ES2705602T3 - Composiciones de péptidos anfifílicos purificadas y usos de las mismas - Google Patents

Abstract

Una composición que comprende una solución acuosa de al menos el 2% y hasta el 5% en peso de cadenas peptídicas anfifílicas, en la que las cadenas peptídicas son cada una n-RADARADARADARADA-c (RAD16- I), para su uso en un método para facilitar la hemostasia por inyección directa en un sitio de herida antes de la gelificación donde los iones migran a la solución peptídica del tejido circundante y hacen que forme un gel hemostático.

Description

DESCRIPCIÓN

Composiciones de péptidos anfifílicos purificadas y usos de las mismas

Campo de la invención

La presente invención se refiere a composiciones de péptidos anfifílicos de alta pureza.

Antecedentes de la invención

En general, el cuerpo es capaz de regenerar tejido lesionado para producir tejido nuevo que tiene propiedades similares al tejido original. Por ejemplo, los cortes pequeños se curan sin formar cicatrices permanentes, y las fracturas limpias en el hueso se curan mediante la formación de hueso nuevo que une los dos fragmentos de hueso. Sin embargo, las células del tejido conectivo y otras células orgánicas dependen del anclaje; requieren un andamiaje para mostrar un comportamiento fisiológico normal. Cuando el daño tisular es extenso o hay grandes huecos, es posible que las células que migran hacia la herida no encuentren el anclaje adecuado y produzcan tejido cicatricial para cerrar el hueco entre el tejido sano en los bordes de la herida. El tejido cicatricial no tiene las mismas propiedades mecánicas y biológicas que el tejido original. Por ejemplo, el tejido cicatricial en la piel no es tan flexible como el tejido original. El tejido cicatricial en el hueso no es tan fuerte como el hueso no lesionado y, a menudo, proporciona un punto débil donde es más fácil volver a romper el hueso. Algunos tejidos, tal como el cartílago articular, no se regeneran de forma natural, y la cicatrización solo procede de la formación de tejido cicatricial.

Hasta la fecha, se ha realizado un esfuerzo sustancial para desarrollar materiales para reemplazar o ayudar a la regeneración de diversos tejidos. Estos materiales a veces explotan la capacidad de las heridas pequeñas para curarse mediante la regeneración en tejidos donde las heridas grandes se curan mediante la formación de cicatrices. Por lo tanto, los materiales se empaquetan en un sitio de la herida que ayuda a cerrar el hueco entre los bordes de una herida e intenta prevenir la formación de cicatrices antes de que proceda la regeneración del tejido. Aunque se han desarrollado diversos materiales sintéticos y derivados naturalmente para la regeneración de tejidos, estos materiales a veces presentan incompatibilidad inmune y distribución inadecuada de la tensión. Además, el uso de material de animales, tal como la piel de vaca o el cartílago de cerdos o tiburones, ha planteado la preocupación de una posible contaminación por agentes infecciosos, tales como priones. Por lo tanto, son deseables materiales mejorados de origen biológico que tengan compatibilidad mejorada, presenten un riesgo reducido de contaminación y proporcionen las características biomecánicas adecuadas para la reparación de tejidos.

Los documentos WO 03/096972 A2 y WO 02/062961 A2 describen composiciones que comprenden hidrogeles de péptidos autoensamblados para su uso en la reparación de tejidos.

El documento WO 03/084980 A2 describe una composición que comprende una solución acuosa de cadenas peptídicas anfifílicas, en la que las cadenas peptídicas tienen una parte hidrófila e hidrófoba y en la que las cadenas peptídicas se autoensamblan como un gel, para su uso en cirugía reconstructiva y para detener el flujo sanguíneo en los vasos.

El documento WO 2005/014615 A2 describe composiciones que comprenden péptidos de autoensamblaje que comprenden (a) un primer dominio de aminoácidos que media el autoensamblaje, en las que el dominio comprende aminoácidos alternativos hidrófobos e hidrófilos que son complementarios, estructuralmente compatibles y se autoensamblan en una estructura macroscópica cuando están presentes en forma no modificada; y (b) un segundo dominio de aminoácidos que no se autoensambla de forma aislada.

Además, la página web de 3D Matrix Japan describe un biomaterial peptídico denominado PuraMatrix™, que comprende un péptido con la secuencia de aminoácidos n-RADARADARADARADA-c (página web de 3D Matrix Japan: establecida a través "WayBackMachine", 15 de abril de 2005, URL:http:// www.3d-matrix.co.jp/pr01.html; "WayBackMachine", 16 de abril de 2005, URL:http://www.3d-matrix.co.jp/pr02.html; "WayBackMachine", 16 de abril de 2005, URL:http://www.3d-matrix.co.jp/ pr03.html).

Definiciones

Por "andamiaje" se entiende una estructura tridimensional capaz de soportar células. Las células pueden estar encapsuladas por el andamiaje o pueden estar dispuestas en una capa sobre una superficie del andamiaje. La estructura secundaria de lámina beta del andamiaje puede confirmarse utilizando dicroísmo circular estándar para detectar un mínimo de absorbancia a aproximadamente 218 nm y un máximo a aproximadamente 195 nm. El andamiaje está formado por el autoensamblaje de péptidos que pueden incluir L-aminoácidos, D-aminoácidos, aminoácidos naturales, aminoácidos no naturales, o una combinación de los mismos. Si están presentes L-aminoácidos en el andamiaje, la degradación del andamiaje produce aminoácidos que pueden ser reutilizados por el tejido huésped. Se contempla también que los péptidos pueden estar unidos covalentemente a un compuesto, tal como un quimioatrayente o un compuesto terapéuticamente activo. Los péptidos pueden sintetizarse químicamente 0 purificarse a partir de fuentes naturales o recombinantes, y los extremos amino y carboxi de los péptidos pueden estar protegidos o no protegidos. El andamiaje peptídico puede formarse a partir de una o más especies moleculares distintas de péptidos que son complementarias y estructuralmente compatibles entre sí. Los péptidos que contienen pares apareados incorrectamente, tales como el apareamiento repulsivo de dos residuos cargados de forma similar de péptidos adyacentes, pueden formar también andamiajes si la fuerza disruptiva está dominada por interacciones estabilizadoras entre los péptidos. A los andamiajes se hace también referencia en el presente documento como estructuras peptídicas, estructuras de hidrogeles peptídicos, estructuras de gel peptídico, o estructuras de hidrogel.

Por "complementario" se entiende capaz de formar interacciones de enlaces iónicos o enlaces de hidrógeno entre residuos hidrófilos procedentes de péptidos adyacentes en el andamiaje, como se ilustra en la Figura 1, cada residuo hidrófilo en un péptido se une por enlaces hidrógeno o se aparea iónicamente con un residuo hidrófilo en un péptido adyacente o se expone a disolvente.

Por "estructuralmente compatible" se entiende capaz de mantener una distancia intrapeptídica suficientemente constante para permitir la formación de andamiaje. La variación en la distancia intrapeptídica es menor de 4, 3, 2, o 1 angstrom. Se contempla también que variaciones mayores en la distancia intrapeptídica pueden no impedir la formación de andamiaje si están presentes fuerzas estabilizadoras eficientes. Esta distancia puede calcularse basándose en la modelación molecular o basándose en un procedimiento simplificado que ha sido publicado con anterioridad (Patente de Estados Unidos Número 5.670.483). En este método, la distancia intrapeptídica se calcula tomando la suma del número de átomos no ramificados en las cadenas laterales de cada aminoácido en un par. Por ejemplo, la distancia intrapeptídica para un par iónico lisina-ácido glutámico es 5 4 = 9 átomos, y la distancia para un par de enlaces hidrógeno glutamina-glutamina es 4 4 = 8 átomos. Utilizando un factor de conversión de 3 angstroms por átomo, la variación en la distancia intrapeptídica de los péptidos que tienen pares lisina-ácido glutámico y pares glutamina-glutamina (por ejemplo, 9 frente a 8 átomos) es 3 angstroms.

El término "puro" se utiliza para indicar la extensión en la que los péptidos descritos en el presente documento están exentos de otras especies químicas, incluyendo aductos de deleción del péptido en cuestión y péptidos de longitudes diferentes.

