ES2402380T3 - Agentes de unión dirigidos que se dirigen a PDGFR-alfa y usos de los mismos - Google Patents

Abstract

Anticuerpo, o fragmento de unión del mismo, que seAnticuerpo, o fragmento de unión del mismo, que se une específicamente a PDGFR-alfa con una Kd infer une específicamente a PDGFR-alfa con una Kd inferior a 10picomolar e inhibe el crecimiento de célulior a 10picomolar e inhibe el crecimiento de células que expresan PDGFR-alfa, que comprende las siguas que expresan PDGFR-alfa, que comprende las siguientes secuencias: (a) la cadena pesada de: (i) laientes secuencias: (a) la cadena pesada de: (i) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, o (ii) secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, o (ii) una secuencia de aminoácidos que tiene una identi una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos el 99% con SEQ ID NO: 10, siempre dad de al menos el 99% con SEQ ID NO: 10, siempre quedicha secuencia de aminoácidos difiera de SEQ Iquedicha secuencia de aminoácidos difiera de SEQ ID NO: 10 en una sustitución conservativa de aminoáD NO: 10 en una sustitución conservativa de aminoácidos, y (b) la cadena ligera de: (i) la secuenciacidos, y (b) la cadena ligera de: (i) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 136, (ii) la secuenc de aminoácidos de SEQ ID NO: 136, (ii) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 136, en la que el ia de aminoácidos de SEQ ID NO: 136, en la que el aminoácido S en la posición está sustituido porT, aminoácido S en la posición está sustituido porT, o (ii) una secuencia de aminoácidos que tiene una o (ii) una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos el 99% con SEQ ID NO: 136, sidentidad de al menos el 99% con SEQ ID NO: 136, siempre quedicha secuencia de aminoácidos difiera diempre quedicha secuencia de aminoácidos difiera de SEQ ID NO: 136 en una sustitución conservativa de SEQ ID NO: 136 en una sustitución conservativa de aminoácidos;en el que una sustitución conservatie aminoácidos;en el que una sustitución conservativa de aminoácidos es una sustitución dentro de unava de aminoácidos es una sustitución dentro de una de las familias deaminoácidos, en el que las fami de las familias deaminoácidos, en el que las familias son: (1) aspartato y glutamato; (2) lisina, alias son: (1) aspartato y glutamato; (2) lisina, arginina e histidina; (3) alanina, valina, leucina,rginina e histidina; (3) alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina y tr isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina y triptófano; y (4) glicina, asparagina, glutamina, ciiptófano; y (4) glicina, asparagina, glutamina, cisteína, serina, treonina y tirosina. steína, serina, treonina y tirosina.

Description

Agentes de unión dirigidos que se dirigen a PDGFR-alfa y usos de los mismos

5 Antecedentes de la invención

Campo de la invención

La presente invención está definida por las reivindicaciones. La invención se refiere en términos generales a agentes de unión dirigidos contra el antígeno diana PDGFR-alfa y a usos de tales agentes. En más detalle, la invención se refiere, entre otros, a anticuerpos monoclonales totalmente humanos tal como se definen en las reivindicaciones que se dirigen a PDGFR-alfa y a usos de estos anticuerpos.

Los anticuerpos son útiles como agentes de diagnóstico y para el tratamiento de enfermedades asociadas con la 15 actividad y/o sobreexpresión de PDGFR-alfa.

Descripción de la técnica relacionada

El factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) es una proteína que regula el crecimiento y la división celulares. Hay cinco isoformas diferentes de PDGF (A, B, C, D y un heterodímero AB) que existen como dímeros y activan la respuesta celular a través de dos receptores diferentes (PDGFR-alfa y PDGFR-beta). Específicamente, los dímeros de PDGF se unen a dos receptores simultáneamente para inducir dimerización del receptor, autofosforilación y señalización intracelular.

25 El factor de crecimiento derivado de plaquetas receptor-alfa (PDGFR-alfa, también conocido como CD140a) es una tirosina cinasa receptora de tipo III caracterizada por un dominio extracelular que tiene cinco dominios similares a IgG, un dominio transmembrana y un dominio intracelular catalítico. PDGFR-alfa puede formar homodímeros o heterodímeros con el PDGFR-beta similar estructuralmente. PDGF-AA activa sólo dímeros de receptor alfa-alfa, PDGF-AB y PDGF-CC activan dímeros de receptor alfa-alfa y/o alfa-beta y PDGF-BB activa las tres combinaciones de dímeros de receptor.

PDGFR-alfa se ha relacionado con la tumorigénesis y se ha implicado en varios cánceres incluyendo cánceres de mama, pulmón, ovarios, próstata, colon y endometrial, así como carcinoma hepatocelular, glioblastoma, melanoma y tumor del estroma gastrointestinal (TEGI)).

35 Varias empresas han desarrollado agentes terapéuticos que seleccionan como diana PDGFR-alfa. Gleevec® (Novartis®) y SUTENT/SU11248 (malato de sunitinib, Pfizer®) son fármacos de moléculas pequeñas que seleccionan como diana PDGFR-alfa así como otras tirosina cinasas receptoras. Además, se han notificado anticuerpos monoclonales que seleccionan como diana PDGFR-alfa. La publicación internacional número WO1992/013867 describe que pueden prepararse anticuerpos monoclonales y/o policlonales de ratón o conejo contra constructos de receptor de PDGF. La publicación internacional número WO 1995/000659 se refiere a un anticuerpo monoclonal, específico para PDGFR-alfa, caracterizado porque se une a PDGFR-alfa y no se une a PDGFR-beta. La solicitud da a conocer dos anticuerpos; caracterizados como que tienen una capacidad de unión que es la mitad de la máxima de 50 pM y 75 pM tal como se mide mediante un ensayo de inmunosorción ligado a

45 enzimas en fase sólida. La publicación internacional número WO2006/138729 da a conocer un anticuerpo monoclonal totalmente humano, denominado 3G3 (ImClone Systems, Inc.), que selecciona como diana PDGFR-alfa. Este anticuerpo tiene una afinidad notificada por PDGFR-alfa soluble de 40 pM tal como se mide en un ensayo de afinidad bivalente; en el que se inmovilizó PDGFR-alfa soluble sobre un chip sensor y se inyectó anticuerpo a diversas concentraciones. Tal como se comenta en el presente documento, en un ensayo bivalente, artefactos experimentales pueden afectar a la afinidad medida. [página 2a adicional]

Un anticuerpo con una afinidad mayor que 40 pM, puede ser deseable ya que tal anticuerpo puede producir una mayor extensión y/o duración de la inhibición de PDGFR-alfa cuando se administra a seres humanos a dosis convencionales. Un anticuerpo con una afinidad mayor que 40 pM puede administrarse a una menor dosis eficaz

55 que un anticuerpo con una menor afinidad, o puede administrarse en intervalos de dosificación más largos en comparación con un intervalo de dosificación convencional para un anticuerpo con una menor afinidad. Loizos et al (2005), Mol Cancer Ther, 4(3):369-79 describen la generación de un anticuerpo monoclonal neutralizante contra PDGFR-alfa humano, que no presentó reacción cruzada con la forma beta del receptor. Este anticuerpo totalmente humano, denominado 3G3, tiene una Kd de 40 pM y bloquea que ligandos tanto de PDGF-AA como de PDGF-BB se unan a PDGFR-alfa.

La presente invención está definida por las reivindicaciones.

Sumario de la invención

65 En más detalle, la presente invención se refiere a un anticuerpo, o fragmento de unión del mismo, que se une específicamente a PDGFR-alfa con una Kd inferior a 10 picomolar e inhibe el crecimiento de células que expresan PDGFR-alfa, que comprende las siguientes secuencias: (a) la cadena pesada de (i) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, o (ii) una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos el 99% con SEQ ID NO: 10, siempre que dicha secuencia de aminoácidos difiera de SEQ ID NO: 10 en una sustitución conservativa de

5 aminoácidos, y (b) la cadena ligera de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 136, la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 136, en la que el aminoácido S en la posición 20 se sustituye por T, o (ii) una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos el 99% con SEQ ID NO: 136, siempre que dicha secuencia de aminoácidos difiera de SEQ ID NO: 136 en una sustitución conservativa de aminoácidos, siendo una sustitución conservativa de aminoácidos una sustitución dentro de una de las familias de aminoácidos, siendo las familias (1) aspartato y glutamato; (2) lisina, arginina e histidina; (3) alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina y triptófano; y (4) glicina, asparagina, glutamina, cisteína, serina, treonina y tirosina.

Según una realización preferida, el anticuerpo, o fragmento de unión del mismo, comprende (a) la cadena pesada tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, y (b) la cadena ligera tiene la secuencia de aminoácidos de

15 SEQ ID NO: 136 o la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 136, en la que el aminoácido S en la posición 20 se sustituye por T.

Según otra realización preferida, el anticuerpo, o fragmento de unión del mismo, de la invención es un anticuerpo monoclonal; un anticuerpo monoclonal totalmente humano; un fragmento de unión de un anticuerpo monoclonal totalmente humano; o un fragmento de unión de un anticuerpo monoclonal totalmente humano seleccionado del grupo que consiste en Fab, Fab’ o F(ab’)2.

En otro aspecto la presente invención se refiere a una molécula de ácido nucleico que codifica para el anticuerpo, o fragmento de unión del mismo, de la invención.

25 Un aspecto adicional de la invención se refiere a un vector que comprende la molécula de ácido nucleico de la invención. También está englobada por la presente invención una célula huésped que comprende el vector de la presente invención.

Según una realización adicional, el anticuerpo, o fragmento de unión del mismo, de la invención se usa en el tratamiento de una enfermedad neoplásica. Según una realización preferida, la enfermedad neoplásica se selecciona del grupo que consiste en: melanoma, cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de pulmón de células no pequeñas, glioma, carcinoma hepatocelular (de hígado), tumor de tiroides, cáncer gástrico (de estómago), cáncer de próstata, cáncer de mama, cáncer de ovarios, cáncer de vejiga, cáncer de pulmón, glioblastoma, cáncer

35 endometrial, cáncer de riñón, cáncer de colon, cáncer de páncreas, carcinoma de esófago, cánceres de cabeza y cuello, mesotelioma, sarcomas, biliar (colangiocarcinoma), adenocarcinoma del intestino delgado, tumores malignos pediátricos, carcinoma epidermoide y tumor del estroma gastrointestinal (TEGI). Según otra realización preferida, la enfermedad neoplásica es cáncer.

Según otra realización, el anticuerpo, o fragmento de unión del mismo, según la invención se usa en el tratamiento de una enfermedad no neoplásica. Según una realización preferida, la enfermedad no neoplásica se selecciona de enfermedades fibróticas o del sistema inmunitario.

También se describen en el presente documento composiciones, que incluyen un anticuerpo de la invención o 45 fragmento de unión del mismo, y un portador farmacéuticamente aceptable.

También se describen en el presente documento métodos de tratamiento eficaz de un animal que padece una enfermedad neoplásica, que incluyen seleccionar un animal que necesita tratamiento para una enfermedad neoplásica, y administrar al animal una dosis terapéuticamente eficaz de un agente de unión dirigido tal como se define por las reivindicaciones que se une específicamente a PDGFR-alfa. El animal puede ser humano. El agente de unión dirigido puede ser un anticuerpo monoclonal totalmente humano.

Las enfermedades neoplásicas que pueden tratarse, incluyen, por ejemplo, cánceres incluyendo, melanoma, cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de pulmón de células no pequeñas, glioma, carcinoma hepatocelular (de

55 hígado), tumor de tiroides, cáncer gástrico (de estómago), cáncer de próstata, cáncer de mama, cáncer de ovarios, cáncer de vejiga, cáncer de pulmón, glioblastoma, cáncer endometrial, cáncer de riñón, cáncer de colon, cáncer de páncreas, carcinoma de esófago, cánceres de cabeza y cuello, mesotelioma, sarcomas, biliar (colargiocarcinoma), adenocarcinoma del intestino delgado, tumores malignos pediátricos, carcinoma epidermoide y tumor del estroma gastrointestinal (TEGI).

La presente invención puede ser adecuada para su uso en el antagonismo de PDGFR-alfa, en pacientes con un tumor que depende solo, o en parte, de un PDGFR-alfa.e

También se describen en el presente documento métodos de inhibición del crecimiento de células tumorales en un

65 animal. Estos métodos incluyen seleccionar un animal que necesita tratamiento para el crecimiento de células tumorales, y administrar al animal una dosis terapéuticamente eficaz de un agente de unión dirigido, en el que dicho agente se une específicamente a PDGFR-alfa. El método puede incluir seleccionar un animal que necesita tratamiento para el crecimiento de células tumorales, y administrar al animal una dosis terapéuticamente eficaz de un anticuerpo monoclonal totalmente humano, en el que dicho anticuerpo se une específicamente a PDGFR-alfa.

5 También se describe en el presente documento el uso de un agente de unión dirigido tal como se define por las reivindicaciones en la preparación de un medicamento para el tratamiento de enfermedades que implican la expresión de PDGFR-alfa en un animal, en el que el agente se une específicamente a PDGFR-alfa.

También se describe en el presente documento que los anticuerpos tal como se definen por las reivindicaciones pueden usarse para la preparación de un medicamento para el tratamiento de enfermedades neoplásicas en un animal, en el que el anticuerpo se une específicamente a PDGFR-alfa.

Se apreciará que las realizaciones de la invención no se limitan a ninguna forma particular de un anticuerpo. Por ejemplo, el anticuerpo anti-PDGFR-alfa, tal como se define por las reivindicaciones puede ser un anticuerpo de

15 longitud completa (por ejemplo, que tiene una región Fc humana intacta) o un fragmento de unión a anticuerpos (por ejemplo, un Fab, Fab’ o F(ab’)2). Además, el anticuerpo puede fabricarse a partir de un hibridoma que secreta el anticuerpo, o a partir de una célula modificada mediante ingeniería genética de manera recombinante que se ha transformado o transfectado con un gen o genes que codifican para el anticuerpo. Además, los anticuerpos pueden ser anticuerpos de un solo dominio tales como dominios VH o VL individuales humanos o de camélidos que se unen a PDGFR-alfa, tales como un fragmento dAb.

También se describen en el presente documento moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican para cualquiera de los anticuerpos tal como se definen por las reivindicaciones, vectores que tienen moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican para dichos anticuerpos anti-PDGFR-alfa o una célula huésped transformada con cualquiera

25 de tales moléculas de ácido nucleico. También se describe en el presente documento un método de producción de un anticuerpo anti-PDGFR-alfa cultivando células huésped en condiciones en las que una molécula de ácido nucleico se expresa para producir el anticuerpo seguido por recuperación del anticuerpo.

También se describe en el presente documento un método de producción de anticuerpos de alta afinidad contra PDGFR-alfa tal como se define por las reivindicaciones inmunizando un mamífero con células que expresan PDGFR-alfa humano, membranas celulares aisladas que contienen PDGFR-alfa humano, PDGFR-alfa humano purificado, o un fragmento del mismo, y/o una o más secuencias ortólogas o fragmentos de las mismas.

PDGFR-alfa se expresa en varios tipos tumorales. Los anticuerpos que neutralizan PDGFR-alfa pueden impedir el

35 crecimiento tumoral inducido por PDGFR-alfa, y otros efectos deseados. También se describe en el presente documento

También se describe en el presente documento un método de diagnóstico de enfermedades o estados en los que un anticuerpo preparado tal como se describe en el presente documento se utiliza para detectar el nivel de PDGFR-alfa en un paciente o muestra de paciente. Se describen además métodos para la identificación de factores de riesgo, diagnósticos de enfermedad y estadificación de enfermedad que implican la identificación de la expresión y/o sobreexpresión de PDGFR-alfa usando anticuerpos anti-PDGFR-alfa. Los métodos pueden comprender administrar a un paciente un conjugado de anticuerpo totalmente humano que se une selectivamente a una proteína PDGFRalfa en una célula. El conjugado de anticuerpo comprende un anticuerpo que se une selectivamente a PDGFR-alfa y

45 un marcador. Los métodos comprenden además observar la presencia del marcador en el paciente. Una cantidad relativamente alta del marcador indicará un riesgo relativamente alto de la enfermedad y una cantidad relativamente baja del marcador indicará un riesgo relativamente bajo de la enfermedad. En una realización, el marcador es una proteína fluorescente verde. También se describen en el presente documento

También se describen en el presente documento métodos para someter a ensayo el nivel de PDGFR-alfa en una muestra de paciente, que comprende poner en contacto un anticuerpo anti-PDGFR-alfa tal como se define por las reivindicaciones con una muestra biológica de un paciente, y detectar el nivel de unión entre dicho anticuerpo y PDGFR-alfa en dicha muestra. La muestra biológica puede ser sangre o suero.

55 También se describe en el presente documento un método para diagnosticar un estado asociado con la expresión de PDGFR-alfa en una célula poniendo en contacto el suero o una célula con un anticuerpo anti-PDGFR-alfa tal como se define por las reivindicaciones, y detectando después de eso la presencia de PDGFR-alfa.

También se describe en el presente documento un kit de ensayo para detectar PDGFR-alfa en tejidos de mamífero, células o líquidos corporales para examinar enfermedades que implican células que expresan PDGFR-alfa. El kit incluye un anticuerpo tal como se define por las reivindicaciones que se une a PDGFR-alfa y medios para indicar la reacción del anticuerpo con PDGFR-alfa, si está presente. Preferiblemente, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. El anticuerpo que se une a PDGFR-alfa puede marcarse. El anticuerpo puede ser un anticuerpo primario no marcado y el kit puede incluir además medios para detectar el anticuerpo primario. Los medios pueden 65 incluir un segundo anticuerpo marcado que es un anticuerpo anti-inmunoglobulina. Preferiblemente, el anticuerpo se marca con un marcador seleccionado del grupo que consiste en un fluorocromo, una enzima, un radionúclido y un

material radiopaco.

También se describen en el presente documento métodos para tratar enfermedades o estados asociados con la expresión de PDGFR-alfa en un paciente, administrando al paciente una cantidad eficaz de un anticuerpo anti

5 PDGFR-alfa tal como se define por las reivindicaciones. El anticuerpo anti-PDGFR-alfa puede administrarse solo, o puede administrarse en combinación con anticuerpos adicionales o fármaco quimioterápico o radioterapia. Por ejemplo, una mezcla monoclonal, oligoclonal o policlonal de anticuerpos PDGFR-alfa que inhiben el crecimiento tumoral puede administrarse en combinación con un fármaco que ha mostrado que inhibe la proliferación de células tumorales directamente. El método puede realizarse in vivo y el paciente es preferiblemente un paciente humano.

Los anticuerpos anti-PDGFR-alfa tal como se definen por las reivindicaciones pueden modificarse para potenciar su capacidad de fijar el complemento y participar en citotoxicidad dependiente del complemento (CDC). En otras realizaciones, los anticuerpos anti-PDGFR-alfa pueden modificarse para potenciar su capacidad de activar células efectoras y participar en citotoxicidad dependiente de anticuerpos (CDAC). Los anticuerpos anti-PDGFR-alfa tal

15 como se definen por las reivindicaciones pueden modificarse tanto para potenciar su capacidad de activar células efectoras como participar en citotoxicidad dependiente de anticuerpos (CDAC) y para potenciar su capacidad de fijar el complemento y participar en citotoxicidad dependiente del complemento (CDC).

También se describe en el presente documento un artículo de fabricación que incluye un recipiente. El recipiente incluye a composición que contiene un anticuerpo anti-PDGFR-alfa tal como se define por las reivindicaciones, y un prospecto o etiqueta que indica que la composición puede usarse para tratar enfermedades caracterizadas por la expresión o sobreexpresión de PDGFR-alfa.

También se describe en el presente documento un kit para tratar enfermedades que implican la expresión de

25 PDGFR-alfa, que comprende anticuerpos monoclonales anti-PDGFR-alfa tal como se definen por las reivindicaciones e instrucciones para administrar los anticuerpos monoclonales a un sujeto que necesita tratamiento.

También se describe en el presente documento un método de destrucción selectiva de una célula cancerosa en un paciente. El método comprende administrar un conjugado de anticuerpo totalmente humano a un paciente. El conjugado de anticuerpo totalmente humano comprende un anticuerpo tal como se define por las reivindicaciones que puede unirse al dominio extracelular de PDGFR-alfa y un agente. El agente es o bien una toxina, o bien un radioisótopo o bien otra sustancia que destruya una célula cancerosa. El conjugado de anticuerpo destruye selectivamente de ese modo la célula cancerosa. El agente puede ser saporina.

35 También se proporciona en el presente documento, un anticuerpo totalmente humano conjugado que se une a PDGFR-alfa. Unido al anticuerpo tal como se define por las reivindicaciones hay un agente, y la unión del anticuerpo a una célula da como resultado el suministro del agente a la célula. El anticuerpo totalmente humano conjugado anterior se une a un dominio extracelular de PDGFR-alfa. El anticuerpo y la toxina conjugada pueden internalizarse por una célula que expresa PDGFR-alfa. El agente puede ser un agente citotóxico. El agente puede ser por ejemplo saporina, o auristatina, exotoxina de Pseudomonas, gelonina, ricina, calicheamicina o inmunoconjugados a base de maitansina, y similares. Todavía en otra realización, el agente es un radioisótopo.

Los patrones de glicosilación de los anticuerpos tal como se definen por las reivindicaciones pueden modificarse para potenciar la función efectora de CDAC y CDC. Véanse Shields RL et al., (2002) JBC. 277:26733; Shinkawa T et

45 al., (2003) JBC. 278:3466 y Okazaki A et al., (2004) J. Mol. Biol., 336: 1239.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 es una gráfica que muestra las respuestas a la dosis para 5 anticuerpos monoclonales seleccionados para el % de inhibición de la proliferación inducida por PDGF-AA de células tumorales MG-63 frente al anticuerpo en ng/ml. Se llevó a cabo la estimulación celular usando PDGF-AA 100 ng/ml (3,45 nM).

Las figuras 2a-2b muestran los resultados de la evaluación antitumoral in vivo de 2.175.3 y 2.449.1.3 en el modelo de xenoinjerto de carcinoma de pulmón de células no pequeñas Calu-6. La figura 2a muestra el tamaño del tumor

55 promedio (mm3) frente al tiempo (días) y la figura 2b muestra el peso corporal promedio (g) frente al tiempo (días). Los puntos cuadrados representan el grupo de tratamiento con vehículo; los puntos circulares representan el grupo de tratamiento con 2.175.3 10 mg/kg; los puntos triangulares representan el grupo de tratamiento con 2.449.1.3 10 mg/kg.

La figura 3 muestra los resultados de la evaluación in vivo de los anticuerpos en el modelo de xenoinjerto de glioma U118 glioma en ratones SCID. Se representa gráficamente el tamaño del tumor (mm3) frente al tiempo (días) de tratamiento con anticuerpos. Los puntos cuadrados muestran el grupo de tratamiento con vehículo; los puntos circulares muestran el grupo de tratamiento con 2.175.3 10 mg/kg; los puntos triangulares muestran el grupo de tratamiento con 2.449.1.3 10 mg/kg. También se describen en el presente documento células que expresan 65 anticuerpos totalmente humanos frente a PDGFR-alfa tal como se define por las reivindicaciones. Los ejemplos de células incluyen hibridomas, o células creadas de manera recombinante, tales como células de ovario de hámster

chino (CHO) que producen anticuerpos frente a PDGFR-alfa tal como se define por las reivindicaciones.

Además, se describen en el presente documento métodos de uso de estos anticuerpos para tratar enfermedades. Los anticuerpos anti-PDGFR-alfa tal como se definen por las reivindicaciones son útiles para inhibir el crecimiento

5 tumoral. El mecanismo de acción puede incluir, pero no se limita a, bloquear la unión a ligando y/o inhibir la señalización celular implicada en el crecimiento celular. Las enfermedades que pueden tratarse a través de este mecanismo incluyen, pero no se limitan a, enfermedades neoplásicas, tales como, cánceres incluyendo, cáncer de pulmón, cáncer de ovarios, cáncer de próstata, cáncer de colon, glioblastoma, melanoma y tumor del estroma gastrointestinal (TEGI).

También se describen en el presente documento ensayos de diagnóstico para determinar específicamente la presencia y/o cantidad de PDGFR-alfa en un paciente o muestra biológica. El kit de ensayo incluye anticuerpos antiPDGFR-alfa tal como se definen por las reivindicaciones junto con los marcadores necesarios para detectar tales anticuerpos. Estos ensayos de diagnóstico son útiles para examinar enfermedades relacionadas con PDGFR-alfa

15 incluyendo, pero sin limitarse a, enfermedades neoplásicas, tales como cánceres incluyendo, cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer de ovarios, cáncer de próstata, cáncer de colon, glioblastoma, melanoma y tumor del estroma gastrointestinal (TEGI).

Una realización adicional es un vector que comprende una molécula o moléculas de ácido nucleico tal como se definen por las reivindicaciones, en el que el vector codifica para una cadena ligera y/o una cadena pesada de un anticuerpo tal como se define por las reivindicaciones.

También se describe en el presente documento una célula huésped que comprende un vector tal como se define por las reivindicaciones. Alternativamente la célula huésped puede comprender más de un vector.

