ES2383802T3 - Secuencias genéticas de flavonoide 3',5'-hidroxilasa y usos de las mismas - Google Patents

Abstract

Un método para producir una planta de rosa transgénica capaz de sintetizar una F3'5'H, comprendiendo dichométodo la transformación estable de una célula de una rosa con una molécula de ácido nucleico que comprende unasecuencia de nucleótidos que codifica o es complementaria a una secuencia que codifica una flavonoide 3', 5'hidroxilasa (F3'5'H) donde la secuencia de nucleótidos codifica una secuencia de aminoácidos seleccionada de lalista consistente de SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 16 o una secuencia deaminoácidos que tiene al menos 90% de similitud con al menos una de las secuencias de aminoácidosseleccionadas de la lista consistente de SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 16, bajocondiciones que permiten la expresión eventual de dicha secuencia de nucleótidos, regenerar una plantatransgénica desde la célula y cultivar dicha planta transgénica durante un tiempo y bajo condiciones suficientes parapermitir la expresión de la secuencia de nucleótidos donde la expresión de dicha molécula de ácidos nucleicos en untejido de pétalo de rosa da como resultado niveles detectables de moléculas de delfinidina o basadas en delfinidinamedidas mediante una técnica cromatográfica.

Description

Secuencias genéticas de flavonoide 3’, 5’-hidroxilasa y usos de las mismas.

Antecedentes de la invención

Campo de la invención

La presente invención se relaciona en general con una secuencia genética que codifica un polipéptido que tiene actividad de flavonoide 3', 5'-hidroxilasa (F3'5'H) y con el uso de la secuencia genética y/o sus correspondientes polipéptidos inter alia para manipular el color en las flores o partes de las mismas o en otros tejidos de plantas. Más particularmente, el F3'5'H tiene la capacidad de modular el metabolismo del dihidrocanferol (DHK) así como el metabolismo de otros sustratos tales como dihidroquercetina (DHQ), naringenina y eriodictol. Aún más particularmente, la presente invención proporciona una secuencia genética que codifica un polipéptido que tiene actividad de F3'5'H cuando se expresa en rosas. La invención presente se relaciona adicionalmente con moléculas antisentido y sentido o moléculas inductoras de ARNi que corresponden a todo o parte de las secuencias genéticas objetivo o un transcripto de la misma así como a plantas genéticamente modificadas así como flores para corte, partes y tejido reproductivo de tales plantas. También se discuten promotores que operan eficientemente en plantas tales como rosa, gerbera o plantas relacionadas botánicamente.

Descripción de la técnica anterior

La referencia a cualquier técnica anterior en esta especificación no es, y no debe tomarse como, un reconocimiento

o cualquier forma de sugerencia de que esta técnica anterior forma parte del conocimiento general común en ningún país.

Los detalles bibliográficos de referencias previstas en la especificación tratada aparecen como una lista al final de la especificación.

La industria de las flores o las plantas ornamentales procura desarrollar nuevas y diferentes variedades de flores y/o plantas. Una manera efectiva de crear tales variedades novedosas es a través de la manipulación del color de las flores. Las técnicas de cruzamiento clásicas han sido utilizadas con algún éxito para producir un amplio rango de colores de casi todas las variedades comerciales de flores y/o plantas disponibles hoy. Esta metodología ha estado limitada, sin embargo, por las restricciones de la reserva genética particular de la especie y por esta razón es raro que una especie individual tenga un espectro completo de variedades coloreadas. Por ejemplo, el desarrollo de variedades coloreadas novedosas de plantas o partes de plantas tales como flores, follaje y tallos ofrecería una oportunidad significativa tanto los mercados de flores cortadas como ornamentales. En la industria de las flores o plantas ornamentales, el desarrollo de variedades coloreadas novedosas de especies principales con florescencia tales como rosa, crisantemo, tulipán, lirio, claveles, gerbera, orquídea, lisianthus, begonia, torenia, geranio, petunia, nierembergia, pelargonio, iris, impatiens y ciclamen sería de gran interés. Un ejemplo más específico sería el desarrollo de una rosa o gerbera azul para el mercado de las cortadas.

Además, el desarrollo de novedosas variedades coloreadas de plantas tales como vegetales, frutos y semillas ofrecería oportunidades significativas en la agricultura. Por ejemplo, semillas novedosas coloreadas serían útiles como marcas de propiedad para plantas. Modificaciones adicionales a flavonoides comunes a bayas o frutas incluyendo uvas y manzanas y sus zumos incluyendo el vino tendrían el potencial de impartir características de estilo modificadas de valor a tales frutas e industrias de subproductos.

El color de las flores predominantemente debido a tres tipos de pigmentos: flavonoides, carotenoides y betalaínas. De los tres, los flavonoides son los más comunes y contribuyen a un amplio rango de colores desde amarillo hasta rojo hasta azul. Las moléculas de flavonoides que hacen la principal contribución al color de las flores son las antocianinas, las cuales son derivadas glicosilados de cianidina y su derivado peonidina metilado, moléculas de delfinidina o basadas en delfinidina y sus derivados metilados petunidina y malvidina y pelargonidina. Las antocianinas están localizadas en las vacuolas de las células epidérmicas de los pétalos o en las vacuolas de las células subepidérmicas de las hojas.

Los pigmentos flavonoides son metabolitos secundarios de la ruta fenilpropanoide. La ruta biosintética de los pigmentos flavonoides (ruta de los flavonoides) está bien establecida, (Holton y Cornish, Plant Cell 7: 1071-1083, 1995; Mol et al., Trends Plant Sci. 3: 212-217,1998; Winkel-Shirley, Plant Physiol. 126: 485-493, 2001a; and Winkel-Shirley, Plant Physiol. 127: 1399-1404, 2001b) y se muestra en las Figuras 1A y B. Estas reacciones y enzimas están involucradas en la conversión de la fenilalanina a p-coumaroil-CoA, uno de los primeros sustratos claves en la ruta de los flavonoides. Las enzimas son fenilalanina amonio-liasa (PAL), cinamato 4-hidroxilasa (C4H) y 4cumarato: CoA ligasa (4CL). La primera etapa comprometida en la ruta involucra la condensación de tres moléculas de malonil-CoA (provista por la acción de la acetil COA carboxilasa (ACC) sobre acetil CoA y CO2) con una molécula de p-cumaroil-CoA. Esta reacción es catalizada por la enzima chalcona sintasa (CHS). El producto de esta relación, la 2’,4,4’,6’,tetrahidroxi-chalcona, normalmente se isomeriza de manera muy rápida debido a la enzima chalcona flavanona isomerasa (CHI) para producir naringenina. La naringenina es hidroxilada subsecuentemente en la posición 3 del anillo central por la flavanona 3-hidroxilasa (F3H) para producir dihidrocampferol (DHK).

El patrón de hidroxilación del anillo B del dihidrocampferol (DHK) juega un papel clave en la determinación del color de los pétalos. El anillo B puede ser hidroxilado bien sea en las posiciones 3’, o en las posiciones 3’ y 5’ juntas, para producir dihidroquercetina (DHQ) o dihidromiricetina (DHM), respectivamente. Las dos enzimas clave involucradas en esta parte de la ruta son la 3’-hidroxilasa y flavonoide 3’, 5’-hidroxilasa, ambos de la clase de citocromo P450 de las enzimas. Las enzimas citocromo P450 tienen amplia distribución en la naturaleza y se han aislado y secuenciado genes a partir de vertebrados, insectos, levaduras, hongos, bacterias y plantas.

La flavonoide 3’-hidroxilasa (F3’H) es una enzima clave en la ruta de los flavonoides que lleva a los pigmentos basados en cianidina los cuales, en muchas especies vegetales (por ejemplo Rosa spp., Dianthus spp., Petunia spp., begonia, ciclamem, impatiens, gloria de la mañana y crisantemo) contribuyen al color rojo y rosa de las flores.

La flavonoide 3’, 5’-hidroxilasa (F3’5’H) es una enzima clave en la ruta de flavonoides que lleva a los pigmentos basados en delfinidina los cuales, en muchas especies de plantas (por ejemplo, petunia spp, Viola spp., Lisianthus spp., Gentiana spp., Sollya spp., Salvia spp., Clitoria spp., Kennedia spp., Campanula spp., Lavandula spp., Verbena spp., Torenia spp., Delphinium spp., Solanum spp., Cineraria spp., Vitis spp., Babiana stricia, Pinus spp., Picea spp., Larix spp., Phaseolus spp., Vaccinium spp., Cyclamen spp., Iris spp., Pelargonium sp., Liparieae, Geranium spp., Pisum spp., Lathyrus spp., Catharanthus spp., Malvia spp., Mucuna spp., Vicia spp., Saintpaulia spp., Lagerstroemia spp., bouchina spp., Plumbago spp., Hypocalyptus spp., Rhododendron spp., Linum spp., Macroptilium spp., Hibiscus spp., Hydrangea spp., Gymbidium spp., Millettia spp., Hedysarum spp., Lespedeza spp., Asparagus spp. Antigonon spp., Pisum spp., Freesia spp., Brunella spp., Clarkia spp., etc.) contribuyen al color púrpura y azul en las flores. Muchas especies tales como rosas, gerberas, crisantemos y claveles no producen pigmentos basados en delfinidina porque carecen de una actividad de F3’5’H.

La siguiente etapa en la ruta, que lleva la producción de las antocianinas coloreadas a partir de los dihidroflovonoides (DHK, DHK, DHM) involucra la dihidroflavonol-4-reductasa (DFR) que lleva a la producción de las leucoantocianidinas. Las leucoantocianidinas se convierten subsecuentemente en antocianidinas, pelargonidina, cianidina y delfinidina o moléculas basadas en delfinidina. Estas moléculas de flavonoide son inestables bajo condiciones fisiológicas normales y la glicosilación en la posición 3, a través de la acción de las glicosiltransferasas, estabiliza la molécula de antocianidina permitiendo así la acumulación de las antocianinas. En general, las glicosiltransferasas transfieren las unidades estructurales de azúcar desde los azucares UDP hacia las moléculas de flavonoide y muestran altas especificidades de la posición de glicosilación y especificidades relativamente bajas para los sustratos a sectores (Seitz y Hinderer Anthocyanins. In: Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants. Constabel, F. and Vasil, I.K. (eds.), Academic Press, New York, USA, 5: 49-76,1988). Las antocianinas pueden presentarse como 3-monósidos, 3-biósidos y 3-triósidos así como 3,5-diglicócidos y 3,7-diglicósidos asociados con las azucares glucosa, galactosa, ramnosa, arabinosa y xilosa (Strack and Wray, In; The Flavonoids -Advances in Research since 1986. Harborne, J.B. (ed), Chapman and Hall, London, UK, 1-22, 1993).

Las glicosiltransferasas involucradas en la estabilización de la molécula de antocianidina incluyen glucosa UDP: flavonoide 3-glucosil transferasa (3GT), la cual transfiere una unidad estructural de glucosa desde la glucosa UDP a la posición 3-O-de la molécula de antocianidina para producir antocianidina 3-O-glucósido.

En la petunia y el pensamiento (entre otras) la antocianidina 3-O-glucosido es en general glicosilada por otra glicosiltransferasa, la ramnosa UDP: antocianidin 3-glucósido ramnosiltransferasa (3RT), la cual añade un grupo ramnosa a la glucosa unida a 3-O-de la molécula de antocianina para producir los antocianidin 3-rutinósidos y una vez acilados, puede modificarse adicionalmente mediante la glucosa UDP antocianin 5-glucosiltransferasa (5GT). Sin embargo, en rosas, (entre otras), los antocianidin 3-O-glucósidos son glicolizados generalmente por otra glicosiltransferasa, la UDP: glucosa antocianin 5-glucosiltransferasa (5GT) para producir antocianidin 3,5diglucósidos.

Muchos antocianidin glicósidos existen en la forma de derivados acilados. Los grupos acilo que modifican los antocianidin glucósidos pueden dividirse en dos clases principales con base en su estructura. Los grupos acilo alifáticos incluyen ácido malónico o ácido succínico y la clase aromática incluye los ácidos hidroxicinámicos, tales como ácido p-cumárico, ácido cafeico y ácido ferúlico y los ácidos benzoicos tales como ácido p-hidroxibenzoico.

También puede presentarse la metilación en las posiciones 3’ y 5’ del anillo B de los antocianidin glicósidos. La metilación de los pigmentos basados en cianidina lleva a la producción de peonidina. La metilación de la posición 3’ de los pigmentos basados en delfinidina da como resultado la producción de petunidina, mientras que la metilación en las posiciones 3’ y 5’ da como resultado la producción de malvidina. La metilación de la malvidina también puede presentarse en las posiciones 5-O y 7-O para producir capensinina (5-O-metil malvidina) y 5,7-di-O-metil malvidina.

Además de las modificaciones anteriores, el pH de la vacuola o compartimiento donde los pigmentos están localizados y la copigmentación con otros flavonoides tales como flavonoles y flavonas puede afectar el color del pétalo. Los flavonoles y las flavonas pueden también ser acilados aromáticamente (Brouillard and Dangles, In: The Flavonoids Advances in Research since 1986. Harborne, J.B. (ed), Chapman and Hall, London, UK, 1-22, 1993).

La capacidad para controlar la actividad de F3’5’H, u otras enzimas involucradas en la ruta de los flavonoides, en plantas con floración produciría un medio para manipular el color de partes de plantas tales como pétalos, frutos, hojas, sépalos, semillas etc. Podrían generarse así diferentes versiones coloreadas de un cultivar sencillo en algunos casos una especie individual podría ser capaz de producir un espectro más amplio del colores.

Se han clonado dos secuencias de nucleótidos (denominadas aquí como SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 3) que codifican la F3’5’H de las petunias (véase la solicitud internacional de patente No PCT/AU92/00334 y Holton et al., Nature, 366: 276-279, 1993a). Estas secuencias fueron eficientes en la modulación de la 3’,5’ hidroxilación de flavonoides en petunias (véase la solicitud de patente internacional No. PCT/AU 92/00334 y Holton et al., 1993a), tabaco (véase la solicitud internacional de patente No PCT/AU 92/00334) y claveles (véase la solicitud internacional de patente No. PCT/AU 96/00296). Sorprendentemente, sin embargo, la inclusión de estas secuencias en casetes de expresión estándar, no llevó a la producción de transcriptos intactos o de longitud completa según se detecta por ARN o análisis de inmunoprecipitación Northern y consecuentemente los flavonoides 3’, 5’-hidroxilados no fueron producidos en rosas. Hay una necesidad por lo tanto, de identificar secuencias genéticas adicionales que codifiquen F3’5’Hs que eficientemente acumulen y sean capaces de modular la 3’, 5’ hidroxilación de flavonoides tales como antocianinas en rosas y otras especies vegetales comerciales clave.

Resumen de la invención

A través de esta especificación, a menos que el contexto requiera otra cosa, la palabra “comprenden” o variaciones tales como “comprende” o “que comprende”, serán entendidas con la implicación de la inclusión de un elemento establecido o un entero o grupo de elementos o enteros pero no la exclusión de ningún otro elemento o entero o grupo de elementos o enteros.

Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos son denominadas mediante un número identificador de secuencia (SEQ ID NO:). La SEQ ID NOs: corresponde numéricamente a los identificadores de secuencia <400>1 (SEQ ID NO: 1), <400>2 (SEQ ID NO: 2), etc.

La secuencia genéticas que codifican un F3’5’H han sido identificadas y clonadas a partir de un cierto número de especies vegetales. La secuencia genética F3’5’H cuando se expresan en tejidos de pétalos de rosa dan como resultado un nivel detectable de delfinidina o moléculas basadas en delfinidina según se determina mediante una técnica cromatográfica tal como cromatografía de capa fina (TLC) o cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC). Alternativamente, o además, la expresión de las secuencias genéticas en los tejidos de pétalos de rosa dan como resultado un nivel suficiente y una longitud de transcripto que es capaz de ser traducida a F3’5’H. Este se mide convenientemente como moléculas de delfinidina o basadas en delfinidina, detectables utilizando una técnica cromatográfica tal como TLC o HPLC. Las secuencias genéticas de la presente invención permiten la modulación de la expresión de genes que codifican esta enzima, por ejemplo, de expresión de novo, sobreexpresión, supresión, inhibición antisentido, actividad de ribozimas, inducción por ARNi o inducción por metilación. La capacidad para controlar la síntesis de F3’5’H en plantas y más específicamente en rosas o gerberas permite la modulación de la composición de antocianinas individuales así como una alteración de niveles relativos de flavonoles y antocianinas, permitiendo por lo tanto la manipulación del color de los tejidos y/o órganos de plantas tales como pétalos, hojas, semillas, sépalos, frutas etc.

De acuerdo con lo anterior, un aspecto de la presente invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica o es complementaria a una secuencia que codifica una flavonoide 3’, 5’hidroxilasa (F3’5’H) donde la secuencia de nucleótidos codifica una secuencia de aminoácidos seleccionada de la lista consistente de SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 16 o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90% de similitud con al menos una de las secuencias de aminoácidos seleccionadas de la lista consistente de SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO:16, donde la expresión de dicha molécula de ácidos nucleicos en un tejido de pétalo de rosa da como resultado niveles detectables de moléculas de delfinidina o basadas en delfinidina según se mide con una técnica cromatográfica.

Preferiblemente la molécula de ácido nucleico aislada de la invención comprende una secuencia de nucleótidos que codifica o es complementaria a una secuencia que codifica una F3’5’H o un polipéptido que tiene actividad de F3’5’H donde la expresión de dicha molécula de ácido nucleico en un tejido de pétalo de rosa da como resultado un nivel suficiente y longitud de transcripción que es traducida a dicha F3’5’H según se determina mediante niveles detectables de moléculas de delfinidina o basadas en delfinidina tal como se mide mediante una técnica cromatográfica.

La molécula de ácido nucleico aislada de la presente invención, por lo tanto, codifica una F3’5’H que es capaz de una conversión más eficiente de DHK a DHM en rosas que lo que es la F3’5’H codificada por la secuencia de nucleótidos definida en SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 3 según se mide mediante la producción de delfinidina en pétalos de rosa.

La eficiencia tal como se utiliza aquí se refiere a la capacidad de la enzima F3’5’H para convertir el sustrato DHK o DHQ en DHM en una célula de rosa) o en cualquier célula de una planta comercialmente importante tal como gerbera). Esta conversión provee la planta con un sustrato (DHM) para otras enzimas de la ruta de los flavonoides que está presente en las plantas para modificar adicionalmente el sustrato. Esta modificación puede incluir por ejemplo, glicosilación acilasión, ramnosilación y/o metilación para producir diversas antocianinas que contribuyen a la producción de un rango de colores. La producción de antocianinas 3’, 5’-hidroxiladas en rosas es potenciada de esta manera. La eficiencia se establece convenientemente mediante uno o más parámetros seleccionados de: grado de transición de F3’5’H, según se determina por la cantidad de ARNm de F3’5’H intacto producido (según se detecta mediante un análisis de inmunoprecipitación Northern); grado de traducción del ARNm de F3’5’H según se determina mediante la cantidad de producto de traducción producido; grado de actividad de la enzima F3’5’H según se determina mediante la producción de derivados de antocianina de DHQ o DHM incluyendo pigmentos de delfinidina o basados en delfinidina (según se detecta por TLC o HPLC); el grado de efectos sobre el color de la flor.

También se ha determinado sorprendentemente que ciertas combinaciones de secuencias promotoras del gen de F3’5’H que fueron funcionales en claveles y petunias no fueron funcionales en rosas. Sorprendentemente, solo un subconjunto particular de combinaciones de secuencias genéticas de promotor y F3’5’H dieron como resultado flavonoides 3’, 5’-hidroxilados en flores de rosa. Estas incluían secuencias de F3’5’H aisladas a partir de viola spp, salvia spp, lavándula spp, isolia spp. Adicionalmente, las secuencias de viola de F3’5’H (o F3’5’H de pensamientos) dieron como resultado la acumulación más alta de flavonoides 3’, 5’ hidroxilados en rosas. Las novedosas combinaciones de secuencias genéticas de promotor y F3’5’H pueden ser empleadas inter alia para modular el color

o sabor u otras características de plantas o partes de plantas tales como pero no limitándose a flores, frutos, nueces, raíces, tallos, hojas o semillas. Así, la presente invención representa una nueva metodología para desarrollar variedades de plantas que tengan características de color alteradas. Otros usos incluyen, por ejemplo, la producción de novedosos extractos de plantas transformadas con F3’5’H donde el extracto tiene uso, por ejemplo, como aditivo saborizante o para alimentos o productos para la salud o bebida o zumo o colorante. Las bebidas pueden incluir pero no se limitan a vinos, licores espirituosos, tés, café, leche y productos lácteos.

En una realización preferida, por lo tanto, la presente invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifican, o son complementarios a una secuencia que codifican F3’5’H de salvia o un derivado funcional de la enzima tal como se define en las reivindicaciones.

Las secuencias de nucleótidos que codifican la F3’5’H de pensamiento (SEQ ID NOs: 9 y 11), F3’5’H de salvia (SEQ ID NOs: 13 y 15) F3’5’H de solia (SEQ ID NO: 17), F3’5’H de lavanda (SEQ ID NO: 31) y F3’5’H de kennedia (SEQ ID NO: 26) se definen mediante identificadores de secuencia indicados en paréntesis. Un resumen de los identificadores de esas secuencias se muestra en la Tabla 1.

De acuerdo con lo anterior, otro aspecto de la presente invención proporciona una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionados de la lista consistente de SEQ ID NO: 13 y SEQ ID NO: 15

o una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 80% de identidad con al menos una de las secuencias de nucleótidos seleccionados de la lista consistente de SEQ ID NO: 13 y SEQ ID NO: 15 o una secuencia de nucleótidos capaz de hibridizar a al menos una de las secuencias de nucleótidos seleccionados de la lista consistente de SEQ ID NO: 13 y SEQ ID NO: 15 o una forma complementaria de los mismo bajo condiciones de alta restricción.

Las secuencias de aminoácidos de las enzimas F3’5’H divulgadas aquí están definidas en SEQ ID NO: 10 (pensamiento) o SEQ ID NO: 12 (pensamiento) o SEQ ID NO: 14 (salvia) o SEQ ID NO: 16 (salvia) o SEQ ID NO: 18 (solia) o SEQ ID NO: 32 (lavanda) o SEQ ID NO: 27 (kennedia).

Un aspecto adicional de la presente invención proporciona un método para producir una planta de rosa transgénica capaz de sintetizar una F3’5’H, comprendiendo dicho método transformar de manera estable una célula de una rosa con una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica o es complementaria con una secuencia que codifica una flavonoide 3’, 5’hidroxilasa (F3’5’H) donde la secuencia de nucleótido codifica una secuencia de aminoácidos seleccionada de la lista consistente de SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 16 o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90% de similitud con al menos una de las secuencias de aminoácidos seleccionadas de la lista consistente de SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 16, bajo condiciones que permiten la expresión eventual de dicha secuencia de nucleótidos, regenerando una planta transgénica a partir de la célula y haciendo crecer dicha planta transgénica durante un tiempo bajo condiciones suficientes para permitir la expresión de la secuencia de nucleótidos donde la expresión de dicha molécula de ácidos nucleicos en un tejido de pétalo de rosas da como resultado niveles detectables de moléculas de delfinidina o basadas en delfinidina según se mide mediante una técnica cromatográfica. La expresión de la secuencia de ácidos nucleicos en general da como resultado transcripción de nivel y longitud suficiente para codificar una F3’5’H. Esto se determina convenientemente mediante niveles detectables de moléculas de delfinidina

o basadas en delfinidina según se mide por técnicas cromatográficas tales como TLC o HPLC. La planta transgénica puede por lo tanto producir una F3’5’H no nativa a niveles elevados con respecto a la cantidad expresada en una planta comparable no transgénica. Esto da como resultado generalmente un cambio de color detectable visualmente en la planta o parte de la planta o preferiblemente en la florescencia o flores de dicha planta.

Un método para producir una planta transgénica con actividad de F3’5’H reducida también se divulga aquí comprendiendo dicho método una transformación estable de una célula en una planta adecuada con una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica o es complementaria a una secuencia que codifica para actividad de F3’5’H, regenerando una planta transgénica a partir de la célula y cuando sea necesario hacer crecer dicha planta transgénica bajo condiciones suficientes para permitir la expresión del ácido nucleico.

Se divulga adicionalmente un método para producir una planta genéticamente modificada con actividad de F3’5’H reducida, comprendiendo dicho método la alteración del gen F3’5’H a través de la modificación de las secuencias nativas a través de recombinación homóloga a partir de un gen F3’5’H apropiadamente alterado o un derivado o parte del mismo introducidos en la célula vegetal, y regenerando la planta modificada genéticamente a partir de la célula.

Otro aspecto de la presente invención contempla un método para producir una planta florescente transgénica que exhibe propiedades de florescencia alteradas, comprendiendo dicho método transformar de manera estable una célula de una planta adecuada con una secuencia de ácidos nucleicos de la presente invención, regenerando una planta transgénica a partir de la célula y haciendo crecer dicha planta transgénica durante un tiempo bajo condiciones suficientes para permitir la expresión de la secuencia de ácidos nucleicos.

Un método adicional para producir una planta transgénica de floración que exhibe propiedades florales o de florescencia alteradas se divulga aquí, comprendiendo dicho método la alteración del gen F3'5'H a través de la modificación de la secuencia de nucleótidos a través de la recombinación homóloga a partir de un gen de F3'5'H apropiadamente alterado o un derivado o parte del mismo introducido en la célula vegetal, y regenerando la planta genéticamente modificada a partir de la célula.

También se divulga aquí un método para producir una planta transgénica capaz de expresar un gen recombinante que codifica una F3'5'H o una parte de la misma o que porta una secuencia de ácidos nucleicos que es sustancialmente complementaria a todo o parte de una molécula de ARNm que codifica dicha F3'5'H, comprendiendo dicho método la transformación de manera estable de una célula de una planta adecuada con la molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifican, o son complementarios a una secuencia que codifican una F3'5'H, cuando sea necesario bajo condiciones que permitan la expresión eventual de dicha molécula de ácido nucleico aislada, y regenerar una planta transgénica a partir de la célula.

Otro aspecto de la presente invención se extiende a todas las plantas de rosa transgénicas o partes de plantas transgénicas o progenie de las plantas transgénicas que contiene todas o parte de las secuencias de ácidos nucleicos de la presente invención, o formas antisentido de las mismas y/o homólogos o formas relacionadas de los mismos divulgadas en las reivindicaciones y, en particular, aquellas plantas transgénicas que exhiben propiedades florales o de florescencia alteradas.

Incluso aún otro aspecto de la presente invención se extiende a todas las plantas de rosa transgénicas o partes de plantas transgénicas o progenie de las plantas transgénicas que contienen todas o parte de las secuencias de ácidos nucleicos de la presente invención, o formas antisentido de las mismas y/o homólogos o formas relacionadas de las mismas divulgadas en las reivindicaciones y, en particular, o plantas que exhiben partes aéreas alteradas de las plantas tales como propiedades de frutos, bayas, sépalos, brácteas, pecíolos, pedúnculos, ovarios, anteras o tallos.

Otro aspecto de la presente invención contempla el uso de los extractos de las plantas transgénicas o partes de plantas, plantas transgénicas o progenie de las plantas transgénicas definidos anteriormente que contienen todas o parte de las secuencias de ácidos nucleicos de la presente invención y, en particular, los extractos de aquellas plantas transgénicas cuando se utilizan como aditivo saborizante o para alimentos o para producto de salud o bebidas o zumos o colorantes.

Un aspecto adicional de la presente invención está dirigido a formas recombinantes de F3'5'H tal como se define aquí.

Otro aspecto de la presente invención contempla el uso de las secuencias genéticas descritas aquí en la manufactura de un constructo genético capaz de expresar una F3'5'H o subregular una enzima F3'5'H nativa en una 5 planta.

Aún otro aspecto de la presente invención está dirigido a un organismo eucariote que porta una secuencia genética que codifica una F3'5'H tal como se define aquí extracromosómicamente en forma de plásmido.

Aún otro aspecto de la presente invención se extiende a una F3'5'H aislada codificada por las moléculas de ácido nucleico de la presente invención. Un polipéptido recombinante que comprende una secuencia de aminoácidos

10 sustancialmente como se establece en SEQ ID NO: 10 o SEQ ID NO: 12 o SEQ ID NO: 14 o SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 18 o SEQ ID NO: 32 o SEQ ID NO: 27 o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente 50% de similitud con SEQ ID NO: 10 o SEQ ID NO:12 o SEQ ID NO:14 o SEQ ID NO:16 o SEQ ID NO: 18 o SEQ ID NO: 32 o SEQ ID NO: 27 o un derivado de dicho polipéptido también se divulga aquí.

También se divulgan promotores que operan eficientemente en plantas tales como rosa y gerbera o plantas

15 botánicamente relacionadas. Tales promotores incluyen un promotor de CHS de rosa, promotor de CHS de crisantemo y un promotor CaMV 35S.

Un resumen de los identificadores de secuencias utilizados a través de la presente especificación se provee en la Tabla 1:

TABLA 1 (continuación)

Resumen de identificadores de secuencia

SEQ ID NO:

NOMBRE ESPECIE TIPO DE SECUENCIA DESCRIPCIÓN

1

petHf1.nt Petunia hybrida nucleótido F3’5’HADNc

2

petHf1.aa Petunia hybrida aminoácido traducción de F3’5’HADNc

3

petHj2.nt Petunia hybrida nucleótido F3’5’HADNc

4

petf2.aa Petunia hybrida aminoácido traducción de F3’5’HADNc

5

RoseCHSpromoter Rosa hybrida nucleótido fragmento de promotor

6

D8 oligo#2 Petunia hybrida nucleótido oligonucleótido

7

D8 oligo #4 Petunia hybrida nucleótido oligonucleótido

8

chrysanCHSATG Chrysanthemum nucleótido oligonucleótido

9

BP#18.nt Viola spp. nucleótido F3’SH ADNc

10

BP#18.aa Viola spp. aminoácido traducción de F3’5’HADNc

11

BP#40.nt Viola spp. nucleótido F3’5’HADNc

12

BP#40.aa Viola spp. aminoácido traducción de F3’5’HADNc

13

Sal#2.nt Salvia spp. nucleótido F3’5’HADNc

Resumen de identificadores de secuencia

SEQ ID NO:

NOMBRE ESPECIE TIPO DE SECUENCIA DESCRIPCIÓN

14

Sal#2.aa Salvia spp. aminoácido traducción de F3’5’HADNc

15

Sal#47.nt Salvia spp. nucleótido F3’5’HADNc

16

Sal#47.aa Salvia spp. aminoácido traducción de F3’5’HADNc

17

Soll#5.nt Sollya spp. nucleótido F3’5’HADNc

18

Soll#5.aa Sollya spp. aminoácido traducción de F’3’5’HADNc

19

FLS-Nco Petunia hybrida nucleótido oligonucleótido

20

BpeaHF2.nt Clitoria ternatea nucleótido F3’5’HADNc

21

BpeaHF2.aa Clitoria ternatea aminoácido traducción de F3’5’HADNc

22

Gen#48.nt Gentiana triflora nucleótido F3’5’HADNc

23

Gen#48.aa Gentiana triflora aminoácido traducción de F3’5’HADNc

24

PetD8 5’ Petunia hybrida nucleótido oligonucleótido

25

Bpeaprimer Clitoria ternatea nucleótido oligonucleótido

26

Kenn#31.nt Kennedia spp. nucleótido F3’5’HADNc

27

Kenn#31.aa Kennedia spp. aminoácido traducción de F3’5’HADNc

28

chrysGHS.nt Chrysanthemum nucleótido CHS ADNc

29

chrysCHS.aa Chrysanthemum aminoácido traducción de CHS ADNc

30

chrysCHSpromoter Chrysanthemum nucleótido fragmento de promotor

31

LBG.nt Lavandula nil nucleótido F3’5’ ADNc

32

LBG.aa Lavandula nil aminoácido traducción de F3’5’HADNc

Breve descripción de las figuras

Las Figuras 1A y 1B son representaciones esquemáticas de la ruta de biosíntesis para los pigmentos flavonoides. La

5 Figura 1A ilustra la producción general de antocianidín 3-glucósidos que ocurre en la mayoría de las plantas que producen antocianinas. La Figura 1B representa modificaciones adicionales de las antocianinas que se presentan en la petunia. Las enzimas involucradas en la ruta han sido indicadas como sigue: PAL = Fenilalanina amoniaco-liasa; C4H = Cinamato 4-hidroxilasa; 4CL = 4-cumarato: CoA ligasa; CHS = Chalcona sintasa, CHI = Chalcona flavanona isomerasa; F3H = Flavanona 3-hidroxilasa; DFR = Dihidroflavonol-4-reductasa; ANS = antocianidín sintasa, 3GT =

10 UDP-glucosa: flavonoide 3-O-glucosiltransferasa; 3RT = UDP ramnosa: antocianidín 3-glucósido ramnosiltransferasa, AR-AT = Antocianidín rutinósido-aciltransferasa, 5GT = Antocianín 5-glucosiltransferasa; 3'OMT = Antocianín 3'O-metiltransferasa, 3'5’ OMT = Antocianín 3’,5' O-metiltransferasa. Otras abreviaturas incluyen: DHK = Dihidrocanferol, DHQ = Dihidroquercetina, DHM = Dihidromiricetina;

TABLA 2: Descripción de las abreviaturas utilizadas en las Figuras 2 a 52

ABREVIATURA

DESCRIPCIÓN

Amp

gen de resistencia a la ampicilina que confiere resistencia al antibiótico ampicilina

ColElori

origen plásmido de la replicación

f1 (+)

origen de fago filamentoso f1 de la replicación

GentR

gen de resistencia a la gentamicina que confiere resistencia al antibiótico gentamicina

LB

Frontera izquierda del ADN-T

nptIII

El gen de neomicín fosfotransferasa III que confiere resistencia al antibiótico kanamicina

ori pRi

origen plásmido de la replicación

ori 322

origen plásmido de la replicación

pACYC ori

replicón modificado de pACYC184 de E. coli

pVSI

Un origen de un amplio origen de rango de huésped de replicación de un plásmido de seudomonas aeroginosa

rev

Localización aproximada del sito del cebador reverso M13 utilizado en el análisis de secuencia

RB

Frontera derecha del AND-T

TetR

Tetraciclina que confiere resistencia al antibiótico tetraciclina

-20

Localización aproximada del sitio de cebador M13 -20 utilizado en el análisis de secuencia

RK2

Amplio rango de huésped de plásmido Gram negativo de origen RK2

La Figura 2 es una representación diagramática del plásmido pCGP602, pCGP601 y pCGP176 que contiene clones de petunia F3'5'H petHf1 ADNc de P. hybrida cv. OGB. El fragmento de petunia F3’5’ H perHf1 fue utilizado en la

5 preparación de constructos que contienen el clon de petunia F3’5’H ADNc. Los fragmentos marcados con 32P del fragmento 1.6 kb BspHI/ FspI de 1.6 kb fueron utilizados para sondear las bibliotecas de ADNc de pétalo. Se marcan los sitios de endonucleasa de restricción seleccionada. Refiérase a Tabla 2 y Tabla 4 para una descripción de las abreviaturas.

La Figura 3 es una representación diagramática del plásmido pCGP175 que contiene el clon de ADNc de la F3’5’H

10 petHf2 de petunia de P. hybrida cv OGB. Se marcan los sitios seleccionados de restricción de endonucleasa. Refiérase a la Tabla 2 y a la Tabla 4 para una descripción de las abreviaturas.

La Figura 4 es una representación diagramática del plásmido pCGP1303 que contiene un subclon del clon de ADNc de F3’5’H petHf1 de petunia de pCGP601. La construcción de pCGP1303 se describe en el Ejemplo 4. Se marcan los sitios seleccionados de restricción de endonucleasa. Refiérase a la Tabla 2 y a la Tabla 4 para una descripción

15 de las abreviaturas.

La Figura 5 es una representanción diagramática del plásmido binario pCGP1452. El gen AmCHS 5’: petHF1: petD8 3’ de pCGP485 fue clonado en el vector binario pWTT2132 (ADNP) Len una orientación en tándem con el gen quimérico SuRB. La construcción de pCGP1452 se describe en el Ejemplo 4. Se marcan los sitios seleccionados de restricción de endonucleasa.

Refiérase a la Tabla 2 y a la Tabla 4 para una descripción de las abreviaturas.

La Figura 6 es una representanción diagramática del plásmido binario pWTT2132 (ADNP) que contiene el gen marcador seleccionable 35S 5’: SuRB y un sitio de clonación múltiple. Se da una descripción de pWTT2132 en el Ejemplo 4. Se marcan los sitios seleccionados de restricción de endonucleasa. Refiérase a la Tabla 2 y a la Tabla 4 para una descripción de las abreviaturas.

La Figura 7 es una representación diagramática del plásmido pCGP725. El gen AmCHS 5’: petHf1: petD8 3’ de pCGP485 fue clonado en el vector pBluescript SK II (+). La construcción de pCGP725 se describe en el Ejemplo 4. Se marcan los sitios seleccionados de restricción de endonucleasa. Refiérase a la Tabla 2 y a la Tabla 4 para una descripción de las abreviaturas.

La Figura 8 es una representanción diagramática del plásmido binario pCGP1453. El gen Mac: petHf1: mas 3’ de pCGP628 fue clonado en el vector binario pWTT2132 (ADNP) en una orientación en tándem con el gen quimérico SuRB. La construcción de pCGP1453 se describe en el Ejemplo 4. Se marcan los sitios seleccionados de restricción de endonucleasa. Refiérase a la Tabla 2 y a la Tabla 4 para una descripción de las abreviaturas.

