ES2337309T5 - Vacuna - Google Patents

Abstract

Una composición inmunogénica que comprende LOS L2 de una cepa de Neisseria que está O-acetilado en el resto GlcNac unido a su resto Heptosa II, en la que el LOS L3 tiene la siguiente estructura:<br /><br /> **(Ver fórmula)** en la que:<br /><br />R1 =<br /><br /> **(Ver fórmula)** <br /><br /> R2= PEA,<br /><br /> R3= H,<br /><br /> R4= OAc,<br /><br /> R5= H o Gly.

Description

Vacuna

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere al campo de las composiciones de vacuna de neisseria, su fabricación y al uso de

5 tales composiciones en medicina. Más particularmente, se refiere a procedimientos para preparar cepas meningocócicas modificadas novedosas que sean más adecuadas para la producción de vacunas de vesícula demembrana externa (o ampolla) de neisseria, en particular, meningocócicas. También se describen procedimientos y productos de vacuna ventajosos basándose en el uso de vacunas novedosas de subunidades de LOS o de vesículade membrana externa (o ampolla) meningocócica que se han convertido en más seguras y más eficaces para el usoen sujetos humanos.

Antecedentes de la invención

Neisseria meningitidis (meningococo) es una bacteria Gram negativa aislada frecuentemente del tracto respiratoriosuperior humano. Es una causa de enfermedades bacterianas invasivas graves, tales como bacteriemia y meningitis.La incidencia de enfermedad meningocócica muestra diferencias geográficas, estacionales y anuales (Schwartz, B.,

15 Moore, P. S., Broome, C. V.; Clin. Microbiol. Rev. 2 (Suplemento), S18-S24, 1989). La bacteria se clasifica comúnmente de acuerdo con el serogrupo de su polisacárido capsular.

La mayor parte de la enfermedad en países templados se debe a cepas del serogrupo B y su incidencia varía entre1-10/100.000/año de población total, alcanzando en ocasiones valores mayores (Kaczmarski, E. B. (1997), Commun.Dis. Rep. Rev. 7: R55-9, 1995; Scholten, R. J. P. M., Bijlmer, H. A., Poolman, J. T. y col. Clin. Infect. Dis. 16: 237246, 1993; Cruz, C., Pavez, G., Aguilar, E., y col. Epidemiol. Infect. 105: 119-126, 1990).

Las epidemias dominadas por meningococos del serogrupo A, en su mayor parte en África central, alcanzan enocasiones niveles de incidencia de hasta 1000/100.000/año (Schwartz, B., Moore, P. S., Broome, C. V. Clin. Microbiol. Rev. 2 (Suplemento), S18-S24, 1989). Prácticamente todos los casos como una totalidad de la enfermedad meningocócica están provocados por meningococos de los serogrupos A, B, C, W-135 e Y y está

25 disponible una vacuna de polisacárido capsular tetravalente A, C, W-135, Y (Armand, J., Arminjon, F., Mynard, M. C., Lafaix, C, J. Biol. Stand. 10: 335-339, 1982).

La frecuencia de infecciones por Neisseria meningitidis ha aumentado en las últimas décadas en muchos países europeos. Esto se ha atribuido a un aumento de la transmisión debido al incremento de las actividades sociales (porejemplo, piscinas, teatros, etc.). Ya no es insólito aislar cepas de Neisseria meningitidis que son menos sensibles o resistentes a algunos de los antibióticos convencionales. Este fenómeno ha creado una necesidad médica no satisfecha y una demanda de nuevos agentes antimicrobianos, vacunas, procedimientos de exploración de fármacosy ensayos de diagnóstico para este organismo.

Las vacunas de polisacáridos disponibles se están mejorando actualmente conjugando químicamente las mismas aproteínas transportadoras (Lieberman, J. M., Chiu, S. S., Wong, V. K., y col. JAMA 275: 1499-1503,1996).

35 Sin embargo, no está disponible una vacuna de serogrupo B. Se ha observado que el polisacárido capsular de serogrupo B no es inmunogénico, muy probablemente debido a que comparte similitud estructural con componentesdel huésped (Wyle, F. A., Artenstein, M. S., Brandt, M. L y col. J. Infect. Dis. 126: 514-522, 1972; Finne, J. M., Leinonen, M., Mäkelä, P. M. Lancet ii.: 355-357, 1983). Por lo tanto, se ha centrado el esfuerzo en intentardesarrollar vacunas de serogrupo B a partir de vesículas de membrana externa (o ampollas) o componentes deproteína purificados de las mismas.

Los antígenos meningocócicos alternativos para desarrollo de vacunas son lipooligosacáridos (LOS) meningocócicos. Estos son glucolípidos unidos a membrana externa que difieren de los lipopolisacáridos (LPS) delas Enterobacteriaceae porque carecen de cadenas laterales O y, por tanto, se parecen a la forma general de LPS(Griffiss y col. Rev Infect Dis 1988; 10: S287-295). La heterogeneidad en el resto de oligosacárido de los LOS genera45 diversidad estructural y antigénica entre diferentes cepas meningocócicas (Griffiss y col. Inf. Immun. 1987; 55: 17921800). Esto se ha usado para subdividir las cepas en 12 inmunotipos (Scholtan y col. J Med Microbiol 1994, 41: 236243). El inmunotipado se realiza habitualmente por el procedimiento de Ouchterlony usando anticuerpos policlonalesadsorbidos generados contra LOS de inmunotipo conocido (Poolman JT, Hopman CTP y Zanen HC, FEMS MicrobiolLetters (1982) 13: 339-348). Los inmunotipos L3, L7 y L9 son inmunológicamente idénticos y son estructuralmente similares (o incluso iguales) y, por lo tanto, se han denominado L3,7,9 (o, para los fines de esta memoria descriptiva,de forma genérica "L3"). Los LOS meningocócicos L3,7,9 (L3), L2 y L5 se pueden modificar por sialilación omediante la adición de ácido citidina 5’-monofosfato-N-acetilneuramínico. Aunque los LOS L2, L4 y L6 se puedendistinguir inmunológicamente, son estructuralmente similares y cuando se menciona en el presente documento L2,dentro del alcance de la invención se puede sustituir opcionalmente con L4 o L6. Se ha demostrado que los

55 anticuerpos para LOS protegen contra infección en ratas de experimentación y contribuyen a la actividad bactericida en niños infectados por N. meningitidis (Griffiss y col J Infect Dis 1984; 150: 71-79).

Un problema asociado al uso de LOS en una vacuna meningocócica, sin embargo, es su toxicidad (debido a su resto de Lípido A).

El LOS también está presente sobre la superficie de ampollas meningocócicas. Durante muchos años, los esfuerzosse han centrado en desarrollar vacunas basadas en vesícula de membrana externa (o ampolla) meningocócica (deMoraes, J. C., Perkins, B., Camargo, M. C. y col. Lancet 340: 1074-1078, 1992; Bjune, G., Hoiby, E. A. Gronnesby, J.

K. y col. 338: 1093-1096, 1991). Tales vacunas tienen la ventaja de incluir varias proteínas de membrana externaintegrales en una conformación plegada apropiadamente que pueden provocar una respuesta inmunológicaprotectora cuando se administran a un huésped. Además, las cepas de Neisseria (incluyendo el serogrupo B de N.

meningitidis - menB) excretan ampollas de membrana externa en cantidades suficientes para permitir su fabricación en una escala industrial. Sin embargo, con mayor frecuencia, se preparan ampollas mediante procedimientos quecomprenden una extracción con detergente al 0,5 % (por ejemplo, desoxicolato) de las células bacterianas (porejemplo, documento EP 11243). Aunque esto se desea debido a la toxicidad de LOS (también denominado endotoxina) como se ha descrito anteriormente, también tiene el efecto de eliminar la mayor parte del antígeno LOSde la vacuna.

Un problema adicional con el uso de LOS como un antígeno de vacuna es que existen 12 inmunotipos de LPS conuna diversa variedad de estructuras de hidratos de carbono (M. P. Jennings y col, Microbiology 1999, 145, 30133021; Mol Microbiol 2002, 43: 931-43). Los anticuerpos generados contra un inmunotipo no consiguen reconocer uninmunotipo diferente. Aunque el esfuerzo se ha centrado en producir una región "central" genérica de las porcionesde oligosacáridos de los inmunotipos de LOS (por ejemplo, documento WO 94/08021), la actividad bactericida deanticuerpos generados contra el LOS modificado se pierde. Por tanto, puede que una vacuna necesite tener muchoscomponentes de LOS de diferente inmunotipo para ser eficaz.

Existe un problema adicional con el uso de LOS (también conocido como LPS o lipopolisacárido) como antígenos envacunas humanas, concretamente, que llevan estructuras de sacáridos que son similares a estructuras de sacáridoshumanos (por ejemplo, en glóbulos rojos humanos), planteando por tanto un problema de seguridad con su uso. Pero el cambio de la estructura de LOS es problemático debido a la sensibilidad estructural de la eficacia bactericidadel antígeno LOS.

El documento WO 2004/014417 describe ciertas soluciones a estos problemas.

Los presentes inventores han encontrado además que:

-

la decoración del núcleo interno de LOS es importante para definir el epítope bactericida del inmunotipo,

-

se ha encontrado la enzima por la que el LOS L2 se somete a la decoración de O-acetilación en el resto GlcNAc unido a Heptosa II y el gen que la codifica Oac1,

-

se ha encontrado un LOS de inmunotipo L3 que está O-acetilado (no descrito nunca previamente) y esto parece estar generalizado entre las cepas L3,

-

auque los anticuerpos contra LOS L3 convencionales pueden inactivar cepas L3 O-acetiladas, la inactivación no es tan eficaz como contra cepas L3 convencionales.

Los anteriores hallazgos han conducido a los inventores a sugerir el uso de LOS L3 O-acetilado en formulaciones de vacuna de Neisseria.

Sumario de la invención

Por consiguiente, en un aspecto de la invención se proporciona una composición inmunogénica que comprende LOS L3 de una cepa de Neisseria que está O-acetilado en el resto GlcNac unido a su resto Heptosa II. La cepa de Neisseria puede producir de forma natural tales LOS (por ejemplo, cepa NZ124) o se puede preparar para ello por lainserción de un gen oac1 funcional (véase más adelante). Para los propósitos de esta invención, el inmunotipo L3Vno se clasifica como una cepa L3, ya que inmunológicamente es más similar al inmunotipo L2.

El LOS L3 puede tener la siguiente estructura:

en la que: R1=

R2= PEA,

R3= H,

5 R4= OAc,

R5= H o Gly.

Los anteriores términos se refieren a abreviaturas convencionales en la técnica de LOS, por ejemplo, Glc se refiere aGlucosa (o D-glucopiranosa), KDO se refiere a 2-ceto-3-desoxioctonato, Hep se refiere a L-glicero-D-mano-heptosa, GlcNAc a N-acetilglucosamina, Gal a Galactosa, NeuNac a ácido siálico, OAc a O-acetilo, PEA a fosfoetanolamina

10 (o 2-aminoetilfosfato), Gly a Glicina, etc.

Cada caso de "neisseria" en esta memoria descriptiva puede indicar N. meningitidis, por ejemplo, los serogrupos A, B, C, W135 e Y. También puede indicar cualquier otra cepa (tal como gonococo o Neisseria lactamica) que pueda producir el LOS de la invención.

Aunque el LOS L3 (L2/L4/L10) de la invención puede abarcar LOS del inmunotipo L3 (L21L4/L10), respectivamente,

15 esto no tiene que ser necesariamente el caso (por ejemplo, el LOS L2 de la invención abarca LOS L3V que ahora se sabe que es del inmunotipo L3, pero las cepas que llevan LOS L3V se inactivan por sueros generados contra LOScon un inmunotipo L2 -véase más adelante). La interpretación funcional de las expresiones "LOS", "LOS L2", "LOSL3", "LOS L4" y "LOS L10" de la invención, por lo tanto, se debe interpretar en su sentido más amplio. Por ejemplo, una composición inmunogénica que comprende un LOS L3 de la invención debe de ser capaz de generar

20 anticuerpos que inactivan cepas de un inmunotipo L3, etc.

La composición inmunogénica de la invención puede comprender además LOS L2 y/o L10 y/o L4 de una cepa deNeisseria. Los LOS L2, L3, L4 o L10 de la invención se pueden aislar de una cepa A, B, C, W 135 o Y de Neisseria meningitidis.

La composición inmunogénica de la invención puede comprender además LOS L2 con la siguiente estructura:

en la que: R1=

R2= PEA, Glc

R3= PEA, R4= H u OAc, R5= H, PEA o Gly. La composición inmunogénica de la invención puede comprender además LOS L10 con la siguiente estructura:

en la que: R1= Hexosa-Hexosa- R2= H o PEA, R3= PEA,

10 R4= OAc, R5= H o Gly. "R1=Hexosa-Hexosa= puede abarcar restos Gal-Gal-, Gal-GIc-, Glc-Gal-o Glc-GIc-, por ejemplo: R1=

15 La Hexosa terminal de R1 en el LOS L10 de la invención puede o no estar sialilada (si lo está, entonces opcionalmente mediante un grupo a-Neu5Ac-(2-3)).

La composición inmunogénica de la invención puede comprender además LOS L4 con la siguiente estructura:

en la que para el LOS L4: R1=

5 R2= H

R3= PEA,

R4= OAc,

R5= Gly.

Alternativamente, el LOS L4 de la invención puede tener R4 = H y/o tiene R5 = H.

10 Con "uno o más de los LOS de la invención" o "LOS de la invención" o expresiones similares en el presente documento se quiere decir LOS L2, LOS L3, LOS L10, LOS L4, LOS L2 y LOS L3, LOS L2 y L10, LOS L3 y L10,LOS L4 y L2, LOS L4 y L3, LOS L4 y L10, LOS L2 y L3 y L10, LOS L2 y L3 y L4, LOS L2 y L4 y L10, LOS L3 y L4 y L10 o LOS L2 y L3 y L10 y L4 de la invención. Con "preparaciones de ampolla de la invención" o expresionessimilares en el presente documento se quieren decir una o más ampollas de la invención que tienen LOS L2, LOS

15 L3, LOS L10, LOS L4, LOS L2 y L3, LOS L2 y L10, LOS L3 y L10, LOS L4 y L2, LOS L4 y L3, LOS L4 y L10, LOS L2 y L3 y L10, LOS L2 y L3 y L4, LOS L2 y L4 y L10, LOS L3 y L4 y L10 o LOS L2 y L3 y L10 y L4 de la invención. Lascepas bacterianas de la invención son aquellas de las que se puede aislar uno o más de los LOS de la invención.

Uno o más de los LOS de la invención se pueden conjugar con un vehículo de proteína (una fuente de epítopes de Tauxiliar -tales como toxoide tetánico, toxoide de Difteria, CRM 197 o una proteína de membrana externa en una

20 ampolla meningocócica (véase más adelante). Uno o más puede tener su resto de Lípido A destoxificado químicamente (véase más adelante) o genéticamente (por ejemplo, si se aísla de una cepa de neisseria que esmsbB(-) y/o htrB(-) -véase más adelante).

Puede estar presente uno o más LOS de la invención en la composición inmunogénica como una preparación deLOS purificada, como una preparación liposómica (que comprende normalmente LOS purificado) o como una

25 preparación de ampolla (véase más adelante).

La preparación o las preparaciones de ampolla de la invención se pueden aislar de sus respectivas cepas deneisseria después de una etapa de extracción usando detergente, preferiblemente desoxicolato, al 0-0,5, 0,02-0,4,0,04-0,3, 0,06-0,2, 0,08-0,15 ó 0,09-0,11 %. Sus respectivas cepas de neisseria se pueden haber cultivado encondiciones con hierro disponible para las mismas o en condiciones de agotamiento de hierro (por ejemplo, con un30 quelante del hierro añadido tal como desferal -véase más adelante). Las preparaciones de ampolla de la invención se pueden aislar de una cepa de neisseria que no puede sintetizar polisacárido capsular. Por ejemplo, la cepa puede tener uno de los siguientes genes de polisacárido capsular regulados negativamente en la expresión o delecionados(es decir, sin expresión funcional del gen) en comparación con la cepa nativa de la que procede: ctrA, ctrB, ctrC, ctrD, synA, synB, synC o, preferiblemente, siaD. Cuando están presentes ampollas tanto L2 como L3 (o está35 presente más de una preparación de ampolla de la invención), las cepas de las que se obtienen pueden tener el mismo gen de polisacárido capsular regulado negativamente en la expresión en cada cepa. La cepa de neisseria

puede tener cualquiera o ambos de los siguientes genes de lípido A regulados negativamente en la expresión y,preferiblemente, delecionados (es decir, sin expresión funcional del gen) en comparación con la cepa nativa de laque se obtiene: msbB o htrB, preferiblemente la primera. Cuando están presentes ampollas tanto L2 como L3 (o estápresente más de una preparación de ampolla de la invención), las cepas de las que se obtienen las ampollas tienen preferiblemente el mismo gen o genes de lípido A regulados negativamente en la expresión en cada cepa. La cepade neisseria puede tener 1 o más de los siguientes genes de proteína de membrana externa reguladosnegativamente en la expresión y, preferiblemente, delecionados (es decir, sin expresión del producto génico en lamembrana externa de la cepa) en comparación con la cepa nativa de la que se obtiene: porA, porB, opA, opC, pilC,IbpA o frpB. Cuando están presentes ampollas tanto L2 como L3 (o está presente más de una preparación deampolla de la invención), las cepas tienen preferiblemente el mismo gen o genes de proteína de membrana externaregulados negativamente en la expresión en cada cepa de neisseria. La cepa de neisseria puede tener 1 o más delos siguientes antígenos de proteína de membrana externa regulados positivamente en la expresión: NspA, TbpA bajo, TbpA alto, Hsf, Hap, OMP85, PilQ, NadA, GNA 1870, MltA. Cuando están presentes ampollas tanto L2 comoL3 (o esta presente más de una preparación de ampolla de la invención), las cepas de las que se obtienen tienen preferiblemente uno o más antígenos diferentes de proteína de membrana externa regulados positivamente en laexpresión en cada cepa.

Se proporcionan además composiciones de vacuna que comprenden una cantidad eficaz de la composición inmunogénica de la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable. La vacuna puede comprender adicionalmente un adyuvante, por ejemplo, hidróxido de aluminio o fosfato de aluminio. La vacuna puedecomprender adicionalmente uno o más polisacáridos u oligosacáridos capsulares conjugados obtenidos de lassiguientes cepas: serogrupo A de meningococo, serogrupo C de meningococo, serogrupo W-135 de meningococo,serogrupo Y de meningococo y H. influenzae de tipo b.

También se proporciona un uso de la composición inmunogénica de la invención o la vacuna de la invención en lafabricación de un medicamento para la prevención o el tratamiento de enfermedad provocada por uno o másserogrupos de N. meningitidis seleccionados entre la siguiente lista: A, B, C, W135 e Y. Se proporciona además unprocedimiento para la prevención o el tratamiento de enfermedad provocada por uno o más serogrupos de N. meningitidis seleccionados entre la siguiente lista: A, B, C, W135 e Y, que comprende la etapa de administrar lacomposición inmunogénica de la invención o la vacuna de la invención a un paciente humano que lo necesite.

Se proporciona además un procedimiento para fabricar las composiciones inmunogénicas o vacunas de la invenciónque comprende la etapa de aislar el LOS L3, combinar el mismo opcionalmente con LOS L2 y/o L10 aislados cuandosea apropiado y formular el LOS L3 con un excipiente farmacéuticamente aceptable.

También se proporciona un uso de la composición inmunogénica o vacuna de la invención en la fabricación de unmedicamento para la prevención o el tratamiento de enfermedad por inmunotipo L3 de N. meningitidis. Al igual que un procedimiento para prevenir o tratar una enfermedad por inmunotipo L3 de N. meningitidis que comprende laetapa de administrar a un paciente humano que lo necesite una cantidad eficaz de la composición inmunogénica ovacuna de la invención. La infección de inmunotipo L3 de N. meningitidis puede estar provocada por una cepa con LOS que está: O-acetilado en el resto GlcNAc unido a su resto Heptosa II, no O-acetilado en el resto GlcNac unido a su resto Heptosa II o está parcialmente O-acetilado y parcialmente no O-acetilado en el resto GlcNac unido a su resto Heptosa II.