25 También se describe en el presente documento un método de producción de un anticuerpo definido por las reivindicaciones cultivando células huésped en condiciones en las que una molécula de ácido nucleico se expresa para producir el anticuerpo, seguido por recuperación del anticuerpo.

También se describe en el presente documento un método de preparación de un agente de unión dirigido tal como se define por las reivindicaciones transfectando al menos una célula huésped con al menos una molécula de ácido nucleico que codifica para el agente de unión dirigido tal como se describió anteriormente en el presente documento, expresando la molécula de ácido nucleico en la célula huésped y aislando el agente de unión dirigido.

35 También se describe en el presente documento un método de inhibición del crecimiento de células que expresan PDGFR-alfa administrando un agente de unión dirigido tal como se define por las reivindicaciones. El método puede incluir seleccionar un animal que necesita tratamiento para la expresión relacionada con enfermedad de PDGFRalfa, y administrar al animal una dosis terapéuticamente eficaz de un agente de unión dirigido que se une específicamente a PDGFR-alfa.

También se describe en el presente documento un método de tratamiento de una enfermedad neoplásica en un mamífero administrando una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente de unión dirigido tal como se define por las reivindicaciones que se une específicamente a PDGFR-alfa. El método puede incluir seleccionar un animal que necesita tratamiento para una enfermedad neoplásica, y administrar al animal una dosis terapéuticamente eficaz de

45 un agente de unión dirigido que se une específicamente a PDGFR-alfa. El agente puede administrarse solo, o puede administrarse en combinación con un segundo agente antineoplásico seleccionado de un anticuerpo, un fármaco quimioterápico o un fármaco radiactivo.

También se describe en el presente documento un método de tratamiento de cáncer en un mamífero administrando una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente de unión dirigido tal como se define por las reivindicaciones que se une específicamente a PDGFR-alfa. El método puede incluir seleccionar un animal que necesita tratamiento para cáncer, y administrar al animal una dosis terapéuticamente eficaz de un agente de unión dirigido que se une específicamente a PDGFR-alfa. El agente puede administrarse solo, o puede administrarse en combinación con un segundo agente antineoplásico seleccionado de un anticuerpo, un fármaco quimioterápico o un fármaco radiactivo.

55 También se describe en el presente documento que puede usarse un agente de unión dirigido tal como se define por las reivindicaciones que se une específicamente a PDGFR-alfa para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad neoplásica.

La presente invención es particularmente adecuada para su uso en la inhibición del crecimiento tumoral en pacientes con un tumor que depende solo, o en parte, de la expresión de PDGFR-alfa.

También se describe en el presente documento un kit de ensayo para detectar PDGFR-alfa en tejidos de mamífero, células o líquidos corporales para examinar enfermedades neoplásicas y/o fibróticas y/o del sistema inmunitario. El 65 kit incluye un agente de unión dirigido tal como se define por las reivindicaciones que se une a PDGFR-alfa y medios para indicar la reacción del agente de unión dirigido con PDGFR-alfa, si está presente. El agente de unión dirigido

puede ser un anticuerpo monoclonal. El anticuerpo que se une a PDCFR-alfa puede marcarse. El anticuerpo puede ser un anticuerpo primario no marcado y el kit puede incluir además medios para detectar el anticuerpo primario. Los medios pueden incluir un segundo anticuerpo marcado que es un anticuerpo anti-inmunoglobulina. Preferiblemente, el anticuerpo se marca con un marcador seleccionado del grupo que consiste en un fluorocromo, una enzima, un

5 radionúclido y un material radiopaco.

Definiciones

A menos que se defina de otro modo, los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tendrán los significados que entienden comúnmente los expertos habituales en la técnica. Además, a menos que se requiera de otro modo por el contexto, los términos en singular incluirán pluralidades y los términos en plural incluirán el singular. Generalmente, las nomenclaturas utilizadas en relación con, y las técnicas de, cultivo celular y tisular, biología molecular y química e hibridación de proteínas y oligo- o polinucleótidos descritas en el presente documento se conocen bien y se usan comúnmente en la técnica.

15 Se usan técnicas convencionales para ADN recombinante, síntesis de oligonucleótidos y transformación y cultivo tisular (por ejemplo, electroporación, lipofección). Se realizan reacciones enzimáticas y técnicas de purificación según las especificaciones del fabricante o tal como se lleva a cabo comúnmente en la técnica o tal como se describe en el presente documento. Las técnicas y los procedimientos anteriores se realizan generalmente según métodos convencionales bien conocidos en la técnica y tal como se describe en diversas referencias generales y más específicas que se citan y se comentan en la totalidad de la presente memoria descriptiva. Véase, por ejemplo, Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N.Y. (2001)). Las nomenclaturas utilizadas en relación con, y los procedimientos de laboratorio y las técnicas de química analítica, química orgánica de síntesis y química médica y farmacéutica descritos en el presente

25 documento son aquéllos bien conocidos y usados comúnmente en la técnica. Se usan técnicas convencionales para las síntesis químicas, análisis químicos, preparación, formulación y suministro de productos farmacéuticos, y tratamiento de pacientes.

Tal como se utiliza según la presente descripción, los siguientes términos, a menos que se indique de otro modo, se entenderá que tienen los siguientes significados:

Un compuesto se refiere a cualquier compuesto de pequeño peso molecular con un peso molecular inferior a aproximadamente 2000 Daltons.

35 El término “PDGFR-alfa” se refiere al receptor alfa de tirosina cinasa del factor de crecimiento derivado de plaquetas codificado por el gen de PDGFR-alfa. PDGFR-alfa también se conoce como CD140a y PDGFR-α.

El término “neutralizante” cuando se refiere a un agente de unión dirigido tal como un anticuerpo se refiere a la capacidad de dicho agente para eliminar, o reducir significativamente, la actividad de un antígeno diana. Por consiguiente, un anticuerpo anti-PDGFR-alfa “neutralizante” de la invención puede eliminar o reducir significativamente la actividad de PDGFR-alfa. Un anticuerpo PDGFR-alfa neutralizante puede actuar, por ejemplo, bloqueando la unión del ligando a su receptor PDGFR-alfa.

El término “polinucleótido aislado” tal como se usa en el presente documento significará un polinucleótido que se ha

45 aislado de su entorno donde se produce de manera natural. Tales polinucleótidos pueden ser genómicos, de ADNc o sintéticos. Los polinucleótidos aislados preferiblemente no se asocian con la totalidad o una parte de los polinucleótidos con los que se asocian en la naturaleza. Los polinucleótidos aislados pueden unirse operativamente a otro polinucleótido al que no se une en la naturaleza. Además, los polinucleótidos aislados preferiblemente no se producen en la naturaleza como parte de una secuencia mayor.

El término “proteína aislada” al que se hace referencia en el presente documento significa una proteína que se ha aislado de su entorno donde se produce de manera natural. Tales proteínas pueden derivarse de ADN genómico, ADNc, ADN recombinante, ARN recombinante o de origen sintético o alguna combinación de los mismos, que en virtud de su origen, o fuente de derivación, la “proteína aislada” (1) no se asocia con proteínas que se encuentran en

55 la naturaleza, (2) está libre de otras proteínas de la misma fuente, por ejemplo libre de proteínas murinas, (3) se expresa por una célula de una especie diferente, o (4) no se produce en la naturaleza.

El término “polipéptido” se usa en el presente documento como término genérico para referirse a proteína nativa, fragmentos, o análogos de una secuencia de polipéptido. Así, proteína nativa, fragmentos y análogos son especies del género del polipéptido. Polipéptidos preferidos según la invención comprenden las moléculas de inmunoglobulina de cadena pesada humana y las moléculas de inmunoglobulina de cadena ligera kappa humana, así como moléculas de anticuerpo formadas por combinaciones que comprenden las moléculas de inmunoglobulina de cadena pesada con moléculas de inmunoglobulina de cadena ligera, tales como las moléculas de inmunoglobulina de cadena ligera kappa o lambda, y viceversa, así como fragmentos y análogos de las mismas. Polipéptidos

65 preferidos según la invención también pueden comprender únicamente las moléculas de inmunoglobulina de cadena pesada humana o fragmentos de las mismas.

El término “que se produce de manera natural” tal como se usa en el presente documento aplicado a un objeto se refiere al hecho de que un objeto puede encontrarse en la naturaleza. Por ejemplo, una secuencia de polipéptido o polinucleótido que está presente en un organismo (incluyendo, virus) que puede aislarse de una fuente en la

5 naturaleza y que no se ha modificado intencionadamente por el hombre en el laboratorio o que se produce de otro modo de manera natural.

El término “operativamente unido” tal como se usa en el presente documento se refiere a posiciones de componentes así descritos que están en una relación que les permite funcionar de la manera pretendida. Por

10 ejemplo, una secuencia de control “operativamente unida” a una secuencia codificante se conecta de modo que se logra la expresión de la secuencia codificante en condiciones compatibles con las secuencias de control.

El término “secuencia de control” tal como se usa en el presente documento se refiere a secuencias de polinucleótido que son necesarias o bien para efectuar o para afectar a la expresión y el procesamiento de 15 secuencias codificantes a las que se conectan. La naturaleza de tales secuencias de control difiere dependiendo del organismo huésped; en procariotas, tales secuencias de control incluyen generalmente promotor, sitio de unión al ribosoma y secuencia de terminación de la transcripción; en eucariotas, generalmente, tales secuencias de control pueden incluir promotores, potenciadores, intrones, secuencias de terminación de la transcripción, secuencias señal de poliadenilación y regiones no traducidas en 5’ y 3. El término “secuencias de control” pretende incluir, como

20 mínimo, todos los componentes cuya presencia es esencial para la expresión y el procesamiento, y también puede incluir componentes adicionales cuya presencia es ventajosa, por ejemplo, secuencias líder y secuencias de pareja de fusión.

El término “polinucleótido” tal como se hace referencia en el presente documento significa una forma polimérica de

25 nucleótidos de al menos 10 bases de longitud, o bien ribonucleótidos o bien desoxinucleótidos o una forma modificada o bien de cualquier tipo de nucleótido, o bien heterodúplex de ARN-ADN. El término incluye formas mono y bicatenarias de ADN.

El término “oligonucleótido” al que se hace referencia en el presente documento incluye nucleótidos que se producen

30 de manera natural y modificados unidos entre sí mediante uniones que se producen de manera natural y que no se producen de manera natural. Los oligonucleótidos son un subconjunto de polinucleótidos que comprenden generalmente una longitud de 200 bases o menos. Preferiblemente, los oligonucleótidos tienen de 10 a 60 bases de longitud y lo más preferiblemente de 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ó 20 a 40 bases de longitud. Los oligonucleótidos son habitualmente monocatenarios, por ejemplo para sondas; aunque los oligonucleótidos pueden ser bicatenarios,

35 por ejemplo para su uso en la construcción de un mutante génico. Los oligonucleótidos pueden ser oligonucleótidos

o bien sentido o bien antisentido.

El término “nucleótidos que se producen de manera natural” al que se hace referencia en el presente documento incluye desoxirribonucleótidos y ribonucleótidos. El término “nucleótidos modificados” al que se hace referencia en el 40 presente documento incluye nucleótidos con grupos de azúcar modificados o sustituidos y similares. El término “uniones de oligonucleótidos” al que se hace referencia en el presente documento incluye uniones de oligonucleótidos tales como fosforotioato, fosforoditioato, fosforoselenoato, fosforodiselenoato, fosforoanilotioato, fosforaniladato, fosforoamidato, y similares. Véanse por ejemplo, LaPltanche et al. Nucl. Acids Res. 14:9081 (1986); Stec et al. J. Am. Chem. Soc. 106:6077 (1984); Stein et al. Nucl. Acids Res. 16:3209 (1988); Zon et al. Anti-Cancer

45 Drug Design 6:539 (1991); Zon et al. Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, págs. 87-108 (F. Eckstein, Ed., Oxford University Press, Oxford England (1991)); Stec et al. patente estadounidense n.º 5.151.510; Uhlmann and Peyman Chemical Reviews 90:543 (1990). Un oligonucleótido puede incluir un marcador para detección, si se desea.

50 El término “hibridar selectivamente” al que se hace referencia en el presente documento significa unirse de manera detectable y específica. Los polinucleótidos, oligonucleótidos y fragmentos de los mismos se hibridan selectivamente con cadenas de ácido nucleico en condiciones de hibridación y lavado que minimizan las cantidades apreciables de unión detectable a ácidos nucleicos no específicos. Pueden usarse condiciones de alta rigurosidad para lograr condiciones de hibridación selectivas tal como se conoce en la técnica y se comenta en el presente documento.

55 Generalmente, la homología de secuencia de ácido nucleico entre los polinucleótidos, oligonucleótidos, o fragmentos de anticuerpo y una secuencia de ácido nucleico de interés será al menos del 80%, y más normalmente con homologías preferiblemente crecientes de al menos el 85%, 90%, 95%, 99% y el 100%.

El término “región CDR” o “CDRs” pretende indicar las regiones hipervariables de las cadenas pesada y ligera de la

60 inmunoglobulina tal como se define por Kabat et al. 1991 (Kabat, E.A. et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ª edición. US Department of Health and Human Services, Public Service, NIH, Washington), y ediciones posteriores. Un anticuerpo contiene normalmente 3 CDRs de cadena pesada y 3 CDRs de cadena ligera. El término CDR o CDRs se usa en este caso para indicar, según el caso, una de estas regiones o varias, o incluso el conjunto, de estas regiones que contienen la mayoría de los residuos de aminoácido responsables de la

65 unión por afinidad del anticuerpo para el antígeno o el epítopo que reconoce.

La tercera CDR de la cadena pesada (HCDR3) tiene una mayor variabilidad de tamaño (mayor diversidad debida esencialmente a los mecanismos de disposición de los genes que dan lugar a la misma). Puede ser tan corta como de 2 aminoácidos aunque el tamaño más largo conocido es de 26. La longitud de la CDR también puede variar según la longitud que puede albergarse por la secuencia de entramado subyacente particular. De manera funcional,

5 HCDR3 desempeña un papel en parte en la determinación de la especificidad del anticuerpo (Segal et al., PNAS, 71:4298-4302, 1974, Amit et al., Science, 233:747-753, 1986, Chothia et al., J. Mol. Biol., 196: 901-917, 1987, Chothia et al., Nature, 342:877- 883, 1989, Caton et al., J. Immunol., 144:1965-1968, 1990, Sharon et al., PNAS, 87:4814-4817, 1990, Sharon et al., J. Immunol., 144:4863-4869, 1990, Kabat et al., J. Immunol., 147: 1709-1719, 1991).

El término un “conjunto de CDRs” al que se hace referencia en el presente documento comprende CDR1, CDR2 y CDR3. Por tanto, un conjunto de HCDRs se refiere a HCDR1, HCDR2 y HCDR3, y un conjunto de LCDRs se refiere a LCDR1, LCDR2 y LCDR3. A menos que se establezca de otro modo, un “conjunto de CDRs” incluye HCDRs y LCDRs.

15 Dos secuencias de aminoácidos son “homólogas” si existe una identidad completa o parcial en sus secuencias. Por ejemplo, una homología del 85% significa que el 85% de los aminoácidos son idénticos cuando se alinean las dos secuencias para una máxima coincidencia. Se permiten huecos (en cualquiera de las dos secuencias que se hacen coincidir) en la maximización de la coincidencia; se prefieren longitudes de hueco de 5 o menos, prefiriéndose más 2

o menos. Alternativa y preferiblemente, dos secuencias de proteína (o secuencias de polipéptido derivadas de las mismas de al menos aproximadamente 30 aminoácidos de longitud) son homólogas, tal como se usa este término en el presente documento, si tienen una puntuación de alineación de más de 5 (en unidades de desviación estándar) usando el programa ALIGN con la matriz de datos de mutación y una penalización por hueco de 6 o más. Véase Dayhoff, M.O., en Atlas of Protein Sequence and Structure, págs. 101-110 (volumen 5, National Biomedical

25 Research Foundation (1972)) y el suplemento 2 de este volumen, págs. 1-10. Las dos secuencias o partes de las mismas son más preferiblemente homólogas si sus aminoácidos son idénticos en más o igual al 50% cuando se alinean de manera óptima usando el programa ALIGN. Debe apreciarse que puede haber distintas regiones de homología dentro de las dos secuencias ortólogas. Por ejemplo, los sitios funcionales de ortólogos de ratón y humanos pueden tener un mayor grado de homología que regiones no funcionales.

El término “corresponde a” se usa en el presente documento para significar que una secuencia de polinucleótido es homóloga (es decir, es idéntica, no estrictamente relacionada desde el punto de vista evolutivo) a la totalidad o una parte de una secuencia de polinucleótido de referencia, o que una secuencia de polipéptido es idéntica a una secuencia de polipéptido de referencia.

35 En contraposición, el término “complementario a” se usa en el presente documento para significar que la secuencia complementaria es homóloga a la totalidad o una parte de una secuencia de polinucleótido de referencia. Para ilustración, la secuencia de nucleótidos “TATAC” corresponde a una secuencia de referencia “TATAC” y es complementaria a una secuencia de referencia “GTATA”.

El término “identidad de secuencia” o “identidad” con referencia a una secuencia significa que dos secuencias de polinucleótido o aminoácidos son idénticas (es decir, nucleótido a nucleótido o residuo a residuo) a lo largo de la ventana de comparación. El término “porcentaje de identidad de secuencia” se calcula comparando dos secuencias alineadas de manera óptima a lo largo de la ventana de comparación, determinando el número de posiciones en las 45 que aparecen la base de ácido nucleico (por ejemplo, A, T, C, G, U o I) o el residuo de aminoácido idénticos en ambas secuencias para producir el número de posiciones coincidentes, dividiendo el número de posiciones coincidentes entre el número total de posiciones en la ventana de comparación (es decir, el tamaño de ventana), y multiplicando el resultado por 100 para producir el porcentaje de identidad de secuencia. Los términos “identidad sustancial” tal como se usa en el presente documento indica una característica de una secuencia de polinucleótido o aminoácidos, en la que el polinucleótido o aminoácido comprende una secuencia que tiene al menos una identidad de secuencia del 85 por ciento, preferiblemente una identidad de secuencia de al menos el 90 al 95 por ciento, más preferiblemente una identidad de secuencia de al menos el 99 por ciento, en comparación con una secuencia de referencia a lo largo de una ventana de comparación de al menos 18 posiciones de nucleótido (6 aminoácidos), frecuentemente a lo largo de una ventana de al menos 24-48 posiciones de nucleótido (8-16 aminoácidos), en el que

55 el porcentaje de identidad de secuencia se calcula comparando la secuencia de referencia con la secuencia que puede incluir deleciones o adiciones que ascienden al 20 por ciento o menor de la secuencia de referencia a lo largo de la ventana de comparación. La secuencia de referencia puede ser un subconjunto de una secuencia mayor.

Tal como se usa en el presente documento, los veinte aminoácidos convencionales y sus abreviaturas siguen la utilización convencional. Véase Immunology - A Synthesis (2ª edición, E.S. Golub y D.R. Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991)). Los estereoisómeros (por ejemplo, D-aminoácidos) de los veinte aminoácidos convencionales, aminoácidos no naturales tales como aminoácidos α-,α-disustituidos, N-alquilaminoácidos, ácido láctico, y otros aminoácidos no convencionales también pueden ser componentes adecuados para los polipéptidos de la presente invención. Los ejemplos de aminoácidos no convencionales incluyen: 465 hidroxiprolina, γ-carboxiglutamato, ε-N,N,N-trimetil-lisina, ε-N-acetil-lisina, O-fosfoserina, N-acetilserina, Nformilmetionina, 3-metilhistidina, 5-hidroxilisina, σ-N-metilarginina, y otros aminoácidos e iminoácidos similares (por

ejemplo, 4-hidroxiprolina). En la notación de polipéptidos usada en el presente documento, el sentido hacia la izquierda es el sentido amino-terminal y el sentido hacia la derecha es el sentido carboxi-terminal, según la utilización y la convención convencionales.

5 De manera similar, a menos que se especifique de otro modo, el extremo a la izquierda de secuencias de polinucleótido monocatenarias es el extremo 5’, el sentido hacia la izquierda de secuencias de polinucleótido bicatenarias se denomina el sentido 5’. El sentido de adición de 5’ a 3’ de transcritos de ARN nacientes se denomina el sentido de transcripción; las regiones de secuencia en la cadena de ADN que tiene la misma secuencia que el ARN y que están en 5’ con respecto al extremo 5’ del transcrito de ARN se denominan “secuencias en sentido 5’”; las regiones de secuencia en la cadena de ADN que tiene la misma secuencia que el ARN y que están en 3’ con respecto al extremo 3’ del transcrito de ARN se denominan “secuencias en sentido 3’”.

Tal como se aplica a los polipéptidos, el término “identidad sustancial” significa que dos secuencias peptídicas, cuando se alinean de manera óptima, tal como mediante los programas GAP o BESTFIT usando pesos de hueco 15 por defecto, comparten una identidad de secuencia de al menos el 80 por ciento, preferiblemente una identidad de secuencia de al menos el 90 por ciento, más preferiblemente una identidad de secuencia de al menos el 95 por ciento, y lo más preferiblemente una identidad de secuencia de al menos el 99 por ciento. Preferiblemente, las posiciones de residuo que no son idénticas difieren en sustituciones conservativas de aminoácidos. Las sustituciones conservativas de aminoácidos se refieren a la intercambiabilidad de residuos que tienen cadenas laterales similares. Por ejemplo, un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales alifáticas es glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales de hidroxilo alifáticas es serina y treonina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen amida es asparagina y glutamina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales aromáticas es fenilalanina, tirosina y triptófano; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales básicas es lisina, arginina e histidina; y un grupo de aminoácidos que

25 tienen cadenas laterales que contienen azufre es cisteína y metionina. Grupos de sustituciones conservativas de aminoácidos preferidos son: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina, glutámicoaspártico y asparagina-glutamina.

Tal como se comenta en el presente documento, se contempla que variaciones menores en las secuencias de aminoácidos de anticuerpos o moléculas de inmunoglobulina están englobadas por la presente invención, siempre que las variaciones en la secuencia de aminoácidos mantengan una identidad de secuencia de al menos el 75%, más preferiblemente una identidad de secuencia de al menos el 80%, 90%, 95%, y lo más preferiblemente una identidad de secuencia de al menos el 99% con los anticuerpos o moléculas de inmunoglobulina descritos en el presente documento. En particular, se contemplan reemplazos conservativos de aminoácidos. Los reemplazos 35 conservativos son aquéllos que tienen lugar dentro de una familia de aminoácidos que tienen cadenas laterales relacionadas. Los aminoácidos codificados genéticamente se dividen generalmente en familias: (1) ácidos = aspartato, glutamato; (2) básicos = lisina, arginina, histidina; (3) apolares = alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano, y -(4) polares no cargados = glicina, asparagina, glutamina, cisteína, serina, treonina, tirosina. Familias más preferidas son: serina y treonina son una familia con hidroxilo alifática; asparagina y glutamina son una familia que contiene amida: alanina, valina, leucina e isoleucina son una familia alifática; y fenilalanina, triptófano, y tirosina son una familia aromática. Por ejemplo, es razonable esperar que un reemplazo aislado de una leucina por una isoleucina o valina, un aspartato por un glutamato, una treonina por una serina, o un reemplazo similar de un aminoácido por aminoácido relacionado estructuralmente no tendrá un efecto importante sobre la función de unión o las propiedades de la molécula resultante, especialmente si el reemplazo no 45 implica un aminoácido dentro de un sitio de región de entramado. Puede determinarse fácilmente si un cambio de aminoácidos da como resultado un péptido funcional sometiendo a ensayo la actividad específica del derivado de polipéptido. Se describen ensayos en detalle en el presente documento. Pueden prepararse fácilmente fragmentos o análogos de anticuerpos o moléculas de inmunoglobulina por los expertos habituales en la técnica. Los extremos amino- y carboxi-terminales de fragmentos o análogos se producen cerca de los límites de dominios funcionales. Puede identificarse dominios estructurales y funcionales mediante la comparación de los datos de secuencia de nucleótidos y/o de aminoácidos con bases de datos de secuencias públicas o privadas. Preferiblemente, se usan métodos de comparación computerizados para identificar motivos de secuencia o dominios de conformación de proteínas predichos que se producen en otras proteínas de estructura y/o función conocidas. Se conocen métodos para identificar secuencias de proteína que se pliegan en una estructura tridimensional conocida. Bowie et al.

55 Science 253:164 (1991). Por tanto, los ejemplos anteriores demuestran que los expertos en la técnica pueden reconocer motivos de secuencia y conformaciones estructurales que pueden usarse para definir dominios estructurales y funcionales según los anticuerpos descritos en el presente documento.

