂交以组装成更长多核苷酸构建物，组成锚寡核苷酸140。将连接酶180引入溶液中以共价连接各个连接，由此形成如图2(e)所示共价连接的更长多核苷酸构建物190。如需要，组装中所述最后寡核苷酸(构建寡核苷酸4)可以用荧光标记物标记，从而指示发生全长构建。
本发明各方面涉及有预定序列的靶标多核苷酸的选择和/或移除不需要的组装产物。在从寡核苷酸组装多核苷酸时，能组装不需要产物如部分长度多核苷酸、截短的构建物。其能用于除去没有正确序列和/或长度的不需要产物或多核苷酸。在一些实施方式中，一种或多种组装的多核苷酸可以测序以测定其是否包含预测定的序列。这个方法能鉴定有正确序列的片段。在其他实施方式中，本领域已知的其他技术可以用于除去包含核酸片段的错误。
本发明的一些方面中，提供了从外切核酸酶消化中选择性保护靶标多核苷酸序列的方法，由此帮助去除不需要的构建物。能使用优选消化单链核酸的任何各种核酸酶。合适的核酸酶包含例如单链特异性3'外切核酸酶、单链特异性内切核酸酶、单链特异性5'外切核酸酶等。在某些实施方式中，所述核酸酶包含大肠杆菌外切核酸酶I。在一些实施方式中，进行所述外切核酸酶消化以消化全部非双链序列。选择方法示于图3。在一个实施方式中，所述选择方法利用全长组装产物的末端3’或5’突出端。应该理解全部组装产物的单链突出序列(5’或3’)会对应末端寡核苷酸序列(例如图3所示的构建寡核苷酸4)。在不需要的产物中，所述单链3’或5’突出端序列有不同于预定末端寡核苷酸的序列。例如，如图3所示，所述不需要的产物有构建寡核苷酸2、或3而不是末端构建寡核苷酸4的游离突出端。本文所用的术语“末端寡核苷酸”或“末端构建寡核苷酸”指在靶标多核苷酸末端序列或末端突出端的寡核苷酸。在一些实施方式中，所述末端寡核苷酸对应所述靶标多核苷酸的3’或5’单链突出端。在一些实施方式中，所述靶标多核苷酸序列包含至少第一寡核苷酸和末端构建寡核苷酸，其中所述末端寡核苷酸是第一寡核苷酸的下游。在一些实施方式中，所述靶标多核苷酸包含第一寡核苷酸、末端寡核苷酸和至少一个内部寡核苷酸。
图3a-c显示的示例中也生成截短或不需要的组装(72、和74，图3b)以及全长组装(70，图3b)。为了过滤掉所述不需要的组装，能将核酸发夹结构或茎环寡核苷酸200加入到组装产物中。所述茎环寡核苷酸设计成与5’或3’突出端杂交，并且连接成在全长组装产物70中存在的两个末端寡核苷酸。另外，所述茎环寡核苷酸设计成不与截短产物72和74杂交或连接。
所述茎环结构可以通过设计在其单链序列中有互补序列的寡核苷酸来形成，由此所述单链自体折叠回以形成双链茎和单链环。优选地，所述双链茎结构域有至少约2个碱基对，和所述单链环有至少3个核苷酸。优选地，所述茎包含突出单链区域(3’或5’)，即所述茎是部分双链体。例如，所述突出端长度能是约3–约10、-约20、-约50个核苷酸等。在示例性实施方式中，所述茎环寡核苷酸的突出端长度与全部组装多核苷酸或靶标多核苷酸的5’或3’单链突出端互补。
参考图3d，所述茎环寡核苷酸与有预定序列的全长多核苷酸连接。参考图3e，所述支持物表面暴露于外切核酸酶，例如3’核酸酶。在优选实施方式中，所述茎环寡核苷酸用于保护全长多核苷酸构建物70的突出端(3’或5’突出端)。没有杂交/连接到所述茎环寡核苷酸的不需要构建物(如截短构建物)易于消化。消化步骤(图3e)后，所述茎环寡核苷酸可以从全长构建物上切除。例如，在一些实施方式中，所述茎环寡核苷酸设计成在茎环寡核苷酸的茎结构上包含II型限制性位点，并且所述茎环寡核苷酸从核酸构建物限制性酶(如II型限制性酶)上切除。在其他实施方式中，所述茎环寡核苷酸设计成包含至少一个尿嘧啶，并且所述茎环寡核苷酸使用尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)和DNA糖基化酶-裂解酶内切核酸酶VIII或USERTM酶的混合物从核酸构建物上切去。在一些实施方式中，所述全长多核苷酸可以从表面切去。在一些实施方式中，必要限制性位点能特异性包含在第一组寡核苷酸设计和/或锚寡核苷酸设计中。在一些实施方式中，所述限制性位点是II型限制性位点。在一些实施方式中，所述全长构建物可以后续扩增。
在一些实施方式中，所述锚寡核苷酸的3’区域包含限制性酶位点。在一些实施方式中，引物/引物结合位点可以设计成包含限制性内切核酸酶切割位点。在示例性实施方式中，引物/引物结合位点包含IIs型限制性内切核酸酶的结合和/或切割位点。有特异性结合和/或切割位点的多种限制性内切核酸酶市售可得，例如来自NEB公司(马萨诸塞州贝弗利)。在多种实施方式中，可以使用生成3’突出端、5’突出端或钝末端的限制性内切核酸酶。当使用生成突出端的限制性内切核酸酶时，可以使用外切核酸酶(如RecJf、外切核酸酶I、外切核酸酶T、S1核酸酶、P1核酸酶、绿豆核酸酶、T4DNA聚合酶、CEL I核酸酶等)生成钝末端。或者，特异性限制性内切核酸酶形成的粘性末端可以用于帮助在所需排列中组装子组件。在示例性实施方式中，可以使用包含IIs型限制性内切核酸酶的结合和/或切割位点的引物/引物结合位点除去暂时引物。所述术语“IIs型限制性内切核酸酶”指有非回文识别序列和在所述识别位点外(如识别位点远端0–约20核苷酸)出现的剪切位点的限制性内切核酸酶。IIs型限制性内切核酸酶可以在双链核酸分子上生成切口，或者生成产生钝末端或粘性末端的双链断裂(如5’或3’突出端)。IIs型限制性内切核酸酶的示例包括例如生成3’突出端的酶，如Bsr I、Bsm I、BstF5I、BsrD I、Bts I、Mnl I、BciV I、Hph I、Mbo II、Eci I、AcuI、Bpm I、Mme I、BsaX I、Bcg I、Bae I、Bfi I、TspDT I、TspGW I、Taq II、Eco57I、Eco57MI、Gsu I、Ppi I、和Psr I;生成5’突出端的酶，如BsmA I、Ple I、Fau I、Sap I、BspM I、SfaNI、Hga I、Bvb I、Fok I、BceA I、BsmF I、Ksp632I、Eco31I、Esp3I、Aar I;和生成钝末端的酶，如Mly I和Btr I。IIs型内切核酸酶市售可得，并且为本领域熟知(NEB公司，马萨诸塞州贝弗利)。
在其他实施方式中，所述引物和/或引物结合位点包含至少一个尿嘧啶，并且所述引物使用提供的尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)和DNA糖基化酶-裂解酶内切核酸酶VIII或USERTM酶的混合物切去。
