ES2338405T3 - Metodo y aparato para mantenimiento y expasion de celulas madre hemopoyeticas y/o celulas progenitoras. - Google Patents

Abstract

Un método para expandir/mantener ex-vivo células madre hemopoyéticas no diferenciadas o células progenitoras, comprendiendo el método las etapas de: (a) cultivar en un biorreactor de flujo por conexión en fase estacionaria un cultivo de células estromales que comprende macrófagos, fibroblastos, adipositos y células endoteliales bajo flujo continuo de un medio de cultivo sobre un sustrato en la forma de una lámina, comprendiendo dicho sustrato una matriz fibrosa no tejida que forma una red tridimensional fisiológicamente aceptable de fibras para generar con la misma un cultivo de células estromales tridimensional; y (b) sembrar las células madre hemopoyéticas no diferenciadas aisladas o células progenitoras en dicho biorreactor de flujo por conexión en fase estacionaria incluyendo, dicho cultivo de células estromales tridimensional y dicho flujo continuo de dicho medio de cultivo, expandiendo/manteniendo por lo tanto ex-vivo las células madre hemopoyéticas no diferenciadas aisladas o células progenitoras.

Description

Método y aparato para mantenimiento y expansión de células madre hemopoyéticas y/o células progenitoras.

La presente invención se relaciona con un método para expandir/mantener células madre hemopoyéticas diferenciadas de acuerdo con la reivindicación 1, y 20, un método para preparar un medio celular estromal acondicionado de acuerdo con la reivindicación 38.

El uso de células madre hemopoyéticas no diferenciadas de acuerdo con la reivindicación 50.

La presente invención se relaciona con un método y aparato para mantenimiento y expansión de células madre hemopoyéticas. Más particularmente, la presente invención se relaciona con un birreactor de flujo de conexión celular estromal tridimensional para el mantenimiento y/o expansión de células madre hemopoyéticas y/o para la producción de un medio acondicionado para el mantenimiento y/o expansión de células madre hemopoyéticas.

El sistema hemopoyético en los mamíferos está compuesto de una población heterogénea de células que varían en función desde las células maduras con potencial proliferativo limitado a células madre pluripotentes con capacidades proliferativas, diferenciadoras y autorrenovadoras extensas (1-3). Las células madre hemopoyéticas (HSC) son requeridas exclusivamente para la reconstitución hemopoyética que sigue a los transplantes y sirve como un objetivo primario para la terapia de genes. A pesar del papel clave de las células madre en el mantenimiento del sistema hemopoyético, su frecuencia extremadamente baja en el tejido hemopoyético, así como la capacidad limitada para mantener o expandir las células madre no diferenciadas bajo condiciones ex-vivo durante períodos prolongados de tiempo, no solamente sigue siendo una desventaja principal para las aplicaciones clínicas esenciales de estas células, sino que también refleja la no disponibilidad actual de, y la necesidad de, novedosos reguladores de células madre.

Se acepta ampliamente que las células madre están asociadas íntimamente in vivo con nichos discretos dentro de la médula (4-6) que proporciona señales moleculares que median de manera colectiva su diferenciación y autorrenovación, a través de contactos célula-célula o interacciones de rango corto (7). Estos nichos son parte del "microambiente inductivo hemopoyético" (HIM), compuesto de células estromales medulares, por ejemplo, macrófagos, fibroblastos, adipositos y células endoteliales (8). Las células estromales de médula mantienen la integridad funcional del HIM proporcionando proteínas de matriz extracelular (ECM) y componentes de cimentación de membrana que facilitan el contacto célula-célula (9-11). También proporcionan diversas citoquinas solubles o residentes necesarias para la diferenciación y proliferación celular hemopoyética controlada (12-14).

A la vista de lo anterior, no es sorprendente que los esfuerzos para desarrollar sistemas de cultivo para el mantenimiento prolongado de HSC humanas estuvieran enfocados principalmente en el uso de monocapas de células estromales de médula primaria preestablecidas. Esto incluía cultivos a largo término de estromas de médula humanos primarios no irradiados (cultivos Dexter, 15) o irradiados (16-19), así como líneas celulares estromales humanas o de murina (16, 19-24), con o sin citoquinas añadidas exógenamente. Las pruebas de salida para HSC inicialmente se basaban en la capacidad de células para producir progenie mieloide (células que inician un cultivo a largo término; LTC-IC) o para generar colonias con morfología (células que forman área de canto rodado; CAFC) después del cultivo prolongado sobre a tales células estromales (16, 17). A pesar del amplio uso de las pruebas de LTC-IC y CAFC, se hace más obvio, sin embargo, que detecten progenitores altamente primitivos, más que las verdaderas células madre hemopoyéticas repobladoras (25, 26).

Un estudio de células madre humanas recientemente desarrollado detecta una célula de repoblación de SCID (SRC), la cual se aloja en la médula ósea de ratones diabéticos no obesos (NOD)/SCID (27), donde da lugar a poblaciones progenitoras humanas mieloide, linfoide, eritroide y CD34+ (28-30). El SRC se encuentra exclusivamente en fracciones celulares hemopoyéticas que expresan el antígeno de superficie CD34+38- (31) y su frecuencia en CB (1/3x10^{5} células) es enriquecido en comparación con BM (1/9x10^{5} células) o PB movilizado (1//6x10^{6} células) (32). Estudios muy recientes mostraron que la SRC reside dentro de una subpoblación de células CD34+/38-/CXCR4+ (33). El CXR4, un receptor de superficie del factor 1 derivado de células estromales de quimoquina (SDF-1, 34), es aparentemente esencial para el alojamiento e inserción de células madre hemopoyéticas humanas en la médula NOD/SCID (33).

Los estudios tendientes al mantenimiento/expansión prolongado inducido de HSC humanas sobre cultivos de células estromales se basaron principalmente en fenotipos de CAFC, LTC-IC o CD34+38- como ensayos de prueba de punto final (16, 19-24). Los escasos reportes de mantenimiento/expansión de SRC en cultivos celulares estromales fallan al indicar un soporte a largo término significativo. Por ejemplo, las estromas de médula humana alogénicas se encontraron que inducían a mantenimiento a término corto (7 días) de SRC, seguido por un rápido y marcado descenso (6 veces) en la actividad (26). La incapacidad para soportar el mantenimiento/expansión a largo término de células madre humanas transplantables o sus capas de células estromales, puede atribuirse a varios factores relacionados con los cultivos in vitro de estas células. Entre estos, uno puede incluir el uso de monocapas celulares estromales, que no reflejan las condiciones de crecimiento in vivo dentro de la estructura natural tridimensional de la médula ósea. Tales condiciones pueden disminuir la capacidad de las células estromales para proveer y el microambiente de soporte apropiado óptimo, así como la capacidad de las células madre para localizarse en nichos específicos y para interactuar físicamente con células estromales y sus productos. En efecto, la evidencia de la importancia de una estructura tridimensional (3D) para la actividad biológica de células progenitoras hemopoyéticas, es provista por el crecimiento superior de unas líneas celular hemopoyética humana sobre células estromales sembradas en una matriz de colágeno 3D, en comparación con su proliferación sobre monocapas de tales células (35). De forma más importante, un biomaterial poroso recubierto con tántalo 3D, demostró recientemente que potencia el mantenimiento a corto término de células LTCIC o CD34+38- de macaco, en comparación con células cultivadas solas o sobre monocapas celulares estromales de médula (36). El efecto de los portadores 3D con recubrimiento de células endoteliales ha sido investigado en WO95/19793.

Estudio recientes han mostrado que la línea celular AFT024 de murina es superior al estroma humano, en el soporte de supervivencia y mantenimiento por 2-3 semanas (a pesar de no tener expansión) de CB SRC (37) humanas. Se ha encontrado que esta línea expresa varios novedosos genes HIM que codifican proteínas de enlace a la membrana (21, 38, 39), que pueden tener un papel esencial en la fisiología de las células madre. La posible expresión de estos y otros genes por células estromales bajo condiciones que imitan de manera más cercana su microambiente medular 3D, y así potencia su actividad funcional fisiológica óptima, no ha sido determinada aún.

Estudios extensos han mostrado que los cultivos sin contacto estromal (19, 21, 22, 40, 41) o medios condicionados de estroma (SCM) (21, 42-44), solo o con citoquinas, puede soportar el mantenimiento o expansión ex-vivo de progenitores hemopoyéticos primitivos. El SCM también ha demostrado mejorar la recuperación y eficiencia de la transducción de tales células (45, 46). Mientras que estos hallazgos de nuevo potencian la importancia de los factores celulares estromales solubles, el uso de los puntos finales de LTC-IC, CAFC o CD34+38- en tales pruebas no pueden reflejar el efecto de SMC sobre el mantenimiento/expansión de HSC transplantable. Adicionalmente, no se sabe si el SCM obtenido a partir de cultivos monocapa de células estromales, contiene en efecto todos los productos genéticos asociados con las células estromales involucrados en la fisiología HSC humana.

La atención reciente que apunta hacia la expansión ex-vivo de células madre hemopoyéticas transplantables se ha enfocado en el establecimiento de cultivos de suspensión suplementados con citoquina (47-53). Estos estudios han ayudado a identificar las principales citoquinas relevantes para este proceso, por ejemplo, las que actúan tempranamente tales como el factor de células madre (SCF), ligando FLT3 y trombopoyetina (TPO). No obstante, se han obtenido resultados variables, indicando pérdidas a corto plazo (48, 49), mantenimiento (50-52) pero también algunos ejemplo raros de expansión de SRC, que se mantienen durante 2-4 semanas de cultivo (47, 53). La capacidad interactiva de estas citoquinas y células estromales, bajo condiciones de crecimiento 3D, para soportar el mantenimiento/expansión de SRC, no ha sido definida aún.

