ES2368962T3

ES2368962T3 - Inserción mejorada direccionada de dna en las plantas.

Info

Publication number: ES2368962T3
Application number: ES08075865T
Authority: ES
Inventors: Kathleen D'halluin; Chantal Vanderstraeten; Rene Ruiter
Original assignee: Bayer Bioscience NV
Current assignee: Bayer CropScience NV
Priority date: 2003-11-18
Filing date: 2004-11-17
Publication date: 2011-11-24
Anticipated expiration: 2024-11-17
Also published as: CA2545564C; DE602004018824D1; EP2025756A1; SI2025756T1; CY1112436T1; US7598365B2; EP2025756B1; US20100003759A1; PL2025756T3; ATE514782T1; JP2007511232A; JP2011177191A; CA2844236C; ATE419367T1; EP1689870A2; AU2010212264B2; US20060282914A1; PL1689870T3; EP1689870B1; WO2005049842A3

Abstract

Un método para introducir un DNA extraño de interés en un sitio preseleccionado de un genoma nuclear de una célula vegetal, que comprende las etapas de (a) inducir una rotura de DNA bicatenario en un sitio preseleccionado en dicho genoma nuclear mediante introducción en dicha célula vegetal de un gen expresable en plantas que codifica una enzima que induce una rotura de DNA bicatenario de corte raro que reconoce dicho sitio preseleccionado; (b) introducir el DNA extraño de interés en la célula vegetal mediante transferencia directa de DNA.

Description

Inserción mejorada direccionada de DNA en las plantas

Campo de la invención

La presente invención se refiere al campo de la biología molecular de las plantas, más específicamente al campo de la ingeniería genómica de las plantas. Se proporcionan métodos para la introducción dirigida de un fragmento de DNA extraño en un sitio de inserción preseleccionado en el genoma de una planta. Las plantas que contienen el DNA extraño insertado en un sitio particular se pueden obtener ahora con una mayor frecuencia y con mayor exactitud que lo que es posible con los métodos de inserción direccionada de DNA disponibles actualmente. Además, en una gran proporción de las plantas resultantes, el DNA extraño se ha insertado solamente en el sitio de inserción preseleccionado, sin que el DNA extraño se haya insertado aleatoriamente en otras localizaciones en el genoma de la planta. Los métodos de la invención son así una mejora, tanto cuantitativa como cualitativamente, con respecto a los métodos de la técnica anterior. Se proporcionan también genes quiméricos, plásmidos, vectores y otros medios para ser usados en los métodos de la invención.

Antecedentes de la invención

La primera generación de plantas transgénicas a principios de los años 80 del siglo pasado por tecnología de transformación mediada por Agrobacterium ha estimulado el desarrollo de otros métodos para introducir un DNA extraño de interés o un transgén en el genoma de una planta, tales como la incorporación de DNA mediada por PEG en protoplastos, bombardeo con microproyectiles, transformación mediada por triquitas de silicio, etc.

Sin embargo, todos los métodos de transformación de plantas tienen en común que los transgenes incorporados en el genoma de la planta se integran de una manera aleatoria y en número de copias impredecible. Con frecuencia, los transgenes pueden integrarse en forma de repeticiones, ya sea del transgén completo o de partes del mismo. Un patrón de integración compleja de este tipo puede influir en el nivel de expresión de los transgenes, v.g. por destrucción del DNA transcrito por mecanismos de silenciación de genes posteriores a la transcripción o por inducción de metilación del DNA introducido, regulando con ello en sentido decreciente la actividad de transcripción en el transgén. Asimismo, el sitio de integración per se puede influir en el nivel de expresión del transgén. La combinación de estos factores da como resultado una gran variación en el nivel de expresión de los transgenes o DNA extraño de interés entre células de plantas y líneas de plantas transgénicas diferentes. Además, la integración del DNA extraño de interés puede tener un efecto disruptivo en la región del genoma en la que ocurre la integración, y puede influir o perturbar la función normal de dicha región diana, conduciendo con ello a efectos secundarios a menudo indeseables.

Por esta razón, siempre que se investiga el efecto de introducción de un DNA extraño particular en una planta, se requiere que se generen y se analicen un gran número de líneas de plantas transgénicas a fin de obtener resultados significativos. Análogamente, en la generación de plantas de cosecha transgénicas, en las que se introduce un DNA de interés particular en las plantas para proporcionar a la planta transgénica un fenotipo deseado conocido, se crea una gran población de líneas de plantas transgénicas creadas independientemente o los denominados sucesos, para permitir la selección de aquellas líneas de plantas que exhiben una expresión óptima de los transgenes, y con efectos secundarios mínimos o inexistentes, en el fenotipo global de la planta transgénica. Particularmente en este campo, sería ventajoso si este proceso de tanteos pudiera reemplazarse por un método más directo, teniendo en cuenta los requisitos reguladores engorrosos y los costes elevados asociados con las pruebas en campo repetidas necesarias para la eliminación de los sucesos transgénicos no deseados. Adicionalmente, estará claro que la posibilidad de inserción de DNA direccionada podría ser también beneficiosa en el proceso de la denominada superposición de transgenes.

La necesidad de controlar la integración del transgén en plantas ha sido pronto reconocida, y se han desarrollado varios métodos en un esfuerzo para satisfacer esta necesidad (para una revisión véase Kumar y Fladung, 2001, Trends in Plant Science, 6, p. 155-159). Estos métodos están basados fundamentalmente en integración de transgenes basada en recombinación homóloga, una estrategia que ha sido aplicada con éxito en procariotas y eucariotas inferiores (véase v.g. EP 0317509 o la publicación correspondiente por Paszkowski et al., 1988, EMBO J., 7, p. 4021-4026). Sin embargo, para las plantas, el mecanismo predominante para la integración de transgenes está basado en la recombinación ilegítima que implica poca homología entre las cadenas de DNA recombinantes. Un desafío importante en esta área es por consiguiente la detección de los sucesos raros de recombinación homóloga, que se ven enmascarados por la integración mucho más eficiente del DNA extraño introducido por recombinación ilegítima.

Una forma de resolver este problema es por selección contra los sucesos de integración que se han producido por recombinación ilegítima, tal como se ilustra en WO 94/17176.

Otra forma de resolver el problema por activación del locus diana y/o del DNA de reparación o donante por la inducción de roturas de DNA bicatenario por medio de endonucleasas de corte raro, tales como I-SceI. Se ha demostrado que esta técnica aumenta la frecuencia de recombinación homóloga al menos en dos órdenes de magnitud utilizando Agrobacterias para suministrar el DNA de reparación a las células de las plantas (Puchta et al., 1996, Proc. Natl. Acad Sci. U.S.A., 93, p. 5055-5060; Chilton y Que, Plant Physiol., 2003).

WO 96/14408 describe un DNA aislado que codifica la enzima I-SceI. Esta secuencia de DNA puede incorporarse en vectores de clonación y expresión, líneas de células transformadas y animales transgénicos. Los vectores son útiles en mapeado génico e inserción de genes dirigida al sitio.

WO 00/46386 describe métodos de modificación, reparación, atenuación e inactivación de un gen u otro DNA cromosómico en una célula por rotura de las dobles cadenas con I-SceI. Se describen también métodos de tratamiento o profilaxis de una enfermedad genética en un individuo que se encuentra en necesidad de ello. Se describen adicionalmente endonucleasas de restricción quiméricas.

Sin embargo, persiste todavía la necesidad de mejorar la frecuencia de la inserción direccionada de un DNA extraño en el genoma de una célula eucariota, particularmente en el genoma de una célula vegetal. Estos y otros problemas se resuelven como se describe más adelante en esta memoria en las diferentes realizaciones detalladas de la invención, así como en las reivindicaciones.

Sumario de la invención

En una realización, la invención proporciona un método para la introducción de un DNA extraño de interés, que puede estar flanqueado por una región de DNA que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con una región de DNA que flanquea un sitio preseleccionado, en un sitio preseleccionado, tal como un sitio I-SceI de un genoma de una célula vegetal, tal como una célula de maíz, que comprende las etapas de

(a): inducir una rotura de DNA bicatenario en el sitio preseleccionado en el genoma de la célula mediante introducción en dicha célula vegetal de un gen expresable en plantas que codifica una enzima que induce una rotura de DNA bicatenario de corte raro que reconoce dicho sitio preseleccionado, por ejemplo introduciendo un gen que codifica I-SceI;

(b): introducir el DNA extraño de interés en la célula vegetal;

caracterizado porque el DNA extraño se suministra mediante transferencia directa de DNA, que se puede lograr mediante bombardeo de microproyectiles revestidos con el DNA extraño de interés. El gen que codifica I-SceI puede comprender una secuencia nucleotídica que codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No. 1, en el que dicha secuencia nucleotídica tiene un contenido de GC de alrededor de 50% a alrededor de 60%, con la condición de que

i) la secuencia nucleotídica no comprende una secuencia nucleotídica seleccionada del grupo que consiste en GATAAT, TATAAA, AATATA, AATATT, GATAAA, AATGAA, AATAAG, AATAAA, AATAAT, AACCAA, ATATAA, AATCAA, ATACTA, ATAAAA, ATGAAA, AAGCAT, ATTAAT, ATACAT, AAAATA, ATTAAA, AATTAA, AATACA y CATAAA;

ii) el nucleótido no comprende una secuencia nucleotídica seleccionada del grupo que consiste en CCAAT, ATTGG, GCAAT y ATTGC;

iii) la secuencia nucleotídica no comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en ATTTA, AAGGT, AGGTA, GGTA o GCAGG;

iv) la secuencia nucleotídica no comprende un tramo GC que consiste en 7 nucleótidos consecutivos seleccionados del grupo de G o C;

v) la secuencia nucleotídica no comprende un tramo AT que consiste en 5 nucleótidos consecutivos seleccionados del grupo de A o T; y

vi) la secuencia nucleotídica no comprende los codones TTA, CTA, ATA, GTA, TCG, CCG, ACG y GCG. Un ejemplo de tal gen que codifica I-SceI comprende la secuencia nucleotídica de SEQ ID 4.

La célula vegetal se puede incubar, antes de la etapa a), en un compuesto fenólico de origen vegetal, que se puede seleccionar del grupo de acetosiringona (3,5-dimetoxi-4-hidroxiacetofenona), α-hidroxi-acetosiringona, ácido sinapínico (ácido 3,5-dimetoxi-4-hidroxicinámico), ácido siríngico (ácido 4-hidroxi-3,5-dimetoxibenzoico), ácido ferúlico (ácido 4-hidroxi-3-metoxicinámico), catecol (1,2-dihidroxibenceno), ácido p-hidroxibenzoico (ácido 4hidroxibenzoico), ácido β-resorcílico (ácido 2,4-dihidroxibenzoico), ácido protocatéquico (ácido 3,4dihidroxibenzoico), ácido pirogálico (ácido 2,3,4-trihidroxibenzoico), ácido gálico (ácido 3,4,5-trihidroxibenzoico) y vanillina (3-metoxi-4-hidroxibenzaldehído).

La enzima que induce una rotura de DNA bicatenario de corte raro puede comprender una señal de localización nuclear.

Breve descripción de las figuras

La Tabla 1 representa las posibles elecciones de trinucleótidos (codones) para una región codificante de I-SceI sintética (véase también la secuencia nucleotídica en SEQ ID No. 2).

La Tabla 2 representa las posibles elecciones preferidas de trinucleótidos para una región codificante de I-SceI sintética (véase también la secuencia nucleotídica en SEQ ID No. 3).

Figura 1: Representación esquemática del locus diana (A) y el DNA de reparación (B) utilizado en el ensayo para la inserción de DNA direccionada mediada por recombinación homóloga. Se representa también el locus diana después de recombinación (C). Sitio DSB: sitio de rotura del DNA bicatenario; 3’g7: señal de poliadenilación y de terminación de la transcripción del gen 7 de A. tumefaciens; neo: neomicina fosfotransferasa expresable en plantas; 35S: promotor del transcrito 35S de CaMV; 5’ bar: región de DNA que codifica la porción amino terminal de la fosfinotricina acetiltransferasa; 3’nos: señal de poliadenilación y de terminación de la transcripción del gen de nopalina sintetasa de A. tumefaciens; Pnos: promotor del gen de nopalina sintetasa de A. tumefaciens; 3’ocs: señal de poliadenilación y de terminación de la transcripción en 3’ del gen de octopina sintasa de A. tumefaciens.

Descripción detallada

Se ha encontrado que:

a) La introducción en las células de la planta del DNA extraño a insertar por transferencia directa de DNA, particularmente bombardeo con microproyectiles, aumentaba inesperadamente la frecuencia de sucesos de inserción direccionada. La totalidad de los sucesos de inserción obtenidos eran sucesos de inserción de DNA direccionada, que ocurrían en el sitio de la rotura de DNA bicatenario inducida. Además, la totalidad de estos sucesos de inserción direccionada parecían ser sucesos de recombinación exacta entre la homología de secuencia proporcionada que flanqueaba la rotura del DNA bicatenario. Sólo alrededor de la mitad de estos sucesos tuvieron una inserción adicional del DNA extraño en un sitio diferente del sitio de la rotura del DNA bicatenario inducida.

b) La inducción de la rotura del DNA bicatenario por expresión transitoria de una endonucleasa inductora de rotura bicatenaria de corte raro, tal como I-SceI, codificada por un gen quimérico que comprende una región codificante sintética para una endonucleasa de corte raro tal como I-SceI, diseñada de acuerdo con un conjunto preseleccionado de reglas, aumentaba sorprendentemente la calidad de los sucesos de inserción del DNA direccionada resultantes (es decir la frecuencia de sucesos de inserción de DNA perfectamente direccionada). Adicionalmente, la endonucleasa se había equipado con una señal de localización nuclear.

c) La preincubación de las células diana en un compuesto fenólico vegetal, tal como acetosiringona, aumentaba adicionalmente la frecuencia de inserción direccionada en roturas de DNA bicatenario inducidas en el genoma de una célula vegetal.

Cualquiera de los hallazgos anteriores, aislados o en combinación, mejora la frecuencia con la cual pueden obtenerse sucesos de inserción direccionada basados en recombinación homóloga, así como la calidad de los sucesos recuperados.

De este modo, en un aspecto, la invención se refiere a un método para introducir un DNA extraño de interés en un sitio preseleccionado de un genoma de una célula vegetal, que comprende las etapas de

(a): inducir una rotura de DNA bicatenario en el sitio preseleccionado en el genoma de la célula mediante introducción en dicha célula vegetal de un gen expresable en plantas que codifica una enzima que induce una rotura de DNA bicatenario de corte raro que reconoce dicho sitio preseleccionado;

(b): introducir el DNA extraño de interés en la célula vegetal;

caracterizado porque el DNA extraño se suministra mediante transferencia directa de DNA.

Como se utiliza en esta memoria, “transferencia directa de DNA” es cualquier método de introducción de DNA en células vegetales que no implica el uso de Agrobacterium spp. natural que es capaz de introducir DNA en células vegetales. Esto incluye métodos bien conocidos en la técnica, tales como la introducción de DNA por electroporación en protoplastos, introducción de DNA por electroporación en células vegetales intactas o tejidos o células vegetales parcialmente degradados, introducción en protoplastos de DNA por la acción de agentes tales como PEG y análogos, y particularmente bombardeo con microproyectiles recubiertos con DNA. La introducción de DNA por transferencia directa en células vegetales difiere de la introducción de DNA mediada por Agrobacterium al menos en que el DNA bicatenario entra en la célula vegetal, en que el DNA que entra no está recubierto con ninguna proteína, y en que la cantidad de DNA que entra en la célula vegetal puede ser considerablemente mayor. Adicionalmente, el DNA introducido por métodos de transferencia directa, tales como el gen quimérico introducido que codifica una endonucleasa inductora de una rotura del DNA bicatenario, puede ser más susceptible a la transcripción, dando como resultado una mejor sincronización de la inducción de la rotura del DNA bicatenario. Aunque no se pretende limitar la invención a un modo de acción particular, se cree que la inserción eficiente basada en recombinación homóloga del DNA de reparación o DNA extraño en el genoma de una célula vegetal puede ser debida a una combinación de cualquiera de estos parámetros.

Convenientemente, la rotura del DNA bicatenario puede inducirse en el sitio preseleccionado por expresión transitoria después de la introducción de un gen expresable en plantas que codifica una enzima de corte raro inductora de la rotura bicatenaria. Como se expone en otro lugar en este documento, se puede utilizar I-SceI para dicho propósito a fin de introducir un DNA extraño en un sitio de reconocimiento de I-SceI. Sin embargo, resultará inmediatamente evidente para la persona experta en la técnica que también pueden utilizarse otras enzimas inductoras de rotura bicatenaria para insertar el DNA extraño en sus sitios de reconocimiento respectivos. Una lista de enzimas de corte raro inductoras de DSB (rotura bicatenaria) y sus sitios de reconocimiento respectivos se proporciona en la Tabla I del documento WO 03/004659 (páginas 17 a 20) (incorporado aquí como referencia). Adicionalmente, están disponibles métodos para diseñar endonucleasas de corte raro fabricadas por encargo que reconocen básicamente cualquier secuencia nucleotídica diana de elección. Tales métodos se han descrito p.ej. en WO 03/080809, WO 94/18313 o WO 95/09933, y en Isalan et al., 2001, Nature Biotechnology 19, 656-660; Liu et al. 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 5525-5530.)

Así pues, como se utiliza en esta memoria, “un sitio preseleccionado” indica una secuencia nucleotídica particular en el genoma nuclear de la planta en cuya localización se desea insertar el DNA extraño. Una persona experta en la técnica sería perfectamente capaz de seleccionar una enzima inductora de rotura del DNA bicatenario (“DSBI”) que reconozca la secuencia nucleotídica diana seleccionada, o de modificar por ingeniería genética una endonucleasa DSBI de este tipo. Alternativamente, un sitio de reconocimiento de una endonucleasa DSBI se puede introducir en el genoma de la planta utilizando cualquier método de transformación convencional o por mejora genética convencional utilizando una línea de plantas que tenga un sitio de reconocimiento de una endonucleasa DSBI en su genoma, y cualquier DNA extraño deseado puede introducirse posteriormente en dicho sitio diana preseleccionado introducido previamente.

La rotura del DNA bicatenario puede inducirse convenientemente por introducción transitoria de un gen quimérico expresable en plantas que comprende una región promotora expresable en plantas enlazada operativamente a una región de DNA que codifique una enzima inductora de rotura bicatenaria. La región de DNA que codifica una enzima inductora de rotura bicatenaria puede ser una región de DNA sintético, tal como, pero sin limitarse a, una región de DNA sintético en la cual los codones se seleccionan de acuerdo con el esquema de diseño que se describe en otro lugar de esta solicitud para las regiones codificantes de I-SceI.

La enzima inductora de rotura bicatenaria puede comprender, pero no comprende necesariamente, una señal de localización nuclear (NLS) [Raikhel, Plant Physiol. 100:1627-1632 (1992) y las referencias allí], tales como la NLS del antígeno T largo de SV40 [Kalderon et al. Cell 39:499-509 (1984)]. La señal de localización nuclear puede localizarse en cualquier lugar de la proteína, pero convenientemente está localizada en el extremo N-terminal de la proteína. La señal de localización nuclear puede reemplazar uno o más de los aminoácidos de la enzima inductora de la rotura bicatenaria.

Como se utiliza en esta memoria, “DNA extraño de interés” indica cualquier fragmento de DNA que se pueda desear introducir en el sitio preseleccionado. Aunque no se requiere estrictamente, el DNA extraño de interés puede estar flanqueado por al menos una región de secuencia nucleotídica que tenga homología con una región de DNA que flanquee el sitio preseleccionado. El DNA extraño de interés puede estar flanqueado en ambos sitios por regiones de DNA que tengan homología con ambas regiones de DNA que flanquean el sitio preseleccionado. Así, la o las moléculas de DNA de reparación introducidas en la célula vegetal pueden comprender un DNA extraño flanqueado por una o dos secuencias flanqueantes que tengan homología con las regiones de DNA situadas respectivamente en dirección 5’ o en dirección 3’ del sitio preseleccionado. Esto permite un mejor control de la inserción del DNA extraño. De hecho, la integración por recombinación homóloga permitirá la unión precisa del fragmento de DNA extraño al genoma nuclear de la planta hasta el nivel nucleotídico.