En un aspecto adicional de la invención se proporciona un uso de una composición inmunogénica que comprendeLOS L3 que no está O-acetilado en el resto GlcNac unido a su resto Heptosa II en la fabricación de un medicamentopara la prevención o el tratamiento de enfermedad por inmunotipo L3 de N. meningitidis provocada por una cepa con LOS que está O-acetilado en el resto GlcNac unido a su resto Heptosa II. También se proporciona un procedimiento para prevenir o tratar una enfermedad por inmunotipo L3 de N. meningitidis provocada por una cepa con LOS que está O-acetilado en el resto GlcNac unido a su resto Heptosa II que comprende la etapa de administrar a un pacientehumano que lo necesite una cantidad eficaz de una composición inmunogénica que comprende LOS L3 que no estáO-acetilado en el resto GlcNac unido a su resto Heptosa II.

En este uso o procedimiento, la composición inmunogénica puede comprender LOS L3 con la siguiente estructura:

en la que: R1=

5 R2= PEA,

R3= H,

R4= H,

R5= H, PEA o Gly.

Como se explica a lo largo de esta memoria descriptiva para LOS de la invención, el LOS L3 en la composición

10 inmunogénica se puede conjugar con un vehículo de proteína (véase anteriormente y más adelante para una explicación adicional), puede comprender un resto de lípido A destoxificado, por ejemplo, que carece de una cadena secundaria de acilo coherente con el LOS que se ha aislado de una cepa de neisseria msbB(-) (y/o formando complejos LOS con los péptidos de destoxificación de Lípido A que se describen más adelante), puede estar presente en la composición inmunogénica como una preparación de LOS purificado, como una preparación

15 liposómica o como una preparación de ampolla. Si es una preparación de ampolla, se puede aislar de su respectiva cepa de neisseria después de una etapa de extracción usando detergente, preferiblemente desoxicolato, al 0-0,5,0,02-0,4, 0,04-0,3, 0,06-0,2, 0,08-0,15 ó 0,09-0,11 %. La cepa de neisseria puede no ser capaz de sintetizarpolisacárido capsular, por ejemplo, puede tener uno de los siguientes genes de polisacárido capsular reguladosnegativamente en la expresión y, preferiblemente, delecionados (sin expresión funcional) en comparación con la

20 cepa nativa de la que se obtiene: ctrA, ctrB, ctrC, ctrD, synA, synB, synC o, preferiblemente, siaD. La cepa de neisseria puede tener cualquiera o ambos de los siguientes genes de lípido A regulados negativamente en laexpresión y, preferiblemente, delecionados (sin expresión funcional) en comparación con la cepa nativa de la que seobtiene: msbB o htrB, preferiblemente la primera.

Se describe un procedimiento para des-O-acetilar el LOS de una cepa de Neisseria que normalmente O-acetila el

25 resto GlcNac unido al resto Heptosa II de su LOS que comprende la etapa de alterar la expresión funcional del gen oac1 de tal forma que ya no pueda expresar Oac1 funcional.

Con oac1 a lo largo de esta memoria descriptiva se quiere decir que el gen de neisseria responsable de catalizar laderivatización de HepII-GlcNac de LOS con un grupo OAc. La secuencia de gen activo y la fase de lectura abierta semuestran, por ejemplo, en la Figura 3D. A partir de esta secuencia se puede encontrar cualquier secuencia de oac130 de neisseria (por ejemplo, fases de lectura abierta que comparten al menos el 70, 80, 90, 95 o el 99 % de identidad de secuencia con la Orf mostrada en la Figura 3D. En un aspecto adicional de la invención se proporcionansecuencias de cebador de 10, 15, 20, 30, 35 o más nucleótidos contiguos de la Figura 3D que se pueden usar pararealizar los procedimientos de manipulación de oacl de la invención. En un aspecto adicional de la invención seproporciona un procedimiento para O-acetilar el resto de GlcNAc unido a HepII de LOS de bacteria Gram negativa

35 que comprende la etapa de mezclar el LOS no (o parcialmente) O-acetilado con enzima Oac1 aislada (que se puede preparar mediante técnicas recombinantes conocidas).

Se describe un procedimiento para O-acetilar, u O-acetilar adicionalmente, el LOS de una cepa de Neisseria que

normalmente no está, o solamente parcialmente, O-acetilado en el resto GlcNac unido al resto Heptosa II de su LOSque comprende la etapa de aumentar la expresión funcional del gen oac1 dentro de la cepa de Neisseria. Esto sepuede realizar si la etapa de aumentar la expresión funcional del gen oac1 se consigue introduciendo una copiafuncional (que puede ser una copia funcional adicional) del gen oac1 en la cepa de Neisseria (por ejemplo, la fase delectura abierta de la Figura 3D, opcionalmente con su secuencia promotora natural). Alternativamente, o adicionalmente, la etapa de aumentar la expresión funcional del gen oac1 se puede conseguir convirtiendo la regiónde variación de fase poli-G (existen dos de tales regiones en el gen oacl como se describe más adelante) de un genno funcional existente para estar en fase para la expresión funcional del gen oac1. Esto se puede realizar mediantetécnicas conocidas de mutagénesis. La región de variación de fase poli-G está habitualmente entre los nucleótidos1136 a 1140 del codón de inicio ATG para genes activos (y se puede extender más allá de 1140 fuera de fase engenes inactivos). Se encontró una segunda región poli-G en la posición 354 del codón de inicio.

Además se proporciona un procedimiento para convertir la expresión de oac1 funcional en una con menos variación de fase en una cepa de Neisseria que comprende la etapa de cambiar (cualquiera o ambas de) la región o lasregiones de variación de fase poli-G del gen oac1 del tal forma que están codificados los mismos aminoácidosusando codones que tienen menos nucleótidos G. Por ejemplo, el codón para el resto de arginina codificado por losnucleótidos 1135-1137 del codón de inicio ATG se puede cambiar de AGG a CGT, CGC, CGA o AGA y/o el codón para el resto de glicina codificado por los nucleótidos 1138-1140 del codón de inicio ATG se puede cambiar de GGG a GGT, GGA o GGC.

Los anteriores procedimientos de manipulación de oac1 se pueden realizar en una cepa de neisseria de inmunotipoL2 o L3. Se proporciona además un procedimiento para preparar una composición inmunogénica que comprende las etapas de realizar los procedimientos de manipulación de oac1 de la invención, aislar LOS de la cepa resultante deneisseria y formular una cantidad eficaz del LOS con un vehículo farmacéuticamente aceptable. De nuevo, como sedescribe a lo largo de esta memoria descriptiva, el LOS se puede conjugar a un vehículo de proteína, se puededestoxificar en su resto de lípido A, por ejemplo, aislando el LOS de una cepa de neisseria msbB(-) y/o combinando el mismo con un péptido de destoxificación de Lípido A descrito más adelante. El LOS se puede aislar como unapreparación de LOS purificado, como una preparación liposómica o como una preparación de ampolla. Si es unapreparación de ampolla, se puede aislar de su respectiva cepa de neisseria después de una etapa de extracciónusando detergente, preferiblemente desoxicolato, al 0-0,5, 0,02-0,4, 0,04-0,3, 0,06-0,2, 0,08-0,15 ó 0,09-0,11 %. Lacepa de neisseria puede no ser capaz de sintetizar polisacárido capsular, por ejemplo, puede tener uno de lossiguientes genes de polisacárido capsular regulados negativamente en la expresión y, preferiblemente, delecionados(sin expresión funcional), en comparación con la cepa nativa de la que se obtiene: ctrA, ctrB, ctrC, ctrD, synA, synB,synC o, preferiblemente, siaD. La cepa de neisseria puede tener cualquiera o ambos de los siguientes genes delípido A regulados negativamente en la expresión y, preferiblemente, delecionados (sin expresión funcional) encomparción con la cepa nativa de la que se obtiene: msbB o htrB, preferiblemente la primera.

Cada caso de "neisseria" en esta memoria descriptiva puede indicar N. meningitidis, por ejemplo, los serogrupos A, B, C, W135 e Y.

Leyendas de las figuras

Figura 1: Los patrones de sustitución comunes de estructuras de LOS meningocócicas como se demuestranpor estructuras de los inmunotipos L1-L8 (tomados de Kahler y col. Glycobiology 2005 15: 409-419 / 2006JBC 281: 19939-19948). La estructura de inmunotipo L7 (no mostrada) es la versión no sialilada de la estructura de inmunotipo L3. La región central interna conservada se muestra con uniones variables indicadas como R1-R5. La composición de la cadena a (R1) está dominada por la expresión de variación de fase de las IgtA-E transferasas e Ist, que codifica la sialiltransferasa que une el grupo a-Neu5Ac (ácidosiálico) terminal. Obsérvese que la unión de glicina a los núcleos internos es mediante la posición 7 en elsegundo resto Hep. Obsérvese que no se muestra un resto KDO adicional que se sabe que está presente enel núcleo interno para todos los inmunotipos unidos al resto KDO mostrado en el diagrama.

Figura 2A: Esquema de las estructuras LOS de diversas cepas L3 de N. meningitidis como se determinan porespectrometría de masas. De forma interesante, algunas cepas L3 menos tendentes a inactivarse por suerosobtenidos de H44/76 están O-acetiladas.

Figura 2B: Estructuras de LOS comunes de diversos inmunotipos de N. meningitidis. Se proporcionan losnombres de genes conocidos que codifican enzimas para formar ciertas partes de la estructura de LOS.

Figura

3A: gen de O-acetilación de LOS de N. meningitidis NMA 2202 de la cepa Z2491. Obsérvese que lasecuencia de 5 G en la fase de lectura abierta (caso superior) hace que la fase de lectura abierta esté enfase.

3B: gen de O-acetilación de LOS de N. meningitidis NMB 0285 de la cepa MC58. La fase de lectura abiertaen el caso superior, las secuencias circundantes (por ejemplo, secuencia promotora) en el caso inferior.Obsérvese que la secuencia de 6 G en la fase de lectura abierta (subrayada) hace que la fase de lecturaabierta esté fuera de fase.

3C: gen de O-acetilación de LOS de N. meningitidis (equivalente a NMB 0285) de la cepa 760676. La fase delectura abierta en el caso superior, las secuencias circundantes (por ejemplo, secuencia promotora) en elcaso inferior. Obsérvese que la secuencia de 5 G en la fase de lectura abierta (subrayada) hace que la fasede lectura abierta esté en fase.

3D: gen de O-acetilación de LOS de N. meningitidis (equivalente a NMB 0285) de (MenB, L3) cepa NZ124.

La fase de lectura abierta en el caso superior, las secuencias circundantes (por ejemplo, secuenciapromotora) en el caso inferior. Obsérvese que la secuencia de 5 G en la fase de lectura abierta (subrayada)hace que la fase de lectura abierta esté en fase.

Figura 4: A - Oligosacárido central interno de LOS 6275 (EN-); B - oligosacárido central interno de LOS 6275(MS/MS EN+ m/z 1803,6), esquema mostrado de la estructura que muestra HepII unida a PEA en lasposiciones 3 y 6 y estando el núcleo interno O-acetilado; C - oligosacárido central interno de Men C cepa C11 (EN-).

Figura 5: Impacto de sialilación de LOS L2 sobre la inducción de anticuerpos bactericidas cruzados porvacunas de OMV obtenidas de L2. Títulos de SBA (GMT para inactivación del 50 %) y seroconversión (%).

Figura 6: Análisis estructural de espectrometría de masas de LOS L10 de 3125 de MenA.

Descripción de la invención

La referencia a "lipooligosacárido" (o "LOS") también se puede denominar "lipopolisacárido" o "LPS".

Las expresiones "que comprende", "comprenden" y "comprende" usadas por los inventores en el presente documento tienen por objeto ser opcionalmente sustituibles por las expresiones "que está constituido por", "constituidos por" y "constituido por", respectivamente, en cualquier caso.

Los presentes inventores han encontrado que el acortamiento de las estructuras de oligosacáridos LOS conduce a lapérdida de epítopes que pueden provocar una respuesta inmune bactericida. En lugar de esto, los inventores han observado que para usar más eficazmente los LOS en una formulación de vacuna, la estructura de oligosacáridosLOS se tiene que conservar tanto como sea posible, pero una combinación de solamente 2 (o 3 ó 4) antígenos LOSpuede producir una vacuna de Neisseria (preferiblemente meningocócica) universalmente eficaz. Un primer aspectode la invención es una composición inmunogénica para la prevención o el tratamiento de enfermedad por Neisseria(preferiblemente meningocócica o meningocócica B) que comprende LOS de Neisseria (preferiblementemeningocócica) de inmunotipo L2 y LOS de inmunotipo L3 (o el LOS L2 y L3 de la invención y opcionalmente el LOS L10 y/o L4 de la invención). Se pueden aislar LOS mediante cualquier procedimiento conocido de purificación opueden estar presentes en al menos dos preparaciones de vesícula de membrana externa (o ampolla) obtenidas,por ejemplo, de cepas de Neisseria L2 y L3. Para eliminar los LOS sujetos de forma suelta tóxicos de la preparaciónde ampolla, pero conservar altos niveles de antígeno LOS integrado en la ampolla, se prefiere que las ampollas seextraigan usando una baja concentración de detergente, preferiblemente desoxicolato (o DOC) -al 0-0,3 %,preferiblemente 0,05-0,2 %, más preferiblemente aproximadamente al 0,1 %. Tal combinación de antígenos LOS,particularmente en una vacuna de ampolla, es sorprendentemente ventajosa por ser eficaz contra más del 90 % delas cepas de N. meningitidis.

Los inventores también han encontrado que las anteriores composiciones inmunogénicas de ampolla de la invencióny, de hecho, cualquier composición inmunogénica de ampolla obtenida de Neisseria (preferiblemente gonocócica omeningocócica) puede tener un efecto mejorado de antígenos protectores (incluyendo LOS) sobre su superficie siciertas combinaciones de proteínas de membrana externa inmunodominantes están reguladas negativamente en laexpresión (y preferiblemente delecionadas). Por lo tanto, un aspecto adicional de la invención es una o máspreparaciones de ampolla de Neisseria de la invención que se obtiene de una cepa de Neisseria que tiene 2 o másde las siguientes proteínas de membrana externa reguladas negativamente en la expresión y, preferiblemente,delecionadas, en comparación con la cepa nativa no modificada: PorA, PorB, OpA, OpC o PilC. Preferiblementeestán reguladas negativamente o delecionadas PorA y OpA, PorA y OpC, OpA y OpC, o PorA y OpA y OpC. Laregulación negativa (preferiblemente deleción) de la expresión de FrpB también se ha demostrado que esbeneficiosa al mejorar el efecto de antígenos con protección cruzada -particularmente en preparaciones de ampollarealizadas a partir de cepas de Neisseria cultivadas en condiciones de limitación de hierro. Una ampolla de Neisseriade la invención obtenida de una cepa con esta mutación es, por tanto, una realización adicional de la invención, aligual que ampollas obtenidas de una combinación de regulación negativa de FrpB con una o más de las regulaciones negativas que se han mencionado anteriormente. Se prefiere que si está regulada negativamente PorA,PorB no debe estar regulada negativamente y viceversa.

Las anteriores mutaciones son beneficiosas en cualquier cepa de Neisseria (preferiblemente meningocócica, máspreferiblemente menB) de la que se tienen que obtener las composiciones inmunogénicas de ampolla de la invención, particularmente las que se describen en el presente documento, sin embargo, se prefiere que se usencepas de Neisseria (preferiblemente meningocócicas, más preferiblemente menB) de inmunotipo L2 o L3, normalmente extraídas con un procedimiento de extracción con bajo % de DOC como se describe en el presentedocumento. Preferiblemente, las composiciones inmunogénicas de ampolla de la invención contienen ampollas tantoL2 como L3 donde al menos una (y preferiblemente ambas) es deficiente en las anteriores combinaciones deproteínas de membrana externa (u OMP) inmunodominantes. Se analizan técnicas para regular negativamente estosgenes en el documento WO 01/09350 (incorporado por referencia en el presente documento). Se conoce que existen cuatro genes de Opa diferentes en el genoma meningocócico (Aho y col. 1991 Mol. Microbiol. 5: 1429-37), por lo tanto, cuando se dice que Opa está regulado negativamente en la expresión, se quiere decir quepreferiblemente 1, 2, 3 o (preferiblemente) los 4 genes presentes en meningococo están regulados negativamentede este modo. Tal regulación negativa se puede realizar genéticamente como se describe en el documento WO01/09350 o buscando cepas meningocócicas que se hallan fácilmente, naturales, estables, que no tienen expresión

o expresión baja de los loci de Opa. Tales cepas se pueden encontrar usando la técnica descrita en Poolman y col(1985 J. Med. Micro. 19: 203-209), donde las células que son Opa tienen un fenotipo diferente con respecto a célulasque expresan Opa que se pueden observar mirando el aspecto de las células en las placas o bajo un microscopio.Una vez encontrada, se puede demostrar que la cepa es Opa estable realizando una transferencia de Western enlos contenidos celulares después de un ciclo de fermentación para establecer la ausencia de Opa.

Seguridad de las anteriores composiciones inmunogénicas de LOS

La seguridad de anticuerpos generados para LOS L3 o L2 se ha cuestionado debido a la presencia de unaestructura similar al grupo de oligosacárido lacto-N-neotetraosa (Gal11-4GlcNAc11-3Gal11-4Glc11-; Fig 1) presente en glucoesfingolípidos humanos. Aunque un gran número de personas se han vacunado de forma segura convacunas de vesícula extraídas con desoxicolato que contienen una cantidad residual de LOS L3 (G. Bjune y col,Lancet (1991), 338, 1093-1096; GVG. Sierra y col, NlPH ann (1991), 14, 195-210), si se tiene que conservar LOScomo un antígeno como se analiza en el presente documento, se ha observado por los presentes inventores que ladeleción de una parte terminal de la estructura de sacárido LOS es ventajosa para evitar la reacción cruzada de larespuesta inmune anti-LOS con estructuras presentes en la superficie de tejidos humanos. En una realizaciónpreferida, la inactivación del gen IgtB da como resultado una estructura de LOS intermedia en la que el resto degalactosa terminal y el ácido siálico están ausentes (véase las Figuras 1 y 2, la mutación deja una estructura de4GlcNAc11-3Gal11-4Glc11- en LOS L2 y L3 y L4). Tales intermedios se podrían obtener en una cepa de LOS L3 y/oL2 (y/o L4). Una versión alternativa y menos preferida (corta) de los LOS se puede obtener desconectando el genIgtE. Una versión alternativa y menos preferida adicional de los LOS se puede obtener desconectando el gen IgtA. Sise selecciona tal mutación IgtA-, se prefiere desconectar también la expresión de IgtC para evitar que se forme elinmunotipo L1 no inmunogénico.

Los mutantes LgtB- son más preferidos ya que los inventores han observado que éste es el truncamiento óptimopara resolver el problema de la seguridad mientras que todavía se conserva un epítope de oligosacárido protectorLOS que todavía puede inducir una respuesta de anticuerpo bactericida (e incluso bactericida cruzado).

Por lo tanto, las anteriores preparaciones de L2 y/o L3 (o uno o más de los LOS de la invención como se handefinido anteriormente) (purificadas o en una ampolla aislada) de la invención o preparaciones de ampollameningocócicas de la invención en general (particularmente L2 y/o L3) se obtienen ventajosamente de una cepa deNeisseria (preferiblemente meningocócica) que se ha modificado genéticamente para regular negativamente deforma permanente la expresión del producto génico funcional del gen IgtB, IgtA o IgtE, preferiblementedesconectando el gen, más preferiblemente delecionando todo o parte del promotor y/o la fase de lectura abierta del gen.

Preferiblemente, las cepas de neisseria de la invención son deficientes en la síntesis de polisacárido capsular.