在一些其他实施方式中，靶标多核苷酸的选择利用所需靶标多核苷酸的大小或长度优势。图4显示了在阵列表面测量多核苷酸构建物长度和选择全长多核苷酸构建物的方法。优选地，所述方法使从不同多核苷酸构建物长度分布中选择正确长度靶标多核苷酸构建物。本领域技术人员应了解核酸与玻璃表面的连接化学性质通常引起核酸分子与分子间距(d)1-15nm，优选2-8nm，优选5-7nm。在一些实施方式中，距离d是约6nm。参考图4b，可以制备表面215，其有固定在所述支持物上的第一组锚寡核苷酸240和第二组锚寡核苷酸242，其中所述第一和第二组锚寡核苷酸有不同的预定序列。在一些实施方式中，所述第一和第二组锚寡核苷酸通过预测定的距离X分开。在一些实施方式中，所述距离X可以通过使等数目的第一和第二锚分子与第三结合于支持物的寡核苷酸序列（称为间隔子寡核苷酸序列245）混合来设定和控制。在一些实施方式中，所述间隔子寡核苷酸序列设计成没有与构建寡核苷酸互补的序列。在一些实施方式中，所述间隔子寡核苷酸是单链。在其他实施方式中，所述间隔子寡核苷酸是双链。在一些实施方式中，使用下列方程式设定所述距离X：
X～d x(C[间隔子]/C[锚1+锚2])
其中d是两个核酸分子之间的距离，C[间隔子]是间隔子寡核苷酸的浓度，C[锚1+锚2]是锚寡核苷酸1和锚寡核苷酸2混合物的浓度。
参考图4，构建寡核苷酸265使用结合于支持物的寡核苷酸230作为模板通过引物延伸来合成。在一些实施方式中，第一结合于支持物的锚寡核苷酸240设计成具有与第一组构建寡核苷酸互补的序列。构建寡核苷酸265可以互相杂交并和与锚寡核苷酸杂交，由此生成结合于支持物的多核苷酸构建物(270、272、273、274，图4b)。组装反应后，一些这种多核苷酸构建物(270)可以是有预定序列的全长多核苷酸，而其他多核苷酸构建物(272、273、274)可以比全长多核苷酸构建物短。考虑到所述核酸构建物中的核苷酸间隔为约0.33nm或0.34nm，包含1000个核苷酸碱基(按照通常基因长度)的核酸构建物长度为约340nm。在一些实施方式中，可以设计第二结合于支持物的锚寡核苷酸242，从而其能连接到全长DNA构建物270的末端或5’突出端。另外，如果距离X设定为全长构建物期望的大致长度，那么全长构建物的所述末端或5’突出端应该仅结合到第二锚寡核苷酸，如果a)所述全长构建物在末端有正确序列，和如果b)所述全长构建物有正确长度(290，如图4c所示)。在一些实施方式中，所示第一锚240可以包含II型内切核酸酶位点。所述全长产物可以使用II型限制性内切核酸酶切割，生成在第二锚242远末端锚定的产物。在一些实施方式中，所述锚序列包含至少一个尿嘧啶，并且所述全长产物使用尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)和DNA糖基化酶-裂解酶内切核酸酶VIII或USERTM酶的混合物切割。
本发明一些方面涉及能进行高度平行结合于支持物的寡核苷酸组装的设备和方法。在一些实施方式中，多核苷酸阵列可以通过顺序加入与多种锚寡核苷酸互补的重叠寡核苷酸而在表面上组装。在优选实施方式中，有不同预测定序列的多核苷酸组在阵列的不同特征上合成。参考图5，提供了锚阵列310，其中所述阵列的各特征包含如上述结合于支持物的锚寡核苷酸(340:A0、B0、C0、D0)。各锚寡核苷酸可以是单链，并且可以在其5’末端包含与第一组寡核苷酸5’末端互补的序列。应该理解对不同多核苷酸的高平行合成而言，各特征上的锚寡核苷酸组需要有与待合成预测定多核苷酸序列5’末端互补的序列。因此，在一些实施方式中，所述锚阵列包含在所述阵列不同特征上的不同锚寡核苷酸群，各群或各组锚寡核苷酸有不同的5’末端序列。另外，能提供两个或更多个构建阵列(311、312和315)，其中上述构建阵列包含特征组，各特征包含有预定序列的不同结合于支持物的寡核苷酸群(An、Bn、Cn、Dn)。应该理解在一些实施方式中，各特征包含结合于支持物的寡核苷酸组，其具有的预测定序列不同于相同表面上另一特征中结合于支持物的寡核苷酸组。所述寡核苷酸序列能有一个或多个碱基的区别。参考图5，第一阵列311包含第一组结合于支持物的寡核苷酸331(A1’、B1’、C1’、D1’)，其中各个第一组寡核苷酸的序列部分与连接到锚阵列的特征的锚寡核苷酸314的5’末端相同。所述第二阵列312包含第二组结合于支持物的寡核苷酸332(A2’、B2’、C2’、D2’)，其中第二组寡核苷酸的各自5’末端与第一组寡核苷酸331的5’末端互补。应理解根据要组装的多核苷酸序列和长度，可以提供一种或多种(例如m)其他阵列，各阵列包含结合于支持物的寡核苷酸组(A’m-1、B’m-1、C’m-1、D’m-1)，其有与另一组结合于支持物的寡核苷酸335(A’m、B’m、C’m、D’m)5’末端互补的游离5’末端。在一些实施方式中，在不同支持物上提供互补寡核苷酸组。
参考图6，使用所述第一组结合于支持物的寡核苷酸331(A1’、B1’、C1’、D1’)作为模板来生成第一组互补寡核苷酸(构建寡核苷酸A1、B1、C1、D1)。在一些实施方式中，一种或多种结合于支持物的寡核苷酸在促进引物延伸条件下于聚合酶存在时与引物一起孵育。在一些实施方式中，所述第一组结合于支持物的寡核苷酸331(A1’、B1’、C1’、D1’)在其3’末端有设计成与引物序列(如引物结合位点)互补的序列。在一些实施方式中，所述引物是包含多个尿嘧啶的引物，而且延伸后，使用本文所述USERTM内切核酸酶移除引物。类似地，构建寡核苷酸A2、B2、C2、D2和Am、Bm、Cm、Dm能以平行或顺序方式合成，由此生成结合于支持物的双链寡核苷酸(如361:A1A1’等…)。
如图7所示，构建寡核苷酸能从构建阵列上释放。在一些实施方式中，所述构建寡核苷酸在促进双链体解离条件下释放(如在本文所述的熔融温度或解旋酶存在下)。图7显示了通过顺序加入互补重叠的构建寡核苷酸而平行合成有不同预测定序列的多核苷酸组。参考图7a，第一组不同构建寡核苷酸371(A1、B1、C1、D1)从构建阵列311释放。在一些实施方式中，所述构建寡核苷酸转移并且与锚阵列310退火，所述锚阵列310包含的锚寡核苷酸(A0、B0、C0、D0)在其5’末端有与第一组构建寡核苷酸371的5’末端序列互补的序列，由此形成双链体381(如A0A1、B0B1、C0C1、D0D1)。在优选实施方式中，所述第一组双链体包含3’游离突出端。如图7b所示，在一个末端有与第一组双链体突出端互补序列的不同构建寡核苷酸372的第二群(A2、B2、C2、D2)从构建阵列312上释放。所述第二群与锚-第一构建寡核苷酸双链体381的游离3’突出端退火，所述双链体381连接到锚阵列310以形成双链体382(A0A1A2、B0B1B2、C0C1C2、D0D1D2)。