DE69032742T2

DE69032742T2 - Direkte radioetikettierung von antikörpern und sonstigen proteinen mittels technetium oder rhenium

Info

Publication number: DE69032742T2
Application number: DE69032742T
Authority: DE
Inventors: Buck Austin Albuquerque New Mexico 87106 Rhodes
Original assignee: Rhomed Inc
Current assignee: Rhomed Inc
Priority date: 1989-08-09
Filing date: 1990-08-08
Publication date: 1999-06-17
Anticipated expiration: 2010-08-09
Also published as: CA2065299C; US5102990A; CA2065299A1; ES2125854T3; WO1991001754A1; EP0486622A4; JP2000053590A; AU6543490A; EP0486622B1; USRE35500E; JPH05508699A; EP0486622A1; DK0486622T3; ATE172879T1; JP3070763B2; US5277893A; AU650629B2; DE69032742D1

Description

Diese Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Radiomarkierung von Proteinen, umfassend Antikörper, mit Radioisotopen von Technetium und Rhenium wie Technetium- 99 m.
Die Verwendung von Radioisotopen zur Markierung von Proteinen ist gut bekannt. Diese Verbindungen können in Proben verwendet werden, können dem menschlichen Körper zugesetzt werden, um das Funktionieren verschiedener Teile des Körpers sichtbar zu machen und aufzuzeichnen oder um das Vorhandensein und die Lage bestimmter Antigene, Antikörper, Hormone od. dgl. festzustellen und können bei der Behandlung verschiedener Krankheitszustände verwendet werden. Eine Vielzahl von Radioisotopen umfassend Isotope von 10d, Technetium, Indium und Rhenium wurden verwendet. Es ist auch gut bekannt, daß Proteinmoleküle mit Technetium-99m gekennzeichnet bzw. markiert werden können, um ein diagnostisches oder ein Abbildungs-Mittel zu erhalten.
Technetium-99 m wurde verwendet, um Proteine, Chelat-Mittel, phosphonierte Knochen Scan-Zusammensetzungen und dergleichen durch eine Technik radiozumarkieren, die Natriumpertechnetat verwendet, wobei das Technetium anfänglich in dem +7-Zustand ist. Technetium-99 m ist allgemein nur als Natriumpertechnetat erhältlich. Das Pertechnetat muß mit einem Reduziermittel wie Zinnchlorid in Kontakt gebracht werden, um das Technetium in den +3, +4 oder +5 Oxidationszustand in der Anwesenheit des Proteins, des Chelat-Mittels oder einer ähnlichen Substans zu bringen, die radiomarkiert werden soll. Das Technetium muß in diesem reduzierten Zustand gehalten werden, um die chemische Verbindung zwischen dem Technetiummolekül und dem radiozumarkierenden Substrat aufrechtzuerhalten. Es ist auch nötig, daß das Technetium fest an das Protein gebunden ist, sodaß das reduzierte Technetium nicht auf andere Moleküle oder andere Proteine übertragen wird, die in der Probe, dem Blut des Patienten oder anderen Medien vorhanden sind, in denen die radiomarkierte Substanz verwendet wird.
Es wurden mehrere verschiedene Verfahren verwendet, um Proteine, insbesondere monoklonale Antikörper mit Technetium-99m radiozumarkieren. Die Verfahren verwenden zwei allgemeine Methoden. Eine Methode ist indirekt, bei der ein bifunktionales Chelat-Mittel mittels einer funktionellen Gruppe an das Protein gebunden wird und das Technetium-99 m mittels der anderen funktionellen Gruppe oder Chelat-Gruppe angebracht ist. Diese Methode wurde durch Krejcarek, G.E. und Tucker, K.L. ("Covalent Attachment of Chelating Groups to Macromolecules," Biochemical and Biophysical Research Communications Vol. 77, pp. 581- 585, 1977) eingeführt und wurde in vielen Variationen häufig unter Verwendung einer großen Vielzahl von bifunktionellen Chelat-Mitteln angewandt, wie dies im Überblick von Wensel und Meares (Wensel, T.G., und Meares, C.F., "'Bifunctional' Chelating Agents for Binding Metal Ions to Proteins," Radioimmunoimaging and Radioimmunotherapy, S.W. Burchiel and B.A. Rhodes, eds., Elsevier Publishing Co., New York, pp 185-196, 1983) beschrieben ist. Andere Verfahren sind durch Hnatowich, D.J., U.S. Patente Nr. 4,668,503 und 4,479,930, durch Haber, E., und Khaw, B.A., U.S. Patent Nr. 4,421,735, durch Fritzberg, A.R., und Kasina, S., U.S. Patent Nr. 4,670,545 und durch Baidoo, K.E., et al. "99mTc Labeling of Proteins: Initial Evalulation of Novel Diaminedithiol Bifunctional Chelating Agent," Cancer Res (Supp), Vol. 50, pp. 799 s-803 s, 1990 geoffenbart. Die bifunktionalen Chelat- Methoden haben alle signifikante Beschränkungen, umfassend die Komplexität der Radiomarkierungsprozedur, der Zeit, die nötig ist, um die Radiomarkierung vorzunehmen und der Einführung und dem Vorhandensein von Substanzen, die das Protein beeinflussen können.
Die andere allgemeine Verfahrensweise ist das direkte Markieren. Obwohl verschiedene direkte Verfahren berichtet worden sind, war das erste direkte Verfahren, das in der Lage war, eine genügend starke Bindung zwischen dem Protein und dem Technetium-99 m für in vivo Anwendungen bereitzustellen, das direkte Verfahren oder Vorverzinnungsverfahren, das im U.S. Patent Nr. 4,424,200 beschrieben ist, welches den Titel "Method for Radiolabeling Proteins with Technetium-99 m hat und für Crockford, D.R., und Rhodes, B.A. erteilt wurde. Bei diesem Verfahren wird eine einzige Reduktionslösung, die aus Zinn [Sn (II)]-Chlorid mit Tartrat- und Phthalat-Salzen besteht. Diese Lösung dient (I) zum Reduzieren des Proteins, wobei die reaktiven Sulfidgruppen freigelegt werden, (2) zum Schützen der reaktiven Sulfidgruppen des reduzierten Proteins, um die Wiederbildung von Disulfidbindungen zu vermeiden, (3) das Natriumpertechnetat zu reduzieren und (4) mit dem reduzierten Tc-99 m einen Komplex zu bilden und ihn an die Sulfidbindungsstellen des reduzierten Proteins zu transferieren. Mit diesem Verfahren können viele Proteine erfolgreich mit Technetium-99 m radiomarkiert werden. Verschiedene Forscher haben über die Verwendung dieses Verfahrens berichtet (Rhodes, B.A., et al. "Technetium-99 m Labeling of Murine Monoclonal Antibody Fragments," Journal of Nuclear Medicine, Vol. 27, pp. 685-693, 1986; Som, P., et al. "Radioimmunoimaging of Experimental Thrombi in Dogs Using Technetium-99m-Labeled Monoclonal Antibody Fragments Reactive with Human Platelets," Journal of Nuclear Medicine, Vol. 27, No. 8, pp. 1315-1320, 1986).
Ein ähnliches Verfahren, das auch eine Reduktionslösung anwendet, die Sn (II) umfaßt, ist im U.S. Patent Nr. 4,478,815 beschrieben.
Es wurden andere frühere direkte Markierungsverfahren berichtet, welche aber keine stabile Tc-Protein-Bindung ergeben haben. Der Grund für die Instabilität der Tc-Protein-Binding in früheren Methoden (Stern, H.S., et al., Radioactive Pharmaceuticals, U.S. Atomic Energy Commission (1966), Textbook, Chapter 19, pp. 359-375; Lin, M.S., et al., "Use of Fe (II) or Sn (II) Alone for Technetium Labeling of Albumin," Journal of Nuclear Medicine, Vol. 12, No. 5, pps. 204-211, 1970; Eckelman, W.C., et al., 99mTc-Human Serim Albumin," Journal of Nuclear Medicine, Vol. 12, No. 11, pp. 707-710, 1971; Wong, D.W., et al., "A Rapid Chemical Method of Labeling Human Plasma Proteins with 99mTc-Pertechnetate at pH 7.4," International Journal of Applied Radiation and Isotopes, Vol. 29, pp. 251-253, 1978; Colombetti, L.G., et al., "A Rapid Method for Labeling IgG with 99 m-Tc," Journal of Nuclear Medicine, Vol. 20, p. 652, 1979; Rhodes, B.A., U.S. Patent No. 4,305,922, Labeling Proteins With 99 m-Tc by Ligand Exchange) war der, daß das Protein nicht reduziert worden ist, um reaktive Sulfid-Gruppen bereitzustellen, die nötig sind, um starke Bindungen zwischen dem Protein und dem reduzierten Radionukliodid zu bilden.
In der Folge wurde eine Vielzahl von Verfahren berichtet, die Abwandlungen des Verfahrens des U.S. Patentes 4,424,200 anwenden. Diese Abwandlungen umfassen im allgemeinen eines oder mehrere der folgenden Mittel: (1) Disulfidreduziermittel, die von Sn (II) verschieden sind, wie beispielsweise 2-Merkaptoethanol, Dithiothreitol und deren Analoge, werden verwendet, um das Protein zu reduzieren; (2) es werden für die reaktiven Sulfid- Gruppen Schutzmittel verwendet, die von Sn (II) verschieden sind, wie beispielsweise Zn (II); (3) es werden Pertechnetatreduziermittel, die von Sn (II) verschieden sind, wie beispielsweise Dithiothreitol verwendet; und (4) es werden komplexbildende Mittel, die von Tartrat verschieden sind, wie beispielsweise Phosphonate, verwendet, um das reduzierte Technetium zu binden und es an die Sulfid-Gruppen des Proteins zu transferieren.
Diese Verfahren haben im allgemeinen zu keiner Verbesserung gegenüber dem Verfahren des U.S. Patentes 4,424,200 geführt. Keines der geoffenbarten Verfahren führt zu Resultaten, die mit jenen vergleichbar sind, welche mit dem Verfahren, der Zusammensetzung und dem Kit erreicht werden können, die hierin geoffenbart sind.
Schwarz, A., und Steinstruaber, A., "A Novel Approach to Tc-99 m-Labeled Monoclonal Antibodies," Journal of Nuclear Medicine, Vol. 28, p. 721, 1987, und Bremer, K.H., et al., europäische Patentanmeldung Nr. 0 271 806 A2 (angemeldet am 8. Dezember 1987) reduzieren die Disulfidgruppen des Proteins mit Monothiolen, wie 2-Merkaptoethanol oder 2- Merkaptoethylamin. Sn (II) wird verwendet, um die Pertechnetatgruppen zu reduzieren und das reduzierte Technetium wird mit Phosphonaten und Pyrophosphaten zu Komplexen gemacht. Dieses Verfahren benötigt zwei oder mehrere Gefäße und eine Vielzahl von Schritten, um die Radiomarkierung zu erreichen. Die verwendeten Phosphonate können zu Radiokolloidunreinheiten im Endprodukt führen. Zusätzlich sind die zum Reduzieren der Disulfidgruppen verwendeten Chemikalien wie 2-Merkaptoethanol potentiell giftig.
Reno, J.W., et al., U.S. Patent Nr. 4,877,868 Radionuclide Antibody Coupling, und die Europäische Patentanmeldung Nr. 0 237 150 (angemeldet am 19. Jänner 1987) verwendeten Dithiothreitol (DTT), um die Disulfidgruppen des Proteins zu reduzieren, um dann die reaktiven Sulfide mit Zn (II) oder anderen sulfhydrylgruppenderivatbildenden Mitteln zu schützen. Sie verwenden Tartrat-Salze, um die reduzierten Radionuklide zu Komplexen zu führen und zu transferieren. Dieses Verfahren verwendet potentiell giftige Chemikalien wie Dithiothreitol, um den Antikörper zu reduzieren. Es benötigt auch eine Mehrzahl von Schritten, um das Protein radiozumarkieren.