La Figura 9 es una representanción diagramática del plásmido binario pCGP1457. El gen petD8 5’: petHf1: petD8 3’ de pCGP1107 fue clonado en el vector binario pWTT2132 (ADNP) en una orientación en tándem con el gen quimérico SuRB. La construcción de pCGP1457 se describe en el Ejemplo 4. Se marcan los sitios seleccionados de restricción de endonucleasa, Refiérase a la Tabla 2 y a la Tabla 4 para una descripción de las abreviaturas.

La Figura 10 es una representanción diagramática del plásmido binario pCGP1461. El gen shortpetFLS 5’: petHf1: petFLS 3’ de pCGP497 fue clonado en el vector binario pWTT2132 (ADNP) en una orientación en tándem con el gen quimérico SuRB. La construcción de pCGP1461 se describe en el Ejemplo 4. Se marcan los sitios seleccionados de restricción de endonucleasa. Refiérase a la Tabla 2 y a la Tabla 4 para una descripción de las abreviaturas.

La Figura 11 es una representanción diagramática del plásmido binario pCGP161G. El gen petRT 5’; petHf1: nos 3’ de pCGP846 fue clonado en el vector binario pWTT2132 (ADNP) en una orientación en tándem con el gen quimérico SuRB. La construcción de pCGP1616 se describe en el Ejemplo 4. Se marcan los sitios seleccionados de restricción de endonucleasa. Refiérase a la Tabla 2 y a la Tabla 4 para una descripción de las abreviaturas.

La Figura 12 es una representanción diagramática del plásmido binario pCGP1623. El gen mas/ 35S: petHf1: ocs 3’ de pCGP1619 fue clonado en el vector binario pWTT2132 (ADNP) en una orientación en tándem con el gen quimérico SuRB. La construcción de pCGP1623 se describe en el Ejemplo 4. Se marcan los sitios seleccionados de restricción de endonucleasa. Refiérase a la Tabla 2 y a la Tabla 4 para una descripción de las abreviaturas.

La Figura 13 es una representanción diagramática del plásmido binario pCGP1638. El gen CaMV 35S: petHf1: nos 3’ de pCGP1636 fue clonado en el vector binario pWTT2132 (ADNP) en una orientación en tándem con el gen quimérico SuRB. La construcción de pCGP1636 se describe en el Ejemplo 4. Se marcan los sitios seleccionados de restricción de endonucleasa. Refiérase a la Tabla 2 y a la Tabla 4 para una descripción de las abreviaturas.

La Figura 14 es una representanción diagramática del plásmido binario pCGP1860. El gen RoseCHS 5’: petHf1: nos 3’ de pCGP200 fue clonado en el vector binario pWTT2132 (ADNP) en una orientación en tándem con el gen quimérico SuRB. La construcción de pCGP1860 se describe en el Ejemplo 4. Se marcan los sitios seleccionados de restricción de endonucleasa. Refiérase a la Tabla 2 y a la Tabla 4 para una descripción de las abreviaturas.

La Figura 15 es una representanción diagramática del plásmido binario pCGP2123. The CaMV35S: petHf2: ocs 3’ gene from pCGP2109 fue clonado en el vector binario pCGP1988 en una orientación en tándem con el gen quimérico SuRB. La construcción de pCGP2123 se describe en el Ejemplo 4. Se marcan los sitios seleccionados de restricción de endonucleasa. Refiérase a la Tabla 2 y a la Tabla 4 para una descripción de las abreviaturas.

La Figura 16 es una representanción diagramática del plásmido binario pCGP1988. El sitio de clonación múltiple del vector binario pWTT2132 (ADNP) fue reemplazado con el sitio de clonación múltiple de pNEB193 (New England Biolabs). La construcción de pCGP1988 se describe en el Ejemplo 4. Se marcan los sitios seleccionados de restricción de endonucleasa. Refiérase a la Tabla 2 y a la Tabla 4 para una descripción de las abreviaturas.

La Figura 17 es una representación diagramática del plásmido pCGP2105. El casete de expresión 35S 5’: ocs 3’ con múltiples sitios de restricción de endonucleasa entre los fragmentos promotor y terminador está en eun esqueleto del vector pBluescript SK (+). La construcción de pCGP2105 se describe en el Ejemplo 4. Se marcan los sitios seleccionados de restricción de endonucleasa. Refiérase a la Tabla 2 y a la Tabla 4 para una descripción de las abreviaturas.

La Figura 18 es una representanción diagramática del plásmido binario pCGP1307. El gen petD8 5’: GUS: petD8 3’ de pCGP1106 fue clonado en el vector binario pCGN1548 en una orientación en tándem al gen marcador seleccionable de nptl quimérico. La construcción de pCGP1307 se describe en el Ejemplo 6. Se marcan los sitios seleccionados de restricción de endonucleasa. Refiérase a la Tabla 2 y a la Tabla 4 para una descripción de las abreviaturas.

La Figura 19 es una representanción diagramática del plásmido binario pCGP1506. El gen longpetFLS 5’: GUS: petFLS 3’ de pCGP496 fue clonado en el vector binario pBIN19 en una orientación en tándem al gen marcador seleccionable de nptl quimérico. La construcción de pCGP1506 se describe en el Ejemplo 6. Refiérase a la Tabla 2 y a la Tabla 4 para una descripción de las abreviaturas.

La Figura 20 es una representanción diagramática del plásmido binario pCGP1626. El gen ChrysCHS 5’: GUS: nos 3’ de pCGP1622 fue clonado en el vector binario pWTT2132 en una orientación en tándem con el gen quimérico SuRB. La construcción de pCGP1626 se describe en el Ejemplo 6. Se marcan los sitios seleccionados de restricción de endonucleasa. Refiérase a la Tabla 2 y a la Tabla 4 para una descripción de las abreviaturas.

La Figura 21 es una representanción diagramática del plásmido binario pCGP1641. El gen petRT 5’: GUS: petRT 3’ de pCGP1628 fue clonado en el vector binario pWTT2132 en una orientación en tándem con el gen quimérico SuRB. La construcción de pCGP1641 se describe en el Ejemplo 6. Se marcan los sitios seleccionados de restricción de endonucleasa. Refiérase a la Tabla 2 y a la Tabla 4 para una descripción de las abreviaturas.

La Figura 22 es una representanción diagramática del plásmido binario pCGP1861. El gen RoseCHS 5’: GUS: nos 3’ de pCGP197 fue clonado en el vector binario pWTT2132 en una orientación en tándem con el gen quimérico SuRB. La construcción de pCGP1861 se describe en el Ejemplo 6. Refiérase a la Tabla 2 y a la Tabla 4 para una descripción de las abreviaturas.

La Figura 23 es una representanción diagramática del plásmido binario pCGP1953. El gen AmCHS 5’: GUS: petD8 3’ de from pCGP1952 fue clonado en el vector binario pWTT2132 en una orientación en tándem con el gen quimérico SuRB. La construcción de pCGP1953 se describe en el Ejemplo 6. Refiérase a la Tabla 2 y a la Tabla 4 para una descripción de las abreviaturas.

La Figura 24 es una representanción diagramática del plásmido binario pWTT2084 (ADNP) containing a 35S 5’: GUS: ocs 3’ gene in a convergent orientation to the chimaeric SuRB selectable marker gene. Se da una descripción de pWTT2084 en el Ejemplo 6. Refiérase a la Tabla 2 y a la Tabla 4 para una descripción de las abreviaturas.

La Figura 25 es una representación diagramática del plásmido pCGP1959 que contiene el clon F3’5’H BP#18 ADNc de Viola spp. cv Black Pensamiento en un esqueleto pBluescript SK II (+). Se da una descripción de pCGP1959 en el Ejemplo 7. Se marcan los sitios seleccionados de restricción de endonucleasa. Refiérase a la Tabla 2 y a la Tabla 4 para una descripción de las abreviaturas.

La Figura 26 es una representación diagramática del plásmido pCGP1961 que contiene el clon F3’5’H BP#40 ADNc de Viola spp. cv Black Pensamiento en un esqueleto pBluescript SK II (+). Se da una descripción de pCGP1961 en el Ejemplo 7. Se marcan los sitios seleccionados de restricción de endonucleasa. Refiérase a la Tabla 2 y a la Tabla 4 para una descripción de las abreviaturas.

La Figura 27 es una representanción diagramática del plásmido binario pCGP1972. El gen AmCHS 5’: BP#18: petD8 3’ de pCGP1970 fue clonado en el vector binario pWTT2132 (ADNP) en una orientación en tándem con el gen quimérico SuRB. La construcción de pCGP1972 se describe en el Ejemplo 7. Se marcan los sitios seleccionados de restricción de endonucleasa. Refiérase a la Tabla 2 y a la Tabla 4 para una descripción de las abreviaturas.

La Figura 28 es una representanción diagramática del plásmido binario pCGP1973. El gen AmCHS 5’: BP#40: petD8 3’ de pCGP1971 fue clonado en el vector binario pWTT2132 (ADNP) en una orientación en tándem con el gen quimérico SuRB. La construcción de pCGP1973 se describe en el Ejemplo 7. Se marcan los sitios seleccionados de restricción de endonucleasa. Refiérase a la Tabla 2 y a la Tabla 4 para una descripción de las abreviaturas.

La Figura 29 es una representanción diagramática del plásmido binario pCGP1967. El gen CaMV 35S: BP#18:ocs 3’ de pCGP1965 fue clonado en el vector binario pWTT2132 (ADNP) en una orientación en tándem con el gen quimérico SuRB. La construcción de pCGP1967 se describe en el Ejemplo 7. Se marcan los sitios seleccionados de restricción de endonucleasa. Refiérase a la Tabla 2 y a la Tabla 4 para una descripción de las abreviaturas.

La Figura 30 es una representanción diagramática del plásmido binario pCGP1969. El gen CaMV 35S: BP#40:ocs 3’ de pCGP1966 fue clonado en el vector binario pWTT2132 (ADNP) en una orientación en tándem con el gen quimérico SuRB. La construcción de pCGP1969 se describe en el Ejemplo 7. Se marcan los sitios seleccionados de restricción de endonucleasa. Refiérase a la Tabla 2 y a la Tabla 4 para una descripción de las abreviaturas.

La Figura 31 es una representación diagramática del plásmido pCGP1995 que contiene el clon F3’5’H Sal#2 ADNc de Salvia spp. en un esqueleto de pBluescript SK II (+). Se da una descripción de pCGP1995 en el Ejemplo 7. Se marcan los sitios seleccionados de restricción de endonucleasa. Refiérase a la Tabla 2 y a la Tabla 4 para una descripción de las abreviaturas.

La Figura 32 es una representación diagramática del plásmido pCGP1999 que contiene el clon F3’5’H Sal#47 ADNc de Salvia spp en un esqueleto de pBluescript SK II (+). Se da una descripción de pCGP1999 en el Ejemplo 7. Se marcan los sitios seleccionados de restricción de endonucleasa. Refiérase a la Tabla 2 y a la Tabla 4 para una descripción de las abreviaturas.

La Figura 33 es una representanción diagramática del plásmido binario pCGP2121. El gen AmCHS 5’: Sal#2: petD8 3’ pCGP2116 fue clonado en el vector binario pCGP1988 en una orientación en tándem con el gen quimérico SuRB. La construcción de pCGP2121 se describe en el Ejemplo 7. Se marcan los sitios seleccionados de restricción de endonucleasa. Refiérase a la Tabla 2 y a la Tabla 4 para una descripción de las abreviaturas.

La Figura 34 es una representanción diagramática del plásmido binario pCGP2122. El gen AmCHS 5’: Sal#47: petD8 3’ de pCGP2117 fue clonado en el vector binario pCGP1988 en una orientación en tándem con el gen quimérico SuRB. La construcción de pCGP2122 se describe en el Ejemplo 7. Se marcan los sitios seleccionados de restricción de endonucleasa. Refiérase a la Tabla 2 y a la Tabla 4 para una descripción de las abreviaturas.

La Figura 35 es una representanción diagramática del plásmido binario pCGP2120. El gen CaMV 35S:Sal#2:ocs 3’ de pCGP2112 fue clonado en el vector binario pCGP1988 en una orientación en tándem con el gen quimérico SuRB. La construcción de pCGP2120 se describe en el Ejemplo 7. Se marcan los sitios seleccionados de restricción de endonucleasa. Refiérase a la Tabla 2 y a la Tabla 4 para una descripción de las abreviaturas.

La Figura 36 es una representanción diagramática del plásmido binario pCGP2119. El gen CaMV 35S:Sal#47:ocs 3’ de pCGP211 fue clonado en el vector binario pCGP1988 en una orientación en tándem con el gen quimérico SuRB. La construcción de pCGP2119 se describe en el Ejemplo 7. Se marcan los sitios seleccionados de restricción de endonucleasa. Refiérase a la Tabla 2 y a la Tabla 4 para una descripción de las abreviaturas.

La Figura 37 es una representación diagramática del plásmido pCGP2110 que contiene el clon F3’5’H Soll#5 ADNc de Sollya spp. en un esqueleto de pBluescript SK II (+). Se da una descripción de pCGP2110 en el Ejemplo 7. Se marcan los sitios seleccionados de restricción de endonucleasa. Refiérase a la Tabla 2 y a la Tabla 4 para una descripción de las abreviaturas.

La Figura 38 es una representanción diagramática del plásmido binario pCGP2130. El gen AmCHS 5’: Soll#5: petD8 3’ de pCGP2128 fue clonado en el vector binario pCGP1988 en una orientación en tándem con el gen quimérico SuRB. La construcción de pCGP2130 se describe en el Ejemplo 7. Refiérase a la Tabla 2 y a la Tabla 4 para una descripción de las abreviaturas.

La Figura 39 es una representanción diagramática del plásmido binario pCGP2131. El gen CaMV 35S: Soll#5:ocs 3’ de pCGP2129 fue clonado en el vector binario pCGP1988 en una orientación en tándem con el gen quimérico SuRB. La construcción de pCGP2131 se describe en el Ejemplo 7. Refiérase a la Tabla 2 y a la Tabla 4 para una descripción de las abreviaturas.

La Figura 40 es una representación diagramática del plásmido pCGP2231 que contiene el clon F3’5’H Kenn#31 ADNc de Kennedia spp. en un esqueleto de pBluescript SK II (+). Se da una descripción de pCGP2231 en el Ejemplo 7. Se marcan los sitios seleccionados de restricción de endonucleasa. Refiérase a la Tabla 2 y a la Tabla 4 para una descripción de las abreviaturas.

La Figura 41 es una representanción diagramática del plásmido binario pCGP2256. El gen AmCHS 5’: Kenn#31: petD8 3’ de pCGP2242 fue clonado en el vector binario pCGP1988 en una orientación en tándem con el gen quimérico SuRB. La construcción de pCGP2256 se describe en el Ejemplo 7. Refiérase a la Tabla 2 y a la Tabla 4 para una descripción de las abreviaturas.

La Figura 42 es una representanción diagramática del plásmido binario pCGP2252. El gen de CaMV 35S: Kenn#31:ocs 3’ de pCGP2236 fue clonado en el vector binario pCGP1988 en una orientación en tándem con el gen quimérico SuRB. La construcción de pCGP2252 se describe en el Ejemplo 7. Refiérase a la Tabla 2 y a la Tabla 4 para una descripción de las abreviaturas.

La Figura 43 es una representación diagramática del plásmido pBHF2F que contiene el clon de longitud completa F3’5’H BpeaHF2 ADNc de Clitoria ternatea en un esqueleto de pBluescript SK II (+). Se da una descripción de pBHF2F en el Ejemplo 7. Se marcan los sitios seleccionados de restricción de endonucleasa. Refiérase a la Tabla 2 y a la Tabla 4 para una descripción de las abreviaturas.

La Figura 44 es una representanción diagramática del plásmido binario pCGP2135. El gen AmCHS 5’: BpeaHF2: petD8 3’ de pCGP2133 fue clonado en el vector binario pCGP1988 en una orientación en tándem con el gen quimérico SuRB. La construcción de pCGP2135 se describe en el Ejemplo 7. Se marcan los sitios seleccionados de restricción de endonucleasa. Refiérase a la Tabla 2 y a la Tabla 4 para una descripción de las abreviaturas.

La Figura 45 es una representanción diagramática del plásmido binario pBEBF5. El gen eCaMV 35S: BpeaHF2: nos 3’ fue construido reemplazando el fragmento GUS de pBE2113-GUSs con el clon Clitoria F3’5’H BpeaHF2 ADNc de pBHF2F La construcción de pBEBF5 se describe en el Ejemplo 7. Refiérase a la Tabla 2 y a la Tabla 4 para una descripción de las abreviaturas.

La Figura 46 es una representanción diagramática del plásmido binario pCGP2134. El gen CaMV 35S: BpeaHF2: ocs 3’ de pCGP2132 fue clonado en el vector binario pCGP19988 en una orientación en tándem con el gen quimérico SuRB. La construcción de pCGP2134 se describe en el Ejemplo 7. Refiérase a la Tabla 2 y a la Tabla 4 para una descripción de las abreviaturas.

La Figura 47 es una representación diagramática del plásmido pG48 que contiene el clon F3’5’H Gen##48 ADNc de Gentiana triflora en un esqueleto de pBluescript SK II (+). Se da una descripción de pG48 en el Ejemplo 7. Se marcan los sitios seleccionados de restricción de endonucleasa. Refiérase a la Tabla 2 y a la Tabla 4 para una descripción de las abreviaturas.

La Figura 48 es una representanción diagramática del plásmido binario pCGP1498. El gen AmCHS 5’: Gen#48: petD8 3’ de pCGP1496 fue clonado en el vector binario pCGP1988 en una orientación en tándem con el gen quimérico SuRB. La construcción de pCGP1498 se describe en el Ejemplo 7. Se marcan los sitios seleccionados de restricción de endonucleasa. Refiérase a la Tabla 2 y a la Tabla 4 para una descripción de las abreviaturas.

La Figura 49 es una representanción diagramática del plásmido binario pBEGHF48. El gen eCaMV 35S: Gen#48: nos 3’ fue construido reemplazando el fragmento GUS de pBE2113-GUSs con el clon Gentiana F3’5’H Gen#48 ADNc de pG48. La construcción de pBEGHF48 se describe en el Ejemplo 7. Se marcan los sitios seleccionados de restricción de endonucleasa. Refiérase a la Tabla 2 y a la Tabla 4 para una descripción de las abreviaturas.

La Figura 50 es una representanción diagramática del plásmido binario pCGP1982. El gen CaMV 35S:Gen#48:ocs 3’ de pCGP1981 fue clonado en el vector binario pWTT2132 (ADNP) en una orientación en tándem con el gen quimérico SuRB. La construcción de pCGP1982 se describe en el Ejemplo 7. Refiérase a la Tabla 2 y a la Tabla 4 para una descripción de las abreviaturas.

La Figura 51 es una representación diagramática del plásmido pLFH8 que contiene el F3’5’H LBG ADNc clone from Lavandula nil en un esqueleto de pBluescript SK II (+). Se da una descripción de pLFH8 en el Ejemplo 7. Se marcan los sitios seleccionados de restricción de endonucleasa. Refiérase a la Tabla 2 y a la Tabla 4 para una descripción de las abreviaturas.

La Figura 52 es una representanción diagramática del plásmido binario pBELF8. The eCaMV 35S: LBG: nos 3’ gene was constructed by replacing el fragmento GUS from pBE2113-GUSs con the Lavandula F3’5’H LBG ADNc clone from pLHF8 La construcción de pBELF8 se describe en el Ejemplo 7. Refiérase a la Tabla 2 y a la Tabla 4 para una descripción de las abreviaturas.

Descripción detallada de las realizaciones preferidas

De acuerdo con la presente invención, las secuencias que codifican los polipéptidos que tienen actividad F3'5'H se han identificado, clonado y definido. Las secuencias genéticas recombinantes de la presente invención permiten la modulación de la expresión de genes que codifican esta enzima, por ejemplo, por expresión de novo, sobreexpresión, supresión de sentido, inhibición antisentido, ribozima, minimización y actividad de la ADNzima, inducción de ARNi o inducción de la metilación u otras actividades transcripcionales o de silenciamiento postranscripcional. La inducción de ARNi incluye moléculas genéticas tales como ADN o ARN de horquilla, de cadena recta corta, y ADNs o ARNs parcialmente de cadena doble con uno o dos sobreporciones de nucleótidos de cadena sencilla. La capacidad para controlar la síntesis de F3'5'H en plantas permite la modulación de la composición de las antocianinas individuales así como la alteración de los niveles relativos de flavonoles y antocianinas, permitiendo por lo tanto la manipulación de color de los pétalos. Además, la presente invención se extiende a plantas y a partes reproductivas o vegetativas de las mismos incluyendo flores, frutos, semillas,

vegetales, hojas, tallos y similares. La presente invención se extiende adicionalmente a plantas ornamentales transgénicas o genéticamente modificadas. El término "transgénico" también incluye plantas de progenie y plantas de cruzamientos genéticos subsecuentes y/o de los mismos a partir de plantas transgénicas primarias.

De acuerdo con lo anterior, un aspecto de la presente invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifican o son complementarios a una secuencia que codifica F3'5'H donde la secuencia de nucleótidos codifica una secuencia de aminoácidos seleccionada de la lista consistente de SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 16 o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente 90% de similitud con al menos una de las secuencias de aminoácidos seleccionada de la lista consistente de SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 16, donde la expresión de dicha molécula de ácido nucleico en un tejido de pétalo de rosa da como resultado niveles detectables de moléculas de delfinidina o basadas en delfinidina tal como se miden mediante una técnica cromatográfica.

Preferiblemente una molécula de ácido nucleico aislada de la invención comprende una secuencia de nucleótidos que codifica o es complementaria a una secuencia que codifica una F3'5'H o un polipéptido que tiene actividad de F3'5'H donde la expresión de dicha molécula de ácido nucleico en un tejido de pétalo de rosa da como resultado un nivel y longitud suficiente de transcripto el cual es traducido a dicha F3'5'H según se determina mediante niveles detectables de moléculas de delfinidina o basadas en delfinidina tal como se mide mediante una técnica cromatográfica.

Preferiblemente de manera adicional la presente invención está dirigida a una molécula de ácido nucleico aislada tal como se define aquí que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica o es complementaria a una secuencia que codifica una F3'5'H o un polipéptido que tiene actividad de F3'5'H donde la expresión de dicha molécula de ácido nucleico en un tejido de pétalo de rosa da como resultado un transcripto de longitud completa que es detectable por un análisis de inmunoprecipitación Northern de ARN total aislado a partir de los pétalos de rosa.

La presente invención está descrita y ejemplificada aquí con referencia a la identificación, clonación y manipulación de secuencias genéticas que codifican una F3'5'H la cual actúa como DHK así como DHQ. Preferiblemente, la enzima de F3'5'H es F3'5'H de salvia. La enzima F3'5'H también puede ser considerada con la inclusión de un polipéptido o proteína que tiene una actividad de F3'5'H o actividad similar a F3'5'H. La actividad abarca derivados que tienen actividades de F3'5'H alteradas.

Un aspecto preferido de la invención, por lo tanto, está dirigido a una molécula de ácido nucleico tal como se define aquí que comprende una secuencia de nucleótidos que codifican, o son complementarios a una secuencia que codifica una F3'5'H o un mutante funcional, derivado, parte, fragmento, homólogo o análogo de la misma donde la molécula de ácido nucleico está caracterizada por lo siguiente:

(i)

el transcripto de F3'5'H en tejido de pétalo de rosa es de suficiente nivel y tamaño para codificar una F3'5'H que da como resultado moléculas detectables de delfinidina o basadas en delfinidina en el tejido de pétalo de rosa según se mide mediante un procedimiento cromatográfico (por ejemplo TLC o HPLC);

(ii)

el transcripto de F3'5'H en tejido de pétalos de rosa es de longitud completa y se detecta mediante análisis de inmunoprecipitación Northern del ARN total aislado a partir de tejido de pétalo de rosa

(iii) la F3'5'H en tejido de pétalos de rosa da como resultado moléculas detectables de delfinidina o basadas en delfinidina según se mide mediante un procedimiento cromatográfico (por ejemplo, TLC o HPLC); y / o

(iv) la F3'5'H da como resultado un cambio de color visible en tejidos de pétalo de rosa.

El término pigmentos basados en delfinidina incluyen la antocianidina, la delfinidina o cualquier derivado de los mismos incluyendo pero no limitándose a formas glicosiladas, aciladas, metiladas u otras. Las formas metiladas de la delfinidina incluyen pero no se limitan a la antocianidina petunidina (metilada en la posición 3’), malvidina (metilada en las posiciones 3’ y 5’), 5-O metilmalvidina (metilada en las posiciones 5, 3’ y 5’), 5,7-O dimetilmalvidina (metilada en las posiciones 5, 7, 3’ y 5’). Las anticianidinas metiladas también pueden ser modificadas por glicosilación y acilación. El término antocianinas define formas glicosiladas de las antocianidinas respectivas.

Con el término “molécula de ácido nucleico” se entiende una secuencia genética en una condición de origen no natural. Generalmente, esto significa aislado de su estado natural o sintetizado o derivado en un ambiente de origen no natural. Más específicamente, incluye moléculas de ácido nucleico formadas o mantenidas in vitro, incluyendo fragmentos de ADN genómico, moléculas recombinantes o sintéticas y ácidos nucleicos en combinación con ácidos nucleicos heterólogos. También se extiende al ADN o ADNc genómico o a partes de los mismos que codifican F3’5’H o una parte de los mismos en orientación reversa con respecto a su promotor propio o a otro. Se extiende adicionalmente a secuencias de origen natural que siguen al menos una purificación parcial con respecto a otras secuencias de ácidos nucleicos.

El término “secuencias genéticas” se utiliza aquí en su sentido más general y abarca cualquier serie contigua de bases de nucleótidos que especifican directamente, o a través de una serie de bases complementarias, una secuencia de aminoácidos en una enzima F3’5’H. Tal secuencia de aminoácidos puede constituir una F3’5’H de longitud completa, tal como la definida en SEQ ID NO: 10 (pensamiento) o SEQ ID NO:12 (pensamiento) o SEQ ID NO: 14 (salvia) o SEQ ID NO: 16 (salvia) o SEQ ID NO:18 (solia) o SEQ ID NO: 32 (lavanda) o SEQ ID NO: 27 (kennedia) o una forma activa truncada de las mismas o puede corresponder a una región particular tal como una porción de terminal N, de terminal C, o interna de la enzima. Una secuencia genética también puede ser denominada como secuencia de nucleótidos o una secuencia de nucleótidos se le incluye una función recombinante de dos o más secuencias.

De acuerdo con los aspectos anteriores de la presente invención, se proporciona una molécula de ácidos nucleicos que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada de la lista consistente de SEQ ID NO: 13 y SEQ ID NO: 15 o una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 80% de identidad con al menos una de las secuencias de nucleótidos seleccionadas de la lista consistente de SEQ ID NO: 13 y SEQ ID NO: 15 o una secuencia de nucleótidos capaz de hibridar a al menos una de las secuencias de nucleótidos seleccionadas de la lista consistente de SEQ ID NO: 13 y SEQ ID NO: 15 o una forma complementaria de las mismas bajo condiciones de alta restricción.

La Tabla 1 proporciona un resumen de los identificadores de secuencia.

Porcentajes de similitudes e identidades alternativas (a nivel de nucleótidos o aminoácidos) incluyen al menos aproximadamente 60% o al menos aproximadamente 65% o al menos aproximadamente 70% o al menos aproximadamente 75% o al menos aproximadamente 80% o al menos aproximadamente 85% o al menos aproximadamente 90% o superior, tal como aproximadamente 95% o aproximadamente 96% o aproximadamente 97% o aproximadamente 98% o aproximadamente 99%, tales como al menos aproximadamente 60%, 61%, 62%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%.

En una realización particularmente preferida se proporciona una molécula de ácido nucleico aislada tal como se definió anteriormente, donde dicha secuencia de nucleótidos codifica un polipéptido que tiene una actividad de F3’5’H.

Para los propósitos de determinación de nivel de restricción para definir las moléculas de ácido nucleico capaces de hibridar a SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 9, o SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO:13 o SEQ ID NO:15 o SEQ ID NO:17 o SEQ ID NO: 31 o SEQ ID NO:26, con referencia aquí a una baja restricción incluye y abarca desde al menos aproximadamente 0% hasta al menos aproximadamente 15% v/v de formamida y desde aproximadamente 1 M hasta aproximadamente 2 M de sal para hibridación, y al menos hasta aproximadamente 1 M hasta aproximadamente 2 M de sal para condiciones de lavado. En general, una restricción baja va desde aproximadamente 25-30ºC hasta aproximadamente 42ºC. La temperatura pude ser alterada y utilizarse temperaturas más altas para remplazar la inclusión de formamida y/o para dar condiciones de restricción alternativas. Las condiciones de restricción alternativas pueden aplicarse cuando sea necesario, tal como restricción media, la cual incluye y abarca desde al menos aproximadamente 16% v/v hasta al menos aproximadamente 30% v/v de formamida y desde aproximadamente 0.5 M hasta aproximadamente 0.9 M de sal para hibridación, y al menos aproximadamente 0.5 M hasta al menos aproximadamente 0.9 M de sal para condiciones de lavado, o de alta restricción, que incluye y abarca desde al menos aproximadamente 31% v/v hasta al menos aproximadamente 50% v/v de formamida y desde al menos aproximadamente 0.01 M hasta al menos aproximadamente 0.15 M de sal para hibridación, y al menos aproximadamente 0.01 M hasta al menos aproximadamente 0.15 M de sal para condiciones de lavado. En general, el lavado se lleva a cabo a Tm = 69.3 + 0.41 (G + C) % (Marmur and Doty, J. Mol. Biol. 5:109, 1962). Sin embargo, la Tm de un ADN dúplex disminuye en 1ºC con cada incremento de 1% en el número de pares de bases no coincidentes (Bonner and Laskey, Eur. J. Biochem. 46:83, 1974). La formamida es opcional en estas condiciones de hibridación. De acuerdo con lo anterior, los niveles preferidos particularmente de restricción se definen como sigue: restricción baja es 6 x por reguladores SSC, 1% p/v de SDS a 25-42ºC. Una restricción moderada es 2 x regulador SSC, 1.’% p/v de SDS a una temperatura en el rango de 20ºC a 65ºC. Restricción alta es 0.1 x regulador de SSC, 0.1% p/v de SDS en una temperatura de al menos 65ºC.

También se divulgan aquí moléculas de ácidos nucleicos que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifican o son complementarios a una secuencia que codifica una secuencia de aminoácidos sustancialmente tal como se define en SEQ ID NO: 10 o SEQ ID NO: 12 o SEQ ID NO: 14 o SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 18 o SEQ ID NO: 32 o SEQ ID NO: 27 o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 50% de similitud a las mismas.

El término similitud tal como se utiliza aquí incluye una identidad exacta entre secuencias comparadas a nivel de nucleótidos o de aminoácidos. Cuando hay una no identidad a nivel de nucleótidos, el término similitud incluye diferencias entre secuencias que dan como resultado diferentes aminoácidos que no obstante están relacionados uno con otro a niveles estructurales, funcionales, bioquímicos y/o conformacionales. Cuando hay no identidad a nivel de aminoácido, similitud incluye aminoácidos que están no obstante relacionados uno con otro a niveles estructurales, funcionales, bioquímicos y/o conformacionales. En una realización particularmente preferida, las comparaciones de nucleótidos y secuencias se hacen a nivel de identidad más que de similitud.

Los términos utilizados para describir las relaciones de las secuencias entre dos o más polinucleótidos o polipéptidos incluyen “secuencia de referencia”, “ventana de comparación”, “similitud de secuencia”, “identidad de secuencia”, “porcentaje de similitud de secuencia”, “porcentaje de identidad de secuencia”, “sustancialmente similar” y “identidad sustancial”. Una “secuencia de referencia” es al menos 12 pero frecuentemente 15 a 18 y frecuentemente al menos 25 o más, tal como 30 unidades de monómero, incluyendo nucleótidos y residuos de aminoácidos, en longitud. Debido a que dos polinucleótidos pueden comprender (1) una secuencia (esto es solamente una porción de la secuencia de polinucleótidos completa) que es similar entre dos polinucleótidos, y (2) una secuencia que es divergente entre los dos polinucleótidos, las comparaciones de secuencia entre dos (o más) polinucleótidos se lleva a cabo típicamente comparando secuencias de los dos polinucleótidos en una “ventana de comparación” para identificar y comparar regiones locales de similitud de secuencia. Una “ventana de comparación” se refiere a un segmento conceptual de típicamente 12 residuos contiguos que se compara con una secuencia de referencia. La ventana de comparación puede comprender adiciones o eliminaciones (esto es brechas) de aproximadamente 20%

o menos en comparación con la secuencia de referencia (la cual no comprende adiciones o eliminaciones) para un alineamiento óptimo de las dos secuencias. El alineamiento óptimo de secuencias para alinear una ventana de comparación puede ser llevado a cabo mediante implementaciones computarizadas de algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Drive Madisson, WI, Estados Unidos) o por inspección y el mejor alineamiento (esto es resultante en el porcentaje más alto de homología frente a la ventana de comparación) generado por cualquiera de los diversos métodos seleccionados. También se hace referencia a la familia BLAST de programas, por ejemplo, como los divulgados por Altschul et al. (Nucl. Acids Res 25: 3389-3402, 1997). Una discusión detallada de análisis de secuencias puede encontrarse en la unidad 19.3 de Ausubel et al. (“Current Protocols in Molecular Biology” Jonh Wiley & Sons Inc, 1994-1998, Chapter 15, 1998).

Los términos “similitud de secuencia” y “identidad de secuencia” tal como se utilizan aquí se refieren al grado en que las secuencias son idénticas o funcional o estructuralmente similares sobre una base nucleótido por nucleótido sobre una base aminoácido por aminoácido sobre una ventana de comparación. Así, un “porcentaje de identidad de secuencia”, por ejemplo, se calcula comparando dos secuencias alineadas óptimamente en la ventana de comparación, determinando el número de posiciones en las cuales la base de ácidos nucleicos idénticos (por ejemplo, A, T, C, G, I) o los residuos de aminoácidos idénticos (por ejemplo, Ala, Pro, Ser, Thr, Gly, Val, Leu, Lle, Phe, Tyr, Lys, Arg, His, Asp, Glu, Asn, Gln, Cys y Met) se presentan ambas secuencias para producir el número de posiciones coincidentes, dividiendo el número de posiciones coincidentes con el número total de posiciones en la ventana de comparación (esto es, el tamaño de la ventana), y multiplicando el resultado por 100 para dar el porcentaje de identidad de secuencia. Para los propósitos de la presente invención, “identidad de secuencia” será entendida como el “porcentaje de coincidencia” calculado mediante el programa de ordenador ADNSIS (versión 2.5 para Windows; disponible de Hitachi Software engineering Co., Ltd., South San Francisco, California, Estados Unidos) utilizando valores de preferencia estándar tal como se usan en el manual de referencia que acompaña al Software. Se aplican comentarios similares a la similitud de secuencia.

Las moléculas de ácido nucleico de la presente invención pueden ser caracterizadas adicionalmente por tener, o haber tenido antes de la derivación, un contenido de AT global inferior (o un contenido de GC superior) en comparación con una molécula de ácido nucleico que codifica una F3’5’H pero que no da como resultado un transcripto intacto detectable en el tejido de pétalos de rosa o, cuando se expresa, no da como resultado moléculas de delfinidina o basadas en delfinidina detectables, tal como se mide mediante un procedimiento cromatográfico tal como TLC o HPLC. Adicionalmente, el % de A o T en la tercera posición de un codón también es inferior a otras enzimas de F3’5’H. Al hacer referencia aquí a procedimientos cromatográfícos se incluye un procedimiento relacionado. Por “relacionado” se entiende un procedimiento técnicamente relacionado o un procedimiento que proporciona un resultado similar. Ejemplo de procedimientos relacionados incluyen otras formas de cromatografía (por ejemplo, cromatografía de gases).

Además, las secuencias y nucleótidos que no se expresan bien en tejidos de rosa pueden modificarse por ejemplo reduciendo el porcentaje de AT global o al menos reduciendo los niveles de porcentaje de AT en la tercera posición de un codón para elevar la expresión en los tejidos de rosa.

Los oligonucleótidos útiles como son las genéticas para las reacciones de amplificación o como moléculas antisentido o sentido capaces de regular la expresión del gen correspondiente en una planta también se divulgan aquí. Las moléculas sentido incluyen constructos en horquilla, ADN y ARN de cadena doble cortas y ADN y ARN de cadena doble parcialmente con uno o más sobrantes de nucleótidos de cadena sencilla. Una molécula antisentido tal como se utiliza aquí también puede abarcar un constructo genético que contiene el gen genómico estructural o de ADNc o parte del mismo en orientación reversa con respecto a su promotor o a otro. También puede abarcar una secuencia genética homóloga. Una molécula de antisentido o sentido también pude ser dirigida a porciones terminales o internas del gen que codifica un polipéptido que tiene una actividad de F3’5’H o a combinaciones de los anteriores de tal forma que la expresión del gen se reduce o elimina.