Las secuencias nucleotídicas flanqueantes pueden variar en longitud, y deberían tener una longitud de al menos alrededor de 10 nucleótidos. Sin embargo, la región flanqueante puede ser tan larga como sea prácticamente posible (v.g. hasta alrededor de 100-150 kb, tal como cromosomas artificiales bacterianos (BACs) completos). Preferiblemente, la región flanqueante tendrá alrededor de 50 pb a alrededor de 2000 pb. Además, las regiones que flanquean el DNA extraño de interés no precisan ser idénticas a las regiones de DNA que flanquean el sitio preseleccionado, y pueden tener entre alrededor de 80% y alrededor de 100% de identidad de secuencia, con preferencia alrededor de 95% a alrededor de 100% de identidad de secuencia con las regiones de DNA que flanquean el sitio preseleccionado. Cuanto más larga sea la región flanqueante, menos restrictivo será el requisito de homología. Además, se prefiere que la identidad de secuencia sea tan alta como sea prácticamente posible en la proximidad de la localización de inserción exacta del DNA extraño.

Además, las regiones que flanquean el DNA extraño de interés no precisan tener homología con las regiones que flanquean inmediatamente el sitio preseleccionado, sino que pueden tener homología con una región de DNA del genoma nuclear situada más lejos de dicho sitio preseleccionado. La inserción del DNA extraño dará entonces como resultado una eliminación del DNA diana entre el sitio de inserción preseleccionado y la región de homología del DNA. Dicho de otro modo, el DNA diana localizado entre las regiones de homología se sustituirá por el DNA extraño de interés.

Para el propósito de esta invención, la “identidad de secuencia” de dos secuencias nucleotídicas o de aminoácidos afines, expresada como porcentaje, hace referencia al número de posiciones en las dos secuencias alineadas óptimamente que tienen restos idénticos (x 100) dividido entre el número de posiciones comparadas. Un salto, es decir, una posición en una alineación en la cual está presente un resto en una secuencia pero no en la otra, se considerará como una posición con restos no idénticos. La alineación de las dos secuencias se realiza mediante el algoritmo de Needleman y Wunsch (Needleman y Wunsch, 1970). La alineación de secuencias asistida por ordenador puede realizarse convenientemente utilizando programas de software estándar tales como GAP, que forma parte del paquete Wisconsin, versión 10.1 (Genetics Computer Group, Madison, Wisconsin, EE.UU.) utilizando la matriz de registro por defecto con una penalización por creación de salto de 50 y una penalización por extensión de salto de 3.

También se describe un fragmento de DNA modificado que codifica I-SceI y el uso del mismo para introducir eficientemente un DNA extraño de interés en un sitio preseleccionado de un genoma de una célula vegetal, con lo que el fragmento de DNA modificado que codifica I-SceI tiene una secuencia nucleotídica que se ha diseñado para cumplir los criterios siguientes:

a) la secuencia nucleotídica codifica una endonucleasa I-SceI funcional, tal como una endonucleasa I-SceI que tiene la secuencia de aminoácidos como se proporciona en SEQ ID No. 1;

b) la secuencia nucleotídica tiene un contenido de GC de alrededor de 50% a alrededor de 60%;

c) la secuencia nucleotídica no comprende una secuencia nucleotídica seleccionada del grupo que consiste en GATAAT, TATAAA, AATATA, AATATT, GATAAA, AATGAA, AATAAG, AATAAA, AATAAT, AACCAA, ATATAA, AATCAA, ATACTA, ATAAAA, ATGAAA, AAGCAT, ATTAAT, ATACAT, AAAATA, ATTAAA, AATTAA, AATACA y CATAAA;

d) el nucleótido no comprende una secuencia nucleotídica seleccionada del grupo que consiste en CCAAT, ATTGG, GCAAT y ATTGC;

e) la secuencia nucleotídica no comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en ATTTA, AAGGT, AGGTA, GGTA o GCAGG;

f) la secuencia nucleotídica no comprende un tramo de GC que consiste en 7 nucleótidos consecutivos seleccionados del grupo de G o C;

g) la secuencia nucleotídica no comprende un tramo de GC que consiste en 5 nucleótidos consecutivos seleccionados del grupo de A o T; y

h) la secuencia nucleotídica no comprende codones que codifiquen Leu, Ile, Val, Ser, Pro, Thr, Ala que comprenden dobletes TA o GC en posiciones 2 y 3 (es decir, la secuencia nucleotídica no comprende los codones TTA, CTA, ATA, GTA, TCG, CCG, ACG y GCG).

I-SceI es una endonucleasa específica del sitio, responsable de la movilidad de los intrones en las mitocondrias en Saccharomyces cerevisiae. La enzima es codificada por el intrón opcional Sc LSU.1 del gen de rRNA 21S, e inicia una rotura del DNA bicatenario en el sitio de inserción del intrón, generando un corte escalonado de 4 pb con salientes 3’OH. El sitio de reconocimiento de la endonucleasa I-SceI se extiende a lo largo de una secuencia no simétrica de 18 pares de bases (Colleaux et al. 1988 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:6022-6026). La secuencia de aminoácidos para I-SceI y un equivalente de código universal del gen mitocondrial de I-SceI han sido proporcionados, v.g., por el documento WO 96/14408.

El dcoumento WO 96/14408 describe que las variantes siguientes de la proteína I-SceI son todavía funcionales:

●: las posiciones 1 a 10 pueden eliminarse

●: posición 36: se tolera Gly (G)

●: posición 40: se toleran Met (M) o Val (V)

●: posición 41: se toleran Ser (S) o Asn (N)

●: posición 43: se tolera Ala (A)

●: posición 46: se toleran Val (V) o N (Asn)

●: posición 91: se tolera Ala (A)

●: posiciones 123 y 156: se tolera Leu (L)

●: posición 223 : se toleran Ala (A) y Ser (S)

y también pueden diseñarse y utilizarse de acuerdo con la presente invención secuencias sintéticas de nucleótidos que codifican tales enzimas variantes de I-SceI.

Una secuencia nucleotídica que codifica la secuencia de aminoácidos de I-SceI, en la cual los cuatro aminoácidos localizados en posición amino terminal se han reemplazado por una señal de localización nuclear (SEQ ID No. 1) consiste así en 244 trinucleótidos que pueden representarse como R1 a R244. Para cada una de estas posiciones son posibles entre 1 y 6 posibles elecciones de trinucleótidos que codifican el mismo aminoácido. La Tabla 1 presenta las elecciones posibles para los trinucleótidos que codifican la secuencia de aminoácidos de SEQ ID 1, y proporciona los requisitos estructurales (sean condicionales o absolutos) que permiten evitar la inclusión en la secuencia de DNA sintética de las “secuencias nucleotídicas prohibidas” arriba mencionadas. Se proporciona también la secuencia nucleotídica de los trinucleótidos contiguos en el código UIPAC.

Como se utilizan en esta memoria, los símbolos del código UIPAC tienen su significado habitual, es decir: N= A o C

o G o T; R= A o G; Y= C o T; B= C o G o T (no A); V= A o C o G (no T); D= A o G o T (no C); H= A o C o T (no G); K= G oT;M= A oC; S= G o C; W=A oT.

Un fragmento de DNA sintético aislado adecuado es aquel que comprende una secuencia nucleotídica como la representada en SEQ ID No. 2, en la que los codones se seleccionan entre las opciones proporcionadas, de tal manera para obtener una secuencia nucleotídica con un contenido global de GC de alrededor de 50% a alrededor de 60%, con preferencia alrededor de 54% a 55%, con la condición de que la secuencia nucleotídica desde la posición 28 a la posición 30 no es AAG; si la secuencia nucleotídica en la posición 34 a la posición 36 es AAT, entonces la secuencia nucleotídica desde la posición 37 a la posición 39 no es ATT o ATA; si la secuencia nucleotídica desde la posición 34 a la posición 36 es AAC, entonces la secuencia nucleotídica desde la posición 37 a la posición 39 no es ATT simultáneamente con el hecho de que la secuencia nucleotídica desde la posición 40 a la posición 42 sea AAA; si la secuencia nucleotídica desde la posición 34 a la posición 36 es AAC, entonces la secuencia nucleotídica desde la posición 37 a la posición 39 no es ATA; si la secuencia nucleotídica desde la posición 37 a la posición 39 es ATT o ATA, entonces la secuencia nucleotídica desde la posición 40 a la 42 no es AAA; la secuencia nucleotídica desde la posición 49 a la posición 51 no es CAA; la secuencia nucleotídica desde la posición 52 a la posición 54 no es GTA; los codones de la secuencia nucleotídica desde la posición 58 a la posición 63 se seleccionan de acuerdo con las opciones proporcionadas de tal manera que la secuencia nucleotídica resultante no comprenda ATTTA; si la secuencia nucleotídica desde la posición 67 a la posición 69 es CCC, entonces la secuencia nucleotídica desde la posición 70 a la posición 72 no es AAT; si la secuencia nucleotídica desde la posición 76 a la posición 78 es AAA, entonces la secuencia nucleotídica desde la posición 79 a la posición 81 no es TTG simultáneamente con el hecho de que la secuencia nucleotídica desde la posición 82 a la 84 sea CTN; si la secuencia nucleotídica desde la posición 79 a la posición 81 es TTA o CTA, entonces la secuencia nucleotídica desde la posición 82 a la posición 84 no es TTA; la secuencia nucleotídica desde la posición 88 a la posición 90 no es GAA; si la secuencia nucleotídica desde la posición 91 a la posición 93 es TAT, entonces la secuencia nucleotídica desde la posición 94 a la posición 96 no es AAA; si la secuencia nucleotídica desde la posición 97 a la posición 99 es TCC o TCG o AGC, entonces la secuencia nucleotídica desde la posición 100 a la 102 no es CCA simultáneamente con el hecho de que la secuencia nucleotídica desde la posición 103 a 105 sea TTR; si la secuencia nucleotídica desde la posición 100 a la 102 es CAA, entonces la secuencia nucleotídica desde la posición 103 a la 105 no es TTA; si la secuencia nucleotídica desde la posición 109 a la posición 111 es GAA, entonces la secuencia nucleotídica desde la posición 112 a la 114 no es TTA; si la secuencia nucleotídica desde la posición 115 a 117 es AAT, entonces la secuencia nucleotídica desde la posición 118 a la posición 120 no es ATT o ATA; si la secuencia nucleotídica desde la posición 121 a 123 es GAG, entonces la secuencia nucleotídica desde la posición 124 a la posición 126; la secuencia nucleotídica desde la posición 133 a 135 no es GCA; la secuencia nucleotídica desde la posición 139 a la posición 141 no es ATT; si la secuencia nucleotídica desde la posición 142 a la posición 144 es GGA, entonces la secuencia nucleotídica desde la posición 145 a la posición 147 no es TTA; si la secuencia nucleotídica desde la posición 145 a la posición 147 es TTA, entonces la secuencia nucleotídica desde la posición 148 a la posición 150 no es ATA simultáneamente con el hecho de que la secuencia nucleotídica desde la posición 151 a 153 sea TTR; si la secuencia nucleotídica desde la posición 145 a la posición 147 es CTA, entonces la secuencia nucleotídica desde la posición 148 a la posición 150 no es ATA simultáneamente con el hecho de que la secuencia nucleotídica desde la posición 151 a 153 sea TTR; si la secuencia nucleotídica desde la posición 148 a la posición 150 es ATA, entonces la secuencia nucleotídica desde la posición 151 a la posición 153 no es CTA o TTG; si la secuencia nucleotídica desde la posición 160 a la posición 162 es GCA, entonces la secuencia nucleotídica desde la posición 163 a la posición 165 no es TAC; si la secuencia nucleotídica desde la posición 163 a la posición 165 es TAT, entonces la secuencia nucleotídica desde la posición 166 a la posición 168 no es ATA simultáneamente con el hecho de que la secuencia nucleotídica desde la posición 169 a la posición 171 sea AGR; los codones de la secuencia nucleotídica desde la posición 172 a la posición 177 se seleccionan de acuerdo con las opciones proporcionadas de tal manera que la secuencia nucleotídica resultante no comprenda GCAGG; los codones de la secuencia nucleotídica desde la posición 178 a la posición 186 se seleccionan de acuerdo con las opciones proporcionadas de tal manera que la secuencia nucleotídica resultante no comprenda AGGTA; si la secuencia nucleotídica desde la posición 193 a la posición 195 es TAT, entonces la secuencia nucleotídica desde la posición 196 a la posición 198 no es TGC; la secuencia nucleotídica desde la posición 202 a la posición 204 no es CAA; la secuencia nucleotídica desde la posición 217 a la posición 219 no es AAT; si la secuencia nucleotídica desde la posición 220 a la posición 222 es AAA, entonces la secuencia nucleotídica desde la posición 223 a la posición 225 no es GCA; si la secuencia nucleotídica desde la posición 223 a la posición 225 es GCA, entonces la secuencia nucleotídica desde la posición 226 a la posición 228 no es TAC; si la secuencia nucleotídica desde la posición 253 a la posición 255 es GAC, entonces la secuencia nucleotídica desde la posición 256 a la posición 258 no es CAA; si la secuencia nucleotídica desde la posición 277 a la posición 279 es CAT, entonces la secuencia nucleotídica desde la posición 280 a la posición 282 no es AAA; los codones de la secuencia nucleotídica desde la posición 298 a la posición 303 se seleccionan de acuerdo con las opciones proporcionadas de tal manera que la secuencia nucleotídica resultante no comprenda ATTTA; si la secuencia nucleotídica desde la posición 304 a la posición 306 es GGC, entonces la secuencia nucleotídica desde la posición 307 a la posición 309 no es AAT; los codones de la secuencia nucleotídica desde la posición 307 a la posición 312 se seleccionan de acuerdo con las opciones proporcionadas de tal manera que la secuencia nucleotídica resultante no comprenda ATTTA; los codones de la secuencia nucleotídica desde la posición 334 a la posición 342 se seleccionan de acuerdo con las opciones proporcionadas de tal manera que la secuencia nucleotídica resultante no comprenda ATTTA; si la secuencia nucleotídica desde la posición 340 a la posición 342 es AAG, entonces la secuencia nucleotídica desde la posición 343 a 345 no es CAT; si la secuencia nucleotídica desde la posición 346 a la posición 348 es CAA, entonces la secuencia nucleotídica desde la posición 349 a la posición 351 no es GCA; los codones de la secuencia nucleotídica desde la posición 349 a la posición 357 se seleccionan de acuerdo con las opciones proporcionadas de tal manera que la secuencia nucleotídica resultante no comprenda ATTTA; la secuencia nucleotídica desde la posición 355 a la posición 357 no es AAT; si la secuencia nucleotídica desde la posición 358 a la posición 360 es AAA, entonces la secuencia nucleotídica desde la posición 361 a 363 no es TTG; si la secuencia nucleotídica desde la posición 364 a la posición 366 es GCC, entonces la secuencia nucleotídica desde la posición 367 a la posición 369 no es AAT; los codones de la secuencia nucleotídica desde la posición 367 a la posición 378 se seleccionan de acuerdo con las opciones proporcionadas de tal manera que la secuencia nucleotídica resultante no comprenda ATTTA; si la secuencia nucleotídica desde la posición 382 a la posición 384 es AAT, entonces la secuencia nucleotídica desde la posición 385 a la posición 387 no es AAT; la secuencia nucleotídica desde la posición 385 a la posición 387 no es AAT; si la secuencia nucleotídica desde la posición 400 a 402 es CCC, entonces la secuencia nucleotídica desde la posición 403 a 405 no es AAT; si la secuencia nucleotídica desde la posición 403 a 405 es AAT, entonces la secuencia nucleotídica desde la posición 406 a 408 no es AAT; los codones de la secuencia nucleotídica desde la posición 406 a la posición 411 se seleccionan de acuerdo con las opciones proporcionadas de tal manera que la secuencia nucleotídica resultante no comprenda ATTTA; los codones de la secuencia nucleotídica desde la posición 421 a la posición 426 se seleccionan de acuerdo con las opciones proporcionadas de tal manera que la secuencia nucleotídica resultante no comprenda ATTTA; la secuencia nucleotídica desde la posición 430 a la posición 432 no es CCA; si la secuencia nucleotídica desde la posición 436 a la posición 438 es TCA, entonces la secuencia nucleotídica desde la posición 439 a la posición 441 no es TTG; la secuencia nucleotídica desde la posición 445 a la posición 447 no es TAT; la secuencia nucleotídica desde la posición 481 a 483 no es AAT; si la secuencia nucleotídica desde la posición 484 a la posición 486 es AAA, entonces la secuencia nucleotídica desde la posición 487 a la posición 489 no es AAT simultáneamente con el hecho de que la secuencia nucleotídica desde la posición 490 a la posición 492 sea AGY; si la secuencia nucleotídica desde la posición 490 a la posición 492 es TCA, entonces la secuencia nucleotídica desde la posición 493 a la posición 495 no es ACC simultáneamente con el hecho de que la secuencia nucleotídica desde la posición 496 a 498 sea AAY; si la secuencia nucleotídica desde la posición 493 a la posición 495 es ACC, entonces la secuencia nucleotídica desde la posición 496 a 498 no es AAT; la secuencia nucleotídica desde la posición 496 a la posición 498 no es AAT; si la secuencia nucleotídica desde la posición 499 a la posición 501 es AAA, entonces la secuencia nucleotídica desde la posición 502 a la posición 504 no es TCA o AGC; si la secuencia nucleotídica desde la posición 508 a posición 510 es GTA, entonces la secuencia nucleotídica desde la posición 511 a 513 no es TTA; si la secuencia nucleotídica desde la posición 514 a la posición 516 es AAT, entonces la secuencia nucleotídica desde la posición 517 a la posición 519 no es ACA; si la secuencia nucleotídica desde la posición 517 a la posición 519 es ACC o ACG, entonces la secuencia nucleotídica desde la posición 520 a la posición 522 no es CAA simultáneamente con el hecho de que la secuencia nucleotídica desde la posición 523 a la posición 525 sea TCN; los codones de la secuencia nucleotídica desde la posición 523 a la posición 531 se seleccionan de acuerdo con las opciones proporcionadas de tal manera que la secuencia nucleotídica resultante no comprenda ATTTA; si la secuencia nucleotídica desde la posición 544 a la posición 546 es GAA, entonces la secuencia nucleotídica desde la posición 547 a la posición 549 no es TAT, simultáneamente con el hecho de que la secuencia nucleotídica desde la posición 550 a la posición 552 sea TTR; los codones de la secuencia nucleotídica desde la posición 547 a la posición 552 se seleccionan de acuerdo con las opciones proporcionadas de tal manera que la secuencia nucleotídica resultante no comprenda ATTTA; si la secuencia nucleotídica desde la posición 559 a la posición 561 es GGA, entonces la secuencia nucleotídica desde la posición 562 a la posición 564 no es TTG simultáneamente con el hecho de que la secuencia nucleotídica desde la posición 565 a 567 sea CGN; si la secuencia nucleotídica desde la posición 565 a la posición 567 es CGC, entonces la secuencia nucleotídica desde la posición 568 a la posición 570 no es AAT; la secuencia nucleotídica desde la posición 568 a la posición 570 no es AAT; si la secuencia nucleotídica desde la posición 574 a la posición 576 es TTC, entonces la secuencia nucleotídica desde la posición 577 a la posición 579 no es CAA simultáneamente con el hecho de que la secuencia nucleotídica desde la posición 580 a la posición 582 sea TTR; si la secuencia nucleotídica desde la posición 577 a la posición 579 es CAA, entonces la secuencia nucleotídica desde la posición 580 a la posición 582 no es TTA; si la secuencia nucleotídica desde la posición 583 a la posición 585 es AAT la secuencia nucleotídica desde la posición 586 a 588 no es TGC; la secuencia nucleotídica desde la posición 595 a la posición 597 no es AAA; si la secuencia nucleotídica desde la posición 598 a la posición 600 es ATT, entonces la secuencia nucleotídica desde la posición 601 a la posición 603 no es AAT; la secuencia nucleotídica desde la posición 598 a la posición 600 no es ATA; la secuencia nucleotídica desde la posición 601 a la posición 603 no es AAT; si la secuencia nucleotídica desde la posición 604 a la posición 606 es AAA, entonces la secuencia nucleotídica desde la posición 607 a la posición 609 no es AAT; la secuencia nucleotídica desde la posición 607 a la posición 609 no es AAT; la secuencia nucleotídica desde la posición 613 a la posición 615 no es CCA; si la secuencia nucleotídica desde la posición 613 a la posición 615 es CCG, entonces la secuencia nucleotídica desde la posición 616 a la posición 618 no es ATA; si la secuencia nucleotídica desde la posición 616 al nucleótido de la posición 618 es ATA, entonces la secuencia nucleotídica desde la posición 619 a 621 no es ATA; si la secuencia nucleotídica desde la posición 619 a la posición 621 es ATA, entonces la secuencia nucleotídica desde la posición 622 a la posición 624 no es TAC; la secuencia nucleotídica desde la posición 619 a la posición 621 no es ATT; los codones de la secuencia nucleotídica desde la posición 640 a la posición 645 se seleccionan de acuerdo con las opciones proporcionadas de tal manera que la secuencia nucleotídica resultante no comprenda ATTTA; si la secuencia nucleotídica desde la posición 643 a la posición 645 es TTA, entonces la secuencia nucleotídica desde la posición 646 a la posición 648 no es ATA; si la secuencia nucleotídica desde la posición 643 a la posición 645 es CTA, entonces la secuencia nucleotídica desde la posición 646 a la posición 648 no es ATA; los codones de la secuencia nucleotídica desde la posición 655 a la posición 660 se seleccionan de acuerdo con las opciones proporcionadas de tal manera que la secuencia nucleotídica resultante no comprenda ATTTA; si la secuencia nucleotídica desde la posición 658 a 660 es TTA o CTA, entonces la secuencia nucleotídica desde la posición 661 a la posición 663 no es ATT o ATC; la secuencia nucleotídica desde la posición 661 a la posición 663 no es ATA; si la secuencia nucleotídica desde la posición 661 a la posición 663 es ATT, entonces la secuencia nucleotídica desde la posición 664 a la posición 666 no es AAA; los codones de la secuencia nucleotídica desde la posición 670 a la posición 675 se seleccionan de acuerdo con las opciones proporcionadas de tal manera que la secuencia nucleotídica resultante no comprenda ATTTA; si la secuencia nucleotídica desde la posición 691 a la posición 693 es TAT, entonces la secuencia nucleotídica desde la posición 694 a la posición 696 no es AAA; si la secuencia nucleotídica desde la posición 694 a la posición 696 es AAA, entonces la secuencia nucleotídica desde la posición 697 a la posición 699 no es TTG; si la secuencia nucleotídica desde la posición 700 a la posición 702 es CCC, entonces la secuencia nucleotídica desde la posición 703 a la posición 705 no es AAT; si la secuencia nucleotídica desde la posición 703 a la posición 705 es AAT, entonces la secuencia nucleotídica desde la posición 706 a la posición 708 no es ACA o ACT; si la secuencia nucleotídica desde la posición 706 a la posición 708 es ACA, entonces la secuencia nucleotídica desde la posición 709 a 711 no es ATA simultáneamente con el hecho de que la secuencia nucleotídica desde la posición 712 a la posición 714 sea AGY; la secuencia nucleotídica no comprende los codones TTA, CTA, ATA, GTA, TCG, CCG, ACG y GCG; dicha secuencia nucleotídica no comprende un tramo GC que consiste en 7 nucleótidos consecutivos seleccionados del grupo de G o C; y la secuencia nucleotídica no comprende un tramo AT que consiste en 5 nucleótidos consecutivos seleccionados del grupo de A o T.