El término "agente biológicamente activo" se utiliza para hacer referencia a agentes, compuestos, o entidades que alteran, inhiben, activan, o afectan de otro modo a eventos biológicos o bioquímicos. Tales agentes pueden ser derivados naturalmente o sintéticos. Los agentes biológicamente activos incluyen clases de moléculas (por ejemplo, proteínas, aminoácidos, péptidos, polinucleótidos, nucleótidos, carbohidratos, azúcares, lípidos, nucleoproteínas, glucoproteínas, lipoproteínas, esteroides, factores de crecimiento, quimioatrayentes, etc.) que se encuentran comúnmente en células y tejidos, tanto si las moléculas propiamente dichas existen naturalmente como si son creadas artificialmente (por ejemplo, por métodos sintéticos o recombinantes). Los agentes biológicamente activos incluyen también fármacos, por ejemplo, sustancias anticancerosas, analgésicos, y opioides. Preferiblemente, aunque no necesariamente, el fármaco es uno que ha sido considerado ya como seguro y eficaz para su uso por la agencia u organismo gubernamental apropiado. Por ejemplo, fármacos para uso humano enumerados por la FDA bajo 21 C.F.R. §§330.5, 331 a 361, y 440 a 460; fármacos para uso veterinario enumerados por la DA bajo 21 C.F.R. §§500 a 589 se consideran todos ellos aceptables para su uso de acuerdo con la presente invención. Los agentes biológicamente activos ejemplares adicionales incluyen, pero sin limitación, sustancias anti-SIDA, sustancias anti­ cáncer, inmunosupresores (por ejemplo, ciclosporina), agentes anti-virales, inhibidores enzimáticos, neurotoxinas, hipnóticos, antihistaminas, lubricantes, tranquilizantes, anticonvulsivos, relajantes musculares y agentes anti-Parkinson, antiespasmódicos y contractivos musculares incluyendo bloqueadores de canales, mióticos y anticolinérgicos, compuestos anti-glaucoma, agentes anti-parásitos, anti-protozoos, y/o anti-fúngicos, moduladores de las interacciones célula-matriz extracelular incluyendo inhibidores del crecimiento celular y moléculas antiadhesión, agentes vasodilatadores, inhibidores de la síntesis de ADN, ARN o proteínas, antihipertensivos, antipiréticos, agentes antiinflamatorios esteroideos y no esteroideos, factores antiangiogénicos, factores antisecretores, anticoagulantes y/o agentes antitrombóticos, anestésicos locales, productos oftálmicos, prostaglandinas, agentes de direccionamiento, neurotransmisores, proteínas, modificadores de la respuesta celular, y vacunas.

Como se usa en el presente documento, un hidrogel tal como un hidrogel peptídico es "estable con respecto a la agitación mecánica o física" si, cuando se somete a agitación mecánica, el mismo retiene sustancialmente las propiedades físicas (tales como elasticidad, viscosidad, etc.), que caracterizaban al hidrogel antes de la agitación física. El hidrogel no precisa mantener su forma o tamaño y puede fragmentarse en piezas más pequeñas cuando se somete a agitación mecánica, si bien se considera todavía estable con respecto a la agitación mecánica o física. El término "estable" no tiene este significado excepto cuando se utiliza con esta frase.

Como se usa en el presente documento, el término "nanofibra" se refiere a una fibra que tiene un diámetro de dimensiones nanoescalares. Típicamente, una fibra nanoescala tiene un diámetro de 500 nm o menos. De acuerdo con un aspecto de la divulgación, una nanofibra tiene un diámetro menor de 100 nm. De acuerdo con algunos otros aspectos de la divulgación, una nanofibra tiene un diámetro menor de 50 nm. De acuerdo con algunos otros aspectos de la divulgación, una nanofibra tiene un diámetro menor de 20 nm. De acuerdo con algunos otros aspectos de la divulgación, una nanofibra tiene un diámetro de entre 10 y 20 nm. De acuerdo con algunos otros aspectos de la divulgación, una nanofibra tiene un diámetro de entre 5 y 10 nm. De acuerdo con algunos otros aspectos de la divulgación, una nanofibra tiene un diámetro menor de 5 nm.

El término "andamiaje de ambiente nanoescalar" se refiere a un andamiaje que comprende nanofibras. De acuerdo con ciertos aspectos de la divulgación, al menos el 50% de las fibras que comprenden el andamiaje son nanofibras. De acuerdo con ciertos aspectos de la divulgación, al menos el 75% de las fibras que comprenden el andamiaje son nanofibras. De acuerdo con ciertos aspectos de la divulgación, al menos el 90% de las fibras que comprenden el andamiaje son nanofibras. De acuerdo con ciertos aspectos de la divulgación, al menos el 95% de las fibras que comprenden el andamiaje son nanofibras. De acuerdo con ciertos aspectos de la divulgación, al menos el 99% de las fibras que comprenden el andamiaje son nanofibras. Por supuesto, el andamiaje puede comprender también constituyentes distintos de fibras, por ejemplo, agua, iones, agentes inductores de crecimiento y/o diferenciación tales como factores de crecimiento, agentes terapéuticos, u otros compuestos, que pueden encontrarse en solución en el andamiaje y/o unidos a andamiaje.

Resumen de la invención

La invención se refiere a una composición para su uso como se define en la reivindicación 1. En el presente documento se describe una solución acuosa que comprende cadenas peptídicas. La solución puede formar un hidrogel que es estable con respecto a la agitación mecánica. La solución puede ser inyectable y puede tener un pH entre aproximadamente 4,5 y aproximadamente 8,5. Los péptidos se pueden autoensamblar en una matriz en la solución. El autoensamblaje no necesita ser estable con respecto a la agitación mecánica. La solución puede contener al menos 0,1 mM de un electrolito.

La solución con el electrolito puede ser inyectable. Los péptidos pueden adaptarse y construirse para ser capaces de autoensamblarse después de la inyección. La concentración de las cadenas peptídicas en la solución acuosa puede ser de al menos aproximadamente el 2%, al menos aproximadamente el 3%, al menos aproximadamente el 4%, al menos aproximadamente el 5% en peso. La solución acuosa o las cadenas peptídicas pueden incluir además uno o más agentes biológicamente activos.

En el presente documento también se describe un método para preparar una cadena peptídica. El método incluye proporcionar aminoácidos que comprenden un grupo en la cadena lateral que está unido a un grupo protector, ensamblar los aminoácidos en una cadena peptídica anfifílica, eliminar el grupo protector haciendo reaccionar la cadena peptídica con un ácido, e intercambiar el ácido por una sal de acetato no fluorada. La sal de acetato no fluorada se puede seleccionar entre acetato de sodio y acetato de potasio. El ácido puede ser ácido trifluoroacético. En el presente documento también se describe una composición que incluye una solución acuosa de más del 2% de cadenas peptídicas anfifílicas de al menos 8 aminoácidos de longitud y que tienen aminoácidos alternativos hidrófilos e hidrófobos. La solución puede, pero no necesitar ser mecánicamente estable con respecto al autoensamblaje de los péptidos.

En el presente documento también se describe un andamiaje macroscópico que comprende cadenas peptídicas anfifílicas, en el que las cadenas peptídicas tienen aminoácidos hidrófobos e hidrófilos alternos, son complementarias y estructuralmente compatibles, y se autoensamblan en un andamiaje macroscópico de lámina beta, y en el que las cadenas peptídicas anfifílicas están en una solución acuosa, y en la que al menos aproximadamente el 75% de las cadenas peptídicas tienen la misma secuencia. El andamiaje macroscópico no necesita ser mecánicamente estable con respecto a la agitación física. Las cadenas peptídicas anfifílicas pueden estar en una solución acuosa que contiene un electrolito, y el andamiaje puede ser mecánicamente estable con respecto a la agitación física. Las cadenas peptídicas pueden adaptarse y construirse para ser capaces de autoensamblarse después de la inyección. Un agente biológicamente activo puede encapsularse dentro del andamiaje.

En el presente documento también se describe un método para administrar un agente biológicamente activo a un paciente que incluye proporcionar una solución acuosa de péptidos anfifílicos, añadir una cantidad predeterminada del agente biológicamente activo a la solución acuosa, y añadir una cantidad predeterminada de un electrolito a la solución acuosa, en el que, después de añadir las cantidades predeterminadas, la solución acuosa forma un hidrogel. El agente biológicamente activo y el electrolito se pueden combinar en una sola solución acuosa y añadirse a la solución acuosa de los péptidos anfifílicos simultáneamente. El agente biológicamente activo puede seleccionarse de un antiinflamatorio, un antibiótico, un agente anticanceroso, un analgésico, un opioide, un fármaco, un factor de crecimiento, una proteína, un aminoácido, un péptido, un polinucleótido, un nucleótido, un carbohidrato, un azúcar, un lípido, un polisacárido, una nucleoproteína, una glucoproteína, una lipoproteína, un esteroide, un quimioatrayente y cualquier combinación de los anteriores. El método puede incluir además inyectar el hidrogel en un sitio predeterminado en un paciente. Por ejemplo, el método puede incluir inyectar la solución acuosa en un paciente antes de añadir una cantidad predeterminada de electrolito y después de añadir una cantidad predeterminada de dicho agente biológicamente activo, en donde añadir una cantidad predeterminada de electrolito comprende permitir que los iones emigren a la solución inyectada desde tejido circundante. El método puede incluir inyectar la solución acuosa en un sitio predeterminado en un paciente antes de añadir una cantidad predeterminada de electrolito y después de añadir una cantidad predeterminada de dicho agente biológicamente activo, en donde la solución acuosa inyectada es estable con respecto a la migración desde el sitio predeterminado.

En el presente documento también se describe un kit para administrar una composición peptídica a un paciente. El kit incluye una composición peptídica purificada, que puede estar en forma de una solución acuosa, y al menos un elemento seleccionado del grupo que consiste en: un electrolito, un tampón, un dispositivo de administración, un recipiente adecuado para mezclar la composición peptídica con uno o más agentes diferentes. El dispositivo de administración puede ser, por ejemplo, un catéter, una aguja, una jeringa o una combinación de cualquiera de estos. El kit puede incluir además instrucciones de uso, por ejemplo, para preparar la composición peptídica, para mezclar la composición peptídica con otros agentes, para introducir la composición peptídica en un sujeto, etc.

