ES2565059T3 - Material polimérico conjugado y sus usos - Google Patents

Abstract

Una composición inyectable o implantable que comprende colágeno unido a partículas mediante enlace covalente, en la que los enlaces amida covalentes se forman entre los grupos ácido carboxílico libres de colágeno y los grupos amina reactivos de las partículas, y en la que las partículas presentan un tamaño de diámetro medio de partículas que oscila de 60 a 900 nanómetros.

Description

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DESCRIPCION

Material polimerico conjugado y sus usos Antecedentes de la invencion

A. Campo de la invencion

La presente invencion se refiere a colageno unido a partfculas mediante enlace covalente, que produce un material que es mas resistente a la degradacion, tal como a la degradacion por colagenasa. El presente material puede utilizarse en una amplia serie de aplicaciones.

B. Descripcion de la tecnica relacionada

El uso de colageno en el tratamiento de la incontinencia urinaria, de la insuficiencia cardfaca congestiva despues de un ataque al corazon, de las fracturas articulares y de los defectos cutaneos faciales congenitos y relacionados con la edad, se limita por la estabilidad y la integridad de los materiales de colageno disponibles actualmente. Por ejemplo, los materiales de relleno dermicos en base a colageno que se utilizan para tratar el envejecimiento facial (por ejemplo, mejora del contorno facial, mejora de las arrugas, correccion de una cicatriz deprimida, etc.) y para aumentar los labios son muy susceptibles a la degradacion durante un periodo de 12 meses.

Una solucion propuesta al problema de la degradacion de colageno es la reticulacion del colageno mediante la formacion de enlaces covalentes entre la macromolecula de las fibrillas de colageno. Sin embargo, la toxicidad de los productos qmmicos utilizados para reticular el colageno puede suscitar inquietud. Por ejemplo, el glutaraldehfdo y el diisocianato de hexametileno se incorporan en el armazon de colageno durante la reticulacion y pueden liberar residuos toxicos en el cuerpo cuando se degrada el colageno. Otro problema es que el exceso de reticulacion puede crear un material de colageno ngido e inutilizable.

El documento WO 2010/033860 A1 desvela un tejido descelularizado que comprende una mezcla de materiales que comprende, entre otros, colageno no soluble, en el que el tejido descelularizado se reticula con un nanomaterial previamente seleccionado.

Sumario de la invencion

La invencion se dirige a una composicion inyectable o implantable segun la reivindicacion 1. La invencion tambien se refiere a un procedimiento para reducir la degradacion de colageno in vitro mediante la degradacion enzimatica segun la reivindicacion 15. Los inventores han descubierto una solucion a los problemas de rendimiento que limitan los productos actuales en base a colageno. La presente solucion incluye el uso de partfculas que presentan un diametro medio de partfculas de 60 a 900 nanometros capaces de formar enlaces covalentes con colageno. El material conjugado (por ejemplo, composiciones que comprenden el material, colageno/partfculas conjugados, o fibrilla/partfculas de colageno conjugados) es mas resistente a la degradacion (por ejemplo, por colagenasa), biocompatible, y se produce en una matriz o armazon de colageno que presenta un nivel aceptable de porosidad, permitiendo asf el crecimiento celular. El crecimiento celular se acelera por las partfculas conjugadas en el material innovador. En ciertos casos, el material conjugado presenta asimismo propiedades antimicrobianas, que pueden utilizarse para combatir la infeccion tras su posterior administracion a un paciente.

En ciertos casos, el colageno tambien puede reticularse mediante un agente de reticulacion, tal como una carbodiimida (por ejemplo, 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida) y/o por las partfculas en sf (por ejemplo, el colageno puede reticularse con las partfculas, en el que al menos una de las partfculas incluye al menos dos grupos reactivos, y en el que al menos pueden formarse dos enlaces covalentes entre, por ejemplo, los grupos acido carboxflico del colageno y al menos dos grupos reactivos, en el que los dos grupos reactivos pueden formarse entre, por ejemplo, los grupos amina.). En ciertos aspectos, el colageno reticulado es poroso y puede presentar un tamano de poro medio que oscila de 500 nanometros a 200 micrometros (y cualquier numero entero o intervalo en el mismo, tal como 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 1.000, 1.100, 1.200, 1.300, 1.400, 1.500, 1.600, 1.700, 1.800, 1.900 nanometros). En aspectos particulares, puede utilizarse un intervalo de tamano de poro entre 1 micrometro y 100 micrometros (o cualquier numero entero o intervalo en el mismo, tal como 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, o 90 micrometros). En ciertos casos, las partfculas presentan un diametro medio de partfculas de 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900 nanometros. En realizaciones particulares, el diametro medio de partfculas oscila de 70 a 800, 80 a 700, 90 a 600, 100 a 500, 150 a 400, o 200 a 300 nanometros. En ciertos aspectos, el diametro medio de partfculas oscila de 60 a 140, 70 a 130, 80 a 120, o 90 a 110 nanometros. Las partfculas pueden estar formadas por o comprenden material metalico. El material metalico puede ser oro, plata, platino, titanio, mquel, o cobre o cualquier combinacion de los mismos. En aspectos particulares, el material metalico es oro o plata. Las partfculas tambien pueden fabricarse de o comprenden material ceramico o material biodegradable. En ciertas realizaciones, la relacion de partfculas en colageno puede ser un intervalo de 1 x 109 partfculas por mg de colageno a 2 x 1010 partfculas por mg de colageno, no obstante, se contemplan intervalos mas amplios (por ejemplo, 1 x 104 a 1 x 1014 por mg de colageno, y cualquier intervalo y numero entero en el mismo). En algunos aspectos, pueden utilizarse 2 a 4 mg de un agente de reticulacion de carbodiimida (por ejemplo, EDC) por 30 mg de colageno para formar los enlaces

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covalentes (en aspectos particulares, la relacion que puede utilizarse puede ser 3,2 mg +/- 0,8 de un agente de reticulacion de carbodiimida, tal como EDC por 30 mg de colageno). Asimismo, pueden utilizarse 0,5 a 0,2 mg de un agente de reticulacion de carbodiimida (por ejemplo, EDC) por 1 x 109-2 x 1010 partmulas para formar los enlaces covalentes. En ciertos aspectos, el material de la presente invencion puede incluir, ademas, celulas que pueden utilizarse para ayudar en las opciones de tratamiento. Los ejemplos no limitantes de dichas celulas incluyen: celulas madre embrionarias, celulas madre adultas, celulas madre pluripotentes inducidas, y celulas derivadas de las mismas, celulas de origen endodermico, mesodermico o ectodermico incluyendo, entre otras, celulas epiteliales, celulas exocrinas y endocrinas, mioblastos, fibroblastos, osteoblastos, condroblastos, celulas estromales, hepatocitos, celulas de los islotes, neuroblastos, queratinocitos, osteoclastos, osteocitos, celulas cardfacas, condrocitos, celulas endoteliales, y/o celulas musculares, y sus combinaciones. El colageno que puede utilizarse incluye los tipos de colageno I, II, III, IV o V, o su combinacion. En realizaciones particulares, el material puede encontrarse en forma de gel, una solucion, una pasta, nano o micrometro de colageno electrohilado, laminas de colageno, o una estructura ngida deshidratada. El material puede contenerse en una jeringa o en una solucion inyectable. El material puede ser una composicion dermatologicamente aceptable o un equivalente dermico o epidermico. En ciertos aspectos, la cantidad de grupos acido carboxflico libres o grupos amina libres presentes en el material conjugado de colageno/partfcula es al menos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, o 90 % inferior en comparacion con el colageno que no se ha conjugado con una partfcula. En otras palabras, se conjugan al menos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, o 90 % o mas de los grupos acido carboxflico libres o amina libres del colageno.