在一些实施方式中，第二组双链体包含5’游离突出端。在一些实施方式中，设计成有与所述5’突出端互补序列的第三构建寡核苷酸群与第二组双链体的5’游离突出端退火。这个过程能用从构建阵列生成和释放的额外构建寡核苷酸来重复，直到合成了各多核苷酸的所需长度和序列。在一些实施方式中，所述内部构建寡核苷酸设计成在其3’末端有与下一个内部构建寡核苷酸3’末端序列区域互补的序列区域。在一些实施方式中，各构建寡核苷酸群从不同的构建阵列上合成，并且设计成互相杂交以组装成有预定序列的更长多核苷酸。在一些实施方式中，对应所需多核苷酸5’末端的所述构建寡核苷酸有与结合于支持物的锚寡核苷酸互补的序列。在一些实施方式中，所述构建寡核苷酸使用连接酶连接。在一些实施方式中，各构建寡核苷酸与突出端退火，并且能连接定义双链靶标多核苷酸的一条链的所述构建寡核苷酸。构建寡核苷酸可以在各顺序加入构建寡核苷酸后连接，或者一旦所述构建寡核苷酸互相退火以形成全长多核苷酸则可连接。
本发明的一些方面中，构建寡核苷酸从构建阵列以高度平行方式顺序转移到锚阵列。在一些实施方式中，通过向锚寡核苷酸组顺序排列、转移和加入互补重叠寡核苷酸来在锚上组装多核苷酸组。在一些实施方式中，所述构建阵列和锚阵列紧密相邻引入以使构建寡核苷酸从构建阵列向锚阵列转移。优选地，使所述构建阵列的距离与两组寡核苷酸(A1、B1等…)之间距离基本相当或更小。在一些实施方式中，所述构建阵列和锚阵列之间的距离是约10μm-约1000μm。在这个范围内实现所需距离，在一些实施方式中，通过使用将间隔子球(例如可获自CM公司（Cospheric Microspheres）)稀释成压缩下保持两个阵列分离的单层。在其他实施方式中，生成硅胶膜例如聚二甲基硅氧烷(PDMS)，以在薄室中包含所述阵列之一，所述薄室在使第二阵列达到膜的高度后密封。在其他实施方式中，使用液体培养基本身作为间隔子，一个阵列能漂浮于另一个的顶部。当在能使用的标准显微镜载玻片上均匀分散时，例如100μL液体培养基或溶液有约50微米的厚度。
在一些实施方式中，构建寡核苷酸组在如上述至少一个阵列上合成。参考图8，构建寡核苷酸组在至少一个构建阵列的选定特征(如表面411)上合成，寡核苷酸组(如A1、B1、C1、D1)有不同的预定序列。在一些实施方式中，构建寡核苷酸组在构建支持物组的选定特征(如表面411、412、415)上合成，各组寡核苷酸有不同的预定序列。根据一些实施方式，构建寡核苷酸使用结合于支持物的寡核苷酸作为模板通过引物延伸来合成。在一些实施方式中，第一组寡核苷酸(如支持物411上的寡核苷酸461)可以在聚合酶存在时于促进引物延伸条件下与引物一起孵育。所述第一组结合于支持物的寡核苷酸在其3’末端能有设计成与引物序列(如引物结合位点)互补的序列。在一些实施方式中，所述引物是包含多个尿嘧啶(如USERTM可剪切的引物)的引物，而且引物延伸后，使用本文所述USERTM内切核酸酶移除引物。相似地，有预定序列的构建寡核苷酸A2、B2C2D2,…Am、Bm Cm、Dm能通过引物延伸以平行或顺序方式合成，由此形成双链体。如图8所示，这产生在其表面(411,12,415)有双链体组的阵列组，所述双链体包含构建寡核苷酸和模板寡核苷酸(表面411上的寡核苷酸461:A1、B1C1D1;表面412上的寡核苷酸462A2、B2C2D2;表面415上的寡核苷酸465Am、Bm Cm、Dm)。
构建阵列组可以设计成有相同构造，各特征与下一个特征通过相同距离分开，并且各特征在阵列上相似排列。例如，所述第一支持物411有n个特征，分别包含寡核苷酸的第一、第二和第n个群，各寡核苷酸有预定序列。应该理解各寡核苷酸组与其他组寡核苷酸差异一个或多个碱基。相似地，所述支持物412有寡核苷酸的第一、第二和第n个群，其中所述第一支持物的第一寡核苷酸群有与所述第二支持物的第一寡核苷酸群互补的序列(如图9c所示)。在示例性实施方式中，所述第一支持物的第一寡核苷酸群有与所述第二支持物的第一寡核苷酸群互补的3’末端序列。相似地，所述第m个支持物的第m个寡核苷酸群有与所述第(m-1)个支持物的第(m-1)个寡核苷酸群互补的序列区域。
在一些实施方式中，第一构建阵列与锚阵列410对齐，其中各特征包含结合于支持物的锚寡核苷酸(A0、B0、C0、D0)。各锚寡核苷酸可以是单链，并且可以在其5’末端包含与第一构建阵列的寡核苷酸组5’末端互补的序列。应该理解对有不同预定序列的多核苷酸组的高平行合成而言，各锚寡核苷酸组能有不同的5’末端序列。在一些实施方式中，所述不同5’末端序列能差异一个或多种碱基。在一些实施方式中，所述构建阵列和锚阵列垂直对齐，所述构建阵列定义为顶部阵列，和所述锚阵列定义为底部阵列。在优选实施方式中，所述锚序列和构建序列设计成有相同构造，各特征与下一个特征通过相同距离分开，并且各特征在阵列上相似排列。应该理解设计构建和锚阵列能对齐所述锚和所述构建寡核苷酸，所述锚寡核苷酸有与所述构建寡核苷酸互补的序列。对齐所述构建和所述锚阵列后，所述构建寡核苷酸可以在溶液中释放，引起所述构建寡核苷酸与锚寡核苷酸的捕获和杂交。然后能使固定在不同支持物上的第二构建寡核苷酸群与锚阵列紧密相邻，并且顺序加入包含所述锚寡核苷酸和所述第一构建寡核苷酸群的双链体。
所述第一构建阵列能与所述锚阵列对齐和临近。一些情况中，所述构建阵列和锚阵列的对齐和临近是在液体培养基或溶液存在下，其允许随后构建寡核苷酸从顶部构建阵列向底物锚阵列近端扩散和转移(图9中竖直方向所示)。构建寡核苷酸能在液体培养基中从构建阵列例如在促进双链体解离的条件下释放。例如，所述双链体能在高于构建寡核苷酸双链体的熔融温度下通过加热选定特征或整体阵列来解离。参考图9a-b，有不同预定序列(A1、B1C1D1)的第一组构建寡核苷酸在液体培养基485中从第一构建阵列释放，并且到所述锚阵列上捕获，形成双链体组(如双链体441，A0A1、B0B1、C0C1、D0D1)。参考图9c-d，第二构建阵列对齐并与包含所述锚-第一构建寡核苷酸双链体群的所述锚阵列紧密相邻。在液体培养基存在下比对和接近所述第二构建阵列和所述锚阵列使随后第二组构建寡核苷酸从第二构建阵列向锚阵列近端转移。参考图9d，所述第二组构建寡核苷酸A2、B2C2D2，462从阵列412上释放，并且与锚微阵列410退火以形成多核苷酸442A0A1A2、B0B1B2、C0C1C2、D0D1D2。然后，所得组装多核苷酸可在液体培养基中通过包含连接酶例如Taq DNA连接酶和其必需反应成分来连接，以形成单共价键连接的分子。在一些实施方式中，所述连接酶可补充有非链置换DNA连接酶以填充缺口和增加连接的效率。这个过程可以用所述构建微阵列组装的额外成员来重复，直到所需长度的多核苷酸在锚寡核苷酸阵列上合成。