Sustituciones de aminoácidos preferidas son aquéllas que: (1) reducen la susceptibilidad a proteólisis, (2) reducen la susceptibilidad a oxidación, (3) alteran la afinidad de unión para formar complejos proteicos, (4) alteran afinidades de unión, y (4) confieren o modifican otras propiedades fisicoquímicas o funcionales de tales análogos. Los análogos pueden incluir diversas muteínas de una secuencia distinta a la secuencia peptídica que se produce de manera natural. Por ejemplo, pueden realizarse sustituciones de aminoácidos individuales o múltiples (preferiblemente, sustituciones conservativas de aminoácidos) en la secuencia que se produce de manera natural (preferiblemente en 65 la parte del polipéptido fuera del/de los dominio(s) formando contactos intermoleculares. Una sustitución conservativa de aminoácidos no debe cambiar sustancialmente las características estructurales de la secuencia

original (por ejemplo, un aminoácido de reemplazo no debe tender a romper una hélice que se produce en la secuencia original, ni perturbar otros tipos de estructura secundaria que caracterizan la secuencia original). Se describen ejemplos de estructuras secundarias y terciarias de polipéptidos reconocidas en la técnica en Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, ed., W. H. Freeman y Company, Nueva York (1984)); Introduction to

5 Protein Structure (C. Branden y J. Tooze, eds., Garland Publishing, Nueva York, N.Y. (1991)); y Thornton et al. Nature 354:105 (1991).

Pueden obtenerse variantes de los dominios VH y VL y CDRs de la presente invención, incluyendo, aquéllos para los que se exponen las secuencias de aminoácidos en el presente documento, y que pueden emplearse en el direccionamiento de agentes y anticuerpos para PDGFR-alfa por medio de métodos de alteración o mutación de secuencias y examinar el direccionamiento de antígenos con características deseadas. Los ejemplos de características deseadas incluyen pero no se limitan a: aumento de la afinidad de unión por el antígeno con relación a anticuerpos conocidos que son específicos para el antígeno; aumento de la neutralización de una actividad antigénica con relación a anticuerpos conocidos que son específicos para el antígeno si la actividad se conoce;

15 capacidad competitiva especificada con un anticuerpo o ligando conocido para el antígeno a una razón molar específica; capacidad de inmunoprecipitar el complejo ligando-receptor; capacidad de unirse a un epítopo especificado; epítopo lineal, por ejemplo secuencia peptídica identificada usando barrido de unión de péptido, por ejemplo usando péptidos examinados en conformación lineal y/o restringida; epítopo conformacional, formado por residuos no continuos; capacidad de modular una nueva actividad biológica de PDGFR-alfa, o molécula en sentido 3’; capacidad de unirse a y/o neutralizar y/o para cualquier otra propiedad deseada.

Las técnicas requeridas para realizar sustituciones dentro de secuencias de aminoácidos de CDRs, dominios VH o VL de anticuerpos y sitios de unión a antígenos están disponibles en la técnica. Pueden producirse variantes de moléculas de anticuerpo dadas a conocer en el presente documento y usarse en la presente invención. Siguiendo la 25 iniciativa de la química computacional en la aplicación de técnicas de análisis de datos multivariantes a las relaciones de estructura/propiedad-actividad (Wold, et al. Multivariate data analysis in chemistry. Chemometrics-Mathematics and Statistics in Chemistry (Ed.: B. Kowalski), D. Reidel Publishing Company, Dordrecht, Holanda, 1984) pueden derivarse relaciones cuantitativas de actividad-propiedad de anticuerpos usando técnicas matemáticas bien conocidas, tales como regresión estadística, reconocimiento y clasificación de patrones (Norman et al. Applied Regression Analysis. Wiley-Interscience; 3ª edición (abril de 1998); Kandel, Abraham & Backer, Eric. Computer-Assisted Reasoning in Cluster Analysis. Prentice Hall PTR, (11 de mayo de 1995); Krzanowski, Wojtek. Principles of Multivariate Analysis: A User’s Perspective (Oxford Statistical Science Series, n.º 22 (Paper)). Oxford University Press; (diciembre de 2000); Witten, Ian H. & Frank, Eibe. Data Mining: Practical Machine Learning Tools and Techniques with Java Implementations. Morgan Kaufmann; (11 de octubre de 1999):Denison David G. T. (editor),

35 Christopher C. Holmes, Bani K. Mallick, Adrian F. M. Smith. Bayesian Methods for Nonlinear Classification and Regression (Wiley Series in Probability and Statistics). John Wiley & Sons; (julio de 2002); Ghose, Arup K. & Viswanadhan, Vellarkad N. Combinatorial Library Design and Evaluation Principles, Software, Tools, and Applications in Drug Discovery). Las propiedades de anticuerpos pueden derivarse de modelos empíricos y teóricos (por ejemplo, análisis de residuos con contacto probable o propiedad fisicoquímica calculada) de secuencia de anticuerpo, estructuras funcionales y tridimensionales y estas propiedades pueden considerarse individualmente y en combinación.

Un sitio de unión a antígenos de anticuerpo compuesto por un dominio VH y un dominio VL está formado normalmente por seis bucles de polipéptido: tres del dominio variable de cadena ligera (VL) y tres del dominio

45 variable de cadena pesada (VH). El análisis de anticuerpos de estructura atómica conocida ha dilucidado relaciones entre la secuencia y la estructura tridimensional de sitios de combinación de anticuerpos. Estas relaciones implican que, excepto por la tercera región (bucle) en los dominios VH, los bucles de sitio de unión tienen uno de un pequeño número de conformaciones de cadena principal: estructuras canónicas. Se ha mostrado que la estructura canónica formada en un bucle particular está determinada por su tamaño y la presencia de determinados residuos en sitios clave tanto en el bucle como en las regiones de entramado.

Este estudio de relaciones secuencia-estructura puede usarse para la predicción de esos residuos en un anticuerpo de secuencia conocida, pero de estructura tridimensional desconocida, que son importantes en el mantenimiento de la estructura tridimensional de sus bucles de CDR y así mantienen especificidad de unión. Estas predicciones

55 pueden respaldarse mediante la comparación de las predicciones con el resultado de experimentos de optimización de compuestos líder. En un enfoque estructural, puede crearse un modelo de la molécula de anticuerpo usando cualquier paquete comercial o disponible gratuitamente, tal como WAM. Entonces puede usarse un paquete de software de análisis y visualización de proteínas, tal como Insight II (Accelrys, Inc.) o Deep View para evaluar posibles sustituciones en cada posición en la CDR. Entonces puede usarse esta información para realizar sustituciones que es probable que tengan un efecto mínimo o beneficioso sobre la actividad o confieran otras propiedades deseables.

El término “fragmento de polipéptido” tal como se usa en el presente documento se refiere a un polipéptido que tiene una deleción amino-terminal y/o carboxi-terminal, pero en el que la secuencia de aminoácidos restante es idéntica a 65 las posiciones correspondientes en la secuencia que se produce de manera natural deducida, por ejemplo, a partir de una secuencia de ADNc de longitud completa. Los fragmentos tienen normalmente al menos 5, 6, 8 ó 10

aminoácidos de largo, preferiblemente al menos 14 aminoácidos de largo, más preferiblemente al menos 20 aminoácidos de largo, habitualmente al menos 50 aminoácidos de largo e incluso más preferiblemente al menos 70 aminoácidos de largo. El término “análogo” tal como se usa en el presente documento se refiere a polipéptidos que se componen de un segmento de al menos 25 aminoácidos que tienen identidad sustancial a una parte de una

5 secuencia de aminoácidos deducida y que tienen al menos una de las siguientes propiedades: (1) unión específica a un PDGFR-alfa, en condiciones de unión adecuadas, (2) capacidad de inhibir la unión de PDGF-AA, (3) capacidad de inhibir la unión de PDGF-AB, (4) capacidad de inhibir la unión de PDGF-BB, y/o (5) capacidad de inhibir la unión de PDGF-CC. Normalmente, los análogos de polipéptido comprenden una sustitución conservativa de aminoácidos (o adición o deleción) con respecto a la secuencia que se produce de manera natural. Los análogos tienen normalmente al menos 20 aminoácidos de largo, preferiblemente al menos 50 aminoácidos de largo o son más largos, y a menudo pueden ser tan largos como el polipéptido que se produce de manera natural de longitud completa.

Los análogos peptídicos se usan comúnmente en la industria farmacéutica como fármacos no peptídicos con

15 propiedades análogas a las del péptido molde. Estos tipos de compuesto no peptídico se denominan “miméticos de péptido” o “peptidomiméticos”. Fauchere, J. Adv. Drug Res. 15:29 (1986); Veber y Freidinger TINS pág. 392 (1985); y Evans et al. J. Ahed. Chem. 30:1229 (1987). Tales compuestos se desarrollan a menudo con la ayuda de modelado molecular computerizado. Pueden usarse miméticos de péptido que son similares estructuralmente a péptidos terapéuticamente útiles para producir un efecto terapéutico o profiláctico equivalente. Generalmente, los peptidomiméticos son similares estructuralmente a un polipéptido paradigma (es decir, un polipéptido que tiene una propiedad bioquímica o actividad farmacológica), tal como anticuerpo humano, pero tienen una o más uniones peptídicas reemplazadas opcionalmente por una unión seleccionada del grupo que consiste en: --CH2NH-, --CH2S--, --CH2-CH2--, -CH=CH--(cis y trans), --COCH2--, --CH(OH)CH2-- y -CH2SO-, mediante métodos bien conocidos en la técnica. Puede usarse la sustitución sistemática de uno o más aminoácidos de una secuencia consenso por un D

25 aminoácido del mismo tipo (por ejemplo, D-lisina en lugar de L-lisina) para generar péptidos más estables. Además, pueden generarse péptidos restringidos que comprenden una secuencia consenso o una variación de secuencia consenso sustancialmente idéntica mediante métodos conocidos en la técnica (Rizo y Gierasch Ann. Rev. Biochem.

61:387 (1992)); por ejemplo, añadiendo residuos de cisteína internos que pueden formar puentes disulfuro intramoleculares que ciclan el péptido.

Tal como se usa en el presente documento, el término “anticuerpo” se refiere a un polipéptido o grupo de polipéptidos que se componen de al menos un dominio de unión que se forma a partir del plegamiento de las cadenas de polipéptido que tienen espacios de unión tridimensionales con formas superficiales internas y distribuciones de cargas complementarias a las características de un determinante antigénico de un antígeno. Un

35 anticuerpo tiene normalmente una forma tetramérica, que comprende dos pares idénticos de cadenas de polipéptido, teniendo cada par una cadena “ligera” y una “pesada”. Las regiones variables de cada par de cadenas ligera/pesada forman un sitio de unión a anticuerpos.

Tal como se usa en el presente documento, un “agente de unión dirigido” es un agente, por ejemplo un anticuerpo, o fragmento de unión del mismo, que se une a un sitio diana. El agente de unión dirigido puede ser específico sólo para un sitio diana. El agente de unión dirigido puede ser específico para más de un sitio diana. El agente de unión dirigido puede ser un anticuerpo monoclonal y el sitio diana puede ser un epítopo. Tal como se describe a continuación, un agente de unión dirigido puede comprender al menos un dominio de unión a antígenos (por ejemplo, una CDR) de un anticuerpo, en el que dicho dominio se fusiona o está contenido dentro de un andamiaje

45 proteico heterólogo, por ejemplo un andamiaje proteico distinto a anticuerpo.

Se producen “fragmentos de unión” de un anticuerpo mediante técnicas de ADN recombinante, o mediante escisión enzimática o química de anticuerpos intactos. Los fragmentos de unión incluyen Fab, Fab’, F(ab’)2, Fv, dAb y anticuerpos de cadena sencilla. Se entiende que un anticuerpo distinto a un anticuerpo “biespecífico” o “bifuncional” tiene cada uno de sus sitios de unión idénticos. Un anticuerpo inhibe sustancialmente la adhesión de un receptor a un contrarreceptor cuando un exceso de anticuerpo reduce la cantidad de receptor unido al contrarreceptor en al menos aproximadamente el 20%, 40%, 60% o el 80%, y más habitualmente en más de aproximadamente el 85% (tal como se mide en un ensayo de unión competitiva in vitro).

55 Un anticuerpo puede ser oligoclonal, un anticuerpo policlonal, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo injertado con CDR, un anticuerpo multiespecífico, un anticuerpo biespecífico, un anticuerpo catalítico, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo totalmente humano, un anticuerpo anti-idiotípico y anticuerpos que pueden marcarse en forma soluble o unida así como fragmentos, variantes o derivados de los mismos, o bien solos o bien en combinación con otras secuencias de aminoácidos proporcionados mediante técnicas conocidas. Un anticuerpo puede ser de cualquier especie. El término anticuerpo también incluye fragmentos de unión de los anticuerpos de la invención; los fragmentos a modo de ejemplo incluyen Fv, Fab, Fab’, anticuerpo monocatenario (svFC), región variable dimérica (diacuerpo) y región variable estabilizada con disulfuro (dsFv).

Se ha mostrado que fragmentos de un anticuerpo completo pueden realizar la función de unión a antígenos.

65 Ejemplos de fragmentos de unión son (Ward, E.S. et al., (1989) Nature 341, 544-546) el fragmento Fab que consiste en dominios VL, VH, CL y CH1; (McCafferty et al (1990) Nature, 348, 552-554) el fragmento Fd que consiste en los

dominios VH y CH1; (Holt et al (2003) Trends in Biotechnology 21, 484-490) el fragmento Fv que consiste en los dominios VL y VH de un único anticuerpo; (iv) el fragmento dAb (Ward, E.S. et al., Nature 341, 544-546 (1989), McCafferty et al (1990) Nature, 348, 552-554, Holt et al (2003) Trends in Biotechnology 21, 484-490], que consiste en un dominio VH o uno VL; (v) regiones de CDR aisladas; (vi) fragmentos F(ab’)2, un fragmento bivalente que 5 comprende dos fragmentos Fab unidos (vii) moléculas de Fv de cadena sencilla (scFv), en las que un dominio VH y un dominio VL se unen mediante un ligador peptídico que permite que los dos dominios se asocien para formar un sitio de unión a antígenos (Bird et al, (1988) Science, 242, 423-426, , Huston et al, (1988) PNAS USA, 85, 58795883); (viii) dímeros de Fv de cadena sencilla biespecíficos (documento PCT/US92/09965) y (ix) “diacuerpos”, fragmentos multivalentes o multiespecíficos construidos mediante fusión génica (documento WO94/13804; Holliger,

P. (1993) et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 6444-6448). Pueden estabilizarse moléculas de Fv, scFv o diacuerpo mediante la incorporación de puentes disulfuro que unen los dominios VH y VL (Reiter, Y. et al, Nature Biotech, 14, 1239-1245, 1996). También pueden prepararse minicuerpos que comprenden un scFv unido a un dominio CH3 (Hu,

S. et al, (1996) Cancer Res., 56, 3055-3061). Otros ejemplos de fragmentos de unión son Fab’, que difieren de fragmentos Fab en la adición de unos cuantos residuos en el extremo carboxilo-terminal del dominio de cadena

15 pesada CH1, incluyendo una o más cisteínas de la región bisagra del anticuerpo, y Fab-SH, que es un fragmento Fab’ en el que el/los residuo(s) de cisteína de los dominios constantes llevan un grupo tiol libre.

El término “epítopo” incluye cualquier determinante proteico que puede dar unión específica a una inmunoglobulina o receptor de células T. Los determinantes epitópicos consisten habitualmente en agrupaciones de superficie químicamente activas de moléculas tales como aminoácidos o cadenas laterales de azúcar y pueden tener, pero no siempre, características estructurales tridimensionales específicas, así como características de carga específicas. Se dice que un anticuerpo se une específicamente a un antígeno cuando la constante de disociación es ≤ 1 μM, preferiblemente ≤ 100 nM y lo más preferiblemente ≤ 10 nM.

25 El término “agente” se usa en el presente documento para indicar un compuesto químico, una mezcla de compuestos químicos, una macromolécula biológica o un extracto preparado a partir de materiales biológicos.

“Activo” o “actividad” con respecto a un polipéptido de PDGFR-alfa se refiere a una parte de un polipéptido de PDGFR-alfa que tiene una actividad biológica o inmunológica de un polipéptido de PDGFR-alfa nativo. “Biológica” cuando se usa en el presente documento se refiere a una función biológica que resulta de la actividad del polipéptido de PDGFR-alfa nativo. Una actividad biológica de PDGFR-alfa preferida incluye, por ejemplo, autofosforilación.

“Mamífero” cuando se usa en el presente documento se refiere a cualquier animal que se considera un mamífero. Preferiblemente, el mamífero es ser humano.

35 La digestión de anticuerpos con la enzima, papaína, da como resultado dos fragmentos de unión a antígenos idénticos, también conocidos como fragmentos “Fab”, y un fragmento “Fc”, que no tiene actividad de unión a antígenos sino que tiene la capacidad de cristalizar. La digestión de anticuerpos con la enzima, pepsina, da como resultado un fragmento F(ab’)2 en el que los dos brazos de la molécula de anticuerpo permanecen unidos y comprenden dos sitios de unión a antígenos. El fragmento F(ab’)2 tiene la capacidad de reticular el antígeno.

“Fv” cuando se usa en el presente documento se refiere al fragmento mínimo de un anticuerpo que conserva sitios tanto de reconocimiento de antígenos como de unión a antígenos.

45 “Fab” cuando se usa en el presente documento se refiere a un fragmento de un anticuerpo que comprende el dominio constante de la cadena ligera y el dominio CH1 de la cadena pesada.

Un “dAb” es un anticuerpo de un solo dominio y comprende o bien el dominio variable de una cadena pesada de anticuerpo (dominio VH) o el dominio variable de una cadena ligera de anticuerpo (dominio VL). Cada dAb contiene tres de las seis CDRs que se producen de manera natural (Ward et al., Binding activities of a repertoire of single immunoglobulin variable domains secreted from Escherichia coli. Nature 341, 544-546 (1989); Holt, et al., Domain antibodies: protein for therapy. Trends Biotechnol. 21, 484-49 (2003)). Con pesos moleculares que oscilan entre 11 y 15 kDa son cuatro veces más pequeños que un fragmento de unión a antígenos (Fab)2 y la mitad del tamaño de una molécula de Fv de cadena sencilla (scFv).

55 El término “Acm” se refiere a un anticuerpo monoclonal.

“Liposoma” cuando se usa en el presente documento se refiere a una pequeña vesícula que puede ser útil para el suministro de fármacos que pueden incluir el polipéptido de PDGFR-alfa de la invención o anticuerpos contra un polipéptido de PDGFR-alfa de este tipo a un mamífero.

“Marcador” o “marcado” tal como se usa en el presente documento se refiere a la adición de un resto detectable a un polipéptido, por ejemplo, un radiomarcador, marcador fluorescente, marcador enzimático quimioluminiscente marcado o un grupo biotinilo. Los radioisótopos o radionúclidos pueden incluir 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, 111In,

65 125I, 131I, los marcadores fluorescentes pueden incluir rodamina, fósforos de lantánidos o FITC y los marcadores enzimáticos pueden incluir peroxidasa del rábano, β-galactosidasa, luciferasa, fosfatasa alcalina.

Marcadores adicionales incluyen, a modo de ilustración y sin limitación: enzimas, tales como glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (“G6PDH”), alfa-D-galactosidasa, glucosa oxidasa, glucosa amilasa, anhidrasa carbónica, acetilcolinesterasa, lisozima, malato deshidrogenasa y peroxidasa; colorantes; marcadores fluorescentes adicionales 5 o agentes que producen fluorescencia se incluyen, tales como fluoresceína y sus derivados, fluorocromo, GFP (GFP para “Green Fluorescent Protein” (proteína fluorescente verde)), dansilo, umbeliferona, ficoeritrina, ficocianina, aloficocianina, o-ftaldehído y fluorescamina; fluoróforos tales como quelatos y criptatos de lantánidos, por ejemplo, de europio etc. (Perkin Elmer y Cis Biointernational); marcadores quimioluminiscentes o agentes que producen quimioluminiscencia, tales como isoluminol, luminol y los dioxetanos; sensibilizantes; coenzimas; sustratos enzimáticos; partículas, tales como partículas de látex o carbono; sol metálico; cristalito; liposomas; células, etc., que pueden marcarse adicionalmente con un colorante, catalizador u otro grupo detectable; moléculas tales como biotina, digoxigenina o 5-bromodesoxiuridina; restos de toxinas, tales como por ejemplo un resto de toxina seleccionado de un grupo de exotoxina de Pseudomonas (PE o un fragmento citotóxico o mutante de la misma), toxina diftérica o un fragmento citotóxico o mutante de la misma, una toxina botulínica A, B, C, D, E o F, ricina o un 15 fragmento citotóxico de la misma, por ejemplo, ricina A, abrina o un fragmento citotóxico de la misma, saporina o un fragmento citotóxico de la misma, toxina antiviral de hierba carmín o un fragmento citotóxico de la misma y briodina I

o un fragmento citotóxico de la misma.

El término “fármaco o agente farmacéutico” tal como se usa en el presente documento se refiere a un compuesto químico o composición que puede inducir un efecto terapéutico deseado cuando se administra apropiadamente a un paciente. Otros térmicos químicos en el presente documento se usan según la utilización convencional en la técnica, tal como se ejemplifica mediante The McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (Parker, S., Ed., McGraw-Hill, San Francisco (1985)).

25 Tal como se usa en el presente documento, “sustancialmente puro” significa una especie objeto que es la especie predominante presente (es decir, con respecto a una base molar, es más abundante que cualquier otra especie individual en la composición), y preferiblemente una fracción sustancialmente purificada es una composición en la que la especie objeto comprende al menos aproximadamente el 50 por ciento (con respecto a una base molar) de todas las especies macromoleculares presentes. Generalmente, una composición sustancialmente pura comprenderá más de aproximadamente el 80 por ciento de todas las especies macromoleculares presentes en la composición, más preferiblemente más de aproximadamente el 85%, 90%, 95% y el 99%. Lo más preferiblemente, la especie objeto se purifica hasta homogeneidad esencial (no pueden detectarse especies contaminantes en la composición mediante métodos de detección convencionales) en la que la composición consiste esencialmente en una única especie macromolecular.

35 “Citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos” y “CDAC” se refieren a una reacción mediada por células en la que células citotóxicas no específicas que expresan receptores de Fc de Ig (FcRs) (por ejemplo, linfocitos citolíticos naturales (NK, natural killer), monocitos, neutrófilos y macrófagos) reconocen anticuerpo unido en una célula diana y posteriormente provocan lisis de la célula diana. Las células primarias para mediar CDAC, células NK, expresan FcγRIII sólo, mientras que los monocitos expresan FcγRI, FcγRII y FcγRIII: se resumen la expresión de FcRs en células hematopoyéticas en la tabla 3, en la página 464 de Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol 9: 457-92 (1991). Para evaluar la actividad CDAC de una molécula de interés, puede realizarse un ensayo de CDAC in vitro, tal como el descrito en la patente estadounidense n.º 5.500.362 ó 5.821.337. Las células efectoras útiles para tales ensayos incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y linfocitos citolíticos naturales (NK, natural

45 killer). Alternativa o adicionalmente, puede evaluarse la actividad CDAC de la molécula de interés in vivo, por ejemplo, en un modelo animal tal como el dado a conocer en Clynes et al. PNAS (USA) 95:652-656 (1988).

“Citotoxicidad dependiente del complemento” y “CDC” se refieren al mecanismo mediante el cual los anticuerpos llevan a cabo su función de destrucción celular. Está iniciado por la unión de C1q, un constituyente del primer componente del complemento, al dominio Fc de Igs, IgG o IgM, que están formando complejo con antígeno (Hughs-Jones, N.C., y B. Gardner. 1979. Mol. Immunol. 16:697). C1q es una gran glicoproteína, compleja estructuralmente de ~410 kDa presente en suero humano a una concentración de 70 μg/ml (Cooper, N.R. 1985. Adv. Immunol. 37:151). Junto con dos serina proteasas, Clr y Cls, C1q forma el complejo Cl, el primer componente del complemento. Al menos dos de las cabezas globulares N-terminales de C1q deben unirse al Fc de Igs para la

55 activación de C1, así para la iniciación de la cascada del complemento (Cooper, N.R. 1985. Adv. Immunol. 37:151).

“Ensayos de sangre completa” usan sangre sin fraccionar como fuente de efectores naturales. La sangre contiene complemento en el plasma, junto con efectores celulares que expresan FcR, tales como células polimorfonucleares (PMNs) y células mononucleares (MNCs). Por tanto, los ensayos de sangre completa permiten la evaluación simultánea de la sinergia de ambos mecanismos efectores de CDAC y CDC in vitro.

El término “paciente” incluye sujetos humanos y veterinarios.

El término “y/o” tal como se usa en el presente documento ha de tomarse como una descripción específica de cada

65 una de las dos características o componentes especificados con o sin los demás. Por ejemplo “A y/o B” ha de tomarse como una descripción específica de cada uno de (i) A, (ii) B y (iii) A y B, como si cada uno se expusiera individualmente en el presente documento.

Estructura de anticuerpos

5 Se sabe que la unidad estructural de anticuerpo básica comprende un tetrámero. Cada tetrámero se compone de dos pares idénticos de cadenas de polipéptido, teniendo cada par una cadena “ligera” (aproximadamente 25 kDa) y una “pesada” (aproximadamente 50-70 kDa). La parte amino-terminal de cada cadena incluye una región variable de aproximadamente 100 a 110 o más aminoácidos responsable principalmente del reconocimiento de antígenos. La parte carboxi-terminal de cada cadena define una región constante responsable principalmente de la función efectora. Las cadenas ligeras humanas se clasifican como cadenas ligeras kappa y lambda. Las cadenas pesadas se clasifican como mu, delta, gamma, alfa o épsilon, y definen el isotipo del anticuerpo como IgM, IgD, IgA e IgE, respectivamente. Dentro de las cadenas ligeras y pesadas, las regiones variables y constantes se unen por una región “J” de aproximadamente 12 o más aminoácidos, incluyendo también la cadena pesada una región “D” de aproximadamente 10 aminoácidos más. Véase generalmente, Fundamental Immunology cap. 7 (Paul, W., ed., 2ª ed.

