JP5597807B2 - フラボノイド合成に関わるサイネリア由来の染色体ｄｎａとその用途 - Google Patents

Description

本発明は、フラボノイド３’，５’−水酸化酵素（Ｆ３’５’Ｈ）遺伝子の転写制御領域、５’−非翻訳領域、エクソン、イントロン、３’−翻訳領域、転写終了に必要な配列を含む、キク科サイネリア（ｃｉｎｅｒａｒｉａ）由来の新規ポリヌクレオチド、及び該ポリヌクレオチドを含む新規遺伝子構築物とそれを含む遺伝子組換え植物に関する。

バラにおいては、図１に示すように、Ｂ環（右上）の水酸基の数はアントシアニジン（花の色）に大きな影響を与え、水酸基が３つになると青から紫の色を呈することが多い。実際、青から紫の色の多くの花にはデルフィニジンに由来するアントシアニンが含まれている。

Ｂ環の水酸化を司る酵素は、フラボノイド３’−水酸化酵素（Ｆ３’Ｈ）とフラボノイド３’，５’−水酸化酵素（Ｆ３’５’Ｈ）であり、いずれもペチュニアはじめ多くの植物からその遺伝子が取得されている。アミノ酸配列の比較から、Ｆ３’ＨとＦ３’５’Ｈは、チトクロームＰ４５０スーパーファミリーに属する、それぞれ、ＣＹＰ７５ＢとＣＹＰ７５Ａに分類されるサブファミリーに属する（以下、非特許文献１を参照のこと）。最近になって、アスターとオスペオスペルマム（いずれもキク科に属する）のＦ３’５’Ｈ活性をもつ酵素は、ＣＹＰ７５Ｂサブファミリーに属することが報告された。一方、これらの植物はＦ３’Ｈ活性を有するＣＹＰ７５Ｂサブファミリーに属する酵素も有している。したがって、キク科の植物においては、ＣＹＰ７５Ｂサブファミチーに属する遺伝子が重複して、Ｆ３’５’活性を有する酵素をコードする機能を獲得したと推察される（以下、非特許文献２を参照のこと）。

ところで、同じくキク科のサイネリア（Ｐｅｒｉｃａｌｌｉｓ ｃｒｕｅｎｔａ又はＳｅｎｅｃｉｏ ｃｒｕｅｎｔｕｓ）のＦ３’５’Ｈとされる蛋白質は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ−ｎｉｈ．ｇｏｖ／）の蛋白質データベースに寄託番号ＡＡＸ１９８８８として登録されている。この蛋白質の活性を酵母で測定した例は報告されているが（以下、非特許文献２を参照のこと）、この蛋白質の活性を植物において測定した結果は報告されていないため、その機能は明らかではない。

バラやカーネーションなどは、Ｆ３’５’Ｈ遺伝子をもたないためデルフィニジンを合成できないので、紫から青の花色をもつ品種はない。紫から青の花色をもつ品種を生産することができれば産業上有用であろう。最近、遺伝子組換え手法を用い、Ｆ３’５’Ｈ遺伝子をバラやカーネーションで発現させることにより、従来の交雑育種では得ることができなかった紫から青の花色の品種が誕生している（以下、非特許文献１、非特許文献３を参照のこと）。また、遺伝子組換え手法を用いて花の色を変えた例も報告されている（以下、非特許文献４を参照のこと）。

例えば、いくつかの植物はペラルゴニジンを生産しないため、鮮やかな赤色やオレンジ色の花を咲かせることができない。ペチュニアなどは、そのジヒドロフラボノール４−還元酵素がジヒドロケンフェロールを還元できないため、ペラルゴニジンを生産しない。一方、キクにおいてはフラボノイド３’−水酸化酵素（Ｆ３’Ｈ）遺伝子の発現を抑制すればペラルゴニジンが蓄積することがｉｎ ｖｉｔｒｏの実験で示されている（以下、非特許文献５を参照のこと）。しかしながら、実際にペラルゴニジンを主なアントシアニジンとして蓄積するようなキクは現在まで知られていない。

これらの報告においては、外来遺伝子を花弁で発現させるために、該外来遺伝子を構成的なプロモーター又は花弁特異的なプロモーターに連結している。花弁特異的なプロモーターとしては、フラボノイド生合成に関与する構造遺伝子のプロモーターが用いられることが多い。例えば、キンギョソウのカルコン合成酵素由来のプロモーターなどが、デルフィニジンを蓄積するカーネーションで使用されている（以下、特許文献１、特許文献２を参照のこと）。

しかしながら、どのプロモーターを用いるとどの植物でどの程度、目的の遺伝子を発現させることができるかを予想することは、予測困難である。また、目的の遺伝子を発現させるためには、プロモーターに加え、ターミネーターと呼ばれる転写を終結させるために必要な塩基配列も利用されることが多い。アグロバクテリウム由来のノパリンシンターゼ、マノピンシンターゼ、オクトピンシンターゼの遺伝子のターミネーターがよく利用されるが、どのターミネーターを利用すれば目的の遺伝子が適切に機能するかをあらかじめ予想することは容易ではない。また、植物の遺伝子の染色体遺伝子（プロモーター、イントロンを含む翻訳配列領域、ターミネーター領域）をそのまま別の植物に導入して、機能させる場合もある（例えば、以下、特許文献２を参照のこと）が、この場合においても導入された遺伝子が実際に機能するかどうかを予想することは困難である。