Cuando las anteriores preparaciones de ampolla se obtienen de una cepa de meningococo B, se prefiereparticularmente que también se elimine el polisacárido capsular (que también contiene estructuras de sacárido detipo humano). Aunque se podrían desconectar muchos genes para conseguir esto, los inventores han demostradoventajosamente que se prefiere que la cepa de producción de ampolla se haya modificado genéticamente pararegular negativamente de forma permanente la expresión del producto génico funcional del gen siaD (es decir,regulando negativamente la actividad de a-2-8 polisialiltransferasa), preferiblemente desconectando el gen, máspreferiblemente delecionando todo o parte del promotor y/o la fase de lectura abierta del gen. Tal inactivación sedescribe en el documento WO 01/09350. La mutación de siaD (también conocida como synD) es la más ventajosade muchas mutaciones que pueden dar como resultado la eliminación del epítope similar a humano del polisacáridocapsular, debido a que es una de las únicas mutaciones que no tiene efecto sobre la biosíntesis de los epítopesprotectores de LOS, siendo por tanto ventajosa en un procedimiento que pretende usar finalmente LOS como unantígeno protector y tiene un efecto mínimo sobre el desarrollo de la bacteria. Un aspecto preferido de la invención,por lo tanto, es una preparación inmunogénica de ampolla como se ha descrito anteriormente, que se obtiene de unacepa mutante de meningococo B IgtE- siaD-, IgtA- siaD- o, preferiblemente, IgtB- siaD’. La propia cepa es un aspecto adicional de la invención.

Aunque es preferible una mutación siaD- por los anteriores motivos, se pueden usar otras mutaciones quedesconectan la síntesis de polisacárido capsular de meningococo B (o meningococo en general). Por tanto, la cepade producción de ampolla se puede modificar genéticamente para regular negativamente de forma permanente laexpresión del producto génico funcional de uno o más de los siguientes genes: ctrA, ctrB, ctrC, ctrD, synA(equivalente a synX y siaA), synB (equivalente a siaB) o synC (equivalente a siaC), preferiblemente desconectandoel gen, más preferiblemente delecionando todo o parte del promotor y/o la fase de lectura abierta del gen. Lamutación IgtE- se puede combinar con una o más de estas mutaciones. Preferiblemente, la mutación IgtB-se combina con una o más de estas mutaciones. Por lo tanto, un aspecto adicional de la invención es una preparacióninmunogénica de ampolla como se ha descrito anteriormente que se obtiene de tal cepa mutante combinada demeningococo B (o meningococo en general). La propia cepa es un aspecto adicional de la invención.

En la técnica se conoce un locus de Neisseria que contiene diversos genes Igt, incluyendo IgtB e Irte, y su secuencia (véase M. P. Jennings y col, Microbiology 1999, 145, 3013-3021 y referencias citadas en ese documento; J. Exp.Med. 180: 2181 -2190 [1994]; documento WO 96/10086).

Cuando se tiene que usar LOS de longitud completa (no truncado) de la invención en el producto final, es deseableque el LOS no esté sialilado (ya que tal LOS puede generar una respuesta inmune contra las cepas de meningococoB más peligrosas, invasivas, que también están sin sialilar). En tal caso, es ventajoso el uso de una cepa negativa acápsula que tenga un gen synA (equivalente a synX y siaA), synB (equivalente a siaB) o synC (equivalente a siaC)delecionado, ya que tal mutación también convierte los LOS de menB en incapaces de ser sialilados. En unarealización de la invención, el gen 1st (Gilbert y col., JBC 1996, 271: 28271-6) se convierte en inactivo funcionalmente (por ejemplo, mediante deleción o alteración o reducción de la expresión del gen) o se seleccionauna cepa para la invención donde el gen está alterado de forma natural (para la familia de inmunotipos L3, tal cepadefectuosa se denomina con frecuencia un inmunotipo L7). Lst es una alfa-2,3-sialiltransferasa que añade el ácidosiálico terminal a la cadena alfa de LOS (pero no tiene ningún efecto sobre la producción de ácido siálico). En unarealización, la cepa de la invención es lst(-) y siaD(-).

Las anteriores mutaciones son beneficiosas en cualquier cepa de Neisseria (preferiblemente meningocócica, más

preferiblemente menB) de la que se tienen que obtener oposiciones inmunogénicas de ampolla, particularmente las que se describen en el presente documento, sin embargo, se prefiere que se usen cepas de Neisseria (preferiblemente meningocócicas, más preferiblemente menB) de inmunotipo L2 o L3, normalmente extraídas con unprocedimiento de extracción con bajo % de DOC como se describe en el presente documento. Preferiblemente, lascomposiciones inmunogénicas de ampolla de la invención contienen ampollas tanto L2 como L3 donde al menos una(y preferiblemente ambas) se obtienen de cepas deficientes en la expresión de los anteriores genes.

La Toxicidad de LOS

Las composiciones inmunogénicas de LOS purificados o ampolla anteriores de la invención también se puedenconvertir en menos tóxicas regulando negativamente la expresión de ciertos genes en la cepa de producciónbacteriana de la que se obtienen. Aunque tal destoxificación puede no ser necesaria para la inmunización intranasalcon OMV nativa (J. J. Drabick y col, Vaccine (2000), 18, 160-172), para la vacunación parenteral la destoxificaciónpresentaría una ventaja. Preferiblemente, las composiciones inmunogénicas de LOS purificado o ampolla de lainvención se destoxifican modificando genéticamente la cepa de producción de Neisseria mediante mutación/modificación/inactivación de los genes implicados en la biosíntesis de Lípido A, particularmente los genesimplicados en la adición de cadenas secundarias de acilo a lípido A, en particular, regulando negativamente laexpresión del producto génico funcional de los genes msbB y/o htrB y preferiblemente desconectando el gen, máspreferiblemente delecionando todo o parte del promotor y/o la fase de lectura abierta del gen. Alternativamente (oadicionalmente), las composiciones inmunogénicas de LOS purificado o de ampolla se pueden obtener de una cepade Neisseria que se ha modificado genéticamente de tal forma que uno o más de los siguientes genes estánregulados positivamente (introduciendo un promotor fuerte o integrando una copia adicional del gen): pmrA, pmrB,pmrE y pmrF. Alternativamente (o adicionalmente), las composiciones inmunogénicas de LOS purificado o ampollase pueden destoxificar añadiendo equivalentes funcionales de péptido no tóxicos de polimixina B [una molécula conalta afinidad por Lípido A] a las composiciones (véase a continuación -es decir, uno o más de los LOS de lainvención se combinan con un péptido de unión a lípido A adecuado para reducir la toxicidad de los LOS, tal comoSAEP2 o SAEPII).

Véase el documento WO 01/09350 para más detalles en relación a los anteriores procedimientos de destoxificacióny para secuencias promotoras / génicas pertinentes y procedimientos de regulación positiva y regulación negativa.Los genes msbB y htrB de Neisseria también se denominan IpxL1 y lpxL2, respectivamente (véase el documentoWO 00/26384) y las mutaciones de deleción de estos genes se caracterizan fenotípicamente por el LOS mutantemsB- que pierde una cadena secundaria de acilo en comparación con el tipo silvestre (y que conserva 4 cadenas primarias de acilo y 1 secundaria) y el LOS mutante htrB- que pierde ambas cadenas secundarias de acilo. Talesmutaciones se combinan preferiblemente con mutaciones para garantizar que la cepa de producción de Neisseriasea deficiente en polisacárido capsular (véase anteriormente) para garantizar la presentación óptima de LOSdestoxificado en la ampolla o para ayudar a la purificación de la subunidad de LOS destoxificado.

Véase los documentos WO 93/14115, WO 95/03327, WO2006/108586, Velucchi y col (1997) J Endotoxin Res 4: 112 y el documento EP 976402 para detalles adicionales para equivalentes funcionales de péptidos no tóxicos depolimixina B (péptidos de unión a lípido A adecuados para reducir la toxicidad del LOS de la invención) que sepueden usar en las composiciones de esta invención -particularmente el uso del péptido SAEP 2 (de la secuencia KTKCKFLKKC en la que las 2 cisteínas forman un puente disulfuro) y SAEP II (un dímero peptídico descrito en lasreivindicaciones 1-10 del documento WO 2006/108586). La referencia a tales péptidos de unión a lípido A en elpresente documento se puede referir a cualquiera de las fórmulas específicas o generales de péptidos descritas enlas reivindicaciones o ejemplos de las solicitudes de patente que se han citado anteriormente.

Con "regular negativamente la expresión del producto génico funcional" se quiere decir en el presente documentoque se realizan adiciones, deleciones o sustituciones en el promotor o la fase de lectura abierta del gen en cuestiónde tal forma que se reduce la actividad biosintética del producto génico total (el 60, 70, 80, 90, 95 o máspreferiblemente el 100 %). Se pueden introducir claramente mutaciones de la fase de lectura o se pueden sustituirpromotores más débiles, sin embargo, más preferiblemente, la mayor parte o toda la fase de lectura abierta y/o elpromotor se delecionan para garantizar una regulación negativa permanente del producto génico (activo) (como sedescribe en el documento WO 01/09350).

Las anteriores mutaciones son beneficiosas en cualquier cepa de Neisseria (preferiblemente meningocócica, máspreferiblemente menB) de la que se tienen que obtener composiciones inmunogénicas de ampolla, particularmentelas que se describen en el presente documento, sin embargo, se prefiere que se usen cepas de Neisseria (preferiblemente meningocócicas, más preferiblemente menB) de inmunotipo L2 o L3, normalmente extraídas con unprocedimiento de extracción con bajo % de DOC como se describe en el presente documento. Preferiblemente, lascomposiciones inmunogénicas de ampolla de la invención contienen ampollas tanto L2 como L3 (o las preparacionesde ampolla de la invención) donde al menos una (y preferiblemente ambas) se obtienen de cepas deficientes en laexpresión de los anteriores genes.

Las preparaciones de LOS o de ampolla que contienen LOS de la invención Un aspecto adicional de la descripción es una preparación de LOS (particularmente cualquiera de las que se han descrito anteriormente)aislada de las cepas de Neisseria de la invención. Preferiblemente, el LOS aislado (o ampolla que contiene LOS) esde inmunotipo L2 o L3 y, preferiblemente, las composiciones inmunogénicas de la invención comprenden preparaciones de LOS tanto L2 como L3 (o ampollas) de la invención.

Tales preparaciones también se pueden mejorar conjugando la porción de oligosacárido del anterior LOS (purificado

o presente en una preparación de ampolla) con un vehículo que comprende una fuente de epítopes de células T(convirtiendo de este modo el LOS en un inmunógeno incluso mejor [dependiente de T]). Una preparación de LOSpurificado de la invención se puede convertir alternativamente (o adicionalmente) en un mejor antígeno presentandoel mismo en formulaciones de liposoma conocidas en la técnica (véase, por ejemplo, el documento WO 96/40063 y referencias citadas en ese documento).

El procedimiento de aislamiento de LOS de bacterias se conoce bien en la técnica (véase, por ejemplo, elprocedimiento de agua caliente-fenol de Wesphal & Jann [Meth. Carbo. Chem. 1965, 5: 83-91]). Véase también Galanos y col. 1969, Eur J Biochem 9: 245-249 y Wu y col. 1987, Anal Bio Chem 160: 281-289. También se conocentécnicas para conjugar LOS aislados (véase, por ejemplo, el documento EP 941738 incorporado por referencia en elpresente documento).

Para los fines de esta invención, "un vehículo que comprende una fuente de epítopes de células T" habitualmente es un péptido o, preferiblemente, un polipéptido o proteína. Las técnicas de conjugación se conocen bien en la técnica.Los vehículos típicos incluyen proteína D de H. influenzae no tipable, toxoide tetánico, toxoide de difteria, CRM197 o proteínas de membrana externa presentes en preparaciones de ampolla (particularmente de neisseria o meningocócicas).

Las composiciones de LOS aislados preferidas son: una composición que comprende LOS aislados L2 y L3 donde laporción de oligosacárido de cada LOS se conjuga opcionalmente con un vehículo que comprende una fuente deepítopes de células T, una composición que comprende LOS L2 o L3 que tiene una estructura coherente conhaberse obtenido de una cepa meningocócica IgtB-, donde la porción de oligosacárido de cada LOS se conjuga opcionalmente con un vehículo que comprende una fuente de epítopes de células T y, más preferiblemente, unacomposición que comprende LOS aislados L2 y L3 que tienen una estructura coherente con haberse obtenido deuna cepa meningocócica IgtB-, donde la porción de oligosacárido de cada LOS se conjuga opcionalmente con unvehículo que comprende una fuente de epítopes de células T.

Preferiblemente, las composiciones de LOS (uno o más de los LOS de la invención) se han destoxificado. Esto sepuede realizar mediante técnicas conocidas de tratamiento químico con hidracina o hidrólisis alcalina que retirancadenas de acilo de la molécula (pero que pueden reducir la eficacia protectora de la molécula), pero se realizapreferiblemente aislando los LOS de un mutante meningocócico htrB- o msbB- ( como se ha descrito anteriormente;particularmente en cepas sin polisacárido capsular) o añadiendo un equivalente funcional de péptido no tóxico depolimixina B [una molécula con alta afinidad por Lípido A] a la composición, en particular, SAEP 2 o SAEPII (como seha descrito anteriormente).

Los LOS de la descripción se pueden administrar en un estado aislado (habitualmente en forma de micelas si elresto de lípido A todavía está intacto) o se pueden administrar en un liposoma. En tal caso, se pueden añadirproteínas de membrana externa al liposoma y los LOS se pueden conjugar dentro del liposoma a tales proteínas demembrana externa para convertir el oligosacárido en un antígeno dependiente de T. Esto se puede realizar con una química similar como la descrita para la reticulación de LOS intra-ampolla como se describe más adelante.

Reticulación (conjugación) intra-ampolla de la porción de oligosacárido de LOS con proteínas de membrana externa presentes sobre la superficie de la ampolla

Cuando está presente LOS (particularmente el LOS de la invención) en una formulación de ampolla, el LOS seconjuga preferiblemente in situ mediante procedimientos que permiten la conjugación de LOS con una o másproteínas de membrana externa también presentes en la preparación de ampolla (por ejemplo, PorA o PorB enmeningococo). Por tanto, un aspecto adicional de la invención es una preparación de ampolla (una o más preparaciones de ampolla de la invención) de una cepa bacteriana Gram negativa en cuya membrana externa seintegra una proteína de membrana externa conjugada con LOS. Aunque se pueden añadir LOS a una preparaciónde ampolla para la conjugación, se prefiere que el LOS esté presente de forma natural sobre la superficie de lapreparación de ampolla.

Este procedimiento puede mejorar ventajosamente la estabilidad y/o inmunogenicidad (proporcionando ayuda decélulas T) y/o antigenicidad del antígeno LOS dentro de la formulación de ampolla -dando por tanto ayuda de célulaT para el inmunógeno de oligosacárido independiente de T en su conformación más protectora- como LOS en suentorno natural sobre la superficie de la membrana externa. Además, la conjugación del LOS dentro de la ampollapuede dar como resultado una destoxificación del LOS (sin desear quedar ligado por la teoría, la porción de lípido Ase puede llevar de forma más estable en la membrana externa si se conjuga, estando por tanto menos disponiblepara provocar toxicidad). Por tanto, los procedimientos de destoxificación que se han mencionado anteriormente deaislar ampollas de mutantes htrB-o msbB- o añadiendo equivalente funcional de péptido no tóxico de polimixina B ala composición, pueden no requerirse (pero se pueden añadir en combinación para seguridad adicional).

Las preparaciones de ampolla conjugadas son normalmente tales, que la toxicidad del LOS en la ampolla es reducida en comparación con las mismas ampollas con la misma cantidad de LOS no conjugado en su totalidad. Latoxicidad de LOS se puede determinar fácilmente por un experto en la materia, por ejemplo, usando el ensayo depirogenicidad de conejo para LOS en la Farmacopea Europea (véase el Ejemplo 7 del documento WO 2004/014417).

Las preparaciones de ampolla conjugadas son ventajosamente de tal manera que el LOS conjugado tiene unaconformación adecuada para provocar una respuesta inmune en un huésped, cuyos sueros son reactivos (puedenunirse) con LOS no conjugado -presente preferiblemente en la bacteria a partir de la cual se preparó la preparaciónde ampolla y más preferiblemente de un modo bactericida en un ensayo de SBA.

Cuando se conjugan ampollas de neisseria con LOS y las ampollas se obtienen de una cepa reguladanegativamente en una o más proteínas de membrana externa inmunodominantes como se describe en el presentedocumento, se prefiere que si PorA está regulado negativamente, PorB no debe estar regulado negativamente y viceversa. Esto permite que la mayoría de los LOS reticulen con una proteína de membrana externa principal y, porlo tanto, minimiza cualquier efecto de conjugación sobre antígenos de membrana externa menores con proteccióncruzada presentes en la ampolla.

En particular, los inventores han observado que una composición que comprende ampollas en las que los LOS presentes en las ampollas se han conjugado de un modo intra-ampolla con proteínas de membrana externa tambiénpresentes en la ampolla pueden formar la base de una vacuna para el tratamiento o la prevención de enfermedadesprovocadas por el organismo del cual se han obtenido las ampollas, donde tal vacuna es de toxicidad reducida(preferiblemente sustancialmente no tóxica) y/o es capaz de inducir una respuesta bactericida dependiente de Tcontra LOS en su entorno nativo.

Por lo tanto, esta invención proporciona además tal preparación de ampolla conjugada con LOS intra-ampolla. Con"intra-ampolla" que quiere decir que el LOS presente de forma natural en la ampolla se conjuga con la proteína demembrana externa presente en la misma ampolla.

Tales preparaciones de ampolla se pueden aislar de la bacteria en cuestión (véase el documento WO 01/09350) y después someter a química de conjugación conocida para unir grupos (por ejemplo, NH2 o COOH) en la porción de oligosacárido de LOS a grupos (por ejemplo, NH2 o COOH) en proteínas de membrana externa de ampolla. Sepueden usar técnicas de reticulación usando glutaraldehído, formaldehído o mezclas de glutaraldehído/formaldehído,pero se prefiere que se usen químicas más selectivas tales como EDAC o EDAC/NHS (J. V. Staros, R. W. Wright y

D. M. Swingle. Enhancement by N-hydroxysuccinimide of water-soluble carbodiimide-mediated coupling reactions.Analytical chemistry 156: 220-222 (1986); y Bioconjugates Techniques. Grez T. Hermanson (1996) págs. 173-176).Se describen otras químicas de conjugación o tratamientos capaces de crear enlaces covalentes entre LOS y moléculas de proteína que se podrían usar en esta invención en el documento EP 941738.

Preferiblemente, las preparaciones de ampolla se conjugan en ausencia de polisacárido capsular. Las ampollas sepueden aislar de una cepa que no produce polisacárido capsular (de forma natural o por mutación) o se puedenpurificar de la mayoría (mas del 60, 70, 80, 90 o el 99 % eliminado) y preferiblemente todos los polisacáridoscapsulares contaminantes. De este modo, la reacción de conjugación de LOS intra-ampolla es mucho más eficaz.

Preferiblemente, más del 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o del 95 % de los LOS presentes en las ampollas estánreticulados/conjugados.

Preferiblemente, las ampollas se han preparado de tal forma que el contenido de LOS de las ampollas es del 3-30,5-25, 10-25, 15-22 y más preferiblemente aproximada o exactamente del 20 % del contenido de LOS como se midepor tinción con plata después de electroforesis en SDS-PAGE usando LOS purificado como un patrón (véase elprocedimiento de Tsai, J. Biol. Standardization (1986) 14: 25-33). Se puede conseguir el 20 % de LOS en ampollasmeningocócicas con una extracción con DOC bajo al 0,1 %, que puede eliminar moléculas de LOS sujetas de formasuelta pero conservar la mayoría del antígeno.