Con respecto al aspecto descrito anteriormente un oligonucleótido puede comprender de 5-50 nucleótidos, tales como 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55 que tiene similitud sustancial a una parte

o región de una molécula con una secuencia de nucleótidos definida en SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO: 13 o SEQ ID NO: 15 o SEQ ID NO: 17 o SEQ ID NO: 31 o SEQ ID NO: 26. Por similitud o complementariedad sustancial en este contexto se entiende una similitud hibridable bajo condiciones de restricción bajas, alternativa y preferiblemente medias y alternativa y lo más preferiblemente altas específicas para hibridación de oligonucleótidos (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor laboratories, Cold Spring Harbor, NY, Estados Unidos 1989). Tal oligonucleótido es útil, por ejemplo, en la selección de secuencias genéticas de F3’5’H a partir de diversas fuentes o para monitoreo de una secuencia genética introducida en una planta transgénica. El oligonucleótido preferido está dirigido a una secuencia genética de F3’5’H o a una secuencia conservada con un genero de plantas, especie de plantas y/o variedad de plantas.

El oligonucleótido descrito anteriormente puede corresponder al extremo 5’ o 3’ de las secuencias genéticas de F3’5’H. Para conveniencia, el extremo 5’ se considera aquí como definidor de una región que está sustancialmente entre el codón de inicio del gen estructural hasta una porción central del gen, y el extremo 3’ se considera aquí como definidor de una región que sustancialmente está entre la porción central del gen y el codón determinación del gen estructural. Por lo tanto, es claro que los oligonucleótidos o sondas pueden hibridar el extremo 5’ o el extremo 3’ de una región común tanto a los extremos 5’ como 3’.

La secuencia de ácidos nucleicos que codifica una F3’5’H o diversos derivados funcionales de la misma tal como se define aquí pude ser utilizado para reducir el nivel de una F3’5’H endógena (por ejemplo mediante la cosupresión o supresión mediada por antisentido) u otros procesos de silenciamiento genético postranscripcionales (PTGS) incluyendo ARNi o alternativamente la secuencia de aminoácidos que codifica esta enzima o diversos derivados o partes de la misma utilizados en la orientación sentido o antisentido para reducir el nivel de una F3’5’H. El uso de estas cadenas, como cadenas dobles o parcialmente sencillas tales como constructos con bucles en horquilla es particularmente útil en la inducción de una respuesta de PTGS. En una alternativa adicional, podrían utilizarse ribozimas, minizimas o ADNzimas para inactivar secuencias de ácidos nucleicos objetivo.

La inhibición postranscripcional puede ser utilizada para reducir la traducción en material polipeptídico. En la alternativa, la metilación puede ser inducida o retirada.

La referencia aquí a la alteración de una actividad de F3’5’H se relaciona con una elevación o reducción de la actividad de hasta un 30% o más preferiblemente de 30-50% o aún más preferiblemente de 50-75% o aún más preferiblemente 75% o más por encima o por debajo de los niveles endógenos o existentes normales de actividad. Tal elevación o reducción puede denominarse como modulación de la actividad de la enzima F3’5’H. En general, la modulación está al nivel de la transcripción o traducción de las secuencias genómicas de F3’5’H.

Los ácidos nucleicos de la presente invención pueden ser un ácido ribonucleico o ácidos desoxirribonucleico, de cadena sencilla o doble y moléculas circulares cerradas lineales o covalentemente. Preferiblemente, la molécula de ácido nucleico es ADNc. Otras moléculas de ácido nucleico que hibridizan bajo condiciones de baja, preferiblemente media y lo más preferiblemente alta restricción con las moléculas de ácido nucleico de la presente invención y en particular con la secuencia de nucleótidos definida en SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO: 13 o SEQ ID NO: 15 o SEQ ID NO: 17 o SEQ ID NO: 31 o SEQ ID NO: 26 o una parte de la región de las mismas también se divulga aquí. En su realización más preferida, la presente invención se extiende a una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos definida en SEQ ID NO: 13 o SEQ ID NO: 15 con una molécula que tiene al menos 90% de similitud a nivel de secuencia de nucleótidos con al menos una de las secuencias definidas en SEQ ID NO: 13 o SEQ ID NO: 15 y donde el ácido nucleico codifica o es complementario con una secuencia que codifica una enzima que tiene una actividad de F3’5’H. También se divulgan moléculas de ácidos nucleicos en la forma de cebadores o sondas de oligonucleótidos capaces de hibridar a una porción de moléculas de ácido nucleico contempladas anteriormente, y en particular a las definidas en SEQ ID NO: 9 SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO: 13 o SEQ ID NO: 15 o SEQ ID NO: 17 o SEQ ID NO: 31 o SEQ ID NO: 26, bajo condiciones bajas, preferiblemente medias y lo más preferiblemente altas de restricción. Preferiblemente una porción corresponde al extremo 5’ o el extremo 3’ del gen. Por conveniencia el extremo 5’ se considera aquí como definidor de una región sustancialmente entre el codón de inicio de la secuencia genética estructural hasta una porción central del gen, y el extremo 3’ se considera aquí como definidor de una región sustancialmente entre la porción central del gen y el codón de terminación de la secuencia genética estructural. Es claro, por lo tanto, que los oligonucleótidos o sondas pueden hibridar el extremo 5’ o el extremo 3’ a una región común a ambos extremos 5’ y 3’.

El término gen se utiliza en su sentido más amplio e incluye ADNc que corresponde a los exones de un gen. De acuerdo con lo anterior, una referencia hecha aquí a un gen debe tomarse incluyendo:

(i) un gen genómico clásico que consiste de secuencias reguladoras transcripcionales y/o de traducción y/o una región de codificación y/o secuencias no traducidas (esto es, intrones, secuencias no traducidas 5’-y 3’-); o

5 (ii) ARNm o ADNc correspondiente a las regiones de codificación (esto es, exones) y secuencias no traducidas de 5’-y 3’-del gen).

El término gen también se utiliza para describir moléculas sintéticas o de fusión que codifican todo o una parte del producto de expresión. En realizaciones particulares, los términos molécula de ácido nucleico y gen pueden ser usados de forma intercambiable.

10 El ácido nucleico o su forma complementaria puede codificar una enzima de longitud completa o una parte de un derivado de la misma. Por “derivado” se entiende cualquier sustitución eliminación y/o adición de aminoácidos individuales o múltiples con respecto a la enzima de origen natural y que retiene actividad de F3’5’H. En este aspecto, el ácido nucleico incluye la secuencia de nucleótidos de origen natural que codifica una F3’5’H o puede contener sustituciones, eliminaciones y/o adiciones de nucleótidos individuales o múltiples a dicha secuencia de

15 origen natural. Un ácido nucleico o su forma complementaria también puede codificar una “parte” de la F3’5’H, bien sea activa o inactiva, y tal molécula de ácido nucleico puede ser útil como una sonda de oligonucleótido, cebador para reacciones en cadena de polimerasa o en diversas técnicas mutagénicas o para la generación de moléculas antisentido.

Una referencia aquí a una “parte” de una molécula de ácido nucleico, secuencia de nucleótidos o secuencia de

20 aminoácidos, preferiblemente se relaciona con una molécula que contiene al menos aproximadamente 10 nucleótidos contiguos o 5 aminoácidos contiguos, según sea apropiado.

Los derivados de inserción de aminoácidos de la F3’5’H de la presente invención incluyen fusiones terminal amino y/o en el terminal carboxilo así como inserciones intrasecuencia de aminoácidos individuales o múltiples. Las variantes de secuencias de aminoácidos insercionales son aquellas en las cuales uno o más residuos de

25 aminoácidos son introducidos en un sitio predeterminado en la proteína a través de inserción aleatoria, lo cual también es posible con una selección adecuada del producto resultante. Las variantes por eliminación se caracterizan por la eliminación de uno o más aminoácidos de la secuencia. Las variantes de aminoácidos de sustitución son aquellas en las cuales al menos un residuo en la secuencia ha sido retirado y se inserta en un residuo diferente en su lugar. Las sustituciones típicas son aquellas que se hacen de acuerdo con la tabla 3.

30 Tabla 3 Residuos adecuados para sustituciones de aminoácidos

Residuo original

Sustituciones de ejemplo

Ala

Ser

Arg

Lys

Asn

Gln; His

Asp

Glu

Cys

Ser

Gln

Asn; Glu

Glu

Asp

Gly

Pro

His

Asn; Gln

(continuación)

Residuo original

Sustituciones de ejemplo

Ile

Leu; Val

Leu

Ile; Val

Lys

Arg; Gln; Glu

Met

Leu; Ile; Val

Phe

Met; Leu; Tyr

Ser

Thr

Thr

Ser

Trp

Tyr

Tyr

Trp; Phe

Val

Ile; Leu; Met

Cuando la F3’5’H es derivada por sustitución de aminoácidos, los aminoácidos se remplazan generalmente por otros aminoácidos que tienen propiedades similares, tales como hidrofobicidad, hidrofilicidad, electronegatividad , cadenas naturales voluminosas y similares. Las sustituciones de aminoácidos son típicamente de residuos individuales. Las inserciones de aminoácidos usualmente están en el orden de aproximadamente 1-10 residuos de aminoácidos y las eliminaciones variarán desde aproximadamente 1-20 residuos. Preferiblemente, las eliminaciones o inserciones se hacen en pares adyacentes, esto es una eliminación de dos residuos o inserción de dos residuos.

Las variantes de aminoácidos denominadas anteriormente pueden hacerse fácilmente utilizando técnicas sintéticas de péptidos bien conocidas en el arte, tales como síntesis de péptidos en fase sólida (Merrifield, J. Am. Chem. Soc.

85: 2149, 1964) y similares, o por manipulaciones de ADN recombinante. Las técnicas para hacer mutaciones por sustitución en sitios predeterminados en el ADN que tiene secuencias conocidas o parcialmente conocidas son bien conocidas e incluyen, por ejemplo, mutagénesis M13. La manipulación de las secuencia de ADN para producir variantes de proteínas que se manifiestan como variantes de sustitución, de inserción o eliminación están descritas convenientemente, por ejemplo, en Sambrook et al. (1989, supra).

Otros ejemplos de mutantes recombinantes o sintéticos y derivados de la enzima F3’5’H incluyen sustituciones, eliminaciones y/o adiciones individuales o múltiples de cualquier molécula asociada con la enzima tal como carbohidratos, lípidos y/o proteínas o polipéptidos.

Los términos “análogos” y “derivados” también se extienden a cualquier equivalente químico funcional de una F3’5’H y también a cualquier derivado aminoácido descrito anteriormente. Por conveniencia, la referencia a F3’5’H aquí incluye referencia a cualquier mutante, derivado, parte, fragmento, homólogo o análogo funcionales de los mismos.

Los métodos divulgados aquí se ejemplifican utilizando secuencias de aminoácidos derivados de pensamiento, salvia, solia o lavanda o kennedia puesto que estas representan la fuente más conveniente y preferida de material hasta la fecha. Sin embargo, una persona experimentada en la técnica apreciará inmediatamente que pueden aislarse secuencias similares a partir de un cierto número de fuentes tales como otras plantas o ciertos microorganismos. Ejemplos de otras fuentes adecuadas de genes que codifican F3’5’H incluyen, pero no se limitan a

Vitis spp., Babiana stricta, Pinus spp., Picea spp., Larix spp., Phaseolus spp., Vaccinium spp., Cyclamen spp., Iris spp., Pelargonium spp., Liparieae, Geranium spp., Pisum spp., Lathyrus spp., Clitoria spp., Catharanthus spp., Malva spp., Mucuna spp., Vicia spp., Saintpaulia spp., Lagerstroemia spp., bouchina spp., Plumbago spp., Hypocalyptus spp., Rhododendron spp., Linum spp., Macroptilium spp., Hibiscus spp., Hydrangea spp., Cymbidium spp., Millettia spp., Hedysarum spp., Lespedeza spp., Asparagus spp. Antigonon spp., Freesia spp., Brunella spp., Clarkia spp., etc.

De acuerdo con la presente invención, una secuencia de ácidos nucleicos de la invención que codifica una F3’5’H puede introducida en y expresarse en una planta transgénica bien sea en orientación proveyendo por lo tanto un medio bien sea para convertir substratos adecuados, si se sintetizan en la célula vegetal, finalmente en DHM, o alternativamente para inhibir tal conversión de metabolitos reduciendo o eliminando actividad endógena o existente de F3’5’H. La producción de estos sustratos 3’, 5’-hidroxilados los convertirá subsecuentemente en pigmentos basados en delfinidina que modificarán el color del pétalo y pueden contribuir a la producción de un color más azul. La expresión de la secuencia de ácidos nucleicos en la planta puede ser constitutiva, inducible o de desarrollo y también puede ser específica para un tejido. La palabra “expresión” se utiliza en su sentido más amplio para incluir la producción de ARN o de ARN y proteínas juntos. También se extiende a la expresión parcial de una molécula de ácido nucleico.

De acuerdo con este aspecto de la presente invención, se proporciona un método para producir una planta de rosa transgénica capaz de sintetizar una F3’5’H, comprendiendo dicho método transformar de manera estable una célula de una rosa con una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica o es complementaria con una secuencia que codifica una flavonoide 3’, 5’hidroxilasa (F3’5’H) donde la secuencia de nucleótidos codifica una secuencia de aminoácidos seleccionada de la lista consistente de SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 16 o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente 90% de similitud con al menos una de las secuencias de aminoácidos seleccionadas de la lista consistente de SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 16, bajo condiciones que permiten la expresión eventual de dicha secuencia de nucleótidos, regenerando una planta transgénica desde la célula y haciendo crecer dicha planta transgénica durante un tiempo y bajo condiciones suficientes para permitir la expresión de la secuencia de nucleótidos donde la expresión de dicha molécula de ácido nucleico en un tejido de pétalo de rosa da como resultado niveles detectables de moléculas de delfinidina o basadas en delfinidina tal como se miden mediante una técnica cromatográfica.

Un método para producir una planta transgénica con actividad nativa reducida o existente de flavonoide 3’, 5’ hidroxilasa también se divulga aquí, comprendiendo dicho método la transformación estable de una célula de una planta adecuada con una molécula de ácido nucleico la cual comprende una secuencia de nucleótidos que codifica o es complementaria a una secuencia que codifica una actividad de F3’5’H, regenerando una planta transgénica a partir de la célula y cuando sea necesario haciendo crecer dicha planta transgénica bajo condiciones suficientes para permitir la expresión del ácido nucleico.

Un método para producir una planta genéticamente modificada con actividad de F3’5’H nativa o asistente reducida también se contempla aquí, comprendiendo dichos métodos la alteración del gen de F3’5’H a través de la modificación de la secuencia nativa a través de la recombinación homóloga a partir de un gen de F3’5’H apropiadamente alterado o un derivado o parte del mismo introducido en la célula de la planta, y regenerando la planta genéticamente modificada a partir de la célula.

Tal como se utiliza aquí una enzima “nativa” es aquella, que es nativa o que se expresa de forma natural en una célula particular. Una enzima “no nativa” es una enzima no nativa a la célula pero que se expresa a través de la introducción de material genético en una célula vegetal por ejemplo, a través de un transgén. Una enzima “endógena” es una enzima producida por una célula pero que puede o puede no ser nativa para esa célula.

En una realización preferida, la presente invención contempla un método para producir una planta de rosa transgénica que exhibe propiedades florales o de florescencia alteradas, comprendiendo dicho método la transformación estable de una célula de una planta adecuada con un secuencia de ácido nucleico de la presente invención, regenerando una planta transgénica a partir de la célula y haciendo crecer dicha planta transgénica durante un tiempo y bajo condiciones suficientes para permitir la expresión de la secuencia de ácidos nucleicos.

Alternativamente, dicho método puede comprender transformar de forma estable una célula de una planta adecuada con una secuencia de ácidos nucleicos de la presente invención o su secuencia complementaria, regenerando una planta transgénica a partir de la célula y haciendo crecer dicha planta transgénica durante un tiempo y bajo condiciones suficientes para alterar el nivel de actividad de la F3’5’H nativa o existente. Preferiblemente el nivel alterado seria menor que el nivel nativa o existente de actividad de F3’5’H en una planta no transgénica comparable. Sin querer limitarse a la presente invención, una teoría del modo de acción es que la reducción de la actividad de la F3’5’H nativa requiere la expresión de la secuencia de aminoácidos introducida o su secuencia complementaria. Sin embargo, la expresión de la secuencia genética introducida o su complemento pueden no requerirse para alcanzar el efecto deseado: a saber, una planta en florecimiento que exhibe propiedades florales o de florescencia alteradas.

En una realización relacionada, la presente invención contempla un método para producir una planta de rosa transgénica que exhibe propiedades de florescencia alteradas, comprendiendo dicho método la alteración del gen flavonoide 3’, 5’-hidroxilasa a través de la modificación de las secuencias nativas mediante una recombinación homologa a partir de un gen de F3’5’H apropiadamente alterado o un derivado o parte del mismo tal como se ha definido aquí anteriormente introduciéndolo en la célula vegetal, y regenerando la planta genéticamente modificada a partir de la célula.

Preferiblemente, las características florales o de florescencia alteradas incluyen la producción de diferentes tonalidades de flores azules o púrpura o rojas o de otros colores, dependiendo del genotipo y de las condiciones fisiológicas de la plata receptora.

De acuerdo con lo anterior, la presente invención se extiende a un método para producir una planta de rosa transgénica capaz de expresar un gen recombinante que codifica una F3’5’H o una secuencia complementaria de la misma tal como se definió aquí anteriormente, comprendiendo dicho método la transformación estable de una célula de una planta adecuada con la molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifican, o son complementarios a una secuencia que codifican una F3’5’H tal como se definió anteriormente, donde sea necesario bajo condiciones que permitan la expresión eventual de dicha molécula de ácido nucleico aislada y la regeneración de una planta transgénica a partir de la célula. Por planta adecuada se entiende una planta capaz de producir DHK y poseer las propiedades fisiológicas apropiadas requeridas para el desarrollo del color deseado.

Una persona experimentada en la técnica reconocerá inmediatamente las variaciones aplicables a los métodos de la presente invención, tales como incremento o decremento de la expresión de la enzima presente de forma natural en una planta objetivo que lleva a diferentes tonalidades de colores tales como diferentes tonalidades de azul, púrpura

o rojo.

La presente invención, por lo tanto, se extiende a todas las plantas de rosas transgénicas o partes de células de las mismas de plantas transgénicas o progenie de las plantas transgénicas que contienen secuencias de ácidos nucleicos de la presente invención, o formas antisentido de las mismas y/o homólogos o formas relacionadas de las mismas tal como se definió aquí anteriormente y, en particular, aquellas plantas transgénicas que exhiben propiedades florales o de florescencia alteradas. Las plantas transgénicas pueden contener una molécula de ácido nucleico introducida que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica o es complementaria a una secuencia que codifica una F3’5’H. En general, el ácido nucleico sería introducido de manera estable en el genoma de la planta, aunque la presente invención también se extiende a la introducción de una secuencia de nucleótidos de F3’5’H dentro de una secuencia de ácido nucleico de replicación autónoma tal como un virus de ADN o de ARN capaz de replicarse dentro de la célula vegetal. La invención también se extiende a semillas de tales plantas transgénicas. Tales semillas, especialmente si están coloreadas, son útiles para marcaciones de propiedad de las plantas. Cualquiera y todos los métodos para introducir material genético en plantas vegetales incluyendo pero no limitándose a la transformación mediada por agrobacterium, el bombardeo de partículas biolísticas, etc., son abarcados por la presente invención.

Otro aspecto de la presente invención contempla el uso de extractos a partir de plantas transgénicas o partes o células de plantas de las mismas de las plantas transgénicas o progenie de las plantas transgénicas que contienen todo o parte de las secuencias de ácidos nucleicos de la presente invención y, en particular, los extractos de aquellas plantas transgénicas que se utilizan como aditivos para saborización o para alimentos o para productos para la salud o bebidas o zumos o colorantes.

Las partes de plantas contempladas por la presente invención incluyen, pero no se limitan a flores, frutos, vegetales, nueces, raíces, tallos, hojas o semillas.

Los extractos de la presente invención pueden derivarse a partir de las plantas o partes de plantas o células de las mismas en un cierto número de maneras diferentes incluyendo pero no limitándose a la extracción química o extracción por calor o filtración o exprimiendo o por pulverización.

La planta, parte de la planta o células de las mismas o extractos pueden utilizarse en cualquier número de diferentes maneras tales como por ejemplo la producción de un saborizante (por ejemplo, una esencia para alimentos), un aditivo para alimentos (por ejemplo, un estabilizador, un colorante), un producto para la salud (por ejemplo, un antioxidante, una tableta), un bebida (por ejemplo, vino, licor espirituoso, té) o un zumo (por ejemplo zumo de frutas)

o colorante (por ejemplo, colorante para alimentos, colorante para textiles, pigmento, pintura, tinte).

Un aspecto adicional de la presente invención está dirigido a formas recombinantes de F3’5’H. Las formas recombinantes de la enzima proveerán una fuente de material para investigación, por ejemplo, enzimas más activas y puede utilizarse en el desarrollo de sistemas in vitro para la producción de componentes coloreados.

Aún un aspecto adicional de la presente invención contempla el uso de las secuencias genéticas descritas aquí en la manufactura de un constructo genético capaz de expresar una enzima F3’5’H en una planta de rosa.

El término constructo genético ha sido utilizado de forma intercambiable a lo largo de la especificación de reivindicaciones con los términos “molécula de fusión”, “molécula recombinante”, “secuencia de nucleótidos recombinantes”. Un constructo genético puede incluir una molécula de ácido nucleico individual que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de señal o puede contener múltiples marcos de lectura abiertos que codifican dos o más proteínas. También puede contener un promotor que está enlazado de manera operativa a uno o más de los marcos de lectura abiertos.

Otro aspecto de la presente invención está dirigido a un sistema eucariote que porta una secuencia genética que codifica una F3’5’H tal como se definió anteriormente de manera extracromosómica en forma de plásmido.

La presente invención se extiende adicionalmente a un polipéptido recombinante que comprende una secuencia de aminoácidos sustancialmente tal como se define en SEQ ID NO: 14 o SEQ ID NO: 16 o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90% de similitud con SEQ ID NO: 14 o SEQ ID NO: 16.

Un “polipéptido recombinante” significa un polipéptido codificado por una secuencia de nucleótidos introducida en una célula directa o indirectamente por intervención humana o en un padre o en otro familiar o precursor de la célula. Un polipéptido recombinante también puede hacerse utilizando sistemas de transcripción in vitro libres de células. El término “polipéptido recombinante” incluye un polipéptido aislado o cuando está presente en una célula o en una preparación celular. También puede estar en una planta o partes de una planta regeneradas a partir de una célula que produce dicho polipéptido.

Un “polipéptido” incluye un péptido o proteína y está abarcado por el término “enzimas”.

El polipéptido recombinante también puede ser una molécula de fusión que comprende dos o más secuencias heterólogas de aminoácidos.

La presente invención se describe adicionalmente mediante los siguientes ejemplos no limitantes.

Ejemplo 1

Métodos generales

En general, los métodos seguidos están descritos en Sambrook et al. (1989 supra) o Sambrook and Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY, USA, 2001 o Plant Molecular Biology Manual (2nd edition), Gelvin and Schilperoot (eds), Kluwer Academic Publisher, The Netherlands, 1994 o Plant Molecular Biology Labfax, Croy (ed), Bios scientific Publishers, Oxford, UK, 1993.

Los vectores de clonación pBluescript y PCR script fueron obtenidos de Stratagene Estados Unidos. La pCR7 2.1 fue obtenida de Invitrogen, Estados Unidos.

Transformación de E. coli

Las cepas de Escherichia coli usadas fueron:

DH5α

-

supE44, A (lacZYA-ArgF)U169, (ø80lacZ∆M15), hsdR17(rk , mk+),

recA1, endA1, gyrA96, thi-1, relA1, deoR. (Hanahan, J. Mol. Biol. 166: 557, 1983)

XLI-Blue

-

supE44, hsdR17(rk , mk+), recA1, endA1, gyrA96, thi-1, relA1,

lac -,[F’proAB, laclq, lacZ∆M15, Tn10(tetR)] (Bullock et al., Biotechniques 5: 376, 1987).

BL21-CodonPlus-RIL strain

ompT hsdS(Rb-mB-) dcm+ Tetr gal endA Hte [ argU ileY leuW Camr]

M15 E. coli is derived from E.coli K12 and has the phenotype Nals, Strs, Rifs, Thi -, Ara+, Gal+, Mtl -, F -, RecA+, Uvr+, Lon+.

La transformación de las cepas de E. coli fue llevada a cabo de acuerdo con el método de Inoue et al., (Gene 96: 2328, 1990).

Cepas y transformaciones de Agrobacterium tumefaciens

La cepa desarmada agrobacterium tumefaciens usada fue AGLO (Lazo et al. Bio/technology 9: 963-967, 1991).

Se introdujo plásmido de ADN en la cepa de Agrobacterium tumefaciens AGLO agregando 5 µg de plásmido de ADN a 100 µL de las células AGLO competentes preparadas por inoculación de un cultivo LB de 50 mL Sambrook et al., 1989, supra) y por incubación durante 16 horas con agitación a 28ºC. Las células fueron convertidas en pellas y resuspendidas en 0.5 ml de CaCl2 100 mM al 85% (v/v)/ glicerol al 15% (v/v). La mezcla de ADN-Agrobacterium fue congelada por incubación en N2 líquido durante 2 minutos y luego se dejó descongelar por incubación a 37ºC durante 5 minutos. La mezcla ADN/bacteriana fue colocada entonces sobre hielo durante 10 minutos adicionales. Las células fueron mezcladas entonces con 1 ml de medio LB (Sambrook et al., 1989 supra) e incubadas con agitación durante 16 horas a 28ºC. Se seleccionaros células de A. tumefaciens que portaban el plásmido sobre placas de LB agar que contenía antibióticos apropiados tales como 50 µg/ml de tetraciclina o 100 µg/ml de gentamicina. La confirmación del plásmido en el A. tumefaciens se hizo mediante trazado de mapas de restricción de endonucleasa de ADN aislado a partir de los transformantes resistentes al antibiótico.

Ligaciones de ADN

Las ligaciones de ADN fueron llevadas a cabo utilizando el Amersham Ligation Kit o Promega Ligation Kit de acuerdo con procedimientos recomendados por el fabricante.

Aislamiento y purificación de los fragmentos de ADN

Los fragmentos fueron aislados en general sobre un gel de agarosa al 1% (p/v) y se purificados utilizando el kit QIAEX II Gel Extraction (Qiagen) o el Kit Bresaclean (Bresatec, Australia) siguientes procedimientos recomendados por el fabricante.

Reparación de los extremos sobrantes después de la digestión con endonucleasas de restricción

Los extremos sobrantes 5' fueron reparados utilizando ADN polimerasa (fragmento de Klenow) de acuerdo con los protocolos estándar (Sambrook et al., 1989 supra). Los extremos sobrantes 3’ fueron reparados utilizando T4 ADN polimerasa de acuerdo con protocolos estándar (Sambrook et al., 1989 supra).

Eliminación de grupos fosforilo de ácidos nucleicos

Se utilizó típicamente fosfatasa alcalina de langostino (SAP) (USB) para eliminar grupos fosforilo de los vectores clonantes para evitar la recircularización de acuerdo con las recomendaciones del fabricante.

Reacción en cadena de polimerasa (PCR)

A menos que se especifique otra cosa, las condiciones para el PCR utilizando el ADN plásmido como molde incluyeron el uso de 2 ng de plásmido de ADN, 100 ng de cada cebador, 2 µL de mezcla de dNTP 10 mM, 5 µL de regulador de polimerasa 10 x TaqADN, 0.5 µL de TaqADN polimerasa en un volumen total de 50 µL. Las condiciones de ciclización comprendieron una etapa inicial de desnaturalización de 5 minutos a 94ºC, seguida por 35 ciclos de 94ºC durante 20 segundos, 50ºC durante 30 segundos y 72ºC durante 1 minuto con un tratamiento final a 72ºC durante 10 minutos antes del almacenamiento a 4ºC.

Los PCR fueron llevados a cabo en un Perkin Elmer GeneAmp PCR System 9600.

Marcación con 32P de sondas de ADN

Los fragmentos de ADN (50 a 100 ng) fueron marcados con radioactividad con 50 µCI de [α-32P]-dCTP utilizando un kit Gigaprime (Geneworks). El [α-32P]-dCTP no incorporado fue eliminado por cromatografía sobre columnas de Sephadex G-50 (fina) o columnas de cromatografía Microbiospin P-30 Tris (BioRad).

Aislamiento del plásmido

Las colonias individuales fueron analizadas en cuanto a insertos inoculando caldo LB (Sambrook et al., 1989, supra) con una selección de antibióticos apropiada (por ejemplo, 100 µg/ml de ampicilina o 10 a 50 µg/ml de tetraciclina,

etc.), e incubando el cultivo líquido a 37ºC (para E. coli) o 29ºC (para A. tumefaciens) durante aproximadamente 16 horas con agitación. El plásmido de ADN fue purificado utilizando el procedimiento de lisis alcalina (Sambrook et al., 1989, supra) o utilizando el sistema de purificación de ADN de minipreparaciones The WizardPlus SV (Promega) o Qiagen Plasmid Mini Kit (Qiagen). Una vez que se ha determinado la presencia de un inserto, se prepararon cantidades más grandes de plásmido de ADN a partir de 50 ml de cultivos durante la noche utilizando el procedimiento de lisis alcalina (Sambrook et al., 1989, supra) o el QIAfilter Plasmid Midi kit (Qiagen) y siguiendo las condiciones recomendadas por el fabricante.

Análisis de secuencia de ADN

El secuenciamiento de ADN se llevó a cabo utilizando el PRISM (marca registrada) Ready Reaction Dye Primer Cycle Sequencing Kits de Applied Biosystems. Se siguieron los protocolos suministrados por el fabricante. Las secuencias de ciclo de secuenciamiento fueron llevadas a cabo utilizando una máquina de PCR Perkin Elmer (GeneAmp PCR System 9600). Los recorridos de secuenciamiento se llevaron a cabo en general en el Australian Genome Research Facility en el The Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research (Melbourne, Australia) o localmente en un secuenciador de ADN automatizado 373A (Applied Biosystems).

Las secuencias fueron analizadas utilizando una aplicación MacVector™ (versión 6.5.3) (Oxford Molecular Ltd., Oxford, Inglaterra).

Las búsquedas de homología contra las bases de datos de Genbank, SWISS-PROT y EMBL se llevaron a cabo utilizando los programas FASTA y TFASTA (Pearson y Lipman, Proc Natl Acad Sci EE.UU. 85 (8): 2444-2448, 1988)

o los programas BLAST (Altschul et al, J. Mol Biol. 215 (3): 403-410, 1990). Se obtuvieron las similitudes en porcentaje de secuencias utilizando el programa LALIGN (Huang y Miller, Adv Appl Math. 12: 373-381, 1991) o el programa ClustalW (Thompson et al, Nucleic Acids Research 22: 4673-4680, 1994) dentro de la aplicación MacVector™ (Oxford Molecular Ltd., Inglaterra) utilizando valores predefinidos.

Las alineaciones de secuencias múltiples fueron producidas utilizando ClustalW (Thompson et al., 1994, supra) utilizando valores predefinidos.

Ejemplo 2

Transformaciones de plantas

Transformaciones de petunia híbrida (Sw63 x Skr4)

Tal como se describe en Holton et al. (1993a, supra) por cualquier otro método bien conocido en la técnica.

Transformaciones de rosa híbrida

Tal como se describe en la solicitud de patente de los Estados Unidos No. 542,841 (PCT/US91/04412) o por Robinson and Firoozabady (Scientia Horticulturae, 55: 83-99, 1993), Rout et al. (Scientia Horticulturae, 81: 201-238, 1999) o Marchant et al. (Molecular Breeding 4: 187-194, 1998) o por cualquier otro método bien conocido en la técnica.

Los cortes de rosa híbrida surgieron en general de Van Wyk y Son Flower Supply, Victoria.

Transformaciones de Dianthus caryophyllus

Solicitud internacional de patente No. PCT/US92/02612 (transformación de claveles). Tal como se describe en la solicitud internacional de patente No. PCT/AU96/00296 (clavel violeta), Lu et al. (Bio/Technology 9: 864-868, 1991), Robinson and Firoozabady (1993, supra) o por cualquier otro método conocido en la técnica.

Cortes de Dianthus caryophyllus cv. Kortina Chanel o Monte Lisa fueron obtenidos de Van Wyk and Son Flower Supply, Victoria.

Ejemplo 3

Análisis transgénico

Codificación de color Se utilizó el Royal Horticultural Society’s Color Chart (Kew, Reino Unido) para proveer una descripción del color observado. Proveyeron medios alternativos mediante los cuales se pueden describir los fenotipos de color observados. Los números designados, sin embargo, deben tomarse solamente como una guía de los colores percibidos y no deben considerarse como limitantes de los posibles colores que pueden ser obtenidos.

Análisis cromatográfico

Los análisis por cromatografía de capa fina (TLC) y por cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) fueron llevados a cabo en general como se describe en Brugliera et al. (Plant J. 5, 81-92, 1994), Extracción de anticianidinas Antes del análisis por HPLC, las moléculas de antocianina y flavonol presentes en los extractos de pétalos y

estamen fueron sometidos a hidrólisis ácida para eliminar unidades estructurales glicosilo del núcleo de antocianidina o flavonol. Se utilizaron estándares de antocianidina y flavonol para ayudar a identificar los compuestos presentes en los extractos florales.

Las antocianidinas en la mezcla de reacción se analizaron por HPLC a través de elución con gradiente utilizando condiciones de gradiente de 50% de B a 60% de B durante 10 minutos, luego 60% de B durante 10 minutos y finalmente 60% de B a 100% de B durante 5 minutos cuando el solvente A consistía de TFA: H2O (5:995) y el solvente B consistía de acetonitrilo: TFA: H2O (500:5:495). Se utilizó una columna de cartucho Asahi Pac ODP-50 (250 mm x 4.6 mm ID) para las separaciones cromatográficas en fase reversa. La rata de flujo fue de 1 ml/minuto y la temperatura fue de 40ºC. La detección de los compuestos de antocianidina se llevó a cabo utilizando un tres detector dimensional Shimadzu SPD-M6A a 400-650 nm.

Los picos de antocianidina fueron identificados por referencia con picos estándar, por ejemplo moléculas de delfinidina o basadas en delfinidina, petunidina, malvidina, cianidina y peonidina Etapas del desarrollo de las flores Petunia Petunia híbrida cv. Se recolectaron flores Skr4 x Sw63 en etapas de desarrollo definidas como sigue: Etapa 1: Sin pigmentación, yema cerrada. Etapa 2: Pigmentada, yema cerrada. Etapa 3: Yema pigmentada con corola emergente. Etapa 4: Pigmentada, flor abierta con anteras intactas (pre-dehiscencia)

Etapa 5: Flor completamente abierta con anteras con dehiscencia. Para el análisis por TLC o HPLC, se recolectaron pétalos de las flores de la etapa 4 en la etapa de acumulación de máxima de pigmento.

Para el análisis por inmunoprecipitación Northern, se recolectaron pétalos de las flores de las etapas 2 y 3 en la etapa de máxima expresión de los genes de la ruta de los flavonoides. Claveles Se recolectaron flores de Dianthus cariofilus en etapas de desarrollo definidas como sigue: Etapa 1: Yema cerrada, pétalos no visibles. Etapa 2: Yemas de flores en abertura: puntas de pétalos visibles. Etapa 3: Puntas de casi todos los pétalos expuestas. "Etapa de Brochazo". Etapa 4: Pétalos externos a un ángulo de 45º con respecto al tallo.

Etapa 5: Flor completamente abierta.

Para los análisis por TLC o HPLC, se recolectaron pétalos de flores de la etapa 4 en la etapa de máxima acumulación de pigmento. Para el análisis por inmunoprecipitación Northern, se recolectaron pétalos de flores de la etapa 3 en la etapa de

máxima expresión de los genes de la ruta de los flavonoides. Rosa Las etapas del desarrollo de las flores de rosa híbrida se definen como sigue: Etapa 1: Yema no pigmentada, apretadamente cerrada. Etapa 2: Yema apretadamente cerrada, pigmentada. Etapa 3: Yema cerrada pigmentada; sépalos apenas comenzando a abrir. Etapa 4: La yema de la floral comienza a abrir; pétalos fuertemente pigmentados; se han separado los sépalos. Etapa 5: Sépalos completamente desdoblados; algún rizamiento. Los pétalos están fuertemente pigmentados y

desdoblados.

Para el análisis por TLC o HPLC, se recolectaron pétalos de las flores de la etapa 4 en la etapa de máxima acumulación de pigmento. Para el análisis por inmunoprecipitación Northern, se recolectaron los pétalos de las flores de las etapas 3 a 4 en la

etapa de máxima expresión de los genes de la ruta de los flavonoides (Tanaka et al., Plant Cell Physiol., 36(6): 1023-1031, 1995).

Mediciones de antocianina/flavonol mediante mediciones espectrofotométricas Aproximadamente 200 mg de tejido de pétalos frescos se agregaron a 2 ml de metanol/HCl al 1% (v/v) y se incubaron durante aproximadamente 16 horas a 4ºC. Se hizo entonces una dilución 1 en 20 (por ejemplo, 50 µL se llevaron a 1000 (µL) y se registró la absorbancia de 350 nm y 530 nm.