Tambien se contempla una fibrilla de colageno unida por enlace covalente a al menos a una partmula, en la que al menos una partmula presenta un diametro medio de partmulas que oscila de 20 a 1.000 nanometros o 50 a 1.000 nanometros. En aspectos particulares, el enlace covalente puede formarse entre un grupo acido carboxflico libre y/o amina en la fibrilla de colageno y un grupo reactivo presente en la superficie de la partfcula. El grupo reactivo puede ser, por ejemplo, un grupo amina reactivo, un grupo carboxilato reactivo, un grupo tiol reactivo, y/o un grupo hidroxilo reactivo. En un aspecto, el enlace covalente puede formarse entre los grupos acido carboxflico libres presentes en la fibrilla de colageno y los grupos amina reactivos en las partfculas, en el que los enlaces amida pueden formarse entre los grupos acido carboxflico de la fibrilla de colageno y los grupos amina reactivos de las partfculas.

Se desvela un procedimiento para rellenar huecos, defectos, o incrementar el volumen tisular en un mairnfero, que comprende administrar a un paciente, o a un mamffero que lo necesite (por ejemplo, ser humano, caballo, vaca, cerdo, perro, gato, conejo, rata, raton, etc.), cualquiera de los materiales desvelados en la presente memoria descriptiva. Los materiales, colageno/partfculas conjugados, o fibrilla/partmulas de colageno conjugado pueden administrarse por una inyeccion intradermica o subcutanea. El hueco puede ser una lmea o arruga fina y la aparicion de la lmea o arruga fina puede reducirse tras la administracion. Los materiales, colageno/partmulas conjugados, o fibrilla/partmulas de colageno conjugado pueden administrarse en un labio del mam^era, en los que el volumen tisular del labio aumenta tras la administracion.

Se desvela un procedimiento para aumentar el tejido blando o el tejido duro en un mamffero en necesidad del mismo que comprende administrar o aplicar uno cualquiera de los materiales desvelados en la presente memoria descriptiva en el tejido blando o duro. El tejido blando puede ser un musculo cardfaco, un musculo liso, un musculo esqueletico, tejido de los meniscos, un cartflago, tendones, ligamentos, fascia, piel, vasos sangumeos, un tejido fibroso, o una matriz extracelular. Por ejemplo, los materiales pueden utilizarse para soportar el musculo del miocardio en un paciente que es susceptible o que ya ha sufrido un ataque al corazon. Con respecto al tejido duro, ejemplos no limitantes incluyen huesos o dientes. Los materiales pueden utilizarse para tratar fracturas oseas o pueden utilizarse para potenciar el crecimiento oseo aplicando los materiales a las fracturas oseas o a los huesos en los que se desea un aumento del crecimiento oseo.

Se desvela un procedimiento para incrementar el cartflago articular aumentando el volumen tisular en una persona, que comprende administrar a una persona en necesidad del mismo uno cualquiera de los materiales o composiciones descritos a lo largo de la memoria descriptiva en una capsula articular.

En un aspecto, se desvela un procedimiento para reducir la degradacion del colageno in vitro mediante la degradacion enzimatica que comprende conjugar colageno con partmulas que presentan un diametro medio de partmulas que oscila de 60 a 900 nanometros, en el que los enlaces covalentes se forman entre el colageno y las partmulas, y en el que la degradacion del colageno por la colagenasa se reduce de este modo en comparacion con el colageno que no se conjuga con las partmulas. La conjugacion se produce a traves de un enlace covalente entre los grupos acido carboxflico libres de colageno y los grupos reactivos presentes en la superficie de las partmulas. Los grupos reactivos son grupos amina reactivos. Dicho colageno se inyecta o implanta.

Se desvela un procedimiento para aumentar la union celular in vitro o in vivo que comprende conjugar colageno con partmulas que presentan un diametro medio de partmulas que oscila de 20 a 1.000 nanometros o 50 a 1.000 nanometros, en el que los enlaces covalentes se forman entre el colageno y las partmulas, y en el que el area superficial con respecto a la relacion en volumen de las nanopartmulas atrae la repoblacion celular y la smtesis de colageno. La conjugacion puede realizarse a traves de un enlace covalente entre los grupos acido carboxflico libres o grupos amina libres de colageno y los grupos reactivos presentes en la superficie de las partmulas. Los grupos reactivos pueden ser, por ejemplo, grupos amina reactivos, grupos carboxilato reactivos, grupos tiol reactivos, y/o

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grupos hidroxilo reactivos. En un aspecto, el enlace covalente puede formarse entre los grupos de acido carbox^lico libres presentes en el colageno y los grupos amina reactivos en las partfculas, en el que los enlaces amida pueden formarse entre los grupos acido carboxflico del colageno y los grupos amina reactivos de las partfculas. El procedimiento puede incluir ademas la administracion de colageno conjugado a un mairnfero (por ejemplo, inyeccion intradermica o subcutanea o aplicacion topica).

Se desvela un procedimiento para generar tejido que comprende la siembra de uno cualquiera de los materiales desvelados en la presente memoria descriptiva con celulas madre embrionarias, celulas madre adultas, celulas madre pluripotentes inducidas, y celulas derivadas de las mismas o la siembra con celulas de origen endodermico, mesodermico o ectodermico incluyendo, entre otras, celulas epiteliales, celulas exocrinas y endocrinas, mioblastos, fibroblastos, osteoblastos, condroblastos, celulas estromales, hepatocitos, celulas de los islotes, neuroblastos, queratinocitos, osteoclastos, osteocitos, celulas cardfacas, condrocitos, celulas endoteliales, y/o celulas musculares. El procedimiento puede incluir ademas la administracion de colageno conjugado a un mai^ero.

Los materiales desvelados a lo largo de la memoria descriptiva pueden utilizarse asimismo para tratar enfermedades urinarias (por ejemplo, incontinencia urinaria) administrando a un mai^ero en necesidad del mismo dicho material. A modo de ejemplo, los materiales pueden formarse en un arnes pelvico o pueden utilizarse con un arnes pelvico existente. Alternativamente, los materiales pueden encontrarse en forma inyectable y pueden utilizarse como agentes espesantes para reducir o prevenir la incontinencia urinaria inyectando dicho material en el mai^ero.

Asimismo se desvela un procedimiento para coagular la sangre que comprende administrar a un marnffero en necesidad del mismo los materiales desvelados a lo largo de la memoria descriptiva en un sitio en el que se desea la coagulacion de la sangre (por ejemplo, heridas internas o externas). Ejemplos no limitantes de heridas externas incluyen ulceras por presion, cortes, aranazos, incisiones, heridas abiertas, perdida de extremidades, etc.

Se desvela un procedimiento para tratar la osteoartritis que comprende administrar a un mamffero en necesidad del mismo uno cualquiera de los materiales desvelados a lo largo de la memoria descriptiva. Por ejemplo, los materiales pueden administrarse en una capsula o cartflago articular como agente espesante para favorecer el recrecimiento y disminuir el dolor.

Se desvela un procedimiento para potenciar el crecimiento nervioso que comprende administrar a un mamffero en necesidad del mismo uno cualquiera de los materiales desvelados a lo largo de la memoria descriptiva. Por ejemplo, los materiales pueden administrarse a los nervios como conductos para el crecimiento o recrecimiento nervioso.

Tambien se desvela un procedimiento para fabricar material conjugado de colageno/partfculas de la presente invencion. Dicho procedimiento incluye 1) funcionalizar las partfculas previamente seleccionadas y 2) reticular las partfculas funcionalizadas con las fibras de colageno solubles en presencia de un reactivo bioconjugado. El procedimiento puede incluir ademas un periodo de incubacion para la polimerizacion tras la etapa de reticulacion. En un aspecto, el procedimiento incluye: (1) obtener partfculas funcionalizadas (por ejemplo, partfculas metalicas, tales como oro funcionalizadas con cisteamina); (2) anadir las partfculas funcionalizadas a una solucion que comprende EDC y NHS y de manera opcional tampon; y (3) anadir colageno a la solucion con mezcla. En ciertas realizaciones, la relacion de partfculas en colageno puede ser un intervalo de 1 x 109 partfculas por mg de colageno a 2 x 1010 partfculas por mg de colageno, no obstante, se contemplan intervalos mas amplios (por ejemplo, 1 x 104 a 1 x 1014 por mg de colageno, y cualquier intervalo y numero entero en el mismo). Asimismo, pueden utilizarse 2 a 4 mg de un agente de reticulacion de carbodiimida (por ejemplo, EDC) por 30 mg de colageno para formar los enlaces covalentes (en aspectos particulares, la relacion que puede utilizarse puede ser 3,2 mg +/- 0,8 de un agente de reticulacion de carbodiimida, tal como EDC por 30 mg de colageno), y/o pueden utilizarse 0,5 a 0,2 mg de un agente de reticulacion de carbodiimida (por ejemplo, EDC) por 1 x 109-2 x 1010 partfculas para formar los enlaces covalentes.