Cuando las ampollas conjugadas intra-ampolla se obtienen de meningococo, se prefiere que la cepa de la que seobtienen sea una cepa mutante que no puede producir polisacárido capsular (por ejemplo, una de las cepasmutantes que se han descrito anteriormente, en particular, siaD). También se prefiere que las composicionesinmunogénicas eficaces contra enfermedad meningocócica comprendan una ampolla tanto L2 como L3, donde elLOS tanto L2 como L3 se conjuga con proteínas de membrana externa de la ampolla. Además, se prefiere que laestructura de LOS dentro de la ampolla conjugada intra-ampolla sea coherente con haberse obtenido de una cepameningocócica IgtB-. Más preferiblemente, las composiciones inmunogénicas comprenden ampollas conjugadasintra-ampolla: obtenidas de una cepa meningocócica mutante L2 o L3 que no puede producir polisacárido capsular y es IgtB-; que comprende ampollas L2 y L3 obtenidas de cepas meningocócicas mutantes que no pueden producirpolisacárido capsular; que comprenden ampollas L2 y L3 obtenidas de cepas meningocócicas mutantes que sonIgtB-; o más preferiblemente, que comprenden ampollas L2 y L3 obtenidas de cepas meningocócicas mutantes queno pueden producir polisacárido capsular y son IgtB-.

Una cepa meningocócica L3 típica que se puede usar para la presente invención es la cepa menB H44/76. Una cepaL2 típica es la cepa menB B16B6 o la cepa de meningococo tipo C 39E o la cepa 760676. Una cepa L10 típica es lacepa menA 3125. Una cepa L4 es la cepa MenC C 19.

Como se ha indicado anteriormente, las ampollas se han destoxificado hasta un grado por el acto de la conjugación y no se tienen que destoxificar adicionalmente, sin embargo, se pueden usar procedimientos adicionales dedestoxificación para seguridad adicional, por ejemplo, usando ampollas obtenidas de una cepa meningocócica que es htrB-o msbB- o añadiendo un equivalente funcional de péptido no tóxico de polimixina B [una molécula con altaafinidad por Lípido A] (preferiblemente SEAP 2 o SEAP II) a la composición de ampolla (como se ha descritoanteriormente). La conjugación de LOS (particularmente de un modo intra-ampolla), por tanto, muestra sorprendentemente una menor toxicidad de LOS en comparación con preparaciones que comprenden la mismacantidad de LOS no conjugado. Por tanto, un procedimiento general para destoxificar ampollas (particularmentemeningocócicas) se proporciona adicionalmente mediante la conjugación intra-ampolla de LOS con proteína demembrana externa de ampolla y también se proporciona un procedimiento para destoxificar LOS mediante laconjugación del LOS a la proteína de membrana externa de ampolla.

De la anterior manera, se proporcionan ampollas meningocócicas y composiciones inmunogénicas que comprendenampollas que tienen un LOS de antígeno importante que tiene toxicidad reducida (y preferiblemente es sustancialmente no tóxico), está desprovisto de problemas de autoinmunidad, tiene un carácter dependiente de T,está presente en su entorno natural y es capaz de inducir una respuesta de anticuerpos bactericidas contra potencialmente más del 90 % de las cepas meningocócicas (en el caso de composiciones L2+L3).

Uno o más de polisacáridos u oligosacáridos capsulares Men A, C, Y o W (preferiblemente al menos MenC o MenAy MenC o Men C y MenY) también se pueden conjugar en una proteína de membrana externa de la ampolla de lainvención. Aunque esto se podría realizar en la misma reacción que la reticulación de LOS, se prefiere que esto serealice en una reacción separada (preferiblemente posterior).

El procedimiento de la conjugación de LOS intra-ampolla óptima es un aspecto adicional de la presente invención.

Dicho procedimiento debe incorporar las etapas de aislar ampollas de una bacteria Gram negativa (preferiblementeusando un bajo % de DOC como se describe en el presente documento), realizando la química adecuada paraconjugar LOS (preferiblemente por su resto de oligosacárido) presente en las ampollas con una proteína demembrana externa presente en la misma ampolla, aislar la preparación de ampolla conjugada intra-ampolla y,opcionalmente, formular la preparación de ampolla conjugada intra-ampolla con una preparación de ampolla conjugada intra-ampolla adicional preparada mediante el mismo procedimiento pero que tiene un inmunotipodiferente de LOS (preferiblemente mezclando ampollas de Neisseria/meningocócicas L2 y L3) y/o formulando lapreparación de ampolla con un excipiente farmacéuticamente aceptable para preparar una composición de vacuna.

La conjugación intra-ampolla debe incorporar preferiblemente 1, 2 o las 3 siguientes etapas del procedimiento: el pHde conjugación debe ser mayor de pH 7,0, preferiblemente mayor de o igual a pH 7,5 (más preferiblemente inferior apH 9); las condiciones de sacarosa al 1-5 %, preferiblemente al 2-4 %, más preferiblemente aproximadamente al 3 %se deben mantener durante la reacción; el NaCl se debe minimizar en la reacción de conjugación, preferiblementepor debajo de 0,1 M, 0,15 M, 0,01 M, 0,005 M, 0,001 M y más preferiblemente, no estar presente en absoluto. Todasestas características del procedimiento garantizan que las ampollas permanezcan estables y en solución a lo largodel procedimiento de conjugación.

El procedimiento de conjugación con EDAC/NHS es un procedimiento preferido para la conjugación intra-ampolla.Se prefiere EDAC/NHS frente a formaldehído que puede reticular en un grado demasiado elevado afectando portanto de forma adversa a la capacidad de filtración. La EDAC reacciona con ácidos carboxílicos (tales como KDO enLOS) para crear un intermedio de éster activo. En presencia de un nucleófilo amina (tal como lisinas en proteínas demembrana externa tales como PorB), se forma un enlace amida con liberación de un producto secundario de isourea. Sin embargo, la eficacia de una reacción mediada por EDAC se puede aumentar mediante la formación deun intermedio de éster de Sulfo-NHS. El éster de Sulfo-NHS sobrevive en solución acuosa más tiempo que el ésteractivo formado por la reacción de EDAC en solitario con un carboxilato. Por tanto, se pueden realizar rendimientos mayores de formación de enlace amida usando este procedimiento de dos etapas. La conjugación con EDAC/NHSse analiza en J. V. Staros, R. W. Wright y D. M. Swingle. Enhancement by N-hydroxysuccinimide of water-solublecarbodiimide-mediated coupling reactions. Analytical chemistry 156: 220-222 (1986); y Bioconjugates Techniques.Greg T. Hermanson (1996) págs. 173-176. Preferiblemente, se usa 0,01-5 mg de EDAC /mg de ampolla en la reacción, más preferiblemente, 0,05-1 mg de EDAC/mg de ampolla. La cantidad de EDAC usada depende de lacantidad de LOS presente en la muestra que, a su vez, depende del % de desoxicolato (DOC) usado para extraerlas ampollas. Con un bajo porcentaje de DOC (por ejemplo, del 0,1 %), se usan grandes cantidades de EDAC (1mg/mg y más allá), sin embargo, con un mayor % de DOC (por ejemplo, de 0,5 %), se usan menores cantidades deEDAC (0,025-0,1 mg/mg) para evitar demasiada reticulación inter-ampolla.

Un procedimiento preferido de la invención, por lo tanto, es un procedimiento para producir LOS (preferiblementemeningocócico) conjugado intra-ampolla que comprende las etapas de conjugar ampollas en presencia deEDAC/NHS a un pH entre pH 7,0 y pH 9,0 (preferiblemente aproximadamente pH 7,5), en sacarosa al 1-5 %(preferiblemente aproximadamente al 3 %) y, opcionalmente, en condiciones sustancialmente desprovistas de NaCl(como se ha descrito anteriormente) y aislar las ampollas conjugadas de la mezcla de reacción.

La reacción se puede seguir en geles de separación de Western de la mezcla de reacción usando mAb anti-LOS(por ejemplo, anti-L2 o anti-L3) para mostrar el aumento del peso molecular de LOS para una mayor proporción delos LOS en las ampollas cuando el tiempo de reacción avanza.

Se pueden recuperar producciones del 99 % de las ampollas usando tales técnicas.

Se observó que EDAC es un excelente agente de reticulación intra-ampolla porque reticuló los LOS a OMP de formasuficiente para una inmunogenicidad dependiente de T de LOS mejorada, pero no reticuló los mismos hasta ungrado tan elevado que tuvieran lugar problemas tales como mala capacidad de filtración, agregación y reticulacióninter-ampolla. La morfología de las ampollas generadas es similar a la de ampollas no conjugadas (mediantemicroscopio electrónico). Además, el anterior protocolo evitó que tuviera lugar una reticulación demasiado elevada(que puede disminuir la inmunogenicidad de las OMP protectoras presentes de forma natural sobre la superficie dela ampolla, por ejemplo, TbpA o Hsf).

Técnicas para aislar ampollas

Se pueden aislar Vesículas de Membrana Externa (OMV o ampollas) mediante muchas técnicas conocidas (Fredriksen y col, NIPH Annals (1991), 14, 67-79; Zollinger y col, J. Clin Invest (1979), 63, 836-848; Saunders y col,Infect Immun (1999), 67, 113-119; J. J. Drabick y col, Vaccine (1999), 18, 160-172). Éstas se dividen en 2 gruposprincipales -técnicas que usan desoxicolato (aproximadamente el 0,5 %) para extraer ampollas de meningococo y técnicas que usan bajos niveles de desoxicolato (DOC) o nada de desoxicolato en absoluto. Las ampollas delprocedimiento sin DOC tienen la característica interesante de mantener un alto nivel de LOS en la OMV -lo que esventajoso en una vacuna en la que LOS es un antígeno protector. En comparación con ampollas extraídas con DOC,la concentración de Ag L3 en OMV obtenidas por un procedimiento sin DOC es aproximadamente diez vecessuperior. Se prefiere un procedimiento sin detergente (preferiblemente sin DOC) para preparar ampollas para losfines de los procedimientos de esta invención por este motivo, aunque la extracción con un tampón que contienebajos niveles de detergente (preferiblemente DOC) también puede ser ventajosa porque la etapa dejaría la mayorparte del LOS de interacción estrecha en la ampolla mientras que eliminaría cualquier LOS retenido de forma sueltamás tóxico. Normalmente se usa detergente (preferiblemente DOC) al 0-0,5 % y preferiblemente al 0,02-0,4 %, 0,043 % o al 0,06-2 % para la extracción de ampolla, más preferiblemente al 0,08-0,15 % y mucho más preferiblementeaproximada o exactamente al 0,1 % para obtener una cantidad óptima de LOS a estar presente de forma estable enlas ampollas. Los procedimientos de extracción sin DOC (o bajo % de DOC -DOC al 0,3 % o inferior) se prefierenparticularmente cuando el LOS se ha destoxificado mediante uno o más de los procedimientos que se han detalladoanteriormente.

Se prefiere que el contenido de LOS de las ampollas en todas las realizaciones sea un contenido del LOS de 3-30,5-25, 10-25, 15-22 y mucho más preferiblemente aproximada o exactamente del 20 % cuando se mide por tinción con plata después de electroforesis en SDS-PAGE usando el LOS purificado como un patrón (véase el procedimiento de Tsai, J. Biol. Standardization (1986) 14: 25-33). Usando LOS L3 de Nmen como un patrón en esteprocedimiento, en general, el contenido de LOS en ampollas de inmunotipo L3 de Nmen extraído con DOC al 0,1 %es aproximadamente LOS al 20 %, con DOC al 0,2 % es aproximadamente LOS al 15 %, con DOC al 0,3 % esaproximadamente LOS al 10 % y con DOC al 0,5 % es aproximadamente LOS al 5 %.

La producción de ampollas se puede realizar usando cualquier técnica apropiada para separar ampollas de células orestos celulares (por ejemplo, mediante centrifugación a baja velocidad). Las preparaciones de ampolla se puedenpurificar adicionalmente mediante el uso de ultracentrifugación (granulando las ampollas) o con técnicas más cuidadosas de ultrafiltración y/o diafiltración como se describe por Frasch y col. "Outer membrane protein vesiclevaccines for meningococcal disease" en Methods in Molecular Medicine, vol 66, Meningococcal Vaccines: Methodsand Protocols 2001 págs. 81 -107 (Editado por A. J. Pollard y M. C. Maiden, Humana Press Totowa, NJ).

Composiciones de Vacuna

Las composiciones inmunogénicas de la invención se pueden formular de forma sencilla como composiciones devacuna añadiendo un excipiente farmacéuticamente aceptable.

Se proporciona adicionalmente un procedimiento para preparar las composiciones inmunogénicas o vacunas deNeisseria (preferiblemente meningocócicas) de la invención que comprende las etapas de aislar LOS purificado de lainvención (preferiblemente L2 o L3) como se ha descrito anteriormente o producir ampollas aisladas de la invención(preferiblemente con un inmunotipo L2 o L3) como se ha descrito anteriormente y formular el LOS o las ampollas conun excipiente farmacéuticamente aceptable. Preferiblemente, los LOS purificados de inmunotipo tanto L2 como L3de la invención o las ampollas de inmunotipo tanto L2 como L3 de la invención o un LOS purificado de L2 y unaampolla de L3 (o viceversa) se combinan en una etapa de mezcla. Preferiblemente, el LOS purificado o la ampollade la invención se ha conjugado como se ha descrito anteriormente después del aislamiento. También se puedeañadir una etapa adicional de formulación en liposoma para el LOS purificado (usando técnicas conocidas en latécnica -véase, por ejemplo, el documento WO 96/40063 y las referencias citadas en ese documento).Preferiblemente, las preparaciones de ampolla se aíslan por extracción con bajas concentraciones de (o sin) DOC(como se ha descrito anteriormente).

Tales procedimientos de combinación de L2 y L3 pueden producir una vacuna que es eficaz contra casi todas las cepas de meningococo B.

Las anteriores composiciones inmunogénicas (o procedimientos) pueden tener añadidos uno o más (2, 3 ó 4)polisacáridos u oligosacáridos meningocócicos (sencillos o conjugados con un vehículo que comprende epítopes decélulas T, como se ha descrito anteriormente) de los serogrupos A, C, Y o W a la composición. Preferiblemente seañade al menos C (más preferiblemente se conjuga) y, más preferiblemente, A y C o Y y C (preferiblemente todosconjugados) y mucho más preferiblemente A, C, Y y W (preferiblemente todos conjugados). Ventajosamente, también se incluye un polisacárido u oligosacárido capsular de H. influenzae B conjugado en las anteriores composiciones para generar una vacuna universal contra meningitis.

Las composiciones que están constituidas por o que comprenden composiciones individualizadas específicamenteen el documento WO 94/08021 no se reivindican en la presente invención. Las composiciones que están constituidas por o que comprenden composiciones individualizadas específicamente en el documento US2006/0047106 no se reivindican en la presente invención.

Formulaciones de Vacuna de la Invención

Las composiciones inmunogénicas de la invención se pueden formular con un adyuvante adecuado para generarcomposiciones de vacuna de la invención.

Los adyuvantes adecuados incluyen una sal de aluminio tal como gel de hidróxido de aluminio (alúmina) o fosfato dealuminio (preferiblemente hidróxido de aluminio), pero también pueden ser una sal de calcio (particularmentecarbonato cálcico), hierro o cinc o pueden ser una suspensión insoluble de tirosina acilada o azúcares acilados,polisacáridos derivatizados catiónica o aniónicamente o polifosfacenos.

Los sistemas de adyuvante Th1 adecuados que se pueden añadir incluyen Monofosforil lípido A, particularmentemonofosforil lípido A 3-des-O-acilado (u otro derivado no tóxico de LPS) y una combinación de monofosforil lípido A,preferiblemente monofosforil lípido A 3-des-O-acilado (3D-MPL) [o derivados de LPS no tóxico] junto con una sal dealuminio (preferiblemente fosfato de aluminio). Un sistema mejorado implica la combinación de un monofosforil lípidoA y un derivado de saponina, particularmente la combinación de QS21 [u otra saponina] y 3D-MPL [o derivado de LPS no tóxico] como se describe en el documento WO 94/00153 o una composición menos reactogénica en la que QS21 [o saponina] se inactiva con colesterol como se describe en el documento WO 96/33739. Una formulación deadyuvante particularmente potente que implica QS21, 3D-MPL y tocoferol en una emulsión de aceite en agua sedescribe en el documento WO 95/17210 y es una formulación preferida que se puede añadir. Otros adyuvantes que se pueden añadir comprenden una saponina, más preferiblemente QS21 y/o una emulsión de aceite en agua y tocoferol. También se pueden añadir CpG no metilados que contienen oligonucleótidos (documento WO 96/02555).

La preparación de vacunas se describe de forma general en Vaccine Design ("The subunit and adjuvant approach"(eds Powell M. F. & Newman M. J.) (1995) Plenum Press New York).

Se puede administrar una dosis inmunoprotectora de vacunas por la vía sistémica o a través de la mucosa. Estasadministraciones pueden incluir inyección a través de las vías intramuscular, intraperitoneal, intradérmica osubcutánea; o administración a través de la mucosa a los tractos oral/alimentario (preferiblemente administración

intranasal), respiratorio, genitourinario. Normalmente, la cantidad de ampolla en cada dosis de vacuna se selecciona como una cantidad que induce una respuesta inmunoprotectora sin efectos secundarios adversos significativos envacunados típicos. Tal cantidad variará dependiendo de qué inmunógeno específico se emplea y cómo se presenta.Generalmente, se espera que cada dosis comprenderá 1-100 !g de cada ampolla o LOS de la invención, preferiblemente 5-50 !g y, más normalmente, en el intervalo de 5-25 pg.

Mejoras adicionales a las composiciones inmunogénicas de ampolla de la invención

Las anteriores composiciones de ampolla de la invención se pueden mejorar adicionalmente en cuanto a la eficaciaen vacunas de la invención si la cepa de Neisseria de la que se obtienen (incluyendo gonococo y, preferiblemente,meningococo, más preferiblemente N. meningitidis B) tiene uno o más de los siguientes genes (que codificanantígenos protectores) regulados positivamente insertando copias adicionales del gen en el genoma o introduciendoun promotor más fuerte cadena arriba del gen existente o cualquiera de los demás modos analizados en el documento WO 01/09350 que sean capaces de inducir cepas modificadas para aumentar 1,2, 1,5, 2, 3, 5 ó 10 vecesel nivel de antígeno en comparación con la cepa no modificada: NspA (documento WO 96/29412), Hsf o truncamientos del mismo (documentos WO 99/31132 y WO 01/55182; también conocido como NhhA), Hap(documento PCT/EP99/02766), OMP85 (documento WO 00/23595), PilQ (documento PCT/EP99/03603), PldA(documento PCT/EP99/06718), FrpB (documento WO 96/31618), TbpA (documentos WO92/03467, US5912336,WO93/06861 y EP586266), TbpB (documentos WO93/06861 y EP586266), NadA (Comanducci y col J. Exp. Med.2002 195; 1445-1454; NMB 1994), FrpA/FrpC o porciones en común entre estos antígenos que implican 5 o másrepeticiones de secuencias (documento WO 92/01460; Thompson y col., (1993) J. Bacteriol. 175: 811-818;Thompson y col., (1993) Infect. Immun. 61: 2906-2911), LbpA, LbpB (documento PCT/EP98/05117), FhaB(documento WO98/02547 SEC ID Nº: 38 [nucleótidos 3083-9025]), HasR (documento PCT/EP99/05989), Iipo02 (documento PCT/EP99/08315), Tbp2 (documento WO 99/57280; NMB 0460), MltA (documento WO 99/57280; NMB0033), TspA (documento WO 00/03003), TspB (documento WO 00/03003), ctrA (documento PCT/EP00/00135),MafA (NMB 0652), MafB (NMB0643), Omp26 (NMB 0181), Adesina X (NMB 0315), Adesina Y (NMB 0995), AdesinaZ (NMB 1119) y OstA (NMB 0280). Los ejemplos de secuencias NMB se pueden encontrar en la base de datos enwww.neisseria.org. Cuando en el presente documento se menciona Hsf, el término puede ser sustituible en cadacaso por truncamientos de Hsf -en particular los descritos en el documento WO 01/55182.