En el presente documento también se describe un kit para administrar un agente biológicamente activo a un paciente. El kit incluye una composición peptídica purificada, que puede estar en forma de una solución acuosa que comprende péptidos anfifílicos, y el agente biológicamente activo, que puede proporcionarse premezclado con los péptidos o por separado. El kit puede incluir además un electrolito, un tampón, un dispositivo de administración, instrucciones, etc. El agente biológicamente activo puede estar presente en nanoesferas, microesferas, etc. (también denominadas nanocápsulas, microcápsulas, etc.). En la técnica se conocen numerosos métodos y reactivos para hacer tales esferas, cápsulas, etc., que encapsulan un agente biológicamente activo. Por ejemplo, se pueden usar polímeros estándar y métodos para hacer formulaciones de fármacos de liberación sostenida y/o resistentes al pH. En el presente documento también se describe un kit para administrar células a un paciente. El kit incluye una composición peptídica purificada, que puede estar en forma de una solución acuosa que comprende los péptidos. El kit puede incluir células. El kit puede incluir cualquiera de los elementos enumerados en la descripción de los kits anteriores. El kit puede incluir además instrucciones para la preparación de las células a administrar utilizando el kit. Por ejemplo, las instrucciones pueden describir cómo cultivar células, cómo recoger células de un sujeto, cómo mezclar células con los péptidos, tipos de células adecuadas para su uso, etc. La solución acuosa puede tener una vida útil de almacenamiento de al menos nueve semanas en condiciones predeterminadas. La solución acuosa puede incluir además un electrolito.

Breve descripción del dibujo

La invención se describe con referencia a las diversas figuras del dibujo, en las cuales,

La Figura 1 es una ilustración esquemática de las interacciones entre los péptidos en el andamiaje peptídico. Diversos péptidos con secuencias de aminoácidos de restos hidrófobos e hidrófilos alternos se autoensamblan para formar un andamiaje estable de láminas beta cuando se exponen a soluciones electrolíticas fisiológicamente equivalentes (Pat. de Estados Unidos N.° 5.955.343 y 5.670.483). Los andamiajes peptídicos están estabilizados por numerosas interacciones entre los péptidos. Por ejemplo, las cadenas laterales de aminoácidos cargadas positivamente y cargadas negativamente de péptidos adyacentes forman pares iónicos complementarios, y otros residuos hidrófilos tal como asparagina y glutamina, participan en las interacciones de enlace de hidrógeno. Los grupos hidrófobos en péptidos adyacentes participan en las interacciones de van der Waals. Los grupos amino y carbonilo en el esqueleto peptídico también participan en interacciones de enlace de hidrógeno intermolecular.

La Figura 2 es una serie de fotomicrografías que representan, para un defecto calvarial de rata 28 días después del tratamiento, A) tejido normal (no lesionado), B) un defecto calvarial de control (no tratado), C) tratamiento con una solución al 3% de cadenas peptídicas no ensambladas, D) tratamiento con COLLAPLUG™, E) tratamiento con una solución al 3% de cadenas peptídicas ensambladas en presencia de NaCl, F) tratamiento con una solución al 3% de cadenas peptídicas ensambladas en medio, tratamiento con una solución al 3% de cadenas peptídicas sin ensamblar combinadas con sangre en una relación 1:1, H) tratamiento con una combinación de COLLAGRAFT™ y sangre, I) tratamiento con una solución al 3% de cadenas peptídicas ensambladas combinadas con fosfato tricálcico en una relación de aproximadamente 1:1 (volumen de solución/peso de TCP), J) tratamiento con una combinación de fosfato tricálcico y sangre (1:1), y K) tratamiento con una solución al 1% de cadenas peptídicas ensambladas en medio.

Descripción detallada

Los péptidos pueden prepararse proporcionando aminoácidos que incluyen un grupo en la cadena lateral que está unido a un grupo protector, ensamblando aminoácidos en un péptido anfifílico, y eliminando el grupo protector haciendo reaccionar el péptido con una sal de acetato en ausencia de ácido trifluoroacético o cualquiera de sus sales.

Péptidos autoensamblables

Se hace referencia a los indicados en las Patentes de Estados Unidos N.° 5.670.483 y 5.955.343, y la Solicitud de Patente de Estados Unidos N.° 09/778.200. Estas cadenas peptídicas consisten en aminoácidos hidrófilos e hidrófobos alternos que son capaces de autoensamblarse para formar una estructura macroscópica de lámina beta extremadamente estable en presencia de electrolitos, tal como cationes monovalentes. Las cadenas peptídicas son complementarias y estructuralmente compatibles. Las cadenas laterales de las cadenas peptídicas en la estructura se dividen en dos caras, una cara polar con cadenas laterales iónicas cargadas y una cara no polar con alaninas u otros grupos hidrófobos. Estas cadenas laterales iónicas son autocomplementarias entre sí, ya que los residuos de aminoácidos cargados positivamente y cargados negativamente pueden formar pares iónicos complementarios. Por lo tanto, estas cadenas peptídicas se denominan péptidos autocomplementarios iónicos o péptidos de autoensamblaje tipo I. Si los residuos iónicos se alternan con un residuo cargado positivamente y uno cargado negativamente (-+-+-+-+), las cadenas peptídicas se describen como "módulo I"; si los residuos iónicos se alternan con dos residuos cargados positivamente y dos cargados negativamente (--++—++), las cadenas peptídicas se describen como "módulo II". Las secuencias peptídicas ejemplares incluyen las enumeradas en la Tabla 1. Pueden usarse tanto los D-aminoácidos como los L-aminoácidos para producir cadenas peptídicas. Se pueden mezclar en la misma cadena, o se pueden preparar composiciones peptídicas con mezclas de cadenas individuales que solo incluyen D-aminoácidos y L-aminoácidos.

Tabla 1. Péptidos de autoensamblaje

Nombre Secuencia (n-->c) Módulo RAD164 n-RADARADARADARADA-c I RGDA16-I n-RADARGDARADARGDA-c I RADA8-I n-RADARADA-c I RAD16-11 n-RARADADARARADADA-c II RAD8-II n-RARADADA-c II EAKA164 n-AEAKAEAKAEAKAEAK-c I EAKA8-I n-AEAKAEAK-c I RAEA16-I n-RAEARAEARAEARAEA-c I RAEA8-I n-RAEARAEA-c I KADA164 n-KADAKADAKADAKADA-c I KADA8-I n-KADAKADA-c I KLD12 n-KLDLKLDLKLDL-c

EAH164I n-AEAEAHAHAEAEAHAH-c II EAH8-II n-AEAEAHAH-c II EFK16-II n-FEFEFKFKFEFEFKFK-c II EFK8-II n-FEFKFEFK-c I Nombre Secuencia (n-->c) Módulo KFE12 n-FKFEFKFEFKFE-c

KFE8 n-FKFEFKFE-c

KFE16 n-FKFEFKFEFKFEFKFE-c

KFQ12 n-FKFQFKFQFKFQ-c

KIE12 n-IKIEIKIEIKIE-c

KVE12 n-VKVEVKVEVKVE

ELK16-II n-LELELKLKLELELKLK-c II ELK8-II n-LELELKLK-c II EAK16-II n-AEAEAKAKAEAEAKAK-c II EAK12 n-AEAEAEAEAKAK-c IV/II EAK8-II n-AEAEAKAK-c II KAE16-IV n-KAKAKAKAEAEAEAEA-c IV EAK16-IV n-AEAEAEAEAKAKAKAK-c IV RAD16-IV n-RARARARADADADADA-c IV DAR16-IV n-ADADADADARARARAR-c IV DAR16-IV* n-DADADADARARARARA-c IV DAR324V n-(ADADADADARARARAR)2-c IV EHK16 n-HEHEHKHKHEHEHKHK-c N/A EHK8-I n-HEHEHKFIK-c N/A VE20* n-VEVEVEVEVEVEVEVEVEVE-c N/A RF20* n-RFRFRFRFRFRFRFRFRFRF-c N/A N/A representa no aplicable

* Estos péptidos forman una lámina p cuando se incuban en una solución que contiene NaCI, sin embargo, no se ha observado que se autoensamblan para formar andamiajes macroscópicos.__________________________________

Muchas secuencias de péptidos autocomplementarias de módulo I y II, tales como EAK16, KAE16, RAD16, RAE16 y KAD16, se han analizado previamente (Tabla 1). También se han estudiado las secuencias peptídicas autocomplementarias iónicas de Módulo IV que contienen 16 aminoácidos, tales como EAK16-IV, KAE16-IV, DAR16-IV y RAD16-IV. Si los residuos cargados en estas cadenas peptídicas de autoensamblaje están sustituidos (es decir, las lisinas cargadas positivamente se reemplazan por argininas cargadas positivamente y los glutamatos cargados negativamente se reemplazan por aspartatos cargados negativamente), esencialmente no hay efectos significativos en el proceso de autoensamblaje. Sin embargo, si los residuos cargados positivamente, la lisina y la arganina, se reemplazan por residuos cargados negativamente, aspartato y glutamato, las cadenas peptídicas ya no pueden autoensamblarse para formar andamiajes macroscópicos; sin embargo, todavía pueden formar una estructura de lámina beta en presencia de sal. Otros residuos hidrófilos, tales como la asparagina y la glutamina, que forman enlaces de hidrógeno pueden incorporarse en las cadenas peptídicas en lugar de, o además de, residuos cargados. Si las alaninas en las cadenas peptídicas se cambian a residuos más hidrófobos, tales como leucina, isoleucina, fenilalanina o tirosina, estas cadenas peptídicas tienen una mayor tendencia a autoensamblarse y formar matrices peptídicas con mayor resistencia. Algunos péptidos que tienen composiciones y longitudes similares a las cadenas peptídicas mencionadas anteriormente forman hélices alfa y bobinas aleatorias en lugar de láminas beta y no forman estructuras macroscópicas. Por lo tanto, además de la autocomplementariedad, es probable que otros factores sean importantes para la formación de andamiajes macroscópicos, tal como la longitud de la cadena, el grado de interacción intermolecular, y la capacidad de formar matrices escalonadas.