Se calcularon entonces las cantidades aproximadas de flavonoles y de antocianinas (nmoles/gramo) de acuerdo con las siguientes fórmulas: Contenido de antocianina

(A530 /34,000) x volumen de regulador de extracción (mL) x factor de dilución x 106

masa de tejido de pétalos (gramos)

Contenido de flavonoles

A350 /14,300 x volumen de regulador de extracción (mL) x factor de dilución x 106

masa de tejido de pétalos (gramos)

Análisis por inmunoprecipitación Northern de ARN

La transcripción de un gen transferido fue monitoreada aislando el ARN y estimando la cantidad y tamaño del transcripto esperado. El análisis por inmunoprecipitación Northern fue utilizado para monitorear el nivel de estado de balance de transcriptos particulares en pétalos. Se determinó que un transcripto estaba intacto o de longitud completa con base en el tamaño estimado esperado para el gen utilizado. En general cuando se utilizaron ADNc como secuencias de codificación el tamaño del transcripto esperado sería el tamaño del ADNc más un componente 5' no traducido del fragmento del promotor fusionado más cualquier secuencia de 3' no traducida del fragmento del terminador fundido. En algunos casos cuando una región de ADNc contenía un sitio de poliadenilación putativo y la región terminadora contenía un sitio de poliadenilación putativa, se detectaron 2 transcriptos. Uno sería de un tamaño consistente con la poliadenilación que se presenta justo corriente abajo del sitio de poliadenilación dentro de

la secuencia de ADNc. El segundo transcripto sería más grande y consistente con el transcripto que está siendo poliadenilado después del sitio de poliadenilación dentro del fragmento terminador.

Se aisló el ARN total a partir de pétalos u hojas utilizando un kit Plant RNAeasy (QIAGEN) siguiendo los procedimientos recomendados por el fabricante. Para muestras de rosas se agregó PVP al 1% (p/v) al regulador de extracción.

Las muestras de ARN (5 µg) fueron sometidas a electroforesis a través de geles de agarosa con formaldehido 2.2 M /agarosa 1.2% p/v utilizando un regulador de desarrollo que contiene 40 mM de ácido morfolinopropanosulfónico (pH 7.0), acetato de sodio 5 mM, EDTA 0.1 mM (pH 8.0). El ARN fue teñido con bromuro de etidio y visualizado bajo luz UV. El ARN ribosomal se utilizó en general como guía en la confirmación de que el ARN no había sido degradado por ribonucleasas intra o extracelulares. El ARN fue transferido a filtros de membrana Hybond-N (Amersham) y tratado como lo describe el fabricante.

Se incluyeron las muestras de control sobre geles de ARN como medida de la integridad de la sonda radiomarcada y como guía para los tamaños de transcripciones esperados. Los controles para los genes petHf1 y petHf2 incluyeron el ARN aislado de pétalos de petunia OGB (etapas 3 a 4) o de flores de claveles transgénicos que previamente habían demostrado acumular transcriptos de petHf1. Los controles para otros genes F3'5'H incluyeron en general ARN aislado de los pétalos de la misma especie de la cual había sido aislada la secuencia F3'5'H.

Las inmunoprecipitaciones de ARN fueron probadas con fragmentos de marcados con 32P. La prehibridación (1 hora a 42ºC) y la hibridación (16 horas a 42ºC) de los filtros de membrana fue llevada a cabo en formamida al 50% v/v, NaCl 1 M, SDS al 1% p/v, sulfato de dextrano al 10% p/v. Los filtros de membrana fueron lavados en general en 2 x SSC, 1% p/v de SDS a 65ºC entre 1 a 2 horas y luego con 0.2 x SSC, SDS al 1% p/v a 65ºC durante 0.5 a 1 hora. Las membranas de filtro se expusieron en general a película Kodak XAR con una pantalla de intensificación a -70ºC durante 16 a 72 horas.

Ejemplo 4

Introducción de genes quiméricos de petunia F3'5'H en rosas

Tal como se describe en la introducción, el patrón de hidroxilación del anillo B de la molécula de antocianidina juega un papel clave en la determinación del color del pétalo. La producción del dihidroflavonol DHM lleva a la producción de los pigmentos púrpura/azules basados en delfinidina en plantas tales como petunias. La ausencia de la actividad F3'5'H ha sido correlacionada con la ausencia de flores azules en muchas especies de plantas tales como Rosa, Gerbera, Antirrhinum, Dianthus y Dendranthema.

Con base en el éxito en la producción de pigmentos basados en delfinidina en una línea de petunia mutante (Holton et al., 1993a, supra y la Solicitud Internacional de Patente No. PCT/AU92/00334), en flores de tabaco (Solicitud Internacional de Patente No. PCT/AU92/00334) y en flores de clavel (Solicitud Internacional de Patente No. PCT/AU96/00296), se introdujeron también genes quiméricos similares de petunia F3'5'H en rosas con el fin de producir novedosos pigmentos basados en delfinidina y modificar el color de la flore.

Preparación de los constructos del gen quimérico de petunia F3’5’H

En la Tabla 4 se presenta un resumen de los fragmentos de promotor, terminador y codón utilizado en la preparación de los constructos y las respectiva abreviaturas

TABLA 4 Abreviaturas usadas en las preparaciones de constructos (continuación) (continuación)

ABREVIATURA

DESCRIPCIÓN

AmCHS 5’

Fragmento de promotor de 1.2 kb del gen de Antirrhinum majus chalcona sintasa (CHS) (Sommer and Saedler, Mol Gen. Gent., 202: 429-434, 1986)

CaMV 35S

Aproximadamente 0.2 kb de fragmento que incorpora BG/II que contiene la región promotora del gen (CaMV 35S) del Virus Mosaico de la Coliflor (Franck et al., Cell 21: 285-294, 1980, Guilley et al., Cell, 30: 763-773, 1982)

ABREVIATURA

DESCRIPCIÓN

35S5’

Fragmento promotor del gen CaMV 35S (Franck et al.,1980, supra) con una secuencia de escalera no traducida de aproximadamente 60 bp 5’ del gen de la proteína enlazante de la clorofila a/b de petunia (gen Cab 22) (Harpster et al., MGG, 212: 182-190, 1988)

chrysCHS5’

Región promotora de un gen CHS de crisantemo (SEQ ID No.: 30)

eCaMV 35S

Promotor CaMV35S potenciado tal como lo describe Mitsuhara et al., Plant Cell Physiol. 37: 49-59,1996

GUS

Secuencia de codificación de β-glucuronidasa (GUS) (Jefferson, et al., EMBO J. 6: 3901-3907, 1987)

Mac

Promotor Híbrido consistente del gen de la manopina sintasa (mas) y la región potenciadora CaMV 35S (Comai et al., Plant Mol. Biol. 15: 373-381, 1990)

mas/35S

Promotor Híbrido consistente de una región promotora del gen CaMV 35S con elementos potenciadores de un fragmento promotor del gen de la manopina sintasa (mas) de Agrobacterium tumefaciens(Janssen and Gardner, Plant Molecular Biology, 14: 61-72,1989)

mas 5’

Región promotora del mas de A. tumefaciens

mas 3’

Región terminadora del gen mas de A. tumefaciens

nos 5’

Región promotora del gen de nopalina sintasa (nos) de A. tumefaciens (Depicker et al., J Mol. and Appl. Genetics 1: 561-573,1982)

nos 3’

Región terminadora del gen nos de A. tumefaciens (Depicker et al.,1982, supra)

nptII

Gen de Resistencia a la Kanamicina (codifica la neomicina fosfotransferasa la cual desactiva los antibióticos aminoglicosídicos tales como la kanamicina, la neomicina y el G418)

ocs 3’

Aproximadamente 1.6 kb de fragmento terminador del gen de octopina sintasa de A. tumefaciens (descrito en Janssen y Gardner, 1989, supra)

petD8 5’

Aproximadamente 3.2 kb de región promotora de un gen de proteína de transferencia de fosfolípidos (D8) de Petunia híbrida (Holton, Isolation and characterization of petal specific genes from Petunia hybrida. PhD thesis, University of Melbourne, Austral 1992) (SEQ ID NO: 24)

petD8 3’

Aproximadamente 0.7 kb de la región Terminadora de un gen de proteína de transferencia de fosfolípidos (D8) de Petunia híbrida cv. OGB (Holton, 1992, supra)

long petFLS 5’

Aproximadamente 4.0 kb de fragmento que contiene la región promotora de un gen de flavonol sintasa (FLS) de P híbrida.

short petFLS5’

Aproximadamente 2.2 kb de un fragmento que contiene la región promotora del gen FLS de P. híbrida

petFLS 3’

Aproximadamente 0.95 kb de un segmento que contiene la región terminadora del gen FLS de P. híbrida

ABREVIATURA

DESCRIPCIÓN

petHf1

Clon de Petunia F3’5’HHf1ADNc (Holton et al., 1993a, supra) (SEQ ID NO: 1)

petHf2

Clon de Petunia F3’5’HHf2ADNc (Holton et al.,1993a, supra) (SEQ ID NO:3)

petRT5’

Región promotora de un gen de antocianidín-3-glucosido ramnosiltransferasa (3RT) de P. híbrida (Brugliera, Characterization of floral specific genes isolated from Petunia hybrida. RMIT, Australia. PhD thesis, 1994)

petRT3’

Región terminadora de un gen de 3RT de P. híbrida (Brugliera, 1994, sura)

RoseCHS5’

Aproximadamente 2.8 kb de un fragmento que contiene la región promotora de un gen de CHS de Rosa híbrida(SEQ ID: 5)

SuRB

Gen de resistencia al Clorosulfuro (codifica Acetolactato Sintasa) con su propio terminador de Nicotiana tabacum (Lee et al., EMBO J. 7: 1241-1248, 1988)

Con el fin de producir moléculas de delfinidina y basadas en delfinidina en pétalos de rosa, se preparó un cierto número de constructos de vector binario utilizando los fragmentos F3'5'H ADNc de petunia y diversos fragmentos

5 promotores y terminadores. Los genes de petunia quimérica de F3'5'H demostraron ser exitosos en claveles y petunia llevando a transcriptos de F3'5'H intactos detectables (detectados por análisis de inmunoprecipitación Northern) y a la producción de pigmentos de moléculas de delfinidina o basadas en delfinidina. La Tabla 5 resume una lista de constructos de vector binario que contiene fragmentos de F3'5'H ADNc de petunia.

Tabla 5 Resumen de casetes de expresión del gen quimérico de petunia F3’5’H contenidos en constructos de 10 vectores binarios usados en la transformación de rosas (véase Tabla 4 para una explicación de las abreviaturas

PLÁSMIDO

GEN F3’5’H GEN MARCADOR SELECIONABLE

pCGP1452

AmCHS 5’: petHf1: petD83’ 35S 5’:SuRB

pCGP1453

Mac: petHf1: mas 3’ 35S 5’:SuRB

pCGP1457

petD85’: petHf1: petD83’ 35S 5’: SuRB

pCGP1461

short petFLS 5’: petHf1: petFLS 3’ 35S 5’: SuRB

pCGP1616

petRT5’: petHf1:nos 3’ 35S 5’:SuRB

pCGP1638

CaMV35S: petHf1:ocs 3’ 35S 5’:SuRB

pCGP1623

mas 35S: petHf1: ocs 3’ 35S 5’:SuRB

pCGP1860

RoseCHS5’: petHf1: nos3’ 35S 5’:SuRB

pCGP2123

CaMV35S: petHf2:ocs 3’ 35S 5’:SuRB

Aislamiento de clones de petunia F3'5'H ADNc (petHf1 y petHf2)

El aislamiento y caracterización de los clones de ADNc de petunia F3'5'H (pethf1 y petHf2 contenidos en pCGP602 (Figura 2) y pCGP175 (Figura 3), respectivamente) (SEC ID No: 1 y SEQ ID NO: 3, respectivamente) fueron descritos en la Solicitud Internacional de Patente No. PCT/AU92/00334 y Holton et al. (1993a, supra).

15 Los plásmidos pCGP601 (Figura 2), pCGP602 (Figura 2), pCGP176 (Figura 2) contienen homólogos del clon de petunia petHf1 F3'5'H ADNc. El plásmido pCGP601 contiene un homólogo de petunia de F3'5'H petHf1 que incluye 52 bp de secuencia 5' no traducida. El plásmido pCGP602 contiene un homólogo de F3'5'H petHf1 de petunia que incluye 125 bp de una secuencia 5' no traducida (SEQ ID No.: 1). El plásmido pCGP176 (descrito en Holton et al., 1993a supra) contiene un homólogo de la F3'5'H petHf1 de petunia que incluye 27 bp de secuencia no traducida 5’ y adicionalmente de forma aproximada 127 bp de la secuencia 3' no traducida sobre el clon de petunia F3'5'H petHf1 ADNc en pCGP602.

Construcción de pCGP1303 (petHf1 en esqueleto pUC19)

El clon de petunia F3'5'H ADNc contenido en el plásmido pCGP601 (descrito anteriormente) (Figura 2) incluye 52 pb de secuencia 5' no traducida y 141 pb de secuencia 3' no traducida incluyendo 16 pb de la cola poli A. El plásmido pCGP601 (Figura 2) fue linealizado inicialmente por digestión con la endonucleasa de restricción BspHI. Los extremos fueron reparados y el clon de petunia F3'5'H petHf1 ADNc fue liberado por digestión con la endonucleasa de restricción FspI. La secuencia de reconocimiento BspHI abarca el codón iniciador de la traducción putativa y la secuencia de reconocimiento FspI comienza a 2 pb corriente abajo del codón de detención. El fragmento de 1.6 kb que contiene el clon de petunia de F3'5'H petHf1 ADNc fue purificado con los extremos reparados EcoRI de pUC19 (New England Biolabs). La inserción correcta del fragmento fue establecida por análisis por endonucleasa de restricción del ADN aislado de transformantes resistentes a la ampicilina. El plásmido resultante fue designado como pCGP1303 (Figura 4).

Construcción de pCGP627 (petHf1 corto en esqueleto pBluescript)

El plásmido pCGP176 (Holton et al., 1993a, supra) (Figura 2) fue digerido con la endonucleasa de restricción SpeI y EcoRI. Los extremos fueron reparados y se permitió que se reunieran. El plásmido resultante fue designado como pCGP627 y contenía el clon de ADNc idéntico como sucede en el pCGP176 excepto que los sitios de restricción en la endonucleasa PstI, BamHI y SmaI fueron retirados del sitio de clonación múltiple del vector pBluescript en el extremo 5' del clon de ADNc.

El vector binario DCGP1452_ (AmCHS 5': petHf1: petH8 3')

El plásmido pCGP1452 (Figura 5) contiene un gen quimérico de petunia F3'5'H (petHf1) bajo el control de un fragmento promotor del gen de Antirrinum majus chalcona sintasa (CHS) (Sommer y Saedler, 1986, supra) con un fragmento terminador del gen de proteína de transferencia de fosfolípidos (PLTP) (petD8 3’) (Holton, 1992, supra). El casete F3'5'H de la petunia quimérica se utilizó en una orientación en tándem con respecto al gen 35S 5': SURB del vector binario, pWTT2132 (ADN Plant Technologies, USA = ADNP) (Figura 6).

Intermedios en la preparación del pCGP1452 binario

El vector binario pWTT2132

El plásmido del vector binario pWTT2132 (ADNP) (Figura 6) contiene un gen quimérico comprendido de la secuencia promotora de 35S 5' (Franck et al., 1980, supra), ligada con la región de codón y una secuencia de terminación para el gen de la acetolactato sintasa (ALS) del locus SuRB de tabaco (Lee et al., 1988, supra). Se incluye una secuencia de aproximadamente 60 bp de guía 5' no traducida del gen de enlazamiento de la proteína a/b de clorofila de petunia (Cab 22 gen) (Harpster et al, MGG, 212:. 182-190, 1988) entre el fragmento promotor 35S 5' y la subsecuencia el SuRB.

Construcción de pCGP725 (AmCHS 5 ': petHf1: petD8 3' en pBluescript)

Un gen quimérico de petunia F3'5H bajo el control del promotor de Antirrinum majus CHS (AmCHS 5') con un terminador de petunia PLTP (petD8 3') fue construido clonando el fragmento de 1.6kb de petunia F3'5'H (petHf1 ) Bc/I/FspI de pCGP602 (Holton et al., 1993a, supra) (Figura 2) entre un fragmento del gen CHS de 1.2 kb del gen CHS Antirrinum majus 5' al sitio de iniciación de la traducción (Sommer y Saedler, 1986, supra) y un fragmento de

0.7 kb SmaI/XhoI PLTP (petD8 3') de pCGP13∆Bam (Holton, 1992, supra), 3' hasta el codón de detención deducido. El plásmido resultante en un vector esqueleto de pBluescript KS II (Stratagene, ESTADOS UNIDOS.) fue designado pCGP725 (Figura 7).

Construcción de pCGP485 y pCGP1452 (vectores binarios AmCHS 5’: petHf1: petD8 3’)

El gen quimérico F3'5'H de pCGP725 (Figura 7) fue clonado en el vector binario pCGN1547 que contiene un casete de gen marcador seleccionable nptll (McBride and Summerfelt Plant Molecular Biology 14: 269-276, 1990) para crear pCGP485. Un fragmento de 3.5 kb que contiene el casete AmCHS 5': petHf1: petD8 3' fue liberado por digestión de pCGP485 con la endonucleasa de restricción PstI. Los extremos sobrantes fueron repararados y el fragmento purificado de 3.5 kb fue ligado a los extremos SmaI del vector binario, pWTT2132 (ADNP). La inserción correcta del fragmento en una orientación en tándem con respecto al casete del gen marcador seleccionable 35S 5': SuRB se estableció por análisis con endonucleasas de restricción del plásmido de ADN aislado a partir de los transformantes resistentes a la tetraciclina. El plásmido fue designado como pCGP1452 (Figura 5).

Transformación de las planta con pCGP1452

El ADN-T contenido en el plásmido vector binario pCGP1452 (Figura 5) fue introducido en rosas a través de una transformación mediada por Agrobacterium.

El vector binario pCGP1453 (Mac: petHf1: mas de 3 ')

El plásmido pCGP1453 (Figura 8) contiene un gen quimérico de petunia F3'3'H (petHf1) bajo el control de un promotor Mac (Comai et al., 1990, supra) con un fragmento terminador del gen de manopina sintasa de Agrobacterium (mas 3'). El casete quimérico de petunia F3'5'H está en una orientación en tándem con respecto al casete del gen marcador seleccionable 35S 5': SuRB del vector binario, pWTT2132 (ADNP) (Figura 6).

Un fragmento de 3,9 kb que contiene el gen Mac: petHf1: Mas 3' fue liberado del plásmido pCGP628 (descrito en la Solicitud Internacional de Patente No. PCT/AU94/00265) por digestión con la endonucleasa de restricción PstI. Los extremos sobrantes fueron repararados y el fragmento purificado fue ligado con extremos SmaI de pWTT2132 (ADNP). La inserción correcta del gen Mac: petHf1: Mas 3' en una orientación en tándem con respecto al casete del gen marcador seleccionable 35S 5': SuRB fue establecido por análisis con endonucleasa de restricción del plásmido de ADN aislado a partir de transformantes resistentes a la tetraciclina. El plásmido fue designado como pCGP1453 (Figura 8).

Transformación de plantas con pCGP1453

El ADN-T contenido en el plásmido vector binario pCGP1453 (Figura 8) fue introducido en rosas a través de transformación mediada por Agrobacterium.

El vector binario pCGP1457 (petD8 5’: petHf1: pet D8 3’)

El plásmido pCGP1457 (Figura 9) contiene un gen quimérico de petunia F3'5'H (petHf1) bajo el control de un fragmento promotor del gen de petunia PLTP (petD8 5') con un fragmento terminador del gen PLTP de petunia (petD8 3'). El casete quimérico de petunia F3'5'H está en una orientación en tándem con respecto al gen 35S 5': SuRB del vector binario, pWTT2132 (ADNP) (Figura 6).

Intermediarios en la preparación del vector binario pCG1457

Aislamiento del clon genómico de petunia D8

Preparación de P. híbrida cv, OGB (Old Glory Blue) biblioteca genómica en λ2001

Se construyó una biblioteca de ADN genómica a partir de Petunia híbrida cv. OGB ADN, en el vector λ2001 (Karn et al., Gene 32: 217-224,1984) utilizando una digestión parcial Sau3A del ADN genómico tal como lo describe Holton, 1992 (supra). La selección de la biblioteca genómica OGB para el gen de petunia D8 fue descrito en Holton, 1992. supra.

Aislamiento del clon OGB2.6 genómico de D8

Se llevó a cabo PCR con el fin de encontrar un clon genómico no mutante que represente D8. Se utilizaron Oligo # 2 (5' a 3' GTTCTCGAGGAAAGATAATACAAT) (SEQ ID NO: 6) y Oligo #4 (5’ a 3’ CAAGATCGTAGGACTGCATG) (SEQ ID NO: 7) para amplificar los fragmentos del gen D8, a través de la región del intrón, utilizando 4 µL de suspensión de fago de los clones aislados de la selección primaria de la biblioteca genómica OGB. Las reacciones se llevaron a cabo en un volumen total de 50 µL que contenía 1 x regulador de amplificación (Cetus), mezcla dNTP

0.2 mM, <1 µg de patrón de ADN, 50 pmoles de cada cebador y 0.25 µL de polimerasa Taq (5 umts/µL -Cetus). Las mezclas de reacción fueron depositadas con 30 µL de aceite mineral y se sometieron a ciclización con temperatura utilizando una Gene Machine (Innovonics). Las reacciones fueron sometidas a ciclos 30 veces utilizando las siguientes condiciones: 94ºC durante 1 minuto, 55ºC durante 50 segundos, 72ºC durante 2 minutos. Un cuarto de cada reacción de PCR se corrió sobre un gel de agarosa utilizando regulador de desarrollo TAE.

Tres clones, λOGB-2.4, λOGB-2.5 y 2.6-λOGB, dieron fragmentos de aproximadamente 1 kb, mientras que el clon mutante, λOGB-3.2 (descrito en Holton, 1992, supra), había generado un producto de 1.25 kb. El clon λOGB-2.6 fue escogido para análisis posterior.

pCGF382

El clon genómico λOGB-2.6, contenía un fragmento XbaI de 3.9 kb que hibridaba con el ADNc D8. El fragmento XbaI fue aislado, purificado y ligado con los extremos XbaI del pBluescriptII SK-(Stratagene, Estados unidos). El trazado de mapas de restricción de este clon revelaron un sitio PstI interno de 350 pb desde el extremo 3'. Sin embargo, el clon genómico "mutante" en pCGP13, tenía un PstI interno cercano al "ATG" iniciador putativo de la región de codificación (aproximadamente 1.5 kb desde su extremo 3'). La diferencia en la posición del sitio PstI en ambos clones sugirió que el fragmento λOGB-2.6 XbaI no contenía la secuencia genómica completa de D8. Se lleva a cabo una inmunoprecipitación Southern sobre λOGB-2.6 ADN digerida con PstI, y se encontró que un fragmento de 2.7 kb hibridaba con el ADNc D8. El trazado de mapas con endonucleasa de restricción confirmó que este fragmento contenía la región codificadora 3' y las secuencias flanqueantes.

Con el fin de obtener un fragmento que contenía la secuencia genómica D8 completa, se llevaron a cabo una serie de etapas de clonación. Los fragmentos λOGB-2.6 PstI de 2.7 kb fueron purificados y ligados con extremos PstI de pBluescriptII SK-(Stratagene, Estados Unidos.). El clon resultante fue digerido con XbaI para retirar el fragmento de 350 pb PstI/XbaI. Este fragmento fue reemplazado mediante el fragmento de 3.9 kb XbaI de λOGB-2.6 para producir el plásmido pCGP382.

Un fragmento de 3.2 kb que contenía la región promotora del gen D8 2.6 en pCGP382 fue liberada por digestión con las endonucleasas de restricción HindIII y NcoI. El fragmento fue purificado y ligado con el fragmento de 4.8 kb NcoI /HindIII de pJB1 (Bodeau, Molecular and genetic regulation of Bronze-2 and other maize anthocyanin genes. Dissertation, Stanford University, USA, 1994) para producir pCGP1101 que contiene un casete petD85': GUS: nos 3’.

Un fragmento de 1.6 kb de petunia F3'5'H petHf1 fue liberado del plásmido pCGP602 (Holton et al, 1993a, supra) (SEQ ID NO: 1) (Figura 2) por digestión con las endonucleasas de restricción BspHII y BamHI. El fragmento fue purificado y ligado con el fragmento de 6.2 kb NcoI/BamHI del pCGP1101 para producir pCGP1102 que contiene un casete de expresión petD8 5': petHf1: 3' nos.

Se purificó un fragmento de 0.75 kb BamHI petD8 3 '(Holton, 1992, supra) a partir del plásmido pCGP13∆BamHI y se ligó con los extremos BamHI/BglII del pCGP1102 para producir el plásmido que contiene un casete de expresión pCGP1107 petD8 5'; petHf1; petD8 3'.

El plásmido pCGP1107 fue linealizado por digestión con la endonucleasa de restricción XbaI. Los extremos sobrantes fueron reparados y luego el fragmento de 5.3 kb que contenía el casete de expresión petD8 5': petHf1: petD8 3' fue liberado por digestión con la endonucleasa de restricción PstI. El fragmento fue purificado y ligado con extremos SmaI/PstI del vector binario pWTT2132 (ADNP) (Figura 6). La inserción correcta del gen petD8 5': petHf1: petD8 3' en una orientación en tándem con respecto al casete del gen marcado seleccionable 35S 5': SuRB fue establecida por análisis de restricción con endonucleasas del plásmido de ADN aislado a partir de transformantes resistentes a la tetraciclina. El plásmido fue designado como pCGP1457 (Figura 9).

Transformación de plantas con pCGP457

El ADN-T contenido en el plásmido de vector binario pCGP1457 (Figura 9) fue introducido en rosas a través de transformación mediada por Agrobacterium.

El vector binario pCGP1461 (pétalos cortos 5': petHf1: pet FLS 3')

El plásmido pCGP1461 (Figura 10) contiene un gen quimérico de petunia F3'5'H (petHf1) bajo el control de un fragmento promotor del gen de la flavonol sintasa (FLS) de petunia (petFLS 5' corto) con un fragmento terminador del gen FLS de petunia (petFLS 3'). El gen quimérico de petunia F3'5'H está en una orientación en tándem con respecto al gen 35S 5': SuRB del vector binario, pWTT2132 (Figura 6).

Intermediarios en la preparación del vector binario pCGP1461

Aislamiento del gen ELS de petunia

Reparación de la biblioteca genómica Th7 de P. híbrida cv.

Una biblioteca genómica Th7 de P. híbrida cv, fue preparada de acuerdo con Sambrook et al. (1989, supra), utilizando una digestión parcial Sau3A del ADN genómico. El ADN parcialmente digerido fue clonado en un vector el EMBL-3 lambda (Stratagene, Estados Unidos).

La biblioteca genómica de ADN Th7 fue seleccionada con fragmentos marcados con 32P de un clon de FLS ADNc de petunia (Holton et al, Plant J. 4:. 1003-1010, 1993b) utilizando condiciones de alta restricción.

Se escogieron dos clones genómicos (FLS2 y FLS3) para análisis posteriores y se encontró que contenían secuencias corriente arriba de la metionina iniciadora putativa de la región codificadora FLS de petunia conteniendo el FLS2 una región promotora más larga que FLS3.

pCGF486

Se liberó un fragmento de 6 kb por digestión del clon genómico FLS2 con la endonucleasa de restricción XhoI. El fragmento que contenía el gen FLS petunia corto de petunia fue purificado y ligado con los extremos XhoI de pBluescript SK (Stratagene, Estados Unidos). La inserción correcta del fragmento fue establecida por análisis con endonucleasa de restricción del ADN aislado de los transformantes resistentes a la ampicilina. El plásmido resultante se designó como pCGP486.

pCGP487

Se liberó un fragmento de 9 kb por digestión del clon genómico FLS3 con la endonucleasa de restricción XhoI. El fragmento que contenía el gen de petunia FLS fue purificado y ligado con extremos XhoI de pBluescript SK (Stratagene, Estados Unidos). La inserción correcta del fragmento fue establecida por un análisis por endonucleasa de restricción de ADN aislado a partir de transformantes resistentes a la ampicilina. El plásmido resultante se designó como pCGP487.

pCGP717

Un fragmento de 2.2 kb de petunia corriente arriba a partir del sitio de iniciación de traducción putativo fue liberado del plásmido pCGP487 por digestión con endonucleasas de restricción XhoI y Pstl. El fragmento generado fue purificado y ligado con extremos XhoI/Pstl de pBluescript II SK+ (Stratagene, Estados Unidos). La inserción correcta del fragmento fue establecida por análisis con endonucleasa de restricción de ADN aislado a partir de transformantes resistentes a la ampicilina. El plásmido resultante fue designado como pCGP717.

pCGP716

Un fragmento de terminador de FLS de petunia de 0.95 kb corriente abajo del sitio de detención de traducción putativo fue liberado a partir del plásmido pCGP487 por digestión con las endonucleasas de restricción HindIII y SacI. El fragmento generado fue purificado y ligado con extremos HindIII/SacI del pBluescript II KS+ (Stratagene, Estados Unidos). La inserción correcta de los fragmentos fue establecida por análisis con endonucleasa de restricción del ADN aislado a partir de transformantes resistentes a la ampicilina. El plásmido resultante fue designado como pCGP716.

Construcción de pCGP493 (casete de expresión corto de netFLS 5’:petFLS3’)

Un fragmento de 1.8 kb que contiene el fragmento promotor de FLS corto de petunia fue amplificado por PCR utilizando el plásmido pCGP717 como molde y el cebador T3 (Stratagene, Estados Unidos) y un cebador FLS-Nco (5’ AAA ATC GAT ACC ATG GTC TTT TTT TCT TTG TCT ATA C 3’) (SEQ ID NO: 19). El producto de PCR fue digerido con las endonucleasas de restricción XhoI y ClaI y el fragmento purificado fue ligado con extremos XhoI/ClaI del pCGP716. La inserción correcta del fragmento fue establecida por análisis con endonucleasa de restricción del ADN aislado a partir de transformantes resistentes a la ampicilina. El plásmido resultante fue designado como pCGP493.

Construcción de pCGP497 (casete de expresión corto de petFLS 5’: petHf1: petFLS3’)

El clon de ADNc F3'5'H (petHf1) de petunia fue liberado a partir del plásmido pCGP627 (descrito más arriba) por digestión con las endonucleasas de restricción BspHI y FspI. La secuencia de reconocimiento de BspHI abarca el codón putativo de iniciación de la traducción y la secuencia de reconocimiento de FspI comienza 2 pb corriente abajo del codón de detención. El fragmento F3'5'H petHf1 de petunia generado fue purificado y ligado con los extremos ClaI (extremos reparados)/NcoI del plásmido pCGP493. La inserción correcta del fragmento fue establecida por el análisis con endonucleasa de restricción del ADN aislado a partir de transformantes resistentes a la ampicilina. El plásmido resultante fue designado como pCGP497.

Construcción de pCGrP1461 (vector binario petFLS 5’: petHf1: petFLS3’) El plásmido pCGP497 fue linealizado por digestión con la endonucleasa de restricción SacI. Los extremos sobrantes fueron reparados y se liberó un fragmento de 4.35 kb del casete de expresión del gen corto de petFLS5': petHf1: petFLS3' por digestión con la endonucleasa de restricción KpnI. El fragmento generado fue purificado y ligado con extremos PstI (extremos reparados)/KpnI del vector binario pWTT2132 (ADN) (Figura 6). La inserción correcta del fragmento en una orientación en tándem con respecto al casete del gen marcador seleccionable 35S 5': SuRB de pWTT2132 fue establecido por análisis con endonucleasa de restricción del ADN de plásmido aislado a partir de transformantes resistentes a la tetraciclina. El plásmido resultante fue designado como pCGP1461 (Figura 10).

Transformación de plantas con pCGP1461

El ADN-T contenido en el plásmido de vector binario pCGP1461 (Figura 10) fue introducido en rosas a través de transformación mediada por Agrobacterium.

El vector binario nCGP1616 (petRT 5': petHf1: 3' nos)

El plásmido pCGP1616 (Figura 11) contiene un gen quimérico de petunia F3'5'H' (petHf1) bajo el control de un fragmento promotor del gen 3RT P. híbrida (petRT 5'), (Brugliera. 1994, supra) con un fragmento de terminador del gen de nopalina sintasa (nos 3') de Agrobacterium (Depicker et al., 1982, supra). El casete quimérico de petunia F3'5'H está en una orientación en tándem con respecto al gen 35S 5': SuRB del vector binario, pWTT2132 (ADNP) (Figura 6).

Intermedios en la preparación del vector binario pCGP1616

Aislamiento del gen 3RT de Petunia

Construcción en EMBL3 de la de la biblioteca de ADN genómico Th7 de P. híbrida cv.

Se preparó una biblioteca genómica Th7 de Petunia híbrida cv. de acuerdo con Sambrook et al. 1989, supra utilizando una digestión parcial con Sau3A del ADN genómico. El ADN parcialmente digerido fue clonado en un vector lambda EMBL-3 (Stratagene, Estados Unidos). La selección de la biblioteca genómica Th7 para el gen 3RT de petunia se hizo como se describe en Brugliera, 1994, supra.

Un fragmento de 3 kb que contiene el casete petRT 5': petHf1: 3' fue liberado a partir del plásmido pCGP846 (descrito en Brugliera, 1994, supra) por digestión con las endonucleasas de restricción PstI y BamHI. El fragmento purificado fue ligado con extremos PstI/BamHI de pWTT2132 (ADNP) (Figura 6). La inserción correcta del fragmento en una orientación en tándem con respecto al casete del gen marcador seleccionable 35S 5': SuRB fue establecido por análisis con endonucleasa de restricción del plásmido de ADN aislado a partir de transformantes resistentes a la tetraciclina. El plásmido fue designado como pCGP1616 (Figura 11).

Transformación de plantas con pCGP1616

El ADN-T contenido en el plásmido de vector binario pCGP1616 (Figura 11) fue introducido en rosas a través de transformación mediada por Agrobacterium.

El vector binario pCGP1623 (mas/35S: petHf1: ocs 3')

El plásmido pCGP1623 (Figura 12) contiene un gen de petunia quimérico F3'5'H (petHf1) bajo el control del casete de expresión contenido en pKIWI101 (Janssen y Gardner, 1989, supra) que consiste de un fragmento promotor del gen 35S del virus mosaico de la coliflor (35S 5') con una secuencia potenciadora del promotor del gen de manopina sintasa (MAS) de Agrobacterium y un fragmento terminador del gen de octopina sintasa de Agrobacterium (ocs 3'). El casete quimérico de petunia F3'5'H está en una orientación en tándem con respecto al gen 35S 5 ': SuRB del vector binario, pWTT2132 (SNAP) (Figura 6).

Intermedios en la preparación del vector binario pCGP3623

El fragmento de 1.6 kb aproximadamente del clon de ADNc de F3'5'H petHf1 de petunia contenido en el plásmido pCGP1303 (Figura 4) fue liberado por digestión con las endonucleasas de restricción BspHI y SmaI. El fragmento de petunia F3'5'H petHf1 fue purificado y se hizo ligar con un fragmento de aproximadamente 5.9 kb de NcoI/EcoRI (extremos reparados) de pKIWI101 (Janssen y Gardener, 1989, supra) para producir el plásmido pCGrP1619.

Un digestión parcial del plásmido pCGP1619 con la endonucleasa de restricción XhoI liberó un fragmento de 4.9 kb que contenía el casete de expresión mas/35S: petHf1: ocs 3'. El fragmento fue purificado y ligado con extremos SalI de pWTT2132 (ADNP) (Figura 6). La inserción correcta del fragmento en la orientación en tándem con respecto al casete del gen marcador seleccionable 35S 5': SuRB fue establecida por análisis con endonucleasa de restricción del ADN de plásmido aislado a partir de transformantes resistentes a la de tetraciclina. El plásmido fue designado como pCGP1623 (Figura 12).

Transformación de plantas con pCGP1613

El ADN-T contenido en el plásmido de vector binario pCGP1623 (Figura 12) fue introducido en rosas a través de transformación mediada por Agrobacterium.

El vector binario pCGP1638 (35S 5': petHf1: ocs 3')

El plásmido pCGP1638 (Figura 13) contiene un gen quimérico de petunia F3'5'H (petHf1) bajo el control de un promotor CaMV 35S (35S 5') con un terminador de octopina sintasa (ocs 3'). Una secuencia líder traducida en 5’ de aproximadamente 60 pb a partir del gen enlazante de clorofila a/b de petunia gen (gen Cab 22) (Harpster et al., 1988, supra) está incluido en el fragmento promotor CaMV 35S y el clon de ADN de petunia F3'5'H petHf1. El casete quimérico de petunia F3'5'H está en orientación en tándem con respecto al casete del gen marcador seleccionable 35S 5': SuRB del vector binario, pWTT2132 (Figura 6).

Intermedios en la preparación del vector binario pCGP1638

Construcción de pCGP1273

El plásmido pCGP1273 fue construido subclonando un fragmento de aproximadamente 3kb de HindIII/HpaI que contenía el gen 35S 5': GUS: ocs 3' del vector binario pJJ3499 (Jones et al., Transgenic Research, 1: 285-297, 1992) con los extremos HindIII/SmaI de los plásmidos pBluescript KS II (+) (Stratagene, Estados Unidos).

Construcción de pCGP1634

Un fragmento de aproximadamente 3kb de HindIII/BamHI que contenía el gen 35S 5': GUS: ocs 3' de pCGP1273 fue aislado entonces y ligado con los extremos del HindIII/BamHI del vector de clonación pUC19 (New England Biolabs) para crear el plásmido pCGP1634.

