ES2310062B1 - Particulas pseudovirales vacias quimericas derivadas del virus causante de la enfermedad de la bursitis infecciosa (ibdv), procedimiento de obtencion y aplicaciones. - Google Patents
Particulas pseudovirales vacias quimericas derivadas del virus causante de la enfermedad de la bursitis infecciosa (ibdv), procedimiento de obtencion y aplicaciones. Download PDFInfo
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Abstract
Partículas pseudovirales vacías quiméricas
derivadas del virus causante de la enfermedad de la bursitis
infecciosa (IBDV), procedimiento de obtención y aplicaciones.
Las partículas pseudovirales vacías quiméricas
del virus causante de la enfermedad de la bursitis infecciosa (IBDV)
están constituidas por ensamblaje de proteínas de fusión que
comprenden una región A constituida por la proteína pVP2 de IBDV o
un fragmento 1-n de dicha proteína pVP2 de IBDV, en
donde "n" es un número entero comprendido entre 441 y 501,
unida a una región B constituida por un polipéptido heterólogo que
comprende un polipéptido de interés, tal como un polipéptido útil
en vacunación, terapia o diagnóstico.
Description
Partículas pseudovirales vacías quiméricas
derivadas del virus causante de la enfermedad de la bursitis
infecciosa (IBDV), procedimiento de obtención y aplicaciones.
La invención se relaciona con la producción de
partículas pseudovirales vacías quiméricas derivadas del virus
causante de la enfermedad de la bursitis infecciosa (IBDV) y sus
aplicaciones.
Las partículas pseudovirales son estructuras
especializadas en el empaquetamiento y la vehiculización de ácidos
nucleicos y proteínas. Una característica general de las partículas
pseudovirales es su excelente capacidad para la estimulación de la
respuesta inmune del hospedador. Estas propiedades convierten a las
partículas pseudovirales en agentes de extraordinario interés para
el desarrollo tanto de sistemas de transporte intracelular
(delivery systems) como para la generación de vacunas
sub-unidad. La utilización de diferentes sistemas
de expresión genética ha facilitado la producción de cápsidas
virales vacías o partículas pseudovirales (VLPs) de diferentes
virus, por ejemplo, rotavirus (US 2003/0175301), retrovirus (US
6.602.705), parvovirus (US 6.458.362), etc. La manipulación
genética de estos sistemas de expresión permite, a su vez, la
producción de VLPs que contienen secuencias aminoacídicas
heterólogas, procedentes de proteínas distintas de aquéllas que
conforman la cápsida viral nativa. Estas VLPs se denominan
genéricamente VLPs heterotípicas, recombinantes o quiméricas (QVLPs)
y han sido utilizadas fundamentalmente con dos finalidades: (i)
generación de vacunas multivalentes, mediante péptidos heterólogos
inmunogénicamente relevantes y (ii) modificación del tropismo,
mediante inserción de secuencias aminoacídicas involucradas en
interacciones receptor-ligando.
El virus causante de la enfermedad de la
bursitis infecciosa (IBDV), perteneciente a la familia
Birnaviridae, infecta diferentes especies aviares y es el
responsable directo de la bursitis infecciosa, una grave enfermedad
inmunosupresora causante de importantes pérdidas económicas en la
industria avícola mundial.
Las partículas de IBDV son icosaédricas, con una
simetría T=13, carecen de envuelta y están formadas por una única
capa proteica. Hasta el momento, las aproximaciones encaminadas a la
obtención un modelo atómico para las partículas de IBDV han
fracasado. Por ello, la información estructural disponible está
basada en modelos tridimensionales generados a partir de imágenes
obtenidas por criomicroscopía electrónica del virus purificado y de
VLPs. En base a esos estudios, se ha comprobado que la superficie
externa de la partícula está formada por un entramado continuo de
260 trímeros de la proteína VP2 (37 kDa) ordenados en cinco
conformaciones diferentes. La cara interna de las partículas
contiene 200 trímeros de la proteína VP3 (29 kDa), estos últimos,
independientes entre sí, se encuentran unidos a la zona basal de los
trímeros de VP2. Se ha sugerido que un tercer polipéptido, VP4 (28
kDa), también podría formar parte
de las partículas, estando situado en la base de los pentámeros que forman los vértices de la estructura icosaédrica.
de las partículas, estando situado en la base de los pentámeros que forman los vértices de la estructura icosaédrica.
Los polipéptidos VP2, VP3 y VP4 se producen a
partir del procesamiento proteolítico de un polipéptido precursor
de un tamaño de 109 kDa. Este precursor se procesa
auto-catalíticamente liberando los polipéptidos pVP2
(48 kDa), VP3 y VP4. El dominio VP4, que se localiza en la región
central de la poliproteína, pertenece a la familia de las proteasas
Ion y es el responsable del corte proteolítico. Los polipéptidos
pVP2 y VP3 son los responsables directos del ensamblaje de las
cápsidas. El producto pVP2 sufre un último corte en su extremo
C-terminal antes de dar lugar a la forma madura de
la proteína, VP2, que es la que se encuentra en las partículas
purificadas. Este procesamiento de pVP2 es necesario para la
correcta formación de las cápsidas y requiere de la presencia de
VP3, aunque la proteasa responsable aún no ha sido identificada.
La morfogénesis es un proceso vital para el
ciclo vírico que requiere de pasos sucesivos asociados a
modificaciones en los polipéptidos precursores. Por ello, los virus
han desarrollado estrategias que permiten la secuencial y correcta
interacción entre cada uno de sus componentes. Una de estas
estrategias, utilizada con frecuencia por virus icosaédricos,
consiste en la utilización de polipéptidos provenientes de una única
poliproteína como base de sus componentes estructurales. En estos
casos, el adecuado procesamiento proteolítico de dicha poliproteína
juega un papel crucial en el proceso de ensamblaje.
En trabajos previos se ha demostrado este
principio para el ensamblaje de las cápsidas de IBDV
(Fernández-Arias A et al. 1998. Expression of
ORF Al of infectious bursal disease virus infectious bursal disease
virus results in the formation of virus-like
particles. Journal of General Virology
79:1047-1054). La expresión en células eucarióticas
del gen que codifica la poliproteína de IBDV da lugar a la formación
de VLPs totalmente indistinguibles morfológica y bioquímicamente de
los viriones de IBDV. Asimismo, se ha comprobado que el ensamblaje
de las cápsidas necesita únicamente de la síntesis y del correcto
procesamiento de la poliproteína viral y es independiente de la
presencia del genoma vírico o de otras proteínas codificadas por el
genoma viral tales como las proteínas VP5 y VP1.
Los resultados obtenidos hasta la fecha a partir
de la expresión de los genes de IBDV en distintos sistemas
recombinantes han permitido concluir que: i) el proceso de
ensamblaje es independiente de la presencia del material genético
del virus, ii) para el ensamblaje sólo son necesarios los
polipéptidos codificados por el gen de la poliproteína, y iii) el
ensamblaje requiere de una interacción coordinada entre los
polipéptidos VP2 y VP3.
Sin embargo, no se conoce si la interacción
pVP2/VP3 se establece entre dominios de VP2 y VP3 de la
poliproteína precursora cuando aún no ha sufrido modificaciones, o
si por el contrario, esta interacción ocurre tras el procesamiento
del precursor. Además, la información actual no excluye la
posibilidad de que VP4 pudiera jugar un papel relevante en la
morfogénesis de la cápsida. De hecho, se han descrito VLPs de IBDV
formadas por ensamblaje de las proteínas VP2, VP3 y VP4 de IBDV (US
6.528.063; US 5.788.970 y JP 5194597).
El trabajo desarrollado por estos mismos
inventores ha permitido establecer sistemas para la obtención de
VLPs de IBDV empleando diferentes vectores de expresión
eucariótica. Estos vectores han sido utilizados para la expresión de
la poliproteína de IBDV en ausencia o presencia de la RNA
polimerasa viral VP1. La caracterización bioquímica de las VLPs
purificadas demuestra que contienen las proteínas pVP2, VP2 y VP3,
cuando se expresa únicamente la poliproteína viral, y las proteínas
pVP2, VP2, VP3 y VP1 cuando se realiza la expresión simultánea de
la poliproteína y la RNA polimerasa viral
(Fernández-Arias A et al. 1998. Expression of
ORF A1 of infectious bursal disease virus infectious bursal disease
virus results in the formation of virus-like
particles. Journal of General Virology
79:1047-1054; Martínez-Torrecuadrada
JL et al. 2000. Different architectures in the assembly of
infectious bursal disease virus capsid proteins expressed in insect
cells. Virology 278:322-331; Maraver A et al.
2003. The oligomerization domain of VP3, the scaffolding protein of
infectious bursal disease virus, plays a critical role for capsid
formation. Journal of Virology 77:6438-49; Lombardo
E et al. 1999. VP1, the putative
RNA-dependent RNA polymerase of infectious bursal
disease virus, forms complexes with the capsid protein VP3, leading
to efficient encapsidation into virus-like
particles. Journal of Virology 73:6973-6983).
Por otra parte, la solicitud de patente WO
02/088339 describe unas partículas pseudovirales de IBDV formadas
por ensamblaje de proteínas quiméricas que comprenden la
poliproteína de IBDV unida en su extremo carboxilo terminal a un
polipéptido.
No se han descrito previamente QVLPs basadas
únicamente en la proteína pVP2 de IBDV, o en fragmentos de la
misma, fusionada a un polipéptido de interés, ni su potencial uso
como vacunas o como vehiculizadoras de productos de interés.
La invención se enfrenta con el problema de
proporcionar nuevas herramientas para vectorizar o vehiculizar
productos de interés, tales como moléculas con actividad biológica,
por ejemplo, fármacos, polipéptidos, proteínas, ácidos nucleicos,
etc.
La solución proporcionada por esta invención se
basa en que los inventores han observado que es posible obtener
partículas pseudovirales vacías quiméricas derivadas de IBDV como
consecuencia de la expresión de la proteína pVP2 de IBDV, o de un
fragmento de dicha proteína que es capaz autoensamblarse y formar
dichas partículas pseudovirales, modificada genéticamente para
incluir una secuencia de nucleótidos que codifica para un
polipéptido heterólogo que comprende un polipéptido de interés,
denominadas genéricamente QVLPs-pVP2* de IBDV en
esta descripción. De hecho, los inventores han observado que la
proteína pVP2 de IBDV de longitud completa, o un fragmento de dicha
proteína de hasta 501, típicamente de 441-466,
restos de aminoácidos contiguos contados a partir del aminoácido
número 1 de la proteína pVP2 de IBDV, puede fusionarse con un
polipéptido heterólogo y las proteínas de fusión (quiméricas) así
obtenidas pueden ensamblarse entre sí y formar QVLPs, en concreto,
dichas QVLPs-pVP2*, las cuales poseen propiedades
similares a las de las cápsidas virales nativas en cuanto a
especificidad e interacciones con las células y que, además, pueden
ser manipuladas para ser dirigidas a otras células diana.
Dichas QVLPs-pVP2* de IBDV están
formadas por ensamblaje de proteínas de fusión que comprenden una
región A constituida por una proteína pVP2 de IBDV o por un
fragmento de dicha proteína pVP2 de IBDV que comprende al menos una
secuencia homóloga a la del fragmento 1-n de la
proteína pVP2 de IBDV, en donde "n" es un número entero
comprendido entre 441 y 501, unida a una región B constituida por un
polipéptido heterólogo que comprende un polipéptido de interés, en
donde dicha región B está unida al extremo amino- o
carboxilo-terminal de dicha proteína pVP2* de IBDV.
Estas QVLPs-pVP2* pueden ser utilizadas con fines
sanitarios, por ejemplo, terapéuticos, profilácticos o preventivos,
de diagnóstico, etc., por ejemplo, en la elaboración de vacunas,
vectores para terapia génica, etc.
Estudios realizados por los inventores han
puesto de manifiesto, sorprendentemente, que es posible obtener
QVLPs formadas por ensamblaje de proteínas de fusión que comprenden
(i) fragmentos de la proteína pVP2 de IBDV (e.g., fragmentos de
pVP2 de 441 a 501, preferentemente de 441 a 466, restos de
aminoácidos contiguos contados desde el aminoácido 1 de la proteína
pVP2 de IBDV) y (ii) una secuencia aminoacídica heteróloga, y que
dichas secuencias aminoacídicas heterólogas no constituyen ningún
obstáculo para la formación de dichas QVLPs. Asimismo, los
inventores han observado que dichas QVLPs pueden ser utilizadas para
inmunizar eficazmente aves frente a la infección causada por IBDV o
bien para proteger eficazmente animales frente a la infección
causada por otros agentes causales (dependiendo de la secuencia
aminoacídica heteróloga presente en dichas QVLPs y del
antígeno/inmunógeno contenido en dicha secuencia).
En una realización particular, los inventores
han obtenido QVLPs formadas por ensamblaje de proteínas de fusión
que comprenden fragmentos de la proteína pVP2 de IBDV (e.g.,
fragmentos de pVP2 de 441 a 466 restos de aminoácidos contiguos
contados desde el aminoácido 1 de la proteína pVP2 de IBDV) y una
secuencia aminoacídica heteróloga, tal como una cola de histidinas
(Ejemplo 1). Asimismo, en otra realización particular, los
inventores han comprobado la formación de QVLPs mediante la
expresión de fragmentos de la proteína pVP2 de IBDV, en particular,
el fragmento identificado en esta descripción como proteína
pVP2-456, fusionados al péptido quimérico del virus
de la fiebre aftosa [foot-and-mouth
disease virus (FMDV)] denominado BT, que comprende los epítopos de
las células B y T de FMDV (Ejemplo 3) (Zhang, Q. et al.,
2002, Acta Virologica 46(1):1-9).
La producción de QVLPs basadas en una única
proteína (pVP2*) presenta numerosas ventajas, tanto a nivel de
manipulación de los vectores expresión empleados como a nivel de
rendimiento en la producción, frente a la producción de otras QVLPs
constituidas por ensamblaje de dos proteínas (e.g., la proteína pVP2
de IBDV y una proteína de fusión basada en la proteína VP3 de
IBDV).