在一些实施方式中，错误校正可以纳入各过程重复和/或组装过程末期之间，从而增加没有从所需序列偏离的合成多核苷酸的相对群。这种错误校正可包含直接测序和/或应用误差校正酶（error correcting enzyme），所述酶例如校误核酸酶(如CEL I)、基于MutS或MutS同源物结合或其他错配结合蛋白的误差校正，本领域已知的其他错误校正方法，或其任何组合。在示例性实施方式中，CEL I可以加入到液体培养基中的寡核苷酸双链体。CEL I是切割所有错配类型的错配特异性内切核酸酶，例如单核苷酸多态性、小插入或删除。加入CEL I内切核酸酶引起错配位点或区域处双链寡核苷酸的切割。图9e描述了在其表面有多核苷酸组452的锚阵列410，所述多核苷酸通过图9a-d所述的加工方法来组装。所组装的多核苷酸可以包含一种或多种序列误差500(十字所显示)。校误核酸酶例如CEL I可以用于在错误位点切割双链多核苷酸，引起如图9f所示的经切割多核苷酸453。
在一些实施方式中，所述第一构建阵列与所述锚阵列的对齐和临近是在液体培养基和多孔膜存在下。根据一些实施方式中，多孔膜置于构建阵列和锚阵列之间以限定所示构建寡核苷酸在液体培养基中向锚阵列的非选定特征横向扩散(图10)。应该理解所述渗透膜能限制构建寡核苷酸主要在垂直方向上扩散，因此降低构建寡核苷酸向非对应锚寡核苷酸的横向扩散。例如，所示膜能是有统一孔径的多孔聚合物膜。在一些实施方式中，所示膜的孔径足以使核酸相对自由通过。在一些实施方式中，所述孔径范围能是约10nm–约100nm或更大。优选所述孔径不大于不同寡核苷酸A1、B1等之间的大约距离。在优选实施方式中，所述孔填充因子或孔径比尽可能大。合适的膜包含描述于下面的那些：Polymer Membraneswith Two-Dimensionally Arranged Pores Derived from Monolayers of SilicaParticles（《来自二氧化硅颗粒单层的二维排列孔的聚合物薄膜》）,Feng Yan和WernerA.Goedel Chem.Mater.,2004,16(9),第1622–1626页。
应该理解对某些情况而言，保证高百分比的所述锚阵列上可用位点捕获所述构建寡核苷酸是有利的，而不是由于所述构建阵列再捕获构建寡核苷酸来保持不填充。为了通过锚阵列增加捕获概率，可以完成至少一些构建寡核苷酸与锚阵列的共价结合。参考图11，描述了图9中详述的改良过程。图11显示了包含至少两个不同重叠构建寡核苷酸的第一构建阵列与锚阵列在包含连接酶和必需反应成分的液体培养基或溶液中的对齐和临近，以及所述构建寡核苷酸从所述构建阵列向锚阵列的后续近端转移。在一些实施方式中，在构建寡核苷酸阵列上的各特征设计成通过所述锚阵列选定特征上的锚寡核苷酸群对两个或更多个要捕获的重叠寡核苷酸起作用。参考图11a，所述构建寡核苷酸阵列420的各特征载有两个寡核苷酸481(如A1和A2)/锚寡核苷酸(如A0)。所述构建寡核苷酸A1和A2可以释放到位于构建阵列420和锚阵列410之间的液体培养基或溶液485中。在一些实施方式中，所述溶液还包含连接酶180，从而当构建寡核苷酸A1和A2组装成锚A0时(图11b)，寡核苷酸A2共价连接到锚A0上。这种排列和存在连接酶通过所述锚阵列上的锚寡核苷酸提供优选捕获构建寡核苷酸。
在一些实施方式中，设计所述构建寡核苷酸阵列和所述锚寡核苷酸阵列，从而要转移到锚阵列的构建寡核苷酸数目对各对应锚寡核苷酸在化学计量上过量。这种设计使所述构建寡核苷酸由各所述锚寡核苷酸捕获的可能性显著更高，由此增加了合成预定多核苷酸中的逐步产率。
图12描述了第一构建阵列与锚阵列在液体培养基中的对齐和临近，以及构建寡核苷酸从所述构建阵列向所述锚阵列的后续近端转移，其中所述构建寡核苷酸的数目对各相应锚寡核苷酸在化学计量上过量。参考图12，设计所述锚阵列430，从而其包含与构建寡核苷酸数目相比化学计量上更少的锚寡核苷酸(A0、B0、C0、D0)，所述构建寡核苷酸由对各对应锚寡核苷酸的构建阵列411提供。这种设计保证了所述锚阵列上所述构建寡核苷酸与各锚寡核苷酸的结合是化学计量上有利的。参考图12a和出于示例性目的，对锚阵列430上的各锚寡核苷酸而言，在所述构建阵列411的各特征上描述了三组构建寡核苷酸。所述构建寡核苷酸阵列411是相对锚寡核苷酸阵列430来排列。关注构建寡核苷酸A1与锚寡核苷酸A0的对齐，在构建寡核苷酸A1从其对应模板寡核苷酸分离后，三个A1拷贝中每一个有四个潜在结合位点：A1的各拷贝能回复结合构建阵列411(3个潜在位点)或者被其重新捕获，或者结合到所述锚寡核苷酸A0上。捕获后，四个潜在结合位点之一会保持是空的。由于各结合位点保持为空的可能性等同，所述A0保持为空的概率是25%，和A0被占据的概率是75%。为了增加构建寡核苷酸与所述锚寡核苷酸甚至更进一步的结合概率，所述构建寡核苷酸与锚寡核苷酸的比率甚至可以进一步倾斜。在一些实施方式中，构建寡核苷酸与锚寡核苷酸的比率是至少10:1、至少100:1、至少1000:1、至少104:1、至少105:1、至少106:1。
应该理解增加构建所需多核苷酸效率的方法是降低构建过程中的步骤数目。在一些实施方式中，所述多核苷酸使用分级构建方法来合成，其中从构建阵列数轮转移后，多个锚阵列可以本身用作下面步骤的构建阵列。分级过程在几何学上降低操作相同数目转移，以及在各锚阵列上完成转移数目的时间，由此降低了逐步损失的影响。图13a显示了两个锚阵列470和471，经历了从构建阵列多次转移，分别产生表面连接的经合成多核苷酸472和473。如所述，合成多核苷酸的一条链与来自所述锚阵列的初始锚连接，从而例如合成多核苷酸的长度长于A0(如果初始锚阵列与分别来自图11或图12的410或430相似)。没有连接到锚阵列的多核苷酸链释放引起图13b所示阵列之间的多核苷酸转移。存在连接酶和必需的连接反应成分使得多核苷酸共价连接在一起。应该注意到对说明目的而言，显示多核苷酸从锚阵列471向锚阵列470转移，尽管所述转移在两个阵列之间分布。为了降低整体误差率，表面固定的经合成多核苷酸472和473可以首先暴露于如图9e-f说明所述的校误核酸酶。由于一些校误核酸酶在双链和单链核酸连接处切割，多核苷酸472和473能设计成完全双链或可以连接后通过向多核苷酸472和473加入其他缺口填充寡核苷酸而转化成双链。
应该理解寡核苷酸环境下组装反应的描述并不意在构成限制。例如，其他多核苷酸(如单链、双链多核苷酸、限制性片段、扩增产物、天然产生的多核苷酸等)可以与一种或多种寡核苷酸共同包含在组装反应中，从而生成感兴趣多核苷酸。