さらに、植物はしばしば高い倍数性を示す。栽培バラは４倍体、栽培キクは６倍体、サイネリアは８倍体である。したがって、フラボノイドの合成にかかわる酵素、例えば、Ｆ３’５’Ｈの遺伝子はこれらの植物においては少なくとも倍数性の数だけは存在することが予想される。そのうち全部が転写され、機能しなくても、その植物はＦ３’５’Ｈ活性を示すことができるため、これらの植物から、実際に機能しうるプロモーターを単離することは容易なことではない。

遺伝子の発現抑制には二本鎖ＲＮＡを転写させる方法（以下、ＲＮＡｉ法ともいう）が一般に広く利用されている。
シアニジンを生産する赤いペチュニアにおいて、Ｆ３’Ｈ遺伝子の発現をその二本鎖ＲＮＡを転写させることにより抑制し、同時にバラ由来のＤＦＲ酵素遺伝子を発現させることによりペラルゴニジンが蓄積し、花色がオレンジ色になったペチュニアが得られた（以下、非特許文献６を参照のこと）。
また、キクにおいても、Ｆ３’Ｈ遺伝子の発現をその二本鎖ＲＮＡを転写させることにより抑制し、パンジーのＦ３’５’Ｈ遺伝子を過剰発現させ、デルフィニジンを蓄積した例がある（ｐＣＧＰ３４２９、以下、特許文献３を参照のこと）。

二本鎖ＲＮＡを転写させる際には、ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｒｅｐｅａｔを生じる配列の間にｃＤＮＡ由来の配列（例えば、Ｆ３’Ｈ ｃＤＮＡ配列）又は無関係の配列（例えば、大腸菌由来のＧＵＳ配列）を挿入することができる。ここにイントロンの配列を挿入すると、目的の遺伝子の抑制功率が上昇するという報告がある（以下、非特許文献７を参照のこと）ものの、イントロンの配列は多種多様であり、具体的にどのイントロン配列を用いればよいかを予想することは当業者であっても容易ではない。

特表平８−５１１６８３号公報 特表平１１−５０５１１６号公報 ＰＣＴ／ＡＵ２００８／００１６９４

Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｒｅｖ．（２００６）５，２８３−２９１ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ（２００６）６１ ３６５−３８１ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ（２００７）４８，１５８９−１６００ Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２００８）１９，１９０−１９７ Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９９３）３５，１４５−１５０ Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００４）２１，３７７−３８６ Ｎａｔｕｒｅ（２０００）４０７，３１９−３２０

本発明が解決しようとする課題は、花の色を変えるためのツールとして、フラボノイド３’，５’−水酸化酵素（Ｆ３’５’Ｈ）のコーディング領域のプロモーターとして機能しうるキク科サイネリア（ｃｉｎｅｒａｒｉａ）由来の新規ポリヌクレオチド、及び該ポリヌクレオチドを含む新規Ｆ３’５’Ｈ遺伝子構築物を提供することである。
また、本発明が解決しようとする課題は、フラボノイド３’，５’−水酸化酵素（Ｆ３’５’Ｈ）遺伝子の転写制御領域、５’−非翻訳領域、エクソン、イントロン、３’−翻訳領域、転写終了に必要な配列を含む、キク科サイネリア（ｃｉｎｅｒａｒｉａ）由来の新規ポリヌクレオチド、及び該ポリヌクレオチドを含む新規遺伝子構築物とそれを含む遺伝子組換え植物を提供することでもある。

本発明者は、前記課題を解決するため、実験を繰り返し、鋭意研究を重ねた結果、サイネリアの染色体クローンから実際に機能しうる遺伝子構築物を取得し、これを、ペチュニア及びキクで発現させて、本発明を完成するに至った。

具体的には、本発明は、以下の［１］〜［１４］である：
［１］（１）配列番号９に示す塩基配列を有するポリヌクレオチドの全部又は一部、及び
（２）配列番号９に示す塩基配列を有するポリヌクレオチドの全部又は一部とストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、フラボノイド３’，５’−水酸化酵素（Ｆ３’５’Ｈ）のコーディング領域のプロモーターとして機能するポリヌクレオチド、
から成る群から選択される、サイネリア由来の花弁特異的プロモーター。

［２］前記［１］に記載のサイネリア由来の花弁特異的プロモーターを含むＦ３’５’Ｈ遺伝子構築物。

［３］（１）配列番号１０に示す塩基配列を有するポリヌクレオチドの全部又は一部、及び
（２）配列番号１０に示す塩基配列を有するポリヌクレオチドの全部又は一部とストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、フラボノイド３’，５’−水酸化酵素（Ｆ３’５’Ｈ）のコーディング領域のターミネーターとして機能するポリヌクレオチド、
から成る群から選択される、サイネリア由来のターミネーターをさらに含む、前記［２］に記載のＦ３’５’Ｈ遺伝子構築物。

［４］（１）配列番号６に示す塩基配列を有するポリヌクレオチド、及び
（２）配列番号６に示す塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、フラボノイド３’，５’−水酸化酵素（Ｆ３’５’Ｈ）をペチュニア又はキクにおいて発現することができるポリヌクレオチド、
から成る群から選択される、前記［３］に記載のＦ３’５’Ｈ遺伝子構築物。