La US-A-5,541,107 describe un sistema de cultivo celular tridimensional el cual puede ser utilizado para cultivar una variedad de células y tejidos diferentes in vitro durante períodos prolongados de tiempo. De acuerdo con la invención, las células derivadas de un tejido deseado son inoculadas y cultivadas sobre una matriz de soporte estromal preestablecida. La matriz de soporte estromal comprende células estromales, tales como fibroblastos que crecen activamente sobre una matriz tridimensional. Las células estromales también pueden incluir otras células encontradas en tejido conectivo suelto tales como células endoteliales, macrófagos/monocitos, adipositos, pericitos, células reticulares encontradas en los estromas de médula ósea, etc. La matriz estromal provee el soporte, factores de crecimiento y factores de regulación necesarios para sostener la proliferación activa a largo término de las células en cultivo. Cuando se cultivan en este sistema tridimensional, las células proliferativas maduran y segregan apropiadamente para formar componentes de los tejidos adultos análogos a las contrapartes encontradas in vivo.

La US-A-5,266,476 se relaciona con una matriz y sistema de cultivo para el anclaje de células dependientes. La matriz es caracterizada por un área superficial efectiva disponible sustancialmente incrementada para la unión de células lo cual se obtiene por redistribución del uso de una red de fibras o espumas de poro abierto con tamaño de poro adecuado. La unión de las células puede potenciarse mediante la modificación de la superficie del sustrato. Una modalidad comprende una matriz en forma de partículas u hojuelas.

Hay así una necesidad ampliamente reconocida por, y debería ser altamente ventajoso obtener, un método y aparato para la expansión y/o mantenimiento ex-vivo de células madre hemopoyéticas transplantables apartándose de las anteriores limitaciones, con resultados superiores en comparación con las enseñanzas de la técnica anterior.

El método de expandir/mantener ex-vivo células madre hemopoyéticas no diferenciadas se define en las reivindicaciones 1 y 20,

el método para preparar un medio condicionado para células estromales se define en la reivindicación 38,

el uso de células madre hemopoyéticas no diferenciadas se define en la reivindicación 50.

Mientras que se lleva la presente invención a la práctica, se ha desarrollado un sistema de biorreactor de flujo por conexión que imita cercanamente el microambiente 3D de la médula ósea, y que es capaz de soportar el crecimiento y el mantenimiento prolongado de las células estromales. Estas últimas fueron sembradas sobre portadores inorgánicos porosos hechos de una matriz textil no tejida de poliéster (54) permitiendo la propagación de grandes números de células en un volumen relativamente pequeño. La estructura y empacado del portador tiene un impacto principal sobre la transferencia de oxígeno y nutrientes, así como sobre las concentraciones locales y productos de las células estromales liberados (por ejemplo, proteínas ECM, citoquinas, 55). Además, la capacidad de las células estromales en este sistema para promover el mantenimiento/expansión de células madre hemopoyéticas humanas transplantables a través de contacto directo célula-célula ha sido determinado como superior sobre los métodos de la técnica anterior. Adicionalmente, la capacidad del medio condicionado de células estromales cultivadas en este sistema para promover el mantenimiento/expansión de células madre hemopoyéticas humanas transplantables a través de nuevos factores de células madre asociadas estromales-celulares incluidas aquí, ha sido determinado como superior sobre los métodos de la técnica anterior.

Así, de acuerdo con un aspecto de la presente invención se provee un método para expandir/mantener células madre hemopoyéticas no diferenciadas o células progenitoras, comprendiendo el método las etapas de (a) obtener células madre hemopoyéticas no diferenciadas o células progenitoras; y (b) sembrar las células madre hemopoyéticas no diferenciadas o células progenitoras en un biorreactor de flujo de conexión en fase estacionaria en el cual se ha preestablecido un cultivo celular estromal tridimensional sobre un sustrato en la forma de una lámina, incluyendo como sustrato una matriz fibrosa no tejida que forma una red de fibras tridimensional fisiológicamente aceptable, que por lo tanto expande/mantiene las células madre hemopoyéticas no diferenciadas o las células progenitoras.

De acuerdo con características aún adicionales en las realizaciones preferidas descritas el método comprende adicionalmente la etapa de aislar las células madre hemopoyéticas no diferenciadas o células progenitoras. De acuerdo con otro aspecto de la presente invención se proporciona un método para expandir/mantener células madre hemopoyéticas no diferenciadas o células progenitoras, comprendiendo el método las etapas de (a) obtener células madre hemopoyéticas no diferenciadas o células progenitoras; y (b) cultivar las células madre hemopoyéticas no diferenciadas o células progenitoras en un medio que contiene medio acondicionado con células estromales, derivándose el medio acondicionado con células estromales a partir de un biorreactor de flujo por conexión en fase estacionaria en el cual se ha establecido un cultivo de células estromales tridimensional sobre un sustrato en la forma de una lámina, incluyendo sustrato una matriz fibrosa no tejida que forma una red de fibras tridimensionales fisiológicamente aceptables, expandiendo, manteniendo en la misma las células madre hemopoyéticas no diferenciadas o las células progenitoras. De acuerdo con aún otro aspecto de la presente invención se proporciona un método para preparar un medio acondicionado de células estromales en la expansión/mantenimiento de células madre hemopoyéticas no diferenciadas o células progenitoras, comprendiendo el método las etapas de (a) establecer un cultivo de células estromales en un biorreactor de flujo por conexión en fase estacionaria sobre un sustrato en la forma de una lámina, incluyendo el sustrato una matriz fibrosa no tejida que forma una red de fibras tridimensionales fisiológicamente aceptable, expandiendo/manteniendo sobre la misma las células madre hemopoyéticas no diferenciadas o células progenitoras; y (b) cuando se haya alcanzado una densidad de células estromales deseada, recoger el medio de un biorreactor de flujo por conexión en fase estacionaria, obteniendo mediante ello el medio acondicionado para células estromales útiles en la expansión/mantenimiento de células madre hemopoyéticas no diferenciadas o células progenitoras.

De acuerdo con aún otro aspecto de la presente invención se proporciona un método para transplantar células madre hemopoyéticas no diferenciadas o células progenitoras en un receptor, comprendiendo el método las etapas de (a) expandir/mantener las células madre hemopoyéticas no diferenciadas o células progenitoras mediante (i) la obtención de células madre hemopoyéticas no diferenciadas o células progenitoras; y (ii) sembrar las células madre hemopoyéticas no diferenciadas o células progenitoras en un biorreactor de flujo por conexión de fase estacionaria en el cual se ha preestablecido un cultivo de células estromales tridimensional sobre un sustrato en la forma de una lámina, incluyendo el sustrato una matriz fibrosa no tejida que forma una red de fibras tridimensionales fisiológicamente aceptable, sobre la cual se expanden/mantienen las células madre hemopoyéticas no diferenciadas o células progenitoras; y (b) transplantar las células madre hemopoyéticas no diferenciadas o células progenitoras resultantes de la etapa (a) en el receptor.

De acuerdo con características aún adicionales en las realizaciones preferidas descritas el método comprende adicionalmente la etapa de aislar las células madre hemopoyéticas no diferenciadas o células progenitoras antes de la etapa (b).

De acuerdo con un aspecto adicional de la presente invención se proporciona un método para transplantar células madre hemopoyéticas no diferenciadas o células progenitoras en un recipiente, comprendiendo el método las etapas de (a) expander/mantener las células madre hemopoyéticas no diferenciadas o células progenitoras mediante (i) la obtención de células madre hemopoyéticas no diferenciadas o células progenitoras; y (ii) por cultivo de las células madre hemopoyéticas no diferenciadas o células progenitoras en un medio que contiene un medio acondicionado de células estromales, siendo derivado el medio acondicionado de células estromales de un biorreactor de flujo por conexión en fase estacionaria en el cual se ha establecido un cultivo de células madre tridimensional sobre un sustrato en la forma de una lámina, incluyendo el sustrato una matriz fibrosa no tejida que forma una red de fibras tridimensional fisiológicamente aceptable, sobre la cual se expanden/mantienen las células madre hemopoyéticas no diferenciadas o células progenitoras.

De acuerdo con aún un aspecto adicional de la presente invención se provee un biorreactor de conexión que comprende un contenedor que tiene una salida y una entrada y que contiene dentro de sí un sustrato en la forma de una lámina, incluyendo el sustrato una matriz fibrosa no tejida que forma una red de fibras tridimensional fisiológicamente aceptable, soportando el sustrato al menos 5 x 10^{6} células estromales por centímetro cúbico del sustrato.

De acuerdo con aún un aspecto adicional se proporciona un biorreactor de flujo por conexión que comprende el biorreactor de conexión anterior.

De acuerdo con características adicionales en realizaciones preferidas de la invención descritas más abajo, las células madre hemopoyéticas no diferenciadas o las células progenitoras son células aisladas a partir de un tejido seleccionado del grupo consistente de sangre del cordón umbilical, sangre periférica movilizada y médula ósea.

De acuerdo con características aún adicionales en la realizaciones preferidas descritas las células madre hemopoyéticas no diferenciadas o las células progenitoras y las células estromales del cultivo celular estromal comparten antígenos HLA comunes.

De acuerdo con características aún adicionales en las realizaciones preferidas descritas las células madre hemopoyéticas no diferenciadas o las células progenitoras y las células estromales del cultivo de células estromales son de un individuo en particular.

De acuerdo con aún características adicionales de las realizaciones preferidas descritas las células madre hemopoyéticas no diferenciadas o las células progenitoras y las células estromales del cultivo de células estromales son de individuos diferentes.