Pak, K.Y., et al., "A Rapid and Efficient Method for Labeling IgG Antibodies with Tc-99 m and Comparison to Tc-99 m Fab' Antibody Fragments," Journal of Nuclear Medicine, Vol. 30, p. 793, 1989, und die Internationale PCT Patentanmeldung Nr. WO 88/07382 (angemeldet am 1. April 1988) verwendeten Dithiothreitol, um die Antikörper zu reduzieren. Tartrat- oder Glucoheptonat-Salze und ihre Analoga werden hinzugefügt, um die reduzierten Radionuklide zu Komplexen zu führen und zu transferieren. Dieses Verfahren verwendet ebenfalls potentiell giftige Chemikalien und benötigt eine Vielzahl von Schritten zur Radiomarkierung.
Shochat, D., et al., Europäische Patentanmeldung Nr. 0 336 678 (angemeldet am 3. April 1989) verwendet konventionelle Disulfidreduziermittel wie Cystein, Dithiothreitol, 2- Merkaptoethanol, Dithionit od. dgl.. Sie behaupten, daß die Vorverzinnungsmethode gemäß US. Patent Nr. 4,424,200 nicht gut funktioniert und deuten an, daß ein Teil des Radiometalls an Stellen gebunden ist, die in der Anwesenheit von Blut und anderen Körperflüssigkeiten oder Geweben verhältnismäßig labil sind. Sie geben in der Anmeldung ein einziges Beispiel, nämlich die Bereitstellung von Tc-99m-anti-CEA-Fab', welches Beispiel offensichtlich exakt das des '200 Patentes ist. Die Verwendung von Sn (II) zum Reduzieren von Natriumpertechnetat ist beim Stand der Technik gut bekannt und im '200 Patent und anderen Bezugsquellen geoffenbart.
Der Vorteil der Sn (II)-Methode zum Reduzieren der Disulfide des Proteins gegenüber anderen Verfahren besteht darin, daß Sn (II) sowohl die Bindung reduziert als auch mit dem Sulfid einen Komplex bildet, der bei der Reduktion gebildet worden ist, um das Sulfid dagegen zu schützen, in unreaktives Disulfid zurückzukehren. Wenn organische Reduziermittel wie DTT verwendet werden, um die Disulfidgruppen des Proteins zu reduzieren, muß das Reduziermittel reduziert werden, bevor sulfidschützende Gruppen hinzugefügt werden, weil andernfalls die schützenden Gruppen, üblicherweise unter Bildung eines Niederschlags, mit dem Reduziermittel reagieren würden. Wenn das Reduziermittel zuerst entfernt wird, um diese Reaktion zwischen ihm und dem Sulfidschutzmittel zu vermeiden, wird das reduzierte Protein über eine Zeitdauer belassen, in der die reaktiven Sulfid-Gruppen wieder unreaktive Disulfidbindungen bilden können. Die in dieser Erfindung beschriebene Sn (II) Reduktionsmethode ist neu in dem Umstand, daß sie gleichzeitig die Reduktion und Komplexbildung von Disulfiden erlaubt.
Andere Verfahren zum direkten Markieren wurden ebenfalls berichtet, die chemisch vom oben beschriebenen 4-Schritt-Verfahren abweichen. Paik, C.H., et al., U. S. Patent Nr. 4,652,440, Method of Stably Radiolabeling Antibodies with Technetium and Rhenium, markieren Proteine mit Sn (II)-Reduktion in der Anwesenheit eines starken Chelatmittels, DTPA, welches um das reduzierte Radionuklid kämpft. Nur eine stark gebundene Tc-99m Markierung des Proteins tritt wahrscheinlich durch eine Bindung an ursprünglich freie Sulfhydrylgruppen des Proteins auf. Es werden jedoch auch beträchtliche Mengen an Tc- 99m-DTPA gebildet, die entfernt werden müssen, bevor das markierte Protein verwendet werden kann. Dieses Verfahren weist keinen ersten Schritt des Reduzierens der Disulfidbindungen auf, die nötig sind, um hohe Ausbeuten von stark gebundenen Radionukliden zu bekommen.
Sundrehagen, E., Internationale PCT Anmeldung Nr. WO 85/03231 (angemeldet am 18. Jänner 1985) verwendet Gentisinsäure, um die niedrigen Konzentrationen von Sn (II) zu stabilisieren, die verwendet werden, um das Pertechnetat zu reduzieren. Dieses Verfahren ist hilfreich beim Minimieren radiochemischer Unreinheiten, wie Radiokolloiden und oxidierten Radionukliden. Dieses Verfahren weist keinen ersten Schritt des Reduzierens der Disulfidbindungen auf, die benötigt werden, um hohe Ausbeuten von stark gebundenen Radionukliden zu bekommen.
Lees, R.S., U.S. Patent Nr. 4,647,445, Radiolabelled Lipoproteins and Method for Making Same verwendet Dithionit bei einem pH-Wert von 8 bis 9, um sowohl Pertechnetat und Lipoproteine gleichzeitig zu reduzieren. Dieses Verfahren verlangt, daß das markierte Produkt durch Säulenchromatographie gereinigt wird, um Radionuklidverunreinigungen vor der Verwendung zu entfernen.
Breedveld, F.C., et al., "Imaging of Inflammatory Arthritis with Technetium-99m-Labeled IgG," Journal of Nuclear Medicine, Vol. 30, No. 12, pp. 2017-2021, 1989, reduzieren zuerst Pertechnetat mit Salzsäure und extrahieren, transferieren und reduzieren das Radionuklid bis zur Trockenheit. Das Protein wird dem das trockene, reduzierte Radionuklid enthaltenden Gefäß beigefügt. Die Markierung wird während einer 60minütigen Inkubation bei 40ºC erreicht. Dieses Verfahren bedarf aufwendiger Vorverarbeitung des Radionuklids und ist somit nicht sofort für ein Schnell-Kit-Verfahren zum Markieren und Formulieren eines Wirkstoffs geeignet.
McKenzie, I., et al., "Coupling of the 99mTechnetium-Nitrido Group to Monoclonal Antibody and Use of the Complexes for the Detection of Tumors in Mice," Journal of the National Cancer Institute, Vol. 77, pp. 431-439, 1986, und die Internationale PCT Anmeldung Nr. WO 87/04164 (angemeldet am 6. Jänner 1987) reduzieren Antikörper, um freie Sulfhydrylgruppen-Bindungsstellen bereitzustellen oder freie Sulfhydrylgruppen- Bindungsstellen einzufügen und markieren die Stellen mit 99mTcN(C1)&sub4;-. Das Produkt benötigt eine Reinigung durch Gelchromatographie, um radiochemische Verunreinigungen vor der Verwendung zu entfernen.
Die EP-A-0 237 150 beschreibt ein Verfahren zum Radiomarkieren, bei dem ein erstes und ein zweites Reduziermittel mit einem dazwischenliegenden Reinigungsschritt angewandt wird. Das erste Reduziermittel kann DDT oder ein Reduziermittel sein, das eine oder ein paar der Mercaptan-Gruppen enthält. Der dazwischenliegende Reinigungsschritt vor dem Hinzufügen des zweiten reduzierenden Mittels (Sn (II)) wird verwendet, um im wesentlichen das erste giftige Reduziermittel zu entfernen.
Bei dem Verfahren der EP-A-0 271 806 wird auch ein erstes Reduziermittel verwendet, das verschieden von Sn (II) ist gefolgt von einen Reinigungsschritt vor dem Hinzufügen eines zweiten Reduziermittels.
Alle vorhergehenden Verfahren sind beschränkt, weil sie kein Ein-Schritt-Markierungskit und ein solches Verfahren angeben, das innerhalb von 15 Minuten ein injizierbares Produkt liefert, welches frei von signifikanten radiochemischen Verunreinigungen ist und bei dem das Radionuklid quantitativ und stark an das Protein gebunden ist, ohne die Immunoreaktivität zu verändern, wenn das markierte Protein ein Antikörper ist. Zusätzlich verwenden viele früheren Verfahren potentiell giftige Chemikalien. Obwohl die Vorverzinnungsmethode nach Crockford und Rhodes imstande war, einen schnellen einstufigen Markierungsprozeß bereitzustellen, der ungefähr 85% des Radionuklids stark an das Protein gebunden hatte, war die radiochemische Reinheit nicht hoch genug für klinische Applikationen von allen monoklonalen Antikörpern und einige Produkte benötigen eine Endreinigung vor der Abgabe an den Patienten.
Bei der vorliegenden Erfindung können sowohl optimale Bedingungen zum Reduzieren des Proteins und die optimalen Bedingungen zum Reduzieren des Radionuklids erreicht werden, während die Annehmlichkeit einer Ein-Stufen-Markierung beibehalten werden kann. Dies wird erreicht durch Hinzufügen von Schritten beim Herstellungsprozeß. Das Protein wird mit Sn (II) wie bei der ursprünglichen Vorverzinnungsmethode von Crockford und Rhodes reduziert. Nachdem die Reduktion abgeschlossen ist, wird das reduzierte Protein einem Reinigungs- und Komplexbildungs-Schritt unterzogen, um überschüssiges Reduziermittel und Reaktionsnebenprodukte, wie Zinnchlorid oder andere Sn (IV)-Mittel zu entfernen. Ein Sn (II) Radionuklid reduzierendes Mittel wird der reduzierten Proteinlösung in Konzentrationen und mit komplexbildenden Mitteln zugefügt, die für die nachfolgende Radiomarkierung optimal sind. Das reduzierte Protein wird zusammen mit der Radionuklid reduzierenden Lösung aufgeteilt, eingefroren und gegebenenfalls gefriergetrocknet zum Lagern, bis es für die Radiomarkierung verwendet wird.
Eine andere Alternative besteht darin, den Antikörper unter Verwendung der Vorverzinnungsmethode von Crockford und Rhodes gemäß dem '200 Patent bei einer optimalen Konzentration der Reagenzien zur Reduktion des Proteins und zur Bildung des Sn (II) und schwefelhältigen Proteinkomplexes zu reduzieren und dann diese Lösung mit Reagenzien aufzulösen, um Bedingungen zu erreichen, die optimal für das Reduzieren des Radionuklids sind, wobei dieses zum Protein transferiert wird.
Beim bevorzugten Ausführungsbeispiel wird ein Radio zu markierendes Protein einer Lösung einer Sn (II)-Chloridzusammensetzung gemischt, die einen pH-Wert von ungefähr 4,5 bis ungefähr 8,5 und vorzugsweise um 5,6 aufweist, wobei die Lösung weiters eine Mischung von Natriumkaliumtartrat und Kaliumhydrogenphthalat umfaßt, wobei der pH-Wert auf ungefähr 5,6 ± 0,05 unter Verwendung von Natriumhydroxid eingestellt wird und die resultierende Lösung mit Sauerstoff gereinigt wird. Alternativ kann die Lösung andere Salze wie Natriumchlorid, Natriumacetat, Gentisinsäure oder Zinnflurid enthalten. Die Sn (II)- Salzlösung wird zum Protein in einer sauerstofffreien Umgebung hinzugefügt und das Protein und die Sn (II)-Salzlösung werden in Abwesenheit von Sauerstoff und bei Raumtemperatur über mehrere Stunden (üblicherweise 21 Stunden) inkubieren gelassen. Abwechselnd höhere oder niedere Inkubationstemperaturen können mit einer entsprechend umgekehrten Veränderung der Inkubationszeit verwendet werden, sodaß dann, wenn die Inkubationstemperatur erhöht wird, die Inkubationszeit verringert wird und umgekehrt. Für bestimmte Proteine, wie einige monoklonale Antikörper oder Fragmente davon, kann die Reaktionszeit auf unter 21 Stunden verkürzt werden, um eine übermäßige Fragmentierung des Antikörperproteins zu vermeiden und sie kann weiter verkürzt werden, wenn das Protein bereits reaktive Sulfidgruppen umfaßt.
