CN103002910A - 疫苗组合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及奈瑟球菌免疫原性组合物和疫苗领域、它们的生产和这样的组合物在药物中的用途。所述的嵌合fHbp(因子H结合蛋白)蛋白和包含所述蛋白的组合物会克服针对fHbp的免疫应答的问题，所述免疫应答对衍生出所述fHbp的脑膜炎球菌菌株是特异性的。

Description

疫苗组合物

技术领域

本公开内容涉及奈瑟球菌免疫原性组合物和疫苗、它们的生产和这样的组合物在药物中的用途的领域。

背景技术

细菌中的奈瑟球菌菌株是很多人类病变的致病因子，需要研制出可抗这些致病因子的有效疫苗。特别是，淋病奈瑟球菌（Neisseria gonorrhoeae）和脑膜炎奈瑟球菌（Neisseria meningitidis）所引起的病变可通过接种疫苗而治疗。

脑膜炎奈瑟球菌是一种重要的病原体，特别是在儿童和年轻人中。败血症和脑膜炎是侵入性脑膜炎球菌病（IMD）的最严重威胁生命的形式。这种疾病由于其较高的发病率和死亡率已经成为全世界的健康问题。

根据荚膜多糖的抗原差异，已经鉴定出了13种脑膜炎奈瑟球菌血清群，最普遍的是A、B和C，它们导致全世界90％的该疾病。血清群B是欧洲、美国和拉丁美洲几个国家中脑膜炎球菌病的最普遍原因。

已经研制出了基于血清群A、C、W和Y的荚膜多糖的疫苗，它们表现出可控制脑膜炎球菌病的暴发(Peltola等人，1985 Pediatrics 76；91-96)。然而，血清群B的免疫原性较差，且仅主要诱导IgM同种型的短暂抗体应答(Ala’Aldeen D和Cartwright K 1996，J. Infect. 33；153-157)。因此，目前还没有能够抗导致绝大多数温带国家中大多数该疾病的血清群B脑膜炎球菌的广泛有效的疫苗。尤为严重的是，血清型B疾病在欧洲、澳洲和美洲的发生率日益增加，主要是在5岁以下的儿童中。抗血清群B脑膜炎球菌的疫苗的研制提出了一个特有的困难，即由于多糖荚膜与人神经细胞粘着分子的免疫学相似性导致其免疫原性较差。因此，已经将疫苗生产的方案集中于脑膜炎球菌外膜的表面暴露结构，但却已经被这些抗原在菌株之间的显著变异所阻碍。

一种测试中的抗原是fHbp。但是，已经再次发现针对fHbp的免疫应答对衍生出所述fHbp的脑膜炎球菌菌株是特异性的。

Lewis等人公开了fHbp作为疫苗候选物的状态。Expert Reviews Vaccines 8(6)第729页, (2009)。

Beernink和Granoff (“Bactericidal antibody induced by meningococcal recombinant chimeric因子H结合protein vaccines”Inf. & Imm. 第76卷, 第2568-2575页, 2008)公开了工程设计含有fhbp的不同结构域的嵌合fHbp分子的可能性，这基于所述蛋白的3个结构域模型，也基于所述蛋白分类成3个主要抗原组。

最近的尝试还已经提示，抗-fH MAb杀菌活性的模型需要针对非重叠表位的2种MAb的结合，这会活化经典的补体途径以及抑制fH结合(P.T. Beernink等人, 2008“Fine antigenic specificity and cooperative bactericidal activity of monoclonal antibodies directed at the meningococcal vaccine candidate Factor H-binding protein”Inf. & Imm. 第76卷, 第4232-4240页)。

WO/2009/114485公开了含有异源b结构域的嵌合因子H结合蛋白(fHbp)和使用方法。

发明内容

本文提供了嵌合fHbp蛋白和包含所述蛋白的组合物。

本公开内容涉及包含氨基酸序列F1和F2的融合蛋白，其中F1是第一个fHbp氨基酸序列的N-端片段；F2是第二个fHbp氨基酸序列的C-端片段；所述第一个和第二个fHbp氨基酸序列来自不同的fHbp家族，其中片段F1和F2的长度都是至少10个氨基酸；其中所述融合蛋白能够引发针对两个fHbp家族的抗体。

在另一个方面，本公开内容涉及编码本公开内容的融合蛋白的多核苷酸。

在另一个方面，本公开内容涉及重组宿主细胞，其含有本公开内容的多核酸。

在另一个方面，本公开内容涉及分离的外膜囊泡，其包含本文公开的融合蛋白。

在另一个方面，本公开内容涉及生产融合蛋白的方法，所述方法包括：在外膜囊泡中表达本文公开的融合蛋白。

在另一个方面，本公开内容涉及生产融合蛋白的方法，所述方法包括：在适合表达嵌合fHBP的条件下，培养含有本公开内容的多核酸的重组宿主细胞；和分离所述嵌合fHBP。

在另一个方面，本公开内容涉及药物组合物，其包含本公开内容的融合蛋白和药学上可接受的赋形剂。

在另一个方面，本公开内容涉及疫苗，其包含本公开内容的融合蛋白和药学上可接受的赋形剂。

在另一个方面，本公开内容涉及治疗或预防脑膜炎奈瑟球菌感染或疾病的方法，所述方法包括：给有此需要的宿主施用保护剂量的本公开内容的疫苗。

在另一个方面，本公开内容涉及：用于治疗或预防脑膜炎奈瑟球菌感染或疾病的本公开内容的融合蛋白，和本公开内容的融合蛋白在药物生产中的用途，所述药物用于治疗或预防脑膜炎奈瑟球菌感染或疾病。

附图说明

图1 - 使用fHbp (菌株MC58 - 全长序列的氨基酸残基1-202)、LVL491、LVL511、LVL512、LVL513和LVL514进行的蛋白序列比对。

图2 - 使用fHbp (菌株8047 -全长序列的氨基酸残基157-274)、LVL491、LVL511、LVL512、LVL513和LVL514进行的蛋白序列比对。

图3 -显示了融合体A的潜在结构。图例：白色- 来自菌株MC58 (fHbp家族B)的蛋白序列；黑色- 来自菌株8047 (fHbp家族A)的蛋白序列；灰色(箭头) - Glu217和Thr238向丙氨酸的2点突变。

图4 -显示了融合体B的潜在结构。图例：白色- 来自菌株MC58 (fHbp家族B)的蛋白序列；黑色- 来自菌株8047 (fHbp家族A)的蛋白序列；灰色(箭头) - Glu217向Ala的点突变。

图5 -显示了融合体C的潜在结构。图例：白色- 来自菌株MC58 (fHbp家族B)的蛋白序列；黑色- 来自菌株8047 (fHbp家族A)的蛋白序列；灰色- Glu218和Thr239向丙氨酸的2点突变；灰色(+ 箭头) - Asp146、Lys148和Ser204分别向Glu146、Arg149和Arg204的3点突变；添加Gly148。

图6 -显示了融合体E的潜在结构。图例：白色-来自菌株MC58 (fHbp家族B)的蛋白序列；黑色- 来自菌株8047 (fHbp家族A)的蛋白序列；灰色- Glu218和Thr239向丙氨酸的2点突变；灰色- Asp146、Lys148和Ser204分别向Glu146、Arg149和Arg204的2点突变；添加Gly148；灰色+ 箭头- Arg230向Lys230的突变。

图7 -显示了TdfI结构。

图8 -显示了表达不同水平的fHBP的完整细胞的蛋白印迹：高(线1)、中等(线7)、低(线5)和不可检测(线2、3、4、6)。

序列标识符

在序列表中包括下述序列标识符，并在说明书提及：

SEQ ID NO: 1 - B族fHbp蛋白的成熟序列的氨基酸残基1-137

SEQ ID NO: 2 - A族fHbp蛋白的成熟序列的氨基酸残基136-254

SEQ ID NO: 3–在113 - 135区域的来自A族的共有序列

SEQ ID NO: 4–在113 - 135区域的来自B族的共有序列

SEQ ID NO: 5–指示家族A的在位置242-246内的氨基酸

SEQ ID NO: 6 - 指示家族B的在位置242-246内的氨基酸

SEQ ID NO: 7 - 来自菌株MC58的成熟的B族fHbp序列

SEQ ID NO: 8–来自菌株MC58的成熟的B族fHbp序列的核酸序列

SEQ ID NO: 9–来自菌株8047的成熟的A族fHbp序列

SEQ ID NO: 10–来自菌株8047的成熟的A族fHbp序列的核酸序列

SEQ ID NO: 11 -全长B族fHbp序列的氨基酸66-72

SEQ ID NO: 12 - 组氨酸亲和标签序列

SEQ ID NO: 13–在A和B族中相同的肽GEHT (在A族的8047成熟序列和B族的MC 58成熟序列中的氨基酸残基136 - 139)

SEQ ID NO: 14–来自菌株8047的全长fHbp序列的氨基酸27-273，具有组氨酸标签(LVL489)

SEQ ID NO: 15 - LVL489的核酸序列

SEQ ID NO: 16 -来自菌株MC58的全长fHbp序列的氨基酸73-320，具有组氨酸标签(LVL490)

SEQ ID NO: 17 - LVL490的核酸序列

SEQ ID NO: 18 - 融合蛋白LVL491的氨基酸序列

SEQ ID NO: 19 - LVL491的核酸序列

SEQ ID NO: 20 - 融合蛋白A (LVL511)氨基酸序列

SEQ ID NO: 21 - 融合蛋白A的核酸序列

SEQ ID NO: 22 - 融合蛋白B (LVL512)氨基酸序列

SEQ ID NO: 23 - 融合蛋白B的核酸序列

SEQ ID NO: 24 - 融合蛋白C (LVL513)氨基酸序列

SEQ ID NO: 25 - 融合蛋白C的核酸序列

SEQ ID NO: 26 - 融合蛋白E (LVL514)氨基酸序列

SEQ ID NO: 27 - 融合蛋白E的核酸序列。

具体实施方式

本公开内容一般地涉及嵌合的fHbp蛋白。

术语嵌合的fHbp蛋白和fHbp融合蛋白可以在本文中可互换地使用，表示本文公开的包含来自不同fHbp家族的区域的蛋白。

本公开内容鉴别了2个fHbp蛋白家族A和B，因而允许用来自2个家族的序列构建嵌合的fHbp融合蛋白，从而提供针对脑膜炎奈瑟球菌感染或疾病的保护。

在第一个方面，本公开内容涉及包含氨基酸序列F1和F2的融合蛋白，其中F1是第一个fHbp氨基酸序列的N-端片段，且F2是第二个fHbp氨基酸序列的C-端片段。

在一个方面，所述融合蛋白包含来自fHbp家族B的F1 N-端片段和来自fHbp家族A的F2 C-端片段。

所述F1片段可以含有来自fHbp的N端部分（适当地，来自fHbp的残基1-139）的任意10个邻接氨基酸，为了避免疑问，其不一定包括fHbp的氨基酸1-10。类似地，所述F2片段可以含有来自fHbp的C端部分（适当地，从fHbp的残基139开始）的任意10个邻接氨基酸，为了避免疑问，其不一定包括fHbp的最后10个氨基酸。

在一个方面，F1和F2的长度是至少10个氨基酸，但是适当地包含20个氨基酸，适当地30个氨基酸，适当地40个氨基酸，适当地50个氨基酸，适当地60个氨基酸，适当地70个氨基酸，适当地80个氨基酸，适当地90个氨基酸，适当地100个氨基酸，适当地110个氨基酸，适当地120个氨基酸，适当地邻接地取自fHbp蛋白的氨基酸序列。

在一个方面，当关于第一个和第二个fHbp家族序列之间的比对进行考虑时，所述F1和F2片段不包含重叠序列。

在一个方面，所述融合蛋白F1 + F2具有至少200个氨基酸（适当地至少210、至少220、至少230、至少240、至少250个氨基酸）的组合长度，且在一个方面，是254个氨基酸的全长FHBP蛋白。

本公开内容的任何融合蛋白的2个部分F1和F2不需要直接相连，且可以包括在F1和F2之间的连接物。但是，在一个方面，所述F1和F2部分直接相连。

任选地，所述融合蛋白可以具有添加、置换或删除。

在一个方面，所述序列的F1和F2部分都包含免疫原性的表位。

在一个方面，所述序列的F1或F2部分含有适用于制备针对A族和B族fHbp蛋白的抗体的表位。

F1和F2适当地是选自天然存在的fHBP序列的片段，适当地来自奈瑟球菌属，适当地来自脑膜炎奈瑟球菌。

在一个方面，N端片段可以与fHbp家族B蛋白的成熟序列的140个N-端氨基酸（适当地，fHbp蛋白的成熟序列的N-端135、136、137、138或139个氨基酸的全部或一部分）等效或是其一部分。

B族菌株的氨基酸编号通常参照下面列出的MC58序列给出。通过与该序列的比对，可以容易地鉴别在其它家族成员中的等效位置。

B族fHbp蛋白的成熟序列的氨基酸残基1-137代表全长B族fHbp序列的氨基酸残基66-202。

合适的片段是B族fHbp蛋白的成熟序列的氨基酸残基1-135、1-136、1-137、1-138和1-139、8-135、8-136、8-137、8-138或8-139。

成熟序列的残基1-137由下面Seq ID No. 1所示的B族菌株MC58或B族其它菌株的等效区域来表示。

在一个方面，所述F1 N端片段的成熟序列的前7个氨基酸中的一个或多个被组氨酸标签或其它亲和标签替代，以促进纯化。在另一个方面，将组氨酸标签或其它亲和标签添加在成熟蛋白的N端以促进纯化。

在一个方面，C-端片段与A族fHbp蛋白的成熟fHbp序列的氨基酸130–254（适当地，所述成熟序列的氨基酸136 - 254、137-254、138 - 254、139 - 254或140-254的全部或一部分）等效或是其一部分。

A族菌株的氨基酸编号通常参照菌株8047序列给出。通过与该序列的比对，可以容易地鉴别在其它家族成员中的等效位置。

A族fHbp蛋白的成熟序列的氨基酸残基136-254代表全长A族fHbp序列的氨基酸残基155-273。

一些合适的片段是A族fHbp蛋白的成熟序列的氨基酸残基136 - 254、137-254、138 - 254、139 - 254或140-254。所述成熟序列的残基136-254由下面Seq ID No. 2所示的A族菌株8047或A族其它菌株的等效区域来表示。

氨基酸残基GEHT (SEQ ID NO. 13)在A和B族之间是保守的(在家族A的8047和家族B的MC 58中的氨基酸残基136 - 139)，且因此可以被包括在任一个家族的氨基酸序列中。

本公开内容的融合蛋白也可以是下述蛋白：其与这样的融合蛋白具有至少80%序列同一性，适当地至少85%、至少90%、至少95%或更高，并对fHbp A和B菌株是免疫原性的。

在本文中，将FHbp蛋白分成2个家族A和B。

在一个方面，所述家族分类公开在：“Sequence Diversity of the Factor H Binding Protein Vaccine Candidate in Epidemiologically Relevant Strains of Serogroup B Neisseria meningitides. The Journal of infectious diseases 2009, 第200卷, 第3期, 第379-389页”。

在一个方面，在所述成熟序列的区域136–254上评估家族同一性。

在一个方面，基于从成熟蛋白的氨基酸136至C端的fHbp序列，在相同家族中的蛋白具有> 80%同一性。

在一个方面，基于从成熟蛋白的氨基酸136至C端的fHbp序列，在不同家族中的蛋白具有50 - 75%同一性。

在一个方面，在所述成熟序列的区域113 - 135上评估家族同一性。

在一个方面，基于fHbp的成熟氨基酸序列的区域113 - 135，在相同家族中的蛋白具有> 69%同一性。

在一个方面，基于fHbp的成熟氨基酸序列的区域113 - 135，在不同家族中的蛋白具有< 20%同一性。

在一个方面，通过一个或多个下述氨基酸的存在，可以区分A和B族:

在一个方面，A和B族在区域113–135中包含下述共有序列：

B族序列的一个实例(SEQ ID NO. 7)是菌株MC58：

在该序列内被鉴别为具有潜在重要性的氨基酸包括：

● Gly121和Lys122：MAb JAR3和5的结合所必需的残基

● 肽Glu146 → Arg149和Arg204：MAb502的结合所必需的残基

● 残基Pro145 、 Phe227 、 Gly228 、 Lys230 和 Glu233：潜在地在MAb502识别中起微小作用

● Glu218和Glu239 (*)：参与因子H结合

对应的核酸序列(SEQ ID No. 8)是：

B族菌株的其它实例包括：菌株H44/76、M982、M060240006、03s-0408，且其它实例是技术人员熟知的。

A族序列的一个实例(SEQ ID NO. 9)是菌株8047：

在该序列内被鉴别为具有潜在重要性的氨基酸包括：

● Ala173：MAb JAR11的结合所必需的残基

● Lys179和Glu191：MAb JAR10的结合所必需的残基

● Ser215：MAb JAR13的结合所必需的残基

● Glu217 (*)和Glu238：参与因子H结合。注释：在有些菌株中，第二个谷氨酸可以被Thr238 (*)替代(在菌株8047中就是如此)。这些菌株也可以结合因子H。

对应的核酸序列(SEQ ID NO. 10)是：

A族菌株的其它实例包括：菌株M1239、M981、M08_240117、M97252153，且其它实例是技术人员熟知的。

所述融合蛋白合适地能够引发针对本文定义的两个家族成员A和B的抗体。在一个方面，所述融合蛋白能够引发中和抗体，适当地响应于表达A族或B族fHbp分子的脑膜炎奈瑟球菌的感染。

适当地，当以有效剂量施用时，所述嵌合蛋白会引发针对奈瑟球菌感染的保护性免疫应答，更适当地，可保护免于脑膜炎奈瑟球菌血清群B感染。

在一个方面，所述融合蛋白与下述抗体是免疫应答性的：针对奈瑟球菌全长fHbp蛋白产生的抗体，或用奈瑟球菌感染哺乳动物宿主产生的抗体。

在一个方面，嵌合蛋白能够引发杀菌抗体的生成，所述杀菌抗体介导表达fHbp A或fHbp B的菌株的补体杀死。

在一个方面，本公开内容的融合蛋白具有至少一个防止因子H结合的突变。

在一个方面，所述突变是删除、插入或置换。因子H结合可以是人因子H结合，例如通过在下述文献中公开的表面ELISA或共振来评估：M.C. Schneider等人, 2009“Neisseria meningitidis recruits factor H using protein mimicry of host carbohydrates”Nature Letters。

在一个方面，所述防止因子H结合的突变被包含在fHbp的氨基酸136–254的C-端F2片段内。

在一个方面，所述防止因子H结合的突变包括：将fHbp中的至少一个Glu置换成Ala。在另一个方面，所述防止因子H结合的突变包括，置换被包含在F2片段内的一个或多个下述残基，以防止fHbp结合：fHbp家族A的Glu 217、Glu/Thr 238；fHbp家族B的Glu 218、Glu 239。在一个方面，一个或多个所述残基突变成丙氨酸。

通过ELISA可以评估因子H结合。例如，可以将fHbp多肽(嵌合的或非嵌合的)包被在微量培养板上。饱和和洗涤以后，在微孔中温育纯化的人fH或重组人fH，并如下揭示与fHBP的结合(在洗涤以后)：加入针对人fH的兔抗体，随后用与过氧化物酶缀合的抗-兔IgG温育。

在一个方面，在F1片段是来自家族B的情况下，所述F1片段包含在位置121处的Gly和在位置122处的Lys (使用MC58菌株作为B族参照菌株进行编号)。

在一个方面，所述融合蛋白能够结合抗体JAR3或JAR5。

在一个方面，在F2片段是来自家族A的情况下，所述F2片段包含一个或多个或所有下述氨基酸(使用8047菌株作为A族参照菌株进行编号)：Ala 173；Ser 215；Lys 179和Glu 191，且在一个方面，包含Lys 179和Glu 191。在一个方面，所述融合蛋白能够结合抗体JAR10、JAR11、JAR13中的一种或多种。

在一个方面，在F2片段是来自家族A的情况下，将所述融合蛋白构建成包含一个或多个或所有下述氨基酸来替代天然存在的氨基酸：Ala217，任选地在位置238处的Ala，Glu146，在谷氨酰胺后面插入在位置146处的Gly (与野生型8047序列相比，以后的编号移动+1)，Gly148，Arg149和Arg204 (使用MC58菌株作为B族参照菌株进行编号)。在一个方面，所述融合蛋白能够结合MAb502。

在一个方面，在F2片段是来自家族A的情况下，那么所述片段可以包含一个或多个或所有的pro 145、phe 227、gly 228、lys 230和glu 233。在一个方面，所述融合蛋白能够结合MAb502。

在下述出版物中提及了上述的抗体，这些出版物通过引用完整地并入本文：P.T. Beernink和D.M. Granoff, 2008“Bactericidal antibody induced by meningococcals recombinant chimeric factor H-binding protein vaccines”Inf. & Imm. 第76卷, 第2568-2575页; P.T. Beernink等人, 2008“Fine antigenic specificity and cooperative bactericidal activity of monoclonal antibodies directed at the meningococcal vaccine candidate Factor H-binding protein”Inf. & Imm. 第76卷, 第4232-4240页; M. Scarselli等人, 2009“Epitope mapping of a bactericidal monoclonal antibody against the factor H binding protein of Neisseria meningitidis”J. Mol. Biol. 第386卷, 第97-108页)。在一个方面，fHbp包括在任意这样的出版物中公开的具有相关的免疫原性的氨基酸。

在一个方面，与没有这些修饰的嵌合蛋白相比，包含上面定义的一个或多个氨基酸改变的本公开内容的嵌合蛋白表现出针对表达fHbp的菌株的杀菌滴度的增加。

在一个方面，本公开内容的融合蛋白包含：来自成熟的B族fHbp蛋白的残基1-135、1-136、1-137、1-138或1-139，和成熟的A族fHbp蛋白的残基136-254、137-254、138-254、139-254或140-254，且不能结合因子H。

在一个方面，本公开内容的融合蛋白包含：来自成熟的B族fHbp蛋白的残基8-135、8-136、8-137、8-138或8-139，任选地具有组氨酸标签，和成熟的A族fHbp蛋白的残基136-254、137-254、138-254、139-254或140-254，且不能结合因子H。

在一个方面，来自成熟的B族fHbp蛋白的前7个氨基酸中的一个或多个不存在，且可以被组氨酸标签或其它亲和标签替代，以促进纯化。在这样的情况下，所述融合蛋白的B族fHbp部分从所述成熟序列的残基2、3、4、5、6或7处开始。

在一个方面，所述融合多肽包含：来自B族fHbp蛋白的残基1-135、残基1-137或残基1-139，例如具有MC58序列，和A族fHbp蛋白的残基136-254、138-254或140-254，例如具有菌株8047的序列，所述融合蛋白被构建成包含下述氨基酸来替代天然存在的氨基酸：来自菌株MC58的B族成熟蛋白序列的Ala217，任选地在位置238处的Ala，Glu146，在谷氨酰胺后面插入在位置146处的Gly (与野生型8047序列相比，以后的编号移动+1)，Gly148，Arg149和Arg204。这些氨基酸存在于下面例证的构建体C中。在一个方面，所述融合多肽另外包含一个或多个或所有的Pro 145、Phe 227、Gly 228、Lys 230和Glu 233。这些氨基酸存在于下面例证的构建体E中。

在一个方面，所述融合蛋白是在本文中被描述为LVL491 (SEQ ID No. 18)的融合蛋白。在一个方面，所述融合多肽选自本文公开的融合蛋白A、B、C、D、E或F，具体地选自融合蛋白A (SEQ ID No. 20)、B (SEQ ID NO. 22)、C (SEQ ID No. 24)和E (SEQID NO. 26)。

本公开内容的融合蛋白可以与来自脑膜炎奈瑟球菌的其它抗原联合使用。

在本文中提及的或要求保护的任何具体抗原包括：该抗原的所有删除、插入和置换突变，或本文所述的抗原的其它具体变体，或(在所述抗原是多肽的情况下)与所述多肽具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%同一性的多肽。在有些方面，在该段落中描述的抗原或多肽是免疫原性的。

合适的抗原可以选自下述蛋白类型：包括粘附素、自体转运蛋白、毒素、完整的外膜蛋白和Fe或Zn (金属离子)获得蛋白。

在一个方面，本公开内容提供了免疫原性组合物，其包含至少或恰好两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种或十种不同的奈瑟球菌抗原。最适当地，这些抗原选自下列的至少或恰好两组、三组、四组或五组选自下述的蛋白：

奈瑟球菌粘附素，其选自：FhaB、NspA PilC、Hsf、Hap、MafA、MafB、Omp26、NMB 0315、NMB 0995、NMB 1119和NadA；

奈瑟球菌自体转运蛋白，其选自：Hsf、Hap、IgA蛋白酶、AspA和NadA；

奈瑟球菌毒素，其选自：FrpA、FrpC、FrpA/C、VapD、NM-ADPRT以及LPS免疫型L2和LPS免疫型L3之一或两者；

奈瑟球菌Fe获得蛋白，其选自：TbpA、TbpB、LbpA、LbpB、HpuA、HpuB、Lipo28 (GNA2132)、Sibp、NMB0293、FbpA、Bcp、BfrA、BfrB和P2086 (XthA)或奈瑟球菌Zn获得蛋白诸如TdfI (NMB0964)；和

奈瑟球菌膜相关蛋白，适当地外膜蛋白，具体地完整的外膜蛋白，其选自：PilQ、OMP85、FhaC、NspA、TbpA、LbpA、TspA、TspB、TdfH、PorB、MItA、HpuB、HimD、HisD、GNA1870、OstA、HlpA (GNA1946)、NMB 1124、NMB 1162、NMB 1220、NMB 1313、NMB 1953、HtrA和PldA (OmplA)。

本发明的抗原都是分离的，即它们被人工改变。在一个方面，它们被纯化至某种程度，最适当地超过40、50、60、70、80、90、95或99%纯度（在与本公开内容的免疫原性组合物的其它组分组合前）。

在本文中具体提到蛋白的情况下，适当地是指天然的、全长的蛋白及其天然变体（即，可从奈瑟球菌属、适当地脑膜炎球菌菌株获得的天然蛋白），但是它还可包括其抗原性片段（特别是在亚单位疫苗的背景下）。这些是含有或包括邻接地取自所述蛋白的氨基酸序列的至少15个氨基酸，适当地至少20个氨基酸、至少30个氨基酸、至少40个氨基酸或至少50个氨基酸的片段（在本文中常常具体描述）。抗原性片段还可以是免疫原性片段。进一步预见到，本文提及的蛋白和蛋白序列包括这样的多肽：所述多肽包含来自所述蛋白序列或来自所述蛋白的氨基酸序列的7、10、12、15、20、30、40或50（或更多）个邻接氨基酸的免疫原性片段（任选地，其中所述免疫原性片段能够引发（如果必要的话，当与蛋白载体偶联时）免疫应答，所述免疫应答可以识别所述蛋白或所述蛋白序列）。此外，抗原性片段是指与下述抗体是免疫应答性的：针对奈瑟球菌全长蛋白产生的抗体，或用奈瑟球菌感染哺乳动物宿主产生的抗体。抗原性片段还包括这样的片段：当以有效剂量施用时，其引发针对奈瑟球菌感染的保护性免疫应答，更适当地，它可保护免于脑膜炎奈瑟球菌和/或淋病奈瑟球菌感染，最适当地，它可保护免于脑膜炎奈瑟球菌血清群B感染。

本发明还包括奈瑟球菌蛋白的重组融合蛋白或其片段。这些可将不同的奈瑟球菌蛋白或其片段组合在同一多肽中。或者，本公开内容还包括奈瑟球菌蛋白的单个融合蛋白或其片段，作为含有异源序列的融合蛋白，所述异源序列例如T-细胞表位或纯化标签的供给者，例如：β-半乳糖苷酶、谷胱甘肽-S-转移酶、绿色荧光蛋白(GFP)，表位标签诸如FLAG、myc标签、多组氨酸，或病毒表面蛋白如流感病毒血细胞凝集素、破伤风类毒素、白喉类毒素、CRM197。

本公开内容的抗原

NMB参照是指可从www.neisseria.org访问的序列参照号。

上述5类蛋白的细节被包含在WO/2004/014418中，它通过引用完整地并入本文。

1. 粘附素：

粘附素包括FhaB(WO 98/02547)、NadA(J. Exp. Med (2002) 195:1445；NMB 1994)、也可称作NhhA的Hsf(NMB 0992)(WO 99/31132)、Hap(NMB1985)(WO 99/55873)、NspA(WO96/29412)、MafA (NMB 0652)和MafB (NMB 0643)(Annu Rev Cell Dev Biol. 16；423-457 (2000)；Nature Biotech 20；914-921 (2002))、Omp26(NMB 0181)、NMB 0315、NMB 0995、NMB 1119和PilC (Mol. Microbiol. 1997，23；879-892)。这些是参与奈瑟球菌与宿主细胞表面结合的蛋白。Hsf是粘附素的一个实例，同时也是自体转运蛋白。因此本公开内容的免疫原性组合物可包括Hsf与其它自体转运蛋白的组合，其中Hsf发挥其粘附素的作用。这些粘附素可来源于脑膜炎奈瑟球菌或淋病奈瑟球菌或其它奈瑟球菌菌株。本公开内容还包括来源于奈瑟球菌的其它粘附素。