De acuerdo con características aún adicionales en las realizaciones preferidas descritas las células madre hemopoyéticas no diferenciadas o células progenitoras y las células estromales del cultivo de células estromales son de la misma especie.

De acuerdo aún características adicionales en las realizaciones preferidas descritas las células madre hemopoyéticas no diferenciadas o células progenitoras y las células estromales del cultivo de células estromales son de especies diferentes.

De acuerdo con características aún diferentes en las realizaciones preferidas descritas las células estromales del cultivo de células estromales son cultivadas hasta una densidad de al menos 5 x 10^{6} células por centímetro cúbico del sustrato.

De acuerdo con características aún adicionales en las realizaciones preferidas descritas las células estromales del cultivo de células estromales se cultivan hasta una densidad de al menos 10^{7} células por centímetro cúbico del sustrato.

De acuerdo con características aún adicionales en las realizaciones preferidas descritas la etapa de sembrar las células madre hemopoyéticas no diferenciadas o células progenitoras en el biorreactor de flujo por conexión en fase estacionaria se efectúa mientras que el flujo en el reactor es detenido durante al menos 10 horas después de la siembra.

De acuerdo con características aún adicionales en las realizaciones preferidas descritas las fibras forman un volumen de poro como un porcentaje de volumen total desde 40 a 95% y un tamaño de poro de 10 micrones a 100 micrones.

De acuerdo con características aún adicionales en las realizaciones preferidas descritas la matriz está hecha de fibras seleccionadas del grupo consistente de fibras planas, no redondeadas y huecas y mezclas de las mismas, siendo las fibras de 0.5 micrones a 50 micrones de diámetro o anchura.

De acuerdo con características aún adicionales en las realizaciones preferidas descritas la matriz está compuesta de cintas que forman fibras que tienen una anchura desde dos micrones. De acuerdo con características aún adicionales en las realizaciones preferidas descritas la proporción de la anchura al espesor de las fibras es de al menos 2:1.

De acuerdo con características aún adicionales en las realizaciones preferidas descritas la matriz tiene un volumen de poro como porcentaje del volumen total de 60 a 95%.

De acuerdo con características aún adicionales en las realizaciones preferidas descritas la matriz tiene un alto de 50-1000 \mum.

De acuerdo con características aún adicionales las realizaciones preferidas descritas el material de la matriz es seleccionado del grupo consistente de poliésteres, polialquilenos, polifluorocloroetilenos, cloruro de polivinilo, poliestireno, polisulfonas, acetato de celulosa, fibras de vidrio y fibras de metales inertes.

De acuerdo con características aún adicionales en las realizaciones preferidas descritas la matriz tiene una forma seleccionada del grupo consistente de cuadrados, anillos, discos, y cruciformes.

De acuerdo con características aún adicionales en las realizaciones preferidas descritas la matriz está recubierta con poli-D-lisina.

La presente invención apunta exitosamente a las desventajas de las configuraciones actualmente conocidas proveyendo medios más efectivos para expandir/mantener células madre hemopoyéticas no diferenciadas.

La implementación del método y biorreactor de la presente invención puede involucrar el ejecutar o llevar a cabo tareas o etapas seleccionadas de forma manual, automática o una combinación de las mismas. Adicionalmente, de acuerdo con la instrumentación y equipo reales de las realizaciones preferidas del método y el biorreactor de la presente invención, diversas etapas seleccionadas podrían ser implementadas mediante equipos o software de cualquier sistema operativo o cualquier sistema de utilización o combinaciones de los mismos.

Por ejemplo, como herramientas, las etapas seleccionadas de la invención podrían ser implementadas como un chip o un circuito. Como software, las etapas seleccionadas de la invención podrían ser implementadas como una pluralidad de instrucciones de software que son ejecutadas por un ordenador que utiliza un sistema operativo adecuado. Cualquier caso, las etapas seleccionadas del método y el biorreactor de la invención podrían ser descritas como llevadas a cabo por un procesador de datos, tales como una plataforma de cómputo para ejecutar una pluralidad de instrucciones.

La invención es descrita aquí, a manera de ejemplo únicamente, con referencia a los dibujos acompañantes. Con referencia específica ahora a los dibujos en detalle, se hace énfasis en que los detalles mostrados son a manera de ejemplo y para propósitos de discusión ilustrativa de las realizaciones preferidas de la presente invención únicamente, y se presentan con el propósito de proveer lo que se cree que es la descripción más útil y fácilmente entendible de los principios y aspectos conceptuelas de la invención. En este aspecto, no se hace ningún intento por mostrar detalles estructurales de la invención en más detalle que el necesario para un entendimiento fundamental de la invención, tomando la descripción con los dibujos haciendo evidente para los expertos en la técnica cómo pueden ponerse en la práctica las diversas formas de la invención.

En los dibujos:

La Figura 1 es una representación esquemática de un biorreactor 20 de flujo por conexión a manera de ejemplo que se utilizó mientras se llevaba la presente invención a la práctica; 1- reservorio de medio; 2- contenedor de mezcla de gases; 3- filtro de gases; 4- puntos de inyección; 5- conector o contenedor de biorreactor de flujo de conexión 20; 6- monitores de flujo; 6a- válvulas de flujo; 7- contenedor de recolección/separación de medio acondicionado; 8- contenedor para intercambio de medio; 9- bomba peristáltica; 10- punto de muestreo; 11- contendor para intercambio de medio; 12- monitor de O_{2}; 14- dispositivo de direccionamiento; PH- sonda de pH.

La Figura 2 demuestra el mantenimiento de CAFC mediante células 14F1.1. Las células de cordón umbilical CD34+ fueron sembradas en una dilución limitante sobre estromas de médula humana irradiadas 14F1.1 o primarias. La formación de cantos rodados fue determinada 5 semanas después. Los resultados representan la media \pm SD de 2 experimentos independientes.

La Figura 3 demuestra el mantenimiento de LTC-IC por células 14F1.1. Las células de cordón umbilical CD34+ fueron sembradas sobre 14F1.1 irradiado o estromas de médula humana primaria. La formación de colonias de mieloides fue determinada 7 semanas después. El ligando FLT-3 (300 ng/ml), TPO (300 ng/ml) y SCF (100 ng/ml) fueron añadidos con un reemplazo semanal del medio. Los resultados representan la media \pm SD de 2 experimentos.

La Figura 4 demuestra la expansión de células CD34+38- en 14F1.1 y en estromas de médula humana primaria. Las células CD34+ fueron sembradas sobre 14F1.1 o estroma de médula humana a 70 CD34+38- células/pozo. Se añadieron las citoquinas semanalmente. Los cultivos fueron tripsinizados 7-21 días después. Las CD34+38- fueron determinadas por análisis FACS. Los resultados representan la media \pm SD de 2 experimentos independientes.

Las Figuras 5a-b muestran las micrografías en barrido electrónico (SEM) del portador sembrado con la línea celular estromal 14F1.1 después de 10 días (Figura 5a) o después de 40 días (Figura b). Magnificación: x 150.

Las Figuras 6a-b demuestran el efecto de el medio acondicionado 14F1.1 3D versus 2D sobre la expansión de CD34+38-. Las células CD34+ fueron sembradas en cultivos en suspensión en la presencia de diversas concentraciones de medio condicionado de 14F1.1 y estroma de médula humana primaria. Los números de células CD34+38- fueron determinados por análisis FACS. Los resultados representan la media \pm SD de dos experimentos independientes.

La Figura 7 demuestra el mantenimiento de células CD 34+38- sobre portadores recubiertos de células estromales. Los portadores recubiertos de células estromales fueron retirados del sistema 3D en placas de 96 pozos recubiertas con silicona, seguido por la adición de 1.5 x 10^{4} de células CD34+. Los controles contenían portadores únicamente y llevaban números equivalentes de células 14F1.1 cultivadas en monocapa (2D). Las células fueron recolectadas en los tiempos designados y analizadas por FASC. Los resultados representan la media \pm SD de dos experimentos independientes.

La presente invención es de métodos y un biorreactor para expansión/mantenimiento de células madre hemopoyéticas las cuales pueden ser utilizadas para transplante a un receptor para otros propósitos como se detalla aquí más adelante. Específicamente, la presente invención es de un biorreactor de flujo por conexión tridimensional de células estromales para el mantenimiento y/o expansión de células madre hemopoyéticas y/o para la producción de un medio acondicionado para el mantenimiento y/o expansión de células madre hemopoyéticas, que pueden ser utilizadas en una variedad de aplicaciones.

Los principios y operación de la presente invención pueden entenderse mejor con referencia a los dibujos y descripciones acompañantes.

Antes de explicar al menos una realización de la invención en detalle, debe entenderse que la invención no está limitada en su aplicación a los detalles de construcción y a la disposición de los componentes definidos en la siguiente descripción ilustrados en los ejemplos. La invención es capaz de otras realizaciones o de ser puesta en práctica o llevada a cabo de diversas maneras. También, debe entenderse que la fraseología y terminología empleada aquí es para propósito de la descripción y no debe ser vista como limitante.