Dem sauerstofffreien Gefäß, das das gefrorene, gereinigte reduzierte und mit Sn (II) zu einem Komplex gebildete Protein enthält, wird eine Lösung, die fähig ist Natriumpertechnetat oder Perrhenat in salziger Lösung zu reduzieren, in einer Weise hinzugegeben, um das sofortige Vermischen der beiden Lösungen zu vermeiden. Ein reines Zinnpellet kann ebenfalls dem Gefäß zugegeben werden. Die resultierende Kombination wird als Lagen von gefrorenen Lösungen oder auf eine andere Weise präpariert, ohne eine Reaktion zwischen dem gefrorenen, gereinigten und reduzierten Protein und der Lösung zum Reduzieren des Natriumpertechnetats oder -perrhenats zu erlauben. Ein Trägerprotein kann auch hinzugefügt werden, um das gereinigte und reduzierte Protein gegen Radiolyse zu schützen und um eine Adhäsion des gereinigten und reduzierten Proteins an Oberflächen wie der Gefäßwand zu verhindern. Eine Lage des Trägerproteins, wie nicht reduziertes menschliches Serum Albumin, oder ein anderes inertes Lösungsmittel, wie Inosit, oder ein anderer inerter Zucker oder eine Aminosäure, wie Glycin, wird hinzugefügt und die Lage wird gefroren oder auf eine andere Weise präpariert, ohne jede Vermischung mit den anderen Lösungen bis zur Verwendung zu ermöglichen. Sauerstoff wird vom Gefäß, das die beiden ungemischten Lösungen enthält, ausgeschlossen. Das Gefäß wird in gefrorenem Zustand gelagert oder gefriergetrocknet und für die nachfolgende Zusammensetzung gespeichert, wenn die Radiomarkierung gewünscht wird. Die Lösung zum Reduzieren des Natriumpertechnetats oder -perrhenats umfaßt Zinnchlorid und eine. Mischung von Natriumkaliumtartrat und Kaliumhydrogenphthalat, wobei der pH-Wert auf ungefähr 5,6 ± 0,05 unter Verwendung von Natriumhydroxid eingestellt wird und die resultierende Lösung von Sauerstoff gereinigt wird. In der Praxis kann häufig dieselbe Sn (II)-Salzlösung verwendet werden, um sowohl das Protein als auch das Natriumpertechnetat oder - perrhenat zu reduzieren. Die Menge oder Konzentration des Sn (II)-Salzes, welches zum Reduzieren des Natriumpertechnetats oder -perrhenats verwendet werden, ist aber wesentlich geringer als die Menge oder die Konzentration, die verwendet wird, um das Protein zu reduzieren. Alternativ kann die Lösung, die zum Reduzieren des Natriumpertechnetats oder Perrhenats verwendet wird, aus irgendeiner anderen Substanz bestehen, die das Natriumpertechnetat oder -perrhenat effektiv reduziert und das das radiozumarkierende Protein nicht verändert, wie beispielsweise Zinntartrat, Zinnphosphat, Zinngluconat, Zinnglucoheptonat oder andere Substanzen, die fähig sind Pertechnetat oder Perrhenat zu reduzieren. Das Zinnchlorid und alle solchen anderen Zinnverbindungen werden in der Beschreibung und den Ansprüchen mit Sn (II) bezeichnet. Es wird nicht mehr von der Pertechnetat oder Perrhenat reduzierenden Lösung verwendet als nötig ist, um das Natriumpertechnetat oder -perrhenat zu reduzieren. Dies wird gemacht, um eine mögliche Zerlegung des Proteins zu vermeiden, primär durch weitere Teilung der Disulfidbindungen aufgrund der Wirkung des Radionuklid reduzierenden Mittels.
Festes, hochreines metallisches Zinn kann dem Gefäß zugegeben werden, und zwar üblicherweise beim oder nach dem Frieren und in der Form eines nicht oxidierten Zinnpellets. Das Hinzufügen von metallischem Zinn vermeidet Oxidationsverluste während der Lagerung und Wiederherstellung.
Die resultierende gefrorene oder gefriergetrocknete Kombination des gereinigten, reduzierten Sn (II) und Schwefel enthaltenden komplexierten Proteins und der Radionuklid reduzierenden Lösung werden zusammen mit dem Zinnpellet, dem Trägerprotein und anderen inerten Lösungsmitteln mit einer Natriumpertechnetat-Tc-99 m oder -perrhenat- Lösung gemischt, wobei das Eindringen von Sauerstoff vermieden wird. Die Mischung wird dann über eine Zeitdauer (üblicherweise 15 Minuten) bei Raumtemperatur inkubiert, um die Reduktion des Technetiums oder Rheniums und seiner Bindungen an das reduzierte und Sn (II) zu einem Komplex gebildete Protein zu ermöglichen. Die Mischung kann durch das Hinzufügen von menschlichem Serum Albumin oder einem anderen ähnlichen Protein in normalem Salz stabilisiert werden, wenn ein Trägerprotein im ursprünglichen Gefäß nicht enthalten war.
Somit stellt dies ein Verfahren zum Radiomarkieren von reaktive Sulfid-Gruppen enthaltenden Proteinen mit Radionukliden von Technetium oder Rhenium dar, um eine stabile Markierung zu erhalten, und zwar durch Inkubieren des Proteins mit einem ersten reduzierenden Mittel, um die Disulfidbindungen teilweise zu reduzieren, Reinigen des reduzierten und Sn (II) komplexierten Proteins, um überschüssiges erstes Reduziermittel und alle Verunreinigungen zu entfernen und Hinzufügen von nur soviel von einem zweiten Reduziermittel als es nötig ist, um das Pertechnetat oder Perrhenat zu reduzieren. Ein bevorzugtes erstes Reduziermittel ist eine Quelle von Sn (II) in einer Lösung, die aus einer Mischung von einem Alkalimetallbiphthalat und einem Alkalimetalltartrat zusammengesetzt ist, welche eine Lösung von zwischen ungefähr 5,0 und 6,0 aufweist. Das erste Reduziermittel kann also 2-Merkaptoethanol, 1,4 Dithiothreitol, 2, 3 Dihydroxybutan-1, 4 Dithiol, 2-Aminoethanthiol HCl, 2-Merkaptoethylamin, Thioglycolat, Cyanid, Cystein oder eine andere Substanz sein, die fähig ist, Disulfidbindungen zu reduzieren, wobei das dann hinzugefügte Sn (II) einen Sn (II) und Schwefel-hältigen Zwischenkomplex bilden. Ein bevorzugtes zweites Reduziermittel ist eine Quelle von Sn (II) in einer Lösung, die zusammengesetzt ist aus einem Alkalimetallbiphthalat und einem Alkalimetalltartrat, welche einen pH-Wert von vorzugsweise zwischen ungefähr 5,0 und 6,0 hat. Das zweite Reduziermittel kann auch Sn (II)-Tartrat, Sn (II)-Gluconat, Sn (II)-Glucoheptonat, Sn (II)- Phosphonat, Dithionit oder andere Substanzen sein, die fähig sind, Pertechnetat oder Perrhenat zu reduzieren. Nach der Reinigung der Proteinkombination kann die gereinigte Proteinkombination eingefroren werden, das zweite Reduziermittel hinzugefügt werden und das zweite Reduziermittel sofort eingefroren werden, sodaß keine chemische Reaktion zwischen der gereinigten Proteinkombination und dem zweiten Reduziermittel vor dem Auftauen für die Verwendung eintritt. Es ist auch möglich, nach dem Frieren der Proteinkombination und dem zweiten Reduziermittel die Zusammensetzung gefrierzutrocknen. Bei oder nach der Hinzugabe des zweiten Reduziermittels kann ein festes, nicht oxidiertes metallisches Zinn der Kombination der Proteinkombination und des zweiten Reduziermittels hinzugefügt werden. Die Reinigung kann durch das Hindurchführen der Proteinkombination durch eine größenausschließende chromatographische Säule oder durch Verfahren wie eine Entsalzungssäule, Dialyse, Ultrafiltration, Niederschlagsbildung, präparative Hochleistungsflüssigchromatographie, Affinitätschromatographie oder präparatives isoelektrisches Fokussieren erfolgen. Optimale Resultate werden erzielt, wenn die Konzentration des Proteins in der Proteinkombination und des zweiten Reduziermittels mindestens 1 mg/ml der Lösung beträgt und das Volumen der Proteinkombination und des zweiten Reduziermittels mindestens 2 ml ist.
Ebenfalls beschrieben aber als solches nicht beansprucht ist eine Zusammensetzung, die geeignet ist für die Verwendung beim Herstellen eines Proteins, welches eine stabile Markierung eines Radionuklids von Technetium oder Rhenium aufweist, wobei diese Zusammensetzung umfaßt: Ein Protein, das reduziert worden ist, sodaß ein Radionuklid- und schwefelhältiger Komplex gebildet werden kann, soviel einer Sn (II) reduzierenden Zusammensetzung für Pertechnetat oder Perrhenat wie es nötig ist, um das Pertechnetat oder Perrhenat ohne weitere Reduktion des Proteins zu reduzieren, und gegebenenfalls reines, nicht oxidiertes metallisches Zinn. Die Quelle von reinem, nicht oxidierten metallischem Zinn kann ein Zinnpellet sein. Die Zusammensetzung kann unter Verwendung eines reduzierten Antikörpers oder Antikörperfragmentes als reduzierte Protein hergestellt werden. Eine inerte Trägersubstans kann ebenfalls der Zusammensetzung beigefügt werden, wie ein inerter Zucker oder ein nicht reduziertes inertes Protein. Die Zusammensetzung kann gefriergetrocknet werden, vorzugsweise gepuffert bei einem pH- Wert von 4 bis 6.
Proteine mit entweder Monosulfid- oder Disulfidbindungen können mit Radionukliden wie Technetium oder Rhenium durch Inkubation mit einem ersten Sn (II)-Mittel radiomarkiert werden. Die Inkubationsdauer muß ausreichend sein, um die Bildung von Sn (II) und schwefelhältigen Komplexen zu ermöglichen. Als Resultat der Bildung dieser Komplexe können Sn (IV)-Reaktionsnebenproduke, wie Zinnchlorid und andere Verunreinigungen, wie Proteinfragmente oder Polymere gebildet werden. Ein Reinigungsschritt wird dann angewandt, um Sn (IV) und andere Verunreinigungen im wesentlichen zu entfernen. Ein zweites Sn (II)-Mittel kann dann dem Protein enthaltenden Sn (II)- und Schwefel- enthaltenden Komplex hinzugefügt werden, und zwar in einer Menge die ausreichend ist, um das Radionuklid zu reduzieren. Das Radiomarkieren wird dann durch Hinzufügen der Radiomarkierung durchgeführt, wobei das zweite Sn (II)-Mittel das Radionuklid reduziert und das reduzierte Radionuklid im Protein Radionuklid- und Schwefel-hältige Komplexe bildet.
Das Radiomarkieren kann auch durch Weglassen des Schrittes der Hinzufügung eines zweiten Sn (II)-Mittels durchgeführt werden, in welchem Fall der Rest des ersten Sn (II)- Mittels das Radionuklid reduziert und das reduzierte Radionuklid Radionuklid- und Schwefelhältige Komplexe mit dem Protein bildet. Dies kann durch Auflösen der Reaktionsmischung geschehen, nachdem die proteinhältigen Sn (II)- und schwefelhältigen Komplexe gebildet worden sind.
Diese Verfahren sind insbesondere anwendbar auf Technetium-99m in der Form von Natriumpertechnetat. Sowohl das erste als auch das zweite Sn (II)-Mittel sind optimal in einer Lösung vorhanden, die ein Alkalimetalltartrat mit einem pH-Wert zwischen 5,0 und 6,0 enthält. Das zweite Sn (II)-Mittel kann auch aus Substanzen, wie Zinnglucoheptonat, Zinngluconat, Zinnphosphonat, Dithionat oder anderen Substanzen bestehen, die in der Lage sind, Radionuklide zu reduzieren.