Se desvela un procedimiento para aumentar la celularidad, favorecer un influjo de celulas, favorecer la adhesion celular, o favorecer la migracion celular en un implante de colageno o un agente espesante en base a colageno, que comprende el uso de cualquier material o composicion desvelado a lo largo de la memoria descriptiva para fabricar una implante de colageno o el agente espesante en base a colageno. Tambien se desvela un procedimiento para aumentar la celularidad, un influjo de celulas, favorecer la adhesion celular, o favorecer la migracion celular en un implante de colageno o un agente espesante en base a colageno, que comprende unir colageno, mediante enlace covalente, con las partfculas para formar el implante de colageno o el agente espesante en base a colageno, en el que los enlaces amida covalentes se forman entre los grupos de acido carboxflico libres del colageno y los grupos amina reactivos de las partfculas, y en el que las partfculas presentan un tamano de diametro medio de partfculas que oscila de 50 a 1.000 nanometros. Tales procedimientos pueden incluir ademas la administracion del implante de colageno o agente espesante en base a colageno a una persona en necesidad del mismo.

Se contempla que los materiales desvelados a lo largo de la memoria descriptiva pueden comprenderse dentro de un vehfculo dermatologicamente aceptable, un vehfculo farmaceuticamente aceptable, o un vehfculo farmacologicamente aceptable. Tales vehfculos son aquellos que no producen toxicidad prohibitiva, incompatibilidad, inestabilidad, respuesta alergica, y/o similares, cuando se administran a un marnffero, tal como un ser humano. Ademas, dichas composiciones pueden estar en forma de polvo, deshidratada, electrohilada, forma lfquida, forma de

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gel, semisolida, o solida. A este respecto, las composiciones de la presente invencion pueden presentar un intervalo de viscosidad entre 10 hasta 100.000.000 cps, medidas en un viscos^etro Brookfield que utiliza un husillo TC a 2,5 rpm a 25 °C. En aspectos particulares, puede utilizarse un intervalo de 150.000 a 250.000.

Las vfas de administracion de los materiales y composiciones de la presente invencion pueden variar con la ubicacion y naturaleza de la afeccion a tratar. A modo de ejemplo, aplicacion topica, intradermica, parenteral, intramuscular, subcutanea, percutanea, intratraqueal, intraperitoneal, inyeccion directa (por ejemplo, una solucion inyectable), y quirurgica (por ejemplo, mediante la incision y colocacion en el area diana).

Se contempla que cualquier realizacion discutida en la presente memoria descriptiva puede implementarse en relacion con cualquier procedimiento o composicion de la invencion, y viceversa. Ademas, las composiciones de la invencion pueden utilizarse para lograr los procedimientos de la invencion.

"Colageno inyectable" incluye pastas, geles, soluciones, o suspensiones, homogeneos o heterogeneos de colageno, que se contienen en jeringas, tubos u otros recipientes equipados con embolos o sistemas apropiados, concebidos para extrudir el colageno a traves de una aguja o una boquilla. El colageno inyectable se disena para la inyeccion, aplicacion quirurgica mediante un trocar, o la aplicacion directa en una superficie de la herida.

"Mairnferos" incluye seres humanos, caballos, vacas, cerdos, perros, gatos, conejos, ratas, ratones, etc.

"Tejido queratinoso" incluye capas que contienen queratina dispuestas como la cubierta protectora externa de marnfferos e incluye, entre otros, piel, cabello y unas.

"Aplicacion topica" significa aplicar o extender una composicion sobre la superficie del tejido queratinoso. "Composicion topica para la piel " incluye composiciones adecuadas para la aplicacion topica sobre el tejido queratinoso. Tales composiciones son normalmente dermatologicamente aceptables dado que cuando se aplican sobre la piel no presentan toxicidad, incompatibilidad, inestabilidad indebida, y similares. Las composiciones topicas para el cuidado de la piel de la presente invencion pueden seleccionar su viscosidad para evitar el goteo o la agrupacion significativa despues de haberse aplicado sobre la piel.

El termino "aproximadamente" o "aproximadamente" se define como la manera mas proxima comprendida por un experto en la materia, y en una realizacion no limitante el termino se define dentro del 10 %, preferentemente dentro del 5 %, mas preferentemente dentro del 1 %, y mas preferentemente dentro del 0,5 %.

El termino "inhibir" o "reducir" o cualquier variante de este termino, cuando se utiliza en las reivindicaciones y/o en la memoria descriptiva incluye cualquier disminucion medible o inhibicion completa para lograr un resultado deseado.

El termino "eficaz", segun se utiliza este termino en la memoria descriptiva y/o en las reivindicaciones, significa adecuar para lograr un resultado deseado, esperado, o previsto.

El uso del termino "un" o "una" cuando se utiliza junto al termino "que comprende" en las reivindicaciones y/o en la memoria descriptiva, puede significar "uno", pero tambien es consistente con el significado de "uno o mas", "al menos uno" y "uno o mas de uno".

El termino "que comprende" (y cualquier forma de comprender, tal como "comprenden" y "comprende"), "que tiene" (y cualquier forma de tener, tal como "tienen" o "tiene"), "que incluye" (y cualquier forma de incluir, tal como "incluye" e "incluyen") o "que contiene" (y cualquier forma de contener, tal como "contiene" y "contienen") es inclusivo o abierto y no excluye elementos adicionales, no citados o etapas del procedimiento.

Otros objetos, caractensticas y ventajas de la presente invencion resultaran evidentes a partir de la siguiente descripcion detallada. Sin embargo, ha de entenderse, que la descripcion detallada y los ejemplos, aunque indican realizaciones espedficas de la invencion, solamente se dan a modo de ilustracion.

Breve descripcion de los dibujos

Los siguientes dibujos forman parte de la presente memoria descriptiva y se incluyen para demostrar adicionalmente determinados aspectos de la presente invencion. La invencion puede comprenderse mejor por referencia a uno o mas de estos dibujos en combinacion con la descripcion detallada de las realizaciones espedficas presentadas a continuacion.

Figura 1. Un diagrama esquematico para conjugar de forma covalente colageno (designado "1") con una partfcula de oro (designada "2") mediante la formacion de un enlace amida entre un grupo de acido carboxflico libre del colageno y un grupo amina reactivo de la partfcula funcionalizada con mercaptoetilamina (MEA). Se utilizan para facilitar la conjugacion hidrocloruro de 1-Etil-3-[3-dimetilaminopropil]carbodiimida (EDC) y N- hidroxisulfosuccinimida (Sulfo-NHS).

Figura 2. Espectro UV que ilustra las partfculas de oro funcionalizadas con p-mercaptoetilamina (MEA).

Figura 3. EEM de un armazon de gel conjugado con partfculas de oro.

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Figura 4. Imagen por EDE que demuestra que las partfculas reticuladas son partfculas de oro en la estructura del armazon.

Figura 5. Diagrama de barras que ilustra la resistencia mejorada a la degradacion por colagenasa del colageno conjugado con partfculas de oro.

Figura 6. Diagrama de barras que ilustra la viabilidad celular en presencia de colageno conjugado con partfculas de oro.

Figura 7. Espectroscopia de infrarrojos por transformada de Fourier de colageno con y sin partfculas de oro que ilustra una disminucion del 18% en los grupos acido carboxflico libres en el material conjugado de colageno/partfculas de oro en comparacion con solo colageno.

Figura 8. Concentraciones de ADN por grupo de armazon y tratamiento con el tiempo. El Dfa 7 se indica mediante la barra izquierda, y el Dfa l4 se indica mediante la barra derecha para cada grupo, respectivamente.

Figura 9. Concentraciones de glicosaminoglicanos (GAG) por grupo de armazon y tratamiento con el tiempo. El Dfa 7 se indica mediante la barra izquierda, y el Dfa 14 se indica mediante la barra derecha para cada grupo, respectivamente.