Construcción de pCGP1636

El fragmento GUS del plásmido pCGP1634 fue retirado digiriendo el pCGP1634 con las endonucleasas de restricción NcoI y XbaI purificando los fragmentos de aproximadamente 3.7 kb que contenían el fragmento promotor 35S 5', el fragmento terminador ocs 3' y el esqueleto vector pUC19.

El clon de ADNc de petunia F3'5'H petHf1 fue liberado a partir del pCCrP1303 (Figura 4) por digestión con las endonucleasas de restricción BspHI y XbaI. El fragmento resultante de aproximadamente 1.6 kb fue purificado y ligado con el fragmento de aproximadamente 3.7 kb de NcoI/XbaI de pCGP1634. La inserción correcta del fragmento de petunia F3'5'H petHf1 fue establecido por análisis con endonucleasa de restricción del plásmido de ADN, aislado de transformantes resistentes a la ampicilina. El plásmido resultante que contenía un gen 35S 5': petHf1: ocs 3' fue designado como pCCxP1636.

Construcción de pCGP1638

El gen 35S 5': petHfI: ocs 3' del plásmido pCGP1636 fue liberado por digestión de pCGP1636 con las endonucleasas de restricción PstI y EcoRI. Los extremos fueron reparados y se purificó el fragmento de aproximadamente 2.6 kb y se ligó con los extremos Sam del vector binario, pWTT2132 (ADNP). La inserción correcta del gen del 35S 5': petHf1: ocs 3' en una orientación en tándem con respecto al casete del gen marcador seleccionable 35S 5': SuRB fue establecido por análisis con endonucleasa de restricción del ADN de plásmido aislado a partir de transformantes resistentes a la tetraciclina. El plásmido fue designado como pCGrP1638 (Figura 13).

Transformación de plantas con pCG1638

El ADN-T contenido en el plásmido de vector binario pCGP1638 (Figura 13) fue introducido en rosas a través de transformación mediada por Agrobacterium.

El vector binario de pCGP1860 (RoseCHS 5 ': petHf1: 3' nos)

El plásmido pCGP1860 (Figura 14) contiene un gen quimérico de petunia F3'5'H (petHf1) bajo el control de un fragmento promotor del gen de chalcona sintasa de Rosa híbrida (RoseCHS 5') con un fragmento terminador del gen de nopalina sintasa de Agrobacterium (nos 3’). El casete quimérico de petunia F3'5'H está en orientación en tándem con respecto al casete del gen marcador seleccionable 35S 5': SuRB del vector binario pWTT2132 (ADNP) (Figura 6).

Intermedios en la preparación del vector binario pCGP 1860

Aislamiento del promotor CHS rosa

Se preparó una biblioteca de ADN genómico de rosa a partir de ADN genómico aislado de hojas jóvenes de Rosa hibrida cv Kardinal.

La biblioteca de ADN genómico de Kardinal fue seleccionada con un fragmento marcado con 32P del clon de rosa CHS ADNc contenido en el plásmido pCGP634. El clon de rosa CHS ADNc fue aislado seleccionando de una biblioteca de ADNc de pétalo preparada a partir de ARN aislado de pétalos de rosa hibrida cv Kardinal (Tanaka et al., 1995 supra) utilizando un fragmento de CHS ADNc de petunia como sonda (clon IF II contenido en pCGP701, descrito en Brugliera et al., 1994 supra). Las condiciones se describen en Tanaka et al., 1995 (supra).

Se escogió un clon genómico de rosa (rosa CHS20λ) para análisis posterior y se encontró que contenía aproximadamente 6.4 kb de secuencia corriente arriba de la metionina iniciadora putativa de la región codificadora de CHS de rosa.

Un fragmento de aproximadamente 6.4 kb corriente arriba del sitio de iniciación de translacional fue clonado en pBluescript KS(-) (Statagene) y el plásmido fue de designado como pCGP1114.

El plásmido pCGP1114 fue digerido con las endonucleasas de restricción HindIII and EcoRV para liberar un fragmento de 2.7-3.0 kb que fue purificado y ligado con los extremos de HindIII/Smal del pUC19 (New England Biolabs). La inserción correcta del fragmento promotor de CHS de rosa fue establecida mediante el análisis con endonucleasa de restricción de ADN aislado a partir de transformantes resistentes a la ampicilina. El plásmido resultante fue designado como pCGP116. La secuencia de ADN del fragmento promotor CHS de rosa fue determinado utilizando pCGP1116 como molde (SEQ ID NO: 5).

Construcción de pCGP197 (esqueleto de Rosa CHS 5’: GUS: nos 3’ en pUC18)

Un fragmento de aproximadamente 3.0 kb que contienen el promotor de chalcona sintasa de rosa (Rosa CHS 5’) fue liberado del plásmido pCGP1116 por digestión con las endonucleasas de restricción HindIII y Asp 718. El fragmento fue purificado y ligado con un fragmento HiII/Asp718 a partir de pJB1 (Bodeau, 1994, supra) que contenía el esqueleto vector, los fragmentos β-glucoronidasa (GUS) y nos 3’. La inserción correcta del fragmento promotor CHS de rosa corriente arriba de la secuencia codificadora de GUS fue establecida por análisis con endonucleasa de restricción del ADN aislado a partir de transformantes resistentes a la ampicilina. El plásmido resultante fue designado como pCGP197.

Constricción de pCGP200 (esqueleto de Rosa CHS 5’: petHf1: nos 3’ en pUC18

Un fragmento de 1.8 kb que contiene el fragmento F3’5’H (petHf1) de petunia fue liberado del plásmido pCGP1303 (descrito más arriba) (Figura 4) por digestión con endonucleasas de restricción BspHl y Sacl. El fragmento F3’5’H petHf1 de petunia fue purificado y ligado con los extremos Ncol/Sacl del pCGP197. La inserción correcta del fragmento F3’5’H petHf1 de petunia entre el promotor CHS de rosa y los fragmentos nos 3’ fue establecido mediante análisis con endonucleasa de restricción del ADN aislado a partir de transformantes resistentes a la ampicilina. El plásmido resultante fue designando como pCGP200.

Construcción de pCG1860 (Rose CHS 5’: petHf1: nos 3’ en un vector binario

Un fragmento de aproximadamente 4.9 kb que contenía el casete Rose CHS 5’ prtHf1: nos 3’ fue liberado a partir del plásmido pCGP200 por digestión con la endonucleasa de restricción Bg/II. El fragmento fue purificado y ligado con los extremos RamHI del vector binario, pWTT2132 (ADNP) (Figura 6). La inserción correcta del fragmento en una orientación en tándem con respecto al casete del gen marcador seleccionable 35S 5’: SuRB del pWTT2132 fue establecido por análisis con endonucleasa de restricción del plásmido de ADn aislado a partir de transformantes resistentes a la tetraciclina. El plásmido resultante fue designado como pCGP1860 (Figura 13).

Transformación de plantas con pCGP1860

El ADN-T contenido en el plásmido de vector binario pCGP1860 (Figura 14) fue introducido en rosas a través de transformación mediada por Agrobacterium.

El vector binario pCGP2123 (CaMV 35S: petHf2: ocs 3’)

El plásmido pCGP2123 (Figura 15) contiene un gen quimérico F3’5’H de petunia (petHf2) bajo el control de un promotor CaMV35S con un fragmento terminador del gen de octopina sintasa de Agrobacterium (ocs 3’). El casete quimérico de petunia F3’5’H está en una orientación en tándem con respecto al casete del gen marcador seleccionable 35S 5’: SuRB del vector binario, pCGP1988 (Figura 16).

Intermedios en la preparación del vector binario pCGP2123

Construcción del pCGP1988 (un derivado del vector binario, pWTT2132).

El vector binario pCGP1988 (Figura 16) está basado sobre el vector binario pWTT2132 (ADNP) (figura 6) pero contiene el sitio de clonación múltiple de pNEB 193 (The England Biolabs). El plásmido pNEB 193 se linealizó inicialmente por digestión con la endonucleasa de restricción EcoRI. Los extremos sobrantes fueron reparados y el fragmento de clonación múltiple fue liberado por digestión con la endonucleasa de restricción Pstl. El fragmento fue purificado y ligado con extremos reparados SalI (extremos reparados) y Pstl del vector binario pWTT2132 (ADNP). La inserción correcta del fragmento de clonación múltiple en pWTT2132 fue establecido por análisis con endonucleasa de restricción del plásmido de ADN aislado a partir de transformantes resistentes a la tetraciclina. Los plásmidos resultantes fueron designados como pCGP1988 (Figura 16).

Construcción de pCGP2000 (fragmento promotor pBluescript de CaMV 35S)

El plásmido pCGP2000 fue un plásmido intermedio que contiene un fragmento promotor (CaMV) 35S del virus mosaico de la coliflor en un esqueleto pBluescript SK (Stratagene Estados Unidos).

El fragmento promotor CaMV 35S de pKIWI101 (Janssen and Gardner 1989, supra) fue liberado por digestión con la endonucleasas de restricción Xbal y Pstl. El fragmento de aproximadamente 0.35 kb generado fue purificado y ligado con los extremos de Xbal/Pstl del vector pBluescript SK. La inserción correcta del fragmento fue establecida por análisis con endonucleasa de restricción del ADN de plásmido aislado a partir de transformantes resistentes a la ampicilina. El plásmido fue designado como pCGP2000.

Construcción de pCGP2105 (fragmentos en pBluescript de CaMV35S 5’ y ocs 3’)

El plásmido pCGP2105 (Figura 17) contenía un fragmento promotor CaMC 35S junto con un fragmento terminador del gen octopina sintasa de Agrobacterium (ocs 3’) ambos a partir de pYIW 101 (Janssen and Gardner 1989 supra).

El fragmento ocs 3’ de pKIWI101 (Janssen and Gardner 1989 supra) fue aislado digiriendo primero el plásmido pKIWI101 con la endonucleasa de restricción EcoRI, seguida por una reparación de los extremos sobrantes, y finalmente por digestión con la endonucleasa de restricción Xhol para liberar un fragmento de 1.6 kb. Este fragmento fue ligado entonces con los extremos HincII/Xhol del pCGP2000. La inserción correcta del fragmento fue establecida por análisis con endonucleasa de restricción del plásmido de ADN aislado a partir de transformantes resistentes a la ampicilina. El plásmido fue designado como pCGP2105 (Figura 17).

Construcción de pCGP2109 (gen CaMV 35S: petHf2: ocs 3’ en pBluescript)

El plásmido pCGP2109 contenía el casete del gen de expresión CaMV 35S: petHf2: ocs 3’ en un esqueleto pBluescript.

El clon de 1.8 kb F3’5’H petHf2 ADNc de petunia fue liberado del pCGP175 (Holton et al., 1993, supra) por digestión con las endonucleasas de restricción Xbal y SspI. Los extremos sobrantes fueron reparados y el fragmento purificado fue ligado con los extremos Pstl (extremos reparados/EcoRV del pCGP2105 (descrito más arriba) (Figura 17). La inserción correcta del fragmento fue establecida por análisis con endonucleasa de restricción del ARN de plásmido aislado a partir de transformantes resistentes a la ampicilina. El plásmido fue designado como pCGP2109.

Construcción de pCGP2123 (vector binario CaMV35S: petHf2: ocs 3’)

El casete CaMV 35S: petHf2: ocs 3’ fue liberado de pCGP2109 por digestión con endonucleasas de restricción Asp718 y Xbal. Los extremos sobrantes fueron reparados y el fragmento de aproximadamente 3.7 kb resultante que contenía el gen CaMV 35S: petHf2: ocs 3’ fue purificado y ligado con los extremos reparados de la Asp718 del vector binario, pCGP1988 (Figura 16).

La inserción correcta del gen CaMV 35S: petHf2: ocs 3’ en una orientación en tándem con respecto al casete del gen marcador seleccionable 35S: petHf2: ocs 3’ se estableció mediante análisis con endonucleasa de restricción del ADN de plásmido a partir de transformantes resistentes a la tetraciclina. El plásmido fue designado como pCGO2123 (Figura 15).

5 Transformación de plantas con pCGP2123

El ADN-T contenido en el plásmido del vector binario pCGP2123 (Figura 15) fue introducido en rosas a través de transformación mediada por Agrobacterium.

Ejemplo 5

Análisis de rosas transgénicas

10 Las rosas transgénicas producidas en los experimentos descritos en el Ejemplo 4 se cultivaron hasta su floración. Las flores fueron recolectadas y se codificaron los colores de los pétalos utilizando el Royal Horticultural Society Colour Charts (RHSCC). Las antocianinas fueron extraídas y las antocianidinas (específicamente la presencia de moléculas de delfinidina o basadas en delfinidina) se analizaron por análisis por TLC y/o HPLC. El ARN total también fue aislado a partir del tejido de los pétalos y se utilizó el análisis de inmunoprecipitación Northern para detectar los

15 transcriptos de los transgenes F3’5’H de petunia, el gen CHS endógeno de rosa y el transgén SuRB. Los resultados de los análisis transgénicos se resumen en la Tabla 6.

Aunque se produjeron 250 rosas Kardinal transgénicas (Tabla 6) ninguna produjo flores con un cambio de color. Los análisis por TLC y/o HPLC fallaron en detectar la acumulación de pigmentos de moléculas de delfinidina o basados en delfinidina confirmando la ausencia de una actividad eficiente de F3’5’H. El análisis subsecuente por Northern

20 sobre el ARN total aislado a partir de tejido de pétalos de estas rosas transgénicas reveló que no había transcriptos de petunia F3’5’H (petHf1 o petHf2) intactos, en algunos casos (véanse las notas a pie de página) transcriptos degradados. La hibridación de las mismas membranas con el gen marcador seleccionable (SuRB) o con una sonda de CHS ADNc de rosa endógena reveló transcriptos de hibridación discretos que indican que el ARN total aislado no estaba degradado. La detección los transcriptos del transgén SuRB confirmaron que las rosas eran transgénicas.

25 Tabla 6 Resultados del análisis transgénico de pétalos de rosa transformados con el ADN-T de diversos casetes de expresión genética de petunia F3’5’H (petHf1 o petHf2)

PLÁSMIDO

GEN F3’5’H EVENTOS DEL ARN

pCGP1452

AmCHS5’: petHf1 petD83’ 34 0/28 0/341

pCGP1453

Mac: petHf1: mas 3’ 16 0/14 0/132

pCGP1457

petD85’: petHf1: petD83’ 11 0/11 0/11

pCGP1461

shortpetFLS5’: petHf1: petFLS 3’ 11 0/11 0/11

pCGP1616

petRT5’: petHf1: nos 3’ 4 0/4 0/4

pCGP1623

mas/35S: petHf1: ocs 3’ 27 0/20 0/123

pCGF1638

CaMV35S: petHf1: ocs 3’ 22 0/14 0/14

(continuación)

PLÁSMIDO

GEN F3’5’H EVENTOS DEL ARN

pCGP1860

RoseCHS5’: petHf1: nos3’ 15 0/13 0/13

pCGP2123

CaMV35S: petHf2: ocs 3’ 40 0/26 0/10

EVENTOS = número de eventos transgénicos independientes producidos DEL = número de eventos transgénicos en los cuales se detectaron moléculas de delfinidina o basadas en delfinidina (por TLC o HPLC) en pétalos sobre el número total de eventos analizados ARN = número de eventos transgénicos en los cuales se detectaron transcriptos intactos de F3’5’H(petHf1 o petHf2) mediante análisis por inmunoprecipitación Northern en ARN total aislado de pétalos de rosa sobre el número total de eventos analizados 1 = Se detectaron transcriptos degradados en 5 de los 34 analizados 2 = Se detectaron transcriptos degradados en 8 de los 13 analizados 3 = Se detectaron transcriptos degradados en 8 de los 12 analizados

El hecho de que no se detectaron jamás transcriptos de petunia F3’5’H (petHf1 o petHf2) en pétalos de rosas transgénicas transformadas con los ADN-T descritos (Tabla 6) sugiere un número de posibilidades:

5 1. que el ARN aislado estaba degradado. Este no fue el caso puesto que el ARN había sido teñido con bromuro de etidio y visualizado bajo luz UV. Las bandas de ARN ribosomal intactas visibles se utilizaron como indicador de la cantidad del ARN aislado. Adicionalmente la detección de los transcriptos de longitud larga de la rosa CHS endógena y de los transgenes de SuRB confirmaron que la preparación de ARN no estaba degradada.

2. que no hubo iniciación de la transcripción de los genes quiméricos F3’5’H evaluados. Esto era un posibilidad con

10 algunos de los casetes de expresión analizados, puesto que no se detectaron transcriptos de F3’5’H por análisis Northern. Sin embargo, todos los casetes de expresión de petunia F3’5’H demostraron ser funcionales (esto es, dar como resultado un transcripto intacto y dar como resultado la producción de pigmentos basados en delfinidina) en otras plantas tales como claveles y petunias.

3. que las F3’5’H petHf1 y petHf2 mARNs de petunia fueron inestables en las rosas. Esto también era una

15 posibilidad puesto que se detectaron transcriptos degradados de petunia F3’5’H por análisis Northern en ARN totalizado a partir de pétalos de algunos eventos. Sin embargo, los petHf1 y petHf2 mARNs de petunia habían mostrado ser estables en otras plantas tales como claveles y petunias. Tal inestabilidad podría deberse a una traducción aberrante que lleva a producción de ARNm, algunas características de la secuencia inestables por herencia en células de rosa, algún otro factor o factores.

20 Hubo necesidad por lo tanto de encontrar fragmentos promotores adecuados que condujeran eficientemente la expresión de los genes en pétalos de rosa y encontraran secuencias de F3’5’H adecuadas que pudieran dar como resultado transcriptos intactos acumulándose en pétalos de rosa llevando una actividad funcional de F3’5’H a la producción de pigmentos basados en delfinidina.

Ejemplo 6

25 Evaluación de promotores en rosas

Desarrollo de casetes de expresión genética GUS

La evaluación de los fragmentos de promotor y terminador se llevó a cabo utilizando el informador de genes GUS. Por lo tanto, se enlazó un cierto número de promotores al gen informador β-glucoronidasa (GUS) (Jefferson et al.,

1987, supra) y se introdujeron en rosas en un intento para identificar los casetes de expresión que llevan a una iniciación efectiva de la transcripción en flores de rosa). En la Tabla 7 se da un resumen de los fragmentos de promotores y terminadores evaluados. Tabla 7 Lista de casetes de expresión genética quiméricos GUS evaluados en rosas

PLÁSMIDO

CASETE DE EXPRESIÓN GUS GEN MARCADOR SELECCIONABLE VECTOR DE ESQUELETO

pC G P 13 07

petD8 5’: GUS: petD8 3’ mas 5’: nptII: mas 3’ pC G N 15 4 8

pC G P 15 06

long petFLS 5’: GUS: petFLS 3’ nos 5’: nptII: nos 3’ pB I N 1 9

pC G P 16 26

chrysCHS 5’: GUS: petRT 3’ 35S 5’: SuRB p WTT 213 2

pCGP1641

perRT5’: GUS:petRT3’ 35S5’: SuRB pWTT2132

pCGP1861

RoseCHS 5’:GUS: nos 3’ 35S5’: SuRB pWTT2132

pCGP1953

AmCHS 5’: GUS: petD83’ 35S5’: SuRB pWTT2132

pWTT2084

35S 5’: GUS: ocs3’ 35S5’: SuRB pWTT2132

El vector binario pCGP1307 (petD8 5’: GUS: petD8 3’)

El plásmido de pCGP1307 (figura 18) contiene un gen de GUS quimérico bajo el control de un fragmento promotor y terminador del gen PLTP de petunia (petD8 5’ y petD3’, respectivamente). El casete de gen informador quimérico de GUS está en una orientación en tándem con respecto al casete del gen marcador seleccionable mas 5’ nptll: mas 3’

10 del vector binario pCGN 1548 (McBride and Summerfelt, 1990, supra).

Intermedios en la preparación del vector binario pCGP1307

El fragmento nos 3’ de pCGP1101 (véase Ejemplo 4) fue remplazado con el fragmento de 0.75 kb petD8 3’ (Holton, 1992, supra) para producir el plásmido pCGP1106 que contenía un casete de expresión petD8 5’: GUS petD8 3’.

El fragmento de 5.3 kb que tiene el casete de expresión petD8 5’: GUS: petD8 3’ fue liberado del plásmido

15 pCGP1106 por digestión con las endonucleasas de restricción Hind III y Pstl. El fragmento fue purificado y ligado con extremos HindIII/Pstl del vector binario pCGN 1548 (McBride Summerfelt, 1990, supra). La inserción correcta del fragmento fue establecida por análisis con endonucleasa de restricción de AND aislado a partir de transformantes resistentes a la gentamicina. El plásmido resultante fue designado com pCGP1307 (Figura 18).

Transformación de plantas con pCGP1307

20 El ADN-T contenido en el plásmido de vector binario pCGP1307 (Figura 18) fue introducido en rosas a través de transformación mediada por Agrobacterium.

El vector binario pCGP1506 (longpetFLS 5’: GUS: petFLS 3’)

El plásmido pCGP1506 (Figura 19) contiene un gen quimérico GUS bajo el control de fragmentos promotores y terminadores del gen de flavonol sintasa de petunia (petFLS 5’ y petFLS 3’, respectivamente). El casete del gen

25 informador quimérico de GUS está en orientación en tándem con respecto al casete del gen marcador seleccionable nos 5’: nptll: nos 3’ del vector binario pBIN19 (Bevan, Nucleic Acids Res 12: 8711-8721, 1984).

Intermedios en la preparación del vector binario pCGP1506

Un fragmento promotor FLS de petunia de 4 kb de longitud corriente arriba del sitio de iniciación translacional putativo fue liberado del plásmido pCGP486 (descrito en el Ejemplo 4) por digestión con las endonucleasas de 30 restricción Xhol y Pstl. El fragmento generado fue purificado y ligado con extremos Xhol/Pstl del pBluescript II KS+

(Stratagene, Estados Unidos). La inserción correcta del fragmento fue establecida por análisis de restricción con endonucleasas del ADN aislado a partir de transformantes resistentes a la ampicilina. El plásmido resultante fue designado como pCGP715.

Construcción del pCGP494 ( casete de expresión largo petFLS 5’:petFLS3’)

Se amplificó un fragmento de 4.0 kb que contenía el fragmento promotor FLS largo de petunia por PCR utilizando el plásmido pCGP715 como molde y el cebador T3 (Stratagene, Estados Unidos) y un cebador FLS-Nco (5’ AAA ATC GAT ACC ATG GTC TTT TTT TCT TTG TCT ATA C 3’) (SEQ ID NO:19). El producto de PCR fue digerido con las endonucleasas de restricción Xhol y Clal y el fragmento purificado fue ligado con los extremos Xhol/Clal del pCGP716 (descrito en el Ejemplo 4). La inserción correcta del fragmento fue establecida por análisis con endonucleasa de restricción del ADN aislado a partir de transformantes resistentes a la ampicilina. El plásmido resultante fue designado como pCGP494.

Construcción de pCGP496 (casete de expresión largo de petFLS 5’: GUS: petFLS3’)

La secuencia codificadora GUS del plásmido pJB1 (Bodeau, 1994, supra) fue liberada por digestión con las endonucleasas de restricciones Ncol y Smal. El fragmento GUS generado fue purificado y ligado con los extremos de Clal (extremo reparados) en NcoI del plásmido pCGP494. La inserción correcta del fragmento fue establecida por análisis con endonucleasa de restricción del ADN aislado a partir de transformantes resistentes a la ampicilina. El plásmido resultante fue designado como pCGP496.

Construcción de pCGP1506 (vector binario largo de petFLS 5’ y petFLS 3’

El plásmido pCGP496 fue linealizado inicialmente por digestión con la endonucleasa de restricción Xhol. Los extremos sobrantes fueron reparados parcialmente (utilizando solamente dTTP y dCTP en la reacción de reparación) y se liberó un fragmento de 6.7 kb que contenía el casete de expresión del gen largo petFLS 5’: GUS: petFLS 3’ por digestión con la endonucleasa de restricción Sacl. El fragmento generado fue purificado y ligado con extremos BamHI (extremos parcialmente reparados utilizando dGTP y dATP en la reacción de reparación)/Sacl del vector binario pBIN19. La inserción correcta del fragmento en una orientación en tándem con respecto al casete del gen marcador seleccionable nos 5’: nptll: nos 3’ fue establecida por análisis con endonucleasa de restricción del plásmido de ADN aislado a partir de transformantes resistentes a la kanamicina. El plásmido resultante fue designado como pCGP1506 (Figura 19).

Transformación de plantas con pCGP1506

El ADN-T contenido en el plásmido del vector binario pCGP1506 (Figura 19) fue introducido en rosa por transformación mediada por Agrobacterium.

El vector binario pCGP1626 (chrysCHS 5’: GUS: petRT 3’)

El plásmido pCGP1626 (Figura 20) contiene un gen quimérico GUS bajo el control del fragmento promotor del gen chalcona sintasa de crisantemo ( chrysCHS 5’) y un fragmento terminador del gen 3RT de petunia ( petRT 3’) (Brugliera, 1994, supra). El casete del gen informador GUS quimérico está en orientación en tándem con respecto al casete del gen marcador seleccionable 35S 5’: SuRB del vector binario pWTT2132 (ADNP) (Figura 6).

Intermediarios en la preparación del vector binario pCGP1626

Aislamiento del promotor CHS de crisantemo

Se preparó una biblioteca de ADN genómico de crisantemo aislado de material de hojas jóvenes del Chrysanthemum cv Hero.

La biblioteca del ADN genómico de crisantemo fue escogida con fragmentos marcados con 32P de un clon CHS de ADNc de crisantemo (SEQ ID NO:28) (contenido en el plásmido pCGP856) usando condiciones de alta restricción. El plásmido pCGP856 contiene un clon de 1.5 kb de ADNc de CHSaislado a partir de una biblioteca de ADNc de pétalo de ARN aislado a partir del crisantemo cv. Dark Pink Pom Pom.

Un clon genómico (CHS5) fue escogido para análisis adicional y se encontró que contenía ~3 kb de secuencia corriente arriba de la metionina iniciadora putativa de la región codificadora CHS de crisantemo.

Se liberaron fragmentos de 4kb por digestión del clon genómico CHS5 con la endonucleasa de restricción HindIII. El fragmento que contiene el promotor CHS de crisantemo fue purificado y ligado con los extremos HindIII de

pBluescript SK (Stratagene, ESTADOS UNIDOS). La correcta inserción del fragmento fue establecida mediante análisis por restricción con endonucleasa de ADN aislado a partir de transformantes resistentes a la ampicilina. El plásmido resultante fue designado como pCGP1316.

Un fragmento ptomotor CHS de crisantemo de 2.6 kb corriente ariba del sitio de iniciación de la traducción fue amplificado por PCR usando pCGP1316 como molde y los cebadores "chrysanCHSATG" (5’GTTAAGGAAGCCATGGGTGT-3’) (SEQ ID NO:8) y el cebador reverso M13 (Stratagene, ESTADOS UNIDOS). El cebador "chrysanCHSATG" incorporó una secuencia de reconocimiento de restricción con endonucleasa NcoI en el punto de iniciación putativo de la traducción para facilidad de clonación. El fragmento de PCR fue purificado y ligado con extremos EcoRV (con colas dT) de pBluescript KS (Holton and Graham, Nuc. Acids Res. 19: 1156, 1990). La correcta inserción del fragmento fue establecida mediante análisis por restricción con endonucleasa de ADN aislado a partir de transformantes resistentes a la ampicilina. El plásmido resultante fue designado como pCGP1620. La secuencia de nucleótidos de un fragmento promotor CHS de crisantemo de contenido en pCGP1620 se representa como SEQ ID NO:30.

Construcción de pCGPF1622 (chrysCHS 5’: GUS: nos 3’ in pUC backbone)

Un fragmento de ~2.5 kb que contiene el promotor CHS de crisantemo fue liberado del plásmido pCGP1620 por digestión con las endonucleasas de restricción NcoI yand PstI. El fragmento fue purificado y ligado con un fragmento de 4.8 kb de NcoI/ PstI de pJB1 (Bodeau, 1994, supra) que contiene el vector de esqueleto con los fragmentos GUS y nos 3’. La correcta inserción del fragmento fue establecida mediante análisis por restricción con endonucleasa de ADN aislado a partir de transformantes resistentes a la ampicilina. El plásmido resultante fue designado como pCGP1622.

Construcción de pCGP1626 (chrysCHS 5’: GUS: nos 3’ en un vector binario)

Un fragmento de ~4.6 kb que contiene el casete de chrysCHS 5’: GUS: nos 3’ fue liberado del plásmido pCGP1622 por digestión con las endonucleasas de restricción PstI and BglII. El fragmento fue purificado y ligado con extremos PstI/ BamHI del vector binario pWTT2132 (ADNP) (Figura 6). La correcta inserción del casete en una orientación en tándem con respecto al casete del gen marcador seleccionable 35S 5’: SuRB fue establecida por análisis de restricción con endonucleasa de ADN aislado a partir de transformantes resistentes a la tetraciclina. El plásmido resultante fue designado como pCGP1626 (Figura 20).

Transformación de plantas con pCGP1626

El ADN-T contenido en el plásmido del vector binario pCGP1626 (Figura 20) fue introducido en rosas por transformación mediada por Agrobacterium.

El vector binario pCGP1641 (petRT 5’: GUS: petRT 3’)

El plásmido pCGP1641 (Figura 21) contiene un gen quimérico GUS bajo el control de un promotor 3RT de petunia ( petRT 5’) que cubre 1.1kb corriente arriba del codon de iniciación de la traducción 3RT putativo con un terminador 3RT de petunia ( petRT 3’) que cubre 2.5 kb corriente abajo del codón de termianción de 3RT. El casete quimérico GUS está en orientación en tándem con respecto al casete del gen marcador seleccionable 35S 5’: SuRB del vector binario, pWTT2132 (ADNP) (Figura 6).

Intermediarios en la preparación del vector binario pCGP1641

Aislamiento dle gen de petunia 3RT

El aislamiento dl gen de petunia 3RT correspondiente al locus Rt de P. hybrida ha sido descrito en Brugliera, 1994, supra.

Construcción de pCGP1625 (casete CaMV 35S: GUS: petRT 3’)

El plásmido intermedio pCGP1625 contiene un casete CaMV 35S: GUS: petRT 3’ en un esqueleto pUC. El fragmento de 2.5 kb que contiene una secuencia de terminación petRT fue liberado del plásmido pCGP1610 (descrito en Brugliera, 1994, supra) por digestión con las endonucleasas de restricción BamHI y SacI. El fragmento fue purificado y ligado con el fragmento BglII/ SacI 4.9kb de pJB1 (Bodeau, 1994, supra) que contiene el esqueleto vector el promotor CaMV 35S y fragmentos GUS. La inserción correcta del terminador 3RT de petuniat corriente abajo del fragmento GUS se estableció por análisis por restricción con endonucleasa de ADN aislado a partir de transformantes resistentes a la ampicilina. El plásmido resultante fue designado como pCGP1625.

Construcción de pCGP1628 (casete petRT 5’: GUS: petRT 3’)

A 1.1 kb petRT promoter fragment fue liberado del plásmido pCGP1611 (descrito en Brugliera, 1994, supra) por digestión con las endonucleasas de restricción NcoI and PstI. The fragmento purificado fue ligado con NcoI/Extremos Pstl of the 7kb fragmentde pCGP1625 que contiene el esqueleto vector and the GUS and petRT 3’ fragments. La inserción correcta del petRT promoter fragment upstream del fragmento GUS se estableció por análisis por restricción con endonucleasa de ADN aislado a partir de transformantes resistentes a la ampicilina. El plásmido resultante fue designado como pCGP1628.

Construcción de pCGP1641 ( petRT 5’: GUS: petRT 3’ vector binario)

Un fragmento de 5.4 kb que contiene el casete petRT 5’: GUS: petRT 3’ fue liberado de pCGP1628 por digestión con la endonucleasa de restricción PstI. El fragmento fue purificado y ligado con Extremos Pstl del vector binario pWTT2132 (ADNP) (Figura 6). La inserción correcta del fragmento en una orientación en tándem con respecto al casete del gen marcador seleccionable 35S 5’: SuRB se estableció por análisis de restricción con endonucleasa de ADN de plásmido aislado a partir de transformantes resistentes a la tetraciclina. El plásmido resultante fue designado como pCGP1641 (Figura 21).

Transformación de plantas con pCGPI641

El ADN-T contenido en el plásmido del vector binario pCGP1641 (Figura 21) fue introducido en rosas por transformación mediada por Agrobacterium.

El vector binario pCGP1861 (RoseCHS 5’: GUS: nos 3’)

El plásmido pCGP1861 (Figura 22) contiene un gen quimérico GUS bajo el control de un fragmento promotor del gen CHS de R. hybrida ( RoseCHS 5’) con un fragmento terminador del gen nos de Agrobacterium (nos 3’). El casete del gen informador GUS quimérico está en orientación en tándem con respecto al gen marcador seleccionable 35S 5’: SuRB cassette del vector binario, pWTT2132 (Figura 6).

Un fragmento de ~5 kb que contiene el casete RoseCHS 5’: GUS: nos 3’ fue liberado de pCGP197 (descrito en el Ejemplo 4) por digestión con la endonucleasa de restricción BglII. El fragmento fue purificado y ligado con BamHI ends del vector binario, pWTT2132 (ADNP). La inserción correcta del fragmento en una orientación en tándem con respecto al gen marcador seleccionable 35S 5’: SuRB cassette se estableció por análisis de restricción con endonucleasa de ADN de plásmido aislado a partir de transformantes resistentes a la tetraciclina. El plásmido resultante fue designado como pCGP1861 (Figura 22).

Transformación de plantas con pCGP1861

El ADN-T contenido en el plásmido del vector binario pCGP1861 (Figura 22) fue introducido en rosas por transformación mediada por Agrobacterium.

El vector binario pCGP1953 (AmCHS 5’: GUS: petD8 3’)

El plásmido pCGP1953 (Figura 23) contiene un gen quimérico GUS bajo el control de un fragmento promotor del gen CHS de Antirrhinum majus ( AmCHS 5’) con un terminador PLTP de petunia ( petD8 3’). El casete del gen informador GUS quimérico está en orientación en tándem con respecto al gen marcador seleccionable 35S 5’: SuRB cassette del vector binario, pWTT2132 (ADNP) (Figura 6).

Intermediarios en la preparación del vector binario pCGP1953

El plásmido pJB1 (Bodeau, 1994, supra) fue linealizado con la endonucleasa de restricción NcoI. Los extremos sobrantes fueron reparados y el fragmento GUS de 1.8 kb fue liberado por digestión con BamHI. El fragmento GUS fue purificado y fue ligado con el fragmento 5 kb XbaI(extremos reparados)/ BamHI de pCGP726 que contiene el vector de esqueleto pBluescript y los fragmentos AmCHS 5’ y petD8 3’ (descrito en el Ejemplo 4). La inserción correcta del Fragmento GUS entre los fragmentos AmCHS 5’ and petD8 3’ se estableció por análisis de restricción con endonucleasa del ADN del plásmido aislado a partir de transformantes resistentes a la ampicilina. El plásmido fue designado como pCGP1952.

Un fragmento de 3.8 kb que contiene el casete de expresión AmCHS 5’: GUS: petD8 3’ fue liberado del plásmido pCGP1952 por digestión con las endonucleasas de restricción EagI and PstI. Los extremos sobrantes fueron reparados y el fragmnto purificado fue ligado con los extremos reparados de un vector binario pWTT2132 digerido con Asp718 (Figura 6). La inserción correcta del fragmento en una orientación en tándem con respecto al casete del gen marcador seleccionable 35S 5’: SuRB se estableció por análisis de restricción con endonucleasa de ADN de plásmido aislado a partir de transformantes resistentes a la tetraciclina. El plásmido fue designado como pCGP1953 (Figura 23).

Transformación de plantas con pCGP1953

5 El ADN-T contenido en el plásmido del vector binario pCGP1953 (Figura 23) fue introducido en rosas por transformación mediada por Agrobacterium.

El vector binario pWTT2084 (35S 5’: GUS: ocs 3’)

El plásmido pWTT2084 (ADNP) (Figura 24) contiene un gen quimérico GUS bajo el control de un promotor CaMV 35S ( 35S 5’) con un terminador de octopina sintasa ( ocs 3’). Una secuencia de guía no traducida de ~60 bp 5’ del

10 gen de la proteína de enlazamiento a/b de clorofila de petunia (gen Cab 22) (Harpster et al., 1988, supra) es incluida entre el fragmento pomotor CaMV 35S y el clon GUS. El casete quimérico GUS está en orientación en tándem con respecto al casete del gen marcador seleccionable 35S 5’: SuRB del vector binario, pWTT2084.

Transformación de plantas con pWTT2084

El ADN-T contenido en el plásmido del vector binario pWTT2084 (Figura 24) fue introducido en rosas por 15 transformación mediada por Agrobacterium.

El análisis transgénico de las rosas transformadas con los casetes de expresión GUS por análisis por inmunoprecipitación Northern fue llevado a cabo sobre el ARN total aislado a partir de pétalos en etapas de desarrollo 3 a 4 de rosas transgénicas Kardinal transformadas con el ADN-T de diversos casetes de expresión de GUS. No hubo transcripto acumulándose o un transcripto intacto de longitud completa del tamaño esperado de

20 aproximadamente 1.8 kb según la detección por hibridación por inmunoprecipitación Northern. Los niveles relativos de transcriptos de GUS que se acumularon en los pétalos de rosa fueron registrados (véase Tabla 8).

