BRPI0612862A2 - polinucleotìdeo isolado, método para obtenção de uma célula transformada, método para obtenção de uma planta transformada, método de produção de recombinação de dna de sìtio especìfico, biblioteca isolada, método de geração de biblioteca de moléculas e método para selecionar sìtio de recombinação frt modificado - Google Patents

Abstract

POLINUCLEOTIDEO ISOLADO, METODO PARA OBTENçAO DE UMA CéLULA TRANSFOPMADA, METODO PARA OBTENçAO DE UMA PLANTA TRANSFOPMADA, METODO DE PRODUçAO DE RECOMBINAçAO DE DNA DE SìTIO ESPECIFICO, BIBLIOTECA ISOLADA, METODO DE GERAçAO DE BIBLIOTECA DE MOLéCULAS E METODO PARA SELECIONAR SìTIO DE RECOMBINAçAO FRT MODIFICADO. A presente invenção refere-se a métodos e composições que utilizam populações de sítios de recombinação FRT modificados, randomizados, para identificar, isolar e/ou caracterizar sítios de recombinação FRT modificados. Os sítios de recombinação FRT modificados recombinogênicos podem ser empregados em uma variedade de métodos para a recombinação direcionada de polinucleotídeos de interesse, incluindo métodos para recombinar polinucleotídeos, avaliar a atividade do promotor, selecionar diretamente organismos transformados, minimizar ou eliminar a expressão resultante de integração randómica no genoma de um organismo, tal como uma planta, excisar polinucleotídeos de interesse, combinar cassetes de transferência múltipla, inverter ou remover um polinucleotídeo, e identificar e/ou caracterizar regiões de regulação transcricional. Adicionalmente, é provido um método para obtenção de uma célula transformada compreendendo a transformação da célula com um polinucleotídeo e o cultivo da dita célula sob ccndições de crescimento, além de um método de obtenção de uma planta transformada compreendendo a transformação de uma célula e a regeneração da planra transformada.

Description

POLINUCLEOTÍDEO ISOLADO, MÉTODO PARA OBTENÇÃO DE UMA CÉLULATRANSFORMADA, MÉTODO PARA OBTENÇÃO DE UMA PLANTATRANSFORMADA, MÉTODO DE PRODUÇÃO DE RECOMBINAÇÃO DE DNA DESÍTIO ESPECÍFICO, BIBLIOTECA ISOLADA, MÉTODO DE GERAÇÃO DEBIBLIOTECA DE MOLÉCULAS E MÉTODO PARA SELECIONAR SÍTIO DERECOMBINAÇÃO FRT MODIFICADO

CAMPO DA INVENÇÃO

A invenção está relacionada a sistemas de recombinaçãositio-especificos e métodos de uso.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

A inserção randômica de DNA introduzido no genoma deuma célula hospedeira pode ser letal se o DNA estrangeirointroduza em, e dessa forma mutar, um gene nativocriticamente importante. Além disso, mesmo se um evento deinserção randômica não provoca o funcionamento de um genede uma célula hospedeira, a expressão de uma seqüência denucleotideos estrangeira inserida pode ser influenciada porefeitos de posição causados pelo DNA genômico ao redor. Emalguns casos, a seqüência de nucleotideos. é inserida em umsitio onde o efeito de posição é forte o suficiente parasuprimir a função ou regulação da seqüência de nucleotideosintroduzida. Em outras instâncias, a sobreprodução doproduto gênico possui efeitos deletérios em uma célula.

Por exemplo, em plantas, efeitos de posição podemresultar em agronomia reduzida, custos adicionais parapesquisa adicional, criação de eventos , transgênicosadicionais, e tempo mais lento para o produto. Por essasrazões, métodos eficientes são necessários para direcionara inserção de seqüências de nucleotideos no genoma devários organismos, tais como plantas, em posiçõescromossômicas que permitem a função desejada da seqüênciade interesse.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

São providos métodos e composições usando populaçõesde sítios de recombinação FRT randomizados modificados paraidentificar, isolar e/ou caracterizar sítios derecombinação FRT modificados. Os sítios de recombinaçãoFRT modificados recombinogênicos podem ser empregados emuma variedade de métodos para recombinação direcionada depolinucleotídeos de interesse, incluindo métodos pararecombinar polinucleotídeos, avaliar atividade promotora,selecionar diretamente organismos transformados, minimizarou eliminar expressão resultante de·integração randômica nogenoma de um organismo, tal como uma planta, removerpolinucleotídeos de interesse, combinar múltiplos cassetesde transferência, inverter ou excisar um polinucleotídeo, eidentificar e/ou caracterizar regiões de regulaçãotranscricionais, são também providos.

Adicionalmente, é provido um método para .obtenção deuma célula transformada compreendendo a transformação dacélula com um polinucleotídeo e o cultivo da dita célulasob condições de crescimento, além de um método de obtençãode uma planta transformada compreendendo a transformação deuma célula e a regeneração da planta transformada.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Métodos e composições usando sítios de recombinaçãoFRT modificados incluem, mas não são limitados aosseguintes:Método para selecionar a recombinogênico sítio decombinação FRT modificado compreendendo:

a) prover uma primeira população de plasmídios,caracterizada pelo fato de que cada plasmídio emdita primeira população compreende um primeiromarcador de seleção comum; e, cada plasmídio emdita primeira população compreende um membro deuma população de sítios de recombinação FRTmodificados;

b) prover uma segunda população de plasmídioscaracterizada pelo fato de que cada plasmídio emdita segunda população compreende um segundomarcador de seleção comum, caracterizado pelofato de que dito primeiro e dito segundomarcadores de seleção são distintos; e, cadaplasmídio em dita segunda população compreende ummembro da população de sítios de recombinação FRTmodificados;

c) combinar dita primeira população de plasmídioscom dita segunda população de plasmídios napresença de uma FLP recombinase sob condiçõesonde a recombinação sitio-específica possaocorrer; e,d) selecionar um plasmídio co-integrantecompreendendo o primeiro e o segundo marcador deseleção, dito plasmídio co-integrantecompreendendo o sítio de recombinação FRTmodificado.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que cada membro de dita população de sítios derecombinação FRT modificados randomizados compreende umaregião de espaçamento compreendendo pelo menos umaalteração de nucleotídeo em SEQ ID NO:43.

3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que dita primeira e dita segunda população deplasmídios são combinadas na presença da FLP recombinase.

4. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que dito plasmídio co-integrante compreende asítio de recombinação FRT modificado funcional.

5. Método de acordo com a reivindicação 1, compreendendo,ainda, isolar o plasmídio co-integrante.

6. Método de acordo com a reivindicação 1, compreendendoainda caracterizar o sítio de recombinação FRT modificadode dito plasmídio co-integrante.7. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizadopelo fato de que caracterizar o sitio de recombinação FRTmodificado compreende determinar a eficiência de excisão.

8. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizadopelo fato de que caracterizar o sitio de recombinação FRTmodificado compreende determinar a especificidade derecombinação.

9. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizadopelo fato de que caracterizar os sitios de recombinação FRTmodificados compreende seqüenciar o sitio de recombinaçãoFRT modificado do plasmidio co-integrante.

10. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que pelo menos um de dito primeiro ou ditosegundo marcadores de seleção é selecionado do grupoconsistindo de ampicilina e espectinomicina.

11. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que dita primeira população de plasmidios edita segunda população de plasmidios são combinadas em umarazão eqüimolar.

12. Uma biblioteca isolada compreendendo uma população deplasmidios, caracterizada pelo fato de que cada plasmidioem dita população compreende um marcador de seleção comum;e, cada plasmidio em dita população compreende um membro deuma população 'de sitios de recombinação FRT modificados,caracterizado pelo fato de que dita população de plasmidioscompreende pelo menos cerca de 5 membros distintos dapopulação de plasmidios.

13. Biblioteca isolada de acordo com a reivindicação 12,caracterizada pelo fato de que cada membro de ditapopulação de sítios de recombinação FRT modificadoscompreende uma região de espaçamento compreendendo pelmenos uma alteração de nucleotídeo em SEQ ID NO:43.

14. Biblioteca isolada de acordo com a reivindicação 12 ou13, caracterizada pelo fato de que ditos sítios derecombinação FRT modificados de dita população sãorecombinogênicos.

15. Biblioteca isolada de acordo com qualquer uma dasreivindicações 12 a 14, caracterizada pelo fato de que omarcador de seleção é selecionado do grupo consistindo deampicilina e espectinomicina.

16. Biblioteca isolada de acordo com qualquer uma dasreivindicações 12 a 15, caracterizada pelo fato de que ditapopulação de plasmidios compreende pelo menos cerca de 100membros distintos da população de plasmidios.

17. Biblioteca isolada de acordo com qualquer uma dasreivindicações 12 a 15, caracterizada pelo fato de que ditapopulação de plasmidios compreende pelo menos um sítio FRTrecombinogênicb modificado compreendendo uma região deespaçamento selecionada do grupo consistindo de SEQ IDNOS: 1, 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17,e 18.

18. Biblioteca isolada de acordo com a reivindicação 17,caracterizada pelo fato de que dita população de plasmídioscompreende pelo menos um sitio FRT recombinogênicomodificado selecionado do grupo consistindo de SEQ IDNO:21, 22, 23, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35,36, 37, ou 38.

19. Um Jcit compreendendo

a) uma primeira população de plasmídios,caracterizada pelo fato de que cada plasmídio emdita primeira população compreende um primeiromarcador de seleção comum; e, cada plasmídio emdita primeira população compreende um membro deuma população de sítios de recombinação FRTmodificados; e,

b) uma segunda população de plasmídios,caracterizada pelo fato de que cada plasmídio emdita segunda população compreende um segundomarcador de seleção comum, caracterizado pelofato de que dito primeiro e dito segundomarcadores de seleção são distintos; e, cadaplasmídio em dita segunda população compreende ummembro da população de sítios de recombinação FRTmodificados.

20. O kit de acordo com a reivindicação 19, caracterizadopelo fato de que dito kit compreende ainda uma FLPrecòmbinase ou um polinucleotídeo codificando dita FLPrecòmbinase.

21. O kit de acordo com a reivindicação 20, caracterizadopelo fato de que dito kit compreende o polinucleotídeocodificando um variante biologicamente ativo da FLPrecòmbinase ou um fragmento biologicamente ativo da FLPrecòmbinase.

22. Kit de acordo com qualquer uma.das reivindicações 19 a21, caracterizado pelo fato de que pelo menos um membro dedita primeira população, ou dita segunda população desítios de recombinação FRT modificados, ou ambas populaçõescompreende

a) uma região de espaçamento compreendendo pelomenos uma alteração de nucleotídeo em SEQ IDNO:4 3; e

b) uma região de espaçamento selecionada do grupoconsistindo de SEQ ID NOS:1, 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9,10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, ou 21, 22,23, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35,36, 37, ou 38.23. Kit de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a22, caracterizado pelo fato de que cada membro de ditaprimeira e dita segunda população de sitio de recombinaçãoFRT modificado é recombinogênico.

24. Kit de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a22, caracterizado pelo fato de que pelo menos um de ditoprimeiro ou dito segundo marcador de seleção é selecionadodo grupo consistindo de ampicilina e espectinomicina.

25. Método para gerar uma biblioteca de moléculascompreendendo:

a) prover uma população de sítios de recombinaçãoFRT modificados; e,

b) promover o contato de dita população de sítios derecombinação FRT modificados com uma população deplasmídios tendo um marcador de seleção comum sobcondições para a inserção de dita população desítios de recombinação FRT modificados em ditapopulação de plasmídios, de forma que cada dosplasmídios de dita população compreende um únicomembro da população de sítios de recombinação FRTmodificados, pelo qual uma biblioteca demoléculas é gerada.26. Método de acordo com a reivindicação 25, caracterizadopelo fato de que cada membro de dita população de sítios derecombinação FRT modificados compreende uma região deespaçamento compreendendo pelo menos uma alteração denucleotídeo em SEQ ID NO:43.

27. Um polinucleotideo isolado compreendendo uma seqüênciade nucleotídeos compreendendo pelo menos um sítio derecombinação FRT modificado funcional, dito sítio derecombinação FRT modificado funcional compreendendo umaregião de espaçamento seqüência selecionada do grupoconsistindo de SEQ ID N0S:1, 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11,12, 13, 14, 15, 16, 17, e 18.

28. Polinucleotídeo isolado de acordo com a reivindicação27, caracterizado pelo fato de que dito sítio derecombinação FRT modificado funcional compreende SEQ IDNO:21, 22, 23, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35,36, 37, ou 38 ou um variante funcional dessas,caracterizado pelo fato de que dito variante funcional ésubstancialmente idêntico a SEQ ID N0:21, 22, 23, 25,- 26,27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, ou 38.

29. Polinucleotídeo isolado de acordo com a reivindicação28, caracterizado pelo fato de que dito sítio derecombinação FRT modificado funcional compreende SEQ IDNO:21, 22, 23, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35,36, 37, ou 38.30. Polinucleotideo isolado de acordo com a reivindicação27, 28 ou 29, caracterizado pelo fato de que ditopolinucleotideo compreende um segundo sitio derecombinação.

31. Polinucleotideo isolado de acordo com a reivindicação30, caracterizado pelo fato de que dito segundo sitio derecombinação é selecionado do grupo consistindo de um sitioFRT, um sitio FRT mutante, um sitio LOX, ou um sitio LOXmutante.

32. Polinucleotideo isolado de acordo com a reivindicação31, caracterizado pelo fato de que dito segundo sitio derecombinação é selecionado do grupo consistindo de SEQ IDNO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16,17, 18, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33,34, 35, 36, 37, ou 38.

33. Polinucleotideo isolado de acordo com qualquer uma dasreivindicações 30 a 32, caracterizado pelo fato de que ditosegundo sitio de recombinação é dissimilar e nãorecombinogênico com respeito ao sitio de recombinação FRTmodificado funcional.

34. Polinucleotideo isolado de acordo com qualquer uma dasreivindicações 30 a 32, caracterizado pelo fato de que ditositio de recombinação FRT modificado funcional e ditosegundo sitio de recombinação são sítios de recombinaçãocorrespondentes.35. Célula compreendendo o polinucleotideo como definidoem qualquer uma das reivindicações 27 a 34.

36. Célula de acordo com a reivindicação 35, caracterizadapelo fato de que dita célula é de uma planta.

37. Célula de acordo com a reivindicação 35· ou 36,caracterizada pelo fato de que o polinucleotideo éestavelmente integrado no genoma de dita célula.

38. Célula de acordo com a reivindicação 36, caracterizadapelo fato de' que dita célula é de uma plantamonocotiledônea.

39. Célula de acordo com a reivindicação 38, caracterizadapelo fato de que dita célula de planta monocotiledônea é demilho, cevada, milhete, trigo, sorgo, centeio, ou arroz.

40. Célula de acordo com a reivindicação 36, caracterizadapelo fato de que dita célula vegetal é de uma plantadicotiledônea.

41. Célula de acordo com a reivindicação 40, caracterizadapelo fato de que dita célula de planta dicotiledônea é desoja, canola, alfafa, girassol, cártamo, tabaco,Arabidopsis, ou algodão.42. Planta compreendendo uma célula como definida emqualquer uma das reivindicações 36 a 41.

43. Sementes tendo integrado estavelmente em seu genoma opolinucleotideo como definido em qualquer uma dasreivindicações 27 a 34.

44. Célula de acordo com qualquer uma das reivindicações35 a 42, caracterizada pelo fato de que dita célula possui,ainda, estavelmente incorporado em seu genoma umpolinucleotideo codificando uma FLP recombinase.

45. Célula de acordo com a reivindicação 44, caracterizadapelo fato de que dito polinucleotideo codifica um variantebiologicamente ativo da FLP recombinase.

46. Método para determinar a eficiência relativa deexcisão de recombinação de um primeiro e um segundo sitiode recombinação FRT compreendendo:

a) prover um polinucleotideo compreendendo oprimeiro e o segundo sitio de recombinação FRT,caracterizado pelo fato de que a seqüência deespaçamento de dito primeiro ou dito segundositio de recombinação FRT é selecionada do grupoconsistindo de SEQ ID NOS:1, 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9,10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, e 18;b) prover uma FLP recombinase sob condições, deforma que dita FLP recombinase implemente umevento de excisão mediada por recombinase; e,

c) determinar a eficiência de excisão de ditoprimeiro e dito segundo sitio de recombinaçãoFRT relativa a uma reação controle, caracterizadopelo fato de que a reação controle é feita sobcondições idênticas usando sítios de recombinaçãoFRT do tipo selvagem como o primeiro e o segundosítios de recombinação FRT.

47. Método de acordo com a reivindicação 46, caracterizadopelo fato de que dito primeiro e dito segundo sítios derecombinação FRT são sítios de recombinaçãocorrespondentes.

48. Método para identificar sítios de recombinaçãodissimilares e não recombinogênicos compreendendo:

a) prover um primeiro sítio de recombinação FRT,càracterizado pelo fato de que a seqüência deespaçamento é selecionada do grupo consistindo deSEQ ID NOS: 1, 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12,13, 14, 15, 16, 17, el8;

b) prover um segundo sítio de recombinação FRTdissimilar;c) prover uma FLP recombinase sob condições, deforma que dita FLP recombinase implemente umevento de recombinação; e,

d) testar um evento de recombinação para, dessaforma, determinar se o primeiro e o segundosítios de recombinação são não recombinogênicos.

49. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações46 a 48, caracterizado pelo fato de que dito primeiro sítiode recombinação FRT compreende SEQ ID NO:21, 22, 23, 25,26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38 ou umvariante funcional dessas, caracterizado pelo fato de quedito variante funcional é substancialmente idêntico a SEQID NO:21, 22, 23, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34,35, 36, 37, ou 38.

50. Método de acordo com a reivindicação 49, caracterizadopelo fato de que dito primeiro sítio de recombinação FRTcompreende SEQ ID N0:21, 22, 23, 25, 26, 27, 28, 29, 30,31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, ou 38.

51. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações46 a 48, caracterizado pelo fato de que dito método ocorrein vivo.

'52. Método de acordo com a reivindicação 51, caracterizadopelo fato de que prover ou mais ditos primeiros sítios FRTou ditos segundos sítios FRT compreende transformação.53. Método para produzir recombinação sítio específica deDNA compreendendo:

a) prover um primeiro fragmento de DNA compreendendoum primeiro sítio de recombinação sítio-específico, caracterizado pelo fato de que oprimeiro sítio de recombinação sítio-específicocompreende um polinucleotídeo que é selecionadodo grupo consistindo de:

i) um sítio de recombinação FRT tendo umaregião de espaçamento selecionado do grupoconsistindo de SEQ ID NOS: 1, 2, 3, 5, 6, 7,8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, e 18;

e

ii) um sítio de recombinação FRT selecionado dogrupo consistindo de SEQ ID NOS: 21, 22, 23,25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35,36, 37, e 38;

b) prover um segundo fragmento de DNA compreendendoum segundo sítio de recombinação sítio-específicoo qual é recombinogênico com o primeiro sítio derecombinação sítio-específco; e,

c) prover uma recombinase sítio-específica quecatalisa uma recombinação sítio-específica entreo primeiro e o segundo sítios de recombinaçãosítio-especificos.

54. Método de acordo com a reivindicação 53, caracterizadopelo fato de que o primeiro fragmento de DNA e o segundofragmento de DNA são providos em uma única molécula depolinucleotideo.

55. Método de acordo com a reivindicação 53 ou 54,caracterizado pelo fato de que o primeiro sítio derecombinação sitio-específico e o segundo sítio derecombinação sítio-específico são sítios correspondentes.

56. Método de acordo com a reivindicação 53 ou 54,caracterizado pelo fato de que o primeiro sítio derecombinação sítio-específico e o segundo sítio derecombinação sítio-específico são sítios dissimilares.

57. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações53 a 56, caracterizado pelo fato de que o primeiro sítio derecombinação sítio-específico e o segundo sítio derecombinação sítio-específico são diretamente orientados,relativo um ao outro.

58. Método de acordo com a reivindicação 57, caracterizadopelo fato de que o primeiro e o segundo sítios derecombinação sítio-específicos flanqueiam um primeiropolinucleotideo de interesse, pelo qual prover arecombinase sitio-especifica excisa o primeiropolinucleotideo de interesse.

59. Método de acordo com a reivindicação 58, caracterizadopelo fato de que a excisão do primeiro polinucleotideo deinteresse ativa a expressão de um segundo polinucleotideode interesse.

60. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações54 a 56, caracterizado pelo fato de que o primeiro sitio derecombinação sitio-especifico e o segundo sitio derecombinação sitio-especifico estão em orientação opostarelativos um ao outro.

61. Método de acordo com a reivindicação 60, caracterizadopelo fato de que o primeiro e o segundo sitios derecombinação sitio-especificos flanqueiam um primeiropolinucleotideo de interesse, pelo qual prover arecombinase sitio-especifica inverte o primeiropolinucleotideo de interesse.

62. Método de acordo com a reivindicação 61, caracterizadopelo fato de que a inversão do primeiro polinucleotideo deinteresse ativa a expressão do primeiro polinucleotideo deinteresse.

63. Método de acordo com a reivindicação 61, caracterizadopelo fato de que a inversão do primeiro polinucleotideo deinteresse ativa a expressão de um segundo polinucleotídeode interesse.

64. Método de acordo com a reivindicação 53, caracterizadopelo fato de que o primeiro fragmento de DNA é provido emum primeiro polinucleotídeo e o' segundo fragmento de DNA éprovido em um segundo polinucleotídeo separado.

65. Método de acordo com a reivindicação 64, caracterizadopelo fato de que o segundo polinucleotídeo é uma moléculacircular.

66. Método de acordo com a reivindicação 64 ou 65,caracterizado pelo fato de que o segundo polinucleotídeocompreende, ainda, um polinucleotídeo de interesse.

67. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações53 a 66, caracterizado pelo fato de que o segundo sítio derecombinação sítio-específico é um sítio de recombinaçãoFRT modificado compreendendo um polinucleotídeo selecionadodo grupo consistindo de SEQ ID NOS:l, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8,9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 21, 22, 23, 24, 25,26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, e 38.

68. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações53 a 67, caracterizado pelo fato de que a recombinaçãosítio-específica ocorre in vivo.69. Método de acordo com a reivindicação 68, caracterizadopelo fato de que a recombinação sitio-especifica ocorre emuma célula eucarionte.

70. Método de acordo com a reivindicação 69, caracterizadopelo fato de que a célula eucarionte é uma célula vegetal.

71. Método de acordo com a reivindicação 70, caracterizadopelo fato de que . a célula vegetal é de uma plantaselecionada do grupo consistindo de milho, arroz, trigo,cevada, milhete, sorgo, centeio, soja, alfafa, canola,Arabidopsisr tabaco, girassol, algodão, e cártamo.

72. Método para direcionar a inserção de umpolinucleotideo de interesse a um sitio alvo compreendendo:

a) prover o sitio alvo compreendendo um- primeirositio de recombinação funcional compreendendo umaseqüência de espaçamento selecionada do grupoconsistindo de SEQ ID NOStl, 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9,10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, e 18;

b) prover um cassete de transferência compreendendoum segundo sitio de recombinação funcional e ditopolinucleotideo de interesse, caracterizado pelofato de que dito primeiro e dito segundo sítiosde recombinação são recombinogênicos com respeitoum ao outro; e,c) prover uma recombinase caracterizada pelo fato deque dita recombinase reconhece e implementarecombinação no primeiro e no segundo sitios derecombinação, e o polinucleotideo de interesse éinserido no sitio alvo.

73. Método para direcionar a inserção de umpolinucleotideo de interesse a um sitio alvo, dito métodocompreendendo:

a) prover o sitio alvo compreendendo um primeiro eum segundo sitio de recombinação funcional,caracterizado pelo fato de que dito primeiro edito segundo sitios de recombinação sãodissimilares e não recombinogênicos com respeitoum ao outro; e pelo menos um de dito primeiro edito segundo sitios de recombinação compreendeuma seqüência de espaçamento selecionada do grupoconsistindo de SEQ ID NOS: 1, 2, 3, 5, 6, 7, 8,9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, e 18;

b) prover um cassete de transferência compreendendoo polinucleotideo de interesse, caracterizadopelo fato de que dito polinucleotideo deinteresse é flanqueado por dito primeiro e ditosegundo sitios de recombinação, e,

c) prover uma recombinase, caracterizada pelo fatode que dita recombinase reconhece e implementarecombinação no primeiro e no segundo sitios derecombinação, e o polinucleotídeo de interesse éinserido no sitio alvo.

74. Método de acordo com a reivindicação 73, caracterizadopelo fato de que dito sitio alvo compreende um segundopolinucleotídeo de interesse flanqueado por dito primeiro edito segundo sítios de recombinação.

75. Método para avaliar a atividade promotora em umacélula compreendendo:

a) prover a célula tendo em seu genoma um sítio alvocompreendendo um primeiro e um segundo sítios derecombinação funcionais, caracterizado pelo fatode que dito primeiro e dito segundo sítios derecombinação são dissimilares e não

recombinogênicos, e pelo menos um de ditoprimeiro e dito segundo sítios de recombinaçãocompreende uma seqüência de espaçamentoselecionada do grupo consistindo de SEQ ID NOS:1, 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15,16, 17, e 18; e,

b) prover à dita célula um cassete de transferênciacompreendendo um promotor operacionalmente ligadoa um polinucleotídeo compreendendo um marcador deseleção, caracterizado pelo fato de que ditocassete de transferência é flanqueado peloprimeiro e pelo segundo sítios de recombinação,

c) prover uma recombinase, caracterizado pelo fatode que dita recombinase reconhece e implementarecombinação no primeiro e no segundo sítios derecombinação, pelo qual dito cassete detransferência é integrado ao sítio alvo; e,

d) monitorar a expressão do marcador de seleção paraavaliar a atividade promotora.

76. Método para selecionar diretamente uma célulatransformada, dito método compreendendo:

a) prover uma população de células compreendendo umpòlinucleotídeo compreendendo, na seguinte ordem,um promotor operacionalmente ligado a um sítioalvo, caracterizado pelo fato de que o sítio alvocompreende um primeiro sítio de recombinação e umsegundo sítio de recombinação, dito primeiro edito segundo sítios de recombinação sãodissimilares e não recombinogênicos com respeitoum ao outro, e pelo menos um de dito primeiro edito segundo sítios de recombinação compreendeuma seqüência de espaçamento selecionada do grupoconsistindo de SEQ ID NOStl, 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9,10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, e 18;b) introduzir em dita população de células umcassete de transferência compreendendo, naseguinte ordem, o primeiro sitio de recombinação,um polinucleotideo codificando um gene marcadorde seleção não operacionalmente ligado a umpromotor, e o segundo sitio de recombinação;

c) prover uma recombinase, caracterizado pelo fatode que dita recombinase reconhece e implementarecombinação no primeiro e no segundo sítios derecombinação; e,

d) cultivar dita população de células em um agenteseletivo apropriado para selecionar diretamente acélula expressando o marcador de seleção..

77. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações72 a 76, caracterizado pelo fato de que dito sítio alvo éestavelmente incorporado no genoma de uma célula.

78. Método para minimizar ou eliminar a expressãoresultante de integração randômica de uma molécula de ácidonucléico de interesse em um genoma de uma célulacompreendendo:

a) prover a célula tendo estavelmente incorporado emseu genoma um polinucleotideo compreendendo, naseguinte ordem: um promotor ativo em dita célulaoperacionalmente ligado a um sítio ATG de iníciode tradução operacionalmente ligado a um sítioalvo compreendendo um primeiro e um segundo sítiode recombinação funcional, caracterizado pelofato de que dito primeiro e dito segundo sítiosde recombinação são dissimilares e nãorecombinogênicos, e pelo menos um de ditoprimeiro e dito segundo sítios de recombinaçãocompreende uma seqüência de espaçamentoselecionada do grupo consistindo de SEQ ID NOS:1, 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15,16, 17, e 18;

prover a dita célula um cassete de transferênciacompreendendo, na seguinte ordem: o primeirosítio de recombinação, a molécula de ácidonucléico de interesse, e o segundo sítio derecombinação, caracterizado pelo fato de que osítio ATG de início de tradução da molécula deácido nucléico de interesse foi substituído comdito primeiro sítio de recombinação; e,

prover uma recombinase, caracterizado pelo fatode que dita recombinase reconhece e implementarecombinação no primeiro e no segundo sítios derecombinação, pelos quais a molécula de ácidonucléico de interesse é integrada no sítio alvoe, dessa forma, operacionalmente ligada aopromotor e sítio de início de tradução dopolinucleotídeo.79. Método para excisar ou inverter um polinucleotideo deinteresse em uma célula compreendendo:

a) prover uma célula tendo um cassete detransferência compreendendo o polinucleotideo deinteresse flanqueado por um primeiro e um segundositio de recombinação funcional, caracterizadopelo fato de que dito primeiro e dito segundosítios de recombinação são dissimilares e nãorecombinogênicos e caracterizados pelo fato deque pelo menos um de dito primeiro e dito segundosítios de recombinação compreende uma seqüênciade espaçamento selecionada do grupo consistindode SEQ ID NOSrlf 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12,13, 14, 15, 16, 17, e 18;

b) prover a dita célula um oligonucleotídeo isoladocapaz de direcionar uma conversão de nucleotídeoem um do primeiro ou do segundo sítios derecombinação, de forma a criar dois sítios derecombinação correspondentes; e,

c) prover uma recombinase, caracterizado pelo fatode que dita recombinase que implementarecombinação nos sítios de recombinaçãocorrespondentes, pelos quais o polinucleotideo deinteresse é excisado ou invertido.80. Método de acordo com a reivindicação 79, caracterizadopelo fato de que ditos sítios de recombinaçãocorrespondentes são diretamente repetidos.

81. Método de acordo com a reivindicação 79, caracterizadopelo fato de que ditos sítios de recombinaçãocorrespondentes são invertidos.

82. Método de acordo.com a reivindicação 79, caracterizadopelo fato de que dito polinucleotídeo de interesse é umpromotor ou codifica um polipeptídeo.

83. Método para localizar sítios de integração preferidosno genoma de uma célula, dito método compreendendo:

a) introduzir em dita célula um sítio alvccompreendendo, na seguinte ordem: um primeirosítio de recombinação funcional, um promotorativo em dita célula operacionalmente ligado a umpolinucleotídeo, e um segundo sítio derecombinação funcional, caracterizado pelo fatode que dito primeiro e dito segundo sítios derecombinação são dissimilares e nãorecombinogênicos, e caracterizado pelo fato deque pelo menos um de dito primeiro e dito segundosítios de recombinação compreende uma seqüênciade espaçamento selecionada do grupo consistindode SEQ ID NOS:1, 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12,13, 14, 15, 16, 17, e 18;b) determinar o nível de expressão de ditopolinucleotídeo; e,

c) selecionar a célula expressando ditopolinucleotídeo.

84. Método de acordo com a reivindicação 83,compreendendo, ainda, introduzir na célula ura cassete detransferência compreendendo um polinucleotídeo de interesseflanqueado por dito primeiro e dito segundo sítios derecombinação; e, prover uma recombinase, caracterizado pelofato de que dita recombinase reconhece e implementarecombinação no primeiro e no segundo sítios derecombinação, pelos quais o cassete de transferência éintegrado no sítio preferido.

85. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações75 a 84, caracterizado pelo fato de que dita célula tem'estavelmente incorporado em seu genoma um polinucleotídeocodificando dita recombinase.

86. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações73 a 84, caracterizado pelo fato de que pelo menos um deditos sítios de recombinação dissimilares e nãorecombinogênicos é selecionado do grupo consistindo de umsítio FRT, um variante funcional do sítio FRT, um sítioLOX, e um variante funcional do sítio LOX.87. Método de acordo com a reivindicação 86, caracterizadopelo fato de que um de ditos sítios de recombinaçãodissimilares e não recombinogênicos compreende um sítio FRTou um variante funcional do sítio FRT.

88. Método de acordo com a reivindicação 87, caracterizadopelo fato de que dito variante funcional do sítio FRT éselecionado do grupo consistindo de SEQ ID NO:21, 22, 23,25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 40,41, ou 42 .

89. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações73 a 84, caracterizado pelo fato de que dita recombinase éuma FLP recombinase ou uma recombinase Cre.

90. Método de acordo com a reivindicação 89, caracterizadopelo fato de que a FLP recombinase ou a recombinase Cre écodifica por um polinucleotídeo tendo códons preferenciaisde milho.

91. Método de acordo com a reivindicação 89, caracterizadopelo fato de que dita. recombinase compreende uma FLPrecombinase ou uma recombinase Cre.

92. Método de acordo com a reivindicação 73, 74, 75, 77 ou78, caracterizado pelo fato de que prover dito cassete detransferência compreende transformação.

93. Método de -acordo com a reivindicação 73, 74, 75, 77 ou78, caracterizado pelo fato de que prover dito cassete detransferência compreende cruzamento sexuado.

94. Método de acordo com a reivindicação 72 a 79 ou 84,caracterizado pelo fato de que prover dita recombinasecompreende transformação.

95. Método de acordo com a reivindicação 72 a 79 ou 84,caracterizado pelo fato de que prover dito cassete detransferência compreende cruzamento sexuadó

96. Método de acordo com a reivindicação 72 a 78, 83 ou84, caracterizado pelo fato de que pelo menos um de ditoprimeiro e dito segundo sítios de recombinação compreendeSEQ ID NO: 21, 22, 23, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33,34, 35, 36, 37, ou 38 ou um variante funcional dessas,caracterizado pelo fato de que dito variante funcional ésubstancialmente idêntico a SEQ ID NO:21, 22, 23, 25, 26,27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, ou 38.

97. Método de acordo com a reivindicação 96, caracterizadopelo fato de que pelo menos um de dito primeiro ou ditosegundo sítio de recombinação compreende uma seqüência denucleotídeos selecionada do grupo consistindo de SEQ IDNOS:21, 22, 23, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35,36, 37, e 38.

98. Método para combinar múltiplos cassetes detransferência compreendendo:prover um sítio alvo compreendendo pelo menos umprimeiro e um segundo sítio de recombinaçãofuncional;

prover um primeiro cassete de transferênciacompreendendo na seguinte ordem pelo menos oprimeiro, um terceiro, e o segundo sítios derecombinação funcionais, caracterizado pelo fatode que o primeiro e o terceiro sítios derecombinação do primeiro cassete de transferênciaflanqueiam um primeiro polinucleotídeo deinteresse, dito primeiro, dito segundo, e ditoterceiro sítios de recombinação são dissimilarese não recombinogênicos com respeito um ao outro,e pelo menos um de dito primeiro, dito segundo,ou dito terceiro sítios de recombinaçãocompreende uma seqüência de espaçamentoselecionada do grupo consistindo de SEQ ID N0S:1,2, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16,17, e 18;

prover uma primeira recombinase, caracterizadopelo fato de que dita primeira recombinasereconhece e implementa recombinação no primeiro eno segundo sítios de recombinação;

prover um segundo cassete de transferênciacompreendendo pelo menos o segundo e o terceirosítios de recombinação, caracterizado pelo fatode que o segundo e o terceiro sítios derecombinação do segundo cassete de transferênciaflanqueiam um segundo polinucleotídeo deinteresse; e,

e) prover uma segunda recombinase, caracterizadopelo fato de que dita segunda recombinasereconhece e implementa recombinação no segundo eno terceiro sítios de recombinação, pelo qual oprimeiro e o segundo cassetes de transferênciasão integrados no sítio alvo.

99. Método para combinar múltiplos cassetes detransferência compreendendo:

a) prover um sítio alvo compreendendo na seguinteordem pelo menos um primeiro, um segundo, e umterceiro sítio de recombinação funcional;caracterizado pelo fato de que dito primeiro,dito segundo, e dito terceiro sítios derecombinação são dissimilares e nãorecombinogênicos com respeito um ao outro, e pelomenos um de dito primeiro, dito segundo, ou ditoterceiro sítios de recombinação compreende umaseqüência de espaçamento selecionada do grupoconsistindo de SEQ ID NOS: 1, 2, 3, 5, 6, 7, 8,9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, e 18;b) prover um primeiro cassete de transferênciacompreendendo um primeiro polinucleotideo. deinteresse flanqueado pelos primeiro e segundosítios de recombinação;

c) prover uma primeira recombinase, caracterizadopelo fato de que dita primeira recombinase ouvariante dessa reconhece e implementa,recombinação no primeiro e no segundo sítios derecombinação;

d) prover um segundo cassete de transferênciacompreendendo um segundo polinucleotideo deinteresse flanqueado ao menos pelo segundo e oterceiro sítios de recombinação; e,

e) prover uma segunda recombinase, caracterizadopelo fato de que dita segunda recombinasereconhece e implementa recombinação no segundo eno terceiro sítios de recombinação, pelos quais oprimeiro e o segundo cassetes de transferênciasão integrados no sítio alvo.

100. Método de acordo com a reivindicação 98 ou 99,caracterizado pelo fato de que dito sítio alvo está em umacélula.

101. Método de acordo com a reivindicação 100,caracterizado ' pelo fato de que dito sítio alvo éestavelmente incorporado no genoma da célula,

102. Método de acordo com a reivindicação 98 ou 99,caracterizado pelo fato de que pelo menos um de ditaprimeira, dita segunda, ou dita primeira e dita segundarecombinase compreende uma FLP recombinase.

103. Método de acordo com a reivindicação 102,caracterizado pelo fato de que dita primeira ou ditasegunda recombinase compreende, ainda, uma recombinase Cre.

104. Método de acordo com a reivindicação 100,caracterizado pelo fato de que- pelo menos umpolinucleotideo codificando pelo menos dita primeira oudita segunda recombinase é estavelmente incorporado nogenoma da célula.

105. Método de acordo com a reivindicação 97 ou 98,caracterizado pelo fato de que pelo menos um de ditos "sitios de recombinação dissimilares e não recombinogênicosé selecionado do grupo consistindo de um sitio FRTf umvariante biologicamente ativo do sitio FRT, um sitio LOX, eum variante biologicamente ativo do sitio LOX.

106. Método de acordo com a reivindicação 105,caracterizado pelo fato de que um de ditos sitios derecombinação dissimilares e não recombinogênicos compreendeum sitio FRT ou um variante biologicamente ativo do sitioFRT.107. Método de acordo com a reivindicação 106,caracterizado pelo fato de que dito variante biologicamenteativo do sitio FRT é FRT 5 (SEQ ID N0:40), FRT 6 (SEQ IDNO: 41) , FRT 7 (SEQ ID NO:42), ou FRT 87 (SEQ ID NO: 24).

108. Método de acordo com a reivindicação 102 ou 103,caracterizado pelo fato de que a FLP recombinase ou arecombinase Cre é codificada por um polinucleotídeo tendocódons preferenciais de milho.

109. Método de acordo com a reivindicação 102,caracterizado pelo fato de que dita primeira, dita segunda,ou dita primeira e dita segunda recombinase compreende umaFLP recombinase.

110. Método de acordo com a reivindicação 102,caracterizado pelo fato de que dita primeira, dita segunda,ou dita primeira e dita segunda recombinase compreende uma'recombinase Cre.

111. Método de acordo com a reivindicação 98 ou 99,caracterizado pelo fato de que prover pelo menos uma dedita primeira ou dita segunda recombinase compreendetransformação.

112. Método de acordo com a reivindicação 98 ou 99,caracterizado pelo fato de que prover pelo menos uma dedita primeira ou dita segunda recombinase compreendecruzamento sexuado.