Figura 10. Tincion Live/Dead de todos los grupos en el Dfa 7 que demuestra una elevada viabilidad y celularizacion.

Figura 11. Celularizacion de los grupos en dos intervalos de tiempo que demuestra la proliferacion superficial en el Dfa 7 con una penetracion interna mas compleja en el Dfa 14. Se observo la celularizacion de los canales y cavidades asociados a AuNP.

Descripcion de las realizaciones ilustrativas

Los inventores han descubierto que mediante la union covalente de las partfculas a colageno en grupos acido carboxflico libres de colageno o fibrillas de colageno, puede reducirse la degradacion de colageno. Esto se traduce en un material a base de colageno que es mas estable cuando se administra a un marnffero para tratar o prevenir una enfermedad o afeccion cutanea particular. Ademas, mediante el uso de partfculas que presentan un diametro medio de partfculas de 50 a 1.000 nanometros, o incluso 50 a 150 nanometros, el material de colageno/partfculas resultante crea un entorno que favorece la proliferacion y la infiltracion celular (por ejemplo, se atraen celulas que se encuentran presentes en el paciente o celulas que se incorporan en el material a las partfculas, lo que permite una proliferacion mas sostenida y dinamica de las celulas de lo esperado, en comparacion con el colageno que no incluye dichas partfculas) mientras que exhibe toxicidad reducida en comparacion con las partfculas que son inferiores a 20 nanometros o inferiores a 50 nanometros. Es decir, los inventores han descubierto una manera eficaz para estabilizar colageno mediante la reduccion de la degradacion del colageno al tiempo que favorece la proliferacion celular sin riesgo de efectos secundarios toxicos que se observan actualmente en los materiales en base a colageno existentes.

Sin desear quedar ligado a teona alguna, se cree que los enlaces covalentes formados en los sitios carboxflicos libres de colageno impidieron y/o bloquearon algunos de los sitios de union de la colagenasa, mientras que el tamano de partfculas proporciona un area superficial suficiente y energfa superficial que permite la adherencia celular, el aumento de la celularidad, y la adsorcion de protemas, favoreciendo asf la proliferacion y el crecimiento celular. Adicionalmente, las partfculas metalicas pueden proporcionar efectos antioxidantes, lo que reduce las especies reactivas del oxfgeno y otros radicales libres que pueden danar las celulas, y las partfculas metalicas pueden proporcionar efectos antimicrobianos. Ademas, el tamano de partfculas es suficiente para reducir la toxicidad en el entorno circundante mediante la prevencion o la reduccion de la captacion celular de las partfculas.

Estos y otros aspectos de la presente invencion se describen a continuacion con mas detalle.

A. Colageno

El colageno es un tipo de protema que se encuentra en los mairnferos que conecta y soporta los tejidos corporales, tales como piel, huesos, tendones, musculos y cartflagos. Tambien proporciona soporte a los organos internos y esta presente en los dientes. Existen mas de 25 tipos de colageno que se presentan de forma natural en el cuerpo, todos ellos pueden utilizarse en el contexto de la presente invencion. Los colagenos mas frecuentes incluyen los Tipos I (hallado en la piel, tendones, vasculares, ligaduras, organos, huesos), II (hallado en el cartflago), III (hallado en las fibras reticulares), IV (formas bases de la membrana basal celular) y V (hallado en las superficies celulares, pelo, y placenta). Algunas de las caractensticas estructurales mas frecuentes de colageno incluyen una gran cantidad de glicina, prolina, hidroxiprolina, grupos acido carboxflico libres, y grupos amina libres, vease Collagen Structure and Mechanics (2008).

En cuanto a la piel, el colageno aporta esta fuerza, flexibilidad y resistencia. Tambien aporta una estructura para el crecimiento de las celulas y los vasos sangumeos en la piel. La degradacion del colageno (por ejemplo, en la piel

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envejecida, piel enferma, danada, tal como cicatrices, dano solar, acne, etc.) da lugar a la presencia de lmeas finas, arrugas, marcas, nodulos, surcos, y similares en la piel. Una forma de reducir la aparicion de estos defectos en la piel es inyectar colageno en la piel, que se traduce en el llenado de los defectos en la piel, por consiguiente, un "relleno dermico." El colageno tambien posee varios usos medicos que van desde el aumento de la movilidad articular, el tratamiento de quemaduras y otras heridas abiertas en la piel, hasta el tratamiento de la osteogenesis imperfecta (es decir, enfermedad de los huesos de cristal), y otros usos medicos desvelados y reivindicados a lo largo de la presente memoria descriptiva.

El colageno que puede utilizarse en el contexto de la presente invencion se puede extraer de un amplio intervalo de fuentes (por ejemplo, porcina, bovina, humana, de pescado, cola de rata, etc.). Materiales de colageno no limitantes que pueden utilizarse incluyen colageno recombinante humano, colageno basado en tejidos humanos geneticamente modificados, colageno porcino, colageno placentario humano, colageno bovino, colageno autologo, fibras de colageno y matriz de colageno de tejido humano. Ademas, el colageno y los productos en base a colageno, que tambien se pueden utilizar se disponen comercialmente, un ejemplo no limitante de los cuales se enumera en International Cosmetic Ingredient Dictionary and Handbook, 12a edicion, volumen 1, pagina 656 (2008), que se incorpora por referencia. Ejemplos no limitantes adicionales de productos de colageno comercialmente disponibles que pueden utilizarse en el contexto de la presente invencion incluyen CosmoDerm® 1 y 2, CosmoPlast®, Zyderm®, Zyplast® y Evolence®, todos ellos se fabrican por Inamed Corp., Santa Barbara CA. En realizaciones particulares, se utiliza colageno porcino.

B. Particulas y formacion de union covalente con colageno

Como se ha explicado previamente, las partfculas que presentan un tamano de diametro medio de partfculas de 50 a 1.000 nanometros, o 50 a 150 nanometros pueden utilizarse en el contexto de la presente invencion. El tamano de diametro medio de partfculas puede determinarse por dispersion de luz dinamica (DLD). La DLD es una tecnica que proporciona el perfil de distribucion de tamano de particulas en suspension. El tamano medio de particulas puede determinarse a partir del perfil de distribucion de tamano (Thomas (1987)). Ademas, existen varios recursos disponibles a traves de los cuales se pueden adquirir u obtener particulas que presentan un tamano de diametro particular (por ejemplo, coloides de oro y plata NanoXact & BioPure PELCO® de Ted Pella, Inc. (Redding, CA); nanopartfculas de oro esfericas Accurate, Nanorodz de oro, Microgold, nanoesferas de oro, nanohilos de oro, platino, paladio, y nanopartfculas trimetalicas de NanoPartz, Inc. (Loveland, CO); y nanopartfculas de oro, nanopartfculas de plata, nanopartfculas de platino, nanopartfculas de paladio y nanopartfculas verdes de Nanoparticle Biochem Inc, (Columbia, MO)).

Las particulas que se pueden utilizar pueden incluir o componerse de cualquier material metalico, material ceramico, y/o material biodegradable o su combinacion. Con respecto a las particulas metalicas, los ejemplos no limitantes incluyen oro, plata, platino, titanio, mquel, y/o cobre. En casos particulares, el material utilizado para las particulas (por ejemplo, oro o plata) puede poseer propiedades antimicrobianas, que pueden resultar utiles para reducir la probabilidad de infeccion. Ademas, dicho material particulado puede funcionar como un aceptor de electrones y por lo tanto puede reducir el dano por radicales libres causado por especies reactivas del oxfgeno ("ERO").

Las particulas utilizadas en el contexto de la presente invencion pueden incluir grupos reactivos, cuyos ejemplos no limitantes incluyen grupos amina reactivos, grupos carboxilato reactivos, grupos tiol reactivos, grupos acido carboxflico reactivos o grupos hidroxilo reactivos, o cualquier combinacion de los mismos. Dichas particulas funcionalizadas se disponen comercialmente y pueden fabricarse por un experto en la materia. Ademas, puede emplearse la utilizacion de agentes de reticulacion para favorecer la formacion de enlaces covalentes entre el colageno y las particulas y tambien puede utilizarse para favorecer la reticulacion entre el propio colageno (por ejemplo, la reticulacion del colageno puede ocurrir a traves de las particulas cuando estas tienen al menos dos grupos funcionales presentes en los que uno de los grupos funcionales forma un enlace covalente con colageno y el otro grupo funcional forma un segundo enlace covalente con colageno o incluso en casos en los que el agente de reticulacion forma enlaces covalentes entre el propio colageno). Un procedimiento no limitante se proporciona a continuacion.