Se pueden generar otras cadenas peptídicas de autoensamblaje cambiando la secuencia de aminoácidos de cualquier cadena peptídica de autoensamblaje por un único residuo de aminoácido o por múltiples residuos de aminoácidos. Además, la incorporación de ligandos de reconocimiento celular específicos, tales como RGD o RAD, en el andamiaje peptídico puede promover la proliferación de las células encapsuladas. In vivo, estos ligandos también pueden atraer células desde fuera de un andamiaje al andamiaje, donde pueden invadir el andamiaje o interactuar de otro modo con las células encapsuladas. Para aumentar la resistencia mecánica de los andamiajes resultantes, las cisteínas pueden incorporarse en las cadenas peptídicas para permitir la formación de enlaces disulfuro, o los residuos con anillos aromáticos pueden incorporarse y reticularse mediante exposición a luz UV. La semivida in vivo de los andamiajes también puede modularse mediante la incorporación de sitios de escisión de proteasa en el andamiaje, lo que permite que el andamiaje se degrade enzimáticamente. También se pueden hacer combinaciones de cualquiera de las alteraciones anteriores en el mismo andamiaje peptídico.

Las estructuras de nanoescala autoensambladas se pueden formar con diversos grados de rigidez o elasticidad. Si desear quedar ligado por ninguna teoría, la baja elasticidad puede ser un factor importante para permitir que las células migren hacia el andamiaje y se comuniquen entre sí una vez que residan en el andamiaje. Los andamiajes peptídicos descritos en el presente documento tienen típicamente un módulo elástico bajo, en el intervalo de 1-10 kPa según se mide en un reómetro de cono-placa estándar. Dichos valores bajos permiten la deformación del andamiaje como resultado de la contracción celular, y esta deformación puede proporcionar los medios para la comunicación célula-célula. Además, tales módulos permiten que el andamiaje transmita tensiones fisiológicas a las células que migran en el mismo, estimulando a las células para que produzcan tejido que esté más cerca en la microestructura al tejido nativo que en la cicatriz. La rigidez del andamiaje se puede controlar mediante una diversidad de medios que incluyen cambios en la secuencia de péptidos, cambios en la concentración de péptidos y cambios en la longitud del péptido. También se pueden usar otros métodos para aumentar la rigidez, tal como unir una molécula de biotina al extremo amino o carboxi de las cadenas peptídicas o entre los extremos amino y carboxi, que después pueden reticularse.

Las cadenas peptídicas capaces de reticularse se pueden sintetizar usando química estándar de f-moc y purificarse usando cromatografía líquida de alta presión (Tabla 2). La formación de un andamiaje peptídico puede iniciarse mediante la adición de electrolitos como se describe en el presente documento. Los residuos hidrófobos con cadenas laterales aromáticas pueden reticularse por exposición a la radiación UV. La extensión de la reticulación se puede controlar con precisión mediante la duración predeterminada de la exposición a la luz UV y la concentración de la cadena peptídica predeterminada. La extensión de la reticulación se puede determinar mediante dispersión de luz, filtración en gel o microscopía electrónica de barrido utilizando métodos estándar. Además, la extensión de la reticulación también se puede examinar mediante HPLC o análisis de espectrometría de masas del andamiaje después de la digestión con una proteasa, tal como las metaloproteasas de matriz. La resistencia del material del andamiaje se puede determinar antes y después de la reticulación, como se describe en el presente documento.

TABLA 2 n i i r r i l ión

Los sitios de procesamiento de agrecano, tal como los subrayados en la Tabla 3, pueden añadirse opcionalmente al extremo amino o carboxi de los péptidos o entre los extremos amino y carboxi. Asimismo, otros sitios de escisión de metaloproteasas de matriz (MMP), tales como los de las colagenasas, pueden introducirse de la misma manera. Los andamiajes peptídicos formados a partir de estas cadenas peptídicas, solos o en combinación con péptidos capaces de reticularse, pueden exponerse a diversas proteasas durante diversos periodos de tiempo y a diversas concentraciones de proteasas y péptidos. La velocidad de degradación de los andamiajes se puede determinar mediante HPLC, espectrometría de masas o análisis de RMN de las cadenas peptídicas digeridas liberadas en el sobrenadante en diversos puntos de tiempo. Como alternativa, si se usan cadenas peptídicas radiomarcadas para la formación de andamiajes, la cantidad de material radiomarcado liberado en el sobrenadante se puede medir por recuento de centelleo. Para algunas formas de realización, la estructura de la lámina beta de las cadenas peptídicas ensambladas se degrada lo suficientemente rápido como para que no sea necesario incorporar sitios de escisión en las cadenas peptídicas.

TABLA 3 S n i i i n n ii r mi n de agrecano

Si se desea, los andamiajes peptídicos también pueden formarse con una forma o volumen predeterminados. Para formar un andamiaje con una geometría o dimensión deseadas, se añade una solución peptídica acuosa a un molde de fundición preformado, y las cadenas peptídicas se inducen a autoensamblarse en un andamiaje mediante la adición de un electrolito, como se describe en el presente documento. La geometría y las dimensiones resultantes del andamiaje de péptidos macroscópicos se rigen por la concentración y la cantidad de solución peptídica que se aplica, la concentración de electrolito utilizada para inducir el ensamblaje del andamiaje, y las dimensiones del aparato de fundición.

Si se desea, los andamiajes peptídicos se pueden caracterizar utilizando diversos instrumentos biofísicos y ópticos, tales como dicroísmo circular (CD), dispersión dinámica de la luz, transformada de Fourier infrarroja (FTIR), microscopía de fuerza atómica (ATM), microscopía electrónica de barrido (SEM), y microscopia electrónica de transmisión (TEM). Por ejemplo, se pueden usar métodos biofísicos para determinar el grado de estructura secundaria de la lámina beta en el andamiaje peptídico. Además, el tamaño de los filamentos y de poro, el diámetro de la fibra, la longitud, la elasticidad y la fracción de volumen se pueden determinar mediante el análisis cuantitativo de imágenes de microscopía electrónica de barrido y transmisión. Los andamiajes también pueden examinarse utilizando varias técnicas de prueba mecánica estándar para medir el grado de hinchamiento, el efecto del pH y la concentración de electrolitos en la formación de andamiajes, el nivel de hidratación en diversas condiciones, y la resistencia a la tracción.

Producción de péptidos

Las cadenas peptídicas para su uso con la invención pueden producirse usando técnicas bien conocidas por los expertos en la técnica, incluyendo la síntesis en fase de solución y síntesis en fase sólida. Estas técnicas pueden optimizarse para la producción de las cadenas peptídicas descritas en el presente documento a niveles de pureza que proporcionan a la composición resultante propiedades sorprendentes, incluyendo, pero sin limitación, vida útil, velocidad de degradación, solubilidad y características mecánicas.

En un aspecto de la divulgación, las cadenas peptídicas para su uso con la invención se producen usando técnicas de síntesis de péptidos en fase sólida. La síntesis puede realizarse a temperatura ambiente en un recipiente de reactor de vidrio, por ejemplo, con un disco de vidrio poroso grueso en el fondo. El reactor facilita la adición de derivados de aminoácidos, disolventes y reactivos utilizados en la reacción. Un experto en la técnica reconocerá que el tamaño del reactor depende de la cantidad de resina utilizada para la síntesis. El recipiente de reactor puede estar equipado con un agitador mecánico o colocado en un agitador de plataforma para realizar una mezcla eficiente del complejo péptido-resina con la solución de reacción.

Un experto en la técnica estará familiarizado con una diversidad de resinas que pueden usarse para soportar cadenas peptídicas a medida que se sintetizan. Una resina ejemplar para su uso con las técnicas de la invención es la resina de MBHA de amida de Rink, disponible en Glycopep Chemicals, Inc. (Chicago, IL). La resina MBHA es una resina de poliestireno reticulado con divinilbenceno al 1% DVB derivada con 0,4-0,8 mmoles/gramo de

donde Fmoc es N-alfa-(9-fluorenilmetiloxicarbonilo) y Nle es norleucina, que se usa como marcador para determinar el nivel de sustitución en la resina. Si bien el nivel de sustitución del polímero no afecta significativamente a la calidad del producto, afecta significativamente al tiempo y coste de fabricación. Un nivel de sustitución demasiado alto puede dar como resultado tiempos de acoplamiento prolongados, mientras que un nivel de sustitución demasiado bajo aumenta la cantidad de resina requerida para realizar la reacción y el volumen de disolventes requeridos para las etapas de lavado. Las resinas adicionales incluyen, pero sin limitación, resina de clorometilpoliestireno (CMS), resina de 4-hidroxifenoximetilpoliestireno, resina de ^a M^s de amida de Rink (

), y resina de sarcosina dimetil acrilamida (

) todas disponibles en Polymer Laboratories. Estas resinas se pueden adquirir con un aminoácido particular ya unido a la resina.