15 Raven Press, N.Y. (1989)). Las regiones variables de cada par de cadenas ligera/pesada forman el sitio de unión a anticuerpos.

Por tanto, un anticuerpo intacto tiene dos sitios de unión. Excepto en anticuerpos bifuncionales o biespecíficos, los dos sitios de unión son iguales.

Las cadenas presentan todas la misma estructura general de regiones de entramado (FR, framework) relativamente conservadas unidas por tres regiones hipervariables, también denominadas regiones determinantes de complementariedad o CDRs. Las CDRs de las dos cadenas de cada par se alinean mediante las regiones de entramado, permitiendo la unión a un epítopo específico. Desde el extremo N-terminal al C-terminal, ambas cadenas

25 ligeras y pesadas comprenden los dominios FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4. La asignación de aminoácidos a cada dominio es según las definiciones de Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 y 1991)), o Chothia & Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987); Chothia et al. Nature 342:878-883 (1989).

Un anticuerpo biespecífico o bifuncional es un anticuerpo híbrido artificial que tiene dos pares de cadena pesada/ligera diferentes y dos sitios de unión diferentes. Los anticuerpos biespecíficos pueden producirse mediante una variedad de métodos incluyendo fusión de hibridomas o unión de fragmentos Fab’. Véanse, por ejemplo, Songsivilai & Lachmann Clin. Exp. Immunol. 79: 315-321 (1990), Kostelny et al. J. Immunol. 148:1547-1553 (1992). Los anticuerpos biespecíficos no existen en forma de fragmentos que tienen un único sitio de unión (por ejemplo,

35 Fab, Fab’ y Fv).

Normalmente, un dominio VH se empareja con un dominio VL para proporcionar un sitio de unión a antígenos del anticuerpo, aunque un dominio VH o VL solo puede usarse para unirse al antígeno. El dominio VH (véase la tabla 12) puede emparejarse con el dominio VL (véase la tabla 13), de modo que se forma un sitio de unión a antígenos del anticuerpo que comprende ambos dominios VH y VL.

Anticuerpos humanos y humanización de anticuerpos

Los anticuerpos humanos evitan algunos de los problemas asociados con los anticuerpos que presentan regiones

45 variables y/o constantes murinas o de rata. La presencia de tales proteínas murinas o derivadas de rata puede conducir a la rápida eliminación de los anticuerpos o puede conducir a la generación de una respuesta inmunitaria frente al anticuerpo por un paciente. Con el fin de evitar la utilización de anticuerpos murinos o derivados de rata, pueden generarse anticuerpos totalmente humanos a través de la introducción de loci de anticuerpos humanos funcionales en un roedor, otro mamífero o animal de modo que el roedor, otro mamífero o animal produzca anticuerpos totalmente humanos.

Un método para generar anticuerpos totalmente humanos es a través del uso de cepas XenoMouse® de ratones que se han modificado mediante ingeniería genética para que contengan fragmentos configurados de línea germinal con un tamaño de hasta pero menos de 1000 kb del locus de cadena pesada humana y el locus de cadena ligera

55 kappa. Véanse Mendez et al. Nature Genetics 15:146-156 (1997) y Green y Jakobovits J. Exp. Med. 188:483-495 (1998). Las cepas XenoMouse® están disponibles de Amgen, Inc. (Fremont, California, EE.UU.).

Tales ratones, entonces, pueden producir moléculas de inmunoglobulina y anticuerpos humanos y son deficientes en la producción de moléculas de inmunoglobulina y anticuerpos murinos. Las tecnologías utilizadas para lograr lo mismo se dan a conocer en las solicitudes de patente internacional n.os WO 98/34893, publicada el 11 de junio de 1998 y WO 00/76310, publicada el 21 de diciembre de 2000. Véase también Mendez et al. Nature Genetics 15:146156 (1997).

La producción de las cepas XenoMouse® de ratones se comenta y delinea adicionalmente en la publicación

65 estadounidense 2003/0093820, presentada el 30 de noviembre de 2001 y las patentes estadounidenses n.os 6.162.963, 6.150.584, 6.114.598, 6.075.181 y 5.939.598 y las patentes japonesas n.os 3 068 180 B2, 3 068 506 B2 y 3 068 507 B2. Véanse también la patente europea n.º EP 0 463 151 B1, concesión publicada el 12 de junio de 1996, la solicitud de patente internacional n.º WO 94/02602, publicada el 3 de febrero de 1994, la solicitud de patente internacional n.º WO 96/34096, publicada el 31 de octubre de 1996, el documento WO 98/24893, publicado el 11 de junio de 1998, el documento WO 00/76310, publicado el 21 de diciembre de 2000.

5 En un enfoque alternativo, otros, incluyendo GenPharm Internacional, Inc., han utilizado un enfoque de “minilocus”. En el enfoque de minilocus, se imita un locus de Ig exógeno a través de la inclusión de trozos (genes individuales) del locus de Ig. Por tanto, uno o más genes VH, uno o más genes DH, uno o más genes JH, una región constante mu, y habitualmente una segunda región constante (preferiblemente, una región constante gamma) se forman en un constructo para la inserción en un animal. Este enfoque se describe en las patentes estadounidenses n.os 5.545.806, 5.625.825, 3.625.126, 5.633.425, 5.661.016, 5.770.429, 5.789.650, 5.814.318, 5.877.397, 5.874.299 y 6.255.458 cada una concedida a Lonberg y Kay, las patentes estadounidenses n.os 5.591.669 y 6.023.010 concedidas a Krimpenfort y Berns, las patentes estadounidenses n.os 5.612.205, 5.721.367 y 5.789.215 concedidas a Bems et al., y la patente estadounidense n.º 5.643.763 concedida a Choi y Dunn. Véase también la patente europea n.º 0 546

15 073 B1, las solicitudes de patente internacional n.os WO 92/03918, WO 92/22645, WO 92/22647, WO 92/22670, WO 93/12227, WO 94/00569, WO 94/25585, WO 96/14436, WO 97/13852, y WO 98/24884 y la patente estadounidense n.º 5.981.175. Véase además Taylor et al., 1992, Chen et al., 1993, Tuaillon et al., 1993, Choi et al., 1993, Lonberg et al., (1994), Taylor et al., (1994) y Tuaillon et al., (1995), Fishwild et al., (1996).

Kirin también ha demostrado la generación de anticuerpos humanos por ratones en los que, a través de fusión microcelular, se han introducido grandes trozos de cromosomas, o cromosomas enteros. Véanse las solicitudes de patente europea n.os 773 288 y 843 961. Adicionalmente, se han generado ratones KMTM, que son el resultado de fecundación cruzada de ratones Tc de Kirin con ratones con minilocus de Medarex (Humab). Estos ratones presentan el transcromosoma de IgH humano de los ratones de Kirin y el transgén de la cadena kappa de los

25 ratones de Genpharm (Ishida et al., Cloning Stem Cells, (2002) 4:91-102).

También pueden derivarse anticuerpos humanos mediante métodos in vitro. Los ejemplos adecuados incluyen pero no se limitan a presentación en fago (CAT, Morphosys, Dyax, Biosite/Medarex, Xorna, Symphogen, Alexion (anteriormente Proliferon), Affirned) presentación en ribosoma (CAT), presentación en levadura, y similares. The may

Los anticuerpos de la invención pueden competir con los anticuerpos dados a conocer. Puede someterse a ensayo fácilmente in vitro la competencia entre anticuerpos, por ejemplo usando ELISA y/o marcando con etiqueta una molécula indicadora específica en un elemento de unión que puede detectarse en presencia de uno o más de otros

35 anticuerpos sin marcar con etiqueta, para permitir la identificación de anticuerpos que se unen al mismo epítopo o un epítopo solapante. Tales métodos se conocen fácilmente por un experto habitual en la técnica, y se describen en más detalle en el presente documento. Por tanto, también se describe en el presente documento, un sitio de unión a antígenos que comprende un sitio de unión a antígenos humanos del anticuerpo que compite con un molécula de anticuerpo, por ejemplo especialmente un molécula de anticuerpo que comprende un dominio VH y/o VL, CDR por ejemplo HCDR3 o conjunto de CDRs del anticuerpo original o cualquiera de los anticuerpos dados a conocer en el presente documento que se unen a PDGFR-alfa. El anticuerpo de la invención puede competir con 2.175.3,

2.449.1.3 y/o 2.998.2.

Preparación de anticuerpos

45 En general, los anticuerpos producidos por los hibridomas fusionados fueron cadenas pesadas de IgG2 o IgG4 humanas con cadenas ligeras kappa o lambda totalmente humanas. Los anticuerpos también pueden ser de otros isotipos humanos, incluyendo cadenas pesadas de IgG1. Los anticuerpos presentaban altas afinidades, presentando normalmente una Kd de desde aproximadamente 10-6 a aproximadamente 10-12 M o inferior, cuando se mide frente a células en técnicas de medición de afinidad basadas en FACS. La afinidad también puede medirse mediante técnicas en fase sólida y en fase de disolución. Los anticuerpos también descritos en el presente documento pueden unirse a CD PDGFR-alfa 20 con una Kd inferior a aproximadamente 500, 400, 300, 200 ó 100 picomolar (pM) e inhiben el crecimiento tumoral. Los anticuerpos pueden unirse a PDGFR-alfa con una Kd inferior a aproximadamente 75, 60, 50, 40, 30, 25, 20, 10 ó 5 pM.

55 Tal como se apreciará, los anticuerpos anti-PDGFR-alfa pueden expresarse en líneas celulares distintas a las líneas celulares de hibridoma. Pueden usarse secuencias que codifican para anticuerpos particulares para transformar una célula huésped de mamífero adecuada. La transformación puede ser mediante cualquier método conocido para introducir polinucleótidos en una célula huésped, incluyendo, por ejemplo empaquetar el polinucleótido en un virus (o en un vector viral) y transducir una célula huésped con el virus (o vector) o mediante procedimientos de transfección conocidos en la técnica, tal como se ejemplifica por las patentes estadounidenses n.os 4.399.216, 4.912.040,

4.740.461 y 4.959.455. El procedimiento de transformación usado depende del huésped que vaya a transformarse. Se conocen bien en la técnica métodos para introducir polinucleótidos heterólogos en células de mamífero e incluyen transfección mediada por dextrano, precipitación con fosfato de calcio, transfección mediada por Polybrene,

65 fusión de protoplastos, electroporación, encapsulación del/de los polinucleótido(s) en liposomas y microinyección directa del ADN en núcleos.

Se conocen bien en la técnica líneas celulares de mamífero disponibles como huéspedes para la expresión e incluyen muchas líneas celulares inmortalizadas disponibles de la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC), incluyendo pero sin limitarse a células de ovario de hámster chino (CHO), células HeLa, células de riñón de hámster

5 recién nacido (BHK), células de riñón de mono (COS), células de carcinoma hepatocelular humano (por ejemplo, Hep G2), células epiteliales de riñón humano 293, y otras líneas celulares varias. Se seleccionan líneas celulares de preferencia particular a través de la determinación de qué líneas celulares tienen altos niveles de expresión y producen anticuerpos con propiedades de unión a PDGFR-alfa constitutivas.

10 Los anticuerpos anti-PDGFR-alfa son útiles en la detección de PDGFR-alfa en muestras de pacientes y por consiguiente son útiles como agentes de diagnóstico para estados de enfermedad tal como se describen en el presente documento. Además, basándose en su capacidad de inhibir el crecimiento tumoral, los anticuerpos antiPDGFR-alfa tienen efectos terapéuticos en el tratamiento de síntomas y estados que resultan de la expresión de PDGFR-alfa. Los anticuerpos y métodos también descritos en el presente documento se refieren al tratamiento de

15 síntomas que resultan del crecimiento tumoral inducido por PDGFR-alfa. Se describe además en el presente documento el uso de los anticuerpos y métodos descritos en el presente documento para tratar enfermedades neoplásicas, tales como cánceres incluyendo, cáncer de pulmón, cáncer de ovarios, cáncer de próstata, cáncer de colon, glioblastoma, melanoma y tumor del estroma gastrointestinal (TEGI).

20 Secuencias de anticuerpos

También se describen en el presente documento los anticuerpos anti-PDGFR-alfa específicos enumerados a continuación en la tabla 1. Esta tabla notifica el número de identificación de cada anticuerpo anti-PDGFR-alfa, junto con el número SEQ ID de regiones variables de los genes de cadena pesada y cadena ligera correspondientes.

25 A cada anticuerpo se le ha facilitado un número de identificación que incluye o bien dos o bien tres números separados por uno o dos puntos decimales. En algunos casos, sólo se enumeran dos números de identificación separados por un punto decimal. Sin embargo, en algunos casos, se prepararon varios clones de un anticuerpo. Aunque los clones tienen las secuencias de ácido nucleico y de aminoácidos idénticas a la secuencia original,

30 también pueden enumerarse por separado, con el número de clon indicado por el número a la derecha del segundo punto decimal. Por tanto, por ejemplo, las secuencias de ácido nucleico y de aminoácidos del anticuerpo 2.84 son idénticas a las secuencias de anticuerpo 2.84.1, 2.84.2 y 2.84.3.

TABLA 1

n.º de ID de Acm:

Secuencia SEQ ID NO:

2.175.3

Secuencia de nucleótidos que codifica para la región variable de la cadena pesada 1

Secuencia de aminoácidos que codifica para la región variable de la cadena pesada

2

Secuencia de nucleótidos que codifica para la región variable de la cadena ligera

3

Secuencia de aminoácidos que codifica para la región variable de la cadena ligera

4

2.451.1.1

Secuencia de nucleótidos que codifica para la región variable de la cadena pesada 5

Secuencia de aminoácidos que codifica para la región variable de la cadena pesada

6

Secuencia de nucleótidos que codifica para la región variable de la cadena ligera O12/JK5

7

Secuencia de aminoácidos que codifica para la región variable de la cadena ligera OI2/JK5

8

Secuencia de nucleótidos que codifica para la región variable de la cadena ligera A201/JK5

21

Secuencia de aminoácidos que codifica para la región variable de la cadena ligera A20/JK5

22

2.449.1.3

Secuencia de nucleótidos que codifica para la región variable de la cadena pesada 9

Secuencia de aminoácidos que codifica para la región variable de la cadena pesada

10

Secuencia de nucleótidos que codifica para la región variable de la cadena ligera

11

Secuencia de aminoácidos que codifica para la región variable de la cadena ligera

12

2.998.2

Secuencia de nucleótidos que codifica para la región variable de la cadena pesada 13

Secuencia de aminoácidos que codifica para la región variable de la cadena pesada

14

Secuencia de nucleótidos que codifica para la región variable de la cadena ligera

15

Secuencia de aminoácidos que codifica para la región variable de la cadena ligera

16

2.84.3

Secuencia de nucleótidos que codifica para la región variable de la cadena pesada 17

Secuencia de aminoácidos que codifica para la región variable de la cadena pesada

18

Secuencia de nucleótidos que codifica para la región variable de la cadena ligera

19

Secuencia de aminoácidos que codifica para la región variable de la cadena ligera

20

2.1576.1. 2

Secuencia de nucleótidos que codifica para la región variable de la cadena pesada 23

Secuencia de aminoácidos que codifica para la región variable de la cadena pesada

24

Secuencia de nucleótidos que codifica para la región variable de la cadena ligera

25

Secuencia de aminoácidos que codifica para la región variable de la cadena ligera

26

3.625.1

Secuencia de nucleótidos que codifica para la región variable de la cadena pesada 27

Secuencia de aminoácidos que codifica para la región variable de la cadena pesada

28

Secuencia de nucleótidos que codifica para la región variable de la cadena ligera

29

Secuencia de aminoácidos que codifica para la región variable de la cadena ligera

30

2.414.2

Secuencia de nucleótidos que codifica para la región variable de la cadena pesada 31

Secuencia de aminoácidos que codifica para la región variable de la cadena pesada

32

Secuencia de nucleótidos que codifica para la región variable de la cadena ligera

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Secuencia de aminoácidos que codifica para la región variable de la cadena ligera

34

2.542.2

Secuencia de nucleótidos que codifica para la región variable de la cadena pesada 35

Secuencia de aminoácidos que codifica para la región variable de la cadena pesada

36

Secuencia de nucleótidos que codifica para la región variable de la cadena ligera

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Secuencia de aminoácidos que codifica para la región variable de la cadena ligera

38

2.737.1.4

Secuencia de nucleótidos que codifica para la región variable de la cadena pesada 39

Secuencia de aminoácidos que codifica para la región variable de la cadena pesada

40

Secuencia de nucleótidos que codifica para la región variable de la cadena ligera

41

Secuencia de aminoácidos que codifica para la región variable de la cadena ligera

42

2.1623.2

Secuencia de nucleótidos que codifica para la región variable de la cadena pesada 43

Secuencia de aminoácidos que codifica para la región variable de la cadena pesada

44

Secuencia de nucleótidos que codifica para la región variable de la cadena ligera

45

Secuencia de aminoácidos que codifica para la región variable de la cadena ligera

46

2.1853.3

Secuencia de nucleótidos que codifica para la región variable de la cadena pesada 47

Secuencia de aminoácidos que codifica para la región variable de la cadena pesada

48

Secuencia de nucleótidos que codifica para la región variable de la cadena ligera

49

Secuencia de aminoácidos que codifica para la región variable de la cadena ligera

50

2.1954.2

Secuencia de nucleótidos que codifica para la región variable de la cadena pesada 51

Secuencia de aminoácidos que codifica para la región variable de la cadena pesada

52

Secuencia de nucleótidos que codifica para la región variable de la cadena ligera

53

Secuencia de aminoácidos que codifica para la región variable de la cadena ligera

54

3.23.2

Secuencia de nucleótidos que codifica para la región variable de la cadena pesada 55

Secuencia de aminoácidos que codifica para la región variable de la cadena pesada

56

Secuencia de nucleótidos que codifica para la región variable de la cadena ligera

57

Secuencia de aminoácidos que codifica para la región variable de la cadena ligera

58

3.87.1.1

Secuencia de nucleótidos que codifica para la región variable de la cadena pesada 59

Secuencia de aminoácidos que codifica para la región variable de la cadena pesada

60

Secuencia de nucleótidos que codifica para la región variable de la cadena ligera

61

Secuencia de aminoácidos que codifica para la región variable de la cadena ligera

62

3.341.1

Secuencia de nucleótidos que codifica para la región variable de la cadena pesada 63

Secuencia de aminoácidos que codifica para la región variable de la cadena pesada

64

Secuencia de nucleótidos que codifica para la región variable de la cadena ligera

65

Secuencia de aminoácidos que codifica para la región variable de la cadena ligera

66

3.472.1.1

Secuencia de nucleótidos que codifica para la región variable de la cadena pesada 67

Secuencia de aminoácidos que codifica para la región variable de la cadena pesada

68

Secuencia de nucleótidos que codifica para la región variable de la cadena ligera

69

Secuencia de aminoácidos que codifica para la región variable de la cadena ligera

70

3.805.1.3

Secuencia de nucleótidos que codifica para la región variable de la cadena pesada 71

Secuencia de aminoácidos que codifica para la región variable de la cadena pesada

72

Secuencia de nucleótidos que codifica para la región variable de la cadena ligera

73

Secuencia de aminoácidos que codifica para la región variable de la cadena ligera

74

3.818.4

Secuencia de nucleótidos que codifica para la región variable de la cadena pesada 75

Secuencia de aminoácidos que codifica para la región variable de la cadena pesada

76

Secuencia de nucleótidos que codifica para la región variable de la cadena ligera

77

Secuencia de aminoácidos que codifica para la región variable de la cadena ligera

78

4.16.2

Secuencia de nucleótidos que codifica para la región variable de la cadena pesada 79

Secuencia de aminoácidos que codifica para la región variable de la cadena pesada

80

Secuencia de nucleótidos que codifica para la región variable de la cadena ligera

81

Secuencia de aminoácidos que codifica para la región variable de la cadena ligera

82

5.1.1.1

Secuencia de nucleótidos que codifica para la región variable de la cadena pesada 83

Secuencia de aminoácidos que codifica para la región variable de la cadena pesada

84

Secuencia de nucleótidos que codifica para la región variable de la cadena ligera

85

Secuencia de aminoácidos que codifica para la región variable de la cadena ligera

86

5.9.3

Secuencia de nucleótidos que codifica para la región variable de la cadena pesada 87

Secuencia de aminoácidos que codifica para la región variable de la cadena pesada

88

Secuencia de nucleótidos que codifica para la región variable de la cadena ligera

89

Secuencia de aminoácidos que codifica para la región variable de la cadena ligera

90

2.796.2

Secuencia de nucleótidos que codifica para la región variable de la cadena pesada 91

Secuencia de aminoácidos que codifica para la región variable de la cadena pesada

92

Secuencia de nucleótidos que codifica para la región variable de la cadena ligera

93

Secuencia de aminoácidos que codifica para la región variable de la cadena ligera

94

3.772.2

Secuencia de nucleótidos que codifica para la región variable de la cadena pesada 95

Secuencia de aminoácidos que codifica para la región variable de la cadena pesada

96

Secuencia de nucleótidos que codifica para la región variable de la cadena ligera

97

Secuencia de aminoácidos que codifica para la región variable de la cadena ligera

98

5.16.1

Secuencia de nucleótidos que codifica para la región variable de la cadena pesada 99

Secuencia de aminoácidos que codifica para la región variable de la cadena pesada

100

Secuencia de nucleótidos que codifica para la región variable de la cadena ligera

101

Secuencia de aminoácidos que codifica para la región variable de la cadena ligera

102

2.2002.3

Secuencia de nucleótidos que codifica para la región variable de la cadena pesada 103

Secuencia de aminoácidos que codifica para la región variable de la cadena pesada

104

Secuencia de nucleótidos que codifica para la región variable de la cadena ligera

105

Secuencia de aminoácidos que codifica para la región variable de la cadena ligera

106

2.2071.1. 3

Secuencia de nucleótidos que codifica para la región variable de la cadena pesada 107

Secuencia de aminoácidos que codifica para la región variable de la cadena pesada

108

Secuencia de nucleótidos que codifica para la región variable de la cadena ligera

109

Secuencia de aminoácidos que codifica para la región variable de la cadena ligera

110

3.23.3

Secuencia de nucleótidos que codifica para la región variable de la cadena pesada 111

Secuencia de aminoácidos que codifica para la región variable de la cadena pesada

112

Secuencia de nucleótidos que codifica para la región variable de la cadena ligera

113

Secuencia de aminoácidos que codifica para la región variable de la cadena ligera

114

3.457.3.1

Secuencia de nucleótidos que codifica para la región variable de la cadena pesada 115

Secuencia de aminoácidos que codifica para la región variable de la cadena pesada

116

Secuencia de nucleótidos que codifica para la región variable de la cadena ligera

117

Secuencia de aminoácidos que codifica para la región variable de la cadena ligera

118

2.84.1

Secuencia de nucleótidos que codifica para la región variable de la cadena pesada 119

Secuencia de aminoácidos que codifica para la región variable de la cadena pesada

120

Secuencia de nucleótidos que codifica para la región variable de la cadena ligera

121

Secuencia de aminoácidos que codifica para la región variable de la cadena ligera

122

2.351.3

Secuencia de nucleótidos que codifica para la región variable de la cadena pesada 123

Secuencia de aminoácidos que codifica para la región variable de la cadena pesada

124

Secuencia de nucleótidos que codifica para la región variable de la cadena ligera

125

Secuencia de aminoácidos que codifica para la región variable de la cadena ligera

126

Se prepararon anticuerpos, tal como se describe en el presente documento en los ejemplos, a través de la utilización de la tecnología XenoMouse®, tal como se describe a continuación. Tales ratones, entonces, pueden producir moléculas de inmunoglobulina y anticuerpos humanos y son deficientes en la producción de moléculas de 5 inmunoglobulina y anticuerpos murinos. Las tecnologías utilizadas para lograr lo mismo se dan a conocer en las patentes, solicitudes y referencias dadas a conocer en la sección de antecedentes en el presente documento. En particular, sin embargo, se da a conocer un modo preferido de producción transgénica de ratones y anticuerpos a partir de los mismos en las solicitudes de patente internacional n.os WO 98/24893, publicada el 11 de junio de 1998 y WO 00/76310, publicada el 21 de diciembre de 2000. Véase también Mendez et al. Nature Genetics 15:146-156

10 (1997).