Por tanto, un aspecto de la presente invención
se relaciona con una proteína de fusión que comprende una región A
constituida por una proteína pVP2 de IBDV o por un fragmento de
dicha proteína pVP2 de IBDV que comprende al menos una secuencia
homóloga a la del fragmento 1-n de la proteína pVP2
de IBDV, en donde "n" es un número entero comprendido entre
441 y 501, unida a una región B constituida por un polipéptido
heterólogo que comprende un polipéptido de interés. El procedimiento
para la obtención de dicha proteína de fusión constituye un aspecto
adicional de esta invención.
En otro aspecto, la presente invención se
relaciona con una partícula pseudoviral vacía quimérica, denominada
genéricamente QVLP-pVP2* (singular) o
QVLPs-pVP2* (plural) de IBDV en esta descripción,
caracterizada porque está constituida por ensamblaje de dicha
proteína de fusión previamente definida.
Un aspecto adicional de esta invención se
relaciona con un procedimiento para la producción de dichas
QVLPs-pVP2* de IBDV proporcionadas por esta
invención, basado en la expresión génica de dicha proteína de
fusión previamente definida.
Los ácidos nucleicos, cassettes de expresión,
vectores recombinantes y células hospedadoras desarrollados para la
puesta en práctica de dicho procedimiento de producción de dichas
proteínas de fusión o de dichas QVLPs-pVP2* de IBDV,
así como su empleo para la producción de dichas proteínas de fusión
QVLPs-pVP2* de IBDV, constituyen aspectos
adicionales de la presente invención.
Dichas QVLPs-pVP2* de IBDV
tienen la capacidad de vectorizar o vehiculizar productos de
interés, tales como moléculas con actividad biológica, por ejemplo,
fármacos, polipéptidos, proteínas, anticuerpos, ácidos nucleicos,
etc.
Por tanto, en otro aspecto adicional, la
presente invención se relaciona con el empleo de dichas
QVLPs-pVP2* de IBDV, en la elaboración de
composiciones farmacéuticas, tales como vacunas, vectores para
terapia génica y sistemas de suministro de sustancias activas.
Dichas vacunas, vectores y sistemas de suministro constituyen
aspectos adicionales de la presente invención.
La Figura 1 muestra la expresión de los mutantes
de deleción del extremo C-terminal de pVP2 con y sin
un His-tag en el extremo N-terminal.
La colección de mutantes de expresión pVP2/VP2 sin (Figura 1A) y con
(Figura 1B, 9C) His-tag se analizó por
SDS-PAGE y western-blot mediante el
empleo de un anticuerpo policlonal anti-VP2 (Figura
1A, 1B) y anti-His (Figura 1C). Se cargó el mismo
volumen de extracto celular para cada mutante para así poder
comparar los niveles relativos de expresión de los mutantes
pVP2/VP2. Como control positivo, se usaron las cápsidas de IBDV, se
indican las posiciones correspondientes a pVP2 y VP2. A la izquierda
se indican los marcadores de peso molecular en kDa. Para
simplificar, los mutantes pVP2/VPs están referidos de acuerdo a la
posición del último aminoácido. Para asegurar que la proteína VP3
no está presente y así descartar posibles contaminaciones, el
Western-blot se controló usando anticuerpos
anti-VP3 (no mostrado).
La Figura 2 muestra un análisis de la
\alpha-hélice del extremo
C-terminal de pVP2. La Figura 2A muestra el
espectro de dicroísmo circular (DC) del péptido FGFKDIIRAIRRI (Seq.
ID. No. 11) en tampón PES, en ausencia (línea discontinua) o
presencia del 30% de trifluoroetanol (TFE) (línea continua). En la
figura se puede observar el mínimo a 208 y 220 nm y el incremento
en la elipticidad a 195 nm. En la Figura 2B se observa la
estructura secundaria de los residuos 241-250 de
LmTIM. Nótese el carácter anfipático de la hélice alfa.
La Figura 3 muestra un análisis de las proteínas
pVP2 y del mutante HT-pVP2 en geles
SDS-PAGE teñidos con azul de Coomassie. La Figura 3A
es un esquema de la región C-terminal de la pVP2,
se indican las posiciones y secuencias que han sido seleccionadas
para las deleciones en los mutantes. También se generaron las
versiones His-tag de los mutantes. Tanto los
mutantes con tag (Figura 3C) como sin tag (Figura 3B) se expresaron
a niveles altos, se centrifugaron en dos pasos; se recogieron 12
fracciones, se concentraron 20 veces, y se cargó
1-10 \mul de cada fracción (0,1 \mul por
mutante HT-pVP2), se analizaron por
SDS-PAGE y se revelaron por tinción de Coomassie.
La estrella indica que el gel se analizó por Western blot usando un
anticuerpo anti-VP2 (VP2-512). Los
mutantes VP2-487 y VP2-494 no
formaron estructuras suficientemente estables como para resistir
las condiciones de purificación, ya que no dieron precipitado a
partir del primer gradiente de sacarosa (resultado no mostrado). En
la Figura 3D se muestra el perfil típico de las proteínas de IBDV de
células infectadas con IBDV. La dirección de la sedimentación fue
de derecha a izquierda, la fracción 12 representa la parte superior
de cada gradiente.
La Figura 4 representa las fotografías por
microscopía electrónica del ensamblaje de pVP2 de los mutantes de
deleción de la región C-terminal. Las Figuras 4A y
4B muestran que los mutantes VP2-441 y
VP2-456 forman partículas con cápsidas de simetría
T=1, a pesar de que algunas permanecieron asociadas en estructuras
inestables de mayor tamaño formadas por 12 partículas dodecaédricas
(flechas en la Figura 4A). Las Figuras 4C, 4D y 4E muestran
fotografías de distintos ensamblajes de la VP2-466:
en la Figura 4C se muestran estructuras tubulares con ordenamiento
hexagonal deducido a partir de sus transformaciones de Fourier
(inserto) en las fracciones más bajas, la Figura 4D muestra
partículas con cápsidas T=1, tubos delgados rotos y material
disociado como estructuras predominantes, asimismo se obtuvieron
partículas con cápsidas T=13 en las fracciones del medio, y la
Figura 4E muestra partículas con T=1 en las fracciones
superiores.
La Figura 5 consta de fotografías obtenidas por
microscopía electrónica de los ensamblajes correspondientes a las
proteínas mutantes His-pVP2 con deleciones en la
región C-terminal. Las fracciones concentradas se
diluyeron (1/50) para una observación óptima de los ensamblajes
obtenidos. La Figura 5A muestra los ensamblajes
HT-VP2-441: estructuras de cápsidas
T=1 y ensamblajes dodecaédricos mayores (indicados con flechas). En
la Figura 5B se muestran los ensamblajes de
HT-VP2-466: partículas con cápsidas
T=13 y T=7 en las fracciones intermedias. En la Figura 5C se
muestran los ensamblajes de
HT-VP2-466 partículas con cápsidas
T=13 y T=7 en las fracciones intermedias. En las Figuras 5D, 5E y
5F se muestran los ensamblajes
HT-VP2-476: estructuras tubulares
tipo I en las fracciones inferiores (Figura 5D), partículas con
cápsidas T=13 y T=7 y piezas con ensamblaje tubular en las
fracciones intermedias (Figura 5E), y ensamblajes irregulares en las
fracciones superiores (Figura 5F). La barra corresponde a una
longitud de 100 nm.
La Figura 6 muestra la estructura tridimensional
de la cápsida de IBDV. La figura 6A muestra una micrografia
crioelectrónica de las cápsidas de IBDV. La longitud de la barra es
de 50 nm. La Figura 6B muestra una representación de la superficie
externa (izquierda) y de la interna (derecha) de la cápsida de IBDV
vista a lo largo de un eje bidimensional de la simetría
icosaédrica. El mapa de superficie se ha representado asumiendo la
presencia de 780 moléculas de VP2-441 y un valor de
0,73 cm^{3}/g como volumen parcial específico de la proteína.
Para observar con claridad los poros de la envuelta, se muestra
solamente el hemisferio frontal del mapa. Los cinco tipos de
capsómeros triméricos se indican con letras de la a a la
e. La longitud de la barra es de 200 \ring{A}.
La Figura 7 muestra la estructura tridimensional
de las cápsidas de HT-VP2-466. La
Figura 7A muestra una fotografía de criomicroscopía electrónica de
los ensamblajes de HT-VP2-466
(fracción 7). La longitud de la barra es de 50 nm. Los círculos
encierran los tres ensamblajes icosaédricos claramente discernibles
con una simetría T=13, T=7 y probablemente, T=1. La longitud de la
barra es de 50 nm. La Figura 7B muestra la estructura
tridimensional de las cápsidas de la
HT-VP2-466 T=13 (izquierda y
centro) y T=7 (derecha). Estos mapas de densidad se perfilaron para
englobar un volumen de 780 (T=13) o 420 moléculas (T=7) de
HT-VP2-466. Las clases de trímeros
de HT-VP2-466 están indicados. La
longitud de la barra es de 200 \ring{A}.
La Figura 8 muestra una comparación estructural
de las cápsidas de IBDV y
HT-VP2-466. La Figura 8A muestra los
perfiles de densidades de las cápsidas de 3DR de IBDV (línea
continua) y HT-VP2-466 (línea a
puntos) analizadas ambas a una resolución de 15 \ring{A}. Las
envueltas proteicas (r = 253-350 \ring{A}) son
prácticamente superponibles excepto por pequeñas diferencias
(flechas). La Figura 8B muestra la fotografía de un gel de
SDS-PAGE con tinción azul de Coomassie de proteínas
de las cápsidas de IBVD y
HT-VP2-466 utilizadas para los datos
de criomicroscopía electrónica. pVP2/VP2 y VP3 se cuantificaron a
partir de geles iguales. Las Figuras 8C y 8D muestran unas
secciones transversales de las cápsidas tomadas a partir de 3DR de
IBDV y HT-VP2-466, respectivamente.
Proteína y ARN están oscuros. La Figura 8E representa un mapa
calculando la diferencia entre
HT-VP2-466 con respecto a la
cápsida de IBDV. El mapa resultante se representa sobre la
superficie externa de la cápsida de IBDV vista a lo largo de un eje
icosaédrico bidimensional. La Figura 8F representa un mapa de
diferencia calculado a partir de la diferencia de IBDV con respecto
a la cápsida de HT-VP2-466. El mapa
resultante al restar estas diferencias, mostrado como 132 lóbulos
mayores, se muestra en la superficie interna de la cápsida de
HT-VP2-466 vista a lo largo de un
eje icosaédrico bidimensional. Cada una de estas islas de densidad,
usando 0,73 cm^{3}/g como volumen parcial de la proteína,
corresponde a 26 kDa aproximadamente. Por otro lado, la masa de
5-6 copias de los segmentos de
442-466 (2,6 kDa) y el His-Tag (3,4
kDa) varían de 31 a 37 kDa cada uno. La longitud de la barra es de
200 \ring{A}.
La Figura 9 muestra la organización estructural
de las cápsidas de IBDV y
HT-VP2-466. Se muestran secciones
icosaédricas de 3DR de las cápsidas de IBDV (mitad izquierda) y de
HT-VP2.466 (mitad derecha), a una resolución de 15
\ring{A}, y vistas bajo un eje bidimensional. Las distancias
perpendiculares de las secciones icosaédricas que se muestran desde
el centro de las cápsidas T=13 son 328 \ring{A} (A), 319
\ring{A} (B), 311 \ring{A} (C), 302 \ring{A} (D), 294
\ring{A} (E), 286 \ring{A} (F), 277 \ring{A} (G) y 269
\ring{A} (H). Las facetas han sido generadas a partir del
programa Facets (proporcionado por R.A. Crowther, MRC, Cambrige).
La longitud de la barra es de 200 \ring{A}.
La Figura 10 muestra los ensamblajes proteicos
de pVP2 y de los mutantes HT-pVP2. La Figura 10A
muestra un esquema que ilustra los ensamblajes adoptados por VP2 con
diferentes extensiones del extremo C-terminal,
dependiendo de la extensión de la secuencia
C-terminal, solo (VP2) o con His-tag
(HT-VP2). Se muestra la hélice \alpha del péptido
443-GFKDIIRAIR-453 (Seq. ID. No.
16). Nótese que a medida que se aumenta la longitud de la secuencia
C-terminal unida a VP2 (o su versión
His-tag) hay un equilibrio en el desplazamiento
entre estructuras con cápsidas T=1 y tubos, favoreciendo la
formación de estructuras tubulares hexagonales. Se muestra además la
secuencia completa de la región C-terminal de pVP2
y de los sitios usados en esta invención. La Figura 10B muestra una
representación de la hélice \alpha predicha para el péptido
GFKDIIRAIR (Seq. ID. No. 16) a la izquierda. En la derecha de la
figura, se muestra la carga complementaria propuesta entre la
hélice \alpha amfipática y los últimos cinco aminoácidos de la
región C-terminal de VP3 (o el alineamiento de la
región similar del His-Tag (H-tag)
de VP3) usada en la presente invención. Las secuencias de VP3 y
H-tag se muestran en direcciones opuestas, de la
región C-terminal a la
N-terminal.
La Figura 11 muestra el resultado de un análisis
por Western blot de distintas fracciones (F6-F11)
conteniendo cápsidas quiméricas de IBDV formadas por ensamblaje de
la proteína pVP2-456 de IBDV y el péptido quimérico
BT que contiene los epítopos B y T del virus de la fiebre aftosa
(Foot-and-Mouth Disease Virus o
FMDV) expresadas en levaduras. El blot superior muestra los
resultados obtenidos utilizando un anticuerpo específico
anti-VP2 de IBDV mientras que el blot inferior
muestra los resultados obtenidos utilizando un anticuerpo específico
anti-FMDV. En el blot superior pueden observarse
distintas bandas inmunoreactivas (polipéptidos) debido a la
existencia de los agregados que producen las proteínas al formar las
cápsidas; esos mismos polipéptidos son reconocidos por anticuerpos
específicos anti-FMDV (panel inferior). El control
(pESCURA/pVP2) muestra una banda inmunoreactiva frente anticuerpos
específicos anti-VP2 de menor peso molecular que no
es reconocida por anticuerpos específicos
anti-FMDV.