En realizaciones particulares, las particulas incluyen grupos amina reactivos que son capaces de formar un enlace amida con grupos acido carboxflico libres presentes en el colageno. A modo de ejemplo, la FIG. 1 describe una realizacion de este tipo. En particular, la FIG. 1 ilustra que el grupo acido carboxflico funcional en la fibra de colageno 1, se activa en primer lugar por EDC, entonces la adicion nucleofila genera un enlace amida entre la fibra de colageno y el nanomaterial metalico 2. La EDC forma un grupo ester funcional activo con grupos carboxilato en las fibrillas de colageno; pero la hidrolisis se produce rapidamente y por consiguiente la EDC se acopla generalmente a sulfo-NHS para formar un intermedio de ester de sulfo-NHS. Los intermedios de ester reaccionan a continuacion con grupos amina en las nanopartfculas metalicas. La EDC-sulfo-NHS facilita un enlace amida entre el colageno y MEA unidos a la partfcula con liberacion de un subproducto de isourea. NHS se anade normalmente a EDC para potenciar la estabilidad y la union.

Ha de considerarse la toxicidad de los productos qrnmicos utilizados para favorecer la formacion de enlaces covalentes entre el colageno y las particulas y la reticulacion de colageno. El glutaraldehfdo, diisocianato de hexametileno, y EDC son agentes de reticulacion utilizados comunmente, pero solo la carbodiimida es no toxica y no

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se incorpora en el armazon de colageno durante la reticulacion (veanse, Shanmugam (2006), Lee (2001), Rault (1996), Grtzer (2001), Chan (2005), Billiar (2001), Pieper (1999), Haidekker (2006)). Por el contrario, el glutaraldetndo y el diisocianato de hexametileno no se incorporan en el armazon y pueden liberar residuos toxicos en el cuerpo cuando el armazon se degrada. Adicionalmente, la reticulacion excesiva puede cambiar drasticamente la microestructura y provocar que el armazon sea tan resistente a la degradacion que se encapsula mediante una capa fibrosa y nunca se reemplaza por el tejido sano.

C. Procedimiento para fabricar conjugados

El siguiente procedimiento es un modo no limitante para fabricar los materiales conjugados de la presente invencion:

(1) Obtener colageno no polimerizado:

a. Mezclar 30 mg de colageno liofilizado con 1 ml de acido acetico (10 mM).

b. Disolver durante 3 horas a temperatura ambiente girando el vial gradualmente.

(2) Preparar nanomateriales concentrados funcionalizados:

a. Girar 1.344 ml de 100 nm de una suspension de nanopartfculas de oro (concentracion de AuNP 5,6 x 109 partfculas/ml durante 5 min a 7.000 rpm.

b. Eliminar 1.144 ml de agua dejando 0,2 ml de AuNP en una suspension en agua.

c. Anadir 9,1 ul de cisteamina 0,12M (= beta-mercaptoetilamina; MEA) a 0,2 ml de una suspension de AuNP.

d. Mezclar para proporcionar nanomateriales funcionalizados mediante una pipeta, girandolos mas de 3 veces, o mediante un vortex durante 5 segundos a temperatura ambiente.

(3) Preparar 10 x una solucion tampon fosfato salino (TFS).

(4) Disolver 0,0032 g de EDC (hidrocloruro de 1-etil-3-[3-dimetilaminopropil]carbodiimida y 0,00424 g de sulfo- NHS (N-hidroxisulfosuccinimida) en 0,2 ml 10 x tampon TFS.

(5) Anadir 0,209 ml de nanomateriales funcionalizados a 0,2 ml de EDC y NHS en 10 x tampon TFS si se utiliza colageno de rata. En caso de utilizar colageno humano entonces puede utilizarse el mismo sistema de tampon o uno diferente (por ejemplo, sistema de tampon fosfato dibasico de sodio).

(6) Anadir 0,045 ml de NaOH 1M a nanomateriales en tampon TFS.

(7) Mezclar 0,454 ml de nanomateriales funcionalizados de EDC, NHS en 10 x tampon TFS con NaOH a 1 ml de solucion de colageno a 30 g/l.

(8) Pipetear arriba y abajo 5-10 veces para garantizar la mezcla.

(9) Colocar en una incubadora a 37 °C durante 90 minutos para polimerizar.

(10) Eliminar el armazon recien formado de la incubadora y la condicion para inyectarse en la aguja 30Ga o preparar el armazon en otras formas.

Como se ha senalado previamente, el presente procedimiento es un ejemplo no limitante de una forma de fabricar un conjugado de partfculas/colageno en el contexto de la presente invencion. Se contemplan y pueden realizarse modificaciones y variaciones para preparar un producto final deseado de una opcion de tratamiento particular.

D. Composiciones de la presente invencion

Como se ha senalado previamente, los materiales conjugados de la presente invencion (por ejemplo, colageno/partfculas conjugados, o fibrilla/partfculas de colageno conjugado) pueden incluirse en las composiciones, tales como composiciones inyectables, composiciones topicas, composiciones implantables, y pueden adquirir diversas formas (por ejemplo, lfquida, en polvo, deshidratada, semisolida, en gel, solida, ngida, etc.). Las composiciones tambien pueden incluir ingredientes adicionales, tales como ingredientes cosmeticos (activos y no activos) e ingredientes farmaceuticos (activos y no activos) en funcion de la naturaleza de la via de administracion y/o enfermedad particular a tratar.

The International Cosmetic Ingredient Dictionary and Handbook de CTFA (2008), 12a edicion, describe una amplia variedad de ingredientes cosmeticos no limitantes que pueden utilizarse en el contexto de la presente invencion. Ejemplos de estos ingredientes, que pueden resultar utiles para los productos topicos incluyen adsorbentes, emulsionantes, estabilizadores, lubricantes, disolventes, hidratantes (incluyendo, por ejemplo, emolientes, humectantes, formadores de la pelfcula, agentes oclusivos, y agentes que afectan a los mecanismos naturales de hidratacion de la piel), repelentes de agua, vitaminas (por ejemplo, A, B, C, D, E, y K), extractos botanicos, agentes antimicrobianos, antioxidantes (por ejemplo, BHT y tocoferol), agentes quelantes (por ejemplo, EDTA disodico y EDTA tetrasodico), y conservantes.

Ejemplos no limitantes de ingredientes farmaceuticos que tambien pueden utilizarse incluyen analgesicos, anestesicos, agentes antiinflamatorios, incluyendo farmacos antiinflamatorios no esteroideos, antibioticos, antifungicos, antivirales, antimicrobianos, activos contra el cancer, agentes antipsoriasicos, agentes antiseborreicos, protemas y peptidos biologicamente activos, agentes de tratamiento de quemaduras, agentes de cauterizacion, agentes protectores/de barrera cutaneos, esteroides incluyendo hormonas y corticosteroides, agentes para el tratamiento de heridas, agentes de cicatrizacion, etc.

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E. Kits

Los kits tambien se contemplan para utilizarse en ciertos aspectos de la presente invencion. Por ejemplo, un material o composicion de la presente invencion puede incluirse en un kit. Un kit puede incluir un recipiente. Los recipientes pueden incluir una botella, un tubo metalico, un tubo laminado, un tubo de plastico, una jeringa, un dispensador, un recipiente presurizado, un recipiente barrera, un envase, un compartimento, u otros tipos de recipientes tales como recipientes de plastico moldeados por inyeccion o soplado en los que se guardan los materiales o composiciones. Un kit tambien puede incluir instrucciones de utilizacion del kit y/o composiciones. Las instrucciones pueden incluir una explicacion de como aplicar, utilizary mantener las composiciones.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos se incluyen para demostrar determinados aspectos de la invencion. Los expertos en la materia han de apreciar que las tecnicas desveladas en los ejemplos siguientes representan tecnicas descubiertas por el inventor que funcionan adecuadamente en la practica de la invencion.