Tabla 8 Resumen de análisis Northern de flores de rosa transgénica Kardinal (etapa de yema abierta) que contenían constructos GUS

PLÁSMIDO

GEN INFORMADOR GUS GEN MARCADOR SELECCIONABLE NIVELES DE TRANSCRIPTO GUS

pCGP1307

petD8 5’: GUS:petD8 3’ mas5’: nptII: mas 3’ -

pCGP1506

petFLS5’:GUS:petFLS 3’ nos 5’: nptII: nos 3’ -

pCGP1626

chrysCHS5’: GUS:petRT 3’ 35S 5’:SuRB ++ to +++

pCGP1641

petRT5’: GUS:petRT3’ 35S 5’:S’uRB -

pCGP1861

RoseCHS 5’: GUS:nos 3’ 35S 5’:SuRB ++++

pCGP1953

AmCHS 5’:GUS:petD83’ 35S 5’:SuRB -

pWTT2084

35S 5’: GUS:ocs3’ 35S 5’:SuRB +++++

-= no se detectan transcriptos + a ++++++ = niveles relativos (bajo a alto) de transcripto GUS de longitud completa detectado por el análisis por inmunoprecipitación Northern

25 Con base en los resultados anteriores (Tabla 8), los promotores CaMV 35S (35S 5') y CHS de rosa (RoseCHS 5') parecen conducir niveles relativamente altos de transcripción en pétalos de rosa. El promotor CHS de crisantemo (chrysCHS 5') parece también conducir a altos niveles de transcripción pero no tan altos como los obtenidos utilizando promotores CAMY 35S o CHS de rosa. Sorprendentemente, los promotores CHS de Antirrinum (linaria)

(AmCHS 5), 3RT de petunia (petRT 5'), FLS de petunia (patFLS 5') y PLTP de petunia -(petD8 5') no parecen funcionar en pétalos de rosa, puesto que no se detectaron transcriptos GUS con casetes de expresión que incorporan estos promotores. Sin embargo, estos mismos promotores se fusionaron con genes petHf1 y/o -GUS como se había probado previamente para funcionar bien en claveles y petunias llevando a niveles relativamente altos de transcripción completa y para genes petHf1, con la producción de pigmentos de moléculas de delfinidina o basadas en delfinidina. El resultado obtenido con el promotor de Antirrinum CHS (AmCHS 5') fusionado con el gen GUS fue más sorprendente puesto que las regiones promotoras de los genes homólogos de otras dos especies (rosa y crisantemo) parecen funcionar relativamente bien en rosas. El promotor CHS de Antirrinum también había sido utilizado exitosamente junto con el de petunia F3'5'H (petHf1) para producir los novedosos claveles coloreados de violeta Florigene Moondust (véase Solicitud Internacional de Patente No. PCT/AU96/00296).

La evaluación de los fragmentos promotores y terminadores fusionados con el gen GUS también proporcionó evidencia adicional para sugerir que las secuencias de petunia F3'5'H petHf1 y petHf2 eran inestables en rosas puesto que los constructos que contenían las secuencias F3'5'H de petunia ligados a los promotores CaMV 35S, CHS de rosa y CHS de crisantemo (los cuales funcionan en rosas) no dieron resultados en los transcriptos intactos de petunia F3'5'H petHf1 o petHf2 en Rosas (véase Tabla 6).

Ejemplo 7

Aislamiento de secuencias de F3'5'H de especies diferentes a la petunia

Puesto que las secuencias F3'5'H de la petunia ya habían demostrado funcionar en diversas plantas tales como claveles, petunias y tabaco y finalmente dieron como resultado la producción de pigmentos basados en delfinidina, era razonable asumir que estas secuencias también demostrarían ser funcionales en rosas. Hubo la suposición de que la actividad enzimática puede variar dependiendo del antecedente de la especie, en efecto entre cultivares de una especie dada, de que la F3'5'H de petunia fue introducida. Sin embargo, no había expectativas de que la F3'5'H ARNm recombinante de petunia de longitud completa no se acumulará. El análisis de las secuencias de nucleótidos de F3'5'H de petunia (petHf1 y petHf2) no reveló ninguna secuencia que pudiera llevar a la inestabilidad y degradación subsecuente (Johnson et al., In A look beyond transcription, ASPP, USA, Bailey-Serres and Gallie, eds, 1998), intrón; uniones exón seccionado (Brendel et al., In A look beyond transcription, ASPP, USA, Bailey-Serres and Gallie, eds, 1998), o cualquier secuencia autocatalítica o disparadora de la degradación reportada en la literatura científica hasta la fecha (In A look beyond transcription, ASPP, USA, Bailey-Serres and Gallie, eds, 1998). El resultado sorprendente sugiere que estos fueron factores específicos para las rosas que dieron como resultado que las secuencias F3'5'H de petunia fueran inestables.

Puesto que no era obvio por qué las secuencias F3'5'W de petunia eran inestables en rosas pero estables en claveles, petunias o tabaco, se aisló un cierto número de secuencias de F3'5'H a través de un rango de familias en un intento para determinar si cualquier secuencia de F3'5'H era inestable en rosas y luego identificar cualquier secuencia de F3'5'H que llevara a la síntesis de transcriptos estables de F3'5'H y a actividad de F3'5'H y finalmente a la producción de pigmentos basados en delfinidina en rosas que lleven a un cambio en el color de la flor.

Construcción de bibliotecas de ADNc de pétalos

Se prepararon bibliotecas de ADNc a partir de ARN aislado de pétalos de las etapas desde yema hasta flores abiertas a partir de diversas especies de plantas descritas en la Tabla 9. La Rosa híbrida se clasifica en la familia Rosaciae, Orden Rosales, Subclase Rosidae y así se seleccionaron especies que producían pigmentos basados en delfinidina y contenían así una F3'5'H funcional y pertenecían a la subclase Rosidae. La petunia híbrida está clasificada en la familia solanácea, Orden Solanales, Subclase Asteridae y así se seleccionaron especies de la subclase Asteridae que producían pigmentos basados en delfinidina.

Tabla 9 Lista de flores a partir de las cuales se aisló el ARN total para la preparación de bibliotecas de ADNc de pétalos. Información obtenida del National Center for Biotechnology Information (NCBI) en su página web bajo el buscador de taxonomía (TaxBrowser) en agosto de 2003.

FLOR

ESPECIE FAMILIA ORDEN SUBCLASE

Genciana

Gentiana spp. Gentianaceae Gentianales Asteridae

Lavanda

Lavandula spp. Lamiaceae Lamiales Asteridae

(continuación)

FLOR

ESPECIE FAMILIA ORDEN SUBCLASE

Salvia

Salvia spp. Lamiaceae Lamiales Asteridae

solia

Sollya spp. Pittosporaceae Apiales Asteridae

kennedia

Kennedia spp. Fabaceae Fabales Rosidae

campanilla

Clitoria ternatea Fabaceae Fabales Rosidae

pensamiento

Viola spp. Violaceae Malpighiales Rosidae

A menos que se describa otra cosa, el ARN total fue aislado a partir del tejido de pétalo de flores púrpura/azules usando el método de Turpen y Griffith (Biotechniques 4: 11-15, 1986). Se seleccionó Poli (A)+ ARN del ARN total, usando oligotex-dTTM (Qiagen) o cromatografía en celulosa de tres ciclos de oligo-dT (Aviv y Leder, Proc. Natl. Acad. Estados Unidos 69:1408,1972).

En general se utilizó un kit λZAPII/Gigapack II Cloning (Stratagene, Estados Unidos.) (Short et al, Nucl Acids Res.

16: 7583-7600, 1988) para construir bibliotecas de ADNc de pétalos direccionales en λZAPII utilizando aproximadamente 5 µg de poli(A)+ ARN aislado de pétalos como molde. El número total de recombinantes obtenidos estuvo generalmente en el orden de 1 x 105 a 1 x 106.

Después de transfectar células XL1-Blue MRF', las mezclas de ADNc empacadas fueron sembradas en placa a alrededor de 50,000 pfu por placa de 15 cm de diámetro. Las placas fueron incubadas a 37ºC durante 8 horas, y el fago fue eluido en NaCl 100 mM, MgSO4 8 mM, Tris-HCl pH 8.0 50 mM, gelatina al 0.01% (p/v) (regulador de almacenamiento de fagos (PSB)) (Sambrook et al., 1989, supra). Se agregó cloroformo y los fagos se almacenaron a 4ºC como bibliotecas amplificadas.

En general aproximadamente 100,000 pfu de las bibliotecas amplificadas fueron sembrados sobre placas NZY (Sambrook et al., 1989, supra) a una densidad de alrededor de 10,000 pfu por placa de 15 cm después de transfectar células XL1-Blue MRF', y se incubó a 37ºC durante 8 horas. Después de la incubación a 4ºC durante la noche, se tomaron levantamientos en duplicado sobre filtros Colony/Plaque Screen™ (DuPont) y se trataron según lo recomienda el fabricante.

Aislamiento de plásmidos

Se utilizó fago auxiliar R408 (Stratagene, Estados Unidos) para escindir fagémidos pBluescript que contenían insertos de ADNc a partir de bibliotecas λZAPII o λZAP de ADNc utilizando métodos descritos por el fabricante.

Selección de bibliotecas de ADNc de pétalos

Antes de la hibridación, se lavaron levantamientos de duplicados de las placas en solución de prelavado (Tris-HCl pH 7.5 50 mM, NaCl 1 M, EDTA 1 mM, sarcosina al 0.1% (p/v)) a 65ºC durante 30 minutos; seguido por lavado con hidróxido de sodio 0.4 M a 65ºC durante 30 minutos; luego se lavaron en una solución de Tris-HCl 0.2 M pH 8.0, 0.1 x SSC, SDS al 01% (p/v) a 65ºC durante 30 minutos y finalmente se enjuagaron en 2 x SSC, con SDS al 1.0% (p/v).

Los levantamientos de membrana de las bibliotecas de ADNc de pétalos fueron hibridados con fragmentos marcados con 32P de un fragmento de 1.6 kb de BspHI/FspI a partir de pCGP602 (Figura 2) (SEC ID NO: 1) que contenía el clon del ADNc de petunia de F3'5'H petHf1 (Holton et al., 1993a, supra).

Las condiciones de hibridación incluían una etapa de prehibridación en formamida al 10% v/v, NaCl 1 M, sulfato de dextrano al 10% p/v, SDS al 1% p/v a 42ºC durante al menos 1 hora. Los fragmentos marcados con 32P (cada uno a 1 x 106 cpm/ml) fueron agregados entonces a la solución de hibridación y la hibridación se continuó a 42º C durante 16 horas adicionales. Los filtros fueron lavados entonces en 2 x SSC, SDS al 1% p/v a 42ºC durante 2 x 1 hora y se expusieron a una película Kodak XAR con una pantalla de intensificación a -70ºC durante 16 horas.

Las placas fuertemente hibridizantes fueron tomadas en PSB (Sambrook et al., 1989, supra) y reseleccionadas para aislar las placas purificadas, utilizando las condiciones de siembra e hibridación tal como se describen para la selección inicial de la biblioteca de ADNc. Los plásmidos contenidos en los vectores bacteriófagos λZAPII o λZAP fueron rescatados y se generaron datos de secuencia desde los extremos 3 'y 5' de los insertos de ADNc. Se identificaron nuevos clones de ADNc de F3'5'H con base en similitud de secuencia al clon de ADNc F3'5'H petHf1 de petunia.

A los clones de ADNc aislados se les dio un número de designación de plásmidos tal como se describe en la Tabla

10.

TABLA 10. Números de plásmidos y SEQ ID NO: de clones de ADNc de F3’5’H aislados a partir de diversas especies

ESPECIE

CLON NÚMERO DE PLÁSMIDO NÚMERO DE FIGURA SEQ ID NO.

Viola spp.

BP#18 pCGP1959 25 9

Viola spp.

BP#40 pCGP1961 26 11

Salvia spp.

SaI#2 pCGP1995 31 13

Salvia spp.

Sal#47 pCGP1999 32 -15

Sollya spp.

Soll#5 pCGP2110 37 17

Kennedia spp.

Kenn#31 pCGP2231 40 26

Clitoria ternatea

BpeaHF2 pBHF2F4 43 20

Gentiana triflora

Gen#48 pG48 47 22

Lavandula nil

LBG pLHF8 51 31

Consructos F3’5’H de Viola (pensamiento) Aislamiento de clones de ADNc de F3’5’H a partir de pétalos de Viola spp. (pensamiento) El ARN total y el ARN poli(A)+ fue aislado a partir de pétalos de yemas jóvenes de un cultivar de Viola spp. pensamiento negra tal como se describe anteriormente. Se construyó una biblioteca de ADNc de pétalos utilizando el kit λZAPII/ Gigapack II Cloning (Stratagene, Estados Unidos) y se seleccionó como se describió anteriormente. Se identificaron dos clones de de ADNc de F3’5’H de longitud completa de pensamiento (BP#18 (SEQ ID NO:9) en pCGP1959 (Figura 25) y BP#40 (SEQ ID NO:11) en pCGP1961 (Figura 26)) mediante la similitud de secuencia al clon de ADNc F3’5’H petHf1 de petunia (SEQ ID NO:1). El BP#18 y BP#40 compartían 82% de identidad a nivel de nucleótidos. La comparación de la secuencia de nucleótidos de los clones F3’5’H de pensamiento (BP#18 y BP#40) con el F3’5’H de petunia revelaron alrededor de 60% de identidad con el clon F3’5’H petHf1 de petunia y 62% de identidad con el clon F3’5’H petHf2 de petunia.

10 Vector binario, pCGP1972 y pCGP1973 (AmCHS 5’: BP#18 o BP#40: petD8 3’)

Los plásmidos pCGP1972 (Figura 27) y pCGP1973 (Figura 28) contienen el clon de ADNc de F3’5’H de pensamiento (BP#18 y BP#40, respectivamente) entre un fragmento promotor CHS de A. majus (linaria) CHS (AmCHS 5’) y un fragmento terminador PLTP de petunia ( petD8 3’). Los genes F3’5’H están en tándem con respecto al casete del gen marcador seleccionable 35S 5’: SuRB del vector binario, pWTT2132 (ADNP) (Figura 6).

15 El clon de ADNc de la F3’5’H ( petHf1) de petunia en pCGP725 (descrito en el Ejemplo 4) (Figura 7) fue eliminado digiriendo inicialmente con pCGP725 con la endonucleasa de restricción BamHI. Los extremos fueron reparados y el plásmido linealizado fue digerido adicionalmente con la endonucleasa de restricción XbaI. El fragmento de ~4.9kb que contiene el vector con los fragmentos de AmCHS 5’ y petD8 3’ fue purificado y ligado con el fragmento ~1.6kb KpnI (extremos reparados)/ XbaI que contiene el clon de pensamientoF3’5’H BP#18 o BP#40 ADNc de pCGP1959 o pCGP1961, respectivamente para producir pCGP1970 y pCGP1971, respectivamente. El casete de AmCHS 5’: pensamiento F3’5’H: petD8 3’ fue aislado entonces a partir de pCGP1970 o pCGP1971 primeramente digiriendo con la endonucleasa de restricción NotI. Los extremos del plásmido linealizado fueron reparados y luego los genes quiméricos F3’5’H fueron liberados por digestión con la endonucleasa de restricción EcoRV. Los fragmentos purificados fueron ligados entonces con Asp718 (extremos reparados) del vector binario pWTT2132 (ADNP). La inserción correcta del fragmento se estableció por análisis de restricción con endonucleasa de ADN de plásmido aislado a partir de transformantes resistentes a la tetraciclina. Los plásmidos resultantes fueron designados como pCGP1972 (Figura 27) y pCGP1973. (Figura 28), respectivamente.

Transformación de clavel y petunia con pCGP1972 y 1973

Los ADN-T contenidos en los plásmidos de los vectores binarios pCGP1972 (Figura 27) y pCGP1973 (Figura 28) fueron introducidos separadamente en los cultivares Dianthus caryoplhyllus Kortina Chanel y Monte Lisa y Petunia hybrida cv. Skr4 x Sw63 a través de transformación mediada por Agrobacterium.

Vectores binarios, pCGP1967 y pCGP1969 (CaMV 35S: pensamiento F3’5’H ocs 3’)

Los vectores binarios pCGP1967 (Figura 29) y pCGP1969 (Figura 30) contienen genes quiméricos CaMV 35S: pensamiento F3’5’H: ocs 3’ en tándem con respecto al casete del gen marcador seleccionable 35S 5’: SuRB del vector binario, pWTT2132 (ADNP) (Figura 6).

Intermediarios en la preparación del vector binarios pCGP1967 y pCGP1969

Los plásmidos pCGP1959 (Figura 25) y pCGP1961 (Figura 26) fueron linealizados primeramente por digestión con la endonucleasa de restricción KpnI. Los extremos sobrantes Kpnl fueron reparados y los clones de ADNc de pensamiento F’5’H, BP#18 y BP#40, fueron liberados por digestión con la endonucleasa de restricción PstI. Los fragmento de ~1.6 kb generados fueron ligados con un fragmento de ~5.9 kb EcoRI (extremos reparados)/ PstI de pKIWI101 (Janssen and Gardner, 1989, supra). La correcta inserción da cada fragmento se estableció por análisis de restricción con endonucleasa del ADN del plásmido aislado a partir de transformantes resistentes a la ampicilina. Los plásmidos resultantes fueron designados como pCGP1965 y pCGP1966, respectivamente.

Los plásmidos pCGP1965 y pCGP1966 fueron digeridos primeramente de manera parcial con la endonucleasa de restricción XhoI. Los fragmentos resultantes fueron digeridos adicionalmente con la endonucleasa de restricción XbaI. Los extremos sobrantes fueron reparados y los fragmentos de 3.6kb que contienen los genes quiméricos de CaMV 35S: pensamiento F3’5’H: ocs fueron aislados y ligados con extremos reparados de Asp 718 de pWTT2132 (Figura 6). La correcta inserción da cada fragmento se estableció por análisis de restricción con endonucleasa del ADN del plásmido, aislado a partir de transformantes resistentes a la tetraciclina. Los plásmidos resultantes fueron designados como pCGP1967 (Figura 29) y pCGP1969 (Figura 30), respectivamente.

Transformación de rosa con pCGP1967 y pCGP1969

Los ADN-T contenidos en los plásmidos de los vectores binarios pCGP1967 (Figura 29) y pCGP1969 (Figura 31) fueron introducidos separadamente en Rose hybrida cv. Kardinal and Soft Promise a través de transformación mediada por Agrobacterium. El ADN-T contenido en el plásmido del vector binarios pCGP1969 (Figura 31) was also introduced into Rosa hybrida cv. Pamela y Medeo a través de transformación mediada por Agrobacterium,

Cosntructos de Salvia F3’5’H

Aislamiento de un clon de ADNc de F3’5’H de pétalos de Salvia spp.

El ARN total y el poli (A) + ARN fueron aislados a partir de yemas de pétalos jóvenes de Salvia spp. (comprados en un vivero) como se describió más arriba. Se construyó una biblioteca de ADNc de pétalos usando λZAPII/ Gigapack II Cloning kit (Stratagene, ESTADOS UNIDOS). Dos clones de longitud completa de salvia F3’5’H ADNc (Sal#2 (SEQ ID NO:13) en pCGP1995 (Figura 31) y Sal#47 (SEQ ID NO:15) en pCGP1999 (Figura 32)) fueron identificados por similitud de secuencia con el clon de ADNc de F3’5’H petHf1 de petunia. El Sal#2 y Sal#47 comparten 95% de identidad al nivel del nucleótido. La comparación de la secuencia de nucleótidos de clones de 3’5’H de salvia (Sal#2 y Sal#47) con la F3’5’H de petunia revelaron alrededor de 57% de identidad con el clon F3’5’H petHf1 de petunia (SEQ ID NO:I) y 58% de identidad con el clon F3’5’H petHf2 de petunia (SEQ ID NO:3).

Vectores binarios, pCGP2121 y pCGP2122

(AmCHS 5’: Salvia F3’5’H #2 o #47: petD8 3’)

Los plásmidos pCGP2121 (Figura 33) y pCGP2122 (Figura 34) contienen los clones de ADNc de F3’5’H de salvia (Sal#2 y Sal#47, respectivamente) entre un fragmento del promotor CHS de linaria ( AmCHS 5’) y un fragmento terminador PLTP de petunia ( petD8 3’) en tándem con el casete del gen marcador seleccionable 35S 5’: SuRB del vector binario pWTT2132 (ADNP) (Figura 6).

El clon de ADNc de F3’5’H (petHf1) de petunia en pCGP725 (descrito en el Ejemplo 4) (Figura 7) fue eliminado digiriendo inicialmente con pCGP725 con la endonucleasa de restricción BamHI. Los extremos fueron reparados y el plásmido linealizado fue digerido adicionalmente con la endonucleasa de restricción XbaI. El fragmento de 4.9 kb que contiene el vector con los fragmentos AmCHS 5’ y petD8 3’ fue purificado y ligado con el fragmento ∼1.6kb XhoI-BamHI (extremos reparados) de pCGP1995 (Figura 31) que contiene el fragmento F3’5’H#2 o XhoI/ EcoRI (extremos reparados) de pCGP1999 de salvia (Figura 32) que contiene el F3’5’H #47 de salvia, respectivamente para producir pCGP2116 y prop2117, respectivamente

El casete AmCHS 5’: salvia F’3’5’H: petD8 3’ fue aislado a partir de pCGP2116 o pCGP2117 primeramente digiriendo con la endonucleasa de restricción NotI. Los extremos de los plásmidos linealizados fueron reparados y luego los casetes del gen quimérico F3’5’H fueron liberados por digestión con la endonucleasa de restricción EcoRV. Los fragmentos purificados de ∼3.6kb fueron ligados entonces con extremos Asp718 reparados del vector binario pCGP1988 (Figura 16) (descrito en el Ejemplo 4). La correcta inserción da cada fragmento se estableció por análisis de restricción con endonucleasa de ADN de plásmido aislado a partir de transformantes resistentes a la tetraciclina. Los plásmidos resultantes fueron designados como pCGP2121 (Figura 33) y pCGP2122 (Figura 34), respectivamente.

Transformación de clavel y petunia con pCGP2121 y pCGP2122

Los ADN-T contenidos en los plásmidos de los vectores binarios pCGP2121 (Figura 33) y pCGP2122 (Figura 34) fueron introducidos separadamente en Dianthus caryoplhyllus cultivares Kortina Chanel y Monte Lisa y Petunia hybrida cv. Skr4 x Sw63 a través de transformación mediada por Agrobacterium.

Vectores binarios, pCGP2120 y pCGP2119 (CaMV 35S: salvia F3’5’H: ocs 3’)

Los vectores binarios pCGP2120 (Figura 35) y pCGP2119 (Figura 36) contienen casetes del gen quimérico de CaMV 35S: salvia F3’5’H: ocs 3’ en tándem con el casete del gen marcador seleccionable 35S 5’: SuRB del vector binario pCGP1988 (Figura 16).

Intermediarios en la preparación del vector binarios pCGP2120 y pCGP2119

Los plásmidos pCGP1995 (Figura 31) y pCGP1999 (Figura 32) fueron linealizados primeramente por digestión con la endonucleasa de restricción XhoI. Los extremos XhoI sobrantes fueron reparados y luego the los clones de F3’5’H ADNc de salvia Sal#2 o Sal#47 fueron liberados por digestión con la endonucleasa de restricción EcoRI. En el caso de pCGP1995 se adelantó una digestión parcial con. Los fragmentos ∼1.7 kb fueron ligados con los extremos ClaI (extremos reparados)/EcoRI def pCGP2105 (Figura 17). La correcta inserción da cada fragmento se estableció por análisis de restricción con endonucleasa del ADN del plásmido aislado a partir de transformantes resistentes a la ampicilina. Los plásmidos resultantes fueron designados como pCGP2112 y pCGP2111, respectivamente.

Los plásmidos pCGP2112 y pCGP2111 fueron digeridos con las endonucleasas de restricción XhoI y XbaI. Los extremos sobrantes resultantes fueron reparados y los fragmentos ∼3.6 kb que contienen los genes quiméricos de CaMV 35S: salvia F3’5’H: ocs 3’ fueron aislados y ligados con Extremos Asp718 reparados del vector binario, pCGP1988 (descrito en el Ejemplo 4). La correcta inserción da cada fragmento se estableció por análisis de restricción con endonucleasa de ADN de plásmido aislado a partir de transformantes resistentes a la tetraciclina. Los plásmidos resultantes fueron designados como pCGP2120 (Figura 35) y pCGP2119 (Figura 36), respectivamente.

Transformación de rosa con pCGP2120 y pCGP2119

Los ADN-T contenidos en los plásmidos de los vectores binarios pCGP2120 (Figura 35) y pCGP2119 (Figura 36) fueron introducidos separadamente en Rosa hybrida cv, Kardinal a través de transformación mediada por Agrobacterium.

Constructos de F3’5’H de Sollya

Aislamiento de unClon de ADNc de F3’5’H a partir de pétalos de Sollya spp.

El ARN total y el poli (A) + ARN fueron aislados a partir de yemas de pétalos jóvenes de Sollya spp. (comprados en un vivero) como se describió más arriba. Se construyó una biblioteca de ADNc de pétalos usando λZAPII/ Gigapack II Cloning kit (Stratagene, ESTADOS UNIDOS). Un clon de longitud completa de ADNc de F3’5’H de Sollya (Soll#5 (SEQ ID NO:17) en pCGP2110 (Figura 37)) fue identificado por similitud de secuencia con el clon de ADNc de F3’5’H petHf1 de petunia. La comparación de la secuencia de nucleótidos del clon de F3’5’H de sollya con el de F3’5’H de petunia revelaron alrededor de 48% de identidad con el clon de F3’5’H petHf1 de petunia (SEQ ID NO:1) y 52% de identidad con el clon de F3’5’H petHf2 de petunia (SEQ ID NO:3).

El vector binario pCGP2130 (AmCHS 5’: Sollya F3’5’H: petD8 3’)

El plásmido pCGP2130 (Figura 38) contiene el clon de ADNc de F3’5’H Soll#5 de sollya entre un fragmento del promotor CHS de linaria ( AmGHS 5’) y un fragmento terminador PLTP de petunia ( petDB 3’) en una orientación en tándem con respecto al casete del gen marcador seleccionable 35S 5’: SuRB del vector binario pCGP1988 (Figura 16).

El clon de ADNc de F3’5’H (peHf1) de petunia en pCGP725 (descrito en el Ejemplo 4) (Figura 7) fue eliminado digiriendo inicialmente con pCGP725 con las endonucleasas de restricción XbaI and BamHI. ,Los extremos fueron reparados el fragmento de 4.9 kb que contiene el vector con los fragmentos AmCHS 5’ y petD8 3’ fue purificado y ligado con the extremos reparados del fragmento de ∼1.6kb Asp718/ PstI de pCGP2110 que contiene el Clon de ADNc de F3’5’H de sollya para producir pCGP2128. La inserción correcta del fragmento de F3’5’H de sollya en tándem con los fragmentos AmCHS 5’ y petD8 3’ fue confirmado mediante el trazado de mapas de endonucleasas de restricción.

El casete del gen AmCHS 5’: sollya F3’5’H: petD8 3’ fue aislado entonces a partir de pCGP2128 primeramente digiriendo con la endonucleasa de restricción NotI. Los extremos de los plásmidos linealizados fueron reparados and el gen quimérico de F3’5’H fue liberado por digestión con la endonucleasa de restricción EcoRV. El fragmento purificado de ∼3.5kb fue ligado entonces con Asp718 (extremos reparados) del vector binario pCGP1988 (descrito en el Ejemplo 4) (Figura 16). La inserción correcta del fragmento se estableció por análisis de restricción con endonucleasa del ADN del plásmido aislado a partir de transformantes resistentes a la tetraciclina. El plásmido resultante fue designado como pCGP2130 (Figura 38).

Transformación de clavel y Petunia con pCGP2130

El ADN-T contenido en el plásmido del vector binario pCGP2130 (Figura 38) fue introducido en Dianthus caryoplhyllus cultivares Kortina Chanel y Monte Lisa y Petunia hybrida cv. Skr4 x Sw63 a través de transformación mediada por Agrobacterium.

El vector binario pCGP2131 (CaMV 35S: sollya F3’5’H: ocs 3’)

El vector binario pCGP2131 (Figura 39) contiene un gen quimérico CaMV 35S: sollya F3’5’H: ocs 3’ en tándem con el casete del gen marcador seleccionable 35S 5’: SuRB del vector binario pCGP1988 (Figura 16).

Intermediarios en la preparación del vector binario pCGP2131

El plásmido pCGP2110 fue linealizado primeramente por digestión con la endonucleasa de restricción Asp718. Los extremos sobrantes fueron reparados y el Clon de ADNc de F3’5’H de sollya fue liberado por digestión con la endonucleasa de restricción PstI. El fragmento de ∼1.7 kb fue ligado con the EcoRV/ Extremos Pstlde pCGP2105 (Figura 17). La inserción correcta del fragmento se estableció por análisis de restricción con endonucleasa del ADN del plásmido aislado a partir de transformantes resistentes a la ampicilina. El plásmido resultante fue designado como pCGP2129.

Un fragmento de 3.6 kb que contiene el gen quimérico CaMV 35S: sollya F3’5’H: ocs 3’ fue liberado por digestión con las endonucleasas de restricción Asp718 and XbaI Los extremos sobrantes fueron reparados y el fragmento purificado fue ligado con of Extremos Asp718 reparados del vector binario, pCGP1988 (Figura 16). La inserción correcta del fragmento se estableció por análisis de restricción con endonucleasa de ADN de plásmido aislado a partir de transformantes resistentes a la tetraciclina. El plásmido resultante fue designado como pCGP2131 (Figura 39).

Transformación de rosa con pCGP2131

El ADN-T contenido en el plásmido del vector binario pCGP2131 (Figura 39) fue introducido en Rosa hybrid cv. Kardinal a través de transformación mediada por Agrobacterium.

Constructos de F3’5’H de Kennedia

Aislamiento de unClon de ADNc de F3’5’H de pétalos de Kennedia spp.

El ARN total y el poli (A) + ARN fueron aislados a partir de yemas de pétalos jóvenes de Kennedia spp. (comprados en un vivero) como se describió más arriba. Se construyó una biblioteca de ADNc de pétalos usando λZAPII/ Gigapack II Cloning kit (Stratagene, ESTADOS UNIDOS). Un clon de ADNc de F3’5’H ( Kenn#31 de longitud completa de kennedia en pCGP2231 (Figura 40)) (SEQ ID NO:26) fue identificado por similitud de secuencia con el clon de ADNc de F3’5’H petHf1 de petunia. La comparación de la secuencia de nucleótidos del clon de F3’5’H de kennedia con el de petunia F3’5’H revelaró alrededor de 64% de identidad con el clon de F3’5’H petHf1 de petunia (SEQ ID NO:1) y 60% de identidad con el clon de F3’5’H petHf2 de petunia (SEQ ID NO:3).

El vector binario pCGP2256 ( Am CHS 5’: kennedia F3’5’H: petD8 3’)

El plásmido pCGP2256 (Figura 41) contiene el clon de ADNc de F3’5’H (Kenn#31) de kennedia entre un fragmento del promotor CHS de linaria (AmCHS 5’) y un fragmento terminador PLTP de petunia ( petD8 3’) en tándem con el casete del gen marcador seleccionable 35S5’: SuRB del vector binario pCGP1988 (Figura 16).

El clon de ADNc de F3’5’H ( petHf1) de petunia en pCGP725 (descrito en el Ejemplo 4) (Figura 7) fue eliminado digiriendo inicialmente con pCGP725 con las endonucleasas de restricción XbaI and BamHI. Los extremos fueron reparados el fragmento de 4.9 kb que contiene el vector con los fragmentos AmCHS 5’ y petD8 3’ fue purificado y ligado con the extremos reparados de los fragmentos ∼1.8kb XhoI/ BamHI de pCGP2231 que contiene el Clon de ADNc de F3’5’H de kennedia para producir pCGP2242. La inserción correcta del fragmento F3’5’H de kennedia en tándem con los fragmentos AmCHS 5’ y petD8 3’ fue confirmado mediante el trazado de mapas de endonucleasas de restricción.

El casete AmCHS 5’: kennedia F3’5’H: petD8 3’ fue aislado entonces a partir de pCGP2242 digiriendo con las endonucleasas de restricción NotI and EcoRI. Los extremos fueron reparados and el fragmento de ∼3.7 kb purificado fue ligado entonces con Extremos Asp718 reparados del vector binario pCGP1988 (descrito en el Ejemplo 4) (Figura 16). La correcta inserción del fragmento se estableció por análisis de restricción con endonucleasa de ADN de plásmido aislado a partir de transformantes resistentes a la tetraciclina. El plásmido resultante fue designado como pCGP2256 (Figura 41).

Petunia transformation con pCGP2256

El ADN-T contenido en el plásmido del vector binario pCGP2256 (Figura 41) fue introducido en Petunia hybrid cv. Skr4 x Sw63 a través de transformación mediada por Agrobacterium.

El vector binario pCGP2252 (CaMV 35S: kennedia F3’5’H: ocs 3’)

El vector binario pCGP2252 (Figura 42) contiene un gen quimérico CaMV 35S: kennedia F3’5’H: ocs 3’ en tándem con el casete marcador seleccionable 35S 5’: SuRB del vector binario pCGP1988 (Figura 16).

Intermediarios en la preparación del vector binario pCGP2252

El plásmido pCGP2231 fue linealizado primeramente por digestión con la endonucleasa de restricción XhoI. Los extremos sobrantes fueron reparados y el kennedia Clon de ADNc de F3’5’H fue liberado por digestión con la endonucleasa de restricción PstI. El fragmento ∼1.7 kb fue ligado con the ClaI (extremos reparados)/ Extremos Pstlde pCGP2105 (Figura 17). La inserción correcta del fragmento se estableció por análisis de restricción con endonucleasa del ADN del plásmido aislado a partir de transformantes resistentes a la ampicilina. El plásmido resultante fue designado como pCGP2236.

Un fragmento de 3.6 kb que contiene el casete del gen quimérico CaMV 35S: kennedia F3’5’H: ocs 3’ fue liberado del plásmido pCGP2236 por digestión con las endonucleasas de restricción XhoI and NotI. Los extremos sobrantes fueron reparados y el fragmento purificado fue ligado con Extremos Asp718 reparados del vector binario, pCGP1988 (Figura 16). La inserción correcta del fragmento se estableció por análisis de restricción con endonucleasa de ADN de plásmido aislado a partir de transformantes resistentes a la tetraciclina. El plásmido resultante fue designado como pCGP2252 (Figura 42).

Transformación de rosa con pCGP2252

El ADN-T contenido en el plásmido del vector binario pCGP2252 (Figura 42) fue introducido en Rosa hybrida cv. Kardinal a través de transformación mediada por Agrobacteriumc.

Constructos de ampanilla N3’5’H

Aislamiento de un clon de ADNc de F3’5’H de pétalos de Clitoria ternatea (campanilla)

Construcción de la biblioteca de ADNc de pétalos de campanilla

Una variedad azul de Clitoria ternatea (campanilla, las semillas fueron amablemente provistas por Osaka Botanical Garden) fuer cultivado en un campo en Osaka. El ARN total fue aislado a partir de pétalos frescos y pigmentado en la etapa de preantesis tal como se describe anteriormente. Se preparó el ARN poli A+ utilizando Oligotex (Takara) de acuerdo con la recomendación del fabricante. Una biblioteca de ADNc de pétalo de campanilla fue construida a partir del ARN poli A+ usando un kit de síntesis direccional λZAP-ADNc (Stratagene, Estados Unidos) siguiendo los protocolos del fabricante.

Selección de una biblioteca de ADNc decampanilla para un clon de ADNc de F3’5’H

La biblioteca de ADNc de pétalo de campanilla fue seleccionada sobre un clon marcado con DIG de F3’5’H petHf1 ADNc de petunia tal como se describió previamente (Tanaka et al., Plant Cell Physiol. 37: 711 -716, 1996). Se identificaron dos clones de ADNc que mostraron alta similitud en secuencia con el F3’5’H petHf1 de petunia. El plásmido que contiene el clon más largo de ADNc fue designado como pBHF2 y se secuenció el clon de ADNc. El alineamiento entre las secuencias de aminoácidos deducidas del clon de F3’5’H de campanilla y el clon de F3’5’H petHf1 de petunia (SEQ ID NO:2) revelaron que el ADNc F3’5’H de campanilla (contenido en pBHF2) no representaba un ADNc de longitud completa y carecía de dos bases del codón de iniciación putativo. Estas dos bases junto con un sitio de reconocimiento e endonucleasa de restricción BamHI fueron agragados al clon de ADNc usando PCR y un iniciador sintético, 5’-GGGATCCAACAATGTTCCTTCTAAGAGAAAT-3’ [SEQ ID NO:25] tal como se describió previamente (Yonekura-Sakakibara et al., Plant Cell Physiol. 41: 495-502, 2000). El fragmento resultante fue digerido con las endonucleasas de restricción BamHI y PstI y se recuperó el fragmento subsecuente de AND de aproximadamente 200 bp. El fragmento de ADN fue ligado con un fragmento de 3.3 kb fragment BamHI/ EcoRI digerido con pBHF2 para producir pBHF2F (Figura 43). Se confirmo que la secuencia de AND excluye errores cometidos durante la PCR (SEQ ID NO:20). La comparación de la secuencia de nucleótidos del clon de F3’5’H de campanilla (SEQ ID NO:20) con el F3’5’H de petunia revelaron alrededor de 59% de identidad con el clon de F’3’5’H petHf1 de petunia (SEQ ID NO:1) y 62% de identidad con el clon de F3’5’H petHf2 de petunia (SEQ ID NO:3).