113. Método de acordo com a reivindicação 98 ou 99,caracterizado pelo fato de que introduzir pelo menos um dedito primeiro ou dito segundo cassete de transferênciacompreende transformação.

114. Método de acordo com a. reivindicação 98 ou 99,caracterizado pelo fato de que introduzir pelo menos um dedito primeiro ou dito segundo cassete de transferênciacompreende cruzamento sexuado.

115. Método de acordo com a reivindicação 98 ou 99,caracterizado pelo fato de que pelo menos um de ditoprimeiro, dito segundo, ou dito terceiro sítios derecombinação compreende SEQ ID N0:21, 22, 23, 25, 26, 27,-28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, ou 38 ou umvariante funcional dessas, caracterizado pelo fato de que'dito variante funcional é substancialmente idêntico a SEQID NO: 21, 22, 23, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34,·-35, 36, 37, ou 38.

116. Método de acordo com a reivindicação 115,caracterizado pelo fato de que pelo menos um de ditoprimeiro, dito segundo, ou dito terceiro sítio derecombinação compreende SEQ ID NO: 21, 22, 23, 25, 26, 27,-28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, ou 38.117. Método para inverter um polinucleotídeo de interessecompreendendo:

a) prover um sitio alvo compreendendo opolinucleotídeo de interesse flanqueado por umprimeiro e um segundo sitio' de recombinação, ditoprimeiro e dito segundo sítios de recombinaçãosão recombinogênicos com respeito um ao outro eestão em uma orientação invertida relativo um aooutro; e pelo menos um de dito primeiro e ditosegundo sítio de recombinação compreende umaseqüência de espaçamento selecionada do grupoconsistindo de SEQ ID NOS: 1, 2, 3, 5, 6, 7, 8,9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, e 18; e,

b) prover uma FLP recombinase, caracterizado pelofato de que dita FLP recombinase reconhece eimplementa recombinação no primeiro e no segundosítios de recombinação, invertendo, dessa forma, 'o polinucleotídeo de interesse.

118. Método para excisar um polinucleotídeo de interessecompreendendo:

a) prover um sítio alvo compreendendo umpolinucleotídeo de interesse flanqueado por umprimeiro e um segundo sítio de recombinação, ditoprimeiro e dito segundo sítios de recombinaçãosão 'recombinogênicos com respeito um ao outro eestão em uma orientação diretamente repetidarelativo um ao outro; e pelo menos um de ditoprimeiro e dito segundo sitio de. recombinaçãocompreende uma seqüência de espaçamentoselecionada do grupo consistindo de SEQ ID NOS:1, 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15,16, 17, e 18;

b) prover uma FLP recombinase, caracterizado pelofato de que dita FLP recombinase reconhece eimplementa recombinação no primeiro e no segundositios de recombinação, excisando, dessa forma, opolinucleotideo de interesse.

119. Método de acordo com a reivindicação 117 ou 118,caracterizado pelo fato de que dito sitio alvo está em umacélula.

120. Método de acordo com a reivindicação 119,"caracterizado pelo fato de que dito sitio alvo éestavelmente incorporado no genoma da célula.

121. Método de acordo com a reivindicação 75, 76, 77, 79,82, 90, 91, 119 ou 120, caracterizado pelo fato de que ditacélula é uma célula vegetal.

122. Método de acordo com a reivindicação 119,caracterizado pelo fato de que dito método ocorre em umacélula tendo estavelmente incorporado em seu genoma umaseqüência de nucleotideos codificando dita FLP recombinase.

123. Método de acordo com a reivindicação 113, 117, il8, ou122, caracterizado pelo fato de que a FLP recombinase écodificada por um polinucleotideo tendo códonspreferenciais de milho.

124. Método de acordo com a reivindicação 113, 117 ou 118,caracterizado pelo fato de que dita recombinase compreendea FLP recombinase.

125. Método de acordo com a reivindicação 119,caracterizado pelo fato de que prover dito sitio alvocompreende transformação.

126. Método de acordo com a reivindicação 119,caracterizado pelo fato de que prover dito sitio alvocompreende cruzamento sexuado.

127. Método de acordo com a reivindicação 119,caracterizado pelo fato de que prover dita FLP recombinasecompreende transformação.

128. Método de acordo com a reivindicação 119,caracterizado pelo fato de que prover dita FLP recombinasecompreende cruzamento sexuado.

129. Método de' acordo com a reivindicação 113, 117 ou 118,caracterizado pelo fato de que dito primeiro e dito segundositios de recombinação compreendem SEQ ID NO:21, 22, 23,25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, ou 38ou um variante funcional dessas, caracterizado pelo fato deque dito variante funcional é substancialmente idêntico aSEQ ID NO:21, 22, 23, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33,34, 35, 36, 37, ou 38.

130. Método de acordo com a reivindicação 129,caracterizado pelo fato de que dito primeiro e dito segundositios de recombinação compreendem uma seqüência denucleotideos selecionada do grupo consistindo de SEQ IDNOS: 21, 22, 23, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34,35, 36, 37, e 38.

131. Método de acordo com a reivindicação 121,caracterizado pelo fato de que dita célula vegetal é umacélula de planta monocotiledônea.

132. Método de acordo com a reivindicação 131,caracterizado pelo fato de que dita célula monocotiledôneaé de milho, cevada, milhete, trigo, sorgo, centeio, ouarroz.

133. Método de acordo com a reivindicação 121,caracterizado pelo fato de que dita célula vegetal é umacélula de planta dicotiledônea.134. Método de acordo com a reivindicação 133,caracterizado pelo fato de que dita célula dicotiledônea desoja, canola, alfafa, girassol, cártamo, tabaco,Arabidopsisl ou algodão.

135. Método de acordo com a reivindicação 72, 117, ou 118,caracterizado pelo fato de que dito primeiro e dito segundosítios de recombinação são correspondentes.

136. Método de acordo com a reivindicação 72 ou 135,caracterizado pelo fato de que dito primeiro e dito segundosítios de recombinação compreendem SEQ ID NO: 21, 22, 23,25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, ou 38ou um variante funcional dessas, caracterizado pelo fato deque dito variante funcional é substancialmente idêntico aSEQ ID NO: 21, 22, 23, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33,34, 35, 36, 37, ou 38.

137. Método de acordo com a reivindicação 136,caracterizado pelo fato de que dito primeiro e dito segundosítios de recombinação compreendem uma seqüência denucleotídeos selecionada do grupo consistindo de SEQ IDNOS: 21, 22, 23, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34,35, 36, 37, e 38.

138. Método de acordo com a reivindicação 73, caracterizadopelo fato de que dito sítio alvo é operacionalmente ligadoa um primeiro e um segundo promotor convergente; ditocassete de tránsferência compreendendo, na seguinte ordem,o primeiro sítio de recombinação funcional, umpolinucleotídeo de interesse orientado na direção 5' a 3',um segundo polinucleotídeo de interesse orientado nadireção 3· a 5\ e o segundo sítio de recombinaçãofuncional; caracterizado pelo fato de que a inserção docassete de transferência no sítio alvo resulta no primeiropolinucleotídeo de interesse operacionalmente ligado aoprimeiro promotor convergente e o segundo polinucleotídeode interesse operacionalmente ligado ao segundo promotorconvergente.

139. o polinucleotídeo isolado de acordo com areivindicação 30, caracterizado pelo fato de que ditopolinucleotídeo compreende um primeiro convergente, oprimeiro sítio de recombinação, o segundo sítio derecombinação, e o segundo promotor convergente.

140. O polinucleotídeo isolado de acordo com areivindicação 139, caracterizado pelo fato de que dito "polinucleotídeo compreende o primeiro promotor convergente,o primeiro sítio de recombinação, uma primeira seqüência de.polinucleotídeos de interesse operacionalmente ligada adito primeiro promotor convergente, um segundopolinucleotídeo de interesse operacionalmente ligado a ditopromotor convergente e o segundo promotor convergente.

141. Método de excisar ou inverter um polinucleotídeo deinteresse compreendendo:a) prover um polinucleotídeo compreendendo, naseguinte ordem, um primeiro sitio de recombinaçãofuncional compreendendo uma seqüência deespaçamento selecionada do grupo consistindo deSEQ ID NOS: 1, 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12,13, 14, 15, 16, 17 e 18, o polinucleotídeo deinteresse, e um segundo sítio de recombinaçãofuncional, caracterizado pelo fato de que ditoprimeiro e dito segundo sítios de recombinaçãosão recombinogênicos com respeito um ao outro; e,

b) prover uma recombinase ou um variantebiologicamente ativo de dita recombinase,caracterizado pelo fato de que dita recombinasereconhece e implementa recombinação no primeiro eno segundo sítios de recombinação, caracterizadopelo fato de que a seqüência de polinucleotídeosde interesse é excisada ou invertida.

142. Método de acordo com a reivindicação 141,caracterizado pelo fato de que dito primeiro e dito segundosítios de recombinação são idênticos.

143. Método de acordo com a reivindicação 141 ou 142,caracterizado pelo fato de que dito primeiro sítio derecombinação, dito segundo sítio de recombinação, ou ambos,compreendem SEQ ID NO:21, 22, 23, 25, 26, 27, 28, 29, 30,31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, ou 38 ou um variante funcionaldessas, caracterizado pelo fato de que dito variantefuncional é substancialmente idêntico a SEQ ID NO: 21, 22,23, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, ou 38.

144. Método de acordo com a reivindicação 143,caracterizado pelo fato de que dito primeiro· sitio derecombinação, dito segundo sitio de recombinação, ou ambos,compreendem uma seqüência de nucleotideos selecionada dogrupo consistindo de SEQ ID NOS: 21, 22, 23, 25, 26, 27,28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, e 38.

145. Método de acordo com a reivindicação 1 a 11, 46, 48,52 a 82, 84, 85, 89, 94, 95, 98 a 138 ou 141 a 144,caracterizado pelo fato de que dita recombinase é umvariante biologicamente ativo da recombinase nativa.

Várias populações de sítios de recombinação FRTmodificados são providas, incluindo, por exemplo, umabiblioteca isolada de moléculas compreendendo uma populaçãode plasmídios onde cada plasmídio na população compreendeum marcador de seleção comum; e, cada plasmídio napopulação compreende um membro de uma população de sítiosde recombinação FRT modificados. A população podecompreender pelo menos cerca de 5 membros distintos dapopulação de plasmídios. Outras composições incluem, umabiblioteca isolada onde os membros da população de sítiosde recombinação FRT modificados compreendem um variante deuma região de espaçamento, como relatado em SEQ ID NO: 43,caracterizado pelo fato de que o variante compreende pelomenos uma alteração de nucleotídeo em SEQ ID NO: 43.Outras composições incluem uma biblioteca isolada onde ossítios de recombinação FRT modificados compreendem umapopulação de sítios de recombinação FRT modificadosfuncionais.

Composições incluem ainda kits compreendendo duaspopulações de plasmídios. Os plasmídios na primeirapopulação compreendem um primeiro marcador de seleçãocomum; .e,- cada dos plasmídios na primeira populaçãocompreende um membro de uma população de sítios derecombinação FRT modificados. A segunda população deplasmídios compreende um segundo e distinto marcador deseleção comum; e, cada dos plasmídios na segunda populaçãocompreende um membro da população de sítios de recombinaçãoFRT modificados. 0 kit por compreender, ainda, uma FLPrecombinase, um variante biologicamente ativo da FLPrecombinase, um polinucleotídeo codificando uma FLPrecombinase, ou um polinucleotídeo codificando um variantebiologicamente ativo da FLP recombinase.

Métodos para selecionar um sítio de recombinação FRTmodificado recombinogênico são também providos. O métodocompreende prover uma primeira população de plasmídios ondecada dos plasmídios na primeira população compreenda umprimeiro marcador de seleção comum; e, cada dos plasmídxosna primeira população compreenda um membro de uma populaçãode sítios de recombinação FRT modificados. Uma segundapopulação de plasmídios é provida onde cada dos plasmídiosna segunda população compreende um segundo distintomarcador de seleção comum; e, cada dos plasmídios nasegunda população compreende um membro da população desítios de recombinação FRT modificados. A primeira

população de plasmídios é combinada com a segunda populaçãode plasmídios na presença de uma FLP recombinase ou umvariante biologicamente ativo da FLP recombinase, sobcondições que permitem a integração mediada porrecombinase. Um plasmídio co-integrante compreendendo

ambos primeiro e segundo marcadores de seleção éselecionado, caracterizado pelo fato de que o plasmídio co-integrante compreende pelo menos um sítio de recombinaçãoFRT modificado.

Métodos compreendem, ainda, isolar o plasmídio co-integrante e/ou caracterizar o sítio de recombinação FRTmodificado do plasmídio co-integrante. Caracterizar osítio de recombinação FRT modificado pode compreenderdeterminar a eficiência de excisão de recombinação e/ou"determinar a seqüência do sítio de recombinação FRTmodificado.

Um método para gerar uma biblioteca de moléculas éainda provido. O método compreende prover uma população desítios de recombinação FRT modificados; e, promover ocontato da população de sítios de recombinação FRTmodificados com uma população de plasmídios tendo ummarcador de seleção comum sob condições que permitem ainserção da população de sítios de recombinação FRTmodificados na população de plasmidios, de forma que cadados plasmidios da população compreenda um membro dapopulação de sítios de recombinação FRT modificados.

Composições adicionais incluem um polinucleotídeoisolado compreendendo pelo menos um sítio de recombinaçãoFRT modificado funcional, onde o sítio de recombinação FRTmodificado funcional compreende uma seqüência deespaçamento selecionada do grupo consistindo de SEQ IDNOS:1, 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17,e 18. Outras composições incluem um polinucleotídeoisolado compreendendo uma seqüência de nucleotídeoscompreendendo pelo menos um sítio de recombinação FRTmodificado funcional compreendendo a seqüência denucleotídeos relatada em SEQ ID NOS: 21, 22, 23, 25, 26,27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, ou 38 ou umvariante funcional dessas, onde o variante possuiidentidade de seqüência substancial a SEQ ID NOS:21, 22,23, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, ou 38 .

São também providos organismos, incluindo, porexemplo, procariotos, tais como bactérias, e eucariotos,tais como leveduras, mamíferos, insetos, vermes, plantas,células vegetais, e sementes compreendendo ospolinucleotídeos citados compreendendo um sítio derecombinação FRT modificado. Em exemplos específicos, ospolinucleotídeos são estavelmente integrados no genoma doorganismo.Métodos são também providos, incluindo métodos paraproduzir recombinação sitio-especifica de DNA. Em algunsexemplos, a recombinação sitio-especifica é uma reaçãointramolecular, em outros exemplos a recombinação sitio-especif ica é uma reação intermolecular. A recombinaçãositio-especif ica pode ser feita in vitro ou in vivo. Areação de recombinação sitio-especifica in vivo pode serfeita em qualquer célula, incluindo células procariontes oueucariontes. Em alguns exemplos, as células são de umaplanta. Métodos adicionais empregam vários métodos derecombinação para permitir a inserção direcionada, troca,alteração, expressão, excisão e/ou inversão de qualquerpolinucleotideo(s) de interesse. Em um exemplo, a métodopara direcionar a inserção de um polinucleotideo deinteresse a um sitio alvo é provido. 0 método compreendeprover o sitio alvo, caracterizado pelo fato de que o sitioalvo compreende um primeiro e um segundo sítios derecombinação funcionais, o primeiro e o segundo sítios derecombinação funcionais são dissimilares e nãorecombinogênicos com respeito um ao outro; e pelo menos umdo primeiro e segundo sítios de recombinação compreende umsítio de recombinação FRT modificado aqui descrito. Umcassete de transferência é provido, caracterizado pelo fatode que o cassete de transferência compreende opolinucleotideo de interesse flanqueado pelo primeiro esegundo sítios de recombinação. Pelo menos uma recombinaseé provida. A recombinase reconhece e implementarecombinação no primeiro e segundo sítios de recombinação.O método pode ocorrer in vitro ou in vivo. Em exemplosespecíficos, o sitio alvo é estavelmente incorporado nogenoma de um organismo.

Em outro exemplo, um método para direcionar a inserçãode um polinucleotídeo de interesse é provido. O métodocompreende prover um sítio alvo tendo pelo menos umprimeiro sítio de recombinação funcional. Um cassete detransferência é provido compreendendo um polinucleotídeo deinteresse e pelo menos um segundo sítio de recombinaçãofuncional, caracterizado pelo fato de que o segundo sítiode recombinação funcional é recombinogênico com o primeirosítio de recombinação funcional, e o primeiro e/ou segundosítio de recombinação compreendem um sítio FRT modificadoaqui descrito. Em alguns exemplos, o primeiro e o segundosítios de recombinação têm a mesma seqüência. Pelo menosuma recombinase é provida. A recombinase reconhece eimplementa recombinação no primeiro e segundo sítios derecombinação. O método pode ocorrer in vitro ou in vivo.Em exemplos específicos, o primeiro sítio de recombinaçãofuncional é estavelmente incorporado no genoma de umorganismo. Em alguns exemplos, o polinucleotídeo deinteresse e/ou o alvo pode ser, mais tarde, excisado,invertido, ou modificado de outra forma, por exemplo, pelaadição de um segundo polinucleotídeo de interesse no sítioalvo.

Em outros exemplos, métodos para avaliar a atividadepromotora, métodos para selecionar diretamente organismostransformados, métodos para minimizar ou eliminar aexpressão resultante de integração randômica no genoma deum organismo, tal como uma planta, métodos para excisar ouinverter um polinucleotideo de interesse, métodos paracombina múltiplos cassetes de transferência, métodos paradeterminar a eficiência de excisão ou eficiência de co-integração de um grupo de sítios de recombinação FRT,métodos para identificar sítios de recombinaçãorecombinogênicos ou não recombinogênicos, métodos paralocalizar sítios de integração preferidos no genoma" de umorganismo, métodos para recombinar moléculas de DNA ambosin vitro e in vivo, métodos para reduzir impacto agronômiconão específico da inserção de um polinucleotideo deinteresse, tais como reduzir a dificuldade de produção, e,métodos para identificar elementos reguladores eis em umorganismo, tal como uma planta, são também providos.

O sítio de recombinação FRT de tipo selvagem mínimofoi caracterizado e compreende uma série de domíniosincluindo a seguinte seqüência de nucleotídeos5 '-AGTTCCTATTCTCTAGAAAGTATAGGAACT-3' (SEQ ID NO:39). Osdomínios do sítio de recombinação FRT mínimo compreende umpar de elementos de simetria de 11 pares de base que são ossítios de ligação FLP (nucleotídeos 1-11 e 20-30. de SEQ IDNO:39);. a região núcleo de 8 pares de base, ou região deespaçamento (nucleotídeos 12-19 de SEQ ID NO:39); e, ostraços de polipirimidina (nucleotídeos 3-14 e nucleotídeos16-29 de SEQ ID NO: 39) . Um sítio de recombinação FRTmodificado pode compreender 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10ou mais alterações que incluem substituições, adições, e/oudeleções em um ou mais desses domínios.