Ejemplo 1

(AuNP funcionalizadas)

Las nanopartfculas de oro (AuNP) que presentan un tamano de diametro medio de partfculas de 20 nanometros se funcionalizaron con 15 uM de 2-mercaptoetilamina (MEA). La espectrometna de FTIR confirma la presencia de los grupos funcionalizados en AuNP. Adicionalmente, la concentracion optima de MEA se determina mediante el uso de espectroscopia UV-Vis antes y despues de la adicion de un electrolito (NaCl al 10 %). La concentracion optima se definio como la concentracion de MEA que estabiliza las AuNPs, previene la agregacion y mantiene la dispersion incluso despues de la adicion de NaCl al 10 %. Como se muestra en la Fig. 2, el espectro UV/Vis se somete a un cambio en el pico de absorbancia cuando se funcionaliza con MEA. Los nanomateriales funcionalizados se mezclan entonces con 2 mM de EDC (1-Etil-3-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida) y 5 mM de sulfo-NHS (sulfo-N- hidroxisuccinimida) con el fin de facilitar la union covalente a los grupos carboxilo en las fibrillas de colageno.

Ejemplo 2

(Material conjugado de AuNP colageno)

Para formar armazones en gel de AuNP colageno, se anadieron 2,5 ml de colageno de cola de rata (concentracion de 9 mg/ml) a una mezcla de 0,5 ml 10x TFS, 0,057ml de NaOH 1M, 4,0 mg de EDC, 5,3 mg de sulfo-NHS y 0,5 ml de solucion de AuNP funcionalizadas (9,408 x 10A9 partfculas). A continuacion, la matriz se coloco en una incubadora a 37 °C durante 90 minutos para la polimerizacion y la reticulacion. La relacion entre el numero de nanopartfculas y la solucion de colageno es de 3,8 x 10A9 AuNP por 9 mg de colageno de cola de rata.

La Fig. 3, que es una EEM de un armazon de gel de colageno ejemplar con 20 nm de AuNP unidas a traves de un agente de reticulacion EDC/NHS de cistema. EEM caracteriza la distribucion y la densidad de las nanopartfculas de oro en los armazones de gel de colageno. Como se muestra en la FIG. 3 se presenta una EEM del material de AuNP colageno a 100x, las AuNPs estan presentes en todo el armazon, lo que indica que las AuNPs se unen a las fibrillas de colageno. Los geles se someten a un lavado exhaustivo que elimina cualquier AuNP sin unir del armazon de colageno (Haidekker (2006)).

Mientras que la micrograffa SEM mostrada en la FIG. 3 confirma la union de las nanopartfculas, la Fig. 4 confirma que las partfculas adheridas son partfculas de oro. La Fig. 4 es una imagen de EDE (espectroscopia por dispersion de energfa) de las nanopartfculas de oro inmovilizadas mediante enlace covalente en el armazon de colageno.

Ejemplo 3

(Ensayo de degradacion)

Como se ha senalado previamente, los inventores creen que mediante el bloqueo de una parte de los sitios de union a acido carboxflico en las fibrillas de colageno con partfculas, se producira una disminucion de la actividad de la colagenasa y una disminucion resultante en los indices de degradacion de colageno. Esto se ha confirmado experimentalmente (veanse los datos en la Fig. 5). Como se ilustra en la Fig. 5, se analizan y se comparan los efectos de los nanomateriales en la degradacion de colageno en diferentes concentraciones con las muestras sin nanomateriales. El tamano del diametro de las nanopartfculas de oro (AuNP) era constante para cada muestra a 100 nm y el procedimiento por el cual se fabrico el material conjugado se describe en la Seccion C ("Procedimiento para fabricar conjugados") de la descripcion de las realizaciones ilustrativas de la presente memoria descriptiva, que se incorpora en este ejemplo por referencia. La concentracion vario entre las muestras (1x, 2x, 4x). La concentracion del agente de reticulacion de longitud cero 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC) tambien vario entre las muestras. El colageno de cola de rata contenido en la muestra de control se reticulo por ECD (1x) sin nanopartfculas. Se llevo a cabo un ensayo con colagenasa para ensayar la estabilidad biologica de las muestras reticuladas. La estabilidad biologica a traves de la degradacion de las muestras se midio por la cantidad de

liberacion de hidroxiprolina. El porcentaje de la matriz degradada se indico en relacion al control (EDC 1x sin nanopartfculas) en la Fig. 5. Las barras de error representan la desviacion estandar calculada a partir de ocho muestras. Duplicando simplemente la concentracion del agente de reticulacion de longitud cero ECD disminuyo significativamente la degradacion del armazon en 30 % (p <0,001). La adicion de nanopardculas de oro a la matriz 5 tambien tuvo un efecto significativo disminuyendo la degradacion de la matriz (p <0,001). Una concentracion 1x de 100 nm de nanopardculas de oro redujo la degradacion en 50 %, mientras que una concentracion 2xtan solo redujo significativamente la degradacion en 7% de (p <0,01). No hay diferencias significativas entre AuNP (2x) y AuNP (4x), asf como AuNP (1x) con un aumento de EDC en la concentracion 2x. Los resultados indican que la adicion de 100 nm de nanopartfculas de oro ayuda en la resistencia proteolttica del colageno y aumenta la estabilidad biologica 10 de la matriz. Los resultados tambien indican que la union de los nanomateriales a los sitios de union a la colagenasa a lo largo de las fibrillas de colageno disminuye el mdice de degradacion del armazon. Los resultados indican, ademas, que puede utilizarse un intervalo de nanomateriales de tamanos y formas, tales como nanobarras con diametros comprendidos entre aproximadamente 20 y aproximadamente 1.000 nm.

Ademas, mediante la funcionalizacion de los nanomateriales con grupos amina (MEA), el numero de enlaces 15 formados entre el nanomaterial y el colageno puede maximizarse. Adicionalmente, cada nanopartfcula puede proporcionar multiples (mas de dos) sitios de union, mientras que la mayona de los agentes de reticulacion generalmente proporcionan un enlace en dos puntos entre las fibrillas de colageno. Este enfoque puede permitir la fabricacion de los tamanos de los poros de la matriz de colageno predeterminados espedficos optimos para el crecimiento tisular y la deposicion de colageno nativo. Dado que los nanomateriales de oro actuan como 20 depuradores de radicales libres, el armazon tambien contribuira a efectos antioxidantes mientras proporciona al mismo tiempo efectos antimicrobianos.

Otras protemas pueden conjugarse con los nanomateriales para facilitar interacciones espedficas una vez se inserten en el cuerpo. Por ejemplo, la fibrina puede anadirse al nanomaterial con MEA para ayudar a la coagulacion de la sangre durante la cicatrizacion.

25 Ejemplo 4

(Ensayo de viabilidad celular)

La Fig. 6 proporciona datos que muestran el efecto de las nanopartfculas de oro utilizadas en la viabilidad celular a traves de un ensayo de viabilidad WST-1. En particular, los armazones de colageno con nanopartfculas de oro preparados en el Ejemplo 3 en concentraciones de 1x, 2x, 4x, y 8x se incubaron con celulas durante 3 dfas. La 30 viabilidad de las celulas se determino mediante la conversion de WST-1 a un valor de absorbancia registrado con UV-Vis. Los resultados mostrados en la Figura 3 indican que la viabilidad del control no es significativamente superior a la viabilidad celular en presencia de nanopartfculas. Por lo tanto, los nanomateriales presentan una citotoxicidad muy baja. Con una mayor lectura de absorbancia de la concentracion mas alta de las nanopartfculas de oro, se sugiere que habfa una renovacion mayor de celulas en presencia de nanopartfculas de oro para convertir 35 mas WST-1 o se satura el numero de sitios de union en una concentracion 2x de AuNP dejando las nanopartfculas de oro en los medios e interfiriendo con los valores de absorbancia UV-Vis.