Las estrategias actuales que pretenden el mantenimiento o expansión ex-vivo a largo término de células madre hemopoyéticas humanas transplantables (HSC), han tenido hasta ahora éxito limitado. Un novedoso biorreactor de flujo por conexión tridimensional (3D) que imite cercanamente el microambiente de la médula ósea y que sea capaza de soportar el crecimiento y mantenimiento prolongado de células estromales de médula se describe aquí. Estas últimas son sembradas sobre portadores porosos hechos de una matriz textil no tejida de poliéster, empacado en una columna de vidrio permitiendo por lo tanto la propagación de grandes números de células en un volumen relativamente pequeño. En los ejemplos provistos en la sección de ejemplos que sigue, el biorreactor fue sembrado con la línea celular estromal de murina 14F1.1 o alternativamente con células estromales de médula humana primarias. En el día 40 después de la siembra, los portadores contenían una densidad celular incrementada en 100 veces. La densidad en diversos niveles de la columna era la misma, indicando una trasferencia homogénea del oxígeno y los nutrientes a las células. Los medios acondicionados por las células estromales dentro del biorreactor (SCM 3D) fue superior al SCM en monocapa (2D) de células estromales, en el soporte del mantenimiento a largo plazo de células (CB) CD34+38- de cordón umbilical humano. El SCM 3D también fue capaz de soportar la expansión de células CD34+38-CXCR4+, que representan células de repoblación SCID/NOD (SRC). En la presencia de citoquinas (ligando FLT3 y TPO), el SCM 3D potenció la autorrenovación de las células madre e inhibió la diferenciación, mientras que el efecto opuesto fue inducido por citoquinas SCM + 2D. Los cultivos de células madre estromales tridimensionales también exhibieron un mantenimiento superior de células CD34+38- que los cocultivos en células estromales monocapa. Estos hallazgos demuestran que el biorreactor de flujo de conexión 3D proporciona un sistema adecuado para mantenimiento/expansión ex-vivo de HSC a través de contacto superior de células madre-estromales y tal vez a través de la producción de células estromales de reguladores de células madre conocidos y/o novedosos.

Las HSC humanas, son un objetivo esencial para el transplante y la terapia genética. La frecuencia altamente reducida de HSC, así como la no disponibilidad actual de factores de crecimiento capaces de inducir la autorrenovación de células madre en ausencia de diferenciación terminal, proporciona aún un impedimento mayor para la implementación de tales estrategias, así como al establecimiento de "bancos" de HSC a gran escala.

Las estrategias actuales que pretenden un mantenimiento/expansión a largo plazo de HSC humanas no diferenciadas, se han encontrado hasta ahora con un éxito limitado. A la vez que estudios recientes con cultivos en suspensión suplementados con citoquina han mostrado alguna expansión de SRC, este proceso también fue acompañado por un incremento masivo de progenitores hemopoyéticos tempranos (53, 62), indicando que un grado sustancial de diferenciación en las células madre estaba teniendo lugar. Un sistema ideal sería uno, por ejemplo, en el cual se expandiera SRC, mientras que las LTC-IC permanecieran reducidas en número.

Los sistemas actuales de expansión celular hemopoyética emplean cultivos de suspensión perfusionados de células hemopoyéticas, solas (véase U.S.-A- 5,646,043) o siembras sobre monocapas de células estromales (véase U.S.-A- 5,605,822). Mientras que el sistema anterior demuestra una producción tremenda de progenitores relacionados, el último sufre de la naturaleza no fisiológica de las interacciones de células estromales/madre en monocapa. Los sistemas adicionales para la expansión de células madre describen el uso de medios acondicionados de células estromales (U.S.-A- 4,536,151 y 5,437,994). Sin embargo, estos últimos fueron obtenidos a partir de cultivos monocapa de células estromales, lo cuales muestran claramente aquí que son inferiores y diferentes en la capacidad de activar las células madre en comparación con las SCM 3D (véase, Tabla 3 de la sección de Ejemplos). Aunque se ha descrito recientemente un biorreactor en fase estacionaria que utiliza perlas de vidrio recubiertas con células estromales (US-A- 5,906,940), las perlas no proveen una estructura 3D fisiológica y permiten la propagación de números menores de 10 veces de células estromales por ml, en comparación con los portadores probados cuando se lleva la presente invención a la práctica. La ventaja de un cultivo de células estromales en 3D versus el monocapa se demuestra claramente por los hallazgos presentados aquí acerca de la capacidad superior de los cultivos de células estromales SCM derivadas de 3D o 3D para soportar el mantenimiento de células CD34+38- (véase, Figuras 6 y 7). El efecto superior de SCM 3D puede ser atribuido a los niveles potenciados de citoquinas conocidas o a reguladores de células madre novedosas. Los experimentos que pretenden evaluar los efectos combinados de SCM 3D y diversas citoquinas (SCF, ligando FLT3, TPO), sobre el mantenimiento/expansión de CD34+38-CXR4+ (o SRC) (Tabla 3), muestran claramente un efecto benéfico de SCM 3D en la presencia de ligando FLT3 y TPO, pero no SCF. Estos hallazgos pueden ser atribuidos a un efecto inhibidor relativo de SCM 3D sobre la diferenciación de células madre. Estos hallazgos indican fuertemente que bajo condiciones 3D, novedosos factores asociados con células estromales, tal vez menos activas por si mismos, pueden actuar de manera sinérgica con tales citoquinas cuando se produjeron. El uso de LTC-IC y células progenitoras comprometidas (GM-CFU) en lecturas de salida, además de las lecturas de CD34+, permiten probar la diferenciación de células madre.

El biorreactor descrito aquí es único en cuanto que combina cultivos de células estromales 3D con un sistema de flujo continuo. Mientras que se han descrito recientemente sistemas de células estromales-hemopoyéticas 3D sin flujo de medio continuo (US-A- 5,541,107), los hallazgos descritos aquí (véase, por ejemplo Figura 7) demuestran claramente la ventaja disminuida de los cultivos de células estromales 3D con respecto a las monocapas, en ausencia de flujo continuo.

El biorreactor de flujo por conexión 3D descrito aquí es capaz de soportar el crecimiento a largo término de líneas celulares estromales, así como de células estromales de médula primaria. El uso de células estromales en el biorreactor no solamente es esencial para el establecimiento de un contacto célula estromal-célula madre (a través de "nichos" únicos e interacciones célula-célula, célula-ECM), si no también para la producción de células estromales de citoquinas conocidas y novedosas solubles y en las enlazadas a membrana. Las células estromales pueden facilitar la implementación de tales biorreactores con citoquinas apropiadas utilizando variantes productoras de citoquina mediante ingeniería genética. Las células estromales en el biorreactor pueden ser procesadas por ingeniería genética para servir como líneas celulares para empaque de retrovirales permitiendo la transducción efectiva de material genético en las células madre, dentro del biorreactor mismo. El uso de diversas células estromales en el biorreactor también puede llevar a la selección del sustrato más adecuado para purgar las células madre Ph-positivas, siendo conocidas estas últimas por su menor capacidad de adherencia a las células estromales (63). Las células estromales primarias tienen la ventaja de que permiten el establecimiento de biorreactores de células estromales-madre "autólogos", sobre los cuales pueden expandirse aún células autólogas o células madre de cordón umbilical y que elimina la necesidad para retirar las células estromales antes del transplante.

Mientras que los experimentos de siembra iniciales en el biorreactor indicaron un rendimiento más bien pequeño de células CD34+38- en el portador, la siembra que siguió a una rata de flujo media, así como el número de células CD34+ iniciales sembradas en el biorreactor puede optimizarse fácilmente. El análisis de CD34+38-CXCR4+ en puntos del tiempo tempranos (1-4 días) después de la siembra es esencial para tal optimización.

En una aguda diferenciación frente a los métodos de la técnica anterior, el biorreactor de la presente invención emplea una matriz de crecimiento que sustancialmente hace incrementar la superficie de unión disponible para la adherencia de las células estromales de manera que imita la infraestructura mecánica de la médula ósea. Por ejemplo, para una matriz de crecimiento de 0.5 mm en altura, el incremento es por un factor de al menos 5 a 30 veces, calculado por proyección sobre la base de una matriz de crecimiento. Tal incremento por un factor de aproximadamente 5 a 30 veces, es por capa de unidad, y si se usa una pluralidad de tales capas bien apiladas o separadas por espaciadores o similares, el factor de 5 a 30 veces se aplica para cada una de tales estructuras. Cuando la matriz se utiliza en forma de lámina, preferiblemente en láminas de fibra no tejida, o láminas de polímeros espumados de poro abierto, el espesor preferido de la lámina es aproximadamente 50 a 1000 \mum o más, habiendo provisto una porosidad adecuada para la entrada de células, entrada de nutrientes y para la eliminación de productos residuales de la lámina. De acuerdo con una realización preferida los poros tienen un diámetro efectivo de 10 \mum a 100 \mum. Tales laminas pueden ser preparadas a partir de fibras de diversos espesores, siendo el rango de espesor de fibra o de diámetro de fibra preferido de apro-
ximadamente 0.5 \mum a 20 \mum, aún más preferiblemente las fibras están en el rango de 10 \mum a 15 \mum en diámetro.

Las estructuras de la invención pueden ser soportadas por, o aún mejor enlazadas a, una lámina de soporte poroso o pantalla que proporciona la estabilidad dimensional y la resistencia física.

Tales láminas de matriz también pueden ser cortadas, perforadas o rasgadas para proveer partículas con área proyectada del orden de aproximadamente 0.2 mm^{2} hasta aproximadamente 10 mm^{2}, con el mismo orden de espesor (aproximadamente 50 a 1000 \mum).

Detalles adicionales a la fabricación, uso y/o ventajas de la matriz de crecimiento que fue utilizada para llevar a cabo la presente invención a la práctica se describen en la US-A- 5,168,085, y en particular, 5,266,476, las cuales se incorporan aquí como referencia.