También son adecuadas las secuencias nucleotídicas sintéticas como se presentan en la Tabla 2, y que corresponden a un fragmento de DNA sintético aislado como se proporciona que comprende una secuencia nucleotídica como se presenta en SEQ ID No 3, en la que los codones se seleccionan entre las opciones proporcionadas de tal manera para obtener una secuencia nucleotídica con un contenido global de GC de alrededor de 50% a alrededor de 60%, con preferencia alrededor de 54%-55%, con la condición de que si la secuencia nucleotídica desde la posición 121 a la posición 123 es GAG, entonces la secuencia nucleotídica desde la posición 124 a 126 no sea CAA; si la secuencia nucleotídica desde la posición 253 a la posición 255 es GAC, entonces la secuencia nucleotídica desde la posición 256 a 258 no es CAA; si la secuencia nucleotídica desde la posición 277 a la posición 279 es CAT, entonces la secuencia nucleotídica desde la posición 280 a 282 no es AAA; si la secuencia nucleotídica desde la posición 340 a la posición 342 es AAG, entonces la secuencia nucleotídica desde la posición 343 a la posición 345 no es CAT; si la secuencia nucleotídica desde la posición 490 a la posición 492 es TCA, entonces la secuencia nucleotídica desde la posición 493 a la posición 495 no es ACC; si la secuencia nucleotídica desde la posición 499 a la posición 501 es AAA, entonces la secuencia nucleotídica desde la posición 502 a 504 no es TCA o AGC; si la secuencia nucleotídica desde la posición 517 a la posición 519 es ACC, entonces la secuencia nucleotídica desde la posición 520 a la posición 522 no es CAA simultáneamente con el hecho de que la secuencia nucleotídica desde la posición 523 a 525 sea TCN; si la secuencia nucleotídica desde la posición 661 a la posición 663 es ATT, entonces la secuencia nucleotídica desde la posición 664 a la posición 666 no es AAA; los codones de la secuencia nucleotídica desde la posición 7 a la posición 15 se seleccionan de acuerdo con las opciones proporcionadas de tal manera que la secuencia nucleotídica resultante no comprenda un tramo de siete nucleótidos contiguos del grupo de G o C; los codones de la secuencia nucleotídica desde la posición 61 a la posición 69 se seleccionan de acuerdo con las opciones proporcionadas de tal manera que la secuencia nucleotídica resultante no comprenda un tramo de siete nucleótidos contiguos del grupo de G o C; los codones de la secuencia nucleotídica desde la posición 130 a la posición 138 se seleccionan de acuerdo con las opciones proporcionadas de tal manera que la secuencia nucleotídica resultante no comprenda un tramo de siete nucleótidos contiguos del grupo de G o C; los codones de la secuencia nucleotídica desde la posición 268 a la posición 279 se seleccionan de acuerdo con las opciones proporcionadas de tal manera que la secuencia nucleotídica resultante no comprenda un tramo de siete nucleótidos contiguos del grupo de G o C; los codones de la secuencia nucleotídica desde la posición 322 a la posición 333 se seleccionan de acuerdo con las opciones proporcionadas de tal manera que la secuencia nucleotídica resultante no comprenda un tramo de siete nucleótidos contiguos del grupo de G o C; los codones de la secuencia nucleotídica desde la posición 460 a la posición 468 se seleccionan de acuerdo con las opciones proporcionadas de tal manera que la secuencia nucleotídica resultante no comprenda un tramo de siete nucleótidos contiguos del grupo de G o C; los codones de la secuencia nucleotídica desde la posición 13 a la posición 27 se seleccionan de acuerdo con las opciones proporcionadas de tal manera que la secuencia nucleotídica resultante no comprenda un tramo de cinco nucleótidos contiguos del grupo de A o T; los codones de la secuencia nucleotídica desde la posición 37 a la posición 48 se seleccionan de acuerdo con las opciones proporcionadas de tal manera que la secuencia nucleotídica resultante no comprenda un tramo de cinco nucleótidos contiguos del grupo de A o T; los codones de la secuencia nucleotídica desde la posición 184 a la posición 192 se seleccionan de acuerdo con las opciones proporcionadas de tal manera que la secuencia nucleotídica resultante no comprenda un tramo de cinco nucleótidos contiguos del grupo de A o T; los codones de la secuencia nucleotídica desde la posición 214 a la posición 219 se seleccionan de acuerdo con las opciones proporcionadas de tal manera que la secuencia nucleotídica resultante no comprenda un tramo de cinco nucleótidos contiguos del grupo de A o T; los codones de la secuencia nucleotídica desde la posición 277 a la posición 285 se seleccionan de acuerdo con las opciones proporcionadas de tal manera que la secuencia nucleotídica resultante no comprenda un tramo de cinco nucleótidos contiguos del grupo de A o T; y los codones de la secuencia nucleotídica desde la posición 388 a la posición 396 se seleccionan de acuerdo con las opciones proporcionadas de tal manera que la secuencia nucleotídica resultante no comprenda un tramo de cinco nucleótidos contiguos del grupo de A o T; los codones de la secuencia nucleotídica desde la posición 466 a la posición 474 se seleccionan de acuerdo con las opciones proporcionadas de tal manera que la secuencia nucleotídica resultante no comprenda un tramo de cinco nucleótidos contiguos del grupo de A o T; los codones de la secuencia nucleotídica desde la posición 484 a la posición 489 se seleccionan de acuerdo con las opciones proporcionadas de tal manera que la secuencia nucleotídica resultante no comprenda un tramo de cinco nucleótidos contiguos del grupo de A o T; los codones de la secuencia nucleotídica desde la posición 571 a la posición 576 se seleccionan de acuerdo con las opciones proporcionadas de tal manera que la secuencia nucleotídica resultante no comprenda un tramo de cinco nucleótidos contiguos del grupo de A o T; los codones de la secuencia nucleotídica desde la posición 598 a la posición 603 se seleccionan de acuerdo con las opciones proporcionadas de tal manera que la secuencia nucleotídica resultante no comprenda un tramo de cinco nucleótidos contiguos del grupo de A o T; los codones de la secuencia nucleotídica desde la posición 604 a la posición 609 se seleccionan de acuerdo con las opciones proporcionadas de tal manera que la secuencia nucleotídica resultante no comprenda un tramo de cinco nucleótidos contiguos del grupo de A o T; los codones de la secuencia nucleotídica desde la posición 613 a la posición 621 se seleccionan de acuerdo con las opciones proporcionadas de tal manera que la secuencia nucleotídica resultante no comprenda un tramo de cinco nucleótidos contiguos del grupo de A o T; los codones de la secuencia nucleotídica desde la posición 646 a la posición 651 se seleccionan de acuerdo con las opciones proporcionadas de tal manera que la secuencia nucleotídica resultante no comprenda un tramo de cinco nucleótidos contiguos del grupo de A o T; los codones de la secuencia nucleotídica desde la posición 661 a la posición 666 se seleccionan de acuerdo con las opciones proporcionadas de tal manera que la secuencia nucleotídica resultante no comprenda un tramo de cinco nucleótidos contiguos del grupo de A o T; y los codones de la secuencia nucleotídica desde la posición 706 a la posición 714 se seleccionan de acuerdo con las opciones proporcionadas de tal manera que la secuencia nucleotídica resultante no comprenda un tramo de cinco nucleótidos contiguos del grupo de A o T.

La secuencia nucleotídica de SEQ ID No 4 es un ejemplo de una secuencia nucleotídica sintética de este tipo que codifica una endonucleasa I-SceI que ya no contiene ninguna de las secuencias nucleotídicas o codones a evitar. Sin embargo, estará claro que una persona experta en la técnica puede obtener fácilmente una secuencia similar codificante de I-SceI reemplazando uno o más (entre dos y veinte) de los nucleótidos a seleccionar por cualquiera de las alternativas proporcionadas en la secuencia nucleotídica de SEQ ID 3 (excluyendo cualquiera de las combinaciones prohibidas descritas en el párrafo anterior), y utilizarla para obtener un efecto similar.

Para la expresión en célula vegetal, los fragmentos de DNA sintéticos que codifican I-SceI se pueden enlazar operativamente a un promotor expresable en plantas, a fin de obtener un gen quimérico expresable en plantas.

En todavía otro aspecto, la invención se refiere a un método para introducir un DNA extraño de interés en un sitio preseleccionado de un genoma de una célula vegetal, que comprende las etapas de

(a): inducir una rotura bicatenaria en el sitio preseleccionado en el genoma de la célula mediante introducción en dicha célula vegetal de un gen expresable en plantas que codifica una enzima que induce una rotura de DNA bicatenario de corte raro que reconoce dicho sitio preseleccionado;

(b): introducir el DNA extraño de interés en la célula vegetal mediante transferencia directa de DNA; caracterizado porque, antes de la etapa (a), las células vegetales se incuban en un compuesto fenólico de origen vegetal.

“Compuestos fenólicos de origen vegetal” o “fenólicos de origen vegetal” adecuados para la invención son aquellas moléculas fenólicas sustituidas que son capaces de inducir una respuesta quimiotáctica positiva, particularmente aquellas que son capaces de inducir expresión incrementada de genes vir en una Agrobacterium sp. que contiene un plásmido Ti, particularmente una Agrobacterium tumefaciens que contiene un plásmido Ti. Los métodos para medir la respuesta quimiotáctica frente a compuestos fenólicos de origen vegetal han sido descritos por Ashby et al., (1988 J. Bacteriol. 170:4181-4187), y los métodos para medir la inducción de la expresión de genes vir son también muy conocidos (Stachel et al., 1985 Nature 318:624-629; Bolton et al., 1986 Science 232:983-985). Los compuestos fenólicos de origen vegetal preferidos son los encontrados en exudados de lesiones de células vegetales. Uno de los compuestos fenólicos de origen vegetal mejor conocidos es la acetosiringona, que está presente en cierto número de células lesionadas e intactas de diversas plantas, si bien en diferentes concentraciones. Sin embargo, la acetosiringona (3,5-dimetoxi-4-hidroxiacetofenona) no es el único compuesto fenólico de origen vegetal que puede inducir la expresión de genes vir. Otros ejemplos son α-hidroxi-acetosiringona, ácido sinapínico (ácido 3,5-dimetoxi4-hidroxicinámico), ácido siríngico (ácido 4-hidroxi-3,5-dimetoxibenzoico), ácido ferúlico (ácido 4-hidroxi-3metoxicinámico), catecol (1,2-dihidroxibenceno), ácido p-hidroxibenzoico (ácido 4-hidroxibenzoico), ácido βresorcílico (ácido 2,4-dihidroxibenzoico), ácido protocatéquico (ácido 3,4-dihidroxibenzoico), ácido pirogálico (ácido 2,3,4-trihidroxibenzoico), ácido gálico (ácido 3,4,5-trihidroxibenzoico) y vanillina (3-metoxi-4-hidroxibenzaldehído). Como se utilizan en esta memoria, las moléculas mencionadas se denominan como compuestos fenólicos de origen vegetal. Los compuestos fenólicos de origen vegetal pueden añadirse al medio de cultivo vegetal, ya sea aisladamente o en combinación con otros compuestos fenólicos de origen vegetal. Aunque no se pretende limitar la invención a un modo de acción particular, se cree que el efecto estimulante aparente de estos compuestos fenólicos de origen vegetal sobre la división celular (y de este modo también sobre la replicación genómica) pueden mejorar la inserción direccionada del DNA extraño.

Las células vegetales se incuban preferiblemente en el compuesto fenólico de origen vegetal durante alrededor de una semana, aunque se espera que la incubación durante alrededor de uno o dos días en o sobre un compuesto fenólico de origen vegetal será suficiente. Las células vegetales deberían incubarse durante un tiempo suficiente para estimular la división celular. De acuerdo con Guivarc’h et al., (1993), Protoplasma 174:10-18), dicho efecto puede obtenerse fácilmente por incubación de las células vegetales durante un tiempo tan reducido como 10 minutos.

Los métodos mejorados arriba mencionados para inserción de DNA direccionada basada en la recombinación homóloga pueden aplicarse también para mejorar la calidad de las células de plantas transgénicas y plantas obtenidas por métodos de transferencia directa de DNA, particularmente por bombardeo con microproyectiles. Es bien conocido en la técnica que la introducción de DNA por bombardeo con microproyectiles conduce frecuentemente a patrones de integración complejos del DNA introducido (integración de copias múltiples del DNA extraño de interés, sea completa o parcial, generación de estructuras repetidas). No obstante, algunos genotipos o variedades de plantas pueden ser más aptos para transformación utilizando bombardeo con microproyectiles que para transformación utilizando v.g. Agrobacterium tumefaciens. De este modo, sería ventajoso si pudiera mejorarse la calidad de las células vegetales o plantas transgénicas obtenidas por bombardeo con microproyectiles, es decir, si pudiera influirse en el patrón de integración del DNA extraño para hacerlo más simple.

El descubrimiento arriba mencionado de que la introducción de DNA extraño por bombardeo con microproyectiles en presencia de una rotura inducida del DNA bicatenario en el genoma celular, con lo que el DNA extraño tiene homología con las secuencias que flanquean la rotura del DNA bicatenario, conduce frecuentemente (alrededor de 50% de los sucesos obtenidos) a patrones de integración simples (inserción de una sola copia de una manera predecible y sin inserción de fragmentos adicionales del DNA extraño) proporciona la base para un método de simplificación de la complejidad de inserción del DNA extraño en el genoma nuclear de las células vegetales.

De este modo, la invención también se refiere a un método de producción de una planta transgénica por bombardeo con microproyectiles, comprende las etapas de

(a): inducir una rotura de DNA bicatenario en un sitio preseleccionado en el genoma de una célula vegetal, de acuerdo con los métodos descritos en cualquier otro lugar en este documento o disponibles en la técnica; y

(b): introducir el DNA extraño de interés en la célula vegetal por bombardeo con microproyectiles, en el que

dicho DNA extraño de interés está flanqueado por dos regiones de DNA que tienen al menos 80% de identidad de secuencia con las regiones de DNA que flanquean el sitio preseleccionado en el genoma de la planta.

Una porción significativa de la población de plantas transgénicas así obtenida tendrá un patrón de integración simple del DNA extraño en el genoma de las células vegetales; más particularmente, una porción significativa de las plantas transgénicas tendrán solamente una inserción de una copia del DNA extraño, comprendida exactamente entre las dos regiones de DNA que flanquean el sitio preseleccionado en el genoma de la planta. Esta porción es mayor que la población de plantas transgénicas con patrones de integración simples, cuando las plantas se obtienen por bombardeo simple con microproyectiles sin inducir una rotura del DNA bicatenario, y sin proporcionar el DNA extraño con homología a las regiones genómicas que flanquean el sitio preseleccionado.

La célula vegetal diana puede comprender en su genoma un gen marcador, flanqueado por dos sitios de reconocimiento para una endonucleasa de corte raro inductora de rotura del DNA bicatenario, una en cada lado. Este DNA marcador puede introducirse en el genoma de la célula vegetal de interés utilizando cualquier método de transformación, o puede haber sido introducido en el genoma de una célula vegetal de otra línea o variedad de plantas (tal como una línea o variedad de una planta fácilmente susceptible de transformación) e introducirse en la célula de la planta de interés por técnicas clásicas de mejora genética. Preferiblemente, la población de plantas o células vegetales transgénicas que comprenden un gen marcador flanqueado por dos sitios de reconocimiento para una endonucleasa de corte raro inductora de una rotura bicatenaria ha sido analizada respecto al patrón de expresión del gen marcador (tal como expresión elevada, expresión regulada temporal o espacialmente) y se han identificado las líneas de plantas con el patrón de expresión deseado. La producción de una planta transgénica por bombardeo con microproyectiles, que comprende las etapas de

(a): inducir una rotura del DNA bicatenario en un sitio preseleccionado en el genoma de una célula vegetal, de acuerdo con los métodos descritos en cualquier otro lugar de este documento o disponibles en la técnica; e

(b): introducir el DNA extraño de interés en la célula vegetal por bombardeo con microproyectiles, en el que dicho DNA extraño de interés está flanqueado por dos regiones de DNA que tienen al menos 80% de identidad de secuencia con las regiones de DNA que flanquean el sitio preseleccionado en el genoma de la planta;

conducirá a células vegetales y plantas transgénicas en las cuales el gen marcador ha sido reemplazado por el DNA extraño de interés.