FhaB

此抗原已在WO 98/02547 SEQ ID NO:38(核苷酸3083-9025)中描述-也参见NMB0497。本发明人已经发现，FhaB在诱导单独的抗-粘附抗体方面特别有效，且特别是与本公开内容的其它抗原组合时。虽然可使用全长FhaB，本发明人已经发现，在交叉菌株作用方面，特定的C-端截短物令人惊讶地至少一样有效，且适当地甚至更有效。已经有利地证实，这种截短物更易克隆。本公开内容的FhaB截短物通常与FhaB分子的N-端三分之二（适当地位于位置1200-1600、更适当地位置1300-1500和最适当地位置1430-1440的新C-端）相对应。具体的实施方案具有在1433或1436处的C-端。因此，本公开内容的这种FhaB截短物和包括这种截短物的疫苗是本公开内容的独立方面，而且是本公开内容的组合免疫原性组合物的组分。N-端还可被截掉最多10、20、30、40或50个氨基酸。

2. 自体转运蛋白

自体转运蛋白通常由信号序列、过客结构域和用于附着外膜的锚定结构域组成。自体转运蛋白的实例包括Hsf(WO 99/31132)(NMB 0992)、HMW、Hia(van Ulsen等人，Immunol. Med. Microbiol. 2001 32；53-64)、Hap(NMB1985)(WO 99/55873；van Ulsen等人，Immunol. Med. Microbiol. 2001 32；53-64)、UspA、UspA2、NadA(NMB 1994)(Comanducci等人，J. Exp. Med. 2002 195；1445-1454)、AspA(Infection and Immunity 2002,70(8)；4447-4461；NMB 1029)、Aida-1样蛋白、SSh-2和Tsh。NadA(J. Exp. Med(2002)195:1445)是自体转运蛋白的另一个实例，同时也是粘附素。本公开内容的免疫原性组合物因此可以包括NadA与粘附素的组合，其中NadA作为自体转运蛋白发挥作用。这些蛋白可来源于脑膜炎奈瑟球菌或淋病奈瑟球菌或其它奈瑟球菌菌株。本公开内容还包括来源于奈瑟球菌属的其它自体转运蛋白。

Hsf

Hsf具有与自体转运蛋白共用的结构。例如，来源于脑膜炎奈瑟球菌菌株H44/76的Hsf由下述部分组成：由氨基酸1-51构成的信号序列，表面暴露且包括可变区(氨基酸52-106、121-124、191-210和230-234)的在成熟蛋白（氨基酸52-479）氨基末端的头区，颈区（氨基酸480-509），疏水的α-螺旋区（氨基酸518-529），和其中4个跨膜链跨越外膜的锚定结构域（氨基酸539-591）。

虽然全长Hsf可用于本公开内容的免疫原性组合物中，但是各种Hsf截短物和缺失物也可适当地使用，这取决于疫苗的类型。

在Hsf用于亚单位疫苗中的情况下，可以使用可溶性过客结构域的一部分；例如氨基酸52-479的完全结构域，最适当地其保守部分，例如氨基酸134-479的特别有利的序列。Hsf的适当形式可被截短，以缺失在WO 01/55182中公开的蛋白的可变区。

适当的变体包括在WO 01/55182中限定的1、2、3、4、或5个可变区的缺失。上述序列和下面描述的那些可在N或C末端的任何一端或两端处伸展或截掉最多1、3、5、7、10或15个氨基酸。

Hsf的适当片段因此包括Hsf的整个头区，适当地包含氨基酸52-473。Hsf的其它适当片段包括表面暴露的头区，它包括一个或多个下列氨基酸序列：52-62、76-93、116-134、147-157、157-175、199-211、230-252、252-270、284-306、328-338、362-391、408-418、430-440和469-479。

在Hsf存在于外膜囊泡制剂中的情况下，它可被表达为全长蛋白，或作为由氨基酸1-51和134-591的融合体组成的变体(产生氨基酸序列134至C末端的成熟外膜蛋白)。Hsf的适当形式可被截短，从而缺失WO 01/55182中公开的蛋白的可变区。适当的变体包括在WO 01/55182中限定的1、2、3、4、或5个可变区的缺失。在一个方面，所述第一个和第二个可变区缺失。

适当的变体是使氨基酸序列52-237或54-237之间的残基缺失，更适当地使氨基酸52-133或55-133之间的残基缺失。所述成熟蛋白可缺少信号肽。

Hap

对来源于脑膜炎奈瑟球菌的Hap-样蛋白进行的计算机分析显示出至少3个结构域。以来源于菌株H44/76的Hap-样序列为例，包含氨基酸1-42的结构域 1编码自体转运蛋白家族特征性的sec依赖性信号肽，包含氨基酸43-950的结构域 2编码很可能表面暴露且易进入免疫系统的过客结构域，包含残基951-C末端（1457）的结构域 3被预测编码可能装配成桶-样结构且被锚定在外膜中的β-链。因为结构域2可能是表面暴露、良好保守的（在所有试验菌株中超过80％）且可作为亚单位抗原在大肠杆菌中产生，因此它代表了目标疫苗候选物。因为结构域2和3很可能是表面暴露且良好保守的(Pizza等人，(2000), Science 287:1816-1820)，因此它们代表了目标疫苗候选物。结构域2被称作过客结构域。

本公开内容的免疫原性组合物可包括全长Hap蛋白，适当地被掺入到OMV制剂中。本公开内容的免疫原性组合物还可包括Hap的过客结构域（在菌株H44/76中，其由氨基酸残基43-950组成）或来自残基43-1178的N-端片段。Hap的这一片段可特别有利地用于本公开内容的亚单位组合物中。Hap过客结构域的上述序列可在N或C末端之一或二者处伸展或截掉最多1、3、5、7、10、15、20、25或30个氨基酸。

3.铁和锌获得蛋白

这些蛋白包括：Tdfl (Done J等人Microbiol 2003，和Turner PC等人Microbiol 2001–加上完整参考文献)、TbpA (NMB 0461) (W092/03467、US5912336、W093/06861和EP586266)、TbpB (NMB 0460) (W093/06861和EP586266)、LbpA (NMB 1540) (Med Microbiol (1999) 32: 1117)、LbpB (NMB 1541) (WO/99/09176)、HpuA (U73112. 2) (Mol Microbiol. 1997,23; 737-749)、HpuB (NC_003116. 1) (Mol Microbiol. 1997,23; 737-749)、也被称作XthA的P2086 (NMB 0399) (13”'International Pathogenic Neisseria Conference 2002)、FbpA (NMB 0634)、FbpB、BfrA (NMB 1207)、BfrB (NMB 1206)、也被称作GNA2132的Lipo28 (NMB 2132)、Sibp (NMB 1882)、HmbR、HemH、Bcp (NMB 0750)、铁(III) ABC转运蛋白-通透酶蛋白(Tettelin等人Science 287; 1809-1815 2000)、铁(III) ABC转运蛋白-周质(Tettelin等人Science 287; 1809-1815 2000)、TonB依赖性的受体(NMB 0964和NMB 0293) (Tettelin等人Science 287; 1809-1815 2000)和转铁蛋白结合蛋白相关蛋白(Tettelin等人Science 287; 1809-1815 2000)。这些蛋白可来源于脑膜炎奈瑟球菌, 淋病奈瑟球菌或其它奈瑟球菌菌株。本公开内容还包括来源于奈瑟球菌属的其它金属离子获得蛋白。

TbpA

TbpA与TbpB相互作用在奈瑟球菌属外膜上形成蛋白复合体，其结合转铁蛋白。在结构上，TbpA包括具有TonB箱的胞内N-端结构域和活塞结构域，该活塞结构域为多个由短胞内环和较长的胞外环连接的跨膜β链。

已经区别了TbpB的两个家族，它们分别具有较高的分子量和较低的分子量。TbpB的高和低分子量形式与TbpA的不同家族结合，可以同源性为基础区别该不同家族。尽管它们的分子量相似，但还是将它们称作高分子量和低分子量家族，这是因为它们与TbpB的高或低分子量形式结合(Rokbi等人，FEMS Microbiol. Lett. 100；51，1993)。术语TbpA(高)和TbpA(低)用于表示TbpA的这两种形式，且与TbpB相似。本公开内容的免疫原性组合物可包括来源于脑膜炎奈瑟球菌血清群A、B、C、Y和W-135的TbpA和TbpB以及来源于包括淋病奈瑟球菌在内的其它细菌的铁获得蛋白。转铁蛋白结合蛋白TbpA和TbpB已经被分别称作Tbp1和Tbp2(Cornelissen等人，Infection and Immunity 65；822，1997)。

TbpA包括若干不同的区。例如，就来源于脑膜炎奈瑟球菌菌株H44/76的TbpA而言，氨基末端的186个氨基酸形成内部球状结构域，22个β链跨越膜，形成β桶结构。

这些是由短胞内环和较大的胞外环连接的。

胞外环2、3和5具有最高程度的序列变异性且环5是表面暴露的。环5和4参与配体结合。

TbpA的适当片段包括TbpA的胞外环。使用来源于脑膜炎奈瑟球菌菌株H44/76的TbpA序列，这些环与环1的氨基酸200-202、环2的氨基酸226-303、环3的氨基酸348-395、环4的氨基酸438-471、环5的氨基酸512-576、环6的氨基酸609-625、环7的氨基酸661-671、环8的氨基酸707-723、环9的氨基酸769-790、环10的氨基酸814-844和环11的氨基酸872-903相对应。在序列对比后，在其它Tbp蛋白中的相应序列也可构成适当片段。最适当的片段可包括构成Tbp的环2、环3、环4或环5的氨基酸序列。

当本公开内容的免疫原性组合物包括TbpA时，它优选地同时包括TbpA（高）和TbpA（低）。

虽然TbpA适当地存在于外膜囊泡(OMV)疫苗中，但它也可以是亚单位疫苗的一部分。例如，可被引入到本公开内容的免疫原性组合物中的分离的铁获得蛋白是本领域众所周知的(WO00/25811)。它们可在细菌宿主中表达，使用去污剂提取（例如2％Elugent），并通过亲和色谱法或使用本领域熟知的标准柱色谱技术纯化(Oakhill等人，Biochem J. 2002 364；613-6)。

当TbpA存在于OMV疫苗中时，它的表达可通过本文中讨论的基因技术增量调节，或可适当地通过亲代菌株在下述铁限制条件下生长而被增量调节。该方法还可导致可变铁-调节蛋白，特别是FrpB的增量调节，其可变为免疫显性的且它因此可按下面所述有利地减量调节这种蛋白（特别是FrpB）的表达（且适当地使编码这种蛋白的基因缺失），以确保本公开内容的免疫原性组合物引发针对存在于大范围奈瑟球菌菌株中的抗原的免疫应答。TbpA（高）和TbpA（低）可能存在于免疫原性组合物中，且这适当地如下实现：将来源于表达TbpA可选择形式的两种菌株的OMV混合。

4. 毒素

毒素包括FrpA(NMB 0585；NMB 1405)、FrpA/C(见下面的定义)、FrpC(NMB 1415；NMB 1405)(WO 92/01460)、NM-ADPRT(NMB 1343)(13^th International Pathogenic Neisseria Conference 2002 Masignani等人，p135)、VapD(NMB 1753)、脂多糖(LPS；也被称作脂寡糖或LOS)免疫型L2和LPS免疫型L3。FrpA和FrpC含有在这两种蛋白之间保守的区域，且所述蛋白的适当片段是含有该保守片段的多肽，适当地含有FrpA/C序列的氨基酸227-1004。这些抗原可来源于脑膜炎奈瑟球菌或淋病奈瑟球菌或其它奈瑟球菌菌株。本公开内容还包括来源于奈瑟球菌属的其它毒素。

在一个替代实施方案中，毒素可包括参与毒性调节的抗原，例如在脂多糖合成中起作用的OstA。

FrpA和FrpC

脑膜炎奈瑟球菌编码两种RTX蛋白，它们被称作FrpA和FrpC，是在铁限制条件下分泌的(Thompson等人，(1993) J. Bacteriol. 175:811-818；Thompson等人，(1993) Infect. Immun.61:2906-2911)。RTX(重复毒素)蛋白家族在靠近它们的C-端处共有下列一致序列的一系列9个氨基酸重复单位：Leu Xaa Gly Gly Xaa Gly (Asn/Asp) Asp Xaa(LXGGXGN_/DDX)。大肠杆菌HlyA中的重复单位被认为是Ca²⁺结合的位点。脑膜炎球菌FrpA和FrpC蛋白，正如在菌株FAM20中所表征的，在它们的中心和C-端区共有广泛的氨基酸相似性但在N-端的相似性（如果有的话）非常有限。

此外，由于9个氨基酸基序的重复(在FrpA中重复13次、在FrpC中重复43次)，在FrpA和FrpC之间保守的区域显示出某些多态性。

本公开内容的免疫原性组合物可包括全长FrpA和/或FrpC，或适当地，含有在FrpA和FrpC之间保守的序列的片段。所述保守序列是由9个氨基酸的重复单位构成。

本公开内容的免疫原性组合物适当地包括多于3个重复单位、多于10个重复单位、多于13个重复单位、多于20个重复单位或多于23个重复单位。

这种截短物具有比全长分子更有利的性质，且包含这种抗原的疫苗形成本公开内容的独立方面，并被掺入到本公开内容的免疫原性组合物中。

在FrpA和FrpC之间保守的序列被命名为FrpA/C，且当FrpA或FrpC形成本公开内容的免疫原性组合物的组分时，可有利地使用FrpA/C。FrpA序列的氨基酸277-1004是适当的保守区。上述序列可以在N或C末端之一或二者处伸展或截掉最多1、3、5、7、10、15、20、25或30个氨基酸。

LPS

LPS(脂多糖，也被称作LOS-脂寡糖)是奈瑟球菌的外膜上的内毒素。已知LPS的多糖部分可诱导杀菌抗体。

LPS寡糖部分内的异质性在不同的奈瑟球菌菌株之间产生结构和抗原多样性(Griffiss等人，Inf. Immun. 1987；55:1792-1800)。这已被用于将脑膜炎球菌菌株细分成12个免疫型(Scholtan等人，J Med Microbiol 1994，41: 236-243)。免疫型L3、L7和L9在免疫学上和在结构上是相似的(或甚至是相同的)，并因此已被命名为L3、7、9(或，为了本说明书的目的，统称为“L3”)。脑膜炎球菌LPS L3、7、9(L3)、L2和L5可通过唾液酸化而被修饰，或通过加入胞苷5'-一磷酸-N-乙酰基神经氨酸而被修饰。虽然L2、L4和L6 LPS在免疫学方面是可区别的，但它们在结构上相似，且在本文中提到L2时，L4或L6在本公开内容的范围内可被任选替代。参见M.P. Jennings等人，Microbiology 1999,145, 3013-3021和Mol Microbiol 2002, 43:931-43，其中进一步例证了LPS的结构和异质性。

当LPS（适当地脑膜炎球菌LPS）被包括在本公开内容的疫苗中时，适当地且有利地存在免疫型L2和L3之一或两者。

LPS适当地存在于外膜囊泡(OMV - 术语'囊泡'和'外膜囊泡' 在本文中可互换地使用)中，适当地其中用低百分比的去污剂（更适当地0-0.5%、0.02- 0.4%、0.04-0. 3%、0.06-0. 2%、0. 08-0. 15%或0.1%，最适当地脱氧胆酸盐[DOC]）提取囊泡，但是还可以是亚单位疫苗的一部分。使用熟知的过程，包括热水-苯酚过程，可分离LPS (Wesphal和Jann Meth. Carbo. Chem. 5; 83-91 1965)。也参见Galanos等人1969, Eur J Biochem 9: 245-249,和Wu等人1987, Anal Bio Chem 160: 281-289。LPS可原样使用，或与T-细胞表位（如破伤风类毒素、白喉类毒素、CRM-197或OMV外膜蛋白）的来源缀合使用。用于缀合分离的LOS的技术也是已知的(见，例如，EP 941738，其通过引用并入本文)。

当LOS(特别是本公开内容的LOS)存在于泡制剂中时，适当地通过使LOS与也存在于泡制剂上的一种或多种外膜蛋白（例如，脑膜炎球菌中的PorA或PorB）缀合的方法，使LOS原位缀合。

该方法可提高泡制剂内LOS抗原的稳定性和/或免疫原性（提供T-细胞帮助）和/或抗原性-因此以其保护性最强的构象为非T-依赖性寡糖免疫原提供T-细胞帮助-如在其天然环境中的、脑膜炎球菌外膜表面上的LOS。此外，LOS在泡内的缀合可导致LOS解毒(脂类A部分被稳定埋藏在外膜中，因此很少引起毒性)。因此，这里提到的从htrB^-或msbB^-突变体中分离泡，或通过向组合物中加入多粘菌素B的无毒肽功能性等价物的解毒方法(见WO 93/14115、WO 95/03327、Velucchi等人，(1997) J Endotoxin Res 4:1-12，和EP 976402，多粘菌素B的无毒肽功能性等价物的进一步描述-特别是(序列KTKCKFLKKC，其中2个半胱氨酸形成二硫键)肽SAEP 2的使用)可能并不是必需的(但其可被加入到组合中用于增加安全性)。因此，发明人已经发现，包括泡的组合物可形成用于治疗或预防由衍生泡的生物所引起疾病的疫苗基础，其中存在于泡中的LOS已以泡内模式与同时存在于泡中的外膜蛋白缀合，其中这种疫苗基本上是无毒的，且能够诱导针对其天然环境中的LOS的T-依赖性杀菌反应。

本公开内容因此进一步提供这种泡内LOS缀合的脑膜炎球菌泡制剂。

这种泡制剂可以分离自目标细菌(见WO 01/09350)，然后经过已知的缀合化学方法，使LOS寡糖部分上的基团(例如，NH₂或COOH)与泡外膜蛋白上的基团（例如，NH₂或COOH）缀合。可使用利用戊二醛、甲醛、或戊二醛/甲醛混合物的交联技术，但在一个方面，使用选择性更强的化学方法，诸如EDAC或EDAC/NHS (J. V. Staros, R. W. Wright和D. M. Swingle. Enhancement by N-hydroxysuccinimide of water- soluble carbodiimide-mediated coupling reactions. Analytical chemistry 156:220-222 (1986)；和Bioconjugates Techniques. Greg T. Hermanson (1996)第l73-176页)。在EP 941738中描述了可使用的、能够在LOS与蛋白分子之间生成共价键的其它缀合化学方法或处理。

在一个方面，泡制剂在没有荚膜多糖存在的条件下缀合。所述泡可从不（按照下面所述天然地或经由突变）产生荚膜多糖的菌株中分离，或可从绝大多数且适当地全部污染荚膜多糖中纯化。以这种方式，泡内LOS缀合反应更加有效。

在一个方面，存在于泡中的超过10、20、30、40、50、60、70、80、90或95%的LOS是交联的/缀合的。

泡内缀合应适当地整合下列方法步骤中的1、2或全部3个步骤：缀合pH应大于pH 7.0，适当地大于或等于pH 7.5（最适当地在pH 9）；在反应过程中应当维持1-5％、适当地2-4％、最适当地约3％蔗糖的条件；在缀合反应中应当将NaCl降到最低，适当地在0. 1M、0. 05M、0. 01M、0. 005M、0. 001M，且最适当地根本不存在。所有这些方法特征可确保在整个缀合过程中泡均保持稳定且保持在溶液中。

EDAC/NHS缀合方法是泡内缀合的适当方法。

EDAC/NHS优于甲醛，甲醛可交联至非常高的程度，由此不利地影响滤过率。EDAC与羧酸（如LOS中的KDO）反应，产生活性酯中间体。在有胺亲核试剂（如外膜蛋白，如PorB中的赖氨酸）存在的条件下，酰胺键是用异脲副产物的释放形成的。然而，EDAC-介导的反应的效能可通过磺基-NHS酯中间体的形成而增加。磺基-NHS酯在水溶液中存在的时间比EDAC单独与羧酸盐反应形成的活性酯要长。因此，更高产率的酰胺键形成可使用这种两阶段方法实现。

在J. V. Staros, R. W. Wright和D. M. Swingle, Enhancement by N-hydroxysuccinimide of water-soluble carbodiimide-mediated coupling reactions. Analytical chemistry 156: 220-222 (1986)；和Bioconjugates Techniques. Greg T. Hermanson (1996)第l73-176页中，讨论了EDAC/NHS缀合。在一个方面，在反应中使用0.01-5mg EDAC/mg泡、更适当地0.05-1mg EDAC/mg泡。所用EDAC的量取决于存在于样品中的LOS量，而其又依次取决于用于提取泡的脱氧胆酸盐(DOC)%。在低%DOC(例如，0.1%)下，使用较大用量的EDAC(1mg/mg及以上)，然而在高%DOC(例如0.5%)下，使用较小用量的EDAC(0.025-0.lmg/mg)以避免太多泡间交联。

因此，本公开内容的优选方法是，用于产生泡内缀合的LOS（适当地脑膜炎球菌）的方法，该方法包括下述步骤：在有EDAC/NHS存在下，在pH 7.0-pH 9.0（适当地约pH 7.5）的pH，在1-5% (适当地约3%)蔗糖中，且任选在基本上没有NaCl（如上所述）的条件下，使泡缀合，并从反应混合物中分离缀合的泡。

所述反应随后使用抗-LOS（例如，抗-L2或抗-L3）mAb在反应混合物的蛋白质分离凝胶上进行，其显示随着反应时间的进行，泡中LOS的比例增大，LOS的分子量增加。

使用这种技术可回收的泡产率99%。

人们发现EDAC是一种极好的泡内交联剂，这是因为它可使LOS与OMP充分交联，用于提高LOS T-依赖性免疫原性，但不会使它交联至非常高的程度而导致如滤过率较差、聚集和泡间交联的问题发生。所产生的泡的形态学与未缀合的泡相似（利用电子显微镜）。此外，上述方案可避免发生过度交联(其可降低天然存在于泡表面上的保护性OMP，例如TbpA或Hsf的免疫原性)。

优选地衍生泡的脑膜炎球菌是不能产生荚膜多糖的突变株(例如，下述突变株的其中一种，特别是siaD^-)。还优选地可有效抗脑膜炎球菌病的免疫原性组合物同时包含L2和L3泡，其中L2和L3 LOS均与泡外膜蛋白缀合。此外，优选地泡内缀合泡中的LOS结构与从lgtB^-脑膜炎球菌菌株衍生的一致（如下所述）。最适当地免疫原性组合物包括泡内缀合的泡：来源于不能产生荚膜多糖且是lgtB^-的突变脑膜炎球菌菌株；包含来源于不能产生荚膜多糖的突变脑膜炎球菌菌株的L2和L3泡；包含来源于lgtB^-突变脑膜炎球菌菌株的L2和L3泡；或最适当地包含来源于不能产生荚膜多糖且是lgtB^-的突变脑膜炎球菌菌株的L2和L3泡。

可用于本公开内容的一般L3脑膜炎球菌菌株是H44/76 menB菌株。一般的L2菌株是B16B6 menB菌株或39E脑膜炎球菌C型菌株。

如上所述，本公开内容的泡已通过缀合作用被解毒至一定程度，且无需进一步解毒，然而进一步的解毒方法可用于增加安全性，例如，使用来源于htrB^-或msbB^-脑膜炎球菌菌株的泡或向泡组合物中加入多粘菌素B的无毒肽功能性等价物[与脂类A具有较高亲和性的分子](适当地SEAP 2)（如上所述）。

在上述方法中，提供脑膜炎球菌泡及含有泡的免疫原性组合物，其具有重要的抗原LOS，该抗原基本上无毒，没有自身免疫性问题，具有T-依赖性特征，存在于其天然环境中，且能够诱导针对超过90％脑膜炎球菌菌株的杀菌抗体应答(在L2+L3组合物的情况下)。

在一个方面，泡内LOS缀合应整合下列方法步骤中的1、2、或全部3个步骤：缀合pH应大于pH 7.0，适当地大于或等于pH 7.5（最适当地在pH 9）；在反应过程中应当维持1-5％、适当地2-4％、最适当地约3％蔗糖的条件；在缀合反应中应当将NaCl降到最低，适当地在0. 1M、0. 05M、0. 01M、0. 005M、0. 001M、且最适当地根本不存在。所有这些方法特征可确保在整个缀合过程中泡保持稳定且保持于溶液中。

虽然可通过各种技术和化学方法使LOS与外膜蛋白在泡内缀合，但EDAC/NHS缀合方法是泡内缀合的适当地方法。EDAC/NHS优于甲醛，甲醛可交联至非常高的程度，由此对滤过率有不利的影响。EDAC与羧酸反应，产生活性酯中间体。

在有胺亲核试剂存在的条件下，酰胺键是用异脲副产物的释放形成的。然而，EDAC-介导的反应的效能可通过磺基-NHS酯中间体的形成而增加。磺基-NHS酯在水溶液中存在的时间比EDAC单独与羧酸盐反应形成的活性酯要长。因此，更高产率的酰胺键形成可使用这种两阶段方法实现。在J. V. Staros, R. W. Wright和D. M. Swingle, Enhancement by N-hydroxysuccinimide of water-soluble carbodiimide-mediated coupling reactions. Analytical chemistry 156: 220-222 (1986)；和Bioconjugates Techniques. Greg T. Hermanson (1996)第l73-176页中，讨论了EDAC/NHS缀合。

5. 完整的外膜蛋白

奈瑟球菌蛋白的其它种类也可以是包括在本公开内容的奈瑟球菌疫苗中的候选物，且能够以令人吃惊的有效方式与其它抗原组合。膜相关蛋白（特别是完整膜蛋白，最有利地是外膜蛋白，特别是完整的外膜蛋白）可用于本公开内容的组合物中。这种蛋白的一个实例是也被称作Omp IA的PIDA (NMB 0464) (WO00/15801)，其是奈瑟球菌磷脂酶外膜蛋白。其它实例是TspA (NMB 0341) (Infect. Immun. 1999,67; 3533-3541)和TspB (T- 细胞刺激蛋白) (WO 00/03003; NMB 1548, NMB 1628或NMB 1747)。

其它实例包括PilQ (NMB 1812) (W099/61620)、也称作D15-的OMP85- (NMB 0182) (WO00/23593)、NspA (U52066) (W096/29412)、FhaC (NMB 0496或NMB 1780)、PorB (NMB 2039) (Mol. Biol. Evol. 12; 363-370、1995)、HpuB (NC_003116. 1)、TdfH (NMB 1497) (Microbiology 2001、147; 1277-1290)、OstA (NMB 0280)、也称作GNA33和Lipo30的MItA (NMB0033)、HtrA (NMB 0532; WO 99/55872)、HimD (NMB 1302)、HisD (NMB 1581)、GNA 1870 (NMB 1870)、HlpA (NMB 1946)、NMB 1124、NMB 1162、NMB 1220、NMB 1313、NMB 1953、HtrA、TbpA (NMB 0461) (W092/03467)和TdfI (NMB0964) (也参见上面的铁和锌获得蛋白)和LbpA (NMB 1541)。

OMP85

本公开内容的免疫原性组合物可包括全长OMP85，适当地作为OMV制剂的一部分。OMP85的片段也可用于本公开内容的免疫原性组合物中，适当地将由氨基酸残基1-475或50-475组成的OMP85表面暴露结构域掺入到本公开内容的免疫原性组合物的亚单位组分中。OMP85的表面暴露结构域的上述序列可在N或C末端之一或二者处伸展或截掉最多1、3、5、7、10、15、20、25或30个氨基酸。优选地删除OMP85片段的信号序列。

OstA

OstA在脂多糖的合成中发挥作用，且可被认为是毒性调节剂。OstA可选择性地包括在毒素种类中，其中毒素种类被扩大至包括毒性调节剂以及毒素。

在另一个方面，本公开内容涉及编码本公开内容的融合蛋白的多核苷酸。

“多核苷酸”通常是指任何多核糖核苷酸或多脱氧核糖核苷酸，其可以是未修饰的RNA或DNA或修饰的RNA或DNA。“多核苷酸”包括、但不限于：单链和双链的DNA，作为单链区和双链区的混合物的DNA，单链和双链的RNA，作为单链区和双链区的混合物的RNA，包含DNA和RNA的杂种分子，所述DNA和RNA可以是单链的、或更通常是双链的、或作为单链区和双链区的混合物。此外“多核苷酸”是指包含RNA或DNA或同时包含RNA与DNA的三链区。术语多核苷酸还包括含有一个或多个修饰碱基的DNA或RNA，和具有由于稳定性或其它原因而被修饰的主链的DNA或RNA。“修饰的”碱基包括，例如，三苯甲基化的碱基和稀有碱基如肌苷。已经对DNA和RNA进行了各种修饰；因此，“多核苷酸”包括一般天然存在的多核苷酸的化学、酶促或代谢修饰形式，以及病毒和细胞特征性的DNA和RNA的化学形式。

“多核苷酸”还包括相对较短的多核苷酸，通常被称作寡核苷酸。

本公开内容的另一方面涉及免疫/疫苗制剂，其包含一种或多种多核苷酸。这种技术是本领域已知的，参见例如Wolff等人, Science, (1990) 247: 1465-8。

这种疫苗包含一种或多种多核苷酸，其编码与上述公开内容的蛋白组合相对应的多种蛋白。

来源于这种多核苷酸的蛋白的表达可以是在真核启动子的控制下，该启动子能够驱动在哺乳动物细胞内的表达。所述多核苷酸可另外包含编码其它抗原的序列。

可驱动表达的真核启动子的实例包括来源于病毒的病毒启动子，包括腺病毒启动子、逆转录病毒启动子。

或者，哺乳动物启动子可用于驱动表达。

在另一个方面，本公开内容涉及含有本公开内容的多核酸的重组宿主细胞和表达嵌合蛋白的方法、这种蛋白的分离和在膜囊泡内生产蛋白。合适的方法是本领域众所周知的，且公开在例如WO/2009/114485中，其通过引用并入本文。