En un primer aspecto, la invención se relaciona
con una proteína de fusión, en adelante proteína de fusión
de la invención, que comprende una región A constituida por la
proteína pVP2 de IBDV (Seq. ID. No. 15) o por un fragmento
1-n de dicha proteína pVP2 de IBDV, en donde
"n" es un número entero comprendido entre 441 y 501, unida a
una región B constituida por un polipéptido heterólogo que comprende
un polipéptido de interés. La región B puede estar localizada en
posición N- o C-terminal con respecto a la región
A.
El término "IBDV", tal como se utiliza en
la presente invención, se refiere al virus causante de la bursitis
infecciosa e incluye a las diferentes cepas de IBDV pertenecientes a
cualquiera de los serotipos (1 ó 2) conocidos [a título ilustrativo
véase la revisión realizada por van den Berg TP et al. 2000.
Rev Sci Tech. 19:509-43].
El término "proteína pVP2 de IBDV" se
refiere, en general, a una proteína cuya secuencia de aminoácidos
está constituida por la secuencia de aminoácidos de la proteína
pVP2 de IBDV (Seq. ID. No. 14) e incluye a cualquiera de las
diferentes formas de las proteínas pVP2 representativas de
cualquiera de las mencionadas cepas de IBDV [NCBI protein
databank], de acuerdo con la definición realizada por Sánchez y
Rodríguez (1999) (Sánchez AB & Rodríguez JF. Proteolytic
processing in infectious bursal disease virus: identification of
the polyprotein cleavage sites by site-directed
mutagenesis. Virology. 1999 Sep 15;
262(1):190-199) así como a proteínas
sustancialmente homólogas a dichas proteínas pVP2 de IBDV, es
decir, proteínas que presentan un buen alineamiento con la
secuencia de una proteína pVP2 de IBDV determinada, por ejemplo,
proteínas cuyas secuencias de aminoácidos tienen un grado de
identidad, respecto a dichas proteínas pVP2 de IBDV, de, al menos,
un 60%, preferentemente de, al menos un 80%, más preferentemente
de, al menos, un 90% y, aún más preferentemente de, al menos, un
95%. Secuencias homólogas a una secuencia de la proteína pVP2 de
IBDV pueden ser identificadas fácilmente por un experto en la
materia con la ayuda de un programa informático apropiado para
comparar secuencias, por ejemplo, el programa BLAST (Altschul et
al. 1997. Nucleic Acids Res. 25:3389). En una realización
particular, la proteína pVP2 de IBDV es la proteína pVP2 de IBDV
cepa Soroa cuya secuencia, longitud completa, de aminoácidos está
depositada en la NCBI con el número de acceso AAD30136.
El término "fragmento 1-n de
la/dicha proteína pVP2 de IBDV, en donde ``n'' es un número entero
comprendido entre 441 y 501", se refiere, en general, a un
péptido o proteína cuya secuencia de aminoácidos está constituida
por la secuencia de aminoácidos contiguos comprendida entre el
resto 1 y el resto "n" de la proteína pVP2 de IBDV, en donde
"n" es un número entero comprendido entre 441 y 501. Por tanto,
dicho fragmento 1-n de la proteína pVP2 de IBDV
presente, en su caso, en las QVLPs-pVP2*
proporcionadas por esta invención, tiene una secuencia de
aminoácidos constituida por, o que comprende, entre 441 y 501
restos de aminoácidos contiguos, contados a partir del resto del
aminoácido número 1, de cualquier proteína pVP2 representativa de
cualquier cepa de IBDV, por ejemplo, de la proteína pVP2 de IBDV
cepa Soroa [NCBI, número de acceso AAD30136].
Los fragmentos 1-n de la
proteína pVP2 de IBDV particulares se denominan siguiendo el
formato "pVP2-n", donde "n" es el definido
previamente. En una realización particular, dicho fragmento
1-n de la proteína pVP2 de IBDV es una proteína
seleccionada del grupo formado por:
- (i)
- la proteína pVP2-441, cuya secuencia de aminoácidos está constituida por la secuencia de aminoácidos contiguos comprendida entre el resto 1 y el resto 441 de la proteína pVP2 de IBDV;
- (ii)
- la proteína pVP2-452, cuya secuencia de aminoácidos está constituida por la secuencia de aminoácidos contiguos comprendida entre el resto 1 y el resto 452 de la proteína pVP2 de IBDV;
- (iii)
- la proteína pVP2-456, cuya secuencia de aminoácidos está constituida por la secuencia de aminoácidos contiguos comprendida entre el resto 1 y el resto 456 de la proteína pVP2 de IBDV;
- (iv)
- la proteína pVP2-466, cuya secuencia de aminoácidos está constituida por la secuencia de aminoácidos contiguos comprendida entre el resto 1 y el resto 466 de la proteína pVP2 de IBDV;
- (v)
- la proteína pVP2-476, cuya secuencia de aminoácidos está constituida por la secuencia de aminoácidos contiguos comprendida entre el resto 1 y el resto 476 de la proteína pVP2 de IBDV;
- (vi)
- la proteína pVP2-487, cuya secuencia de aminoácidos está constituida por la secuencia de aminoácidos contiguos comprendida entre el resto 1 y el resto 487 de la proteína pVP2 de IBDV;
- (vii)
- la proteína pVP2-494, cuya secuencia de aminoácidos está constituida por la secuencia de aminoácidos contiguos comprendida entre el resto 1 y el resto 494 de la proteína pVP2 de IBDV; y
- (viii)
- la proteína pVP2-501, cuya secuencia de aminoácidos está constituida por la secuencia de aminoácidos contiguos comprendida entre el resto 1 y el resto 501 de la proteína pVP2 de IBDV.
\vskip1.000000\baselineskip
La proteína de fusión de la invención comprende
una región A constituida por la proteína pVP2 de IBDV o por un
fragmento 1-n de dicha proteína pVP2 de IBDV, en
donde "n" es un número entero comprendido entre 441 y 501,
unida a una región B constituida por un polipéptido heterólogo que
comprende un polipéptido de interés. En una realización particular,
dicha región B está unida a la región amino-terminal
de dicha proteína pVP2 de IBDV, mientras que en otra realización
particular, dicha región B está unida a la región
carboxilo-terminal de dicha proteína pVP2 de
IBDV.
En una realización particular, dicha región A
está constituida por la proteína pVP2 de IBDV. En este caso, la
proteína pVP2 de IBDV que constituye la región A de la proteína de
fusión de la invención puede ser cualquier proteína pVP2
representativa de cualquier cepa de IBDV, por ejemplo, la proteína
pVP2, longitud completa, de IBDV cepa Soroa [NCBI, número de acceso
AAD30136].
En otra realización particular, dicha región A
está constituida por un fragmento 1-n de dicha
proteína pVP2 de IBDV. En este caso, dicho fragmento
1-n de la proteína pVP2 de IBDV que constituye la
región A de la proteína de fusión de la invención puede ser
cualquier fragmento 1-n de una proteína pVP2
representativa de cualquier cepa de IBDV, por ejemplo, de la cepa
Soroa. En una realización particular, dicho fragmento
1-n de la proteína pVP2 de IBDV que constituye
dicha región A es una proteína seleccionada del grupo formado por
la proteína pVP2-441, la proteína
pVP2-452, la proteína pVP2-456, la
proteína pVP2-466, la proteína
pVP2-476, la proteína pVP2-487, la
proteína pVP2-494, y la proteína
pVP2-501, preferentemente, seleccionada entre
proteína pVP2-441, la proteína
pVP2-452, la proteína pVP2-456 y la
proteína pVP2-466.
La región B presente en la proteína de fusión de
la invención está constituida por un polipéptido heterólogo que
comprende un polipéptido de interés. Tal como se utiliza en la
presente invención el término "polipéptido heterólogo" se
refiere a un polipéptido no propio de la cápsida de IBDV
nativo.
El tamaño del polipéptido de interés puede
variar dentro de un amplio intervalo, desde unos pocos aminoácidos
hasta cientos de aminoácidos. Dicho polipéptido de interés puede
ser prácticamente cualquier polipéptido, independientemente de su
origen (eucarótico, procariótico, viral, etc.), susceptible de ser
expresado de forma recombinante, por ejemplo, un antígeno, tal como
un antígeno viral, bacteriano, microbiano, etc., frente al que se
desea inducir una respuesta inmune en un animal (incluido el ser
humano); una enzima, tal como una enzima destinada a suplementar
una función en la que un organismo sea deficiente; o un polipéptido
que comprende un dominio peptídico de unión a un ácido nucleico
capaz de reconocer específicamente una secuencia diana de ADN o de
ARN permitiendo la unión de la proteína de fusión de la invención a
una secuencia de ácido nucleico que comprenda dicha secuencia diana
y su encapsidación en una partícula pseudoviral que comprende dicha
proteína de fusión de la invención (QVLPs-pVP2* de
IBDV). En una realización particular, dicho polipéptido de interés
es un polipéptido útil en vacunación, terapia o diagnóstico, tal
como un epítopo o determinante antigénico capaz de inducir una
respuesta inmune en animales y humanos frente a enfermedades
causadas por virus, bacterias, parásitos o cualquier otro tipo de
microorganismos o frente a enfermedades tumorales. En una
realización concreta, dicho polipéptido de interés es el péptido
quimérico del virus de la fiebre aftosa (FMDV) denominado BT, que
comprende los epítopos de las células B (epítopo B) y de las
células T (epítopo T) de FMDV (Zhang, Q. et al., 2002, Acta
Virologica 46(1):1-9). En una realización
particular, el epítopo B está localizado en la proteína VP1 de
FMDV, por ejemplo, entre las posiciones 133-159 de
dicha proteína VP1 del aislado español del serotipo C, o en
posiciones equivalentes de otros aislados, mientras que el epítopo
T está localizado en la proteína VP4 de FMDV, por ejemplo, entre
las posiciones 20-34 de dicha proteína VP4 de FMDV
del serotipo Asia.
En una realización particular, dicha región B
comprende un único polipéptido de interés. Sin embargo, en otra
realización particular, dicha región B comprende dos o más
polipéptidos de interés, iguales o diferentes, los cuales pueden
estar formando tándems.
En una realización particular, la proteína de
fusión de la invención comprende una región A unida a una única
región B. En este caso, dicha región B puede estar unida a la región
amino-terminal de dicha proteína pVP2 de IBDV o de
dicho fragmento 1-n de la proteína pVP2 de IBDV; o
bien, alternativamente, dicha región B puede estar unida a la
región carboxilo-terminal de dicha proteína pVP2 de
IBDV o de dicho fragmento 1-n de la proteína pVP2
de IBDV.
\newpage
La región B, tal como se ha mencionado
previamente, puede contener uno o más polipéptidos de interés. En
una realización particular, dicha región B contiene un único
polipéptido de interés mientras que en otra realización particular,
dicha región B comprende dos o más polipéptidos de interés
diferentes.
En otra realización particular, la proteína de
fusión de la invención comprende una región A unida a dos regiones
B, una de ellas unida a la región amino-terminal de
la proteína pVP2 de IBDV o de dicho fragmento 1-n
de la proteína pVP2 de IBDV presente en la región A y la otra a la
región carboxilo-terminal de la proteína pVP2 de
IBDV o de dicho fragmento 1-n de la proteína pVP2
de IBDV presente en la región A. Dichas regiones B pueden ser
iguales o diferentes y cada una de ellas puede contener uno o más
polipéptidos de interés, los cuales pueden ser iguales o diferentes
entre sí. En una realización concreta, la proteína de fusión de la
invención comprende una región A unida a una primera región B que
contiene un primer polipéptido de interés (B1) y una segunda región
B que contiene un segundo polipéptido de interés (B2). Dichos
polipéptidos de interés (B1) y (B2) pueden ser iguales o
diferentes. En una realización concreta, dichos polipéptidos de
interés (B1) y (B2) son distintos entre sí.
La región A de la proteína de fusión de la
invención puede estar unida directamente a dicha región B.
Alternativamente, dicha región A no está unida directamente a dicha
región B sino que está unida a través de un polipéptido espaciador
(linker) entre dichas regiones A y B. Por tanto, si se desea, la
proteína de fusión de la invención puede contener, además, un
polipéptido espaciador situado entre dichas regiones A y B.
Ventajosamente, dicho polipéptido espaciador es un péptido con
flexibilidad estructural, preferentemente, un polipéptido que dé
lugar a un dominio no estructurado capaz o no de inducir una
respuesta inmune. A modo ilustrativo, dicho péptido flexible puede
contener repeticiones de restos de aminoácidos, en particular de
restos de Gly y Ser o cualquier otra repetición de restos de
aminoácidos adecuada.
La proteína de fusión de la invención puede
obtenerse mediante la expresión génica de la secuencia de
nucleótidos que codifica para dicha proteína de fusión en células
hospedadoras apropiadas. Dichas células hospedadoras apropiadas son
células que contienen la secuencia de nucleótidos que codifica para
la proteína de fusión de la invención, por ejemplo, células que
contienen una secuencia de ácido nucleico que contiene la secuencia
de nucleótidos que codifica para la proteína de fusión de la
invención o que han sido transformadas por dicho ácido nucleico, o
células transformadas, transfectadas o infectadas con un vector
recombinante que comprende una secuencia de ácido nucleico que
codifica para la proteína de fusión de la invención. Las secuencias
de ácido nucleico, los cassettes de expresión, los vectores
recombinantes y las células hospedadoras apropiadas para la
obtención de la proteína de fusión de la invención se describirán
más adelante de forma detallada en combinación con el procedimiento
para la producción de QVLPs-pVP2* de IBDV.
La proteína de fusión de la invención expresada
en una célula hospedadora apropiada puede autoensamblarse y formar
partículas pseudovirales vacías quiméricas derivadas de IBDV
denominadas genéricamente QVLP-pVP2* (singular) o
QVLPs-pVP2* (plural) de IBDV en esta
descripción.
Por tanto, en otro aspecto, la invención se
relaciona con dichas QVLPs-pVP2* de IBDV.
Dichas QVLPs-pVP2* de IBDV están fomadas por
ensamblaje de la proteína de fusión de la invención, tienen
simetría T=1 y se caracterizan porque están constituidas únicamente
por ensamblaje de proteínas de fusión de la invención que comprenden
una región A constituida por la proteína pVP2 de IBDV o por un
fragmento 1-n de dicha proteína pVP2 de IBDV, en
donde "n" es un número entero comprendido entre 441 y 501,
unida a una región B constituida por un polipéptido heterólogo que
comprende un polipéptido de interés.