El gen marcador puede ser cualquier gen marcador seleccionable o un gen marcador expresable en plantas y susceptible de cribado, que es preferiblemente un gen marcador quimérico convencional. El gen marcador quimérico puede comprender un DNA marcador que se encuentra bajo el control de, y enlazado operativamente en su extremo 5’, a un promotor, preferiblemente un promotor constitutivo expresable en plantas, tal como un promotor 35S de CaMV, o un promotor ligero inducible tal como el promotor del gen que codifica la subunidad pequeña de Rubisco; y enlazado operativamente en su extremo 3’ a señales adecuadas de poliadenilación y terminación de la transcripción en plantas. El DNA marcador codifica preferiblemente un RNA, proteína o polipéptido que, cuando se expresa en las células de una planta, permite que tales células se separen fácilmente de aquellas células en las cuales no se expresa el DNA marcador. La elección del DNA marcador no es crítica, y puede seleccionarse cualquier DNA marcador adecuado de una manera bien conocida. Por ejemplo, un DNA marcador puede codificar una proteína que proporciona un color distinguible a la célula vegetal transformada, tal como el gen A1 (Meyer et al., (1987), Nature 330:677), puede codificar una proteína fluorescente [Chalfie et al., Science 263; 802-805 (1994); Crameri et al, Nature Biotechnology 14:315-319 (1996)], puede codificar una proteína que proporciona a la célula vegetal transformada resistencia a los herbicidas, tal como el gen bar, codificante de PAT, que proporciona resistencia a la fosfinotricina (documento EP 0242246), o puede codificar una proteína que proporciona a las células transformadas resistencia a los antibióticos, tal como el gen aac(6’), que codifica GAT, que proporciona resistencia a la gentamicina (documento WO 94/01560). Un gen marcador seleccionable de este tipo codifica generalmente una proteína que confiere a la célula resistencia a un antibiótico u otro compuesto químico que es normalmente tóxico para las células. En las plantas, el gen marcador seleccionable puede codificar también así una proteína que confiere resistencia a un herbicida, tal como un herbicida que comprende un inhibidor de la glutamina sintetasa (v.g. fosfinotricina) como ingrediente activo. Un ejemplo de tales genes son genes que codifican fosfinotricin acetil transferasa, tales como los genes sfr o sfrv (EP 242236; EP 242246; De Block et al., 1987 EMBO J. 6:2513-2518).

El DNA de reparación introducido puede comprender adicionalmente un gen marcador que permite discriminar mejor entre la integración por recombinación homóloga en el sitio preseleccionado y la integración en cualquier otra parte del genoma. Genes marcadores de este tipo están disponibles en la técnica, e incluyen genes marcadores por cuyo medio la ausencia del gen marcador puede seleccionarse positivamente en condiciones selectivas (v.g. codA, citosina desaminasa de E. coli que confiere sensibilidad a 5-fluoro-citosina, Perera et al. 1993 Plant Mol. Biol. 23, 793; Stougaard (1993) Plant J.: 755). El DNA de reparación tiene que comprender el gen marcador de una manera tal que la integración del DNA de reparación en el genoma nuclear de manera aleatoria da como resultado la presencia del gen marcador, mientras que la integración del DNA de reparación por recombinación homóloga da como resultado la ausencia del gen marcador.

Quedará inmediatamente claro que pueden obtenerse también los mismos resultados utilizando un solo sitio preseleccionado en el que inducir la rotura bicatenaria, que está localizado en o cerca de un gen marcador. Las regiones de homología flanqueantes se seleccionan luego preferiblemente de tal manera que o bien desactivan el gen marcador, o eliminan el gen marcador y se sustituye por el DNA extraño a insertar.

Se apreciará que los medios y métodos de la invención son particularmente útiles para maíz, pero pueden ser utilizados también en otras plantas con efectos similares, particularmente en plantas de cereales que incluyen trigo, avena, cebada, centeno, arroz, césped de hipódromo, sorgo, mijo o caña de azúcar. Los métodos de la invención pueden aplicarse también a cualquier planta, incluyendo, pero sin limitarse a, algodón, tabaco, cánola, colza oleaginosa, soja, hortalizas, patatas, Lemna spp., Nicotiana spp., Arabidopsis, alfalfa, cebada, habichuelas, maíz, algodón, lino, guisante, colza, arroz, centeno, cártamo, sorgo, soja, girasol, tabaco, trigo, espárragos, remolacha, brócoli, col, zanahoria, coliflor, apio, pepino, berenjena, lechuga, cebolla, colza oleaginosa, pimiento, patata, calabaza, rábano, espinaca, calabaza de cuello curvo, tomate, calabacín, almendra, manzana, albaricoque, plátano, mora, arándano común, cacao, cereza, coco, arándano agrio, dátil, uva, pomelo, guayaba, kiwi, limón, lima, mango, melón, nectarina, naranja, papaya, fruto de la pasión, melocotón, cacahuete, pera, piña, pistacho, ciruela, frambuesa, fresa, mandarina, nogal y sandía.

De acuerdo con los métodos de la invención pueden obtenerse células vegetales y plantas que comprenden moléculas de DNA extraño insertadas en sitios preseleccionados. También pueden obtenerse gametos, semillas, embriones, sean cigóticos o somáticos, progenie o híbridos de plantas que comprenden los sucesos de inserción de DNA direccionada, que se producen por métodos de mejora genética tradicionales.

Las plantas obtenidas por los métodos descritos en esta memoria pueden cruzarse adicionalmente por técnicas tradicionales de mejora genética con otras plantas para obtener plantas de progenie que comprenden los sucesos de inserción de DNA direccionada obtenidos de acuerdo con la presente invención.

Los siguientes ejemplos no limitantes describen el diseño de un gen quimérico modificado codificante de I-SceI, y el uso del mismo para insertar DNA extraño en un sitio preseleccionado del genoma vegetal.

A no ser que se indique de otro modo en los ejemplos, todas las técnicas de DNA recombinante se llevan a cabo de acuerdo con protocolos estándar como se describen en Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY y en los Volúmenes 1 y 2 de Ausubel et al. (1994) Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols, USA. Materiales y métodos estándar para trabajo molecular con plantas se describen en Plant Molecular Biology Labfax (1993) por R.D.D. Croy, publicado conjuntamente por BIOS Scientific Publications Ltd (Reino Unido) y Blackwell Scientific Publications, Reino Unido. Otras referencias para técnicas estándar de biología molecular incluyen Sambrook y Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Tercera Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, Volúmenes I y II de Brown (1998) Molecular Biology LabFax, Segunda Edición, Academic Press (UK). Materiales y métodos estándar para las reacciones en cadena de la polimerasa pueden encontrarse en Dieffenbach y Dveksler (1995) PCR Primer: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, y en McPherson et al. (2000) PCR -Basics: From Background to Bench, Primera Edición, Springer Verlag, Alemania.

A lo largo de la descripción y los ejemplos, se hace referencia a las siguientes secuencias:

SEQ ID No 1: secuencia de aminoácidos de una I-SceI quimérica que comprende una señal de localización nuclear enlazada a una proteína I-SceI que carece de los 4 aminoácidos amino-terminales.

SEQ ID No 2: secuencia nucleotídica de la región codificante de I-SceI (código UIPAC).

SEQ ID No 3: secuencia nucleotídica de la región codificante de I-SceI sintética (código UIPAC).

SEQ ID No 4: secuencia nucleotídica de la región codificante de I-SceI sintética.

SEQ ID No 5: secuencia nucleotídica del T-DNA de pTTAM78 (locus diana).

SEQ ID No 6: secuencia nucleotídica del T-DNA de pTTA82 (DNA de reparación).

SEQ ID No 7: secuencia nucleotídica de pCV78.

Tabla 1. (correspondiente a SEC ID 2)

Trinucleótido: AA Trinucleótidos posibles Código UIPAC CONDICIÓN

R1: M ATG ATG

R2: A GCA GCC GCG GCT GCN

R3: K AAA AAG AAR

R4: P CCA CCC CCG CCT CCN

R5: P CCA CCC CCG CCT CCN

R6: K AAA AAG AAR

R7: K AAA AAG AAR

R8: K AAA AAG AAR

R9: R AGA AGG CGA CGC CGG CGT AGR o CGN

R10: K AAA AAG AAR NO AAG

R11: V GTA GTC GTG GTT GTN

R12: N AAC AAT AAY SI R12 AAT NO (R13 ATT O R13 ATA). SI R12 AAC NO (R13 ATT Y R14 AAA) SI R12 AAC NO R13 ATA

R13: I ATA ATC ATT ATH SI R13 ATT NO R14 AAA SI R13 ATA NO R14 AAA

R14: K AAA AAG AAR

R15: K AAA AAG AAR

R16: N AAC AAT AAY

R17: Q CAA CAG CAR NO CAA

R18: V GTA GTC GTG GTT GTN NO GTA

R19: M ATG ATG

R20: N AAC AAT AAY EVITAR ATTTA

R21: L TTA TTG CTA CTC CTG CTT TTR o CTN

R22: G GGA GGC GGG GGT GGN

R23: P CCA CCC CCG CCT CCN SI R23 CCC NO R24 AAT

R24: N AAC AAT AAY

R25: S AGC AGT TCA TCC TCG TCT AGY o TCN

R26: K AAA AAG AAR SI R26 AAA NO (R27 TTG Y R28 CTN)

R27: L TTA TTG CTA CTC CTG CTT TTR o CTN SI R27 (TTA O CTA) NO R28 TTA

Trinucleótido: AA Trinucleótidos posibles Código UIPAC CONDICIÓN

R28: L TTA TTG CTA CTC CTG CTT TTR o CTN

R29: K AAA AAG AAR

R30: E GAA GAG GAR NO GAA

R31: Y TAC TAT TAY SI R31 TAT NO R32 AAA

R32: K AAA AAG AAR

R33: S AGC AGT TCA TCC TCG TCT AGY o TCN SI R33 (TCC O TCG O AGC) NO (R34 CAA Y R35 TTR)

R34: Q CAA CAG CAR SI R34 CAA NO R35 TTA

R35: L TTA TTG CTA CTC CTG CTT TTR o CTN

R36: I ATA ATC ATT ATH

R37: E GAA GAG GAR SI R37 GAA NO R38 TTA

R38: L TTA TTG CTA CTC CTG CTT TTR o CTN

R39: N AAC AAT AAY SI R39 AAT NO R40 (ATT O ATA)

R40: I ATA ATC ATT ATH

R41: E GAA GAG GAR SI R41 GAG NO R42 CAA

R42: Q CAA CAG CAR

R43: F TTC TTT TTY

R44: E GAA GAG GAR

R45: A GCA GCC GCG GCT GCN NO GCA

R46: G GGA GGC GGG GGT GGN

R47: I ATA ATC ATT ATH NO ATT

R48: G GGA GGC GGG GGT GGN SI R48 GGA NO R49 TTA

R49: L TTA TTG CTA CTC CTG CTT TTR o CTN SI R49 TTA NO (R50 ATA Y R51 TTR) SI R49 CTA NO (R50 ATA Y R51 TTR)

R50: I ATA ATC ATT ATH SI R50 ATA NO R51 (CTA O TTG)

R51: L TTA TTG CTA CTC CTG CTT TTR o CTN

R52: G GGA GGC GGG GGT GGN

R53: D GAC GAT GAY

R54: A GCA GCC GCG GCT GCN SI R54 GCA NO R55 TAC

R55: Y TAC TAT TAY SI R55 TAT NO (R56 ATA Y R57 AGR)

R56: I ATA ATC ATT ATH

Trinucleótido: AA Trinucleótidos posibles Código UIPAC CONDICIÓN

R57: R AGA AGG CGA CGC CGG CGT AGR o CGN

R58: S AGC AGT TCA TCC TCG TCT AGY o TCN EVITAR GCAGG

R59: R AGA AGG CGA CGC CGG CGT AGR o CGN

R60: D GAC GAT GAY

R61: E GAA GAG GAR EVITAR AAGGT

R62: G GGA GGC GGG GGT GGN

R63: K AAA AAG AAR

R64: T ACA ACC ACG ACT ACN

R65: Y TAC TAT TAY SI R65 TAT NO R66 TGC

R66: C TGC TGT TGY

R67: M ATG ATG

R68: Q CAA CAG CAR NO CAA

R69: F TTC TTT TTY

R70: E GAA GAG GAR

R71: W TGG TGG

R72: K AAA AAG AAR

R73: N AAC AAT AAY NO AAT

R74: K AAA AAG AAR SI R74 AAA NO R75 GCA

R75: A GCA GCC GCG GCT GCN SI R75 GCA NO R76 TAC

R76: Y TAC TAT TAY

R77: M ATG ATG

R78: D GAC GAT GAY

R79: H CAC CAT CAY

R80: V GTA GTC GTG GTT GTN

R81: C TGC TGT TGY

R82: L TTA TTG CTA CTC CTG CTT TTR o CTN

R83: L TTA TTG CTA CTC CTG CTT TTR o CTN

R84: Y TAC TAT TAY

R85: D GAC GAT GAY SI R85 GAC NO R86 CAA

R86: Q CAA CAG CAR

Trinucleótido: AA Trinucleótidos posibles Código UIPAC CONDICIÓN

R87: W TGG TGG

R88: V GTA GTC GTG GTT GTN

R89: L TTA TTG CTA CTC CTG CTT TTR o CTN

R90: S AGC AGT TCA TCC TCG TCT AGY o TCN

R91: P CCA CCC CCG CCT CCN

R92: P CCA CCC CCG CCT CCN

R93: H CAC CAT CAY SI R93 CAT NO R94 AAA

R94: K AAA AAG AAR

R95: K AAA AAG AAR

R96: E GAA GAG GAR

R97: R AGA AGG CGA CGC CGG CGT AGR o CGN

R98: V GTA GTC GTG GTT GTN

R99: N AAC AAT AAY

R100: H CAC CAT CAY EVITAR ATTTA

R101: L TTA TTG CTA CTC CTG CTT TTR o CTN

R102: G GGA GGC GGG GGT GGN SI R102 GGC NO R103 AAT

R103: N AAC AAT AAY EVITAR ATTTA

R104: L TTA TTG CTA CTC CTG CTT TTR o CTN

R105: V GTA GTC GTG GTT GTN

R106: I ATA ATC ATT ATH

R107: T ACA ACC ACG ACT ACN

R108: W TGG TGG

R109: G GGA GGC GGG GGT GGN

R110: A GCA GCC GCG GCT GCN

R111: Q CAA CAG CAR

R112: T ACA ACC ACG ACT ACN EVITAR ATTTA

R113: F TTC TTT TTY

R114: K AAA AAG AAR SI R114 AAG NO R115 CAT

R115: H CAC CAT CAY

R116: Q CAA CAG CAR SI R116 CAA NO R117 GCA

Trinucleótido: AA Trinucleótidos posibles Código UIPAC CONDICIÓN

R117: A GCA GCC GCG GCT GCN EVITAR ATTTA

R118: F TTC TTT TTY

R119: N AAC AAT AAY NO AAT

R120: K AAA AAG AAR SI R120 AAA NO R121 TTG

R121: L TTA TTG CTA CTC CTG CTT TTR o CTN

R122: A GCA GCC GCG GCT GCN SI R122 GCC NO R123 AAT

R123: N AAC AAT AAY EVITAR ATTTA

R124: L TTA TTG CTA CTC CTG CTT TTR o CTN

R125: F TTC TTT TTY

R126: I ATA ATC ATT ATH

R127: V GTA GTC GTG GTT GTN

R128: N AAC AAT AAY SI R128 AAT NO R129 AAT

R129: N AAC AAT AAY NO AAT

R130: K AAA AAG AAR

R131: K AAA AAG AAR

R132: T ACA ACC ACG ACT ACN

R133: I ATA ATC ATT ATH

R134: P CCA CCC CCG CCT CCN SI R134 CCC NO R135 AAT

R135: N AAC AAT AAY SI R135 AAT NO R136 AAT

R136: N AAC AAT AAY EVITAR ATTTA

R137: L TTA TTG CTA CTC CTG CTT TTR o CTN

R138: V GTA GTC GTG GTT GTN

R139: E GAA GAG GAR

R140: N AAC AAT AAY

R141: Y TAC TAT TAY EVITAR ATTTA

R142: L TTA TTG CTA CTC CTG CTT TTR o CTN

R143: T ACA ACC ACG ACT ACN

R144: P CCA CCC CCG CCT CCN NO CCA

R145: M ATG ATG

R146: S AGC AGT TCA TCC TCG TCT AGY o TCN SI R146 TCA NO R147 TTG

Trinucleótido: AA Trinucleótidos posibles Código UIPAC CONDICIÓN

R147: L TTA TTG CTA CTC CTG CTT TTR o CTN

R148: A GCA GCC GCG GCT GCN

R149: Y TAC TAT TAY NO TAT

R150: W TGG TGG

R151: F TTC TTT TTY

R152: M ATG ATG

R153: D GAC GAT GAY

R154: D GAC GAT GAY

R155: G GGA GGC GGG GGT GGN

R156: G GGA GGC GGG GGT GGN

R157: K AAA AAG AAR

R158: W TGG TGG

R159: D GAC GAT GAY

R160: Y TAC TAT TAY

R161: N AAC AAT AAY NO AAT

R162: K AAA AAG AAR SI R162 AAA NO (R163 AAT Y R164 AGY)

R163: N AAC AAT AAY

R164: S AGC AGT TCA TCC TCG TCT AGY o TCN SI R164 TCA NO (R165 ACC Y R166 AAY)

R165: T ACA ACC ACG ACT ACN SI R165 ACC NO R166 AAT

R166: N AAC AAT AAY NO AAT

R167: K AAA AAG AAR SI R167 AAA R168 NO TCA O R168 NO AGC

R168: S AGC AGT TCA TCC TCG TCT AGY o TCN

R169: I ATA ATC ATT ATH

R170: V GTA GTC GTG GTT GTN SI R170 GTA NO R171 TTA

R171: L TTA TTG CTA CTC CTG CTT TTR o CTN

R172: N AAC AAT AAY SI R172 AAT NO R173 ACA

R173: T ACA ACC ACG ACT ACN SI R173 (ACC O ACG) NO (R174 CAA Y R175 TCN)

R174: Q CAA CAG CAR

Trinucleótido: AA Trinucleótidos posibles Código UIPAC CONDICIÓN

R175: S AGC AGT TCA TCC TCG TCT AGY o TCN EVITAR ATTTA

R176: F TTC TTT TTY

R177: T ACA ACC ACG ACT ACN

R178: F TTC TTT TTY

R179: E GAA GAG GAR

R180: E GAA GAG GAR

R181: V GTA GTC GTG GTT GTN

R182: E GAA GAG GAR SI R182 GAA NO (R183 TAT Y R184 TTR)

R183: Y TAC TAT TAY EVITAR ATTTA

R184: L TTA TTG CTA CTC CTG CTT TTR o CTN

R185: V GTA GTC GTG GTT GTN

R186: K AAA AAG AAR

R187: G GGA GGC GGG GGT GGN SI R187 GGA NO (R188 TTG Y R189 CGN)

R188: L TTA TTG CTA CTC CTG CTT TTR o CTN

R189: R AGA AGG CGA CGC CGG CGT AGR o CGN SI R189 CGC NO R190 AAT

R190: N AAC AAT AAY NO AAT

R191: K AAA AAG AAR

R192: F TTC TTT TTY SI R192 TTC NO (R193 CAA Y R194 TTR)