例如，在一个方面，本公开内容涉及生产融合蛋白的方法，所述方法包括：在适合表达嵌合fHBP的条件下，培养含有本公开内容的多核酸的重组宿主细胞；和分离所述嵌合fHBP。

在另一个方面，本公开内容涉及在泡或外膜囊泡中表达所述融合蛋白。

例如，通过任意合适的方法，包括重组和非重组方法(例如，化学合成)，可以生产嵌合fHBP。在使用重组技术生产嵌合fHBP的情况下，所述方法可以包括任意合适的构建体和任意合适的宿主细胞，所述宿主细胞可以是原核或真核细胞，通常是细菌或酵母宿主细胞，更通常是细菌细胞。将遗传物质导入宿主细胞中的方法包括，例如，转化、电穿孔、接合、磷酸钙方法等等。可以选择转移方法，从而提供导入的编码嵌合fHBP的核酸的稳定表达。编码嵌合fHBP的核酸可以提供为可遗传的附加型元件(例如，质粒)，或可以整合进基因组中。

适用于转移编码嵌合fHBP的核酸的载体可以在组成方面发生变化。整合型载体可以是有条件地复制的或自杀的质粒、噬菌体等等。所述构建体可以包括各种元件，包括、例如，启动子、选择性遗传标记（例如，赋予对抗生素（例如卡那霉素、红霉素、氯霉素或庆大霉素）的抗性的基因）、复制起点（以促进在宿主细胞（例如，细菌宿主细胞）中的复制）等等。载体的选择取决于多种因素，诸如希望在其中繁殖的细胞的类型和繁殖的目的。某些载体可用于扩增和制备大量希望的DNA序列。其它载体适用于在培养的细胞中表达。其它载体适用于在完整动物的细胞中转移和表达。适当载体的选择属于本领域的技能。许多这样的载体可商业得到。

在一个实施方案中，所述载体是基于附加型质粒的表达载体，其含有：选择性的药物抗性标志物，和提供在不同宿主细胞中(例如，在大肠杆菌和脑膜炎奈瑟球菌中)自主复制的元件。这样的“穿梭载体”的一个实例是质粒pFPIO (Pagotto等人Gene 2000 244:13- 19)。

例如，可以如下制备构建体：将目标多核苷酸插入构建体主链中，通常借助于DΝA连接酶向载体中的切割的限制性酶位点的连接。或者，通过同源重组或位点特异性的重组，可以插入希望的核苷酸序列。通常，通过将同源性区域连接至载体上与希望的核苷酸序列侧接来实现同源重组，而通过使用促进位点特异性的重组的序列(例如，cre-lox、att位点等)，可以实现位点特异性的重组。例如，通过连接寡核苷酸，或通过聚合酶链式反应（使用包含同源性区域和希望的核苷酸序列部分的引物），可以添加含有这样的序列的核酸。

载体可以提供在宿主细胞中的染色体外维持，或可以提供向宿主细胞基因组中的整合。如在本领域技术人员熟知的众多出版物中所述，扩增载体，所述出版物包括、例如，Short Protocols in Molecular Biology, (1999) F. Ausubel, 等人编, Wiley & Sons。载体可以提供编码嵌合fHBP的核酸的表达，可以提供主题核酸的扩增，或二者。

可以使用的示例性载体包括、但不限于：从重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA衍生出的那些。例如，可以使用质粒载体，诸如pBR322、pUC 19/18、pUC 118、119和M13 mp系列的载体。pET21也是可以使用的表达载体。噬菌体载体可以包括λgtlO、λgtl l、λgtl8-23、λZAP/R和EMBL系列的噬菌体载体。可以使用的其它载体包括、但不限于：pJB8、pCV 103、pCV 107、pCV 108、pTM、pMCS、pNNL、pHSG274、COS202、COS203、pWE15、pWE16和卡隆粒9系列的载体。

为了表达目标嵌合fHBP，可以使用表达盒。因而，本公开内容提供了包含主题核酸的重组表达载体。所述表达载体会提供转录和翻译调节序列，且可以提供诱导型或组成型表达，其中编码区在转录起始区和转录和翻译终止区的转录控制下可操作地连接。这些控制区可以对衍生出嵌合fHBP的fHBP而言是天然的，或可以源自外源性来源。一般而言，所述转录和翻译调节序列可以包括、但不限于：启动子序列、核糖体结合位点、转录起始和终止序列、翻译起始和终止序列和增强子或活化剂序列。启动子可以是组成型或诱导型，且可以是强组成型启动子(例如，T7等等)。

表达载体通常具有位于启动子序列附近的方便的限制位点，以提供编码目标蛋白的核酸序列的插入。可以存在在表达宿主中起作用的选择标记，以促进含有所述载体的细胞的选择。另外，所述表达构建体可以包括其它元件。例如，所述表达载体可以具有1或2个复制系统，因而允许它维持在生物体（例如哺乳动物或昆虫细胞）中进行表达，和维持在原核生物宿主中进行克隆和扩增。另外，所述表达构建体可以含有选择标记基因，以允许选择转化的宿主细胞。选择基因是本领域众所周知的，且随使用的宿主细胞而变化。

应当指出，本公开内容的嵌合fHBP可以包含其它元件，诸如可检测的标记，例如，放射性的标记、荧光标记、生物素标记、免疫学上可检测的标记(例如，HA标签、多组氨酸标签)等等。可以提供嵌合fHBP的其它元件，以促进通过各种方法(例如，亲和捕获等)的分离(例如，生物素标签、免疫学上可检测的标签)。通过共价或非共价连接，可以任选地将嵌合fHBP固定化在支持物上。

根据本领域已知的方法，可以分离和纯化嵌合fHBP。例如，通过免疫亲和纯化，可以从遗传修饰成表达嵌合fHBP的细胞的裂解物中，或从合成的反应混合物中，分离出嵌合fHBP，所述免疫亲和纯化通常包括：使样品接触抗-嵌合fHBP抗体(例如，抗-嵌合fHBP mAb，诸如JAR 5 mAb或本文所述的其它适当的JAR mAb)，洗涤以去除非特异性地结合的物质，和洗脱特异性地结合的嵌合fHBP。通过在蛋白纯化方法中常用的透析和其它方法，可以进一步纯化分离的嵌合fHBP。在一个实施方案中，使用金属螯合物色谱法，可以分离嵌合fHBP。

许多合适的宿主细胞中的任一种可以用于生产嵌合fHBP。一般而言，根据常规技术，可以在原核生物或真核生物（通常细菌，更通常地大肠杆菌或奈瑟球菌属（例如，脑膜炎奈瑟球菌））中表达本文所述的嵌合fHBP。因而，本公开内容另外提供了遗传修饰的宿主细胞，其含有编码嵌合fHBP的核酸。用于生产(包括大规模生产)嵌合fHBP的宿主细胞可以选自多种可得到的宿主细胞中的任一种。用于表达的示例性的宿主细胞包括：诸如细菌(例如，大肠杆菌菌株)、酵母(例如，酿酒酵母、毕赤酵母属某些种等)等原核或真核单细胞生物的那些宿主细胞，且可以包括最初源自高等生物（诸如昆虫、脊椎动物、特别是哺乳动物(例如CHO、HEK等等)）的宿主细胞。通常，细菌宿主细胞和酵母对于嵌合fHBP生产而言是特别重要的。

可以以基本上纯的或基本上分离的形式(即，基本上不含有其它奈瑟球菌或宿主细胞多肽)或基本上分离的形式制备嵌合fHBP。在某些实施方案中，所述嵌合fHBP存在于这样的组合物中：与可能存在的其它组分(例如，其它多肽或其它宿主细胞组分)相比，所述组合物富含多肽。可以提供纯化的嵌合fHBP，使得所述多肽存在于这样的组合物中：所述组合物基本上不含有其它表达的多肽，例如，小于90%、通常小于60%和更通常小于50%的所述组合物由其它表达的多肽构成。

在要在膜囊泡中提供嵌合fHBP的情况下(在下面更详细地讨论)，将奈瑟球菌宿主细胞遗传修饰成表达嵌合fHBP。可以修饰多种奈瑟球菌属菌株中的任一种以生产嵌合fHBP，且任选地，其生产或可以修饰成生产其它目标抗原，诸如PorA，可以用于本文公开的方法中。

用于提供奈瑟球菌菌株的遗传修饰和目标多肽的表达的方法和载体是本领域已知的。示例性载体和方法提供在WO 02/09746和O'Dwyer等人Infect Immun 2004;72:6511-80中。强启动子、特别是组成型强启动子是特别重要的。示例性的启动子包括porA、porB、lbpB、tbpB、pi 10、hpuAB、lgtF、opa、pi 10、1st、hpuAB.和rmp的启动子。

病原性奈瑟球菌属或衍生自病原性奈瑟球菌属的菌株，特别是人类的病原性菌株或衍生自人类的病原性或共生菌株的菌株，就用于膜囊泡生产而言是特别重要的。示例性的奈瑟球菌属包括：脑膜炎奈瑟球菌、浅黄奈瑟球菌（N. flavescens）、淋病奈瑟球菌、乳酰胺奈瑟球菌（N. lactamica）、多糖奈瑟球菌(N. polysaccharea)、灰色奈瑟球菌(N. cinerea)、粘膜奈瑟球菌(N. mucosa)、微黄色奈瑟球菌(N. subflava)、干燥奈瑟球菌(N. sicca)、长形奈瑟球菌(N. elongata)等等。

其它信息提供在WO/2009/114485中。

本公开内容的免疫原性组合物或疫苗可以是亚单位组合物。

亚单位组合物是这样的组合物：其中所述一种或多种组分已经分离和纯化至至少50%（适当地至少60%、70%、80%、90%）的纯度。

本公开内容的免疫原性亚单位组合物适当地包括本公开内容的融合蛋白和另一种抗原或2种抗原，所述抗原选自下面的列表：TdfI、TdfH、FhaB、PilC、Hsf、Hap、NadA、OMP85、IgA蛋白酶、AspA、AspA的过客结构域、Hsf的过客结构域、Hap的过客结构域、FrpA、FrpC、TbpA、TbpB、LbpA、LbpB、HpuA、HpuB、TspA、TspB、PIdA、PilQ、FhaC、NspA、以及LPS免疫型L2和LPS免疫型L3之一或两者。

亚单位组合物可以是在水溶液中。它们可包含去污剂、适当的非离子型、两性离子型或离子型去污剂，以便使抗原的疏水部分溶解。它们可包含脂类，这样就可形成脂质体结构，使抗原以跨越脂膜的结构呈现。

脑膜炎奈瑟球菌血清群B(menB)分泌足量的外膜囊泡，从而使得能够以工业规模制造它们。外膜囊泡还可经由用去污剂提取细菌细胞的方法制备(参见例如EP 11243)。

本公开内容的免疫原性组合物还可包括具有至少两种抗原的外膜囊泡制剂，所述抗原已被增量调节，即被重组增量调节或通过其它方式增量调节，包括在清空铁和/或清空锌的条件下生长。在这种外膜囊泡制剂中被增量调节的抗原的实例包括：Tdfl、TdfH、NspA、Hsf、Hap、OMP85、TbpA (high)、TbpA (low)、LbpA、TbpB、LbpB、PilQ、AspA、PorB、HpuB、P2086、NM- ADPRT、MafA、MafB和PIdA。这种制剂还可任选地包括LPS免疫型L2和LPS免疫型L3之一或两者。

通过本领域技术人员熟知的任何方法，可以制备来源于奈瑟球菌菌株的泡制剂。在一个方面，使用在下述文献中公开的方法：EP 301992, US 5,597, 572, EP 11243或US 4,271, 147, Frederikson等人(NIPH Annals [1991], 14: 67-80), Zollinger等人(J. Clin. Invest. [1979], 63: 836-848), Saunders等人(Infect. Immun. [1999], 67: 113-119), Drabick等人(Vaccine [2000], 18: 160-172)或WO 01/09350 (实施例8)。通常，使用去污剂（适当地脱氧胆酸盐）提取OMV，且任选酶促去除核酸。通过超速离心，任选接着进行尺寸排阻色谱法，实现纯化。如果包括本公开内容的2种或更多种不同的泡，则它们可在单一容器中组合，以形成本公开内容的多价制剂(尽管如果本公开内容的不同泡是处于单独容器中的单独组合物，但它们是在同时[同一次就诊从业人员]施用给宿主，那么制剂也被认为是多价的)。

通常通过0.2 μm滤器过滤而灭菌OMV制剂，且适当地贮存在蔗糖溶液（例如3％）中，该蔗糖溶液已知可使泡制剂稳定化。

通过将基因的附加拷贝插入到衍生出OMV制剂的奈瑟球菌菌株中，可以实现蛋白在外膜囊泡制剂内的增量调节。或者，可将衍生出OMV制剂的奈瑟球菌菌株中的基因启动子交换成更强的启动子。这种技术在WO01/09350中描述。与从未修饰的脑膜炎奈瑟球菌(例如菌株H44/76)衍生出的OMV中存在的蛋白水平相比，蛋白的增量调节将导致OMV中存在更高水平的蛋白。在一个方面，所述水平高1.5、2、3、4、5、7、10或20倍。

在LPS是OMV中的附加抗原的情况下，使用低浓度的提取去污剂（例如，脱氧胆酸盐或DOC）的方案可适当地用于OMV制备方法中，以便保持高水平的结合的LPS，同时去除特别有毒的、结合较差的LPS。所用DOC的浓度适当地是0-0.5% DOC、0.02-0. 4% DOC、0.04-0. 3% DOC，更适当地，0.06%-0. 2% DOC或0.08-0. 15% DOC，最适当地约或准确的0.1%DOC。

更通常地，使用低浓度的提取去污剂（例如，脱氧胆酸盐或DOC），可以得到OMV。所用DOC的浓度适当地是0-0.5% DOC、0.02-0. 4% DOC、0.04-0. 3% DOC，更适当地，0.06%-0. 2% DOC或0.08-0. 15% DOC，最适当地约或准确的0.1%DOC。

在一个方面，OMV可以包括不使用去污剂提取得到的天然OMV，适当地过表达抗原诸如fHbp。

“更强的启动子序列”是指，增加编码目标抗原的基因转录的调节控制元件。

“增量调节表达”是指，相对于未修饰的（即天然存在的）泡而言，增加目标抗原表达的任何方式。

应当理解，增量调节的量随特定目标抗原而变化，但不会超出破坏泡的膜完整性的量。抗原的增量调节是指，与未修饰的泡相比，高至少10％的表达。在一个方面，高至少50％。更适当地。高至少100％（2倍）。最适当地，高3、4、5、7、10、20倍。替换地或额外地，增量调节表达可以表示，使表达对代谢或营养变化是非条件性的，特别是在TbpA、TbpB、LbpA和LbpB的情况下。在一个方面，当从在铁限制条件中生长的细菌中衍生泡时（例如在有铁螯合剂存在下），评价表达水平。

又为了清楚的目的，术语“工程改造细菌菌株以生产更少的所述抗原”或减量调节是指，相对于未修饰的（即天然存在的）泡而言，适当地通过删除而减少目标抗原表达（或功能性基因产物的表达）的任何方式，使得表达比未修饰的泡低至少10％。

在一个方面，低至少50％，且最适当地完全缺乏。如果减量调节的蛋白是酶或功能性蛋白，则减量调节可通过引入一种或多种突变而获得，所述突变导致酶活性或功能活性降低10%、20%、50%、80%或适当地a 100%。

调节奈瑟球菌蛋白表达所需的工程改造步骤可以以本领域技术人员已知的各种方式进行。例如，可插入序列(例如，启动子或开放读码框)，并通过转座子插入技术来破坏启动子/基因。例如，为了增量调节基因的表达，可经由转座子将强启动子插入到基因起始密码子的上游最多2kb (更适当地上游200-600bp，最适当地上游约400bp)。还可利用点突变或缺失(特别是用于减量调节基因的表达)。

然而，这种方法可能相当不稳定或不确定，且因此适当地经由同源重组事件进行工程改造步骤。在一个方面，该事件发生在细菌染色体上至少30个核苷酸的序列（重组发生区）和在菌株内转化的载体上至少30个核苷酸的序列（第二重组发生区）之间。在一个方面，所述区域是40-1000个核苷酸，更适当地100-800个核苷酸，最适当地500个核苷酸。这些重组发生区应当足够相似，使得它们能够在非常严谨的条件下彼此杂交。

在WO01/09350中描述了用于进行本文所述的遗传修饰事件的方法(如通过重组事件和将其它基因序列引入到奈瑟球菌属基因组中，将基因增量调节或减量调节)。可在奈瑟球菌属中整合的一般强启动子是porA、porB、IgtF、Opa、p110、lst和hpuAB。PorA和PorB是适当的组成型强启动子。已经确定，PorB启动子活性被包含在与PorB的起始密码子上游的核苷酸1-250相对应的片段中。

通过在铁限制培养基中生长而增量调节抗原的表达

适当地通过从在铁限制条件下生长的奈瑟球菌属亲代菌株中分离出外膜囊泡，实现本公开内容的外膜囊泡制剂中的某些抗原的增量调节。培养基中低浓度的铁将导致参与铁获得的蛋白(包括TbpA, TbpB, LbpA, LbpB, HpuA, HpuB和P2086)的增加表达。这些蛋白的表达由此被增量调节，无需重组修饰所涉及的基因，例如通过插入更强的启动子或插入基因的附加拷贝。本公开内容还包括通过在铁限制培养基中生长而增量调节铁获得蛋白，其中所述基因也已被重组修饰。

通过向培养基中加入铁螯合剂而实现铁限制。

适宜的铁螯合剂包括2,2-双吡啶，EDDHA(乙二胺-二(邻-羟基苯乙酸)和Desferal(甲磺酸去铁胺，Sigma)。Desferal是适当的铁螯合剂，且以10-100 μM、适当地25-75 μM、更适当地50-70 μM、最适当地60 μM的浓度加入到培养基中。培养基的铁内含物主要来源于酵母提取物和大豆胨组分，且存在的用量可根据批次而变化。因此，在不同批的培养基中，不同浓度的Desferal对于实现铁获得蛋白的增量调节而言是最佳的。本领域技术人员应当能够容易地确定最佳浓度。一般而言，应向培养基中加入充足的铁螯合剂，从而增量调节所需铁-调节蛋白的表达，但也不能过量而不利地影响细菌的生长。

在一个方面，将通过在铁限制条件下生长的铁获得蛋白的增量调节与其它抗原的重组增量调节相组合，从而获得本公开内容的外膜囊泡。

在一个方面，可以使用锌限制来增加egTdfI的表达。例如，这可以如下实现：通过使用含有低Zn²⁺ 浓度（即低于5、4、3、2、1、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1、0.05或0.01µM的游离Zn²⁺）的培养基(诸如Roswell Park Memorial Institute培养基1640 (RPMI)，通过ICP-MS测得其含有约1.69µM Zn²⁺)，或通过去除培养基中的Zn²⁺，例如使用已知的锌螯合剂诸如TPEN (N,N,N',N'-四(2-吡啶基甲基)乙二胺)，其应当足量地加入培养基中，使得NMB0964的表达最大化。还可以使用合成的培养基诸如Catlin或Catlin改进培养基(Nutritional profiles of Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, and Neisseria lactamica in chemically defined media and the use of growth requirements for gonococcal typing. Catlin BW J Infect Dis. 1973 Aug;128(2):178-94.)。

在NMB0964中富集在低Zn²⁺的特定培养条件中或从突变体脑膜炎奈瑟球菌菌株（其被工程设计成过表达NMB0964或去除通过Zur介导的锌抑制机理）制备的OMV疫苗，且与没有使用这些方法制备的OMV相比，这样的OMV可以引发良好的杀菌抗体应答。

可变的和非保护性的免疫显性抗原的减量调节 / 去除

很多表面抗原在细菌菌株中是可变的，且因此仅可保护免于有限的紧密相关的菌株集合。本公开内容的一方面覆盖本公开内容的外膜囊泡，其中其它蛋白的表达减少，或适当地编码可变表面蛋白的基因缺失。这种缺失会产生生产泡的细菌菌株，当以疫苗形式给药时，所述泡具有更强的针对各种菌株的交叉反应性潜能，这是由于保守蛋白（留存在外膜上）对被接种者的免疫系统施加的更强影响。在本公开内容的泡免疫原性组合物中可减量调节的奈瑟球菌属中的这种可变抗原的实例包括PorA、PorB、Opa。

可被减量调节或关闭的其它类型基因是在体内可被细菌容易地开启（表达）或关闭的基因。因为由这种基因编码的外膜蛋白并不总是存在于细菌上，因此这种蛋白在泡制剂中的存在还可由于上述原因而对疫苗有效性有害。减量调节或缺失的适当实例是奈瑟球菌属Opc蛋白。由含Opc的泡疫苗诱导的抗-Opc免疫性仅具有有限的保护能力，这是因为感染生物体很容易变为Opc^-。

例如，这些可变或非保护性的基因的表达可被减量调节，或最终被关闭。如此则具有将免疫系统集中于更好抗原上的优点，所述抗原仅少量存在于泡外表面上。减量调节还指，上述外膜蛋白的表面暴露的、可变的免疫显性环可被改变或缺失，从而产生免疫显性更低的外膜蛋白。

在WO01/09350中公开了减量调节表达的方法。

在本公开内容的泡免疫原性组合物中被减量调节的适当蛋白组合包括PorA和OpA；PorA和OpC；OpA和OpC；PorA和OpA和OpC。

已知4种不同的Opa基因存在于脑膜炎球菌基因组中(Aho等人，1991 Mol. Microbiol. 5:1429-37)，因此当提到Opa的表达被减量调节时，它是指，适当地存在于脑膜炎球菌中的1、2、3或(适当地)全部4个基因都被这样减量调节。可以通常按照WO01/09350所述遗传地进行这种减量调节，或通过查找很容易发现的、天然的、稳定的脑膜炎球菌菌株而进行，所述菌株具有较低的或没有来自Opa基因座的表达。使用Poolman等人(1985 J. Med. Micro. 19: 203-209)描述的技术，可以发现这种菌株，其中Opa^-细胞具有与表达Opa的细胞不同的表型，这可通过在平板上或显微镜下观察胞外观而见到。一旦找到，在进行发酵以使Opa缺失后，通过对细胞内含物进行蛋白质印迹可以显示出该菌株是稳定的Opa^-。

在通过在铁限制条件下生长而实现外膜囊泡中某些抗原的增量调节的情况下，可变蛋白FrpB(Microbiology 142; 3269-3274, (1996); J. Bacteriol. 181; 2895-2901 (1999) )也可被增量调节。发明人已经发现，通过按照WO01/09350所述减量调节全部蛋白的表达，或通过使FrpB可变区缺失，在这些环境下减量调节FrpB表达是有利的。如此可确保，由所述免疫原性组合物引发的免疫应答是针对存在于大范围菌株中的抗原。在本公开内容的泡免疫原性组合物中，FrpB的减量调节适当地与PorA和OpA、PorA和OpC、OpA和OpC、PorA和OpA和OpC的减量调节相组合。

在本公开内容的替代实施方案中，在外膜囊泡中的FrpB被减量调节，所述外膜囊泡已经从不是在铁限制条件下生长的奈瑟球菌菌株制备。

经由WO01/09350公开的LPS解毒方法，可将本公开内容的免疫原性组合物中的泡解毒。具体地，本公开内容的LPS解毒方法包括：使WO01/09350中公开的htrB和/或msbB酶被减量调节/缺失。奈瑟球菌属的msbB和htrB基因还分别被称作lpxL1和lpxL2 (WO 00/26384)，且通过失去一个仲酰基链的msbB-突变LOS和失去两个仲酰基链的htrB-突变LOS，从表型方面表征这些基因的缺失突变。WO 93/14155和WO 95/03327描述了可用于本公开内容组合物中的多粘菌素B的无毒肽功能性等价物。

这种方法适当地与泡提取方法组合，所述泡提取方法包括使用低水平的DOC、适当地0-0.3%DOC、更适当地0.05%-0.2%DOC、最适当地约或准确的0.1%DOC。

LPS解毒的其它方法包括：向泡制剂中加入如上所述的多粘菌素B的无毒肽功能性等价物(适当地SAEP 2)。

交叉反应性多糖

从有荚膜的革兰氏阴性细菌中分离出细菌外膜囊泡，常常导致荚膜多糖的共-纯化。在某些情况下，这种“污染”材料可证明是有用的，因为多糖可提高由其它泡组分产生的免疫应答。然而在其它情况下，污染性多糖材料在细菌泡制剂中的存在可证明对泡在疫苗中的应用是有害的。例如，已经证实，至少在脑膜炎奈瑟球菌的情况下，血清群B荚膜多糖不会赋予保护性免疫，且容易在人类中诱导不利的自身免疫应答。因此，可将本公开内容的外膜囊泡从细菌菌株中分离出来用于泡生产，所述菌株已被工程改造成没有荚膜多糖。所以所述泡适用于人类。这种泡制剂的特别适当的实例是来源于没有荚膜多糖的脑膜炎奈瑟球菌血清群B的泡制剂。

这可通过使用修饰的泡生产菌株实现，在所述菌株中，荚膜生物合成和/或输出所需的基因已损坏。

通过（适当地使用上述同源重组技术）使控制区、编码区或两者发生突变（点突变、缺失或插入），或通过降低这种基因的酶功能的任何其它方式，可以实现编码荚膜多糖生物合成或输出的基因的灭活。此外，通过反义过表达或转座子诱变，还可实现荚膜生物合成基因的灭活。优选的方法是，使多糖生物合成及输出所需的脑膜炎奈瑟球菌cps基因的一部分或全部缺失。就该目的而言，置换质粒pMF121(在Frosh等人1990, Mol. Microbiol. 4: 1215-1218中所述)可用于传递使cpsCAD (+ galE)基因簇缺失的突变。

WO 01/09350公开了质粒pMF121 (Frosch等人, 1990)，该质粒已经用于构建缺少荚膜多糖的脑膜炎奈瑟球菌B菌株。该质粒含有编码B组多糖(B PS)的生物合成途径的基因座的侧接区和红霉素抗性基因。B PS的缺失会导致B组荚膜多糖的表达缺失以及导致合成半乳糖缺陷型LPS的galE的活性拷贝的缺失。

已经质疑针对L3或L2 LPS所产生的抗体的安全性，这是由于与存在于人鞘糖脂中的乳糖-N-新四糖寡糖基团(Galβl-4GlcNAcβl- 3Galβl-4Glcβl-)相似的结构的存在。尽管已经有很多人安全接种了脱氧胆酸盐提取的含有残余量L3 LPS的囊泡疫苗(G. Bjune等人, Lancet (1991), 338,1093-1096; GVG. Sierra等人, NIPH ann (1991), 14,195-210)，LOS糖末端部分的缺失可有利地防止与存在于人组织表面处的结构的任何交叉反应。在一个优选的实施方案中，lgtB基因的灭活会产生中间体LPS结构，其中缺少末端半乳糖残基和唾液酸(突变留下L2和L3 LOS中的4GlcNAcpl-3Galpl-4Glcpl-结构)。这种中间体可在L3和L2 LPS菌株中获得。通过关闭IgtE基因，可以获得LPS的替代性的且次优选的（短的）版本。

另一种替代方案是，使用galE突变(Cloning and molecular analysis of the galE gene of Neisseria meningitidis and its role in lipopolysaccharide biosynthesis. Jennings MP, van der Ley P, Wilks KE, Maskell DJ, Poolman JT, Moxon ER. Mol Microbiol. 1993 Oct;10(2):361-9)来获得荚膜阴性菌株和含有短α-链的LOS (作为lgtE突变)。

通过关闭lgtA基因，可以获得LPS的其它替代性的且次优选的版本。如果选择这种lgtA^-突变，优选地还可关闭lgtC表达，从而防止形成非免疫原性的LI免疫型。

lgtB^-突变体是最优选的，因为发明人已经发现，这是用于解决安全性问题同时仍然保留可诱导杀菌抗体应答的LPS保护性寡糖表位的最佳截短体。

因此，还包含L2或L3制剂（纯化的或在分离的泡中）或脑膜炎球菌泡制剂的本公开内容的免疫原性组合物通常有利地来源于奈瑟球菌菌株(适当地脑膜炎球菌)，所述菌株已被基因工程改造成永久性减量调节来源于lgtB、lgtA或lgtE基因的功能性基因产物的表达，适当地通过关闭所述基因，最适当地通过使所述基因的启动子和/或开放读码框的全部或一部分缺失。

在本公开内容的上述免疫原性组合物来源于脑膜炎球菌B菌株的情况下，还优选地去除荚膜多糖（其还包含人-样糖结构）。虽然可将很多基因关闭以实现此目的，发明人已经有利地证实，优选地已将泡生产菌株进行基因工程改造以永久减量调节siaD基因的功能性基因产物的表达(即，减量调节α-2-8聚唾液酸转移酶活性)，适当地通过关闭所述基因，最适当地通过使所述基因的启动子和/或开放读码框的全部或一部分缺失。在WO 01/09350中描述了这种灭活。siaD(也被称作synD)突变是可从荚膜多糖去除人-相似表位的多种突变中最有利的，因为它，突变中仅有一种对LOS的保护性表位的生物合成没有作用，因此在最终使用LOS作为保护性抗原的方法中是有利的，且对细菌生长的影响最小。因此本公开内容的优选方面是上述的泡免疫原性制剂，其来源于lgtE^- siaD^-、lgtA^-siaD^-或适当地lgtB^-siaD^-脑膜炎球菌B突变株。所述菌株本身是本公开内容的另一方面。