［５］前記［１］に記載の花弁特異的プロモーター又は前記［２］〜［４］のいずれかに記載のＦ３’５’Ｈ遺伝子構築物を含むベクター。

［６］前記［５］に記載のベクターを含む微生物。

［７］前記［１］に記載の花弁特異的プロモーター又は前記［２］〜［４］のいずれかに記載のＦ３’５’Ｈ遺伝子構築物が導入された植物、その組織、その子孫又はその栄養増殖体。

［８］配列番号６に示す塩基配列の第３０９３位〜３０１７位にある第一イントロンの全部又は一部であるポリヌクレオチドをループに持つ、ＲＮＡｉ法において遺伝子の発現を抑制するための遺伝子構築物。

［９］前記発現が抑制される遺伝子がフラボノイド３’−水酸化酵素である、前記［８］に記載の遺伝子構築物。

［１０］前記［９］に記載の遺伝子構築物が導入された植物、その器官、その組織、その子孫又はその栄養増殖体。

［１１］前記導入の前後で、フラボノイドの含有量が変化した、前記［１０］に記載の植物、その器官、その組織、その子孫又はその栄養増殖体。

［１２］前記導入の前後で、デルフィニジンの含有量が変化した、前記［１０］に記載の植物、その器官、その組織、その子孫又はその栄養増殖体。

［１３］前記導入の前後で、ペラルゴニジンの含有量が変化した、前記［１０］に記載の植物、その器官、その組織、その子孫又はその栄養増殖体。

［１４］前記導入の前後で、花色が変化した、前記［１０］に記載の植物又はその子孫。

本発明に係るフラボノイド３’，５’−水酸化酵素（Ｆ３’５’Ｈ）のコーディング領域のプロモーターとして機能しうるキク科サイネリア（ｃｉｎｅｒａｒｉａ）由来の新規ポリヌクレオチド、及び該ポリヌクレオチドを含む新規Ｆ３’５’Ｈ遺伝子構築物は、花の色を変えるためのツールとして好適に利用できる。
また、本発明に係るフラボノイド３’，５’−水酸化酵素（Ｆ３’５’Ｈ）のコーディング領域のプロモーターとして機能しうるキク科サイネリア（ｃｉｎｅｒａｒｉａ）由来の新規ポリヌクレオチドのイントロンの配列（配列番号６に示す塩基配列の第３０９３位〜３０１７位にある第一イントロンの全部又は一部であるポリヌクレオチド）は、ループ配列として、ＲＮＡｉ法において遺伝子の発現を抑制するための遺伝子構築物に好適に利用できる。

バラの花色色素合成の経路の概略図である。 本発明に係るＦ３’５’Ｈ遺伝子構築物の構造模式図である。 植物形質転換用ベクターｐＣＧＰ３６１８の構造模式図である。 植物形質転換用ベクターｐＣＧＰ３６１７の構造模式図である。 植物形質転換用ベクターｐＣＧＰ３６２０の構造模式図である。

以下、本発明をさらに詳細に説明する。
本明細書中、「ストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、サザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるポリヌクレオチドを意味し、例えば、検出対象となるポリヌクレオチドを固定化した支持体に、プローブ（例えば、配列番号６に示す塩基配列を有するポリヌクレオチド）を作用させ、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下において４２℃にて２時間プレハイブリダイゼーションを行った後、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下において４２℃にて１２〜１６時間ハイブリダイゼーションを行い、その後０．１〜２倍程度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウム）を用いて４２℃でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡ等を挙げることができる。ハイブリダイゼーションは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２_ｎｄ Ｅｄ．，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ．，１９８９）等に記載されている方法に準じて行うことができる。

また、ハイブリダイゼーションの条件としては、例えば、低ストリンジェント条件が挙げられる。低ストリンジェント条件とは、ハイブリダイゼーション後の洗浄において、例えば４２℃、５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳの条件であり、好ましくは５０℃、５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳの条件である。より好ましいハイブリダイゼーション条件としては、高ストリンジェント条件が挙げられる。高ストリンジェントな条件とは、例えば６５℃、０．１×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳの条件である。これらの条件において、温度を上げる程に高い相同性を有するＤＮＡが効率的に得られることが期待できる。但し、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度や塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。

ストリンジェント条件下でハイブリダイズするＤＮＡとしては、例えば、プローブとして使用するＤＮＡの塩基配列と一定以上の配列同一性を有するＤＮＡが挙げられ、配列同一性は、例えば７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９３％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上である。

以下、非制限的な実施例により本発明を具体的に説明する。
実施例１：サイネリアのＣＹＰ７５Ｂ遺伝子の取得
青いサイネリアセネッティー（サントリーフラワーズ社）の蕾の花弁から常法に基づいてＲＮＡを抽出した。このＲＮＡから調製したｐｏｌｙ−Ａ＋ＲＮＡを用いて、ＺＡＰ−ｃＤＮＡ（登録商標）Ｌｉｂｒａｒｙ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ストラタジーン社、製品番号２００４５０）を用いて製造者の推奨する方法に従って、ｃＤＮＡライブラリーを作製した。このｃＤＮＡライブラリーを、ＤＩＧシステム（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ社）で標識したチョウマメＦ３’５’Ｈ ｃＤＮＡ（Ｃｌｉｔｏｒｉａ ｔｅｒｎａｔｅａ）（Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｏｎｏｌｏｇｙ ２３，５−１１（２００６）参照）を用いて、同社が推奨する方法でスクリーニングを行った。得られた４８個のシグナルを示すファージを純化した。これらのファージから製造者（ストラタジーン社）の推奨する方法でｉｎ ｖｉｖｏ ｅｘｃｉｓｉｏｎによりプラスミドを得た。