Ejemplo 5

(Analisis de union a acido carboxilico)

Los armazones de colageno preparados en el Ejemplo 3 se analizaron para determinar la cantidad de grupos acido 40 carboxilico libres restantes en los armazones. En particular, la espectroscopia de infrarrojos por transformada de Fourier se utilizo en el armazon con y sin las partfculas de oro. Esta tecnica se utiliza para indicar una reduccion en el pico en los sitios de acido carboxilico que muestran la union del oro a COOH en el colageno. Como se ilustra en la Fig. 7, se observo una disminucion en el pico en el area 1125-920 nm, que es indicativo de una reduccion en el enlace C-OH (grupos COOH libres). El area bajo la curva vario de 0,3680 hasta 0,3, que es una disminucion del 45 18 % en los grupos acido carboxilico libres en el armazon conjugado de colageno/partfculas.

Ejemplo 6

(Evaluacion de la celularidad in vitro, retencion celular, y produccion de la matriz extracelular).

El presente ejemplo proporciona datos que muestran los efectos del material conjugado de colageno/partfculas en la celularidad, viabilidad celular, produccion de la matriz extracelular, y distribucion celular en comparacion con 50 controles sin tratar.

Materiales y procedimientos

Asignaciones del grupo de armazon: Se evaluaron cinco combinaciones diferentes de nanopartfculas de oro y geles de colageno. Los grupos se numeraron de 1 a 5 y se describen en la Tabla 1. Se sembro un total de 10 construcciones con fibroblastos dermicos y se incubaron durante 7 y 14 dfas. Se analizaron un total de 50 muestras.

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Tabla 1

Grupo

Grupo 1: Control Colageno + EDC Grupo 2: Colageno + EDC + 2x AuNP Grupo 3: Colageno + EDC + 1x AuNP Grupo 4: Colageno + EDC + 4x AuNP Grupo 5: Colageno + A EDC + 2x AuNP

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n=5 n=5 n=5 n=5 n=5

Dfa 14

n=5 n=5 n=5 n=5 n=5

Recogida y cultivo de fibroblastos: La dermis de la piel se recogio de perros sacrificados por una sobredosis de barbituricos por razones no relacionadas con el presente estudio. El tejido se coloco en medio de Eagle modificado de Dulbecco con suero fetal bovino al10 %, tampon de Hepe al 0,008 %, aminoacidos no esenciales al 0,008 %, 100 Ul/ml penicilina al 0,002 %, 100 ug/ml de estreptomicina, 25 ug/ml de anfotericina B, L-ascorbato al 0,002 %, L- glutamina al 0,01 % (MEMD + SFB) para el transporte. El tejido dermico se secciono en partes de 2 mm x 2 mm utilizando una hoja de bistun # 10 en una tecnica esteril. Los fragmentos tisulares se combinaron con una solucion de colagenasa clostridial Tipo IA esteril (Sigma, EE. UU.), en una concentracion de 7,5 mg/ml de solucion RPMI 1640. La mezcla se agito en una incubadora a 37 °C, CO2 al 5 %, 95 % de humedad durante 6 horas. La solucion digerida se centrifugo a 1.000 rpm durante 10 minutos. El sobrenadante se decanto y el pellet celular se volvio a suspender en 5 ml de MEMD + SFB. Los matraces se incubaron a 37 °C, CO2 al 5 %, 95 % de humedad con cambio en el medio esteril realizado cada 3 dfas. Los fibroblastos se controlaron para el crecimiento utilizando un microscopio invertido hasta una observancia del 95 % de confluencia celular por matraz de cultivo tisular. Las celulas se transfirieron a matraces de cultivo tisular de 75 ml mediante subcultivo hasta alcanzar el 3er pase y despues se congelan para su posterior uso. Las celulas se descongelaron posteriormente, se liberaron de la monocapa y se introdujeron en solucion antes de su uso.

Siembra del armazon: Se formaron 250 pl de geles de colageno en volumen aproximado a partir de cada uno de los grupos y tratamientos. Se colocaron diez (n=10) construcciones de cada grupo en pocillos individuales de una placa de cultivo tisular en TFS durante 24 horas, colocandose en incubadoras esteriles a 37 °C, CO2 al 5 %, 95 % de humedad como un acondicionamiento de preinmersion. Los cultivos microbianos y los analisis de sensibilidad previos no confirmaron crecimiento alguno despues de 3 dfas de cultivo de las construcciones durante un periodo de 3 dfas. Tras la preinmersion, se eliminaron los medios de cada pocillo y se reemplazaron con la solucion celular de fibroblastos en una concentracion de 1 x 106 celulas/ml. Las construcciones se cultivaron estaticamente con la solucion celular durante 24 horas, momento en el que la solucion celular se reemplazo con medios de cultivo MEMD + SFB durante la duracion del estudio.

Siembra de la construccion y evaluacion: Se recogieron cinco (n=5) construcciones de cada grupo en los dfas 7 y 14. Se recogieron secciones transversales de cada construccion para determinar la viabilidad celular y la evaluacion de la distribucion. La viabilidad celular se determino usando el homodfmero-1 de etidio (4 ul/ml de TFS) y tincion fluorescente de calcema AM (acetoximetilester) (0,4 ul/ml TFS) (Kit de viabilidad/citotoxicidad LIVE/DEAD, Molecular Probes Co.) y el uso de microscopfa ultravioleta. Se fabricaron secciones de un milfmetro y se incubaron con los agentes de tincion durante 20 minutos a temperatura ambiente, se colocaron en un portaobjetos de microscopio de vidrio, se humedecieron con varias gotas de TFS, y se tineron utilizando la tecnica de doble marcado fluorescente. Las secciones se examinaron en un aumento de 10X. Las imagenes de cada seccion se capturaron digitalmente por una camara digital Olympus DP-70 (Olympus, Melville, NY) y se guardaron como archivos Tiff. El resto de cada construccion se liofilizo, se obtuvo un peso en seco y luego se mezclo con 1 ml de solucion de papama. Para determinar el contenido de GAG se utilizaron partes de cada digestion mediante los ensayos de azul de dimetilmetileno, y el contenido en colageno para determinar las concentraciones de hidroxiprolina. La solucion restante se incubo a 60 °C en un bano de agua durante 4 horas. Se utilizo el ensayo para la cuantificacion del ADN bicatenario Quant-iT PicoGreenTM (Invitrogen) para determinar la celularidad del armazon restante. El ADN bicatenario extrafdo del timo bovino se mezclo con tampon TE (Invitrogen) para crear concentraciones convencionales de ADN de 1.000, 100, 10 y 1 ng/ml. Se anadieron los patrones y 100 ul de cada muestra digerida de papama (utilizados en GAG y en ensayos de hidroxiprolina previos) a una placa de 96 pocillos. Se anadieron 100 uL de 2 ug/ml de reactivo Pico Green a cada pocillo y la placa se incubo durante 5 minutos. La fluorescencia de la muestra se leyo con una excitacion de 485 nm/emision de 528 nm por el lector de placas espectrofotometrico Syngergy HT-KC-4 (BioTec, Winooski Vermont). Las absorbancias se convirtieron en concentraciones ng/l y el rendimiento del ADN bicatenario total se expreso en ng utilizando el software FT4 (BioTec, Winooski Vermont).

Cada conjunto de datos se analizo y los valores atfpicos se determinaron por aquellos valores que eran superiores o inferiores a 2 desviaciones estandar fuera del conjunto de datos restantes, y esos valores se descartaron. Las diferencias en y entre los grupos se analizaron estadfsticamente con un ensayo de ANOVA de una via con diferencias entre los grupos individuales determinados por los diversos analisis de comparacion post-hoc de todos los pares con significado estadfstico establecido a p <0,05.

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Resultados

Evaluacion del ADN bc como medida de celularidad: Como se ilustra en la Fig. 8, D^a 7: el Grupo 1 posefa cantidades significativamente superiores de ADN que los grupos 2, 3 y 5. No se detectaron otras diferencias significativas. Dfa 14: el Grupo 2 posefa cantidades significativamente superiores de ADN que el grupo 5. No se detectaron otras diferencias significativas. Los Grupos 1 mostraron una disminucion significativa en el contenido de ADN con el tiempo, mientras que los Grupos 2 y 3 mostraron un aumento en el ADN entre los dos intervalos de tiempo. No se detectaron otras diferencias significativas.

