ES2307346B1 - Capsidas vacias (vlps(-vp4)) del virus causante de la enfermedad de la bursitis infecciosa (ibdv), su procedimiento de obtencion y aplicaciones. - Google Patents
Capsidas vacias (vlps(-vp4)) del virus causante de la enfermedad de la bursitis infecciosa (ibdv), su procedimiento de obtencion y aplicaciones. Download PDFInfo
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Abstract
Cápsidas vacías (VLPs(-VP4)) del virus causante
de la enfermedad de la bursitis infecciosa (IBDV), su
procedimiento de obtención y aplicaciones.
Las cápsidas vacías del virus causante de la
bursitis infecciosa (IBDV), VLP(-VP4), se caracterizan porque están
constituidas, únicamente, por ensamblaje de proteínas pVP2 de IBDV y
proteínas VP3 de IBDV. Dichas cápsidas tienen actividad
inmunogénica y pueden ser utilizadas en la elaboración de vacunas
para proteger animales de la infección causada por IBDV así como en
la elaboración de vectores para terapia génica.
Description
Cápsidas vacías (VLPs(-VP4)) del virus causante
de la enfermedad de la bursitis infecciosa (IBDV), su
procedimiento de obtención y aplicaciones.
La invención se refiere a cápsidas virales
vacías del virus causante de la bursitis infecciosa (IBDV), con
actividad inmunogénica frente a IBDV, constituidas por las
proteínas pVP2 y VP3 de IBDV, a su producción mediante ingeniería
genética y a sus aplicaciones, en particular, en la elaboración de
vacunas frente a la enfermedad aviar denominada bursitis infecciosa
causada por IBDV y en la elaboración de vectores para terapia
génica.
El virus causante de la enfermedad de la
bursitis infecciosa (IBDV), también conocida como enfermedad de
Gumboro, pertenece a la familia Birnaviridae, infecta distintas
especies aviares y es el responsable directo de una grave enfermedad
inmunosupresora causante de importantes pérdidas económicas en la
industria avícola mundial.
Las partículas de IBDV son icosaédricas, con una
simetría T=13, carecen de envuelta y están formadas por una única
capa proteica. Hasta el momento, las aproximaciones encaminadas a
la obtención un modelo atómico para las partículas de IBDV han
fracasado. Por ello, la información estructural disponible está
basada en modelos tridimensionales generados a partir de imágenes
obtenidas por criomicroscopía electrónica del virus purificado y de
VLPs. En base a esos estudios, se ha comprobado que la superficie
externa de la partícula está formada por un entramado continuo de
260 trimeros de la proteína VP2 (37 kDa) ordenados en cinco
conformaciones diferentes. La cara interna de las partículas
contiene 200 trimeros de la proteína VP3 (29 kDa), estos últimos,
independientes entre sí, se encuentran unidos a la zona basal de los
trimeros de VP2. Se ha sugerido que un tercer polipéptido, VP4 (28
kDa), también podría formar parte de las partículas, estando
situado en la base de los pentámeros que forman los vértices de la
estructura icosaédrica.
Los polipéptidos VP2, VP3 y VP4 se producen a
partir del procesamiento proteolítico de un polipéptido precursor
de un tamaño de 109 kDa. Este precursor se procesa
auto-catalíticamente liberando los polipéptidos pVP2
(48 kDa), VP3 y VP4. El dominio VP4, que se localiza en la región
central de la poliproteína, pertenece a la familia de las proteasas
Lon y es el responsable del corte proteolítico. Los polipéptidos
pVP2 y VP3 son los responsables directos del ensamblaje de las
cápsidas. El producto pVP2 sufre un último corte en su extremo
C-terminal antes de dar lugar a la forma madura de
la proteína, VP2, que es la que se encuentra en las partículas
purificadas (Da Costa, B., Chevalier, C., Henry, C., Huet, J. C.,
Petit, S., Lepault, J., Boot, H. & Delmas, B. (2002). The
capsid of infectious bursal disease virus contains several small
peptides arising from the maturation process of pVP2. Journal of
Virology 76:2393-2402). Este procesamiento de
pVP2 es necesario para la correcta formación de las cápsidas y
requiere de la presencia de VP3, aunque la proteasa responsable aún
no ha sido identificada (Maraver, A., Oña, A., Abaitua, F.,
González, D., Clemente, R., Díaz-Ruiz, A., Castón,
J. R., Pazos, F. & Rodríguez, J. F. (2003). The oligomerization
domain of VP3, the scaffolding protein of infectious bursal disease
virus, plays a critical role for capsid formation. Journal of
Virology 77:6438-49).
Las vacunas convencionales empleadas para el
control de la bursitis infecciosa se basan en el empleo de cepas,
con diferentes grados de virulencia, del propio IBDV crecidas en
cultivo celular o en huevos embrionados. Los extractos que contienen
el material infeccioso son sometidos a procesos de inactivación
química para producir vacunas inactivadas o bien son empleados de
forma directa para producir vacunas vivas atenuadas (Sharma, J. M.,
Kim, I. J., Rautenschlein, S. & Yeh, H. Y. (2000). Infectious
bursal disease virus of chickens: pathogenesis and
immunosuppression. Developmental and Comparative Immunology
24:223-235; van den Berg TP, Eterradossi N, Toquin
D, Meulemans G. 2000. Rev Sci Tech 2000,
19:509-543). Este último tipo de vacunas presenta
los inconvenientes clásicos asociados con el empleo de vacunas vivas
atenuadas, concretamente, el riesgo de mutaciones que reviertan la
virulencia del virus o le hagan perder su inmunogenicidad.
Se han descrito vacunas
sub-unidad recombinantes que contienen la proteína
VP2 de IBDV expresada en diversos sistemas de expresión, por
ejemplo, bacterias, levaduras o baculovirus, normalmente en forma
de proteína de fusión. Los resultados obtenidos en ensayos de
inmunización de pollos con dichas vacunas no han sido completamente
satisfactorios.
Las cápsidas virales vacías o partículas
pseudovirales (VLPs, del inglés "virus-like
particles"), constituyen una alternativa al empleo de vacunas
vivas atenuadas y de vacunas sub-unidad
recombinantes. Las VLPs se obtienen por autoensamblaje de las
sub-unidades constituyentes de la cápsida viral y
mimetizan la estructura y propiedades antigénicas del virión nativo
aunque carecen de material genético por lo que son incapaces de
replicarse. Además de su aplicación con fines vacunales las VLPs
pueden ser utilizadas como vectores de moléculas de interés
biológico, por ejemplo, ácidos nucleicos, péptidos o proteínas. A
modo ilustrativo pueden citarse VLPs de parvovirus (US 6.458.362) o
del virus de la inmunodeficiencia humana (HIV) (US 6.602.705).
La morfogénesis es un proceso vital para el
ciclo vírico que requiere de pasos sucesivos asociados a
modificaciones en los polipéptidos precursores. Por ello, los virus
han desarrollado estrategias que permiten la secuencial y correcta
interacción entre cada uno de sus componentes. Una de estas
estrategias, utilizada con frecuencia por virus icosaédricos, es la
utilización de polipéptidos provenientes de una única poliproteína
como base de sus componentes estructurales. En estos casos, el
adecuado procesamiento proteolítico de dicha poliproteína juega un
papel crucial en el proceso de ensamblaje.
En trabajos previos se ha demostrado este
principio para el ensamblaje de las cápsidas de IBDV
(Fernández-Arias, A., Risco, C., Martínez, S.,
Albar, J. P. & Rodríguez, J. F. (1998). Expression of ORF A1 of
infectious bursal disease virus infectious bursal disease virus
results in the formation of virus-like particles.
Journal of General Virology 79, 1047-1054).
La expresión en células eucarióticas del gen codificador para la
poliproteína de IBDV da lugar a la formación de VLPs totalmente
indistinguibles morfológica y bioquímicamente de los viriones de
IBDV. Asimismo, se ha comprobado que el ensamblaje de las cápsidas
necesita únicamente de la síntesis y del correcto procesamiento de
la poliproteína viral y es independiente de la presencia del genoma
vírico o de otras proteínas codificadas por el genoma viral tales
como VP5 y VP1.
Paralelamente a la formación de cápsidas, el
producto VP4 de IBDV es capaz de autoensamblarse en estructuras
tubulares de 20 nm de diámetro. Estos túbulos, conocidos como
túbulos de tipo II, se co-purifican parcialmente con
las partículas virales. Otros experimentos han demostrado que la
obtención de VLPs de IBDV, utilizando para la expresión de la
poliproteína baculovirus recombinantes (rBVs), es extremadamente
ineficiente obteniéndose como resultado la acumulación de grandes
cantidades de túbulos de tipo I en el citosol de las células
infectadas (Martínez-Torrecuadrada, J. L., Castón,
J. R., Castro, M., Carrascosa, J. L., Rodríguez, J. F. & Casal,
J. I. (2000). Different architectures in the assembly of infectious
bursal disease virus capsid proteins expressed in insect cells.
Virology 278:322-331; Chevalier, C.,
Lepault, J., Erk, I., Da Costa, B. & Delmas, B. (2002). The
maturation process of pVP2 requires assembly of infectious bursal
disease virus capsids. Journal of Virology
76:2384-2392). Recientemente se ha demostrado que
esto es debido al corte proteolitico a que es sometida la proteína
VP3 cuando es sintetizada en células de insecto. Dicha proteolisis
se previene casi totalmente por la formación de complejos VP3/VP1
(Maraver, A., Oña, A., Abaitua, F., González, D., Clemente, R.,
Díaz-Ruiz, A., Castón, J. R., Pazos, F. &
Rodríguez, J. F. (2003). The oligomerization domain of VP3, the
scaffolding protein of infectious bursal disease virus, plays a
critical role for capsid formation. Journal of Virology
77:6438-6449).