本发明各方面可以用于涉及合成核酸的生成和/或使用的一定范围应用。如本文所述，本发明提供了生成保真度增加的合成核酸和/或降低合成组装反应的成本和/或时间的方法。所得组装核酸可以体外扩增(如使用PCR、LCR，或任何合适的扩增技术)，体内扩增(如通过克隆到合适的载体中)，分离和/或纯化。
本文提供的方法和设备方面可以包含移除本文所述含有错误的核酸序列。无错误的核酸序列能通过移除包含错误的序列或包含错误的核苷酸来富集。所述核酸序列能是构建寡核苷酸，或组装产物，例如子组件或最终所需的多核苷酸。在一些实施方式中，所述核酸序列可以使用本领域已知方法（例如酶切割或扩增）在溶液中从支持物上释放。这个步骤能在局部仅包含感兴趣区域或特征的单个微体积或者单个体积中发生。在一些实施方式中，在微滴中进行移除包含错误的核酸序列。所述核酸序列可以是有预定序列的任何双链多核苷酸。在组装过程中的一个或多个阶段进行扩增，产生双链寡核苷酸或组装产物的库。应该理解这种库可以包含异源双链体(有一个或多个序列错误的双链核酸序列)和同源双链体(无错误双链核酸序列或有互补序列错误的双链核酸序列)。如图14所示，所述双链核酸可以包含一个或多个序列错误(十字指示异源双链体)。CEL核酸酶(CEL I或CEL II)是错配特异性内切核酸酶，已知其在单碱基取代、小缺失或小插入位点的双链中剪切双链核酸。CEL I在错配位点的3’侧剪切核酸，生成一个或多个核苷酸的单链3’突出端。在一些实施方式中，所述内切核酸酶CEL I(SurveyorTM)能用于在这种错误位点剪切双链核酸，生成抗酸序列库，所述库如图14c所示包含带3’突出端的含有错误的经剪切核酸、和无错误同源双链体。所述错配核苷酸能使用有3’-5’外切核酸酶活性的T4聚合酶和/或Klenow聚合酶移除，由此生成基本无错误的双链核酸库(如图14d所示的同源双链体)。在一些实施方式中，所述核酸序列库然后能例如通过聚合酶链反应(PCR)使用末端引物(图14e)扩增。引物可以是通用引物、半通用引物、或对核酸分子末端序列特异的引物。在一些实施方式中，在使核酸库扩增前，双链体首先能解离和再退火。所述过程能检测和移除互补错误，所示互补错误可以保持无法由错配特异性内切核酸酶保留检测。
组装核酸(单独或克隆到载体中)可以转化入宿主细胞(如原核、真核、昆虫、哺乳动物或其他宿主细胞)。在一些实施方式中，所述宿主细胞可以用于增殖所述核酸。在某些实施方式中，所述核酸可以整合到所述宿主细胞的基因组中。在一些实施方式中，所述核酸可以取代细胞基因组上的对应核酸区域(如通过同源重组)。因此，核酸可以用于生成重组生物。在一些实施方式中，靶标核酸可以是整个基因组或用于取代全部或部分宿主生物基因组的基因组大片段。重组生物也可以用于多种研究、工业、农业、和/或医学应用。在一些实施方式中，本文所述方法可以在组装大的核酸分子(如大于5,000个核苷酸长度，如大于约10,000、大于约25,000、大于约50,000、大于约75,000、大于约100,000个核苷酸等)中使用。在示例性实施方式中，本文所述方法可以在组装生物(如病毒、细菌、酵母或其他原核或真核生物)的整个基因组(或其大片段，如约10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更多)中使用，可选将特异性修饰在一个或多个所需位置整合到序列中。
本文提供的方法和设备方面可以包含自动操作本文所述的一个或多个作用（act）。在一些实施方式中，扩增和/或组装反应的一个或多个步骤可以使用一个或多个自动化样品处理设备(如一个或多个自动化液体或流体处理设备)来自动操作。自动化设备和方法可以用于递送反应试剂，包含下列中的一个或多个：起始核酸、缓冲液、酶(如一种或多种连接酶和/或聚合酶)、核苷酸、盐、和任何其他试剂如稳定剂。自动化设备和方法也可以用于控制反应条件。例如，自动化热循环仪可以用于控制反应温度和可以使用的任何反应循环。在一些实施方式中，扫描激光器可以自动化以提供适于孵育多核苷酸的一个或多个反应温度或温度循环。相似地，经组装多核苷酸产物的后续分析可以自动进行。例如，测序可以使用测序设备和自动化测序方案自动进行。其他步骤(如扩增、克隆等)也可以使用一种或多种合适设备和相关方案自动进行。应该理解本文所述的一个或多个设备或设备组件可以在某一系统(如机器人系统)或微环境(如微流体反应室)中组合。组装反应混合物(如液体反应样品)可以从所述系统的一个组件向另一个组件转移，使用自动化设备和方法(如样品和/或样品容器的机械化操作和/或转移，包含自动化移液设备、微系统等)。所述系统和其任何组件可以通过控制系统来控制。由此，本文所提供设备的方法步骤和/或内容可以使用例如计算机系统(如计算机控制系统)自动进行。能实施本文所提供技术方面的计算机系统可以包含用于任何处理类型的计算机(如本文所述序列分析和/或自动化设备控制)。然而，应该理解某些处理步骤可以通过作为所述组装系统一部分的一种或多种自动化设备来提供。在一些实施方式中，计算机系统可包含两个或更多个计算机。例如，一个计算机可以通过网络偶联到第二个计算机。一个计算机可以进行序列分析。第二计算机可以控制系统中的一个或多个自动化合成和组装设备。其他方面中，其他计算机可以包含在网络中以控制一个或多个分析或处理作用（act）。各计算机可以包含内存和处理器。所述计算机可采用任何形式，因为本文提供的技术方面对在任何特定计算机平台上实施没有限制。相似地，所述网络能采用任何形式，包含专用网络或公共网络(如互联网)。显示设备能与一个或多个设备和计算机联合。或者，或另外，显示设备可以位于远端位点，并且根据本文提供的技术连接以显示分析输出。所述系统不同组件之间的连接可以通过有线、光纤、无线传送，卫星传送，任何其他合适的传送，或者上述两种或多种的任意组合。
本文所提供技术的各个不同方面、实施方式、或作用（act）能以多种方式独立自动进行和实施。例如，各个方面、实施方式或作用（act）能使用硬件、软件或其组合独立实施。当以软件实施时，所述软件密码能在任何合适的处理器或处理器集合上执行，所述处理器集合在单独计算机中提供或分布在多个计算机上。应该理解完成上述功能的任何组件或组件集合能通常看作控制上面所讨论功能的一个或多个控制器。所述一个或多个控制器能以多种方式实施，例如有使用微码或软件程序控制的专用硬件或通用目的硬件(如一个或多个处理器)以完成上述功能。