Se prefiere particularmente si tanto Hsf como TbpA (formas de peso molecular Bajo o Alto o tanto Bajo como Alto[documento EP 586266]) o Hsf y OMP85, u OMP85 y TbpA (formas de peso molecular Bajo o Alto o tanto Bajo comoAlto) o NspA y Hsf, o NspA y OMP85 o NspA y TbpA (formas de peso molecular Bajo o Alto o tanto Bajo como Alto)estén los dos regulados positivamente. Cuando están comprendidas 2 ampollas en la composición, se prefiere quecada ampolla tenga regulaciones positivas diferentes. Si TbpA tanto Alto como Bajo se tienen que regularpositivamente, es preferible que los mismos se regulen positivamente en 2 ampollas separadas presentes en lacomposición obtenidas de 2 cepas que comprenden de forma natural las 2 formas de TbpA. Mucho máspreferiblemente, las 2 cepas tienen inmunotipos LOS L2 y L3. El TbpA puede estar regulado positivamentegenéticamente o mediante cultivo de las cepas de producción de neisseria/meningocócicas en condiciones conlimitación de hierro, por ejemplo, en presencia de Desferal 50-70 !M (mesilato de desferoxamina, disponible enSigma). Si se adopta la última estrategia, se prefiere que la expresión del gen FrpB esté regulada negativamente(preferiblemente delecionada) ya que este antígeno variable puede convertirse en inmunodominante en ampollasaisladas de cepas meningocócicas aisladas en condiciones con limitación de hierro.

Preferiblemente, la composición descrita comprende una ampolla L3 de una cepa msbB- de polisacárido capsular IgtB-(o 1st-) preferiblemente regulada positivamente en TbpA Alto y Hsf y una ampolla L2 de una cepa msbB-de polisacárido capsular IgtB-(o 1 st-) preferiblemente regulada positivamente en TbpA Bajo y Omp85. Máspreferiblemente, ambas ampollas están reguladas adicionalmente negativamente en expresión de PorA y/o FrpB y,opcionalmente, expresión de OpC y/o OpA. Las ampollas se aíslan más preferiblemente por un procedimiento debajo contenido de DOC como se ha descrito anteriormente y el LOS en ambas ampollas se reticula intra-ampolla conla proteína de membrana externa.

Vacunas de células fantasma o completas inactivadas

Los inventores consideran que las anteriores composiciones y vacunas que se refieren a ampollas se pueden extender de forma sencilla a procedimientos que hacen referencia a preparaciones y vacunas de células fantasma ocompletas inactivadas (con ventajas idénticas). Los procedimientos para preparar preparaciones fantasma (célulasvacías con envueltas intactas) a partir de cepas Gram-negativas se conocen bien en la técnica (véase, por ejemplo,el documento WO 92/01791). Los procedimientos para inactivar células completas para preparar preparaciones decélulas inactivadas para uso en vacunas también se conocen bien. Por lo tanto, las composiciones y vacunas queimplican ampollas que se describen a lo largo de el presente documento se considera que son aplicables a lasmismas composiciones o vacunas que comprenden preparaciones de células fantasma y completas inactivadasequivalentes de la invención.

Ensayos bactericidas de suero en las composiciones de la invención

El ensayo bactericida de suero es el procedimiento preferido para evaluar las relaciones sinérgicas entre antígenoscuando se combinan en una composición inmunogénica de la invención.

Tal respuesta sinérgica se puede caracterizar por el SBA provocado por la combinación de antígenos que es almenos el 50 %, dos veces, tres veces, preferiblemente cuatro veces, cinco veces, seis veces, siete veces, ochoveces, nueve veces y mucho más preferiblemente diez veces superior que el SBA provocado por cada antígeno porseparado. Preferiblemente, el SBA se mide frente a una cepa homóloga de la que se obtienen los antígenos y preferiblemente también frente a un panel de cepas heterólogas. (Véase a continuación para un panelrepresentativo, por ejemplo, BZ10 (B:2b:P1.2) que pertenece al agrupamiento A-4; B16B6 (B:2a: P1.2) quepertenece al complejo ET-37; y H44/76 (B:15:P1.7,16)). El SBA es el marcador inmunológico más comúnmente

convenido para estimar la eficacia de una vacuna meningocócica (Perkins y col. J Infect Dis. 1998, 177: 683-691).Se puede evaluar un SBA satisfactorio mediante cualquier procedimiento conocido. Se puede realizar el SBA usando sueros obtenidos de modelos animales o de sujetos humanos.

Un procedimiento preferido para realizar SBA con sueros humanos es el siguiente. Se toma una muestra de sangreantes de la primera vacunación, dos meses después de la segunda vacunación y un mes después de la terceravacunación (siendo tres vacunaciones en un año un programa de vacunación primario humano típico administrado,por ejemplo, a los 0, 2 y 4 meses o 0, 1 y 6 meses). Tales programas de vacunación primaria humana se pueden realizar en niños menores de 1 año de edad (por ejemplo, al mismo tiempo que vacunaciones de Hib) o niños de 2-4años de edad o adolescentes también se pueden vacunar para ensayar SBA con tal programa de vacunaciónprimaria. Se puede tomar una muestra de sangre adicional de 6 a 12 meses después de la vacunación primaria y unmes después de una dosis de refuerzo, si es aplicable.

El SBA será satisfactorio para una preparación de antígeno o de ampolla con actividad bactericida homóloga si unmes después de la tercera dosis de vacuna (del programa de vacunación primario) (en niños de 2-4 años de edad oadolescentes, pero preferiblemente en niños en el primer año de vida), el porcentaje de sujetos con un aumento decuatro veces en términos de títulos de SBA (dilución de anticuerpo) (en comparación con título pre-vacunación)frente a la cepa de meningococo de la cual se obtuvieron los antígenos de la invención es mayor del 30 %,preferiblemente mayor del 40 %, más preferiblemente mayor del 50 % y mucho más preferiblemente mayor del 60 %de los sujetos.

Por supuesto, una preparación de antígeno o de ampolla con actividad bactericida heteróloga también puedeconstituir una preparación de ampolla con actividad bactericida homóloga si también puede provocar SBA satisfactorio frente a la cepa meningocócica de la que se obtiene.

El SBA será satisfactorio para una preparación de antígeno o de ampolla con actividad bactericida heteróloga si unmes después de la tercera dosis de vacuna (del programa de vacunación primaria) (en niños de 2-4 años de edad oadolescentes, pero preferiblemente en niños en el primer año de vida), el porcentaje de sujetos con un aumento decuatro veces en términos de título de SBA (dilución de anticuerpo) (en comparación con el título pre-vacunación)frente a tres cepas heterólogas de meningococo es mayor del 20 %, preferiblemente mayor del 30 %, máspreferiblemente mayor del 35 % y mucho más preferiblemente mayor del 40 % de los sujetos. Tal ensayo es unabuena indicación de si la preparación de antígeno o de ampolla con actividad bactericida heteróloga puede induciranticuerpos bactericidas cruzados frente a diversas cepas meningocócicas. Las tres cepas heterólogas deben tenerpreferiblemente un patrón de complejo de tipo electroforético (ET) o tipado de secuencia multilocus (MLST) diferente (véase Maiden y col. PNAS USA 1998, 95: 3140-5) entre sí y preferiblemente con la cepa a partir de la cual seprepara o se obtiene la preparación de antígeno o de ampolla con actividad bactericida heteróloga. Un experto en lamateria será capaz de forma sencilla de determinar tres cepas con un diferente complejo de ET que reflejan ladiversidad genética observada entre meningococos, particularmente entre cepas de meningococos de tipo B que se reconocen como la causa de una carga de enfermedad significativa y/o que representan linajes hipervirulentos deMenB reconocidos (véase Maiden y col. anteriormente). Por ejemplo, las tres cepas que se podrían usar son lassiguientes: BZ10 (B:2b:P1.2) que pertenece al agrupamiento A-4; B16B6 (B:2a:P1.2) que pertenece al complejo ET37; y H44/76 (B:15:P1.7,16), que pertenece al complejo ET-5 o cualquier otra cepa que pertenece al mismo ET/Agrupamiento. Tales cepas se pueden usar para ensayar una preparación de antígeno o de ampolla con actividad bactericida heteróloga preparado u obtenida, por ejemplo, de la cepa meningocócica CU385 (B:4:P1.15)que pertenece al complejo ET-5. Otra cepa de muestra que se podría usar es del clon epidémico de Linaje 3 (por ejemplo, NZ124 [B:4:P1.7,4]). Otra cepa ET-37 es NGP165 (B: 2a:P1.2).

En la técnica se conocen procedimientos para medir la actividad de SBA. Por ejemplo, se describe un procedimientoque se podría usar en el documento WO 99/09176 en el Ejemplo 10C. En términos generales, un cultivo de la cepa aensayar se cultiva (preferiblemente en condiciones de agotamiento de hierro -mediante adición de un quelante dehierro tal como EDDA al medio de cultivo) en la fase logarítmica de crecimiento. Esto se puede suspender en unmedio con BSA (tal como medio de Hanks con BSA al 0,3 %) para obtener una suspensión celular de trabajo ajustaa aproximadamente 20000 UFC/ml. Se puede realizar una serie de mezclas de reacción mezclando una serie dediluciones de factor dos de sueros a ensayar (preferiblemente inactivados por calor a 56 ºC durante 30 min) [porejemplo, en un volumen de 50 !l/pocillo] y los 20000 UFC/ml de cepa meningocócica de suspensión a ensayar [por ejemplo, en un volumen de 25 !l/pocillo]. Los viales de reacción se deben incubar (por ejemplo, a 37 ºC durante 15minutos) y agitar (por ejemplo, a 210 rpm). La mezcla de reacción final [por ejemplo, en un volumen de 100 !l]contiene adicionalmente una fuente de complemento [tal como el 25 % de volumen final de suero de cría de conejopreensayado o suero humano para serología humana] y se incuba como anteriormente [por ejemplo, a 37 ºC durante60 min]. Se puede usar una placa de microtitulación de 96 pocillos de fondo en U de poliestireno estéril para este ensayo. Se puede tomar una alícuota [por ejemplo, 10 !l] de cada pocillo usando una pipeta multicanal y descargaren placas agar Mueller-Hinton (que contienen preferiblemente Isovitalex al 1 % y Suero de Caballo inactivado porcalor al 1 %) e incubar (por ejemplo, durante 18 horas a 37 ºC en CO2 al 5 %). Preferiblemente, se pueden recontarcolonias individuales hasta 80 UFC por alícuota. Se pueden usar las siguientes tres muestras de ensayo comocontroles: tampón + bacteria + complemento; tampón + bacteria + complemento inactivado; suero + bacteria +complemento inactivado. Se pueden calcular los títulos de SBA directamente usando un programa que procesa losdatos para dar una medición de la dilución que se corresponde al 50 % de la inactivación celular por un cálculo deregresión.

EJEMPLOS

Los siguientes ejemplos se realizan usando técnicas convencionales, que se conocen bien y son rutinarias para losexpertos en la materia, excepto cuando se describe con detalle de otro modo. Los ejemplos son ilustrativos, pero nolimitan la invención.

Ejemplo 1:

Los ejemplos que describen deleciones de genes que codifican proteínas implicadas en la producción depolisacárido capsular de meningococo (por ejemplo, MenB), la deleción del gen PorA, la regulación positiva dediversas proteínas de membrana externa protectoras sobre la superficie de ampollas meningocócicas, la regulaciónnegativa de proteínas inmunodominantes o enzimas biosintéticas (tales como mutaciones siaD(-)) y procedimientospara aislar ampollas se describen en el documento WO 01/09350. Se proporciona información adicional en losdocumentos WO 2004/014417 y WO 2004/014418. Obsérvese que las referencias a la secuencia de gen NMB y NMA en el presente documento se refieren a los números de referencia para secuencias a las que se puede accederpor www.neisseria.org. Se muestra un esquema que muestra las estructuras convencionales de los inmunotipos deLOS en la Figura 1 (de Kahler y col. 2005 Glycobiology 15: 409-419/2006 JBC 281: 19939-19948). Véase también laFigura 2B.

Ejemplo 2: O-acetilación de LOS de núcleo interno - impacto potencial sobre títulos bactericidas

Sumario

•

El análisis de EM-EM ha mostrado que la N-acetil-glucosamina (GlcNAc) del LOS de núcleo interno de la cepa NZ124 (L3) está O-acetilada. Esto no es el caso para las cepas H44/76 y M687 así como para lascepas de vacuna L3 IgtB(-) y L3 Ist(-) (B1854= TrL3 y B 1948= L7, respectivamente) obtenidas de la cepaH44/76.

•

La cepa NZ124 no es más resistente a la inactivación por complemento mediada por anticuerpo que lascepas H44/76 y M687

•

La accesibilidad de los epítopes de superficie de poca exposición a anticuerpos bactericidas parece ser similar para las cepas NZ124 y H44/76.

•

En cinco modelos animales que usan cuatro especies animales, y cualquiera que sea la formulación usada,los sueros de ampollas anti-TrL3 y anti-L7 fueron menos eficaces al mediar la inactivación de la cepa NZ124en comparación con las cepas H44/76 y M687

•

Estos resultados sugieren que la acetilación de la GlcNAc del LOS de núcleo interno podría reducir la eficaciade la inactivación mediada por anticuerpos anti-"LOS no acetilado".

Introducción

Basándose en análisis EM/EM, se describen dos estructuras diferentes del LOS L3 de Neisseria meningitidis. Estas dos estructuras se diferencian por la presencia o no de un grupo acetilo en la GlcNAc del núcleo interno (Figura 2A).En la bibliografía, la estructura L3 se describe sin este grupo acetilo adicional.

La GlcNAc del LOS de núcleo interno de ampollas TrL3 y L7 no está acetilada. Esto también es el caso para lascepas de tipo silvestre H44/76 y M97250687 (M687). Por el contrario, la cepa WT NZ124 posee una GlcNAcacetilada. Estas tres cepas de N. meningitidis serogrupo B de WT se inmunotipan como L3. NZ124 es una cepaepidémica de Nueva Zelanda aislada en 1998 y disponible en el New Zealand Institute of Environmental Science and Research, Wellington, Nueva Zelanda.

Los sueros de ratones inmunizados con ampollas TrL3 o L7 contienen altos niveles de anticuerpos bactericidascontra las cepas H44/76 y M687. Sin embargo, estos sueros son menos eficaces contra la cepa NZ124. De hecho, los títulos bactericidas medidos con ampollas anti-L7/TrL3 en la cepa NZ124 son 3-20 veces menores que los títulosmedidos en las cepas H44/76 y M687.

Al menos tres hipótesis podrían explicar los menores títulos de anticuerpo bactericida medidos frente a la cepaNZ124:

•

esta cepa podría ser de forma intrínseca más resistente a la inactivación mediada por anticuerpos ycomplemento que las cepas H44/76 y M687;

•

en esta cepa, los epítopes de LOS podrían ser menos accesibles a los anticuerpos bactericidas;

•

la acetilación del LOS de núcleo interno podría afectar negativamente a la eficacia de la inactivación mediada por anticuerpos anti-LOS "no acetilados".

Resultados

¿Es la cepa NZ124 más resistente a la inactivación mediada por anticuerpos?

Para contestar a esta cuestión, se han analizado en SBA los sueros de ratones inmunizados con diferentes vacunas de ampollas PorA+. Los antisueros se han ensayado en SBA frente a cepas de PorA homólogas y heterólogas. Losresultados presentados en la Tabla 1 son de dos experimentos.

La inmunización de ratones con ampollas P1.7,16 indujo la producción de anticuerpos bactericidas que eran capacesde mediar en la inactivación de la cepa P1.7,16 de PorA homóloga (título de 1/2300 en H44/76) pero ninguna cepa de PorA heteróloga (M687 y NZ124). Se hizo una observación similar con la vacuna P1.19,15 que solamente fuecapaz de inducir una respuesta bactericida protectora frente a la cepa PorA homóloga (título de 1/900 en M687). Losratones inmunizados con una vacuna que contenía el PorA P1.7,4 tenían niveles altos de anticuerpos bactericidasfrente a la cepa NZ124 (título de 1/6200) pero no frente a la cepa H44/76.

Tabla 1: Impacto de inmunización con diferentes ampollas PorA+ sobre la inducción de anticuerpos bactericidas frente a un panel de cepas MenB que expresan diferentes PorA (GMT para inactivación del 50 %).

Cepas ensayadas en SBA

Cepa o cepas de vacuna

H44/76 (P1.7,16)

CU385 (P1.19,15) CU385-NZ228/98 (P1.19,15 +P1.7,4)

H44/76(P1.7, 16)

2300 < 100 < 100

M687(P1.19,15)

<100 900 3800

NZ124(P1.7,4)

NT < 100 6200

En estos experimentos, se midieron los mayores títulos de anticuerpo bactericida frente a la cepa NZ124, sugiriendo 5 que esta cepa no es más resistente a la inactivación mediada por anticuerpos y complemento que las cepas H44/76 y M687.

¿Son los epítopes de LOS de la cepa NZ124 bien accesibles a anticuerpos?

Se ha sugerido previamente que el tamaño de la cápsula puede limitar la accesibilidad de anticuerpos a los epítopesde superficie NspA especialmente debido a que los bucles de NspA son relativamente pequeños en comparación,

10 por ejemplo, con los bucles VR1 y VR2 de PorA. De hecho, se estableció una relación entre el tamaño de la cápsula y la capacidad de los sueros anti-NspA de inducir la inactivación mediada por complemento (Moe y col, 1999 l&l 67:5664-75).

Debido a que el LOS de N. meningitidis posee una cadena sacarídica corta, la accesibilidad a sus epítopesprotectores por anticuerpos se podría alterar por el grosor de la cápsula. Para determinar si tal mecanismo podría

15 explicar los menores títulos bactericidas medidos con anticuerpos anti-LOS en la cepa NZ124, se realizaron ensayos bactericidas con un MAb anti-NspA (MAb Me-7) en tres cepas de MenB diferentes incluyendo NZ124.

En presencia de complemento, las cepas H44/76 y NZ124 se inactivaron de forma sencilla por el MAb Me-7 como sedemuestra por los títulos bactericidas superiores a 1/2560. Por el contrario, la cepa M687 era más resistente a la inactivación mediada por el MAb anti-NspA; se midió un título de solamente 1/347.

20 En conclusión, la accesibilidad de los epítopes de NspA protectores es similar para las cepas H44/76 y NZ124. Por lo tanto, se puede postular que la menor eficacia de anticuerpos anti-ampollas Trl3 en la mediación de la inactivaciónde la cepa NZ124 no se debe a una menor accesibilidad de los epítopes de LOS protectores.

¿Reduce la acetilación de la GlcNAc de LOS de núcleo interno la eficacia de anticuerpos bactericidas anti-LOS "no acetilados"?

25 Se inmunizaron ratones, conejos, cobayas, crías de rata y ratas adultas con ampollas KO porA. La mayoría de los experimentos se realizó con ampollas obtenidas de cepas que producen LOS de lípido A penta-acilado (mutación msbB, ampollas de B1853, B1854 y B1948) pero también se realizaron unos pocos experimentos con ampollas quecontenían LOS hexa-acilados (ampollas B1820). Se ensayaron diferentes formulaciones usando sales de aluminio(AI(OH)3 o AIPO4) o no (formulaciones no adsorbidas) y CpG. Los sueros anti-ampollas se ensayaron en SBA

30 usando complemento de cría de conejo frente a las cepas H44/76, M687 y NZ124.

Los títulos bactericidas medidos con sueros de animales inmunizados con ampollas TrL3 B1820 se muestran en laTabla 2. Cualquiera que fuese la especie animal, los títulos bactericidas obtenidos con la cepa NZ124 son menoresque los títulos bactericidas obtenidos con las cepas H44/76 y M687.

Tabla 2: Impacto de la inmunización de ratones, cobayas y conejos con ampollas B1820 sobre la inducción de35 anticuerpos bactericidas contra tres cepas de MenB (GMT para inactivación del 50 %)

Ratones

Cobayas Conejos

Formulación

H44/76 M687 NZ124 H44/76 M687 NZ124 H44/76 M687 NZ124

AI(OH)3

300 300 100 40 20 <10 300 300 20

AIPO4

3000 5000 800 NT NT NT NT NT NT

La inmunización con ampollas TrL3 KO msbB (B1853 o B1854) o ampollas L7 KO msbB (B1948) también inducemayores títulos bactericidas de suero contra las cepas H44/76 y M687 que contra la cepa NZ124. Esto se observa40 en los cinco modelos animales diferentes ensayados: ratones, crías de rata y ratas adultas (Tabla 3a), cobayas y conejos (Tabla 3b) y cualquiera que sea la formulación usada.