Por tanto, los resultados obtenidos hasta la
fecha a partir de la expresión de los genes de IBDV en distintos
sistemas recombinantes ha permitido concluir que: (i) el proceso de
ensamblaje es independiente de la presencia del material genético
del virus, (ii) para el ensamblaje sólo son necesarios los
polipéptidos codificados por el gen de la poliproteína, y (iii) el
ensamblaje requiere de una interacción coordinada entre los
péptidos pVP2 y VP3.
Sin embargo, no se conoce si la interacción
pVP2/VP3 se establece entre dominios de VP2 y VP3 de la
poliproteína precursora cuando aún no ha sufrido modificaciones, o
si por el contrario, esta interacción ocurre tras el procesamiento
del precursor. Además, la información actual no excluye la
posibilidad de que VP4 pudiera jugar un papel relevante en la
morfogénesis de la cápsida viral. De hecho, se han descrito VLPs de
IBDV formadas por ensamblaje de las proteínas VP2, VP3 y VP4 de
IBDV (US 6.528.063, US 5.788.970 y JP 5194597).
Por otro lado, la información acerca de la
expresión de proteínas de IBDV mediante ingeniería genética en
distintos modelos celulares es escasa. Se ha descrito la expresión
de proteínas de IBDV en células de insecto, bacterias y levaduras.
Jagadish et al. (Jagadish MN, Vaughan PR, Irving RA, Azad
AA, Macreadie IG. (1990). Expression and characterization of
infectious bursal disease virus polyprotein in yeast. Gene
9:179-186; Macreadie IG, Vaughan PR, Chapman AJ,
McKern NM, Jagadish MN, Heine HG, Ward CW, Fahey KJ, Azad AA.
(1990). Passive protection against infectious bursal disease virus
by viral VP2 expressed in yeast. Vaccine 8:549-552)
describen la expresión de VP2 de IBDV en levaduras. Los resultados
descritos indican que la expresión de la poliproteína viral en 2
especies de levadura, Saccharomyces cerevisiae y
Saccharomyces pombe, es muy ineficiente, acumulándose una
gran variedad de productos proteicos de diferente masa molecular.
El fracaso en la obtención de productos proteicos del tamaño
esperado y la imposibilidad de detectar estructuras producidas por
el ensamblaje de éstas fue atribuido a dos posibles causas: (i) una
posible toxicidad de la proteasa de IBDV (VP4) en este sistema; y/o
(ii) la ineficiencia del sistema de expresión para llevar a cabo
una transcripción y/o traducción correcta de la poliproteína de
IBDV. Recientemente, Pitcovski et al. (Pitcovski J., Gutter
B, Gallili G, Goldway M, Perelman B, Gross G, Krispel S, Barbakov
M, Michael A. (2003). Vaccine 21:4736-4743) han
descrito la expresión de VP2 de IBDV en Pichia pastoris y la
inmunización de pollos con un material que comprende la proteína
recombinante (rVP2) en forma parcialmente purificada. En ningún
caso se ha descrito la obtención en levaduras de VLPs de IBDV.
Un trabajo previo desarrollado por los
inventores ha permitido establecer sistemas para la obtención de
VLPs de IBDV empleando diferentes vectores de expresión
eucariótica. Estos vectores han sido utilizados para la expresión de
la poliproteína de IBDV en ausencia o presencia de la RNA
polimerasa viral VP1. La caracterización bioquímica de las VLPs
purificadas demuestra que contienen las proteínas pVP2, VP2 y VP3,
cuando se expresa únicamente la poliproteína viral y las proteínas
pVP2, VP2, VP3 y VP1 cuando se realiza la expresión simultánea de la
poliproteína y la RNA polimerasa viral
(Fernández-Arias, A., Risco, C., Martínez, S.,
Albar, J. P. & Rodríguez, J. F. (1998). Expression of ORF Al of
infectious bursal disease virus infectious bursal disease virus
results in the formation of virus-like particles.
Journal of General Virology 79: 1047-1054;
Martínez-Torrecuadrada, J. L., Castón, J. R.,
Castro, M., Carrascosa, J. L., Rodríguez, J. F. & Casal, J. I.
(2000). Different architectures in the assembly of infectious
bursal disease virus capsid proteins expressed in insect cells.
Virology 278: 322-331; Maraver, A., et
al., (2003) citado supra; Lombardo, E., Maraver, A.,
Castón, J. R., Rivera, J., Fernández-Arias, A.,
Serrano, A., Carrascosa, J. L. & Rodríguez, J. F. (1999). VP1,
the putative RNA- dependent RNA polymerase of infectious bursal
disease virus, forms complexes with the capsid protein VP3, leading
to efficient encapsidation into virus-like
particles. Journal of Virology 73:
6973-6983). Sin embargo, no se han descrito
previamente VLPs basadas únicamente en pVP2 y VP3 de IBDV, ni su
potencial uso con fines vacunales o como vehiculizadoras de
productos biológicos de interés.
La invención se enfrenta con el problema de
proporcionar nuevas vacunas eficaces y seguras frente al virus
causante de la bursitis infecciosa (IBDV).
La solución proporcionada por esta invención se
basa en que es posible obtener VLPs de IBDV correctamente
ensambladas mediante la expresión simultánea de los polipéptidos
pVP2 y VP3 de IBDV como genes independientes y como única
representación de las proteínas de IBDV en un sistema de expresión
génica. Dichas VLPs están formadas por autoensamblaje de,
únicamente, pVP2 y VP3 de IBDV, por lo que carecen de VP4 de IBDV,
y, por ese motivo, se denominan VLP(-VP4) (singular) o VLPs(-VP4)
(plural) en esta descripción. Dichas VLPs(-VP4) pueden ser
utilizadas, por ejemplo, con fines terapéuticos o de diagnóstico,
por ejemplo, en la elaboración de vacunas para proteger aves de la
infección causada por IBDV o en la elaboración de vectores para
terapia génica.
Los resultados obtenidos permiten concebir dos
nuevas conclusiones al entendimiento del patrón de ensamblaje del
IBDV: (i) las interacciones entre los polipéptidos pVP2/VP3 dan
como resultado un ensamblaje eficiente de las partículas de IBDV
sin necesidad de la expresión de la poliproteína completa, y (ii) el
polipéptido VP4 no es necesario para la formación de la
cápsida.
Estos resultados han permitido diseñar una nueva
estrategia o procedimiento para la producción eficiente de VLPs de
IBDV que contienen los elementos proteicos antigénicamente
relevantes para inducir una respuesta inmune. Esta estrategia se
basa en la utilización de un sistema o vector de expresión génica
que permite la coexpresión de los polipéptidos pVP2 y VP3 como
genes independientes y que evita la síntesis de la poliproteína
precursora de dichos polipéptidos así como la presencia del
polipéptido VP4 durante el proceso de ensamblaje de las cápsidas
virales vacías.
En una realización particular, se describe la
expresión y obtención de VLPs de IBDV, en particular, VLPs(-VP4),
en células de insecto mientras que en otra realización particular
dichas VLPs(-VP4) se obtienen en levaduras, con un rendimiento muy
elevado y con un coste económico muy bajo.
Las vacunas obtenidas utilizando dichas
VLPs(-VP4) presentan numerosas ventajas ya que, por una parte, se
evita la manipulación de material altamente infeccioso, se previene
el riesgo potencial de aparición de nuevos mutantes de IBDV y se
elimina el uso de virus vivo en las explotaciones avícolas,
previniéndose de este modo el riesgo de diseminación de cepas
vacunales de IBDV al Medio Ambiente, y, por otra parte, permite el
desarrollo de sistemas de diagnóstico diferencial para discriminar
entre animales vacunados e infectados. Estos sistemas de diagnóstico
se basan en la detección de anticuerpos frente a las proteínas VP2
y VP4. Los animales con IBDV desarrollan una fuerte respuesta
humoral frente a ambas proteínas. Mientras que los animales
inmunizados con VLPs(-VP4) solo presentan anticuerpos frente a la
proteína VP2.
Por consiguiente, un objeto de la presente
invención lo constituye una cápsida viral vacía de IBDV, VLP(-VP4),
con actividad inmunogénica frente a la infección en IBDV,
caracterizada porque está constituida por autoensamblaje de,
únicamente, las proteínas pVP2 y VP3 de IBDV.
Un aspecto adicional de esta invención se
relaciona con un procedimiento para la producción de dichas
VLPs(-VP4) de IBDV proporcionadas por esta invención, basado en la co-expresión génica de dichas proteínas pVP2 y VP3 de IBDV como dos genes independientes.
VLPs(-VP4) de IBDV proporcionadas por esta invención, basado en la co-expresión génica de dichas proteínas pVP2 y VP3 de IBDV como dos genes independientes.
Los ácidos nucleicos, construcciones génicas,
sistemas de expresión y células huésped desarrollados para la
puesta en práctica de dicho procedimiento de producción de dichas
VLPs(-VP4) de IBDV, así como su empleo para la producción de dichas
VLPs(-VP4) de IBDV, constituyen aspectos adicionales de la presente
invención.
Dichas VLPs(-VP4) de IBDV tienen la capacidad de
inmunizar animales, en particular, aves, frente a la enfermedad
aviar causada por el IBDV así como la capacidad de vectorizar o
vehiculizar moléculas de interés biológico, por ejemplo,
polipéptidos, proteínas, ácidos nucleicos, etc. En una realización
particular, dichas VLPs(-VP4) de IBDV pueden ser utilizadas en la
elaboración de una vacuna para proteger aves frente al virus
causante de la enfermedad aviar conocida como bursitis infecciosa
(IBDV). Prácticamente cualquier ave, preferentemente aquellas
especies aviares de interés económico, por ejemplo, pollos, pavos,
ocas, gansos, faisanes, codornices, avestruces, etc., pueden ser
inmunizadas frente a la infección causada por IBDV con las vacunas
proporcionadas por esta invención. En otra realización particular,
dichas VLPs(-VP4) de IBDV pueden vehiculizar, en su interior,
productos con actividad biológica, por ejemplo, ácidos nucleicos,
péptidos, proteínas, fármacos, etc., por lo que pueden ser
utilizadas en la elaboración de vectores para terapia génica.