Las QVLPs-pVP2* de IBDV de la
invención pueden obtenerse mediante la expresión de la proteína de
fusión de la invención en células hospedadoras apropiadas bajo
condiciones que permiten la formación de dichas partículas
pseudovirales de IBDV.
Por tanto, en otro aspecto, la invención
proporciona un ácido nucleico cuya secuencia de nucleótidos
comprende la secuencia de nucleótidos que codifica para la proteína
de fusión de la invención.
En una realización particular, la secuencia de
ácido nucleico de la invención comprende (i) una secuencia de
nucléotidos que comprende la fase de lectura abierta o región
codificante correspondiente a la proteína pVP2 de IBDV o a un
fragmento 1-n de dicha proteína pVP2 de IBDV, en
donde "n" es un número entero comprendido entre 441 y 501, y
(ii) una secuencia de nucleótidos que comprende la fase de lectura
abierta o región codificante de uno o más polipéptidos heterólogos
que comprende uno o más polipéptidos de interés.
En otra realización particular, la secuencia del
ácido nucleico proporcionado por esta invención comprende (i) una
secuencia de nucléotidos que comprende la fase de lectura abierta o
región codificante correspondiente a la proteína pVP2 de IBDV o a un
fragmento 1-n de dicha proteína pVP2 de IBDV, en
donde "n" es un número entero comprendido entre 441 y 501,
(ii) una primera secuencia de nucleótidos que comprende la fase de
lectura abierta o región codificante de uno o más polipéptidos
heterólogos que comprende uno o más polipéptidos de interés, y
(ii') una segunda secuencia de nucleótidos que comprende la fase de
lectura abierta o región codificante de uno o más polipéptidos
heterólogos que comprende uno o más polipéptidos de interés, en
donde dicha segunda secuencia de nucleótidos puede ser igual o
diferente a dicha primera secuencia de nucleótidos. En este caso,
una de dichas primera o segunda secuencia de nucleótidos está
operativamente unida al extremo 5' de la secuencia de nucléotidos
que comprende la fase de lectura abierta o región codificante
correspondiente a dicha proteína pVP2 de IBDV o a dicho fragmento
1-n de dicha proteína pVP2 de IBDV y la otra está
operativamente unida al extremo 3' de la secuencia de nucléotidos
que comprende la fase de lectura abierta o región codificante
correspondiente a dicha proteína pVP2 de IBDV o a dicho fragmento
1-n de dicha proteína pVP2 de IBDV.
Tal como se utiliza en esta descripción, el
término "fase de lectura abierta correspondiente a la proteína
pVP2 de IBDV" o "fase de lectura abierta correspondiente a un
fragmento 1-n de la proteína pVP2 de IBDV"
incluye, además de las secuencias de nucleótidos de dichas fases de
lectura abierta, otras fases de lectura abiertas análogas a las
mismas codificantes de las proteínas pVP2 y fragmentos
1-n, donde "n" es un número entero comprendido
entre 441 y 501, de dicha proteína pVP2 de IBDV.
Asimismo, el término "fase de lectura abierta
de uno o más polipéptidos heterólogos que comprenden uno o más
polipéptidos de interés" incluye cualquier secuencia de
nucleótidos codificante de dicho(s) polipéptido(s)
heterólogo(s)
que comprende(n) uno o más polipéptidos de interés. El término "análoga", tal como aquí se utiliza, pretende incluir cualquier secuencia de nucleótidos que puede ser aislada o construida sobre la base de la secuencia de nucleótidos codificantes de la proteína pVP2 de IBDV o del fragmento 1-n, donde "n" es un número entero comprendido entre 441 y 501, de dicha proteína pVP2 de IBDV, por ejemplo, mediante la introducción de sustituciones de nucleótidos conservativas o no conservativas, incluyendo la inserción de uno o más nucleótidos, la adición de uno o más nucleótidos en cualquiera de los extremos de la molécula o la deleción de uno o más nucleótidos en cualquier extremo o en el interior de la secuencia. En general, una secuencia de nucleótidos análoga a otra secuencia de nucleótidos es sustancialmente homóloga a dicha secuencia de nucleótidos.
que comprende(n) uno o más polipéptidos de interés. El término "análoga", tal como aquí se utiliza, pretende incluir cualquier secuencia de nucleótidos que puede ser aislada o construida sobre la base de la secuencia de nucleótidos codificantes de la proteína pVP2 de IBDV o del fragmento 1-n, donde "n" es un número entero comprendido entre 441 y 501, de dicha proteína pVP2 de IBDV, por ejemplo, mediante la introducción de sustituciones de nucleótidos conservativas o no conservativas, incluyendo la inserción de uno o más nucleótidos, la adición de uno o más nucleótidos en cualquiera de los extremos de la molécula o la deleción de uno o más nucleótidos en cualquier extremo o en el interior de la secuencia. En general, una secuencia de nucleótidos análoga a otra secuencia de nucleótidos es sustancialmente homóloga a dicha secuencia de nucleótidos.
En el sentido utilizado en esta descripción, la
expresión "sustancialmente homóloga" significa que las
secuencias de nucleótidos en cuestión tienen un grado de identidad,
a nivel de nucleótidos, de, al menos, un 60%, preferentemente de, al
menos, un 80%, más preferentemente de, al menos, un 90% y, aún más
preferentemente de, al menos, un 95%.
En otro aspecto, la invención proporciona un
cassette de expresión que comprende una secuencia de ácido
nucleico proporcionado por esta invención, es decir, un ácido
nucleico cuya secuencia de nucleótidos comprende la secuencia de
nucleótidos que codifica para la proteína de fusión de la
invención, operativamente unida a unos elementos de control de
transcripción y, opcionalmente, de traducción.
En una realización particular, el cassette de
expresión proporcionado por esta invención comprende,
operativamente unida a unos elementos de control de transcripción
y, opcionalmente, de traducción, una secuencia de nucléotidos que
comprende (i) una secuencia de nucléotidos que comprende la fase de
lectura abierta o región codificante correspondiente a la proteína
pVP2 de IBDV o a un fragmento 1-n de dicha proteína
pVP2 de IBDV, en donde "n" es un número entero comprendido
entre 441 y 501, y (ii) una secuencia de nucleótidos que comprende
la fase de lectura abierta o región codificante de uno o más
polipéptidos heterólogos que comprende uno o más polipéptidos de
interés.
En otra realización particular, el cassette de
expresión proporcionado por esta invención comprende,
operativamente unida a unos elementos de control de transcripción
y, opcionalmente, de traducción, una secuencia de nucleótidos que
comprende (i) una secuencia de nucléotidos que comprende la fase de
lectura abierta o región codificante correspondiente a la proteína
pVP2 de IBDV o a un fragmento 1-n de dicha proteína
pVP2 de IBDV, en donde "n" es un número entero comprendido
entre 441 y 501, (ii) una primera secuencia de nucleótidos que
comprende la fase de lectura abierta o región codificante de uno o
más polipéptidos heterólogos que comprende uno o más polipéptidos
de interés, y (ii') una segunda secuencia de nucleótidos que
comprende la fase de lectura abierta o región codificante de uno o
más polipéptidos heterólogos que comprende uno o más polipéptidos de
interés, en donde dicha segunda secuencia de nucleótidos puede ser
igual o diferente a dicha primera secuencia de nucleótidos. En este
caso, una de dichas primera o segunda secuencia de nucleótidos está
operativamente unida al extremo 5' de la secuencia de nucléotidos
que comprende la fase de lectura abierta o región codificante
correspondiente a dicha proteína pVP2 de IBDV o a dicho fragmento
1-n de dicha proteína pVP2 de IBDV y la otra está
operativamente unida al extremo 3' de la secuencia de nucléotidos
que comprende la fase de lectura abierta o región codificante
correspondiente a dicha proteína pVP2 de IBDV o a dicho fragmento
1-n de dicha proteína pVP2 de IBDV.
Los elementos de control de transcripción y,
opcionalmente, de traducción, presentes en el cassette de expresión
proporcionado por esta invención incluyen promotores, que dirigen
la transcripción de las secuencias de nucleótidos (pVP2 de IBDV o
fragmento de la misma y polipéptido heterólogo) al que está
operativamente enlazado, y otras secuencias necesarias o apropiadas
para la transcripción y su regulación adecuada en tiempo y lugar,
por ejemplo, señales de inicio y terminación, sitios de corte, señal
de poliadenilación, origen de replicación, activadores
transcripcionales (enhancers), silenciadores transcripcionales
(silencers), etc. En general, dichos elementos, así como los
vectores utilizados para construir los cassettes de expresión y los
vectores recombinantes según la invención, se eligen en función de
las células hospedadoras que se pretenden utilizar.
En otro aspecto, la invención proporciona un
vector recombinante que comprende una secuencia de ácido
nucleico proporcionado por esta invención o un cassette de
expresión proporcionado por esta invención. Prácticamente cualquier
vector puede ser utilizado en la generación del vector recombinante
proporcionado por esta invención. A modo ilustrativo, dichos
sistemas o vectores de expresión apropiados pueden seleccionarse de
acuerdo con las condiciones y necesidades de cada caso concreto
entre plásmidos, bácmidos, cromosomas artificiales de levadura
(YACS), cromosomas artificiales de bacteria (BACs), cromosomas
artificiales basados en el bacteriófago P1 (PACs), cósmidos, o
virus, que pueden contener, además, un origen de replicación
heterólogo, por ejemplo, bacteriano o de levadura para que pueda ser
amplificado en bacterias o levaduras, así como un marcador
utilizable para seleccionar las células transfectadas diferente al
gen o genes de interés. Estos vectores recombinantes pueden ser
obtenidos por los técnicos en la materia mediante el empleo de
técnicas convencionales de ingeniería genética (Sambrook et
al. 1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd Ed. Cold
Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.) y forman
parte de la presente invención.
En una realización particular, dicho vector
recombinante es un plásmido, tal como un plásmido adecuado para
transformar levaduras, o un virus, tal como un baculovirus
recombinante (rBV) que expresa durante su ciclo de replicación la
proteína de fusión de la invención y que, tras su ensamblaje,
forman QVLPs-pVP2* de IBDV. En una realización
particular se han obtenido QVLPs en levaduras, en concreto,
QVLPs-pVP2* de IBDV que contienen el péptido
quimérico BT de FMDV en posición C-terminal con
respecto a la proteína pVP2-456. Para ello, se
generó el plásmido de expresión
pESCURA/pVP2-456-BT, el cual fue
utilizado para transformar cultivos de Saccharomyces
cerevisiae (Ejemplo 3). En otra realización particular se han
obtenido QVLPs mediante el empleo de un sistema de expresión basado
en rBV (Ejemplo 1).
En otro aspecto, la invención proporciona una
célula hospedadora que contiene una secuencia de ácido
nucleico proporcionada por esta invención, es decir, la secuencia
de nucleótidos que codifica para la proteína de fusión de la
invención. En una realización particular, dicha célula hospedadora
es una célula transformada por una secuencia de ácido nucleico
proporcionada por esta invención que contiene la secuencia de
nucleótidos que codifica para la proteína de fusión de la
invención. En otra realización particular, dicha célula hospedadora
es una célula transformada, transfectada o infectada con un vector
recombinante proporcionado por esta invención que comprende una
secuencia de ácido nucleico de la invención que contiene una
secuencia de nucleótidos que codifica para la proteína de fusión de
la invención.
Prácticamente cualquier célula hospedadora
susceptible de ser transformada por una secuencia de ácido nucleico
proporcionada por esta invención, o cualquier célula hospedadora
susceptible de ser transformada, transfectada o infectada por un
vector recombinante proporcionado por esta invención puede ser
utilizada, por ejemplo, células de mamífero, células aviares,
células de insecto, levaduras, etc.; no obstante, en una
realización particular, dicha célula huésped se selecciona entre
levaduras y células de insecto. Las levaduras son adecuadas por
razones de simplicidad y coste de producción. Las células de
insecto son adecuadas cuando el sistema de expresión comprende un
rBV. El empleo de rBV es ventajoso por cuestiones de bioseguridad
relacionadas con el rango de huésped de los baculovirus, incapaces
de replicar en otros tipos celulares que no sean de insecto.
En una realización particular, la invención
proporciona una célula hospedadora, tal como una levadura, por
ejemplo, una levadura del género Saccharomyces, tal como
S. cerevisae, S. pombe, etc., o del género
Pichia, tal como P. pastoris, etc., transformada con
un vector recombinante proporcionado por esta invención, tal como un
plásmido que comprende una secuencia de ácido nucleico de la
invención o un cassette de expresión proporcionado por esta
invención que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica
para la proteína de fusión de la invención.
En otra realización particular, la invención
proporciona una célula hospedadora, tal como una célula de insecto,
infectada con un vector recombinante proporcionado por esta
invención, tal como un rBV que comprende una secuencia de ácido
nucleico de la invención o un cassette de expresión proporcionado
por esta invención que comprende la secuencia de nucleótidos que
codifica para la proteína de fusión de la invención.
En otro aspecto, la invención proporciona un
procedimiento para la producción de QVLPs-pVP2*
de IBDV que comprende cultivar una célula hospedadora
proporcionada por esta invención que contiene la secuencia de
nucleótidos que codifica para la proteína de fusión de la invención
y que expresa dicha proteína, y, si se desea, recuperar dichas
QVLPs-pVP2* de IBDV. En una realización particular,
dicho procedimiento se realiza mediante el empleo de una célula
hospedadora proporcionada por esta invención consistente en una
célula transformada por una secuencia de ácido nucleico de la
invención que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica
para la proteína de fusión de la invención. En otra realización
particular, dicho procedimiento se lleva a cabo utilizando una
célula hospedadora proporcionada por esta invención consistente en
una célula transformada, transfectada o infectada con un vector
recombinante proporcionado por esta invención que comprende una
secuencia de ácido nucleico de la invención que contiene una
secuencia de nucleótidos que codifica para la proteína de fusión de
la invención.
Tras la expresión de la proteína de fusión de la
invención en dichas células, las proteínas expresadas se ensamblan
y forman las QVLPs-pVP2* de IBDV, las cuales pueden
ser aisladas o retiradas del medio, y, si se desea, purificadas. El
aislamiento y purificación de dichas QVLPs-pVP2* de
IBDV puede realizarse por métodos convencionales, por ejemplo,
mediante fraccionamiento en gradientes de sacarosa.