El vector binario pCGP2135 (AmCHS 5’: campanilla F3’5’H: petD8 3’)

El plásmido pCGP2135 (Figura 44) contiene el Clon de ADNc de F3’5’H de campanilla entre un fragmento del promotor CHS de linaria ( AmCHS 5’) y un fragmento terminador PLTP de petunia ( petD8 3’) en tándem con el casete del gen marcador seleccionable 35S 5’: SuRB del vector binario pCGP1988 (Figura 16).

El clon de ADNc de F3’5’H ( petHf1) de petunia en pCGP725 (descrito en el Ejemplo 4) (Figura 7) fue eliminado digiriendo inicialmente con pCGP725 con las endonucleasas de restricción XbaI and BamHI. Los extremos fueron reparados el fragmento de 4.9 kb que contiene el vector con los fragmentos AmCHS 5’ y petD8 3’ fue purificado y ligado con the extremos reparados del fragmento de ∼1.6kb XhoI/ BamHI de pBHF2F (Figura 43) que contiene el Clon de ADNc de F3’5’H de campanilla para producir prop2133. La inserción correcta del fragmento de F3’5’H de campanilla t en tándem con los fragmentos AmCHS 5’ y petD8 3’ fue confirmado mediante el trazado de mapas de endonucleasas de restricción.

El casete AmCHS 5’: campanilla F3’5’H: petD8 3’ fue aislado entonces a partir de pCGP2133 primeramente digiriendo con la endonucleasa de restricción NotI . Los extremos del plásmido linealizado fueron reparados y el gen quimérico de F3’5’H fue liberado por digestión con la endonucleasa de restricción EcoRV. El fragmento de ∼3.6kb purificado fue ligado entonces con extremos Asp718 reparados del vector binario pCGP1988 (descrito en el Ejemplo 4) (Figura 16). La inserción correcta del fragmento se estableció por análisis de restricción con endonucleasa de ADN de plásmido aislado a partir de transformantes resistentes a la tetraciclina. El plásmido resultante fue designado como pCGP2135 (Figura 44).

Transformación de clavel y petunia con pCGP2135

El ADN-T contenido en el plásmido del vector binario pCGP2135 (Figura 44) fue introducido en Dianthus caryoplhyllus cultivares Kortina Chanel y Monte Lisa y Petunia hybrida cv. Skr4 x Sw63 a través de transformación mediada por Agrobacterium.

El vector binario pBEEF5 (eCaMV35S: Campanilla F3’5’H: nos 3’)

El vector binario, pBE2113-GUS contiene una región de codificación GUS entre un promotor potenciado CaMV 35S y un terminador en un vector binario pBI121 binary vector (Mitsuhara et al., 1996, supra). El plásmido pBE2113-GUS fue digerido con la endonucleasa de restricción SacI. Los extremos sobrantes fueron reparados y ligados con con un

enlazante SaII para producir pBE2113-GUSs. El fragmento de 1.8 kb BamHI-XhoI de pBHF2F fue ligado con pBE2113-GUSs digeridos con BamHI/ SalI para crear pBEBF5 (Figura 45).

Transformación de rosa con pBEBF5

El ADN-T contenido en el plásmido del vector binario pBBBF5 (Figura 45) fue introducido en Rosa hybrida cultivar Lavande a través de transformación mediada por Agrobacterium.

El vector binario pCGP2134 (CaMV 35S: campanilla F3’5’H: ocs 3’)

El vector binario pCGP2134 (Figura 46) contiene un casete del gen quimérico CaMV 35S: campanilla F3’5’H: ocs 3’ en una orientación en tándem con el casete del gen marcador seleccionable 35S 5’: SuRB del vector binario pCGP1988 (Figura 16).

Intermediarios en la preparación del vector binario pCGP2134.

El clon de ADNc de F3’5’H de campanilla fue liberado por digestión del plásmido pBHF2F (Figura 43) con las endonucleasas de restricción XhoI and BamHI. Los extremos sobrantes fueron reparados y el fragmento de ∼1.7 kb fue ligado con los extremos PstI (extremos reparados)/EcoRV pCGP2105 (descrito en el Ejemplo 4) (Figura 17). La inserción correcta del fragmento se estableció por análisis de restricción con endonucleasa del ADN del plásmido aislado a partir de transformantes resistentes a la ampicilina. El plásmido resultante fue designado como pCGP2132. Un fragmento de ∼3.6 kb que contiene el casete del gen quimérico CaMV 35S: campanilla F3’5’H: ocs 3’ fue liberado por digestión con las endonucleasas de restricción XhoI and XbaI . Los extremos sobrantes fueron reparados y el fragmento purificado fue ligado con Extremos Asp718 reparados del vector binario, pCGP1988 (descrito en el Ejemplo 4) (Figura 16). La inserción correcta del fragmento se estableció por análisis de restricción con endonucleasa de ADN de plásmido aislado a partir de transformantes resistentes a la tetraciclina. El plásmido resultante fue designado como pCGP2134 (Figura 46).

Transformación de rosa con pCGP2134

El ADN-T contenido en el plásmido del vector binario pCGP2134 (Figura 46) fue introducido en Rosa hybrida cv. Kardinal a través de transformación mediada por Agrobacterium.

Cosntructos de Gentia F3’5’H

Aislamiento de un clon de ADNc de F3’5’H de pétalos de Gentiana triflora (genciana).

Construcción y selección de una biblioteca de ADNc de pétalo de genciana

El aislamiento de un ADNc de genciana que codifica F3’5’H ha sido descrito previamente (Tanaka et al., 1996, supra) y está contendio dentro del plásmido pG48 (Figura 47). La comparación de la secuencia de nucleótidos del clon de F3’5’H de genciana ( Gen#48) (SEQ ID NO:22) contenido en el plásmido pG48 (Figura 47) con el de petunia F3’5’H reveló alrededor de 61% de identidad con el clon de F3’5’H petHf1 de petunia (SEQ ID NO:1) y 64% de identidad con el clon de F3’5’H petHf2 de petunia (SEQ ID NO:3).

El vector binario pCGP1498 (AmCHS 5’: gentia F3’5’H: petD8 3’)

El plásmido pCGP1498 (Figura 48) contiene el clon de ADNc de F3’5’H (Gen#48) de genciana entre un fragmento del promotor CHS de linaria ( AmCHS 5’) y un fragmento terminador PLTP de petunia ( petD8 3’) en tándem con el casete del gen marcador seleccionable 35S 5’: SuRB del vector binario pWTT2132 (Figura 6).

El clon de ADNc de F3’5’H ( petHf1) de petunia en pCGP725 (descrito en el Ejemplo 4) (Figura 7) fue eliminado digiriendo inicialmente con pCGP725 con las endonucleasas de restricción XbaI and BamHI. Los extremos fueron reparados, el fragmento de -4.9kb que contiene el vector con los fragmentos AmCHS 5’ y petD8 3’ fue purificado y ligado con los extremos reparados del fragmento de ~1.7 kb XhoI/ BamHI de pG48 (Figura 47) que contiene el clon de ADNc de F3’5’H de genciana para producir pCGP1496. La inserción correcta del fragmento de F3’5’H de genciana en tándem con los fragmentos AmCHS 5’ y petD8 3’ fue confirmado mediante el trazado de mapas de endonucleasas de restricción.

El casete AmCHS 5’: gentia F3’5’H: petD8 3’ fue aislado entonces a partir de pCGP1496 primeramente digiriendo con la endonucleasa de restricción NotI. Los extremos sobrantes del plásmido linealizado fueron reparados y luego el gen quimérico de F3’5’H fue liberado por digestión con la endonucleasa de restricción EcoRV. El fragmento de ~3.6kb purificado fue ligado entonces con extremos Asp718 reparados del vector binario pWTT2132 (Figura 6). La inserción correcta del fragmento se estableció por análisis de restricción con endonucleasa de ADN de plásmido aislado a partir de transformantes resistentes a la tetraciclina. El plásmido resultante fue designado como pCGP1498 (Figura 48).

Transformación de clavel y petunia con DCGP1498

El ADN-T contenido en el plásmido del vector binario pCGP1498 (Figura 48) fue introducido en Dianthus caryoplhyllus, cultivares Kortina Chanel y Monte Lisa y Petunia hybrida cv. Skr4 x Sw63 a través de transformación mediada por Agrobacterium.

El vector binario pBEGHF48 (eVaMV 35S: gentia F3’5’H: nos 3’)

El clon de ADNc de F3’5’H de genciana fue liberado por digestión del plásmido pG48 con las endonucleasas de restricción BamHI y XhoI. El fragmento resultante de ~1.7 kb ADN fue aislado y ligado con pBE2113-GUSs digerido con BamHI/ SalI (Mitsuhara et al., 1996, supra) para crear pBEGHF48 (Figura 49).

Transformación de rosa con pBEGFIF48

El ADN-T contenido en el plásmido del vector binario pBEGHF48 (Figura 49) fue introducido en Rose hybrid cv. Lavande a través de transformación mediada por Agrobacterium.

El vector binario pCGP1982 CaMV 35S: gentia F3’5’H: ocs 3’)

El vector binario pCOP1982 (Figura 50) contiene un casete del gen quimérico CaMV 35S: gentia F3’S’H.· ocs 3’ en tándem con el casete del gen marcador seleccionable 35S 5’: SuRB del vector binario pWTT2132 (Figura 6).

Intermediarios en la preparación del vector binario pCGP1982

El plásmido pG48 (Figura 47) fue linealizado por digestión con la endonucleasa de restricción Ass718. Los extremos sobrantes fueron reparados y el clon de ADNc de F3’5’H de genciana ( Gen#48) fue liberado por digestión con la endonucleasa de restricción BamHI . El fragmento de ~1.7 kb fue ligado con el fragmento de 5.95kb EcoRI (extremos reparados)/ BamHI de pKIWI101 (Janssen and Gardner, 1989, supra). La inserción correcta del fragmento se estableció por análisis de restricción con endonucleasa del ADN del plásmido aislado a partir de transformantes resistentes a la ampicilina. El plásmido resultante fue designado como pCGP1981.

Un fragmento de ~3.6 kb que contiene el casete del gen quimérico CaMV 35S: gentia F3’5’H: ocs 3’ fue liberado por digestión del plásmido pug1’1981 con las endonucleasas de restricción XhoI and XbaI Los extremos sobrantes fueron reparados y el fragmento purificado fue ligado con extremos reparados del vector binario digerido por Asp718, pWTT2132. La inserción correcta del fragmento fue establecida por análisis con endonucleasa de restricción de ARN de plásmido aislado de transformantes resistentes a la tetraciclina. El plásmido resultante fue designado como pCGP1982 (Figura 50).

Transformación de rosa con pCGP1982

El ADN-T contenido en el plásmido del vector binario pCGP1982 (Figura 50) fue introducido en Rosa hybrid cv. Kardinal a través de transformación mediada por Agrobacterium.

Constructos de F3’5’H de lavanda

Aislamiento de unClon de ADNc de F3’5’H de pétalos de Lavandula nil (lavanda)

Construcción de biblioteca de ADNc de pétalo de lavanda

Cortes de flores de una variedad violeta de Lavandula nil were purchased de un florista. El IONA total fue aislado a partir de pétalos frescos y pigmentados como se describió más arriba. Se preparó poliA+ ARN usando Oligotex (Takara) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Se construyó una biblioteca de ADNc de pétalo de lavanda a partir de poliA+ RNA usando un kit de síntesis direccional λZAP-ADNc (Stratagene, ESTADOS UNIDOS) siguiendo los protocolos del fabricante.

Selección de una biblioteca de ADNc de lavanda para un clon de ADNc de F3’5’H

La biblioteca de ADNc de pétalo de lavanda fue seleccionada con un clon marcado con DIG de ADNc de F3’5’H petHf1 de petunia tal commo se describió previamente (Tanaka et al.1996, supra). Se idenificó un clon de ADNc (LBG) que mostró alta similitud con F3’5’H petHf1 de petunia y el plásmido fue designado como pLHF8 (Figura 51). La secuencia de nucleótidos del clon de ADNc de F3’5’H ( LBG) de lavanda fue designado como SEQ ID NO: 31.

La comparación de la secuencia de nucleótidos del clon de F3’5’H de lavanda con el clon de ADNc de F3’5’Hs de petunia reveló alrededor de 59% de identidad con el clon de F3’5’H petHf1 de petunia (SEQ ID NO:1) y 60% de identidad con el clon de petHf2 de petunia (SEQ ID NO:3).

El vector binario pBELF8 (eCaMV 35S: lavenda F3’5’H nos 3’)

El plásmido of pLHF8 (Figura 51) fue digerido con las endonucleasas de restricción BamHI y XhoI para liberar un fragmento de ADN de aproximadamente 1.8 kb. El fragmento de ~1.8kb purificado a partir de pLHF8 fue ligado entonces con los extremos digeridos de BamHI –SalI del plásmido pBE2113-GUSs (descrito anteriormente) para crear pBELF8 (Figura 52).

Transformación de rosa con pBELF8

El ADN-T contenido en el plásmido del vector binario pBELF8 (Figura 52) fue introducido en Rosa hybrida, cultivar Lavande a través de transformación mediada por Agrobacterium.

Ejemplo 8

Análisis de clavel, petunia y rosa transgénicos

Las plantas transgénicas producidas en los experimentos descritos en el Ejemplo 7 fueron cultivadas hasta la floración. Las flores fueron recolectadas y se codificaron los colores de los pétalos utilizando el Royal Horticultural Society Colour Charts (RHSCC). Las antocianinas fueron extraídas y se analizaron las antocianidinas por análisis espectrofotométrico, TLC y/o HPLC. El ARN total también fue aislado a partir del tejido de los pétalos en las etapas apropiadas del desarrollo de las flores y se utilizó el análisis de inmunoprecipitación Northern para detectar transcriptos de los transgenes de F3'5'H. Los resultados de los análisis transgénicos se resumen en las Tablas 11, 12 y 13.

Clavel

Los genes de F3’5'H descritos en el Ejemplo 7 fueron evaluados en cuanto a su capacidad para guiar la producción de pigmentos basados en delfinidina en pétalos de clavel. Se utilizaron dos cultivares de clavel, Kortina Chanel (KC) y Monte Lisa (ML), en los experimentos de transformación. El cultivar de clavel Kortina Chanel produce flores de color rosa que normalmente acumulan antocianinas basadas en cianidina. Este cultivar por lo tanto contiene una actividad de F3'H y DFR de clavel que una F3'5'H introducido requeriría para competir por el sustrato. El cultivar de clavel Monte Lisa produce flores color rojo ladrillo que acumulan normalmente antocianinas basados en pelargorridan. Se cree que este cultivar carece de actividad F3'H completamente funcional y que contiene un DFR que es capaz de actuar sobre DHK y por lo tanto una F3'5'H introducida solamente se requeriría para competir con el DFR endógeno por el sustrato.

Tabla 11 Resultados de análisis transgénicos de pétalos de claveles transformados con ADN-T que contiene casetes de expresión del gen de F’3’5’H (AmCHS 5’: F3’5’H petD8 3’).

F3’5’H

pCGP cv. #tg TLC+ HPLC+ % de del más alto AV % del Northern +

Salvia#2

2121 KC 22 2/16 3/4 12.5% 7% nd

ML

21 17/18 9/9 76% 57% 14/15

Salvia#4 7

2122 KC 23 6/12 8/8 29% 12% nd

ML

25 21/22 17/17 88% 56% 12/14

(continuación) (continuación)

F3’5’H

pCGP cv. #tg TLC+ HPLC+ % de del más alto AV % del Northern +

Sollya

2130 KC 30 22/27 17/17 35% 11% nd

ML

23 14/15 14/14 76% 49% 13/14

Campanilla

2135 KC 22 0/16 0/1 nd nd nd

ML

24 19/20 13/13 23% 10% 14/14

Gensiana

1498 KC 22 0/14 nd nd nd 7/8

ML

2 2/2 1/1 nd nd 1/2

pensamiento BP#18

1972 KC 26 18/20 12/12 14% 9% 19/19

ML

21 15/16 8/8 80% 66% 14/16

pensamiento BP#40

1973 KC 26 11/15 7/8 18% 8% 13/17

ML

33 19/22 20/20 72% 52% 12/15

petunia petHf1

1452 KC 144 41164 nd 3.5% 1.3% 15/17

ML

48 39/41 26/26 75% 30% 12/13

petunia petHf2

1524 ML 27 18/19 17/17 81% 41% 12/14

F3’5’H = secuencia de F3’5’H contenida en el AND-T pCGP = número de plásmido pCGP del vector binario utilizado en el experimento de transformación cv. = cultivar KC = cultivar de clavel Kortina Chanel (línea de cianidina) ML = cultivares de clavel Monte Lisa (línea de pelargonidina) #tg = número total de transgénicos producidos TLC+ = número de eventos individuales en los cuales las moléculas de delfinidina basadas en delfinidina fueron detectados en pétalos (tal como se determina por TLC) sobre el número total de eventos individuales analizados HPLC+ = número de eventos individuales en los cuales se detectaron moléculas de delfinidina o basadas en delfinidina en pétalos (según se determina por HPLC) sobre el número total de eventos individuales analizados % de del más alto = % más alto de moléculas de delfinidina o basadas en delfinidina detectadas en los pétalos para la población de eventos transgénicos % de del Av= % promedio de moléculas de delfinidina o basadas en delfinidina detectados en pétalos para la población de eventos transgénicos

F3’5’H

pCGP cv. #tg TLC+ HPLC+ % de del más alto AV % del Northern +

Northern = número de eventos individuales en los cuales los transcriptos específicos intactos de F3’5H fueron detectados por análisis de inmunoprecipitación Northen en el ARN total aislado a partir de pétalos sobre el número total de eventos analizados nd= no hecho

Los resultados sugieren que todas las secuencias de F3'5'H evaluadas (petunia petHf1, petunia petHf2, Salvia Sal#2, Salvia Sal#47, Sollya Sol#5, Campanilla BpeaHF2, pensamiento BP#18, pensamiento BF#40 y Gentian

5 Gen#48) fueron estables en claveles y dieron como resultado la producción de nuevos pigmentos basados en delfinidina en flores de clavel. Los transcriptos intactos de cada F3'5'H fueron detectados por análisis de inmunoprecipitación Northern en ARN total aislado a partir de pétalos de los claveles transgénicos.

Petunia

Los genes Fuzz descritos en el Ejemplo 7 fueron evaluados en cuanto a su capacidad para guiar a la producción de

10 pigmentos basados en delfinidina en pétalos de petunia. El híbrido P. híbrida F1 Skr4 x SW63 el cual es homocigoto recesivo para HF1 y HF2, fue utilizado en los experimentos de transformación. Aunque el Skr4 x SW63 es un homocigoto recesivo para HF1 y HF2, estas mutaciones no bloquean completamente la producción de la F3'5'H endógena (véase la patente de los Estados Unidos No. 5,349,125) y se producen bajos niveles de malvidina para dar al borde del pétalo un color lila pálido. La malvidina es el derivado metilado de las moléculas de pigmento 3'5'

15 hidroxiladas de delfinidina o basadas en delfinidina (Figuras 1A y 1B). El análisis espectrofotométrico fue utilizado para medir las antocianinas totales que se acumulan en pétalos a partir de las flores de petunia transgénica. El nivel incrementado de antocianinas y/o el cambio de color detectado fue utilizado como guía para la eficacia del gen de F3'5'H bajo evaluación.

Tabla 12 Resultados del análisis transgénico de pétalos de plantas de P. híbrida cv Skr4 x SW63 transformadas con 20 ADN-T que contiene los casetes de expresión del gen de F3’5’H (AmCHS 5’: F3’5’H: petD8 3’).

F3’5’H

pCGP # tg TLC+ Col ↑ A/c Mejor Promedi o Northern + Mejor color

control

na na na na na 144-25 0 0 75C

Gensiana

1498 22 3/5 18/20 nd 6/6 72B/ 78A

Campanilla

2135 24 18/20 22/24 23/24 4427 2397 nd 74A/ 78A

Kennedia

2256 24 22/24 22/24 22/24 4212 2592 nd T4A/ 78A

Salvia#2

2121 24 21/24 21/24 21/24 2471 1730 nd 78A

Salvia#47

2122 19 17/19 16/19 16/19 2634 1755 nd 78A/ 80A

Sollya#5

2130 22 14/16 13/16 13/16 3446 1565 nd 78A

(continuación)

F3’5’H

pCGP # tg TLC+ Col ↑ A/c Mejor Promedi o Northern + Mejor color

pensamient oBP#1 8

1972 22 nd 20/22 nd nd nd 9/9 74A/B

pensamient o BP#40

1973 19 8/8 18/19 18/20 2583 1556 nd 74/78A

petunia petHf1

484 16 nd 9/16 8/15 2683 1250 nd 74AIB

petunia petHf2

1524 20 nd 18/20 8/8 4578 2357 8/8 74A/B

F3’5’H = secuencia de F3’5H contenida en el ADN-T pCGP = número de plásmido pCGP del vector binario usado en el experimento de transformación #tg = número total de transgénicos producidos TALC+ = número de eventos individuales en los cuales fue detectada la malvidina en las flores (a un nivel por encima de la referencia Skr4 x Sw63) (según se determinó por TLC) sobre el número total de eventos individuales analizados Col = número de eventos individuales que produjeron flores con un color de flor alterado en comparación con el control sobre el número total examinado ↑ A/c = número de eventos individuales que tienen un nivel incrementado de antocianina en pétalos según se mide por análisis espectrofotométrico de extractos crudos sobre el número de eventos individuales analizados (en µmoles/g) Mejor= cantidad más alta de antocianina medida por análisis espectrofotométrico de extractos crudos a partir de una flor de un evento individual (en µmoles/g) Av = la cantidad promedio de antocianina detectada según se mide por análisis espectrofotométrico de extractos crudos a partir de una flor en la población de flores transgénicas analizadas (en µmoles/g) Northern – número de eventos individuales en los cuales fueron detectados los transcriptos intactos específicos de F3’5H por análisis de inmunoprecipitación Northern en ARN total aislado a partir de pétalos sobre el número total de eventos analizados Mejor color = cambio de color más dramático registrado para la población transgénica nd= no hecho na= no aplicable

La introducción de los casetes de expresión del gen F3'5H en Skr4 x SW63 llevó a un cambio dramático de color en la flor de lila pálido a púrpura con un incremento dramático en la producción de malvidina en los pétalos.

El resultado sugiere que todas las secuencias de F3'5'H probadas (petunia petHf1, petunia petHf2, Salvia Sal#2;Salvia Sal#47, Sollya Sol#5, Campanilla BpeaHF2. pensamiento BP#18, pensamiento bop#40, Gentian Gen#48, Kennedia Kenn#31) fueron estables en pétalos de petunia y dieron como resultado la complementación de la mutación de HF1 o HF2 en la línea de petunia Skr4 x SW63 llevando a niveles dramáticamente incrementados de acumulación de malvidina con un cambio de color concomitante

Rosa

Los genes de F3'5'H descritos en el Ejemplo 7 fueron evaluados en cuanto a su capacidad para guiar la producción de pigmentos basados en delfinidina en pétalos de rosa. Se usó una selección de tres cultivares de rosas, Kardinal (Kard), Soft Promise (SP) o Lavande (LAV) en los experimentos de transformación. El cultivar de rosa Kardinal 5 produce flores coloreadas de rojo que normalmente acumulan antocianinas basadas en cianidina. El cultivar contiene por lo tanto actividades de F3'H y DFR de rosa que la F3'5'H introducida requeriría para competir con el sustrato. El cultivar de rosa Lavande produce flores coloreadas de rosa claro que normalmente acumulan antocianinas basadas en cianidina. Este cultivar contiene por lo tanto actividades de F3'H y DFR de rosa funcionales que la F3'5'H introducida requeriría para competir por el sustrato. El cultivar de rosa Soft Promise produce flores de

10 color albaricoque que normalmente acumulan pelargonidina. Se cree que este cultivar carece de una actividad F3'H funcional completa de rosa y contiene un DFR que es capaz de actuar sobre DHM y así la F3'5'H solamente sería requerida para competir con el DFR endógeno de rosa por el sustrato.

Tabla 13 Resultados de los análisis transgénicos de pétalos de rosa transformados con ADN-T que contienen casetes de expresión del gen F3’3’H (CaMV 35S: F3’5’H: ocs 3’)

F3’5’H

plásmidos Cultivar #tg TLC+ HPLC+ % de del más alto % promedio de del Northern+

Salvia2

pCGP2120 Kard 30 18/20 21/21 12% 5% 18/18

Salvia47

pCGP2119 Kard 22 11/16 9/9 7.1% 2% 12/15

Sollya

pCGP2131 Kard 27 0/23 2/2 1% 0.5% 6/6

Campanilla

pCGP2134 Kard 29 0/15 nd na na 0/9

pBEBF5

Lav 25 nd 0/25 0% 0% nd

Gentian

pCGP1482 Kard 27 0/23 nd na na 0/23

pBEGHF48

Lav 23 nd 0/23 0% 0% 0/23

pensamiento BP18

pCGPl967 Kard 56 30/33 33134 58% 12% 21/21

SP

36 21/24 18/18 65% 35% 16/21

pensamiento BP40

pCGP1969 Kard 22 15/15 15/15 24% 9% 16/16

SP

37 17/17 16/17 80% 54% 11/19

Petunia petHf1

pCGP1638 Kard 22 0/21 nd na na 0/16

pCGP1392

Lav 34 nd 0/34 0% 0% nd

Petunia petHf2

pCGP2123 Kard 41 0/26 nd na na 0/10

Lavender

pBELF8 Lav 28 nd 4/28 4% 3.5% nd

F3’5’H = la secuencia de F3’5’H contenida en el AND-T

(continuación)

F3’5’H

plásmidos Cultivar #tg TLC+ HPLC+ % de del más alto % promedio de del Northern+

plásmido = el número de plásmido del vector binario utilizado en el experimento de transformación Cult = cultivar de Rosa híbrida Kard = Kardinal SP = Soft Promise Lav = Lavande #tg = # de eventos transgénicos independientes producido TLC+ = número de eventos individuales que acumulan moléculas de delfinidina o basadas en delfinidina detectables (determinadas por TLC) en los pétalos sobre el número total de eventos individuales analizados HPLC+ = número de eventos individuales que acumulan moléculas de delfinidina o basadas en delfinidina detectables (determinado por HPLC) en los pétalos sobre el número de eventos individuales analizados Northern = número de eventos individuales en los cuales se detectaron los transcriptos específicos intactos de F3'5H mediante análisis por inmunoprecipitación Northern en ARN total aislado a partir de pétalos sobre el número total de eventos analizados nd= no hecho

Los resultados sugieren sorprendentemente que no todas las secuencias F3'5'H establecidas (petunia petHf1, petunia petHf2, Salvia Sal#2, Salvia Sal#47, Sollya Sol#5, Campanilla BpeaHF2, pensamiento BP#18, pensamiento 5 BP#40, Gentian Gen# 48, Kennedia Kenn#31 and Lavender LBG) fueron funcionales en la rosa. En efecto los transcriptos de las secuencias de F3'5'H introducidos aislados a partir de Clitoria ternatea (campanilla), Gencian triflora, (genciana) y Petunia híbrida (petunia) fallaron en acumularse en pétalos de rosa. Solamente los transcriptos de longitud completa de F3'5'H de pensamiento, salvia, Kenedia, Sollya y lavanda se acumularon en pétalos de rosa. Sin embargo, aunque los transcriptos de Kenedia F3'5'H se acumularon en los pétalos de rosa, no hubo ni 10 acumulación de la enzima o la enzima producida no fue funcional o fue incapaz de competir con las enzimas F3'H y DFR endógenas de la rosa para permitir la producción de pigmentos de moléculas de delfinidina o basadas en delfinidina. De las secuencias de F3'5'H evaluadas, solamente las secuencias de F3'5'H derivadas de los clones de ADNc de Salvia spp. (Sal#2 y Sal#47), (BP#18 y BP#40), Sollya spp. (Soll#5) y Lavandula nil (LBG) dio como resultado la producción de pigmentos basados en moléculas de delfinidina o basadas en delfinidina en pétalos de

15 rosa. Con base en los porcentajes relativos de moléculas de delfinidina o basadas en delfinidina producidas en los pétalos de rosa, las secuencias de F3'S'H de pensamiento (By#18 y BP#40) se revelaron como las más efectivas aquellas establecidas en la producción de moléculas de delfinidina o basadas en delfinidina en pétalos de rosa.

Introducción de la secuencia de F3’5’H de Viola spp. en Rosa híbridas cv. Medeo y Pamela

Tal como se describe en la introducción, la copigmentación con otros flavonoides como la modificación adicional de

20 la molécula de antocianidina y el pH de la vacuola, impactan sobre el color producido por las antocianinas. Por lo tanto, la selección de los cultivares de rosa con niveles relativamente altos de flavonoles y pH vacuolar relativamente alto da como resultado colores de flor más azules por producción de pigmentos de moléculas de delfinidina o basadas en delfinidina.

El cultivar de rosa Medeo produce generalmente flores de color crema hasta albaricoque pálido con (RHSCC 158C a

25 159A). El análisis por HPLC de las antocianidinas y los flavonoles que se acumulan en los pétalos de la rosa Medeo revelan que los pétalos acumulan altos niveles de flavonoles (2.32 mg/g de campferol, 0.03 mg/g de quercitina) y niveles muy bajos de antocianinas (0.004 mg/g de cianidina, 0.004 mg/g pelargonidina). El pH vacuolar estimado de los pétalos de Medeo está alrededor de 4.6.

El cultivar de rosa Pamela produce flores coloreadas de blanco hasta rosa muy pálido. Acumula de la misma forma niveles bajos de antocianina y niveles relativamente altos de flavonoles.

El ADN-T contenido en el constructo pCGP1969 (Figura 30) que incorpora el clon F3'5'H de pensamiento, BP#40, fue introducido también en los cultivares de rosa Medeo y Pamela dando como resultado la producción de más del 90% de moléculas de delfinidina o basadas en delfinidina en estas rosas y llevando a un cambio dramático de color y a flores de colores novedosos. El cambio de color más dramático en las flores de Medeo transgénicos fue a un color púrpura/violeta de RHSCC 70b, 70c, 80c, 186b. El cambio de color más dramático en las flores transgénicas de Pamela fue un color púrpura/violeta de RHSCC 71c, 60c, 71a, 80b.

En conclusión, se revelaron dos hallazgos inesperados cuando las secuencias genéticas que habían sido probadas por guiar la funcionalidad en petunia y clavel fueron introducidas en rosas.

Primero las secuencias de F3'5'H petHf1 (y petHf2) de petunia que habían dado como resultado la producción de colores novedosos en claveles y también habían demostrado guiar la síntesis de una enzima funcional en petunia no guiaron una acumulación de transcripto de longitud completa (o intacto) (detectable por análisis de inmunoprecipitación Northern) en pétalos de rosa. En efecto, no hubo acumulación de un transcripto de longitud completa o intacto o los transcriptos que fueron detectados fueron degradados y vistos como deterioros de bajo MW (o de migración rápida) o precipitaciones de ARN que indicaban la presencia de heterólogos de bajo MW que hibridan ARN. Por lo tanto con el fin de encontrar una secuencia de F3'5'H que se acumulara en rosas y llevara a una enzima funcional, se asiló un cierto número de secuencias de F3'5'H. de nuevo no fue obvio cual secuencia llevaría a una enzima activa en los pétalos de rosa. Todas las secuencias de F3'5'H aisladas fueron probadas en cuanto a su funcionalidad en claveles y/o petunia y todas llevaron a la acumulación de transcriptos intactos y a la producción de una actividad de F3'5'H funcional. Sin embargo solamente las secuencias de F3'5'H de pensamiento (BP#18 y BP#40), salvia ( Sal#2 y Sal#47), sollya (Soll#5), kennedia (Kenn#31) y lavender (LBG) dieron como resultado la acumulación de transcriptos intactos de longitud completa y solamente las de pensamiento (BP#18 y BP#40), salvia (Sal#2 y Sal#47), solia (Soll#5) y lavanda (LBG) dieron como resultado la producción de una enzima funcional en rosa medida por la síntesis de moléculas de delfinidina o basadas en delfinidina.

En segundo lugar no fue obvio cuales promotores serían efectivos en rosas. Los casetes promotores que habían sido probados y habían demostrado ser funcionales en flores clavel y petunia no llevaron a la acumulación de transcriptos detectables en pétalos de rosa. De los promotores probados en rosas, solamente los promotores CaMV 35S, RoseCHS 5’, ChrysCHS 5’, mas 5’ y nos 5’ llevaron a una acumulación de transcriptos de GUS o nptII o SuRB detectables en pétalos de rosa.

La Tabla 14 muestra un resumen de los resultados obtenidos al establecer secuencias de F3'5'H de diversas especies en petunia, clavel y rosa.

Tabla 14 Resumen de efectividad de las secuencias de F3’5’H en petunia, clavel y rosa

F3’5’H

Petunia Clavel Rosa

Mal

RNA Del RNA Del ADN

Kennedia (Kenn#31)

+ nd nd nd - +

Gentian (Gen#48)

+ + + + - -

Salvia (Sal#2)

+ nd + + + +

Salvia (Sa/#47)

+ nd + + + +

Sollya (Sol#5)

+ nd + + + +

Campanilla (BpeaHF2)

+ nd + + - -

Pensamiento (BP#18)

+ + + + + +

Pensamiento (BP#40)

+ nd + + + +

Petunia (petHf1)

+ + + + - -

Petunia (petHf2)

+ + + + - -

Lavender (LBG)

nd nd nd nd nd +

nd= no hecho Mal = malvidina detecta en pétalos según se analiza por TLC Del = moléculas de delfinidina o basadas en delfinidina detectadas en pétalos analizadas por TLC o HPLC + = si -= no

Ejemplo 9

Uso de secuencias de F3’5’H de pensamiento en especies diferentes a rosa

5 Gerbera

De los ejemplos anteriores, fue claro que las secuencias de F3'5'H de Pensamiento, BP#18 y BP#40, dieron como resultado la actividad funcional de F3'5'H y llevaron a la producción de altos niveles de moléculas de delfinidina o basadas en delfinidina en rosas y claveles.

El ADN-T del constructo binario pCGP1969 (descrito en el Ejemplo 8) (Figura 30) que contiene el casete de

10 expresión del gen quimérico de CaMV 35S: pensamiento BP#40 F3’5’H: ocs 3’ fue introducido en el cultivar de gerbera Boogie a través de transformación mediada por Agrobacterium, para probar la funcionalidad de la secuencia de F3'5'H de pensamiento en gerbera.

De los seis eventos producidos hasta la fecha, uno (#23407) había producido flores con un cambio dramático de color (RHSCC 70c) en comparación con el color de la flor de control (RHSCC 38a, 38c).

El cambio de color de los pétalos de la gerbera transgénica fue correlacionado con la presencia de moléculas de delfinidina o basadas en delfinidina detectadas por TLC.

Otras especies

Con el fin de producir pigmentos de moléculas de delfinidina o basadas en delfinidina en plantas que normalmente no producen pigmentos basados en delfinidina y no contienen constructos de flavonoide 3'5'-hidroxilasa que contengan un gen de F3'5'H (tales pero no limitadas al gen F3'5'H quimérico de Viola spp. and/or Salvia spp. and/or Sollya spp. and/or Lavandula spp. y/o Kennedia spp.) se introducen en una especie que normalmente no produce pigmentos basados en delfinidina. Tales plantas pueden incluir pero no se limitan a clavel, crisantemo, gerbera, orquídeas, Euforbia, Begonia y manzana.

Ejemplo 10

Características de las secuencias de F3'5'H evaluadas en petunia, clavel y rosa

La regulación de los genes en los eucariotes es facilitada, en términos simples, por un cierto número de factores que interactúan con un rango de secuencias proximales y distales a una secuencia de nucleótidos que codifica para un polipéptido dado. Los casetes de expresión manipulados para la introducción en plantas para la generación de uno o más cambios se basan en el entendimiento de la regulación de los genes en eucariotes en general y, en casos seleccionados, de plantas en particular. Los elementos esenciales incluyen una serie de secuencias de regulación transcripcionales típicamente, pero no exclusivamente, localizadas corriente arriba o en 5' con respecto al punto de la iniciación de la transcripción. Tales elementos se describen típicamente como potenciadores y promotores, siendo estos últimos proximales al punto de la iniciación de la transcripción. Inmediatamente corriente abajo de, o en 3' con respecto a, el punto de iniciación de la transcripción es una región variable de ADN transcrito que se denota como la región no traducida 5' (5'utr) que juega un papel en la estabilidad del transcripto y en la eficiencia de traducción. Tales secuencias, cuando se manipulan en casetes de expresión, son frecuentemente quiméricas y pueden ser derivadas de las secuencias que se presentan de manera natural adyacentes a la secuencia de codificación y/o adyacentes a una secuencia de promotor dada. La secuencia de codificación (algunas veces perturbada por intrones) se encuentra en 3' con respecto a la 5'utr seguida por una 3'utr importante para la estabilidad del transcripto (ARNm) y a la eficiencia de traducción. Las secuencias 3' al extremo de la región de codificación y 3' al 3'utr mismos se denotan como secuencias terminadoras. Todos estos elementos constituyen un casete de expresión. Al hacer comparaciones directas entre los promotores u otros elementos es importante mantener la uniformidad en los elementos restantes de un casete de expresión. Por lo tanto, cuando se compara la eficacia de diversas secuencias de F3'5'H fue posible confinar las secuencias que llevan a la inestabilidad y subsecuente autodegradación de ARNm manipulado y la ausencia resultante de productos trihidroxilados (derivados de moléculas de delfinidina o basadas en delfinidina) a la región de codificación para la F3'5'H y no a otros elementos en el casete de expresión tales como las secuencias 5'utr y/o 3'utr por ejemplo.