Por tanto, en otro aspecto adicional, la
presente invención se relaciona con el empleo de dichas VLPs(-VP4)
de IBDV, en la elaboración de medicamentos, tales como vacunas y
vectores para terapia génica. Dichas vacunas y vectores constituyen
aspectos adicionales de la presente invención. En una realización
particular, dicha vacuna es una vacuna útil para proteger aves de
la infección causada por IBDV. En una realización concreta, dichas
aves seleccionan del grupo formado por pollos, pavos, ocas, gansos,
faisanes, codornices y avestruces, preferentemente, pollos.
Figura 1. (a) El diagrama esquematiza los pasos
de procesamiento proteolítico necesarios para la formación de las
proteínas maduras de la cápsida VP2 y VP3 a partir de la
poliproteína precursora. (b) El diagrama refleja las diferentes
construcciones genéticas derivadas de la poliproteína de IBDV
descritas hasta el momento, así como las estructuras producidas
mediante su expresión en diferentes sistemas heterólogos. Los
números indican la posición correspondiente al primer y último
residuo aminoacídico de la poliproteína presente en cada una de las
construcciones. La parte inferior de la figura muestra imágenes
obtenidas mediante microscopía electrónica de transmisión de las
estructuras obtenidas mediante expresión de las diferentes
construcciones. La barra corresponde a 50 nm. Los datos han sido
tomados de las siguientes referencias:
Fernández-Arias et al., (1998), citado
supra; Maraver et al., (2003), citado supra;
Martínez-Torrecuadrada et al., (2000), citado
supra; Castón et al., 2001. C terminus of infectious
bursal disease virus major capsid protein VP2 is involved in
definition of the t number for capsid assembly. Journal of
Virology 75, 10815-10828.
Figura 2. Análisis microscópico de células de
insecto H5 que coexpresan pVP2 y VP3. La distribución
subcelular de las proteínas pVP2 y VP3 fue analizada mediante
inmunomicroscopía confocal. Células infectadas con los rBVs FB/pVP2
(a), FB/VP3 (b), o FBD/pVP2-VP3
(c-e) fueron incubadas con suero de conejo
anti-pVP2 y suero de rata anti-VP3.
A continuación, las células fueron incubadas con suero de cabra
anti-Ig de conejo acoplada a Alexa 488 (rojo) y con
suero de cabra anti-Ig de rata acoplada a Alexa 594
(verde). Los núcleos se tiñeron con To-Pro 3 (azul).
(e) Superposición de las imágenes mostradas en los paneles (c) y
(d). Imágenes de microscopía electrónica correspondientes a
secciones de células H5 infectadas con diferentes construcciones
genéticas derivadas de la poliproteína de IBDV. (f) Imagen a baja
magnificación de una célula H5 infectada con virus FB parental. El
inserto corresponde a un detalle ampliado del área indicada por el
recuadro. (g) Imagen a baja magnificación de una célula H5
infectada con el virus FBD/pVP2-VP3. El inserto
corresponde a un detalle ampliado del área indicada por el recuadro.
(h) Imagen de alta magnificación de una célula H5 infectada con el
virus FBD/pVP2-VP3 que muestra en detalle la
formación de estructuras de IBDV. (i) Imagen de alta magnificación
de una célula BSC1 infectada con el virus vacunal recombinante
VTLacOI/POLY mostrando estructuras similares a las detectadas en el
panel (h). Las barras indican 600 nm (paneles f y g) y 200 nm
(paneles h e i).
Figura 3. Caracterización estructural y
bioquímica de las estructuras derivadas de IBDV producidas en
células de insecto co-infectadas con los
baculovirus recombinantes (rBV) FB/pVP2 +
FB/his-VP3. Células
co-infectadas con los rBV FB/pVP2 y
FB/his-VP3, o infectadas con el virus
FBD/Poly-VP1 o FB/pVP2 fueron empleadas para
purificar estructuras derivadas de IBDV mediante centrifugación en
gradientes de sacarosa. Los paneles (a), (b), y (c) muestran
imágenes de microscopía electrónica de transmisión correspondientes
a la fracción 4 de los gradientes obtenidos a partir de las
infecciones con FBD/Poly-VP1,
FB/pVP2+FB/his-VP3, y FB/pVP2, respectivamente. El
panel (d) muestra los resultados de un análisis mediante Western
blot de los gradientes de sacarosa correspondientes a cultivos
infectados con FBD/Poly-VP1 y
FB/pVP2+FB/his-VP3, respectivamente. Los extractos
totales (input) y las diferentes fracciones de los gradientes de
sacarosa (la fracción F1 corresponde al fondo del gradiente) fueron
analizadas mediante Westen blot empleando sueros específicos frente
a las proteínas VP1, pVP2, VP3, y VP4 de IBDV, respectivamente. Se
indica la masa molecular en kDa de los polipéptidos
inmunoreactivos.
Figura 4. Caracterización bioquímica y
estructural de VLPs de IBDV producidas en S. cerevisiae
transformadas con el plásmido
pESCURA/pVP2-VP3-GFP. Un cultivo
de S. cerevisiae transformada con el plásmido
pESCURA/pVP2-VP3-GFP fue crecido a
30ºC en medio suplementado con el inductor galactosa. A las 18 h el
cultivo fue recogido y centrifugado. El sedimento resultante fue
procesado mediante fraccionamiento en un gradiente lineal
25-50% de sacarosa. A) Análisis bioquímico de
muestras correspondientes al sedimento antes de fraccionar (T) así
como de las diferentes fracciones del gradiente de sacarosa. Las
muestras fueron analizadas mediante SDS-PAGE y
western blot empleando anticuerpos específicos frente a las
proteínas VP3 (anti-VP3) y pVP2
(anti-pVP2). Las flechas indican las posiciones de
las bandas inmunoreactivas correspondientes a las proteínas
VP3-GFP (61 kDa) y pVP2 (48 kDa), respectivamente.
B) El análisis estructural de las muestras obtenidas fue realizado
mediante TEM. La imagen corresponde a una micrografia obtenida a
partir de una alícuota correspondiente a la mezcla de las
fracciones 7, 8 y 9 del gradiente de sacarosa. La muestra fue
teñida con acetato de uranilo y observada mediante TEM. La barra
corresponde a 65 nm. C) Muestra de VLPs obtenidas mediante la
expresión de la poliproteína de IBDV en células de mamífero
mediante infección con el virus vacunal recombinante VT7/Poly
(Fernández-Arias et al., (1998), citado
supra). La barra corresponde a 65 nm.
En un primer aspecto, la invención proporciona
una cápsida vacía del virus causante de la enfermedad de la
bursitis infecciosa (IBDV), en adelante VLP(-VP4) de la
invención, caracterizada porque está constituida por ensamblaje de,
únicamente, proteínas pVP2 de IBDV y proteínas VP3 de IBDV.
El término "IBDV", tal como se utiliza en
la presente invención, se refiere a las diferentes cepas de IBDV
pertenecientes a cualquiera de los serotipos (1 ó 2) conocidos [a
título ilustrativo véase la revisión realizada por van den Berg TP,
Eterradossi N, Toquin D, Meulemans G., en Rev Sci Tech 2000
19: 509-43] y los términos "proteína pVP2 de
IBDV" y "proteína VP3 de IBDV" se refieren a las diferentes
formas de las proteínas pVP2 y VP3 representativas de cualquiera de
las mencionadas cepas de IBDV [NCBI protein databank], de acuerdo
con la definición realizada por Sánchez y Rodríguez (1999) (Sánchez
AB, Rodríguez JF. Proteolytic processing in infectious bursal
disease virus: identification of the polyprotein cleavage sites by
site-directed mutagenesis. Virology. 1999 Sep 15;
262(1):190-199) así como proteínas
sustancialmente homólogas a dichas proteínas pVP2 y VP3 de IBDV, es
decir, proteínas cuyas secuencias de aminoácidos tienen un grado de
identidad, respecto a dichas proteínas pVP2 y VP3 de IBDV, de, al
menos, un 60%, preferentemente de, al menos un 80%, más
preferentemente de, al menos, un 90% y, aún más preferentemente de,
al menos, un 95%.
La proteína pVP2 de IBDV presente en la
VLP(-VP4) de la invención puede ser cualquier proteína pVP2
representativa de cualquier cepa de IBDV, por ejemplo, la proteína
pVP2, longitud completa, de IBDV cepa Soroa [NCBI, número de acceso
AAD30136].
La proteína de VP3 de IBDV presente en la
VLP(-VP4) de la invención puede ser cualquier proteína VP3
representativa de cualquier cepa de IBDV, por ejemplo, la proteína
VP3, longitud completa, de IBDV cepa Soroa [NCBI, número de acceso
AAD30136].
En una realización particular, las VLPs(-VP4) de
la invención presentan un diámetro de 65-70 nm y un
contorno poligonal indistinguible de las VLPs de IBDV obtenidas en
otros sistemas de expresión (Figura 4C).
Las VLPs(-VP4) de la invención pueden obtenerse
mediante la expresión simultánea de dichas proteínas pVP2 y VP3 de
IBDV, en células huésped apropiadas. Dichas células huésped
apropiadas son células que contienen la secuencia de nucleótidos
codificante de la proteína pVP2 de IBDV y la secuencia de
nucleótidos codificante de la proteína VP3 de IBDV, bien en una
única construcción génica o bien en dos construcciones génicas. En
una realización particular, dichas células huésped apropiadas son
células transformadas, transfectadas o infectadas con un sistema de
expresión adecuado, tal como un sistema de expresión que comprende
una construcción génica, en donde dicha construcción génica
comprende la secuencia de nucleótidos que codifica para la proteína
pVP2 de IBDV y la secuencia de nucleótidos codificante de la
proteína VP3 de IBDV, o bien, alternativamente, con un sistema de
expresión que comprende una primera construcción génica que
comprende la secuencia de nucleótidos que codifica para la proteína
pVP2 de IBDV, y una segunda construcción génica que comprende la
secuencia de nucleótidos que codifica para la proteína VP3 de
IBDV.