En una realización particular, la expresión
génica de la proteína de fusión de la invención se realiza mediante
el empleo de un rBV que permite la expresión de la proteína de
fusión de la invención a partir de la secuencia de ácido nucleico
proporcionado por esta invención en células de insecto. Por tanto,
en una realización particular, la invención proporciona un
procedimiento para la producción de QVLPs-pVP2* de
IBDV que comprende (i) cultivar células de insecto infectadas con
un rBV que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica para
la proteína de fusión de la invención, bajo condiciones que
permiten la expresión de las proteínas recombinantes y su ensamblaje
para formar QVLPs-pVP2* de IBDV, y (ii) si se
desea, aislar y, opcionalmente, purificar, dichas
QVLPs-pVP2* de IBDV. Dicho procedimiento comprende,
por tanto, en primer lugar, la obtención de un vector recombinante
constituido por un rBV que comprende una secuencia de ácido
nucleico de la invención o un cassette de expresión proporcionado
por esta invención que comprende la secuencia de nucleótidos que
codifica para la proteína de fusión de la invención, seguido de la
infección de células de insecto con dicho rBV, expresión de las
proteínas recombinantes y, si se desea, aislamiento de las
QVLPs-PVP2* de IBDV formadas por ensamblaje de la
proteína de fusión de la invención, y, opcionalmente, purificación
posterior de dichas QVLPs-pVP2* de IBDV.
La construcción de un baculovirus recombinante
que permite la expresión de la proteína de fusión de la invención
puede ser realizada por un experto en la materia en base a lo aquí
descrito y al estado de la técnica sobre esta tecnología (Sambrook
et al. 1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd Ed.
Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.;
Leusch MS et al. 1995. A novel host-vector
system for direct selection of recombinant baculoviruses (bacmids)
in Escherichia coli. Gene 160:91-4; Luckow
VA et al. 1993. Efficient generation of infectious
recombinant baculoviruses by site-specific
transposon-mediated insertion of foreign genes into
a baculovirus genome propagated in Escherichia coli. J Virol
67:4566-79).
En otra realización particular, la expresión
génica de la proteínas de fusión de la invención se realiza
mediante el empleo de un vector recombinante que permite la
expresión de la proteína de fusión de la invención en células de
levadura. Por tanto, en una realización particular, la invención
proporciona un procedimiento para la producción de
QVLPs-pVP2* de IBDV que comprende (i) cultivar
levaduras transformadas con un vector recombinante que comprende la
secuencia de nucleótidos que codifica para la proteína de fusión de
la invención, bajo condiciones que permiten la expresión de las
proteínas recombinantes y su ensamblaje para formar
QVLPs-pVP2* de IBDV, y (ii) si se desea, aislar y,
opcionalmente, purificar, dichas QVLPs-pVP2* de
IBDV. Dicho procedimiento comprende, por tanto, en primer lugar, la
obtención de un vector recombinante constituido por un plásmido que
comprende una secuencia de ácido nucleico de la invención o un
cassette de expresión proporcionado por esta invención que
comprende la secuencia de nucleótidos que codifica para la proteína
de fusión de la invención, seguido de transformación de levaduras
con dicho vector recombinante, expresión de las proteínas
recombinantes y, si se desea, aislamiento de las
QVLPs-pVP2* de IBDV formadas por ensamblaje de la
proteína de fusión de la invención, y, opcionalmente, purificación
posterior de dichas QVLPs-pVP2* de IBDV. En una
realización concreta, el sistema de expresión adecuado para
transformar levaduras está basado en un sistema de expresión pESC
Yeast (Stratagene). La obtención de levaduras transformadas con un
vector recombinante apropiado que permite la expresión de la
proteína de fusión de la invención, puede ser realizada por un
experto en la materia en base a lo aquí descrito y al estado de la
técnica sobre esta tecnología (pESC epitope tagging vectors
Instructions manual. Stratagene www.stratagene.com; Sambrook
et al. 1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd Ed.
Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.). En
general, las QVLPs-pVP2* de IBDV obtenidas en
levaduras son cápsidas T=1; a modo ilustrativo, cuando se produjeron
en levaduras QVLPs-pVP2* de IBDV en las que la
región A está constituida por la proteína pVP2-441,
la proteína pVP2-456 o la proteína
pVP2-466, las QVLPs-pVP2* de IBDV
así obtenidas únicamente eran cápsidas T=1.
En otro aspecto, la invención se relaciona con
el empleo del vector recombinante proporcionado por esta
invención para la producción y obtención de la proteína de fusión
de la invención y/o de las QVLPs-pVP2* de IBDV de la
invención.
Las QVLPs-pVP2* de IBDV pueden
ser utilizadas como vectores o vehiculizadores de productos de
interés, tales como moléculas con actividad biológica, por ejemplo,
fármacos, polipéptidos, proteínas, anticuerpos, hormonas, enzimas
con potencial terapéutico para tratar enfermedades, ácidos
nucleicos, etc., por lo que pueden ser utilizadas con fines
terapéuticos, de diagnóstico o de investigación. En una realización
particular, dichas moléculas de interés biológico incluyen
polipéptidos de interés, tales como antígenos o inductores de
respuestas inmunes en animales o humanos a los que se suministre,
por lo que pueden ser utilizadas en la elaboración de vacunas frente
a enfermedades humanas y animales causadas por virus, bacterias,
parásitos o cualquier otro tipo de microorganismos o frente
enfermedades tumorales, o bien incluyen secuencias de ácido
nucleico, útiles en terapia génica, destinadas a ser introducidas en
el interior de las células apropiadas, por lo que pueden ser
utilizadas en la elaboración de vectores para terapia génica, o
bien incluyen compuestos de interés sanitario (anticuerpos,
hormonas, enzimas con potencial terapéutico para tratar
enfermedades, etc.) para su administración al cuerpo humano o
animal, por lo que pueden ser utilizadas como sistemas de suministro
de sustancias activas (delivery systems).
Por tanto, en otro aspecto, la invención se
relaciona con el empleo de las QVLPs-pVP2* de
IBDV en la elaboración de una composición farmacéutica, por
ejemplo, vacunas, vectores para terapia génica, sistemas de
suministro de sustancias activas, etc. En una realización
particular, dicha composición farmacéutica es una vacuna destinada a
conferir protección frente a enfermedades humanas o animales
causadas por virus, bacterias, parásitos o cualquier otro tipo de
microorganismos, o frente a enfermedades tumorales. En otra
realización particular, dicha composición farmacéutica es un vector
para terapia génica. En otra realización particular, dicha
composición farmacéutica es un sistema de suministro de sustancias
activas; ejemplos ilustrativos, no limitativos, de dichas
sustancias activas incluyen fármacos, anticuerpos, hormonas, enzimas
potencialmente implicados en el tratamiento de enfermedades,
etc.
En otro aspecto, la invención proporciona una
vacuna que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de
QVLPs-pVP2* de IBDV, junto con, opcionalmente, uno o
más adyuvantes y/o vehículos farmacéuticamente aceptables. Dicha
vacuna es útil para proteger animales y humanos frente a
enfermedades causadas por microorganismos (virus, bacterias,
parásitos, etc.), o frente a enfermedades tumorales. En una
realización particular, dicha vacuna resulta especialmente útil
para proteger animales y humanos simultáneamente frente a la
infección causada por dos o más agentes infecciosos causantes de
enfermedades. A modo ilustrativo, la vacuna proporcionada por esta
invención puede ser utilizada para proteger aves, por ejemplo,
pollos, pavos, ocas, gansos, faisanes, codornices, avestruces,
etc., frente a IBDV y frente a uno o más agentes infecciosos
responsables de enfermedades aviares (patógenos aviares).
En el sentido utilizado en esta descripción, la
expresión "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a la
cantidad de QVLPs-pVP2* de IBDV calculada para
producir el efecto deseado y, en general, vendrá determinada, entre
otras causas, por las características propias de las
QVLPs-pVP2* de IBDV y el efecto de inmunización a
conseguir.
Los adyuvantes y vehículos farmacéuticamente
aceptables que pueden ser utilizados en dichas vacunas son los
adyuvantes y vehículos conocidos por los técnicos en la materia y
utilizados habitualmente en la elaboración de vacunas.
En una realización particular, dicha vacuna se
prepara en forma de una solución o suspensión acuosa, en un
diluyente farmacéuticamente aceptable, tal como solución salina,
solución salina tamponada con fosfato (PBS), o cualquier otro
diluyente farmacéuticamente aceptable.
La vacuna proporcionada por esta invención puede
ser administrada por cualquier vía de administración apropiada que
dé como resultado una respuesta inmune protectora frente a la
secuencia heteróloga o epítopo utilizado, para lo cual dicha vacuna
se formulará en la forma farmacéutica adecuada a la vía de
administración elegida. En una realización particular, la
administración de la vacuna proporcionada por esta invención se
efectúa por vía parenteral, por ejemplo, por vía intraperitoneal,
subcutánea, etc.
En otro aspecto, la invención se relaciona con
un sistema de suministro de sustancias activas que comprende, al
menos, una QVLP-pVP2* de IBDV y una sustancia
activa. Ejemplos ilustrativos, no limitativos de sustancias activas
incluyen fármacos, anticuerpos, hormonas, enzimas con potencial
terapéutico para el tratamiento de enfermedades, etc.
Los siguientes ejemplos ilustran la invención y
no deben ser considerados en sentido limitativo de la misma.
\vskip1.000000\baselineskip
IBDV cepa Soroa, una cepa de IBDV de serotipo I
se purificó por un protocolo estándar a partir de células de
músculo de codorniz QM7 (Lombardo et al. 1999. VP 1, the
putative RNA-dependent RNA polymerase of infectious
bursal disease virus, forms complexes with the capsid protein VP3,
leading to efficient encapsidation into virus-like
particles. J Virol 73, 6973-6983) y se
almacenó en tampón PES
(piperacina-N-N'-bis
(2-ácido etanosulfónica) [PIPES] 25 mM pH=6,2, NaCl 150 mM y
CaCl_{2} 20 mM).
El baculovirus recombinante (rBV)
FB/VP2-456 ya ha sido descrito previamente (Castón
et al., 2001. C terminus of infectious bursal disease virus
major capsid protein VP2 is involved in definition of the T number
for capsid assembly. J Virol 75,
10815-10828).
El plásmido pVOTE.2/POLY (Oña et al.,
2004. The C-terminal domain of the pVP2 precursor
is essential for the interaction between VP2 and VP3, the capsid
polypeptides of infectious bursal disease virus. Virology
322, 135-142.) se ha usado como DNA molde para la
síntesis por PCR de los fragmentos de DNA de los derivados de pVP2
para generar los rBV identificados como FB/VP2-441,
FB/VP2-466, FB/VP2-476,
FB/VP2-487, FB/VP2-494,
FB/VP2-501 y FB/VP2-512. La PCR se
llevó a cabo con la DNA polimerasa Vent (Biolabs) usando un cebador
común para el extremo 5' (5'-pVP2) y un cebador
específico para el extremo 3' de cada mutante (Tabla 1).
Los fragmentos de la digestión de la PCR con
BglII-HindIII se donaron en los sitios de donación
múltiple (polylinker) BamHI-HindIII de los plásmidos
FastBac y pHisFastBac-C (Invitrogen) de expresión
de proteínas. El plásmido pHisFastBac-C se usó para
expresar las variantes His-pVP2. La secuencia extra
tag que se empleó es MSYYHHHHHHDYDIPTTENLYFQGAMGS (SEQ ID No. 10).
Las secuencias de los plásmidos resultantes se comprobaron mediante
el método de secuenciación de Sanger (Sanger et al., 1977.
DNA sequencing with chain-terminating inhibitors.
Proc Natl Acad Sci USA 74, 5463-5467).
La selección de los bácmidos derivados de la
cepa DH10Bac de E. coli y la preparación de la misma para su
transfección con lipofectamina se llevó a cabo según los protocolos
de los fabricantes (Invitrogen).
Las construcciones se expresaron en células de
insecto H5 (Maraver et al., 2003. Identification and
molecular characterization of the RNA
polymerase-binding motif of infectious bursal
disease virus inner capsid protein VP3. J Virol 77,
2459-2468) (Figura 1).
Se infectaron células 1-15
(2-5 x 10^{8} células) con el rBV apropiado a una
multiplicidad de infección (m.d.i.) de 1-5 unidades
formadoras de placa (UFP)/célula. Las células se recogieron a las
48 horas post-infección (h.p.i.) y se lisaron en
tampón de lisis PES conteniendo un 1% de IGEPAL
CA-630 (Sigma) en hielo. El material particulado se
purificó a través de un colchón de sacarosa al 20% y un gradiente
lineal de sacarosa de un 25-50%. El material
particulado que contenía la proteína mutada de deleción pVP2 se
concentró 20 veces por ultracentrifugación y se identificó mediante
SDS-PAGE y Western blotting. Las fracciones ricas en
VP2 se seleccionaron para estudios estructurales y se usaron dentro
de los 1-2 días posteriores a la purificación.
Los extractos celulares de las células
infectadas (10-15 \mul) o las fracciones del
gradiente de concentración de sacarosa (2-5 \mul)
se añadieron al tampón de Laemmli hasta alcanzar una concentración
final de 1x, se calentó (100°C, 2 minutos). La electroforesis se
llevó a cabo en geles de poliacrilamida al 11% (38,96% (w/v)
acrilamida y 1,04 (w/v) bis-acrilamida metileno). El
Western blotting se llevó a cabo con un suero
anti-VP2 (Lombardo et al., 1999. VP1, the
putative RNA-dependent RNA polymerase of infectious
bursal disease virus, forms complexes with the capsid protein VP3,
leading to efficient encapsidation into virus-like
particles. J Virol 73, 6973-6983). Como
control negativo interno se usó suero anti-VP3 de
conejo. El anticuerpo anti-His tag se obtuvo de
Sigma.
Se dispusieron muestras de 2-5
\mul de cada fracción del gradiente de sacarosa y se tiñeron
negativamente con 2% (w/v) de acetato de uranilo acuoso. Las
micrografías se registraron con un microscopio electrónico JEOL
1200 EXII que operaba a 100 kV a una ampliación nominal de
x40.000.