Diese Verfahren sind insbesondere anwendbar auf monoklonale Antikörper, monoklonale Antikörperfragmente und polyklonale Antikörper. Diese Verfahren können verwendet werden, um ein Produkt herzustellen, welches beim Radiomarkieren mit Technetium oder Rhenium durch Einführen von Natriumpertechnetat oder -perrhenat und einer Inkubationszeit weiter dadurch gekennzeichnet ist, daß es 85% oder mehr an Technetium oder Rhenium enthält, welches stark an das Protein gebunden ist. Wenn das Produkt unter Verwendung monoklonaler Antikörper oder monoklonaler Antikörperfragmente hergestellt ist, ist weiters die Immunoreaktivität des Produktes im wesentlichen dieselbe als die Immunoreaktivität des Antikörpers vor der Inkubation mit dem ersten Sn (II)-Mittel. Das Produkt kann gefriergetrocknet werden und braucht keine Filtration oder Purifikation vor Abgabe an den Patienten in vivo.
Proteine mit entweder Monosulfid- oder Disulfidbindungen können auch mit Radionukliden, wie Technetium oder Rhenium unter Verwendung einer Abwandlung der obigen Methode radiomarkiert werden. Das Protein wird mit einem ersten Sn (II)-Mittel inkubiert, welches wie oben beschrieben sein kann. Die Inkubationsdauer muß ausreichend sein, um die Bildung von Sn (II)- und Schwefel- hältigen Komplexen zu erlauben. Als Resultat der Bildung der Komplexe können Sn (IV)-Reaktionsnebenprodukte und andere Verunreinigungen gebildet werden. Sn (IV)-Reaktionsnebenprodukte können dann mit einer Polyamincarbonsäure, wie Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) oder Diethylentriaminpentaessigsäure (DTPA) zu Komplexen geführt werden. Das Radiomarkieren wird durch Hinzufügen des Radionuklids durchgeführt, wobei der Rest des ersten Sn (II)-Mittels das Radionuklid reduziert und das reduzierte Radionuklid Radionuklid- und schwefelhältige Komplexe im Protein bildet.
Das Radiomarkieren kann optimal durch das Hinzufügen eines zweiten Sn (II)-Mittels durchgeführt werden, um die Reduktion des Radionuklids zu erleichtern, gefolgt von der Hinzufügung des komplexbildenden Mittels, wie einer Polyamincarbonsäure.
Die Verfahren, welche Polyamincarbonsäure verwenden, sind insbesondere auf Technetium-99m in der Form von Natriumpertechnetat anwendbar. Sowohl die ersten als auch zweiten Sn (II)-Mittel sind optimal in einer Lösung vorhanden, die ein Alkalimetalltartrat mit einem pH-Wert zwischen 5,0 und 6,0 enthält. Das zweite Sn (II)-Mittel kann auch aus Substanzen, wie Zinnglucoheptonat, Zinngluconat, Zinnphosphonat oder anderen Substanzen bestehen, die in der Lage sind, Radionuklide zu reduzieren.
Die Polyamincarbonsäuren verwendenden Verfahren sind insbesondere auf monoklonale Antikörper, monoklonale Antikörperfragmente und polyklonale Antikörper anwendbar. Diese Verfahren können verwendet werden, um ein Produkt herzustellen, welches beim Radiomarkieren mit Technetium durch Einführen von Natriumpertechnetat und einer Inkubationszeit weiters dadurch gekennzeichnet sind, daß sie 85% oder mehr an Technetium stark an das Protein gebunden haben. Wenn das Produkt unter Verwendung monklonaler Antikörper oder monklonaler Antikörperfragmente hergestellt ist, ist weiters die Immunoreaktivität des Produktes im wesentlichen dieselbe, als die Immunoreaktivität des Antikörpers vor der Inkubation mit dem ersten Sn (II)-Mittel. Das Produkt kann gefriergetrocknet werden und braucht keine Filtrierung oder Reinigung vor der Abgabe an den Patienten in vivo.
Alle vorhergehenden Verfahren führen zu einer eiweißartigen Zusammensetzung, in der sich ein Sn (II)- und Schwefel-hältiger Komplex findet, welcher reaktive Sulfid-Gruppen im Komplex mit Sn (II) enthält, wobei die Verbindung zum Radiomarkieren mit Radionukliden, wie Technetium oder Rhenium geeignet ist. Die Verbindung kann auch ein Sn (II) reduzierendes Mittel in einer Menge enthalten, die ausreicht, um das Radionuklid zu reduzieren und kann auch ein komplexbildendes Mittel, vorzugsweise eine Polyamincarbonsäure, wie EDTA und DTPA enthalten. Das Protein kann ein monoklonaler Antikörper, ein monoklonales Antikörperfragment oder ein polyklonaler Antikörper sein und kann in ein Produkt eingearbeitet sein. Das Produkt kann gefriergetrocknet werden. Beim Radiomarkieren mit Technetium durch Hinzufügen von Natriumpertechnetat und einer Inkubationszeit ist das Produkt weiters dadurch gekennzeichnet, daß es 85% oder mehr an Technetium enthält, welches stark an das Protein gebunden ist. Es ist auch dadurch gekennzeichnet, daß es eine Inkubationszeit von 15 Minuten oder weniger benötigt.
Es ist daher ein Vorteil der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur direkten Markierung von Proteinen mit Technetium oder Rhenium bereitzustellen, welches unerwünschte Fragmente oder auf andere Weise degradierte Proteinkomponenten aus dem Endprodukt eliminiert.
Es ist ein weiterer Vorteil der vorliegenden Erfindung ein Verfahren bereitzustellen, das zu erhöhten Radiomarkierungsausbeuten führt, und zwar unter Verwendung von Technetium oder Rhenium als dem Radioisotopen.
Es ist ein weiterer Vorteil der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zum Radiomarkieren von Antikörpern oder Antikörperfragmenten bereitzustellen, ohne die Affinität der Antikörper oder Antikörperfragmente aufgrund des Radiomarkierungsprozesses zu verlieren.
Es ist ein weiterer Vorteil der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zum Radiomarkieren von Proteinen mit Technetium oder Rhenium bereitzustellen, das keine möglicherweise giftigen oder verletzenden Chemikalien oder Substanzen beim Verfahren verwendet.
Ein weiterer Vorteil der vorliegenden Erfindung besteht darin ein Verfahren bereitzustellen, das es erlaubt das Radiomarkieren durch den Endbenutzer unter Verwendung eines einzelnen Gefäßes durchzuführen, welches sowohl den reduzierten Antikörper als auch Zinnionen enthält und welches weiter ein Mittel enthält, um geringe Mengen an Zinnionen aufrechtzuerhalten, während ein Schutz gegen Oxidationsverluste erfolgt, wobei das Verfahren nur einen einzigen Schritt benötigt, um das Radiomarkieren durchzuführen, nämlich die Einfügung von Natriumpertechnetat.
Weitere Vorteile und neue Merkmale sowie ein weiterer Umfang der Anwendbarkeit der vorliegenden Erfindung werden zum Teil in der detaillierten folgenden Beschreibung dargelegt und werden zum Teil den Fachleuten beim Studieren des folgenden augenscheinlich werden oder können durch Ausführung der Erfindung erfahren werden. Die Vorteile der Erfindung können durch die Instrumentierungen und Kombinationen, die in den angefügten Ansprüchen ausgeführt sind, realisiert und erzielt werden.
Jedes Protein, Chelatmittel oder andere Substrat, das eine oder mehrere Monosulfid- oder Disulfidbindungen enthält, die reduzierbar ist, kann gemäß dieser Erfindung radiomarkiert werden. Repräsentative geeignete Substanzen umfassen humanes Serum Albumin, Fibrinogen, Urokinase, Gammaglobulin, Glycoproteine, andere Proteine und Antikörper oder Antikörperfragmente jeder Art, umfassend sowohl polyklonale als auch monoklonale Antikörper, die auf irgendeine Weise hergestellt sind, sowie chemisch und genetisch hergestellte Antikörper und Antikörperfragmente von all dem vorhergehenden. Dies umfaßt Immunoglobuline jeder Klasse, wie IgG, IgM, IgA, IgD oder IgE vom Ursprung irgendeiner Spezies inklusive des Menschen, chemische Antikörper oder Hybridantikörper mit doppelten oder multiplen Antigen- oder Epitopspezifikationen und Fragmente von all dem vorhergehenden, inklusive F(ab')&sub2;, F(ab)&sub2;, Fab', Fab und andere Fragmente inklusive Hybridfragmente, wobei weiters jedes Immunoglobulin oder jedes natürliche synthetisch oder genetisch hergestellte Protein umfaßt ist, das funktionell wie ein Antikörper agiert durch Bindung an ein spezifisches Antigen, um einen Komplex zu bilden. Der Begriff "Antikörper" und die Phrase "monoklonale Antikörperkomponente", wie sie in der Beschreibung und den Ansprüchen verwendet sind, soll alle solchen Antikörper und Antikörperfragmente enthalten.
Die vorliegende Erfindung weist durch den Einschluß eines Reinigungsschrittes und der gleichzeitigen Entfernung von überschüssigen Reduzierreagenzien eine Vielzahl von signifikanten Vorteilen auf. Durch Entfernung aller Arten von reduziertem Protein außer dem Radio zu markierenden Protein, inklusive solcher mit kleineren oder größeren Molekulargewicht, wird die Konkurrenz für reduziertes Tc-99 m eliminiert. Dies führt zu wesentlich höheren Radiomarkierungsausbeuten. Durch Halten der Gesamtmenge von zinnartigen oder Zinnionen in der Pertechnetat- oder Perrhenatreduzierlösung so gering wie möglich, wird die Bildung von zusätzlichen reduzierten Proteinarten vermieden. Es braucht im allgemeinen weit weniger Zinnionen, um Pertechnetat oder Perrhenat zu reduzieren, als für die Reduzierung von Disulfidbindungen in Proteinen, wobei die Reduktion von Pertechnetat und Perrhenat ohne zusätzliche Reduzierung von Disulfidbindungen im radiozumarkierenden Protein ermöglicht wird, welche zusätzliche Reduktion zu Proteinarten führen könnte, die anders sind als das Radio zu markierende Protein.
Die vorliegende Erfindung bietet auch signifikante Vorteile, weil sie nur einen Schritt benötigt, um das Radiomarkieren durch den Endbenutzer durchzuführen, nämlich die Hinzufügung von Natriumpertechnetat oder -perrhenat und die gleichzeitige Inkubation von diesem. Die signifikante Vereinfachung ist möglich, weil sowohl die Zinnionen als auch die reduzierten Antikörper zusammen mit einem Trägerprotein und anderen inerten Lösungsmitteln und optional gefriergetrocknet im selben Gefäß gefroren sind. Das Hinzufügen eines Zinnpellets oder einer anderen Quelle von gereinigten und nicht oxidierten metallischem Zinn hält weiter die niedrige Konzentration von Zinnionen aufrecht und hilft den Verlust von Radiomarkierungen aufgrund der Oxidation während der Lagerung und Wiederherstellung zu vermeiden.
Die Erfindung wird weiter in den folgenden nicht einschränkenden Beispielen beschrieben.