Por tanto, en otro aspecto, la invención
proporciona un ácido nucleico cuya secuencia de nucleótidos
comprende la secuencia de nucleótidos que codifica para dicha
proteína pVP2 de IBDV y la secuencia de nucleótidos que codifica
para dicha proteína VP3 de IBDV, en forma de 2 genes
independientes. De forma más concreta, el ácido nucleico
proporcionado por esta invención se caracteriza porque su secuencia
de nucleótidos está constituida por (i) una secuencia de
nucléotidos que comprende la fase de lectura abierta correspondiente
a la proteína pVP2 de IBDV y (ii) una secuencia de nucléotidos que
comprende la fase de lectura abierta correspondiente a la proteína
VP3 de IBDV. Una característica del ácido nucleico proporcionado
por esta invención es que carece de la secuencia de nucléotidos que
comprende la fase de lectura abierta correspondiente a la proteína
VP4 de IBDV. Tal como se utiliza en esta descripción, el término
"fase de lectura abierta correspondiente a la proteína pVP2" o
"fase de lectura abierta correspondiente a la proteínas VP3 de
IBDV" incluye, además de las secuencias de nucleótidos de dichas
fases de lectura abierta, otras fases de lectura abiertas análogas
a las mismas codificantes de las proteínas pVP2 y VP3 de IBDV. El
término "análogo/a", tal como aquí se utiliza, pretende
incluir cualquier secuencia de nucleótidos que puede ser aislada o
construida sobre la base de la secuencia de nucleótidos
codificantes de pVP2 y VP3 de IBDV, por ejemplo, mediante la
introducción de sustituciones de nucleótidos conservativas o no
conservativas, incluyendo la inserción de uno o más nucleótidos, la
adición de uno o más nucleótidos en cualquiera de los extremos de
la molécula o la deleción de uno o más nucleótidos en cualquier
extremo o en el interior de la secuencia. En general, una secuencia
de nucleótidos análoga a otra secuencia de nucleótidos es
sustancialmente homóloga a dicha secuencia de nucleótidos. En el
sentido utilizado en esta descripción, la expresión
"sustancialmente homóloga" significa que las secuencias de
nucleótidos en cuestión tienen un grado de identidad, a nivel de
nucleótidos, de, al menos, un 60%, preferentemente de, al menos, un
80%, más preferentemente de, al menos, un 90% y, aún más
preferentemente de, al menos, un
95%.
95%.
En otro aspecto, la invención proporciona una
construcción génica que comprende un ácido nucleico
proporcionado por esta invención, es decir, un ácido nucleico cuya
secuencia de nucleótidos está constituida por (i) una secuencia de
nucléotidos que comprende la fase de lectura abierta correspondiente
a la proteína pVP2 de IBDV y (ii) una secuencia de nucléotidos que
comprende la fase de lectura abierta correspondiente a la proteína
VP3 de IBDV. Dicha construcción génica carece de la secuencia de
nucléotidos que comprende la fase de lectura abierta correspondiente
a la proteína VP4 de IBDV.
En otro aspecto, la invención proporciona un
sistema o vector de expresión seleccionado entre:
- a)
- un sistema de expresión que comprende una construcción génica proporcionada por esta invención, operativamente unida a unos elementos de control de transcripción y, opcionalmente, de traducción, en donde dicha construcción génica comprende la secuencia de nucleótidos que comprende la fase de lectura abierta correspondiente a la proteína pVP2 de IBDV y la secuencia de nucleótidos que comprende la fase de lectura abierta correspondiente a la proteína VP3 de IBDV; y
- b)
- un sistema de expresión que comprende dos construcciones génicas, una primera construcción génica que comprende la fase de lectura abierta correspondiente a la proteína pVP2 de IBDV, operativamente unida a unos elementos de control de transcripción y, opcionalmente, de traducción, y una segunda construcción génica que comprende la fase de lectura abierta correspondiente a la proteína VP3 de IBDV, operativamente unida a unos elementos de control de transcripción y, opcionalmente, de traducción.
En una realización particular, el sistema de
expresión proporcionado por esta invención comprende una
construcción génica que comprende (i) una secuencia de nucléotidos
que comprende la fase de lectura abierta o región codificante
correspondiente a la proteína pVP2 de IBDV y (ii) una secuencia de
nucléotidos que comprende la fase de lectura abierta o región
codificante correspondiente a la proteína VP3 de IBDV, en donde
dicha construcción génica está operativamente unida a unos
elementos de control de transcripción y, opcionalmente, de
traducción.
En otra realización particular, el sistema de
expresión proporcionado por esta invención comprende (i) una
primera construcción génica, operativamente unida a unos elementos
de control de transcripción y, opcionalmente, de traducción,
comprendiendo dicha primera construcción génica una secuencia de
nucléotidos que comprende la fase de lectura abierta o región
codificante correspondiente a la proteína pVP2 de IBDV, y (ii) una
segunda construcción génica, operativamente unida a unos elementos
de control de transcripción y, opcionalmente, de traducción,
comprendiendo dicha segunda construcción génica una secuencia de
nucléotidos que comprende la fase de lectura abierta o región
codificante correspondiente a la proteína VP3 de IBDV.
Los elementos de control de transcripción y,
opcionalmente, de traducción, presentes en el sistema de expresión
proporcionado por esta invención incluyen promotores, que dirigen
la transcripción de las secuencias de nucleótidos de interés a las
que están operativamente enlazados, y otras secuencias necesarias o
apropiadas para la transcripción y su regulación adecuada en tiempo
y lugar, por ejemplo, señales de inicio y terminación, sitios de
corte, señal de poliadenilación, origen de replicación, activadores
transcripcionales (enhancers), silenciadores transcripcionales
(silencers), etc.
Prácticamente cualquier sistema o vector de
expresión apropiado puede ser utilizado en la generación del
sistema de expresión proporcionado por esta invención. A modo
ilustrativo, dichos sistemas o vectores de expresión apropiados
pueden seleccionarse de acuerdo con las condiciones y necesidades
de cada caso concreto entre plásmidos, bácmidos, cromosomas
artificiales de levadura (YACS), cromosomas artificiales de
bacteria (BACs), cromosomas artificiales basados en el bacteriófago
P1 (PACs), cósmidos, o virus, que pueden contener, además, un
origen de replicación heterólogo, por ejemplo, bacteriano o de
levadura para que pueda ser amplificado en bacterias o levaduras,
así como un marcador utilizable para seleccionar las células
transfectadas diferente al gen o genes de interés. Estos sistemas o
vectores de expresión pueden ser obtenidos por métodos
convencionales conocidos por los técnicos en la materia [Sambrook,
J., Fritsch, E.F., and Maniatis, T. (1989). Molecular cloning: a
laboratory manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory] y forman
parte de la presente invención. En una realización particular,
dicho sistema o vector de expresión es un plásmido, tal como un
plásmido adecuado para transformar levaduras, por ejemplo, el
plásmido denominado
pESCURA/pVP2-VP3-GFP (Ejemplo 2), o
un virus, tal como un baculovirus recombinante (rBV), por ejemplo,
el rBV denominado FBD/pVP2-his-VP3
(Ejemplo 1.2), que expresa durante su ciclo de replicación ambas
proteínas (pVP2 de IBDV e his-VP3) simultáneamente
en células de insecto, o los rBVs denominados FB/pVP2 y
FB/his-VP3 (Ejemplo 1.1) que expresan las proteínas
pVP2 de IBDV e his-VP3, respectivamente, cuando
co-infectan células de insecto, obteniéndose
VLPs(-VP4) de IBDV.
En otro aspecto, la invención proporciona una
célula huésped que contiene la secuencia de nucleótidos
codificante de la proteína pVP2 de IBDV y la secuencia de
nucleótidos codificante de la proteína VP3 de IBDV, bien en una
única construcción génica o bien en dos construcciones génicas
diferentes. En una realización particular, dicha célula huésped es
una célula huésped transformada, transfectada o infectada con (i)
un sistema de expresión proporcionado por esta invención que
comprende bien una construcción génica, en donde dicha construcción
génica comprende la secuencia de nucleótidos que codifica para
dicha proteína pVP2 de IBDV y la secuencia de nucleótidos que
codifica para dicha proteína VP3 de IBDV, o bien, alternativamente,
con (ii) un sistema de expresión que comprende una construcción
génica que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica para
dicha proteína pVP2 de IBDV y otra construcción génica que
comprende la secuencia de nucleótidos que codifica para dicha
proteína VP3 de IBDV.
En una realización particular, la célula huésped
proporcionada por esta invención es una célula huésped
transformada, transfectada o infectada con un sistema de expresión
que comprende una construcción génica que comprende (i) una
secuencia de nucléotidos que comprende la fase de lectura abierta o
región codificante correspondiente a la proteína pVP2 de IBDV y
(ii) una secuencia de nucléotidos que comprende la fase de lectura
abierta o región codificante correspondiente a la proteína VP3 de
IBDV, en donde dicha construcción génica está operativamente unida a
unos elementos de control de transcripción y, opcionalmente, de
traducción.
En otra realización particular, la célula
huésped proporcionada por esta invención es una célula huésped
transformada, transfectada o infectada con una primera construcción
génica, operativamente unida a unos elementos de control de
transcripción y, opcionalmente, de traducción, comprendiendo dicha
primera construcción génica una secuencia de nucléotidos que
comprende la fase de lectura abierta o región codificante
correspondiente a la proteína pVP2 de IBDV, y con una segunda
construcción génica, operativamente unida a unos elementos de
control de transcripción y, opcionalmente, de traducción,
comprendiendo dicha segunda construcción génica una secuencia de
nucléotidos que comprende la fase de lectura abierta o región
codificante correspondiente a la proteína VP3 de IBDV.