R193: Q CAA CAG CAR SI R193 CAA NO R194 TTA

R194: L TTA TTG CTA CTC CTG CTT TTR o CTN

R195: N AAC AAT AAY SI R195 AAT NO R196 TGC

R196: C TGC TGT TGY

R197: Y TAC TAT TAY

R198: V GTA GTC GTG GTT GTN

R199: K AAA AAG AAR NO AAA

R200: I ATA ATC ATT ATH SI R200 ATT NO R201 AAT NO ATA

R201: N AAC AAT AAY NO AAT

Trinucleótido: AA Trinucleótidos posibles Código UIPAC CONDICIÓN

R202: K AAA AAG AAR SI R202 AAA NO R203 AAT

R203: N AAC AAT AAY NO AAT

R204: K AAA AAG AAR

R205: P CCA CCC CCG CCT CCN NO CCA SI R205 CCG NO R206 ATA

R206: I ATA ATC ATT ATH SI R206 ATA NO R207 ATA

R207: I ATA ATC ATT ATH SI R207 ATA NO R208 TAC NO ATT

R208: Y TAC TAT TAY

R209: I ATA ATC ATT ATH

R210: D GAC GAT GAY

R211: S AGC AGT TCA TCC TCG TCT AGY o TCN

R212: M ATG ATG

R213: S AGC AGT TCA TCC TCG TCT AGY o TCN

R214: Y TAC TAT TAY EVITAR ATTTA

R215: L TTA TTG CTA CTC CTG CTT TTR o CTN SI R215 (TTA O CTA) NO R216 ATA

R216: I ATA ATC ATT ATH

R217: F TTC TTT TTY

R218: Y TAC TAT TAY

R219: N AAC AAT AAY EVITAR ATTTA

R220: L TTA TTG CTA CTC CTG CTT TTR o CTN SI R220 (TTA O CTA) NO R221 ATT SI R220 (TTA O CTA) NO R221 ATC

R221: I ATA ATC ATT ATH SI R221 ATT NO R222 AAA NO ATA

R222: K AAA AAG AAR

R223: P CCA CCC CCG CCT CCN

R224: Y TAC TAT TAY EVITAR ATTTA

R225: L TTA TTG CTA CTC CTG CTT TTR o CTN

R226: I ATA ATC ATT ATH

R227: P CCA CCC CCG CCT CCN

R228: Q CAA CAG CAR

Trinucleótido: AA Trinucleótidos posibles Código UIPAC CONDICIÓN

R229: M ATG ATG

R230: M ATG ATG

R231: Y TAC TAT TAY SI R231TAT NO R232 AAA

R232: K AAA AAG AAR SI R232 AAA NO R233 TTG

R233: L TTA TTG CTA CTC CTG CTT TTR o CTN

R234: P CCA CCC CCG CCT CCN SI 234 CCC NO R235 AAT

R235: N AAC AAT AAY SI R235 AAT NO R236 ACA SI R235 AAT NO R236 ACT

R236: T ACA ACC ACG ACT ACN SI R236 ACA NO (R237 ATA Y R238 AGY)

R237: I ATA ATC ATT ATH

R238: S AGC AGT TCA TCC TCG TCT AGY o TCN

R239: S AGC AGT TCA TCC TCG TCT AGY o TCN

R240: E GAA GAG GAR

R241: T ACA ACC ACG ACT ACN

R242: F TTC TTT TTY

R243: L TTA TTG CTA CTC CTG CTT TTR o CTN

R244: K AAA AAG AAR

Tabla 2. (correspondiente a SEC ID Nº 3)

Trinucleótido: AA Opciones UIPAC CONDICIÓN I-SceI ejemplificada (SEC ID Nº 4)

R1: M ATG ATG ATG

R2: A GCC GCT GCY GCC

R3: K AAA AAG AAR AAG

R4: P CCA CCC CCT CCH CCT

R5: P CCA CCC CCT CCH CCC

R6: K AAA AAG AAR AAG

R7: K AAA AAG AAR AAG

R8: K AAA AAG AAR AAG

R9: R AGA CGC CGG AGA o CGS CGC

R10: K AAA AAA AAA

R11: V GTC GTG GTS GTG

R12: N AAC AAC AAC

R13: I ATC ATT ATY ATC

R14: K AAA AAG AAR AAG

R15: K AAA AAG AAR AAG

R16: N AAC AAC AAC

R17: Q CAG CAG CAG

R18: V GTC GTG GTS GTG

R19: M ATG ATG ATG

R20: N AAC AAC AAC

R21: L CTC CTG CTS CTG

R22: G GGC GGA GGM GGA

R23: P CCA CCC CCT CCH CCT

R24: N AAC AAC AAC

R25: S AGC TCA TCC AGC o TCM AGC

R26: K AAA AAG AAR AAG

R27: L CTC CTG CTS CTC

R28: L CTC CTG CTS CTG

R29: K AAA AAG AAR AAG

R30: E GAG GAG GAG

R31: Y TAC TAC TAC

R32: K AAA AAG AAR AAG

R33: S AGC TCA TCC AGC o TCM AGC

R34: Q CAA CAG CAR CAG

R35: L CTC CTG CTS CTG

R36: I ATC ATT ATY ATC

R37: E GAA GAG GAR GAA

R38: L CTC CTG CTS CTG

R39: N AAC AAC AAC

R40: I ATC ATT ATY ATC

R41: E GAA GAG GAR SI R41 GAG NO R42 CAA GAG

R42: Q CAA CAG CAR CAG

R43: F TTC TTC TTC

R44: E GAA GAG GAR GAA

R45: A GCC GCT GCY GCT

R46: G GGC GGA GGM GGC

R47: I ATC ATC ATC

R48: G GGC GGA GGM GGC

R49: L CTC CTG CTS CTG

R50: I ATC ATT ATY ATC

R51: L CTC CTG CTS CTG

R52: G GGC GGA GGM GGC

R53: D GAC GAT GAY GAT

R54: A GCC GCT GCY GCC

R55: Y TAC TAC TAC

R56: I ATC ATT ATY ATC

R57: R AGA CGC CGG AGA o CGS AGA

R58: S AGC TCA TCC AGC o TCM TCC

R59: R AGA CGC CGG AGA o CGS CGG

R60: D GAC GAT GAY GAC

R61: E GAA GAG GAR GAA

R62: G GGC GGA GGM GGC

R63: K AAA AAG AAR AAG

R64: T ACC ACT ACY ACC

R65: Y TAC TAC TAC

R66: C TGC TGT TGY TGC

R67: M ATG ATG ATG

R68: Q CAG CAG CAG

R69: F TTC TTC TTC

R70: E GAA GAG GAR GAG

R71: W TGG TGG TGG

R72: K AAA AAG AAR AAG

R73: N AAC AAC AAC

R74: K AAA AAG AAR AAG

R75: A GCC GCT GCY GCC

R76: Y TAC TAC TAC

R77: M ATG ATG ATG

R78: D GAC GAT GAY GAC

R79: H CAC CAT CAY CAC

R80: V GTC GTG GTS GTG

R81: C TGC TGT TGY TGT

R82: L CTC CTG CTS CTG

R83: L CTC CTG CTS CTG

R84: Y TAC TAC TAC

R85: D GAC GAT GAY SI R85 GAC NO R86 CAA GAC

R86: Q CAA CAG CAR CAG

R87: W TGG TGG TGG

R88: V GTC GTG GTS GTC

R89: L CTC CTG CTS CTG

R90: S AGC TCA TCC AGC o TCM AGC

R91: P CCA CCC CCT CCH CCT

R92: P CCA CCC CCT CCH CCT

R93: H CAC CAT CAY SI R93 CAT NO R94 AAA CAC

R94: K AAA AAG AAR AAG

R95: K AAA AAG AAR AAG

R96: E GAA GAG GAR GAG

R97: R AGA CGC CGG AGA o CGS CGC

R98: V GTC GTG GTS GTG

R99: N AAC AAC AAC

R100: H CAC CAT CAY CAT

R101: L CTC CTG CTS CTG

R102: G GGC GGA GGM GGC

R103: N AAC AAC AAC

R104: L CTC CTG CTS CTC

R105: V GTC GTG GTS GTG

R106: I ATC ATT ATY ATC

R107: T ACC ACT ACY ACC

R108: W TGG TGG TGG

R109: G GGC GGA GGM GGA

R110: A GCC GCT GCY GCC

R111: Q CAA CAG CAR CAG

R112: T ACC ACT ACY ACC

R113: F TTC TTC TTC

R114: K AAA AAG AAR SI R114 AAG NO R115 CAT AAG

R115: H CAC CAT CAY CAC

R116: Q CAA CAG CAR CAG

R117: A GCC GCT GCY GCC

R118: F TTC TTC TTC

R119: N AAC AAC AAC

R120: K AAA AAG AAR AAG

R121: L CTC CTG CTS CTG

R122: A GCC GCT GCS GCC

R123: N AAC AAC AAC

R124: L CTC CTG CTS CTG

R125: F TTC TTC TTC

R126: I ATC ATT ATY ATC

R127: V GTC GTG CTS GTG

R128: N AAC AAC AAC

R129: N AAC AAC AAC

R130: K AAA AAG AAR AAG

R131: K AAA AAG AAR AAG

R132: T ACC ACT ACY ACC

R133: I ATC ATT ATY ATC

R134: P CCA CCC CCT CCH CCC

R135: N AAC AAC AAC

R136: N AAC AAC AAC

R137: L CTC CTG CTS CTC

R138: V GTC GTG GTS GTG

R139: E GAA GAG GAR GAG

R140: N AAC AAC AAC

R141: Y TAC TAC TAC

R142: L CTC CTG CTS CTC

R143: T ACC ACT ACY ACT

R144: P CCC CCT CCY CCC

R145: M ATG ATG ATG

R146: S AGC TCA TCC AGC TCM o AGC

R147: L CTC CTG CTS CTG

R148: A GCC GCT GCY GCC

R149: Y TAC TAC TAC

R150: W TGG TGG TGG

R151: F TTC TTC TTC

R152: M ATG ATG ATG

R153: D GAC GAT GAY GAC

R154: D GAC GAT GAY GAC

R155: G GGC GGA GGM GGA

R156: G GGC GGA GGM GGC

R157: K AAA AAG AAR AAG

R158: W TGG TGG TGG

R159: D GAC GAT GAY GAC

R160: Y TAC TAC TAC

R161: N AAC AAC AAC

R162: K AAA AAG AAR AAG

R163: N AAC AAC AAC

R164: S AGC TCA TCC AGC TCM o SI R164 TCA NO R165 ACC AGC

R165: T ACC ACT ACY ACC

R166: N AAC AAC AAC

R167: K AAA AAG AAR SI R167 AAA R168 NO TCA o R168 NO AGC AAG

R168: S AGC TCA TCC AGC o TCM TCA

R169: I ATC ATT ATY ATT

R170: V GTC GTG GTS GTG

R171: L CTC CTG CTS CTG

R172: N AAC AAC AAC

R173: T ACC ACT ACY SI R173 ACC NO (R174 CAA Y R175 TCN) ACC

R174: Q CAA CAG CAR CAA

R175: S AGC TCA TCC AGC o TCM AGC

R176: F TTC TTC TTC

R177: T ACC ACT ACY ACC

R178: F TTC TTC TTC

R179: E GAA GAG GAR GAA

R180: E GAA GAG GAR GAA

R181: V GTC GTG GTS GTG

R182: E GAA GAG GAR GAG

R183: Y TAC TAC TAC

R184: L CTC CTG CTS CTC

R185: V GTC GTG GTS GTC

R186: K AAA AAG AAR AAG

R187: G GGC GGA GGM GGC

R188: L CTC CTG CTS CTG

R189: R AGA CGC CGG AGA o CGS CGC

R190: N AAC AAC AAC

R191: K AAA AAG AAR AAG

R192: F TTC TTC TTC

R193: Q CAA CAG CAR CAG

R194: L CTC CTG CTS CTG

R195: N AAC AAC AAC

R196: C TGC TGT TGY TGC

R197: Y TAC TAC TAC

R198: V GTC GTG GTS GTG

R199: K AAG AAG AAG

R200: I ATC ATT ATY ATC

R201: N AAC AAC AAC

R202: K AAA AAG AAR AAG

R203: N AAC AAC AAC

R204: K AAA AAG AAR AAG

R205: P CCC CCT CCY CCT

R206: I ATC ATT ATY ATC

R207: I ATC ATC ATC

R208: Y TAC TAC TAC

R209: I ATC ATT ATY ATC

R210: D GAC GAT GAY GAC

R211: S AGC TCA TCC AGC o TCM AGC

R212: M ATG ATG ATG

R213: S AGC TCA TCC AGC o TCM AGC

R214: Y TAC TAC TAC

R215: L CTC CTG CTS CTG

R216: I ATC ATT ATY ATC

R217: F TTC TTC TTC

R218: Y TAC TAC TAC

R219: N AAC AAC AAC

R220: L CTC CTG CTS CTG

R221: I ATC ATT ATY SI R221 ATT NO R222 AAA ATC

R222: K AAA AAG AAR AAG

R223: P CCA CCC CCT CCH CCA

R224: Y TAC TAC TAC

R225: L CTC CTG CTS CTG

R226: I ATC ATT ATY ATC

R227: P CCA CCC CCT CCH CCT

R228: Q CAA CAG CAR CAG

R229: M ATG ATG ATG

R230: M ATG ATG ATG

R231: Y TAC TAC TAC

R232: K AAA AAG AAR AAG

R233: L CTC CTG CTS CTG

R234: P CCA CCC CCT CCH CCC

R235: N AAC AAC AAC

R236: T ACC ACT ACY ACC

R237: I ATC ATT ATY ATC

R238: S AGC TCA TCC AGC o TCM AGC

R239: S AGC TCA TCC AGC o TCM AGC

R240: E GAA GAG GAR GAG

R241: T ACC ACT ACY ACC

R242: F TTC TTC TTC

R243: L CTC CTG CTS CTG

R244: K AAA AAG AAR AAG

Ejemplos

Ejemplo 1: Diseño, síntesis y análisis de un gen quimérico expresable en plantas que codifica I-SceI.

La región codificante de I-SceI en la cual se han reemplazado los 4 aminoácidos amino terminales por una señal de 5 localización nuclear se optimizó utilizando el proceso siguiente:

1.: Cambiar los codones al uso de codones más preferido para maíz sin alterar la secuencia de aminoácidos de la proteína I-SceI, utilizando el equipo Synergy Geneoptimizer™;

2.: Ajustar la secuencia para crear o eliminar sitios de restricción específicos para cambiar la región codificante de I-SceI sintética con el gen de I-SceI de código universal;

10 3. Eliminar todos los tramos GC más largos que 6 pb y los tramos AT más largos que 4 pb, para evitar la formación de estructuras de RNA secundarias que pueden efectuar el corte y empalme de pre-mRNA;

4.: Evitar dobletes CG y TA en las posiciones de los codones 2 y 3;

5.: Evitar otros elementos reguladores, tales como posibles señales prematuras de poliadenilación (GATAAT,

TATAAA, AATATA, AATATT, GATAAA, AATGAA, AATAAG, AATAAA, AATAAT, AACCAA, ATATAA, AATCAA, 15 ATACTA, ATAAAA, ATGAAA, AAGCAT, ATTAAT, ATACAT, AAAATA, ATTAAA, AATTAA, AATACA y CATAAA), sitios de corte y empalme de intrones crípticos (AAGGTAAGT y TGCAGG), pentámeros ATTTA y secuencias de la caja CCAAT (CCAAT, ATTGG, CGAAT y ATTGC);

6. Comprobar de nuevo si la región codificante adaptada cumple la totalidad de los criterios arriba mencionados.

Un posible ejemplo de una secuencia nucleotídica de este tipo se representa en SEQ ID No 4. Un fragmento de DNA sintético que tenía la secuencia nucleotídica de SEQ ID No 4 se sintetizó y se enlazó operativamente a un promotor CaMV35S y una señal de terminación y poliadenilación en 3’ de CaMV35S (produciendo el plásmido pCV78; SEQ ID No 7).

La región codificante de I-SceI sintética se clonó también en un vector de expresión bacteriano (como una proteína de fusión que permitía el enriquecimiento de la proteína en perlas de amilosa). Se comprobó la capacidad de la proteína I-SceI semi-purificada para escindir in vitro un plásmido que contuviera un sitio de reconocimiento de I-SceI.

Ejemplo 2. Aislamiento de líneas de células de maíz que contienen un gen bar sin promotor precedido por un sitio I-SceI.

Con objeto de desarrollar un ensayo para la recombinación mediada por homología inducida por la rotura de DNA bicatenario, se aislaron suspensiones de células de maíz que contenían un gen bar sin promotor precedido por un sitio de reconocimiento de I-SceI integrado en el genoma nuclear en una sola copia. Con la inducción de la rotura del DNA bicatenario por suministro de un gen quimérico expresable en plantas que codifica la endonucleasa I-SceI, y el suministro simultáneo de DNA de reparación que comprende un promotor 35S de CaMV enlazado operativamente al extremo 5’ del gen bar, se puede insertar el promotor 35S por inserción del DNA direccionada mediada por homología, dando como resultado un gen bar funcional que confiere resistencia a fosfinotricina (PPT). El ensayo se representa esquemáticamente en la Figura 1.

Se construyó el locus diana enlazando operativamente mediante técnicas convencionales de clonación las regiones de DNA siguientes:

a) una señal de terminación y poliadenilación en el extremo 3’ del gen de nopalina-sintetasa

b) una región de DNA codificante de bar sin promotor

c) una región de DNA que comprendía un sitio de reconocimiento de I-SceI

d) una señal de terminación y poliadenilación en el extremo 3’ del gen 7 de A. tumefaciens (3’g7)

e) un gen de resistencia a neomicina expresable en plantas que comprende un promotor de nopalinasintetasa, un gen de neomicina-fosfotransferasa, y una señal 3’ ocs.

Esta región de DNA se insertó en un vector de T-DNA entre los límites del T-DNA. El vector de T-DNA se designó pTTAM78 (para la secuencia nucleotídica del T-DNA véase SEQ ID No 5).

El vector de T-DNA se utilizó directamente para transformar protoplastos de maíz de acuerdo con los métodos descritos en EP 0469273, utilizando una suspensión de células de maíz derivada de He89. El vector T-DNA se introdujo también en Agrobacterium tumefaciens C58C1Rif(pEHA101) y la cepa de Agrobacterium resultante se utilizó para transformar una línea de células derivada de He89. Se identificaron varias líneas diana que contenían una sola copia del constructo del locus diana pTTAM78, tales como T24 (obtenida por transformación de protoplastos) y las líneas 14-1 y 1-20 (obtenidas por transformación mediada por Agrobacterium).

Se establecieron suspensiones de células a partir de estas líneas diana en un medio de suspensión de células N6M, y se hicieron crecer en presencia de luz en un agitador (120 rpm) a 25ºC. Las suspensiones se subcultivaron cada semana.

Ejemplo 3: Inserción direccionada basada en homología

El DNA de reparación pTTA82 es un vector de T-DNA que contiene entre los límites del T-DNA las siguientes regiones de DNA enlazadas operativamente:

a) una región de DNA que codifica solamente la parte amino terminal del gen bar

b) una región de DNA que comprende un sitio de reconocimiento parcial de I-SceI (13 nucleótidos localizados en el extremo -5’ del sitio de reconocimiento)

c) una región promotora 35S de CaMV

d) una región de DNA que comprende un sitio de reconocimiento parcial de I-SceI (9 nucleótidos localizados en el extremo 3’ del sitio de reconocimiento)

e) una señal de terminación y de poliadenilación en el extremo 3’ del gen 7 de A. tumefaciens (3’g7)

f) un gen quimérico de resistencia a neomicina expresable en plantas

g) un gen que codifica una endonucleasa I-SceI defectuosa, bajo control de un promotor 35S de CaMV

La secuencia nucleotídica del T-DNA de pTTA82 se representa en SEQ ID No 6.

5 Este DNA de reparación se suministró juntamente con pCV78 (véase el Ejemplo 1) por bombardeo con partículas en células derivadas de suspensión que se extendieron en placas sobre papel de filtro como una capa delgada. El papel de filtro se extendió sobre sustrato Mahq1 VII.

El DNA se bombardeó a las células utilizando un dispositivo PDS-1000/He Biolistics. La preparación de los microvehículos y el recubrimiento del DNA sobre los microvehículos se realizó esencialmente como ha sido descrito 10 por Sanford et al. 1992. Los parámetros del bombardeo de partículas fueron: distancia a la diana 9 cm; presión de bombardeo de 1350 psi (94,8 kg/cm2), distancia de salto de ¼” (6,35 mm) y distancia de vuelo del macrovehículo 11 cm. Inmediatamente después del bombardeo, el tejido se transfirió al sustrato no selectivo Mhi1VII. Como control para el suministro con éxito del DNA por bombardeo con partículas, las tres líneas diana se bombardearon también con microvehículos recubiertos con DNA plasmídico que comprendía un gen bar quimérico bajo el control de un

15 promotor CaMV35S (pRVA52).

Cuatro días después del bombardeo, los filtros se transfirieron a un sustrato Mh1 VII complementado con 25 mg/l de PPT o sobre sustrato Ahx1.5VIIino1000 complementado con 50 mg/l de PPT.