在这方面，应该理解本文所提供技术实施方式的一种实现中包含了用计算机程序(如多种指令)编码的至少一种计算机可读介质(如计算机内存、软盘、光盘、磁带等)，当在处理器上运行时，完成本文所提供技术的一种或多种上述功能。所述计算机可读介质可运输，从而其上存储的程序能加载到任何计算机系统来源以运行本文所提供技术的一种或多种功能。另外，应该理解执行时，提及完成上面讨论功能的计算机程序不限于在主机上运行应用程序。相反，所述术语计算机程序在本文以一般意义使用，指任何类型的计算机编码(如软件或微码)，能用于编程处理器以进行上面讨论的本文所提供技术方面。
应该理解与处理器存储于计算机可读介质上的数个本文所提供技术的实施方式一致，所述计算机实施处理在其执行过程中可以接收手工输入(如来自用户)。
因此，本文所述组装设备或组件的整体系统水平控制可以通过系统控制器进行，所述系统控制器可以向以下提供控制信号：相关的核酸合成器、液体处理设备、热循环仪、测序设备、相关的机械化组件，以及对运行所需输入/输出或其他控制功能的其他合适系统。因此，所述系统控制器与任何设备控制器一起形成控制核酸组装系统运作的控制器。所述控制器可以包含通用目的数据处理系统和其他相关设备，所述通用目的数据处理系统能是通用目的计算机或用常目的计算机的网络，所述其他相关设备包含通信设备、调制解调器、和/或其他回路或组件，以进行所需输入/输出或其他功能。所述控制器也能至少部分作为单个特定目的集成电路(如ASIC)或ASIC阵列实施，各有用于整体、系统水平控制的主要或中央处理器部分，和专用的分离部分以在中央处理器部分控制下进行多种不同特定计算、功能和其他处理。所述控制器也能使用多种分离的专用程序集成或其他电子回路或设备实施，例如硬线电子或逻辑回路如分开的元件电路或程序逻辑设备。所述控制器也能包含任何其他组件或设备，如用户输入/输出设备(监控器、显示器、打印机、键盘、用户点击设备、触摸屏、或其他用户界面等)、数据存储设备、驱动马达、连接、阀控制器、机械化设备、真空和其他泵、压力传感器、检测器、电源供应器、脉冲源、通信设备或其他电子电路或组件等。所述控制器也可以控制系统其他部分的运作，如自动化客户订单处理、质量控制、包装、运输、开票等，以进行本领域已知而本文没有详述的其他合适功能。
本发明的各方面可以单独使用、联用或以前述实施方式未特定讨论的各种排列来使用，并且因此并不限制其应用于前面描述或附图说明所示组件的细节和排列。例如，一个实施方式的所述方面可与其他实施方式所述方面以任何方式组合。
权利要求中修改权利要求项使用的顺序术语“第一”、“第二”、“第三”等本身并不暗指任何优先、级别高低、或一个权利要求项高于另一个的顺序或实行方法作用（act）的暂时顺序，而是仅仅用作标记把有某一名称的一个权利要求项与有相同名称的另一项(但是就顺序术语使用而言)区分开以区别权利要求项。
而且，本文所用的词语和术语是为了描述目的，而不是限制性的。本文使用“包含”、“包括”、或“具有”、“含有”、“涉及”及其变化意味着涵盖其后列出的项目及其等价物，以及额外的项目。
等同形式
本发明提供了用于高保真基因组装的新方法和设备等。尽管讨论了本发明的具体实施方式，但以上说明书仅为说明性而非限制性的。本领域的技术人员在阅读本说明书后将清楚了解本发明的许多变化。本发明的全部范围应该通过参考所附权利要求书连同其等同物的全部范围，以及说明书连同此类变化来决定。
通过引用纳入
参考文献是2010年11月12日提交的美国临时申请61/412,937，名为“Methods andDevices for Nucleic Acids Synthesis（核酸合成的方法和设备）”;2010年11月30日提交的美国临时申请61/418,095，名为“Methods and Devices for Nucleic Acids Synthesis（核酸合成的方法和设备）”和2011年3月23日提交的美国临时申请61/466,814，名为“Methods and Devices for Nucleic Acids Synthesis（核酸合成的方法和设备）”，2009年8月27日提交的PCT申请PCT/US2009/55267，2010年11月03日提交的PCT申请PCT/US2010/055298，和2010年11月19日提交的PCT申请PCT/US2010/057405。本文提到的所有发表物、专利和序列数据库条目在此通过引用全文纳入，就好像各个单独发表物或专利特定和单独地表明通过引用纳入。
Claims (55)
1.一种生成至少一种有预定序列的多核苷酸的方法，所述方法包含：
a.提供至少第一组和第二组3’末端结合于支持物的单链寡核苷酸，其中第一组和第二组结合于支持物的寡核苷酸各自具有预定序列，并且结合于一个或多个支持物的不同位点上，结合于支持物的第一组寡核苷酸各自5’末端所含序列区域与结合于支持物的第二组寡核苷酸5’末端序列区域互补；
b.在链延伸反应中生成与所述第一组和第二组结合于支持物的寡核苷酸互补的至少第一组和第二组构建寡核苷酸，第一组构建寡核苷酸3’末端所含序列区域与第二组构建寡核苷酸的3’末端所含序列区域互补；
c.在选定位点上提供3’末端结合于锚支持物的单链锚寡核苷酸组，其中，所述锚寡核苷酸的5’末端与第一组构建寡核苷酸的5’末端互补；
d.使至少第一组和第二组构建寡核苷酸与结合于支持物的所述第一组和第二组寡核苷酸解离；
e.将所述一个或多个支持物与锚支持物对齐；并且
f.使至少第一组和第二组构建寡核苷酸与所述锚寡核苷酸组在锚支持物上杂交。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包含将第一组构建寡核苷酸从第一位点转移到所述选定位点，并且将所述第二组构建寡核苷酸从第二位点转移到选定位点，其中所述选定位点包含结合于支持物的锚单链寡核苷酸组。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括
(i)提供第三组结合于支持物的单链寡核苷酸，其中结合于支持物的第三组寡核苷酸各自具有预定序列，并且其3’末端结合到所述一个或多个支持物的第三不同位点上，结合于支持物的第三组寡核苷酸各自在其3’末端有与结合于支持物的第二组寡核苷酸3’末端序列区域互补的序列区域；
(ii)在链延伸反应中生成与第三组结合于支持物的寡核苷酸互补的第三组构建寡核苷酸；
(iii)在选定位点上使至少第一、第二和第三组构建寡核苷酸与锚寡核苷酸组杂交；和
(iv)将至少第一和第三组构建寡核苷酸连接，由此生成所述至少一种多核苷酸。
4.如权利要求1所述的方法，所述方法还包括：
(i)提供结合于支持物的第三组单链寡核苷酸，其3’末端所含序列区域与结合于支持物的第二组寡核苷酸3’末端序列区域互补，
(ii)在链延伸反应中生成与第三组结合于支持物的单链寡核苷酸互补的第三组构建寡核苷酸；