Prácticamente cualquier célula huésped
susceptible de ser transformada, transfectada o infectada por un
sistema de expresión proporcionado por esta invención puede ser
utilizada, por ejemplo, células de mamífero, células aviares,
células de insecto, levaduras, etc.; no obstante, en una
realización particular, dicha célula huésped se selecciona entre
levaduras y células de insecto. Las levaduras son adecuadas por
razones de simplicidad y coste de producción. Las células de insecto
son adecuadas cuando el sistema de expresión comprende uno o dos
baculovirus recombinantes (rBV). El empleo de rBV es ventajoso por
cuestiones de bioseguridad relacionadas con el rango de huésped de
los baculovirus, incapaces de replicar en otros tipos celulares que
no sean de insecto.
En una realización particular, la invención
proporciona una célula huésped, tal como una levadura, por ejemplo,
Saccharomyces cerevisae, Saccharomyces pombe, etc.,
transformada con un sistema de expresión, tal como un plásmido o un
vector de expresión, que comprende una construcción génica
proporcionada por esta invención que comprende la secuencia de
nucleótidos que codifica para dicha proteína pVP2 de IBDV y la
secuencia de nucleótidos que codifica para la proteína VP3 de
IBDV.
En otra realización particular, la invención
proporciona una célula huésped, tal como una célula de insecto,
infectada con un sistema de expresión, tal como un baculovirus
recombinante, que comprende una construcción génica proporcionada
por esta invención que comprende la secuencia de nucleótidos que
codifica para dicha proteína pVP2 de IBDV y la secuencia de
nucleótidos que codifica para la proteína VP3 de IBDV.
En otra realización particular, la invención
proporciona una célula huésped, tal como una célula de insecto,
co-infectada con un sistema de expresión que
comprende un primer baculovirus recombinante que comprende una
construcción génica proporcionada por esta invención que comprende
la secuencia de nucleótidos que codifica para dicha proteína pVP2
de IBDV y con un segundo baculovirus recombinante que comprende una
construcción génica proporcionada por esta invención que comprende
la secuencia de nucleótidos que codifica para la proteína VP3 de
IBDV.
En otro aspecto, la invención proporciona un
procedimiento para la producción de VLPs(-VP4) de la
invención que comprende cultivar una célula huésped
proporcionada por esta invención que contiene la secuencia de
nucleótidos codificantes de dicha proteína pVP2 de IBDV y la
secuencia de nucleótidos codificante de dicha proteína VP3 de IBDV,
bien en una única construcción génica o bien en dos construcciones
génicas diferentes, y que expresa simultáneamente dichas proteínas
pVP2 y VP3 de IBDV, y, si se desea, recuperar dichas VLPs(-VP4) de
la invención. En una realización particular, dicha célula huésped
proporcionada por esta invención es una célula transformada,
transfectada o infectada con un sistema de expresión adecuado, tal
como un sistema de expresión que comprende una construcción génica,
en donde dicha construcción génica comprende la la secuencia de
nucleótidos que codifica para dicha proteína pVP2 de IBDV y la
secuencia de nucleótidos que codifica para dicha proteína VP3 de
IBDV, o bien, alternativamente, con un sistema de expresión que
comprende una primera construcción génica que comprende la
secuencia de nucleótidos que codifica para dicha proteína pVP2 de
IBDV y una segunda construcción génica que comprende la secuencia
de nucleótidos que codifica para dicha proteína VP3 de IBDV.
Dicho procedimiento comprende, por tanto, la
co-expresión génica de dichas proteínas pVP2 y VP3
de IBDV como dos genes independientes. Tras la expresión simultánea
de dichas proteínas (pVP2 y VP3 de IBDV) en dichas células, las
proteínas expresadas se ensamblan y forman las VLPs(-VP4) de la
invención, las cuales pueden ser aisladas o retiradas del medio, y,
si se desea, purificadas. El aislamiento y purificación de dichas
VLPs(-VP4) de la invención puede realizarse por métodos
convencionales, por ejemplo, mediante fraccionamiento en gradientes
de sacarosa.
En una realización particular, la
co-expresión génica de las proteínas pVP2 y VP3 de
IBDV se realiza mediante el empleo de un rBV que permite la
expresión simultánea de dichas proteínas a partir de dos genes
quiméricos independientes en células de insecto. En este caso, la
producción de VLPs(-VP4) de la invención puede realizarse mediante
un procedimiento que comprende, en primer lugar, la obtención de un
sistema de expresión génica constituido por un rBV que contiene una
construcción génica que codifica simultáneamente para dichas
proteínas pVP2 y VP3 de IBDV, tal como el rBV denominado
FBD/pVP2-his-VP3 (Ejemplo 1.2) o
bien, alternativamente, la obtención de un rBV que contiene una
construcción genica que codifica para la proteína pVP2 de IBDV y la
obtención de otro rBV que contiene una construcción génica que
codifica para dicha proteína VP3 de IBDV, tales como los rBVs
denominados FB/pPV2 y FB/his-VP3 (Ejemplo 1.1),
seguido de la infección de células de insecto con dicho sistema de
expresión basado en dicho(s) baculovirus
recombinante(s), expresión de las proteínas recombinantes y,
si se desea, aislamiento de las VLPs(-VP4) de la invención formadas
por ensamblaje de dichas proteínas pVP2 y VP3 de IBDV, y,
opcionalmente, purificación posterior de dichas VLPs(-VP4) de la
invención.
La construcción de un baculovirus recombinante
que permite la expresión de forma independiente de las proteínas
pVP2 y VP3 de IBDV se puede realizar por cualquier experto en la
materia en base a lo aquí descrito y al estado de la técnica sobre
esta tecnología (Cold Spring Harbor, N.Y.; Leusch MS, Lee SC, Olins
PO. 1995. A novel host-vector system for direct
selection of recombinant baculoviruses (bacmids) in Escherichia
coli. Gene 160: 191-4; Luckow VA, Lee SC, Barry
GF, Olins PO. 1993. Efficient generation of infectious recombinant
baculoviruses by site-specific
transposon-mediated insertion of foreign genes into
a baculovirus genome propagated in Escherichia coli. J Virol
67: 4566-79).
En otra realización particular, la
co-expresión génica de las proteínas pVP2 y VP3 de
IBDV se realiza mediante el empleo de un vector que permite la
expresión de dichas proteínas en células de levadura. En este caso,
la producción de VLPs(-VP4) de la invención puede llevarse a cabo
mediante un procedimiento que comprende, en primer lugar, la
obtención de un sistema de expresión génica constituido por un
plásmido que contiene una construcción génica que codifica
simultáneamente para las proteínas pVP2 y VP3 de IBDV, seguido de
la transformación de levaduras con dicho sistema de expresión,
expresión de las proteínas recombinantes y, si se desea, aislamiento
de las VLPs(-VP4) de la invención formadas por ensamblaje de dichas
proteínas pVP2 y VP3 de IBDV, y, opcionalmente, purificación
posterior de dichas VLPs(-VP4) de la invención. En una realización
concreta, el sistema de expresión adecuado para transformar
levaduras está basado en un sistema de expresión pESC Yeast
(Stratagene) tal como, por ejemplo, el plásmido
pESCURA/pVP2/VP3-GFP (Ejemplo 2) que contiene una
construcción génica que codifica para las proteínas pVP2 de IBDV y
VP3-GFP.
La obtención de levaduras transformadas con una
construcción génica o con un sistema o vector de expresión
apropiado que permite la expresión simultánea de las proteínas pVP2
y VP3 de IBDV se puede realizar por cualquier experto en la materia
en base a lo aquí descrito y al estado de la técnica sobre esta
tecnología @ESC epitope tagging vectors Instructions manual.
Stratagene www.stratagene.com; Sambrook, J., Fritsch, E.F.,
and Maniatis, T. (1989). Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd
ed. Cold Spring Harbor Laboratory).
En otro aspecto, la invención se relaciona con
el empleo del sistema de expresión génica proporcionado por
esta invención para la producción y obtención de VLPs(-VP4) de la
invención.
Las VLPs(-VP4) de la invención pueden ser
utilizadas para inmunizar animales, en particular, aves, per
se o como vectores o vehiculizadores de moléculas con actividad
biológica, por ejemplo, polipéptidos, proteínas, ácidos nucleicos,
fármacos, etc., por lo que pueden ser utilizadas con fines
terapéuticos o de diagnóstico. En una realización particular, dichas
moléculas con actividad biológica incluyen antígenos o inductores de
respuestas inmune en animales o humanos a los que se suministre, o
bien fármacos que se liberan en su sitio de acción específico, o
bien secuencias de ácido nucleico, todas ellas útiles en terapia
génica y destinadas a
\hbox{ser introducidas en el interior de
las células apropiadas.}
Por tanto, en otro aspecto, la invención se
relaciona con el empleo de las VLPs(-VP4) de la invención en la
elaboración de medicamentos tales como, vacunas, vectores para
terapia génica (delivery systems), etc. En una realización
particular, dicho medicamento es una vacuna destinada a conferir
protección a animales, en particular, aves, frente al virus
causante de la bursitis infecciosa (IBDV). En otra realización
particular, dicho medicamento es un vector para terapia génica.
En otro aspecto, la invención proporciona una
vacuna que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de
VLPs(-VP4) de la invención, junto con, opcionalmente, uno o más
adyuvantes y/o vehículos farmacéuticamente aceptables. Dicha vacuna
es útil para proteger animales, en particular, aves, frente al
virus causante de la bursitis infecciosa (IBDV). En una realización
particular, dichas aves se seleccionan del grupo formado por
pollos, pavos, ocas, gansos, faisanes, codornices y avestruces. En
una realización preferida, la vacuna proporcionada por esta
invención es una vacuna útil para proteger pollos de la infección
causada por IBDV.
En el sentido utilizado en esta descripción, la
expresión "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a la
cantidad de VLPs(-VP4) de la invención calculada para producir el
efecto deseado y, en general, vendrá determinada, entre otras
causas, por las características propias de las VLPs(-VP4) y el
efecto de inmunización a conseguir.
Los adyuvantes y vehículos farmacéuticamente
aceptables que pueden ser utilizados en dichas vacunas son los
adyuvantes y vehículos conocidos por los técnicos en la materia y
utilizados habitualmente en la elaboración de vacunas.