虽然由于上述原因siaD^-突变是优选的，但也可使用关闭脑膜炎球菌B荚膜多糖合成的其它突变。

因此，可将泡生产菌株进行基因工程改造以永久减量调节来源于下列一种或多种基因的功能性基因产物的表达：ctrA、ctrB、ctrC、ctrD、synA (相当于synX和siaA)、synB(相当于siaB)或synC(相当于siaC)基因，适当地通过关闭所述基因，最适当地通过使所述基因的启动子和/或开放读码框的全部或一部分缺失。lgtE^-突变可与这些突变中的一种或多种相组合。在一个方面，lgtB^-突变与这些突变中的一种或多种相组合。因此本公开内容的另一方面是上述的泡免疫原性制剂，其来源于脑膜炎球菌B的这种组合突变株。所述菌株本身是本公开内容的另一方面。

含有各种lgt基因（包括lgtB和lgtE）的奈瑟球菌基因座及其序列是本领域已知的(参见M. P. Jennings等人, Microbiology 1999,145, 3013-3021和其中引用的参考文献,和J. Exp. Med. 180: 2181-2190 [1994])。

在把全长（未截短的）LOS用于终产品中的情况下，希望LOS没有被唾液酸化(因为这种LOS可产生针对大多数危险的、侵入性脑膜炎球菌B菌株的免疫应答，所述菌株也未被唾液酸化)。在这种情况下，使用具有缺失的synA（相当于synX和siaA）、synB(相当于siaB)或synC(相当于siaC)基因的荚膜阴性菌株是有利的，因为这种突变也可导致menB LOS不能被唾液酸化。

在泡制剂中，特别是在用低浓度DOC提取的制剂中，可使用LPS作为本公开内容的免疫原性组合物中的抗原。然而，可有利地减量调节/缺失/灭活lgtE、lgtA(特别是与lgtC组合)、或适当地lgtB基因/基因产物的酶功能，以便去除人样乳糖-N-新四糖结构。也可以使用galE突变来获得荚膜阴性菌株和具有短α-链的LOS(lgtE突变)。包含用于生物合成LPS寡糖结构的lgt基因的奈瑟球菌基因座（及其序列）是本领域已知的(Jennings等人Microbiology 1999 145; 3013-3021和其中引用的参考文献,和J. Exp. Med。180: 2181-2190 [1994] )。lgtB（或功能性基因产物）的减量调节/缺失是优选的，这是因为它可留下完整的LPS保护性表位。

在本公开内容的脑膜炎奈瑟球菌血清群B泡制剂中，siaD和lgtB的减量调节/缺失是优选的(虽然，在脑膜炎球菌B泡生产菌株中也可使用lgtB^-与ctrA^-、ctrB^-、ctrC^-、ctrD^-、synA^-(相当于synX^-和siaA^-)、synB^-(相当于siaB^-)或synC^-(相当于siaC^-)中的任何一个的组合)，得到具有最佳安全性和LPS保护性表位保留的泡制剂。

因此本公开内容的另一方面是上述泡免疫原性制剂，其来源于脑膜炎球菌B的这种组合突变株。所述菌株本身是本公开内容的另一方面。

本公开内容的免疫原性组合物可包括至少1、2、3、4或5种不同的外膜囊泡制剂。当包括两种或多种OMV制剂时，本公开内容的至少一种抗原在每种OMV中被增量调节。这种OMV制剂可来源于相同种类和血清群的奈瑟球菌菌株，或适当地来源于不同种类、血清群、血清型、亚血清型或免疫型的奈瑟球菌菌株。例如，免疫原性组合物可包括一种或多种含有免疫型L2的LPS的外膜囊泡制剂和一种或多种含有免疫型L3的LPS的外膜囊泡制剂。L2或L3 OMV制剂适当地来源于稳定的菌株，所述菌株在LPS寡糖合成基因座中具有最小的相变异性。

本公开内容的免疫原性组合物还可包括亚单位组合物和外膜囊泡。若干抗原由于它们的溶解性而特别适于包括在亚单位组合物中。这种蛋白的实例包括：Tdfl、FhaB、NspA、Hsf的过客结构域、Hap的过客结构域、AspA的过客结构域、AspA、OMP85、FrpA、FrpC、TbpB、LbpB、PilQ。外膜囊泡制剂具有选自下列的至少一种不同抗原，所述抗原在外膜囊泡中已被重组增量调节：NspA、Hsf、Hap、OMP85、TbpA (high)、TbpA (low)、LbpA、TbpB、LbpB、NadA、TspA、TspB、PilC、PilQ、TdfH、PorB、HpuB、P2086、NM- ADPRT、MafA、MafB和PldA；且任选地包括LPS免疫型L2和LPS免疫型L3之一或两者。

本公开内容的另一个方面是，基因工程改造的奈瑟球菌菌株，从所述菌株可以衍生出本公开内容的外膜囊泡(任选地，其中至少种本公开内容的蛋白被重组地增量调节，如上所述)。这样的奈瑟球菌菌株可以是脑膜炎奈瑟球菌或淋病奈瑟球菌。

还可以已经工程设计所述菌株(如上所述)，以减量调节其它奈瑟球菌蛋白的表达，包括LgtB、LgtE、SiaD、OpC、OpA、PorA、FrpB、msbB和HtrB中的1、2、3、4、5、6、7或8种的表达。用于减量调节的适当组合包括：至少LgtB和SiaD的减量调节(适当地缺失)、至少PorA和OpC的减量调节、至少PorA和OpA的减量调节以及至少PorA、OpA和OpC的减量调节。所述gale突变还可以用于获得荚膜阴性菌株和具有短α-链的LOS (作为lgtE突变)。

根据上面关于泡生产的公开内容，本公开内容的另一个方面包括，制备本公开内容的免疫原性组合物或疫苗的方法。这些包括含有下述步骤的方法：将本公开内容的嵌合蛋白与从奈瑟球菌属分离的抗原或蛋白（其可以以衍生自本公开内容的奈瑟球菌菌株的泡的形式存在）一起混合，以制备本公开内容的免疫原性组合物，也包括含有下述步骤的制备本公开内容的疫苗的方法：将本公开内容的免疫原性组合物与药学上可接受的载体相组合。

在本公开内容中还包括制备本公开内容的免疫原性组合物的方法，所述方法包括下述步骤：从奈瑟球菌培养物中分离出包含所述嵌合蛋白的外膜囊泡。这样的方法可以包括下述额外步骤：组合至少2种外膜囊泡制剂，在一个方面，其中至少一种外膜囊泡制剂含有免疫型L2的LPS，且至少一种外膜囊泡制剂含有免疫型L3的LPS。本公开内容还包括这样的方法，其中通过使用0-0. 5%浓度的DOC进行提取，分离出所述外膜囊泡。使用0. 3%-0.5% 的DOC浓度，使LPS含量最小化。在其中保藏LPS作为抗原的OMV制剂中，使用0-0.3%、适当地0.05%- 0.2%、最适当地约0. 1%的DOC浓度进行提取。

本公开内容的免疫原性组合物还可包括细菌荚膜多糖或寡糖。荚膜多糖或寡糖可来源于下列一种或多种：脑膜炎奈瑟球菌血清群A、C、Y和/或W-135、流感嗜血杆菌b（Haemophilus influenzae b）、肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）、A组链球菌、B组链球菌、金黄色葡萄球菌（Staphylococcas aureus）和表皮葡萄球菌（Stapylocoaus epidermidis）。

本公开内容的另一个方面是，含有本公开内容的抗原性组合物和其它抗原的疫苗组合，其可有利地用于抗某些疾病状况，包括与病毒或革兰氏阳性细菌有关的那些。

在一种组合中，本公开内容的抗原性组合物是用下列脑膜炎球菌荚膜多糖或寡糖（其可以是原样的或与蛋白载体缀合）中的1、2、3或适当地全部4种配制：A、C、Y或W-135。在一个方面，本公开内容的免疫原性组合物是用A和C、或C、或C和Y配制。这种含有源自脑膜炎奈瑟球菌（适当地血清群B）的蛋白的疫苗可被用作通用的脑膜炎球菌疫苗。

在另一个实施方案中，本公开内容的抗原性组合物（适当地用原样的或缀合的脑膜炎球菌荚膜多糖或寡糖A、C、Y或W-135中的1、2、3或全部4种配制（如上所述））是用缀合的流感嗜血杆菌b荚膜多糖或寡糖和/或一种或多种原样的或缀合的肺炎球菌荚膜多糖或寡糖配制。任选地，所述疫苗还可包括一种或多种蛋白抗原，所述蛋白抗原可保护宿主免受肺炎链球菌感染。这种疫苗可被有利地用作通用脑膜炎疫苗。

在另一个实施方案中，本公开内容的免疫原性组合物是用来源于下述菌株中的一种或多种的荚膜多糖或寡糖配制：脑膜炎奈瑟球菌、流感嗜血杆菌b、肺炎链球菌、A组链球菌、B组链球菌、金黄色葡萄球菌或表皮葡萄球菌。肺炎球菌荚膜多糖抗原适当地选自：血清型1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F (最适当地选自血清型1、3、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F和23F)。另一个实施方案包括流感嗜血杆菌的PRP荚膜多糖。另一个实施方案含有金黄色葡萄球菌的5型、8型或336荚膜多糖。另一个实施方案含有表皮葡萄球菌的I型、II型或III型荚膜多糖。另一个实施方案含有B组链球菌的Ia型、Ic型、II型或III型荚膜多糖。另一个实施方案含有A组链球菌的荚膜多糖，适当地还包括至少一种M蛋白且更适当地多种类型的M蛋白。

本公开内容的这种荚膜多糖可以是未缀合的，或与载体蛋白缀合，所述载体蛋白诸如破伤风类毒素、破伤风类毒素片段C、白喉类毒素、CRM197、肺炎球菌溶血素、蛋白D(US6342224)。所述多糖缀合物可通过任何已知的偶联技术制备。例如，可经由硫醚键使多糖偶联。这种缀合方法依靠用1-氰基-4-二甲氨基吡啶鎓四氟硼酸盐(CDAP)活化多糖而形成氰酸酯。活化的多糖可因此与载体蛋白上的氨基直接偶联或经由间隔基团偶联。在一个方面，使用包括形成硫醚键的杂连接化学方法使氰酸酯与己二胺偶联，并使氨基-衍生的多糖与载体蛋白缀合。在PCT公开申请WO93/15760 Uniformed Services University中描述了这种缀合物。

还可通过如US 4365170(Jennings)和US 4673574(Anderson)中描述的直接还原胺化方法来制备缀合物。其它方法描述在EP-0-161-188、EP-208375和EP-0-477508中。其它方法包括：通过碳二亚胺缩合，使脂肪酸酰肼(ADH)衍生的溴化氰活化的多糖与蛋白载体偶联(Chu C.等人，Infect. Immunity，1983 245-256)。当包括寡糖时，适当地缀合它们。

适当的肺炎球菌蛋白抗原是在肺炎球菌外表面上暴露的那些肺炎球菌蛋白（在肺炎球菌的至少部分生命周期内能够被宿主免疫系统识别），或是由肺炎球菌分泌或释放的蛋白。

最适当地，所述蛋白是毒素、粘附素、2-组分信号转导蛋白、或肺炎链球菌的脂蛋白，或其片段。特别适当的蛋白包括，但不限于：肺炎球菌溶血素(适当地通过化学处理或突变而解毒) [Mitchell等人，Nucleic Acids Res. 1990年7月11日:18(13): 4010“Comparison of pneumolysin genes and proteins from Streptococcus pneumoniae types 1 and 2.”，Mitchell等人，Biochim Biophys Acta 1989年1月23日；1007(1):67-72，“Expression of the pneumolysin gene in Escherichia coli:rapid purification and biological properties.”，WO 96/05859(A. Cyanamid)、WO 90/06951 (Paton等人)、WO 99/03884(NAVA)]；PspA及其跨膜缺失变体(US 5804193-Briles等人)；PspC及其跨膜缺失变体(WO 97/09994-Briles等人)；PsaA及其跨膜缺失变体(Berry和Paton, Infect Immun 1996年12月；64(12):5255-62，“Sequence heterogeneity of PsaA, a 37-kilodalton putative adhesin essential for virulence of Streptococcuspneumoniae”)；肺炎球菌胆碱结合蛋白及其跨膜缺失变体；CbpA及其跨膜缺失变体(WO 97/41151、WO 99/51266)；甘油醛-3-磷酸-脱氢酶(Infect. Immun. 1996 64:3544)；HSP70 (WO 96/40928)；PcpA (Sanchez-Beato等人，FEMS Microbiol Lett 1998, 164:207-14)；M样蛋白(EP 0837130)和粘附素18627(EP 0834568)。其它肺炎球菌蛋白抗原是在WO 98/18931中公开的那些，特别是在WO98/18930和PCT/US99/30390中选择的那些。其它合适的肺炎球菌蛋白抗原是在WO 98/18931中公开的那些，特别是在WO98/18930和PCT/US99/30390中选择的那些。

本公开内容的免疫原性组合物/疫苗还可任选地包括由其它革兰氏阴性细菌（例如粘膜炎莫拉菌（Moraxella catarrhalis）或流感嗜血杆菌）制备的外膜囊泡制剂。

本公开内容的免疫原性组合物可以另外包括来源于粘膜炎莫拉菌的OMV制剂。工程改造的OMV制剂可来源于如WO01/09350所述的粘膜炎莫拉菌。下列基因（编码保护性抗原）中的一种或多种适用于增量调节：OMP106 (WO 97/41731和WO 96/34960)、HasR (PCT/EP99/03824)、PilQ (PCT/EP99/03823)、OMP85 (PCT/EP00/01468)、lipo06 (GB 9917977.2)、lipolO (GB 9918208.1)、lipoll (GB 9918302.2)、lipol8 (GB 9918038.2)、P6 (PCT/EP99/03038)、ompCD、CopB (Helminen ME等人(1993) Infect. Immun. 61: 2003-2010)、D15 (PCT/EP99/03822)、OmplAl (PCT/EP99/06781)、Hly3 (PCT/EP99/03257)、LbpA和LbpB (WO 98/55606)、TbpA和TbpB (WO 97/13785和WO 97/32980)、OmpE、UspAl和UspA2 (WO 93/03761)和Omp21。它们也适合作为可被异源引入到其它革兰氏阴性细菌中的基因。

下列基因中的一个或多个适用于减量调节：CopB、OMP106、OmpBl、TbpA、TbpB、LbpA和LbpB。

下列基因中的一个或多个优选地用于减量调节：htrB、msbB和lpxK。

下列基因中的一个或多个优选地用于增量调节：pmrA、pmrB、pmrE和pmrF。

本公开内容的免疫原性组合物可以另外包括来源于流感嗜血杆菌的OMV制剂。工程改造的OMV制剂可来源于如WO01/09350所述的流感嗜血杆菌。下列基因中的一个或多个(编码保护性抗原)优选地用于增量调节: D15 (WO 94/12641)、P6 (EP 281673)、TbpA (W096/40929; W095/13370)、TbpB (W096/40929; W095/13370)、P2、P5 (WO 94/26304)、OMP26 (WO 97/01638)、HMW1、HMW2、HMW3、HMW4、Hia、Hsf、Hap、Hin47和Hif (该操纵子中的所有基因均应被增量调节，以增量调节菌毛蛋白)。它们也优选地作为可被异源引入到其它革兰氏阴性细菌中的基因。

下列基因中的一个或多个优选地用于减量调节：P2、P5、Hif、IgAl-蛋白酶、HgpA、HgpB、HMW1、HMW2、Hxu、htrB、msbB和lpxK。

下列基因中的一个或多个优选地用于增量调节：pmrA、pmrB、pmrE和pmrF。

本公开内容的免疫原性组合物/疫苗还可任选地包括这样的抗原：其提供抗白喉、破伤风和百日咳博德特菌感染中的一种或多种的保护。百日咳博德特菌组分可以是杀死的全细胞百日咳博德特菌(Pw)或无细胞的百日咳博德特菌(Pa)，其包含来源于PT、FHA和69kDa百日咳杆菌粘附素的至少一种抗原（适当地2或所有3种）。通常，提供抗白喉和破伤风保护的抗原是白喉类毒素和破伤风类毒素。所述类毒素可以是化学灭活的毒素，或通过引入点突变而灭活的毒素。

免疫原性组合物/疫苗还可任选地包括一种或多种可以保护宿主免受无法分类的流感嗜血杆菌、RSV感染的抗原和/或一种或多种可以保护宿主免受流感病毒感染的抗原。这种疫苗可有利地用作通用中耳炎疫苗。

优选的无法分类的流感嗜血杆菌蛋白抗原包括丝束蛋白(US 5766608)和含有来自丝束蛋白的肽的融合蛋白(例如，LB1融合蛋白) (US 5843464-Ohio State Research Foundation)、OMP26、P6、蛋白D、TbpA、TbpB、Hia、Hmwl、Hmw2、Hap和D15。

优选的流感病毒抗原包括完整的、活的或灭活的病毒、分裂的流感病毒(其在卵或MDCK细胞中生长)或Vero细胞或完整的流感病毒体(如R. Gluck, Vaccine, 1992,10, 915-920所述)或其纯化或重组蛋白，诸如HA、NP、NA或M蛋白或其组合。

优选的RSV (呼吸道合胞病毒)抗原包括F糖蛋白、G糖蛋白、HN蛋白、M蛋白或其衍生物。

本公开内容的免疫原性组合物可包括：粘膜炎莫拉菌的蛋白，包括TbpA (W097/13785; W099/52947)、TbpB (W097/13785; W099/52947; Mathers等人FEMS Immunol Med Microbiol 1997 19; 231-236; Myers等人Infect Immun 1998 66; 4183-4192)、LbpA、LbpB (Du等人Infect Immun 1998 66; 3656-3665)、UspAl、UspA2 (Aebi等人Infect Immun. 1997 65; 4367-4377)、OMP106 (US6214981)、Ton-B依赖性的受体(WO00/78968)、CopB (Sethi等人Infect. Immun. 1997 65; 3666-3671)和HasR受体(WO00/78968)；流感嗜血杆菌的蛋白，包括HMW (St Geme等人Infect Immun 1998 66; 364-368)、Hia (St Geme等人J. Bacteriol. 2000 182; 6005- 6013)、Tbpl (W096/40929; W095/13370)、Tbp2 (W096/40929; W095/13370; Gray-Owen等人Infect Immun 1995 63; 1201-1210)、LbpA、LbpB (Schryvers等人1989、29: 121-130)、HasR、TonB依赖性的受体(Fleishmann等人Science 1995 269; 496-512)、血红蛋白结合蛋白、HhuA (Cope等人Infect Immun 2000 68; 4092-4101)、HgpA (Maciver等人Infect Immun 1996 64; 3703-3712)、HgbA、HgbB和HgbC (Jin等人Infect Immun 1996 64; 3134-3141)、HxuA (Cope等人Mol Microbiol 1994 13; 863-873)、HxuC (Cope等人Infect Immun 2001 69; 2353-2363)；来自脑膜炎奈瑟球菌的蛋白，包括Tbpl、Tbp2、FbpA、FbpB、BfrA、BfrB (Tettelin等人Science 2000 287; 1809-1815)、LbpA、LbpB和HmbR。

在本公开内容的一个方面，所述嵌合蛋白与第二抗原相组合，以提供能够产生针对脑膜炎奈瑟球菌L2免疫型的抗体应答的免疫原性组合物。在一个方面，所述免疫原性组合物可保护免于所有L1 - L12免疫型。在一个方面，所述第二抗原选自：L2 LOS、TdfI、Hap、Hsf、TdfH。在一个方面，所述第二抗原是TdfI。

所述能够产生针对脑膜炎奈瑟球菌L2免疫型的抗体应答的抗原可以是任意合适的抗原，适当地能够产生这样的免疫应答的抗原：所述免疫应答会保护或改善由L2血清型感染造成的感染或疾病。

所述第二抗原可以是全长“野生型”蛋白，或可以是其免疫原性的变体，诸如缺失、添加或置换突变体，或与野生型蛋白具有至少80%、至少85%、至少90%或至少95%同一性的多肽，或具有所述抗原的10、20、30、40、50或更多个邻接氨基酸的多肽。

在一个方面，所述抗原是这样的抗原：其由>50%、>60%、>70%、>80%、>90% 的脑膜炎奈瑟球菌L2免疫型和/或脑膜炎奈瑟球菌ST11克隆复合体(其中许多属于L2免疫型)编码或表达，更适当地，由基本上所有的脑膜炎奈瑟球菌L2免疫型和/或脑膜炎奈瑟球菌ST11克隆复合体编码或表达，且更适当地，其中%表达是关于在给定的国家或地区中循环的菌株来确定。

在一个方面，所述抗原选自：L2 LOS, Tdfl, Hap, Hsf (或其中2种或更多种抗原的组合)。这些抗原在下面更详细地讨论。

在本公开内容的一个方面，所述嵌合蛋白与对ST269克隆复合体有效的第二抗原相组合。在一个方面，所述对ST269克隆复合体有效的抗原选自：TdfI、Hap、Hsf、TdfH (或其中2种或更多种抗原的组合)。这些抗原在下面更详细地讨论。所述第二抗原可以是全长“野生型”蛋白，或可以是其免疫原性的变体，诸如缺失、添加或置换突变体，或与野生型蛋白具有至少80%、至少85%、至少90%或至少95%同一性的多肽，或具有所述抗原的10、20、30、40、50或更多个邻接氨基酸的多肽。

Hsf

Hsf具有与自体转运蛋白共用的结构。例如，来源于脑膜炎奈瑟球菌菌株H44/76的Hsf由下述部分组成：由氨基酸1-51构成的信号序列，表面暴露且包括可变区(氨基酸52-106、121-124、191-210和230-234)的在成熟蛋白（氨基酸52-479）氨基末端的头区，颈区（氨基酸480-509），疏水的α-螺旋区（氨基酸518-529），和其中4个跨膜链跨越外膜的锚定结构域（氨基酸539-591）。

适当地，将全长Hsf用于本公开内容的免疫原性组合物中。还可以使用各种Hsf截短物和缺失物，这取决于疫苗的类型。

在Hsf用于亚单位疫苗中的情况下，优选地使用可溶性过客结构域的一部分；例如氨基酸52-479的完全结构域，最适当地其保守部分，例如氨基酸134-479的特别有利的序列。Hsf的优选形式可被截短，以缺失在WO 01/55182中公开的蛋白的可变区。

适当的变体包括在WO 01/55182中限定的1、2、3、4、或5个可变区的缺失。上述序列和下面描述的那些可在N或C末端的任何一端或两端处伸展或截掉最多1、3、5、7、10或15个氨基酸。

Hsf的适当片段因此包括Hsf的整个头区，适当地包含氨基酸52-473。Hsf的其它优选片段包括表面暴露的头区，它包括一个或多个下列氨基酸序列：52-62、76-93、116-134、147-157、157-175、199-211、230-252、252-270、284-306、328-338、362-391、408-418、430-440和469-479。

在Hsf存在于外膜囊泡制剂中的情况下，它可被表达为全长蛋白，或适当地作为由氨基酸1-51和134-591的融合体组成的有利变体(产生氨基酸序列134至C末端的成熟外膜蛋白)。Hsf的优选形式可被截短，从而缺失WO 01/55182中公开的蛋白的可变区。优选的变体包括在WO 01/55182中限定的1、2、3、4、或5个可变区的缺失。在一个方面，所述第一个和第二个可变区缺失。

适当的变体是使氨基酸序列52-237或54-237之间的残基缺失，更适当地使氨基酸52-133或55-133之间的残基缺失。所述成熟蛋白可缺少信号肽。

Hap

对来源于脑膜炎奈瑟球菌的Hap-样蛋白进行的计算机分析显示出至少3个结构域。以来源于菌株H44/76的Hap-样序列为例，包含氨基酸1-42的结构域 1编码自体转运蛋白家族特征性的sec依赖性信号肽，包含氨基酸43-950的结构域 2编码很可能表面暴露且易进入免疫系统的过客结构域，包含残基951-C末端（1457）的结构域 3被预测编码可能装配成桶-样结构且被锚定在外膜中的β-链。因为结构域2可能是表面暴露、良好保守的（在所有试验菌株中超过80％）且可作为亚单位抗原在大肠杆菌中产生，因此它代表了目标疫苗候选物。因为结构域2和3很可能是表面暴露且良好保守的(Pizza等人，(2000), Science 287:1816-1820)，因此它们代表了目标疫苗候选物。结构域2被称作过客结构域。

本公开内容的免疫原性组合物可包括全长Hap蛋白，适当地被掺入到OMV制剂中。本公开内容的免疫原性组合物还可包括Hap的过客结构域（在菌株H44/76中，其由氨基酸残基43-950组成）。Hap的这一片段可特别有利地用于本公开内容的亚单位组合物中。Hap过客结构域的上述序列可在N或C末端之一或二者处伸展或截掉最多1、3、5、7、10、15、20、25或30个氨基酸。

Tdfl

奈瑟球菌抗原NMB0964 (NMB编号表示可从www.neisseria.org得到的脑膜炎奈瑟球菌B组基因组序列) [在菌株Z2491的脑膜炎奈瑟球菌A组基因组中称作NMA1161，且在WO 00/55327中称作BASB082，和称作ZnuD]是在奈瑟球菌属中保守的抗原，且可以诱导针对许多奈瑟球菌菌株的杀菌抗体。该抗原在细菌中起Zn²⁺受体的功能，且它的表达由培养基中的Zn²⁺水平调节。

在本文中的术语TdfI或NMB0964多肽包括，通常来自任意奈瑟球菌菌株的奈瑟球菌TdfI多肽(由tdfI基因编码)(所述蛋白在奈瑟球菌菌株中是如此确定的保守，它在任何具体奈瑟球菌菌株中的同一性可由本领域技术人员容易地确定)。该术语因此包括WO 00/55327的NMA1161序列和BASB082多肽序列(和本公开内容中关于BASB082多肽的所有多肽)。例如，本公开内容的Tdfl/ NMB0964多肽将覆盖WO00/55327的SEQ ID NO: 2，或与所述SEQ ID NO:2具有超过70、80、90或95%序列同一性的多肽，或包含来自所述SEQ ID NO: 2的7、10、12、15或20 (或更多)个邻接氨基酸的免疫原性片段的多肽(具体地，所述免疫原性片段能够引发（如果必要的话，当与蛋白载体相偶联时）可以识别所述SEQ ID NO: 2的免疫应答)。特别优选的NMB0964免疫原性片段实施方案是在图7的拓扑图中所示的那些胞外环序列，这也适用于任何给定的NMB0964序列。具体地，提供了第9个胞外环(其中所述2个Cys残基任选地形成或没有形成二硫键连接)。所述NMB0964免疫原性片段多肽序列可以与在图7中定义的、来自WO 00/55327的SEQ ID NO:2的胞外环序列具有超过70、80、90或95%序列同一性，或可以是包含在图7中定义的、来自WO 00/55327的SEQ ID NO:2的胞外环序列的7、10、12、15或20 (或更多)个邻接氨基酸的免疫原性片段的多肽(具体地，所述免疫原性片段能够引发（如果必要的话，当与蛋白载体相偶联时）可以识别WO 00/55327的SEQ ID NO: 2的免疫应答)，且被提供为本公开内容的NMB0964多肽。所述NMB0964免疫原性片段多肽序列可以与来自图7给出的第三个胞外环序列的序列具有超过70、80、90、95、99或100%序列同一性(其中任选地，所述2个Cys残基应当是保守的，且可以形成或未形成二硫键连接)，或可以是包含来自所述胞外环序列的7、10、12、15或20 (或更多)个邻接氨基酸的免疫原性片段的多肽(具体地，所述免疫原性片段能够引发（如果必要的话，当与蛋白载体相偶联时）可以识别WO 00/55327的SEQ ID NO: 2的免疫应答)，且被提供为本公开内容的NMB0964多肽。在一个实施方案中，所述NMB0964免疫原性片段多肽不是全长NMB0964 (成熟序列或具有信号序列)多肽。

在一个方面，NMB0964可以在亚单位疫苗方案中用作分离的抗原。

在另一个方面，所述NMB0964抗原可以以从奈瑟球菌种细菌制备的分离的外膜囊泡的形式和药学上可接受的赋形剂一起使用，其中所述奈瑟球菌种细菌生产足以提供囊泡生产水平的NMB0964多肽，所述囊泡当被施用给受试者时会引发抗-NMB0964抗体。这可以是由于例如如下遗传修饰奈瑟球菌种细菌的NMB0964多肽生产而实现：破坏Zur阻遏物(NMB1266，即在培养基中有Zn²⁺存在的情况下，关闭NMB0964的表达的蛋白)的功能表达；用不结合Zur的启动子（具体地，比内源NMB0964启动子更强的启动子，诸如lac启动子）替代NMB0964启动子；或通过使用含有低Zn²⁺ 浓度的培养基，即含有5、4、3、2、1、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1、0.05或0.01µM游离Zn²⁺ - (诸如Roswell Park Memorial Institute培养基1640 (RPMI)，通过ICP-MS测得其含有约1.69µM Zn²⁺)，或通过去除培养基中的Zn²⁺，例如使用已知的锌螯合剂诸如TPEN (N,N,N',N'-四(2-吡啶基甲基)乙二胺)，其应当足量地加入培养基中，使得NMB0964的表达最大化。

所述奈瑟球菌种细菌可以是荚膜多糖缺陷型，例如通过破坏siaD基因的功能表达。可以在msbB和/或htrB基因的功能表达中破坏它，以将外膜囊泡中的LOS解毒。可以在一个或多个下述基因的表达中破坏它：PorA、PorB、OpA、OpC、PilC或FrpB。可以在lgtB基因的功能表达中破坏它。这种破坏方法描述在WO 01/09350和WO2004/014417中。所述奈瑟球菌种细菌可以属于免疫型L2或L3。