Cuando las cadenas peptídicas se sintetizan a partir del aminoácido C-terminal, tanto la cadena lateral reactiva como el grupo alfa amino del aminoácido que se añade a la cadena peptídica deben protegerse. Se puede usar un grupo protector lábil tal como Fmoc para bloquear el grupo alfa amino, mientras que se puede usar un grupo protector estable para bloquear cadenas laterales reactivas. En un aspecto de la divulgación, el grupo protector lábil se elimina con piperidina, y el grupo protector estable se elimina con ácido fuerte, como se describe a continuación. Los grupos protectores ejemplares para cadenas laterales de aminoácidos incluyen, pero sin limitación, 2,2,4,6,7-pentametildihidrobenzofurano (Pbf), terc-butoxi (OtBu), tritilo (Trt), terc-butilo (tBu) y Boc (terc-butoxicarbonilo). Un experto en la técnica reconocerá qué grupos protectores son apropiados para los aminoácidos específicos. Los aminoácidos con grupos protectores ya existentes están disponibles comercialmente, por ejemplo, en Advanced ChemTech, Louisville, KY.

Para añadir un aminoácido a una cadena peptídica en crecimiento, el grupo alfa amino en el extremo de la cadena terminada en resina se acila por el siguiente aminoácido activado que se añade a la cadena peptídica. En un aspecto de la divulgación, el aminoácido protegido y hexafluorofosfato de 2-(1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio (HBTU) se disuelven en DMF. Se añade N-metilmorfolina (NMM) a la solución, que después se añade a la resina. En general, los reactivos para la acilación se seleccionan para optimizar las condiciones de reacción y para facilitar la eliminación después del acoplamiento.

La mezcla de HBTU/NMM/resina se deja reaccionar durante un intervalo apropiado, por ejemplo, al menos una hora, después de lo cual se puede determinar el grado de reacción utilizando la prueba TNBS (Hancock, et al., Anal. Biochem., 1976, 71, 260) y/o la prueba de ninhidrina (por ejemplo, reacción de muestra con ninhidrina, aminas identificadas colorimétricamente). Si se detectan grupos amino residuales, la reacción de acoplamiento se puede repetir utilizando la mitad de la cantidad de reactivo requerida para la reacción de acoplamiento inicial. Los aminoácidos alfa sin reaccionar aún presentes después de la repetición de la reacción se pueden cubrir con anhídrido acético para evitar secuencias de deleción en los ciclos siguientes.

Después de añadir cada aminoácido, el grupo protector de Fmoc lábil puede escindirse de la función alfa amino del aminoácido N-terminal en el péptido en crecimiento tratando la resina dos veces con una solución al 20% de piperidina en DMF o una mezcla de DMF con agua. En este aspecto de la divulgación, el grupo protector estable es resistente a la eliminación en estas condiciones y permanece unido al aminoácido.

Después tanto de la reacción de acoplamiento como de la reacción de desprotección, la resina se puede lavar con DMF para eliminar el exceso de reactivo. La DMF es un excelente disolvente para los reactivos utilizados en la etapa de acoplamiento y también tiene excelentes propiedades de hinchamiento. También se pueden usar disolventes alternativos para producir cadenas peptídicas para su uso con la invención. Dichos disolventes deben seleccionarse para minimizar el riesgo de reacciones secundarias mientras se extrae eficientemente el exceso de reactivo de la mezcla de reacción. Los tiempos de enjuague deben ser suficientes para permitir un contacto completo de la resina peptídica con el disolvente y para la extracción de los reactivos. Un experto en la técnica reconocerá que las etapas de lavado pueden repetirse, pero que el lavado repetido aumentará el coste de fabricación.

Después de que se haya añadido el último aminoácido en la secuencia, el extremo N-terminal del péptido se puede proteger con anhídrido acético y la cadena completa se puede desprender de la resina. Después se escinde cualquier grupo protector de cadena lateral. Esto se puede lograr mediante el tratamiento del complejo péptidoresina con ácido trifluoroacético en presencia de secuestradores, por ejemplo, agua, fenol y/o triisopropilsilano. Los secuestradores atrapan los cationes reactivos durante la escisión y evitan la alquilación de cadenas laterales reactivas.

En un aspecto alternativo de la divulgación, las cadenas peptídicas se sintetizan usando técnicas en fase de solución. La síntesis en fase de solución se basa en la adición gradual de aminoácidos protegidos a la cadena peptídica en crecimiento. Este método es más rápido que los métodos en fase sólida para cadenas peptídicas que tienen una unidad de repetición, tal como RAD16. Por ejemplo, RADA de cuatro mer puede producirse en varios recipientes de reacción. En uno de los recipientes de reacción, el aminoácido C-terminal está desprotegido y el ácido N-terminal está protegido. La adición de los cuatro mer no protegidos C-terminal a un segundo recipiente de reacción duplica la longitud del péptido en una sola etapa de reacción. El proceso se repite para producir un 12-mer. Un experto en la técnica reconocerá que varias combinaciones de cuatro mers entre sí darán como resultado una producción rápida de 16-mer.

Los péptidos completados se pueden purificar usando técnicas de purificación de péptidos estándar, incluyendo filtración en gel y cromatografía líquida de alto rendimiento de intercambio iónico (HPLC). En un aspecto de la divulgación, las cadenas peptídicas se purifican usando HPLC de fase inversa con PLRP-S, un poliestireno reticulado con DVB disponible en Polymer Laboratories, Inc., Amherst, MA. La separación se basa en interacciones hidrófobas entre el péptido y el polímero. La interacción de las cadenas peptídicas con la resina es lo suficientemente específica como para que las cadenas peptídicas de estructuras similares puedan separarse fácilmente utilizando el soporte de resina. En general, la columna se lava con ácido acético acuoso para equilibrarla. El péptido en bruto se carga en la columna y se eluye utilizando un gradiente de ácido acético/agua y acetonitrilo/ácido acético/agua. En una forma de realización, se usan ácido acético al 0,1% y acetonitrilo al 80%, pero un experto en la técnica reconocerá que las proporciones pueden ajustarse para optimizar los tiempos de procesamiento y la separación entre el péptido deseado y diversas impurezas. Asimismo, el gradiente puede ser un cambio por minuto del 0,5%-1,0% (por ejemplo, un aumento en la solución de acetonitrilo), pero puede ajustarse para optimizar la separación entre el producto de reacción y las impurezas. El método de purificación también intercambia acetato por trifluoroacetato, convirtiendo el péptido en la forma de sal de acetato. El producto intercambiado con acetato es más biocompatible que el producto fluorado. Inesperadamente, el uso de acetato de sodio también produce un producto más altamente purificado con menos aductos de eliminación.

A medida que se recogen las fracciones, el contenido de la fracción puede controlarse mediante HPLC analítica en fase inversa eluida con TFA al 0,1% en acetonitrilo acuoso. Cualquier soporte de HPLC de fase inversa que pueda usarse para purificar el producto peptídico también puede usarse para analizar la calidad de las fracciones eluidas. En un aspecto de la divulgación, se puede usar una columna C18 (por ejemplo, utilizando sílice derivada con cadenas C18). Las fracciones de la columna de purificación que cumplen la especificación de pureza deseada pueden combinarse y liofilizarse. Las fracciones con menor pureza pueden procesarse de nuevo. Las fracciones que no se pueden procesar de nuevo para obtener un material de mayor pureza se pueden descartar.

La etapa de purificación separa las cadenas peptídicas que tienen la secuencia deseada de varios tipos de subproductos. El primero es el exceso de reactivos, de los cuales la secuencia peptídica deseada se separa fácilmente porque tiene una estructura química diferente y un peso molecular más alto. El segundo incluye aductos de deleción, cadenas peptídicas similares en secuencia al péptido deseado pero que tienen uno o más aminoácidos faltantes. Se ha encontrado inesperadamente que la eliminación mejorada de los aductos de eliminación aumenta la solubilidad de las cadenas peptídicas deseadas en medios acuosos y cambia diversas propiedades de los andamiajes autoensamblados. En algunas formas de realización, el producto final puede ser al menos el 75%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95%, o al menos el 99% puro.

Preparación de la solución peptídica y sus características

El producto purificado se puede almacenar como un polvo o se puede volver a disolver en una solución acuosa. El producto peptídico es significativamente más soluble en agua que las formulaciones anteriores, y se pueden alcanzar concentraciones superiores al 2% o el 3%. La agitación, por ejemplo, el uso de sonicación o una mesa de agitación, ayuda a que las cadenas peptídicas entren en solución. La concentración de cadenas peptídicas en solución puede variar dependiendo de la aplicación deseada. Las cadenas peptídicas en solución se autoensamblan espontáneamente en andamiajes a través de interacciones electrostáticas. Las cadenas peptídicas autoensambladas forman un hidrogel que permanece dúctil y susceptible de fluir tras la aplicación de un estímulo apropiado.