Sítios de recombinação FRT modificados são providos.Um sítio de recombinação FRT modificado é uma seqüência denucleotídeos que é similar, mas não idêntica- ao sítio derecombinação FRT nativo mínimo relatado em SEQ ID NO:39.Enquanto o sítio de recombinação FRT modificado pode serfuncional, um sítio de recombinação FRT modificado nãoprecisa reter atividade. A menos que notado de outraforma, um sítio de recombinação FRT modificado retém aatividade biológica do sítio de recombinação FRT de tiposelvagem e compreende um sítio de recombinação funcionalque é reconhecido por uma FLP recombinase e capaz de umareação de recombinação mediada por recombinase. Assim, umsítio de recombinação FRT modificado pode compreender umadeleção, adição, e/ou substituição de um ou maisnucleotídeos na extremidade 5' ou 3' do sítio derecombinação FRT nativo mínimo, em um ou mais sítiosinternos no sítio de recombinação FRT nativo mínimo.Geralmente, sítios de recombinação modificados terão pelomenos cerca de 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 76%,77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%,89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oumais de identidade de seqüência ao sítio de recombinaçãonativo mínimo pelo seu comprimento completo ou em relação aqualquer domínio aí contido. Por exemplo, um sítio derecombinação FRT modificado terá a % de identidade deseqüência citada em relação à seqüência de nucleotídeos FRTnativa minima; em relação aos elementos 'de simetria daseqüência FRT nativa minima; em relação à seqüência deespaçamento da seqüência FRT de tipo selvagem; e/ou, emrelação ao(s) traço(s) de polipirimidina do sitio FRTnativo minimo, como determinado por programas dealinhamento de seqüências e parâmetros aqui descritos emoutra parte. O sitio de recombinação FRT modificadopoderia, portanto, incluir 1, 2, 3, 4, 5, 8, 10, 12, 13,14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 28, 29 oumais substituições, adições, e/ou deleções de nucleotideosatravés de todo o comprimento do sitio de recombinaçãominimo, ou alternativamente, em cada dos vários dominios dositio de recombinação como ressaltado acima.

Um fragmento é uma porção de uma seqüência denucleotideos, ou de qualquer domínio caracterizado aicontido. Por exemplo, um fragmento de um sitio derecombinação FRT modificado poderia ser uma porção do sitiode recombinação FRT nativo minimo, uma porção de um ouambos elementos de simetria, uma porção da região deespaçamento e/ou uma porção do(s) traço(s) depolipirimidina do sitio FRT nativo. Enquanto os fragmentosde um sitio de recombinação modificado não precisam teratividade biológica, em alguns exemplos, os fragmentos dossitios de recombinação podem reter a atividade biológica dositio de recombinação, e dessa forma, os fragmentos podemser funcionais. A menos que notado de outra forma, umfragmento de sitio de recombinação FRT modificado retém aatividade biológica do sitio de recombinação FRT de tiposelvagem. Por exemplo, fragmentos de um sitio derecombinação FRT modificado podem variar de pelo menoscerca de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15,16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, ou30 nucleotideos. Fragmentos de um sítio de elemento desimetria modificado podem variar de pelo menos cerca de 2,3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, ou 11 nucleotideos, fragmentos deuma seqüência de espaçamento podem variar de pelo menoscerca de 1, 2, 3, 5, 6, ou 7 de uma região de espaçamentoFRT de tipo selvagem mínima, e fragmentos de um traço depolipirimidina podem variar de pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6,7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, ou 14 nucleotideos.

Em outros exemplos, sítios de recombinação FRTmodificados possuem mutações, tais como alterações,adições, deleções no domínio de espaçamento de 8 pares debase. Exemplos não limitantes de domínios espaçadoresmodificados são relatados em SEQ ID NO:l, 2, 3, 4, 5, 6, 7,8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 ou 18. Em exemplosespecíficos, os sítios FRT modificados são funcionais. Emoutros exemplos, sítios de recombinação FRT modificadoscompreendem as regiões de espaçamento relatadas em SEQ IDNOS:1-18 e compreendem adicionalmente sítios de ligação FLPde elemento de simetria que correspondem àquelesencontrados no sítio de recombinação FRT nativo mínimo.Ver, SEQ ID NOS:19 e 20 mostrando seqüências de elementosde simetria de tipo selvagem. Tais sítios de recombinaçãoFRT modificados são relatados em SEQ ID NOS:21-38. Emexemplos específicos, os sítios FRT modificados sãofuncionais. Em outros exemplos, sitios de recombinação FRTmodificados podem compreender a seqüência de espaçamentorelatada em SEQ ID NOS: 1-18 e compreendem, ainda, uma oumais modificações dos elementos de simetria relatados emSEQ ID NOS: 19 e 20. Em exemplos específicos, os sítios FRTmodificados são funcionais. Modificações dos elementos desimetria (seqüências de nucleotídeos na posição 1 a 11 e 20a 30 de SÈQ ID NOS:21-38) podem incluir 1, 2, 3, 4, 5, 6,7, 8, 9, 10 ou mais substituições, adições, deleções, oumodificações da seqüência de nucleotídeos dos elementos desimetria de tipo selvagem relatados em SEQ ID NOS:19 e 20.

Em outros exemplos, as modificações dos elementos desimetria são substancialmente idênticas a SEQ ID NOS:21-28.Identidade de seqüência substancialmente idêntica ousubstancialmente similar refere-se a uma seqüência denucleotídeos tendo pelo menos uma, duas, ou trêssubstituições, deleções, e/ou adições se comparado a umareference seqüência. Assim, por um variantesubstancialmente idêntico de um sítio de recombinação FRTmodificado pretende-se um variante de um sítio derecombinação FRT modificado funcional compreendendo aseqüência de nucleotídeos relatada em SEQ ID N0:21, 22, 23,24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 43, 35, 36, 37, ou38, caracterizado pelo fato de que o variante funcionalcompreende A) uma, duas ou três alterações, substituições,adições e/ou deleções entre as posições de nucleotídeo 1 a11 de SEQ ID NO:21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,32, 33, 43, 35, 36, 37, ou 38; B) uma, duas ou trêsalterações, substituições, adições e/ou deleções entre asposições de nucleotideo 20 a 30 de SEQ ID NO:21, 22, 23,24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 43, 35, 36, 37, ou38; e/ou C) qualquer combinação de A e B. Em exemplosespecíficos, o sítio de recombinação FRT modificadocompreende as seqüências de espaçamento de SEQ ID NOS:1-18e variantes funcionais dos elementos de simetria.Variantes funcionais de FRT elementos de simetria sãoconhecidos, ver,' por exemplo, Senecoff et ai. (1988) J MolBiol 201:406-421 e Voziyanov et al. (2002) Nucleic Acid Res30:7. Em certos exemplos, mais de um sítio de recombinaçãopode ser usado em uma composição ou método.

Como discutido acima, um sítio de recombinaçãomodificado pode ser funcional. Um sítio de recombinaçãofuncional é um sítio de recombinação que é recombinogênicocom um sítio de recombinação na presença da recombinaseapropriada, a menos que notado ao contrário, um sítio derecombinação é funcional e inclui sítios de tipo selvagem,sítios modificados, variantes, e fragmentos. Métodos paradeterminar se um sítio de recombinação modificado érecombinogênico são conhecidos. Como aqui usado, um sítiode recombinação variante funcional compreende um sítio derecombinação modificado funcional.

Os sítios de recombinação empregados nos métodos podemser sítios correspondentes ou sítios dissimilares. Sítiosde recombinação correspondentes, ou um grupo de sítios derecombinação correspondentes refere-se a sítios derecombinação tendo a mesma seqüência de nucleotídeos. Emoutros exemplos, os sítios de recombinação sãodissimilares. Sitios de recombinação dissimilares, ou umgrupo de sitios de recombinação dissimilares, são sitios derecombinação que são distintos um do outro por possuírempelo menos uma diferença de nucleotideo. Os sitios derecombinação em um grupo de sitios de recombinaçãodissimilares podem ser tanto recombinogênicos ou nãorecombinogênicos com respeito um ao outro. Recombinogênicorefere-se a sitios de recombinação capazes de se recombinarum com o outro. A menos que declarado ao contrário, sitiosde recombinação recombinogênicos ou um grupo de sitios derecombinação recombinogênicos incluem aqueles sitios onde aeficiência relativa de excisão de recombinação entre ossitios é maior do que 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 75%,100%, ou maior. Como aqui definido, a eficiência relativade excisão de recombinação é a eficiência de excisão napresença da recombinase nativa de um primeiro sitio derecombinação modificado com um segundo sitio· derecombinação modificado divido pela eficiência de excisãode um par dos sitios de recombinação nativos apropriados X100%. Por exemplo, quando trabalhando com sitios FRTmodificados, a eficiência, relativa de excisão derecombinação é definida como a eficiência de excisão napresença de FLP nativa (SEQ ID NO: 49) de um primeiro sitioFRT modificado com um segundo sitio FRT modificado dividopela eficiência excisão de um par de sitios FRT nativos(FRT1, SEQ ID NO:39). Não recombinogênico refere-se aSitios de recombinação que na presença da recombinaseapropriada não recombinará um com o outro, ou arecombinação entre os sítios é mínima. ' A menos quedeclarado ao contrário, sítios de recombinação nãorecombinogênicos, ou um grupo de sítios de recombinaçãorecombinogênicos incluem aqueles sítios onde a eficiênciarelativa de excisão de recombinação entre os sítios é menordo que 2%, 1,5%, 1%, 0,75%, 0,5%, 0,25%, 0,1%, 0,075,0,005%, 0,001%. Conseqüentemente, qualquer grupo adequadode sítios de recombinação não recombinogênicos e/ourecombinogênicos pode ser utilizado, incluindo um sítio FRTou variante funcional desses, um sítio LOX ou variantefuncional desse, qualquer combinação desses, ou qualqueroutra combinação de não recombinogênicos e/ou sítios derecombinação conhecida.

Métodos para identificar sítios de recombinaçãodissimilares e não recombinogênicos são providos. Em ummétodo, um primeiro sítio de recombinação FRT compreendendouma seqüência de espaçamento selecionada do grupoconsistindo de SEQ ID NOS: 1, 2, 3, 5, 6, I1 8, 9, 10, 11,12, 13, 14, 15, 16, 17, e 18 é provido. Um segundo sítiode recombinação FRT dissimilar é provido, junto com uma FLPrecombinase sob condições que permitem dita FLP recombinaseimplementar um evento de recombinação. A recombinação étestada para determinar se o primeiro e o segundo sítios derecombinação são não recombinogênicos com respeito um aooutro. Em exemplos específicos, o primeiro e o segundosítios de recombinação são providos no mesmopolinucleotídeo, enquanto em outros exemplos, o primeiro eo segundo sítios de recombinação sãò providos empolinucleotideos distintos.

Em um exemplo, um método para determinar a eficiênciade recombinação, tal como eficiência relativa de excisão oueficiência relativa de co-integração de um primeiro e umsegundo sítios de recombinação FRT, é provido. Porexemplo, um método para determinar a eficiência de excisãocompreende prover um polinucleotídeo compreendendo oprimeiro e o segundo sítio de recombinação FRTcaracterizado pelo fato de que a seqüência de espaçamentopara pelo menos o primeiro e/ou o segundo sítio FRT éselecionada do grupo consistindo de SEQ ID NOS: 1, 2, 3, 4,5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, e 18 ou umvariante dessas; e, prover uma FLP recombinase sobcondições que permitem à FLP recombinase implementar umevento de excisão mediado por recombinase. A eficiência deexcisão de recombinação é determinada. Métodos para testareficiência de excisão de recombinação são conhecidos. Porexemplo, no Exemplo 3, vetores de excisão compreendendoduas cópias de um sítio de recombinação FRT modificado emorientação direta são usados. Testes in vivo ou in vitropodem ser usados para determinar se os dois sítios derecombinação FRT modificados são capazes de mediar aexcisão na presença de FLP recombinase.

Em outro exemplo, um método para determinar aeficiência relativa de co-integração é provido. O métodocompreende prover um primeiro polinucleotídeo compreendendoum primeiro sitio de recombinação FRT e prover um segundopolinucleotideo compreendendo um segundo sitio derecombinação FRT, caracterizado pelo fato de que aseqüência de espaçamento de um deles ou ambos primeiro esegundo sítios de recombinação é selecionada do grupoconsistindo de SEQ ID NOS: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10,11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, e 18 ou uma variante dessas; e,prover uma FLP recombinase sob condições que permitem que aFLP recombinase implemente um evento de integração mediadopor recombinase. A eficiência relativa de co-integração édeterminada. A eficiência relativa de co-integração de umgrupo de sítios FRT é definida como a eficiência de co-integração do primeiro sítio FRT modificado com um segundosítio FRT comparada à eficiência de co-integração dequalquer dado sítio FRT escolhido como um padrãoapropriado, tal como um FRTl mínimo de tipo selvagem (SEQID NO: 39) . Um sítio de recombinação FRT modificadofuncional pode ter uma eficiência de co-integração de cercade 2%, 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%,90%, 95%, ou 100%, ou maior para o padrão relativo,mostrado, por exemplo, no Exemplo 4.

Em um exemplo, o primeiro e o segundo sítios derecombinação FRT ' possuem seqüências de nucleotídeoscorrespondentes. Ainda em outro exemplo, o primeiro e osegundo sítios de recombinação FRT são dissimilares.Portanto, vários grupos e combinações de sítios derecombinação FRT podem ser identificados, tais como gruposde sítios FRT funcionais, dissimilares, sítios FRT nãorecombinogênicos, funcionais, dissimilares, sitiosrecombinogênicos, e/ou grupos de sitios FRT funcionaisrecombinogênicos correspondentes.

Um ou mais dos sitios de recombinação FRT modificadospodem estar contidos em um polinucleotideo. Em um exemplo,o polinucleotideo compreende uma ou mais unidades deexpressão. Uma unidade de expressão é uma seqüência denucleotideos compreendendo uma unidade de DNA caracterizadopor ter um único promotor transcricional.

Alternativamente, o polinucleotideo contendo o sitio derecombinação FRT modificado não necessita conter umpromotor e/ou seqüências reguladoras abaixo. Em outrosexemplos, o polinucleotideo compreendendo o sitio derecombinação modificado pode ser projetado de forma que comintegração no genoma, as seqüências contidas nopolinucleotideo estejam operacionalmente ligadas a umpromotor ativo. É reconhecido que um polinucleotideo podeter elementos adicionais incluindo, mas não limitando-se a,seqüências de nucleotideos de interesse, genes marcadores,sitios de recombinação, regiões de terminação, etc. Comoilustrado abaixo, o polinucleotideo pode compreendercassetes de transferência, sitios alvo, ou quaisquerporções desses.

Um polinucleotideo, ou proteína, isolado oupurificado, ou porção biologicamente ativa desse, ésubstancialmente ou essencialmente sem componentes quenormalmente acompanham ou interagem com o polinucleotideoou proteína, como encontrado em seu ambiente naturalmenteocorrente. Um polinucleotideo, ou proteína, isolado oupurificado é substancialmente livre de outro materialcelular, ou meio de cultura quando produzido por técnicasrecombinantes, ou substancialmente livre de precursoresquímicos ou outros químicos quando quimicamentesintetizados. Tipicamente, um polinucleotideo isolado élivre de seqüências que naturalmente flanqueiam asextremidades 5' e/ou 3' no DNA genômico do organismo doqual o polinucleotideo é derivado. Por exemplo, em váriosexemplos, o polinucleotideo isolado pode conter menos doque cerca de 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb, ou 0,1kb de seqüência de nucleotídeos que naturalmente flanqueiampolinucleotideo no DNA genômico da célula do qual opolinucleotideo é derivado. Uma proteína que ésubstancialmente livre de material celular incluipreparações de proteína tendo menos do que cerca de 30%,20%, 10%, 5%, ou 1% de peso seco de proteína contaminante.

Quando a proteína ou porção biologicamente ativa dessa érecombinantemente produzida, geralmente o meio de culturarepresenta menos do que cerca de 30%, 20%, 10%, 5%, ou 1%(por peso seco) de precursores químicos ou químicos que nãoda proteína de interesse.

Polinucleotídeos podem compreender ribonucleotídeos ecombinações de ribonucleotídeos e desoxirribonucleotídeos.

Tais desoxirribonucleotídeos e ribonucleotídeos incluemambas moléculas naturalmente ocorrentes e análogassintéticas. Polinucleotídeos também englobam todas asformas de seqüências incluindo, mas não 'limitando-se a,formas de fita simples, formas de dupla-fita, hairpins,estruturas stem-and-loop, e similares.

Em um exemplo, um polinucleotideo isolado é provido,caracterizado pelo fato de que o polinucleotideo compreendeum sitio de recombinação FRT modificado. Em exemplosespecíficos, o sítio de recombinação FRT modificado é aseqüência de polinucleotídeos. Por exemplo, é provido umpolinucleotideo isolado pode compreender pelo menos umsítio de recombinação FRT modificado funcional, onde osítio de recombinação FRT modificado funcional compreendeuma seqüência de espaçamento selecionada do grupoconsistindo de SEQ ID NOS:l, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10,11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, e 18. Em exemplos específicos,o sítio de recombinação FRT modificado é heterólogo aopolinucleotideo.

Heterólogo refere-se a um polipeptídeo ou umaseqüência de nucleotídeos que se origina de uma espéciediferente, ou se da mesma espécie, é substancialmentemodificado de sua forma nativa em composição e/ou lócusgenômico. Por exemplo, um sítio de recombinação heterólogoé um polinucleotideo não encontrado no polinucleotideonativo ou não é encontrado na mesma localidade nopolinucleotideo nativo, e/ou é modificado de sua composiçãonativa.

Em outros exemplos, um polinucleotideo isolado éprovido compreendendo uma seqüência de nucleotídeosrelatada em SEQ ID NO:21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29,30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, ou 38 ou um variantefuncional dessas. Em exemplos específicos, o variantefuncional compreende pelo menos um, dois, três, quatro,cinco, seis ou mais alterações entre as posições denucleotídeo 1 a 11 e/ou entre as posições de nucleotídeo 20a 30 de SEQ ID NO:21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30,31, 32, 33, 34, 35, 37, ou 38. Em outros exemplos, ovariante funcional é substancialmente idêntico à seqüênciarelatada em SEQ ID NO:21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29,30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, ou 38.

Um sítio de recombinação FRT modificado pode serintroduzido em um organismo de interesse. Introduzircompreende apresentar ao organismo pelo menos uma molécula,composição, polinucleotídeo, ou. polipeptídeo, de talmaneira que a composição ganhe acesso ao interior de umacélula. Os métodos não dependem de um método em particularpara introduzir um polinucleotídeo ou polipeptídeo em umorganismo, apenas que o polinucleotídeo ou polipeptídeoganhe acesso ao interior de pelo menos uma célula doorganismo.

Organismos de interesse incluem, mas não são limitadosa ambos organismos procariontes e eucariontes incluindo,por exemplo, bactérias, leveduras, insetos, mamíferosincluindo camundongos, humanos, e plantas. Em um exemplo,o organismo é uma planta.Métodos para prover ou introduzir uma composição emvários organismos são conhecidos e incluem, mas não sãolimitados a, métodos de transformação estável, métodos detransformação transiente, métodos mediados por virus, ecruzamento sexuado. Transformação estável indica que opolinucleotideo introduzido se integra no genoma doorganismo e é capaz de ser herdado pela progênie desse.Transformação transiente indica que a composiçãointroduzida é apenas temporariamente expressada ou presenteno organismo.