Como será fácilmente apreciado por los técnicos experimentados, la presente invención proporciona una población de células madre hemopoyéticas no diferenciadas expandida, que puede ser utilizada en una variedad de aplicaciones, tales, pero no limitándose a: (i) expansión de células madre humanas (de una fuente autóloga o de cordón umbilical) sobre estromas receptores, sin necesidad de una separación de células estromales-madre antes del transplante; (ii) disminución de las células madre Ph+ CML en una definición autóloga a través de una interacción célula estromal-madre; (iii) transferencia genética en células madre autorrenovadoras dentro del reactor o después de la recolección desde el biorreactor; (iv) producción de medio acondicionado para células estromales 3D (SCM) para mantenimiento/expansión ex-vivo de células madre hemopoyéticas no diferenciadas en cultivos en suspensión o en un biorreactor de células madre; (v) aislamiento de proteínas novedosas que inducen la autorrenovación de las células madre en ausencia de diferenciación, así como proteínas que tienen funciones biológicas adicionales; (vi) aislamiento de ARN de células estromales 3D por clonación de reguladores de células madre asociadas con células estromales y productos genéticos de células estromales funcionales adicionales.

De acuerdo con un aspecto de la presente invención se proporciona un método para expandir/mantener células madre hemopoyéticas no diferenciadas o células progenitoras. El método de acuerdo con este aspecto de la presente invención se efectúa implementando las siguientes etapas de método. Primero, se obtienen las células madre hemopoyéticas no diferenciadas o células progenitoras. En segundo lugar, las células madre hemopoyéticas no diferenciadas o las células progenitoras son sembradas en un biorreactor de flujo por conexión en fase estacionaria, un ejemplo del cual se representa en la Figura 1 junto con numerales de referencia, en los cuales un cultivo celular estromal tridimensional, de una línea celular estromal o un cultivo de células estromales primarias, ha sido preestablecido sobre un sustrato en la forma de una lámina, incluyendo el sustrato una matriz fibrosa no tejida que forma una red de fibras tridimensionales fisiológicamente aceptables, mediante la cual, como se describió en detalle más arriba y se ejemplifica en la sección de ejemplos que sigue, expande/mantiene las células madre hemopoyéticas no diferenciadas o células progenitoras.

Tal como se usa aquí en la especificación en la sección de reivindicaciones que sigue, la frase "células madre hemopoyéticas no diferenciadas" se refiere a células hemopoyéticas no comprometidas.

Tal como se usa aquí en la especificación y en la sección de reivindicaciones que sigue, la frase "células progenitoras" se refiere a células hemopoyéticas comprometidas aún inmaduras.

Tanto las células madre hemopoyéticas no diferenciadas como las células progenitoras son células CD34+. Así, la frase "obtener células madre hemopoyéticas no diferenciadas o células progenitoras" y su frase equivalente "se obtienen células madre hemopoyéticas no diferenciadas o células progenitoras" se refieren ambas a la obtención bien de células madre hemopoyéticas no diferenciadas aisladas y/o células progenitoras, o a una población de células CD34+ la cual contiene células madre hemopoyéticas no diferenciadas y células progenitoras.

Tal como se usa aquí en la especificación y en la sección de reivindicaciones que sigue, los términos "expandir" y "expansión" se refieren a crecimiento de células sustancialmente sin diferenciación, esto es, el incremento de una población celular sin una diferenciación que acompañe tal incremento.

Tal como se usa aquí en la especificación y en la sección de reivindicaciones que sigue, los términos "mantener" y "mantenimiento" se refiere a sustancialmente renovación de células sin diferenciación, esto es, a una población de células sustancialmente estacionarias sin diferenciación que acompañe tal estacionalidad.

Tal como se usa aquí el término "diferenciación" se refiere a cambios de clase relativamente generalizada a especializada durante el desarrollo. La diferenciación celular de diversas líneas celulares es un proceso bien documentado y no requiere una descripción adicional aquí.

Tal como se usa aquí el término "ex-vivo" se refiere a células retiradas de un organismo viviente que son propagadas por fuera del organismo (por ejemplo, en un tubo de ensayo).

Después de la expansión, por ejemplo, las células madre hemopoyéticas no diferenciadas o células progenitoras ahora expandidas pueden aislarse mediante una variedad de técnicas de separación/marcación por afinidad, tales como, pero no limitándose a, escogencia celular activadas por fluorescencia y separación por afinidad a través de un sustrato de afinidad. Las moléculas con afinidad que pueden ser utilizadas para implementar tales métodos de aislamiento incluyen anticuerpos anti-CD34, por ejemplo, que enlazan células CD34+.

De acuerdo con otro aspecto de la presente invención se proporciona otro método para expandir/mantener células madre hemopoyéticas no diferenciadas o células progenitoras. El método de acuerdo con este aspecto de la presente invención se efectúa implementando las siguientes etapas de método. Primero, se obtienen células madre hemopoyéticas no diferenciadas o células progenitoras. En segundo lugar, las células madre hemopoyéticas no diferenciadas o células progenitoras son cultivadas en un medio que contiene, como único ingrediente o como aditivo, un medio condicionado por células estromales, siendo derivado el medio condicionado de células estromales a partir de un biorreactor de flujo por conexión en fase estacionaria con un cultivo de células estromales tridimensional, de una línea de células estromales o un cultivo de células estromales primarias, que han sido establecidos sobre un sustrato en la forma de una lamina, incluyendo el sustrato una matriz fibrosa no tejida que forma una red de fibras tridimensional fisiológicamente aceptable, sobre el cual, tal como se describe aquí adicionalmente más adelante y se ejemplifica en la sección de ejemplos que sigue, expande/mantiene las células madre hemopoyéticas no diferenciadas o células progenitoras.

De acuerdo con aún otro aspecto de la presente invención se proporciona un método para preparar un medio acondicionado de células estromales útil en la expansión/mantenimiento de células madre hemopoyéticas no diferenciadas o células progenitoras. El método de acuerdo con este aspecto de la presente invención se efectúa implementando las siguientes etapas de método. Primero, se establece un cultivo de células estromales, de una línea de células estromales o de células estromales primarias, en un biorreactor de flujo por conexión en fase estacionaria sobre un sustrato en forma de una lamina, incluyendo el sustrato una matriz fibrosa no tejida que forma una red de fibras tridimensional fisiológicamente aceptable, expandiendo/manteniendo en el mismo las células madre hemopoyéticas no diferenciadas o células progenitoras, en segundo lugar, cuando se ha alcanzado una densidad de células estromales deseadas, digamos, por ejemplo, por encima de 5 x 10^{6} o por encima de 10^{7} células por centímetro cúbico de la matriz, se recoge el medio del biorreactor de flujo por conexión en fase estacionaria, tal como se describe más arriba y se ejemplifica en la sección de ejemplos que sigue, obteniéndose el medio acondicionado de células estromales útil en la expansión/mantenimiento de células madre hemopoyéticas no diferenciadas o células progenitoras.

De acuerdo con aún otro aspecto de la presente invención se proporciona un método para transplantar las células madre hemopoyéticas no diferenciadas o células progenitoras a un receptor. El método de acuerdo con este aspecto de la presente invención se efectúa implementando las siguientes etapas de método. Primero, las células madre hemopoyéticas no diferenciadas o células progenitoras son expandidas/mantenidas por cualquiera de los métodos descritos más arriba. En segundo término, las células madre hemopoyéticas no diferenciadas o células progenitoras resultantes de la primera etapa son transplantadas al receptor.

Como se muestra en la Figura 1, de acuerdo con aún un aspecto adicional de la presente invención se proporciona un biorreactor de conexión que comprende un contenedor 5, típicamente en la forma de una columna, que tiene una salida y una entrada y que contiene dentro de sí un sustrato en la forma de una lamina, incluyendo el sustrato una matriz fibrosa no tejida que forma una red de fibras tridimensional fisiológicamente aceptable, soportando el sustrato al menos 5 x 10^{6} células estromales, preferiblemente, al menos 10^{7}, bien de una línea celular estromal o de un cultivo de células estromales primarias, por centímetro cúbico del sustrato.

De acuerdo con aún un aspecto adicional de la presente invención se provee un biorreactor de flujo en conexión que comprende el biorreactor de conexión anterior.

Será evidente en este aspecto que el sustrato puede teóricamente soportar hasta 5 x 10^{7} células por centímetro cúbico del mismo. Una vez que se han acumulado células suficientes sobre el sustrato, pueden emplearse medios tales como irradiación para detener el crecimiento celular adicional, de manera que se controle el número exacto de células soportadas por el sustrato.

Las células madre hemopoyéticas no diferenciadas o células progenitoras que se utilizan como fuente para tales células a la vez que se implementan los métodos de la presente invención pueden ser purificadas o aisladas a partir de un tejido, tal como, pero no limitándose a, sangre de cordón umbilical, sangre periférica movilizada con citoquina (recolectada, por ejemplo, por leucaferesis), y medula ósea, todos los cuales son conocidos por incluir células madre hemopoyéticas no diferenciadas o células progenitoras. Los métodos para tal separación son bien conocidos en la técnica, siendo usado más frecuentemente la escogencia de células activada por fluorescencia en el cual las células son primero etiquetadas por marcación por afinidad con un fluoróforo y luego recolectadas.

De acuerdo con una realización preferida de la presente invención las células madre hemopoyéticas no diferenciadas o células progenitoras y células estromales de cultivo de células estromales comparten antígenos HLA comunes. De acuerdo con otra realización preferida de la presente invención las células madre hemopoyéticas no diferenciadas o células progenitoras y las células estromales del cultivo de células estromales son de un individuo en particular. Así, la separación de las células no es requerida en caso de transplante de las mismas a un receptor.

De acuerdo con aún otra realización preferida de la presente invención las células madre hemopoyéticas no diferenciadas o células progenitoras y las células estromales del cultivo de células estromales son de individuos diferentes. Por ejemplo, un receptor futuro de las células madre hemopoyéticas no diferenciadas o células progenitoras y las células estromales puede ser utilizado para proveer las células estromales, mientras que las células madre hemopoyéticas no diferenciadas o células progenitoras y células estromales son de un donador seleccionado de acuerdo con la compatibilidad de HLA para donar tales células al receptor. Así, de nuevo, la separación de las células no es requerida antes del transplante.