Beispiel I

Eine Sn (II) reduzierende Lösung wurde aus Zinnchlorid in einer Tartrat-Phthalat-Lösung hergestellt. Das Zinnchlorid wurde durch Auflösen von Zinnchloridkristallen in konzentrierter Salzsäure bei 0,5 M hergestellt, was zu ungefähr 94,8 mg Zinnchlorid pro ml führt. Diese Lösung wird dann in verschlossenen und stickstoffgereinigten Gefäß bis zur Verwendung aufbewahrt. Alternative Quellen für Zinnchlorid können verwendet werden, inklusive der Verwendung von nicht oxidierten, festen Zinnpellets, die mit konzentrierter Salzsäure in Kontakt gebracht werden.
Eine Tartrat-Phthalat-Lösung von einer Mischung aus Natrium-Kalium-Tartrat und Kaliumhydrogenphthalat wurde hergestellt. 0,282 g Natrium-Kalium-Tartrat wurde in 100 ml destilliertem Wasser aufgelöst und dieser wurde 0,817 g Kaliumhydrogenphthalat zugegeben. Der pH-Wert wurde auf ungefähr 5,0 unter Verwendung von 10 N Natriumhydroxid eingestellt und wurde dann auf 5,6 ± 0,05 unter Verwendung von 1 N Natriumhydroxid eingestellt. Die resultierende Lösung wurde gerührt und von Sauerstoff durch Einblasen von Inertgas, wie Stickstoff, Helium od. dgl., durch die Substanz gereinigt.
Die Sn (II) reduzierende Lösung wurde durch Zumessen einer Portion der gereinigten Tartrat-Phthalat-Lösung in eine Flasche und langsames Zugeben eines Volumens von Zinnchlorid hergestellt. Es ist vorteilhaft, wenn ein Pürierstift oder ein ähnlicher Mechanismus verwendet wird, um das Mischen des Zinnchlorids sicherzustellen, wenn es der Lösung zugegeben wird. Ungefähr ein Volumenteil an Zinnchlorid auf 100 Volumenteile an Puffer wurden verwendet. Der pH-Wert wurde kontinuierlich überwacht und sobald das Zinnchlorid zugegeben war, wurde der pH-Wert auf ungefähr 5,0 unter Verwendung von 10 N Natriumhydroxid eingestellt und wurde dann auf 5,6 ± 0,05 unter Verwendung von 1 N Natriumhydroxid eingestellt.
Alle Schritte wurden in einer sauerstofffreien Umgebung durchgeführt und können ausgeführt werden, während Inertgas durch die Lösung in Blasen geführt wird. Die resultierende Lösung wird von Sauerstoff durch Einblasen von Inertgas, wie Stickstoff, Helium od. dgl., durch die Substanz gereinigt.
Alternativ kann die Antikörper reduzierende Lösung unter Verwendung anderer Disulfid reduzierender Mittel, wie 2-Merkaptoethanol, 1,4 Dithiothreitol, 2, 3 Dihydroxybutan-1, 4 Dithiol, 2-Aminoethanthiol HCl, 2-Merkaptoethylamin, Thioglycolat, Cyanid, Cystein oder andere Disulfid zerteilende Reagenzien hergestellt werden.
Das zu reduzierende Protein wird in ein Stickstoff gereinigtes, verschlossenes Gefäß gegeben. Wenn ein monoklonaler Antikörper oder Fragmente davon zu markieren sind, wird ein Minimum von 0,1 mg und vorzugsweise mindestens 2 mg des monoklonalen Antikörpers oder Fragmentes verwendet, und zwar mit einer Konzentration von 1 mg oder mehr pro ml, vorzugsweise 1,7 mg/ml. Der monoklonale Antikörper, Fragmente oder ein anderes Protein können in einer Normalsalzlösung aufgelöst werden oder durch Ultrafiltration konzentriert werden, wenn dies nötig ist. Dem Protein wird eine Sn (II) reduzierende Lösung im ungefähren Verhältnis von 3 Volumsteilen des Proteins auf 2 Volumsteile des Sn (II) reduzierenden Lösung hinzugegeben. Das Gefäß, das das Protein und die Sn (II) reduzierende Lösung enthält, wird dann inkubieren gelassen, und zwar vorzugsweise in einer sauerstofffreien Umgebung, wie einem mit Stickstoff oder einem anderen Inertgas gefüllten Behälter. Das Gefäß wird bei Raumtemperatur über eine Zeitdauer inkubieren gelassen, die ausreicht, um die Reduktion der Disulfidbindungen im Protein zu reduzieren. Im allgemeinen ist eine Inkubation zwischen 1 und 24 Stunden bei Raumtemperatur angemessen, wobei die Inkubation über 24 Stunden bei Raumtemperatur für die meisten ganzen Immunoglobuline bevorzugt ist. Wenn die Temperatur angehoben wird, wird die Inkubationszeit verringert und umgekehrt verlangt die Inkubation bei niedrigeren ' Temperaturen entsprechende längere Inkubationszeiten. Die Inkubation wird durch Frieren der Mischung des Proteins und der Sn (II) reduzierenden Lösung, durch Auflösung oder durch sofortiges Weiterbehandeln mit der Reinigung beendet.
Wenn andere Reduziermittel verwendet werden, wie 2-Merkaptoethanol, 1,4 Dithiothreitol, 2,3 Dihydroxybutan-1, 4 Dithiol, 2-Aminoethanthiol HCl, 2-Merkaptoethylamin, Thioglycolat, Cyanid, Cystein oder andere Disulfid teilende Reagenzien, muß die Inkubationszeit für das spezifisch verwendete Reduziermittel angepaßt werden. Im allgemeinen ist eine geringere Inkubationszeit nötig. Nachdem die Reduzierlösung entfernt ist, wird Sn (II) Salz zugegeben, um einen Sn (II) und Schwefel enthaltenden Komplex zu bilden und damit die reduzierten Disulfidgruppen während der folgenden Reinigungsschritte zu erhalten. Die Reinigungsschritte, die mit diesen Reduziermitteln vorgenommen werden, müssen im wesentlichen das gesamte Reduziermittel entfernen.
Die Mischung des Proteins und der Sn (II) reduzierenden oder anders reduzierenden Lösung wird vorzugsweise durch Größenausschlußchromatographie gereinigt. Eine Säule wird mit einem geeigneten Gel, wie Sephacryl®-200 Gel (Pharmacia, Piscataway, NJ) zur Verwendung mit monoklonalen Antikörperfragmenten F(ab')&sub2; mit niedrigem Molekulargewicht. Die Säule wird mit einem geeigneten Eluierungspuffer, wie einer Gentisat gepufferten Lösung equilibriert. Die Mischung des Proteins und der reduzierenden Lösung wird der Säule zugeführt und unter Verwendung des Eluierungspuffers fraktioniert. Ein Fraktionsprofil wird unter Verwendung eines Ultraviolettdetektors oder einer ähnlichen Einrichtung erzeugt und die Teile, welche das resultierende radiozumarkierende Protein enthalten, werden gesammelt und vereinigt. Das resultierende reduzierte Protein wird wenn nötig konzentriert, vorzugsweise auf eine Konzentration von 1,7 mg/ml. Die Konzentration kann durch Ultrafiltration erzielt werden. Das resultierende Konzentrat kann auch gegen eine Normalsalzlösung dialysiert werden, um jeden Rest an Sn (IV) zu salzen oder anderen Resten reduzierender Mittel zu entfernen.
Alternativ kann die Mischung des Sn (II) und Schwefel enthaltenden komplexierten Proteins und der Sn (II) oder anders reduzierenden Lösung durch Durchführen der Mischung durch eine Entsalzungssäule, Sammeln des reduzierten Proteins und Entfernen der Sn (IV) Salze und überschüssigen Reduzierreagenzien gereinigt. Das resultierende Extraktionsmittel kann wie gewünscht konzentriert und dialysiert werden. Dieses Verfahren entfernt überschüssige Sn (II) Lösung, Sn (IV) Reaktionsnebenprodukte und andere Reduktionsreagenzien, aber wird nicht notwendigerweise andere Verunreinigungen wie kleinere Fragmente des Proteins, die von einer Überreduktion der Disulfidbindungen im Protein stammen, oder die Aggregation reduzierter Proteine entfernen. Diese kleinen Fragmente oder großen Aggregate können im Fall monoklonalen Antikörpern nicht mehr immunoreaktiv sein oder können eine Bioverteilung haben, die von der des gewünschten Proteins verschieden ist, was es nötig macht, sie aus dem Endprodukt zu entfernen.
Alternativ kann die Mischung des reduzierten Proteins und der Sn (II) oder anders reduzierenden Lösung auch durch andere Mittel gereinigt werden, umfassend Dialyse, Ultrafiltration, Fällung, präparative Hochleistungsflüssigchromatographie, Affinitätschromatographie, andere Formen der Chromatographie, präparative isoelektrische Fokussierung oder andere Reinigungsmittel, die beim Stand der Technik üblich sind.
Das gereinigte, reduzierte und Sn (II) komplexierte Protein wird dann von Sauerstoff, vorzugsweise durch Einblasen von Inertgas, wie Stickstoff, durch die Lösung gereinigt und kann in Sauerstoff gereinigtem Gefäß eingefroren werden. Zu jedem Gefäß, das die gefrorene Proteinlösung enthält, wird eine Pertechnetat reduzierende Lösung zugegeben und der Inhalt entweder sofort gefroren oder gefriergetrocknet, sodaß keine Reaktion zwischen der gefrorenen Proteinlösung und der Pertechnetat-Reduzierlösung eintritt. Ein nicht oxidiertes Zinnpellet kann auch dem Gefäß zugegeben werden, wobei das Zinnpellet Spurenmengen von Sn (II) ersetzen wird und hilft, die niedrige Konzentration von Zinnionen in der Pertechnetat-Reduzierlösung zu stabilisieren und hilft Radiomarkierungsverluste aufgrund von Reoxidation während der Lagerung des radiomarkierten Produktes zu vermeiden. Die Pertechnetat-Reduzierlösung kann wie die Sn (II) Reduzierlösung hergestellt werden mit Ausnahme, daß ungefähr 1 Volumsteil Zinnchlorid mit 0,1M ungefähr 5000 Volumsteilen Tartrat-Phthalat-Lösung zugegeben wird, was zu einer Pertechnetat reduzierenden Lösung von ungefähr 0,1 Millimol führt. Ungefähr 1 Volumsteil Pertechnetat reduzierender Lösung wird 2 Volumsteilen gereinigter, reduzierter und Sn (II) komplexierten Protein beigegeben. Optimalerweise liegt die Konzentration der Proteinlösung bei ungefähr 1,7 mg/ml und auf jeden 1,32 ml an gereinigter, reduzierter und Sn (II) komplexierter Proteinlösung wird ungefähr 0,68 ml der Pertechnetat reduzierenden Lösung hinzugefügt.
Alternativ kann die Pertechnetat reduzierende Lösung unter Verwendung von Sn (II) Glucoheptonat, Sn (II) Tartrat, Sn (II) Phosphonat, Dithionit und anderen üblicherweise verwendeten Tc-99m radiopharmakologischen Kits hergestellt werden.
Die Pertechnetat reduzierende Lösung kann auch verwendet werden, um Perrhenat zu reduzieren. Die Diskussion von Pertechnetat und Pertechnetatverbindungen in der ganzen Beschreibung ist auch auf Perrhenat und Perrhenatverbindungen anwendbar. Ähnlich ist die Diskussion von Technetium und seinen Verbindungen durch die ganze Beschreibung auch auf Rhenium und seine Verbindungen anwendbar.
Um Radiozumarkieren, wird die gewünschte Aktivität von Natriumpertechnetat-Tc-99m zugegeben und gemischt und die Mischung wird über eine Zeitdauer inkubieren gelassen, im allgemeinen ungefähr 15 Minuten. Dieser Schritt wird durchgeführt, während die Einführung von atmosphärischem Sauerstoff vermieden oder minimiert wird. Wenn dies gewünscht ist, kann das resultierende radiomarkierte Protein durch Hinzugabe von 1% menschlichem Serum Albumin in Normalsalzlösung oder eines anderen geeigneten Schutzproteins stabilisiert werden.
Die Quelle an Technetium-99m wird auf konventionelle Art als Natriumpertechnetat-Tc-99m aus einem 99Mo/99mTc-Generator gewonnen. Jede Quelle für pharmazeutisch akzeptables Technetium-99m kann für die vorliegende Erfindung verwendet werden.
Alternativ können andere Radioisotope von Technetium und Isotope von Rhenium, wie Re- 186 und Re-188 verwendet werden. Wenn Perrhenat statt Pertechnetat reduziert wird, sind im allgemeinen eine höhere Temperatur und ein längeres Radiomarkieren nötig, um die Reaktion zu Ende zu führen.