La solución peptídica puede tener una vida útil de almacenamiento de al menos un año con o sin electrolito agregado (véase a continuación).

La solución peptídica puede esterilizarse por radiación, si se desea. En un aspecto de la descripción, la solución peptídica es estable con respecto a la exposición a radiación gamma a aproximadamente 35 Kgrey. Si es suficiente, se puede usar menos radiación para la esterilización, por ejemplo, aproximadamente 25 Kgrey. Las soluciones peptídicas producidas usando las técnicas descritas en el presente documento son estables con respecto a la exposición a la radiación y no experimentan alteraciones estructurales tras la exposición a la radiación de esterilización. Por supuesto, las soluciones de péptidos también pueden esterilizarse por inyección a través de un filtro de 0,45 micrómetros.

Formación de un andamiaje peptídico autoensamblado y sus propiedades

Las soluciones peptídicas se pueden formar en un andamiaje estable mediante la exposición a una solución salina monovalente. Se añade suficiente electrolito a la solución para iniciar el autoensamblaje de los péptidos en una estructura macroscópica de lámina beta. En cierto aspecto de la divulgación, la concentración del electrolito añadido es de al menos 5, 10, 20 o 50 mM. También se pueden usar concentraciones más pequeñas, por ejemplo, de 0,1 a 1 mm, o concentraciones más grandes. La elección de la concentración depende parcialmente de la fuerza iónica deseada del gel peptídico y también afecta a la velocidad de gelificación. Los electrolitos adecuados incluyen, pero sin limitación, Li+, Na+, K+, y Cs+. El electrolito hace que las cadenas peptídicas se autoensamblen en un andamiaje que sea estable con respecto a la agitación mecánica.

A bajas concentraciones, la adición de electrolito a la solución peptídica da como resultado un gel de tipo agar que presenta un flujo de líquido limitado y una alta flexibilidad. El comportamiento mecánico de los hidrogeles de baja concentración peptídica es similar al de la gelatina. Si bien es altamente flexible, el hidrogel también es quebradizo. En lugar de deformarse plásticamente, el gel se rompe en trozos separados o se fractura. Se ha encontrado que estas propiedades no se duplican en concentraciones más altas. Más bien, los geles de mayor concentración permanecen dúctiles y coherentes y son susceptibles de deformación plástica. Con una consistencia similar a la del ácido hialurónico de cadena larga, pueden inyectarse a través de una aguja de calibre 30.

En concentraciones más altas, las soluciones de cadenas peptídicas se comportan como fluidos no newtonianos. Además, la solución se vuelve más viscosa con el tiempo. Por ejemplo, una solución al 3% mostró un límite elástico de 20-30 Pa y una viscosidad inferior a 40 cP aproximadamente una hora después de la mezcla, aumentando el límite elástico a 50-65 Pa después de 5-6 horas. Después de dos semanas, el límite elástico aumentó a 100-160 Pa, y la viscosidad aumentó a menos de 200 cP.

El gel dúctil se comporta como un material moldeado por inyección. Los hidrogeles peptídicos que pasan a través de una aguja llenan el espacio deseado con un único bolo coherente en lugar de una masa enredada y enroscada. Es decir, el material se ensambla tanto en la escala de las cadenas peptídicas individuales como en una macroescala como un gel. Proporciona tanto un material inyectable para facilitar la administración como una red fibrosa continua que facilita el crecimiento y la proliferación celular.

También se ha descubierto que los geles peptídicos de alta pureza (por ejemplo, con respecto a la composición de la cadena) presentan una degradación acelerada en comparación con los geles de pureza más baja. De hecho, los geles producidos usando las técnicas de la invención presentan una degradación más rápida in vivo que el colágeno o el ácido hialurónico. Por ejemplo, un bolo de 20011.1 del 1% de RAD16 producido usando las técnicas de la invención e implantado in vivo se degradó y se excretó en 28 días. Más del 90% de un bolo de 70 pl de RAD16 al 1% se degradó y se excretó en 14 días. Los geles de mayor concentración presentan tiempos de degradación más largos.

En cierto aspecto de la divulgación, los geles de alta pureza también son estables a pH fisiológico. Los geles se pueden llevar a pH fisiológico al equilibrarlos con una solución tampón. Por ejemplo, una capa de solución tamponada que tiene el pH deseado puede cargarse por encima o por debajo de una capa de un gel peptídico producido usando las técnicas de la invención. Este enfoque se ha utilizado, por ejemplo, para equilibrar andamiajes peptídicos con una solución salina tamponada con fosfato o medio de cultivo tisular antes del uso de los andamiajes para el cultivo de células. Después de que el gel y la solución tampón se hayan equilibrado durante cierto tiempo, el pH del gel se prueba fácilmente retirando la solución y colocando una tira de papel de pH en el gel. Un experto en la técnica reconocerá que puede ser necesario repetir el proceso varias veces para llevar el gel al pH deseado. Como alternativa, o, además, se puede usar un exceso de tampón. También se puede usar un balancín para acelerar el equilibrio del tampón y el gel. Los geles a pH fisiológico pueden conservar las propiedades físicas que tenían a un pH más bajo. Todavía pueden ser inyectados o combinados con células. Por supuesto, tales geles son mucho más compatibles con el tejido fisiológico y las células a pH fisiológico que a pH 2-3.

De acuerdo con cierto aspecto de la divulgación, es deseable modificar el pH de una solución peptídica, por ejemplo, para elevar el pH a un pH fisiológico de ~7 - 8,5 antes de introducir la solución peptídica en un sujeto (véase a continuación) o antes de encapsular las células. Las soluciones peptídicas modificadas con pH también se pueden usar para otros fines, por ejemplo, para cultivo de tejidos o para encapsular agentes biológicamente activos. Puede ser deseable lograr la modificación del pH de una manera relativamente rápida, por ejemplo, sin la necesidad de un equilibrio prolongado con solución tampón y/o múltiples cambios de la solución tampón.

Se probaron varios tampones diferentes para evaluar su capacidad para elevar el pH de una solución acuosa al 1% de péptido. Se usó el péptido RAD16-I para este estudio, y se probaron los siguientes tampones:

1. acetato de amonio (preparado en laboratorio)

2. citrato de sodio (preparado en laboratorio)

3. acetato de sodio (preparado en laboratorio)

4. bicarbonato de sodio (grado clínico fabricado por Abbott, Inc.),

5. HEPES (grado de investigación fabricado por Stem Cell Technologies, Inc.)

6. Tris-HCl (preparado en laboratorio)

7. Trometamina, también denominada THAM (grado clínico fabricado por Abbott, Inc.).

8. Solución salina tamponada con fosfato sin Ca o Mg (Gibco-BRL)

Todos estos tampones pudieron aumentar el pH de la solución peptídica sin destruir la capacidad de las cadenas peptídicas para ensamblarse en un andamiaje, ya sea antes o después de la adición de un electrolito. Los andamiajes ensamblados también se pueden equilibrar con un tampón para elevar el pH. Las Tablas 4 y 5 resumen los resultados obtenidos en estos experimentos. En las tablas, "Pre-sal" se refiere a los experimentos en los que se añadió un electrolito a la composición peptídica antes de la adición de la solución tampón, y "Post-sal" se refiere a los experimentos en los que se añadió un electrolito a la composición peptídica tras la adición del tampón. Las columnas "Pre-sal" y "Post-sal" indican la concentración final del tampón y el pH de la solución peptídica. Los tampones enumerados permiten que el gel peptídico alcance pH entre 4,5 y 8,5. Los geles peptídicos resultantes no fueron estables con respecto a la agitación mecánica. Por ejemplo, cuando el tampón se agitó en un gel ensamblado, la estructura peptídica se desensambló y se volvió líquida y acuosa. Se observó un fenómeno similar cuando el electrolito se agitó en soluciones no tamponadas. Dichos valores de pH son compatibles con los usos in vivo de las soluciones peptídicas e hidrogeles, ya que son diversos entre los valores de pH, por ejemplo, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, etc.

En ambos conjuntos de experimentos, el pH de las soluciones peptídicas y los geles se determinó poniendo en contacto la solución peptídica o el andamiaje peptídico ensamblado con papel de pH que se había calibrado frente a soluciones estándar de calibración de pH. La solución peptídica se eliminó de un recipiente que la contenía y se lanza a chorro sobre papel de pH con una pipeta o, en el caso de geles peptídicos que permanecieron ensamblados en presencia de la solución tampón, la solución tampón se retiró primero y el gel peptídico se eliminó después del recipiente usando una espátula y se puso en contacto con el papel de pH.

Se observa que los datos experimentales indicados en el presente documento se proporcionan con fines ejemplares y no pretenden limitar la invención.

T l 4: R l -T m n m z l n n m i i n í i l 1 :

T l : R l - r i i n m n r l r ri r l m i i n í i :

Uso de andamiajes peptídicos autoensamblados como rellenos de tejido

Los geles peptídicos descritos en el presente documento proporcionan una matriz a la que pueden adherirse las células y sobre la cual pueden migrar al interior de un sitio de herida. Los andamiajes peptídicos descritos en el presente documento comprenden una red de nanofibras con espacios intermedios en lugar de una matriz sólida. Tal estructura puede permitir la infiltración celular y la interacción célula-célula de una manera que se asemeja más a la configuración de las células dentro del cuerpo que lo permitido por otras técnicas y materiales de cultivo. En lugar de simplemente curarse de los bordes, toda el área de la herida puede regenerarse simultáneamente a medida que las células migran hacia el centro del andamiaje.