从奈瑟球菌菌株制备或分离外膜囊泡(也称作微囊泡或泡)的方法是本领域众所周知的，且描述在WO 01/09350和WO2004/014417以及下文中。通常，如下分离外膜囊泡：通过不使用去污剂进行提取，或使用0-0.5、0.02-0.4、0.04-0.3、0.06-0.2或0.08-0.15% 去污剂（例如脱氧胆酸盐）进行提取，例如使用约或准确的0.1% 脱氧胆酸盐。

在NMB0964中富集在低Zn²⁺的特定培养条件中或从突变体脑膜炎奈瑟球菌菌株（其被工程设计成过表达NMB0964或去除通过Zur介导的锌抑制机理）制备的OMV疫苗，且与没有使用这些方法制备的OMV相比，这样的OMV可以引发良好的杀菌抗体应答。

在一个方面，本公开内容涉及一种免疫原性组合物，其包含：从奈瑟球菌种细菌制备的分离的外膜囊泡和药学上可接受的赋形剂，其中所述奈瑟球菌种细菌生产足以提供囊泡生产水平的NMB0964多肽，所述囊泡当被施用给受试者时会引发抗-NMB0964抗体。所述NMB0964多肽可以是所述奈瑟球菌种细菌的内源多肽。所述奈瑟球菌种细菌可以被遗传修饰成含有编码外源性NMB0964多肽的核酸。可以从含有内源启动子的NMB0964基因表达所述NMB0964多肽。可以遗传修饰所述奈瑟球菌种细菌的NMB0964多肽生产。通过破坏Zur阻遏物(NMB1266)的功能表达，可以遗传修饰所述奈瑟球菌种细菌。

可以将所述奈瑟球菌种细菌遗传修饰成，提供从异源启动子表达NMB0964多肽。在一个方面，所述异源启动子不会结合Zur阻遏物。在一个方面，所述异源启动子在所述奈瑟球菌种细菌中是比NMB0964基因的未抑制的内源启动子更强的启动子。在一个方面，所述异源启动子是IPTG可诱导的lac启动子。

在一个方面，由所述奈瑟球菌种细菌生产的NMB0964多肽的水平大于由在胰蛋白酶大豆培养基(TSB)中培养的脑膜炎奈瑟球菌菌株H44/76生产的水平。在一个方面，由所述奈瑟球菌种细菌生产的NMB0964多肽的水平等于或大于由在Roswell Park Memorial Institute培养基1640 (RPMI)中培养的脑膜炎奈瑟球菌菌株H44/76生产的水平。在一个方面，由所述奈瑟球菌种细菌生产的NMB0964多肽的水平等于或大于由在含有1µM TPEN (N,N,N',N'-四(2-吡啶基甲基)乙二胺)的Roswell Park Memorial Institute培养基1640 (RPMI)中培养的脑膜炎奈瑟球菌菌株H44/76生产的水平。在一个方面，由所述奈瑟球菌种细菌生产的NMB0964多肽的水平等于或大于在含有小于5、4、3、2、1、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1、0.05或0.01µM游离Zn²⁺的培养基中培养的脑膜炎奈瑟球菌菌株H44/76生产的水平。

在一个方面，所述奈瑟球菌种细菌是脑膜炎奈瑟球菌或脑膜炎奈瑟球菌血清群B。在一个方面，所述奈瑟球菌种细菌是荚膜多糖缺陷型。在一个方面，通过破坏siaD基因的功能表达，使所述奈瑟球菌种细菌是荚膜多糖缺陷型。在一个方面，破坏所述奈瑟球菌种细菌的msbB和/或htrB基因的功能表达。在一个方面，破坏所述奈瑟球菌种细菌的一个或多个下述基因的表达：PorA、PorB、OpA、OpC、PilC或FrpB。在一个方面，破坏所述奈瑟球菌种细菌的lgtB基因的功能表达。在一个方面，其中所述奈瑟球菌种细菌属于免疫型L2或L3。

在一个方面，通过用0-0.5、0.02-0.4、0.04-0.3、0.06-0.2或0.08-0.15% 去污剂（例如脱氧胆酸盐，例如使用约或准确的0.1% 脱氧胆酸盐）进行提取，分离出外膜囊泡。

在一个方面，本公开内容涉及生产免疫原性组合物的方法，所述方法包括: 培养生产NMB0964多肽的奈瑟球菌种细菌，其中在足以提供外膜囊泡生产的水平生产所述NMB0964多肽，所述外膜囊泡当被施用给受试者时会引发抗-NMB0964抗体；从培养的细菌制备外膜囊泡；和将所述外膜囊泡与药学上可接受的赋形剂相组合，以生产适合与fHbp多肽组合地施用给受试者的免疫原性组合物。在一个方面，所述NMB0964多肽是所述奈瑟球菌种细菌的内源多肽。在一个方面，所述奈瑟球菌种细菌已经被遗传修饰成含有编码外源性NMB0964多肽的核酸。在一个方面，从含有内源启动子的NMB0964基因表达所述NMB0964多肽。在一个方面，已经遗传修饰所述奈瑟球菌种细菌的NMB0964多肽生产。在一个方面，通过破坏Zur阻遏物(NMB1266)的功能表达，已经遗传修饰所述奈瑟球菌种细菌。在一个方面，所述奈瑟球菌种细菌已经被遗传修饰成，提供从异源启动子表达NMB0964多肽。在一个方面，所述异源启动子不会结合Zur阻遏物。在一个方面，所述异源启动子在所述奈瑟球菌种细菌中是比NMB0964基因的未抑制的内源启动子更强的启动子。在一个方面，所述异源启动子是IPTG可诱导的lac启动子。在一个方面，由所述奈瑟球菌种细菌生产的NMB0964多肽的水平大于由在胰蛋白酶大豆培养基(TSB)中培养的脑膜炎奈瑟球菌菌株H44/76生产的水平。在一个方面，由所述奈瑟球菌种细菌生产的NMB0964多肽的水平等于或大于由在Roswell Park Memorial Institute培养基1640 (RPMI)中培养的脑膜炎奈瑟球菌菌株H44/76生产的水平。在一个方面，由所述奈瑟球菌种细菌生产的NMB0964多肽的水平等于或大于由在含有1µM TPEN (N,N,N',N'-四(2-吡啶基甲基)乙二胺)的Roswell Park Memorial Institute培养基1640 (RPMI)中培养的脑膜炎奈瑟球菌菌株H44/76生产的水平。在一个方面，由所述奈瑟球菌种细菌生产的NMB0964多肽的水平等于或大于在含有小于5、4、3、2、1、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1、0.05或0.01µM游离Zn²⁺的培养基中培养的脑膜炎奈瑟球菌菌株H44/76生产的水平。在一个方面，在含有小于5、4、3、2、1、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1、0.05或0.01µM游离Zn²⁺的培养基中，培养所述奈瑟球菌种细菌。

在一个方面，在含有Zn²⁺ 螯合剂的培养基中，培养所述奈瑟球菌种细菌。在一个方面，Zn²⁺ 螯合剂以0.01-100、0.1-10、0.3-5或0.5-1µM的浓度存在于培养基中。在一个方面，存在于培养基中的Zn²⁺ 螯合剂是TPEN，适当地在1-25µM的浓度范围，适当地在5µM、10µM、15µM、20µM或25µM的浓度。

在一个方面，通过用0-0.5、0.02-0.4、0.04-0.3、0.06-0.2或0.08-0.15% 去污剂（例如脱氧胆酸盐，例如使用约或准确的0.5%或0.1% 脱氧胆酸盐）进行提取，进行制备外膜囊泡的步骤。在一个方面，不使用去污剂进行制备外膜囊泡的步骤。

在一个方面，所述fHbp多肽与下述多肽和药学上可接受的载体相组合：与下述序列RDQYGLPAHSHEYDDCHADIIWQKSLINKRY LQLYPHLLTEEDIDYDNPGLSCGFHDDDNAHAHTHS具有超过50、60、70、80、90、95、99或100%序列同一性的肽序列；或包含来自所述序列的7、10、12、15或20 (或更多)个邻接氨基酸的免疫原性片段的多肽（任选地，其中所述肽序列或所述免疫原性片段能够引发（如果必要的话，当与蛋白载体相偶联时）可以识别WO 00/55327的SEQ ID NO: 2的免疫应答）。在一个方面，2个Cys残基存在于所述多肽中，且可以通过二硫键相连。在一个方面，所述多肽不是全长成熟的NMB0964多肽，或不是含有完整信号序列的全长NMB0964多肽。

LPS(脂多糖，也被称作LOS-脂寡糖)是奈瑟球菌的外膜上的内毒素。已知LPS的多糖部分可诱导杀菌抗体。在Verheul Microbiological reviews, 1993年3月, 第57卷, 第1期, 第34–49页中，描述了Los的结构和功能。

LPS寡糖部分内的异质性在不同的奈瑟球菌菌株之间产生结构和抗原多样性(Griffiss等人，Inf. Immun. 1987；55:1792-1800)。这已被用于将脑膜炎球菌菌株细分成12个免疫型(Scholtan等人，J Med Microbiol 1994，41: 236-243)。免疫型L3、L7和L9在免疫学上和在结构上是相似的(或甚至是相同的)，并因此已被命名为L3、7、9(或，为了本说明书的目的，统称为“L3”)。脑膜炎球菌LPS L3、7、9(L3)、L2和L5可通过唾液酸化而被修饰，或通过加入胞苷5'-一磷酸-N-乙酰基神经氨酸而被修饰。参见M. P. Jennings等人, Microbiology 1999,145, 3013-3021和Mol Microbiol 2002, 43: 931-43，其中进一步例证了LPS的结构和异质性。

L2 LOS定义了L2免疫型，并因而是补充基于fHbp的疫苗的潜在抗原。

L2 LOS适当地产生能够杀死奈瑟球菌2免疫型的抗体。在一个方面，在本文中提及的L2 LOS包括L3V菌株。L2 LOS可以存在于外膜囊泡(OMV)中，适当地其中用低百分比的去污剂（更适当地，0-0.5%、0.02- 0.4%、0.04-0. 3%、0.06-0. 2%、0. 08-0. 15%或0.1%，最适当地，脱氧胆酸盐[DOC]）提取囊泡，但是还可以是亚单位疫苗的一部分。

LOS可原样使用，或与T-细胞表位（诸如破伤风类毒素、白喉类毒素、CRM-197或OMV外膜蛋白）的来源缀合使用。

可以将L2 LOS解毒。

关于LOS的选择和制备，在下面更详细地描述了所有这些方面的细节。

在LPS（适当地脑膜炎球菌LPS）被包括在本公开内容的疫苗中的情况下，适当地存在免疫型L2和L3之一或二者。

在一个方面，所述第二抗原是这样的脑膜炎球菌LPS：其至少具有在内核的Hep II上的6位处的PEA，具有或没有在该Hep II上的第二PEA或葡萄糖。

在本文公开抗原组合的情况下，它们可以同时地（例如在混合物中）或伴随地或顺序地递送，且可以形成试剂盒的组分。

在一个方面，本公开内容也涉及药物组合物，其包含与药学上可接受的赋形剂相组合的融合蛋白。合适的赋形剂是本领域众所周知的。合适的赋形剂通常是大的、缓慢代谢的大分子，诸如蛋白、糖类、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合的氨基酸、氨基酸共聚物、蔗糖(Paoletti等人, 2001, Vaccine, 19:2118)、海藻糖(WO 00/56365)、乳糖和脂质聚集体(诸如油小滴或脂质体)。这样的载体是本领域普通技术人员熟知的。所述疫苗也可以含有稀释剂，诸如水、盐水、甘油等。另外，可以存在辅料，诸如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂等等。无菌的无热原的、磷酸盐缓冲的生理盐水是典型的载体。药学上可接受的赋形剂的彻底讨论，可参见：Gennaro, 2000, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 第20版, ISBN:0683306472。

本公开内容的一个优选实施方案是，本文公开的融合蛋白或其它免疫原性组合物在疫苗中的制剂，其也可以包含药学上可接受的赋形剂或载体。

疫苗制剂一般地描述在：Vaccine Design (“The subunit and adjuvant approach”(Powell M. F. 和Newman M. J.编) (1995) Plenum Press New York)中。

有效疫苗的开发需要可靠的实验，以确定在接种疫苗的个体中是否已经引发有效的免疫应答。就脑膜炎奈瑟球菌而言，可以使用血清杀菌活性(SBA)试验来测定适合包含在任何疫苗中的抗原，且适当地，SBA的4倍增加可以接受为保护替代物。因而，会诱导SBA的4倍增加的剂量可以接受为保护剂量或有效量。具体地，本发明的疫苗或免疫原性组合物可以包含(或大于)0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10 μg每种列举的(分离的和/或纯化的)抗原在组合物中的人剂量。

本公开内容的药物组合物或疫苗也可以包含佐剂。

适宜的佐剂包括铝盐如氢氧化铝凝胶(明矾)或磷酸铝，但还可以是钙盐(特别是碳酸钙)、铁盐或锌盐，或可以是酰化的酪氨酸或酰化的糖、阳离子或阴离子衍生的多糖或聚磷腈的不溶性悬浮液。

可使用的适宜Thl佐剂系统包括单磷酰基脂类A，特别是3-脱-O-酰化单磷酰基脂类A和单磷酰基脂类A、适当地3-脱-O-酰化单磷酰基脂类A(3D-MPL)与铝盐(适当地磷酸铝)的组合。增强的系统包括单磷酰基脂类A和皂苷衍生物的组合，特别是WO 94/00153中公开的QS21与3D-MPL的组合，或如WO 96/33739中公开的反应原性较低的组合物，其中用胆固醇猝灭QS21。WO 95/17210中描述了特别有效的、包含QS21 3D-MPL和生育酚的水包油乳液的佐剂，且其是优选的制剂。

所述疫苗可包括皂苷，更适当地QS21。它还可包括水包油乳液和生育酚。含有未甲基化的CpG的寡核苷酸(WO 96/02555)也是TH1应答的优选诱导剂，且适用于本公开内容。

本公开内容的另一个方面是，制备用于预防或治奈瑟球菌感染的免疫球蛋白的方法，所述方法包括下述步骤：用本公开内容的疫苗使受体免疫，并从所述受体分离出免疫球蛋白。通过该方法制备的免疫球蛋白是本公开内容的另一个方面。包含本公开内容的免疫球蛋白以及药学上可接受的载体的药物组合物是本公开内容的另一个方面，其可用于生产药物，所述药物用于治疗或预防奈瑟球菌病。用于治疗或预防奈瑟球菌感染的方法是本公开内容的另一方面，该方法包括下述步骤：给患者施用有效量的本公开内容的药物制剂。

通常如下制备用于多克隆抗体生产的接种物：将抗原性组合物分散在适于人类使用的生理学耐受的稀释剂（如生理盐水或其它佐剂）中，从而形成含水组合物。将免疫刺激量的接种物施用给哺乳动物，然后使接种的哺乳动物维持足以使抗原性组合物诱导保护性抗体的一段时间。

通过熟知的技术，如亲和色谱法(Harlow和Lane Antibodies；a laboratory manual 1988)，可以分离抗体至所需的程度。

抗体可包括来源于通常使用的各种动物（例如，山羊、灵长类动物、驴、猪、马、豚鼠、大鼠或人）的抗血清制剂。从所述动物抽血，并回收血清。

按照本公开内容生产的免疫球蛋白可包括完整的抗体、抗体片段或亚片段。抗体可以是任何种类（例如IgG、IgM、IgA、IgD或IgE）的完整免疫球蛋白、嵌合抗体或对本公开内容的两种或多种抗原具有双重特异性的杂交抗体。它们还可以是片段，例如F(ab')₂、Fab’、Fab、Fv等，包括杂交片段。免疫球蛋白还包括天然的、合成的或基因工程改造的蛋白，它们可通过与特异性抗原结合形成复合体而像抗体一样发挥作用。

可将本公开内容的疫苗施用给受体，所述受体然后作为免疫球蛋白的来源，所述免疫球蛋白响应于特定疫苗的攻击而产生。然后经由常规的血浆分级分离方法，从如此治疗过的受试者所捐献的血浆中获得超免疫球蛋白。将所述超免疫球蛋白施用给另一受试者，从而产生针对奈瑟球菌感染的抗性或治疗奈瑟球菌感染。本公开内容的超免疫球蛋白具体地可用于治疗或预防儿童、免疫受损个体中的奈瑟球菌病，或需要治疗且个体不会响应于疫苗接种而产生抗体的情况。

本公开内容的另一方面是一种药物组合物，它包含对本公开内容的免疫原性组合物的至少两种组分具有反应性的两种或多种单克隆抗体（或其片段；适当地人的或人源化的），该药物组合物可用于治疗或预防革兰氏阴性细菌（适当地奈瑟球菌属，更适当地脑膜炎奈瑟球菌或淋病奈瑟球菌，最适当地脑膜炎奈瑟球菌血清群B）的感染。

这种药物组合物包括单克隆抗体，所述单克隆抗体可以是任何种类（例如IgG、IgM、IgA、IgD或IgE）的完整免疫球蛋白、嵌合抗体或对本公开内容的两种或多种抗原具有特异性的杂交抗体。它们还可以是片段，例如F(ab')₂、Fab’、Fab、Fv等，包括杂交片段。

制备单克隆抗体的方法是本领域熟知的，且可以包括：脾细胞与骨髓瘤细胞的融合体(Kohler和Milstein 1975 Nature 256；495; Antibodies-a laboratory manual Harlow and Lane 1988)。或者，通过筛选适宜的噬菌体展示库可获得单克隆Fv片段(Vaughan TJ等人，1998 Nature Biotechnology 16；535)。利用已知方法，可以人源化或部分人源化单克隆抗体。

本公开内容的另一个方面涉及治疗或预防奈瑟球菌病的方法，所述方法包括：给有此需要的宿主施用保护剂量(或有效量)的本公开内容的疫苗。

本公开内容还包括本公开内容的融合多肽在制备用于治疗或预防奈瑟球菌感染或疾病的药物中的用途，和用于治疗或预防脑膜炎奈瑟球菌感染或疾病的本文所述的融合蛋白。

在一个方面，所述预防是预防免于menB感染和/或疾病。

所述宿主适当地是人宿主。

本公开内容的疫苗制剂可用于保护或治疗易于感染的哺乳动物，其中经由全身或粘膜途径施用所述疫苗。这些给药可包括经由肌内、腹膜内、真皮内或皮下途径的注射；或经由粘膜施用给口腔/消化道、呼吸道、泌尿生殖道。因此，本公开内容的一个方面是使人类宿主免疫而抗革兰氏阴性菌感染所引起的疾病的方法，该方法包括：给所述宿主施用免疫保护剂量的本公开内容的制品。

选择每个疫苗剂量中的抗原的量，作为会诱导免疫保护应答且没有一般疫苗的明显不利副作用的量。这种量可随所用的特定免疫原以及如何提供而变化。通常，预期每个剂量包含1 -100 pg蛋白抗原或OMV制剂，适当地5-50pg，且最一般在5-25 pg的范围内。

通过标准研究可以确定特定疫苗的最佳量，所述标准研究包括：观察受试者中的适宜免疫应答。

在初次疫苗接种后，受试者可接受一次或若干次适当间隔的加强免疫。

本公开内容的疫苗适当地是免疫保护性的且无毒的，并适合儿童和青少年使用。

儿科使用是指，用于小于4岁的儿童。

免疫保护性的是指，令人满意地满足上述SBA和/或动物保护模型和/或粘附阻断试验。

无毒的是指，通过众所周知的LAL和致热原性试验测得，疫苗中的内毒素活性水平不大于令人满意的水平。

通过多种试验，可以评估疫苗的功效。在动物模型中的保护试验是本领域熟知的。此外，血清杀菌试验(SBA)是用于估测脑膜炎球菌疫苗的功效的最普遍认可的免疫学标记(Perkins等人J Infect Dis. 1998,177: 683-691)。

这种协同应答可通过由抗原组合引发的SBA来表征，所述SBA比由每种抗原单独引发的SBA高至少50％、2倍、3倍、适当地4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍和最适当地10倍。在一个方面，相对于衍生出抗原的同源性菌株来测量SBA，且适当地相对于一组异源菌株进行测量(见下面代表性小组，例如属于A-4簇的BZ10(B:2b:P1.2)；属于ET-37复合体的B16B6(B:2a:P1.2)；H44/76(B:15:P1.7,16))、NZ124/98 (B:4:P1.7-2,4:L3 ST-44复合体),和760676 (B:2a:P1.5,2:L2 ST-11复合体)。SBA是用于评估脑膜炎球菌疫苗功效的最普遍认可的免疫学标记(Perkins等人J Infect Dis. 1998, 177: 683-691)。通过任何已知方法可测定令人满意的SBA。利用从动物模型或从人类受试者获得的血清，可以进行SBA。

用人血清进行SBA的选方法如下。在第一次疫苗接种前、第二次疫苗接种后2个月和第三次疫苗接种后1个月（在1年中进行3次疫苗接种是一般的人类初次疫苗接种程序，例如在第0、2和4个月或第0、1和6个月时施用），采集血液样品。这种人类初次疫苗接种程序可对1岁以下的婴儿进行（例如，与Hib疫苗接种同时进行），或也可给2-4岁的儿童或青少年接种，以测试这种初次疫苗接种程序的SBA。如果适合，可在初次疫苗接种后6-12个月以及激发剂量后1个月，再次采集血液样品。

如果在(初次疫苗接种程序的)第三疫苗剂量后一个月(在2-4岁儿童或青少年中，但适当地在生命第一年的婴儿中)，针对衍生出本公开内容的抗原的脑膜炎球菌菌株的SBA(抗体稀释)效价(与疫苗接种前效价相比)增加4倍的受试者的百分比超过30％、适当地超过40％、更适当地超过50％、最适当地超过60％受试者，那么对于具有同源杀菌活性的抗原或泡制剂而言，SBA是令人满意的。

当然，如果它也可相对于衍生它的脑膜炎球菌菌株引发令人满意的SBA的话，则具有异源杀菌活性的抗原或泡制剂也可构成具有同源杀菌活性的泡制剂。

如果在(初次疫苗接种程序的)第三疫苗剂量后一个月(在2-4岁儿童或青少年中，但适当地在生命第一年的婴儿中)，针对脑膜炎球菌的3种异源菌株的SBA(抗体稀释)效价(与疫苗接种前效价相比)增加4倍的受试者的百分比超过20％、适当地超过30％、更适当地超过35％、最适当地超过40％受试者，那么对于具有异源杀菌活性的抗原或泡制剂而言，SBA是令人满意的。这种试验是具有异源杀菌活性的抗原或泡制剂是否可诱导针对各种脑膜炎球菌菌株的交叉杀菌抗体的良好指示。所述三种异源菌株应当适当地具有彼此不同且适当地与制备或衍生出具有异源杀菌活性的抗原或泡制剂的菌株不同的电泳型（ET）-复合体或多基因座序列分型(MLST)模式(参见Maiden等人PNAS USA 1998,95: 3140-5)。本领域技术人员能够容易地测定具有不同ET-复合体的三种菌株，其可反映在脑膜炎球菌之间（特别是脑膜炎球菌B型菌株之间）观察到的基因多样性，所述基因多样性被认为是重要疾病负担的原因和/或代表认可的MenB剧毒谱系(参见Maiden等人同上)。例如，可使用的三种菌株是下列：属于A-4簇的BZ10(B:2b:P1.2)；属于ET-37复合体的B16B6 (B:2a:P1.2)；和属于ET-5复合体的H44/76(B:15:P1.7,16)，或属于同一ET/簇的任何其它菌株。这种菌株可用于测试从例如属于ET-5复合体的脑膜炎球菌菌株CU385(B:4:P1.15)制备或衍生的、具有异源杀菌活性的抗原或泡制剂。可使用的其它样品菌株来源于谱系3流行性克隆(例如，NZ124[B:4:P1.7,4])。另一个ET-37菌株是NGP165(B:2a:P1.2)。

测量SBA活性的方法是本领域已知的。例如，在WO 99/09176的实施例10C中描述了可使用的方法。在一般情况中，在生长的对数期（适当地在铁缺失的条件中——通过向生长培养基中加入铁螯合剂如EDDA，或在锌缺失的条件中——通过向诸如MH琼脂等生长培养基中加入锌螯合剂如TPEN），培养要测试的菌株培养物。可将其悬浮在具有BSA的培养基（如具有0.3％BSA的Hanks培养基）中，以便获得调至约20000 CFU/ml的工作细胞悬浮液。通过将一系列要测试的2倍稀释的血清（适当地在56℃热灭活30分钟）[例如，50 μl/孔体积]和20000 CFU/ml要测试的脑膜炎球菌菌株悬浮液（例如，25 μl/孔体积）混合，可以制备一系列反应混合物。应温育（例如，37℃15分钟）并振摇（例如，210rpm）反应瓶。终反应混合物[例如，100 μl体积]还可包含补体源[如，25%终体积的预试幼兔血清]，并按照上面所述温育[例如，37℃60分钟]。无菌的聚苯乙烯U-底96-孔微量滴定平板可用于该试验。可使用多道移液器从每个孔中采集等分试样[例如，10 μl]，滴在Mueller-Hinton琼脂平板(适当地含有1% Isovitalex和1%热灭活的马血清)上，并温育(例如，在37℃、5％CO₂中温育18小时)。在一个方面，单独的菌落可计数高达80 CFU/等分试样。将下列三种试验样品用作对照：缓冲液+细菌+补体；缓冲液+细菌+灭活补体；血清+细菌+灭活补体。可使用程序直接计算SBA效价，该程序可对数据进行加工，得到稀释度的测量值，该测量值与通过回归计算得到的50%细胞杀死相对应。

或者，通过抗原组合在动物保护试验中的功效，表征协同应答。例如，可使用实施例12或13中描述的试验。在一个方面，与使用抗原自身（特别是次优剂量的抗原）相比，通过抗原组合而保护的动物的数量明显增加。

用于防止淋病奈瑟球菌感染的成功疫苗可能需要不止一个下列要素：血清和/或粘膜抗体的产生以促进补体介导的淋病双球菌杀死，和/或增强白细胞如多形核白细胞的吞噬作用和微生物杀死，和/或防止淋病双球菌附着于宿主组织；细胞介导的免疫应答的诱导也可参与保护。

可以如下评价本公开内容的泡淋病疫苗制剂的功效的提高：通过分析诱导的血清和/或粘膜抗体的免疫应答，它们具有抗粘附和/或调理性质和/或杀菌活性，如其它人所述(McChesney D等人, Infect. Immun. 36:1006, 1982；Boslego J等人：Efficacy trial of a purified gonococcl pilus vaccine, in Program and Abstracts of the 24th Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy, Washington, American Society for Microbiology, 1984；Siegel M等人，J. Infect. Dis 145:300, 1982；de la Pas, Microbiology, 141(Pt4):913-20,1995)。

近来已经描述了淋病奈瑟球菌的生殖器感染的小鼠模型(Plante M, J. Infect. Dis.，182:848-55，2000)。还可通过其防止或降低淋病奈瑟球菌在这种小鼠感染模型中定居的能力，评价本公开内容的泡淋病疫苗功效的提高。

或者，通过抗原组合在粘附阻断试验中的功效，可以表征协同应答。在一个方面，与使用抗原自身产生的抗血清、特别是次优剂量的抗体相比，由针对抗原组合产生的抗血清诱导的阻断程度显著提高。

在本申请中的所有参考文献（包括专利申请和授权的专利）的教导，都通过引用完整地并入本文。本申请要求其优先权的任何专利申请以本文中关于出版物和参考文献所述的方式通过引用整体并入本文。

为了避免疑惑，发明人在本文中意图用术语“包含”和“包括”表示，在每种情况下，任选地可被术语“由……组成”替换。如在本说明书和权利要求书中使用的，词语“包含”(和包含的任意形式)、“具有”(和具有的任意形式)、“包括”(和包括的任意形式)或“含有”(和含有的任意形式)是包括性的或开放式的，且不排除额外的、未列举的要素或方法步骤。

本文中关于本公开内容的“疫苗组合物”的实施方案也适用于关于本公开内容的“免疫原性组合物”的实施方案，反之亦然。在所有数字值前的术语“约”(或“大约”)允许5% 偏差，即约1.25%的值是指1.19%-1.31%。

当在权利要求书和/或说明书中结合术语“包含”使用时，使用的词语“一个”或“一种”可以表示“一个(种)”，但是也与“一个(种)或多个(种)”、“至少一个(种)”和“一个(种)或超过一个(种)”相一致。在权利要求书中使用的术语“或”用于表示“和/或”，除非明确地指出仅表示替代方案，或所述替代方案是相互排斥的，尽管本公开内容支持仅表示替代方案和“和/或”的定义。在本申请的通篇中，术语“约”用于表示，数值包括测定所述数值所用的装置、方法所固有的误差变化，或者研究受试者之间存在的变化。

本文使用的术语“或其组合”表示，在所述术语前面列出的项目的所有变换和组合。例如，“A、B、C或其组合”意图包括A、B、C、AB、AC、BC或ABC中的至少一个，且如果在特定背景下次序是重要的，也包括BA、CA、CB、CBA、BCA、ACB、BAC或CAB。继续演化该实例，特别地包括含有一个或多个项目或术语的重复的组合，诸如BB、AAA、BBC、AAABCCCC、CBBAAA、CABABB、诸如此类。技术人员会理解，通常不存在关于任意组合中的项目或术语的数目的限制，除非从上下文中另外显而易见。