De acuerdo con otra realización de la presente invención las células madre hemopoyéticas no diferenciadas o células progenitoras y las células estromales del cultivo de células estromales son de la misma especie. Sin embargo, de acuerdo con aún otra realización preferida de la presente invención las células madre hemopoyéticas no diferenciadas o células progenitoras y células estromales del cultivo de células estromales son de especies diferentes.

De acuerdo con una realización preferida actualmente de la presente invención la etapa de sembrar las células madre hemopoyéticas no diferenciadas o células progenitoras en el biorreactor de flujo por conexión en fase estacionaria se efectúa mientras que el flujo en el biorreactor está cortado durante al menos diez horas después de tal siembra, de manera que permita que las células se anclen en la matriz cubierta por células estromales.

Las siguientes descripciones proporcionan observaciones con respecto a los sustratos preferidos que se utilizan al implementar la presente invención.

Así, de acuerdo con una realización las fibras del sustrato forman un volumen de poro como un porcentaje del volumen total de 40 a 95% y un tamaño de poro de 10 micrones a 100 micrones. De acuerdo con otra realización, la matriz que conforma el sustrato esta hecha de una fibra seleccionada del grupo consistente de fibras planas, no redondeadas y huecas y mezclas de las mismas, siendo las fibras de 0.5 micrones a 50 micrones de diámetro o anchura. De acuerdo con aún otra realización, la matriz está compuesta de fibras formadas por cintas que tienen una anchura desde 2 micrones. De acuerdo con una realización adicional, la relación de anchura a espesor de las fibras es de al menos 2:1. De acuerdo con aún otra realización, la matriz que conforma el sustrato tiene un volumen de poro como un porcentaje de volumen total de 60 a 95%. De acuerdo con aún otra realización, la matriz tiene una altura de 50-1000 \mum, mientras que se emplean apilamientos de las mismas. De acuerdo con aún otra realización, el material de la matriz que conforma el sustrato es seleccionado de un grupo consistente de poliésteres, polialquilenos, polifluorocloroetilenos, cloruro de polivinilo, poliestileno, polisulfonas, acetato de celulosa, fibras de vidrio y fibras de metales inertes. De acuerdo con aún otra realización, la matriz está en una forma seleccionada del grupo consistente de cuadrados, anillos, discos o cruciformes. De acuerdo con aún otra realización, la matriz está recubierta con poli-D-lisina.

Objetivos, ventajas y características novedosas adicionales de la presente invención serán evidentes para una persona de experiencia ordinaria en la técnica por examen de los siguientes ejemplos, los cuales no pretenden ser limitantes. Adicionalmente, cada una de las diversas modalidades y especies de la presente invención como se han delineado aquí más arriba y como se reivindican en la sección de reivindicaciones más abajo encuentra soporte experimental en los siguientes ejemplos.

Ejemplos

Se hace referencia ahora a los siguientes ejemplos, los cuales junto con las descripciones anteriores, ilustran la invención de una manera no limitante.

En general, la nomenclatura utilizada aquí y los procedimientos de laboratorio utilizados en la presente invención incluyen técnicas moleculares, bioquímicas, microbiológicas y de ADN recombinante. Tales técnicas son explicadas exhaustivamente en la literatura, véase por ejemplo, "Molecular Cloning: A laboratory Manual" Sambrook et al., (1989); "Current Protocols in Molecular Biology" Volumes I-III Ausubel, R. M., ed. (1994); Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley & Sons, New York (1988); Watson et al., "Recombinant DNA", Scientific American Books, New York; Birren et al. (eds) "Genome Analysis: A Laboratory Manual Series", Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998); metodologías tales como se establece en las patentes de los Estados Unidos No 4,666,828; 4,683,202; 4,801,531; 5,192,659 y 5,272,057; "Cell Biology: A Laboratory Handbook", Volumes I-III Cellis, J. E., ed. (1994); "Current Protocols in Immunology" Volumes I-III Coligan J. E., ed. (1994); Stites et al. (eds), "Basic and Clinical Immunology" (8th Edition), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell and Shiigi (eds), "Selected Methods in Cellular Immunology", W. H. Freeman and Co., New York (1980); los inmunoensayos disponibles están descritos de manera extensa en la literatura de patentes y científica, véase, por ejemplo, patente de los Estados Unidos Nos. 3,791,932; 3,839,153; 3,850,752; 3,850,578; 3,853,987; 3,867,517; 3,879,262; 3,901,654; 3,935,074; 3,984,533; 3,996,345; 4,034,074; 4,098,876; 4,879,219; 5,011,771 y 5,281,521; "Oligonucleotide Synthesis" Gait, M. J., ed. (1984); "Oligonucleotide Synthesis" Gait, M. J., ed. (1984); "Nucleic Acid Hybridization" Hames, B. D., and Higgins S. J., eds. (1985); "Transcription and Translation" Hames, B. D., and Higgins S. J., eds. (1984); "Animal Cell Culture" Freshney, R. I., ed. (1986); "Immobilized Cells and Enzymes" IRL Press, (1986); "A Practical Guide to Molecular Cloning" Perbal, B., (1984) and "Methods in Enzymology" Vol. 1-317, Academic Press; "PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications", Academic Press, San Diego, CA (1990); Marshak et al., "Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual" CSHL Press (1996); todas las cuales se incorporan aquí como referencia y se definen por completo aquí. Otras referencias generales se proveen a través de este documento. Los procedimientos presentes se cree que son bien conocidos en la técnica y se proveen para conveniencia del lector. Toda la información contenida en los mismos se incorpora aquí como
referencia.

Materiales y métodos experimentales

Biorreactor: El biorreactor utilizado de acuerdo con las enseñanzas de la presente invención fue construido de acuerdo con el diseño descrito en la Figura 1. El material de vidrio fue diseñado y manufacturado en Technion (Israel) conectado mediante tubos de silicona (Degania, Israel). Los portadores se hicieron rotar durante la noche en solución salina regulada con fosfato (PBS; Beit Ha'Emek Industries, Israel), sin Ca+^{2} y Mg+^{2}, seguido por eliminación del PBS y de los residuos liberados. Cada columna fue cargada con 10 ml de portador empacado. El biorreactor fue llenado con PBS-Ca-Mg, todas las salidas fueron selladas y el sistema fue sometido a autoclave (120ºC, 30 minutos). El PBS fue retirado a través del contenedor [8] y en el biorreactor se hizo circular en una incubadora a 37ºC con 300 ml de medio elevado en glucosa Dulbecco (DMEM; GIBCO BRL) que contenía 10% de suero de ternera fetal inactivado por calor (FCS Beit Ha'Emek Industries Israel) y una mezcla Pen-Strep-Nistatina (100 U/ml; 100 \mug/ml: 1.25 \mun/ml; Beit Ha'Emek), durante un periodo de 48 horas. El medio de circulación fue remplazado con DMEM fresco que contenía la anterior L-glutamina+2mM (Beit Ha'Emek).

Células estromales: Las líneas de células estromales fueron mantenidas a 37ºC en DMEM suplementado con FCS al 10%, en un incubador humidificado con 5% de CO_{2} en aire. Las células fueron cultivadas en matraces de cultivo de tejidos (Corning) y fueron divididas por tripsinización al alcanzar la confluencia. Los cultivos estromales de medula humana primarios fueron establecidos a partir de medula del esternón aspirada de donadores saludables hematológicamente que pasaban por cirugía a corazón abierto. Rápidamente, los aspirados de la medula fueron diluidos tres veces en solución de sales balanceadas de Hank (HBSS, GIBCO BRL) y fueron sometidos a centrifugación por gradiente de densidad según Ficoll-Hypaque (Robbins Scientific Corp. Sunnyvale, CA). Las células mononucleares de medula (<1.077 gm/cm^{3}) fueron recolectadas, lavadas tres veces en HBSS y resuspendidas en un medio de cultivo a largo termino (LTC), consistente de DMEM suplementado con 12.5% de FDS, 12.5% de suero de caballo (Beit Ha'Emek), 10^{-4} M de \beta-mercaptoetanol (Merck) y 10-6 mol/L de hidrocortisona succinato de sodio (Sigma). Las células fueron incubadas en matraces de cultivo de tejidos de 25 ml (Corning) durante 3 días a 37ºC (5% de CO2) y luego a 36ºC (idem) con realimentación semanal de cultivo. Las células estromales de donadores individuales fueron empleadas para cada biorreactor. Para estudios 3D y de monocapa, los cultivos de células estromales primarios fueron divididos por tripsinización (0.25% de tripsina y EDTA en solución salina A de Puck; Beit Ha'Emek) cada 10 días para permitir una expansión celular estromal suficiente. Para LTC- IC y CAFC (véase más abajo), se irradiaron las células estromales (1500 cGy) utilizando una fuente de ^{137}Cs, los cultivos fueron mantenidos a 33ºC en medio LTC.

Siembra de células estromales: Los cultivos confluentes de líneas de células estromales o células estromales de médula primarias de 5 semanas fueron tripsinizados y las células lavadas 3 veces en HBSS, se resuspendieron en un medio en el biorreactor (véase más arriba), se contaron y se sembraron a 10^{6} células/ml en volúmenes de 10 ml a través de un punto de inyección ([4], Figura 1) sobre portadores de 10 ml en la columna de vidrio del biorreactor. Inmediatamente después de la siembra, se detuvo la circulación durante 16 horas para permitir que las células se fijasen sobre los portadores. El crecimiento de células estromales en el biorreactor fue monitorizado por eliminación de portadores y la numeración celular por el método MTT (56). Cuando las células estromales fueron confluentes, el medio se reemplazó con medio LTC, para estudios continuados (preparación de SCM, siembra de células madre).