これらのプラスミドに含まれるｃＤＮＡ部分の塩基配列を決定し、ＤＮＡデータベースに対してＢｌａｓｔ検索を行ったところ、多くのチトクロームＰ４５０に相同性を示す遺伝子を得ることができ、これらは８種類に分類することができた。それらの内ＣＹＰ７５Ｂに分類されると推定された２つのクローン（Ｃｉ５ａ１３（配列番号１））と（Ｃｉ５ａ１８（配列番号２））の全塩基配列をそれぞれ決定した。

実施例２：取得した遺伝子Ｃｉ５ａ１３とＣｉ５ａ１８の機能解析
Ｃｉ５ａ１３とＣｉ５ａ１８それぞれのｃＤＮＡ部分を、バイナリーベクターｐＢｉｎＰＬＵＳ（Ｔｒａｎｇｅｎｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．４：２８８−２９０，１９９５参照）上にある構成的なプロモーターＭａｃＩプロモーター（Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１５：３７３−３８１，１９９０参照）とマノピンシンターゼターミネーターとの間に挿入し、それぞれ、ｐＳＰＢ２７８５とｐＳＰＢ２７８６と命名した。
得られたバイナリーベクターをアグロバクテリウム法によりペチュニア系統Ｓｋｒ４ｘＳｗ６３に形質転換した。形質転換の方法、本ペチュニア系統については、特許第３０８７２６号を参照のこと。形質転換ペチュニアのいくつかの系統は、宿主に比べて、花の色が濃くなっていた。アントシアニジンを分析したところ、Ｃｉ５ａ１３を導入した系統ではシアニジンとその誘導体であるペオニジンの量が顕著に増加しており、一方、Ｃｉ５ａ１８を導入した系統ではデルフィニジンとその誘導体であるペチュニジンとマルビジンの量が顕著に増加していた。したがって、Ｃｉ５ａ１３はＦ３’Ｈを、そしてＣｉ５ａ１８はＦ３’５’Ｈをコードしていることが分かった。以下の表１に、ペチュニア形質転換体の花弁中のペラルギニジン、シアニジン、ペオニジン、デルフィニジン、ペチュニジン、及びマルビジンの分析値（花弁１ｇ当りのマイμｇ数）を示す。

実施例３：サイネリア染色体クローンの取得
実施例１と同じサイネリアの葉から染色体ＤＮＡを抽出し、染色体ライブラリーをλＢｌｕｅＳＴＡＲ^ＴＭ Ｘｈｏ Ｉ Ｈａｌｆ−Ｓｉｔｅ Ａｒｍｓ Ｋｉｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｅｒｃｋｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔ／６９２４２）を用いて作製した。得られた２０万プラークを、ＤＩＧで標識したＣｉ５ａ１８ｃＤＮＡ断片を用いてスクリーニングした。このｃＤＮＡ断片は、プライマー（Ｃｉ５ａ１８Ｆ１（配列番号７）：５’−ＣＡＴＣＴＧＴＴＴＴＣＴＧＣＣＡＡＡＧＣ−３’とＣｉ５ａ１８Ｒ１（配列番号８）：５’−ＧＧＡＴＴＡＧＧＡＡＡＣＧＡＣＣＡＧＧ−３’）を用いてＣｉ５ａ１８を鋳型にして増幅した。得られた１７プラークから最終的に４つのプラークを得、これらをｉｎ ｖｉｖｏ ｅｘｃｉｓｉｏｎによりプラスミドに変換した。これらのＤＮＡ塩基配列を決定したところ、これらは同じ配列を含んでいた。このうちｇＣｉ０１−ｐＢｌｕｅｓｔａｒとしたクローンを以後の実験に供した。ｇＣｉ０１−ｐＢｌｕｅｓｔａｒクローン塩基配列を配列番号５に示す。この配列は、サイネリアＦ３’５’Ｈのプロモーター領域と翻訳領域を含んでいることが期待された。翻訳領域のアミノ酸配列は配列番号４に示すＣｉ５ａ１８アミノ酸配列と４箇所アミノ酸が変化していた。すなわち、Ｃｉ５ａ１８アミノ酸配列（配列番号４）の１５１，１５９，１６１、及び３２９番目の残基は、それぞれ、メチオニン、グリシン、グルタミン酸、及びイソロイシンであるが、染色体クローンでは、それぞれ、スレオニン、アルギニン、グリシン、及びバリンであった（配列番号６参照）。