Se pueden inyectar directamente geles de alta pureza en los sitios de la herida para facilitar la cicatrización de la herida. Por ejemplo, pueden inyectarse en sitios de biopsia o sitios de herida creados por la extirpación de un tumor. Los geles también pueden usarse para facilitar la cicatrización en heridas crónicas, tales como lesiones cutáneas y úlceras diabéticas. El uso de hidrogeles peptídicos para facilitar la cicatrización en el tejido nervioso se analiza en la Solicitud de Estados Unidos N.° 10/968.790. Por supuesto, los geles peptídicos se pueden usar para promover la regeneración tisular en sitios de herida no creados quirúrgicamente. Debido a que los geles pueden inyectarse, no hay necesidad de agrandar el sitio de herida más allá de lo que originalmente se necesitaba para extirpar el tejido enfermo. Además, el gel no necesita ser moldeado para adaptarse al sitio de herida. Más bien, simplemente llena el sitio de herida de la manera en que un líquido llena un recipiente en el que se vierte. Debido a que el gel inyectado forma un bolo coherente en lugar de hebras o hilos individuales, penetra fácilmente en los rincones y grietas de los bordes de una herida irregular.

Los geles peptídicos se pueden usar como agentes de carga. Por ejemplo, se pueden inyectar geles o soluciones de péptidos debajo de la piel para rellenar las depresiones tisulares resultado de las cicatrices. También se pueden usar en lugar de inyecciones de colágeno o ácido hialurónico para rellenar la piel flácida y rellenar las arrugas. Los hoyuelos grandes también pueden ser el resultado de grandes heridas subcutáneas, por ejemplo, lesiones graves en el cráneo o la mandíbula. Los geles peptídicos se pueden usar para rellenar dichos hoyuelos, se desee o no tener la remodelación del gel en tejido natural o una cápsula de tejido fibroso. Por ejemplo, los geles peptídicos se pueden usar para un aumento mamario. No es necesario que el gel sea remodelado en el tejido mamario. Como se describe en el presente documento, los geles se pueden inyectar por vía subcutánea para hacer que la piel se estire. Por ejemplo, cuando se necesita un colgajo de piel para la cirugía, la piel se puede producir de forma autóloga inyectando un bolo de gel debajo de la piel cerca del sitio de la cirugía o en otro lugar del cuerpo. La presión del bolo de gel estira la piel existente. Para aliviar la presión, el cuerpo produce más piel en el área del bolo, al igual que el cuerpo produce piel nueva para adaptarse a un embarazo. Se puede añadir gel adicional con el tiempo para aumentar el tamaño del bolo.

Los tejidos internos también pueden aumentarse con geles peptídicos. Por ejemplo, se pueden inyectar geles en la uretra para prevenir el reflujo o corregir la incontinencia. En una solicitud relacionada, los geles descritos en el presente documento se pueden usar para la embolización. Por ejemplo, se pueden inyectar geles en vasos sanguíneos alrededor de un tumor o vasos que se han cortado durante la cirugía para detener el flujo de sangre. El uso de geles peptídicos como agentes hemostáticos se analiza en la Solicitud Provisional de Estados Unidos N.° 60/674.612. Como alternativa, o además, se pueden inyectar geles entre los tejidos, especialmente después de la cirugía, para prevenir la adhesión. Los geles inyectados en heridas abiertas pueden ayudar a prevenir la adhesión de los apósitos a los tejidos subyacentes. Como alternativa, los geles pueden inyectarse bajo el periostio abdominal para prevenir la formación de adherencias después de la cirugía abdominal.

Los geles también se pueden inyectar en el músculo cardíaco para estimular la producción muscular en las paredes cardíacas finas, como se analiza en la Publicación de Patente N.° 20040242469. Sin quedar limitado por una teoría particular, se cree que el gel peptídico inyectado en ciertos sitios de tejido crea una cavidad permisiva para el crecimiento celular y el desarrollo de tejidos. El pH del gel se puede ajustar para promover aún más el crecimiento celular y la producción de matriz extracelular, o se pueden añadir factores de crecimiento al gel peptídico para promover el comportamiento celular específico.

Las técnicas descritas en el presente documento también pueden usarse para curar defectos ortopédicos. Por ejemplo, los geles producidos utilizando las técnicas descritas en el presente documento pueden disponerse alrededor de implantes dentales para cerrar cualquier hueco entre el implante y el tejido circundante y promover el crecimiento interno en los implantes. Los geles se pueden inyectar en los defectos del cartílago o defectos osteocondrales para evitar la formación de cicatrices. Los geles también se pueden usar para recubrir las superficies internas o rellenar los poros en los andamiajes cerámicos. Por ejemplo, un bloque tridimensional de fosfato de calcio o hidroxiapatita puede infundirse con una solución peptídica antes o después de la gelificación. La infusión puede ser asistida presionando la solución peptídica o dibujando un vacío para promover la infiltración. Como alternativa, o, además, las partículas cerámicas, especialmente los materiales de fosfato de calcio cristalinos, semicristalinos o amorfos, pueden combinarse con una solución peptídica para formar una composición inyectable. La Figura 2 muestra fotomicrografías de defectos del hueso calvarial rellenos con soluciones al 1% y al 3% tamponadas con fosfato (PBS) de cadenas peptídicas producidas como se describe en el presente documento. Ambas concentraciones peptídicas facilitaron la curación ósea superior a COLLAGRAFT™, un producto de colágeno/fosfato tricálcico, o COLLAPLUG™, un producto de colágeno absorbible. La solución peptídica facilitó el desarrollo de tejido óseo, con pocos o ningún hueco en el sitio del defecto, mientras que los defectos rellenos con COLLAGRAFT™ desarrollaron tejido cicatricial fibroso, al igual que un defecto de control no tratado. Se lograron mejores resultados con concentraciones más altas, combinaciones del gel peptídico con fosfato tricálcico, y el ensamblaje del gel usando un electrólito. El control no tratado mostró muy poca cicatrización y hueso nuevo mínimo (Figura 2B). La solución de cadena peptídica no ensamblada al 3% dio como resultado un hueco de aproximadamente la mitad del tamaño del control vacío, con más osteoide, buena vascularización y sin reacción inflamatoria (Figura 2C). El tratamiento con Collaplug dio como resultado islas discontinuas de hueso y formación de cicatriz fibrosa (Figura 2D).

El tratamiento con una solución al 3% de cadena peptídica ensamblada en NaCI dio como resultado un hueso continuo y más grueso (Figura 2E), mientras que el tratamiento con la misma solución ensamblada en medio dio como resultado un hueso discontinuo y la formación de tejido fibroso (Figura 2F). Cuando se empleó una solución al 3% sin ensamblar combinada con sangre, el sitio del defecto era detectable pero mucho más pequeño que el defecto original (Figura 2G). La combinación de Collagraft y sangre dio como resultado el desarrollo de tejido fibroso y un hueso muy delgado. El implante se reabsorbió muy lentamente (Figura 2H). Una solución al 3% de cadenas peptídicas ensambladas en medio y combinadas con fosfato tricálcico facilitaron la curación continua y completa del sitio del defecto (Figura 2I). Una mezcla 1:1 de TCP y sangre proporcionó curación discontinua; los fragmentos estaban rodeados de osteoblastos, pero se reabsorbieron lentamente (Figura 2J). Una solución al 1% de cadenas peptídicas ensambladas en medio era líquida y no era ideal para la implantación o combinación con otros materiales; sin embargo, facilitó el desarrollo de hueso continuo en el sitio del defecto, aunque el hueso no era tan grueso como después del tratamiento con soluciones de mayor concentración (Figura 2K).

Los geles descritos en el presente documento también encuentran utilidad en aplicaciones oftálmicas. Por ejemplo, los geles se pueden usar para la reparación a corto o largo plazo del desprendimiento de retina. El gel se inyecta en el globo ocular, donde la presión adicional presiona la retina contra la pared del ojo. Debido a que el gel es transparente, los láseres todavía se pueden usar para fijar de forma permanente la retina en su lugar. En las técnicas terapéuticas de la técnica anterior, los pacientes a menudo tienen que mantener sus cabezas en posiciones incómodas para retener una burbuja de aire en su lugar contra la retina. Los geles descritos en el presente documento ejercen una presión hidrostática constante. Como resultado, se espera que, en las aplicaciones en las que las terapias de la técnica anterior requieran que una burbuja de aire se disponga contra un punto particular en la retina, reemplazar la burbuja de aire con un gel incompresible puede aliviar al menos parte de la dificultad de convalecencia después de la cirugía retiniana. Como alternativa, o además, los geles peptídicos descritos en el presente documento pueden usarse para procedimientos de pandeo escleral. El gel está dispuesto contra la superficie externa del ojo para empujar la esclerótica hacia la mitad del ojo.