Catorce días después, los filtros se transfirieron sobre medio Mh1 VII nuevo con 10 mg/l de PPT para las líneas diana T24 y 14-1, y sustrato Mh1 VII con 25 mg/l de PPT para la línea diana 1-20.

20 Dos semanas después, se registraron los sucesos potenciales de inserción direccionada basándose en su resistencia a PPT. Estos sucesos resistentes a PPT fueron también positivos en el test Liberty Link de Hojas/Semillas de Maíz (Strategic Diagnostics Inc.).

Número de callos resistentes a PPT 38 días después del bombardeo:

Línea diana: pRVA52 pTTA82+pCV78

Número total de sucesos PPTR: Número medio de sucesos PPTR/cápsula Petri Número total de sucesos PPTR Número medio de sucesos PPTR/cápsula Petri

1-20: 75 25 115 7,6

14-1: 37 12,3 38 2,2

24: 40 13,3 2 0,13

25 Los sucesos resistentes a PPT se subcultivaron ulteriormente en sustrato Mh1 VII que contenía 10 mg/l de PTT, y se utilizó material de callo para el análisis molecular. Se analizaron 20 candidatos independientes TSI mediante análisis Southern utilizando el promotor 35S y la señal de poliadenilación y de terminación en el extremo 3’ del gen de nopalina-sintasa como sonda. Basándose en el tamaño del fragmento esperado, todos los sucesos parecían ser sucesos de inserción de secuencia direccionada perfectos. Además, el análisis ulterior de aproximadamente la mitad

30 de los sucesos de inserción de secuencia direccionada no mostró integración adicional no direccionada del DNA de reparación o el DNA codificante de I-SceI.

El análisis de secuencias de DNA amplificado a partir de ocho de los sucesos de inserción direccionada demostró que estos sucesos fueron de hecho sucesos TSI perfectos basados en recombinación homóloga.

Basándose en estos datos, la relación de inserción de DNA basada en recombinación homóloga frente a la

35 recombinación “normal” ilegítima varía desde aproximadamente 30% para 1-20 hasta aproximadamente 17% para 14-1 y hasta aproximadamente 1% para 24.

Cuando se utilizan vectores similares a los descritos en Puchta et al. 1996 (más arriba) suministrados por electroporación a protoplastos de tabaco en presencia de roturas de DNA bicatenario inducidas por I-SceI, la relación de inserción de DNA basada en recombinación homóloga frente a inserción normal fue aproximadamente 40 15%. Sin embargo, solamente uno de 33 sucesos caracterizados fue un suceso de inserción de secuencia direccionada mediada por homología, con lo cual la recombinación homóloga fue perfecta a ambos lados de la

rotura bicatenaria.

Utilizando los vectores del Ejemplo 2, pero con un “constructo de I-SceI de código universal” que comprende una señal de localización nuclear, la relación de inserción de DNA basada en HR frente a inserción normal varió entre 0,032% y 16% para líneas diana diferentes, utilizando tanto electroporación como suministro de DNA mediado por

5 Agrobacterium. La frecuencia relativa de sucesos de inserción direccionada perfectos difirió entre las diferentes líneas diana, y varió desde 8 hasta 70% para el suministro de DNA mediado por electroporación, y entre 73 y 90% para suministro de DNA mediado por Agrobacterium.

Ejemplo 4. La preincubación con acetosiringona mejora la frecuencia de recuperación de los sucesos de inserción direccionada.

10 Una semana antes del bombardeo como se describe en el Ejemplo 3, se diluyeron suspensiones de células en medio N6M o en medio LSIDhy1.5 complementado con acetosiringona 200 µM. En caso contrario, se utilizó el método como se describe en el Ejemplo 3. Como puede verse por los resultados resumidos en la tabla siguiente, la preincubación de las células a transformar con acetosiringona tuvo un efecto beneficioso sobre la recuperación de sucesos de inserción resistente a PPT direccionada.

Línea diana: Preincubación con acetosiringona Sin preincubación

1-20: 89 7,6 26 3,7

14-1: 32 3,6 6 0,75

24: 0 0 2 0,3

Ejemplo 5: Inserción de la secuencia direccionada mediada por DSB en maíz por suministro de DNA de reparación mediado por Agrobacterium

Para realizar la inserción de secuencia direccionada mediada por DSB en el maíz, con lo cual el DNA de reparación es suministrado por transformación mediada por Agrobacterium, se construyeron vectores de T-DNA similares a

20 pTTA82 (véase Ejemplo 3), en los cuales la I-SceI defectuosa se reemplazó por el gen sintético codificante de I-SceI del Ejemplo 1. El vector de T-DNA contenía adicionalmente una copia de Agrobacterium tumefaciens virG y virC (pTCV83) o virG, virCy virB (pTCV87) fuera de los límites del T-DNA. Estos vectores de T-DNA se insertaron en LBA4404, que contenía el plásmido Ti adyuvante pAL4404, produciendo las cepas de Agrobacterium A4995 y A4996, respectivamente.

25 Cultivos en suspensión de las líneas de células diana del Ejemplo 2, así como otras líneas de células diana obtenidas de manera similar a la descrita en el Ejemplo 2, se cultivaron conjuntamente con las cepas de Agrobacterium, y se extendieron después en varias placas. El número de extensiones en placa se determinó por la densidad de la suspensión de células. Como control para la eficiencia de transformación, se cultivaron conjuntamente la suspensión de células en un experimento paralelo con una cepa de Agrobacterium LBA4404 que

30 contenía el plásmido Ti adyuvante pAL4404 y un vector de T-DNA con un gen quimérico de resistencia a fosfinotricina (gen bar) bajo control de un vector 35S de CaMV. El vector de T-DNA contenía adicionalmente una copia de los genes de Agrobacterium tumefaciens virG, virC y virD, fuera del límite de T-DNA. Los resultados de cuatro experimentos independientes diferentes se resumen en las tablas siguientes:

Experimento I con Agrobacterium:

Línea diana: Control A4495

No. de
No. de
No. de: No. de sucesos de

extensiones en: transformantes extensiones en TSI

placa: placa(1)

T24: 26 10 32 0

T26: 36 44 36 1

14-1: 20 18 28 0

T1 F155: 26 7 24 0

Experimento II con Agrobacterium:

Línea diana: Control A4495

No. de
No. de
No. de: No. de sucesos de

extensiones en: transformantes extensiones en TSI

placa: placa(1)

1-20: 18 ~200 27 11

T79: 24 ~480 24 6

T66: 26 73 31 0

T5: 28 35 18 0

T1 F154: 22 65 16 1

Experimento III con Agrobacterium: Línea diana Control A4495

No. de No. de No. de extensiones No. de sucesos extensiones en transformantes en placa(1) de TSI placa T24 5 ~2250 30 1 T26 44 ~220 32 1 14-1 20 ~1020 13 1 T1 F155 3 ~1870 32 0

Experimento IV con Agrobacterium: Línea diana Control A4495

No. de No. de No. de No. de sucesos de

extensiones en transformantes extensiones en TSI placa placa(1)

T1 F154 28 1

T5 12~600 28 1

T66 280

T79 240

1-20 18 ~400 40 9

Por consiguiente, está claro que, si bien el suministro de DNA de reparación mediado por Agrobacterium es claramente factible, la frecuencia de sucesos de Inserción de Secuencia Direccionada (TSI) es menor en comparación con el suministro de DNA de reparación mediado por bombardeo con partículas. El análisis Southern

5 realizado sobre 23 sucesos de TSI supuestos demostraron que 20 sucesos de TSI son perfectos, basándose en el tamaño del fragmento. Sin embargo, en contraste con sucesos obtenidos por bombardeo con microproyectiles como en el Ejemplo 3, únicamente 6 sucesos de 20 no contenían insertos adicionales del DNA de reparación, 9 sucesos contenían 1 a 3 insertos adicionales del DNA de reparación, y 5 sucesos contenían muchos insertos adicionales del DNA de reparación.

10 El suministro mediado por bombardeo con partículas de DNA de reparación da también como resultado una mejor calidad de los sucesos de TSI mediados por DSB, comparado con el suministro del DNA de reparación por Agrobacterium. Esto contrasta con el suministro mediado por bombardeo con partículas de “DNA transformante normal”, que se caracteriza por la menor calidad de los transformantes (patrón de integración complejo) en comparación con la transformación mediada por Agrobacterium.

15 Esto indica que la calidad de los transformantes obtenidos por bombardeo con partículas u otros métodos de suministro directo de DNA puede mejorarse por inserción de secuencias mediada por DSB. Este resultado se confirma también por el experimento siguiente: con la inserción de secuencia direccionada de un promotor 35S mediada por DSB, en ausencia de secuencias flanqueantes con homología para el locus diana en el DNA de reparación, se observó que, con el suministro de DNA de reparación mediado por electroporación, solamente una

20 minoría de los sucesos de TSI contenían inserciones adicionales no direccionadas de promotor 35S (2 sucesos de TSI de un total de 16 sucesos de TSI analizados muestran una o unas inserciones adicionales aleatorias del promotor 35S). En contraste, la inserción aleatoria del promotor 35S era considerablemente mayor en los sucesos de TSI obtenidos por suministro del promotor 35S mediado por Agrobacterium (17 de 22 sucesos de TSI analizados mostraban una o unas inserciones adicionales aleatorias del promotor 35S).

25 Ejemplo 6: Composición de los medios

Mahq1VII: Medio N6 (Chu et al. 1975) complementado con 100 mg/l de hidrolizado de caseína, L-prolina 6 mM, 0,5 g/l de ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico (MES), manitol 0,2 M, sorbitol 0,2 M, 2% de sacarosa, 1 mg/l de ácido 2,4diclorofenoxi-acético (2,4-D), ajustado a pH 5,8, solidificado con 2,5 g/l de Gelrite®.

Mhi1VII: Medio N6 (Chu et al. 1975) complementado con 0,5 g/l de ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico (MES),

30 manitol 0,2 M, 2% de sacarosa, 1 mg/l de ácido 2,4-diclorofenoxi-acético (2,4-D), ajustado a pH 5,8 y solidificado con 2,5 g/l de Gelrite®.

Mh1VII: Igual que el sustrato Mhi1VII, pero sin manitol 0,2 M.

Ahx1.5VIIino1000: Sales MS, complementadas con 1000 mg/l de mio-inositol, 0,1 mg/l de hidrocloruro de tiamina, 0,5 mg/l de ácido nicotínico, 0,5 mg/l de hidrocloruro de piridoxina, 0,5 g/l de MES, 30 g/l de sacarosa, 10 g/l de

35 glucosa, 1,5 mg/l de 2,4-D, ajustado a pH 5,8 y solidificado con 2,5 g/l de Gelrite®.

LSIDhy1.5: Sales MS complementadas con 0,5 mg/l de ácido nicotínico, 0,5 mg/l de hidrocloruro de piridoxina, 1 mg/l de hidrocloruro de tiamina, 100 mg/l de mio-inositol, L-prolina 6 mM, 0,5 g/l de MES, 20 g/l de sacarosa, 10 g/l de glucosa, 1,5 mg/l de 2,4-D, ajustado a pH 5,2.

N6M: Macro-elementos: 2830 mg/l de KNO3; 433 mg/l de (NH4)2SO4; 166 mg/l de CaCl2.2H2O; 250 mg/l de MgSO4.7H2O; 400 mg/l de KH2PO4; 37,3 mg/l de Na2EDTA; 27,3 mg/l de FeSO4.7H2O, micro-elementos MS, 500 mg/l de Bactotriptona, 0,5 g/l de MES, 1 mg/l de hidrocloruro de tiamina, 0,05 mg/l de ácido nicotínico, 0,5 mg/l de hidrocloruro de piridoxina, 2 mg/l de glicina, 100 mg/l de mio-inositol, 3% de sacarosa, 0,5 mg/l de 2,4-D, ajustado a pH 5,8.

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> Bayer BioScience N.V. D’Halluin, Kathleen

10 Vanderstraeten, Chantal Ruiter, Rene

<120> Inserción de DNA direccionada mejorada en plantas

15 <130> BCS 03-2007 EPw2

<150> EP 03078700.6

<151> 2003-11-18

20 <160> 7

<170> PatentIn version 3.0

<210> 1 25 <211> 244

<212> PRT

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 1

30 Met Ala Lys Pro Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Asn Ile Lys Lys Asn 1 5 10 15

Gln Val Met Asn Leu Gly Pro Asn Ser Lys Leu Leu Lys Glu Tyr Lys 20 25 30

35 Ser Gln Leu Ile Glu Leu Asn Ile Glu Gln Phe Glu Ala Gly Ile Gly 35 40 45

Leu Ile Leu Gly Asp Ala Tyr Ile Arg Ser Arg Asp Glu Gly Lys Thr40 50 55 60

Tyr Cys Met Gln Phe Glu Trp Lys Asn Lys Ala Tyr Met Asp His Val

65 70 75 80

Cys Leu Leu Tyr Asp Gln Trp Val Leu Ser Pro Pro His Lys Lys Glu85 90 95

Arg Val Asn His Leu Gly Asn Leu Val Ile Thr Trp Gly Ala Gln Thr100 105 110

Phe Lys His Gln Ala Phe Asn Lys Leu Ala Asn Leu Phe Ile Val Asn10 115 120 125

Asn Lys Lys Thr Ile Pro Asn Asn Leu Val Glu Asn Tyr Leu Thr Pro130 135 140

15 Met Ser Leu Ala Tyr Trp Phe Met Asp Asp Gly Gly Lys Trp Asp Tyr145 150 155 160

Asn Lys Asn Ser Thr Asn Lys Ser Ile Val Leu Asn Thr Gln Ser Phe165 170 175

Thr Phe Glu Glu Val Glu Tyr Leu Val Lys Gly Leu Arg Asn Lys Phe180 185 190

Gln Leu Asn Cys Tyr Val Lys Ile Asn Lys Asn Lys Pro Ile Ile Tyr25 195 200 205

Ile Asp Ser Met Ser Tyr Leu Ile Phe Tyr Asn Leu Ile Lys Pro Tyr210 215 220

30 Leu Ile Pro Gln Met Met Tyr Lys Leu Pro Asn Thr Ile Ser Ser Glu225 230 235 240

Thr Phe Leu Lys

<210> 2

<211> 732

<212> DNA

40 <213> Artificial

<220>

<223> Secuencia sintética de DNA codificante de I-SceI (código UIPAC)

45 <220>

<221> característica diversa

<222> (6)..(6)

<223> N= A,G, C o T <220>

<221> variación

<222> (25)..(27)

<223> AGR

<220>

<221> variación

<222> (61)..(63)

<223> TTR

<220>

<221> variación

<222> (73)..(75)

<223> AGY

<220>

<221> variación

<222> (79)..(81)

<223> TTR

<220>

<221> variación

<222> (82)..(84)

<223> TTR

<220>

<221> variación

<222> (97)..(99)

<223> AGY <220>

<221> variación

<222> (103)..(105)

<223> TTR

<220>

<221> variación

<222> (112)..(114)

<223> TTR

<220>

<221> variación

<222> (145)..(147)

<223> TTR

<220>

<221> variación

<222> (151)..(153)

<223> TTR

<220>

<221> variación

<222> (169)..(171)

<223> AGR

<220>

<221> variación

<222> (172)..(174) <223> AGY

<220>

<221> variación

<222> (175)..(177)

<223> AGR

<220>

<221> variación

<222> (244)..(246)

<223> TTR

<220>

<221> variación

<222> (247)..(249)

<223> TTR

<220>

<221> variación

<222> (265)..(267)

<223> TTR

<220>

<221> variación

<222> (268)..(270)

<223> AGY

<220>

<221> variación

<222> (289)..(291)

<223> AGR

<220>

<221> variación

<222> (301)..(303)

<223> TTR

<220>

<221> variación

<222> (310)..(312)

<223> TTR

<220>

<221> variación

<222> (361)..(363)

<223> TTR

<220>

<221> variación

<222> (370)..(372)

<223> TTR

<220>

<221> variación

<222> (409)..(411)

<223> TTR

<220> <221> variación

<222> (424)..(426)

<223> TTR

<220>

<221> variación

<222> (436)..(438)

<223> AGY

<220>

<221> variación

<222> (439)..(441)

<223> TTR

<220>

<221> variación

<222> (490)..(492)

<223> AGY

<220>

<221> variación

<222> (502)..(504)

<223> AGY

<220>

<221> variación

<222> (511)..(513)

<223> TTR

<220>

<221> variación

<222> (523)..(525)

<223> AGY

<220>

<221> variación

<222> (550)..(552)

<223> TTR

<220>

<221> variación

<222> (562)..(564)

<223> TTR

<220>

<221> variación

<222> (565)..(567)

<223> AGR

<220>

<221> variación

<222> (580)..(582)

<223> TTR

<220>

<221> variación

<222> (631)..(633)

<223> AGY <220>

<221> variación

<222> (637)..(639)

<223> AGY

<220>

<221> variación

<222> (643)..(645)

<223> TTR

<220>

<221> variación

<222> (658)..(660)

<223> TTR

<220>

<221> variación

<222> (673)..(675)

<223> TTR

<220>

<221> variación

<222> (697)..(699)

<223> TTR

<220>

<221> variación

<222> (712)..(714)

<223> AGY <220>

<221> variación

<222> (715)..(717)

<223> AGY

<220>

<221> variación

<222> (727)..(729)

<223> TTR

<220>

<221> característica diversa

<222> (12)..(12)

<223> N = A,G, C o T

<220>

<221> característica diversa

<222> (15)..(15)

<223> N = A,G, C o T

<220>

<221> característica diversa

<222> (27)..(27)

<223> N = A,G, C o T

<220>

<221> característica diversa

<222> (33)..(33)

<223> N = A,G, C o T

<220>

<221> característica diversa

<222> (54)..(54)

<223> N = A,G, C o T

<220>

<221> característica diversa

<222> (63)..(63)

<223> N = A,G, C o T

<220>

<221> característica diversa

<222> (66)..(66)

<223> N = A,G, C oT

<220>

<221> característica diversa

<222> (69)..(69)

<223> N = A,G, C o T

<220>

<221> característica diversa

<222> (75)..(75)

<223> N = A,G, C o T

<220>

<221> característica diversa

<222> (81)..(81)

<223> N = A,G, C o T

<220>

<221> característica diversa

<222> (84)..(84)

<223> N = A,G, C o T

<220>

<221> característica diversa

<222> (99)..(99)

<223> N = A,G, C o T

<220>

<221> característica diversa

<222> (105)..(105)

<223> N = A,G, C o T

<220>

<221> característica diversa

<222> (114)..(114)

<223> N = A,G, C o T

<220>

<221> característica diversa

<222> (135)..(135)

<223> N = A,G, C o T

<220> <221> característica diversa

<222> (138)..(138)

<223> N = A,G, C o T

<220>

<221> característica diversa

<222> (144)..(144)

<223> N = A,G, C o T

<220>

<221> característica diversa

<222> (147)..(147)

<223> N = A,G, C o T

<220>

<221> característica diversa

<222> (153)..(153)

<223> N = A,G, C o T

<220>

<221> característica diversa

<222> (156)..(156)

<223> N = A,G, C o T

<220>

<221> característica diversa

<222> (162)..(162)

<223> N = A,G, C o T

<220>

<221> característica diversa

<222> (171)..(171)

<223> N = A,G, C o T

<220>

<221> característica diversa

<222> (174)..(174)

<223> N = A,G, C o T

<220>

<221> característica diversa

<222> (177)..(177)

<223> N = A,G, C o T

<220>

<221> característica diversa

<222> (186)..(186)

<223> N = A,G, C o T

<220>

<221> característica diversa

<222> (192)..(192)

<223> N =A,G, CoT

<220>

<221> característica diversa

<222> (225)..(225)

<223> N = A,G, C o T <220>

<221> característica diversa

<222> (240)..(240)

<223> N = A,G, C o T

<220>

<221> característica diversa

<222> (246)..(246)

<223> N = A,G, C o T

<220>

<221> característica diversa

<222> (249)..(249)

<223> N = A,G, C o T

<220>

<221> característica diversa

<222> (264)..(264)

<223> N = A,G, C o T

<220>

<221> característica diversa

<222> (267)..(267)