Protocolos para introduzir polinucleotideos epolipeptideos em plantas podem variar dependendo do tipo deplanta ou célula vegetal visado para transformação, talcomo monocotiledônea ou dicotiledônea. Métodos adequadospara introduzir polinucleotideos e.polipeptideos em célulasvegetais e subseqüente inserção no genoma vegetal incluemmicro injeção (Crossway et al. (1986) Biotechniques4:320-334; e U.S. Patent 6.300.543), transformação demeristema (U.S. Patent 5.736.369), eletroporação (Riggs etal. (1986) Proc Natl Acad Sci USA 83:5602-5606,transformação mediada por Agrobacterium (U.S. Patents5.563.055; e 5.981.840), transferência direta de gene(Paszkowski et al. (1984) EMBO J 3:2717-2722), e aceleraçãobalística de partículas (U.S. Patents 4.945.050; 5.879.918;5.886.244; 5.932.782; Tomes et al. (1995) "Direct DNATransfer into Intact Plant Cells via MicroprojectileBombardment," in Plant Cellf Tissuef and Organ Culture:Fundamental Methods, ed. Gamborg and Phillips (Springer-Verlag, Berlin); McCabe et al. (1988) Biotechnology6:923-926; Weissinger et al. (1988) Ann Rev Genet22:421-477; Sanford et al. (1987) Particulate Science andTechnology 5:27-37 (cebola); Christou et al. (1988) PlantPhysiol 87:671-674 (soja); Finer & McMullen (1991) In VitroCell Dev Biol 27P:175-182 (soja); Singh et al. (1998) TheorAppl Genet 96:319-324 (soja); Datta et al. (1990)Biotechnology 8:736-740 (arroz); Klein et al. (1988) ProcNatl Acad Sci USA 85:4305-4309 (milho); Klein et al. (1988)Biotechnology 6:559-563 (milho); U.S. Patents 5.240.855;5.322.783, and 5.324.646; Klein et al. (1988) Plant Physiol91:440-444 (milho); Fromm et al. (1990) Biotechnology8:833-839 (milho); Hooykaas-Van Slogteren et al. (1984)Nature 311:763-764; U.S. Patent No. 5.736.369 (cereais);Bytebier et al. (1987) Proc Natl Acad Sci USA 84:5345-5349(Liliaeeae) ; De Wet et al. (1985) in The ExperimentalManipulation of Ovule Tissues, ed. Chapman et al. (Longman,New York), pp. 197-209 (pólen); Kaeppler et al. (1990)Plant Cell Rep 9:415-418) e Kaeppler et al. (1992) TheorAppl Genet 84:560-566 (transformação mediada por fios decarbeto de silício); D'Halluin et al. (1992) Plant Cell4:1495-1505 (eletroporação); Li et al. (1993) Plant CellRep 12:250-255; Christou & Ford (1995) Annals of Botany75:407-413 (arroz); e, Osjoda et al. (1996) Nat Biotechnol14:745-750 (milho via Agrobacterium tumefaciens).

Alternativamente, os polinucleotídeos podem serintroduzidos em plantas levando as plantas em contato comum vírus ou ácidos nucléicos virais. Geralmente, taismétodos envolvem incorporar um polinucleotídeo em um DNAviral ou molécula de RNA. É reconhecido que umpolipeptídeo de interesse pode ser inicialmente sintetizadocomo parte de uma poliproteína viral, que mais tarde podeser processada por proteólise in vivo ou in vitro paraproduzir a proteína recombinante desejada. Ainda, éreconhecido que promotores também englobam promotoresutilizados para transcrição por RNA polimerases virais.Métodos para introduzir polinucleotídeos em plantas eexpressar um proteína aí codificada, envolvendo moléculasde DNA ou RNA viral, são conhecidos, ver, por exemplo, U.S.Patents 5.889.191, 5.889.190, 5.866.785, 5.589.367 e5.316.931.

Métodos de transformação transiente incluem, mas nãosão limitados a, a introdução de polipeptídeos, tais comoproteína recombinase, diretamente no organismo, aintrodução de polinucleotídeos, tais como polinucleotídeosde DNA e/ou RNA, e a introdução do transcrito de RNA, talcomo um RNAm codificando uma recombinase, no organismo.Tais métodos incluem, por exemplo, micro injeção oubombardeamento de partículas. Ver, por exemplo, Crosswayet al. (1986) Mol Gen Genet 202:179-185; Nomura et al.(1986) Plant Sci 44:53-58; Hepler et al. (1994) Proc NatlAcad Sci USA 91:2176-2180; e, Hush et al. (1994) J Cell Sci107:775-784.As células tendo a seqüência introduzida podem sercultivadas em plantas de acordo com meios convencionais,ver, por exemplo, McCormick et al. (1986) Plant Cell Rep5:81-84. Essas plantas pode ser, então, cultivadas, etanto polinizadas com a mesma linhagem transformada ou comuma linhagem diferente, e a progênie resultante expressar acaracterística fenotípica desejada e/ou compreender opolinucleotídeo ou polipeptídeo introduzido identificado.

Duas ou mais gerações podem ser cultivadas para assegurarque o polinucleotídeo está estavelmente mantido e herdado,e sementes colhidas. Dessa maneira, são providas sementestransformadas, também referidas como sementes transgênicas,tendo um polinucleotídeo, por exemplo, compreendendo umsítio FRT modificado, estavelmente incorporado em seugenoma.

Exemplos de gêneros e espécies de plantas de interesseincluem, mas não são limitados a, monocotiledôneas edicotiledôneas, tais como milho (Zea mays), Brassica sp.(e.g., B. napus, B. rapa, B. juncea), particularmenteaquelas espécies de Brassica úteis como fontes de óleo desemente, alfafa (Medicago sativa), arroz (Oryza satíva) ,centeio (Secale cereale), sorgo (Sorghum bicolor, Sorghumvulgare), milhete (e.g., milheto (Pennisetum glaucum),painço (Panicum miliaceum), painço português (Setariaitalica), capim (Eleusine coracana)), girassol (Helianthusannuus), cártamo (Carthamus tinctorius), trigo (Triticumaestivum), soja (Glyeine max), tabaco (Nieotiana tabaeum),batata (Solanum tuberosum), amendoim (Arachis hypogaea),algodão (Gossypium barbadense, Gossypium hirsutum) , batata-doce (Ipomoea batatus), mandioca (Manihot esculenta) , café(Coffea spp.), coco (Cocos nucifera) , abacaxi (Ananascomosus), árvores citricas (Citrus spp.), cacau (Theobromacacao), chá (Camellia sinensis), banana (Musa spp.), abacate(Persea americana), figo (Ficus casica) , goiaba (Psidiumguajava), manga (Mangifera indica), oliveira (Oleaeuropaea), mamão papaia (Carica papaya) , caju (Anacardiumoccidentale), macadâmia (Macadamia integrifolia) , amêndoa(Prunus amygdalus), beterraba (Beta vulgaris) , cana-de-açúcar (Saeeharum spp.), aveia (Avena) , cevada (Hordeum) ,palmeiras, leguminosas incluindo feijões e ervilhas, taiscomo guar, alfarrobeira, feno grego, soja, feijões dejardim, caupi, feijão mungo, feijão manteiga, fava,lentilhas, grão-de-bico, e ricino, Arabidopsis, verduras,ornamentais, gramineas, coniferas, plantas de cultivo egrãos que provêm sementes de interesse, plantas de óleo desementes, e outras plantas leguminosas. Verduras incluemtomates (Lyeopersieon eseulentum) , alface (e.g., Laetueasativa), feijões (Phaseolus vulgaris e Phaseolus limensis) ,ervilhas (Lathyrus spp.), e membros do gênero Cueumis, talcomo pepino (C. sativus), cantalupo (C. eantalupensis), emelão (C. melo). Ornamentais incluem azaléia (Rhododendronspp.), hortênsia (Maerophylla hydrangea) , hibisco (Hibiseusrosasanensis), rosas (Rosa spp.), tulipas (Tulipa spp.),narcisos (Nareissus spp.), petúnias (Petunia hybrida) , cravo(Dianthus earyophyllus), bico-de-papagaio (Euphorbiapuleherrima), e crisântemo. Coniferas incluem, por exemplo,pinheiros, tais como pinheiro da variedade loblolly (Pinustaeda), pinheiro, slash (Pinus elliotii), pinheiro ponderosa(Pinus ponderosa), pinheiro lodgepole (Pinus contorta) , epinheiro de Monterey (Pinus radiata) ; Pseudotsuga(Pseudotsuga menziesii); cicuta do oeste (Tsugacanadensis); espruce Sitka (Picea glauca); sequóia (Sequoiasempervirens); abetos verdadeiros, tais como abeto prateado(Abies amabilis) e bálsamo (Abies balsamea); e cedros, taiscomo cedro vermelho (Thuja plicata) e cedro-amarelo doAlasca (Chamaecyparis nootkatensis).

0 termo planta inclui células vegetais, protoplastosvegetais, culturas de tecidos de células vegetais das quaisplantas podem ser regeneradas, calos vegetais, moitas, ecélulas vegetais que são intactas em plantas ou partes deplantas, tais como embriões, pólen, óvulos, sementes,flores, grãos, espigas, sabugos, cascas, caules, raízes,pontas de raízes, anteras, e similares.

Células procariontes , podem ser também usadas nosmétodos. Procariontes incluem várias linhagens de E. coli;contudo, outras linhagens microbianas podem ser tambémusadas, incluindo, por exemplo, Bacillus sp, Salmonella, eAgrobacterium. Exemplos de linhagens de Agrobacteriumincluem CSScl (pGUSINT), Agtl21 (pBUSINT), EHAlOl(pMTCA23GUSINT), EHA105 (pMTl), LBA4404 (pTOK233), GU2260,BU3600, AGL-I, e LBA4402. Tais linhagens são descritas emdetalhe em Chan et al. (1992) Plant Cell Physiol 33:577;Smith et al. (19,95) Crop Sci 35:301; e Hiei et al. (1994)Plant J 6:271-282. Exemplos de linhagens bacterianasincluem, mas não são limitados a, C600 (ATCC 23724),C600hf1, DHl (ATCC 33849), DH5a, DH5oíF', ER1727, GM31,GMl 19 (ATCC 53339), GM2163, HBlOl (ATCC 33694), JM83 (ATCC35607), JM101 (ATCC 33876), JM103 (ATCC 39403), JM105 (ATCC47016), JMl07 (ATCC 47014), JM108, JM109 (ATCC53323), JMllO(ATCC 47013), LE392 (ATCC 33572), K802 (ATCC 33526), NM522(ATCC 47000), RRl (ATCC31343), χ1997 (ATCC 31244), e Y1088(ATCC 37195). Ver também, Jendrisak et al. (1987) Guide toMolecular Cloning Techniques, Academic Press, 359-371,Hanahan et al. (1983) J Mol Biol 166:557-580, Schatz et al.(1989) Cell 59:1035, Bulloek et al. (1987) BioTeehniques5:376-378, ATCC Bactéria and Baeteriophages (1996) 9thEdition, and Palmer et al. (1994) Gene 143:7-8.

Exemplos não limitantes de linhagens virais incluem,mas não são, mas não são limitados a, geminivirus,begomovirus, curtovirus, mastrevirus, banda (-) de RNAvirus, banda (+) de RNA vírus, potivírus, potexvírus,tobamovírus, ou outros vírus, nanovírus, viróides, esimilares, por exemplo, vírus de mosaico de mandiocaafricana (ACMV) (Ward et al. (1988) EMBO J 7:899-904 eHayes et al. (1988) Nature 334:179-182) , vírus de mosaicoestriado de cevadas (BSM) (Joshi et al. (1990) EMBO J9:2663-2669), vírus de mosaico de couve-flor (CaMV)(Gronenborn et al. (1981) Nature 294:773-776 e Brisson etal. (1984) Nature 310:511-514), vírus da listra do milho(MSV) (Lazarowitz et al. (1989) EMBO J 8:1023-1032 e Shenet al. (1994) J Gen Virol 76:965-969), vírus de mosaico detabaco (TMV) (Takamatsu et al. (1987) EMBO J 6:307-311 eDawson et al. (1989) Virology 172:285-292), vírus demosaico dourado de tomate (TGMV) (Elmer et al. (1990)Nucleic Acids Res 18:2001-2006), e vírus anão do trigo(WDV) (Woolston et al. (1989) Nucleie Aeids Res 17:6029-6041) e derivados desses. Ver também, Porat et al. (1996)Mol Bioteehnol 5:209-221.

Seqüências controle procariontes comumente usadasincluem promotores para iniciação de transcrição,opcionalmente com um operador, junto com seqüências deligação de ribossomos, incluem tais promotores comumenteusados como sistemas promotores de beta lactamase(penicilinase) e lactose (Iac) (Chang et al. (1977) Nature198:1056), o sistema promotor de triptofano (trp) (Goeddelet al. (1980) Nucleic Acids Res 8:4057) e o promotor P Llambda derivado e o sítio de ligação de ribossomo N-gene(Shimatake et al. (1981) Nature 292:128).

0 vetor é selecionado para permitir a introdução nacélula hospedeira apropriada. Vetores bacterianos sãotipicamente de origem de plasmídio ou fago. Célulasbacterianas apropriadas são infectadas com partículas devetor de fago ou transf ectadas com DNA sem histonas devetor de fago. Se um vetor de plasmídio é usado, ascélulas bacterianas são transfectadas com o DNA de vetor deplasmídio. Sistemas de expressão procariontes/bacterianospara expressar uma proteína estão disponíveis usandoBacillus sp. e Salmonella (Paiva et al. (1983) Gene 22:229-235; Mosbach et al. (1983) Nature 302:543-545). 0 operonTet e o operon Lac podem ser também empregados.

Uma variedade de sistemas de expressão eucariontes,tais como leveduras, linhas celulares de insetos, célulasvegetais ou de mamíferos, são conhecidas pela expressão deum polinucleotídeo de interesse. Em alguns exemplos,células vegetais transformadas/transfectadas são empregadascomo sistemas de expressão. A síntese(introdução/expressão) de seqüências de nucleotídeosheterólogas em leveduras é bem conhecida (Sherman et al.(1982) Methods in Yeast Geneticsf Cold Spring HarborLaboratory). Duas leveduras largamente utilizadas paraprodução de proteínas eucariontes são Saccharomycescerevisiae e Pichia pastoris. Vetores, linhagens, eprotocolos para expressão em Saccharomyces e Piehia sãoconhecidos e disponibilizados pelos fornecedores comerciais(e.g.r InVitrogen). Vetores adequados possuem usualmenteseqüências de controle de expressão, tais como promotores,incluindo 3-fosfoglicerato quinase ou álcool oxidase, e umaorigem de replicação, seqüências de terminação e similares,como desejado.

Bacilovírus recombinantes são gerados inserindo-se asseqüências de interesse particulares no genoma dobacilovírus usando protocolos estabelecidos com vetores ereagentes de fornecedores comerciais (e.g., InVitrogen,Life Technologies Incorporated). Vetores comerciais estãosão prontamente disponibilizados com vários promotores,tais como polihedrina e plQ, seqüências sinal opcionaispara secreção de proteínas, ou marcas de afinidade, taiscomo 6X histidina. Esses vírus recombinantes sãocultivados, mantidos e propagados em linhas celularescomercialmente disponíveis derivadas de diversas espéciesde insetos, incluindo Spodoptera frugiperda e Trichoplusiani. As células de insetos podem ser cultivadas usandoprotocolos bem estabelecidos em uma variedade de meiosdiferentes, por exemplo, com ou sem suplementação de sorobovino. As células cultivadas são infectadas com os vírusrecombinantes e a seqüência de interesse é expressada.

Proteínas expressadas com o sistema de bacilovírus foramextensivamente caracterizadas e, em vários casos, suasmodificações pós tradução, tais como fosforilação,acilação, etc., são idênticas à proteína expressanaturalmente.

Composições compreendem, ainda, populações de sítiosde recombinação FRT modificados. Uma população é um grupoou coleção que compreende dois ou mais (i.e., 5, 10, 100,300, 500, 700, 900, 1100, 1300, 1500, 1700, 1900, 2100,2300, 2500, 2700, 2900, 3100, 3300, 3500, 3700, 3900, 4000,4096, IO4, IO5, IO6, IO7, IO8, IO9, ou mais) sítios derecombinação FRT modificados dissimilares. Em exemplosespecíficos, os sítios de recombinação FRT modificados sãoheterólogos ao polinucleotídeo. Várias populações desítios de recombinação FRT modificados são providas,incluindo, por exemplo, uma biblioteca de sítios derecombinação FRT modificados randomizados. A biblioteca desítios de recombinação FRT modificados pode ser usada viatécnicas de seleção para a identificação de populações desítios de recombinação FRT modificados funcionais,recombinogênicos e/ou não recombinogênicos.

Em um exemplo, a população de sítios de recombinaçãoFRT modificados compreende uma biblioteca. Uma bibliotecade sítios de recombinação FRT modificados compreende umapopulação de plasmídios, caracterizada pelo fato de quecada dos plasmídios na população compreende um marcador deseleção comum. Além disso, cada dos plasmídios napopulação compreende um membro da população de sítios derecombinação FRT modificados randomizados.

Conseqüentemente, cada plasmídio na população da bibliotecatem o potencial de conter um membro dissimilar do sítio derecombinação FRT modificado randomizado. Populações devários sítios de recombinação FRT modificados diferentespodem ser rastreadas para identificar sítios derecombinação FRT modificados recombinogênicos.

Métodos de produzir ou formar uma população de sítiosde recombinação FRT modificados randomizados incluemidentificar a região do sítio de recombinação FRT na qualalteração são desejadas, tais como todo o comprimento dosítio FRT, a região de simetria, a região de espaçamento, otraço de polipirimidina, ou qualquer combinação desses, e,por exemplo, gerar uma população de oligonucleotídeos quepossui os nucleotídeos randomicamente modificados na regiãodesejada. As seqüências randomizadas na biblioteca desítios de recombinação FRT modificados podem ser de várioscomprimentos e compreendem vários domínios. As reaçõesenzimáticas pelas quais segmentos de seqüência aleatóriossão feitos podem não produzir matematicamente seqüênciasaleatórias devido a tendências desconhecidas oupreferências de nucleotídeos que possam existir. O termorandomizado, ou aleatório, reflete a possibilidade de taisdesvios de não idealidade. Conseqüentemente, o termorandomizado é usado para descrever um segmento de ácidonucléico tendo, em princípio, qualquer seqüência denucleotídeos possível contendo bases naturais oumodificadas por um dado comprimento. Além disso, umatendência pode ser - deliberadamente introduzidas naseqüência randomizada, por exemplo, alterando-se as razõesmolares de nucleosídeos precursores ou desoxinucleosídeostrifosfatos da reação de síntese. Uma tendência deliberadapode ser desejada, por exemplo, para aproximar asproporções de bases individuais em um dado organismo, oupara afetar a estrutura secundária. Ver, Hermes et al.(1998) Gene 84:143-151 e Barril et al. (1991) Cell 67:529-536. Ver também, Davis et al. (2002) Proc Natl AcadSei.USA 99:11616-11621, que geraram uma populaçãorandomizada tendo uma tendência compreendendo uma estruturadesejada. Portanto, uma população randomizada de sítios derecombinação FRT modificados pode ser gerada para contemuma tendência desejável na estrutura primária e/ousecundária do sítio, ou vários domínios do sítio.Não é necessário que a biblioteca inclua todasseqüências variantes possíveis. A biblioteca pode incluirtanto quanto um número possível de variante de seqüênciacomo é pratico para seleção, para assegurar que um númerosuficiente de sítios de recombinação FRT modificadosfuncionais potenciais sejam identificados. Por exemplo, sea seqüência randomizada no sítio de recombinação FRTmodificado inclui os resíduos internos de espaçamento 6(ver, Tabela 1) , ela conteria aproximadamente 46 (ou 4096)permutações de seqüência usando as 4 bases naturalmenteocorrentes. Contudo, não é necessário para a bibliotecaincluir todas seqüências possíveis para permitir a seleçãode sítios de recombinação FRT modificados funcionais.

Uma vez que os membros da população dos sítios derecombinação FRT modificados randomizados são gerados, asseqüências são empacotadas em plasmídios usando métodospadrão. Em alguns exemplos, a população de plasmídios podeser introduzida em células adequadas tanto paraamplificação como armazenamento. Apesar de clonagem eamplificação serem tipicamente conseguidas usando célulasbacterianas, qualquer combinação funcional de plasmídio ecélula pode ser usada. As células clonadas podem sercongeladas para futura amplificação e uso, ou a bibliotecade plasmídio empacotada pode ser isolada e ela própriaarmazenada em qualquer forma que preserve viabilidade.