En cualquiera de las aplicaciones descritas anteriormente, las soluciones peptídicas se pueden inyectar antes de la gelificación. De hecho, las soluciones de péptidos se pueden inyectar antes de la gelificación en cualquier aplicación en la que los iones puedan migrar a la solución de péptidos desde el tejido circundante y hacer que se gelifique. Por ejemplo, cuando se requiere una aguja de calibre largo o estrecho, o cuando es ventajoso para el gel infiltrar tejido denso en los bordes de un sitio de herida, la inyección de pre-gelificación proporciona un material más fluido que generará menos presión de retorno durante la inyección y puede penetrar en tejidos fibrosos densos y entre las fibrillas óseas mineralizadas. En lugar de fluir alejándose del lado de la herida, el fluido experimenta cierto autoensamblaje incluso antes de la exposición a un electrolito. Se ha observado un autoensamblaje espontáneo de cadenas peptídicas en soluciones con concentraciones de cadenas peptídicas de hasta el 5%. Esto retiene el material en su lugar sin la necesidad de una cubierta o un colgajo de tejido. Por supuesto, cuando la fuerza iónica del fluido en el sitio de inyección es insuficiente, la solución peptídica puede inyectarse después de la gelificación o puede ir seguida de una solución de electrólito.

Opcionalmente, pueden añadirse a los geles peptídicos uno o más agentes biológicamente activos, por ejemplo, compuestos terapéuticamente activos o quimioatrayentes. Los ejemplos de dichos compuestos incluyen moléculas orgánicas sintéticas, moléculas orgánicas de origen natural, moléculas de ácido nucleico, proteínas biosintéticas tales como quimiocinas, y proteínas de origen natural modificadas. Los factores de crecimiento también se prevén para su uso en esta forma de realización de la invención, en solitario o en combinación con otros agentes biológicamente activos. Los factores de crecimiento ejemplares incluyen, pero sin limitación, citocinas, factor de crecimiento epidérmico, factor de crecimiento nervioso, factor de crecimiento transformante alfa y beta, factor de crecimiento derivado de plaquetas, factor de crecimiento de tipo insulina, factor de crecimiento endotelial vascular, factor de crecimiento hematopoyético, factor de crecimiento de unión a heparina, factor de crecimiento de fibroblastos ácidos, factor de crecimiento de fibroblastos básicos, factor de crecimiento de hepatocitos, factor neurotrófico derivado del cerebro, factor de crecimiento de queratinocitos, proteína morfogenética ósea, o un factor de crecimiento derivado del cartílago.

Por ejemplo, también pueden añadirse agentes biológicamente activos a los geles para reclutar células en un sitio de herida o para promover la producción de matriz extracelular o el desarrollo de la vascularización. Los geles también pueden incluir compuestos seleccionados para reducir la inflamación después de la implantación o para controlar el dolor. Debido a que los geles descritos en el presente documento se degradan con relativa rapidez, se pueden añadir analgésicos, por ejemplo, sin temor a que los analgésicos se administren continuamente en el sitio de herida durante meses. Además, los analgésicos potentes pueden administrarse localmente en el sitio de herida sin tener que administrarlos sistemáticamente. La administración sistémica deja a los pacientes letárgicos, y la administración a largo plazo de opiáceos aumenta el riesgo de dependencia futura a los fármacos. La administración local deja a los pacientes en alerta y puede continuar durante periodos de tiempo mucho más prolongados.

Debido a que el gel es inyectable, se puede usar para la administración repetida y localizada del fármaco. Por ejemplo, se puede usar para administrar medicamentos contra el cáncer a un paciente para una terapia a largo plazo. Las técnicas tradicionales de quimioterapia distribuyen fármacos tóxicos en todo el cuerpo del paciente. Las técnicas de la invención pueden usarse para administrar agentes quimioterapéuticos a un sitio específico y liberarlos rápidamente o durante un periodo de días o semanas. En lugar de la administración sistémica repetida, los geles que contienen el agente deseado pueden administrarse periódicamente a un sitio deseado. Como alternativa, o adicionalmente, los agentes anticancerosos pueden administrarse localmente a un sitio del cual se acaba de extirpar un tumor. Los geles peptídicos se pueden usar como depósitos de fármacos para almacenar fármacos y liberarlos durante largos periodos de tiempo. Incluso los productos biológicos, tales como las proteínas, están estabilizados por el andamiaje peptídico y pueden liberarse durante un periodo de días, semanas o meses sin perder su potencia. Los geles peptídicos pueden producirse con agentes biológicamente activos encapsulados y almacenarse durante largos periodos de tiempo. Es decir, no es necesario almacenar el agente añadido y el péptido por separado y mezclarlos antes de la administración. Cuando el propio agente es iónico o se almacena comúnmente en medios iónicos, la adición del agente biológicamente activo a una solución peptídica hará que la solución se gelifique, atrapando al agente. Como alternativa, el agente puede combinarse con una solución iónica y añadirse a una solución peptídica. Se ha descubierto que los anticuerpos añadidos a una solución peptídica no gelificada gelifican la solución peptídica y también permanecen estables, sin difundirse fuera del gel, durante al menos nueve semanas. La vida útil prolongada de una mezcla gel-fármaco aumenta la comodidad para el proveedor de atención médica y reduce el riesgo de contaminación e infección al mezclar los materiales o transferir material de un vial a otro. En algunos casos, es posible enseñar a los pacientes a inyectarse. Cuando se indica la administración repetida durante un periodo de tiempo prolongado, la autoadministración puede ayudar al paciente a reducir las visitas hospitalarias. En una posibilidad alternativa, la solución peptídica y el agente añadido se combinan sin electrolito añadido. Después de la inyección, los iones migran hacia la solución desde el tejido circundante para gelificar la solución peptídica y encapsular el agente.

Como también se describe en el presente documento, los agentes biológicamente activos pueden unirse directamente a las cadenas peptídicas. Por ejemplo, dichos agentes pueden unirse a los extremos de las cadenas peptídicas durante la síntesis de péptidos. Como alternativa, o además, pueden estar ligados a través de sitios de procesamiento de agrecano, tales como los descritos en relación con la Tabla 3. Si bien hay agentes que son lo suficientemente grandes para interferir con el autoensamblaje de las cadenas peptídicas, estos no son necesariamente inadecuados para su uso con las composiciones de la invención. Más bien, el agente simplemente formará una protuberancia en la estructura de la lámina beta de las cadenas peptídicas ensambladas.

La concentración o composición de los materiales que se combinan con los geles descritos en el presente documento puede variar. Por ejemplo, se puede producir una cápsula de gel que contiene una molécula particular a una concentración dada. Esa cápsula puede estar encapsulada dentro de una cápsula más grande o en una matriz que contiene varias cápsulas similares. La cápsula o matriz más grande puede contener una molécula diferente, por ejemplo, un agente biológicamente activo adicional, o una concentración diferente del mismo material.

Las células también pueden encapsularse dentro de los andamiajes, como se describe, por ejemplo, en las solicitudes pendientes junto con la presente U.S.S.N. 09/778.200, titulada "Peptide Scaffold Encapsulation of Tissue Cells and Uses Thereof", presentada el 6 de febrero de 2001, y en U.S.S.N. 10/877068, titulada "Self-Assembling Peptides Incorporating Modifications", presentada el 25 de junio de 2004.

Como también se describe en el presente documento, el producto peptídico purificado se puede proporcionar como parte de un kit. El kit puede incluir una composición peptídica purificada en forma seca o en solución, y uno o más de un electrolito, un tampón, un dispositivo de administración, un recipiente adecuado para mezclar la composición peptídica con uno o más agentes adicionales, instrucciones para preparar la composición peptídica para su uso, instrucciones para mezclar la composición peptídica con otros agentes, e instrucciones para introducir la composición peptídica en un sujeto. El dispositivo de administración puede ser, por ejemplo, un catéter, una aguja, una jeringa o una combinación de cualquiera de estos. Cuando los kits están proporcionados con una solución acuosa de cadenas peptídicas, la solución puede tener una vida útil de almacenamiento de al menos nueve semanas en condiciones predeterminadas y puede incluir un electrolito.

Dichos kits pueden administrar un agente biológicamente activo además de la composición peptídica purificada. El

Claims (8)

REIVINDICACIONES

1. Una composición que comprende una solución acuosa de al menos el 2% y hasta el 5% en peso de cadenas peptídicas anfifílicas, en la que las cadenas peptídicas son cada una n-RADARADARADARADA-c (RAD16-I), para su uso en un método para facilitar la hemostasia por inyección directa en un sitio de herida antes de la gelificación donde los iones migran a la solución peptídica del tejido circundante y hacen que forme un gel hemostático.

2. La composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en la que dicho método para facilitar la hemostasia comprende detener el flujo de sangre en los vasos sanguíneos que se han cortado durante la cirugía.

3. La composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 2, en la que el flujo de sangre se detiene por embolización.

4. La composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en la que dicha composición infiltra tejido denso en los bordes del sitio de herida donde los iones migran a la solución peptídica del tejido circundante y hacen que forme un gel hemostático.

5. La composición para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la concentración de las cadenas peptídicas en la solución acuosa es superior al 2% en peso.

6. La composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 5, en la que la concentración de las cadenas peptídicas en la solución acuosa es de al menos aproximadamente el 3% en peso.

7. La composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 5, en la que la concentración de las cadenas peptídicas en la solución acuosa es de al menos aproximadamente el 4% en peso.

8. La composición para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la composición es al menos el 75%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95% o al menos el 99% pura.