実施例４：サイネリア染色体クローンのナス科ペチュニアでの機能解析
ｇＣｉ０１−ｐＢｌｕｅｓｔａｒからＰｖｕＩとＥｃｏＲＶで切り出される約５．７ｋｂのＤＮＡ断片（配列番号６）をＤＮＡ ｂｌｕｎｔｉｎｇ ｋｉｔ（ＴＡＫＡＲＡ）を用いて平滑末端化した。このＤＮＡ断片をｐＢｉｎＰＬＵＳのＳｍａＩ部位にクローニングし、これをｐＳＰＢ３１３０と命名した。図２にｇＣｉ０１−ｐＢｌｕｅｓｔａｒからＰｖｕＩとＥｃｏＲＶで切り出される約５．７ｋｂのＤＮＡ断片（配列番号６）の構造を示す。
このバイナリーベクターはＴ−ＤＮＡ領域にカナマイシンによる選抜に使用できるｎｐｔＩＩ遺伝子を有していた。
このバイナリーベクターを実施例２に記載した方法でペチュニアに導入したところ、花の色が宿主より濃くなった。代表的なアントシアニジン結果を以下の表２に示す。

また、組換えペチュニアの葉と花（生育段階によって５段階に分けた（Ｎａｔｕｒｅ，３６６：２７６−２７９，１９９３）を参照のこと）から、ＲＮＡをＲＮｅａｓｙＰｌａｎｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて抽出し、ＲＴ−ＰＣＲ法（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ２ ｆｉｒｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｔｒｏｇｅｎ社）を用いて逆転写した後、ＰＣＲで増幅）により、導入遺伝子由来の転写物を増幅した。プライマーは、前述のＣｉ５ａ１８Ｆ１（配列番号７）とＣｉ５ａ１８Ｒ１（配列番号８）を使用した。葉では転写物は検出されなかった。花弁のステージ３（花弁が開きかける時期）で最も多い転写物が検出された。花弁のステージ３は花色に関わるフラボノイド合成に関わる構造遺伝子がもっとも高発現する時期である（Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１３２：１６５２−１６６３，２００３を参照のこと）。以上の結果は、キク科のサイネリアのＦ３’５’Ｈの染色体遺伝子由来のＤＮＡ配列（プロモーター、翻訳配列、ターミネーターを含む）（配列番号６）がナス科のペチュニアで機能したこと、すなわち、配列番号９に示す本願発明に係るプロモーターが、花色に関わるフラボノイド合成に関わる構造遺伝子を制御するために適していることを示す。キク科とナス科は植物の分類では、必ずしも近縁ではなく、それぞれキク目とナス目という異なる目に属する。今般、キク科の染色体遺伝子由来のＤＮＡ配列が異なる目の植物でも機能したことが示された訳である。このようにして得られた遺伝子組換え植物は、挿し芽などの栄養増殖により増やすことができる。また、導入遺伝子はその宿主植物の染色体ＤＮＡに挿入され、後代に伝達され、後代に置いても表現形を示すことが通常である。

実施例５：サイネリア染色体クローンのキクでの発現
ｇＣｉ０１−ｐＢｌｕｅｓｔａｒ（配列番号５）からＰｖｕＩとＥｃｏＲＶで切り出される約５．７ｋｂのＤＮＡ断片（配列番号６）をｐＣＧＰ１９８８（ＰＣＴ／ＡＵ０３／０１１１１を参照のこと）のＳｍａＩ部位に挿入し、ｐＣＧＰ３１４１とした。このバイナリーベクターをアグロバクテリウム法によりキク品種Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｒｅｇａｎに導入した。キクの形質転換は、例えば、国際公開第ＷＯ９４／２８１４０号パンフレットに記載される方法に従って行ったが、該方法に限定されるものではない。開花したキクの花弁を分析したところ、宿主には含まれない、デルフィジンが約５％検出された。したがって、サイネリアのＦ３’５’Ｈの染色体遺伝子由来のＤＮＡ配列（プロモーター、翻訳配列、ターミネーターを含む）（配列番号６）が実際にキクで機能したことが示された。このようにして得られた遺伝子組換え植物は、挿し芽などの栄養増殖により増やすことができる。また、導入遺伝子はその宿主植物の染色体ＤＮＡに挿入され、後代に伝達され、後代に置いても表現形を示すことが通常である。

実施例６：ｐＣＧＰ３６１８の構築
ｐＣＧＰ３６１８は、バラカルコン合成酵素プロモーターとパンジーＦ３’５’Ｈ＃１８とノパリンシンターゼターミネーターを含む発現カセットと、バラカルコン合成酵素プロモーターとサイネリアＦ３’５’Ｈ遺伝子のイントロンを含むキクＦ３’Ｈ遺伝子の逆方向繰り返し配列とノパリンシンターゼターミネーターを含む発現カセットを含む。このベクターは、キクにおいてＦ３’Ｈ遺伝子の発現を抑制し、同時にＦ３’５’Ｈ遺伝子を発現することを意図して構築した。
以下順に構築過程を述べる。