En conclusión, la inmunización de animales con ampollas que contienen "LOS no acetilado" provocó una respuestade anticuerpos bactericidas menor contra la "cepa acetilada" (NZ124) que contra las "cepas no acetiladas" (H44/76 y M687).

Tabla 3a : Impacto de la inmunización de ratones, crías de rata y ratas adultas con ampollas deTrL3 penta-acetiladas(B1853 o B1854) y L7 (B1948) sobre la inducción de anticuerpos bactericidas contra tres cepas de MenB (GMT para inactivación del 50 %)

Formulació n

Ampollas H44 Ratones M687 NZ124 Crías de rata H44 M687 NZ124 Ratas H44 M687 NZ124

No-ads

B1853/54 B1948 3000 2600 1700 250 2900 100 260 2000 <20 710 230 40 450 5800 400 2500 <20 <20

AI(OH)3

B1853/54 B1948 2000 1600 1200 280 940 140 30 60 10320 480 10

CpG

B1853/54 B1948 640 770 203300 120 60

Tabla 3b : Impacto de la inmunización de cobayas y conejos con ampollas de TrL3 penta-acetilado (B1853 o B1854)y L7 (B1948) sobre la inducción de anticuerpos bactericidas contra tres cepas de MenB (GMT para inactivación del10 50 %)

Formulación

Ampollas Cobayas H44/76 M687 NZ 124 Conejos H44/76 M687 NZ 124

No-ads

B1853/54 B1948 300 2200 <20 1000 500 30

AI(OH)3

B1853/54 400 400 30

Discusiones, conclusiones y perspectivas

La inmunización de ratones con ampollas TrL3 o L7 provocó un alto nivel de anticuerpos bactericidas que median enla inactivación de las cepas H44/76 y M687. Estos anticuerpos eran menos bactericidas contra la cepa NZ124 ya

15 que los títulos de SBA medidos con sueros de ratón eran de 3 a 20 veces menores frente a la cepa NZ124 que frente a la cepa H44/76 y M687.

Los datos preclínicos sugieren que la cepa NZ124 no es más resistente a la inactivación mediada por complementode anticuerpos que las cepas H44/76 y M687. Además, existen pruebas que sugieren que los epítopes protectorespoco expuestos a superficie de NZ124 no son menos accesibles a anticuerpos que epítopes similares sobre la

20 superficie de la cepa H44/76. Se podrían realizar análisis de microscopía electrónica y/o citometría de flujo para confirmar este hallazgo.

Una diferencia entre los LOS de la cepa NZ124 y los LOS de las cepas H44/76 y M687 es la acetilación de laGlcNAc de núcleo interno que se observa solamente en LOS de NZ124. Esta diferencia podría explicar la menoreficacia de sueros de ampollas anti-TrL3 y anti-L7 en la mediación de la inactivación de la cepa NZ124 en

25 comparación con las cepas H44/76 y M687. De hecho, se conoce que la acetilación de epítopes sacarídicos protectores puede influir positiva o negativamente en el reconocimiento de tales epítopes por anticuerpos. Sinembargo, el impacto de acetilación/no acetilación sobre la inmunogenicidad/antigenicidad de epítopes protectoresdescritos en una especie animal no se observa siempre en otra especie animal y en seres humanos.

El impacto de la acetilación en epítopes sacarídicos sobre su inmunogenicidad varía de acuerdo con la "especie

30 animal", pero también de acuerdo con los antígenos. Sin embargo, en el caso de MenB, se han realizado observaciones similares en los cinco modelos animales ensayados. Estas observaciones comunes entre 4 especiesanimales diferentes sugieren que los anticuerpos bactericidas inducidos por la inmunización con "LOS no acetilados"podrían ser menos eficaces en la mediación de la inactivación de cepas "acetiladas", tales como la cepa NZ124.

Para confirmar esta hipótesis, se desarrollará un ensayo bactericida de suero usando una segunda cepa acetilada

35 L3 (cepa BZ10). Además, también se planea el desarrollo de SBA usando cepas modificadas genéticamente tales como una cepa H44/76 acetilada y una cepa NZ124 desacetilada. Basándose en estos resultados, se podríanevaluar nuevas ampollas de L3 (con GlcNAc acetilada).

Ejemplo 3: O-acetilación de LOS de núcleo interno - el gen de neisseria para O-acetilación de núcleo interno de LOS

En la parte superior de la composición de azúcar de la cadena alfa, la "decoración" de heptosa II parece tener unimpacto sobre la inmunogenicidad de LOS. Los números y posiciones de PEA, la presencia de una Glucosa en laposición 3, la presencia de una Glicina en la posición 7 y la O-acetilación de GlcNac parecen ser determinantes importantes de protección cruzada.

5 El gen Ipt3 (MacKinnon y col. 2002 Mol Microbiol. 43: 931-943) expresa la enzima que añade PEA en la posición 3 en la Heptosa II. El gen (NMB2010) no tiene variación de fase.

El gen IgtG expresa la enzima que añade una Glucosa en la posición 3 en la Heptosa II. Este gen tiene variación de fase (véase el documento WO04/015099). Este gen está delecionado en varias cepas de N. m., solo o en combinación con Ipt6.

10 El gen Ipt6 (Wright y col. 2004 J Bact. 186: 6970-6982) expresa la enzima que añade PEA en la posición 6 en la Heptosa II. El gen (NMA0408) está delecionado en varias cepas de N. m., solo o en combinación con IgtG. El gen notiene variación de fase. Ipt6 e IgtG se localizan en la misma región en el cromosoma denominado Igt3.

La enzima que añade PEA en la posición 7 en la Heptosa II es desconocida.

La enzima que añade Glicina en la posición 7 en la Heptosa II es desconocida.

15 La enzima que añade O-Acetilo en GlcNAc era desconocida hasta el presente estudio.

Identificación del gen de O-acetilación

• Después de estudios BLAST con la proteína OafA (de Salmonella; homóloga a O-acetilasa de Haemophilus Hi0391 + Hi0392) en genomas de Neisseria traducidos (N. gonorrhoeae, N. meningitidis MenB MC58, MenC FAM18 y MenA Z2491), se encontraron dos familias de genes en Neisseria denominadas oacl (representada

20 por el gen de MC58 NMB0285) y oac2 (representado por el gen de MC58 NMB1836) estando la familia oac1 más próxima a OafA que oac2.

•

Ambos genes tienen variación de fase: presencia de un tramo poliG en la ORF.

•

En MC58 (LOS no O-acetilado), el gen oac1 (NMB0285) está fuera de fase mientras que el oac2 (NMB1836) está en fase.

25 • Se obtuvieron productos de PCR correspondientes a oac1 y oac2 para cada cepa ensayada

• El tramo poliG se secuenció para investigar la funcionalidad por el tramo poliG.

Presencia y funcionalidad de gen NMB0285 y NMB1836 en cepas de N. m. de SBA: Datos analíticos obtenidos porARD con EM-EM (espectrometría de masas). Presencia/funcionalidad de los genes determinada por biología molecular. Los números entre paréntesis son los números de G en el tramo de poliG en la ORF del gen.

cepas

Tipo de cepa Inmunotipo O-Ac (ARD) oac1 (NMB0285) oac2 (NMB1836)

presencia(PCR)

funcionalidad presencia(PCR) funcionalidad

H44/76

B L3 - + -(6) + +(10)

760676

B L2 + + +(5) + -(14)

NZ124

B L3 + + +(5) + -(11)

BZ10

B L3 + + +(5) + -(9)

M687

B L3 - + -(6) + +(13)

B16B6

B L2 + + +(5) + -(15)

6275 (B2003)

B L3V + + +(5) + -(12)

2986

B L2 + + +(5) + +(10)

C11 (B1983)

C L3V + + +(5) + -(14)

CC19

C + + +(5) + (8)

YS1975

Y + + +(5) + +(13)

Y M010240539

Y + + +(5) + -(12)

cepas

Tipo de cepa Inmunotipo O-Ac (ARD) oac1 (NMB0285) oac2 (NMB1836)

presencia(PCR)

funcionalidad presencia(PCR) funcionalidad

W3193

W L3 - + -(5*) + -

W S4383

W + + +(5) + -(12)

A F8238

A L11 + + +(5) + +(7)

A 3048

A + + +(5) + +(10)

A3125

A L10 + + +(5) + +(13)

* 1 sustitución que introduce una DETENCIÓN delante el tramo de G

Conclusión

• Correlación perfecta (16/16) entre la funcionalidad del gen NMB0285 y la detección de un grupo O-acetilo por EM-EM.

5 • Ninguna correlación (7/16) entre la funcionalidad del gen NMB1836 y los datos obtenidos por EM-EM.

• Existen fuertes pruebas de que el gen de O-acetilación en Neisseria es NMB0285.

La Figura 3B muestra el gen de O-acetilación de LOS de N. meningitidis NMB 0285 (oac 1) de la cepa MC58(idéntico al 100 % con la secuencia génica de fase de lectura abierta de la cepa H44/76). Fase de lectura abierta enel caso superior, secuencias circundantes (por ejemplo, secuencia promotora) en el caso inferior. Obsérvese que la

10 secuencia de 6 G en la fase de lectura abierta (subrayada) hace que la fase de lectura abierta esté fuera de fase. En la Figura 3A, se muestra el gen equivalente NMA2202 (oac1) de la cepa Z2491. Obsérvese que la secuencia de 5 Gen la fase de lectura abierta (caso superior) hace que la fase de lectura abierta esté en fase.

1136-GGG GGG ATA TTG AA-1150 MC58

1136-GGG GGA TAT TGA A-1149 Z2491 (NMA 2202)

También está en fase para la cepa 760676 (Figura 3C) [identidad del 97 % entre la secuencia génica de fase de15 lectura abierta de oac1 de H44/76 y 760676).

En la cepa W3193 el LOS no estaba acetilado incluso aunque tenía 5G en la región que se ha descrito anteriormente. Esto se observó que se debía a un tramo poli G adicional en el gen que comienza en el nucleótido354 de la ORF. 4 G están presentes en el gen en esta posición para las cepas MC58, 760676 y NZ124 (en fase, genactivo) y se encontraron 3 G en W3193 (fuera de fase, explicando su estado des-O-acetilado).

Inactivación del gen de O-acetilación en NZ124

El gen equivalente NMB0285 (oac1) se anuló en NZ124, una cepa L3 que está O-acetilada (con oac1 en unaconfiguración activa) y es más resistente a suero inducido por ampollas obtenidas de H44/76 (no acetiladas). Lainactivación del gen de O-acetilasa se confirmó en primer lugar por análisis de espectrometría de masas y el mutante

25 KO se usará en el análisis SBA para investigar adicionalmente la implicación de O-acetilación de LOS en la protección cruzada de vacuna.

• Se secuenció el locus de NMB0285 de NZ124 (Figura 4D) y compartía el 98,6 % de identidad con el locusequivalente de MC58 de NMB0285 (confirmación de un número G "EN FASE" en NZ124). Después de laterminación, existe una secuencia adicional similar a IS1106, también presente en MC58 y 760676, que está

30 ausente en NZ124.

• Se construyó un plásmido KO de NMB0285 (vector pMG-T-easy) que contenía la región 5’ y 3’ recombinantede NZ124 que se corresponde a las regiones flanqueantes 5’ y 3’ del gen de O-Acetilación. Se introdujo un marcador KanR en sustitución del gen NMB0285. Este plásmido se denominó pRIT 15574.

• Se construyó la cepa KO de oac 1 de NZ124 -el LOS obtenido de la misma está des-O-acetilado- mostrando 35 adicionalmente que oac1 es la O-acetilasa de LOS de Nmen.

Gen de O-Acetilación ON en nuevas cepas obtenidas de L3

Las ampollas obtenidas de la cepa H44/76 son del inmunotipo L3 (no acetilado). Ya que las ampollas tienen unacapacidad reducida para inducir anticuerpos bactericidas contra las cepas O-acetiladas de L3 (por ejemplo, NZ124,

BZ10), se propone reintroducir un gen de O-acetilación funcional (oac1) en la cepa de producción de ampolla obtenida de H44/76.

Estrategia:

•

Sustitución del gen de H44/76 NMB0285 (gen desconectado) por el gen NZ124 (cepa ON O-ac).

•

Se incluyeron secuencias promotoras y de regulación cadena arriba de NZ124 (se insertó la orf de NZ124 y los 448pb cadena arriba de NZ124).

•

La inserción tuvo lugar usando un gen de resistencia a Eritromicina en orientación con sentido.

•

Se ensayó la importancia de la O-Acetilación de LOS L3 de ampolla sobre la eficacia de protecciónheteróloga de vacuna (para observar si había inactivación mejorada de NZ124 por ampollas de H44/76modificadas del anterior modo). También se ensayará una combinación de esta ampolla de L3 con ampollasde una cepa L2 O-acetilada 760676 para buscar producción de anticuerpo bactericida heterólogo.

Resultados

• Lo anterior se realizó y se demostró que el LOS resultante de la cepa H44/76 modificada estaba O-acetilado en Hepll por espectrometría de masas.

Ejemplo 4: Caracterización de los LOS de las cepas 6275 y C11 por el procedimiento de Ouchterlony (inmunotipado), análisis de EM/EM y análisis de biología molecular

Sumario

•

Se inmunotiparon las cepas 6725 y C11 por inmunodifusión usando anticuerpos policlonales específicos (procedimiento de Ouchterlony). La composición de LOS de núcleo interno se determinó por análisis de EM/EM. Los genes que codifican las enzimas implicadas en la decoración de núcleo interno de LOS seanalizaron mediante PCR y secuenciación.

•

Basándose en el análisis de EM/EM, la cepa 6275 posee dos restos PEA en la Hep II. Esta cepa seinmunotipó como una cepa L3, aunque las cepas convencionales de L3 tienen solamente una PEA (en laposición 3 en HepII).

•

Se observaron dos composiciones diferentes del LOS de núcleo interno de la cepa C11 mediante EM-EM. Una población contiene un resto PEA en la Hep II mientras que la segunda población contiene dos restos PEA. La cepa se inmunotipó como una cepa de L3 también con una reacción muy débil con sueros anti-L2.

Introducción

La composición de LOS de núcleo interno de LOS de Neisseria meningitidis parece ser más compleja que la que seha descrito previamente. Hasta recientemente, se propuso que el LOS de núcleo interno no contiene PEA osolamente un resto PEA en la Hep II en la posición 3 ó 6 (7). Pero recientemente se describió un nuevo LOS denúcleo interno con dos restos PEA en la posición 3 y en la posición 6 (ó 7). Debido a que esta nueva estructura deLOS se describió a partir de una cepa inmunotipada previamente como L3, esta nueva estructura de LOS se ha denominado L3v por variante de L3.

Antes del descubrimiento de la estructura de L3v, los datos epidemiológicos basados en el inmunotipado de LOShan demostrado que aproximadamente el 70 % de las cepas de serogrupo B invasivas eran L3 (PEA en la posición3) y que la mayor parte de las cepas remanentes eran L2 (PEA en la posición 6).

Basándose en los datos bactericidas obtenidos con un panel de cepas de L3 y L2 y sueros de animales inmunizadoscon ampollas obtenidas de L3 o ampollas obtenidas de L2, se ha concluido que solamente los sueros obtenidos deanti-L3 son capaces de mediar en la inactivación por complemento de cepas L3 mientras que solamente los suerosanti-L2 son capaces de inactivar cepas L2. Pero, de forma interesante, los datos bactericidas obtenidos en dosnuevas cepas de L3v no están de acuerdo con las conclusiones previas. De hecho, la inactivación por complementode estas dos cepas está mediada por sueros obtenidos anti-L2 pero no sueros anti-L3. Estas dos cepas "atípicas"son la cepa 6275 de serogrupo B y la cepa de referencia de serogrupo C C11.

Para comprender los resultados divergentes entre inmunotipo y resultados bactericidas, la composición de núcleointerno de las cepas 6275 y C11 se determinó por EM/EM. Además, el inmunotipado de estas cepas se realizóusando el procedimiento de Ouchterlony (inmunodifusión usando sueros policlonales específicos). También se analizó la presencia de los genes Ipt3, Ipt6 e IgtG funcionales usando procedimientos de biología molecular. Estosgenes codifican enzimas responsables de la adición de Hep II de una PEA en la posición 3, una PEA en la posición 6y una Glucosa en la posición 3, respectivamente.

Resultados

1. Composición de núcleo interno por análisis de EM/EM

Los análisis de EM/EM (véase la Figura 4) muestran que:

• En ambas cepas, el LOS de cadena a es el típico tetrasacárido LNnT descrito para cepas L2 y L3 con un grupo de ácido siálico terminal.

•

El LOS de núcleo interno de la cepa 6275 posee dos restos PEA más probablemente en las posiciones 3 y 6(7), pero a confirmar por análisis de RMN.

•

La cepa C11 estaba compuesta por dos núcleos internos diferentes:

•

una poblacion con una PEA (su posición en Hep II no está definida, pero se observa una señal débil parauna glicina en Hep II que excluye una PEA en la posición 7)

•

una segunda poblacion con dos PEA (mas probablemente en la posicion 3 y 6 debido a que tambien se detectó una glicina en esta Hep II)

•

Para ambas cepas no se detecta glucosa en Hep II.

2. Inmunotipado de LOS

El inmunotipado se realizó usando un panel de antisueros específicos. Solamente se describen a continuación los resultados obtenidos con el antisuero L3 y el antisuero L2 debido a que los resultados con los demás antisueros (L1,L4, L5...) eran negativos para las cepas 6275 y C11. En estos experimentos, las cepas 6275 y C11 usadasactualmente en GSK Bio (GSK6275-1 &2 y GSK C11) se compararon con cepas similares conservadas en un congelador durante más de 20 años en la Universidad de Ámsterdam (cepas Zol 6275 y RIV C11).

Las dos cepas 6275 (Zol 6275 y GSK6275-1&2) tienen un comportamiento similar en el ensayo de inmunotipado. Reaccionan intensamente con el suero anti-L3 pero no con el suero anti-L2.

La cepa GSK C11 y la cepa RIV C11 también presentan resultados idénticos. Ambas cepas son positivas con elsuero anti-L3 y débilmente positivas con el suero anti-L2.

Para confirmar la precipitación muy débil obtenidas con las cepas C11 y el suero anti-L2, se realizaron nuevosexperimentos de inmunodifusión en combinación con aislados de 5 pacientes tipados previamente como L3,2 en 1980. Los resultados de C11 muestran de nuevo precipitaciones muy débiles con el suero anti L2 mientras que seconfirma el tipado de las 5 cepas de enfermedad.

Cepas

Serogrupo tipado 1980 tipado 2006

2991

B L3,(2) L3,2

3072

W L3,2 L3,2

3146

C L3,(2) L3,(2)

3151

W L3,2 L3,2

3356

B L3,2 L3,2

GSK C11

C L3,(2)

RIV C11

C L3,(2)

3. Caracterización molecular

La enzima que añade la PEA en la posición 3 se ha identificado y se codifica por el gen Ipt3. Se detecta una PEA en la posición 3 en Hep II en el 70 % de cepas hipervirulentas de N. meningitidis y Wright y colaboradores detectaron el gen Ipt3 mediante PCR en el 86 % de las cepas analizadas. Este gen no está regulado por variación de fase y seobservó que estaba parcialmente delecionado en diversas cepas de serogrupo C y A. Se planteó la hipótesis que laadición de una PEA en la posición 3 estaba en competición con la adición de glucosa en la misma posición. Laenzima implicada está codificada por el gen IgtG (véase el documento WO04/015099), regulado por variación de fase con un tramo de poliC en la ORF. La hipótesis del laboratorio Moxon es que, si la ORF de IgtG está presente y en fase, se produce una enzima funcional, se añade glucosa en la posición 3 y no se añade una PEA en esaposición.

El gen que codifica la enzima que añade una PEA en la posición 6 es Ipt, localizado al lado del gen IgtG. Este gen no contiene regiones susceptibles a ser reguladas por variación de fase y se detectó en el 48 % de N. m. (Wright ycol, 2004). El gen que codifica la enzima que añade una Glicina en la posición 7 en Hep II no se conoce.