Plasmídios de interesse típicos incluem vetores tendosítios de clonagem definidos, origens de replicação emarcadores de seleção. O plasmídio pode incluir aindaseqüências de iniciação de transcrição e tradução,terminadores de transcrição e tradução, e promotores úteispara a regulação da expressão do ácido nucléico emparticular. Plasmidios podem incluir também cassetes deexpressão genéricos contendo pelo menos uma seqüência determinação independente, seqüências permitindo a replicaçãodo cassete em eucariotos, ou procariotos, ou ambos, taiscomo vetores de embaralhamento, e marcadores de seleçãopara ambos sistemas procariotos e eucariotos. Vetorespodem ser adequados para replicação e integração emeucariotos, ou procariotos, ou ambos. Para descriçõesgerais de clonagem, empacotamento, e sistemas de expressãoe métodos, ver Giliman & Smith (1979) Gene 8:81-97; Robertset al. (1987) Nature 328:731-734; Berger & Kimmel (1989)Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods inEnzymology, Vol. 152, Academic Press, Inc., San Diego,Calif, (Berger); Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning—-A Laboratory Manual (2nd ed.) Vols. 1-3, Cold Spring HarborLaboratory, Cold Spring Harbor Press, N.Y., (Sambrook) ; eF. M. Ausubel et al. (eds.) (1994) Current Protocols inMolecular Biology, Current .Protocols, a joint venturebetween Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley &Sons, Inc. (1994 Supplement) (Ausubel).

Em um exemplo, os membros da população de sítios derecombinação FRT modificados randomizados são introduzidosem uma população de plasmídios, caracterizado pelo fato deque cada dos plasmídios na população compreende um marcadorde seleção comum. Nesse exemplo, uma população de sítiosde recombinação FRT modificados randomizados é colocada emcontato com uma população de plasmidios sob condições quepermitem a inserção da população de sítios de recombinaçãoFRT modificados randomizados em cada plasmídio da populaçãode plasmidios, tal como cada dos plasmidios de ditapopulação compreendem um único membro da população desítios de recombinação FRT modificados randomizados. Em umexemplo, o marcador de seleção é operacionalmente ligado aum promotor ativo em uma célula hospedeira de interesse.Vários marcadores de seleção podem ser usados no método.

Um marcador selecionável ou rastreável compreende umsegmento de DNA que permite que se identifique ou selecionepara ou contra uma molécula ou uma célula que o contenha,freqüentemente sob condições em particular. Qualquermarcador de seleção pode ser usado. Esses marcadores podemcodificar uma atividade, tal como, mas não limitando-se a,produção de RNA, peptídeo, ou proteína, ou pode prover umsítio de ligação para RNA, peptídeos, proteínas, compostosinorgânicos e orgânicos ou composições e similares.Exemplos de marcadores de seleção incluem, mas não sãolimitados a, segmentos de DNA que compreendem sítios deenzimas de restrição; segmentos de DNA que codificamprodutos que provêm resistência contra compostos tóxicosincluindo antibióticos, tais como, espectinomicina,ampicilina, canamicina, tetraciclina, Basta, neomincinafosfotransferase II (NEO) e higromicina fosfotransferase(HPT)) ; segmentos de DNA que codificam produtos que são,pelo contrário, sem a célula recipiente (e.g., genes deRNAt, marcadores auxotróficos); segmentos de DNA quecodificam produtos que podem ser prontamente identificados(e.g., marcadores fenotipicos, tais como β-galactosidase,GUS; proteína fluorescentes, tais como proteína verdefluorescente (GFP) , ciano (CFP), amarela (YFP) , vermelha(RFP), e proteína de superfície celular); a geração denovos sítios de primer para PCR (e.g., a justaposição deduas seqüências de DNA não justapostas previamente), ainclusão de seqüências de DNA não acionadas ou acionadaspor uma endonuclease de restrição ou outra enzimamodificadora de DNA, químico, etc. ; e, a inclusão deseqüências de DNA requeridas para uma modificaçãoespecífica (e.g., metilação) que permite sua identificação.

Marcadores de seleção adicionais incluem genes queconferem resistência a compostos herbicidas, tais comoamônio glufosinato, bromoxinil, imidazolinonas, e 2,4-diclorofenoxiacetato (2,4-D). Ver, em geral, Yarranton(1992) Curr Opin Biotech 3:506-511; Christopherson et al.(1992) Proc Natl Acad Sci USA 8 9:6314-6318; Yao et al.(1992) Cell 71:63-72; Reznikoff (1992) Mol Microbiol6:2419-2422; Barkley et al. (1980) in The Operonf pp. 177-220; Hu et al. (1987) Cell 48:555-566; Brown et al. (1987)Cell 49:603-612; Figge et al. (1988) Cell 52:713-722;Deuschle et al. (1989) Proc Natl Acad Sci USA 86:5400-5404;Fuerst et al. (1989) Proc Natl Acad Sci USA 8 6:254 9-2553;Deuschle et al. (1990) Science 248:480-483; Gossen (1993)Ph.D. Thesis, University of Heidelberg; Reines et al.(1993) Proc Natl Acad Sci USA 90:1917-1921; Labow et al.(1990) Mol Cell Biol 10:3343-3356; Zambretti et al. (1992)Proe Natl Aead Sei USA 89:3952-3956; Baim et al. (1991)Proe Natl Aead Sei USA 88:5072-5076; Wyborski et al. (1991)Nueleie Aeids Res 19:4647-4653; Hillen & Wissman (1989)Topies Mol Strue Biol 10:143-162; Degenkolb et al. (1991)Antimierob Agents Chemother 35:1591-1595; Kleinsehnidt etal. (1988) Bioehemistry 27:1094-1104; Bonin (1993) Ph.D.Thesis, University of Heidelberg; Gossen et al. (1992) ProeNatl Aead Sei USA 89:5547-5551; Oliva et al. (1992)Antimierob Agents Chemother 36:913-919; Hlavka et al.(1985) Handbook of Experimental Pharmacology, Vol. 78(Springer-Verlag, Berlin); Gill et al. (1988) Nature334:721-724.

Os sítios de reeombinação FRT modificados, sítios derecombinação FRT modificados funcionais, e as váriaspopulações de tais moléculas incluindo as bibliotecas epopulações plasmídios podem ser usadas, também, comoreagentes em kits. Por exemplo, kits que podem serempregados nos vários métodos aqui descritos são providos.

Em um exemplo, o kit compreende uma primeira população deplasmídios caracterizada pelo fato de que cada dosplasmídios na primeira população compreende um primeiromarcador de seleção comum; e, cada dos plasmídios naprimeira população compreende um membro de uma população desítios de recombinação FRT modificados. 0 kit pode incluirainda uma segunda população de plasmídios caracterizadapelo fato de que cada dos plasmídios em dita segundapopulação compreende um segundo marcador de seleção comum,caracterizado pelo fato de que o primeiro e o segundomarcadores de seleção são distintos; e, cada de ditosplasmidios na segunda população compreende um membro dapopulação de sítios de recombinação FRT modificados. Emoutros exemplos, os kits podem compreender ainda uma FLPrecombinase. Ainda em outros exemplos, o kit podemcompreender um polinucleotídeo, opcionalmente integrado nogenoma de um organismo, tendo pelo menos um sítio alvoflanqueado por sítio de recombinação FRT modificadofuncional, dissimilares, não recombinogênico. Qualquer kitpode ser ainda acompanhado por instruções pára uso.

Adicionalmente, providos são kits tendo umpolinucleotídeo compreendendo pelo menos um sítio derecombinação FRT modificado funcional heterólogo, ditosítio de recombinação FRT modificado funcional compreendeuma seqüência de espaçamento selecionada do grupoconsistindo de SEQ ID NOS:l, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10,11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 e 18. Kits tendo qualquer dosoutros polinucleotídeos aqui descritos são ainda providos,Em exemplos específicos, o polinucleotídeo no kitcompreende, ainda, pelo menos um sítio de recombinaçãoadicional. Em exemplos específicos, os sítios derecombinação são dissimilares e não recombinogênicos comrespeito um ao outro, dissimilares e recombinogênicos comrespeito um ao outro, ou correspondentes erecombinogênicos. Kits podem incluir, ainda, um ou maisdas recombinases apropriadas ou um polinucleotídeocodificando a mesma.

Populações de plasmídios compreendendo um membro deuma população de sítios de recombinação FRT modificadospodem ser geradas. São providos métodos para selecionar,identificar e/ou caracterizar sítios de recombinação FRTmodificados recombinogênicos da população de sítios derecombinação FRT modificados. Em um exemplo, a seleção deum sítio de recombinação FRT recombinogênico compreendeprover uma primeira população de plasmídios, caracterizadopelo fato de que cada dos plasmídios na primeira populaçãocompreende um primeiro marcador de seleção comum; e, cadados plasmídios na primeira população compreende um membroheterólogo de uma população de sítios de recombinação FRTmodificados. Uma segunda população de plasmídios éprovida. A segunda população de plasmídios compreende umsegundo marcador de seleção comum, caracterizado pelo fatode que o primeiro e o segundo, marcadores de seleção sãodistintos; e, cada dós plasmídios na segunda populaçãocompreende um membro da população de sítios de recombinaçãoFRT modificados. Um marcador de seleção distinto indicaque o marcador presente na primeira população de plasmídiosemprega um esquema de seleção diferente ou agente do que omarcador de seleção presente na segunda população deplasmídios. Em outras palavras, a presença de um marcadorde seleção distinto nas duas populações de plasmídiospermitirá o rastreamento de populações de plasmídios paradeterminar se nenhum, um, ou ambos marcadores de seleçãoestão presentes.

Em um método, a primeira população de plasmidios écombinada com a segunda população de plasmidios na presençade uma FLP recombinase. Os componentes são combinados invivo ou in vitro sob condições que permitem que ocorra aintegração mediada por recombinase. A integração mediadapor recombinase resulta em um evento de recombinação entreum sitio FRT recombinogênico modificado em um plasmidio eum sitio FRT recombinogênico modificado em um segundoplasmidio. 0 evento de recombinação resulta na geração deum plasmidio co-integrante. Um co-integrante é umamolécula de ácido nucléico que contém ambas moléculasparentais, o plasmidio da primeira biblioteca e o plasmidioda segunda biblioteca. Isto seria usualmente circular, ruaspode ser também linear. Um co-integrante pode compreenderplasmidios da primeira e segunda bibliotecas e, portanto,ter dois marcadores de seleção distintos. Plasmidios co-integrantes adicionais podem se formar entre plasmidios damesma população. -Esses co-integrantes compreendemmarcadores de seleção comuns. Esquemas de seleção quepermitem a seleção de co-integrantes gerados via um eventomediado por recombinase entre plasmidios da primeira esegunda populações de plasmidios são discutidos em detalheabaixo.

As condições nas quais as duas populações deplasmidios são combinadas permitirão que FLP recombinaseraedie um evento de recombinação entre um sítio derecombinação FRT recombinogênico modificado contido em umplasmídio da primeira população com um sítio derecombinação FRT recombinogênico modificado contido em umplasmídio da segunda população e, portanto, formem umplasmídio co-integrante. Condições que permitem a o eventode integração mediada por recombinase podem variar. Porexemplo, a quantidade de recombinase adicionada para·dirigir a reação integração mediada por recombinase podeser determinada usando testes conhecidos, tais como testesde titulação, para determinar a quantidade apropriada derecombinase sob dadas condições. Similarmente, aconcentração de ambas populações de plasmídios pode servariada, junto com o tempo, temperatura e outras condiçõesde reação para permitir uma reação desejada. Em umexemplo, as populações de plasmídios são adicionadas em umarazão equimolar.

Qualquer método que permita a seleção, enriquecimento/ou identificação de um plasmídio co-integrante -pode serusado nos métodos. Em um exemplo, o co-integrantecompreenderá dois marcadores de seleção' distintos.Conseqüentemente, métodos para selecionar co-integrantesfora dos plasmídios que tanto falharam tanto para sujeitarum evento de integração mediado por recombinase ou sujeitarum evento entre plasmídios da mesma população podemintroduzir a mistura compreendendo os co-integrantes e osoutros plasmídios que não reagiram em uma célula hospedeirae selecionar células hospedeiras tendo ambos marcadores.Após a formação do co-integrante, a etapa de seleçãopode ser conduzida tanto in vivo ou in vitro dependendo doesquema de seleção em particular sendo empregado, ver porexemplo, U.S. Patent 6.277.608. Os esquemas de seleção quepodem ser empregados nos métodos e composições irão variardependendo do marcador de seleção empregado nas populaçõesde plasmídios.

Esquemas de seleção in vivo podem ser usados com umavariedade de células hospedeiras incluindo, por exemplo, E.coli. Segue um exemplo não limitante de um plasmidio co-integrante junto com um esquema de seleção não limitante invivo. Nesse exemplo, um plasmidio A compreende um marcadorde seleção de ampicilina e um sitio FRT modificado eplasmidio B compreende um marcador de seleção deespectinomicina e um sitio de recombinação FRT modificadocorrespondente. Com a adição de FLP recombinase, ocorre umevento de recombinação entre o sitio FRT modificado deplasmidio A e plasmidio Β. 0 plasmidio co-integranteresultante compreende ambos marcador de ampicilina doplasmidio Aeo marcador espectinomicina de plasmidio B.

Os plasmidios da mistura de reação são introduzidos em E.coli competente. E. coli contendo co-integrantes sãoresistentes a ambas ampicilina e espectinomicina. Seguindoa seleção de co-integrantes, os sítios de recombinação FRTmodificados contidos' no co-integrante podem sercaracterizados, e os sítios de recombinação FRT modificadoscontidos nos plasmídios AeB podem ser, então,determinados. Por exemplo, os sítios podem serseqüenciados. Além disso, a eficiência de excisão derecombinação pode ser também determinada. Em algunsexemplos, o sitio FRT modificado de plasmídio A e deplasmídio B pode ser também dissimilares erecombinogênicos. Em tais instâncias, os sítios derecombinação aparecendo no plasmídio co-integrante podemser seqüenciados para determinar os sítiosdissimilares/recombinogênicos aparecendo no plasmídio A eplasmídio B.

Outros esquemas para seleção incluem testes in vitroque testam para a seleção dos co-integrantes através dageração de novos sítios de primer para PCR; inclusão deseqüências de DNA acionadas ou não acionadas por umaendonuclease de restrição ou outras enzima modificadora deDNA, químicos, etc.; a seleção do produto desejado portamanho ou outra propriedade física da molécula; e ainclusão de uma seqüência de DNA requerida para umamodificação específica (e.g., metilação).

Sítios de recombinação FRT modificadosrecombinogênicos podem ser usados em vários métodos derecombinação sítio específicos ih vitro e in vivo quepermitem a integração direcionada, troca, modificação,alteração, excisão, inversão, e/ou expressão de umaseqüência de nucleotídeos de interesse, ver, por exemplo,W099/25821, W099/25854, W099/25840, W099/25855, eW099/25853.Os métodos empregam um sistema de recombinação sitioespecifico. Uma recombinase sitio especifica, tambémreferida como uma recombinase, é um polipeptideo quecatalisa a recombinação conservativa sitio especifica entreseus sítios de recombinação compatíveis, portanto, umarecombinase inclui polipeptídeos nativos, assim comovariantes e/ou fragmentos que retêm atividade, epolinucleotídeos nativos e variantes e/ou fragmentos quecodificam uma recombinase que retém atividade. Arecombinase usada nos métodos podem ser uma recombinasenativa ou um fragmento biologicamente ativo ou variante darecombinase. Um polipeptideo ou polinucleotídeo nativocompreende uma seqüência de aminoácidos ou 'seqüência denucleotídeos naturalmente ocorrente. Para revisões derecombinases sítio específicas, ver Sauer (1994) Curr OpBiotechnol 5:521-527; e Sadowski . (1993) FASEB 7:760-767.

Recombinases úteis nos métodos e composições incluemrecombinases das famílias Integrase e Resolvase, variantesbiologicamente ativos e fragmentos dessas, e qualquer outraenzima naturalmente ocorrente ou produzidarecombinantemente ou variante dessa, que catalisamrecombinação conservativa sítio específica entre sítios derecombinação de DNA especificados.

A família de recombinases Integrase possui mais de cemmembros e inclui, por exemplo, FLP, Cre, lambda integrase,e R. Para outros membros da família Integrase, ver, porexemplo, Esposito et al. (1997) Nucleic Acids Res 25:3605-3614 e Abremski et al. (1992) Protein Eng 5:87-91. Outrossistemas de recombinação incluem, por exemplo, phi C31estreptomiceto bacteriófago (Kuhstoss et al. (1991) J MolBiol 20:897-908); o sistema de recombinação SSVl sitioespecifico de Sulfolobus shibatae (Maskhelishvili et al.(1993) Mol Gen Genet 237:334-342); e um sistema deintegração retroviral baseado em integrase (Tanaka et al.(1998) Gene 17:67-76). Em outros exemplos, a recombinase éuma que não requer cofatores ou um substrato superhelicoidal. Tais recombinases incluem a Cre nativa (SEQ IDNOS: 4 5 e 46), a FLP nativa (SEQ ID NOS:48 e 49), ouvariantes ou fragmentos ativos dessas (SEQ ID NOS:47 e 50).

A FLP recombinase é uma proteína que catalisa umareação sítio específica que é envolvida em amplificar onúmero de cópias do plasmídio de dois mícron de S.cerevisiae durante a replicação de DNA. FLP recombinasecatalisa a recombinação sítio específica entre dois sítiosFRT. A proteína FLP foi clonada e expressada (Cox (1993)Proc Natl Acad Sci USA 80:4223-4227). A FLP recombinasepara uso nos métodos e com as composições pode ser derivadado gênero Saccharomyces. Pode-se também sintetizar umpolinucleotídeo compreendendo a recombinase usando códonspreferenciais de planta para ótima expressão em uma plantade interesse. Uma enzima FLP recombinante codificada poruma seqüência de nucleotídeos compreendendo códonspreferenciais de milho (FLPm) que catalisam eventos derecombinação sítio específicos é conhecida (SEQ ID NO:50, eUS Patent 5.929.301). Variantes funcionais adicionais efragmentos de FLP são conhecidos (Buchholz et al. (1998)Nat Biotechnol 16:617-618, Hartung et al. (1998) J BiolChem 273:22884-22891, Saxena et al. (1997) Biochim BiophysActa 1340:187-204; e Hartley et al. (1980) Nature 286:860-864).

A recombinase Cre de bacteriófago catalisa arecombinação sitio especifica entre dois sítios lox. A Crerecombinase é conhecida (Guo et al. (1997) Nature 389:40-46; Abremski et al. (1984) J Biol Chem 259:1509-1514; Chenet al. (1996) Somat Cell Mol Genet 22:477-488; Shaikh etal. (1977) J Biol Chem 272:5695-5702; e, Buchholz et al.(1998) Nat Biotechnol 16:617-618.. Seqüências denucleotídeos Cre podem ser também sintetizadas usandocódons preferenciais de plantas, por exemplo taisseqüências (moCre) são descritas em WO 99/25840 e relatadasem SEQ ID NO:47.

É ainda reconhecido que uma recombinase quimérica podeser usada nos métodos. Uma recombinase quimérica é umaproteína de fusão recombinante que é capaz de catalisar arecombinação sítio específica entre sítios de recombinaçãoque se originam de diferentes sistemas de recombinação.

Por exemplo, se um grupo de sítios de recombinaçãofuncionais, caracterizada como sendo dissimilares e nãorecombinogênicos com respeito uma à outra, é utilizado nosmétodos e composições, e o grupo compreende um sítio FRT eum sítio LoxP, uma FLP/Cre recombinase quimérica ouvariante ou fragmento ativo dessa será necessário ou ambasrecombinases podem ser providas separadamente. Métodospara a produção e uso de tais recombinases quiméricas ouvariantes ou fragmentos ativos dessas são descritos em WO99/25840.

Fragmentos e variantes dos polinucleotideoscodificando recombinases e fragmentos e variantes dasproteínas recombinase são também englobados. Um fragmentoé uma porção do polinucleotídeo e/ou qualquer proteínacodificada dessa forma ou uma porção do polipeptídeo.