En una realización particular, dicha vacuna se
prepara en forma de una solución o suspensión acuosa, en un
diluyente farmacéuticamente aceptable, tal como solución salina,
solución salina tamponada con fosfato (PBS), o cualquier otro
diluyente farmacéuticamente aceptable.
La vacuna proporcionada por esta invención puede
ser administrada por cualquier vía de administración apropiada que
dé como resultado una respuesta inmune protectora frente a la
secuencia heteróloga o epítopo utilizado, para lo cual dicha vacuna
se formulará en la forma farmacéutica adecuada a la vía de
administración elegida. En una realización particular, la
administración de la vacuna proporcionada por esta invención se
efectúa por vía parenteral, por ejemplo, por vía intraperitoneal,
subcutánea, etc.
Los siguientes ejemplos ilustran la invención y
no deben ser considerados en sentido limitativo de la misma.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
En este ejemplo se describen los resultados de
una serie de experimentos diseñados para analizar la posibilidad de
obtener VLPs de IBDV a partir de una estrategia que evita la
síntesis de la poliproteína de IBDV y, por tanto, la presencia de la
proteasa VP4 durante el proceso de ensamblaje. El diseño
experimental se basa en la coexpresión de las proteínas pVP2 y VP3
de IBDV a partir de dos genes quiméricos independientes. Para ello,
se han utilizado dos baculovirus recombinantes (rBVs) descritos
previamente, FB/his-VP3 (Kochan, G., González, D.
& Rodríguez, J. F. (2003). Characterization of the RNA binding
activity of VP3, a major structural protein of IBDV. Archives of
Virology 148, 723-744) y FB/VPX [también
identificado como FB/pVP2 en esta descripción]
(Martínez-Torrecuadrada, J. L., Castón, J. R.,
Castro, M., Carrascosa, J. L., Rodríguez, J. F. & Casal, J. I.
(2000). Different architectures in the assembly of infectious
bursal disease virus capsid proteins expressed in insect cells.
Virology 278, 322-331). Estos rBVs fueron
generados mediante el clonaje en vectores apropiados de los DNA
complementarios (cDNAs) codificadores de las proteínas pVP2 y pVP3
de IBDV. Dichos cDNAs fueron obtenidos por RT-PCR a
partir del segmento A del genoma de IBDV serotipo I cepa Soroa
(número de acceso al NCBI, AAD30136). El rBV
FB/his-VP3 expresa una proteína VP3 quimérica que en
su extremo N-terminal contiene un tandem de 6
histidinas fusionadas a la secuencia de VP3
(Met754-G1u1012 de la poliproteína) denominada
his-VP3. El rBV FB/pVP2 expresa la región
codificadora de la proteína pVP2 (Met1-A1a512).
El análisis de la expresión de estas proteínas
pVP2 y his-pVP3, bien de forma independiente o
conjunta, se realizó en cultivos celulares. Para la realización de
estos experimentos, se utilizaron cultivos en monocapa de células
procedentes del insecto Trichloplusia ni (H5, Invitrogen)
que fueron crecidos sobre cubreobjetos de cristal. Dichos cultivos
fueron infectados independientemente con FB/pVP2,
FB/his-VP3, o co-infectados con
ambos rBVs. La multiplicidad de infección fue de 5 unidades
formadoras de placa (ufp)/célula. A las 48 horas después de la
infección (hpi) las células fueron fijadas, e incubadas con sueros
policlonales de conejo anti-VP2 y con sueros
policlonales de rata anti-VP3
(Fernández-Arias, A., Risco, C., Martínez, S.,
Albar, J. P. & Rodríguez, J. F. (1998). Expression of ORF A1 of
infectious bursal disease virus infectious bursal disease virus
results in the formation of virus-like particles.
Journal of General Virology 79, 1047-1054).
Después de sucesivos lavados, los cubreobjetos fueron incubados con
sueros de cabra anti-rata conjugado con Alexa 594 y
con sueros de cabra anti-conejo conjugado a Alexa
488 (Jackson Immunoresearch Laboratories, Inc.). Los núcleos
celulares fueron teñidos con el marcador especifico
To-Pro-3 (Molecular Probes, Inc.).
Finalmente, las muestras se visualizaron por epifluorescencia con
un microscopio Zeiss Axiovert 200 equipado con el sistema confocal
Bio Rad Radiance 2100. Las imágenes obtenidas se almacenaron
utilizando el equipo de software Laser Sharp Package (Bio Rad).
Como se muestra en la Figura 2a, en los cultivos infectados con
FB/pVP2 el suero anti-VP2 mostró una señal granular
fina mezclada con estructuras tubulares ambas distribuidas en todo
el citoplasma. La señal anti-VP3, detectada en las
células infectadas con el rBV FB/his-VP3, se
caracterizó por la presencia de acumulaciones de forma esférica
alrededor del núcleo y, aparentemente, huecas. En los cultivos
coinfectados con ambos rBV se detectó una notable modificación en
el patrón de distribución de ambas proteínas. En estas células, las
señales específicas de pVP2 y VP3 se colocalizaron en acumulaciones
esféricas y densas, sugiriendo que su coexpresión permitía la
formación de complejos pVP2/his- VP3 (Figura 2c a la 2e).
Con la intención de caracterizar estas
estructuras en mayor detalle, extractos similares, correspondientes
a células infectadas con FB/pVP2+FB/hisVP3 fueron analizados por
microscopía electrónica de transmisión (TEM). Como control, y en
paralelo, se analizaron por la misma técnica cultivos de células H5
infectadas con la cepa silvestre del virus FBD (FastBacDual,
Invitrogen). Después de la infección, las células fueron recogidas a
las 48 h, y procesadas como se ha descrito previamente
(Fernández-Arias A, Risco C, Martínez S, Albar JP
& Rodríguez JF. (1998). Expression of ORF A1 of infectious
bursal disease virus infectious bursal disease virus results in the
formation of virus-like particles. Journal of
General Virology 79:1047-1054) para su análisis
en cortes ultrafinos por TEM. Como se muestra en la Figura 2, el
citoplasma de las células coinfectadas contiene agregados formados
por una mezcla de túbulos y estructuras similares a cápsidas
(Figura 2g, 2h y 2i). Estos agregados no fueron observados en
ningún caso en las muestras correspondientes a células infectadas
con el virus silvestre FBD (Figura 2f). El aspecto y el tamaño de
los túbulos, así como de las estructuras similares a cápsidas fue
semejante a los descritos previamente en cultivos celulares
infectados con VT7/Poly, un recombinante del virus vaccinia que
expresa el gen de la poliproteína de IBDV
(Fernández-Arias A, Risco C, Martínez S, Albar JP
& Rodríguez JF. (1998). Expression of ORF A1 of infectious
bursal disease virus infectious bursal disease virus results in the
formation of virus-like particles. Journal of
General Virology 79:1047-1054).
Para establecer de forma inequívoca que la
coexpresión de pVP2 e his-VP3 permitía el
ensamblaje y, por tanto, la obtención de VLPs-(VP4), se decidió
purificar las partículas formadas. Para ello, se infectaron con
FB/pVP2+FB/his-VP3 cultivos de células H5. 60 hpi,
las células se homogeneizaron y los extractos se separaron en
gradientes de sacarosa tal y como se ha descrito previamente
(Lombardo E, Maraver A, Castón JR, Rivera J,
Fernández-Arias A, Serrano A, Carrascosa JL &
Rodríguez JF. (1999). VP1, the putative
RNA-dependent RNA polymerase of infectious bursal
disease virus, forms complexes with the capsid protein VP3, leading
to efficient encapsidation into virus-like
particles. Journal of Virology 73:6973-6983).
Después de su centrifugación, los gradientes fueron fraccionados, y
las distintas fracciones fueron analizadas por TEM tal como se ha
descrito previamente (Lombardo E et al., citado
supra). Como control, y sujetos al mismo procedimiento, se
fraccionaron gradientes correspondientes a extractos de células
infectadas con el rBV FB/VPX o con el rBV
FBD/Poly-VP1. El virus recombinante
FBD/Poly-VP1 expresa simultáneamente la
poliproteína y el polipéptido VP1. Como era predecible, la infección
con FBD/Poly-VP1 tenía como resultado una eficiente
producción de VLPs (Maraver A, Oña A, Abaitua F, González D,
Clemente R, Díaz-Ruiz A, Castón JR, Pazos F &
Rodríguez JF. (2003). The oligomerization domain of VP3, the
scaffolding protein of infectious bursal disease virus, plays a
critical role for capsid formation. Journal of Virology
77:6438-49). Por otra parte, las fracciones
correspondientes a las células infectadas con FB/VPX sólamente
contenían túbulos de aspecto retorcido. Los gradientes
correspondientes a células coinfectadas con los rBVs
FB/pVP2+FB/his-VP3 contenían túbulos rígidos de
tipo I en las fracciones cercanas al fondo del gradiente, y
VLPs-(VP4) en las centrales y en las fracciones superiores (Figura
3b). Las VLPs-(VP4) aisladas de las células
co-infectadas con rBV
FB/pVP2+FB/his-VP3 tenían un diámetro de
65-70 nm, así como un contorno poligonal
característico, absolutamente indistinguible de las VLPs
purificadas de cultivos infectados con FBD/Poly-VP1
(Maraver, A., Oña, A., Abaitua, F., González, D., Clemente, R.,
Díaz-Ruiz, A., Castón, J. R., Pazos, F. &
Rodríguez, J. F. (2003). The oligomerization domain of VP3, the
scaffolding protein of infectious bursal disease virus, plays a
critical role for capsid formation. Journal of Virology
77:6438-49) o de los cultivos infectados con
VT7/Poly (Fernández-Arias, A., Risco, C., Martínez,
S., Albar, J. P. & Rodríguez, J. F. (1998). Expression of ORF A1
of infectious bursal disease virus infectious bursal disease virus
results in the formation of virus-like particles.
Journal of General Virology 79,
1047-1054).