<223> N = A,G, C o T

<220>

<221> característica diversa

<222> (270)..(270)

<223> N = A,G, C o T <220>

<221> característica diversa

<222> (273)..(273)

<223> N = A,G, C o T

<220>

<221> característica diversa

<222> (276)..(276)

<223> N = A,G, C o T

<220>

<221> característica diversa

<222> (291)..(291)

<223> N = A,G, C o T

<220>

<221> característica diversa

<222> (294)..(294)

<223> N = A,G, C o T

<220>

<221> característica diversa

<222> (303)..(303)

<223> N = A,G, C o T

<220>

<221> característica diversa

<222> (306)..(306)

<223> N = A,G, C o T

<220>

<221> característica diversa

<222> (312)..(312)

<223> N = A,G, C o T

<220>

<221> característica diversa

<222> (315)..(315)

<223> N = A,G, C o T

<220>

<221> característica diversa

<222> (321)..(321)

<223> N = A,G, C o T

<220>

<221> característica diversa

<222> (327)..(327)

<223> N = A,G, C o T

<220>

<221> característica diversa

<222> (330)..(330)

<223> N = A,G, C o T

<220>

<221> característica diversa

<222> (336)..(336)

<223> N= A,G, C oT

<220>

<221> característica diversa

<222> (351)..(351)

<223> N = A,G, C o T

<220>

<221> característica diversa

<222> (363)..(363)

<223> N = A,G, C o T

<220>

<221> característica diversa

<222> (366)..(366)

<223> N = A,G, C o T

<220>

<221> característica diversa

<222> (372)..(372)

<223> N = A,G, C o T

<220>

<221> característica diversa

<222> (381)..(381)

<223> N = A,G, C o T

<220> <221> característica diversa

<222> (396)..(396)

<223> N = A,G, C o T

<220>

<221> característica diversa

<222> (402)..(402)

<223> N = A,G, C o T

<220>

<221> característica diversa

<222> (411)..(411)

<223> N = A,G, C o T

<220>

<221> característica diversa

<222> (414)..(414)

<223> N = A,G, C o T

<220>

<221> característica diversa

<222> (426)..(426)

<223> N = A,G, C o T

<220>

<221> característica diversa

<222> (429)..(429)

<223> N = A,G, C o T

<220>

<221> característica diversa

<222> (432)..(432)

<223> N = A,G, C o T

<220>

<221> característica diversa

<222> (438)..(438)

<223> N = A,G, C o T

<220>

<221> característica diversa

<222> (441)..(441)

<223> N = A,G, C o T

<220>

<221> característica diversa

<222> (444)..(444)

<223> N = A,G, C o T

<220>

<221> característica diversa

<222> (465)..(465)

<223> N = A,G, C o T

<220>

<221> característica diversa

<222> (468)..(468)

<223> N = A,G, C o T <220>

<221> característica diversa

<222> (492)..(492)

<223> N = A,G, C o T

<220>

<221> característica diversa

<222> (495)..(495)

<223> N = A,G, C oT

<220>

<221> característica diversa

<222> (504)..(504)

<223> N = A,G, C o T

<220>

<221> característica diversa

<222> (510)..(510)

<223> N = A,G, C o T

<220>

<221> característica diversa

<222> (513)..(513)

<223> N = A,G, Co T

<220>

<221> característica diversa

<222> (519)..(519)

<223> N = A,G, C o T <220>

<221> característica diversa

<222> (525)..(525)

<223> N = A,G, C o T

<220>

<221> característica diversa

<222> (531)..(531)

<223> N = A,G, C o T

<220>

<221> característica diversa

<222> (543)..(543)

<223> N = A,G, C o T

<220>

<221> característica diversa

<222> (552)..(552)

<223> N = A,G, C o T

<220>

<221> característica diversa

<222> (552)..(552)

<223> N = A,G, C o T

<220>

<221> característica diversa

<222> (555)..(555)

<223> N = A,G, C o T

<220>

<221> característica diversa

<222> (561)..(561)

<223> N = A,G, C o T

<220>

<221> característica diversa

<222> (564)..(564)

<223> N = A,G, C o T

<220>

<221> característica diversa

<222> (567)..(567)

<223> N = A,G, C o T

<220>

<221> característica diversa

<222> (582)..(582)

<223> N = A,G, C o T

<220>

<221> característica diversa

<222> (594)..(594)

<223> N = A,G, C o T

<220>

<221> característica diversa

<222> (615)..(615)

<223> N = A,G, C o T

<220>

<221> característica diversa

<222> (633)..(633)

<223> N = A,G, C o T

<220>

<221> característica diversa

<222> (639)..(639)

<223> N = A,G, C o T

<220>

<221> característica diversa

<222> (645)..(645)

<223> N = A,G, C o T

<220>

<221> característica diversa

<222> (660)..(660)

<223> N = A,G, C o T

<220>

<221> característica diversa

<222> (669)..(669)

<223> N = A,G, C o T

<220> <221> característica diversa

<222> (675)..(675)

<223> N = A,G, C o T

<220>

<221> característica diversa

<222> (681)..(681)

<223> N = A,G, C o T

<220>

<221> característica diversa

<222> (699)..(699)

<223> N = A,G, C o T

<220>

<221> característica diversa

<222> (702)..(702)

<223> N = A,G, C o T

<220>

<221> característica diversa

<222> (708)..(708)

<223> N = A,G, C o T

<220>

<221> característica diversa

<222> (714)..(714)

<223> N = A,G, C o T

<220>

<221> característica diversa

<222> (717)..(717)

<223> N = A,G, C o T 5

<220>

<221> característica diversa

<222> (723)..(723) 10 <223> N = A,G, C o T

<220>

<221> característica diversa 15 <222> (729)..(729)

<223> N = A,G, C o T

<400> 2 20 atggcnaarc cnccnaaraa raarcgnaar gtnaayatha araaraayca rgtnatgaay 60 ctnggnccna aytcnaarct nctnaargar tayaartcnc arctnathga rctnaayath 120 garcarttyg argcnggnat hggnctnath ctnggngayg cntayathcg ntcncgngay 180

garggnaara cntaytgyat gcarttygar tggaaraaya argcntayat ggaycaygtn 240 tgyctnctnt aygaycartg ggtnctntcn ccnccncaya araargarcg ngtnaaycay 300 30 ctnggnaayc tngtnathac ntggggngcn caracnttya arcaycargc nttyaayaar 360 ctngcnaayc tnttyathgt naayaayaar aaracnathc cnaayaayct ngtngaraay 420 tayctnacnc cnatgtcnct ngcntaytgg ttyatggayg ayggnggnaa rtgggaytay 480

aayaaraayt cnacnaayaa rtcnathgtn ctnaayacnc artcnttyac nttygargar 540 gtngartayc tngtnaargg nctncgnaay aarttycarc tnaaytgyta ygtnaarath 600 40 aayaaraaya arccnathat htayathgay tcnatgtcnt ayctnathtt ytayaayctn 660 athaarccnt ayctnathcc ncaratgatg tayaarctnc cnaayacnat htcntcngar 720 acnttyctna ar 732

45 <210> 3

<211> 732

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Secuencia sintética de DNA preferida codificante de I-SceI (código UIPAC)

<220>

<221> variación

<222> (25)..(27)

<223> AGA

<220>

<221> variación

<222> (73)..(75)

<223> AGC

<220>

<221> variación

<222> (97)..(99)

<223> AGC

<220>

<221> variación

<222> (169)..(171)

<223> AGA

<220>

<221> variación

<222> (172)..(174)

<223> AGC

<220>

<221> variación

<222> (175)..(177)

<223> AGA

<220>

<221> variación

<222> (268)..(270)

<223> AGC

<220>

<221> variación

<222> (289)..(291)

<223> AGA

<220>

<221> variación

<222> (436)..(438)

<223> AGC

<220>

<221> variación

<222> (490)..(492)

<223> AGC

<220> <221> variación

<222> (502)..(504)

<223> AGC

<220>

<221> variación

<222> (523)..(525)

<223> AGC

<220>

<221> variación

<222> (565)..(567)

<223> AGA

<220>

<221> variación

<222> (631)..(633)

<223> AGC

<220>

<221> variación

<222> (637)..(639)

<223> AGC

<220>

<221> variación

<222> (712)..(714)

<223> AGC

<220>

<221> variación

<222> (715)..(717)

<223> AGC

<400> 3

atggcyaarc chcchaaraa raarcgsaaa gtsaacatya araaraacca ggtsatgaac 60 ctsggmccha actcmaarct sctsaargag tacaartcmc arctsatyga rctsaacaty 120 garcarttcg argcyggmat cggmctsaty ctsggmgayg cytacatycg stcmcgsgay 180 garggmaara cytactgyat gcagttcgar tggaaraaca argcytacat ggaycaygts 240 tgyctsctst acgaycartg ggtsctstcm cchcchcaya araargarcg sgtsaaccay 300 ctsggmaacc tsgtsatyac ytggggmgcy caracyttca arcaycargc yttcaacaar 360 ctsgcsaacc tsttcatyct saacaacaar aaracyatyc chaacaacct sgtsgaraac 420 tacctsacyc cyatgtcmct sgcytactgg ttcatggayg ayggmggmaa rtgggaytac 480 aacaaraact cmacyaacaa rtcmatygts ctsaacacyc artcmttcac yttcgargar 540 gtsgartacc tsgtsaargg mctscgsaac aarttccarc tsaactgyta cgtsaagaty 600 aacaaraaca arccyatyat ctacatygay tcmatgtcmt acctsatytt ctacaaccts 660 atyaarccht acctsatycc hcaratgatg tacaarctsc chaacacyat ytcmtcmgar 720 acyttcctsa ar 732

<210> 4

<211> 732

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<400> 4

atggccaagc ctcccaagaa gaagcgcaaa gtgaacatca agaagaacca ggtgatgaac 60 ctgggaccta acagcaagct cctgaaggag tacaagagcc agctgatcga actgaacatc 120

gagcagttcg aagctggcat cggcctgatc ctgggcgatg cctacatcag atcccgggac 180 gaaggcaaga cctactgcat gcagttcgag tggaagaaca aggcctacat ggaccacgtg 240 5 tgtctgctgt acgaccagtg ggtcctgagc cctcctcaca agaaggagcg cgtgaaccat 300 ctgggcaacc tcgtgatcac ctggggagcc cagaccttca agcaccaggc cttcaacaag 360 ctggccaacc tgttcatcgt gaacaacaag aagaccatcc ccaacaacct cgtggagaac 420

tacctcactc ccatgagcct ggcctactgg ttcatggacg acggaggcaa gtgggactac 480 aacaagaaca gcaccaacaa gtcaattgtg ctgaacaccc aaagcttcac cttcgaagaa 540 15 gtggagtacc tcgtcaaggg cctgcgcaac aagttccagc tgaactgcta cgtgaagatc 600 aacaagaaca agcctatcat ctacatcgac agcatgagct acctgatctt ctacaacctg 660 atcaagccat acctgatccc tcagatgatg tacaagctgc ccaacaccat cagcagcgag 720

accttcctga ag 732

<210> 5 25 <211> 3262

<212> DNA

<213> Artificial

<220> 30 <223> T-DNA de pTTAM78 (locus diana)

<220>

<221> característica diversa

<222> (1)..(25) 35 <223> Secuencia del borde derecho del T-DNA

<220>

<221> característica diversa 40 <222> (26)..(72)

<223> Secuencia de polienlazador sintética <220>

<221> característica diversa

<222> (73)..(333)

<223> 3’ nos (complemento)

<220>

<221> característica diversa

<222> (334)..(351)

<223> Secuencia de polienlazador sintética

<220>

<221> característica diversa

<222> (352)..(903)

<223> secuencia de bar (complemento)

<220>

<221> característica diversa

<222> (904)..(928)

<223> Secuencia de polienlazador sintética

<220>

<221> característica diversa

<222> (929)..(946)

<223> Sitio de reconocimiento de I-SceI

<220>

<221> característica diversa

<222> (947)..(967)

<223> Secuencia de polienlazador sintética

<220>

<221> característica diversa

<222> (968)..(1171)

<223> 3’g7

<220>

<221> característica diversa

<222> (1172)..(1290)

<223> Secuencia de polienlazador sintética

<220>

<221> característica diversa

<222> (1291)..(1577)

<223> promotor del gen de nopalina-sintetasa

<220>

<221> característica diversa

<222> (1578)..(1590)

<223> Secuencia de polienlazador sintética

<220>

<221> característica diversa

<222> (1591)..(2394)

<223> nptII

<220>

<221> característica diversa

<222> (2395)..(2567)

<223> 3’ neo <220>

<221> característica diversa 5 <222> (2568)..(3183)

<223> 3’ ocs

<220> 10 <221> característica diversa

<222> (3184)..(3234)

<223> Secuencia de polienlazador sintética

15 <220>

<221> característica diversa

<222> (3235)..(3262)

<223> Secuencia del borde izquierdo del T-DNA

<400> 5

aattacaacg gtatatatcc tgccagtact cggccgtcga cctgcaggca attggtacct 60 agaggatctt cccgatctag taacatagat gacaccgcgc gcgataattt atcctagttt 120

gcgcgctata ttttgttttc tatcgcgtat taaatgtata attgcgggac tctaatcata 180 aaaacccatc tcataaataa cgtcatgcat tacatgttaa ttattacatg cttaacgtaa 240 30 ttcaacagaa attatatgat aatcatcgca agaccggcaa caggattcaa tcttaagaaa 300 ctttattgcc aaatgtttga acgatctgct tcggatccta gacgcgtgag atcagatctc 360 ggtgacgggc aggaccggac ggggcggtac cggcaggctg aagtccagct gccagaaacc 420

cacgtcatgc cagttcccgt gcttgaagcc ggccgcccgc agcatgccgc ggggggcata 480 tccgagcgcc tcgtgcatgc gcacgctcgg gtcgttgggc agcccgatga cagcgaccac 540 40 gctcttgaag ccctgtgcct ccagggactt cagcaggtgg gtgtagagcg tggagcccag 600 tcccgtccgc tggtggcggg gggagacgta cacggtcgac tcggccgtcc agtcgtaggc 660 gttgcgtgcc ttccaggggc ccgcgtaggc gatgccggcg acctcgccgt ccacctcggc 720

45 69

gacgagccag ggatagcgct cccgcagacg gacgaggtcg tccgtccact cctgcggttc 780 ctgcggctcg gtacggaagt tgaccgtgct tgtctcgatg tagtggttga cgatggtgca 840 gaccgccggc atgtccgcct cggtggcacg gcggatgtcg gccgggcgtc gttctgggtc 900 catggttata gagagagaga tagatttaat taccctgtta tccctaggcc gctgtacagg 960 gcccgggatc ttgaaagaaa tatagtttaa atatttattg ataaaataac aagtcaggta 1020 ttatagtcca agcaaaaaca taaatttatt gatgcaagtt taaattcaga aatatttcaa 1080 taactgatta tatcagctgg tacattgccg tagatgaaag actgagtgcg atattatgtg 1140 taatacataa attgatgata tagctagctt aggcgcgcca tagatcccgt caattctcac 1200 tcattaggca ccccaggctt tacactttat gcttccggct cgtataatgt gtggaattgt 1260 gagcggataa caatttcaca caggaaacag gatcatgagc ggagaattaa gggagtcacg 1320 ttatgacccc cgccgatgac gcgggacaag ccgttttacg tttggaactg acagaaccgc 1380 aacgattgaa ggagccactc agccgcgggt ttctggagtt taatgagcta agcacatacg 1440 tcagaaacca ttattgcgcg ttcaaaagtc gcctaaggtc actatcagct agcaaatatt 1500 tcttgtcaaa aatgctccac tgacgttcca taaattcccc tcggtatcca attagagtct 1560 catattcact ctcaatcaaa gatccggccc atgatcatgt ggattgaaca agatggattg 1620 cacgcaggtt ctccggccgc ttgggtggag aggctattcg gctatgactg ggcacaacag 1680 acaatcggct gctctgatgc cgccgtgttc cggctgtcag cgcaggggcg cccggttctt 1740 tttgtcaaga ccgacctgtc cggtgccctg aatgaactgc aggacgaggc agcgcggcta 1800 tcgtggctgg ccacgacggg cgttccttgc gcagctgtgc tcgacgttgt cactgaagcg 1860 ggaagggact ggctgctatt gggcgaagtg ccggggcagg atctcctgtc atctcacctt 1920 gctcctgccg agaaagtatc catcatggct gatgcaatgc ggcggctgca tacgcttgat 1980 ccggctacct gcccattcga ccaccaagcg aaacatcgca tcgagcgagc acgtactcgg 2040 atggaagccg gtcttgtcga tcaggatgat ctggacgaag agcatcaggg gctcgcgcca 2100 gccgaactgt tcgccaggct caaggcgcgc atgcccgacg gcgaggatct cgtcgtgacc 2160 catggcgatg cctgcttgcc gaatatcatg gtggaaaatg gccgcttttc tggattcatc 2220 gactgtggcc ggctgggtgt ggcggaccgc tatcaggaca tagcgttggc tacccgtgat 2280 attgctgaag agcttggcgg cgaatgggct gaccgcttcc tcgtgcttta cggtatcgcc 2340 gctcccgatt cgcagcgcat cgccttctat cgccttcttg acgagttctt ctgagcggga 2400 ctctggggtt cgaaatgacc gaccaagcga cgcccaacct gccatcacga gatttcgatt 2460

ccaccgccgc cttctatgaa aggttgggct tcggaatcgt tttccgggac gccggctgga 2520 tgatcctcca gcgcggggat ctcatgctgg agttcttcgc ccaccccctg ctttaatgag 2580 5 atatgcgaga cgcctatgat cgcatgatat ttgctttcaa ttctgttgtg cacgttgtaa 2640 aaaacctgag catgtgtagc tcagatcctt accgccggtt tcggttcatt ctaatgaata 2700 tatcacccgt tactatcgta tttttatgaa taatattctc cgttcaattt actgattgta 2760

ccctactact tatatgtaca atattaaaat gaaaacaata tattgtgctg aataggttta 2820 tagcgacatc tatgatagag cgccacaata acaaacaatt gcgttttatt attacaaatc 2880 15 caattttaaa aaaagcggca gaaccggtca aacctaaaag actgattaca taaatcttat 2940 tcaaatttca aaaggcccca ggggctagta tctacgacac accgagcggc gaactaataa 3000 cgttcactga agggaactcc ggttccccgc cggcgcgcat gggtgagatt ccttgaagtt 3060

gagtattggc cgtccgctct accgaaagtt acgggcacca ttcaacccgg tccagcacgg 3120 cggccgggta accgacttgc tgccccgaga attatgcagc atttttttgg tgtatgtggg 3180 25 ccctgtacag cggccgcgtt aacgcgtata ctctagagcg atcgccatgg agccatttac 3240 aattgaatat atcctgccgc cg 3262

30 <210> 6

<211> 5345

<212> DNA

<213> Artificial

35 <220>

<223> T-DNA de pTTA82 (DNA de reparación)

<220>

<221> característica diversa 40 <222> (1)..(25)

<223>: Secuencia del borde derecho del T-DNA

<223>: Secuencia de polienlazador sintética

<220>

45: <221> característica diversa

<222> (26)..(62)

<220>

<221> característica diversa

<222> (63)..(578)

<223> bar 3’ suprimido (complemento)

<220>

<221> característica diversa

<222> (579)..(603)

<223> Secuencia de polienlazador sintética

<220>

<221> característica diversa

<222> (604)..(616)

<223> sitio de I-SceI parcial

<220>

<221> característica diversa

<222> (617)..(1429)

<223> P35S3 (complemento)

<220>

<221> característica diversa

<222> (1430)..(1438)

<223> sitio de I-SceI parcial

<220>

<221> característica diversa

<222> (1460)..(1663)

<223> gen 7 de 3’

<220>

<221> característica diversa

<222> (1664)..(1782)

<223> Secuencia de polienlazador sintética

<220>

<221> característica diversa

<222> (1783)..(2069)

<223> promotor del gen de nopalina-sintetasa

<220>

<221> característica diversa

<222> (2070)..(2082)

<223> Secuencia de polienlazador sintética

<220>

<221> característica diversa

<222> (2083)..(2886)