Fragmentos de um polinucleotídeo podem codificar fragmentosde proteína que retém a atividade biológica da proteínanativa e, assim, implementar um evento de recombinação.Assim, fragmentos de um polinucleotídeo podem variar depelo menos cerca de 20 nucleotídeos, a cerca de 50nucleotídeos, a cerca de 100 nucleotídeos, e até opolinucleotídeo de comprimento total codificando umarecombinase.

Um fragmento de um polinucleotídeo que codifica umaporção biologicamente ativa de uma proteína recombinasecodificará pelo menos 15, 25, 30, 50, 100, 150, 200, 250,300, 320, 350, 375, 400, ou 420 aminoácidos contíguos, ouaté o número total de aminoácidos presentes em uma proteínarecombinase de comprimento total (i.e., 423 aminoácidospara a FLP recombinase e 338 aminoácidos para a Crerecombinase) usada nos métodos.Uma porção biologicamente ativa dé uma proteínarecombinase pode ser preparada isolando uma porção de umdos polinucleotídeos codificando a porção do polipeptideorecombinase e expressando a porção codificada da proteínarecombinase, e avaliando a atividade da porção darecombinase. Polinucleotídeos que codificam fragmentos deum polipeptideo recombinase podem compreender seqüências denucleotídeos compreendendo pelo menos 16, 20, 50, 75, 100,150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700,800, 900, 1.000, 1.100, ou 1.200 nucleotídeos, ou até onúmero total de nucleotídeos presentes em uma seqüência denucleotídeos de recombinase de comprimento total (i.e.,1032 nucleotídeos para a FLP recombinase e 1260nucleotídeos para a Cre recombinase) aqui descrita.

Seqüências variantes possuem um alto grau desimilaridade de seqüência. . Para polinucleotídeos,variantes conservativos incluem aquelas seqüências que, porcausa da degeneraçãò do código genético, codificam aseqüência de aminoácidos de um dos polipeptídeosrecombinase nativos. Variantes, tais como esses, podem seridentificado com o uso de técnicas de biologia molecularbem conhecidas, como, por exemplo, com reação de cadeia depolimerase (PCR) e técnicas de hibridização.

Polinucleotídeos variantes também incluem seqüências denucleotídeos sinteticamente derivadas, tais como aquelasgeradas, por exemplo, usando mutagênese sítio-direcionada,mas que ainda codificam uma proteína recombinase.Geralmente, variantes de um polinucleotídeo em particularterão pelo menos cerca de 40%, 45%, 50%, * 55%, 60%, 65%,70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%,98%, 99% ou mais de identidade de seqüência àquelepolinucleotideo em particular, como determinado porprogramas de alinhamento de seqüências e parâmetrosconhecidos.

Variantes de um polinucleotideo em particular (aseqüência de nucleotideos referência) pode ser tambémavaliada por comparação da identidade de seqüênciapercentual entre o polipeptideo codificado por umpolinucleotideo variante e o polipeptideo codificado pelopolinucleotideo referência. Assim, por exemplo,polinucleotídeos isolados que codificam um polipeptideo comuma dada identidade de seqüência percentual à recombinasesão conhecidos. A identidade de seqüência percentual entredois polipeptideos pode ser calculada usando programas dealinhamento de seqüências e parâmetros descritos. Ondequalquer par de polinucleptideos é avaliada por comparaçãoda identidade de seqüência percentual compartilhada pelosdois polipeptideos que codificam, a identidade de seqüênciapercentual entre os dois polipeptideos é pelo menos cercade 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%,91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais deidentidade de seqüência.

Uma proteína variante deve significar uma proteínaderivada da proteína nativa por deleção, adição, e/ousubstituição de um ou mais aminoácidos à(s) região(ões) N-terminal, interna , e/ou extremidade C-terminal da proteínanativa. Proteínas variantes são biologicamente ativas,isto é, continuam a possuir a atividade biológica desejadada proteína nativa, por exemplo, uma recombinase varianteimplementará um evento de recombinação entre sítios derecombinação apropriados. Tais variantes podem resultarde, por exemplo, polimorfismo genético ou de manipulaçãohumana. Variantes biologicamente ativos de uma proteínarecombinase nativa terá pelo menos cerca de 40%, 45%, 50%,55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%,95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de seqüênciaà seqüência de aminoácidos para a proteína nativa, comodeterminado por programas de alinhamento de seqüências eparâmetros conhecidos. Um variante biologicamente ativo deuma proteína pode diferir daquela proteína por tão poucoquanto 1-15 resíduos de aminoácidos, tão pouco quanto 1-10,tal como 6-10, tão pouco quanto 5, tão pouco quanto 4, 3,2, ou até 1 resíduo de aminoácido.

Relações de seqüência podem ser analisadas e descritasusando algoritmos implementados por computador. A relaçãode seqüência entre dois ou mais polinucleotídeos, ou doisou mais polipeptídeos, pode ser determinada gerando oalinhamento ótimos das seqüências, e pontuando ascorrespondências e os espaços no alinhamento, que resultana identidade de seqüência percentual, e a similaridade deseqüência percentual. Relações de polinucleotídeo pode sertambém descritas baseadas em uma comparação dospolipeptídeos que cada um codifica. Vários programas ealgoritmos para a comparação e análise de seqüências estãodisponíveis.

A menos que declarado ao contrário, os valoresidentidade/similaridade de seqüência aqui providos referem-se ao valor usando GAP Version 10 (GCG, Accelrys, SanDiego, CA) usando os seguintes parâmetros: % identidade e %similaridade para uma seqüência de nucleotídeos usando umpeso de penalidade de criação de espaço de 50 e um peso depenalidade de extensão de espaço de 3, e a matriz depontuação nwsgapdna.cmp; % identidade e % similaridade parauma seqüência de aminoácidos usando um peso de penalidadede criação de espaço de 8 e um peso de penalidade deextensão de espaço de 2, e a matriz de pontuação BLOSUM62(Henikof f & Henikoff (1989) Proc Natl Acad Sci USA89:10915).

GAP usa o algoritmo de Needleman and Wunsch (1970) J.Mol. Biol. 48 : 443-453, para encontrar o alinhamento deduas seqüências completas que maximiza o número decorrespondências e minimiza o número de espaços. GAPconsidera todos alinhamentos possíveis e posições de espaçopossíveis e cria o alinhamento com o maior número de basescom correspondência e o menor de espaços. Isto permite aprovisão de uma penalidade por criação de espaços e umapenalidade por extensão de espaços em unidades de bases comcorrespondência. GAP deve fazer um saldo de número depenalidade de criação de espaços de correspondências paracada espaço que insere. Se uma penalidade por extensão deespaço maior que zero é escolhida, GAP deve,adicionalmente, fazer um saldo para cada espaço inserido docomprimento do espaço vezes a penalidade por extensão deespaço. GAP apresenta um membro da família de alinhamentosótimos.

Identidade de seqüência, ou identidade, é uma medidados resíduos nas duas seqüências que são a mesma quandoalinhadas para máxima correspondência. Seqüências,particularmente polipeptídeos, que diferem porsubstituições conservativas são ditas por ter similaridadede seqüência ou similaridade. Meios para fazer esse ajustesão conhecidos, e tipicamente envolvem pontuar umasubstituição conservativa como uma parcial, ao invés de umafalta de correspondência completa. Por exemplo, onde umaminoácido idêntico recebe uma pontuação de 1 e umasubstituição não conservativa recebe uma pontuação de zero,uma substituição conservativa recebe uma pontuação entrezero e 1. A pontuação de substituições conservativas écalculada, usando a matriz de pontuação selecionada(BLOSUM62 por padrão para GAP).

Proteínas podem ser alteradas em vários meiosincluindo substituições, deleções, truncações, e inserçõesde aminòácidos. Métodos para tais manipulações sãogeralmente conhecidos. Por exemplo, variantes deseqüências de aminoácidos das proteínas recombinase podemser preparados por mutações no DNA. Métodos paramutagênese e alterações de seqüências de nucleotídeosincluem, por exemplo, Kunkel (1985) Proc Natl Acad Sci USA82:488-492; Kunkel et al. (1987) Methods in Enzymol154:367-382; U.S. Patent 4,873,192; Walker & Gaastra, eds.(1983) Techniques in Molecular Biology (MacMillanPublishing Company, New York) e as referências ai citadas.Direções como para substituições de aminoácidos apropriadasque não afetam a atividade biológica da proteína deinteresse podem ser encontradas no modelo de Dayhoff et al.(1978) Atlas of Protein Sequence and Structure (Natl BiomedRes Found, Washington, D.C.). Substituições conservativas,tais como permuta de um aminoácido por outro tendopropriedades similares, podem ser preferíveis.

Os polinucleotídeos. recombinase usados incluem ambasseqüências nativas naturalmente ocorrentes, assim comoformas mutantes ou modificadas. Da mesma maneira, asproteínas usadas nos métodos englobam ambas proteínasnaturalmente ocorrentes, assim como variações e formasmodificadas dessas. Tais variantes continuam a possuir ahabilidade de implementar um evento de recombinação.Geralmente, as mutações feitas no polinucleotídeocodificando o polipeptídeo variante não posicionam aseqüência foram do quadro de leitura ou criam regiõescomplementares que poderiam produzir estrutura de RNAsecundária. Ver, EP Patent Application Publication No.75.444.

Não espera-se que as deleções, inserções, esubstituições das seqüências de proteínas aqui englobadasproduzam mudanças radicais nas características da proteína.Contudo, quando é difícil prever o efeito exato dasubstituição, deleção, ou inserção antes de fazê-la, oefeito será avaliado por testes de rastreamento de rotina.

Testes para atividade de recombinase são conhecidos egeralmente medem a atividade total da enzima em substratosde DNA contendo sítios de recombinação. Por exemplo, paratestar atividade FLP, inversão de uma seqüência de DNA emum plasmídio circular contendo dois sítios FRT invertidospodem ser detectados como uma mudança em posição de sítiosde enzima de restrição. Esse teste é descrito em Vetter etal. (1983) PNAS 80:7284. Alternativamente, a excisão deDNA de uma molécula ou freqüência de recombinaçãointermolecular induzida pela enzima podem ser testadas,como descrito, por exemplo, em Babineau et al. (1985) JBiol Chem 260:12313; Meyer-Leon et al. (1987) Nucleic AcidRes 15:6469; e Gronostajski et al. (1985) J Biol Chem260:12328. Alternativamente, atividade de recombinase podeser também testada por excisão de uma seqüência flanqueadapor sítios FRT recombinogênicos que com remoção ativarão umgene marcador testável. Estratégias de teste similarespodem ser usadas pra Cre ou outras enzimas recombinase.

Polinucleotídeos e proteínas variantes também englobamseqüências e proteínas derivadas de um procedimentomutagênico e/ou recombinogênico, tal como embaralhamento deDNA. Com tal procedimento, uma ou mais seqüênciascodificadoras de recombinase diferentes podem sermanipuladas para criar uma nova proteína recombinasepossuindo as propriedades desejadas. Dessa maneira,bibliotecas de polinucleotídeos recombinantes são geradas apartir de uma população de polinucleotídeos relacionadoscompreendendo regiões de seqüência que possuem identidadede seqüência substancial e podem ser homologamenterecombinadas in vitro ou in vivo. Estratégias para talembaralhamento de DNA são conhecidas e incluem, porexemplo, Stemmer (1994) Proc Natl Acad Sci USA 91:10747-10751; Stemmer (1994) Nature 370:389-391; Crameri et al.(1997) Nat Biotech 15:436-438; Moore et al. (1997) J Mol" Biol 272:336-347; Zhang et al. (1997) Proc Natl Acad SciUSA 94:4504-4509; Crameri et al. (1998) Nature 391:288-291;e U.S. Patents 5.605.793 e 5.837.458.

Os métodos e composições podem empregar, ainda, sítiosde recombinação que não os sítios FRT modificados aquiprovidos. Um sítio de recombinação é qualquerpolinucleotídeo nativo ou sintético/artificial que éreconhecido pela enzima recombinase de interesse. Váriossistemas de recombinação são conhecidos, como é o sítio(s)de recombinação apropriado a ser usado com o sistema derecombinação de interesse, incluindo variantesbiologicamente ativos e fragmentos de sítios derecombinação. Exemplos de sítios de recombinação para usosão conhecidos e incluem sítios FRT incluindo o sítio FRTnativo (FRTl, SEQ ID NO:39), e vários variantes funcionaisde FRT, incluindo mas não limitando-se a, FRT 5 (SEQ IDNO: 40) , FRT6 (SEQ ID N0:41), FRT7 (SEQ ID NO:42), FRT87(SEQ ID NO:24), e outros sítios FRT modificados funcionaisaqui descritos. Ver, por exemplo, WO' 03/054189, WO02/00900, WO 01/23545, e, Schlake et al. (1994)Biochemistry 33:12745-12751.

Sitios de recombinação do sistema de recombinaçãoCre/Lox sitio especifico podem ser também usados. Taissítios de recombinação incluem, por exemplo, sítios LOXnativos e vários variantes funcionais de LOX. Uma análiseda atividade de recombinação de sítios LOX variantes éapresentada em Lee et al. (1998) Gene 216:55-65 e em U.S.Patent 6.465.254. Também, ver por exemplo, Schlake & Bode(1994) Biochemistry 33:12746-12751; Huang et al. (1991)Nucleic Acids Res 19:443-448; Sadowski (1995) In Progressin Nucleic Acid Research and Molecular Biology Vol. 51, pp.53-91; U.S. Patent 6.465.254; Cox (1989) In Mobile DNA,Berg and Howe (eds) American Society of Microbiology,Washington D.C., pp. 116-670; Dixon et al. (1995) MolMicrobiol 18:449-458; Umlauf & Cox (1988) EMBO J 7:1845-1852; Buchholz et al. (1996) Nucleic Acids Res 24:3118-3119; Kilby et al. (1993) Trends Genet 9:413-421; Rossant &Geagy (1995) Nat Med 1:592-594; Albert et al. (1995) PlantJ 7:649-659; Bayley et al. (1992) Plant Mol Biol 18:353-361; Odell et al. (1990) Mol Gen Genet 223:369-378; Dale &Ow (1991) Proc Natl Acad Sci USA 88:10558-10562; Qui et al.(1994) Proc Natl Acad Sei USA 91:1706-1710; Stuurman et al.(1996) Plant Mol Biol 32:901-913; Dale et al. (1990) Gene91:79-85; e WO 01/111058.

Qualquer sítio de recombinação adequado ou grupo desítios de recombinação podem ser utilizado nos métodos ecomposições, incluindo um sitio FRT, um variante funcionalde um sitio FRT, um sitio LOX, e variante funcional de umsitio LOX, qualquer combinação desses, ou qualquer outracombinação de sítios de recombinação conhecidos.

Diretamente repetido indica que . os sítios derecombinação em um grupo de sítios de recombinaçãorecombinogênicos são arranjados na mesma orientação, deforma que a recombinação entre esses sítios resulte emexcisão, ao invés de inversão, da seqüência de DNAinterveniente. Sítio(s) de recombinação invertido(s)indica que o os sítios de recombinação em um grupo desítios de recombinação recombinogênicos são arranjados naorientação oposta, de forma que a recombinação entre essessítios resulta em inversão, ao invés de excisão, daseqüência de DNA interveniente.

O sítio alvo e cassete de transferência compreendempelo menos um sítio de recombinação. A(s) recombinase(s)sítio-específica (s) usada(s) dependerá dos sítios derecombinação presentes no sítio alvo e no cassete detransferência, por exemplo se sítios FRT são utilizados,uma FLP recombinase ou variante ativo dessa será provida.

Da mesma maneira, onde sítios Lox são utilizados, uma Crerecombinase ou variante ativo dessa é provido. Se o grupode sítios de recombinação funcionais compreende ambos sítioFRT e um sítio Lox, serão providos tanto uma FLP/Crerecombinase quimérica ou um variante ativo ou ambas FLP eCre recombinases ou variantes ativos dessas. Em umexemplo, pelo menos um dos sítios de recombinaçãoempregados no sítio alvo, cassete de transferência, ouambos compreenderão pelo menos um sítio de recombinação FRTmodificado funcional aqui descrito.

Prover inclui qualquer método que permite que umpolipeptídeo e/óu a polinucleotídeo, tal como umarecombinase, sítio alvo, cassete de transferência,polinucleotídeo de interesse, sejam trazidos juntos com oscomponentes citados. Por exemplo, uma célula pode serprovida com esses vários componentes via uma variedade demétodos incluindo métodos de transformação transiente eestável; co-introduzir um DNA de recombinase, RNAm ouproteína diretamente na célula; empregar um organismo,célula, linhagem ou linha que expresse a recombinase para atransformação inicial; ou cultivar o organismo carregando osítio alvo e cruzando-o a um organismo que expresse umaproteína recombinase ativa e selecionar eventos naprogênie". Qualquer promotor incluindo promotorconstitutivo, induzido, regulado pordesenvolvimento/temporal, ou espacialmente regulado, capazde regular a expressão no organismo de interesse pode serusado para expressar a recombinase apropriada.

Composições compreendendo sítios de recombinação FRTmodificados recombinogênicos são providas, junto comvariantes biologicamente ativos e fragmentos dos sítios FRTrecombinantes modificados recombinogênicos. O sítio derecombinação FRT modificado recombinogênico pode ser usadoem vários métodos de recombinação sitio específicos.

Os métodos podem empregar sítios alvo e cassetes detransferência para permitir a manipulação, troca, excisão,alteração, inversão e/ou introdução de uma seqüência denucleotídeos in vivo ou in vitro. Um sítio alvo compreendepelo menos um sítio' de recombinação. Em exemplosespecíficos, o sítio alvo compreende um polinucleotídeo queé imediatamente flanqueado por pelo menos dois sítios derecombinação, incluindo grupos de sítios de recombinaçãofuncionais que são dissimilares e não recombinogênicos comrespeito um ao outro; correspondentes e recombinogênicosrespeito um ao outro; ou dissimilares e recombinogênicosrespeito um ao outro. Uma ou mais seqüênciasintervenientes podem estar presentes entre os sítios derecombinação do sítio alvo. Seqüências intervenientes departicular interesse incluem ligantes, adaptadoras, regiõesreguladoras, íntrons, sítios de restrição,intensificadorès, isolantes, marcadores de seleção,seqüências de nucleotídeos de interesse, promotores, e/ououtros sítios que auxiliam na construção ou análise devetor. É ainda reconhecido que um sítio de recombinaçãopode estar contido na seqüência de nucleotídeos deinteresse incluindo íntrons, seqüência codificadora, UTRs5', UTRs 3', e/ou regiões reguladoras.

Em exemplos específicos, o sítio alvo está em umacélula ou um organismo de interesse. Em outros exemplos, ositio alvo está estavelmente integrado no genoma da célulaou no organismo de interesse. É reconhecido que a célulaou o organismo podem compreender múltiplos sítios alvo, osquais podem ser localizados em um ou múltiplos Ioci noscromossomos ou através dos cromossomos. Múltiplasmanipulações independentes de cada sítio alvo no organismoestão disponibilizadas. Adicionalmente, o sítio alvo podecompreender, também, um cassete de expressão compreendendouma seqüência de nucleotídeos codificando uma recombinaseapropriada. Em outro exemplo, a seqüência de nucleotídeoscodificando a recombinase é estavelmente integrada nogenoma do organismo.

Os métodos empregam, ainda, cassetes de transferência.