Con la intención de conseguir una
caracterización bioquímica del material obtenido, se realizaron
experimentos de western-blot en los que las
distintas fracciones se enfrentaron a sueros específicos contra las
proteínas VP1, pVP2, VP3 y VP4 (Fernández-Arias
et al. 1998, Lombardo et al., 2000). Como control se
utilizaron extractos de células infectadas con IBDV. Los resultados
obtenidos se muestran en la Figura 3d. Como se esperaba, las bandas
correspondientes a los polipéptidos VP1 y VP4 sólo fueron
detectadas en muestras correspondientes a células infectadas con
FBD/Poly-VP1. Los patrones correspondientes a
pVP2/VP3 en muestras correspondientes a células infectadas con
FBD/Poly-VP1 o coinfectadas con FB/VPX+
FB/his-VP3 fueron similares, detectándose dos
bandas correspondientes a pVP2 y VP3, respectivamente.
Además, se procedió a la construcción del
plásmido pFBD/pVP2-his-VP3. El
primer paso de la construcción se realizó mediante el clonaje de la
región codificante de la proteína pVP2 en el vector pFBDual
(Invitrogen). El fragmento de DNA correspondiente a pVP2 se obtuvo
mediante PCR con los oligonucleótidos identificados como Oligo I
(SEQ ID NO: 1) y Oligo II (SEQ ID NO: 2) empleando como molde el
plásmido pVOTE.2/Poly (Fernández-Arias, A., Risco,
C., Martinez, S., Albar, J. P. & Rodríguez, J. F. (1998).
Expression of ORF A1 of infectious bursal disease virus infectious
bursal disease virus results in the formation of
virus-like particles. Journal of General
Virology 79, 1047-1054). El fragmento fue
purificado, sometido a digestión con los enzimas BglII y HindIII y
clonado en el vector pFBDual (Invitrogen) previamente digerido con
los enzimas BamHI y HindIII. El plásmido resultante se denominó
pFBD/pVP2. A continuación, se obtuvo un fragmento de DNA conteniendo
la fase de lectura abierta correspondiente a la proteína VP3
mediante digestión del plásmido pFB/his-VP3 (Kochan
et al., 2003, citado supra) con el enzima RsrII,
tratamiento con Klenow, y posterior restricción con KpnI. Este
fragmento de DNA fue purificado y clonado en el plásmido pFBD/pVP2
previamente digerido con los enzimas SmaI y KpnI. El plásmido
resultante se denominó
pFBD/pVP2-his-VP3 (SEQ ID NO: 3) y
contiene la secuencia de nucleótidos codificante de las proteínas
pVP2 e his-pVP3 (esta última está codificada por la
cadena complementaria a los nucleótidos 6734-7585 de
la SEQ ID NO: 3). La secuencia de aminoácidos de la proteína pVP2
codificada por la secuencia de nucleótidos contenida en dicho
plásmido pFBD/pVP2-his-VP3 se
muestra en la SEQ ID NO: 4.
El plásmido
pFBD/pVP2-his-VP3 permite la
obtención de un rBV, denominado
FBD/pVP2-his-VP3, que expresa
durante su ciclo de replicación ambas proteínas simultáneamente
[http://invitrogen.com/content/sfs/manuals/bevtest.
pdf].
pdf].
Los resultados obtenidos con
FBD/pVP2-his-VP3 son idénticos a los
obtenidos mediante la coinfección con los rBVs FB/pVP2 y
FD/his-VP3, obteniéndose VLPs(-VP4) de IBDV.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
Con el fin de estudiar la posibilidad de obtener
VLPs(-VP4) de IBDV en cultivos de levadura (Saccharomyces
cerevisiae) se generó el vector
pESCURA/pVP2-VP3-GFP con el gen
heterólogo GFP unido al extremo N-terminal de VP3.
El primer paso en la construcción del vector se realizó mediante el
clonaje de la región codificante de la proteína pVP2 de IBDV en el
vector pESCURAinv. El plásmido pESCURAinv se generó mediante
digestión del vector pRS426 (Stratagene) con el enzima PvuII y
religación de la mezcla de digestión. El vector resultante,
pESCURAinv, contiene la región de clonaje múltiple en posición
invertida con respecto a la del vector parental pRS426. El
fragmento de DNA correspondiente a la proteína pVP2 se obtuvo
mediante PCR con los oligonucleótidos denominados Oligo III (SEQ ID
NO: 5) y Oligo IV (SEQ ID NO: 6) empleando como molde el plásmido
pVOTE.2/Poly (Fernández-Arias, A., Risco, C.,
Martínez, S., Albar, J. P. & Rodríguez, J. F. (1998). Expression
of ORF A1 of infectious bursal disease virus infectious bursal
disease virus results in the formation of
virus-like particles. Journal of General
Virology 79, 1047-1054). El fragmento fue
purificado, sometido a digestión con los enzimas BglII y HindIII y
clonado en el vector pESCURA.inv previamente digerido con los
enzimas BamHI y HindIII. El plásmido resultante se denominó
pESCURA/pVP2.
El plásmido pFB/VP3-GFP fue
construido en dos etapas. La primera consistió en el clonaje de una
fragmento de DNA, generado mediante PCR, que contiene la ORF de la
proteína VP3 de IBDV carente del codón de terminación. Esta PCR se
realizó utilizando los oligonucleótidos denominados Oligo V (SEQ ID
NO: 7) y Oligo VI (SEQ ID NO: 8) y empleando como molde el plásmido
pVOTE.2/Poly (Fernández-Arias, A., Risco, C.,
Martínez, S., Albar, J. P. & Rodríguez, J. F. (1998). Expression
of ORF A1 of infectious bursal disease virus results in the
formation of virus-like particles. Journal of
General Virology 79, 1047-1054). El DNA
resultante fue digerido con los enzimas EcoRI y BamHI y clonado en
el vector pEGFP-N3 (Clontech) también digerido con
los mismos enzimas. El plásmido resultante se denominó
pVP3-GFP. A continuación, el plásmido
pEGFP-GFP fue digerido con los enzimas EcoRI y NotI
y clonado en el vector pFastBac1 (Invitrogen). El plásmido
resultante se denominó pFB/VP3-GFP.
A continuación, se obtuvo un fragmento de DNA
que contenía la fase de lectura abierta correspondiente a la
proteína VP3 de IBDV fusionada a la región codificante de la
proteína EGFP mediante digestión del plásmido
pFB/VP3-GFP con los enzimas EcoRI y NotI. Este
fragmento de DNA fue purificado y clonado en el plásmido
pESCURA/pVP2 previamente digerido con los enzimas EcoRI y NotI. El
plásmido resultante se denominó
pESCURA/pVP2-VP3-GFP (SEQ ID NO: 9)
y contiene las ORFs de las proteínas pVP2 y VP3-GFP
bajo el control transcripcional de dos promotores independientes,
GAL 1 y GAL 10, ambos inducibles por galactosa (la proteína pVP2
está codifica por la cadena de nucleótidos complementaria a los
nucleótidos 5862-7343 de la SEQ ID NO: 9). La
secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión
VP3-GFP codificada por la secuencia de nucleótidos
contenida en dicho plásmido
pESCURA/pVP2-VP3-GFP se muestra en
la SEQ ID NO: 10.
Posteriormente,
pESCURA/pVP2-VP3-GFP se empleó para
transformar un cultivo de la levadura S. cerevisiae haploide
cepa 499 de acuerdo con un protocolo previamente descrito (Gietz,
R.D. and R.A. Woods. (2002), Transformation of yeast by the Liac/SS
carrier DNA/PEG method. Methods in Enzymology
350:87-96). Las levaduras transformadas con el
plásmido fueron seleccionadas mediante crecimiento en placas de
medio SC (CSM + YNB, glucosa 2% y bacto agar) suplementadas con los
aminoácidos triptófano, leucina e histidina y carentes de uracilo
(-Ura). Tras una incubación de 48 h a 30ºC, se seleccionó una
colonia que fue empleada para la realización de los subsiguientes
análisis de expresión de proteínas y formación de VLPs-(VP4).
El análisis de la expresión de las proteínas
pVP2 y VP3 y formación de VLPs-(VP4) se realizó siguiendo un
protocolo descrito previamente para la caracterización de VLPs de
IBDV en otros sistemas de expresión
(Fernández-Arias, A., Risco, C., Martínez, S.,
Albar, J. P. & Rodríguez, J. F. (1998). Expression of ORF A1 of
infectious bursal disease virus results in the formation of
virus-like particles. Journal of General
Virology 79, 1047-1054; Lombardo, E., Maraver,
A., Castón, J. R., Rivera, J., Fernández-Arias, A.,
Serrano, A., Carrascosa, J. L. & Rodríguez, J. F. (1999). VP1,
the putative RNA-dependent RNA polymerase of
infectious bursal disease virus, forms complexes with the capsid
protein VP3, leading to efficient encapsidation into
virus-like particles. Journal of Virology 73,
6973-698). La colonia seleccionada fue cultivada en
medio liquido CSM (-Ura) + YNB suplementado con rafinosa al 2%. El
cultivo se incubó a 30ºC durante 24 h. Este cultivo fue empleado
para inocular, a una densidad óptica (D.O.) de 0,2, un matraz de
200 ml de medio CSM (-Ura) + YNB suplementado con el inductor
galactosa al 2%. El cultivo fue mantenido a 30ºC durante 18 horas
(hasta una D.O. entre 1,0 y 2,0). Las levaduras fueron centrifugadas
a 3.000 rpm, 5 minutos a 4ºC, se lavaron con agua destilada una
vez, y el pellet fue resuspendido en tampón de Tisis (TEN: Tris 10
mM, pH 8,0; NaCl 150 mM; EDTA 1 mM) + inhibidores de proteasas 2X
(Compl Roche). Para la lisis se añadió un volumen de "glass
beads" (cuentas o perlas de vidrio) de un tamaño aproximado de
425-600 micrones (Sigma).