(iii)使所述第三组构建寡核苷酸与所述第二组构建寡核苷酸杂交；和
(iv)将第三和第一组构建寡核苷酸连接，由此生成所述至少一种多核苷酸。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述结合于支持物的寡核苷酸组各自在其3’末端有引物结合位点。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述引物结合位点是通用引物结合位点。
7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法还包含将引物与至少第一组和第二组结合于支持物的寡核苷酸在促进引物延伸的条件下退火，由此形成延伸产物双链体。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述引物序列包含至少一个尿嘧啶。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述每组结合于支持物的寡核苷酸组合成或点样在所述一个或多个固体支持物上。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述一个或多个支持物是微阵列设备。
11.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述不同位点处于促进引物延伸的条件。
12.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包含：
提供N组预定的3’末端结合于支持物的单链寡核苷酸，由此产生第一组构建寡核苷酸至第N组构建寡核苷酸，该第一组构建寡核苷酸3’末端所含序列区域与第二组构建寡核苷酸3’末端序列区域互补，其中第N组构建寡核苷酸所含序列区域与第(N-1)组构建寡核苷酸所含序列区域互补，N≥3，并且，当N为偶数时，第N组构建核苷酸的3’末端所含序列区域与第(N-1)组构建寡核苷酸内序列区域互补，当N为奇数时，第N组构建核苷酸的5’末端所含序列区域与第(N-1)组构建寡核苷酸内序列区域互补；和
提供锚寡核苷酸组，所述锚寡核苷酸在其5’末端包含与第一组构建寡核苷酸5’末端所含序列区域互补的序列。
13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，生成与结合于支持物的单链寡核苷酸互补的N组构建寡核苷酸，并且其中所述N组构建寡核苷酸无缺口地跨越所述多核苷酸的全部序列。
14.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法还包括解离所述延伸双链体，由此释放所述至少第一组和第二组构建寡核苷酸。
15.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述方法还包括使用尿嘧啶DNA糖基化酶和DNA糖基化酶-裂解酶内切核酸酶VIII的混合物去除引物。
16.一种生成有预定序列的多核苷酸的方法，所述方法包含：
a.用权利要求1所述方法合成包含游离单链突出端的结合于支持物的双链多核苷酸组，所述多核苷酸序列组包含预定多核苷酸序列，其中所述单链突出端包含末端构建寡核苷酸N的序列；
b.提供包含单链突出端的茎环寡核苷酸，其中所述单链突出端与所述末端构建寡核苷酸序列N互补；
c.使所述茎环寡核苷酸与有预定序列的多核苷酸的游离突出端杂交；
d.将所述茎环寡核苷酸与有预定序列的多核苷酸的游离突出端连接；和
e.降解不含有所述末端构建寡核苷酸序列N的多核苷酸序列。
17.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述方法还包含使含有N组构建寡核苷酸的构建寡核苷酸库与结合于支持物的锚单链寡核苷酸杂交，其中所述库中第一组构建寡核苷酸在其5’末端包含与所述锚寡核苷酸5’末端序列区域互补的序列区域，并且其中第N组构建寡核苷酸包含与第(N-1)组构建寡核苷酸序列区域互补的序列，N≥2，并且，当N为偶数时，第N组构建核苷酸的3’末端所含序列区域与第(N-1)组构建寡核苷酸内序列区域互补，当N为奇数时，第N组构建核苷酸的5’末端所含序列区域与第(N-1)组构建寡核苷酸内序列区域互补。
18.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述方法还使用单链特异性外切核酸酶来降解不含有所述末端寡核苷酸序列的多核苷酸序列。
19.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述外切核酸酶选自单链特异性3'外切核酸酶、单链特异性内切核酸酶、和单链特异性5'外切核酸酶。
20.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述茎环寡核苷酸包含II型限制性位点，并且所述方法还包括使用II型限制性内切核酸酶移除茎环寡核苷酸。
21.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述茎环寡核苷酸包含至少一个尿嘧啶核苷酸，并且所述方法还包括使用尿嘧啶DNA糖基化酶和DNA糖基化酶-裂解酶内切核酸酶VIII的混合物去除所述茎环寡核苷酸。
22.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述方法还包括扩增所述有预定序列的多核苷酸。
23.如权利要求1或16所述的方法，其特征在于，所述方法还包括从所述支持物上释放所述多核苷酸。
24.如权利要求23所述的方法，其特征在于，使用II型限制性酶释放所述多核苷酸。
25.如权利要求23所述的方法，其特征在于，使用尿嘧啶DNA糖基化酶和DNA糖基化酶-裂解酶内切核酸酶VIII的混合物释放所述多核苷酸。
26.一种合成有预定序列多核苷酸的方法，所述方法包含：
a.提供支持物，其具有(i)第一组3’末端结合于支持物的锚寡核苷酸和(ii)第二组3’末端结合于支持物的锚寡核苷酸，其中所述第一组锚寡核苷酸的5’末端与第一构建寡核苷酸5’末端互补，所述第二组锚寡核苷酸的5’末端与末端构建寡核苷酸N互补；
b.合成包含与第一组锚寡核苷酸杂交的第一构建寡核苷酸并包含5’单链突出端的结合于支持物的双链多核苷酸组，所述多核苷酸组包含所述预定多核苷酸序列，其中，所述5’单链突出端包含所述末端构建寡核苷酸N序列；和
c.使所述多核苷酸处于杂交条件，由此使所述5’单链突出端与所述第二组锚寡核苷酸5’末端杂交，由此选出所述有预定序列的多核苷酸。