A través del uso de tal tecnología, se han producido anticuerpos monoclonales totalmente humanos contra una variedad de antígenos. Esencialmente, se inmunizan líneas de ratones XenoMouse® con un antígeno de interés (por ejemplo, PDGFR-alfa), se recuperan células linfáticas (tales como células B) de los ratones hiperinmunizados, y se 15 fusionan los linfocitos recuperados con una línea celular de tipo mieloide para preparar líneas celulares de hibridoma inmortales. Se examinan estas líneas celulares de hibridoma y se seleccionan para identificar líneas celulares de hibridoma que produjeron anticuerpos específicos contra el antígeno de interés. Se proporcionan en el presente documento métodos para la producción de múltiples líneas celulares de hibridoma que producen anticuerpos específicos contra PDGFR-alfa. Además, se proporcionan en el presente documento la caracterización de los

20 anticuerpos producidos por tales líneas celulares, incluyendo análisis de las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de las cadenas pesadas y ligeras de tales anticuerpos.

Alternativamente, en vez de fusionarse a células de mieloma para generar hibridomas, pueden someterse a ensayo directamente células B. Por ejemplo, pueden aislarse células B CD 19+ de ratones XenoMouse® hiperinmunes y

permitirse que proliferen y se diferencien en células plasmáticas que secretan anticuerpos. Entonces se examinan los anticuerpos de los sobrenadantes celulares mediante ELISA para determinar la reactividad frente al inmunógeno PDGFR-alfa. También podrían examinarse los sobrenadantes para determinar inmunorreactividad frente a fragmentos de PDGFR-alfa para mapear adicionalmente los diferentes anticuerpos por la unión a dominios de 5 interés funcional en PDGFR-alfa. Los anticuerpos también pueden examinar otros receptores humanos relacionados y frente a los ortólogos de PDGFR-alfa de rata, ratón y primate no humano, tal como mono cinomolgo, esto último para determinar reactividad cruzada entre especies. Pueden inmortalizarse células B de pocillos que contienen anticuerpos de interés mediante diversos métodos incluyendo fusión para preparar hibridomas o bien a partir de pocillos individuales o bien a partir de pocillos combinados, o mediante infección con VEB o transfección mediante

10 genes de inmortalización conocidos y entonces sembrarse en placa en un medio adecuado. Alternativamente, se aíslan entonces células plasmáticas individuales que secretan anticuerpos con las especificidades deseadas usando un ensayo de placas hemolíticas específico de PDGFR-alfa (véase por ejemplo Babcook et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:7843-48 (1996)). Las células seleccionadas como diana para la lisis son preferiblemente glóbulos rojos de oveja (SRBCs) recubiertos con el antígeno PDGFR-alfa.

15 En presencia de un cultivo de células B que contiene células plasmáticas que secretan la inmunoglobulina de interés y complemento, la formación de una placa de lisis indica lisis mediada por PDGFR-alfa específica de los glóbulos rojos de oveja que rodean la célula plasmática de interés. La célula plasmática específica de antígeno individual en el centro de la placa de lisis puede aislarse y la información genética que codifica para la especificidad del

20 anticuerpo se aísla de la célula plasmática individual. Usando transcripción inversa seguida por PCR (RT-PCR), puede clonarse el ADN que codifica para las regiones variables de cadena pesada y ligera del anticuerpo. Tal ADN clonado puede insertarse entonces además en un vector de expresión adecuado, preferiblemente un casete de vector tal como un pcDNA, más preferiblemente un vector pcDNA tal que contiene los dominios constantes de cadena pesada y ligera de inmunoglobulina. Entonces puede transfectarse el vector generado en células huésped,

25 por ejemplo, células HEK293, células CHO, y cultivarse en medios de nutrientes convencionales modificados según sea apropiado para inducir transcripción, seleccionar transformantes o amplificar los genes que codifican para las secuencias deseadas.

Los anticuerpos anti-PDGFR-alfa pueden tener efectos terapéuticos en el tratamiento de síntomas y estados

30 relacionados con la expresión de PDGFR-alfa. Por ejemplo, los anticuerpos pueden inhibir el crecimiento de células que expresan PDGFR-alfa, inhibiendo de ese modo el crecimiento tumoral, o los anticuerpos pueden asociarse con un agente y suministrar una toxina letal a una célula seleccionada como diana. Los anticuerpos anti-PDGFR-alfa pueden tener efectos terapéuticos en el tratamiento de enfermedades fibróticas, tales como fibrosis cardiaca, pulmonar, hepática, renal o cutánea. Los anticuerpos anti-PDGFR-alfa también pueden tener efectos terapéuticos en

35 el tratamiento de reestenosis o vasculopatía de aloinjertos. Además, los anticuerpos anti-PDGFR-alfa son útiles como agentes de diagnóstico para los estados de enfermedad, especialmente enfermedades neoplásicas, fibróticas y del sistema inmunitario.

Si se desea, el isotipo de un anticuerpo anti-PDGFR-alfa puede cambiarse, por ejemplo para aprovecharse de una

40 propiedad biológica de un isotipo diferente. Por ejemplo, en algunas circunstancias, puede ser deseable en relación con la generación de anticuerpos como anticuerpos terapéuticos frente a PDGFR-alfa que los anticuerpos puedan fijar el complemento y participar en citotoxicidad dependiente del complemento (CDC). Existen varios isotipos de anticuerpos que pueden hacer lo anterior, incluyendo, sin limitación, los siguientes: IgM murina, IgG2a murina, IgG2b murina, IgG3 murina, IgM humana, IgA humana, IgG1 humana e IgG3 humana. Puede ser deseable en relación con

45 la generación de anticuerpos como anticuerpos terapéuticos frente a PDGFR-alfa que los anticuerpos puedan unirse a receptores de Fc en células efectoras y participar en citotoxicidad dependiente de anticuerpos (CDAC). Existen varios isotipos de anticuerpos que pueden hacer lo anterior, incluyendo, sin limitación, los siguientes: IgG2a murina, IgG2b murina, IgG3 murina, IgG1 humana e IgG3 humana. Se apreciará que no es necesario que los anticuerpos que se generan presenten inicialmente tal isotipo sino que, más bien, el anticuerpo tal como se genera puede

50 presentar cualquier isotipo y puede cambiarse el isotipo del anticuerpo posteriormente usando técnicas convencionales que se conocen bien en la técnica. Tales técnicas incluyen el uso de técnicas recombinantes directas (véase por ejemplo, la patente estadounidense n.º 4.816.397), técnicas de fusión intercelular (véanse por ejemplo, las patentes estadounidenses n.os 5.916.771 y 6.207.418), entre otras.

55 A modo de ejemplo, los anticuerpos anti-PDGFR-alfa comentados en el presente documento son anticuerpos totalmente humanos. Si un anticuerpo presentara la unión deseada a PDGFR-alfa, podría cambiarse fácilmente de isotipo para generar un isotipo de IgM humana, IgG1 humana o IgG3 humana, a la vez que presentaría todavía la misma región variable (que define la especificidad del anticuerpo y parte de su afinidad). Tal molécula podría fijar entonces el complemento y participar en CDC y/o podría unirse a receptores de Fc en células efectoras y participar

60 en CDAC.

En la técnica de fusión intercelular, se prepara una célula de mieloma, CHO u otra línea celular que presenta una cadena pesada con cualquier isotipo deseado y se prepara otra célula de mieloma, CHO u otra línea celular que presenta la cadena ligera. Tales células pueden fusionarse posteriormente, y puede aislarse una línea celular que

65 expresa un anticuerpo intacto.

Por consiguiente, como se generan candidatos a anticuerpo que cumplen con los atributos “estructurales” deseados tal como se comentó anteriormente, pueden dotarse generalmente de al menos determinados atributos de los atributos “estructurales” deseados a través de cambio de isotipo.

5 Administración terapéutica y formulaciones

También se describen en el presente documento formulaciones farmacéuticas estériles de anticuerpos anti-PDGFRalfa que son útiles como tratamientos para enfermedades. Tales formulaciones inhibirían el crecimiento celular, tratando de ese modo de manera eficaz estados patológicos en los que, por ejemplo, la expresión de PDGFR-alfa está elevada de forma anómala o células que expresan PDGFR-alfa median estados de enfermedad. Los anticuerpos anti-PDGFR-alfa presentan preferiblemente una afinidad adecuada para unirse específicamente a PDGFR-alfa, y preferiblemente tienen una duración de acción adecuada para permitir la dosificación poco frecuente en seres humanos. Una duración de acción prolongada permitirá programas de dosificación menos frecuente y más conveniente por vías parenterales alternas tales como inyección subcutánea o intramuscular.

15 Pueden crearse formulaciones estériles, por ejemplo, mediante filtración a través de membranas de filtración estériles, antes de o después de liofilización y reconstitución del anticuerpo. El anticuerpo se almacenará habitualmente en forma liofilizada o en disolución. Las composiciones de anticuerpos terapéuticos generalmente se sitúan en un recipiente que tiene un orificio de acceso estéril, por ejemplo, una bolsa de disolución intravenosa o vial que tiene un adaptador que permite la recuperación de la formulación, tal como un tapón perforable por una aguja para inyección hipodérmica. Según

La vía de administración del anticuerpo es según métodos conocidos, por ejemplo, inyección o infusión por vías intravenosa, intraperitoneal, intracerebral, intramuscular, intraocular, intraarterial, intratecal, por inhalación o

25 intralesional, o mediante sistemas de liberación sostenida tal como se indica a continuación. El anticuerpo se administra preferiblemente de manera continua mediante infusión o mediante inyección en bolo.

Una cantidad eficaz de anticuerpo que va a emplearse terapéuticamente dependerá, por ejemplo, de los objetivos terapéuticos, la vía de administración y el estado del paciente. Por consiguiente, se prefiere que el terapeuta ajuste la dosificación y modifique la vía de administración según se requiera para obtener el efecto terapéutico óptimo. Normalmente, el médico clínico administrará el anticuerpo hasta que se alcanza una dosificación que logra el efecto deseado. El progreso de esta terapia se monitoriza fácilmente mediante ensayos convencionales o mediante los ensayos descritos en el presente documento.

35 Pueden prepararse anticuerpos, tal como se describe en el presente documento, en una mezcla con un portador farmacéuticamente aceptable. Esta composición terapéutica puede administrarse por vía intravenosa o a través de la nariz o los pulmones, preferiblemente como un líquido o aerosol de polvo (liofilizado). La composición también puede administrarse por vía parenteral o por vía subcutánea según se desee. Cuando se administra de manera sistémica, la composición terapéutica debe ser estéril, libre de pirógenos y en una disolución aceptable por vía parenteral teniendo en cuenta el pH, la isotonicidad y la estabilidad. Estas condiciones las conocen los expertos en la técnica. Brevemente, se preparan formulaciones de dosificación de los compuestos descritos en el presente documento para el almacenamiento o la administración mezclando el compuesto que tiene el grado de pureza deseado con portadores, excipientes o estabilizadores fisiológicamente aceptables. Tales materiales no son tóxicos para los receptores a las dosificaciones y concentraciones empleadas, e incluyen tampones tales como TRIS HCl,

45 fosfato, citrato, acetato y otras sales de ácidos orgánicos; antioxidantes tales como ácido ascórbico; péptidos de bajo peso molecular (inferior a aproximadamente diez residuos) tales como poliarginina, proteínas, tales como albúmina sérica, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidinona; aminoácidos tales como glicina, ácido glutámico, ácido aspártico o arginina; monosacáridos, disacáridos, y otros hidratos de carbono incluyendo celulosa o sus derivados, glucosa, manosa, o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; alcoholes de azúcar tales como manitol o sorbitol; contraiones tales como sodio y/o tensioactivos no iónicos tales como TWEEN, PLURONICS o polietilenglicol.

Pueden formularse composiciones estériles para inyección según la práctica farmacéutica convencional tal como se describe en Remington: The Science and Practice of Pharmacy (20ª ed, Lippincott Williams & Wilkens Publishers 55 (2003)). Por ejemplo, puede desearse la disolución o suspensión del compuesto activo en un vehículo tal como agua

o aceite vegetal que se produce de manera natural como aceite de sésamo, cacahuete o semilla de algodón o un vehículo graso sintético como oleato de etilo o similar. Pueden incorporarse tampones, conservantes, antioxidantes y similares según la práctica farmacéutica aceptada.

Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que contienen el polipéptido, matrices que están en forma de artículos conformados, películas o microcápsulas. Los ejemplos de matrices de liberación sostenida incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli(metacrilato de 2-hidroxietilo) tal como se describe por Langer et al., J. Biomed Mater. Res., (1981) 15:167-277 y Langer, Chem. Tech., (1982) 12:98-105, o poli(alcohol vinílico)), polilactidas (patente estadounidense n.º 3.773.919, 65 documento EP 58.481), copolímeros de ácido L-glutámico y L-glutamato de gamma-etilo (Sidman et al., Biopolymers, (1983) 22:547-556), etileno-acetato de vinilo no degradable (Langer et al., citado anteriormente),

copolímeros de ácido láctico-ácido glicólico degradables tales como el LUPRON Depot™ (microesferas inyectables compuestas por copolímero de ácido láctico-ácido glicólico y acetato de leuprolida), y ácido poli-D-(-)-3hidroxibutírico (documento EP 133.988).

5 Aunque polímeros tales como etileno-acetato de vinilo y ácido láctico-ácido glicólico permiten la liberación de moléculas durante más de 100 días, determinados hidrogeles liberan proteínas durante periodos de tiempo más cortos. Cuando permanecen en el organismo proteínas encapsuladas durante un largo tiempo, pueden desnaturalizarse o agregarse como resultado de la exposición a humedad a 37ºC, dando como resultado una pérdida de actividad biológica y posibles cambios en la inmunogenicidad. Pueden concebirse estrategias racionales

10 para la estabilización de proteínas dependiendo del mecanismo implicado. Por ejemplo, si se descubre que el mecanismo de agregación es la formación de enlaces S-S intermoleculares a través de intercambio de disulfuro, puede lograrse la estabilización modificando residuos sulfhidrilo, liofilizando a partir de disoluciones ácidas, controlando el contenido en humedad, usando aditivos apropiados y desarrollando composiciones de matriz polimérica específicas.

15 Las composiciones de liberación sostenida también incluyen preparaciones de cristales del anticuerpo suspendidos en formulaciones adecuadas que pueden mantener los cristales en suspensión. Estas preparaciones cuando se inyectan por vía subcutánea o por vía intraperitoneal pueden producir un efecto de liberación sostenida. Otras composiciones también incluyen anticuerpos atrapados en liposomas. Se preparan liposomas que contienen tales

20 anticuerpos mediante métodos conocidos per se: patente estadounidense n.º DE 3.218.121; Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (1985) 82:3688-3692; Hang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (1980) 77:4030-4034; documentos EP 52.322; EP 36.676; EP 88.046; EP 143.949; 142.641; solicitud de patente japonesa 83-118008; patentes estadounidenses n.os 4.485.045 y 4.544.545; y documento EP 102.324.

25 La dosificación de la formulación de anticuerpo para un paciente dado estará determinada por el médico que atiende teniendo en cuenta diversos factores que se sabe que modifican la acción de fármacos incluyendo la gravedad y el tipo de enfermedad, el peso corporal, el sexo, la dieta, el momento y la vía de administración, otras medicaciones y otros factores clínicos relevantes. Pueden determinarse dosificaciones terapéuticamente eficaces mediante métodos

o bien in vitro o bien in vivo.

30 Una cantidad eficaz de los anticuerpos, descritos en el presente documento, que va a emplearse terapéuticamente dependerá, por ejemplo, de los objetivos terapéuticos, la vía de administración y el estado del paciente. Por consiguiente, se prefiere que el terapeuta ajuste la dosificación y modifique la vía de administración según se requiera para obtener el efecto terapéutico óptimo. Una dosificación diaria típica podría oscilar entre

35 aproximadamente 0,001 mg/kg y hasta 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. Normalmente, el médico clínico administrará el anticuerpo terapéutico hasta que se alcanza una dosificación que logra el efecto deseado. El progreso de esta terapia se monitoriza fácilmente mediante ensayos convencionales o mediante los ensayos descritos en el presente documento.

40 Se apreciará que la administración de entidades terapéuticas según las composiciones y los métodos en el presente documento se administrará con portadores, excipientes adecuados, y otros agentes que se incorporan en formulaciones para proporcionar una transferencia, suministro y tolerancia mejorados, y similares. Estas formulaciones incluyen, por ejemplo, polvos, pastas, pomadas, gelatinas, ceras, aceites, lípidos, vesículas que contienen lípidos (catiónicos o aniónicos) (tales como LipofectinTM), conjugados de ADN, pastas de absorción

45 anhidras, emulsiones de aceite en agua y de agua en aceite, emulsiones de Carbowax (polietilenglicoles de diversos pesos moleculares), geles semisólidos y mezclas semisólidas que contienen Carbowax. Cualquiera de las mezclas anteriores puede ser apropiada en tratamientos y terapias según la presente invención, siempre que el principio activo en la formulación no se inactive por la formulación y la formulación sea fisiológicamente compatible y tolerable con la vía de administración. Véase también Baldrick P. “Pharmaceutical excipient development: the need for

50 preclinical guidance.” Regul. Toxicol. Pharmacol. 33(2):210-8 (2000), Wang W. “Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals.” Int. J. Pharm. 203(1-2):1-60 (2000), Charman WN “Lipids, lipophilic drugs, and oral drug delivery-some emerging concepts.” J Pharm Sci .89(8):967-78 (2000), Powell et al. “Compendium of excipients for parenteral formulations” PDA J Pharm Sci Technol. 52:238-311 (1998) y las citas en los mismos para información adicional relacionada con las formulaciones, los excipientes y portadores bien conocidos por los químicos

55 farmacéuticos.

Diseño y generación de otros agentes terapéuticos

Según la presente invención y basándose en la actividad de los anticuerpos que se producen y se caracterizan en el

60 presente documento con respecto a PDGFR-alfa, se facilita el diseño de otras modalidades terapéuticas y se da a conocer a un experto en la técnica. Tales modalidades incluyen, sin limitación, anticuerpos terapéuticos avanzados, tales como anticuerpos biespecíficos, inmunotoxinas, agentes terapéuticos radiomarcados y dominios V de anticuerpos individuales, agente de unión de tipo anticuerpo basado en andamiajes distintos a la región V, generación de péptidos terapéuticos, terapias génicas, particularmente intracuerpos, agentes terapéuticos

65 antisentido y moléculas pequeñas.

Un sitio de unión a antígenos puede proporcionarse por medio de la disposición de CDRs en andamiajes proteicos distintos de anticuerpos, tales como fibronectina o citocromo B, etc. (Haan & Maggos (2004) BioCentury, 12(5): A1-A6; Koide et al. (1998) Journal of Molecular Biology, 284: 1141 - 1151; Nygren et al. (1997) Current Opinion in Structural Biology, 7: 463-469) o aleatorizando o mutando residuos de aminoácido de un bucle dentro de un 5 andamiaje proteico para conferir especificidad de unión para una diana deseada. Se han revisado en detalle andamiajes para la modificación mediante ingeniería genética de sitios de unión novedosos en proteínas por Nygren et al. (Nygren et al. (1997) Current Opinion in Structural Biology, 7: 463-469). Se dan a conocer andamiajes proteicos para miméticos de anticuerpo en el documento WO/0034784, en el que los inventores describen proteínas (miméticos de anticuerpo) que incluyen un dominio de fibronectina tipo III que tiene al menos un bucle aleatorizado. Puede proporcionarse un andamiaje adecuado en el que se injertan una o más CDRs, por ejemplo un conjunto de HCDRs, mediante cualquier elemento de dominio de la superfamilia de genes de inmunoglobulina. El andamiaje puede ser una proteína humana o no humana. Una ventaja de un andamiaje proteico distinto a anticuerpo es que puede proporcionarse un sitio de unión a antígenos en una molécula de andamiaje que es más pequeña y/o más fácil de fabricar que al menos algunas moléculas de anticuerpo. El pequeño tamaño de un elemento de unión puede 15 conferir propiedades fisiológicas útiles, tales como una capacidad de entrar en las células, penetrar de forma profunda en tejidos o alcanzar dianas dentro de otras estructuras, o de unirse dentro de cavidades proteicas del antígeno diana. El uso de sitios de unión a antígenos en andamiajes proteicos distintos a anticuerpo se revisa en Wess, 2004 (Wess, L. en: BioCentury, The Bernstein Report on BioBusiness, 12(42), A1-A7, 2004). Son típicas las proteínas que tienen una estructura principal estable y uno o más bucles variables, en las que la secuencia de aminoácidos del bucle o los bucles se muta específica o aleatoriamente para crear un sitio de unión a antígenos que se une al antígeno diana. Tales proteínas incluyen los dominios de unión a IgG de la proteína A de S. aureus, transferrina, albúmina, tetranectina, fibronectina (por ejemplo, 10º dominio de fibronectina tipo III), lipocalinas así como andamiajes gamma-cristalinos y otros Affilin™ (Scil Proteins). Los ejemplos de otros enfoques incluyen “microcuerpos” sintéticos basados en ciclótidos, pequeñas proteínas que tienen enlaces disulfuro intramoleculares,

25 microproteínas (Versabodies™, Amunix) y proteínas con repetición de anquirina (DARPins, Molecular Partners).

Además de secuencias de anticuerpo y/o un sitio de unión a antígenos, un agente de unión dirigido según la presente invención puede comprender otros aminoácidos, por ejemplo formando un péptido o polipéptido, tal como un dominio plegado o conferir a la molécula otra característica funcional además de la capacidad de unirse al antígeno. Los agentes de unión dirigidos de la invención pueden portar un marcador detectable, o pueden conjugarse con una toxina o una enzima o resto de direccionamiento (por ejemplo, mediante un ligador o enlace de peptidilo). Por ejemplo, un agente de unión dirigido puede comprender un sitio catalítico (por ejemplo, en un dominio enzimático) así como un sitio de unión a antígenos, en el que el sitio de unión a antígenos se une al antígeno y por tanto selecciona como diana el sitio catalítico para el antígeno. El sitio catalítico puede inhibir la función biológica del

35 antígeno, por ejemplo mediante escisión.

En relación con la generación de anticuerpos terapéuticos avanzados, en los que la fijación al complemento es un atributo deseable, puede ser posible eludir la dependencia del complemento para la destrucción celular a través del uso de agentes biespecíficos, inmunotoxinas o radiomarcadores, por ejemplo.

Por ejemplo, pueden generarse anticuerpos biespecíficos que comprenden (i) dos anticuerpos, uno con una especificidad por PDGFR-alfa y otro por una segunda molécula, que se conjugan entre sí, (ii) un anticuerpo individual que tiene una cadena específica para PDGFR-alfa y una segunda cadena específica para una segunda molécula, o (iii) un anticuerpo de cadena sencilla que tiene especificidad tanto por PDGFR-alfa como por la otra

45 molécula. Tales anticuerpos biespecíficos pueden generarse usando técnicas que se conocen bien, por ejemplo, en relación con (i) y (ii) véanse por ejemplo, Fanger et al. Immunol Methods 4:72-81 (1994) y Wright y Harris, citados anteriormente. Y en relación con (iii) véase por ejemplo, Traunecker et al. Int. J. Cancer (Supl.) 7:51-52 (1992). En cada caso, puede realizarse la segunda especificidad según se desee. Por ejemplo, puede realizarse la segunda especificidad para receptores de activación de cadena pesada, incluyendo, sin limitación, CD 16 o CD64 (véase por ejemplo, Deo et al. 18:127 (1997)) o CD89 (véase por ejemplo, Valerius et al. Blood 90:4485-4492 (1997)).

También pueden modificarse anticuerpos para que actúen como inmunotoxinas utilizando técnicas que se conocen bien en la técnica. Véase por ejemplo, Vitetta Immunol Today 14:252 (1993). Véase también la patente estadounidense n.º 5.194.594. En relación con la preparación de anticuerpos radiomarcados, tales anticuerpos 55 modificados también pueden prepararse fácilmente utilizando técnicas que se conocen bien en la técnica. Véase por ejemplo, Junghans et al. en Cancer Chemotherapy and Biotherapy 655-686 (2ª edición, Chafner y Longo, eds., Lippincott Raven (1996)). Véanse también las patentes estadounidenses n.os 4.681.581, 4.735.210, 5.101.827,

5.102.990 (RE 35.500), 5.648.471 y 5.697.902. Resultaría probable que cada una de las inmunotoxinas y moléculas radiomarcadas destruyera células que expresan el dominio de oligomerización de subunidad enzimática multimérica deseada. Puede proporcionarse una composición farmacéutica que comprende una cantidad eficaz del anticuerpo en asociación con un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable.

Un anticuerpo anti-PDGFR-alfa puede unirse a un agente (por ejemplo, radioisótopo, composición farmacéutica o una toxina). Preferiblemente, pueden usarse tales anticuerpos para el tratamiento de enfermedades, tales 65 enfermedades pueden relacionarse con células que expresan PDGFR-alfa o células que sobreexpresan PDGFRalfa. Por ejemplo, se contempla que el fármaco presente la propiedad farmacéutica seleccionada del grupo de

agentes antimitóticos, alquilantes, antimetabolito, antiangiogénicos, apoptóticos, alcaloides, de COX-2 y antibióticos y combinaciones de los mismos. El fármaco puede seleccionarse del grupo de mostazas de nitrógeno, derivados de etilenimina, alquilsulfonatos, nitrosoureas, triazenos, análogos de ácido fólico, antraciclinas, taxanos, inhibidores de COX-2, análogos de pirimidina, análogos de purina, antimetabolitos, antibióticos, enzima, epipodofilotoxinas,

5 complejos de coordinación de platino, alcaloides de la vinca, ureas sustituidas, derivados de metilhidrazina, depresores corticosuprarrenales, antagonistas, endostatina, taxoles, camptotecinas, oxaliplatino, doxorubicinas y sus análogos, y una combinación de los mismos.