<223> nptII

<220>

<221> característica diversa

<222> (2887)..(3059)

<223> 3’ neo

<220> <221> característica diversa

<222> (3060)..(3675)

<223> 3’ ocs

<220>

<221> característica diversa

<222> (3676)..(3731)

<223> Secuencia de polienlazador sintética

<220>

<221> característica diversa

<222> (3732)..(4246)

<223> P35S2

<220>

<221> característica diversa

<222> (4247)..(4289)

<223> Ats1BL

<220>

<221> característica diversa

<222> (4290)..(4322)

<223> NLS

<220>

<221> característica diversa

<222> (4323)..(5023)

<223> I-SceI defectuosa

<220>

<221> característica diversa

<222> (5024)..(5260)

<223> 3’ 35S 5

<220>

<221> característica diversa

<222> (5261)..(5317) 10 <223> Secuencia de polienlazador sintética

<220>

<221> característica diversa 15 <222> (5318)..(5345)

<223> Secuencia del borde izquierdo del T-DNA

<400> 6 20 aattacaacg gtatatatcc tgccagtact cggccgtcga cctgcaggca attggtacga 60 tcctagacgc gtgagatcag atcctgccag aaacccacgt catgccagtt cccgtgcttg 120 aagccggccg cccgcagcat gccgcggggg gcatatccga gcgcctcgtg catgcgcacg 180

ctcgggtcgt tgggcagccc gatgacagcg accacgctct tgaagccctg tgcctccagg 240 gacttcagca ggtgggtgta gagcgtggag cccagtcccg tccgctggtg gcggggggag 300 30 acgtacacgg tcgactcggc cgtccagtcg taggcgttgc gtgccttcca ggggcccgcg 360 taggcgatgc cggcgacctc gccgtccacc tcggcgacga gccagggata gcgctcccgc 420 agacggacga ggtcgtccgt ccactcctgc ggttcctgcg gctcggtacg gaagttgacc 480

gtgcttgtct cgatgtagtg gttgacgatg gtgcagaccg ccggcatgtc cgcctcggtg 540 gcacggcgga tgtcggccgg gcgtcgttct gggtccatgg ttatagagag agagatagat 600 40 ttaattaccc tgttattaga gagagactgg tgatttcagc gtgtcctctc caaatgaaat 660 gaacttcctt atatagagga agggtcttgc gaaggatagt gggattgtgc gtcatccctt 720 acgtcagtgg agatgtcaca tcaatccact tgctttgaag acgtggttgg aacgtcttct 780

ttttccacga tgctcctcgt gggtgggggt ccatctttgg gaccactgtc ggcagaggca 840

tcttgaatga tagcctttcc tttatcgcaa tgatggcatt tgtaggagcc accttccttt 900 tctactgtcc tttcgatgaa gtgacagata gctgggcaat ggaatccgag gaggtttccc 960 gaaattatcc tttgttgaaa agtctcaata gccctttggt cttctgagac tgtatctttg 1020 acatttttgg agtagaccag agtgtcgtgc tccaccatgt tgacgaagat tttcttcttg 1080 tcattgagtc gtaaaagact ctgtatgaac tgttcgccag tcttcacggc gagttctgtt 1140 agatcctcga tttgaatctt agactccatg catggcctta gattcagtag gaactacctt 1200 tttagagact ccaatctcta ttacttgcct tggtttatga agcaagcctt gaatcgtcca 1260 tactggaata gtacttctga tcttgagaaa tatgtctttc tctgtgttct tgatgcaatt 1320 agtcctgaat cttttgactg catctttaac cttcttggga aggtatttga tctcctggag 1380 attgttactc gggtagatcg tcttgatgag acctgctgcg taggaacgct tatccctagg 1440 ccgctgtaca gggcccggga tcttgaaaga aatatagttt aaatatttat tgataaaata 1500 acaagtcagg tattatagtc caagcaaaaa cataaattta ttgatgcaag tttaaattca 1560 gaaatatttc aataactgat tatatcagct ggtacattgc cgtagatgaa agactgagtg 1620 cgatattatg tgtaatacat aaattgatga tatagctagc ttaggcgcgc catagatccc 1680 gtcaattctc actcattagg caccccaggc tttacacttt atgcttccgg ctcgtataat 1740 gtgtggaatt gtgagcggat aacaatttca cacaggaaac aggatcatga gcggagaatt 1800 aagggagtca cgttatgacc cccgccgatg acgcgggaca agccgtttta cgtttggaac 1860 tgacagaacc gcaacgattg aaggagccac tcagccgcgg gtttctggag tttaatgagc 1920 taagcacata cgtcagaaac cattattgcg cgttcaaaag tcgcctaagg tcactatcag 1980 ctagcaaata tttcttgtca aaaatgctcc actgacgttc cataaattcc cctcggtatc 2040 caattagagt ctcatattca ctctcaatca aagatccggc ccatgatcat gtggattgaa 2100 caagatggat tgcacgcagg ttctccggcc gcttgggtgg agaggctatt cggctatgac 2160 tgggcacaac agacaatcgg ctgctctgat gccgccgtgt tccggctgtc agcgcagggg 2220 cgcccggttc tttttgtcaa gaccgacctg tccggtgccc tgaatgaact gcaggacgag 2280 gcagcgcggc tatcgtggct ggccacgacg ggcgttcctt gcgcagctgt gctcgacgtt 2340 gtcactgaag cgggaaggga ctggctgcta ttgggcgaag tgccggggca ggatctcctg 2400 tcatctcacc ttgctcctgc cgagaaagta tccatcatgg ctgatgcaat gcggcggctg 2460 catacgcttg atccggctac ctgcccattc gaccaccaag cgaaacatcg catcgagcga 2520 gcacgtactc ggatggaagc cggtcttgtc gatcaggatg atctggacga agagcatcag 2580 gggctcgcgc cagccgaact gttcgccagg ctcaaggcgc gcatgcccga cggcgaggat 2640 ctcgtcgtga cccatggcga tgcctgcttg ccgaatatca tggtggaaaa tggccgcttt 2700 tctggattca tcgactgtgg ccggctgggt gtggcggacc gctatcagga catagcgttg 2760 gctacccgtg atattgctga agagcttggc ggcgaatggg ctgaccgctt cctcgtgctt 2820 tacggtatcg ccgctcccga ttcgcagcgc atcgccttct atcgccttct tgacgagttc 2880 ttctgagcgg gactctgggg ttcgaaatga ccgaccaagc gacgcccaac ctgccatcac 2940 gagatttcga ttccaccgcc gccttctatg aaaggttggg cttcggaatc gttttccggg 3000 acgccggctg gatgatcctc cagcgcgggg atctcatgct ggagttcttc gcccaccccc 3060 tgctttaatg agatatgcga gacgcctatg atcgcatgat atttgctttc aattctgttg 3120 tgcacgttgt aaaaaacctg agcatgtgta gctcagatcc ttaccgccgg tttcggttca 3180 ttctaatgaa tatatcaccc gttactatcg tatttttatg aataatattc tccgttcaat 3240 ttactgattg taccctacta cttatatgta caatattaaa atgaaaacaa tatattgtgc 3300 tgaataggtt tatagcgaca tctatgatag agcgccacaa taacaaacaa ttgcgtttta 3360 ttattacaaa tccaatttta aaaaaagcgg cagaaccggt caaacctaaa agactgatta 3420 cataaatctt attcaaattt caaaaggccc caggggctag tatctacgac acaccgagcg 3480 gcgaactaat aacgttcact gaagggaact ccggttcccc gccggcgcgc atgggtgaga 3540 ttccttgaag ttgagtattg gccgtccgct ctaccgaaag ttacgggcac cattcaaccc 3600 ggtccagcac ggcggccggg taaccgactt gctgccccga gaattatgca gcattttttt 3660 ggtgtatgtg ggccctgtac agcggccgcg ttaacgcgta tactctagta tgcaccatac 3720 atggagtcaa aaattcagat cgaggatcta acagaactcg ccgtgaagac tggcgaacag 3780 ttcatacaga gtcttttacg actcaatgac aagaagaaaa tcttcgtcaa catggtggag 3840 cacgacactc tcgtctactc caagaatatc aaagatacag tctcagaaga ccaaagggct 3900 attgagactt ttcaacaaag ggtaatatcg ggaaacctcc tcggattcca ttgcccagct 3960 atctgtcact tcatcaaaag gacagtagaa aaggaaggtg gcacctacaa atgccatcat 4020 tgcgataaag gaaaggctat cgttcaagat gcctctgccg acagtggtcc caaagatgga 4080 cccccaccca cgaggagcat cgtggaaaaa gaagacgttc caaccacgtc ttcaaagcaa 4140 gtggattgat gtgatatctc cactgacgta agggatgacg cacaatccca ctatccttcg 4200 caagaccctt cctctatata aggaagttca tttcatttgg agaggactcg agaattaagc 4260 aaaagaagaa gaagaagaag tccaaaacca tggctaaacc ccccaagaag aagcgcaagg 4320 ttaacatcaa aaaaaaccag gtaatgaacc tgggtccgaa ctctaaactg ctgaaagaat 4380 acaaatccca gctgatcgaa ctgaacatcg aacagttcga agcaggtatc ggtctgatcc 4440

tgggtgatgc ttacatccgt tctcgtgatg aaggtaaaac ctactgtatg cagttcgagt 4500 ggaaaaacaa agcatacatg gaccacgtat gtctgctgta cgatcagtgg gtactgtccc 4560 10 cgccgcacaa aaaagaacgt gttaaccacc tgggtaacct ggtaatcacc tggggcgccc 4620 agactttcaa acaccaagct ttcaacaaac tggctaacct gttcatcgtt aacaacaaaa 4680 aaaccatccc gaacaacctg gttgaaaact acctgacccc gatgtctctg gcatactggt 4740

tcatggatga tggtggtaaa tgggattaca acaaaaactc taccaacaaa gtattgtact 4800 gaacacccag tctttcactt tcgaagaagt agaatacctg gttaagggtc tgcgtaacaa 4860 20 attccaactg aactgttacg taaaaatcaa caaaaacaaa ccgatcatct acatcgattc 4920 tatgtcttac ctgatcttct acaacctgat caaaccgtac ctgatcccgc agatgatgta 4980 caaactgccg aacactatct cctccgaaac tttcctgaaa tagggctagc aagcttggac 5040

acgctgaaat caccagtctc tctctacaaa tctatctctc tctattttct ccataataat 5100 gtgtgagtag ttcccagata agggaattag ggttcctata gggtttcgct catgtgttga 5160 30 gcatataaga aacccttagt atgtatttgt atttgtaaaa tacttctatc aataaaattt 5220 ctaattccta aaaccaaaat ccagtactaa aatccagatc atgcatggta cagcggccgc 5280 gttaacgcgt atactctaga gcgatcgcca tggagccatt tacaattgaa tatatcctgc 5340

cgccg 5345

<210> 7 40 <211> 4066

<212> DNA

<213> Artificial

<220> 45 <223> pCV78

<220>

<221> característica diversa

<222> (234)..(763)

<223> promotor P35S2

<220>

<221> característica diversa

<222> (764)..(805)

<223> Ats1b’

<220>

<221> característica diversa

<222> (808)..(839)

<223> señal de localización nuclear

<220>

<221> característica diversa

<222> (840)..(1541)

<223> I-SceI sintética

<220>

<221> característica diversa

<222> (1544)..(1792)

<223> 3’ 35S

<220>

<221> característica diversa

<222> (3006)..(3886)

<223> Resistencia a ampicilina (complemento)

<400> 7

tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120 ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180 accatacctg caggcaattg gtacctacgt atgcatggcg cgccatatgc accatacatg 240 gagtcaaaaa ttcagatcga ggatctaaca gaactcgccg tgaagactgg cgaacagttc 300 atacagagtc ttttacgact caatgacaag aagaaaatct tcgtcaacat ggtggagcac 360 gacactctcg tctactccaa gaatatcaaa gatacagtct cagaagacca aagggctatt 420 gagacttttc aacaaagggt aatatcggga aacctcctcg gattccattg cccagctatc 480 tgtcacttca tcaaaaggac agtagaaaag gaaggtggca cctacaaatg ccatcattgc 540 gataaaggaa aggctatcgt tcaagatgcc tctgccgaca gtggtcccaa agatggaccc 600 ccacccacga ggagcatcgt ggaaaaagaa gacgttccaa ccacgtcttc aaagcaagtg 660 gattgatgtg atatctccac tgacgtaagg gatgacgcac aatcccacta tccttcgcaa 720 gacccttcct ctatataagg aagttcattt catttggaga ggactcgaga attaagcaaa 780 agaagaagaa gaagaagtcc aaaaccatgg ccaagcctcc caagaagaag cgcaaagtga 840 acatcaagaa gaaccaggtg atgaacctgg gacctaacag caagctcctg aaggagtaca 900 agagccagct gatcgaactg aacatcgagc agttcgaagc tggcatcggc ctgatcctgg 960 gcgatgccta catcagatcc cgggacgaag gcaagaccta ctgcatgcag ttcgagtgga 1020 agaacaaggc ctacatggac cacgtgtgtc tgctgtacga ccagtgggtc ctgagccctc 1080 ctcacaagaa ggagcgcgtg aaccatctgg gcaacctcgt gatcacctgg ggagcccaga 1140 ccttcaagca ccaggccttc aacaagctgg ccaacctgtt catcgtgaac aacaagaaga 1200 ccatccccaa caacctcgtg gagaactacc tcactcccat gagcctggcc tactggttca 1260 tggacgacgg aggcaagtgg gactacaaca agaacagcac caacaagtca attgtgctga 1320 acacccaaag cttcaccttc gaagaagtgg agtacctcgt caagggcctg cgcaacaagt 1380 tccagctgaa ctgctacgtg aagatcaaca agaacaagcc tatcatctac atcgacagca 1440 tgagctacct gatcttctac aacctgatca agccatacct gatccctcag atgatgtaca 1500 agctgcccaa caccatcagc agcgagacct tcctgaagtg aggctagcaa gcttggacac 1560 gctgaaatca ccagtctctc tctacaaatc tatctctctc tattttctcc ataataatgt 1620 gtgagtagtt cccagataag ggaattaggg ttcctatagg gtttcgctca tgtgttgagc 1680 atataagaaa cccttagtat gtatttgtat ttgtaaaata cttctatcaa taaaatttct 1740 aattcctaaa accaaaatcc agtactaaaa tccagatcat gcatggtaca gcggccgcgt 1800 taacgcgtat actctagagc gatcgcaagc ttggcgtaat catggtcata gctgtttcct 1860 gtgtgaaatt gttatccgct cacaattcca cacaacatac gagccggaag cataaagtgt 1920 aaagcctggg gtgcctaatg agtgagctaa ctcacattaa ttgcgttgcg ctcactgccc 1980 gctttccagt cgggaaacct gtcgtgccag ctgcattaat gaatcggcca acgcgcgggg 2040 agaggcggtt tgcgtattgg gcgctcttcc gcttcctcgc tcactgactc gctgcgctcg 2100 gtcgttcggc tgcggcgagc ggtatcagct cactcaaagg cggtaatacg gttatccaca 2160 gaatcagggg ataacgcagg aaagaacatg tgagcaaaag gccagcaaaa ggccaggaac 2220 cgtaaaaagg ccgcgttgct ggcgtttttc cataggctcc gcccccctga cgagcatcac 2280 aaaaatcgac gctcaagtca gaggtggcga aacccgacag gactataaag ataccaggcg 2340 tttccccctg gaagctccct cgtgcgctct cctgttccga ccctgccgct taccggatac 2400 ctgtccgcct ttctcccttc gggaagcgtg gcgctttctc aaagctcacg ctgtaggtat 2460 ctcagttcgg tgtaggtcgt tcgctccaag ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag 2520 cccgaccgct gcgccttatc cggtaactat cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac 2580 ttatcgccac tggcagcagc cactggtaac aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt 2640 gctacagagt tcttgaagtg gtggcctaac tacggctaca ctagaagaac agtatttggt 2700 atctgcgctc tgctgaagcc agttaccttc ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc 2760 aaacaaacca ccgctggtag cggtggtttt tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga 2820 aaaaaaggat ctcaagaaga tcctttgatc ttttctacgg ggtctgacgc tcagtggaac 2880 gaaaactcac gttaagggat tttggtcatg agattatcaa aaaggatctt cacctagatc 2940 cttttaaatt aaaaatgaag ttttaaatca atctaaagta tatatgagta aacttggtct 3000 gacagttacc aatgcttaat cagtgaggca cctatctcag cgatctgtct atttcgttca 3060 tccatagttg cctgactccc cgtcgtgtag ataactacga tacgggaggg cttaccatct 3120 ggccccagtg ctgcaatgat accgcgagac ccacgctcac cggctccaga tttatcagca 3180 ataaaccagc cagccggaag ggccgagcgc agaagtggtc ctgcaacttt atccgcctcc 3240 atccagtcta ttaattgttg ccgggaagct agagtaagta gttcgccagt taatagtttg 3300 cgcaacgttg ttgccattgc tacaggcatc gtggtgtcac gctcgtcgtt tggtatggct 3360 tcattcagct ccggttccca acgatcaagg cgagttacat gatcccccat gttgtgcaaa 3420 aaagcggtta gctccttcgg tcctccgatc gttgtcagaa gtaagttggc cgcagtgtta 3480 tcactcatgg ttatggcagc actgcataat tctcttactg tcatgccatc cgtaagatgc 3540

ttttctgtga ctggtgagta ctcaaccaag tcattctgag aatagtgtat gcggcgaccg 3600 agttgctctt gcccggcgtc aatacgggat aataccgcgc cacatagcag aactttaaaa 3660 5 gtgctcatca ttggaaaacg ttcttcgggg cgaaaactct caaggatctt accgctgttg 3720 agatccagtt cgatgtaacc cactcgtgca cccaactgat cttcagcatc ttttactttc 3780 accagcgttt ctgggtgagc aaaaacagga aggcaaaatg ccgcaaaaaa gggaataagg 3840

gcgacacgga aatgttgaat actcatactc ttcctttttc aatattattg aagcatttat 3900 cagggttatt gtctcatgag cggatacata tttgaatgta tttagaaaaa taaacaaata 3960 15 ggggttccgc gcacatttcc ccgaaaagtg ccacctgacg tctaagaaac cattattatc 4020 atgacattaa cctataaaaa taggcgtatc acgaggccct ttcgtc 4066

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para introducir un DNA extraño de interés en un sitio preseleccionado de un genoma nuclear de una célula vegetal, que comprende las etapas de

(a)

inducir una rotura de DNA bicatenario en un sitio preseleccionado en dicho genoma nuclear mediante introducción en dicha célula vegetal de un gen expresable en plantas que codifica una enzima que induce una rotura de DNA bicatenario de corte raro que reconoce dicho sitio preseleccionado;

(b)

introducir el DNA extraño de interés en la célula vegetal mediante transferencia directa de DNA.
2.

El método según la reivindicación 1, en el que dicha enzima que induce una rotura de DNA bicatenario comprende una señal de localización nuclear.
3.

El método según las reivindicaciones 1 y 2, en el que dicha enzima que induce una rotura de DNA bicatenario es la endonucleasa I-SceI.
4.

El método según las reivindicaciones 1-3, en el que dicha transferencia directa de DNA se logra por bombardeo de microproyectiles recubiertos con el DNA extraño de interés.
5.

El método según las reivindicaciones 1-3, en el que dicha transferencia directa de DNA se logra mediante introducción de DNA por electroporación en protoplastos.
6.

El método según las reivindicaciones 1-3, en el que dicha transferencia directa de DNA se logra mediante introducción de DNA por electroporación en células vegetales intactas o tejidos o células vegetales parcialmente degradados.
7.

El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que dicho DNA extraño de interés está flanqueado por una región de DNA que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con una región de DNA que flanquea el sitio preseleccionado.
8.

El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, por el cual la célula vegetal es una célula de maíz.
9.

El método de la reivindicación 8, en el que la célula de maíz está comprendida en una suspensión celular.
10.

El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, por el cual dicha célula vegetal se incuba en un compuesto fenólico vegetal antes de la etapa (a).
11.

El método de la reivindicación 10, en el que dicho compuesto fenólico vegetal es acetosiringona.