本文提及的泡、囊泡和外膜囊泡也意图表示，本领域技术人员已知的所有分离的膜衍生的蛋白性产物，诸如泡、微囊泡、OMV、OMPC (外膜蛋白复合体)或膜空壳等等。

在本文中的所有情况下提及的“为了保护”和“为了治疗”可以分别替代性地书写为“用于预防”或“用于治疗”。

考虑到本公开内容，无需过多实验，可以制备和执行在本文中公开的和要求保护的所有组合物和/或方法。尽管已经以特定实施方案的方式描述了本公开内容的组合物和方法，本领域技术人员会明白，可以对所述组合物和/或方法和本文所述方法的步骤或步骤的次序做出变化，而不脱离本公开内容的概念、精神和范围。本领域技术人员显而易见的所有这样的类似的替代和修改视作在所附权利要求书定义的本公开内容的精神、范围和概念内。

应该理解，本文所述的特定实施方案以例证的方式显示，而不是显示为本公开内容的限制。本公开内容的基本特征可以用于不同的实施方案中，而不脱离本公开内容的范围。本领域技术人员仅仅使用常规研究会认识到或能够确定本文所述的具体操作的众多等效方式。这样的等效方式被视作在本公开内容的范围内，且被权利要求覆盖。在本说明书中提及的所有出版物和专利申请都指示本公开内容所属领域的技术人员的技术水平。所有出版物和专利申请都通过引用并入本文，其程度如同特别地且单个地指出每篇单独的出版物或专利申请通过引用并入。

将通过参考下述的非限制性的实施例，进一步描述本公开内容：

实施例1

融合蛋白的生产

1. 在大肠杆菌菌株中表达来自fHbp的不同融合蛋白。

表1

2. 宿主菌株：

T7 Express感受态大肠杆菌(NEB目录号C2566H)：增强的BL21衍生物。在lac操纵子中的T7 RNA聚合酶–没有λ原噬菌体。蛋白酶Lon和OmpT缺陷型。可抗噬菌体T1 (fhuA2) 。不限制甲基化的DNA (McrA^-、McrBC^-、EcoBr^-m^-、Mrr^-)。B菌株。没有动物产物。基因型：fhuA2 lacZ::T7 gene1 [lon] ompT gal sulA11 R(mcr-73::miniTn10--Tet^S)2 [dcm] R(zgb-210::Tn10--Tet^S) endA1Δ(mcrC-mrr)114::IS10：

3. 重组蛋白：

本文例证的融合体的B族部分从全长MC58序列的氨基酸位置73开始，该全长序列自身包含从氨基酸66开始的成熟序列(7个N-端氨基酸(CSSGGGG - SEQ ID NO. 11)被MHHHHHH (SEQ ID NO. 12)替代，以允许纯化)。

所述融合体的MC58部分在残基200处结束(….DIA)，如果我们考虑全长MC58蛋白序列的编号，全长序列的残基200对应着成熟的MC58序列的残基135。

本文例证的融合体的8047部分在全长( 273个氨基酸) 8047蛋白序列的残基155处开始(GEH…)。肽GEHT (残基155-158 - SEQ ID NO. 13)在A和B族中是相同的，所述2个部分之间的接头是Gly残基。全长序列的残基155对应着所述成熟序列的残基136。

表2

* 序列比对参见图1和2。

4. 重组蛋白的表达：

4.1- 转化

通过标准方法，用CaCl₂处理过的细胞，转化含有质粒DNA的大肠杆菌T7 Express (Hanahan D. «Plasmid transformation by Simanis. »见Glover, D. M. (编), DNA cloning. IRL Press London. (1985):第109-135页)。

重组质粒ID	宿主菌株	琼脂平板
			LVL489、LVL490、LVL491、LVL511、LVL512、LVL513和LVL514	T7 ExpressA	LB+琼脂-1.5%B 40µg/ml卡那霉素C

A: NEB (目录号C2566H)

B: BBL^TM Select APS^TM LB培养基基础, BD, MD, 美国(目录号: 292438)；琼脂, Laboratoire MAT, QC, 加拿大(目录号: AP-0108)

C: Sigma, ON, 加拿大(目录号: K-4000)。

4.2- 培养

将接种了来自转化(第5.1部分)的大肠杆菌T7 Express + 质粒的铺满的琼脂平板划线，重新悬浮于培养基中，并用于接种800 ml LB培养基(BD)±1% (w/v)葡萄糖(Laboratoire MAT, 目录号: GR-0101) +抗生素(如在第5.1部分中所述)，以得到0.1-0.2的O.D._600nm。

在37℃、250 RPM温育培养物，直到O.D._600nm为约0.8。在此时，收集1 ml每种培养物，在14 000 RPM离心5分钟，并分别在-20℃冷冻上清液/沉淀物。

4.3- 诱导

在O.D._600nm约0.8，冷却(-20℃、20分钟)培养物T7 Express，然后通过加入1 mM异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG; EMD化学试剂Inc., 目录号: 5815)，诱导重组蛋白的表达，并在22℃、250 RPM温育过夜。

4.4- 诱导后制备样品

在过夜诱导(约16小时)以后，在诱导后评价O.D._600nm，并将培养物在14 000 RPM离心5分钟，并分别在-20℃冷冻上清液/沉淀物。

5. 纯化：

将细菌沉淀物重新悬浮于20 mM n,n-双(2-羟乙基)甘氨酸缓冲液(pH 8.0)中，所述缓冲液含有500 mM NaCl和蛋白酶抑制剂的混合物(Complete, Roche)。使用Constant System 1.1 KW 2 X 30 000 PSI，裂解细菌。通过在4℃在20 000 g离心20 min，分离可溶性的（上清液）和不溶性的（沉淀物）组分。

使用Profinia标准方案(流速: 2 ml / min)，在天然条件下在IMAC上纯化6-His标记的蛋白。将可溶性的组分装载上5ml His Trap柱(BioRad)，该柱用与用于细菌重悬浮的相同缓冲液预平衡。在装载该柱以后，用相同缓冲液洗涤该柱。我们使用含有500 mM NaCl、10 mM咪唑的20 mM n,n-双(2-羟乙基)甘氨酸缓冲液(pH 8.0)进行第二次洗涤。使用含有500 mM NaCl和250 mM咪唑的20mM n,n-双(2-羟乙基)甘氨酸缓冲液(pH 8.0)，进行洗脱。使用PBS 1X pH 7.4，透析蛋白，并使用BioRad的DC Protein试验，测定剂量。

SDS-Page：

凝胶：NuPAGE 4-12% Bis-Tris凝胶1.0mm X 15孔(Invitrogen目录号: NP0323BOX)

在供应商(Invitrogen)推荐的条件下，进行样品、缓冲液和迁移条件的准备。

蛋白印迹：

在供应商(Invitrogen)推荐的条件下，进行缓冲液和迁移条件的准备。

使用3% 乳/ PBS 1X新鲜溶液，在37℃、60 RPM封闭膜30分钟。在封闭温育以后，分别以在3% 乳/ PBS 1X新鲜溶液中的1:1000或1:400稀释度，加入由α-6XHis Tag (AbCam, 目录号: ab9108-100)或α-fHbpA (200802032集合g2, 18/06/08 D42)组成的第一抗体1小时（在37℃、60 RPM）。此后，使用0.02% 吐温20 / PBS 1X，在室温洗涤膜3次各5分钟。使用山羊抗-兔碱性磷酸酶(Jackson laboratory, 目录号: 111-055-144)（在3% 乳/ PBS 1X新鲜溶液中的1:14 000稀释度）或山羊碱性磷酸酶抗-IgG + IgM (H+L)小鼠(Jackson laboratory, 目录号: 115-055-068))（在3% 乳/ PBS 1X新鲜溶液中的1:6 000稀释度），加入第二抗体。在37℃、60 RPM温育膜1小时。此后，使用0.02% 吐温20 / PBS 1X在室温洗涤膜3次各5分钟，然后在供应商推荐的条件下将膜曝光于碱性磷酸酶底物(Sigma Fast NBT/BCIP, 目录号:B5655-25TAB)。

实施例 2

融合蛋白A

该融合体包含B族MC58成熟蛋白序列的一部分(残基1至残基135)和A族8047成熟蛋白序列的一部分(残基136至残基254)。在该融合体中，2个残基(Glu217和Thr238)（M.C. Schneider等人将它们鉴别为参与所述蛋白的因子H结合功能）被突变为丙氨酸。

在核酸序列中的这些突变：

密码子GAA (nT 649, Glu217)被突变为密码子GCA (Ala217, *)

密码子ACC (nT 712, Thr238)被突变为密码子GCC (Ala238; *)

该融合体的序列- SEQ ID No.20 (长度：254个氨基酸)：

加下划线的序列是来自菌株MC58的B族序列。所述融合体的其它部分是来自菌株8047的A族序列。

对应的核酸序列(SEQ ID No. 21)：

图3显示了融合体A的潜在结构。

实施例 3

融合蛋白B (SEQ ID NO. 22和23)

鉴于Glu238不是在可以结合因子H的所有菌株中都是保守的，该残基对于该结合而言可能不是关键性的。因而，提出了融合蛋白B。

该融合体是基于这样的融合体A：其中仅氨基酸Glu217 (在所有分析的菌株中是保守的，且非常可能参与因子H结合)被突变为Ala217。

图4显示了融合体B的潜在结构。

实施例 4

融合蛋白C

该融合体是基于这样的融合体A：其另外包括一些突变，所述突变的导入用于恢复在融合体A和B中缺少的B族MAb502表位。

B族成熟蛋白序列的残基Glu146→Arg149和Arg204被鉴别为MAb502识别的关键残基。

残基Gly147已经存在于fHbp A族成熟蛋白序列中。fHbp家族A蛋白序列的氨基酸Asp146、Lys148和Ser203分别被Glu146、Arg149和Arg204替代。此外，将甘氨酸导入在位置147处。

在核酸序列中的突变：

Asp146→Glu146: GAC→GAA (nT 436)

Gly147的添加: GGC (nT 439)

Lys148→Arg149: AAA→AGG (nT 445)

Ser203→Arg204: TCA→CGT (nT 610)

融合体的序列(长度：255个氨基酸) (SEQ ID No. 24)：

对应的核酸序列(SEQ ID No. 25)：

图5显示了融合体C的潜在结构。

实施例 5

提出的融合蛋白D

融合蛋白D是基于这样的融合体C：其中仅氨基酸Glu218（其参与因子H结合）被突变为Ala218。

实施例 6

融合蛋白E

该融合体是基于融合蛋白C。一些额外的残基被鉴别为可能参与MAb502识别。在B族成熟蛋白序列中存在Pro145、Phe227、Gly228、Lys230和Glu233。

为了测试这些残基的作用，提出了融合体E，它是在其中插入这些残基的融合体C。

为了恢复融合体中所有这些可能令人感兴趣的残基，在所述融合蛋白C构建体上必须仅做出一个密码子突变：在A族成熟蛋白序列中的Arg230 (菌株8047)必须突变为Lys230。

融合体的序列- SEQ ID no. 26 (长度：255个氨基酸)：

在核酸序列中的突变：

Arg230→Lys230: CGC→AAA (nT 688)

对应的核酸序列(SEQ ID No. 27)：

图6显示了融合体E的潜在结构。

实施例 7

提出的融合蛋白F

它是基于这样的融合体E：其中仅氨基酸Glu218（其参与因子H结合）被突变为Ala218。

实施例 8

与生产含有L3-样内核的LOS的菌株相比，L2脑膜炎奈瑟球菌菌株表达更低水平的fHbp。

方法

抗原制备

在IPTG诱导以后，在BL21 (DE3)大肠杆菌中生产重组fHBP变体(v) A和B，并使用IMAC柱进行纯化。fhbp序列衍生自菌株MC58 (fHBP B)和2996 (fHBP A)。将基因克隆进pET24b质粒中，所述质粒没有与前导序列相对应的核苷酸序列，且具有在C-末端中的His-Tag。还在BL21大肠杆菌中生产重组nadA，并从菌株2996衍生出所述序列。

动物操作：

在第0、21和28天，用吸附在Al(OH)₃上的纯化的重组蛋白，通过肌肉内(IM)途径免疫30只OF1小鼠组3次。在第42天，采集血液样品测定血清。小鼠血清来自实验20080232。

使用全细胞制品的蛋白印迹

在37℃+ 5% CO₂，在MH琼脂平板上培养脑膜炎奈瑟球菌菌株过夜。在37℃+ 5% CO₂，在含有20µM TPEN (锌螯合剂)的MH琼脂平板上，将它们继代培养4小时。通过在37℃在PBS-PMSF (200µM)-叠氮化物(0.2%)中温育从琼脂平板收获的细胞过夜，进行灭活。然后在PBS中洗涤灭活的细胞，并在-20℃冷冻。

给每个孔加载10微克细胞制品，并在还原条件下使用12% 凝胶(Novex)分离蛋白，然后将所述蛋白转移至硝酸纤维素膜上。在阻断非特异性的结合位点以后，用被fHBP A、fHBP B或NadA免疫的小鼠的血清混合物温育所述膜2h。为了TdfI检测，用抗-TdfI兔血清或4种抗-TdfI Mab的混合物温育所述膜。在洗涤以后，用抗-小鼠Ig生物素化的抗体(Amersham)温育所述膜。使用抗生蛋白链菌素-过氧化物酶缀合物(Amersham)，检测抗体的结合。

对于每个菌株，通过蛋白印迹评估fHBP、TdfI和NadA的表达水平。将表达水平如下评分：高表达水平，++；中间表达水平，+；低表达水平，+/-；和不可检测的表达，-，如在图8中所例证。

fhbp 等位基因的鉴别：

对于大多数菌株，通过Beerninck和合作者在2006年描述的PCR分型，测定fHbp等位基因。对于有些菌株，通过使用引物的PCR，从粗MenB裂解物扩增整个fhbp基因座。然后使用High Pure PCR纯化试剂盒(Roche)，纯化PCR片段，并通过Sanger方法测序。在使用Fletcher等人, 2004描述的Lasergene MegAlign-ClustalX软件与A和B族参照序列(分别是2996和MC58)对比以后，推论出序列类型(家族A或B)。

LOS 内核组成

● 在使用下述规则分析lpt3、lpt6、lot3/oac1和lgtG基因的存在/功能性以后，推论出LOS内核组成

● 如果lot3/oac1存在且同相，GlcNAc被O-乙酰化

● 如果lgtG存在且同相，葡萄糖连接在HepII的位置3上

● 如果lpt6存在，PEA连接在HepII的位置6上

● 如果lpt3存在且lgtG不存在或异相►PEA连接在HepII的位置3上

● 如果lpt3存在且lgtG同相►没有PEA连接在HepII的位置3上

● 如果lpt3不存在►没有PEA连接在HepII的位置3上

● 使用下述命名法来表征不同的内核结构：

● L3 = 一个PEA在HepII的位置3上，具有或没有在内核GlcNAc上的额外乙酰基。这样的内核与下述LOS免疫型有关：L1、L3、L7、L8

● L2 = 一个PEA在HepII的位置6上，一个葡萄糖在HepII的位置3，且一个额外的乙酰基在内核GlcNAc上

● L3v = 两个PEA在HepII上(在位置3和6上)，且通常一个额外的乙酰基在内核GlcNAc上

● L5 =一个葡萄糖在HepII的位置3上，且一个额外的乙酰基在内核GlcNAc上

● LX = 没有PEA或葡萄糖在HepII的位置3和6上，且一个额外的乙酰基在内核GlcNAc上

结果

● 通过分子方法，将155个菌株的LOS内核分型(下面的表1)。这些菌株随机地选自最近在英国(n=53)、德国(n=40)和西班牙(n=47)分离的疾病分离物(在2004年以后)，或在2002年以前分离自5个不同国家中的患者(n= 15)。

● 在140个最近的分离物中，大部分菌株生产L3内核(66-94%)。分别在2%和2.5%的英国和德国菌株中观察到L2内核，而在超过17%的西班牙菌株中发现它。

● 在155个临床分离物中，分析了52个菌株的fHBP和NadA基因发生、等位基因和fHBP、NadA、TdfI表达。如下选择这52个：在2002年之前分离出15个菌株，每个国家(英国、德国和西班牙)10个随机选择的最新分离物，和髓样最新的L2 (下面的表2)。

● fhbp基因存在于所有52个菌株中，62% (32/52)的菌株具有等位基因B，且38% (20/52)的菌株具有等位基因A。

● 在内核LOS类型和fhbp等位基因之间不存在明显的关联，因为分别在68% (21/31)和60% (9/15)的L3和L2菌株中检测到fhbp B等位基因。

● 在fHBP等位基因和fHBP表达之间不存在明显的关联，因为分别在50%和62%的具有fhbp A等位基因和fhbp B等位基因的菌株中较好地表达fHBP (+或++)。

● 但是，尽管仅19% (6/31)的L3菌株生产低或不可检测水平的fHBP，在93% (14/15)的L2菌株中观察到fHBP的低/零表达。

● 此外发现，许多L2免疫型菌株也是ST11克隆复合体。

● nadA基因存在于44%的分析菌株(23/52)中，但是通过蛋白印迹测得，仅25%的菌株表达可检测量的NadA (13/52)。

● 与fHBP表达相比，在LOS内核和NadA表达之间不存在联系。实际上，仅16% 的L3和27%的L2菌株生产可检测量的NadA。

● 在52个不表达fHBP或表达低水平fHBP的菌株中的22个中，仅4个表达可检测水平的NadA。

● 使用4种针对TdfI的单克隆抗体的混合物和/或来自用重组TdfI免疫的兔的多克隆血清，分析TdfI的表达。在51个受测菌株中，94%表达可检测量的TdfI (48/51)。

● 在22个表达低或不可检测水平的fHBP的菌株中，除了1个以外都生产TdfI。该菌株不具有nadA基因。

结论

结果提示，与表达L3内核LOS的菌株相比，L2菌株倾向于生产显著更低水平的fHBP。该发现不同于仅仅基于fHBP的MenB疫苗，特别是在诸如西班牙等国家，其中L2菌株占最近临床分离物的17%。另外，测试的所有西班牙L2菌株不表达可检测量的NadA。

在22个不表达fHBP或表达低水平的fHBP的菌株中，仅4个表达可检测水平的NadA，除了一个以外都表达TdfI。

表1：155个(包括140个最近分离的)侵入性的menB菌株的内核分型

表2：分析的52个菌株的特征：LOS内核类型，fhbp等位基因（基因），fHBP的表达水平，nadA基因的存在，NadA的表达水平，TdfI的表达（使用MAb和/或兔血清）。

实施例9

通过TdfI的添加来提高基于fHBP的疫苗的功效

方法

抗原制备

在IPTG诱导以后，在BL21 (DE3)大肠杆菌中生产重组fHBP变体(v) A和B，并使用IMAC柱进行纯化。fhbp序列衍生自菌株MC58 (fHBP B)和2996 (fHBP A)。将基因克隆进pET24b质粒中，所述质粒没有与前导序列相对应的核苷酸序列，且具有在C-末端中的His-Tag。

动物操作：

在第0、21和28天，通过肌肉内(IM)途径免疫10-30只小鼠组3次。每次注射含有用AS04佐剂系统(AIP04 plus 3-O-脱酰基-4' 单磷酰基脂质A)配制的、标准化为5 ug蛋白的OMV抗原，或含有用吸附到AI(OH)上的单价fHBP疫苗(fHBP A或fHBP B)或二价fHbpA+B疫苗配制的OMV抗原。在第42天，采集血液样品测定血清。小鼠血清来自实验20040652、20070371和20080083。

使用全细胞制品的蛋白印迹

在37℃+ 5% CO₂，在MH琼脂平板上培养脑膜炎奈瑟球菌菌株过夜。在37℃+ 5% CO₂，在含有20µM TPEN (锌螯合剂)的MH琼脂平板上，将它们继代培养4小时。通过在37℃在PBS-PM SF (200µM)-叠氮化物(0.2%)中温育从琼脂平板收获的细胞过夜，进行灭活。然后在PBS中洗涤灭活的细胞，并在-20℃冷冻。

给每个孔加载10微克细胞制品，并在还原条件下使用12% 凝胶(Novex)分离蛋白，然后将所述蛋白转移至硝酸纤维素膜上。在阻断非特异性的结合位点以后，用针对Tdfl的单克隆抗体或被fHBP A或fHBP B血清免疫的小鼠的血清混合物温育所述膜2h。在洗涤以后，用抗-小鼠Ig生物素化的抗体(Amersham)温育所述膜。使用抗生蛋白链菌素-过氧化物酶缀合物(Amersham)，检测抗体的结合。

对于每个菌株，通过蛋白印迹评估fHBP的表达水平。将表达水平如下评分：高表达水平，++；中间表达水平，+；低表达水平，+/-；不可检测的表达，-。

SBA

在37℃+ 5% CO₂，在培养皿上培养脑膜炎奈瑟球菌菌株过夜。在37℃+ 5% CO₂，在不含或含有20µM TPEN (锌螯合剂)的培养皿上将它们继代培养4小时。在56℃灭活血清样品(合并的血清) 40 min，然后在PBS-葡萄糖0.1%中1/10或1/50稀释，然后在平底微量培养板中在25µL体积中2倍稀释。然后，将25µL细菌(在PBS-葡萄糖0.1%中稀释，以产生约100-150 CFU/孔)和幼兔补体(在微孔中的终浓度：12.5% v/v)的混合物加入血清稀释液中。在摇动下在37℃温育75 min以后，将2层琼脂(0.9%)加入孔中。在35或37℃+ CO₂下温育微量培养板过夜。计数CFU，并计算杀死百分比。SBA滴度是产生50%杀死的稀释度。

fhbp 等位基因的鉴别：

通过含有引物的PCR，从粗MenB裂解物扩增整个fhbp基因座。然后使用High Pure PCR纯化试剂盒(Roche)纯化PCR片段，并通过Sanger方法测序。在使用Lasergene MegAlign-ClustalX软件与变体1、2和3参照序列对比以后，推论出序列类型(变体1、2或3)。

结果

使用来自用单价fHbp疫苗(fHbp A或fHbp B)或二价fHbp疫苗(fHbp A+B)免疫的小鼠的血清，在SBA中测试不同的脑膜炎奈瑟球菌菌株。基于通过蛋白印迹测得的fHbp的表达水平和通过它们的fHbp等位基因，选择这些菌株。结果(下面的表3)清楚地指示，fHbp不能诱导交叉保护性的fHbp应答，因为来自用fHbp B免疫的小鼠的血清不能杀死生产fHbp A蛋白的菌株(并且也观察到相反现象)。来自用fHBPA和fHBP B免疫的小鼠的血清会引发杀菌抗体的生产，所述抗体能够介导表达fHbp A或fHbp B蛋白的菌株的补体杀死。另外，靶向的SBA菌株的fHbp表达水平也会影响杀菌滴度: fHbp表达水平越低，杀菌滴度越低。这些结果解释了通过加入其它抗原来提高基于fHbp的疫苗的需要，以便保护免于生产低或不可检测水平的fHbp的菌株。

表3：针对表达不同水平的不同fHBP蛋白的一组脑膜炎奈瑟球菌菌株的抗-fHBP小鼠血清的血清杀菌滴度

用不同的OMV制剂免疫小鼠，所述OMV制剂从具有共同背景（porA KO、galE LOS和荚膜^-）的重组H44/76菌株得到。通过Tdfl和fHbp的水平，区分所述不同制剂。对照OMV (Ctrl OMV)不具有可检测量的Tdfl和fHbp。从过表达Tdfl的菌株生产Tdfl OMV，且Tdfl-fHBPOMV表现出Tdfl和fHbp。使用表达不同水平的Tdfl的H44/76菌株组，在SBA中分析血清。野生型(WT)菌株不表达任何可检测量的Tdfl，而用pfP10质粒（其含有在pTac启动子下的Tdfl基因）转化的重组H44/76菌株在有ITPG (IPTG)存在下生产高水平的Tdfl(下面的表4)。

来自用对照制剂(Ctrl-OMV)免疫的小鼠的血清不是杀菌的。在有补体存在下，仅表达大量Tdfl (IPTG)的菌株被抗-Tdfl抗体杀死。相反，来自用Tdfl-fHbp OMV制剂免疫的小鼠的血清会介导2种H44/76菌株的补体杀死（经由抗-fHbp抗体的存在），并观察到，在杀菌滴度和靶向的菌株生产的Tdfl水平之间存在关联(下面的表4)。

表4：对生产不同水平的Tdfl的不同H44/76菌株(野生型，WT；或经由IPTG诱导而过度生产Tdfl；IPTG)的血清杀菌滴度。

	WT		IPTG
SBA滴度
				抗-Ctrl OMV血清	50		50
抗-Tdfl OMV血清	50		679
				抗-Tdfl-fHbp OMV血清	592		1146

实施例10: 通过添加TdfI来提高基于fHBP的疫苗的功效

方法

抗原制备

使用经典的0.5% DOC提取，从不同的重组H44/76菌株(porA KO、荚膜^-、galE LOS且过度生产不同的外膜蛋白)生产外膜囊泡(OMV)。

在IPTG诱导以后，在BL21 (DE3)大肠杆菌中生产重组fHBP变体(v) A和B，并使用IMAC柱进行纯化。fhbp序列衍生自菌株MC58 (fHBP B)和2996 (fHBP A)。将基因克隆进pET24b质粒中，所述质粒没有与前导序列相对应的核苷酸序列，且具有在C-末端中的His-Tag。

动物操作：

在第0、21和28天，通过肌肉内(IM)途径免疫10-30只小鼠组3次。每次注射含有吸附到Al(OH)₃上的5µg单价fHBP疫苗(fHBP A或fHBP B)。在第42天，采集血液样品测定血清。小鼠血清来自实验20080790和20090265。

在第0、14和28天，通过肌肉内(IM)途径，免疫10只豚鼠组3次。每次注射含有用AlPO₄配制的、标准化为10µg蛋白的OMV抗原。在第42天，采集血液样品测定血清。豚鼠血清来自实验20090266。

SBA

在37℃+ 5% CO₂，在培养皿上培养脑膜炎奈瑟球菌菌株过夜。在37℃+ 5% CO₂，在不含或含有20µM TPEN (锌螯合剂)的培养皿上将它们继代培养4小时。在56℃灭活血清样品(合并的血清) 40 min，然后在PBS-葡萄糖0.1%中1/10或1/50稀释，然后在平底微量培养板中在25µL体积中2倍稀释。然后，将25µL细菌(来自琼脂平板培养物或在细胞接触以后，在PBS-葡萄糖0.1% 中稀释以产生约100-150 CFU/孔)和幼兔补体(在微孔中的终浓度：12.5% v/v)的混合物加入血清稀释液中。在摇动下在37℃温育75 min以后，将2层琼脂(0.9%)加入孔中。在35或37℃+ CO₂下温育微量培养板过夜。计数CFU，并计算杀死百分比。SBA滴度是产生50%杀死的稀释度。

结果

使用表达fHbp家族B的菌株，在SBA中测试抗-fHbpB血清，而针对表达fHbp家族A的菌株，在SBA中使用抗-fHbpA血清。针对fHbpB和fHbpA菌株，测试从过表达TdfI的菌株生产的OMV (囊泡)免疫的豚鼠的血清。

单独地测试抗-TdfI和抗-fHbp血清，或在混合以后，在有或没有TPEN存在下进行SBA。

在SBA中使用一组16个菌株。在这些中，5-7个被抗-fHbp抗体杀死(在SBA培养条件中不存在或存在TPEN)(SBA滴度>128)。在没有TPEN存在下，仅3个菌株被来自用TdfI-囊泡免疫的豚鼠的血清杀死，而在TPEN存在下，12个菌株被杀死。

当混合抗-fHbp和抗-TdfI囊泡血清时存在提高SBA滴度的一般趋势，表明抗-fHBp和抗-TdfI囊泡血清杀菌活性的至少累加影响。

实施例11

使用幼兔血清作为补体源，针对19种脑膜炎奈瑟球菌菌株在SBA中测定不同的疫苗组合物的保护效应。将结果表达为杀死的菌株的百分比(滴度≥1/128)。

表6二价15% LOS OMV疫苗、二价fHBP和包含fHbp (GNA1870) NadA、GNA2132 (Lipo28)、GNA1030、GNA2091的五价亚单位疫苗诱导的菌株覆盖度的对比。

^a 表达各种LOS类型的受测菌株的数目

^b 在SBA中测试各种LOS类型的菌株代表的血清群。

相同的结果，但是更详细地呈现：

表7

实施例12：针对fHbp的抗体对ST269克隆复合体的影响

方法

抗原制备

在IPTG诱导以后，在BL21 (DE3)大肠杆菌中生产重组fHBP变体(v) A和B，并使用IMAC柱进行纯化。fhbp序列衍生自菌株MC58 (fHBP B)和2996 (fHBP A)。将基因克隆进pET24b质粒中，所述质粒没有与前导序列相对应的核苷酸序列，且具有在C-末端中的His-Tag。

动物操作：

在第0、21和28天，通过肌肉内(IM)途径免疫10-30只小鼠组3次。每次注射含有吸附在Al(OH)₃上的5µg单价fHBP疫苗(fHBP A或fHBP B)。在第42天，采集血液样品测定血清。小鼠血清来自实验20080790和20090265。

在第0、14和28天，通过肌肉内(IM)途径，免疫10只豚鼠组3次。每次注射含有用AlPO₄配制的、标准化为10µg蛋白的OMV抗原。在第42天，采集血液样品测定血清。豚鼠血清来自实验20090266。

