ES2550705T3 - Proteínas quiméricas hipoalergénicas pertenecientes a la familia de transferencia de lípidos de Parietaria judaica para usar en el tratamiento de alergias - Google Patents
Proteínas quiméricas hipoalergénicas pertenecientes a la familia de transferencia de lípidos de Parietaria judaica para usar en el tratamiento de alergias Download PDFInfo
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Abstract
Una proteína quimérica que comprende secuencias de aminoácidos derivadas de las secuencias que corresponden a los principales alergenos del polen de Parietaria judaica conocidos como Par j 1 y Par j 2, la secuencia de aminoácidos de la proteína quimérica carece de uno o más epítopos para la unión a anticuerpos IgE correspondientes a las secuencias de la cual se deriva, y en donde la proteína no tiene una reducción en la inmunogenicidad, caracterizada porque la proteína comprende la secuencia de aminoácido de la sec. con núm. de ident.: 4.
Description
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E07734344
21-10-2015
La Figura 11 muestra la inmunodetección con anticuerpos IgE de una mezcla de sueros de pacientes alérgicos a P. judaica que comprende: nPar j 1-nPar j 2 (carril 1), rPar j 1 (carril 2), rPar j 2 (carril 3), Q1 (carril 4), Q2 (carril 5), Q3 (carril 6).
La Figura 12 muestra una unión de anticuerpos IgE a Q1, Q2 y Q3 usando 15 sueros de pacientes alérgicos a P. judaica (dilución 1/10). Los valores de tres experimentos se muestran con sus desviaciones.
La Figura 13 muestra un resultado de la prueba ELISA de inhibición usando extracto de P. judaica en la fase sólida y nPar j 1-Par j 2, Q1,, Q2, y Q3 como inhibidores usando una mezcla de sueros de pacientes alérgicos a P. judaica. Cada valor corresponde a la media de tres experimentos con una desviación estándar de menos de 10 %.
La Figura 14 muestra el resultado de las pruebas cutáneas llevadas a cabo con extracto de P. judaica, nPar j 1-Par j 2 y Q1 (50 µg/ml), y Q3 (250 µg/ml). El valor que se muestra es el área del parche en mm 2.
La Figura 15 muestra la determinación de IgE específica llevada a cabo con extracto de P. judaica, nPar j 1-Par j 2, y Q1 (50 µg/ml), y Q2 y Q3 (250 µg/ml).
La Figura 16 muestra una determinación de la concentración óptima para estudiar la proliferación de linfocitos T en pacientes alérgicos a P.judaica. Indice de Estimulación (IE).
La Figura 17 muestra la proliferación de linfocitos T obtenidos con extracto de P.judaica y 0,5µg/ml de las tres proteínas quiméricas y las formas natural y recombinante de Par j 1 y Par j 2. El valor que se muestra es el del índice de estimulación (%). Sin diferencia significativa (ns).
Descripción detallada
Se proporciona en la presente descripción una proteína quimérica o péptido de baja alergenicidad obtenido por la supresión de cualquier epítopo B o epítopo de unión a IgE o síntesis sin cualquier epítopo B o de unión a IgE. La supresión se aplicará preferentemente a los epítopos B en las posiciones 28 a 53 de Par j 1 y Par j 2.
El término "baja alergenicidad", y variantes similares como se usa en la presente descripción es un término relativo y se relaciona con la capacidad in vivo e in vitro reducida de las proteínas de la invención a estimular una respuesta alérgica cuando se compara con la misma capacidad de los inmunógenos silvestres.
La proteína quimérica comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en la sec. con núm. de ident.: 4 con la máxima preferencia la proteína quimérica consiste de la secuencia de aminoácidos que se muestra en la sec. con núm. de ident.: 4.
En la presente se describen además proteínas quiméricas que comprenden adicionalmente una secuencia homóloga a la secuencia de aminoácidos que se muestra en la sec. con núm. de ident.: 2, 4 o 6. Preferentemente, la secuencia homóloga tiene una homología de al menos 70 %, con mayor preferencia al menos 80 %, aun con mayor preferencia al menos 90 %, con la máxima preferencia 100 %, a la secuencia de aminoácidos que se muestra en la sec. con núm. de ident.: 2, 4 o 6, con la máxima preferencia a la secuencia de aminoácidos se muestra en la sec. con núm. de ident.:4.
En la presente se describen además proteínas quiméricas o péptidos que tienen una secuencia de aminoácidos con al menos 70 %, preferentemente al menos 80 %, con mayor preferencia al menos 90 %, con la máxima preferencia 100 %, de homología a la secuencia de aminoácidos que se muestra en la sec. con núm. de ident.: 2, 4 o 6.
La proteína quimérica puede comprender además una secuencia de péptido que facilita su purificación. Tales péptidos son conocidos comúnmente en la técnica, por ejemplo una cola de polihistidina.
Los fragmentos que constituyen las proteínas quiméricas se pueden sintetizar por una persona entrenada cualificada siguiendo un esquema conocido para la amplificación en la cadena de la polimerasa (PCR). Dichos fragmentos, después que se digieren por las enzimas de restricción apropiadas, se pueden integrar mediante ligación a un vector de expresión. Este vector de expresión (como el vector pQE32 comercial) puede tener la capacidad para fusionar la proteína quimérica con las secuencias que ayudan a la purificación tales como una serie de histidinas posicionadas en el extremo amino terminal. Durante la construcción de las proteínas quiméricas, los diferentes fragmentos de ADN se unen por enlazadores formados por secuencias reconocidas por diferentes enzimas de restricción, y los residuos que no existían en la secuencia original del alergeno natural, por lo tanto, aparecen en la molécula quimérica final. Estos nuevos residuos, lo que no interfieren en la lectura correcta de la proteína, se han marcado en las secuencias en la Figura 2, 5, y 8, y se describen adecuadamente en los ejemplos pertinentes. Del mismo modo, las quimeras tienen 14 residuos en la zona amino-terminal que no están presentes en la secuencia original y corresponderían a la región rica en histidina que permite la purificación rápida por la interacción con metales divalentes unidos a soportes sólidos.
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