Evaluacion de glicosaminoglicanos (GAG): Como se ilustra en la Fig. 9, Dfa 7: el Grupo 1 posefa cantidades significativamente superiores de GAG que el grupo 5. No se detectaron otras diferencias significativas. Dfa 14: el Grupo 2 posefa cantidades significativamente superiores de GAG que los grupos 1 y 5. No se detectaron otras diferencias significativas. El Grupo 1 mostro una disminucion significativa en el contenido de GAG con el tiempo, mientras que los Grupos 2, 3 y 5 mostraron un aumento en GAG entre los dos intervalos de tiempo. No se detectaron otras diferencias significativas.

Evaluacion de la viabilidad celular/integracion: La viabilidad celular era subjetivamente > 95 % en todos los grupos en todos los intervalos de tiempo (Fig. 11). La balsa celular marcada resulto evidente en todos los grupos que hadan la cuantificacion de la viabilidad espedfica imposible a traves del analisis de imagen por ordenador debido a la enorme confluencia de celularidad viable. Ningun grupo demostro lo que se interpretana como indicios de muerte celular. Cada grupo demostro la adhesion celular, la retencion y la proliferacion (Figura 12). El dfa 7, los grupos demostraron mas evidencia de proliferacion sobre la superficie celular en grandes balsas, mientras que el dfa 14 se presencio una penetracion mas profunda en el interior de las construcciones de gel de cada grupo. De modo subjetivo, ninguna diferencia puede detectarse en el grado o extension de la penetracion celular entre los grupos. En aquellas secciones en las que se presenciaron las cavidades asociadas a AuNP en el gel, se observo que la proliferacion celular es abundante a lo largo de los canales (veanse Dfa 7, Grupos 2 y 5).

Conclusiones

Estos datos del Ejemplo 6 sugieren que aunque la celularizacion inicial de geles de colageno pareda mas optima en los geles sin tratar, el analisis a largo plazo revelo que, en general, los grupos tratados con AuNP paredan retener las celulas o fomentar mejor su proliferacion que las construcciones de gel sin tratar. Cabe senalar que estas observaciones se basan en gran medida solo en las tendencias segun en el Dfa 14, la unica diferencia estadfstica en cuanto al contenido de ADN entre los grupos era que el Grupo 2 posefa mas celularidad que el Grupo 5. La diferencia de tratamiento entre estos dos grupos era duplicar la concentracion de EDC en el Grupo 5 que puede conferir un efecto perjudicial en la retencion o la proliferacion celular. No obstante, examinando los dos intervalos de tiempo en cada tratamiento, el Grupo 1 es el unico grupo que demostro una disminucion significativa en la celularidad con el tiempo, mientras que los Grupos 2 y 3 mostraron aumentos. Aunque la mitogenesis o la proliferacion celular no se analizo espedficamente en este caso, este aumento de la celularidad en estos grupos era probablemente el resultado (en parte) del aumento de la celularidad ya que no se anadieron celulas adicionales en ningun intervalo de tiempo. Todos los grupos demostraron la capacidad de retener las celulas y favorecer su integracion en el interior de las construcciones de gel con el tiempo sin indicios de muerte celular detectable. En base a los datos emparejados de ADN bc/viabilidad celular, parece que las celulas se retuvieron con menos exito (pero no se sometieron necesariamente a cantidades cada vez mayores de muerte celular) en el Grupo 1 entre los dfas 7 y 14, revelando por consiguiente que los grupos tratados tambien favorecieron mejor la retencion celular, en especial en los Grupos 2 y 3 (concentraciones de 1X y 2X AuNP). Este aumento de la celularidad era probablemente responsable de un gran aumento correspondiente en la produccion de GAG del Grupo 2 en el Dfa 14. En lo que respecta al analisis de hidroxiprolina como determinante de la produccion de colageno, la actividad de los Grupos 1, 2 y 3 era muy similar en ambos intervalos de tiempo. Resulta interesante, que el Grupo 4 (4X AuNP) demostro niveles inferiores de concentraciones de HP, especialmente en el Dfa 14. El Grupo 5 mostro un pico inicial en el contenido de HP que disminuyo significativamente con el tiempo.

Todos los materiales, composiciones, o procedimientos desvelados y reivindicados en la presente memoria descriptiva pueden fabricarse y ejecutarse sin experimentacion indebida a tenor de la presente descripcion.

Claims (15)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   45

   REIVINDICACIONES

   1. Una composicion inyectable o implantable que comprende colageno unido a partfculas mediante enlace covalente, en la que los enlaces amida covalentes se forman entre los grupos acido carbox^lico libres de colageno y los grupos amina reactivos de las partfculas, y en la que las partfculas presentan un tamano de diametro medio de partfculas que oscila de 60 a 900 nanometros.
2. 2. La composicion de la reivindicacion 1, en la que el colageno es reticulado, preferentemente en la que el colageno reticulado es preferentemente poroso y tiene un tamano de poro medio que oscila de 500 nanometros a 200 micrometros o de 1 micrometro a 100 micrometros, y en la que el colageno es reticulado preferentemente a traves de las partfculas, en la que se forman al menos dos enlaces amida covalentes entre los grupos acido carboxflico libres del colageno y al menos dos grupos amina reactivos en al menos una partfcula.
3. 3. La composicion de la reivindicacion 2, en la que el colageno es reticulado con un agente de reticulacion de carbodiimida, en la que se utilizan preferentemente 2 a 4 mg de un agente de reticulacion de carbodiimida por 30 mg de colageno para formar los enlaces covalentes; o en la que se utilizan preferentemente 0,5 a 0,2 mg de un agente de reticulacion de carbodiimida por 1 x 109- 2x 1010 partfculas para formar los enlaces covalentes.
4. 4. La composicion de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en la que las partfculas comprenden un material metalico, en la que el material metalico se selecciona preferentemente entre el grupo que consiste en oro, plata, platino, titanio, mquel y cobre.
5. 5. La composicion de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en la que las partfculas comprenden un material ceramico o un material biodegradable.
6. 6. La composicion de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en la que el grupo reactivo es mercaptoetilamina o cistamina o ambas.
7. 7. La composicion de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en la que la relacion de partfculas en colageno se encuentra en un intervalo de 1 x 109 partfculas por mg de colageno a 2 x 1010 partfculas por mg de colageno.
8. 8. La composicion de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, que comprende ademas celulas madre embrionarias, celulas madre adultas, celulas madre pluripotentes inducidas, celulas epiteliales, celulas exocrinas o endocrinas, mioblastos, fibroblastos, osteoblastos, condroblastos, celulas estromales, hepatocitos, celulas de los islotes, neuroblastos, queratinocitos, osteoclastos, osteocitos, celulas cardfacas, condrocitos, celulas endoteliales, o celulas musculares, o cualquiera de sus combinaciones.
9. 9. La composicion de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en la que la composicion es un gel, una solucion, una pasta, o una estructura ngida deshidratada.
10. 10. La composicion de una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en la que la composicion esta comprendida en una jeringa.
11. 11. La composicion de una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en la que la composicion es un equivalente de la dermis o de la epidermis.
12. 12. La composicion de una cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en la que 15 a 20% de los grupos acido carboxflico libres del colageno se unen de manera covalente a las partfculas a traves de un enlace amida.
13. 13. La composicion de una cualquiera de las reivindicaciones 1-12, para su uso en un procedimiento para incrementar el cartflago articular aumentando el volumen tisular en una persona, en la que la composicion es formulada para una administracion por inyeccion en una capsula articular.
14. 14. La composicion de una cualquiera de las reivindicaciones 1-12, para su uso en un procedimiento para rellenar huecos, defectos, o para aumentar el volumen tisular en una persona, en la que la composicion se formula para una administracion por inyeccion intradermica o subcutanea.
15. 15. Un procedimiento para reducir la degradacion del colageno in vitro mediante la degradacion enzimatica, que comprende conjugar colageno con partfculas que tienen grupos amina reactivos y que tienen un diametro medio de partfculas que oscila de 60-900 nanometros, en el que los enlaces amida covalentes se forman entre los grupos acido carboxflico libres del colageno y los grupos amina reactivos en las partfculas, y en el que la degradacion del colageno por la colagenasa se reduce de dicha forma, en el que dicho colageno es inyectable o implantable.