Los ejemplos de toxinas incluyen además gelonina, exotoxina de Pseudomonas (PE), PE40, PE38, toxina diftérica, ricina, ricina, abrina, toxina alfa, saporina, ribonucleasa (ARNasa), ADNasa I, enterotoxina A estafilocócica, proteína antiviral de hierba carmín, gelonina, endotoxina de Pseudomonas, así como derivados, combinaciones y modificaciones de las mismas.

Los ejemplos de radioisótopos incluyen emisores gamma, emisores de positrones y emisores de rayos X que

15 pueden usarse para localización y/o terapia, y emisores beta y emisores alfa que pueden usarse para terapia. Los radioisótopos descritos previamente como útiles para diagnóstico, pronóstico y estadificación también son útiles para terapéutica. Los ejemplos no limitativos de agentes anticancerígenos o antileucémicos incluyen antraciclinas tales como doxorubicina (adriamicina), daunorubicina (daunomicina), idarubicina, detorubicina, carminomicina, epirubicina, esorubicina, y derivados de morfolino y sustituidos, combinaciones y modificaciones de los mismos. Los agentes farmacéuticos a modo de ejemplo incluyen cis-platino, taxol, calicheamicina, vincristina, citarabina (Ara-C), ciclofosfamida, prednisona, daunorubicina, idarubicina, fludarabina, clorambucilo, interferón alfa, hidroxiurea, temozolomida, talidomida y bieomicina, y derivados, combinaciones y modificaciones de los mismos. Preferiblemente, el agente anticancerígeno o antileucémico es doxorubicina, morfolinodoxorubicina o morfolinodaunorubicina.

25 Los anticuerpos de la invención también engloban anticuerpos que tienen semividas (por ejemplo, semividas séricas) en un mamífero, preferiblemente un ser humano, mayores que la de un anticuerpo sin modificar. Dicha semivida del anticuerpo puede ser mayor que aproximadamente 15 días, mayor que aproximadamente 20 días, mayor que aproximadamente 25 días, mayor que aproximadamente 30 días, mayor que aproximadamente 35 días, mayor que aproximadamente 40 días, mayor que aproximadamente 45 días, mayor que aproximadamente 2 meses, mayor que aproximadamente 3 meses, mayor que aproximadamente 4 meses, o mayor que aproximadamente 5 meses. Las semividas aumentadas de los anticuerpos de la presente invención o fragmentos de los mismos en un mamífero, preferiblemente un ser humano, dan como resultado un mayor título en suero de dichos anticuerpos o fragmentos de anticuerpo en el mamífero, y por tanto, reducen la frecuencia de la administración de dichos

35 anticuerpos o fragmentos de anticuerpo y/o reduce la concentración de dichos anticuerpos o fragmentos de anticuerpo que van a administrarse. Pueden generarse anticuerpos o fragmentos de los mismos que tienen semividas in vivo aumentadas, mediante técnicas conocidas por los expertos en la técnica. Por ejemplo, pueden generarse anticuerpos o fragmentos de los mismos con semividas in vivo aumentadas mediante la modificación (por ejemplo, sustitución, deleción o adición) de residuos de aminoácido identificados como implicados en la interacción entre el dominio Fc y el receptor FcRn (véanse, por ejemplo, las publicaciones internacionales n.os WO 97/34631 y WO 02/060919. Pueden generarse anticuerpos o fragmentos de los mismos con semividas in vivo aumentadas mediante la unión a dichos anticuerpos o fragmentos de anticuerpo de moléculas de polímero tales como polietilenglicol (PEG) de alto peso molecular. El PEG puede unirse a dichos anticuerpos o fragmentos de anticuerpo con o sin un ligador multifuncional o bien a través de conjugación específica del sitio del PEG al extremo N-o C

45 terminal de dichos anticuerpos o fragmentos de anticuerpo o bien a través de grupos épsilon-amino presentes en residuos de lisina. Se usará la derivatización de polímeros lineales o ramificados que da como resultado una pérdida mínima de actividad biológica. Se monitorizará estrechamente el grado de conjugación mediante SDS-PAGE y espectrometría de masas para garantizar la conjugación apropiada de moléculas de PEG a los anticuerpos. Puede separarse el PEG sin reaccionar de los conjugados de anticuerpo-PEG mediante, por ejemplo, cromatografía de exclusión molecular o de intercambio iónico.

Tal como apreciará un experto en la técnica, aunque los valores de afinidad pueden ser importantes, otros factores pueden ser tan importantes o más, dependiendo de la función particular del anticuerpo. Por ejemplo, para una inmunotoxina (toxina asociada con un anticuerpo), el acto de la unión del anticuerpo a la diana puede ser útil; sin

55 embargo, puede ser la internalización de la toxina en la célula lo que es el resultado final deseado. Como tal, pueden ser deseables anticuerpos con una alta internalización porcentual en esas situaciones. Por tanto, pueden contemplarse anticuerpos con una alta eficacia en la internalización. Puede medirse una alta eficacia de internalización como un tanto por ciento de anticuerpo internalizado, y puede ser de desde un valor bajo hasta del 100%. Por ejemplo, el 0,1-5, 5-10, 10-20, 20-30, 30-40, 40-45, 45-50, 50-60, 60-70, 70-80, 80-90, 90-99 y el 99100% puede ser una alta eficacia. Tal como apreciará un experto en la técnica, la eficacia deseable puede ser diferente dependiendo de, por ejemplo, el agente asociado, la cantidad de anticuerpo que puede administrarse a una zona, los efectos secundarios del complejo anticuerpo-agente, el tipo (por ejemplo, el tipo de cáncer) y la gravedad del problema que va a tratarse.

65 Los anticuerpos dados a conocer en el presente documento pueden proporcionar un kit de ensayo para la detección de la expresión de PDGFR-alfa en tejidos o células de mamífero con el fin de examinar una enfermedad o trastorno asociado con cambios en la expresión de PDGFR-alfa. El kit comprende un anticuerpo que se une a PDGFR-alfa y medios para indicar la reacción del anticuerpo con el antígeno, si está presente.

También se describe en el presente documento, se proporciona un artículo de fabricación que comprende un

5 recipiente, que comprende una composición que contiene un anticuerpo anti-PDGFR-alfa, y un prospecto o etiqueta que indica que la composición puede usarse para tratar una enfermedad mediada por la expresión de PDGFR-alfa. Preferiblemente, un mamífero y, más preferiblemente, un ser humano, recibe el anticuerpo anti-PDGFR-alfa.

Combinaciones

El tratamiento antineoplásico definido en el presente documento puede aplicarse como una sola terapia o puede implicar, además de los compuestos de la invención, cirugía convencional, trasplantes de médula ósea y células madre periféricas o radioterapia o quimioterapia. Tal quimioterapia puede incluir una o más de las siguientes categorías de agentes antitumorales:

(i) otros fármacos antiproliferativos/antineoplásicos y combinaciones de los mismos, tal como se usan en oncología médica, tales como agentes alquilantes (por ejemplo, cis-platino, oxaliplatino, carboplatino, ciclofosfamida, mostaza de nitrógeno, melfalán, clorambucilo, busulfano, temozolamida y nitrosoureas); antimetabolitos (por ejemplo, gemcitabina y antifolatos tales como fluoropirimidinas como 5-fluorouracilo y tegafur, raltitrexed, metotrexato, arabinósido de citosina e hidroxiurea); antibióticos antitumorales (por ejemplo, antraciclinas como adriamicina, bleomicina, doxorubicina, daunomicina, epirubicina, idarubicina, mitomicina-C, dactinomicina y mitramicina); agentes antimitóticos (por ejemplo, alcaloides de la vinca como vincristina, vinblastina, vindesina y vinorelbina y taxoides como taxol y Taxotere e inhibidores de polocinasas); e inhibidores de topoisomerasa (por ejemplo, epipodofilotoxinas como etopósido y tenipósido, amsacrina, topotecán y camptotecina);

(ii) agentes citostáticos tales como antiestrógenos (por ejemplo, tamoxifeno, fulvestrant, torernifeno, raloxifeno, droloxifeno y yodoxifeno), antiandrógenos (por ejemplo, bicalutamida, flutamida, nilutamida y acetato de ciproterona), antagonistas de LHRH o agonistas de LHRH (por ejemplo, goserelina, leuprorelina y buserelina), progestágenos (por ejemplo, acetato de megestrol), inhibidores de aromatasa (por ejemplo, como anastrozol, letrozol, vorazol y exemestano) e inhibidores de 5α-reductasa tales como finasterida;

(iii) agentes contra la invasión (por ejemplo, inhibidores de la familia de cinasas del c-Src como 4-(6-cloro-2,3metilendioxianilino)-7-[2-(4-metilpiperazin-1-il)etoxi]-5-tetrahidropiran-4-iloxiquinazolina (AZD0530; solicitud de patente internacional WO 01/94341) y N-(2-cloro-6-metilfenil)-2-{6-[4-(2-hidroxietil)piperazin-1-il]-2-metilpirimidin-4

35 ilamino}tiazol-5-carboxamida (dasatinib, BMS-354825; J. Med. Chem., 2004, 47, 6658-6661), e inhibidores de metaloproteinasas como marimastat, inhibidores de la función del receptor del activador del plasminógeno tipo urocinasa o inhibidores de catepsinas, inhibidores de serina proteasas, por ejemplo, matriptasa, hepsina, urocinasa, inhibidores de heparanasa);

(iv) agentes citotóxicos tales como fludarabina, 2-clorodesoxiadenosina, clorambucilo o doxorubicina y combinación de los mismos tal como fludarabina + ciclofosfamida, CVP: ciclofosfamida + vincristina + prednisona, ACVBP: doxorubicina + ciclofosfamida + vindesina + bleomicina + prednisona, CHOP: ciclofosfamida + doxorubicina + vincristina + prednisona, CNOP: ciclofosfamida + mitoxantrona + vincristina + prednisona, m-BACOD: metotrexato + bleomicina + doxorubicina + ciclofosfamida + vincristina + dexametasona + leucovorina, MACOP-B: metotrexato +

45 doxorubicina + ciclofosfamida + vincristina + dosis fija de prednisona + bleomicina + leucovorina, o ProMACE CytaBOM: prednisona + doxorubicina + ciclofosfamida + etopósido + citarabina + bleomicina + vincristina + metotrexato + leucovorina.

(v) inhibidores de la función de factores de crecimiento, por ejemplo tales inhibidores incluyen anticuerpos contra factores de crecimiento y anticuerpos contra receptores de factores de crecimiento (por ejemplo, el anticuerpo antierbB2 trastuzumab [Herceptin™], el anticuerpo anti-EGFR panitumumab, el anticuerpo anti-erbB1 cetuximab [Erbitux, C225] y cualquier anticuerpo contra factores de crecimiento o receptores de factores de crecimiento dado a conocer por Stern et al. Critical reviews in oncology/haematology, 2005, vol. 54, págs. 11-29); tales inhibidores también incluyen inhibidores de tirosina cinasas, por ejemplo inhibidores de la familia del factor de crecimiento 55 epidérmico (por ejemplo, inhibidores de tirosina cinasas de la familia de EGFR tales como N-(3-cloro-4-fluorofenil)-7metoxi-6-(3-morfolinopropoxi)quinazolin-4-amina (gefitinib, ZD 1839), N-(3-etinilfenil)-6,7-bis(2metoxietoxi)quinazolin-4-amina (erlotinib, OSI-774) y 6-acrilamido-N-(3-cloro-4-fluorofenil)-7-(3-morfolinopropoxi)quinazolin-4-amina (CI 1033), inhibidores de tirosina cinasas de erbB2 tales como lapatinib, inhibidores de la familia del factor de crecimiento de hepatocitos, inhibidores de la familia del factor de crecimiento derivado de plaquetas tales como imatinib, inhibidores de serina/treonina cinasas (por ejemplo, inhibidores de la señalización Ras/Raf tales como inhibidores de farnesil transferasa, por ejemplo sorafenib (BAY 43-9006)), inhibidores de la señalización celular a través de MEK y/o AKT cinasas, inhibidores de la familia del factor de crecimiento de hepatocitos, inhibidores de c-kit, inhibidores de abl cinasas, inhibidores de cinasas del receptor de IGF (factor de crecimiento similar a insulina), inhibidores de aurora cinasas (por ejemplo, AZD1162, PH739358, VX-680, MLN8054, R763,

65 MP235, MP529, VX-528 y AX39459), inhibidores de cinasas dependientes de ciclina tales como inhibidores de CDK2 y/o CDK4 e inhibidores de proteínas de señalización de supervivencia tales como Bcl-2, Bcl-XL por ejemplo ABT-737;

(vi) agentes antiangiogénicos tales como los que inhiben los efectos del factor de crecimiento endotelial vascular, [por ejemplo el anticuerpo anti-factor de crecimiento de células endoteliales vasculares bevacizumab (Avastin™) e

5 inhibidores de tirosina cinasas receptoras de VEGF tales como 4-(4-bromo-2-fluoroanilino)-6-metoxi-7-(1metilpiperidin-4-ilmetoxi)quinazolina (ZD6474; ejemplo 2 en el documento WO 01/32651), 4-(4-fluoro-2-metilindol-5iloxi)-6-metoxi-7-(3-pirrolidin-1-ilpropoxi)quinazolina (AZD2171; ejemplo 240 en el documento WO 00/47212), vatalacaib (PTK787; documento WO 98/35985) y SU11248 (sunitinib; documento WO 01/60814), compuestos tales como los dados a conocer en las solicitudes de patente internacional WO97/22596, WO 97/30035, WO 97/32856, WO 98/13354, WO00/47212 y WO01/32651 y compuestos que actúan mediante otros mecanismos (por ejemplo, linomida, inhibidores de la función de la integrina αvβ3 y angiostatina)] o factor estimulante de colonias 1 (CSF1) o receptor de CSF1;

(vii) agentes de daño vascular tales como combretastatina A4 y los compuestos dados a conocer en las solicitudes 15 de patente internacional WO 99/02166, WO 00/40529, WO 00/41669, WO 01/92224, WO 02/04434 y WO 02/08213;

(viii) terapias antisentido, por ejemplo las que se dirigen a las dianas enumeradas anteriormente, tales como G-3139 (Genasense), un anticuerpo anti-bcl2 antisentido;

(ix) enfoques de terapia génica, incluyendo por ejemplo enfoques para reemplazar genes aberrantes tales como p53 aberrante o BRCA 1 o BRCA2 aberrante, enfoques GDEPT (terapia con profármaco enzimático dirigido por genes) tales como los que usan citosina desaminasa, timidina cinasa o una enzima nitrorreductasa bacteriana y enfoques para aumentar la tolerancia por parte del paciente a la quimioterapia o radioterapia tal como terapia con genes con resistencia a múltiples fármacos; y

(x) enfoques de inmunoterapia, incluyendo por ejemplo el tratamiento con alemtuzumab (campath-1H™), un anticuerpo monoclonal dirigido a CD52, o tratamiento con anticuerpos dirigidos a CD22, enfoques ex vivo e in vivo para aumentar la inmunogenicidad de células tumorales del paciente, transfección con citocinas tales como interleucina 2, interleucina 4 o factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos, enfoques para disminuir la anergia de células T tales como tratamiento con anticuerpos monoclonales que inhiben la función de CTLA-4, enfoques que usan células inmunitarias transfectadas tales como células dendríticas transfectadas con citocinas, enfoques que usan líneas celulares tumorales transfectadas con citocinas y enfoques que usan anticuerpos antiidiotípicos.

35 (xi) inhibidores de la degradación de proteínas tales como inhibidor del proteasoma tal como Velcade (bortezomid).

(xii) enfoques terapéuticos-bioterapéuticos, por ejemplo, los que usan péptidos o proteínas (tales como anticuerpos o constructos de dominios de receptores externos solubles) que o bien secuestran ligandos del receptor, o bien bloquean la unión de ligandos al receptor o bien disminuyen la señalización del receptor (por ejemplo, debido a una degradación potenciada del receptor o niveles de expresión disminuidos).

Tal tratamiento conjunto puede lograrse por medio de la dosificación simultánea, secuencial o por separado de los componentes individuales del tratamiento. Tales productos de combinación emplean los compuestos de esta invención, o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, dentro del intervalo de dosificación descrito

45 anteriormente en el presente documento y el otro agente farmacéuticamente activo dentro de su intervalo de dosificación aprobado.

Los tratamientos antineoplásicos descritos en el presente documento pueden combinarse con agentes que inhiben los efectos del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), (por ejemplo, el anticuerpo anti-factor de crecimiento de células endoteliales vasculares bevacizumab (Avastin®), anticuerpos anti-receptor del factor de crecimiento endotelial vascular tales como anticuerpos anti-KDR y anticuerpos anti-flt1, compuestos tales como los dados a conocer en las solicitudes de patente internacional WO 97/22596, WO 97/30035, WO 97/3285, WO 98/13354, WO00/47212 y WO01/32651) y compuestos que actúan mediante otros mecanismos (por ejemplo, linomida, inhibidores de la función de la integrina αvβ3 y angiostatina); los tratamientos antiangiogénicos descritos

55 en el presente documento pueden ser agentes combinados que inhiben la actividad tirosina cinasa del receptor del factor de crecimiento endotelial vascular, KDR (por ejemplo, AZD2171 o AZD6474). Pueden encontrarse detalles adicionales sobre AZD2171 en Wedge et al (2005) Cancer Research. 65(10):4389-400. Pueden encontrarse detalles adicionales sobre AZD6474 en Ryan & Wedge (2005) British Journal of Cancer. 92 Supl. 1:S6-13. Los anticuerpos totalmente humanos 1.1.2, 1.5.3, 2.1.2 pueden combinarse solos o en combinación con Avastin™, AZD2171 o AZD6474.

Tal tratamiento conjunto puede lograrse por medio de la dosificación simultánea, secuencial o por separado de los componentes individuales del tratamiento. Tales productos de combinación emplean los compuestos de esta invención, o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, dentro del intervalo de dosificación descrito

65 anteriormente en el presente documento y el otro agente farmacéuticamente activo dentro de su intervalo de dosificación aprobado.

Ejemplos

Se proporcionan los siguientes ejemplos, incluyendo los experimentos llevados a cabo y los resultados obtenidos 5 con fines de ilustración únicamente y no han de interpretarse como limitativos con las enseñanzas en el presente documento.

EJEMPLO 1

INMUNIZACIÓN Y TITULACIÓN

Inmunógeno

Se obtuvo el dominio extracelular de PDGFR-alfa soluble recombinante de R&D Systems (Minneapolis, MN. n.º de

15 catálogo: 322-PR/CF) y se usó como inmunógeno. Además, se usó PDGFR-alfa humano recombinante expresado en células BHK (de riñón de hámster recién nacido) como antígeno para la inmunización. Se obtuvieron las células BHK de la Colección Americana de Cultivos Tipo, n.º de catálogo CCL-10.

Inmunización

Se desarrollaron anticuerpos monoclonales frente a PDGFR-alfa mediante inmunización secuencial de ratones XenoMouse® (cepas XenoMouse: XMG2 (IgG2 kappa) y XM3C-1 (IgG4 kappa) Amgen, Inc. Fremont, CA) con el dominio extracelular de PDGFR-alfa (R&D Systems, n.º de catálogo: 322-PR/CF). Se inmunizaron los animales XenoMouse a través de la vía en la almohadilla de la pata para todas las inyecciones mediante medios

25 convencionales. El volumen total de cada inyección era de 50 μl por ratón que contenía 10 microgramos de dominio extracelular de PDGFR-alfa, 25 μl por almohadilla de la pata. Los adyuvantes incluían Titennax GoldTM (Sigma, cat. T2684), adyuvante de gel de fosfato de aluminio, HCL Biosector (cat. 1452-250) y adyuvante de ratón ImmuneEasy (qCpG, n.º de cat. Qiagen 303105). Se administró la primera inyección con Titermax GoldTM (día 0). Se administraron inyecciones de refuerzo como 5 ul de adyuvante de gel de fosfato de aluminio (5 ul) y qCpG (15 ul) junto con 10 ug de dominio extracelular de PDGFR-alfa en los días 3, 6, 10, 13, 20, 24, 27, 31 y 34.

EJEMPLO 2

RECUPERACIÓN DE LINFOCITOS, AISLAMIENTOS DE CÉLULAS B, FUSIONES Y GENERACIÓN DE 35 HIBRIDOMAS

Se sacrificaron los ratones inmunizados mediante dislocación cervical y se recogieron los ganglios linfáticos de drenaje y se reunieron de cada cohorte. Se disociaron las células linfoides mediante trituración en DMEM para liberar las células de los tejidos, y se suspendieron las células en DMEM. Se contaron las células, y se añadieron 0,9 ml de DMEM por 100 millones de linfocitos al sedimento celular para resuspender las células suavemente pero de forma completa. Usando 100 μl de perlas magnéticas CD90+ por 100 millones de células, se marcaron las células incubando las células con las perlas magnéticas a 4ºC durante 15 minutos. Se cargó la suspensión de células marcadas magnéticamente que contenía hasta 108 células positivas (o hasta 2x109 células totales) sobre una columna LS+ y se lavó la columna con DMEM. Se recogió el efluente total como la fracción negativa para CD90 (se

45 esperaba que la mayor parte de estas células fuesen células B).

Se realizó una fusión mezclando células B enriquecidas lavadas de lo anterior y células de mieloma no secretoras P3X63Ag8.653 adquiridas de la ATCC (n.º de cat. CRL 1580) (Kearney et al, J. Immunol. 123, 1979, 1548-1550) a una razón de 1:1. Se sedimentó suavemente la mezcla celular mediante centrifugación a 800 x g. Tras la retirada por completo del sobrenadante, se trataron las células con 2-4 ml de disolución Pronase (CalBiochem, n.º de cat. 53702; 0,5 mg/ml en PBS) durante no más de 2 minutos. Entonces se añadieron 3-5 ml de FBS para terminar la actividad enzimática y se ajustó la suspensión hasta un volumen total de 40 ml usando disolución de electrofusión celular, ECFS (sacarosa 0,3 M, Sigma, n.º de cat. S7903, acetato de magnesio 0,1 mM, Sigma, n.º de cat. M2545, acetato de calcio 0,1 mM, Sigma, n.º de cat. C4705). Se retiró el sobrenadante tras centrifugación y se resuspendieron las

55 células en 40 ml de ECFS. Se repitió esta etapa de lavado y se resuspendieron las células de nuevo en ECFS hasta una concentración de 2x106 células/ml.

Se realizó la electrofusión celular usando un generador de fusión, modelo ECM2001, Genetronic, Inc., San Diego, CA. El tamaño de la cámara de fusión usado fue de 2,0 ml, usando los siguientes ajustes de los instrumentos: condición de alineación: tensión: 50 V, tiempo: 50 segundos; ruptura de membrana a: tensión: 3000 V, tiempo: 30 μsegundos; tiempo de mantenimiento tras la fusión: 3 segundos.

Tras la ECF, se retiraron cuidadosamente las suspensiones celulares de la cámara de fusión en condiciones estériles y se transfirieron a un tubo estéril que contenía el mismo volumen de medio de cultivo de hibridoma (DMEM 65 (JRH Biosciences), FBS al 15% (Hyclone), complementado con L-glutamina, pen./estrep., OPI (oxaloacetato, piruvato, insulina bovina) (todos de Sigma) e IL-6 (Boehringer Mannheim). Se incubaron las células durante 15

30 minutos a 37ºC y entonces se centrifugaron a 400 x g (1000 rpm) durante cinco minutos. Se resuspendieron suavemente las células en un pequeño volumen de medio de selección de hibridoma (medio de cultivo de hibridoma complementado con HA 0,5x (Sigma, n.º de cat. A9666)), y se ajustó el volumen apropiadamente con más medio de selección de hibridoma, basándose en un cultivo en placa final de 5x106 células B totales por placa de 96 pocillos y

5 200 μl por pocillo. Se mezclaron suavemente las células y se pipetearon a placas de 96 pocillos y se permitió que creciesen. En el día 7 ó 10, se retiró la mitad del medio, y volvieron a alimentarse las células con medio de selección de hibridoma.

Examen mediante ELISA:

Para el análisis de ELISA, se usó PDGFR-alfa humano recombinante (R&D Systems, n.º de cat. 322-PR/CF), a una concentración de 4 ug/ml, como reactivo de captura. Se recubrieron placas para ELISA con PDGFR-alfa humano recombinante en un volumen de 50 μl/pocillo en tampón de recubrimiento de antígeno (tampón carbonato 0,1 M, pH 9,6 NaHCO3 (PM 84) 8,4 g/l) y se incubó durante la noche a 4ºC. Al día siguiente, se lavó la placa para ELISA 3

15 veces con tampón de lavado (Tween 20 al 0,05% en PBS 1x) y posteriormente se bloqueó con 200 μl/pocillo de tampón de bloqueo (BSA al 1%, Tween 20 al 0,1%, timerosal al 0,01% en PBS 1x) durante 1 hora a temperatura ambiente. Tras la finalización de la etapa de bloqueo, se incubaron 50 μl/pocillo de sobrenadante de hibridoma a temperatura ambiente durante 2 horas. Tras la incubación, se lavó la placa para ELISA 3 veces con tampón de lavado. Tras la etapa de lavado, se añadieron 50 μl /pocillo de anticuerpo de detección a los pocillos y se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora. Posteriormente, se lavó la placa para ELISA 3 veces con tampón de lavado y se añadió sustrato TMB (50 μl/pocillo). Tras la adición de la disolución de detención (50 μl/pocillo), se leyó la placa para ELISA a 650 nm con un lector de placas para ELISA. Posteriormente se evaluaron mediante FMAT y FACS los sobrenadantes considerados positivos mediante ELISA.