Se dispusieron las muestras (gotas de 5 \mul),
o las fracciones que contenían los viriones o las cápsidas
HT-VP2-466 sobre rejillas
recubiertas de carbón, se lavaron dos veces con gotas de agua, se
secaron por absorción (blot) y el conjunto se sumergió en un baño
de etano líquido siguiendo los procedimientos establecidos,
esencialmente tal como describen Castón et al. (Castón et
al. 2001. C terminus of infectious bursal disease virus major
capsid protein VP2 is involved in definition of the T number for
capsid assembly. J Virol 75, 10815-10828).
Las micrografías se registraron bajo unas condiciones de exposición
mínimas de modo que los especímenes captados recibieron
exposiciones de 6-10 e^{-}/nm^{2}, a
ampliaciones nominales de x50.000 en un microscopio electrónico
Tecnai G2 que operó a 200 kV y estaba equipado con un dispositivo de
emisión de campo. Se vitrificó el bacteriófago T4 y el espaciado
axial de 40,5 \ring{A} de su vaina de cola se usó como patrón
interno de magnificación.
\vskip1.000000\baselineskip
El péptido FGFKDIIRAIRRI (Seq. ID. No. 11) se
sintetizó químicamente, y su espectro de DC en UV lejano se
almacenó in un dicrógrafo Jasco, usando células de tamaño 0,1 a 1
mm a 25°C. Cada espectro es la acumulación de 3 escáneres. Las
concentraciones de péptidos usadas son de 10 a 200 \muM. El
espectro de DC se analizó según se ha descrito previamente por
Jiménez, 1999 (Jiménez et al., 1999. Helicity of alpha
(404-451) and beta (394-445) tubulin
C-terminal recombinant peptides. Protein Sci 8,
788-799) (Figura 4A).
\vskip1.000000\baselineskip
Las operaciones de procesado de imagen generales
se llevaron a cabo utilizando un sistema de software PIC (Trus
et al. 1996. Digital image processing of electron
micrographs: the PIC system-III. J Struct Biol
116, 61-67). Las micrografías se valoraron en
cuanto a su resolución y astigmatismo por un análisis de Fourier. El
valor de sub-foco de las micrografías electrónicas
seleccionadas permitió las reconstrucciones de las estructuras a
una resolución dentro del primer cero de la función de transferencia
de contraste (CTF) del microscopio electrónico. Para las
micrografías seleccionadas analizadas (81 de las IBDV, 82 para las
cápsidas HT-VP2-466), los valores de
sub-foco, determinados con el paquete Bsoft
(Heymann, 2001), oscilaron de 0,6 a 3,7 \muM (CTF a espacios de
12-30 \ring{A}, respectivamente). Las micrografías
se adquirieron con un escáner Zeiss PhotoScan TD a 7 \mum/pixel y
binned para producir 21 \mum pixels (4,2 \ring{A} en la
muestra. Las partículas proteicas se extrajeron y se
pre-procesaron usando el procedimiento automatizado
de Conway et al. (Conway et al., 1993. The effects of
radiation damage on the structure of frozen hydrated
HSV-1 capsids. J Struct Biol 111,
222-233). Las primeras estimaciones de las
orientaciones angulares de las partículas se determinaron por los
procedimientos de "líneas comunes" en las transformadas de
Fourier (PTF) (Baker and Cheng, 1996. A model-based
approach for determining orientations of biological macromolecules
imaged by cryoelectron microscopy. J Struct Biol 116,
120-130), tomando como modelo de partida el 3DR del
IBDV, a escala aproximada, a 28 \ring{A} de resolución. Se calculó
un nuevo mapa de densidad y éste se usó para todos los
refinamientos de orientación y de origen de fase subsiguientes,
usando una versión modificada del algoritmo PTF de forma que se
pueden usar ambas, información de fase y amplitud.
Para la reconstrucción de la cápsida pequeña de
VP2 se utilizaron sólo procedimientos basados en modelo, y como
modelo de partida se usó otra cápsida pequeña de VP2 extraída de la
cápsida grande de VP2. Como control interno, se calculó su
estructura tridimensional sin imponer la simetría icosaédrica usando
un método de retroproyección ponderada y distribuyendo las
orientaciones a lo largo de todo el espacio de orientación
seleccionando al azar vistas equivalentes que se relacionaron con
los originales por simetría. El mapa de densidad resultante fue
similar al obtenido con el método basado en la simetría icosaédrica
pero a una resolución más baja (datos no mostrados). Las fases de
corrigieron para la función de transferencia de contraste (CTF)
mediante simple transposición de las fases de los lóbulos requeridos
de la CTF. Las reconstrucciones se calcularon utilizando las
técnicas de Fourier-Bessel (Crowther, 1971.
Procedures for three-dimensional reconstruction of
spherical viruses by Fourier synthesis from electron micrographs.
Phil Trans R Soc Ser B 261, 221-230). Las
reconstrucciones finales combinaban 10.849 y 1.557 imágenes para
IBDV y cápsidas HT-VP2-466, y las
resoluciones obtenidas mediante el criterio de correlación de
Fourier de la envuelta (0,5 de umbral) de 12 y 15 \ring{A},
respectivamente. Otra reconstrucción para cápsidas más pequeñas de
HT-VP2-466 se calculó a partir del
mismo set de micrografias. La resolución de la reconstrucción final,
que contenía 108 partículas, se estimó en 23 \ring{A}
aproximadamente, según la estimación obtenida por el análisis FSC
(Convay et al., 1993. The effects of radiation damage on the
structure of frozen hydrated HSV-1 capsids. J
Struct Biol 111, 222-233).
Los perfiles de densidad radial cuantificadas
esféricamente se calcularon para ambos mapas de T=13, y fueron
normalizados y llevados a escala para solapar ambos perfiles. Los
mapas se obtuvieron entonces por la diferencia de ambos y cambiando
el orden de los dos mapas. Para traducir los resultados de ambos
mapas (ver Figuras 8E y 8F), se filtraron pequeñas islas de
densidades, solamente considerando las mayores diferencias en
radios correspondientes a la envuelta proteica.
Dado que el procesamiento del extremo
C-terminal la proteína pVP2 (512 aminoácidos) que
da lugar a la proteína VP2 (441 aminoácidos) no se produce al
expresarse en baculovirus recombinantes, se han expresado diferentes
construcciones de pVP2 en dicho sistema que varían en la longitud
del extremo C-terminal. Para cubrir uniformemente
dicha región, se han seleccionado las posiciones 456, 466, 476, 487,
494 y 501 (Figura 3A). El análisis por Western blot de estas
variantes de pVP2/VP2 muestra que todos los mutantes de pVP2 con las
deleciones del C-terminal se expresan
correctamente, dando lugar a una banda mayoritaria (Figura 1). Se
han generado también las mismas series de mutantes de pVP2/VP2,
fusionados en su extremo N-terminal a un
His-tag (HT-VP2). Los pesos
moleculares de dichas variantes de PVP2/VP2 se presentan en la
Tabla 2.
Las variantes pVP2/VP2 se expresaron a niveles
elevados y se purificaron mediante un colchón de sacarosa seguido
de un gradiente de sacarosa. Las fracciones obtenidas del gradiente
se caracterizaron por electroforesis SDS-PAGE. Los
geles teñidos con azul de Coomassie mostraron que las fracciones
que contenían las variantes de pVP2 presentaban un rango de bandas
muy amplio (Figuras 3B, 3C). Con el objetivo de comparar dichos
resultados, se purificaron las proteínas de fusión obtenidas a
partir de células infectadas con IBDV siguiendo la estrategia
descrita anteriormente (Figura 3D). Mientras que los mutantes de
pVP2 que no contenían el His-tag mostraron una
organización heterogénea (Figura 3B), las proteínas de fusión de
pVP2/VP2 que conteían el His-tag se organizan de
forma que incrementan su tamaño a medida que aumenta la longitud
del dominio C-terminal (Fig 3C).
Los análisis de las diferentes fracciones
proteicas obtenidas a partir del gradiente de sacarosa, que se
tiñen negativamente por microscopía electrónica, mostraron una
morfología distinta dependiendo de la longitud del extremo
C-terminal de la pVP2 y de la presencia o ausencia
del His-tag.
VP2-441 (Figura 4A) y
VP2-456 (Figura 4B) dieron lugar a unas estructuras
de ensamblaje a modo de donut, de aproximadamente 23 nm de
diámetro, que corresponde al de cápsidas dodecaédricas con una
simetría T=1. Dependiendo del tipo de ensamblaje
VP2-466 que se forme, así se sitúa la variante a
través del gradiente de sacarosa. Las fracciones inferiores
contenían tubos delgados con un diámetro de aproximadamente 25 nm
(Figura 4C), ordenados de forma regular con una morfología
helicoidal (Figura 4C, recuadro). Las fracciones del medio
mostraron unos tubos delgados más cortos con cápsidas de simetría
similar a T=1 rodeadas de material irrumpiendo las mismas,
indicando que probablemente esta simetría es muy inestable (Figura
4D). Ocasionalmente también se observaron simetrías similares a
T=13 (Figura 4D, recuadro). Las estructuras predominantes en la
parte superior del gradiente eran pequeñas partículas isométricas
(Figura 4E). VP2-476 se comporta de forma similar a
VP2-466. La mayoría de las VP2-501
migraban hacia fracciones en la mitad-fondo del
gradiente y se ensamblan en tubos de aproximadamente 35 nm de
diámetro parcialmente ordenados (Figura 4F). En la parte
mitad-superior del gradiente,
VP2-501 se ensambla en una estructura de túbulos
girados y algunas partículas de forma isométrica con un tamaño
irregular. Finalmente, VP2-512 se vio como túbulos
cortos curvados y como partículas irregulares.
En las células infectadas por IBDV, la mayoría
de las estructuras purificadas se localizaban en la mitad del
gradiente y se corresponden con una partícula icosaédrica de un
diámetro de 65-70 nm (Figura 4H). Sin embargo, cerca
del fondo del gradiente, se encontraron estructuras de forma
tubular con una organización hexagonal, llamados tubos de tipo I
(Figura 4G).
Todos estos resultados en conjunto muestran que
VP2-466 contiene información suficiente para la
formación de cápsidas tipo hexámero (tubo delgado) y pentámero
(cápsida T=1), de forma esporádica se encontraron cápsidas con
ensamblaje de T=13.
\vskip1.000000\baselineskip
De forma similar, se analizaron los ensamblajes
de las proteínas de fusión HT-pVP2/VP2. En las
fracciones de enriquecimiento de
HT-VP2-441, se observó la aparición
de partículas de 23 nm de diámetro (Figura 5A). El mutante
HT-VP2-456 produjo ensamblaje de
estructuras de morfología similar a verdaderas cápsidas infecciosas
T=13 (comparar Figuras 5B y 4H), que migraban a la mitad del
gradiente. La mayoría de las
HT-VP2-456, cápsidas T=1, se
localizaron en la parte superior del gradiente. La tendencia a
formar cápsidas correctas se mejoró con la proteína
HT-VP2-466 (Figura 5C). Partículas
con cápsidas similares a T=13 se presentaban con mayor abundancia,
y, a medida que se obtenían con alta eficiencia, se fueron
seleccionando para estudios estructurales de alta resolución. Las
cápsidas con un tamaño medio de aproximadamente 53 nm se pudieron
distinguir fácilmente de las cápsidas T=13 (Figura 5C,
flechas).
Las proteínas de fusión
HT-VP2-476 (Figuras
5D-F) y HT-VP2-487
mantuvieron la capacidad de ensamblar como cápsidas con estructura
similar a los virus, aunque con una menor eficiencia. Las
estructuras predominantes eran los tubos hexagonales de longitudes
variables (Figura 5D). Finalmente, las proteínas
HT-VP2-494,
HT-VP2-501 y
HT-VP2-512, formaron solamente
estructuras tubulares con un ordenamiento aparentemente
hexagonal.
El extremo N-terminal
His-tag de las diferentes proteínas pVP2/VP2 no
afectó al ensamblaje de las subunidades en partículas regulares. En
ausencia de la proteína VP3, el otro componente mayoritario de las
cápsidas, HT-VP2-456 permitió el
ensamblaje correcto de estructuras con simetría similar a cápsidas
T=13.
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La estructura secundaria del péptido GFKDIIRAIR
(Seq. ID. No 16), que corresponde a los aminoácidos
443-452 del extremo C-terminal de la
proteína pVP2, se predijo mediante el programa informático Agadir
(Muñoz y Serrano, 1994. Elucidating the folding problem of helical
peptides using empirical parameters. Nat Struct Biol 1,
399-409). Dicho programa detectó una marcada
tendencia helicoidal en el péptido, que daba lugar a una
\alpha-hélice anfipática (Figura 10B, izquierda).
Para contrastar esta predicción, se sintetizó un péptido sintético,
aminoácidos 442-454, y se analizó la media de la
estructura secundaria por dicroísmo circular. En un tampón acuoso,
el péptido presentaba una estructura helicoidal insignificante, de
forma que adoptaba una conformación de enrollamiento aleatoria.
Cuando se añade trifluoroetanol (TFE) que es un solvente inductor
de hélices resultaba en la formación de un componente claramente
helicoidal (Figura 2). Para comprobar si se pueden encontrar
péptidos similares en estructuras conocidas, se realizó una
búsqueda en la base de datos PDB (Protein Data Base) con WHATIF
(http://www.cmbi.kun.nl/gv/wahtif) y se encontró dicho
péptido en los aminoácidos 241-250 de la isomerasa
triosa-fosfato de Leishmania mexicana
(Lm TIM) (Williams et al., 1999. Structural and
mutagenesis studies of leishmania triosephosphate isomerase: a
point mutation can convert a mesophilic enzyme into a superstable
enzyme without losing catalytic power. Protein Eng 12,
243-250). Cuando se compara dicha secuencia,
EFRDIIDATR (Seq. ID. No 17), con los diez aminoácidos de pVP2, se
observa que el carácter anfipático es casi idéntico: hay un cambio
conservacional (R por K), una sustitución de D por R, que cambia la
polaridad manteniendo un lado de la cadena cargado, y un cambio de
T por I.