La cepa 6275 de MenB y la cepa C11 de menC se analizaron en paralelo con cepas de referencia correspondientesde L3 y L2. Se realizaron experimentos de amplificación por PCR y secuenciación:

•

Mientras que se evaluó la presencia de una copia completa del gen Ipt3 (PCR), se prosiguieron investigaciones sobre la funcionalidad del gen IgtG (presencia por PCR y secuencia del tramo poliC en la ORF)

•

Se evaluó la presencia del gen Ipt6 mediante PCR. Si está presente una copia completa del gen, se postulará que la cepa contiene LOS con una PEA en la posición 6.

PCR y análisis de secuencia de genes Ipt3, Ipt6 e IgtG

Ipt3

IgtG Ipt6

Presencia

Presencia

Funcionalidad

Presencia

H44/76 (L3)

+ + - -

NZ124(L3)

+ - - -

B16B6(L2)

+ + + +

760676 (L2)

+ + + +

6275

+ + +* +

C11

+ + +* +

Basándose en estos datos, las cepas de menB 62875 y de menC C11 parecen estar relacionadas con el inmunotipoL2. Sin embargo, el análisis de EM/EM muestra para ambas cepas dos grupos de PEA y ninguna Glucosa. La *indica que el gen IgtG tiene 14 en lugar de 11 (el número normal observado en genes activos) nucleótidos C

5 consecutivos en la región de variación de fase. Aunque esto significa que la fase de lectura abierta está en fase y, por tanto, puede producir una proteína funcional, también es posible que la adición de un resto de Prolina adicionalpueda alterar la estructura de la proteína y, por tanto, su función.

4. Sumario

La siguiente tabla resume la caracterización de diferentes cepas meningocócicas usando diferentes procedimientos

Cepas

Inmunotipado Inactivación de SBA Anti-TrL3 Anti-TrL2 EM/ EM PEA Glc Caracterización molecular Ipt3 Ipt6 IgtG funcional

H44/76

L3 + - 1 - + - -

NZ124

L3 + - 1 - + - -

760676

L2 - + 1 + + + +

B16B6

L2 - + 1 + + + +

6275

L3 - + 2 - + + +*

C11

L3(2) - + 1 y 2 - + + +*

Discusiones

15 La diversidad de la composición de LOS de núcleo interno es más compleja que la que se ha descrito previamente. Inicialmente, se representaron cepas sin o con un grupo de PEA en Hep II (en la posición 3 ó 6/7) perorecientemente se describieron cepas con dos grupos de PEA. Tales cepas son, por ejemplo, la cepa 6275 delserogrupo B y la cepa C11 del serogrupo C.

Sorprendentemente, los resultados de inmunotipado y los resultados bactericidas de suero obtenidos con las cepas

20 6275 y C11 no están de acuerdo. De hecho, estas dos cepas se tipan como cepas L3 pero su inactivación está mediada por sueros de ampollas obtenidas de anti-L2 y no de sueros de ampollas obtenidas de anti-L3 (véase elsiguiente ejemplo).

Se planteó una cuestión con respecto a la relevancia de estas cepas y si la presencia de dos grupos de PEA podríaser un artefacto de laboratorio debido a pases de cultivo in vitro sucesivos. Se tuvo la oportunidad de comparar25 diferentes siembras de cepas 6275 y C11. Para cada cepa, una siembra usada actualmente por los inventores se comparó con una siembra más antigua almacenada durante más de 20 años (en la Universidad de Ámsterdam).Para cada cepa, las dos siembras han mostrado el mismo comportamiento en el ensayo de Ouchterlony sugiriendo

ausencia de deriva al menos durante los últimos 20 años. Sin embargo, la composición de LOS de núcleo interno delas siembras más antiguas se debe determinar para confirmar la presencia de dos restos PEA.

De acuerdo con la bibliografía, aproximadamente el 70 % de las cepas meningocócicas invasivas son L3. Losresultados de Ouchterlony obtenidos con cepas L3v sugirieron que este procedimiento no diferencia entre cepas L35 y L3v. Por lo tanto, el número de cepas "L3 verdaderas" se podría sobreestimar en ambos estudios. Los genes Ipt3 e Ipt6 son responsables de la adición del grupo de PEA en la posición 3 y 6 en Hep II, respectivamente.Aproximadamente el 36 % de las cepas circulantes contienen ambos genes, el 50 % poseen solamente Ipt3 y el 12 % poseen solamente Ipt6 (Wright JC y col, 2004). Por lo tanto, potencialmente el 36 % de las cepas podrían ser L3vincluso si se tipan como L3. Sin embargo, los datos epidemiológicos recientes obtenidos con un panel de MAb

10 específicos para diferentes estructuras de LOS de núcleo interno sugirieron que menos del 2 % de las cepas tienen dos grupos de PEA en Hep II (Gidney MAJ y col, Infect Immun. 2004 72: 559-69). La diferencia entre estos dosestudios (el 36 % frente al 2 %) se podría explicar mediante la mayor sensibilidad a complemento humano de lascepas que poseen un grupo de PEA en la posición 6 (Ram S y col J Biol Chem. 2003 278: 50853-62). Tomados enconjunto, todos los datos sugieren que la mayoría de las cepas invasivas son "L3 verdadera".

15 Se sugirió que IgtG e lpt-3 compiten por la posición O-3 de Hep II, con una desviación descrita para la adición del resto Glc con respecto al resto PEA (Wright JC y col 2004). Esta hipótesis puede no ser una regla universal como sedemuestra por la presencia de dos restos PEA en el LOS de núcleo interno de las cepas 6275 y C11 incluso enpresencia de un gen IgtG funcional (a menos que el gen IgtG en fase con 14 nucleótidos C en la región de variación de fase no sea activo -véase anteriormente). Además de la hipótesis del laboratorio Moxon se describió

20 recientemente otro sistema implicado en la regulación/composición de la estructura de núcleo interno de LOS de la cepa NmB. Este sistema es el sistema regulador de dos componentes MisR/MisS (Tzeng YL y col J Biol Chem. 2004

279: 35053-62). En conclusión, los mecanismos implicados en la composición de LOS de núcleo interno parecen sermúltiples y no se han aclarado completamente.

Cinco cepas aisladas de pacientes presentaron un inmunotipo de LOS sorprendente debido a que muestran una

25 precipitación predominante con sueros anti-L3 pero también una precipitación más débil con suero anti-L2. Esto también es el caso de la cepa C11 incluso si la precipitación con el suero anti-L2 es muy débil. El análisis de EM/EMdel LOS de núcleo interno de la cepa C11 también muestra dos composiciones de núcleo interno diferentesparcialmente de acuerdo con la co-expresión de LOS L3 y L2. El LOS L3 identificado por inmunoprecipitación podríaser en realidad un LOS L3v (con dos restos PEA) mientras que el LOS L2 debe estar relacionado con LOS de núcleo

30 interno que posee una PEA en la posición 6 (a confirmar por análisis de RMN) incluso en ausencia de Glc detectable que debe estar presente en alguna molécula de LOS debido a la detección de un gen IgtG aparentemente funcionalen la cepa C11. Sin embargo, se debe realizar el análisis (EM/EM, caracterización molecular y SBA) del LOS de núcleo interno de uno o más de estos aislados de pacientes para confirmar que estas cepas L3,2 co-expresan LOSL3v y L2.

35 En conclusión, las cepas que poseen dos grupos de PEA en su núcleo interno se inmunotipan como cepas L3, pero este inmunotipado no está de acuerdo con la reactividad biológica en SBA y análisis de la presencia de genes IgtG, Ipt3 e Ipt6 "funcionales". Los datos indican que estas cepas L3v probablemente no proceden de cepas L3 (debido ala presencia del gen Ipt6) y, por tanto, se deben renombrar.

Ejemplo 5: Vacuna de Neisseria meningitidis: composición bivalente de vacunas basadas en ampollas ricas 40 en LOS

Cepas de producción de ampolla usadas (inmunotipo, modificaciones genéricas, etc.)

Cepa

Basado en: LOS siaD porA msbB - IgtB- Ist- frpB- TrHsf up

B1854

H44/76 TrL3 X X X X X X

B1948

H44/76 L7 X X X X X X

B1900

760676 TrL2 X X X X

B1987

760676 TrL2 X X X X X

B1971

760676 L2 X X X X

B1984

760676 L2 X X X X X

Producción de ampollas de cultivo realizado con o sin desferal

• Se produjeron ampollas B 1854, B1948, B1971, B1984 y B1987 a partir de cultivos en presencia de desferal 45 • Se obtuvieron ampollas B 1900 de un cultivo sin desferal

Procedimientos

Procedimiento animal: Se inmunizaron grupos de 30 ratones tres veces con OMV (que contenían aproximadamenteel 15-20 % de LOS destoxificado) por la vía intramuscular (IM) el día 0, 21 y 28. Cada inoculación estaba compuestapor 5 !g (contenido de proteína) de OMV no adsorbidas. Las OMV se produjeron a partir de cepas de Neisseria 50 meningitidis (Nmen) modificadas de tal forma que los polisacáridos capsulares y PorA estaban regulados

negativamente y el LOS destoxificado (mutación msbB). Las cepas de producción (véase la anterior tabla) seobtuvieron de la cepa H44/76 de tipo silvestre modificada genéticamente (en este caso, expresaron el LOS L7 o elLOS TrL3) o la cepa 760676 de tipo silvestre modificada genéticamente (en este caso, expresaron el LOS L2,sialilado o no, o el LOS TrL2). Se aislaron ampollas de cepas desarrolladas en las condiciones de cultivo que se handescrito anteriormente. El día 42 se tomaron muestras de sangre para el análisis por el ensayo bactericida de suero(SBA) usando un panel de cepas de Neisseria meningitidis (véase la tabla 1). Se realizaron SBA en muestras desangre combinadas o en sueros individuales (de 10 a 30 sueros por grupo).

Se realizaron experimentos con crías de rata del siguiente modo. Se inmunizaron grupos de 20 ratas de siete díasde edad por la vía IM el día (0, 14, 28 y 63). Cada inoculación estaba compuesta por 10 !g (contenido de proteína)de ampollas no adsorbidas. Se tomaron muestras de sangre 14 días después de la cuarta inyección.

Se realizaron experimentos con cobayas del siguiente modo. Se inmunizaron grupos de 20 cobayas por la vía IM eldía (0, 14, 28). Cada inoculación estaba compuesta por 20 !g (contenido de proteína) de ampollas no adsorbidas.Se tomaron muestras de sangre 14 días después de la tercera inyección.

Se realizaron experimentos con conejos del siguiente modo. Se inmunizaron grupos de 5 conejos blancos NewZealand por la vía IM el día (0, 21, 42). Cada inoculación se preparó a partir de 20 !g (contenido de proteína) deampollas no adsorbidas. Se tomaron muestras de sangre 14 días después de la tercera inyección.

SBA usando cultivo en líquido con desferal: Se cultivaron cepas de N. meningitidis durante una noche en placas de Petri con MH + Polyvitex al 1 % + suero de caballo al 1 % a 37 ºC + CO2 al 5 %. Se sub-cultivaron durante 3 horas en un medio TSB líquido complementado con 50 !M de desferal (quelante de hierro) a 37 ºC con agitación paraalcanzar una DO de aproximadamente 0,5 a 470 nm. Las muestras de suero se inactivaron durante 40 min a 56 ºC y después se diluyeron 1/10 o 1/50 en PBS-glucosa al 0,1 % y después se diluyeron dos veces (8 diluciones) en unvolumen de 25 !l en microplacas de fondo plano. Las bacterias se diluyeron en PBS-glucosa al 0,1 % para producir5300 UFC/ml y 18,8 !l de esta dilución se añadieron a la dilución de suero. También se añadió complemento de conejo (6,2 !l) a cada pocillo. Después de 75 min de incubación a 37 ºC con agitación, se añaden 50 !l de MH + agar al 0,9 % a los pocillos y 50 !l de PBS + agar al 0,9 % aproximadamente 30 min más tarde. Las microplacas seincuban durante una noche a 37 ºC + CO2. Las UFC se recuentan y se calcula el porcentaje de inactivación. El títulode SBA es la dilución que da el 50 % de inactivación.

SBA usando cultivo en agar (sin desferal): Se cultivaron cepas de N. meningitidis durante una noche en Placas de Petri con BHI + suero de caballo al 1 % a 37 ºC + CO2 al 5 %. Se sub-cultivaron durante 4 horas en BHI + suero de caballo al 1 % a 37 ºC + CO2 al 5 %. Las muestras de suero se inactivaron durante 40 min a 56 ºC y después sediluyeron 1/10 en PBS-glucosa al 0,1 % y después se diluyeron dos veces (8 diluciones) en un volumen de 25 !l en microplacas de fondo plano. Las bacterias se diluyeron en PBS-glucosa al 0,1 % para dar 6400 UFC/ml y 12,5 !l de esta dilución se añadieron a la dilución de suero. También se añadió complemento de conejo (12,5 !l) a cada pocillo. Después de 75 min de incubación a 37 ºC con agitación se añaden 50 !l de TSB + agar al 0,9 % a los pocillos y 50 !l de PBS + agar al 0,9 % aproximadamente 30 minutos más tarde. Las microplacas se incuban durante una noche a 35 ó 37 ºC + CO2. Las UFC se recuentan y se calcula el porcentaje de inactivación. El título de SBA es la dilución que da el 50 % de inactivación.

Composiciones de LOS de núcleo interno de diferentes inmunotipos

•

L3 = una PEA en Hepll (más probablemente en la posición 3) y ningún Acetilo adicional en la GlcNAc denúcleo interno

•

"L3" = una PEA en Hepll (más probablemente en la posición 3) y un Acetilo adicional en la GlcNAc de núcleointerno

•

L2 = una PEA en Hepll (más probablemente en la posición 6) y un Acetilo adicional en la GlcNAc de núcleo interno

•

Variante = dos PEA en Hepll (más probablemente en las posiciones 3 y 6) y un Acetilo adicional en laGlcNAc de núcleo interno; aunque obsérvese que en la cepa W3193 no estaba presente Oac en Hepll

•

L10 y L11 = estructuras no determinadas

•

L3, "L3", L2 y variante albergan el tetrasacárido LNnT (sialilado o no).

Resultados

Los resultados resumidos en la siguiente Tabla 1 y la Figura 5 muestran que

•

Las ampollas obtenidas de L2 inducen anticuerpos bactericidas contra cepas L2 de NmenB pero no contracepas L3 de NmenB (excepto para la cepa M97250687), mientras que las ampollas obtenidas de L3 inducenuna respuesta protectora contra cepas L3 y "L3" de NmenB, contra la cepa 3125 (L10) del serogrupo A y lacepa M01.0240539 (M01.539 en la tabla) del serogrupo Y pero no contra cepas L2. La estructura del LOSL10 de 3125 por espectrometría de masas se muestra en la Figura 6.

•

Además, las ampollas obtenidas de L2 inducen protección contra cepas que albergan un LOS variante(cepas 6275 de NmenB y C11 de NmenC) y también contra otras cepas del serogrupo C (C19), serogrupo Y(S1975), serogrupo A (F8238, L11) y serogrupo W-135 (cepas S4383 y 3193).

•

Una vacuna bivalente basada en ampollas de LOS enriquecidas obtenidas de cepas L2 y L3 induce unarespuesta protectora (anticuerpos bactericidas) contra todas las cepas ensayadas (cualquiera que sea el

serogrupo y el inmunotipo de LOS) (se tiene que ensayar una vacuna bivalente con OMV de L2 NS y TrL3).

• El LOS L2 no trucado induce una mejor "protección cruzada" que mutantes IgtB (=TrL2). Esto no es el caso para ampollas obtenidas de L3 (TrL3=L7).

•

Las ampollas de L2 no sialiladas inducen un nivel similar de anticuerpos bactericidas que las ampollas de L25 sialiladas (al menos contra la cepa 6275).

• De acuerdo con las cepas dirigidas en SBA, se observan o no interferencias con las vacunas bivalentes queindican que se requiere un ajuste fino de la formulación bivalente/composición para garantizar la mejoreficacia (títulos SBA) contra todas las cepas ensayadas.

•

La decoración del núcleo interno tiene un gran impacto sobre la inducción de anticuerpos bactericidas10 cruzados.

Tabla 1. Anticuerpos bactericidas cruzados inducidos por vacunas de OMV enriquecidas en LOS monovalentes ybivalentes. Títulos de SBA (para el 50 % de inactivación) y seroconversión (%)

Cepas

Grupo LOS Vacunas (no adsorbidas)

L7(B1948)

L2(B1971) L7+L2 TrL3(B1854) TrL2(B1900) TrL3+TrL2 Tampón

H44/76

B L3 4979 <100 5267 5507 <100 12754 <100

M97250687

B L3 10123 3800 5739 >51200 469 >51200 <100

NZ124

B "L3" 479 <20 228 949 <20 523 <20

760676

B L2 <20 329 213 <20 104 40 <20

2986

B L2 <200 5288 2670 <200 1486 1486 <200

B16B6

B L2 <100 1746 1401 <100 2236 1097 <100

6275S

B Variante <200 % 267100 % 4360 % <200 % 2860 % <205 % <200 %

6275*

B Variante <100 2748 1456 <100 657 456 <100

C11

C Variante <200 % 2767 100 % 1303 100 % <200 % 405100 % 176100 % <200 %

SI 975

Y Variante <200 % >5120 100 % >5120 100 % <2020 % >5120 100 % 2205 100 % <20 10 %

M01.539

Y ?? 235100 % 1820 % 14075 % 16889 % 1920 % 7670 % <20 20 %

F82383125

AA L11L10 142100 %8288 % >5120100 %1420 % >5120 100 %NT 4260 %207100 % 3469100 %<20 0 % 1665100 %NT <2010 %<20 0 %

S4383

W "L3" 5455 % 1259 100 % NT NT NT NT NT

3193

W Variante <200 % >5120 100 % NT NT NT NT NT

H44/76, M97250687, NZ124, 760676, 2986 y B16B6: SBA en sueros combinados. Otras cepas: SBA en sueros individuales.

Cepas no de serogrupo B y cepas L2: SBA realizado de cultivos en agar sin desferal (a diferenciade excepciones)

5 S Media de dos ensayos usando cultivo en líquido + desferal

* Sueros combinados ensayados usando cultivo en agar (sin desferal)

Los resultados en la Tabla 2 muestran que:

• La protección cruzada otorgada por ampollas obtenidas de L2 (L2 con o sin ácido siálico

terminal y TrL2) contra cepas que no son de serogrupo B y la cepa 6275 también se 10 observa en cobayas, conejos y crías de rata.

• En general, las ampollas obtenidas de L2 no son capaces de inducir un nivel significativode Ab bactericidas capaces de mediar en la inactivación por complemento de cepas L3excepto la cepa M97250687 (M687 en la tabla) (los datos de la cepa H44/76 usando suerosde crías de rata y de conejo no son fiables y se tienen que repetir debido al fondo de

15 actividades medidas en sueros negativos).

•

En cobayas, las ampollas de TrL2 parecen inducir un mayor nivel de anticuerpos bactericidas que a las ampollas de L2 Ist-y L2 mientras que en crías de rata, ratones y conejos se observa la siguiente clasificación: L2 ; L2 Ist-; TrL2.

•

Esos resultados muestran que la sialilación de LOS L2 no se requiere para inducir la

20 inducción de anticuerpos bactericidas y que las ampollas de TrL2 (mutación IgtB) también son capaces de provocar la producción de anticuerpos bactericidas (como LOS de TrL3).