25 EJEMPLO 3

SELECCIÓN DE ANTICUERPOS CANDIDATOS MEDIANTE FMAT Y FACS

Tras 14 días de cultivo, se examinaron los sobrenadantes de hibridoma para determinar anticuerpos monoclonales específicos para PDGFR-alfa mediante tecnología de ensayo de microvolúmenes fluorométricos (FMAT) mediante examen frente a o bien la línea celular de osteosarcoma humano MG-63 o bien células HEK293 recombinantes que se transfectaron con PDGFR-alfa humano y se sometieron a contraexamen frente a células HEK293 parentales.

Se retiraron los sobrenadantes de cultivo de los pocillos de crecimiento de células de hibridoma positivas basándose

35 en el examen primario y se suspendieron las células de hibridoma positivas para PDGFR-alfa con nuevo medio de cultivo de hibridoma y se transfirieron a placas de 24 pocillos. Tras dos días en cultivo, estos sobrenadantes estaban listos para un examen de confirmación secundario. En el examen de confirmación secundario, se examinaron mediante FACS los positivos en el primer examen con dos conjuntos o tres conjuntos de anticuerpos de detección usados por separado: GAH-Gamma Cy5 1,25 ug/ml (n.º JIR 109-176-098) para la detección de cadena gamma humana; GAH-Kappa PE 1,2 ug/ml (n.º S.B. 2063-09) para la detección de cadena ligera kappa humana y GAHlambda PE 1,25 ug/ml (n.º S.B. 2073-09) para la detección de cadena ligera lambda humana con el fin de confirmar que los anticuerpos anti-PDGFR-alfa eran totalmente humanos.

EJEMPLO 4

45 ENSAYO DE FOSFORILACIÓN DE TIROSINAS DE PDGFR

Se interrogaron 791 líneas de anticuerpos usando un ensayo de fosforilación de tirosinas de PDGFR (pTyr) para determinar si las líneas de anticuerpos inhibían la fosforilación de PDGFR-alfa en células tumorales.

Brevemente, se sembraron células de osteosarcoma humano MG-63 a 10.000 células por pocillo en una placa de ensayo para FMAT de 96 pocillos en 100 μl de medios de privación de nutrientes (carbón vegetal al 1%/FBS tratado con dextrano) y se incubó a 37ºC durante aproximadamente 20 horas. Se retiraron los medios de privación de nutrientes y se añadieron 37,5 μl de medios a todos los pocillos que recibieron muestra y se añadieron 12,5 μl a los 55 pocillos que recibieron control (Acm de ratón anti-PDGFRa (BD PharMingen n.º de catálogo 556001) o IgG2a de ratón (Serotech, concentración final 2X)) y se incubó durante 30 minutos a 37ºC. Se añadieron 50 μl de PDGF-AA (R&D) en medios de ensayo al 1% a una concentración final 2X (50 ng/ml) a todas las placas y se añadieron medios a la columna 12 de la placa de control. Se incubaron las placas durante 10 minutos a 37ºC. Se retiraron los medios y se añadieron 100 μl de formaldehído al 3,7% en PBS/BSA al 3% y se incubó durante 20 minutos a temperatura ambiente. Se lavaron las placas dos veces con PBS y se añadieron 100 μl de tampón de permeabilización (Triton-X al 0,1% en BSA al 3%/PBS) a cada pocillo, se incubaron a temperatura ambiente durante 10 minutos, y se desecharon. Se añadieron 100 μl de peróxido de hidrógeno al 0,6% en PBS/BSA al 3% para inactivar cualquier actividad peroxidasa endógena y se incubó a temperatura ambiente durante 20 minutos. Se lavaron las placas tres veces con PBS/Tween-20 al 0,1% y se bloquearon con 100 μl de FBS al 10% en PBS/Tween-20 al 0,1%. Se 65 incubaron las placas durante 1 hora a temperatura ambiente, se retiró el tampón de bloqueo, y se añadieron 50 μl de

anticuerpo anti-fosfo-PDGFa (sc-12910-R) (1 μg/ml) a cada pocillo en FBS al 10%/PBS-T. Se incubaron las placas durante 2 horas a temperatura ambiente, entonces se lavaron tres veces con PBST, se empaparon durante 5 minutos entre cada lavado. Se añadieron 50 μl de anticuerpo secundario de cabra anti-IgGFc de conejo-HRP diluido con tampón de bloqueo y se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora. Se lavaron las placas tres veces

5 durante 5 minutos con PBST y se taparon secas. Se añadieron 50 μl de reactivo de ECL (LumiGLO Reserve, n.º de catálogo KPL 54-71-01) y se leyeron inmediatamente las ULR. Se lavaron las placas dos veces con PBST y se taparon secas. Se congelaron entonces las placas a -80ºC durante 30-60 minutos. Se llevaron las placas a temperatura ambiente y se añadieron 100 μl de CyQuant a cada pocillo. Se leyeron las placas a 485 nm de excitación y 530 nm de emisión en un lector de fluorescencia.

10 Se seleccionaron 103 líneas basándose en una neutralización mayor que o igual al 90% en el ensayo de pTyr, es decir las líneas de anticuerpos seleccionadas inhibían la fosforilación de tirosinas del receptor de PDGF alfa en más de o igual al 90%. (Datos no mostrados.)

15 EJEMPLO 5

ANÁLISIS DE AFINIDAD Y CONCENTRACIÓN DE ANÁLISIS DE SOBRENADANTES DE HIBRIDOMA CON ALTO CONTENIDO EN ANTÍGENO (HA) / ANTÍGENO LIMITADO (LA)

20 Se interrogaron 103 líneas de anticuerpos usando un análisis con alto contenido en antígeno (HA) / antígeno limitado (LA) tal como se describe a continuación. HA es una reacción dependiente de la concentración de anticuerpo, y es por tanto una medida de la concentración de anticuerpo. LA es principalmente una reacción dependiente de la afinidad de anticuerpo y por tanto, puede ser una medida de la afinidad de anticuerpo.

25 Ensayo de cuantificación de alto contenido en antígeno

Brevemente, se recubrieron las placas para ELISA con una mayor cantidad de antígeno PDGFR-alfa humano (R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN n.º de cat. 322-PR-050/CF) en comparación con el ensayo de cuantificación de antígeno limitado descrito a continuación. Se titularon los sobrenadantes de hibridomas que contienen anticuerpo a

30 lo largo de un intervalo de dilución de 1:51 a 1:1656. Se usó un control de un anticuerpo de ratón específico antiPDGFR-alfa humano conocido (PharMingen, n.º de catálogo 556001) para definir el intervalo lineal del ensayo. Entonces se usaron datos dentro del intervalo lineal para derivar la concentración relativa del anticuerpo específico de PDGFR en cada muestra titulada.

35 Ensayo de cuantificación de antígeno limitado

Se recubrieron placas de microtitulación con una menor cantidad de antígeno PDGFR-alfa humano en comparación con el ensayo de cuantificación de alto contenido en antígeno descrito anteriormente. Se añadieron a cada pocillo cincuenta microlitros (50 μl) de PDGFR-alfa humano a 64, 32, 16, 8, 4 y 2 ng/ml (cubriendo un intervalo de 8,5 nM a

40 0,26 nM) en leche desnatada al 1% / PBS 1X pH 7,4 / azida al 0,5%. Se incubó la placa durante 30 minutos.

Se lavaron las placas cuatro veces con agua, y se añadieron a los pocillos 50 μl de sobrenadante de hibridoma que contenía anticuerpos de prueba diluidos 1:25 con leche desnatada al 1% / PBS 1X pH 7,4 / azida al 0,5%. Se envolvieron las placas estrechamente con película de parafina o envoltorio de plástico, y se incubaron durante la

45 noche con agitación a temperatura ambiente.

Al día siguiente, se lavaron todas las placas cinco veces y se añadieron a cada pocillo 50 μl de anticuerpo policlonal de cabra anti-Fc de IgG humana-HRP a una concentración de 0,5 ug/ml en leche al 1%, PBS 1X pH 7,4. Se incubaron las placas durante 1 hora a temperatura ambiente.

50 Se lavaron las placas al menos cinco veces con agua del grifo. Se añadieron a cada pocillo cincuenta microlitros (50 μl) de sustrato de HPR TMB, y se incubaron las placas durante 30 minutos. Se detuvo la reacción HRP-TMB añadiendo 50 μl de ácido fosfórico 1 M a cada pocillo. Se midió la densidad óptica (absorbancia) a 450 nm para cada pocillo de la placa.

55 Se seleccionaron treinta y cuatro (34) líneas de anticuerpos basándose en la afinidad de unión relativa. Se basó la selección en la titulación del antígeno a 16 ng/ml y 2 ng/ml. Los puntos de corte seleccionados fueron LA mayor que 0,3 unidades de DO y 3,3 μg/ml. Se eliminaron de la selección las líneas que mostraron una reactividad débil a la concentración de antígeno de 2 ng/ml de antígeno.

60 Se añadieron nueve (9) líneas adicionales para aumentar la combinación de candidatos basándose en la inhibición de la fosforilación de PDGFR-alfa en células MG-63, de manera que se continuó con un total de 43 líneas de anticuerpos que mostraron una inhibición potente de la fosforilación de tirosinas y alta afinidad relativa basándose en el análisis de HA/LA. Las nueve líneas adicionales mencionadas anteriormente mostraron una inhibición completa de

65 la fosforilación de PDGFR-alfa (es decir, el 100%). Ninguna de las líneas presentó reactividad cruzada con PDGFRbeta o sus homólogos (FLT3, c-kit, CSF-1R). TABLA 2

RESUMEN DE 43 LÍNEAS DE ANTICUERPOS SELECCIONADAS BASÁNDOSE EN LA CAPACIDAD DE INHIBIR DE MANERA POTENTE LA FOSFORILACIÓN DE PDGFR-ALFA EN CÉLULAS MG-63

Línea de anticuerpos

Inhibición de pTyr promedio

3.197

>100%

3.476

>100%

2.1623

>100%

3.87

>100%

3.404

>100%

3.72

>100%

2.1795

>100%

2.1853

>100%

2.1954

>100%

2.2002

>100%

2.2071

>100%

3.156

>100%

3.341

>100%

3.456

>100%

3.818

>100%

2.1696

>100%

2.451

>100%

3.457

>100%

2.175

99%

2.259

99%

2.998

99%

2.449

99%

2.414

98%

2.84

98%

3.268

98%

2.351

97%

2.850

95%

3.472

95%

2.886

94%

2.415

94%

3.23

94%

2.10

93%

2.737

93%

2.796

93%

2.565

92%

2.12

92%

2.624

92%

2.862

92%

3.805

92%

2.542

91%

3.259

91%

3.772

91%

2.889

90%

EJEMPLO 6

EXAMEN IN VITRO Y ANÁLISIS DE DATOS DE ANTICUERPOS MONOCLONALES CLONADOS 5 Se clonaron treinta (30) líneas de anticuerpos y se interrogaron adicionalmente tal como sigue.

Ensayo de pTyr

10 Se realizó la fosforilación de tirosinas de PDGFR (ensayo de pTyr) usando células MG-63 tal como se describió anteriormente en el ejemplo 4. Se muestran los resultados en la tabla 3.

Ensayo de proliferación

15 Se evaluó la inhibición del crecimiento de células MG-63 por los anticuerpos monoclonales purificados frente a PDGFR-alfa usando un examen mediante ensayo de proliferación de PDGF-AA.

Brevemente, se sembraron células MG-63 a 5.000 células por pocillo en 100 μl de medios de crecimiento total en los pocillos internos de placas negras de fondo transparente y se incubaron a 37ºC, CO2 al 5% durante 3-4 horas. Se

20 lavaron las células con PBS 1X con medios y se reemplazaron por medios de cultivo de privación de nutrientes (MEM, NEAA al 1%, NaBicarb al 0,1%, L-glut al 1%) y se dejaron con privación de nutrientes durante la noche. Se retiraron los medios de las placas y se añadieron 50 μl de Acm 2X o medios a los pocillos apropiados. Se añadieron 50 μl de titulación de PDGF-AA, PDGF-AA 200 ng/ml o medios solos y se incubaron las placas durante 3 días. Se leyeron las placas con Alamar Blue a 530 de excitación y 580 nm de emisión (100 μl por pocillo/100 μl).

25 Se resumen a continuación los datos para los 15 mejores anticuerpos monoclonales, es decir que presentaban los menores valores de CI50, para una estimulación celular usando PDGF-AA 100 ng/ml (3,45 nM) en la tabla 3. Se muestran en negrita los anticuerpos monoclonales seleccionados para análisis adicional. Se muestran las curvas de dosis-respuesta para 5 de los anticuerpos seleccionados en la figura 1. La preparación de 2.451.1.1 puede contener

30 dos anticuerpos diferentes, con la misma cadena pesada pero diferentes cadenas ligeras, puesto que se detectaron dos secuencias de cadena ligera diferentes durante la secuenciación del ADN para este anticuerpo monoclonal.

TABLA 3

ENSAYO DE PROLIFERACIÓN: CÉLULAS MG-63

Acm

CI50 (ng/ml)

2.175.3

56,1 (0,37 nM)

2.414.2

349,1 (2,3 nM)

2.451.1.1

283,1 (1,9 nM)

2.542.2

651,6 (4,35 nM)

2.737.1.4

558,5 (3,72 nM)

2.1623.2

981,7 (6,5 nM)

2.1853.3

2679,2 (18 nM)

3.341.2

471,0 (3,1 nM)

2.796.2

756,8 (5 nM)

5.16.1

422,7 (2,8 nM)

2.2071.1.3

492,0 (3,3 nM)

2.449.1.3

236,6 (1,57 nM)

2.84.3

480,8 (3,2 nM)

2.998.2

315,5 (2,1 nM)

2.351.3

648,6 (4,3 nM)

BD556001

2857,6 (19 nM)

IgG2 hu

> 10 μg/ml

IgG4 hu

>10 μg/ml

Determinación de afinidad de Kd mediante FACS

Se determinó la afinidad de anticuerpos monoclonales purificados (Acm 2.175.3, 2.449.1.3, 2.451.1.1. 2.998.2. 5 2.84.3) frente a PDGFR-alfa mediante análisis de FACS.

Brevemente, se resuspendieron células MG-63 que expresaban PDGFR-alfa en tampón para FACS (FBS al 2%, NaN3 al 0,05%) a una concentración de aproximadamente 3 a 5 millones de células/ml. Se mantuvieron las células en hielo. Se diluyeron en serie los anticuerpos purificados y control de CD140a con PBS 1x filtrado (2x) a lo largo de

10 11 pocillos en placas de 96 pocillos. El duodécimo pocillo en cada fila sólo contenía tampón. Se añadieron PBS 1x y células a cada pocillo con Acm de manera que el volumen final era de 30 μl/pocillo y cada pocillo contenía aproximadamente 100.000 células. Los intervalos de concentración molecular final para los Acms fueron tal como sigue:

Acm Concentración

2.451.1.1 = 19,1 -0,019 nM 2.175.3 = 10,8 -0,021 nM 2.449.1.3 = 10,7 -0,021 nM

2.449.1.3 = 9,2 -0,009 nM

2.84.3 = 4,4 -0,009 nM 2.449.1.3 = 9,2 -0,009 nM 2.998.2 = 4,6 -0,009 nM

CD140a = 20,2 -0,020 nM

15 Se pusieron las placas en un agitador de placas durante 5 horas a 4ºC, entonces se centrifugaron y se lavaron 3x con PBS. Se añadieron a cada pocillo 200 μl de anticuerpo policlonal de cabra anti-α humana-Cy5 100 ó 131 nM (Jackson Laboratories, n.º 109-175-008), y se añadieron 200 μl de anticuerpo policlonal de cabra anti-α de ratón-Cy5 100 nM a las células complejadas con anticuerpo contra CD140a. Entonces se pusieron las placas en un agitador

20 durante 40 minutos a 4ºC, entonces se centrifugaron y se lavaron 3x con PBS.

Se determinó la media geométrica de la fluorescencia (GMF) de 15.000 a 20.000 “acontecimientos” celulares para cada concentración de Acm usando un instrumento FACSCalibur. Para cada Acm, se normalizaron los datos de GMF para ambas titulaciones por duplicado con relación a un punto de concentración de Acm idéntico en cada

25 titulación. Se promediaron los puntos de titulación normalizados correspondientes para proporcionar un punto de GMF normalizado para cada concentración de Acm. Sólo un conjunto de datos de titulación para el Acm 2.351.3 era de calidad aceptable para análisis. Se ajustó una representación gráfica no lineal de GMF como una función de la de Acm molecular usando el software Scientist, usando la ecuación:

En la ecuación anterior, F = media geométrica de la fluorescencia, LT = concentración de Acm molecular total, P’ = constante de proporcionalidad que relaciona las unidades de fluorescencia arbitrarias con el Acm unido y KD = constante de disociación de equilibrio. Para cada Acm, se obtuvo una estimación para KD ya que se permitió que P’ 35 y KD fueran flotantes libremente en el análisis no lineal. La tabla 4 a continuación enumera las KDs resultantes para cada Acm junto con el intervalo de confianza del 95% del ajuste. Se enumeran los Acms en orden de afinidad

decreciente. TABLA 4

Muestra

KD (pM) 95°%> IC (pM)

2.175.3

328 ± 202

2.451.1.1

389 ± 196

2.449.1.3 (control)

52 ± 51

2.449.1.3

53 ± 49

2.998.2

57 +68 (IC superior sólo)

CD140a

146 ± 99

2.84.3

227 ± 121

5 Reactividad cruzada con ratón

Para configurar estudios de xenoinjertos con animales, se determinó la reactividad cruzada con ratón usando análisis de FACS realizado con células NIH3T3, una línea de fibroblastos murina que expresa PDGFRa endógeno. Se incubaron las células NIH3T3 a 0,5 X 106 células/ml con 10 ug/ml de anticuerpos de prueba en hielo durante 1 h,

10 se enjuagaron y se resuspendieron entonces en PBS con 5 ug/ml de anticuerpos de cabra anti-IgG humana marcados con Cy5. Se enjuagaron las células y se analizaron mediante FACS para determinar la presencia de Cy5. Sólo 3 de los anticuerpos monoclonales sometidos a prueba mostraron reactividad cruzada con ratón. Se resumen los resultados en la tabla 5.

15 Internalización porcentual

Se determinó el porcentaje de anticuerpo que se internaliza en células usando un protocolo de internalización convencional. Se resumen los resultados de internalización porcentual a 10 μg/ml en la tabla 5.

20 Resultados

Se resumen los resultados del examen in vitro y el análisis de datos de los 30 anticuerpos monoclonales clonados en la tabla 5. Se enumeran los Acms en orden de valores de CI50 crecientes. Se seleccionaron los Acms en cursiva como los diez mejores Acms y se seleccionado los anticuerpos en negrita como los tres candidatos líder. “()” indica

25 la clasificación en la tabla 5.

Tal como puede observarse a partir de la tabla 5, el Acm 2.175.3 mostró una inhibición excepcional de la proliferación de PDGF-AA de células MG-63 así como una inhibición excepcional de fosforilación de PDGFR-alfa en células MG-63. Los Acms 2.449.1.3 y 2.998.2 también inhibieron la fosforilación de PDGFR-alfa en células MG-63 e

30 inhibieron la proliferación de PDGF-AA de células MG-63. Además, los Acms 2.449.1.3 y 2.998.2 también tuvieron una alta afinidad de unión para PDGFR-alfa.

TABLA 5 EJEMPLO 7

RESUMEN DE ANTICUERPOS MONOCLONALES CONTRA PDGFR-ALFA

Anticuerpo

Ensayo de pTyr: % de inhibición a 2 μg/ml Ensayo de proliferación: CI50 ng/ml (1-6-06) Ensayo de proliferación: CI50 ng/ml (1-23-06) % de internalización a 10 μg/ml Reactividad cruzada con ratón Afinidad : KD

2.175.3

100 67,3 (1) (0,45 nM) 56,1 (1) (0,37 nM) 19% Sí 328 pM

2.449.1.3

99 178,6 (2) (1,2 nM) 236,6 (2) (1,57 nM) 20% - 52 pM

2.451.1.1

100 399,0 (6) (2,67 nM) 283,1 (3) (1,9 nM) 21% - 389 pM

2.998.2

99 307,6 (4) (2,05 nM) 315,5(4) (2,1 nM) 25% - 57 pM

2.84.3

98 192,3 (3) (1,3 nM) 480,9 (8) (3,2 nM) 26% - 227 pM

2.414.2

99 657,7(9) (4,4 nM) 349,1 (5) (2,3 nM) 28% -

5.16.1

99 385,5 (5) (2,57 nM) 422,7 (6) (2,81 nM)) 31% -

3.341.2

100 403,6(7) (2,7 nM) 471,0 (7) (3,1 nM) 22% -

2.2071.1.3

99 1.276,4 (10) (8,5 nM) 492,0 (9) (3,3 nM) 21% -

2.737.1.4

99 550,8 (8) (3,7 nM) 558,5 (10) (3,73 nM) 22% -

2.796.2

99 497,7 756,8 19% -

2.542.2

99 1037,5 651,6 26% -

2.351.3

97 1.075,9 648,6 21% -

2.1623.2

97 755,1 981,7 46% Sí

2.1853.3

98 1.122,0 2679,2 30% Sí

3.818.4

92 4.602.6 -

3.457.3.1

85 - -

3.23.3

84 61.9 -

5.1.1.1

77 > 10 μg/ml -

4.16.2

74 > 10 μg/ml -

3.87.1.1

69 6.237,3 -

2.1576.1.2

65 > 10 μg/ml -

3.472.1.1

61 - -

3.805.1.3

58 1.016,2 -

3.772.2

56 167,9 -

5.9.3

31 2,2 -

3.23.2

26 150,3 -

2.1954.2

-3 - -

3.625.1.7

-3 3819,44 -

2.2002.3

-9 - -

ANÁLISIS ESTRUCTURAL DE ANTICUERPOS ANTI-PDGFR-ALFA

5 Se secuenciaron los dominios variables de cadena pesada y ligera de los anticuerpos para determinar sus secuencias de ADN. Se proporciona la información de secuencia completa para los anticuerpos anti-PDGFR-alfa en la lista de secuencias con las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos para cada combinación de cadenas gamma y kappa. Se analizaron las secuencias pesadas variables para determinar la familia de VH, la secuencia de

10 la región D y la secuencia de la región J. entonces se tradujeron las secuencias para determinar la secuencia primaria de aminoácidos y se compararon con las secuencias de VH, región D y J de línea germinal para evaluar hipermutaciones somáticas. “-” indica identidad con la secuencia de la línea germinal. “#” indica un aminoácido adicional en las secuencias de anticuerpo que no se encuentra en la línea germinal.

15 La tabla 12 es una tabla que compara las regiones de cadena pesada de anticuerpo con su región de cadena pesada de la línea germinal relacionada. La tabla 13 es una tabla que compara las regiones de cadena ligera kappa de anticuerpo con su región de cadena ligera de línea germinal relacionada.

Las regiones variables (V) de cadenas de inmunoglobulina están codificadas por múltiples segmentos de ADN de la 20 línea germinal, que se unen en regiones variables funcionales (VHDJH o VKJK) durante la ontogenia de células B.

También debe apreciarse que cuando un anticuerpo particular difiere de su secuencia de la línea germinal respectiva a nivel de aminoácidos, la secuencia del anticuerpo puede retromutarse a la secuencia de la línea germinal. Tales mutaciones correctoras pueden producirse en una, dos, tres posiciones o más, o una combinación de cualquiera de las posiciones mutadas, usando técnicas de biológica molecular convencionales. A modo de ejemplo no limitativo, la 5 tabla 12 muestra que la secuencia de cadena pesada del Acm 2.175.3 (SEQ ID NO.: 2) difiere de la secuencia de la línea germinal correspondiente, entre otros, a través de una mutación de Q a H (mutación 1) en la región FR1, una mutación de S a H (mutación 2) en la región CDR1, y una mutación de S a R mutación (mutación 3) en la región CDR2. Por tanto, la secuencia de aminoácidos o nucleótidos que codifica para la cadena pesada del Acm 2.175.3 puede modificarse para cambiar la mutación 1 para producir la secuencia de la línea germinal en el sitio de la 10 mutación 1. Además, la secuencia de aminoácidos o nucleótidos que codifica para la cadena pesada de Acm

2.175.3 puede modificarse para cambiar la mutación 2 o la mutación 3 para producir la secuencia de la línea germinal en el sitio de la mutación 2 o la mutación 3. En efecto, la secuencia de aminoácidos o nucleótidos que codifica para la cadena pesada del Acm 2.175.3 puede englobar cualquier combinación de dos o más mutaciones para producir la secuencia de la línea germinal en esos sitios particulares. Las tablas 6-11 a continuación ilustran la

15 posición de tales variaciones con respecto a la línea germinal para el Acm 2.175.3, 2.449.1.3 y 2.998.2. Cada fila representa una combinación única de residuos de línea germinal y que no son de línea germinal en las posiciones indicadas. En el caso de una discrepancia entre las listas de secuencias y las tablas 6-11, tiene preferencia la información proporcionada en la tabla.