SBA

在37℃+ 5% CO₂，在培养皿上培养脑膜炎奈瑟球菌菌株过夜。在37℃+ 5% CO₂，在不含或含有20µM TPEN (锌螯合剂)的培养皿上将它们继代培养4小时。在56℃灭活血清样品(合并的血清) 40 min，然后在PBS-葡萄糖0.1%中1/10或1/50稀释，然后在平底微量培养板中在25µL体积中2倍稀释。然后，将25µL细菌(来自琼脂平板培养物或在细胞接触以后，在PBS-葡萄糖0.1% 中稀释以产生约100-150 CFU/孔)和幼兔补体(在微孔中的终浓度：12.5% v/v)的混合物加入血清稀释液中。在摇动下在37℃温育75 min以后，将2层琼脂(0.9%)加入孔中。在35或37℃+ CO₂下温育微量培养板过夜。计数CFU，并计算杀死百分比。SBA滴度是产生50%杀死的稀释度。

使用来自克隆复合体ST269的2个菌株：M01-240013和M01-240101。2个菌株于2001年在英国分离出。

结果

使用表达fHbp B族的菌株(M01-240101)，在SBA中测试抗-fHbpB血清，而针对表达fHbp家族A的菌株(M01-240013)，在SBA中使用抗-fHbpA血清。在没有或有TPEN存在下，进行SBA。

在有补体存在下，仅一个菌株(菌株M01-240101)被抗-fHbp抗体杀死。第二个菌株M01-240013没有被抗-fHbp抗体杀死。如观察到的，杀菌培养条件(不存在或存在TPEN)对SBA滴度没有影响。

表1：在有幼兔补体存在下的抗-fHbp抗体杀菌滴度

结论

抗-fHbp抗体不能单独提供M01-240013菌株(来自克隆复合体ST269)的有效杀死。

实施例13

嵌合fHbp蛋白的免疫原性

方法

抗原制备

如在上述实施例(实施例1-7)中所述，制备含有/没有fH结合位点突变的嵌合fHbp蛋白。

动物操作：

在第0、21和35天，通过肌肉内(IM)途径，免疫20只小鼠组3次。每次注射含有吸附在Al(OH)₃上的5µg嵌合fHbp蛋白。在第49天，采集血液样品测定血清。小鼠血清来自实验20090833。

rSBA

在37℃+ 5% CO₂，在培养皿上培养脑膜炎奈瑟球菌菌株过夜。在37℃+ 5% CO₂，在培养皿上将它们继代培养4小时。在56℃灭活血清样品(单个的血清) 40 min，然后在PBS-葡萄糖0.1%中1/50稀释，然后在平底微量培养板中在25µL体积中2倍稀释(8x)。然后，将25µL细菌(来自琼脂平板培养物，在PBS-葡萄糖0.1%中稀释，以产生约50-250 CFU/孔)和幼兔补体(在微孔中的终浓度：12.5% v/v)的混合物加入血清稀释液中。在摇动下在37℃温育75 min以后，将2层琼脂(0.9%)加入孔中。在33℃+ CO₂下温育微量培养板过夜。计数CFU，并计算杀死百分比。SBA滴度是产生50%杀死的稀释度。

分析各个血清，并计算几何平均滴度。对于几何平均值计算，当第一次稀释的杀死低于50%杀死时，将滴度设定为50，或如果杀死高于在最后一次稀释时的50%，将滴度设定为25600。

结果

用表达fHbp B族(H44/76)或fHbp A族(S3446)的菌株(下面表1)，在rSBA中测试了血清。

使用重组fHbpB的免疫诱导了杀菌抗体的生产，所述杀菌抗体能够介导H44/76菌株(fHbp家族B)的补体杀死，但是不会介导S3446菌株(fHbp家族A) (应答者的百分比分别为100%和10%)。重组fHbpA诱导了针对S3446菌株的低杀菌抗体应答和针对H44/76菌株的非常低的应答。

用嵌合fHbp (具有或没有fH结合位点突变)免疫的动物能够引发针对H44/76和S3446菌株的杀菌应答(针对H44/76和S3446的应答者分别高达100%和90%)。使用构建体LVL-511 (2个氨基酸突变)实现了最佳应答。

结论

抗-嵌合fHbp抗体能够提供来自fHbp家族(A和B)的菌株的有效杀死。该能力未被fH结合位点的突变改变。

实施例14

Hap (在本文中也称作Map)的免疫原性

方法

抗原制备

Map

从发酵H44/76 cps^-菌株以后得到的上清液中纯化天然的切割的Map。生产2批，第二批从过表达Map的H44/76 cps^-得到[如下实现：通过PCR，扩增来自H44/76的整个map基因，并克隆进从pFP10衍生出的奈瑟球菌复制质粒中(Pagotto等人, Plasmid 43, 24-34, 2000)，所述质粒含有lacI^Q 基因和串联的lac/tac启动子，用于Map的受控表达]。通过浓缩和色谱法步骤，纯化Map。

通过在大肠杆菌中的细胞质表达，生产重组Map N-末端(氨基酸43-1178)。

fHbp

在IPTG诱导以后，在BL21 (DE3)大肠杆菌中生产重组fHBP变体(v) A和B，并使用IMAC柱进行纯化。fhbp序列衍生自菌株MC58 (fHbp B)和2996 (fHbp A)。将基因克隆进pET24b质粒中，所述质粒没有与前导序列相对应的核苷酸序列，且具有在C-末端中的His-Tag。

动物操作

Map

在第0、14和28天，通过肌肉内(IM)途径，免疫10-25只小鼠组3次。每次注射含有10µg天然的切割的Hap或5µg rec N-末端Hap（用specol配制）。在第42天，采集血液样品测定血清。小鼠血清来自实验20090608、20100463、20100708。

在第0、14和28天，通过肌肉内(IM)途径，免疫6-10只豚鼠组3次。每次注射含有10µg蛋白（用specol配制）。在第42天，采集血液样品测定血清。豚鼠血清来自实验20090619、20100464、20100711。

fHbp

在第0、21和28天，通过肌肉内(IM)途径免疫10-30只小鼠组3次。每次注射含有吸附在Al(OH)₃上的5µg单价fHbp疫苗(fHbp A或fHbp B)。在第42天，采集血液样品测定血清。小鼠血清来自实验20080790和20090265。

在第0、14和28天，通过肌肉内(IM)途径，免疫6-10只豚鼠组3次。每次注射含有吸附在Al(OH)₃上的10µg单价fHbp疫苗(fHbp A或fHbp B)。在第42天，采集血液样品测定血清。血清来自实验20090200g3或20100464g10。

SBA

在37℃+ 5% CO₂，在培养皿上培养脑膜炎奈瑟球菌菌株过夜。在37℃+ 5% CO₂，在不含或含有20µM TPEN (锌螯合剂)的培养皿上将它们继代培养4小时。在56℃灭活血清样品(合并的血清) 40 min，然后在PBS-葡萄糖0.1%中1/50稀释，然后在平底微量培养板中在25µL体积中2倍稀释。然后，将25µL细菌(来自琼脂平板培养物或在细胞接触以后，在PBS-葡萄糖0.1% 中稀释以产生约50-250 CFU/孔)和幼兔补体(在微孔中的终浓度：12.5% v/v)的混合物加入血清稀释液中。在摇动下在37℃温育75 min以后，将2层琼脂(0.9%)加入孔中。在33℃+CO₂下温育微量培养板过夜。计数CFU，并计算杀死百分比。SBA滴度是产生50%杀死的稀释度。

Map KO 菌株构建

如以前所述(Weynants等人 , 2009)，进行脑膜炎奈瑟球菌菌株生长和转化操作。

菌株17540是由Julio Vasquez (CNM, 马德里, 西班牙)赠送，菌株M01-240355和NZ98/254来自R.Borrow (HPA, 曼彻斯特, 英国)。

map/hap:: kanR质粒（由插入H44/76 hap基因的独特PstI位点中的卡那霉素抗性盒组成）(van Ulsen等人 , 2003)由Tommassen教授友情赠送。通过PCR，在煮沸的细菌裂解物上筛选卡那霉素抗性菌落的hap基因灭活。通过三(羟甲基)甲基甘氨酸凝胶和银染色，检查所有克隆的LOS完整性，以避免补体敏感性的变化。

来自脑膜炎奈瑟球菌血清群B的遗传修饰的L3、7和L2脂寡糖会赋予广泛的交叉杀菌应答（Genetically modified L3,7 and L2 lipooligosaccharides from Neisseria meningitidis serogroup B会赋予广泛的cross-bactericidal response）. Weynants V, Denoël P, Devos N, Janssens D, Feron C, Goraj K, Momin P, Monnom D, Tans C, Vandercammen A, Wauters F, Poolman JT. Infect Immun. 2009年5月; 77(5): 2084-93。

调节其它自体转运蛋白的加工的奈瑟球菌自体转运蛋白NalP（A Neisserial autotransporter NalP modulating the processing of other autotransporters）. van Ulsen P, van Alphen L, ten Hove J, Fransen F, van der Ley P, Tommassen J. Mol Microbiol. 2003年11月; 50(3)。

结果

使用来自用天然的切割的Map或重组N-末端Map（用specol配制）免疫的小鼠和豚鼠的血清，在SBA中测试不同的脑膜炎奈瑟球菌菌株（基于它们的Map同源性进行选择）。如结果所示(下面的表1)，Map会诱导交叉保护性的杀菌应答，因为与H44/76具有最低同源性的菌株M06-240336被杀死。17/22个菌株被从豚鼠得到的抗-天然的切割的Map抗体杀死。这17个菌株中的6个没有被抗-fHbp抗体杀死。Map的表达水平的差异，可以解释下述事实提示的没有杀死某些菌株：具有类似的Map序列的菌株被杀死(M06-240336)或未被杀死(M06-240877)。

为了证实Map是杀菌抗体的靶标，在杀菌试验中使用ΔMap菌株(NZ98/254、M05-240355、SP17540) (下表2)。在这样的SBA条件下，没有观察到杀死。这些结果证实，Map是诱导交叉杀菌抗体的主要抗原。

结论

Map会诱导交叉杀菌活性，并提供没有被抗-fHbp杀死的菌株（包括来自克隆复合体ST269的菌株（例如M01-240013菌株）和来自L2免疫型的菌株（例如SP17540菌株））的有效杀死。

结果提示，基于Map和fHbp的疫苗会提供比基于fHbp的疫苗更好的菌株覆盖度。

实施例15

Hsf (在本文中也称作Msf)会诱导针对野生型菌株的杀菌抗体

方法

抗原制备

OMV

使用经典的0.5% DOC提取，从重组H44/76菌株(porA KO、荚膜^-、galE LOS且过度生产Msf和/或ZnuD蛋白)生产外膜囊泡(OMV)。

fHbp

在IPTG诱导以后，在BL21 (DE3)大肠杆菌中生产重组fHBP变体(v) A和B，并使用IMAC柱进行纯化。fhbp序列衍生自菌株MC58 (fHbp B)和2996 (fHbp A)。将基因克隆进pET24b质粒中，所述质粒没有与前导序列相对应的核苷酸序列，且具有在C-末端中的His-Tag。

mAb

使用重复的多位点免疫接种策略（命名为RIMMS），从用20µg来自重组H44/76菌株(porA KO、荚膜^-、过度生产Msf，来自菌株M01-0240101)的OMV免疫的BALB/c小鼠得到的骨髓瘤细胞和淋巴细胞B的融合体，得到mAb Hsfcross/5。

动物操作：

OMV

在第0、14和28天，通过肌肉内(IM)途径，免疫10只豚鼠(GP)组3次。每次注射含有用AlPO₄配制的、标准化为10µg蛋白的OMV抗原。在第42天，采集血液样品测定血清。血清来自实验20090266。

fHbp

在第0、14和28天，通过肌肉内(IM)途径，免疫6-10只豚鼠组3次。每次注射含有吸附在Al(OH)₃上的10µg单价fHbp疫苗(fHbp A或fHbp B)。在第42天，采集血液样品测定血清。血清来自实验20090200g3或20100464g10。

SBA

在37℃+ 5% CO₂，在培养皿上培养脑膜炎奈瑟球菌菌株过夜。在37℃+ 5% CO₂，在培养皿上将它们继代培养4小时。在56℃灭活血清样品(合并的血清) 40 min，然后在PBS-葡萄糖0.1%中1/50稀释，然后在平底微量培养板中在25µL体积中2倍稀释。然后，将25µL细菌(来自琼脂平板培养物，在PBS-葡萄糖0.1% 中稀释以产生约50-250 CFU/孔)和幼兔补体(在微孔中的终浓度：12.5% v/v)的混合物加入血清稀释液中。在摇动下在37℃温育75 min以后，将2层琼脂(0.9%)加入孔中。在33℃+ CO₂下温育微量培养板过夜。计数CFU，并计算杀死百分比。SBA滴度是产生50%杀死的稀释度。

Msf/Hsf KO 菌株构建

如以前所述(Weynants等人 , 2009)，进行脑膜炎奈瑟球菌B菌株17567 (来自J. Vasquez, CNM, 马德里, 西班牙)生长和转化操作。如下构建msf/hsf:: CmR质粒。简而言之，使用Hsf有义引物(CGCAATAAATGGGGTTGTCAATAATTGT)和Hsf反义引物(AGTCAAGGCGCACGCTGTCGGCAT)，通过PCR，从H44/76基因组DNA扩增与hsf基因的1531bp 5’侧接区、1775 bp的hsf编码序列和1465 bp 3’侧接区相对应的4771bp的DNA片段，并克隆进pGEMT-Easy载体中。然后使用引物HSF5’ci2 (gaagatctgccgtctgaaacccgtaccgatgcggaaggctata)和HSF3’ci2 (gaagatctttcagacggcgataaagtcctgccgcgttgtgtttc)，对质粒进行循环PCR诱变，以便：(i)删除hsf基因，(ii)插入吸收序列，和(iii)插入BglII限制位点，从而实现抗生素抗性基因的容易克隆。使用引物BAD20 (tcccccgggagatctcactagtattaccctgttatccc)和CAM3’Bgl2 (agatctgccgctaactataacggtcc)引物，从pCMC质粒(Weynants等人, 2009)扩增CmR基因。将该片段克隆进循环PCR产物，在BglII限制以后，得到质粒pRIT15456。通过在煮沸的细菌裂解物上的PCR，筛选氯霉素抗性的菌落的msf/hsf基因灭活。通过蛋白印迹，进一步证实Msf表达的缺失。通过三(羟甲基)甲基甘氨酸凝胶和银染色，检查所有克隆的LOS完整性，以避免补体敏感性的变化。

来自脑膜炎奈瑟球菌血清群B的遗传修饰的L3、7和L2脂寡糖会赋予广泛的交叉杀菌应答。

Weynants V, Denoël P, Devos N, Janssens D, Feron C, Goraj K, Momin P, Monnom D, Tans C, Vandercammen A, Wauters F, Poolman JT. Infect Immun. 2009 May;77(5):2084-93。

结果

为了评价Msf的诱导针对野生型菌株的杀菌抗体的潜力，选择具有高Msf表达水平(蛋白印迹结果)的菌株SP17567。

在血清杀菌试验中，测试针对Msf或Msf-ZnuD OMV和对照囊泡(没有抗原过表达或仅ZnuD过表达)的血清。还测试了对Msf特异性的单克隆抗体。

在下面的表1中的结果显示，过表达Msf的囊泡的杀菌活性与对照囊泡相比增加了至少20倍。使用Msf特异性的mAb，也观察到高杀菌滴度。仅重组fHbpA诱导在实验的检测限附近的低杀菌应答。

为了证实Msf是杀菌抗体的主要靶标，在杀菌试验中使用了ΔMsf SP17567菌株。在这样的SBA条件下，没有观察到杀死。这些结果证实，Msf作为抗原能够诱导表达高水平的Msf的野生型菌株的杀死。

表1：针对菌株SP17567野生型和Msf KO的杀菌滴度

结论

抗-Msf抗体可以介导被抗-fHbp抗体较差地杀死的野生型菌株的杀死。这提示，将Msf加入基于fHbp的疫苗中，可以增强MenB疫苗的覆盖度。

实施例16

针对过表达TdfI (在本文中也ZnuD)的囊泡的抗体对L2菌株的影响

方法

抗原制备

使用经典的0.5% DOC提取，从重组H44/76菌株(porA KO、荚膜^-、galE LOS且过度生产ZnuD (和Msf)蛋白)生产外膜囊泡(OMV)。

动物操作：

OMV

在第0、21和28天，通过肌肉内(IM)途径，免疫26-30只小鼠组3次。

在第0、14和28天，通过肌肉内(IM)途径，免疫10只豚鼠(GP)组3次。

每次注射含有用AlPO₄配制的、标准化为5 (小鼠)或10µg (GP)蛋白的OMV抗原。在第42天，采集血液样品测定血清。小鼠和豚鼠血清分别来自实验20090265、20100463和20090266、20100464。

fHbp

在第0、21和35天，通过肌肉内(IM)途径，免疫20只小鼠组3次。每次注射含有吸附在Al(OH)₃上的5µg单价fHbp疫苗(fHbp A或fHbp B)。在第49天，采集血液样品测定血清。小鼠血清来自实验20090833。

SBA

在37℃+ 5% CO₂，在培养皿上培养脑膜炎奈瑟球菌菌株过夜。在37℃+ 5% CO₂，在不含或含有20µM TPEN (锌螯合剂)的培养皿上将它们继代培养4小时。在56℃灭活血清样品(合并的血清) 40 min，然后在PBS-葡萄糖0.1%中1/50稀释，然后在平底微量培养板中在25µL体积中2倍稀释。然后，将25µL细菌(来自琼脂平板培养物，在PBS-葡萄糖0.1% 中稀释以产生约50-250 CFU/孔)和幼兔补体(在微孔中的终浓度：12.5% v/v)的混合物加入血清稀释液中。在摇动下在37℃温育75 min以后，将2层琼脂(0.9%)加入孔中。在33℃+ CO₂下温育微量培养板过夜。计数CFU，并计算杀死百分比。SBA滴度是产生50%杀死的稀释度。

ZnuD KO SP17540 菌株构建

如以前所述(Weynants等人 , 2009)，进行脑膜炎奈瑟球菌菌株生长和转化操作。当需要时，通过在培养基中加入20mM TPEN (N,N,N',N'-四(2-吡啶基甲基)乙二胺)，得到ZnuD表达的诱导。菌株17540由Julio Vasquez (CNM, 马德里, 西班牙)赠送。

znuD:: kanR质粒由Tommassen教授友情赠送，且描述在Stork等人 , 2010。通过在煮沸的细菌裂解物上的PCR，筛选卡那霉素抗性的菌落中znuD基因的部分缺失。在有TPEN存在下培养以后，通过在全细胞裂解物上的蛋白印迹，进一步证实ZnuD灭活。通过三(羟甲基)甲基甘氨酸凝胶和银染色，检查所有克隆的LOS完整性，以避免补体敏感性的变化。

来自脑膜炎奈瑟球菌血清群B的遗传修饰的L3、7和L2脂寡糖会赋予广泛的交叉杀菌应答（Genetically modified L3,7 and L2 lipooligosaccharides from Neisseria meningitidis serogroup B会赋予广泛的cross-bactericidal response）. Weynants V, Denoël P, Devos N, Janssens D, Feron C, Goraj K, Momin P, Monnom D, Tans C, Vandercammen A, Wauters F, Poolman JT. Infect Immun. 2009年5月; 77(5): 2084-93。

脑膜炎奈瑟球菌的外膜受体参与具有疫苗潜力的锌获取（An outer membrane receptor of Neisseria meningitidis involved in zinc acquisition with vaccine potential）. Stork M, Bos MP, Jongerius I, de Kok N, Schilders I, Weynants VE, Poolman JT, Tommassen J. PLoS Pathog. 2010年7月1日; 6:e1000969。

结果

在rSBA中使用来自L2免疫型和克隆复合体ST11的3个菌株。这些菌株没有被抗-fHbp抗体和补体杀死(表1)。

通过使用锌限制的生长培养基(象体内条件一样)，进行ZnuD抗体的杀菌潜力的评价。这通过在MH琼脂平板中使用20µM的TPEN来实现。

在TPEN条件下在杀菌试验中测试的小鼠抗-ZnuD OMV血清表现出3个受测菌株的杀死。使用来自豚鼠的血清，观察到类似的结果。在培养基中没有TPEN存在下，菌株没有被抗-ZnuD抗体杀死。

为了证实ZnuD是杀菌抗体的主要靶标，在含有TPEN的杀菌试验中使用ΔZnuD SP17540菌株。在这样的SBA条件下，没有观察到杀死。这些结果证实，ZnuD是针对菌株SP17540的杀菌抗体的主要靶标。

表1：针对L2菌株的抗-OMV的杀菌滴度

讨论和结论

应当指出，在以前的实验中(参见上面的实施例10)，2个L2菌株(760676和M05-0240072)没有被抗-ZnuD抗体杀死。在重复的实验中(呈现在该实施例中)，这2个菌株被抗-ZnuD抗体杀死。因为没有在培养物上系统地检查ZnuD的表达（进行该检查以执行SBA），认为在前述的系列实验中菌株760676和M05-0240072不表达ZnuD (呈现在实施例10中)。表达缺失的一种可能的解释是，将太老的TPEN平板用于锌的有效螯合。

使用WT L2菌株以及SP17540 znuD KO菌株得到的新结果证实，ZnuD (过表达OMV)会有效地杀死没有被抗-fHbp杀死的L2免疫型菌株。所述数据支持了下述理论：即与仅基于fHbp的疫苗相比，基于fHbp和其它抗原（如ZnuD）的疫苗会提高菌株覆盖度。

序列表

<110> GlaxoSmithKline Biologicals S.A.

<120> 疫苗组合物

<130> VB64163P

<160> 27

<170> PatentIn 3.5版

<210> 1

<211> 136

<212> PRT

<213> 脑膜炎奈瑟球菌

<400> 1

Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu

1 5 10 15

Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Gly Leu Gln

20 25 30

Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu

35 40 45

Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn

50 55 60

Thr Gly Lys Leu Lys Asn Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg Gln

65 70 75 80

Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe Gln

85 90 95

Val Tyr Lys Gln Ser His Ser Ala Leu Thr Ala Phe Gln Thr Glu Gln

100 105 110

Ile Gln Asp Ser Glu His Ser Gly Lys Met Val Ala Lys Arg Gln Phe

115 120 125

Arg Ile Gly Asp Ile Ala Gly Glu

130 135

<210> 2

<211> 119

<212> PRT

<213> 脑膜炎奈瑟球菌

<400> 2

Gly Glu His Thr Ala Phe Asn Gln Leu Pro Asp Gly Lys Ala Glu Tyr

1 5 10 15

His Gly Lys Ala Phe Ser Ser Asp Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr

20 25 30

Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu

35 40 45

Lys Thr Pro Glu Gln Asn Val Glu Leu Ala Ala Ala Glu Leu Lys Ala

50 55 60

Asp Glu Lys Ser His Ala Val Ile Leu Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Ser

65 70 75 80

Glu Glu Lys Gly Thr Tyr His Leu Ala Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln

85 90 95

Glu Ile Ala Gly Ser Ala Thr Val Lys Ile Gly Glu Lys Val His Glu

100 105 110

Ile Gly Ile Ala Gly Lys Gln

115

<210> 3

<211> 23

<212> PRT

<213> 脑膜炎奈瑟球菌

<220>

<221> 变体

<222> (8)..(8)

<223> "X"是I/T

<220>

<221> 变体

<222> (14)..(14)

<223> "X"是Q/R

<400> 3

Lys Ile Asn Asn Pro Asp Lys Xaa Asp Ser Leu Ile Asn Xaa Arg Ser

1 5 10 15

Phe Leu Val Ser Gly Leu Gly

20

<210> 4

<211> 23

<212> PRT

<213> 脑膜炎奈瑟球菌

<220>

<221> 变体

<222> (2)..(2)

<223> X是V/I/E

<220>

<221> 变体

<222> (5)..(5)

<223> X是S/P

<220>

<221> 变体

<222> (7)..(7)

<223> X是D/H

<220>

<221> 变体

<222> (9)..(9)

<223> X是G/R

<220>

<221> 变体

<222> (10)..(10)

<223> X是K/S

<220>

<221> 变体

<222> (16)..(16)

<223> X是Q/R

<220>

<221> 变体

<222> (18)..(18)

<223> X是R/K

<220>

<221> 变体

<222> (23)..(23)

<223> X是A/V

<400> 4

Gln Xaa Gln Asp Xaa Glu Xaa Ser Xaa Xaa Met Val Ala Lys Arg Xaa

1 5 10 15

Phe Xaa Ile Gly Asp Ile Xaa

20

<210> 5

<211> 4

<212> PRT

<213> 脑膜炎奈瑟球菌 (B组)

<400> 5

Arg Glu Lys Val

1

<210> 6

<211> 4

<212> PRT

<213> 脑膜炎奈瑟球菌 (B组)

<400> 6

Val Asn Gly Ile

1

<210> 7

<211> 255

<212> PRT

<213> 脑膜炎奈瑟球菌菌株MC58

<400> 7

Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu

1 5 10 15

Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Gly Leu Gln

20 25 30

Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu

35 40 45

Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn

50 55 60

Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg

65 70 75 80

Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe

85 90 95

Gln Val Tyr Lys Gln Ser His Ser Ala Leu Thr Ala Phe Gln Thr Glu

100 105 110

Gln Ile Gln Asp Ser Glu His Ser Gly Lys Met Val Ala Lys Arg Gln

115 120 125

Phe Arg Ile Gly Asp Ile Ala Gly Glu His Thr Ser Phe Asp Lys Leu

130 135 140

Pro Glu Gly Gly Arg Ala Thr Tyr Arg Gly Thr Ala Phe Gly Ser Asp

145 150 155 160

Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln

165 170 175

Gly Asn Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Ser Pro Glu Leu Asn Val Asp

180 185 190

Leu Ala Ala Ala Asp Ile Lys Pro Asp Gly Lys Arg His Ala Val Ile

195 200 205

Ser Gly Ser Val Leu Tyr Asn Gln Ala Glu Lys Gly Ser Tyr Ser Leu

210 215 220

Gly Ile Phe Gly Gly Lys Ala Gln Glu Val Ala Gly Ser Ala Glu Val

225 230 235 240

Lys Thr Val Asn Gly Ile Arg His Ile Gly Leu Ala Ala Lys Gln

245 250 255

<210> 8

<211> 768

<212> DNA

<213> 脑膜炎奈瑟球菌菌株MC58

<400> 8

tgcagcagcg gagggggtgg tgtcgccgcc gacatcggtg cggggcttgc cgatgcacta 60

accgcaccgc tcgaccataa agacaaaggt ttgcagtctt tgacgctgga tcagtccgtc 120

aggaaaaacg agaaactgaa gctggcggca caaggtgcgg aaaaaactta tggaaacggt 180

gacagcctca atacgggcaa attgaagaac gacaaggtca gccgtttcga ctttatccgc 240

caaatcgaag tggacgggca gctcattacc ttggagagtg gagagttcca agtatacaaa 300

caaagccatt ccgccttaac cgcctttcag accgagcaaa tacaagattc ggagcattcc 360

gggaagatgg ttgcgaaacg ccagttcaga atcggcgaca tagcgggcga acatacatct 420

tttgacaagc ttcccgaagg cggcagggcg acatatcgcg ggacggcgtt cggttcagac 480

gatgccggcg gaaaactgac ctacaccata gatttcgccg ccaagcaggg aaacggcaaa 540

atcgaacatt tgaaatcgcc agaactcaat gtcgacctgg ccgccgccga tatcaagccg 600

gatggaaaac gccatgccgt catcagcggt tccgtccttt acaaccaagc cgagaaaggc 660

agttactccc tcggtatctt tggcggaaaa gcccaggaag ttgccggcag cgcggaagtg 720

aaaaccgtaa acggcatacg ccatatcggc cttgccgcca agcaataa 768

<210> 9

<211> 254

<212> PRT

<213> 脑膜炎奈瑟球菌菌株8047

<400> 9

Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Arg Leu

1 5 10 15

Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Ser Leu Gln

20 25 30

Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu

35 40 45

Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn

50 55 60

Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg

65 70 75 80

Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe

85 90 95

Gln Ile Tyr Lys Gln Asp His Ser Ala Val Val Ala Leu Gln Ile Glu

100 105 110

Lys Ile Asn Asn Pro Asp Lys Ile Asp Ser Leu Ile Asn Gln Arg Ser

115 120 125

Phe Leu Val Ser Gly Leu Gly Gly Glu His Thr Ala Phe Asn Gln Leu

130 135 140

Pro Asp Gly Lys Ala Glu Tyr His Gly Lys Ala Phe Ser Ser Asp Asp

145 150 155 160

Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln Gly

165 170 175

His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Thr Pro Glu Gln Asn Val Glu Leu

180 185 190

Ala Ala Ala Glu Leu Lys Ala Asp Glu Lys Ser His Ala Val Ile Leu

195 200 205

Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Ser Glu Glu Lys Gly Thr Tyr His Leu Ala

210 215 220

Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln Glu Ile Ala Gly Ser Ala Thr Val Lys