Esta mezcla fue sometida al vortex vigoroso
durante 30 segundos 4 veces, con intervalos de 30 segundos, y todo
ello a 4ºC. Tras ello se recuperó la fracción soluble por
centrifugación de la mezcla de lisis a 13.000 rpm durante 15 minutos
a 4ºC. Esta muestra fue sometida a fraccionamiento en un gradiente
de sacarosa de acuerdo con un protocolo previamente descrito
(Lombardo, E., Maraver, A., Castón, J. R., Rivera, J.,
Fernández-Arias, A., Serrano, A., Carrascosa, J. L.
& Rodríguez, J. F. (1999). VP1, the putative
RNA-dependent RNA polymerase of infectious bursal
disease virus, forms complexes with the capsid protein VP3, leading
to efficient encapsidation into virus-like
particles. Journal of Virology 73,
6973-6983). Las muestras obtenidas tras el
fraccionamiento así como una muestra del material de partida fueron
analizadas mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con
dodecilsulfato sódico (SDS-PAGE) [Current Protocols
in Molecular Biology] e inmunodetección por Western blot (Figura
4A) empleando sueros anti-pVP2 y
anti-VP3 [Current Protocols in Molecular Biology].
Como se muestra en la Figura 4A, el Western blot reveló la presencia
de bandas, con la masa molecular predicha correspondiente a las
proteínas pVP2 (48 kDa) y VP3-GFP (61 kDa), así
como otras bandas inmunoreactivas de menor tamaño producidas
probablemente por degradación proteolítica tanto en la muestra
inicial como en las diferentes fracciones del gradiente. Estos
resultados demostraron de forma fehaciente la correcta expresión de
ambos polipéptidos en el cultivo de S. cerevisiae
transformado con el plásmido pESCURA/pVP2-VP3. A
continuación, las distintas fracciones del gradiente fueron
analizadas mediante TEM tal como se ha descrito previamente
(Lombardo, E., Maraver, A., Castón, J. R., Rivera, J.,
Fernández-Arias, A., Serrano, A., Carrascosa, J. L.
& Rodríguez, J. F. (1999). VP1, the putative
RNA-dependent RNA polymerase of infectious bursal
disease virus, forms complexes with the capsid protein VP3, leading
to efficient encapsidation into virus-like
particles. Journal of Virology 73,
6973-6983). Como se muestra en la Figura 4B, el
análisis mediante TEM de las fracciones del gradiente reveló la
existencia de VLPs de IBDV en la fracciones superiores del
gradiente. Estas VLPs, VLPs(-VP4), presentan un diámetro de
65-70 nm y un contorno poligonal indistinguible de
las VLPs de IBDV obtenidas en otros sistemas de expresión (Figura
4C).
<110> CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES
CIENTÍFICAS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<110> BIONOSTRA, S.L.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> CÁPSIDAS VACÍAS (VLPs(-VP4)) DEL
VIRUS CAUSANTE DE LA ENFERMEDAD DE LA BURSITIS INFECCIOSA (IBDV), SU
PROCEDIMIENTO DE OBTENCIÓN Y APLICACIONES
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> VLPs(-VP4)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligo I
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcgcagatct atgacaaacc tgtcagatca aaccc
\hfill35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligo II
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcgcaagctt aggcgagagt cagctgcctt atgc
\hfill34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7595
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Plásmido
pFBD/pVP2-his-VP3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> promotor
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (157)..(285)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Promotor ppolh
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (291)..(1289)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> pVP2 ORF
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> promotor
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (7443)..(7503)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Promotor p10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 333
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Plásmido
pFBD/pVP2-his-VP3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligo III
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcgcagatct atgacaaacc tgtcagatca aaccc
\hfill35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligo IV
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcgcaagctt aggcgagagt cagctgcctt atgc
\hfill34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligo V
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcgcgaattc gatggcatca gagttcaaag aga
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligo VI
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgcggatccc tcaaggtcct catcagagac gg
\hfill32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9600
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Plásmido
pESCURA/pVP2-VP3-GFP
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> promotor
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (5649)..(5859)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Promotor GAL 1 (pVP2)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> promotor
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (7402)..(8080)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Promotor GAL 2
(VP3-GFP)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (8086)..(9597)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> VP3-GFP ORF
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 503
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Plásmido
pESCURA/pVP2-VP3-GFP
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
Claims (19)
1. Una cápsida vacía del virus causante de la
enfermedad de la bursitis infecciosa (IBDV), VLP(-VP4),
caracterizada porque está constituida, únicamente, por
ensamblaje de proteínas pVP2 de IBDV y proteínas VP3 de IBDV.
2. Un ácido nucleico caracterizado porque
su secuencia de nucleótidos está constituida por (i) una secuencia
de nucléotidos que comprende la fase de lectura abierta
correspondiente a la proteína pVP2 de IBDV y (ii) una secuencia de
nucléotidos que comprende la fase de lectura abierta
correspondiente a la proteína VP3 de IBDV.
3. Una construcción génica que comprende un
ácido nucleico según la reivindicación 2.
4. Un sistema de expresión seleccionado
entre:
- a)
- un sistema de expresión que comprende (i) una construcción génica que comprende la fase de lectura abierta correspondiente a la proteína pVP2 de IBDV, operativamente unida a unos elementos de control de transcripción y, opcionalmente, de traducción, y (ii) una construcción génica que comprende la fase de lectura abierta correspondiente a la proteína VP3 de IBDV, operativamente unida a unos elementos de control de transcripción y, opcionalmente, de traducción; y
- b)
- un sistema de expresión que comprende una construcción génica según la reivindicación 3, operativamente unida a unos elementos de control de transcripción y, opcionalmente, de traducción.
5. Sistema de expresión según la reivindicación
4, caracterizado porque se selecciona entre plásmidos,
bácmidos, cromosomas artificiales de levadura (YACs), cromosomas
artificiales de bacteria (BACs), cromosomas artificiales basados en
el bacteriófago P1 (PAC), cósmidos, y virus, que pueden contener,
opcionalmente, un origen de replicación heterólogo.
6. Una célula huésped que contiene un ácido
nucleico según la reivindicación 2, o una construcción génica según
la reivindicación 3, o un sistema de expresión según cualquiera de
las reivindicaciones 4 ó 5.
7. Una célula huésped transformada, transfectada
o infectada con un sistema de expresión según cualquiera de las
reivindicaciones 4 ó 5.
8. Célula huésped según la reivindicación 6 ó 7,
caracterizada porque es una célula de insecto o una
levadura.
9. Un procedimiento para la producción de
cápsidas vacías del virus causante de la enfermedad de la bursitis
infecciosa (IBDV), VLPs(-VP4), según la reivindicación 1, que
comprende cultivar una célula huésped según cualquiera de las
reivindicaciones 6 a 8, y, si se desea, recuperar dichas cápsidas
vacías de IBDV.
10. Procedimiento según la reivindicación 9, en
el que dicha célula huésped es una célula de insecto, que comprende
las etapas de:
- a)
- preparar un sistema de expresión seleccionado entre:
- -
- un sistema de expresión constituido por un baculovirus recombinante que contiene una construcción génica según la reivindicación 3, operativamente unida a unos elementos de control de transcripción y, opcionalmente, de traducción; y
- -
- un sistema de expresión constituido por (i) un baculovirus recombinante que contiene una construcción génica que comprende la fase de lectura abierta correspondiente a la proteína pVP2 de IBDV, y (ii) un baculovirus recombinante que contiene una construcción génica que comprende la fase de lectura abierta correspondiente a la proteína VP3 de IBDV;
- b)
- infectar células de insecto con dicho sistema de expresión preparado en la etapa a);
- c)
- cultivar las células de insecto infectadas obtenidas en la etapa b) bajo condiciones que permiten la expresión de las proteínas recombinantes y su ensamblaje para formar cápsidas vacías, VLPs(-VP4), de IBDV; y
- d)
- si se desea, aislar y, opcionalmente, purificar, dichas cápsidas vacías, VLPs(-VP4), de IBDV.
11. Procedimiento según la reivindicación 9, en
el que dicha célula huésped es una levadura, que comprende las
etapas de:
- a)
- preparar un sistema de expresión constituido por un plásmido que contiene una construcción génica según la reivindicación 3;
- b)
- transformar células de levadura con dicho sistema de expresión preparado en la etapa a);
- c)
- cultivar las levaduras transformadas obtenidas en la etapa b) bajo condiciones que permiten la expresión de las proteínas recombinantes y su ensamblaje para formar cápsidas vacías, VLPs(-VP4), de IBDV; y
- d)
- si se desea, aislar y, opcionalmente, purificar, las cápsidas vacías, VLPs(-VP4), de IBDV.
12. Empleo de un sistema de expresión génica
según cualquiera de las reivindicaciones 4 ó 5, para la producción
y obtención de cápsidas vacías, VLPs(-VP4), de IBDV según la
reivindicación 1.
13. Empleo de cápsidas vacías del virus causante
de la enfermedad de la bursitis infecciosa (IBDV), VLPs(-VP4),
según la reivindicación 1, en la elaboración de un medicamento.
14. Empleo según la reivindicación 13, en el que
dicho medicamento es una vacuna frente a la enfermedad aviar
denominada bursitis infecciosa.
15. Empleo según la reivindicación 13, en el que
dicho medicamento es un vector para terapia génica.
16. Una vacuna que comprende una cantidad
terapéuticamente efectiva de cápsidas vacías de IBDV, VLPs(-VP4),
según la reivindicación 1, junto con, opcionalmente, uno o más
adyuvantes y/o vehículos farmacéuticamente aceptables.
17. Vacuna según la reivindicación 16, para
proteger aves de la infección causada por el virus causante de la
bursitis infecciosa (IBDV).
18. Vacuna según la reivindicación 17, en la que
dichas aves se seleccionan del grupo formado por pollos, pavos,
ocas, gansos, faisanes, codornices y avestruces.
19. Una vacuna para proteger pollos de la
infección causada por el virus causante de la bursitis infecciosa
(IBDV) que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de
cápsidas vacías de IBDV, VLPs(-VP4), según la reivindicación 1,
junto con, opcionalmente, uno o más adyuvantes y/o vehículos
farmacéuticamente aceptables.
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