Tabla 2. Anticuerpos bactericidas cruzados inducidos por OMV obtenidas de L2 enriquecidas en LOS monovalentes. Títulos de SBA (para el 50 % de inactivación) yserconversión (%)

760676

L2 B16B6 2986 MenB H44/76 L3 M687 NZ124 Variante 6275 MenA L11 F8238 MenC Variante C11 MenY Variante S1975 Men W "L3" S4383

Crías de rata TrL2 (B1987)

PI V 463 129 1447 410 122 50 1822 1250 143 6446 6010

L2 lst(B1984)

PI V 1812 486 4396 2188 138 50 385 3090 365 8923 1577

L2 lst+ (B1971)

PI V 1519 996 5294 110 168 983? 961 3604 554 11000 1478

Ctrl(-)

PI V 50 50 50 360 50 50 50 50 50 50 154

Ratones TrL2 (B1987)

PIll 186 1692 6081 50 107 10 410 1929 1131 2661 2782

L2 lst(B1984)

PIll 232 1645 7557 50 321 10 748 3929 1804 8032 1371

L2 lst+ (B1971)

PIll 790 1330 8216 50 582 10 1305 5082 2525 11731 1040

Ctrl(-)

PIll 50 50 50 50 50 10 50 50 50 50 50

CobayaTrL2(B1987) L2 lst(B1984)

PIll >12800 8129 4194 50 182 50 7253 3952 627 10207 7200

PIll

>12800 5473 6608 594 770 123? 7326 5431 1491 >12800 5417

L2 lst+(B1971)

PIll >12800 5945 6484 457 527 50 4148 5061 1051 5967 5036

Ctrl(-)

PIll 50 50 50 50 50 50 50 124 50 665 50

Conejos TrL2 (B1987)

Pré 59 50 50 562 50 50 50 50 50 50 50

PIll

752 362 346 134 50 50 157 221 66 636 723

Conejos L2 lst(B1984)

Pré 63 50 50 318 50 50 50 50 50 50 50

PIll

1541 507 430 307 72 50 317 414 122 1386 1238

L2 lst+ (B1971)

Pré 50 50 50 178 50 50 50 50 50 50 62

PIll

4727 1540 551 116 90 50 750 892 224 2419 3667

Ctrl(-)

Pré 50 50 50 73 50 50 50 50 50 50 173

PIll

50 50 50 236 50 50 50 50 50 50 372

Se realizaron SBA en sueros combinados excepto para sueros de conejos que se ensayaron individualmente

Conclusión: Una combinación de vacunas LOS basadas en L2 y L3 puede provocar anticuerpos que puedeninactivar cepas Men A, B, C, W135 e Y -es la primera vez que esto se ha demostrado. Las vacunas basadas en L2pueden inactivar cepas L2, variantes (L3v) y cepas L11. Las vacunas basadas en L3 pueden inactivar cepas L3, "L3"(menos bien) y L10. Aunque las cadenas alfa truncadas (IgtB(-)) y de longitud completa (o lst(-)) pueden inactivar, las

5 truncadas parecen ser beneficiosas para las vacunas L3 y las de longitud completa (o Ist(-)) parecen ser beneficiosas para vacunas L2. Una combinación de estas dos vacunas basadas en LOS muestra mucho potencial como una vacuna contra N. meningitidis.

Ejemplo 6: vacuna de Neisseria meningitidis: las OMV bivalentes (obtenidas de L7 y obtenidas de L2) inducen protección cruzada contra cepas ABCWY

10 Procedimientos

Procedimientos en animales:

-

Se inmunizaron grupos de 30 ratones tres veces con formulación de OMV bivalente (OMV obtenida de L3 +OMV obtenida de L2 que contiene aproximadamente el 15-20 % de LOS destoxificado) por la vía intramuscular (IM) el día 2, 21 y 28. Cada inoculación estaba compuesta por 0,8 !g + 0,8 !g (contenido de

15 LOS) de OMV no adsorbidas. Las OMV se produjeron a partir de cepas de Neisseria meningitidis (Nmen) modificadas de tal forma que los polisacáridos capsulares y PorA estaban regulados negativamente y LOSdestoxificados (mutación msbB). Las cepas de producción se obtuvieron de la cepa H44/76 de tipo silvestremodificada genéticamente (L3) o la cepa 760676 de tipo silvestre modificada genéticamente (L2) (véase acontinuación una tabla que describe las modificaciones genéticas y condiciones de cultivo). El día 42, se

20 tomaron muestras de sangre para el análisis por ensayo bactericida de suero (SBA) usando un panel de 22 cepas de Neisseria meningitidis de los serogrupos A, B, C, W135 (W) e Y. Se realizaron SBA en muestras desangre combinadas. Los sueros eran de los experimentos 20060425 y 20060426.

-

Se realizó el experimento con crías de rata del siguiente modo. Se inmunizaron ratas de siete días de edad(n=20 por grupo) por la vía IM el día (0, 14, 28 y 63). Cada inoculación estaba compuesta por 1,6 !g + 1,6 !g

25 (contenido de LOS) de OMV no adsorbidas. Se tomaron muestras de sangre 14 días después de la cuarta inyección y se combinaron (experimento 20060484).

-

Se realizó el experimento con cobayas del siguiente modo. Se inmunizaron grupos de 20 cobayas por la víaIM el día (0, 14, 28). Cada inoculación estaba compuesta por 3,2 !g + 3,2 !g (contenido de LOS) de OMV noadsorbidas. Se tomaron muestras de sangre 14 días después de la tercera inyección y se combinaron

30 (experimento 20060487).

-

Se realizó el experimento con conejos del siguiente modo. Se inmunizaron grupos de 5 conejos blancos NewZealand por la vía IM el día (0, 21, 42). Cada inoculación estaba compuesta por 3,2 !g + 3,2 !g (contenidode LOS) de OMV no adsorbidas. Se tomaron muestras de sangre antes de la primera inyección y 14 díasdespués de la tercera inyección y se ensayaron individualmente en SBA (experimento 20060486).

35 Cepas de producción de OMV (inmunotipo) y modificaciones genéricas

siaD

porA msbB - IgtB- Ist frpB- TrHsf up NspA up

B1854

TrL3 X X X X X X

B1948

L7 X X X X X X

B2084

TrL2 X X X X X

B2071

NSL2 X X X X X

Producción de OMV de cultivo realizado con o sin desferal

Se produjeron OMV de B1854 y B1948 de cultivos realizados con desferal.

Se obtuvieron OMV de B2071 y B2084 de un cultivo realizado sin desferal.

40 SBA: Se cultivaron cepas de N. meningitidis durante una noche en Placas de Petri a 37 ºC + CO2 al 5 %. Se subcultivaron durante 4 horas en Placas de Petri con o sin desferal (quelante de hierro) a 37 ºC + CO2 al 5 %. Las muestras de suero se inactivaron durante 40 min a 56 ºC y después se diluyeron 1/10 ó 1/50 en PBS-glucosa al 0,1% y después se diluyeron dos veces en un volumen de 25 !l en microplacas de fondo plano. Entonces se añadieron 25 !l de una mezcla de bacterias (diluidas en PBS-glucosa al 0,1 % para dar �100-150 UFC por pocillo) y

45 complemento de cría de conejo (concentración final en micropocillo: 12,5 % v/v) a la dilución sérica. Después de 75 min de incubación a 37 ºC con agitación se añadieron 2 capas de agar (0,9 %) a los pocillos. Las microplacas seincubaron durante una noche a 35 ó 37 ºC + CO2. Las UFC se recontaron y se calculó el porcentaje de inactivación.El título de SBA es la dilución que proporciona el 50 % de inactivación.

Composiciones de LOS de núcleo interno de diferentes inmunotipos

•

L3 = una PEA en Hepll (más probablemente en la posición 3) y sin ningún Acetilo adicional en GlcNAc de núcleo interno

•

"L3" = una PEA en Hepll (más probablemente en la posición 3) y un Acetilo adicional en GlcNAc de núcleointerno

•

L2 = una PEA en Hepll (más probablemente en la posición 6) y un Acetilo adicional en GlcNAc de núcleointerno

•

Variante = dos PEA en Hepll (más probablemente en posiciones 3 y 6) y, en general, un Acetilo adicional enGlcNAc de núcleo interno;

•

L10 y L11 = estructuras no determinadas completamente

•

L3, "L3", L2 y la variante albergan el tetrasacárido LNnT (sialilado o no).

Resultados

Basándose en un aumento de cuatro veces de los títulos bactericidas (usando muestras de suero combinadas de animales de control o de muestra de suero pre-vacuna como comparador), los resultados (véase la tabla en lasiguiente página) muestran que

•

Las formulaciones bivalentes no adsorbidas que contienen OMV de L7 + NSL2 u OMV de TrL3 + TrL2 que son capaces de otorgar una protección cruzada contra cepas de N. meningitidis que pertenecían a los serogrupos A, B, C, W e Y.

•

Esta protección cruzada se observa no solamente en ratones sino también en crías de rata, cobayas y conejos.

•

Sin embargo, estas formulaciones no son capaces de provocar una respuesta protectora contra cepas queexpresan el inmunotipo de LOS L4. En estos experimentos, los sueros no son bactericidas contra una cepaL10.

•

La mayoría de las cepas que expresan LOS L3 o "L3" o variante o L2 se inactivan por sueros de ratón, cría de rata y cobaya. Frente a estas cepas, el porcentaje de protección cruzada está próximo al 90 %.

•

La protección cruzada parece ser menor en conejos.

Conclusión

Una vacuna bivalente basada en OMV obtenida de cepas de N. meningitidis L3 y L2 es capaz de otorgar protección contra las cepas de N. meningitidis que expresan LOS L3 o "L3" o variante (L3v) o L2. Esta protección no está restringida a ningún serogrupo dado.

Tabla: Anticuerpos bactericidas cruzados inducidos por vacunas de OMV enriquecidas en LOS bivalentes. Títulos de SBA (para el 50 % de inactivación).

Títulos de SBA post-vacunación que no muestran un aumento de al menos cuatro veces (en comparación con muestras sanguíneas de control o muestras sanguíneas previas)

La cepa S3483 es inmunológicamente una cepa L2 o L3v pero estructuralmente una L3II (sin Glucosa en el interior y sin gen fpt6) *

Ejemplo 7: Impacto de OAc sobre inmunogenicidad de OMV de L7

Procedimientos

Procedimientos en animales:

-

Se inmunizaron grupos de 30 ratones tres veces con OMV (que contenía aproximadamente el 15-20 % de

5 LOS destoxificados) por la vía intramuscular (IM) el día 0, 21 y 28. Cada inoculación estaba compuesta por 0,8 !g (contenido de LOS) de OMV no adsorbidas. Las OMV se produjeron a partir de cepas de N. meningitidis modificadas de tal forma que los polisacáridos capsulares y PorA estaban regulados negativamente y el LOS destoxificado (mutación msbB). Las cepas de producción se obtuvieron de la cepa H44/76 de tipo silvestre modificada genéticamente (véase a continuación una tabla que describe las

10 modificaciones genéticas y las condiciones de cultivo). El día 42 se tomaron muestras de sangre para análisis por el ensayo bactericida de suero (SBA) usando cepas de N. meningitidis. Se realizaron SBA en sueros individuales. Los sueros eran del experimento 20060634.

-

Se realizó el experimento con cobaya del siguiente modo. Se inmunizaron grupos de 20 cobayas por la víaIM el día (0, 14, 28). Cada inoculación se preparó a partir de 3,2 !g (contenido de LOS) de OMV no

15 adsorbidas. Se tomaron muestras de sangre 14 días después de la tercera inyección (experimento 20060636).

Cepas de producción de OMV (inmunotipo) y modificaciones genéticas

siaD

porA msbB - Ist- frpB- TrHsf up nmb0285

B1948

L7 OAc- X X X X X X OFF

B2103

L7 OAc+ X X X X X X ON

Las OMV de B1948 y B2103 se produjeron a partir de cultivos desarrollados con desferal

20 SBA: Se cultivaron cepas de N. meningitidis (H44/76 y M97250687 que son OAc-y NZ124 que es OAc+) durante una noche en Placas de Petri a 37 ºC + CO2 al 5 %. Se subcultivaron durante 4 horas en Placas de Petri con desferal (quelante de hierro) a 37 ºC + CO2 al 5 %. Las muestras de suero se inactivaron durante 40 min a 56 ºC y después se diluyeron 1/10 ó 1/50 en PBS-glucosa al 0,1 % y después de diluyeron dos veces en un volumen de 25!l en microplacas de fondo plano. Después se añadieron 25 !l de una mezcla de bacterias (diluidas en PBS-glucosa

25 al 0,1 % para dar 100-150 UFC por pocillo) y complemento de cría de conejo (concentración final en micropocillo: 12,5 % v/v) a las diluciones de suero. Después de 75 min de incubación a 37 ºC con agitación se añadieron 2 capasde agar (0,9 %) a los pocillos. Las microplacas se incubaron durante una noche a 35 ó 37 ºC + CO2. Las UFC se contaron y se calculó el porcentaje de inactivación. El título de SBA es la dilución que da el 50 % de inactivación.

Resultados

30 En ratones, las OMV de L7 OAc+ son más inmunogénicas que las OMV de L7 OAc- (véase la siguiente tabla). De hecho, los sueros de ratones inmunizados con OMV de L7 OAc+ muestran una mayor actividad bactericida mediada por complemento que los sueros de ratones inmunizados con OMV de L7 OAc-. Esto se observa frente a cepas detipo silvestre OAc- y OAc+. Sin embargo, se observan diferencias significativas solamente frente a cepas OAc(H44/76 y M97205687).

35 Tabla: Anticuerpos bactericidas inducidos por OMV de L7 OAc- (B1948) y OMV de L7 OAc+ (B2103) en ratones. GMT (para el 50 % de inactivación) e intervalos de confianza del 95 %.

OMV de B1948 (OAc-)

OMV de B2103 (OAC+)

H44/76

3699 (1987-6886) 9122* (6381-13041)

M97.250687

2768 (1741-4401) 7780* (5594-10820)

NZ124

117 (61-225) 191 (105-348)

*p<0,05 en comparación con GMT para ratones inmunizados con B1948

En cobayas, ambos tipos de OMV muestran en SBA una inmunogenicidad similar frente a cepas de tipo silvestreOAc+ y OAc- (véase la siguiente tabla).

Tabla: Anticuerpos bactericidas inducidos por OMV de L7 OAc- (B 1948) y OMV de L7 OAc+ (B2103) en cobayas. GMT (para el 50 % de inactivación) e intervalos de confianza del 95 %.

OMV de B1948 (OAc-)

OMV de B2103 (OAC+)

H44/76

1283 1392

(896-1836)

(876-2212)

NZ124

69 43

(38-128)

(25-74)

Conclusión

Se ha demostrado que la O-acetilación de GlcNAc de núcleo interno aumenta la inmunogenicidad (título de SBA) de OMV en ratones pero no en cobayas.

Claims (15)

1. REIVINDICACIONES

   1. Una composición inmunogénica que comprende LOS L3 aislado de una cepa de Neisseria que está Oacetilado en el resto GlcNac unido a su resto Heptosa II, en la que el LOS L3 tiene la siguiente estructura:

   en la que: R1=

   R2= PEA, R3= H,

   10 R4= OAc, R5= H o Gly.
2. 2. La composición inmunogénica de la reivindicación 1, que comprende además LOS L2 de una cepa deNeisseria, aislado opcionalmente de una cepa A, B, C, W135 o Y de Neisseria meningitidis.
3. 3. La composición inmunogénica de la reivindicación 1 ó 2, que comprende además LOS L2 con la siguiente 15 estructura:

   en la que para el LOS L2: R1=

   R2= PEA o Glc,

   R3= PEA,

   R4= H u OAc,

   R5= H, PEA o Gly.

4. 4.

   La composición inmunogénica de las reivindicaciones 1-3, que comprende además LOS L10 de una cepa de Neisseria, opcionalmente aislado de una cepa A, B, C, W135 o Y de Neisseria meningitidis.

5. 5.

   La composición inmunogénica de las reivindicaciones 1-4, que comprende además LOS L4 de una cepa deNeisseria, opcionalmente aislado de una cepa A, B, C, W135 o Y de Neisseria meningitidis.

6. 6.

   La composición inmunogénica de las reivindicaciones 1-5, en la que el LOS L3 se aísla de una cepa A, B, C, W135 o Y de Neisseria meningitidis.

7. 7.

   La composición inmunogénica de las reivindicaciones 1-6, en la que LOS L2, LOS L3, LOS L10, LOS L4,LOS L2 y L3, LOS L2 y L10, LOS L3 y L10, LOS L4 y L2, LOS L4 y L3, LOS L4 y L10, LOS L2 y L3 y L10, LOS L2 y L3 y L4, LOS L2 y L4 y L10, LOS L3 y L4 y L10 o LOS L2 y L3 y L10 y L4 se conjugan con un vehículo de proteína.

8. 8.

   La composición inmunogénica de las reivindicaciones 1-7, en la que el LOS L2, LOS L3, LOS L10, LOS L4,LOS L2 y L3, LOS L2 y L10, LOS L3 y L10, LOS L4 y L2, LOS L4 y L3, LOS L4 y L10, LOS L2 y L3 y L10, LOS L2 y L3 y L4, LOS L2 y L4 y L10, LOS L3 y L4 y L10 o LOS L2 y L3 y L10 y L4 tienen un resto de lípido A destoxificado,por ejemplo, que carece de una cadena secundaria de acilo coherente con el LOS que se ha aislado de una cepa deneisseria msbB(-).

9. 9.

   La composición inmunogénica de las reivindicaciones 1-8, en la que el LOS L2, LOS L3, LOS L10, LOS L4,LOS L2 y L3, LOS L2 y L10, LOS L3 y L10, LOS L4 y L2, LOS L4 y L3, LOS L4 y L10, LOS L2 y L3 y L10, LOS L2 y L3 y L4, LOS L2 y L4 y L10, LOS L3 y L4 y L10 o LOS L2 y L3 y L10 y L4 están presentes en la composicióninmunogénica como una preparación de LOS purificado.

10. 10.

    La composición inmunogénica de las reivindicaciones 1-9, en la que el LOS L2, LOS L3, LOS L10, LOS L4,LOS L2 y L3, LOS L2 y L10, LOS L3 y L10, LOS L4 y L2, LOS L4 y L3, LOS L4 y L10, LOS L2 y L3 y L10, LOS L2 y L3 y L4, LOS L2 y L4 y L10, LOS L3 y L4 y L10 o LOS L2 y L3 y L10 y L4 están presentes en la composicióninmunogénica como una preparación liposómica.

11. 11.

    La composición inmunogénica de las reivindicaciones 1-10, en la que el LOS L2, LOS L3, LOS L10, LOS L4, LOS L2 y L3, LOS L2 y L10, LOS L3 y L10, LOS L4 y L2, LOS L4 y L3, LOS L4 y L10, LOS L2 y L3 y L10, LOS

    L2 y L3 y L4, LOS L2 y L4 y L10, LOS L3 y L4 y L10 o LOS L2 y L3 y L10 y L4 están presentes en la composicióninmunogénica como una preparación de ampolla.
12. 12. Una composición de vacuna que comprende una cantidad eficaz de la composición inmunogénica de lasreivindicaciones 1-11, uno o más polisacáridos u oligosacáridos capsulares conjugados derivados de las siguientes

    5 cepas: serogrupo A de meningococo, serogrupo C de meningococo, serogrupo W-135 de meningococo, serogrupo Y de meningococo y H. influenza de tipo b y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptables.
13. 13. Uso de la composición inmunogénica de las reivindicaciones 1-11 o de la vacuna de la reivindicación 12 enla fabricación de un medicamento para la prevención o el tratamiento de enfermedad provocada por uno o másserogrupos de N. meningitidis seleccionados entre la siguiente lista: A, B, C, W135 e Y.

    10 14. Un procedimiento para fabricar la composición inmunogénica de las reivindicaciones 1-11 o la vacuna de la reivindicación 12 que comprende la etapa de aislar el LOS L3, combinando el mismo opcionalmente con LOS L2 y/o L10 y/o L4 aislados en la forma apropiada y formular el LOS L3 con un excipiente farmacéuticamente aceptable.
14. 15. Uso de la composición inmunogénica de las reivindicaciones 1-11 o de la vacuna de la reivindicación 12 en

    la fabricación de un medicamento para la prevención o el tratamiento de enfermedad por inmunotipo L3 de N. 15 meningitidis.
15. 16. El uso de la reivindicación 15, en el que la enfermedad por inmunotipo L3 de N. meningitidis está provocada por una cepa con LOS que está: O-acetilado en el resto GlcNac unido a su resto Heptosa II, no O-acetilado en el resto GlcNac unido a su resto Heptosa II o está parcialmente O-acetilado y parcialmente no O-acetilado en el resto GlcNac unido a su resto Heptosa II.