＜サイネリアＦ３’５’Ｈ遺伝子の第一イントロンを含むｐＣＧＰ３４４５の構築＞
サイネリアのＦ３’５’Ｈ遺伝子の、配列番号６に示す塩基配列の第３０９３位〜３０１７位にある第一イントロンを含む５６９ｂｐのＤＮＡ断片を、プラスミドｇＣｉ０１を鋳型にし、以下の合成ＤＮＡプライマーを用いて増幅した：
ＣｉｎＦ ５１４６−５１７０Ｓ （５’−ＧＣＡＴＣＣＣＧＧＧＡＧＴＴＣＧＡＣＡＧＧＴＴＴＴＧＴＡＣＴＴＴＣＡＣ−３’）（配列番号１１）（配列番号６の第３０８３位〜３１０７位の配列、及び制限酵素ＳｍａＩの認識配列を含む）；
ＣｉｎＲ ５６７０−５６９０ＲＶ（５’−ＧＣＡＴＧＴＣＧＡＣＧＡＴＡＴＣＡＣＣＴＣＣＴＣＣＴＧＴＡＧＴＴＡＣＧ−３’）（配列番号１２）（配列番号６の第３６０６位〜３６２４位の配列の相補配列、及び制限酵素ＳａｌＩとＥｃｏＲＶの認識配列を含む）。
この５６９ｂｐのＤＮＡ断片を、プラスミドｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にサブクローニングし、得られたプラスミドをｐＣＧＰ３４４５とした。

＜プラスミドｐＣＧＰ３６０２（バラＣＨＳプロモーターに連結したサイネリアＦ３’５’Ｈ遺伝子のイントロンとノパリンシンターゼターミネーター）の構築＞
ｐＣＧＰ３４４５をＸｈｏＩとＳａｌＩで消化し、約５６０ｂｐのＤＮＡ断片を回収した。このＤＮＡ断片を、ＸｈｏＩで消化したｐＣＧＰ２２０３（ＰＣＴ／ＡＵ２００８／００１６９４に記載、パンジーＦ３’５’Ｈ＃１８ ｃＤＮＡがバラＣＨＳプロモーターとｎｏｓターミネーターの間に挿入されている）に挿入し、得られたプラスミドをさらにＳｍａＩで消化することにより、パンジーＦ３’５’Ｈ＃１８ ｃＤＮＡ由来の約２６０ｂｐのＤＮＡ断片を除去した。得られたプラスミドをｐＣＧＰ３６０２とした。

＜プラスミドｐＣＧＰ３６０９（バラＣＨＳプロモーター＋正方向のキクＦ３’ＨｃＤＮＡ＋サイネリアＦ３’５’Ｈ遺伝子のイントロン＋ノパリンシンターゼターミネーター）の構築＞
プラスミドｐＣＧＰ３１３３（ＰＣＴ／ＡＵ２００８／００１６９４に記載、キクのＦ３’Ｈ遺伝子の一部をＰＣＲにより増幅し、両側にＸｈｏＩ配列を付加したものを含む）をＮｃｏＩとＢａｍＨＩで消化して得られる約１．１ｋｂのＤＮＡ断片を回収し、平滑末端化し、ｐＣＧＰ３６０２のＳｍａＩ部位に挿入した。プロモーターの下流に、ｃＤＮＡが正方向に連結されたプラスミドをｐＣＧＰ３６０９とした。

＜プラスミドｐＣＧＰ３６１３（バラＣＨＳプロモーター＋正方向のキクＦ３’ＨｃＤＮＡ＋サイネリアＦ３’５’Ｈ遺伝子のイントロン＋逆方向のキクＦ３’ＨｃＤＮＡ＋ノパリンシンターゼターミネーター）の構築＞
プラスミドｐＣＧＰ３１３３をＸｂａＩで消化して得られる約１．１ｋｂのＤＮＡ断片を平滑末端化し、ｐＣＧＰ３６０９のＥｃｏＲＶ部位に挿入した。ｃＤＮＡが逆方向に挿入されたプラスミドをｐＣＧＰ３６１３とした。以下、正方向のキクＦ３’ＨｃＤＮＡ＋サイネリアＦ３’５’Ｈ遺伝子のイントロン＋逆方向のキクＦ３’ＨｃＤＮＡのＤＮＡ構築物を、ｄｓキクＦ３’Ｈ（サイネリアイントロン１）ともいう。

＜形質転換用プラスミドｐＣＧＰ３６１８（バラＣＨＳプロモーター＋パンジーＦ３’５’Ｈ＃１８＋ノパリンシンターゼターミネーター；バラＣＨＳプロモーター＋ｄｓキクＦ３’Ｈ（サイネリアイントロン１）＋ノパリンシンターゼターミネーター）の構築＞
バラＣＨＳプロモーター＋ｄｓキクＦ３’Ｈ（サイネリアイントロン１）＋ノパリンシンターゼターミネーターを含むＤＮＡ断片をｐＣＧＰ３６１３から、制限酵素ＢｇｌＩＩとＮｏｔＩで消化することにより回収した。このＤＮＡ断片を平滑末端化し、ｐＣＧＰ２２１７（ＰＣＴ／ＡＵ２００８／００１６９４に記載）をＰｍｅＩで消化したＤＮＡ断片と連結することにより、図３に示す植物形質転換用ベクターｐＣＧＰ３６１８を得た。