20 TABLA 6. Mutaciones a modo de ejemplo de la cadena pesada del Acm 2.175.3 (SEQ ID NO: 2) con respecto a la línea germinal en el número de residuo indicado.

Nota.- DELETED = DELECIONADO

TABLA 7. Mutaciones a modo de ejemplo de la cadena ligera del Acm 2.175.3 (SEQ ID NO: 4) con respecto a la línea germinal en el número de residuo indicado.

TABLA 8. Mutaciones a modo de ejemplo de la cadena pesada del Acm 2.449.1.3 (SEQ ID NO: 10) con respecto a

Nota.- DELETED = DELECIONADO

TABLA 9. Mutaciones a modo de ejemplo de la cadena ligera del Acm 2.449.1.3 (SEQ ID NO: 12) con respecto a la línea germinal en el número de residuo indicado.

Nota.- DELETED = DELECIONADO

TABLA 10. Mutaciones a modo de ejemplo de la cadena pesada del Acm 2.995.2 (SEQ ID NO: 14) con respecto a la línea germinal en el número de residuo indicado.

Nota.- DELETED = DELECIONADO

TABLA 12

SECUENCIAS DE CADENA PESADA DE ANTICUERPO ANTI-PDGFR-ALFA

Nombre de cadena

V D J FR1 CDR1 FR2

I Línea germinal

QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAAS GFTFSDYYMS WIRQAPGKGLEWVS

2.175.3

VH3-11 D1-26 JH4B --H---------------------- ---------H --------------

Línea germinal

QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAAS GFTFSDYYMS WIRQAPGKGLEWVS

2.451.1.1

V3-11 D6-6 JH6B ------------------------- --------- N --------------

2.449.1.3

V3-11 D6-6 JH6B ------------------------- --------- N --------------

Línea germinal

QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVS GGSISSSSYYWG WIRQPPGKGLEWIG

2.84.1

V4-39 D7-27 JH4B ------------------------- --F --------- --------------

2.998.2

V4-39 D7-27 JH4B ------------------------- -D----FI---- --------------

CDR2

FR3 CDR3 FR4 SEQ ID NO.

YISSSGSTIYYADSVKG

RFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR ###YSGS#FDY WGQGTLVTVSS 127

---R---L---V-----

-------------N------------------ GGP----P--- ----------- 2

YISSSGSTIYYADSVKG

RFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR ##SIAARGMDV WGQGTTVTVSS 128

F----------------

-------------------------------- DGH-------- ----------- 6

-----------I--------------

-------------------------------- EGR-------- ----------- 10

SIYYSGSTYYNPSLKS

RVT1SVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAR ##W#FDY WGQGTLVTVSS 129

T-----T----S----

---------Q---------------------- HH-VFDY ----------- 18

T---------------

-----------------R-------------- HH-VFDY -----Q----- 14

TABLA 13

SECUENCIAS DE CADENA LIGERA DE ANTICUERPO ANTI-PDGFR-ALFA

Nombre de cadena

V J FR1 CDR1 FR2

Línea germinal

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC RASQSISSYLN MYQQKPGKAPKLLIY

2.175.3

O12 JK1 ----------------------- - P - - R -- R --- -----------F---

Línea germinal

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC RASQGISNYLA WYQQKPGKVPKLLIY

2.451.1.1

A26 JK5 V------------------------------ -- - - V - T --- - --------------F

Línea germinal

TQGPTTQSVTPKEKVTITC RASQSIGSSLH WYQQKPDQSPKLLIK

2.84.1

A26 JK1 --V---------------------I---- ----I--T--- ---K-----------

2.998.2

A26 JK1 D-----F---------------- ----V------ ---------------

Línea germinal

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC RASQSISSYLN WYQQKPGKAPKLLIY

2.449.1.3

012 JK5 -------------------S--- -P---F-R-I- --------------H

2.451.1.1

012 JK5 ----------------------- ---H--TR-I ----------N----

CDR2

FR3 CDR3 FR4 SEQ ID NO.

AASSLOS

GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QQSYSTPPWT FGQGTKVEIK 130

-----P-

--------------------T----------- ---------- ---------- 4

AASTLOS

GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLOPEDVATYYC OKYNSAP#####IT FGQGTRLEIK 131

-S-----

-------------------------------- -------PRTRS-- ---------- 22

YASQSFS

GVPSRFSGSGSGTDFTLTINSLEAEDAATYYC HOSSSLPWT FGQGTKVEIK 132

-------

-------------E------------T----- ---TN---- ---------- 20

-------

-----------------------V-------- ---TI---- --------V- 16

AASSLQS

GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QQSYS###IT FGQGTRLEIK 133

-----VG

-------------------------------- --T--NPP-- --------M- 12

-------

-------------------------------- --T--NPP-- ---------- 8

EJEMPLO 8 5 DETERMINACIÓN DE LA AFINIDAD MEDIANTE ANÁLISIS BIACORE

Se realizaron experimentos Biacore usando un instrumento Biacore T100 a 22ºC. Se utilizó el acoplamiento de aldehído convencional de la superficie del biosensor con el anticuerpo. Específicamente, se hicieron reaccionar 10 50 μg de cada Acm con NaIO4 ~1 mM durante 25 min. en hielo en NaOAc 0,1 M, pH 5,5, y entonces se detuvo la reacción de oxidación mediante desalación de la muestra en una columna Sephadex G-25 de purificación de ácido nucleico-5 (NAP-5, GE biosciences) con NaOAC 10 mM, pH 4,0. Entonces se hicieron fluir los Acms a lo largo de una superficie de biosensor CM5 que se había hecho reaccionar con EDC/NHS, carbohidrazida y etanolamina. Tras haberse alcanzado la capacidad de superficie deseada, se redujeron los enlaces hidrazona entre el Acm y la

15 superficie haciendo fluir NaBH3CN 0,1 M en NaOAc 0,1 M, pH 4,0 a través de los Acms inmovilizados durante 20 min.

Se inmovilizaron los Acms 2.998.2 (SEQ ID Nos: 14 y 16), 2.175.3 (SEQ ID Nos: 2 y 4), variante A de 2.175.3 (SEQ ID NO: 2 con 3Q, 80Y (SEQ ID NO:134); SEQ ID NO: 4 con 46L, 77S (SEQ ID NO:135)), 2.449.1 (SEQ ID NO: 10 y 20 12) y variante A de 2.449.1 (SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 12 con 49Y, 1071 (SEQ ID NO:136)) sobre un biochip sensor CM5. Se inyectó sPDGFR-alfa humano recombinante (R&D n.º de catálogo 322-PR/CF; n.º de lote

QY056081) durante 90 segundos en un intervalo de concentración de 51,6 – 0,806 nM (dilución en serie 2x) seguido

por una disociación durante 3 minutos. Puesto que la fase de disociación obviamente era extremadamente lenta

para todas las interacciones estudiadas, se realizaron seis inyecciones adicionales, tres a 25,8 nM y tres inyecciones

de tampón como blanco, con una inyección durante 90 segundos con una fase de disociación de 14.400 segundos

5 (4 h) tras haberse completado las 30 inyecciones iniciales. Se prepararon las muestras en solución salina

tamponada con Hepes, polisorbato 20 al 0,005%, pH 7,4 (HBS-P) con 100 μg/ml de BSA añadido. Se inyectaron

aleatoriamente todas las muestras por triplicado con más de diez inyecciones de tampón intercaladas para doble

referenciación. Se procesaron todos los datos de sensograma con Scrubber 2.0 y se ajustaron de manera global a

un modelo de interacción 1:1 incluyendo un término para el transporte de masa usando CLAMP. Se enumeran las 10 constantes de unión resultantes en la tabla a continuación. Se enumeran los Acms en orden desde la mayor hasta la

menor afinidad.

TABLA 14. AFINIDAD DE ANTICUERPOS SELECCIONADOS

Muestra

ka (M-1 s -1) kd (s-1) KD (pM)

Variante A de 2.175.3

3,55 X 105 2,53 X 10-6 7,1

Variante A de 2.449.1

4,40 X 105 3,50 X 10-6 8,6

2.175.3

5,16 X 105 2,59 X 10-5 50

2.449.1

4,40 X 105 6,16 X 10-5 140

2.998.2

2,98 X 105 4,89 X 10-5 164

15 Los resultados en la tabla 14 muestran que las variantes de la línea germinal de 2.175.3 y 2.449.1 mostraron un aumento de afinidad por PDGFRa soluble tal como se determinó mediante análisis Biacore en comparación con los anticuerpos que no son de la línea germinal respectivos. Ambos anticuerpos de línea germinal muestran una reducción de las constantes de disociación en comparación con sus homólogos normales que contribuye al aumento observado en la afinidad. Se sometieron a prueba cuatro de los anticuerpos con la mayor afinidad en la tabla 14 en

20 un ELISA de unión a PDGFRa soluble tal como se describió en el ejemplo 2 y un ensayo de fosforilación de MG-63 tal como se describió en el ejemplo 4. Se enumeran los valores de CI50 resultantes en la tabla 15.

TABLA 15. ACTIVIDAD DE ANTICUERPOS SELECCIONADOS EN EL ELISA DE UNIÓN A sPDGFRa Y ENSAYO DE FOSFORILACIÓN DEL RECEPTOR

Anticuerpo

CI50 de ELISA de sPDGFRa (ng/ml) CI50 de ensayo de PTYR (ng/ml)

2.175.3

38 28

Variante A de 2.175.3

46 29

2.449.1.3

44 21

Variante A de 2.449.1.3

45 31

25 EJEMPLO 9

EVALUACIÓN DE LA EFICACIA ANTITUMORAL EL MODELOS DE XENOINJERTO DE TUMOR HUMANO

30 Se evaluó la eficacia antitumoral de dos de los anticuerpos anteriores en un modelo de xenoinjerto de carcinoma de pulmón de células no pequeñas, Calu-6. Se derivaron los ratones huésped de un cruzamiento entre ratones Black6/129 que tenían el gen de PDGFRa murino reemplazado por el de PDGFRa humano mediante recombinación homóloga y ratones SCID. Los ratones resultantes expresaban el receptor PDGFRa humano y no el receptor murino. Se les inyectó a estos ratones con inserción/deficientes de 19 semanas de edad (10/grupo) 2X106 células Calu-6 en

35 0,1 ml de Matrigel en el flanco derecho. Cuando los tumores alcanzaron el promedio de 170 mm3 de tamaño, se administraron los anticuerpos en un vehículo de solución salina tamponada con fosfato o vehículo de solución salina vacío por vía intraperitoneal a 10 mg de anticuerpo por kilogramo dos veces a la semana durante la duración del estudio. La figura 2a muestra el tamaño del tumor promedio por grupo de tratamiento a lo largo del tiempo, mientras que la figura 2b muestra el peso corporal promedio a lo largo del tiempo. El tratamiento con ambos anticuerpos

40 redujo la tasa de crecimiento tumoral significativamente; el tratamiento con 2.175.3 produjo un crecimiento reducido en un 55% (p=0,06) mientras que el tratamiento con 2.449.1.3 produjo una tasa de crecimiento reducida en un 73% (p< 0,001). No hubo diferencia significativa entre grupos con respecto al cambio de peso corporal durante el estudio (figura 2b).

45 Se evaluó adicionalmente la eficacia antitumoral de 2.449.1.3 y la variante A de 2.449.1.3 en el modelo de xenoinjerto de glioma U118. Se les inyectó a ratones SCID de 19 semanas de edad (10/grupo) 2X106 células en 0,1 ml de Matrigel en el flanco derecho de los animales. Cuando los tumores alcanzaron el promedio de 280 mm3 de tamaño, se administraron los anticuerpos tal como se describió anteriormente para el modelo con Calu-6. Se muestran los resultados en la figura 3. El anticuerpo 2.449.1.3 redujo el crecimiento de los tumores U118 en un 94% (p < 0,000001). La variante A de 2.449.1.3 redujo el crecimiento en un 101%. Por tanto, tanto 2.449.1.3 como la variante A de 2.449.1.3 son altamente activos en la reducción del crecimiento de este xenoinjerto de glioma, y las mutaciones de la variante A no reducen la actividad in vivo en este modelo.

Lista de secuencias

<110> AstraZeneca AB 10 <120> Agentes de unión dirigidos que se dirigen a PDGFR-alfa y usos de los mismos

<130> ASTR-013/01WO

<150> Documento US 60/835.647 15 <151>

<160> 136

<170> PatentIn versión 3.4 20

<210> 1

<211> 360

<212> ADN 25 <213> Homo sapiens

<400> 1

30 <210> 2

<211> 120

<212> PRT

<213> Homo sapiens

35 <400> 2

<210> 3

<211> 324

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<210> 4

<211> 108

<212>

PRT 15 <213> Homo sapiens

<400> 4

<210> 5

<211> 360

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 5

<210> 7

<211> 336

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 7

<210> 8

<211> 112

<212>

PRT 15 <213> Homo sapiens

10

<210> 6

<211> 120

<212> PRT

<213> Homo sapiens

15

<400> 6

<400> 8

<210> 9

<211> 360

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 9

10

<210> 10

<211> 120

<212> PRT

<213> Homo sapiens

15

<400> 10

<210> 11

<211> 324

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 11

10 <211> 108

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<210> 13

<211> 351

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 13

10

<210> 14

<211> 117

<212> PRT

<213> Homo sapiens

15

<400> 14

<210> 15

<211> 321

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 15

10

<210> 16

<211> 107

<212> PRT

<213> Homo sapiens

15

<400> 16

<210> 12

5 10

<210> 17 <211> 351 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 18

<210> 19

<211> 321

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 19

10

<210> 20

<211> 107

<212> PRT

<213> Homo sapiens

15

<400> 20

<210> 21

<211> 324

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 21

<210> 22

<211> 108

<212> PRT

<213> Homo sapiens 15

<400> 22

<210> 23

<211> 372

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 23

10

<210> 24

<211> 124

<212> PRT

<213> Homo sapiens

15

<400> 24

<210> 25

<211> 321

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 25

10

<210> 26

<211> 107

<212> PRT

<213> Homo sapiens

15

<400> 26

<210> 27

<211> 354

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 27

10

<210> 28

<211> 118

<212> PRT

<213> Homo sapiens

15

<400> 28

<210> 29

<211> 321

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 29

10

<210> 30

<211> 107

<212> PRT

<213> Homo sapiens

15

<400> 30

<210> 31

<211> 351

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 31

10

<210> 32

<211> 117

<212> PRT

<213> Homo sapiens

15

<400> 32

20 <210> 33

<211> 321

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 33

<210> 34

<211> 107 10 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 34

15

<210> 35

<211> 351

<212> ADN

<213> Homo sapiens

20

<400> 35

<210> 36

<211> 117

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 36

10

<210> 37

<211> 321

<212> ADN

<213> Homo sapiens

15

<400> 37

<210> 38

<211> 107

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 38

10

<210> 39

<211> 360

<212> ADN

<213> Homo sapiens

15

<400> 39

<210> 40 20 <211> 120

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 40

<210> 41

<211> 324

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 41

10

<210> 42

<211> 108

<212> PRT

<213> Homo sapiens

15

<400> 42

<210> 43

<211> 360

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 43

<210> 44<212> PRT

<213> Homo sapiens

<210> 45

<211> 324

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 45

10

<210> 46

<211> 108

<212> PRT

<213> Homo sapiens

15

<400> 46

20 <210> 47

<211> 360

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 47

<210> 48

<211> 120 10 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 48

15

<210> 49

<211> 324

<212> ADN

<213> Homo sapiens

20

<400> 49

<210> 50

<211> 108

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 50

10

<210> 51

<211> 363

<212> ADN

<213> Homo sapiens

15

<400> 51

<210> 52

<211> 121

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 52

10 <210> 53

<211> 327

<212> ADN

<213> Homo sapiens

15 <400> 53

<210> 54

<211> 109 20 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 54

<210> 55

<211> 351

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 55

10

<210> 56

<211> 117

<212> PRT

<213> Homo sapiens

15

<400> 56

<210> 57

<211> 321

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 57

10

<210> 58

<211> 107

<212> PRT

<213> Homo sapiens

15

<400> 58

<210> 59

<211> 354

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 59

10

<210> 60

<211> 118

<212> PRT

<213> Homo sapiens

15

<400> 60

<210> 61

<211> 321

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 61

10

<210> 62

<211> 107

<212> PRT

<213> Homo sapiens

15

<400> 62

<210> 63 20 <211> 363

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 63

<210> 64

<211> 121

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<210> 65

<211> 321

<212> ADN 15 <213> Homo sapiens

<400> 65

<210> 66

<211> 107

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 66

10

<210> 67

<211> 354

<212> ADN

<213> Homo sapiens

15

<400> 67

<210> 68 20 <211> 118

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<210> 69

<211> 321

<212> ADN 10 <213> Homo sapiens

<400> 69

15 <210> 70

<211> 107

<212> PRT

<213> Homo sapiens

20 <400> 70

<210> 71

<211> 354

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 71

10

<210> 72

<211> 118

<212> PRT

<213> Homo sapiens

15

<400> 72

<210> 73

<211> 321

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 73

10

<210> 74

<211> 107

<212> PRT

<213> Homo sapiens

15

<400> 74

<210> 75

<211> 363

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 75

10

<210> 76

<211> 121

<212> PRT

<213> Homo sapiens

15

<400> 76

<210> 77

<211> 321

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 77

10

<210> 78

<211> 107

<212> PRT

<213> Homo sapiens

15

<400> 78

<210>

79 20 <211> 366

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 79

<210> 80

<211> 122

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 80

<210> 82

<211> 107

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 82

<210>

84 20 <211> 119

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 84

<210> 85

<211> 321

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<210>

86 15 <211> 107

10

<210> 81

<211> 321

<212> ADN

<213> Homo sapiens

15

<400> 81

10

<210> 83

<211> 357

<212> ADN

<213> Homo sapiens

15

<400> 83

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<210> 87

<211> 372

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 87

10

<210> 88

<211> 124

<212> PRT

<213> Homo sapiens

15

<400> 88

<210> 89

<211> 321

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 89

10

<210> 90

<211> 107

<212> PRT

<213> Homo sapiens

15

<400> 90

<210> 91

<211> 360

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 91

10

<210> 92

<211> 120

<212> PRT

<213> Homo sapiens

15

<400> 92

20 <210> 93

<211> 324

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 93

<210> 94

<211> 108 10 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 94

15

<210> 95

<211> 360

<212> ADN

<213> Homo sapiens

20

<400> 95

<210> 96

<211> 118

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 96

10

<210> 97

<211> 321

<212> ADN

<213> Homo sapiens

15

<400> 97

<210> 98

<211> 107

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 98

10

<210> 99

<211> 351

<212> ADN

<213> Homo sapiens

15

<400> 99

<210>

100 20 <211> 117

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 100

<210> 101

<211> 321

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 101

<210> 103

<211> 381

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 103

<210> 105

<211> 333

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 105

<210> 107

<211> 360

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 107

<210>

109 20 <211> 324

10

<210> 102

<211> 107

<212> PRT

<213> Homo sapiens

15

<400> 102

10

<210> 104

<211> 127

<212> PRT

<213> Homo sapiens

15

<400> 104

10

<210> 106

<211> 111

<212> PRT

<213> Homo sapiens

15

<400> 106

10

<210> 108

<211> 120

<212> PRT

<213> Homo sapiens

15

<400> 108

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 109

<210> 109

<211> 324

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<210> 111

<211> 360

<212> ADN 15 <213> Homo sapiens

<400> 111

<210> 112

<211> 120

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 112

<210> 113 10 <211> 321

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<210> 114

<211> 107

<212> PRT 20 <213> Homo sapiens

<400> 114

<210> 115

<211> 354

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 115

10

<210> 116

<211> 118

<212> PRT

<213> Homo sapiens

15

<400> 116

<210> 117

<211> 306

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 117

10

<210> 118

<211> 107

<212> PRT

<213> Homo sapiens

15

<400> 118

<210> 119

<211> 351

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 119

10

<210> 120

<211> 117

<212> PRT

<213> Homo sapiens

15

<400> 120

<210> 121

<211> 321

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 121

10

<210> 122

<211> 107

<212> PRT

<213> Homo sapiens

15

<400> 122

<210> 123 20 <211> 384

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 123

<210> 124

<211> 128

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<210> 125

<211> 321

<212>

ADN 15 <213> Homo sapiens

<400> 125

<210> 126

<211> 107

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<210> 127

<211> 116

<212>

PRT 15 <213> Homo sapiens

<400> 127

<210> 128

<211> 118

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 128

<210> 130

<211> 108

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<210> 131

<211> 107

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<210> 132

<211> 107

<212>

PRT 10 <213> Homo sapiens

10

<210> 129

<211> 114

<212> PRT

<213> Homo sapiens

15

<400> 129

<400> 132

<210> 133

<211> 105

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 133

<210> 134

<211> 120 10 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 134

<210> 135

<211> 108

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 135

10 <210> 136

<211> 108

<212> PRT

<213> Homo sapiens

15 <400> 136

Claims (11)

1. REIVINDICACIONES

   1. Anticuerpo, o fragmento de unión del mismo, que se une específicamente a PDGFR-alfa con una Kd inferior a 10 picomolar e inhibe el crecimiento de células que expresan PDGFR-alfa, que comprende las siguientes secuencias:

   (a)

   la cadena pesada de:

   (i)

   la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, o

   (ii)

   una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos el 99% con SEQ ID NO: 10, siempre que dicha secuencia de aminoácidos difiera de SEQ ID NO: 10 en una sustitución conservativa de aminoácidos, y

   (b)

   la cadena ligera de:

   (i)

   la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 136,

   (ii)

   la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 136, en la que el aminoácido S en la posición 20 está sustituido por T, o

   (ii)

   una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos el 99% con SEQ ID NO: 136, siempre que dicha secuencia de aminoácidos difiera de SEQ ID NO: 136 en una sustitución conservativa de aminoácidos;

   en el que una sustitución conservativa de aminoácidos es una sustitución dentro de una de las familias de aminoácidos, en el que las familias son:

   (1)

   aspartato y glutamato;

   (2)

   lisina, arginina e histidina;

   (3)

   alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina y triptófano; y

   (4)

   glicina, asparagina, glutamina, cisteína, serina, treonina y tirosina.

2. 2. Anticuerpo, o fragmento de unión del mismo, según la reivindicación 1, en el que:

   (a)

   la cadena pesada tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, y

   (b)

   la cadena ligera tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 136 o la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 136, en la que el aminoácido S en la posición 20 está sustituido por T.

3. 3.

   Anticuerpo, o fragmento de unión del mismo, según las reivindicaciones 1 ó 2, en el que dicho anticuerpo, o fragmento de unión del mismo, es: un anticuerpo monoclonal; un anticuerpo monoclonal totalmente humano;

   un fragmento de unión de un anticuerpo monoclonal totalmente humano; o un fragmento de unión de un anticuerpo monoclonal totalmente humano seleccionado del grupo que consiste en Fab, Fab’ o F(ab’)2.

4. 4.

   Molécula de ácido nucleico que codifica para el anticuerpo, o fragmento de unión del mismo, según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores.

5. 5.

   Vector que comprende la molécula de ácido nucleico según la reivindicación 4.

6. 6.

   Célula huésped que comprende el vector según la reivindicación 5.

7. 7.

   Anticuerpo, o fragmento de unión del mismo, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, para su uso en el tratamiento de una enfermedad neoplásica.

8. 8.

   Anticuerpo, o fragmento de unión del mismo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, según el uso de la reivindicación 7, en el que dicha enfermedad neoplásica se selecciona del grupo que consiste en: melanoma, cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de pulmón de células no pequeñas, glioma, carcinoma hepatocelular (de hígado), tumor de tiroides, cáncer gástrico (de estómago), cáncer de próstata, cáncer de mama, cáncer de

   ovarios, cáncer de vejiga, cáncer de pulmón, glioblastoma, cáncer endometrial, cáncer de riñón, cáncer de colon, cáncer de páncreas, carcinoma de esófago, cánceres de cabeza y cuello, mesotelioma, sarcomas, biliar (colangiocarcinoma), adenocarcinoma del intestino delgado, tumores malignos pediátricos, carcinoma epidermoide y tumor del estroma gastrointestinal (TEGI).

9. 9.

   Anticuerpo, o fragmento de unión del mismo, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, para su uso en el tratamiento de una enfermedad no neoplásica.

10. 10.

    Anticuerpo, o fragmento de unión del mismo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, según el uso de

    10 la reivindicación 9, en el que la enfermedad no neoplásica se selecciona de enfermedades fibróticas o del sistema inmunitario.
11. 11. Anticuerpo, o fragmento de unión del mismo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, según el uso según la reivindicación 7, en el que la enfermedad neoplásica es cáncer.