En un intento para identificar motivos o similitudes entre las secuencias de F3'5'H que dieron como resultado transcriptos de longitud completas detectados en el ARN total aislado de flores de rosa, y finalmente en la producción de moléculas de delfinidina o basadas en delfinidina, se llevaron a cabo comparaciones a través de un rango de parámetros. Incluyeron identidades de secuencia a niveles de ácido nucleico y aminoácidos, alineamientos de secuencia, clasificaciones taxonómicas,% de nucleótidos A o T, presentes en la secuencia,% de codones con una A o una T en la tercera posición, etc.

Clasificación taxonómica

Se examinó la taxonomía de cada una de las especies de la cuales fueron aisladas las secuencias de F3'5'H (Tabla 15). Parece no haber una relación obvia entre la clasificación de subclases y en el hecho de si las secuencias de F3'5'H dieron como resultado un transcripto intacto y la subsecuente producción de moléculas de delfinidina o basadas en delfinidina en rosas.

Tabla 15: Clasificaciones taxonómicas de las especies de las cuales fueron aisladas las secuencias F3'5'H' y si el uso de las secuencias dieron como resultado un transcripto intacto en pétalos de rosa que fuera detectable por análisis de inmunoprecipitación de ARN.

Flor

Especie Familia Orden Subclase Transcripto Intacto Delfinidina en pétalos de rosa

genciana

Gentiana triflora Gentianaceae Gentianales Asteridae NO NO

Lavanda

Lavandula nil Lamiaccae Lamiales Asteridae SI SI

salvia

Salvia spp. Lamiaccae Lamiales Asteridae SI SI

sollya

Sollya spp. Pittosporaceae Apiales Asteridae SI SI

petunia

Petunia hybrida Solanaceae Solanales Asteridae NO NO

kenedia

Kennedia spp. Fabaceae Fabales Rosidae SI NO

campanilla

Clitaria ternatea Fabaceae Fabales Rosidae NO NO

pensamiento

Viola spp. Violaceae Malpighiales Rosidae SI SI

Rosa

Rosa hybrida Rosaciae Rosales Rosidae na na

Transcripto intacto = ARNM de F3’5’H de longitud completa detectada por análisis de inmunoprecipitación Northern en ARN total aislado a partir de pétalos de rosas transgénicas

Comparación de secuencias de nucleótidos de F3'5'H

Las identidades en secuencias de nucleótidos entre cada una de las secuencias de F3'5'H evaluadas fueron

5 determinadas utilizando el programa ClustalW (Thompson et al., 1994, supra), dentro de la versión MacVector™ programa de aplicación 6.5.3 (Oxford Molecular Ltd., Inglaterra) (Tabla 16). No hubo diferencias obvias entre las secuencias de F3'5'H que dieron como resultado la detección de transcriptos de longitud completa intactos de ADN aislado de pétalos de rosa y aquellos que no lo fueron.

Tabla 16: Porcentaje de identidad de secuencia de ácidos nucleicos entre las secuencias de nucleótidos de las

10 F3’5’H aisladas a partir de diversas especies. Las secuencias de F3’5’H que dieron como resultado transcriptos intactos detectados en ARN aislado de pétalo de rosas se subrayan y están en cursiva

BP18

BP40 Lav Sal A 7 Sal2 Soll Kenn Bpea Gent PetHf 1 PetHf 2

BP18

100 82 60 61 62 51 60 62 62 59 62

BP40

100 60 57 58 50 59 62 58 60 62

Lav

100 68 68 48 57 57 58 59 60

Sal47

100 95 48 56 57 59 57 58

Sal2

100 49 57 58 60 57 59

Soll

100 48 50 50 48 51

Kenn

100 70 56 64 60

Bpea

100 59 59 62

Gen t

100 61 64

PetHf 1

100 84

PetHf 2

100

Comparación de secuencias de nucleótidos traducidas de FD3’5’H

Las identidades de secuencias de nucleótidos traducidas y similitudes entre cada una de las secuencias de F3'5'H evaluadas también fueron determinadas utilizando el programa ClustalW (Thompson et al., 1994, supra), dentro de

5 la versión 6.5.3 de del programa de aplicación MacVector™ (Oxford Molecular Ltd., Inglaterra) (Tabla 17). No hubo diferencias obvias entre las secuencias de F3'5'H que dieron como resultaron la detección de transcriptos de longitud completa intactos en ARN aislado de pétalos de rosa y los que no lo fueron.

Tabla 17: Porcentaje de identidad y similitud de secuencia de aminoácidos (entre paréntesis) entre secuencias de F3'5'H aislado de diversas especies. Las secuencias de F3'5'H que dieron como resultado transcriptos intactos

10 detectados en ARN aislados a partir de pétalos de rosa están subrayados y en cursiva.

BP18

BP40 Lav Sal47 Sal2 Soll Kenn Bpea Gent PetHf 1 PetHf 2

BP18

100 91(94) 65 (77) 65(76) 65(76) 44 (63) 69(83) 64(75) 69 (80) 74(85) 74(85)

BP40

100 67 (89) 66 (77) 66(77) 46 (64) 69(82) 64(75) 68(79) 74(85) 75(86)

Lav

100 75(86) 75(86) 45 (63) 63(79) 59(74) 66 (80) 68(82) 69 (83)

Sal47

100 98 45 (65) 64(78) 60(72) 64(76) 68 (79) 69 (81)

Sal2

100 45 (65) 64(78) 60 (72) 63(75) 68 (79) 69(81)

Soll

100 46(66) 41(61) 44(62) 46(67) 46(66)

Kenn

100 72(80) 65(75) 71(83) 72(83)

Bpea

100 69(81) 65(75) 65(74)

Gent

100 73 (82) 73(82)

PetHf 1

100 93 (95)

PetHf 2

100

Porcentaje de nucleótidos A o T en las secuencias de ADN de F3’5’H.

Hay alguna evidencia que sugiere que la selección de los codones influye en la rata de traducción y de degradación de ARNm. Ciertos codones se utilizan menos frecuentemente que otros y esto puede estar relacionado con la 5 abundancia de ARNt isoaceptables. Los ARN de transferencia correspondientes a codones raros son menos abundantes en E. coli y levadura que los ARNt correspondientes a codones preferidos (van Hoof and Greeen, Plant Molecular Biology, 35: 383-387, 1997). Ejemplos de uso alterado de codones y de producción de un gen más “similar a plantas” son el gen de la toxina bacteriana B.t. (revisado en Diehn et al., Genet Engin, 18: 83-99, 1996) y el gen gfp de medusa (Haseloff et al., Proc. Natl. Acad. Sci Estados Unidos, 94: 2122-2127, 1997). Sin embargo, tal como 10 se comenta en van Hoff and Green, (1997) (supra), el efecto de eliminar los codones raros en los genes B.t. incrementan el contenido de GC, eliminando por lo tanto las secuencias ricas en AU que pueden ser responsables por un reconocimiento impropio de intrones y sitios de poliadenilación así como la eliminación de determinantes de la inestabilidad. La alteración del uso de codones en el gen gfp de medusa también da como resultado la eliminación de un intrón críptico (Haseloff et al., 1996, supra). Los estudios que examinan el efecto de uso de codones y los 15 elementos de inestabilidad se ha limitado en general a diferencias entre los genes aislados a partir de especies en diferentes reinos, esto es bacterial versus levadura versus animal versus plantas. Dentro del reino vegetal, se han observados diferencias entre la dicotiledóneas y las monocotiledóneas. Estudios sobre plantas transgénicas han sugerido que los fragmentos de promotores utilizados para conducir la expresión genética en plantas dicotiledóneas no son tan efectivos cuando se utilizan en plantas monocotiledóneas (véase Galun and Breiman, Transgenic Plants, 20 Imperial College Press, London, England 1997). Las diferencias en la metilación y en la expresión final de un transgén de DFR en petunia híbrida (dicotiledónea) fueron detectados cuando se comparó un ADNc de DFR de maíz

(monocotiledónea) con un ADNc de DFR de gerbera (dicotiledónea) (Elomaa et al., Molecular and General Genetics,

248: 649-656 1995). La conclusión fue que el ADNc de DFR de gerbera tenía un contenido de AT más alto (contenido de GC más bajo) y era más “compatible” con la organización genómica de la petunia evitando que fuese reconocido como un gen foráneo y por lo tanto silenciado por metilación. La rosa junto con el clavel y la petunia son

5 dicotiledóneas y los genes F3’5’H probados fueron aislados todos a partir de plantas dicotiledóneas). Estos puntos sirven para ilustrar que los mecanismos de degradación y estabilidad no son entendidos en detalle y que aparecen diferencias entre plantas y otros reinos y dentro del reino vegetal.

El contenido de A y T fue examinado en los ADNc de F3’5’H evaluados junto con los de los genes de la ruta de los flavonoides (F3’H, DFR, CHS, FLS) que habían sido aislados de rosas (Tabla 18). La tercera posición de cada codón

10 (dentro del marco de lectura abierto) también fue examinada y se calculó porcentaje de codones con una A o una T en la tercera posición (Tabla 18).

Tabla 18: resumen de la cantidad en porcentaje de los dinocleotidos A o T en las secuencias F3’5’H aislados y si la F3’5’H dio como resultado transcriptos de longitud completa detectados en pétalos de rosa por el análisis por inmunoprecipitación Northern.

F3’5’H seq

%AT % A o T en 3ª posición ARN Delfinidina

Viola BP#18

50 40 SI SI

Viola BP#40

51 35 SI SI

Salvia#2

48 33 SI SI

Salvia#47

48 34 SI SI

Sollya#5

54 54 SI SI

LavenderLBG

50 37 SI * SI

Kennedia#31

54 47 SI NO

petunia petHf1

61 66 NO NO

petunia petHf2

59 65 NO NO

Gentian#48

57 57 NO NO

Campanilla#HF2

57 53 NO 1 NO

rose F3’H

47 34 ** na

rose CHS

52 42 ** na

rose DFR

53 46 ** na

(continuación)

F3’5’H seq

%AT % A o T en 3ª posición ARN Delfinidina

rose FLS

56 43 ** na

%AT = % de nucleótidos que son A o T en la secuencia de ácidos nucleicos %A o T en 3a posición = porcentaje de codones que tienen una A o una T en la tercera posición ARN= si un transcripto de ARNm de longitud completa fue detectado por análisis por inmunoprecipitación Northern en el ARN total aislado a partir de pétalos de rosa Del = si las moléculas de delfinidina o basadas en delfinidina fueron detectadas por TLC o HPLC en pétalos de rosa SI* = aunque el análisis de inmunoprecipitación Northern de las rosas transgénicas transformadas con los casetes de expresión de F3’5’H de lavanda no fueron ejecutados, puede asumirse que el transcripto de longitud completa fue producido puesto que se detectaros moléculas de delfinidina o basadas en delfinidina en los pétalos de rosa. rose F3’H (descrito en International Patent Application No. PCT/AU97/00124) rose DFR (Tanaka et al., 1995, supra) rose FLS (GenBank accession number AB038247) rose CHS (GenBank accession number AB038246)

El contenido de AT de las cuatro secuencias de rosas (más arriba) que codifican las enzimas de la ruta de los flavonoides tiene un contenido de AT de entre 47 y 56%. En general el contenido de AT de las secuencias de F3’5’H

5 que dio como resultado transcriptos intactos en pétalos de rosa estaba entre 48 y 54%. Sin embargo, las secuencias de F3’5’H que no dieron como resultado transcriptos intactos que se acumulaban en pétalos de rosa tenían en general un contenido de AT de entre 57 y 61%. Por lo tanto el contenido de AT de los genes de F3’5’H en rosa pueden ser un factor en la determinación de si el transcripto intacto se acumula en pétalos de rosa y lleva así la producción de F3’5’H y de moléculas de delfinidina o basadas en delfinidina.

10 El nucleótido base en la tercera posición de cada codón de las cuatro secuencias de rosa que codifican las enzimas de la ruta de los flavonoides fue generalmente una A o una T en 34 a 46% de los codones. En general las secuencias de F3’5’H que dieron como resultado transcriptos intactos en pétalos de rosa contenían una A o una T en la tercera posición de cada codón en 33 a 54% de los codones. Sin embargo las secuencias de F3’5’H que no dieron como resultado transcriptos intactos acumulados en pétalos de rosa contenían generalmente una A o una T

15 en la tercera posición de cada codón en 53 a 66% de los codones. Así el porcentaje de codones con una A o una T en la tercera posición de los genes de F3’5’H introducidos en la rosa puede ser también un factor que influye en si un transcripto intacto se acumula en pétalos de rosa de manera que lleve a la producción de F3’5’H y moléculas de delfinidina o basadas en delfinidina.

Puede ser que al alterar el contenido global de los nucleótidos A y/o T en cualquier secuencia de ADN de F3’5’H que

20 no de como resultado transcriptos intacto en rosas tal como pero no limitándose a Petunia hybrida petHf1, Petunia hybrida petHf2, Clitora ternatea (campanilla) BpeaHF2 o Gentiana triflora (genciana) Gen#48, hasta un nivel más consistente con el encontrado en genes de rosa, los transcriptos intactos se acumularán y darán como resultado la traducción eficiente de los transcriptos de F3’5’H y así a la acumulación de moléculas de delfinidina o basadas en delfinidina en pétalos de rosa. Una manera de alterar el contenido de AT de la secuencia de ADN sin alterar la

25 secuencia de aminoácidos es apuntar a la generación de la tercera posición de cada codón.

Las personas experimentadas en la técnica apreciarán que la invención descrita aquí es susceptible de variaciones y modificaciones diferentes a las descritas específicamente. Debe entenderse que la invención incluye todas tales variaciones y modificaciones que caen dentro del alcance de las reivindicaciones. La invención también incluye todas las etapas, características, composiciones y compuestos denominados o indicados en esta especificación, individual o colectivamente, y cualquiera y todas las combinaciones de cualquiera dos o más de dichas etapas o

características cuando caen dentro del alcance de las reivindicaciones que siguen a esta descripción.

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(eds.), Academic Press, New York, USA, 5: 49-76, 1988. Short et al., Nucl. Acids Res. 16. 7583-7600,1988. Sommer and Saedler, Mol Gen. Gent., 202: 429-434, 1986. Strack and Wray, In: The Flavonoids -Advances in Research since 1986. Harborne, J.B. (ed), Chapman and Hall,

London, UK, 1-22, 1993. Tanaka et al., Plant Cell Physiol. 36: 1023-1031, 1995.

Tanaka et al., Plant Cell Physiol. 37: 711-716, 1996. Thompson et al., Nucleic Acids Research 22: 4673-4680, 1994. Turpen and Griffith, BioTechniques 4: 11-15, 1986. van Hoof and Green, Plant Molecular Biology, 35: 383-387, 1997

5 Winkel-Shirley, Plant Physiol. 126: 485-493, 2001a. Winkel-Shirley. Plant Physiol. 127: 1399-1404, 2001b. Yonekura-Sakakibara et al., Plant Cell Physiol. 41: 495-502, 2000. Listado de secuencias

<110> International Flower Developments Pty. Ltd.

10 Brugliera, Filippa (US only) Tanaka, Yoshikazu (US only) Mason, John (US only)

<120> Secuencias genéticas y uso de las mismas

<130> 12322720/EJH 15 <150> AU 2002951088<151> 2002-08-30

<150> AU 2002952835<151> 2002-09-16

<160> 32

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1 20 <211> 1812

<212> ADN

<213> petunia

<400> 1

<210> 2

<211> 506

<212> PRT

<213> petunia

<400> 2

<210> 3

<211> 1756

<212> ADN

<213> petunia

<400> 3 <210> 4

<211> 508

<212> PRT

<213> petunia

<400> 4

<210> 5

<211> 2934

<212> ADN

<213> rosa

<400> 5

<210> 6

<211> 24

<212> ADN 5 <213> petunia

<400> 6 gttctcgagg aaagataata caat 24

<210> 7

<211> 20 10 <212> ADN

<213> petunia

<400> 7 caagatcgta ggactgcatg 20

<210> 8 15 <211> 20

<212> ADN

<213> crisantemo

<400> 8

gttaaggaag ccatgggtgt 20

<210> 9

<211> 1648

<212> ADN

<213> viola

<400> 9

<210> 10

<211> 506

<212> PRT

<213> viola

<400> 10

<210> 11

<211> 1782

<212> ADN 5 <213> viola

<220>

<221> características-misceláneas

<222> (307) .. (307)

<223> n = cualquier nucleótido 10 <400> 11

<210> 12

<211> 506

<212> PRT

<213> viola

<400> 12

<210> 13

<211> 1659

<212> ADN

<213> salvia

<400> 13

<210> 14

<211> 520

<212> PRT

<213> salvia

<400> 14

<210> 15

<211> 1617

<212> ADN

<213> salvia

<400> 15

<210> 16

<211> 518

<212> PRT

<213> salvia

<400> 16

<210> 17

<211> 1730

<212> ADN 5 <213> sollya

<220>

<221> características-misceláneas

<222> (1372) .. (1372)

<223> n = cualquier nucleótido 10 <400> 17

<210> 18

<211> 521

<212> PRT

<213> sollya

<400> 18

<210> 19

<211> 37

<212> ADN

<213> petunia

<400> 19 aaaatcgata ccatggtctt tttttctttg tctatac 37

<210> 20

<211> 1748

<212> ADN

<213> clitoria

<400> 20

<210> 21

<211> 525

<212> PRT

<213> clitoria

<400> 21

<210> 22

<211> 1684

<212> ADN

<213> genciana

<400> 22 <210> 23

<211> 516

<212> PRT

<213> genciana

<400> 23

<210> 24

<211> 3731

<212> ADN

<213> petunia

<400> 24

<210> 25

<211> 31

<212> ADN 5 <213> clitoria

<400> 25 gggatccaac aatgttcctt ctaagagaaa t 31

<210> 26

<211> 1831 10 <212> ADN

<213> kennedia

<400> 26

<210> 27

<211> 513

<212> PRT

<213> kennedia

<400> 27

<210> 28

<211> 1374

<212> ADN

<213> crisantemo

<400> 28

<210> 29

<211> 398

<212> PRT

<213> crisantemo

<400> 29

<210> 30

<211> 2979

<212> ADN 5 <213> crisantemo

<220>

<221> características-misceláneas

<222> (2051) .. (2051)

<223> n = cualquier nucleótido 10 <400> 30

<210> 31

<211> 1778

<212> ADN

<213> lavendula

<400> 31 <210> 32

<211> 520

<212> PRT

<213> lavendula

<400> 32

Claims (21)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Un método para producir una planta de rosa transgénica capaz de sintetizar una F3’5’H, comprendiendo dicho método la transformación estable de una célula de una rosa con una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica o es complementaria a una secuencia que codifica una flavonoide 3’, 5’ hidroxilasa (F3’5’H) donde la secuencia de nucleótidos codifica una secuencia de aminoácidos seleccionada de la lista consistente de SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 16 o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90% de similitud con al menos una de las secuencias de aminoácidos seleccionadas de la lista consistente de SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 16, bajo condiciones que permiten la expresión eventual de dicha secuencia de nucleótidos, regenerar una planta transgénica desde la célula y cultivar dicha planta transgénica durante un tiempo y bajo condiciones suficientes para permitir la expresión de la secuencia de nucleótidos donde la expresión de dicha molécula de ácidos nucleicos en un tejido de pétalo de rosa da como resultado niveles detectables de moléculas de delfinidina o basadas en delfinidina medidas mediante una técnica cromatográfica.

2. 2.

   Un método como el reivindicado en la reivindicación 1 donde dicha secuencia de nucleótidos es seleccionada de la lista consistente de SEQ ID NO: 9 SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13 y SEQ ID NO: 15 o una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 80% de identidad con al menos una de las secuencias de nucleótidos seleccionadas de la lista consistente de SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO. 11, SEQ ID NO: 13 y SEQ ID NO: 15 o una secuencia de nucleótidos capaz de hibridar a al menos una de las secuencias de nucleótidos seleccionadas de la lista consistente de SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13 y SEQ ID NO: 15 o una forma complementaria de las mismas bajo condiciones de alta restricción.

3. 3.

   Un método como el reivindicado en la reivindicación 1 o 2 donde la molécula de ácido nucleico es derivada de una planta seleccionada de Viola spp y Salvia spp.

4. 4.

   Un método para producir una planta de rosa transgénica que exhibe propiedades de florescencia alteradas, comprendiendo dicho método transformar de manera estable una célula de una planta adecuada con una molécula de ácido nucleico tal como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, regenerando una planta transgénica desde la célula y cultivando dicha planta transgénica durante un tiempo y bajo condiciones suficientes para permitir la expresión de la molécula de ácido nucleico.

5. 5.

   Una planta de rosa o parte de la misma o células de la misma modificada genéticamente que comprende una molécula de ácido nucleico tal como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

6. 6.

   La planta de rosa o parte de la misma o células de la misma modificada genéticamente de la reivindicación 5, donde la parte de planta es seleccionada del grupo que comprende sépalo, bráctea, peciolo, pedúnculo, ovarios, antenas, flores, frutos, nueces, raíces, tallos, hojas y semillas.

7. 7.

   Uso de una molécula de ácido nucleico tal como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la manufactura de un constructo genético capaz de expresar la F3’5’H en una planta de rosa.

8. 8.

   Un extracto de una planta o parte de la misma o células de la misma modificada genéticamente de la reivindicación 5 o reivindicación 6.

9. 9.

   El extracto de la reivindicación 8, donde el extracto es un saborizante o un aditivo para alimentos o un producto para la salud o una bebida o jugo o colorante o pigmento o pintura o tinte.

10. 10.

    Un organismo eucariote no humano que porta una secuencia de nucleótidos que codifica una molécula de F3’5’H de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 extracromosómicamente en forma de plásmido.

11. 11.

    El uso de una molécula de ácido nucleico tal como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en la manufactura de una planta de rosa o parte de la misma o células de la misma modificadas genéticamente.

12. 12.

    La planta o parte de la misma o células de la misma modificadas genéticamente de la reivindicación 5, donde la planta o parte de la misma o células de la misma modificadas genéticamente exhiben flores o inflorescencia alteradas.

13. 13.

    Uso de un molécula de ácido nucleico tal como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en la identificación de un material genético que codifica una F3’5’H.

14. 14.

    Uso de una molécula de ácido nucleico definida en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en la amplificación y clonación de material genético que codifica una F3’5’H.

15. 15.

    Progenie de la planta modificada genéticamente de una cualquiera de las reivindicaciones 5, 6 o 12, donde dicha progenie comprende dicha molécula de ácido nucleico tal como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

16. 16.

    Una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica o es

    5 complementaria a una secuencia que codifica una flavonoide 3’, 5’hidroxilasa (F3’5’H) donde la secuencia de nucleótidos codifica una secuencia de aminoácidos seleccionada de la lista consistente de SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 16 o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90% de similitud con al menos una de las secuencias de aminoácidos seleccionadas de la lista consistente de SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 16, donde la expresión de dicha molécula de ácido nucleico en un tejido de pétalo de rosa da como resultado niveles detectables de moléculas

    10 de delfinidina o basadas en delfinidina medidas mediante una técnica cromatográfica.
17. 17. La molécula de ácido nucleico aislada de la reivindicación 16, que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada de la lista consistente de SEQ ID NO: 13 y SEQ ID NO: 15 o una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 80% de identidad con al menos una de las secuencias de nucleótidos seleccionadas de la lista consistente de SEQ ID NO: 13 y SEQ ID NO: 15 o una secuencia de nucleótidos capaz de hibridar a al menos una de las

    15 secuencias de nucleótidos seleccionada de la lista consistente de SEQ ID NO: 13 y SEQ ID NO: 15 o una forma complementaria de las mismas bajo condiciones de alta restricción.

18. 18.

    La molécula de ácido nucleico aislada de la reivindicación 16 o 17 donde la molécula de ácido nucleico es derivada de Salvia spp.

19. 19.

    Un constructo que comprende una secuencia de nucleótidos que comprende: (i) un promotor que es operable en

    20 tejidos de pétalo de rosa y donde dicho promotor está enlazado operativamente a, (ii) una molécula de ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18.

20. 20.

    El constructo de la reivindicación 19, donde dicho promotor es seleccionado del grupo consistente de CHS de rosa, CHS de crisantemo y CaMV 35S.

21. 21.

    Un constructo de la reivindicación 20, donde dicho promotor comprende SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 30.

    25 22. Una F3’5’H aislada codificada por la secuencia de nucleótidos de una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18.

    Replicón: pBluescript SK (+) vector 2.95 kb Inserto: Homólogos de ∼1.8kb de ADNc de F3'5'H petHf1 de P-hybrida

    cv.

    OGB Figura 2

    Replicón: pBluescript SK (+) vector 2.95 kb Inserto: Homólogos de ∼1.8kb de ADNc de F3'5'H petHf2 de P-hybrida

    cv.

    OGB Figura 3

    Replicón: vector de pPU19 de ∼2,7kb de EcoRI

    Inserto: fragmento de ∼1.6kb de BspHI (romo)/Fspl que contiene ADNc de F3'5'H petHf1 de pCGP601 de petunia Figura 4 Replicón: vector pWTT2132 de SmaI de ∼18.7 kb

    Inserto: Fragmento de Pstl (romo) de ∼3.5 kb que contiene gen AmCHS5’:petHf1:petD 8 3’ de pCGP485 Figura 5

    Figura 6

    Replicón: Fragmento de vector romo (BamHI/Hbal) de 2.95 kb de pBluescript II KS (+)

    Inserto: Fragmento (romo) de Pstl de ∼3.5kb que contine gen AmCHS 5’:petHF1: petD8 3’ de pCGP483

    Figura 7 Replicón: vector de SmaI pWTT2132 de ∼18.7 kb

    Inserto: Fragmento (romo) de Pstl de ∼3.9 kb que contiene gen Mac:petHf1 : mas 3’ de pCGP628 Figura 8 Replicón: vector de SmaI pWTT2132 de ∼18.7 kb

    Inserto: Fragmento de Xbal (romo)/Pstl de ∼5.3 kb que contiene gen petD8 5’:petHf1 : petD8 3’ de pCGP1107 Figura 9 Replicón: vector pWTT2132 de Pstl (romo)/Kpnl de ∼18.7 kb

    Inserto: Fragmento de Sacl (romo)/Knpl de ∼4,35 kb que contiene gen short FSL 5’:petHf1 : petFSL 3’ de pCGP1107 Figura 10 Replicón: vector pWTT2132 de Pstl (romo)/BamHI de ∼18.7 kb

    Inserto: Fragmento de Pstl/BamHI de ∼3 kb que contiene gen petRT5’:petHf1 : nos 3’ de pCGP846 Figura 11 Replicón: vector pWTT2132 de Sall de ∼18.7 kb

    Inserto: Fragmento de XhoI de ∼4,9 kb que contiene gen mas/35S :petHf1 : ocs 3’ de pCGP1619 Figura 12 Replicón: vector pWTT2132 de SmaI de ∼18.7 kb

    Inserto: Fragmento romo de (Pstl/EcoRI) de ∼2,6 kb que contiene gen CaMV 35S :petHf1 : ocs 3’ de pCGP1636 Figura 13 Replicón: vector pWTT2132 de BamHI de ∼18.7 kb

    Inserto: Fragmento de BgIII de ∼4,9 kb que contiene gen RoseCHS 5’ :petHf1 : nos 3’ de pCGP200 Figura 14

    Replicón: vector pCGP1988 de Asp718 (romo) de ∼18.7 kb Inserto: Fragmento romo de (Asp718/Xbal) de ∼3,7 kb que contiene gen CaMV 35S :petHf2 : ocs 3’ de pCGP2109 Figura 15

    Replicón: fragmento de vector pWTT2132 de SaII (romo)/Pstl de ∼18.7 kb

    Inserto: Fragmento de (EcoRI (romo)/Pstl) de ∼66 bp que contiene sitio de clonación múltiple de pNEB193

    Figura 16

    Replicón: fragmento de vector Hincll/Xhol de ∼3,3 kb de pGCP2000 (que contiene fragmento promotor CaMV 35S en pBluescript SK) Inserto: Fragmento de EcoRI (romo)/Xhol ocs 3’ de ∼1,6 kb de pKIWI101 Figura 17

    Replicón: vector pCGN1548 de HindIII/Pstl de ∼15 kb Inserto: Fragmento de HindIII/Pstl de ∼5,3 kb que contiene gen petD8 5’: GUS: petD8 3’ de pCGP1106 Figura 18

    Replicón: vector pBIN19 de BamHI (lleno con GA)/SacI de ∼11,8 kb

    Inserto: Fragmento de Xhol (leno con TC)/SacI de ∼6,7 kb que contiene gen longpetFSL 5’: GUS: petFSL 3’ de pCGP496 Figura 19 Replicón: vector pWTT2132 de Pstl/BamHI de ∼18,7 kb

    Inserto: Fragmento de Pstl/BgIII de ∼4,6 kb que contiene gen ChrysCHS 5’: GUS: nos 3’ de pCGP1622 Figura 20 Replicón: vector pWTT2132 de Pstl de ∼18,7 kb

    Inserto: Fragmento de Pstl de ∼5,4 kb que contiene gen pet RT 5’: GUS: petRT 3’ de pCGP1628 Figura 21

    Replicón: vector pWTT2132 de BamHI de ∼18,7 kb Inserto: Fragmento de BgIII de ∼5 kb que contiene gen RoseCHS 5’: GUS: nos 3’ de pCGP197 Figura 22

    Replicón: vector pWTT2132 de Asp718 (romo) de ∼18,7 kb Inserto: Fragmento romo (EagI/Pstl) de ∼3,8 kb que contiene gen AmCHS 5’: GUS: petD8 3’ de pCGP1952 Figura 23

    Figura 24

    Replicón: vector pBluescript SK II (+) de ∼2,95 kb

    Inserto: ADNc de pansyF3'5'H BP#18 de ∼1,6 kb de Viola spp. Cv. Pensamiento negro Figura 25 Replicón: vector pBluescript SK II (+) de ∼2,95 kb

    Inserto: ADNc de pansyF3'5'H BP#40 de ∼1,6 kb de Viola spp. Cv. Pensamiento negro Figura 26

    Replicón: vector pWTT2132 de Asp718 (romo) de ∼18,7 kb Inserto: Fragmento de Notl (romo)/EcoRV de ∼3,8 kb que contiene gen AmCHS 5’: BP#18: petD8 3’ de pCGP1970 Figura 27

    Replicón: vector pWTT2132 de Asp718 (romo) de ∼18,7 kb

    Inserto: Fragmento de Notl (romo)/EcoRV de ∼3,8 kb que contiene gen AmCHS 5’: BP#40: petD8 3’ de pCGP1971

    Figura 28

    Replicón: vector pWTT2132 de Asp718 (romo) de ∼18,7 kb

    Inserto: Fragmento romo (Xhol/Xbal) de ∼3,6 kb que contiene gen CaMV 35S: BP#18: ocs 3’ de pCGP1965

    Figura 29

    Replicón: vector pWTT2132 de Asp718 (romo) de ∼18,7 kb

    Inserto: Fragmento romo (Xhol/Xbal) de ∼3,6 kb que contiene gen CaMV 35S: BP#40: ocs 3’ de pCGP1966 Figura 30

    Replicón: vector pBluescript SK II (+) de 2.95 kb Inserto: ADNc de F3'5'H SaI#2 de ∼1.6 kb de Salvia spp. Figura 31 Replicón: vector pBluescript SK II (+) de 2.95 kb Inserto: ADNc de F3'5'H SaI#47 de ∼1.6 kb de Salvia spp. Figura 32 Replicón: vector pGCP1988 de Asp718 (romo) de ∼18,7 kb

    Inserto: Fragmento Notl (romo)/EcoRV de ∼3,6 kb que contiene gen AmCHS 5’: Sal#2: petD8 3’ de pCGP2116 Figura 33 Replicón: vector pGCP1988 de Asp718 (romo) de ∼18,7 kb

    Inserto: Fragmento Notl (romo)/EcoRV de ∼3,6 kb que contiene gen AmCHS 5’: Sal#47: petD8 3’ de pCGP2117 Figura 34 Replicón: vector pGCP1988 de Asp718 (romo) de ∼18,7 kb

    Inserto: Fragmento (Xhol/Xbal) romo de ∼3,6 kb que contiene gen AmCHS 5’: Sal#2: petD8 3’ de pCGP2112 Figura 35 Replicón: vector pGCP1988 de Asp718 (romo) de ∼18,7 kb

    Inserto: Fragmento (Xhol/Xbal) romo de ∼3,6 kb que contiene gen AmCHS 5’: Sal#47: petD8 3’ de pCGP2111 Figura 36

    Replicón: vector Bluescript SK II (+) de 2.95 kb Inserto: ADNc de F3'5'H SoII#5 de ∼1.7 kb de Sllya spp. Figura 37 Replicón: vector pGCP1988 de Asp718 (romo) de ∼18,7 kb

    Inserto: Fragmento Notl (romo)/EcoRV de ∼3,5 kb que contiene gen AmCHS 5’: SoII#5: petD8 3’ de pCGP2128 Figura 38 Replicón: vector pGCP1988 de Asp718 (romo) de ∼18,7 kb

    Inserto: Fragmento (Asp718/Xbal) (romo)/EcoRV de ∼3,6 kb que contiene gen CaMV 35S’: SoII#5: ocs 3’ de pCGP2129 Figura 39

    Replicón: vector Bluescript SK II (+) de 2.95 kb Inserto: ADNc de F3'5'H Kenn#31 de ∼1.7 kb de Kennedia spp. Figura 40 Replicón: vector pGCP1988 de Asp718 (romo) de ∼18,7 kb

    Inserto: Fragmento (Notl/EcoRI) romo de ∼3,7 kb que contiene gen AmCHS 5’: Kenn#31: petD8 3’ de pCGP2242 Figura 41 Replicón: vector pGCP1988 de Asp718 (romo) de ∼18,7 kb

    Inserto: Fragmento (Xhol/Notl) romo de ∼3,6 kb que contiene gen CaMV 35S: Kenn#31: ocs 3’ de pCGP2236

    Figura 42 Replicón: vector pBHF2 BamHI/Pstl de 4.5 kb + inserto parcial BpeaHF2 (esqueleto= vector pBluescript SK II (+))

    Inserto: fragmento BamHI/Pstl de ∼200 bp de PCR usando pBHF2 como molde (fragmento 5’ de ADNc de F3'5'H de campanilla (BpeaHF2) de Clitoria termata incluyendo el codón de iniciación putativo (ATG))

    Figura 43 Replicón: vector pGCP1988 de Asp718 (romo) de ∼18,7 kb

    Inserto: Fragmento de Notl (romo)/EcoRV de ∼3,6 kb que contiene gen AmCHS 5’: BpeaHF2:: petD8 3’ de pCGP2133 Figura 44 Replicón: PBE2113-GUSs BamHI/SaII de ∼12,8 kb (esqueleto pBI121)

    Inserto: fragmento de BamHI/Xhol de ∼1.7 kb que contiene clon de ADNc de F3'5'H BpeaHF2 de pBHF2F Figura 45 Replicón: vector pGCP1988 de Asp718 (romo) de ∼18,7 kb

    Inserto: Fragmento de (Xhol/Xbal) romo de ∼3,6 kb que contiene gen CaMV 35S’: BpeaHF2: petD8 3’ de pCGP2132

    Figura 46 Replicón: vector pBluescript SK II (+) de 2.95 kb Inserto: ADNc de F3'5'H Gent#48 de ∼1.7 kb de Gentiana triflora Figura 47 Replicón: vector pWTT2132 de Asp718 (romo) de ∼18,7 kb

    Inserto: Fragmento de Notl (romo)/EcoRV de ∼3,6 kb que contiene gen AmCHS 5’Gen#48: petD8 3’ de pCGP1496 Figura 48 Replicón: PBE2113-GUSs BamHI/SaII de ∼12,8 kb (esqueleto pBI121)

    Inserto: fragmento de BamHI/Xhol de ∼1.8 kb que contiene clon de ADNc de F3'5'H (Genn#48) de pG48 Figura 49 Replicón: vector pWTT2132 de Asp718 (romo) de ∼18,7 kb

    Inserto: Fragmento romo (Xhol/Xbal) de ∼3,6 kb que contiene gen CaMV 35S:Gen#48: ocs 3’ de pCGP1981 Figura 50

    Replicón: vector pBluescript SK II (+) de 2.95 kb Inserto: ADNc de lavanda F3'5'H LBG de ∼1.7 kb de Lavendula nil Figura 51 Replicón: PBE2113-GUSs BamHI/SaII de ∼12,8 kb (esqueleto pBI121)

    Inserto: fragmento de BamHI/Xhol de ∼1.8 kb que contiene clon de ADNc de lavanda F3'5'H (LBG) de pLHF8 Figura 52