Beispiel II

Dieses Beispiel illustriert das Verfahren der Erfindung zum Markieren von Immunoglobulin G (IgG). IgG wird aus Tieren, wie Schafen, Geisen, Mäusen, oder Menschen gewonnen. Natriumpertechnetat-Tc-99m U.S.P. wird von einer kommerziellen Quelle erhalten.
Ein Sn (II) disulfidbindungsreduzierendes Mittel wurde durch Zugabe von 0,2 ml von 0,5 M Zinnchlorid in konzentrierter HCl (12 M) zu 20 ml von 40 mM Kaliumbiphthalat und 10 mM Natriumtartrat-Lösung (pH-Wert von 5,6). Das Zinnchlorid wurde durch Hinzufügen von konzentrierter Salzsäule zu nicht oxidierten Pellets von SnCl&sub2; hergestellt, die eine von matten zinnoxidfreie Oberfläche haben. Der pH-Wert der resultierenden Reduktionslösung wurde dann auf 5,6 ± 0,05 gebracht, und zwar durch Hinzufügen von 10M NaOH auf einen pH-Wert auf 5,5 und Hinzufügen von 1 M NaOH, um den endgültigen pH-Wert einzustellen.
Eine IgG-Herstellung wurde durch Auflösen von 0,25 ml Immunglobulin (menschlich), U.S. P., Cutter Biological, das 15-18% in 0,21-0,32 M Glyzin stabilisiertes Protein enthält, mit 7,25 ml sterilem Wasser zur Injektion, U.S.P., und durch Filtern durch einen Filter mit 0,22 Mikron hergestellt. 5 ml der Sn (II) reduzierenden Lösung wurde mit 7,5 ml von IgG gemischt. Das die gemischten Lösungen enthaltenden Gefäße wurden versiegelt und mit N&sub2;- Gas geflutet, um Sauerstoff zu entfernen. Die gemischte Lösung wurde 21 Stunden lang bei Raumtemperatur im Dunkeln gelagert, um die teilweise Reduktion der Disulfidbindungen zu erlauben und das zu bilden, was im folgenden als reduziertes Protein bezeichnet wird. Nach 21-stündiger Inkubation wurde der Inhalt des Gefäßes durch eine PD-10-Entsalzungssäule (Pharmacia LKB Biotechnology, Piscataway, NJ) geführt; Der das Protein enthaltende Teil wurde gesammelt und das übrige Eluat, das das Sn (II), Sn (IV) und andere Salze enthalten hat, wurde entfernt. Der reduzierte und Sn (II) komplexierte Proteinteil wurde durch Ultrafiltration auf eine Konzentration von 1,7 mg/ml konzentriert. 0,5 mg-Teile des reduzierten und Sn (II) komplexierten Proteins wurden in versiegelte Stickstoffgas gefüllte Serumgefäß gegeben und eingefroren. Eine Sn (II) Pertechnetatreduzierlösung wurde mit 0,5 ml von 0,1 mM SnCl&sub2; in 40 mM Kaliumbiphthalatllo mM Natrium bei einem pH-Wert von 5,6 hergestellt. Die Sn (II) Pertechnetatreduzierlösung wurde hinzugegeben, ohne es der Antikörperlösung zu erlauben, aufzutauen und diese Lösung wurde auch eingefroren. Ein steriles Zinngranulat mit 3 mm Durchmesser wurde hinzugegeben, das Gefäß mit N&sub2; geflutet und bei -20ºC gelagert, bis es zum Radiomarkieren benötigt wurde.
Um die Gammaglobulinpräparation mit Tc-99m radiozumarkieren, wurde 1,0 ml an Natriumpertechnetat-Tc-99m, U.S.P., mit einer Radioaktivität von 2,5 mCi dem Gefäß zugegeben und das Gefäß und der Inhalt auf Raumtemperatur gebracht, gemischt und 15 Minuten lang stehengelassen. Eine Dünnschichtchromatographische Analyse des Produktes ergab, daß 99,6% der Radioaktivität an das Protein gebunden war. Eine Hochleistungsflüssigchromatographie, die sowohl UV als auch Radioisotopdetektoren verwendet, zeigte, daß die Tc-99 m Elution parallel zum Proteinelutionsprofil verläuft.

Beispiel III

Dieses Beispiel illustriert das Verfahren der Erfindung zur Markierung monoklonaler mäuslicher Antikörper der IgG- und IgM-Klassen. Der Antikörper wurde aus mäuslicher Asciten- oder Bioreaktor-Flüssigkeit gewonnen, auf mehr als 95% gereinigt und bei Konzentrationen hergestellt, die größer als 1 mg/ml in 0,9% NaCl-Lösung sind.
Eine Sn (II) Reduzierlösung wurde wie in Beispiel II hergestellt. Zwei ganze Antikörperpräparationen wurden getestet; B72.3, ein mäuslicher Antikörper und Anti-SSEA- 1, ein IgG mäuslicher Antikörper. Die Antikörperpräparation war bei einer Proteinkonzentration von 1,7 mg /ml vor. Auf jeden ml der gereinigten Proteinlösung wurden 0,66 ml der Sn (II) reduzierenden Lösung zugefügt. Die gemischten Lösungen wurden inkubiert und durch eine PD-10-Säule wie in Beispiel II durchgeführt. Der reduzierte Proteinteil wurde durch Ultrafiltrationkonzentration von 2 mg/ml konzentriert. Teile des reduzierten Proteins, die zwischen 0,5 und 2,0 mg Protein enthalten haben, wurden in verschlossene Sn (II)-Gas gefüllte Serumgefäße gegeben und gefroren.
Eine Pertechnetatreduzierlösung wurde durch Auflösen von 50 mg Gentisinsäure, 0,375 ug SnCl&sub2; und 975 ug Natriumkaliumtartrat in 50 ml destilliertem Wasser hergestellt, welches vorher durch Durchführen von N&sub2;-Gas über 2 oder 3 Minuten von Sauerstoff befreit wurde. Der pH-Wert wurde bei 7,0 durch Hinzugabe von stark verdünntem NaOH (0,05 N) eingestellt. Gleiche Teile dieser Lösung wurden über der gefrorenen reduzierten und Sn (II) komplexierten Proteinlösung gegeben und gefroren. Ein steriles Zinnmetallgranulat mit 3 mm Durchmesser wurde hinzugefügt, das Gefäß mit N&sub2; geflutet und bei -20ºC bis zum Bedarf für das Radiomarkieren gespeichert.
Um die IgG und IgM Präparationen mit Tc-99m radiozumarkieren, wurde 1,0 ml Natriumpertechnetat-Tc-99 m, U.S.P., mit 2,5 mCi an Radioaktivität jedem Gefäß zugegeben und das Gefäß und der Inhalt auf Raumtemperatur gebracht, gemischt und 15 Minuten lang stehengelassen. Eine Dünnschichtchromatographieanalyse der Produkte zeigte, daß 90,0% bis 96,5% der Radioaktivität an das Protein gebunden war. Eine Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC), die sowohl UV als auch Radioisotopdetektoren verwendet, zeigte, daß die Tc-99m Elution parallel zum Proteinelutionsprofil verlief. Es wurde keine nicht an das Protein Radioaktivität durch die HPLC-Analyse gefunden.