実施例７：形質転換用ベクターｐＣＧＰ３６１７（バラＣＨＳプロモーター＋ｄｓキクＦ３’Ｈ（サイネリアイントロン１）＋ノパリンシンターゼターミネーター）の構築
バラＣＨＳプロモーター＋ｄｓキクＦ３’Ｈ（サイネリアイントロン１）＋ノパリンシンターゼターミネーターを含むＤＮＡ断片をｐＣＧＰ３６１３から、制限酵素ＢｇｌＩＩとＮｏｔＩで消化することにより回収した。このＤＮＡ断片を平滑末端化し、ｐＣＧＰ１９８８（ＰＣＴ／ＡＵ０３／０１１１１に記載）をＰｍｅＩで消化したＤＮＡ断片と連結することにより、図４に示す植物形質転換用ベクターｐＣＧＰ３６１７を得た。

実施例８：形質転換用ベクターｐＣＧＰ３６２０（サイネリアＦ３’５’Ｈのプロモーター領域＋パンジーＦ３’５’Ｈ＃１８ｃＤＮＡ＋ノパリンシンターゼターミネーター）の構築
＜ｐＣＧＰ３６０４（サイネリアＦ３’５’Ｈ プロモーター領域）の構築＞
サイネリアＦ３’５’Ｈ染色体ＤＮＡ配列を含むプラスミドｇＣｉｌを鋳型にして、以下の合成ＤＮＡをプライマーにしてサイネリアＦ３’５’Ｈ プロモーター領域のＤＮＡ配列をＰＣＲにより増幅した：
ＣｉｎＦ ３１１３−３１２８ＲＶ（５’−ＧＡＡＡＴＧＴＧＴＡＡＧＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＣ−３’）（配列番号１３）（ＰｖｕＩＩ認識部位を含む）；
ＣｉｎＲ ４６９４−４７１４ＲＩ（５’−ＴＴＴＡＴＴＴＡＣＴＴＧＡＣＡＡＣＧＴＡＡＧＡＡＴＴＣＧＴＴＡＧＴＡＡＴＴＡＴＡＧＧ−３’）（配列番号１４）（ＥｃｏＲＩ認識部位を含む）。
得られた約１．５ｋｂのＤＮＡ断片を、ＥｃｏＲＩで消化したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ＋を平滑末端化したＤＮＡ断片と連結した。得られたプラスミドをｐＣＧＰ３６０４とした。

＜ｐＣＧＰ３６１５（サイネリアＦ３’５’Ｈ プロモーター領域＋パンジーＦ３’５’Ｈ＃１８ｃＤＮＡ＋ノパリンシンターゼターミネーター）の構築＞
プラスミドｐＣＧＰ２２０３を、ＥｃｏＲＩとＮｏｔＩで消化することにより、パンジーパンジーＦ３’５’Ｈ＃１８ｃＤＮＡ＋ノパリンシンターゼターミネーターを含むＤＮＡ断片（約１．９ｋｂ）を回収した。このＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩとＮｏｔＩで消化したｐＣＧＰ３６０４と連結し、プラスミドｐＣＧＰ３６１５とした。

＜形質転換用ベクターｐＣＧＰ３６２０（サイネリアＦ３’５’Ｈのプロモーター領域＋パンジーＦ３’５’Ｈ＃１８ｃＤＮＡ＋ノパリンシンターゼターミネーター）の構築＞
プラスミドｐＣＧＰ３６１５をＮｏｔＩで消化し、平滑末端化した。さらにＥｃｏＲＶで消化することにより、約３．６ｋｂのＤＮＡ断片を得た。このＤＮＡ断片と、ＰｍｅＩで消化したｐＣＧＰ１９８８とを連結することにより、図５に示す植物形質転換用バイナリーベクターｐＣＧＰ３６２０を得た。

実施例９：キクにおけるペラルゴニジンの生産
キク品種Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ＲｅｇａｎにｐＣＧＰ３４２６とｐＣＧＰ３６１７のＴ−ＤＮＡ部分を実施例５に記載したように導入した。形質転換体の花においては、花の色がＩｍｐｒｏｖｅｄ Ｒｅｇａｎのピンク色からアプリコット色へ変化した。また、形質転換体の花には、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｒｅｇａｎの花には含まれない、ペラルゴニジンが含まれていた。ｐＣＧＰ３４２６に由来する形質転換体のペラルゴニジンの含有率（アントシアニジン総量に対するペラルゴニジンの割合）は平均１７％程度であったのに対し、ｐＣＧＰ３６１７に由来する形質転換体のペラルゴニジンの含有率は平均５６％程度であった。いずれのベクターを導入した場合も天然のキクには通常含まれないペラルゴニジンを含み、その結果新しい色の花を得ることができた。これは産業上有用な結果である。また、サイネリアのイントロンを利用するとＦ３’Ｈ遺伝子を効率よく抑制でき、花色をより顕著に変更できることも分かった。