Reparación del medio acondicionado de células estromales (SCM): En densidades celulares equivalentes, las células estromales de monocapa y biorreactor fueron recargadas con medio de cultivo LTC fresco. Las SCM fueron recolectadas después de una incubación durante la noche de las células. Para este propósito, el flujo de medio en los cultivos 3D fue detenido durante 16 horas y retirado directamente de la columna antes de la reiniciación de la circulación. Para análisis del efecto de las células CD34+ sobre la producción de células estromales de SRC, se detuvo la circulación en diversos intervalos (2-7 días) después de sembrar las CD34+ en el sistema 3D y de recoger el medio de la columna como se describió más arriba. La SCM fue rotada (1000 x g, 10 minutos), filtrada y almacenada a -20ºC. Las células estromales también fueron cultivadas en el biorreactor en un medio libre de suero, para recolección de SCM, excluyendo por lo tanto variables indefinidas.

Aislamiento de células CD34+: Muestras de sangre de cordón umbilical tomadas bajo condiciones estériles durante el parto fueron fraccionadas sobre Ficoll-Hypaque y las células mononucleares flotantes (<1.077 gr/cm^{3}) fueron recolectadas. Las células de muestras de CB individuales fueron reunidas, incubadas con anticuerpos anti-CD34 y aisladas por midi MACS (Miltenyl Biotech).

Cultivos de suspensión de células CD34+: Células CB CD34+ (5 x 10^{5}/pozo) fueron incubadas en placas de 24 pozos (TPP, Suiza), en 0.5 ml de SCM0-100%, menos o más 300 ng/ml de cada uno de ligando FLT3, SCF, o TPO, solos o en combinación. Los controles contenían el medio LTC más o menos citoquinas. Las células fueron incubadas a 37ºC en CO_{2} al 5% en aire. El medio de cultivo fue cambiado semanalmente. Antes de la siembra y en diversos tiempos (1-3 semanas) las células fueron recolectadas, enumeradas y probadas en cuanto a CD34+/38-/CXCR4+ por citometría de flujo. Los ensayos de salida también pueden incluir SRC, CAFC y LTC-IC.

Cocultivo células madre-estromales: Células CBCD34+ aisladas, reunidas fueron sembradas en números equivalentes (aproximadamente 5 x 10^{5}) sobre monocapas o un biorreactor que contenía densidades equivalentes de células estromales confluentes. A las adicionales al biorreactor, se detuvo el flujo de medio durante 16 horas para permitir el contacto con las células estromales y se reinició a una velocidad de 0.1 - 1.0 ml por minuto. Los portadores de células CD34+ sembradas sobre células estromales fueron retirados para estudios de control en ausencia de cambio de medio. Los cultivos fueron mantenidos en medio LTC, con o sin citoquinas. En varios tiempos (hasta 4 semanas) se recogieron las células no adherentes de los sobrenadantes de las monocapas o del medio de cultivo circulante a través de un contenedor ([8], Figura 1). Las células adherentes fueron recogidas a través de tripsinización secuencial y exposición a un regulador de disociación con base en EDTA (GIBCO BRL), seguido por extracción suave de las células mediante pipeta. Para evitar la presencia de células estromales en la suspensión resultante, las células fueron resuspendidas en HBSS + FCS al 10% y se sometieron a un procedimiento de adhesión durante 60 minutos en placas de cultivo de tejido plástico (Corning), a 37ºC. Las células hemopoyéticas circulantes y aisladas del portador fueron lavadas, contadas y ensayadas separadamente en cuanto a CD34+/38-/CXCR4+ por citometría de flujo. Los ensayos de salida también pueden incluir SRC, CAFC y LTC-IC.

Citometría de flujo: Se incubaron células a 4ºC durante 30 minutos con concentraciones saturadas de anti-CD34+
PerCP monoclonal (Beckton-Dickinson), isocianato de anti-CXCR4- fluoresceína (FITC, R&D systems), y ficoeritrina (PE, Beckton-Dickinson) anticuerpos. Las células fueron lavadas dos veces en PBS enfriado con hielo que contenía 5% de FCS inactivado al calor y se resuspendió para una citometría de flujo en tres colores sobre un FACSscan (Beckton-Dickinson).

Pruebas LTC IC y CAFC: Células CD34+ recién aisladas, células aisladas de cocultivos de células madre y estromales o de cultivos en suspensión, fueron analizadas en cuanto a LTC- IC y CAFC, como se describió previamente (16, 17). Células estromales de médula primarias concluyentes fueron tripsinizadas, irradiadas (1500 cGy) y colocadas en placa en platos de 96 pozos de 0.1 ml (Corning) a 1.5 x 10^{4}/pozo. Se establecieron 24 replicados de pozos/grupo. Las células estromales fueron recubiertas con 0.1 ml de medio LTC que contenía diluciones seriales de células CD34+ (500- 5 células/pozo) o con diluciones seriales de células recolectadas de diversos ensayos. Los cultivos fueron incubados directamente a 33ºC durante 5 semanas, con cambio semanal de la mitad del medio. Las placas fueron hechas rotar a 1000 rpm durante 10 minutos, los sobrenadantes del cultivo fueron retirados y las células restantes fueron recubiertas con cultivos de metil celulosa y citoquinas para hacer pruebas de células progenitoras mieloides, tal como se describió previamente (57). Las colonias fueron enumeradas después de 14 días y la frecuencia de LTC-IC se determinó de acuerdo con la reciprocidad de la concentración de células de prueba que daban 37% de cultivos negativos (16). La prueba CAFC fue llevada a cabo básicamente como se indica anteriormente excepto por la ausencia de recubrimiento con metilcelulosa y citoquinas. El porcentaje de pozos con al menos un clon hemopoyético en fase oscura de al menos cinco células (área de canto rodado) por debajo de la capa estromal se determinó a la semana 6 después de la siembra de las suspensiones de las células de prueba, en diluciones seriales.

Resultados experimentales

El sistema de biorreactor empleado para llevar la presente invención a la práctica se representa en la Figura 1. Contiene cuatro unidades de biorreactor de flujo en conexión en paralelo [5]. Cada unidad de biorreactor contenía un gramo de portadores porosos 4 mm de diámetro) hechos de una matriz de poliéster textil no tejida (58). Estos portadores permiten la propagación de números grandes de células en un volumen relativamente pequeño. La estructura y empaque del portador tienen un mayor impacto sobre la transferencia de oxígeno y nutrientes, así como sobre las concentraciones locales de los productos de células estromales liberados (por ejemplo, proteínas ECM, citoquinas, 59). El biorreactor fue mantenido en una incubadora a 37ºC.

El flujo en cada biorreactor fue monitorizado [6] y se reguló a través de una válvula [6a]. Cada biorreactor contiene un punto de muestreo e inyección [4], permitiendo la siembra secuencial de células estromales y hemopoyéticas. El medio de cultivo fue suministrado a pH 7.0 [13] a partir de un reservorio [1]. El reservorio fue alimentado mediante una mezcla de gas filtrado [3] que contenía aire/CO_{2}/O_{2} [2] a diferentes proporciones con el fin de mantener 5-40% de oxígeno disuelto a la salida de la columna, dependiendo de la densidad celular en el biorreactor. La proporción de O_{2} fue adecuada al nivel del O_{2} disuelto en la salida al biorreactor, y se determinó mediante un monitor [12].

La mezcla de gas fue suministrada al reservorio a través de tubos de silicona. El medio de cultivo pasó a través de un contenedor de separación [7] el cual permitió la recolección de células circulantes no adherentes. La circulación del medio fue obtenida por medio de una bomba peristáltica [9] que operaba a una rata de 0.1-3 ml/minuto. Las unidades de biorreactor fueron equipadas con un punto de muestreo adicional [10] y dos contenedores [8, 11] para un cambio continuo de medio a una rata de 10-50 ml/día. El uso de cuatro unidades de biorreactor en paralelo permite el desmantelamiento periódico para propósitos tales como eliminación de células, microscopía de barrido electrónico, histología, inmunohistoquímica, extracción de ARN, etc.

En un experimento un sistema de biorreactor que contiene la línea celular estromal de murina 14F1.1 (24, 60, 61), que se mostró previamente para soportar el crecimiento de progenitores mieloides humanos comprometidos (24) ha sido establecido. Esta línea celular también puede soportar igualmente CB CAFC humano (Figura 2), LTC-IC (Figura 3) y células CD34+38- (Figura 4), así como células estromales de médula humana primarias. Los resultados presentados en estas Figuras también muestran que la adición del ligando FLT3 + TPO a estos cultivos no tiene efecto sobre LTC- IC, mientras que estas citoquinas potenciaban significativamente la producción de células CAFC y CD34+38-. En contraste la SCF indujo un descenso tanto en LTC-IC como en CAFC. Cuando se sembró en el biorreactor a 1.5x10^{6} células/10 ml de volumen de cultivo, las células 14F1.1 crecieron y se distribuyeron sobre los portadores (Figura 5). En el día 40 después de la siembra. Los portadores contenían una densidad celular incrementada en 100 veces, esto es, aproximadamente 1.5x10^{6} células/portador, 1.5x10^{7} células/ml (Tabla 1).