Beispiel IV

Dieses Beispiel zeigt das Verfahren der Erfindung zum Markieren eines F(ab')&sub2;-Fragmentes eines monoklonalen Antikörpers. Dieses Beispiel zeigt auch, daß die Zusammensetzung des radiomarkierten Produktes mit dem Verfahren und dem Typ des verwendeten Disulfidreduziermittels variiert. Dieses Beispiel zeigt auch, daß das laufende Verfahren besser ist als das ursprüngliche direkte Markierverfahren von Crockford und Rhodes, U.S. Patent Nr. 4,424,200 mit dem Titel "Method for Radiolabeling Proteins with Technetium- 99M", und zwar für dieses spezielle monoklonale Antikörperfragment. Das F(ab')&sub2;-Fragment wurde durch Pepsinverdauung monoklonaler Antikörper gefolgt von chromatographischer Reinigung erhalten, die die F(ab')&sub2;-Fragmente mit einer Reinheit von mehr als 95% von anderen Materialien getrennt hat, die in der Pepsinverdauung gefunden wurden.
Das monoklonale Antikörperfragment, das bei diesem Beispiel verwendet wurde, wurde von Sorin Biotechnica, Italien erhalten. Es war ein mäuslicher Anti-CEA F(ab')&sub2;, für den frühere Experimente eine sehr schlechte Radiomarkierung mit Tc-99m unter Verwendung einer Vorverzinnungsmethode gezeigt hatten.
Es wurden vier verschiedene Radiomarkierungsprozeduren angewandt, eine verwendete die originale Vorverzinnungsmethode, wie sie im U.S. Patent Nr. 4,424,200 beschrieben ist und im Vergleich dazu drei andere Verfahren. Die vier Verfahren können wie folgt zusammengefaßt werden:
1. Das originale Vorverzinnungsverfahren, das im U.S. Patent Nr. 4,424,200 beschrieben ist, bei dem eine Sn (II) reduzierende Lösung, wie im Beispiel II beschrieben, hergestellt worden ist, aber kein Reinigungsschritt durchgeführt wurde und keine Pertechnetatreduzierlösung zugegeben wurde.
2. Das Verfahren dieser Erfindung unter Verwendung einer Sn (II) reduzierenden Lösung, um die Disulfidbindungen im Antikörperfragment zu reduzieren, wie dies im Beispiel II beschrieben wurde, mit Reinigungsschritt unter Verwendung einer PD-10 Entsalzungssäule und einer Pertechnetatreduzierlösung, die aus einem Zinnsalz mit einem Zinnpellet zusammengesetzt ist.
3. Ein Verfahren unter Verwendung von 2-Merkaptoethanol zum Reduzieren der Disulfidbindungen im Antikörperfragment. Eine 5%ige 2-Merkaptoethanollösung wurde in einem 0,1 M Phosphatpuffer bei einem pH-Wert von 8,0 hergestellt. 1 ml dieser Lösung wurde 1 mg des gefriergetrockneten Antikörperfragmentproteins zugegeben und bis zum Auflösen gemischt. Nach einer 1stündigen Inkubation bei Raumtemperatur wurde 1,6 ml einer Salzlösung zugegeben und das teilweise reduzierte Protein von den anderen Komponenten in der Lösung durch Hindurchführen durch eine PD-10 Entsalzungssäule getrennt. Das Protein wurde durch Ultrafiltration auf 1,7 mg/ml konzentriert. Eine Pertechnetatreduzierlösung, die aus einem Zinnsalz mit einem Zinnpellet zusammengesetzt war, wie im Beispiel II, wurde dann hinzugefügt.
4. Ein Verfahren unter Verwendung von Dithiothreitol zum Reduzieren der Disulfidbindungen im Antikörperfragment. 15,4 mg von d1-Dithiothreitol (DTT) wurde 10 ml einer Lösung von 50 mM Tris und 1 mM EDTA bei einem pH-Wert von 8,0 aufgelöst. Für jedes mg des gefriergetrockneten zu reduzierenden Proteins wurde 0,33 ml der Reduktionslösung hinzugefügt und bis zur Auflösung des Proteins gemischt. Die Reduktionsmischung wurde 1 Stunde lang bei 37ºC reagieren gelassen. Das teilweise reduzierte Protein wurde durch eine Größenausschlußchromatographiesäule gereinigt, wobei der Proteinteil, der im Molekulargewicht dem ursprünglichen F(ab')&sub2; Antikörperfragment entsprochen hat, gesammelt wurde. Das chromatographisch gereinigte Fragment wurde durch Ultrafiltration auf 1,7 mg/ml in 0,9%iger Salzlösung gereinigt. Eine Pertechnetat reduzierende Lösung, die aus einem Zinnsalz mit einem Zinnpellet zusammengesetzt ist, wurde dann, wie im Beispiel II, zugegeben.
Für jede der vier Präparationen wurde das gefrorene und in einem Glasfläschchen befindliche Antikörperfragment radiomarkiert und wie in Beispiel II getestet. Die Resultate der vier verschiedenen Verfahren, welche dasselbe Antikörperfragment verwenden, sind in der Tabelle 1 aufgelistet.
Die Tabelle 1 zeigt, daß dieses spezifische mäusliche monoklonale F(ab')&sub2; Antikörperfragment unter Verwendung der ursprünglichen Vorverzinnungsmethode, wie sie im U.S. Patent Nr. 4,424,200 gelehrt ist, nicht effektiv radiomarkiert werden kann, bei welcher Methode keinen Reinigungsschritt und keine Hinzufügung beschränkter Mengen einer Pertechnetatreduzierlösung gibt, das aber eine effektive Radiomarkierung unter Verwendung einer der anderen drei Verfahren möglich ist. Dasselbe Pertechnetatreduziermittel, hier Sn (II), wurde bei jedem Verfahren verwendet. Die Bedingungen während des Verfahrens wurden nicht optimiert, um eine über 85% liegende Bindung zu erzielen. Der Zweck des Vergleiches war es zu zeigen, wie die Bindung unter Verwendung des Verfahrens der Erfindung wesentlich verbessert werden kann.

Tabelle 1

Vergleich der Resultate unter Verwendung verschiedener
Verfahren zur teilweisen Reduktion der Disulfidbindungen
von Anti-CEA F(ab')&sub2;
Disulfidreduktionsverfahren Resultate
1. Originale Vorverzinnungsmethode nach U.S. Patent Nr. 4,424,200 4-9% des Tc-99m gebunden an F(ab')&sub2;; 45-53% gebunden an kleinere Fragmente.
2. Diese Erfindung unter Verwendung von Sn (II) 18-29% des Tc-99M gebunden an F(ab')&sub2;; 51-76% gebunden an kleinere Fragmente.
3. Das Verfahren unter Verwendung von 2-Merkaptoethanol 79% des Tc-99m gebunden an F(ab')&sub2;; nichts gebunden an kleinere Fragmente.
4. Das Verfahren unter Verwendung von DTT 74% des Tc-99 m gebunden an F(ab')&sub2;; nichts gebunden an kleinere Fragmente.

Beispiel V

Dieses Beispiel zeigt das erfindungsgemäße Verfahren zum Markieren eines monoklonalen Antikörpers der durch die ursprüngliche direkte oder Vorverzinnungsmethode oder durch andere Äquivalente direkte Markierungsmethoden nicht zufriedenstellend markiert werden kann. Der Grund für das Versagen der früheren direkten Methoden bei bestimmten monoklonalen Antikörpern besteht darin, daß während der Reduktion des Antikörpers entweder eine Fragmentation oder eine Aggregation des Antikörpers eintritt, was zu einer Proteinspezies mit geändertem Molekulargewicht führt. Ein Beispiel für dies ist ein Anti-CEA mäuslicher monoklonaler IgG, der von Sorin Biomedia, Italien, bereitgestellt ist. Wenn dieser Antikörper mit Sn (II)-Salzen reduziert wird, werden kleine Mengen an Fragmenten gebildet, die vorzugsweise mit dem reduzierten Tc-99m markiert werden. Wenn dieser Antikörper mit Dithiothreitol oder 2-Merkaptoethanol reduziert wird, werden dimere oder polymere des reduzierten IgG gebildet, die mit Tc-99m markiert werden. Durch das Verfahren dieser Erfindung wird der Antikörper nachdem Disulfidbindungsreduktionsschritt durch eine Größenausflußchromatographiesäule gereinigt. Das Säuleneluat entspricht nur dem Molekulargewicht des ursprünglichen Antikörpers und wurde von sowohl kleineren als auch größeren Proteinspezies getrennt. Eine Menge der Pertechnetatreduzierlösung wurde im ausreichendem Maß hinzugegeben, um das Natriumpertechnetat, nicht aber weiters die Disulfidbindungen im Antikörper zu reduzieren und damit der Antikörper radiomarkiert. Das resultierende mit Tc-99m markierte Protein wies das richtige Molekulargewicht auf und war frei von Verunreinigungen mit kleinerem oder größerem Molekulargewicht.

Beispiel VI

Dieses Beispiel zeigt die Verwendung einer Reinigung und IEDTA, um höhere HPLC Ausbeuten zu erzielen.
Vier gleiche Teile eines chemischen IgG monoklonalen Antikörpers wurden mit einem Sn (II) Reduziermittel wie in Beispiel II reduziert. Zwei gleiche Teile wurden durch Hindurchführen durch eine PD-10 Säule gereinigt, gefolgt von der Hinzugabe einer Sn (II) Pertechnetatreduzierlösung. Die übrigen beiden Teile wurden nicht gereinigt und keine zusätzliche Sn (II) Pertechnetatreduzierlösung wurde hinzugegeben. Zu jedem der beiden Paare von gleichen Teilen wurde Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) vor dem Radiomarkieren zugegeben.
Die quantitative radiochemische Reinheit wurde durch die HPLC Ausbeute bestimmt. Bei diesem Verfahren wird der Prozentsatz des stark gebundenen Tc-99m als Prozentsatz des Tc-99m bestimmt, der bei der HPLC Größenausschlußchromatographie wiedergewonnen wird, und zwar bezogen auf das gesamte injizierte Tc-99m, multipliziert mit dem Prozentsatz von Tc-99m unter dem IgM Protein peak. Schwach gebundenes Tc-99m wird nahezu vollständig auf die HPLC Säule transferiert und dort gebunden, und zwar mit unreduzierten Tc-99m Eluat, aber nicht mit dem Protein-Peak. Dieses Verfahren liefert somit ein Maß für das stark gebundene Tc-99m.