225 230 235 240

Ile Gly Glu Lys Val His Glu Ile Gly Ile Ala Gly Lys Gln

245 250

<210> 10

<211> 765

<212> DNA

<213> 脑膜炎奈瑟球菌菌株8047

<400> 10

tgcagcagcg gaggcggcgg tgtcgccgcc gacatcggcg cgaggcttgc cgatgcacta 60

accgcaccgc tcgaccataa agacaaaagt ttgcagtctt tgacgctgga tcagtccgtc 120

aggaaaaacg agaaactgaa gctggcggca caaggtgcgg aaaaaactta tggaaacggc 180

gacagcctca atacgggcaa attgaagaac gacaaggtca gccgcttcga ctttatccgt 240

caaatcgaag tggacgggca gctcattacc ttggagagcg gagagttcca aatatacaaa 300

caggaccact ccgccgtcgt tgccctacag attgaaaaaa tcaacaaccc cgacaaaatc 360

gacagcctga taaaccaacg ctccttcctt gtcagcggtt tgggcggaga acataccgcc 420

ttcaaccaac tgcctgacgg caaagccgag tatcacggca aagcattcag ctccgacgat 480

gctggcggaa aactgaccta taccatagat ttcgccgcca aacagggaca cggcaaaatc 540

gaacacctga aaacacccga gcaaaatgtc gagcttgccg ccgccgaact caaagcagat 600

gaaaaatcac acgccgtcat tttgggcgac acgcgctacg gcagcgaaga aaaaggcact 660

taccacctcg cccttttcgg cgaccgcgcc caagaaatcg ccggctcggc aaccgtgaag 720

ataggggaaa aggttcacga aatcggcatc gccggcaaac agtag 765

<210> 11

<211> 7

<212> PRT

<213> 脑膜炎奈瑟球菌 (B组)

<400> 11

Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly

1 5

<210> 12

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 组氨酸标签

<400> 12

Met His His His His His His

1 5

<210> 13

<211> 4

<212> PRT

<213> 脑膜炎奈瑟球菌 (B组)

<400> 13

Gly Glu His Thr

1

<210> 14

<211> 254

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 具有组氨酸标签的、来自脑膜炎奈瑟球菌菌株8047的

全长fHbp的氨基酸27-273

<400> 14

Met His His His His His His Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Arg Leu

1 5 10 15

Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Ser Leu Gln

20 25 30

Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu

35 40 45

Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn

50 55 60

Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg

65 70 75 80

Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe

85 90 95

Gln Ile Tyr Lys Gln Asp His Ser Ala Val Val Ala Leu Gln Ile Glu

100 105 110

Lys Ile Asn Asn Pro Asp Lys Ile Asp Ser Leu Ile Asn Gln Arg Ser

115 120 125

Phe Leu Val Ser Gly Leu Gly Gly Glu His Thr Ala Phe Asn Gln Leu

130 135 140

Pro Asp Gly Lys Ala Glu Tyr His Gly Lys Ala Phe Ser Ser Asp Asp

145 150 155 160

Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln Gly

165 170 175

His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Thr Pro Glu Gln Asn Val Glu Leu

180 185 190

Ala Ala Ala Glu Leu Lys Ala Asp Glu Lys Ser His Ala Val Ile Leu

195 200 205

Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Ser Glu Glu Lys Gly Thr Tyr His Leu Ala

210 215 220

Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln Glu Ile Ala Gly Ser Ala Thr Val Lys

225 230 235 240

Ile Gly Glu Lys Val His Glu Ile Gly Ile Ala Gly Lys Gln

245 250

<210> 15

<211> 762

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 具有组氨酸标签的、来自脑膜炎奈瑟球菌菌株8047的

全长fHbp的氨基酸27-273的核酸序列

<400> 15

atgcatcatc atcaccatca tgttgcagca gatattggtg cacgtctggc agatgcactg 60

accgcaccgc tggatcataa agataaaagc ctgcagagcc tgaccctgga tcagagcgtt 120

cgcaaaaatg aaaaactgaa actggcagca cagggtgcag aaaaaaccta tggtaatggc 180

gatagcctga ataccggcaa actgaaaaat gataaagtga gccgctttga ttttattcgc 240

cagattgaag ttgatggtca gctgattacc ctggaaagcg gtgaatttca gatttataaa 300

caggatcata gcgcagttgt tgcactgcag attgaaaaaa ttaataatcc ggataaaatt 360

gatagcctga ttaatcagcg tagctttctg gttagcggtc tgggtggtga acataccgca 420

tttaatcagc tgccggatgg taaagcagaa tatcatggca aagcctttag ctctgatgat 480

gccggtggta aactgaccta taccattgat tttgcagcca aacagggtca tggcaaaatt 540

gaacatctga aaacaccgga acagaatgtt gaactggcag cagcagaact gaaagcagat 600

gaaaaaagcc atgccgttat tctgggtgat acccgttatg gtagcgaaga aaaaggcacc 660

tatcatctgg cactgtttgg tgatcgtgca caggaaattg caggtagcgc aaccgttaaa 720

attggcgaaa aagtgcatga aattggcatt gccggtaaac ag 762

<210> 16

<211> 255

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 具有组氨酸标签的、来自脑膜炎奈瑟球菌菌株MC58的

全长fHbp的氨基酸73-320

<400> 16

Met His His His His His His Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu

1 5 10 15

Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Gly Leu Gln

20 25 30

Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu

35 40 45

Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn

50 55 60

Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg

65 70 75 80

Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe

85 90 95

Gln Val Tyr Lys Gln Ser His Ser Ala Leu Thr Ala Phe Gln Thr Glu

100 105 110

Gln Ile Gln Asp Ser Glu His Ser Gly Lys Met Val Ala Lys Arg Gln

115 120 125

Phe Arg Ile Gly Asp Ile Ala Gly Glu His Thr Ser Phe Asp Lys Leu

130 135 140

Pro Glu Gly Gly Arg Ala Thr Tyr Arg Gly Thr Ala Phe Gly Ser Asp

145 150 155 160

Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln

165 170 175

Gly Asn Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Ser Pro Glu Leu Asn Val Asp

180 185 190

Leu Ala Ala Ala Asp Ile Lys Pro Asp Gly Lys Arg His Ala Val Ile

195 200 205

Ser Gly Ser Val Leu Tyr Asn Gln Ala Glu Lys Gly Ser Tyr Ser Leu

210 215 220

Gly Ile Phe Gly Gly Lys Ala Gln Glu Val Ala Gly Ser Ala Glu Val

225 230 235 240

Lys Thr Val Asn Gly Ile Arg His Ile Gly Leu Ala Ala Lys Gln

245 250 255

<210> 17

<211> 765

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 具有组氨酸标签的、来自脑膜炎奈瑟球菌菌株MC58的

全长fHbp的氨基酸73-320的核酸序列

<400> 17

atgcatcatc atcaccatca tgttgcagca gatattggcg caggtctggc agatgcactg 60

accgctccgc tggatcataa agataaaggt ctgcagagcc tgaccctgga tcagagcgtt 120

cgcaaaaatg aaaaactgaa actggcagca cagggtgcag aaaaaaccta tggtaatggc 180

gatagcctga ataccggcaa actgaaaaat gataaagtga gccgctttga ttttattcgc 240

cagattgaag ttgatggtca gctgattacc ctggaaagcg gtgaatttca ggtgtataaa 300

cagagccata gcgcactgac cgcctttcag accgaacaaa ttcaggatag cgaacatagc 360

ggtaaaatgg ttgccaaacg ccagtttcgt attggtgata ttgccggtga acataccagc 420

tttgataaac tgccggaagg tggtcgtgca acctatcgtg gcaccgcatt tggttctgat 480

gatgccggtg gtaaactgac ctataccatt gattttgcag ccaaacaggg caatggcaaa 540

attgaacatc tgaaatctcc ggaactgaat gttgatctgg cagcagccga tattaaaccg 600

gatggtaaac gccatgcagt tattagcggt agcgtgctgt ataatcaggc agaaaaaggt 660

agctatagcc tgggtatttt tggtggtaaa gcacaggaag ttgcaggtag cgcagaagtt 720

aaaaccgtca acggcattcg tcatattggt ctggcagcga aacag 765

<210> 18

<211> 254

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 融合蛋白 LVL491

<400> 18

Met His His His His His His Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu

1 5 10 15

Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Gly Leu Gln

20 25 30

Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu

35 40 45

Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn

50 55 60

Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg

65 70 75 80

Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe

85 90 95

Gln Val Tyr Lys Gln Ser His Ser Ala Leu Thr Ala Phe Gln Thr Glu

100 105 110

Gln Ile Gln Asp Ser Glu His Ser Gly Lys Met Val Ala Lys Arg Gln

115 120 125

Phe Arg Ile Gly Asp Ile Ala Gly Glu His Thr Ala Phe Asn Gln Leu

130 135 140

Pro Asp Gly Lys Ala Glu Tyr His Gly Lys Ala Phe Ser Ser Asp Asp

145 150 155 160

Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln Gly

165 170 175

His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Thr Pro Glu Gln Asn Val Glu Leu

180 185 190

Ala Ala Ala Glu Leu Lys Ala Asp Glu Lys Ser His Ala Val Ile Leu

195 200 205

Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Ser Glu Glu Lys Gly Thr Tyr His Leu Ala

210 215 220

Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln Glu Ile Ala Gly Ser Ala Thr Val Lys

225 230 235 240

Ile Gly Glu Lys Val His Glu Ile Gly Ile Ala Gly Lys Gln

245 250

<210> 19

<211> 762

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 融合蛋白 LVL491的核酸序列

<400> 19

atgcatcatc atcaccatca tgttgcagca gatattggcg caggtctggc agatgcactg 60

accgctccgc tggatcataa agataaaggt ctgcagagcc tgaccctgga tcagagcgtt 120

cgcaaaaatg aaaaactgaa actggcagca cagggtgcag aaaaaaccta tggtaatggc 180

gatagcctga ataccggcaa actgaaaaat gataaagtga gccgctttga ttttattcgc 240

cagattgaag ttgatggtca gctgattacc ctggaaagcg gtgaatttca ggtgtataaa 300

cagagccata gcgcactgac cgcctttcag accgaacaaa ttcaggatag cgaacatagc 360

ggtaaaatgg ttgccaaacg ccagtttcgt attggtgata ttgccggtga acataccgca 420

tttaatcagc tgccggatgg taaagcagaa tatcatggca aagcctttag ctctgatgat 480

gccggtggta aactgaccta taccattgat tttgcagcca aacagggtca tggcaaaatt 540

gaacatctga aaacaccgga acagaatgtt gaactggcag cagcagaact gaaagcagat 600

gaaaaaagcc atgccgttat tctgggtgat acccgttatg gtagcgaaga aaaaggcacc 660

tatcatctgg cactgtttgg tgatcgtgca caggaaattg caggtagcgc aaccgttaaa 720

attggcgaaa aagtgcatga aattggcatt gccggtaaac ag 762

<210> 20

<211> 254

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 融合蛋白 A

<400> 20

Met His His His His His His Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu

1 5 10 15

Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Gly Leu Gln

20 25 30

Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu

35 40 45

Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn

50 55 60

Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg

65 70 75 80

Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe

85 90 95

Gln Val Tyr Lys Gln Ser His Ser Ala Leu Thr Ala Phe Gln Thr Glu

100 105 110

Gln Ile Gln Asp Ser Glu His Ser Gly Lys Met Val Ala Lys Arg Gln

115 120 125

Phe Arg Ile Gly Asp Ile Ala Gly Glu His Thr Ala Phe Asn Gln Leu

130 135 140

Pro Asp Gly Lys Ala Glu Tyr His Gly Lys Ala Phe Ser Ser Asp Asp

145 150 155 160

Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln Gly

165 170 175

His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Thr Pro Glu Gln Asn Val Glu Leu

180 185 190

Ala Ala Ala Glu Leu Lys Ala Asp Glu Lys Ser His Ala Val Ile Leu

195 200 205

Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Ser Glu Ala Lys Gly Thr Tyr His Leu Ala

210 215 220

Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln Glu Ile Ala Gly Ser Ala Ala Val Lys

225 230 235 240

Ile Gly Glu Lys Val His Glu Ile Gly Ile Ala Gly Lys Gln

245 250

<210> 21

<211> 762

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 融合蛋白 A的核酸序列

<400> 21

atgcatcatc atcaccatca tgttgcagca gatattggcg caggtctggc agatgcactg 60

accgctccgc tggatcataa agataaaggt ctgcagagcc tgaccctgga tcagagcgtt 120

cgcaaaaatg aaaaactgaa actggcagca cagggtgcag aaaaaaccta tggtaatggc 180

gatagcctga ataccggcaa actgaaaaat gataaagtga gccgctttga ttttattcgc 240

cagattgaag ttgatggtca gctgattacc ctggaaagcg gtgaatttca ggtgtataaa 300

cagagccata gcgcactgac cgcctttcag accgaacaaa ttcaggatag cgaacatagc 360

ggtaaaatgg ttgccaaacg ccagtttcgt attggtgata ttgccggtga acataccgca 420

tttaatcagc tgccggatgg taaagcagaa tatcatggca aagcctttag ctctgatgat 480

gccggtggta aactgaccta taccattgat tttgcagcca aacagggtca tggcaaaatt 540

gaacatctga aaacaccgga acagaatgtt gaactggcag cagcagaact gaaagcagat 600

gaaaaaagcc atgccgttat tctgggtgat acccgttatg gtagcgaagc aaaaggcacc 660

tatcatctgg cactgtttgg tgatcgtgca caggaaattg caggtagcgc agcagttaaa 720

attggcgaaa aagtgcatga aattggcatt gccggtaaac ag 762

<210> 22

<211> 254

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 融合蛋白 B

<400> 22

Met His His His His His His Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu

1 5 10 15

Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Gly Leu Gln

20 25 30

Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu

35 40 45

Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn

50 55 60

Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg

65 70 75 80

Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe

85 90 95

Gln Val Tyr Lys Gln Ser His Ser Ala Leu Thr Ala Phe Gln Thr Glu

100 105 110

Gln Ile Gln Asp Ser Glu His Ser Gly Lys Met Val Ala Lys Arg Gln

115 120 125

Phe Arg Ile Gly Asp Ile Ala Gly Glu His Thr Ala Phe Asn Gln Leu

130 135 140

Pro Asp Gly Lys Ala Glu Tyr His Gly Lys Ala Phe Ser Ser Asp Asp

145 150 155 160

Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln Gly

165 170 175

His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Thr Pro Glu Gln Asn Val Glu Leu

180 185 190

Ala Ala Ala Glu Leu Lys Ala Asp Glu Lys Ser His Ala Val Ile Leu

195 200 205

Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Ser Glu Ala Lys Gly Thr Tyr His Leu Ala

210 215 220

Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln Glu Ile Ala Gly Ser Ala Thr Val Lys

225 230 235 240

Ile Gly Glu Lys Val His Glu Ile Gly Ile Ala Gly Lys Gln

245 250

<210> 23

<211> 762

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 融合蛋白 B的核酸序列

<400> 23

atgcatcatc atcaccatca tgttgcagca gatattggcg caggtctggc agatgcactg 60

accgctccgc tggatcataa agataaaggt ctgcagagcc tgaccctgga tcagagcgtt 120

cgcaaaaatg aaaaactgaa actggcagca cagggtgcag aaaaaaccta tggtaatggc 180

gatagcctga ataccggcaa actgaaaaat gataaagtga gccgctttga ttttattcgc 240

cagattgaag ttgatggtca gctgattacc ctggaaagcg gtgaatttca ggtgtataaa 300

cagagccata gcgcactgac cgcctttcag accgaacaaa ttcaggatag cgaacatagc 360

ggtaaaatgg ttgccaaacg ccagtttcgt attggtgata ttgccggtga acataccgca 420

tttaatcagc tgccggatgg taaagcagaa tatcatggca aagcctttag ctctgatgat 480

gccggtggta aactgaccta taccattgat tttgcagcca aacagggtca tggcaaaatt 540

gaacatctga aaacaccgga acagaatgtt gaactggcag cagcagaact gaaagcagat 600

gaaaaaagcc atgccgttat tctgggtgat acccgttatg gtagcgaagc aaaaggcacc 660

tatcatctgg cactgtttgg tgatcgtgca caggaaattg caggtagcgc aaccgttaaa 720

attggcgaaa aagtgcatga aattggcatt gccggtaaac ag 762

<210> 24

<211> 255

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 融合蛋白 C

<400> 24

Met His His His His His His Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu

1 5 10 15

Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Gly Leu Gln

20 25 30

Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu

35 40 45

Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn

50 55 60

Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg

65 70 75 80

Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe

85 90 95

Gln Val Tyr Lys Gln Ser His Ser Ala Leu Thr Ala Phe Gln Thr Glu

100 105 110

Gln Ile Gln Asp Ser Glu His Ser Gly Lys Met Val Ala Lys Arg Gln

115 120 125

Phe Arg Ile Gly Asp Ile Ala Gly Glu His Thr Ala Phe Asn Gln Leu

130 135 140

Pro Glu Gly Gly Arg Ala Glu Tyr His Gly Lys Ala Phe Ser Ser Asp

145 150 155 160

Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln

165 170 175

Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Thr Pro Glu Gln Asn Val Glu

180 185 190

Leu Ala Ala Ala Glu Leu Lys Ala Asp Glu Lys Arg His Ala Val Ile

195 200 205

Leu Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Ser Glu Ala Lys Gly Thr Tyr His Leu

210 215 220

Ala Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln Glu Ile Ala Gly Ser Ala Ala Val

225 230 235 240

Lys Ile Gly Glu Lys Val His Glu Ile Gly Ile Ala Gly Lys Gln

245 250 255

<210> 25

<211> 765

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 融合蛋白 C的核酸序列

<400> 25

atgcatcatc atcaccatca tgttgcagca gatattggcg caggtctggc agatgcactg 60

accgctccgc tggatcataa agataaaggt ctgcagagcc tgaccctgga tcagagcgtt 120

cgcaaaaatg aaaaactgaa actggcagca cagggtgcag aaaaaaccta tggtaatggc 180

gatagcctga ataccggcaa actgaaaaat gataaagtga gccgctttga ttttattcgc 240

cagattgaag ttgatggtca gctgattacc ctggaaagcg gtgaatttca ggtgtataaa 300

cagagccata gcgcactgac cgcctttcag accgaacaaa ttcaggatag cgaacatagc 360

ggtaaaatgg ttgccaaacg ccagtttcgt attggtgata ttgccggtga acataccgca 420

tttaatcagc tgccggaagg tggtcgtgca gaatatcatg gcaaagcctt tagctctgat 480

gatgccggtg gtaaactgac ctataccatt gattttgcag ccaaacaggg tcatggcaaa 540

attgaacatc tgaaaacacc ggaacagaat gttgaactgg cagcagcaga actgaaagca 600

gatgaaaaac gtcatgccgt tattctgggt gatacccgtt atggtagcga agcaaaaggc 660

acctatcatc tggcactgtt tggtgatcgc gcacaggaaa ttgcaggtag cgcagcagtt 720

aaaattggcg aaaaagtgca tgaaattggc attgccggta aacag 765

<210> 26

<211> 255

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 融合蛋白 E

<400> 26

Met His His His His His His Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu

1 5 10 15

Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Gly Leu Gln

20 25 30

Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu

35 40 45

Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn

50 55 60

Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg

65 70 75 80

Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe

85 90 95

Gln Val Tyr Lys Gln Ser His Ser Ala Leu Thr Ala Phe Gln Thr Glu

100 105 110

Gln Ile Gln Asp Ser Glu His Ser Gly Lys Met Val Ala Lys Arg Gln

115 120 125

Phe Arg Ile Gly Asp Ile Ala Gly Glu His Thr Ala Phe Asn Gln Leu

130 135 140

Pro Glu Gly Gly Arg Ala Glu Tyr His Gly Lys Ala Phe Ser Ser Asp

145 150 155 160

Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln

165 170 175

Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Thr Pro Glu Gln Asn Val Glu

180 185 190

Leu Ala Ala Ala Glu Leu Lys Ala Asp Glu Lys Arg His Ala Val Ile

195 200 205

Leu Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Ser Glu Ala Lys Gly Thr Tyr His Leu

210 215 220

Ala Leu Phe Gly Asp Lys Ala Gln Glu Ile Ala Gly Ser Ala Ala Val

225 230 235 240

Lys Ile Gly Glu Lys Val His Glu Ile Gly Ile Ala Gly Lys Gln

245 250 255

<210> 27

<211> 765

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 融合蛋白 E的核酸序列

<400> 27

atgcatcatc atcaccatca tgttgcagca gatattggcg caggtctggc agatgcactg 60

accgctccgc tggatcataa agataaaggt ctgcagagcc tgaccctgga tcagagcgtt 120

cgcaaaaatg aaaaactgaa actggcagca cagggtgcag aaaaaaccta tggtaatggc 180

gatagcctga ataccggcaa actgaaaaat gataaagtga gccgctttga ttttattcgc 240

cagattgaag ttgatggtca gctgattacc ctggaaagcg gtgaatttca ggtgtataaa 300

cagagccata gcgcactgac cgcctttcag accgaacaaa ttcaggatag cgaacatagc 360

ggtaaaatgg ttgccaaacg ccagtttcgt attggtgata ttgccggtga acataccgca 420

tttaatcagc tgccggaagg tggtcgtgca gaatatcatg gcaaagcctt tagctctgat 480

gatgccggtg gtaaactgac ctataccatt gattttgcag ccaaacaggg tcatggcaaa 540

attgaacatc tgaaaacacc ggaacagaat gttgaactgg cagcagcaga actgaaagca 600

gatgaaaaac gtcatgccgt tattctgggt gatacccgtt atggtagcga agcaaaaggc 660

acctatcatc tggcactgtt tggtgataaa gcacaggaaa ttgcaggtag cgcagcagtt 720

aaaattggcg aaaaagtgca tgaaattggc attgccggta aacag 765

Claims (34)

1. 一种包含氨基酸序列F1和F2的融合蛋白，其中F1是第一个fHbp氨基酸序列的N-端片段；F2是第二个fHbp氨基酸序列的C-端片段；所述第一个和第二个fHbp氨基酸序列来自不同的fHbp家族，其中片段F1和F2的长度都是至少10个氨基酸；其中所述融合蛋白能够引发针对两个fHbp家族的抗体。

2. 根据权利要求1所述的融合蛋白，其具有至少一个防止因子H结合的突变。

3. 根据权利要求2所述的融合蛋白，其中所述防止因子H结合的突变包括，置换下述的任意一个或多个：

fhbp家族A的Glu 217；

fhbp家族A的Glu/Thr 238；

fhbp家族B的Glu 218；和

fhbp家族B的Glu 239。

4. 根据权利要求3所述的融合蛋白，其中所述置换是，用丙氨酸置换所述氨基酸。

5. 根据任意前述权利要求所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含来自fHbp家族B的N-末端F1片段和来自fHbp家族A的C-端F2片段。

6. 根据权利要求5所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白的B族部分包含Gly121和Lys 122。

7. 根据任意前述权利要求所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白的A族部分包含一个或多个或所有下述氨基酸：Ala 173; Ser 215、Lys 179和Glu 191。

8. 根据权利要求5-7中任一项所述的融合蛋白，其包含：

F1序列，其包含B族fHbp蛋白的残基1至残基135、或残基1至残基136、或残基1至残基137、或残基1至残基138、或残基1至残基139 (B族fHbp蛋白的残基1至135-139)，和

F2序列，其包含A族fHbp蛋白的残基136至残基254、或残基137至残基254、或残基138至残基254、或残基139至残基254、或残基140至残基254 (A族fHbp蛋白的残基136-140至254)，

或，其中所述融合蛋白具有来自B族fHbp蛋白的残基1至135-139的10个或更多个邻接氨基酸残基，所述残基与来自A族fHbp蛋白的残基136-140至254的10个或更多个邻接氨基酸残基融合，

或是与这样的融合蛋白具有至少80%序列同一性的蛋白。

9. 根据任意前述权利要求所述的融合蛋白，其中所述F1家族B序列是下述的MC58序列(SEQ ID NO. 7)的一部分，或与该序列具有80%或更高同一性的多肽：

。

10. 根据任意前述权利要求所述的融合蛋白，其中所述F2家族A序列是下述的菌株8047序列(SEQ ID NO. 9)的一部分，或与该序列具有80%或更高同一性的多肽：

。

11. 一种融合蛋白，其具有本文公开的融合蛋白A (SEQ ID NO 20)、B (SEQ ID NO. 22)、C (SEQ ID NO 24)、D、E (SEQ ID NO 26)或F的序列。

12. 一种分离的外膜囊泡(OMV)，其包含根据任意前述权利要求所述的融合蛋白。

13. 根据权利要求12所述的分离的OMV，其中所述融合蛋白被脂质化。

14. 一种多核苷酸，其编码任意前述权利要求所述的融合蛋白。

15. 一种药物组合物，其包含根据权利要求1-11中的任一项所述的融合蛋白、或根据权利要求14所述的多核苷酸、或根据权利要求12或13所述的分离的外膜囊泡和药学上可接受的赋形剂。

16. 一种疫苗，其包含根据权利要求1-11中的任一项所述的融合蛋白、或根据权利要求14所述的多核苷酸、或根据权利要求12或13所述的分离的外膜囊泡和药学上可接受的赋形剂，所述疫苗适当地用于治疗或预防奈瑟球菌感染或疾病。

17. 一种治疗或预防奈瑟球菌感染或疾病的方法，所述方法包括：给有此需要的宿主施用保护剂量的根据权利要求16所述的疫苗。

18. 根据权利要求1-11中的任一项所述的融合蛋白、或根据权利要求14所述的多核苷酸、或根据权利要求12或13所述的分离的外膜囊泡，其用于治疗或预防奈瑟球菌感染或疾病。

19. 根据权利要求1-11中的任一项所述的融合蛋白、或根据权利要求14所述的多核苷酸、或根据权利要求12-13所述的分离的外膜囊泡在药物生产中的用途，所述药物用于治疗或预防奈瑟球菌感染。

20. 根据权利要求17-19中任一项所述的方法、融合蛋白或用途，其中所述奈瑟球菌是脑膜炎奈瑟球菌。

21. 根据权利要求1-11、18或20中任一项所述的生产融合蛋白的方法，所述方法包括，在细胞或体外系统中表达权利要求14所述的多核苷酸。

22. 根据权利要求1-11、18或20中任一项所述的生产融合蛋白的方法，所述方法包括，在外膜囊泡中表达所述融合蛋白。

23. 根据权利要求22所述的生产方法，其中用0-0.5% 去污剂、任选地脱氧胆酸盐[DOC]提取外膜囊泡。

24. 根据权利要求1-23中任一项所述的融合蛋白、OMV、组合物、疫苗、方法或用途，其中所述融合蛋白与第二抗原相组合(或一起配制)，所述第二抗原能够引发针对脑膜炎奈瑟球菌L2免疫型的抗体，所述L2免疫型任选地选自L2 LOS、TdfI、Hap、Hsf和TdfH，或选自2种或更多种所述抗原的组合，诸如L2 LOS和TdfI、L2 LOS和Hap、L2 LOS和Hsf、TdfI和Hap、TdfI和Hsf、Hap和Hsf、TdfI和Hap和Hsf、L2 LOS和TdfI和Hap、L2 LOS和TdfI和Hsf、以及L2 LOS和Hap和Hsf。

25. 根据权利要求24所述的融合蛋白、OMV、组合物、疫苗、方法或用途，其中所述融合蛋白和第二抗原是用于治疗或预防奈瑟球菌感染或疾病，例如用于治疗或预防脑膜炎奈瑟球菌L2免疫型感染或疾病。

26. 根据权利要求24或25所述的融合蛋白、OMV、组合物、疫苗、方法或用途，其中所述第二抗原来自不是脑膜炎奈瑟球菌L2菌株的菌株。

27. 根据权利要求1-26中任一项所述的融合蛋白、OMV、组合物、疫苗、方法或用途，其中所述融合蛋白与第二抗原相组合(或一起配制)，所述第二抗原能够引发针对ST269克隆复合体的抗体，所述ST269克隆复合体任选地选自TdfI、Hap、Hsf和TdfH，或选自2种或更多种所述抗原的组合，诸如TdfI和Hap、TdfI和Hsf、Hap和Hsf、以及TdfI和Hap和Hsf。

28. 根据权利要求27所述的融合蛋白、OMV、组合物、疫苗、方法或用途，其中所述融合蛋白和第二抗原是用于治疗或预防脑膜炎奈瑟球菌感染或疾病，例如用于治疗或预防脑膜炎奈瑟球菌ST269克隆复合体感染或疾病。

29. 根据权利要求27或28所述的融合蛋白、OMV、组合物、疫苗、方法或用途，其中所述第二抗原来自不是脑膜炎奈瑟球菌ST269菌株的菌株。

30. 根据权利要求1-29中任一项所述的融合蛋白、OMV、组合物、疫苗、方法或用途，其中所述融合蛋白与第二抗原相组合(或一起配制)，所述第二抗原能够引发针对ST11克隆复合体的抗体，所述ST11克隆复合体任选地选自L2 LOS、TdfI、Hap、Hsf和TdfH，或选自2种或更多种所述抗原的组合，诸如L2 LOS和TdfI、L2 LOS和Hap、L2 LOS和Hsf、TdfI和Hap、TdfI和Hsf、Hap和Hsf、TdfI和Hap和Hsf、L2 LOS和TdfI和Hap、L2 LOS和TdfI和Hsf、以及L2 LOS和Hap和Hsf。

31. 根据权利要求30所述的融合蛋白、OMV、组合物、疫苗、方法或用途，其中所述融合蛋白和第二抗原是用于治疗或预防脑膜炎奈瑟球菌感染或疾病，例如用于治疗或预防脑膜炎奈瑟球菌ST11克隆复合体感染或疾病。

32. 根据权利要求30或31所述的融合蛋白、OMV、组合物、疫苗、方法或用途，其中所述第二抗原来自不是脑膜炎奈瑟球菌ST11菌株的菌株。

33. 根据权利要求1-32中任一项所述的融合蛋白、OMV、组合物、疫苗、方法或用途，其中所述融合蛋白与NadA相组合(或一起配制)。

34. 根据权利要求1-33中任一项所述的融合蛋白、OMV、组合物、疫苗、方法或用途，其中所述融合蛋白与Lipo28相组合(或一起配制)。

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