\vskip1.000000\baselineskip
Una criomicrografia de las partículas de IBDV
muestra claras zonas dentadas periféricas (Figura 6A). El mapa de
densidad final de la cápsida T=13 se calculó con una resolución de
12 \ring{A}. La arquitectura molecular de la cápsida es
esencialmente como la descrita por Böttcher et al. (Böttcher
et al., 1997. Three-dimensional structure of
infectious bursal disease virus determined by electron
cryomicroscopy. J Virol 71, 325-330) en la
que la característica principal es la presencia de 260 trímeros de
VP2 que sobresalen de una envoltura continua y que están
organizados en cinco tipos de conformaciones diferentes (Figura 6B
a-e). En la cara interna hay 200 protuberancias
triméricas internas con forma de Y. La mejora en la resolución
permitió identificar un número de detalles estructurales de forma
más fina y precisa, particularmente, en los cinco ejes de la
cápsida interna. De esta manera, los 60 trímeros internos ausentes,
cinco por pentámero, se reemplazan por dos bordes anulares.
Mientras que el borde más exterior está formado por diez densidades
globulares íntimamente conectadas, el borde interno está formado
por cinco glóbulos, tal como se había predicho (Figura 9). Otro
aspecto relevante concierne al la apariencia porosa de la envoltura
capsular. Estos poros (616 en total) tienen un diámetro de
aproximadamente 15 \ring{A}, y se sitúan exactamente bajo
conexiones de densidad, llamados brazos conectores, entre trímeros
adyacentes en la cara externa.
El análisis por criomicroscopía electrónica de
las fracciones ricas en partículas pseudovirales muestra que las
cápsidas de VP2-466 están formadas por una mezcla
compleja de diferentes cápsidas, pero de ensamblaje similar (Figura
7A). Estas cápsidas tienen un tamaño aproximado que varía de 65 nm
(similares a las cápsidas de IBDV T=13) a 53 nm, con una variación
también de ensamblajes isométricos menores. Todas estas estructuras
mostraron las mismas zonas dentadas periféricas. La 3DR de las
cápsidas HT-VP2-466 se determinó con
una resolución de 15 \ring{A} (Figura 7B, izquierda y centro).
Las caras externas de las cápsidas de IBDV y de
HT-VP2-466 son casi superponibles,
mientras que las caras internas mostraron diferencias aparentes. La
mayor diferencia estructural está relacionada con los ejes de
simetría de orden cinco y seis, donde se observa una densidad extra
que conecta la estructura del trímero con forma de Y en la cápsida
HT-VP2-466, y no en la de IBDV.
El mapa de densidad de las cápsidas de tamaño
intermedio HT-VP2-466 mostraban una
simetría T=7 (Figura 7B, derecha), la cual se basó en una
equivalencia con los capsómeros triméricos como los de las T=13,
excepto por el requerimiento de sólo tres clases diferentes de
capsómeros triangulares (llamados a', b' y c'). Las cápsidas T=13 y
T=7 comparten el mismo bloque trimérico fundamental del
HT-VP2-466 en el entramado
icosaédrico.
Tanto en los perfiles de densidad radial (Figura
8A) como en las secciones transversales centrales (Figuras 8C y 8D)
de las cápsidas de IBDV y de
HT-VP2-466 se encontraron
similitudes estructurales, las cuales son prácticamente
superponibles. Se han encontrado dos diferencias menores en la
cubierta proteica (radio aproximado 253 \ring{A} - 350 \ring{A})
(Figura 8A, flechas). Se ha observado un pico de densidad extra en
la cara interior de la cápsida de IBDV, situada principalmente en
un radio de 325 \ring{A} - 345 \ring{A}, y otra en la cápsida
del HT-VP2-466 en su cara interior
(en un radio de 268 \ring{A} -
285 \ring{A}). Para localizar de forma más precisa dichas diferencias, se han calculado mapas de diferencias mediante sustracción arimética de los valores de densidad de la cubierta proteica en ambas estructuras. Alternando el orden de sustracción en los dos mapas, los mapas resultantes mostraron sólo aquellas diferencias estructurales que podían atribuirse a cada estructura (Figuras 8E y 8F). La localización de las diferencias estructurales en la cara externa de la cápsida de IBDV muestra que las regiones con mayores diferencias se encuentran en los brazos conectores entre los trímeros VP2 adyacentes. Las diferencias estructurales a lo largo de la cara interna se encuentran principalmente en los ejes
de simetría de orden cinco y seis, donde precisamente se localizan las densidades internas de la cápsida HT-VP2-466.
285 \ring{A}). Para localizar de forma más precisa dichas diferencias, se han calculado mapas de diferencias mediante sustracción arimética de los valores de densidad de la cubierta proteica en ambas estructuras. Alternando el orden de sustracción en los dos mapas, los mapas resultantes mostraron sólo aquellas diferencias estructurales que podían atribuirse a cada estructura (Figuras 8E y 8F). La localización de las diferencias estructurales en la cara externa de la cápsida de IBDV muestra que las regiones con mayores diferencias se encuentran en los brazos conectores entre los trímeros VP2 adyacentes. Las diferencias estructurales a lo largo de la cara interna se encuentran principalmente en los ejes
de simetría de orden cinco y seis, donde precisamente se localizan las densidades internas de la cápsida HT-VP2-466.
La tinción de los geles de
SDS-PAGE con azul de Coomassie mostró que las
fracciones enriquecidas de partículas virales contienen como
componentes mayoritarios pVP2/VP2 y VP3 (Figura 8B), comprendiendo
casi un 90% de la proteína total. Un análisis equivalente de las
fracciones usadas para obtener los datos de criomicroscopía
electrónica de las cápsidas
HT-VP2-466 mostró que dichas
cápsidas están constituidas por un único polipéptido de
aproximadamente 54 kDa. Como las diferencias mínimas a nivel de la
cubierta proteica no se pueden tener en cuenta para ver las
diferencias con la VP3, los resultados obtenidos implican que ambas
cápsidas son construidas a partir de una única proteína, VP2, o su
variante His-tag, para las cápsidas de IBDV e
HT-VP2-466, respectivamente, así
como que la VP3 no se incorpora como un componente integral de la
cápsida de IBDV.
Se debe considerar un nuevo escenario para la
cápsida de IBDV, ya que ésta debe considerarse como una cápsida
cuasi-equivalente. Para confirmar esta hipótesis y
valorar convenientemente las características equivalentes de las
cápsidas de IBDV y de HT-VP2-466,
se compararon mapas de alineamiento de secciones icosaédricas de
dichas cápsidas (Figura 9). Las secciones más exteriores (de 328 a
311 \ring{A}) mostraron que las unidades triméricas eran
básicamente idénticas (Figuras 9A, 9B y 9C). Además, en (302 a 294
\ring{A}), es evidente la cápsida continua y se aprecian
diferencias mínimas (Figuras 9D y 9E). En un radio de 286
\ring{A}, las secciones correspondientes al comienzo de la capa
interna de ambas cápsidas de T=13 mostraron que las 260 unidades
triméricas internas presentan una clara continuidad con otras 260
unidades triméricas internas, incluidas aquellas alrededor del eje
de simetría de orden 5 (Figura 9F). Los trímeros pentaméricos se
empaquetan más estrechamente entre ellos que los hexaméricos, y
aparecen fusionados en un radio a 277 \ring{A}, donde son visibles
densidades extra en ejes de simetría del orden 6 de la cápsida del
HT-VP2-466 (Figura 9G). A 269
\ring{A} de radio, son evidentes densidades extra en ejes de
simetría del orden 6 (Figura 9H).
En la presente invención se ha analizado el
poliforfismo conformacional de la proteína de mayor abundancia en
IBDV, la proteína VP2. VP2 se sintetiza inicialmente como un
precursor de 512 aminoácidos, pVP2 (Seq. ID. No. 15), el cual sufre
varios procesamientos en su extremo C-terminal para
dar lugar a la proteína madura VP2 (441 aminoácidos). La mayoría de
los mutantes expresados en el sistema de baculovirus desarrollado
en esta invención podrían corresponder por lo tanto a intermediarios
ocurridos naturalmente durante el proceso de ensamblaje del virus.
El mecanismo molecular responsable del control de los polimorfismos
reside en una secuencia de 71 aminoácidos temporalmente unida al
extremo C-terminal y que es eliminada cuando
completa su función. En ausencia de VP3, se requiere de la presencia
de un His-tag en el extremo
N-terminal de la proteína VP2 para su correcto
ensamblaje, indicando que este His-tag reproduce la
función de la proteína VP3 durante el ensamblaje. El control del
ensamblaje del complejo de la cápsida de IBDV T=13 requiere por lo
tanto de la interacción de dos elementos polipeptídicos por
separado y que pueden ser desconectados en el sistema de la
presente invención.
Los resultados de la presente invención indican
que el controlador molecular del cambio de la proteína VP2 (Seq.
ID. No. 15) se localiza en el segmento
443-GFKDIIRAIR-453 (Seq. ID. No 16),
el cual está organizado en forma de hélice \alpha. El mutante
HT-VP2-456 de la invención
representa la frontera entre la formación en la VP2 de una única
conformación o múltiples conformaciones. Si las unidades de
ensamblaje son más cortas, como en el caso de
HT-VP2-441, sólo se producen
estructuras pentaméricas (cápsidas T=1), mientras que si se incluyen
los aminoácidos 443-452, se forman tanto cápsidas
T=13 como cápsidas T=1.
\vskip1.000000\baselineskip
Para evaluar la inmunogenicidad de las
QVLPs-pVP2-456 obtenidas en el
Ejemplo 1 se realizó un ensayo de inmunización en pollos de 1 día.
Brevemente, un grupo de 7 animales SPF (libre de patógenos
específicos) fue inmunizado por vía intramuscular con una única
dosis de 200 \mul conteniendo 10 \mug de
QVLPs-pVP2-456/animal diluidas en
PBS. Un grupo similar fue inyectado con PBS. Se realizaron
extracciones semanales de suero de cada uno de los animales de ambos
grupos. Los sueros de cada grupo y fecha fueron mezclados para
obtener un suero homogéneo (pool) representado por volúmenes
equivalentes de cada individuo del grupo. Los sueros fueron
analizados mediante ELISA. Para ello, los pocillos fueron tapizados
con 10 ng de QVLPs-pVP2-456. Los
ensayos fueron realizados según un protocolo previamente descrito
(Current Protocols in Immunology. Edited by: Bierer, Coligan,
Margulies, Shevach, Strober, John Wiley & Sons
\underbar{http://www.interscience.wiley.com/c\_p/index.htm}). Los
resultados obtenidos ponen de manifiesto que una única inmunización
en ausencia de adyuvante produce una potente respuesta frente a la
proteína pVP2-456. Resultados similares se
obtuvieron cuando se ensayaron otras QVLPs-pVP2*
obtenidas en el Ejemplo 1. Asimismo, se obtuvieron resultados
similares cuando se ensayaron otras VLPs, tanto quiméricas (QVLPs)
como no quiméricas, conteniendo VP2 de IBDV descritas en las
solicitudes de patentes españolas P200300751, P200400120 y
P200400121.
\vskip1.000000\baselineskip
Con el fin de estudiar la posibilidad de obtener
QVLPs-pVP2* de IBDV en cultivos de levadura (S.
cerevisiae) se generó el plásmido de expresión
pESCURA/pVP2-456-BT con el gen
heterólogo que codifica para el péptido quimérico de FMVD
denominado BT (Zhang, Q. et al., 2002, Acta Virologica
46(1):1-9) unido al extremo
N-terminal de pVP2-456. Dicho
péptido quimérico BT comprende el epítopo de las células B
(localizado entre las posiciones 133-159 de la
proteína VP1 del aislado español, serotipo C, de FMDV) y el epítopo
de células T (localizado entre las posiciones 20-34
de la proteína VP4 de FMDV, serotipo Asia). La secuencia de
aminoácidos del epítopo de las células B es SIINNYYMQQYQNSM (SEQ ID
No 12), mientras que la secuencia de aminoácidos del epítopo de las
células T es MTTTYTASARGDLAHLTTTHARHLP (SEQ ID No 13).
El primer paso en la construcción del plásmido
de expresión se realizó mediante el clonaje de la región
codificante de la proteína pVP2-456 en el vector
pESCURAinv. El plásmido pESCURAinv se generó mediante digestión del
vector pRS426 (Stratagene) con el enzima PvuII y religación de la
mezcla de digestión. El vector resultante, pESCURAinv, contiene la
región de clonaje múltiple en posición invertida con respecto a la
del vector parental pRS426. El fragmento de DNA correspondiente a la
proteína pVP2-456 se obtuvo mediante PCR con los
oligonucleótidos correspondientes (Tabla 1) empleando como molde el
plásmido pVOTE.2/Poly (Fernández-Arias, A., Risco,
C., Martínez, S., Albar, J. P. & Rodríguez, J. F. (1998).
Expression of ORF Al of infectious bursal disease virus infectious
bursal disease virus results in the formation of
virus-like particles. Journal of General
Virology 79, 1047-1054). El fragmento fue
purificado, sometido a digestión con los enzimas BglII y HindIII y
clonado en el vector pESCURA.inv previamente digerido con los
enzimas BamHI y HindIII. El plásmido resultante se denominó
pESCURA/pVP2-456.
Un fragmento de DNA que contenía la fase de
lectura abierta correspondiente a dicho péptido quimérico BT de
FMDV fue clonado en el plásmido pESCURA/pVP2-456
previamente digerido con los enzimas de restricción apropiados. El
plásmido resultante se denominó
pESCURA/pVP2-456-BT y contiene las
ORFs de la proteína pVP2-456 de IBDV y del péptido
quimérico BT de FMDV.
Posteriormente, dicho plásmido
pESCURA/pVP2-456-BT fue utilizado
para transformar un cultivo de la levadura S. cerevisiae
haploide cepa 499 según un protocolo previamente descrito (Gietz,
R.D. and R.A. Woods. (2002) Transformation of yeast by the Liac/SS
carrier DNA/PEG method. Methods in Enzymology 350:
87-96). Las levaduras transformadas con el plásmido
fueron seleccionadas mediante crecimiento en placas de medio SC
(CSM + YNB, glucosa 2% y bacto agar) suplementadas con los
aminoácidos triptófano, leucina e histidina y carentes de uracilo
(-Ura). Tras una incubación de 48 h a 30°C, se seleccionó una
colonia que fue empleada para la realización de los subsiguientes
análisis de expresión de proteínas y formación de
QVLPs-pVP2-456-BT.