実施例１０：キクにおけるデルフィニジンの生産
キク品種Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ＲｅｇａｎにｐＣＧＰ３４２９（バラＣＨＳプロモーター＋パンジーＦ３’５’Ｈ＃１８＋ノパリンシンターゼターミネーター；バラＣＨＳプロモーター＋ｄｓキクＦ３’Ｈ（イントロンを入れていない）＋ノパリンシンターゼターミネーター、ＰＣＴ／ＡＵ２００８／００１６９４に記載）とｐＣＧＰ３６１８（実施例６に記載）のＴ−ＤＮＡ部分を実施例５に記載したように導入した。得られた形質転換体は、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｒｅｇａｎに比べ、花色が青く変化していた。また、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｒｅｇａｎには含まれないデルフィジンを生産していた。ｐＣＧＰ３４２９に由来する形質転換体のデルフィニジン含有率は２６−６４％程度であったのに対し、ｐＣＧＰ３６１８に形質転換体のデルフィニジン含有率は最高８０％に達した。キクの内在性のＦ３’Ｈと外から導入したＦ３’５’Ｈはキクの中で同じ基質（ジヒドロケンフェロールなど）を水酸化し、それぞれシアニジンとデルフィニジンの合成に供していると考えられる。デルフィニジンの含有率を高めるためには、Ｆ３’５’Ｈの発現を強化するのに加え、Ｆ３’Ｈの活性を抑制することが有効である。ｐＣＧＰ３４２９よりもｐＣＧＰ３６１８を導入したキクの方がデルフィニジン含有率が高かったことは、サイネリアのイントロンの配列がＦ３‘Ｈ遺伝子の発現抑制に有効であることを示唆している。

本発明に係るフラボノイド３’，５’−水酸化酵素（Ｆ３’５’Ｈ）のコーディング領域のプロモーターとして機能しうるキク科サイネリア（ｃｉｎｅｒａｒｉａ）由来の新規ポリヌクレオチド、及び該ポリヌクレオチドを含む新規Ｆ３’５’Ｈ遺伝子構築物は、花の色を変えるためのツールとして好適に利用できる。
また、本発明に係るフラボノイド３’，５’−水酸化酵素（Ｆ３’５’Ｈ）のコーディング領域のプロモーターとして機能しうるキク科サイネリア（ｃｉｎｅｒａｒｉａ）由来の新規ポリヌクレオチドのイントロンの配列（配列番号６に示す塩基配列の第３０９３位〜３０１７位にある第一イントロンの全部又は一部であるポリヌクレオチド）は、ループ配列として、ＲＮＡｉ法において遺伝子の発現を抑制するための遺伝子構築物に好適に利用できる。

３５Ｓ：カリフラワーモザイクウィルス３５Ｓプロモーター
ＬＢ：レフトボーダー
ＳｕＲＢ：タバコアセト乳酸合成酵素ＳｕＲＢ
ｒｏｓｅ ＣＨＳ：バラカルコンシンターゼ５’非翻訳配列（＝プロモーター）
ＢＰＦ３’５’Ｈ＃１８：ｂｌａｃｋ ｐａｎｓｙ Ｆ３’５’Ｈ＃１８遺伝子
ｎｏｓ：ノパリンシンターゼ３’非翻訳配列
ｄｓ ｃｈｒｙｓ Ｆ３’Ｈ：二本鎖キクＦ３’Ｈ
ｃｉｎＦ３’５’Ｈ ｉｎｔｒｏｎ：サイネリアＦ３’５’Ｈ遺伝子イントロン
ＲＢ：ライトボーダー
ＴｅｔＲ：テトラサイクリン抵抗性遺伝子
ｄｓ ｃｈｒｙｓ Ｆ３’Ｈ：二本鎖キクＦ３’Ｈ
ＣｉｎＦ３’５’Ｈ ５’：サイネリアＦ３’５’Ｈ遺伝子５’非翻訳領域（＝プロモーター）
［配列表］

Claims (14)

1. （１）配列番号９に示す塩基配列を有するポリヌクレオチドである、サイネリア由来の花弁特異的プロモーター。
2. 請求項１に記載のサイネリア由来の花弁特異的プロモーターを含むF3'5'H遺伝子構築物。
3. （１）配列番号１０に示す塩基配列を有するポリヌクレオチドである、サイネリア由来のターミネーターをさらに含む、請求項２に記載のF3'5'H遺伝子構築物。
4. （１）配列番号６に示す塩基配列を有するポリヌクレオチドである、請求項３に記載のF3'5'H遺伝子構築物。
5. 請求項１に記載の花弁特異的プロモーター又は請求項２〜４のいずれか１項に記載のF3'5'H遺伝子構築物を含むベクター。
6. 請求項５に記載のベクターを含む微生物。
7. 請求項１に記載の花弁特異的プロモーター又は請求項２〜４のいずれか１項に記載のF3'5'H遺伝子構築物が導入された植物、その器官、その組織、その子孫又はその栄養増殖体。
8. 配列番号６に示す塩基配列の第３０９３位〜３６１７位にある第一イントロンであるポリヌクレオチドをループに持つ、ＲＮＡｉ法において遺伝子の発現を抑制するための遺伝子構築物。
9. 前記発現が抑制される遺伝子がフラボノイド3'-水酸化酵素である、請求項８に記載の遺伝子構築物。
10. 請求項９に記載の遺伝子構築物が導入された植物、その器官、その組織、その子孫又はその栄養増殖体。
11. 前記導入の前後で、フラボノイドの含有量が変化した、請求項１０に記載の植物、その器官、その組織、その子孫又はその栄養増殖体。
12. 前記導入の前後で、デルフィニジンの含有量が変化した、請求項１０に記載の植物、その器官、その組織、その子孫又はその栄養増殖体。
13. 前記導入の前後で、ペラルゴニジンの含有量が変化した、請求項１０に記載の植物、その器官、その組織、その子孫又はその栄養増殖体。
14. 前記導入の前後で、花色が変化した、請求項１０に記載の植物又はその子孫。

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