Tabelle 2

Vergleich der Resultate unter Verwendung von
EDTA um Verunreinigungen teilweise zu binden
Reduktionsverfahren HPLC Ausbeute
1. SN (II) Reduktion, keine Reinigung 52%
2. SN (II) Reduktion, keine Reinigung, EDTA 78%
3. SN (II) Reduktion, PD-10 Entsalzungssäule, SN (II) Pertechnetatreduzierlösung 96%
4. SN (II) Reduktion, PD-10 Entsalzungssäule, SN (II) Pertechnetatreduzierlösung, EDTA 97%

Beispiel VII

Dieses Beispiel zeigt die Bildung von reaktiven Sulfid-Gruppen bei der Reduktion der Disulfidbindungen durch Sn (II) und durch Dithiothreitol (DTT). Ein mäuslicher monoklonaler IgM Antikörper wurde mit I-125 unter Verwendung der Iodtröpfchenmethode markiert. Gleiche Anteile wurden mit einer Sn (II) Reduzierlösung inkubiert, die, wie in Beispiel II, hergestellt worden ist. Die gleichen Teile wurden bei verschiedenen bis zu 21 Stunden dauernden Zeitintervallen entfernt und durch eine PD-10 Säule geführt, um die Reduktionsreaktion zu stoppen. Die Teile wurden auch mit DU inkubiert. Natriumchlorid wurde als ein Regler zugegeben. Die PD-10 Säulen wurden mit Stickstoff gereinigter Salzlösung eluiert, um die Wiederoxidation der reaktiven Sulfid-Gruppen zu vermeiden. Ein Teil jedes Aliquots wurde für die Messung der freien reaktiven Sulfid-Gruppen verwendet und der andere Teil wurde zum Tc-99m-Markieren verwendet und zum Messen des Prozentsatzes des stark gebundenen Tc-99m.
Die reaktiven Sulfid-Gruppenbindung wurde durch relative Bindung des I-125 markierten Antikörpers an Thio Avidgel F (Bioprobe, Justin, CA) bestimmt. Thio Avidgel F bindet Proteine, die freie Schwefelhydryl oder reaktive Sulfid-Gruppen haben; wenn solche Gruppen während der Inkubation mit Reduziermitteln gebildet sind, sollte der Prozentsatz von bindenden Antikörpern proportional zu den reaktiven Sulfid-Gruppen sein. Die Markierung mit Tc-99m wurde unter Verwendung einer Sn (II) Pertechnetatreduzierlösung durchgeführt, die, wie in Beispiel II, hergestellt worden ist und zu welcher humanes Serum Albumin und Inosit zugegeben worden sind. Der Prozentsatz des stark gebundenen Tc-99m wurde durch die HPLC Ausbeute, wie in Beispiel VI beschrieben, bestimmt.

Beispiel VIII

Dieses Beispiel zeigt, daß das Verfahren der Erfindung unter Verwendung des Sn (II) Reduziermittels nach Beispiel II gefolgt von Durchführen durch eine PD-10 Säule, die Immunoreaktivität des monoklonalen Antikörpers nicht beeinträchtigt. Für Myosin spezifischer F(ab')&sub2; Antikörper wurde mit I-125 markiertem polygonalen Immunoglobulin verbunden. Ein Teil wurde, wie beschrieben, reduziert und durch eine PD-10 Säule geführt. Gleiche Teile sowohl des reduzierten F(ab')&sub2; und des unreduzierten F(ab')&sub2; wurden dann angepaßt, um dieselben Konzentrationen unter Verwendung von I-125 markiertem polyklonalen Immunoglobulin als dem Standard zu ergeben. ELISA wurde gegen gereinigtes schweres Myosinantigen mit beiden Aliquoten durchgeführt, wobei abnehmende Konzentrationen von F(ab')&sub2; Antikörper verwendet worden sind. Die Affinitätskonstanten wurden auf der halben Plateaumaximumabsorbierung berechnet und als identisch gefunden.
Die vorgehenden Beispiele können mit ähnlichem Erfolg durch Ersetzen der generisch oder spezifisch beschriebenen Reaktionsmittels und/oder Verfahrensbedingungen dieser Erfindung gegen jene, die in den vorhergehenden Beispielen beschrieben worden sind, wiederholt werden. Insbesondere können andere Proteine, Chelatmittel und Substrate, die Monosulfid- und Disulfidbindungen enthalten, die reduzierbar sind, anstelle von IgG, IgM und F(ab')&sub2; monoklonalem Antikörper verwendet werden; andere Reduziermittel können verwendet werden, um die Disulfidbindungen im Radio zu markierenden Substrat zu reduzieren; andere Reinigungsmethoden können verwendet werden, um das Reduziermittel zu entfernen; andere Pertechnetatreduziermittel können verwendet werden, um das Natriumpertechnetat zu reduzieren; und Isotope von Rhenium können zusätzlich zu den Technetiumisotopen verwendet werden.

Claims

1. Ein Verfahren zur Radiomarkierung eines Monosulfid- oder Disulfidbindungen enthaltenden Proteins, mit einem Radionuklid zum Erhalt einer stabilen Markierung, welches die Schritte umfaßt:

a) Inkubieren des Monosulfid- oder Disulfidbindungen enthaltenden Proteins mit einem ersten nicht Zinn(II)-haltigen Reduktionsmittel, wobei die Inkubationszeit ausreichend ist, um verfügbare Disulfidbindungen zu reaktiven Sulfidgruppen zu reduzieren, dabei aber eine übermäßige Fragmentierung des Proteins zu vermeiden;

b) Hinzufügen einer Quelle eines ersten Sn(II)-Mittels zum reduzierten Protein, um die Bildung von Sn(II)-haltigen und schwefelhaltigen Komplexen zu ermöglichen;

c) Reinigen des reduzierten, mit Sn(II)-haltigen und schwefelhaltigen Komplexen versehenen Proteins, um das erste Reduktionsmittel und Verunreinigungen im wesentlichen zu beseitigen, und

d) Radiomarkieren des gereinigten, mit Sn(II)-haltigen und schwefelhaltigen Komplexen versehenen Proteins durch Hinzugeben des Radionuklids, wobei das als Komplex vorliegende Sn(II)-Mittel das Radionuklid reduziert und das reduzierte Radionuklid und das reduzierte Protein radionuklidhaltige und schwefelhaltige Komplexe bilden.

2. Ein Verfahren zur Radiomarkierung eines Monosulfid- oder Disulfidbindungen enthaltenden Proteins, mit einem Radionuklid zum Erhalt einer stabilen Markierung, welches die Schritte umfaßt:

a) Inkubieren des Monosulfid- oder Disulfidbindungen enthaltenden Proteins mit einem ersten Sn(II)-haltigen Reduktionsmittel, wobei die Inkubationszeit ausreichend ist, um die Bildung von Sn(II)-haltigen und schwefelhaltigen Komplexen zu ermöglichen, dabei aber eine übermäßige Fragmentierung des Proteins zu vermeiden;

b) Reinigen des reduzierten Proteins, um nicht als Komplex vorliegende Sn(II)-Mittel und andere Verunreinigungen zu entfernen, dabei aber Sn(II) in einer ausreichenden Menge zurückzubehalten, um das Radionuklid zu reduzieren und keine bedeutenden radiochemischen Verunreinigungen zu erzeugen, wobei das Radionuklid in einem nachfolgenden Schritt hinzugefügt wird, und

c) Radiomarkieren des gereinigten mit Sn(II)-haltigen und schwefelhaltigen Komplexen versehenen Proteins durch Hinzufügen des Radionuklids, wobei das Sn(II)-Mittel das Radionuklid reduziert und das reduzierte Radionuklid und reduziertes Protein radionuklidhaltige und schwefelhaltige Komplexe bilden.

3. Ein Verfahren zur Radiomarkierung eines Monosulfid- oder Disulfidbindungen enthaltenden Proteins, mit einem Radionuklid zum Erhalt einer stabilen Markierung, welches die Schritte umfaßt:

a) Inkubieren des Monosulfid- oder Disulfidbindungen enthaltenden Proteins mit einem Sn(II)-Mittel, wobei die Inkubationszeit ausreichend ist, um die Bildung von Sn(II)-haltigen und schwefelhaltigen Komplexen und die Bildung von Sn(IV)- Reaktionsnebenprodukten zu ermöglichen, dabei aber eine übermäßige Fragmentierung des Proteins zu vermeiden;

b) Reinigen des reduzierten Proteins, um nicht als Komplex vorliegende Sn-Mittel und andere Verunreinigungen im wesentlichen zu entfernen;

c) Hinzufügen eines zweiten Sn(II)-Mittels zum gereinigten mit Sn(II)-haltigen und schwefelhaltigen Komplexen versehenen Proteins in einer ausreichenden Menge, um das Radionuklid zu reduzieren, dabei aber keine bedeutenden radiochemischen Verunreinigungen zu erzeugen, wobei das Radionuklid in einem nachfolgenden Schritt hinzugefügt wird, und

d) Radiomarkieren des gereinigten mit Sn(II)-haltigen und schwefelhaltigen Komplexen versehenen Proteins durch Hinzufügen des Radionuklids, wobei die Sn(II)-Mittel das Radionuklid reduzieren und das reduzierte Radionuklid radionuklidhaltige und schwefelhaltige Komplexe bildet.

4. Das Verfahren nach Anspruch 1, wobei anschließend an Schritt c) zum gereinigten mit Sn(II)-haltigen und schwefelhaltigen Komplexen versehenen Protein ein zweites Reduktionsmittel in einer ausreichenden Menge hinzugefügt wird, um das Radionuklid zur Gänze zu reduzieren, wobei das reduzierte Radionuklid radionuklidhaltige und schwefelhaltige Komplexe bildet.

5. Das Verfahren nach Anspruch 4, wobei das zweite Reduktionsmittel eine Quelle von Sn(II)-Mitteln enthält, welches in einer Lösung, die Alkalimetall-Tartrat enthält, mit einem pH-Wert zwischen etwa 5,0 und 6,0 vorliegt.

6. Das Verfahren nach Anspruch 1, wobei das erste Reduktionsmittel mindestens eines der Mitglieder der Gruppe bestehend aus 2-Merkaptoethanol; 1,4 Dithiothreitol; 2,3 Dihydroxybutan-1; 4-Dithiole; 2-Aminoethanthiol HCl; 2- Merkaptoethylamin; Thioglykolat; Cyanid; Cystein aufweist.

7. Das Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, wobei die Quelle des Sn(II)-Mittels mindestens ein Mitglied aus der Gruppe bestehend aus Zinntartrat, Zinnglukoheptonat, Zinnglukonat, Zinnphosphonat, Zinnchlorid und Zinnfluorid aufweist.

8. Das Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, wobei das Protein ein Mitglied aus der Gruppe bestehend aus monoklonalen Antikörpern, monoklonalen Antikörperfragmenten und polyklonalen Antikörpern aufweist.

9. Das Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, wobei anschließend an Schritt c) und vor Schritt d) die Sn(II)-haltigen und schwefelhaltigen Komplexe in einem Gefäß eingefroren werden und optional in einem Gefäß gefriergetrocknet werden, wobei das gefrorene oder gefriergetrocknete Sn(II)-Mittel und sulfhydrylhaltige Protein für eine unbestimmte Zeit vor der Markierung in Schritt d) durch Hinzufügung des Radionuklids in das Gefäß bewahrt werden können.

10. Das Verfahren nach Anspruch 2, wobei anschließend an Schritt b) und vor Schritt c) die Sn(II)-haltigen und schwefelhaltigen Komplexe in einem Gefäß eingefroren werden und optional im Gefäß gefriergetrocknet werden, wobei das gefrorene oder gefriergetrocknete Sn(II)-Mittel und sulfhydrylhaltige Protein für eine unbestimmte Zeit vor dem Markieren in Schritt c) durch das Hinzufügen des Radionuklids in das Gefäß bewahrt werden können.

11. Das Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, wobei das Radionuklid Technetium oder Rhenium, insbesondere Technetium-99m in der Form von Natriumpertechnetat ist.

12. Das Verfahren nach Anspruch 2, wobei das reduzierte Protein zur Entfernung von nicht als Komplex vorliegenden Sn(II)-Mitteln und anderen Verunreinigungen durch Bildung von Komplexen der nicht als Komplex vorliegenden Sn(II)-Mittel mittels eines komplexbildenden Mittels gereinigt wird, wobei das komplexbildende Mittel optional eine Polyamincarbonsäure und insbesondere EDTA oder DTPA ist.