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TABLA 1

1

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La densidad celular sobre los portadores en diversos niveles de la columna fue la misma, indicando una transferencia homogénea de oxígeno y nutrientes a las células. Las condiciones de cultivo fueron optimizadas para estas células: medio de cultivo (medio alto en glucosa de Dulbecco + 10% de suero de ternera fetal), rata de flujo (1 ml/min), frecuencia de cambio medio (una vez a la semana), densidad de siembra inicial (como más arriba). No se encontró un efecto benéfico de un recubrimiento con colágeno o poli L-lisina del portador, sobre la rata de crecimiento y la densidad final de células 14F1.1. Los hallazgos preliminares con células estromales de médula humana primarias (Tabla 1) indican una densidad similar de 14F1.1 y células estromales primarias, en los días 10 y 14 después de la siembra, respectivamente.

Con el fin de probar la actividad funcional de las células estromales dentro del reactor, el efecto del medio de acondicionamiento de células estromales (SCM) obtenido de la columna del biorreactor (SCM 3D) sobre la expansión de células CD34+38- en cultivos en suspensión sembrados con células CB CD34+ humanas fue determinado. La actividad fue comparada con la del SCM obtenido a partir de cultivos monocapa (SCM 2D) que contenían la misma concentración de células estromales. Como se muestra en la Figura 6, la SCM de las células 14F1.1 se encontró que era igualmente o más capaz de soportar el mantenimiento de células CB CD34+38- humanas, que la SCM de células estromales de médula primarias. Un nivel máximo de 14F1.1 SCM se observó de manera consistente en una concentración más baja que la del SCM de médula primaria. Adicionalmente, se encontró que SCM 3D era superior a SCM 2D de ambos tipos de células, para soportar la expansión de células CB CD34+38- humanas. La diferencia de actividad entre SCM 2D y 3D fue más pronunciada con la duración del cultivo (14 versus 21 días). La adición de SCM 14F1.1 3D a cultivos en suspensión de células CB CD34+ humanas también se tradujo en el mantenimiento de las células CD34+38-CXCR4+ (Tabla 2), en comparación con cultivos de control que contenían solamente el medio.

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TABLA 2

2

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La Tabla 3 demuestra el efecto de las citoquinas en cultivos en suspensión de CD34+ que contenía 2D versus SCM 3D. Los resultados demuestran claramente que SCM 3D fue superior a SCM 2D en el soporte del mantenimiento de CD34+38- y en forma más importante, en el subgrupo CD34+38-CXCR4+ (SRC).

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TABLA 3

3

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Esto puede estar relacionado con el efecto más fuerte de SCM 2D sobre la diferenciación celular, tal como se detecta por la producción de células CD34+. TPO más ligando FLT3 redujo el rendimiento de CD34+38-/CD34+38-CXCR4+ en la presencia de SCM 2D pero potenció su rendimiento en cultivos suplementados con SCM 3D. De nuevo, esto puede ser atribuido al menor grado de diferenciación en el sistema 3D, según se determina mediante el marcador de superficie CD34+. En ambos cultivos SCM 2D y 3D, el SCF indujo un incremento marcado en la diferenciación celular y un descenso marcado en el rendimiento de células CD34+38-/CD34+38-GXCR4+.

Con el fin de probar las interacciones entre células estromales/madre en nuestro biorreactor, el mantenimiento/expansión de células CD34+38- o células estromales (14F1.1), recubiertas sobre portadores fue evaluado inicialmente. Estas últimas fueron retiradas del biorreactor hacia placas de 96 pozos recubiertas con silicona, seguida por la adición de células CD34+. Los controles que contenían los portadores solos y los números equivalentes de portadores 14F1.1 en monocapas. Como se muestra en la figura 7, la supervivencia de las células CD34+38- fue potenciada por la presencia del portador solo, confirmando el efecto benéfico de una estructura 3D sobre la supervivencia/mantenimiento de progenitores primitivos (36). Los portadores recubiertos con células estromales fueron superiores a los portadores solos o a las células monocapa 14F1.1, en la promoción de la supervivencia/mantenimiento por 7 días de células CD34+38-. El cultivo prolongado (día 14), se tradujo en números incrementados de CD34+38- tanto en cultivos en monocapa 14F1.1 como en portador recubierto con 14F1.1.

En un experimento subsecuente, 6x10^{6} células reunidas de CB CD34+ (3x10^{5} CD34+38-) fueron sembrados sobre un biorreactor que contenía 4 columnas no irradiadas, soportes recubiertos con 14F1.1, en 350 ml de medio de cultivo circulante. El flujo de medio fue detenido durante 16 horas y se continuó después a una velocidad normal (1 ml/min). Después de 4 días del cocultivo, el medio circulante contenía 10% de las células CD34+38- inicialmente sembradas, determinadas por análisis FACS de las células viables recolectadas. Después de 18 días de cultivo, el medio circulante contenía 0.4% de células CD34+38-, mientras que las células adherentes al portador contenían 3% de la población de CD34+38- inicialmente sembrado.

Aunque la invención ha sido descrita junto con realizaciones específicas de la misma, es evidente que muchas alternativas, modificaciones y variaciones serán evidentes para los expertos en la técnica. De acuerdo con ello, se pretende abarcar tales alternativas, modificaciones y variaciones que caen dentro del espíritu y el amplio alcance de las reivindicaciones anexas. Todas las publicaciones citadas aquí son incorporadas como referencia en su totalidad. La cita o identificación de cualquier referencia en esta solicitud no debe ser considerada como una admisión de que tal referencia está disponible como técnica anterior a la presente invención.

Referencias

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Claims (19)

1. Un método para expandir/mantener ex-vivo células madre hemopoyéticas no diferenciadas o células progenitoras, comprendiendo el método las etapas de:

(a)

cultivar en un biorreactor de flujo por conexión en fase estacionaria un cultivo de células estromales que comprende macrófagos, fibroblastos, adipositos y células endoteliales bajo flujo continuo de un medio de cultivo sobre un sustrato en la forma de una lámina, comprendiendo dicho sustrato una matriz fibrosa no tejida que forma una red tridimensional fisiológicamente aceptable de fibras para generar con la misma un cultivo de células estromales tridimensional; y

(b)

sembrar las células madre hemopoyéticas no diferenciadas aisladas o células progenitoras en dicho biorreactor de flujo por conexión en fase estacionaria incluyendo, dicho cultivo de células estromales tridimensional y dicho flujo continuo de dicho medio de cultivo, expandiendo/manteniendo por lo tanto ex-vivo las células madre hemopoyéticas no diferenciadas aisladas o células progenitoras.

2. El método de la reivindicación 1, donde dichas células madre hemopoyéticas no diferenciadas o células progenitoras son células aisladas a partir de un tejido seleccionado del grupo consistente de sangre de cordón umbilical, sangre periférica movilizada y médula ósea.

3. El método de la reivindicación 1, donde dichas células madre hemopoyéticas no diferenciadas o células progenitoras y células estromales de dicho cultivo de células estromales comparten antígenos HLA comunes.

4. El método de la reivindicación 1, donde dichas células madre hemopoyéticas no diferenciadas o células progenitoras y células estromales de dicho cultivo de células estromales son de un individuo en particular.

5. El método de la reivindicación 1, donde dichas células madre hemopoyéticas no diferenciadas o células progenitoras y células estromales de dicho cultivo de células estromales son de individuos diferentes.

6. El método de la reivindicación 1, donde dichas células madre hemopoyéticas no diferenciadas o células progenitoras y células estromales de dicho cultivo de células estromales son de la misma especie.

7. El método de la reivindicación 1, donde dichas células madre hemopoyéticas no diferenciadas o células progenitoras y células estromales de dicho cultivo de células estromales son de especies diferentes.

8. El método de la reivindicación 1, donde dichas células estromales de dicho cultivo de células estromales son cultivadas hasta una densidad de al menos 5x10^{6} células por centímetro cúbico de dicho sustrato.

9. El método de la reivindicación 1, donde dichas células estromales de dicho cultivo de células estromales se cultiva hasta una densidad de al menos 10^{7} células por centímetro cúbico de dicho sustrato.

10. El método de la reivindicación 1, donde dicha etapa de sembrar dichas células madre hemopoyéticas no diferenciadas o células progenitoras en dicho biorreactor de flujo por conexión en fase estacionaria se efectúa mientras que el flujo en dicho biorreactor es cortado durante al menos 10 horas después de dicha siembra.

11. El método de la reivindicación 1, donde dichas fibras forman un volumen de poro como un porcentaje del volumen total de 40 a 95% y un tamaño de poro de 10 micrones a 100 micrones.

12. El método de la reivindicación 1, donde dicha matriz está hecha de fibra seleccionada del grupo consistente de fibras planas, no redondeadas y huecas y mezclas de las mismas, siendo dichas fibras desde 0.5 micrones a 50 micrones en diámetro o anchura.

13. El método de la reivindicación 1, donde dicha matriz está compuesta de fibras formadas por cintas que tienen una anchura de 2 micrones a 20 micrones, y donde la proporción de anchura a espesor de las fibras es al menos 2:1.

14. El método de la reivindicación 1, donde dicha matriz tiene un volumen de poro como un porcentaje del volumen total de 60 a 95%.

15. El método de la reivindicación 1, donde la matriz tiene una altura de 50-1000 \mum.

16. El método de la reivindicación 1, donde el material de la matriz es seleccionado del grupo consistente de poliésteres, polialquilenos, polifluorocloroetilenos, cloruro de polivinilo, poliestireno, polisulfonas, acetato de celulosa, fibras de vidrio y fibras de metales inertes.

17. El método de la reivindicación 1, donde la matriz es en una forma seleccionada del grupo consistente de cuadrados, anillos, discos y cruciformes.

18. El método de la reivindicación 1, donde la matriz está en forma de un disco.

19. El método de la reivindicación 1, donde la matriz está recubierta con poli-D-lisina.