El análisis de la expresión de las proteínas
pVP2-456 y BT y formación de QVLPs se realizó
siguiendo un protocolo descrito previamente para la caracterización
de VLPs de IBDV en otros sistemas de expresión
(Fernández-Arias, A., Risco, C., Martínez, S.,
Albar, J. P. & Rodríguez, J. F. (1998). Expression of ORF A1 of
infectious bursal disease virus results in the formation of
virus-like particles. Journal of General
Virology 79, 1047-1054; Lombardo, E., Maraver,
A., Castón, J. R., Rivera, J., Fernández-Arias, A.,
Serrano, A., Carrascosa, J. L. & Rodríguez, J. F. (1999). VP1,
the putative RNA-dependent RNA polymerase of
infectious bursal disease virus, forms complexes with the capsid
protein VP3, leading to efficient encapsidation into
virus-like particles. Journal of Virology 73,
6973-698). La colonia seleccionada fue cultivada en
medio liquido CSM (-Ura) + YNB suplementado con rafinosa al 2%. El
cultivo se incubó a 30°C durante 24 h. Este cultivo fue empleado
para inocular, a una densidad óptica (D.O.) de 0,2, un matraz de 200
ml de medio CSM (-Ura) + YNB suplementado con el inductor galactosa
al 2%. El cultivo fue mantenido a 30°C durante 18 horas (hasta una
D.O. entre 1,0 y 2,0). Las levaduras fueron centrifugadas a 3.000
rpm, 5 min a 4°C, se lavaron con agua destilada 1 vez, y el pellet
fue resuspendido en tampón de lisis (TEN: Tris 10 mM, pH 8,0; NaCl
150 mM; EDTA 1 mM) + inhibidores de proteasas 2X (Compl Roche).
Para la lisis se añadió 1 volumen de "glass beads" (cuentas o
perlas de vidrio) de un tamaño aproximado de 425-600
micrones (Sigma). Esta mezcla fue sometida al vortex vigoroso
durante 30 segundos 4 veces, con intervalos de 30 segundos, y todo
ello a 4°C. Tras ello se recuperó la fracción soluble por
centrifugación de la mezcla de lisis a 13.000 rpm durante 15 min a
4°C. Esta muestra fue sometida a fraccionamiento en un gradiente de
sacarosa de acuerdo al protocolo previamente descrito (Lombardo,
E., Maraver, A., Castón, J. R., Rivera, J.,
Fernández-Arias, A., Serrano, A., Carrascosa, J. L.
& Rodríguez, J. F. (1999). VP1, the putative
RNA-dependent RNA polymerase of infectious bursal
disease virus, forms complexes with the capsid protein VP3, leading
to efficient encapsidation into virus-like
particles. Journal of Virology 73,
6973-6983). Las muestras obtenidas tras el
fraccionamiento así como una muestra del material de partida fueron
analizadas mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con
dodecilsulfato sódico (SDS-PAGE) [Current Protocols
in Molecular Biology] e inmunodetección por Western blot empleando
sueros anti-pVP2-456 y
anti-BT [Current Protocols in Molecular Biology].
El Western blot reveló la presencia de bandas, con la masa
molecular predicha correspondiente a las proteínas pVP2 (48 kDa) y
BT (Figura 11). Estos resultados ponen de manifiesto la correcta
expresión de ambos péptidos en el cultivo de S. cerevisiae
transformado con el plásmido
pESCURA/pVP2-456-BT. A
continuación, las distintas fracciones del gradiente fueron
analizadas mediante TEM como se ha descrito previamente (Lombardo,
E., Maraver, A., Castón, J. R., Rivera, J.,
Fernández-Arias, A., Serrano, A., Carrascosa, J. L.
& Rodríguez, J. F. (1999). VP1, the putative
RNA-dependent RNA polymerase of infectious bursal
disease virus, forms complexes with the capsid protein VP3, leading
to efficient encapsidation into virus-like
particles. Journal of Virology 73:,
6973-6983). El análisis mediante TEM de las
fracciones del gradiente reveló la existencia de
QVLPs-VP2-456-BT
(datos no mostrados).
<110> BIONOSTRA S.L., CONSEJO SUPERIOR DE
INVESTIGACIONES CIENTÍFICAS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> PARTÍCULAS PSEUDOVIRALES VACÍAS
QUIMÉRICAS DERIVADAS DEL VIRUS CAUSANTE DE LA ENFERMEDAD DE LA
BURSITIS INFECCIOSA (IBDV), PROCEDIMIENTO DE OBTENCIÓN Y
APLICACIONES
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> P200501733
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> P200501733
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
2005-07-15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador 5'-VP2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador NotI-441
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
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<212> DNA
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<213> Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
HindIII-456
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
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\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 4
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<211> 31
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<212> DNA
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<213> Artificial
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<220>
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<223> Cebador
HindIII-466
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<400> 4
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<210> 5
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<211> 33
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<212> DNA
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<213> Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
HindIII-476
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
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<210> 6
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<211> 33
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<212> DNA
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<213> Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> Cebador
HindIII-487
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<400> 6
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\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
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<212> DNA
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<213> Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
HindIII-494
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 7
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\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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<213> Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
HindIII-501
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
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\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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<213> Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
HindIII-512
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia extra tag
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0.5cm13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0.5cm14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
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<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia de aminoácidos del epítopo
de las células B
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0.5cm15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
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<211> 25
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<212> PRT
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<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia de aminoácidos del epítopo
de las células T
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0.5cm16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
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<211> 1536
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia de nucleotidos de IBDV
Soroa pVP2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
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<211> 512
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia de aminoácidos de IBDV
Soroa pVP2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> péptido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0.5cm22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido Sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0.5cm23
Claims (37)
1. Una proteína de fusión que comprende una
región A constituida por la proteína pVP2 del virus de la bursitis
infecciosa (IBDV) o un fragmento 1-n de dicha
proteína pVP2 de IBDV, en donde "n" es un número entero
comprendido entre 441 y 501, unida al menos a una región B
constituida por un polipéptido heterólogo.
2. Proteína según la reivindicación 1, en la que
dicha región A está constituida por la proteína pVP2 de IBDV.
3. Proteína según la reivindicación 1, en la que
dicha región A está constituida por un fragmento
1-n de dicha proteína pVP2 de IBDV seleccionado del
grupo formado por:
- (i)
- pVP2-441, cuya secuencia de aminoácidos está constituida por la secuencia de aminoácidos comprendida entre el resto 1 y el resto 441 de la proteína pVP2 de IBDV;
- (ii)
- pVP2-452, cuya secuencia de aminoácidos está constituida por la secuencia de aminoácidos comprendida entre el resto 1 y el resto 452 de la proteína pVP2 de IBDV;
- (iii)
- pVP2-456, cuya secuencia de aminoácidos está constituida por la secuencia de aminoácidos comprendida entre el resto 1 y el resto 456 de la proteína pVP2 de IBDV;
- (iv)
- pVP2-466, cuya secuencia de aminoácidos está constituida por la secuencia de aminoácidos comprendida entre el resto 1 y el resto 466 de la proteína pVP2 de IBDV;
- (v)
- pVP2-476, cuya secuencia de aminoácidos está constituida por la secuencia de aminoácidos comprendida entre el resto 1 y el resto 476 de la proteína pVP2 de IBDV;
- (vi)
- pVP2-487, cuya secuencia de aminoácidos está constituida por la secuencia de aminoácidos comprendida entre el resto 1 y el resto 487 de la proteína pVP2 de IBDV;
- (vii)
- pVP2-494, cuya secuencia de aminoácidos está constituida por la secuencia de aminoácidos comprendida entre el resto 1 y el resto 494 de la proteína pVP2 de IBDV; y
- (viii)
- pVP2-501, cuya secuencia de aminoácidos está constituida por la secuencia de aminoácidos comprendida entre el resto 1 y el resto 501 de la proteína pVP2 de IBDV.
\vskip1.000000\baselineskip
4. Proteína según la reivindicación 1, en la que
dicha región B está unida a la región
amino-terminal de dicha proteína pVP2 de IBDV o de
dicho fragmento 1-n de dicha proteína pVP2 de
IBDV.
5. Proteína según la reivindicación 1, en la que
dicha región B está unida a la región
carboxilo-terminal de dicha proteína pVP2 de IBDV o
de dicho fragmento 1-n de dicha proteína pVP2 de
IBDV.
6. Proteína según la reivindicación 1, en la que
dicho polipéptido heterólogo comprende al menos un polipéptido de
interés útil en vacunación, terapia o diagnóstico.
7. Proteína según la reivindicación 1, en la que
dicha región B comprende un único polipéptido de interés.
8. Proteína según la reivindicación 1, en la que
dicha región B comprende dos o más polipéptidos de interés.
9. Proteína según la reivindicación 1, en la que
dicha proteína de fusión comprende una región A unida a una única
región B.
10. Proteína según la reivindicación 1, en la
que dicha proteína de fusión comprende una región A unida a dos
regiones B, iguales o diferentes, estando una de dichas regiones B
unida a la región amino-terminal de la proteína pVP2
de IBDV o de dicho fragmento 1-n de dicha proteína
pVP2 de IBDV presente en la región A y estando la otra región B
unida a la región carboxilo-terminal de la proteína
pVP2 de la proteína pVP2 de IBDV o de dicho fragmento
1-n de dicha proteína pVP2 de IBDV presente en la
región A.
11. Proteína según la reivindicación 10, en la
que dichas regiones B contienen unos polipéptidos de interés
iguales o diferentes entre sí.
12. Proteína según la reivindicación 1, en la
que dicha proteína de fusión comprende, además, un polipéptido
espaciador situado entre dichas regiones A y B.
13. Una partícula pseudoviral vacía quimérica
que comprende al menos una proteína de fusión según cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 12.
14. Un ácido nucleico caracterizado
porque su secuencia de nucleótidos comprende la secuencia de
nucléotidos que codifica para la proteína de fusión definida en
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12.
15. Un cassette de expresión que comprende una
secuencia de ácido nucleico según la reivindicación 14,
operativamente unida a unos elementos de control de
transcripción.
16. Cassette de expresión según reivindicación
15 caracterizado porque la secuencia de ácido nucleico se
encuentra operativamente unida a elementos de control de
traducción.
17. Un vector recombinante que comprende una
secuencia de ácido nucleico según la reivindicación 14.
18. Vector según la reivindicación 17,
caracterizado porque dicho vector se selecciona entre
plásmidos, bácmidos, cromosomas artificiales de levadura (YACS),
cromosomas artificiales de bacteria (BACs), cromosomas artificiales
basados en el bacteriófago P1 (PACs), cósmidos, o virus.
19. Vector según reivindicación 18
caracterizado porque contiene un origen de replicación
heterólogo.
20. Una célula hospedadora que contiene una
secuencia de ácido nucleico según la reivindicación 14, o un
cassette de expresión según cualquiera de las reivindicaciones
15-16, o un vector recombinante según cualquiera de
las reivindicaciones 17-19.
21. Una célula hospedadora transformada por una
secuencia de ácido nucleico según la reivindicación 14.
22. Una célula hospedadora transformada,
transfectada o infectada con un vector recombinante según
cualquiera de las reivindicaciones 17-19.
23. Célula hospedadora según cualquiera de las
reivindicaciones 20-22, caracterizada porque
se selecciona entre una célula de mamífero, una célula aviar, una
célula de insecto y una levadura.
24. Un procedimiento para la producción de
partículas pseudovirales vacías quiméricas según la reivindicación
13, que comprende cultivar una célula hospedadora según cualquiera
de las reivindicaciones 20-23.
25. Procedimiento según reivindicación 24
caracterizado porque adicionalmente comprende recuperar
dichas partículas pseudovirales vacías quiméricas.
26. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 24-25, en el que dicha célula
hospedadora es una célula de insecto, que comprende (i) cultivar
células de insecto infectadas con un baculovirus recombinante que
comprende la secuencia de nucleótidos que codifica para una
proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12,
bajo condiciones que permiten la expresión de dicha proteína de
fusión y su ensamblaje para formar partículas pseudovirales vacías
quiméricas, QVLPs-pVP2* de IBDV, según la
reivindicación 13.
27. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 24-25, en el que dicha célula
hospedadora es una levadura, que comprende las etapas (i) cultivar
levaduras transformadas con un vector recombinante que comprende la
secuencia de nucleótidos que codifica para una proteína de fusión
según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, bajo condiciones
que permiten la expresión de dicha proteína de fusión y su
ensamblaje para formar partículas pseudovirales vacías quiméricas,
QVLPs-pVP2* de IBDV, según la reivindicación
13.
28. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 26-27 que adicionalmente implica
aislar dichas QVLPs-pVP2* de IBDV.
29. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 26-28 que adicionalmente comprende
purificar dichas QVLPs-pVP2* de IBDV.
30. Empleo de un vector recombinante según
cualquiera de las reivindicaciones 17-19, para la
producción y obtención de partículas pseudovirales vacías quiméricas
según la reivindicación 13.
31. Empleo de partículas pseudovirales vacías
quiméricas según la reivindicación 13, en la elaboración de una
composición farmacéutica.
32. Empleo según la reivindicación 31, en el que
dicha composición farmacéutica es una vacuna, un vector para
terapia génica o un sistema para el suministro de sustancias
activas.
33. Una vacuna que comprende una cantidad
terapéuticamente efectiva de partículas pseudovirales vacías
quiméricas según la reivindicación 13.
34. Vacuna según reivindicación 33 que
adicionalmente comprende uno o más adyuvantes y/o vehículos
farmacéuticamente aceptables.
35. Vacuna según cualquiera de las
reivindicaciones 33-34, útil para proteger animales
y humanos simultáneamente frente a la infección causada por dos o
más agentes infecciosos causantes de enfermedades.
36. Un vector para terapia génica que comprende
una partícula pseudoviral vacía quimérica según la reivindicación
13.
37. Empleo de una partícula pseudoviral vacía
quimérica según reivindicación 13 en la elaboración de un sistema
de suministro de sustancias activas que comprende dicha partícula
pseudoviral y una sustancia activa.
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