27.如权利要求26所述的方法，其特征在于，所述方法还包括降解有游离3’或5’末端的多核苷酸序列。
28.如权利要求27所述的方法，其特征在于，用外切核酸酶降解所述多核苷酸序列。
29.如权利要求26所述的方法，其特征在于，所述方法还包括从所述支持物上释放所述有预定序列的多核苷酸。
30.如权利要求29所述的方法，其特征在于，使用II型内切核酸酶释放所述多核苷酸。
31.如权利要求29所述的方法，其特征在于，使用尿嘧啶DNA糖基化酶和DNA糖基化酶-裂解酶内切核酸酶VIII的混合物释放所述多核苷酸。
32.如权利要求27所述的方法，其特征在于，所述第一组锚寡核苷酸与所述第二组锚寡核苷酸相距一定的距离，所述距离对应于有预定序列的多核苷酸的长度。
33.如权利要求32所述的方法，其特征在于，所述支持物还包含结合于支持物的间隔子单链寡核苷酸以设定所述第一和第二锚寡核苷酸之间的距离。
34.如权利要求26所述的方法，其特征在于，使用结合于支持物的单链寡核苷酸组作为模板通过聚合酶链延伸合成单链构建寡核苷酸组，由所述单链构建寡核苷酸组组装形成结合于支持物的双链多核苷酸组。
35.一种核酸阵列，所述阵列包含：
a.固体支持物；
b.与所述固体支持物相关联的不同位点，其中各位点包含有预定序列的3’末端结合于支持物的寡核苷酸组，其中第一组结合于支持物的寡核苷酸其5’末端所含序列区域与结合于支持物的第二寡核苷酸5’末端序列区域互补，其中当N是大于3的偶数，结合于支持物的寡核苷酸N组其5’末端所含序列与结合于支持物的寡核苷酸(N-1)组5’末端序列区域互补，或者，当N是大于或等于3的奇数，结合于支持物的寡核苷酸N组其3’末端所含序列与结合于支持物的寡核苷酸(N-1)组3’末端序列区域互补；和
c.第一组3’末端结合于锚支持物的锚寡核苷酸，所述锚寡核苷酸在其5’末端包含与第一组结合于支持物的寡核苷酸序列内某区域相同的序列，并且，具有第二组锚寡核苷酸，所述第二锚寡核苷酸的5’末端与结合于支持物的寡核苷酸N组的3’末端相同，N是偶数。
36.一种生成有预定序列的多核苷酸组的方法，所述方法包含：
a.提供具有多个位点的第一和第二支持物，其中各位点包含有不同预定序列的3’末端结合于支持物的不同寡核苷酸；
b.用结合于支持物的寡核苷酸作为模板生成有不同预定序列的第一组和第二组不同构建寡核苷酸组，所述第一组和第二组构建寡核苷酸有3’末端互补序列；
c.提供具有多个位点的第三支持物，其中各位点包含3’末端结合于支持物的锚单链寡核苷酸组，其中锚寡核苷酸组的5’末端与第一组构建寡核苷酸的5’末端互补；
d.将所述第一支持物与所述第三支持物对齐，并使所述第一组构建寡核苷酸与所述锚寡核苷酸杂交；
e.将所述第二支持物与所述第三支持物对齐，并使所述第二组构建寡核苷酸与已与所述锚寡核苷酸杂交的所述第一组构建寡核苷酸杂交；
f.产生第三组构建寡核苷酸并使其与经步骤(e)与第一组构建寡核苷酸杂交的所述第二组构建寡核苷酸杂交；和
g.将第一和第三组构建寡核苷酸连接。
37.如权利要求36所述的方法，其特征在于，定义具有预定序列多核苷酸的构建寡核苷酸组各自在不同支持物上合成。
38.如权利要求36所述的方法，其特征在于，所述多核苷酸组在包含结合于支持物的锚寡核苷酸的第三支持物的不同位点上组装。
39.如权利要求36所述的方法，其特征在于，所述生成第一组构建寡核苷酸的步骤包含有至少一个尿嘧啶的引物序列与第一组结合于支持物的寡核苷酸退火，所述退火条件促进引物延伸，和用尿嘧啶DNA糖基化酶和DNA糖基化酶-裂解酶内切核酸酶VIII的混合物去除所述引物。
40.一种合成有预定序列的多核苷酸组的方法，所述方法包含：
a.提供了有多个位点的第一支持物，其中各位点包含3’末端结合于支持物的锚单链寡核苷酸组；
b.提供有多个位点的第二支持物组，其中各位点包含具有各自不同预定序列的单链结合于支持物的模板寡核苷酸组；
c.用单链结合于支持物的模板寡核苷酸组作为模板通过聚合酶延伸生成第一组构建寡核苷酸，由此产生第一组构建寡核苷酸，该第一组构建寡核苷酸的5’末端与对应的锚寡核苷酸的5’末端互补；
d.定位所述第一和第二支持物，以使第二支持物的各位点与所述第一支持物的相应位点对齐；
e.在促进所述第一组寡核苷酸与对应锚寡核苷酸组杂交条件下于溶液中释放所述第一组构建寡核苷酸；和
f.可选地，用包含结合于支持物的第二组寡核苷酸的第三支持物重复步骤b-e，由此产生第二组构建寡核苷酸，所述第一和第二组构建寡核苷酸有互补的3’末端序列。
41.如权利要求40所述的方法，其特征在于，所述生成第一组构建寡核苷酸的步骤包括：有至少一个尿嘧啶的引物序列与第一组结合于支持物的寡核苷酸退火，所述退火条件促进引物延伸，和用尿嘧啶DNA糖基化酶和DNA糖基化酶-裂解酶内切核酸酶VIII的混合物去除所述引物。
42.如权利要求40所述的方法，其特征在于，所述方法还包括将所述锚寡核苷酸与第二组构建寡核苷酸连接。
43.如权利要求40所述的方法，其特征在于，所述第二支持物位于所述第一支持物的上面并与之相向。
44.如权利要求43所述的方法，其特征在于，所述于溶液中释放第一组构建寡核苷酸的步骤使第一组寡核苷酸得以向锚寡核苷酸扩散。
45.如权利要求44所述的方法，其特征在于，所述于溶液中释放第一组构建寡核苷酸的步骤在多孔膜存在下进行，使构建寡核苷酸向锚寡核苷酸垂直扩散。
46.如权利要求45所述的方法，其特征在于，所述多孔膜降低所述构建寡核苷酸的横向扩散。
47.如权利要求40所述的方法，其特征在于，经步骤e)后，所述第一支持物的各位点包含具有3’游离突出端或5’游离突出端的双链。
48.如权利要求47所述的方法，其特征在于，所述双链具有5’游离突出端。
49.如权利要求40所述的方法，其特征在于，在所述释放步骤中，第一组构建寡核苷酸与第二组构建寡核苷酸杂交，并且第一组寡核苷酸与锚寡核苷酸杂交。
50.如权利要求49所述的方法，其特征在于，所述溶液包含连接酶。
51.如权利要求40所述的方法，其特征在于，所述第一组构建寡核苷酸的化学计量高于锚寡核苷酸的化学计量。
52.如权利要求40所述的方法，其特征在于，所述方法还包含在适于剪切含错配核苷酸的双链多核苷酸的条件下，用错配识别和剪切组分处理所述多核苷酸组。
53.如权利要求52所述的方法，其特征在于，所述多核苷酸组固定在所述支持物上或处于溶液中。
54.如权利要求53所述的方法，其特征在于，所述错配识别和剪切组分包含错配内切核酸酶。
55.如权利要求54所述的方法，其特征在于，所述错配特异性内切核酸酶是CEL I酶。
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