Um cassete de transferência compreende pelo menos um sítiode recombinação. Em exemplos específicos, o cassete detransferência compreendendo um polinucleotídeo flanqueadopor pelo menos um primeiro sítio de recombinação e umsegundo sítio de recombinação, caracterizado pelo fato deque o primeiro e o segundo sítios de recombinaçãocorrespondem aos sítios de recombinação no sítio alvo. 0primeiro e o segundo sítios de recombinação funcionais docassete de transferência podem ser dissimilares e nãorecombinogênicos com respeito um ao outro. Quando um sítioalvo e um cassete de transferência compreendendo sítios derecombinação compatíveis e a recombinase são combinados, aseqüência de nucleotídeos entre os sítios de recombinaçãodo sítio alvo será trocada com a seqüência de nucleotídeosentre os sítios de recombinação do cassete detransferência. Flanqueado por, quando usado em referênciaà posição dos sítios de recombinação do sítio alvo ou ocassete de transferência, refere-se a uma posiçãoimediatamente adjacente à seqüência que pretende sertrocada ou inserida.

0 cassete de transferência pode ainda compreender umpolinucleotídeo de interesse. Os sítios de recombinaçãopodem ser diretamente contíguos com o polinucleotídeo deinteresse ou pode existir uma ou mais seqüênciasintervenientes presentes entre uma ou ambas extremidades dopolinucleotídeo de interesse e os sítios de recombinação.Seqüências intervenientes de particular interesse incluemligantes, adaptadores, intensificadores, íntrons,isolantes, sítios de restrição, marcadores de seleção,polinucleotídeos de interesse, promotores, e/ou outrossítios que auxiliam na construção ou análise de vetor. Ossítios de recombinação podem estar contidos nopolinucleotídeo de interesse incluídos nos , íntrons,seqüência codificadora, e/ou regiões 5' e 3' nãotraduzidas.

Em um exemplo, o cassete de transferência e/ou o sítioalvo compreendem pelo menos um sítio de recombinação FRTmodificado funcional, onde o de recombinação FRT modificadofuncional compreende uma seqüência de espaçamentoselecionada do grupo consistindo de SEQ ID N0S:1, 2, 3, 4,5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, e 18. Emoutros exemplos, o cassete de transferência e/ou sítio alvocompreende pelo menos um sítio de recombinação FRTmodificado funcional compreendendo SEQ ID NO:21, 22, 23,24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, ou38 ou um variante funcional dessas. 0 variante funcionalpodem compreender uma, duas, três, quatro, cinco, seis oumais alterações entre as posições de nucleotídeo 1 a 11e/ou entre as posições de nucleotídeo 20 a 30 de SEQ IDNO:21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34,35, 36, 37, ou 38. Ainda em outros exemplos, o variantefuncional é substancialmente idêntico à seqüência de SEQ IDNOS:21-38.

Quaisquer meios podem ser usados para juntar os várioscomponentes do sistema de recombinação. Por exemplo, emsistemas in vitro, a recombinase e o(s) polinucleotídeo(s)compreendendo os sítios de recombinação podem ser providospromovendo o contato dos componentes sob condiçõesapropriadas para permitir um evento de recombinação.

Alternativamente uma variedade de métodos é conhecida paraa introdução de seqüências de nucleotídeos e polipeptídeosem um organismo, incluindo, por exemplo, transformação,cruzamento sexuado, e a introdução do polipeptídeo, DNA, ouRNAm na célula.. Ver, também, W099/25884.

Os métodos são úteis em várias aplicações. Porexemplo, os métodos podem empregar o uso de dois sítios derecombinação FRT modificados funcionais e permitir troca,inserção, inversão, ou excisão in vivo e in vitro de umaseqüência de nucleotídeos de interesse. Por exemplo, acélula ou o organismo de interesse pode * compreender umprimeiro polinucleotideo compreendendo um sitio alvocompreendendo um primeiro sitio de recombinação funcionalFRT modificado. A célula, ou o organismo, é provida com umsegundo polinucleotideo compreendendo um cassete detransferência compreendendo tanto um segundo sitio derecombinação FRT correspondente e funcional ou um segundositio FRT dissimilar que é recombinogênico com respeito aoprimeiro sitio. Uitia FLP recombinase é provida sobcondições que permitem um evento de recombinação. 0 eventode recombinação entre os dois sitios de recombinaçãorecombinogênicos resulta na inserção do cassete detransferência junto com todo o segundo polinucleotideo queestá contido no primeiro polinucleotideo. Em algunsexemplos, o primeiro polinucleotideo está estavelmenteintegrado no genoma do organismo. 0 método podem sertambém empregado em um contexto in vitro. Por exemplo, ρprimeiro e o segundo polinucleotideos podem compreenderpoliriuçleotídeos, tais como plasmidios combinados in vitrona presença de uma recombinase apropriada. Nesse exemplo,um evento de recombinação produzirá um plasmidio co-integrante. Tais métodos são úteis, por exemplo, em váriastecnologias de clonagem, incluindo amplificação defragmentos por PCR (Sadowski et al. (2003) BMC Biotechnol18:9), vetores de clonagem (Snaith et al. (1995) Gene166:173-174 e U.S. Patents 6.140.129, 6.410.317, 6.355.412,5.888.732, 6.143.557, 6.171.861, 6.270.969, e 6.277.608) evetores virais (U.S. Patent 6.541.245).Em outros exemplos, o método compreende prover umsitio alvo tendo um primeiro e um segundo sitio derecombinação funcional, caracterizado pelo fato de que oprimeiro e o segundo sítios de recombinação sãodissimilares e não recombinogênicos com respeito um aooutro, e pelo menos um do primeiro ou segundo sítios derecombinação compreendem um sítio de recombinação FRTmodificado funcional aqui descrito; prover um cassete detransferência compreendendo um polinucleotídeo de interesseflanqueado pelo primeiro e segundo sítio de recombinação;e, prover uma recombinase. A recombinase reconhece eimplementa recombinação no primeiro e segundo sítios derecombinação.

Em exemplos específicos, o sítio alvo está em umacélula ou organismo hospedeiro; e, em outros exemplos, osítio alvo está estavelmente integrado no genoma da célulaou do organismo hospedeiro. Ainda em outros exemplos, osítio alvo compreende um polinucleotídeo de interesse.Nesse exemplo, se o sítio alvo e cassete de transferênciacompreendem o primeiro e o segundo sítios de recombinaçãoque são dissimilares e não recombinogênicos com respeito umao outro, a seqüência de interesse no sítio alvo é trocadapor um segundo polinucleotídeo de interesse contido nocassete de transferência.

Em outros exemplos, as composições aqui providas sãousadas em métodos para reduzir a complexidade de integraçãode transgenes no genoma de uma célula ou organismo, talcomo uma célula vegetal ou uma planta. Nesse método,organismos tendo padrões de integração simples em seusgenomas são selecionados. Um padrão de integração simplesindica que o cassete de transferência se integrapredominantemente apenas no sitio alvo, e a menos do quecerca de 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, ou 1posição(ões) randômica(s) que não o sitio alvo no genoma.Métodos para determinar os padrões de integração sãoconhecidos na arte e incluem, por exemplo, análise deSouthern blot e análise RFLP.

É provido um método para selecionar diretamente umacélula transformada ou um organismo, tal como uma planta oucélula vegetal. 0 método compreende prover uma populaçãode células ou organismos tendo um polinucleotideocompreendendo um sitio alvo. O polinucleotideo compreende,na seguinte ordem, um promotor e um sitio alvocompreendendo um primeiro e um segundo sítios derecombinação funcionais, caracterizado pelo fato de que oprimeiro e o segundo sítios de recombinação sãodissimilares e não recombinogênicos com respeito um aooutro, e pelo menos um do primeiro ou o segundo sítios derecombinação compreendem um sítio de recombinação FRTmodificado funcional aqui provido. Um cassete detransferência é introduzido na. população de células ouorganismos, onde o cassete de transferência compreende, naseguinte ordem, o primeiro sítio de recombinação, umpolinucleotideo compreendendo um marcador de seleção nãooperacionalmente ligado a um promotor, e o segundo sítio derecombinação. Uma recombinase, ou um fragmentobiologicamente ativo, é provida, que reconhece e implementarecombinação no primeiro e segundo sitios de recombinação,e, dessa forma, liga operacionalmente o marcador de seleçãoao promotor. A população de células ou organismos é entãocultivada no agente seletivo apropriado para recuperar oorganismo que sofreu com de forma bem-sucedida a integraçãodo cassete de transferência no sitio alvo. Em outrosexemplos, a população de células ou organismos foiestavelmente incorporada em seus genomas no sitio alvo.

A atividade de vários promotores em uma localidadecaracterizada no genoma de uma célula ou organismo podemser determinadas. Assim, a atividade e/ou nível deexpressão desejados de uma seqüência de nucleotídeos deinteresse podem ser alcançados, assim como, acaracterização de promotores para. expressão na célula ouorganismo de interesse. Em um exemplo, o método paraavaliar a atividade promotora em uma célula ou um organismocompreende prover uma célula ou um organismo compreendendoem seu genoma um polinucleotídeo compreendendo um sítioalvo tendo um primeiro e um segundo sítios de recombinaçãofuncional, caracterizado pelo fato de que o primeiro e osegundo sítios de recombinação são dissimilares e nãorecombinogênicos com respeito um ao outro, caracterizadopelo fato de que pelo menos um do primeiro ou segundosítios de recombinação funcionais compreende um sítio derecombinação FRT modificado funcional aqui provido. Umcassete de transferência é introduzido na célula ouorganismo, onde o cassete de transferência compreende umpromotor operacionalmente ligado a um polinucleotideocompreendendo um marcador de seleção e o cassete detransferência é flanqueado pelo primeiro e o segundo sítiosde recombinação funcionais. Uma recombinase é provida,caracterizada pelo fato de que dita recombinase reconhece eimplementa recombinação no primeiro e segundo sítios derecombinação. A atividade promotora é avaliadamonitorando-se a expressão do marcador de seleção. Dessamaneira, promotores diferentes podem ser integrado na mesmaposição no genoma e sua atividade comparada.

Em alguns exemplos, o cassete de transferênciacompreende na seguinte ordem: o primeiro sítio derecombinação, um promotor operacionalmente ligado a umterceiro sítio de recombinação operacionalmente ligado a umpolinucleotideo compreendendo um marcador de seleção, e osegundo sítio de recombinação, onde o primeiro, o segundo eo terceiro . sítios de recombinação funcionais sãodissimilares e não recombinogênicos com respeito- um ououtro. Esse cassete de transferência pode sergenericamente representado como RSa-Pl::RSc::Sl-RSb. Apósa introdução do cassete de transferência no sítio alvo, aatividade do promotor (Pl) pode ser analisada usandométodos conhecidos na arte. Uma vez que a atividade dopromotor é caracterizada, cassetes de transferênciaadicionais compreendendo um polinucleotideo de interesseflanqueado pelo segundo e pelo terceiro sítio derecombinação pode ser introduzido no organismo. Comrecombinação, a expressão do polinucleotídeo de interesseserá regulada pelo promotor caracterizado.

Conseqüentemente, organismos, tais como linhas de plantas,tendo promotores que alcançam os níveis de expressãodesejados nos tecidos desejados podem ser construídos deforma que seqüências de nucleotídeos de interesse possamser prontamente inseridas abaixo do promotor eoperacionalmente ligadas ao promotor e, dessa forma,expressadas de uma maneira previsível.

Em alguns exemplos, múltiplos promotores podem serempregados para regular a transcrição em um único sítioalvo. Nesse método, o sítio alvo compreendendo o primeiroe o segundo sítios de recombinação é flanqueado por doispromotores convergentes. Promotores convergentes refere-sea promotores que são-orientados em ambos terminais do sítioalvo. 0 mesmo promotor, ou promotores diferentes podem serusados no sítio alvo. Cada dos promotores convergentes éoperacionalmente ligado tanto ao primeiro ou o segundosítio de recombinação. Por exemplo, o sítio alvoflanqueado pelos promotores convergentes pode compreenderPl->: R1-R2: ^-P2, onde P é ura promotor, a seta indica adireção de transcrição, R é um sítio de recombinação, e ocólon indica que os componentes estão operacionalmenteligados.

O cassete de transferência empregado com o sítio alvotendo os promotores convergentes pode compreender, naseguinte ordem, o primeiro sítio de recombinação, umprimeiro polinucleotídeo de interesse orientado na direção5' a 3 ' , um segundo polinucleotídeo de interesse orientadona direção 3' a 5', e um segundo sítio de recombinação. Ainserção do cassete de transferência no sítio alvo resultano primeiro polinucleotídeo de interesse operacionalmenteligado ao primeiro promotor convergente, e o segundopolinucleotídeo de interesse operacionalmente ligado aosegundo promotor convergente. A expressão do primeiro e/ousegundo polinucleotídeo de interesse pode ser aumentada oudiminuída na célula ou organismo. A expressão do primeiroe/ou segundo polinucleotídeo de interesse pode ser tambémindependentemente regulada dependendo de quais promotoressão usados. É reconhecido que sítios alvo podem serflanqueados por outros elementos que influenciam atranscrição. Por exemplo, elementos isolantes podemflanquear o sítio alvo para minimizar efeitos de posição.Ver, por exemplo, U.S. Publication.No. 2005/0144665.

Qualquer promotor pode ser usado, e é tipicamenteselecionado baseado no resultado desejado. Um promotor éuma região de DNA envolvida no reconhecimento e ligação deRNA polimerase e outras proteínas para iniciar atranscrição. Um promotor vegetal é um promotor capaz deiniciar a transcrição em uma célula vegetal, para umarevisão de promotores vegetais, ver Potenza et al. (2004)In Vitro Cell Dev Biol 40:1-22.

Promotores constitutivos incluem, por exemplo, opromotor núcleo do promotor Rsyn7 e outros promotoresconstitutivos descritos em WO 99/43838 ' e U.S. Patent6.072.050; o promotor núcleo CaMV 35S (Odell et al. (1985)Nature 313:810-812); actina de arroz (McElroy et al. (1990)Plant Cell 2:163-171); ubiquitina (Christensen et al.(1989) Plant Mol Biol 12:619-632 e Christensen et al.(1992) Plant Mol Biol 18:675-689); pEMU (Last et al. (1991)Theor Appl Genet 81:581-588); MAS (Velten et al. (1984)EMBO J 3:2723-2730); promotor ALS (U.S. Patent 5.659.026),e similares. Outros promotores constitutivos são descritosem, por exemplo, U.S. Patents 5.608.149; 5.608.144;5.604.121; 5.569.597; 5.466.785; 5.399.680; 5.268.463;5.608.142; e 6.177.611.

Em alguns exemplos um promotor induzido pode serusado. Promotores induzidos por patógenos induzidos após ainfecção por um patógeno incluem, mas não são limitadosàqueles regulando a expressão de proteínas PR, proteínasSAR, beta-1,3-glucanase, quitináse, etc. Ver, por exemplo,Redolfi et al, (1983) Neth J Plant Pathol 89:245-254; Ukneset al. (1992) Plant Cell 4 : 645-656; Van Loon (1985) PlantMol Virol 4:111-116; WO 99/43819; . Marineau et al. (1987)Plant Mol Biol 9:335-342; Matton et al. (1989) Mol Plant-Microbe Interact 2:325-331; Somsisch et al. (1986) ProcNatl Acad Sci USA 83:2427-2430; Somsisch et al. (1988) MolGen Genet 2:93-98; Yang (1996) Proc Natl Acad Sci USA93:14972-14977; Chen et al. (1996) Plant J 10:955-966;Zhang et al. (1994) Proc Natl Acad Sci USA 91:2507-2511;Warner et al. (1993) Plant J 3:191-201; Siebertz et al.(1989) Plant Cell 1:961-968; U.S. Patent No. 5.750.386(induzido por nematódeo) ; e as referências ai citadas; eCordero et al. (1992) Physiol Mol Plant Path 41:189-200(induzido por Fusarium). Promotores induzidos porferimento incluem gene proteinase inibidora de batata (pinII) (Ryan (1990) Ann Rev Phytopath 28:425-449; Duan et al.(1996) Nat Biotechnol 14:494-498); wunl e wun2 (U.S. Patent5.428.148); winl e win2 (Stanford et al. (1989) Mol GenGenet 215:200-208); sistemina (McGurl et al. (1992) Science225:1570-1573); WIPl (Rohmeier et al. (1993) Plant Mol Biol22:783-792; Eckelkamp et al. (1993) FEBS Lett 323:73-76);MPI gene (Corderok et al. (1994) Plant J 6:141-150); esimilares. Promotores regulados quimicamente podem serusados para modular a expressão de um gene em uma plantaatravés da aplicação· de um regulador químico exógeno. 0promotor pode ser um promotor induzido por químico, onde aaplicação do químico induz a expressão gênica, ou umpromotor reprimido por químico, onde a aplicação do químicoreprime a expressão gênica. Promotores induzidos porquímicos incluem, mas não são limitados a, promotor In2-2de milho, defensores herbicidas ativados porbenzenosulfonamida (De Veylder et al. (1997) Plant CellPhysiol 38:568-77), promotor GST de milho (GST-II-27, WO93/01294) ativado por compostos hidrofóbicos eletrofílicosusados como herbicidas pré-emergentes, e promotor PR-Ia detabaco (Ono et al. (2004) Biosci Biotechnol Biochem 68:803-7) ativado por ácido salicílico. Outros promotoresregulados por químicos de interesse incluem promotores deresposta a esteróides (ver, por exemplo, promotor induzidopor glucocorticóide em Schena et al. (1991) Proc Natl AcadSci USA 88:10421-10425; e McNellis et al.' (1998) Plant J14:247-257); promotores induzidos por tetraciclina ereprimidos por tetraciclina (Gatz et al. (1991) Mol GenGenet 227:229-237; U.S. Patents 5.814.618, e 5.789.156).

Promotores preferenciais de tecido podem serutilizados para direciona expressão intensificada de umaseqüência de interesse em um tecido vegetal em particular.Promotores preferenciais de tecidos incluem Kawamata et al.(1997) Plant Cell Physiol 38:792-803; Hansen et al. (1997)Mol Gen Genet 254:337-343; Russell et al. (1997) TransgenicRes 6:157-168; Rinehart et al. (1996) Plant Physiol112:1331-1341; Van Camp et al. (1996) Plant Physiol112:525-535; Canevascini et al. (1996) Plant Physiol112:513-524; Lam (1994) Results Probl Cell Differ 20:181-196; e Guevara-Garcia et al. (1993) Plant J 4:495-505.

Promotores preferenciais de folhas são conhecidos eincluem, por exemplo, Yamamoto et .al. (1997) Plant J12:255-265; Kwon et al. (1994) Plant Physiol 105:357-67;Yamamoto et al. (1994) Plant Cell Physiol 35:773-778; Gotoret al. (1993) Plant J 3:509-18; Orozco et al. (1993) PlantMol Biol 23:1129-1138; Matsuoka et al. (1993) Proc NatlAcad Sci USA 90(20):9586-9590; e promotores cab e rubisco(Simpson et al. (1958) EMBO J 4:2123-2129; Timko et al.(1988) Nature 318:57-58).

Promotores preferenciais de raiz são conhecidos eincluem, por exemplo, Hire et al. (1992) Plant Mol Biol20:207-218 (gene de glutamina sintase especifico de raiz desoja); Miao et al. (1991) Plant Cell 3:11-22 (glutaminasintase citosólico (GS) expressado em raízes e nódulos deraiz de soja; Keller & Baumgartner (1991) Plant Cell3:1051-1061 (elemento controle específico de raiz de geneGRP 1.8 de feijão francês); Sanger et al. (1990) Plant MolBiol 14:433-443 (promotor específico de raiz de A manopinasintase de . tumefaciens (MAS)); Bogusz et al. (1990) PlantCell 2:633-641 (promotores específicos de raiz isolados apartir de Parasponia andersoníi e Trema tomentosa); Leach &Aoyagi (1991) Plant Sci 79:69-76 (genes indutores de raizrolC e rolD de A. rhizogenes) ; Teeri et al. (1989) EMBO J8:343-350 (genes TRl1 e TR2' induzidos por ferimento deAgrobácterium); gene promotor VfEN0D-GRP3 (Kuster et al.(1995) Plant Mol Biol 29:759-772); e promotor rolB (Capanaet al. (1994) Plant Mol Biol 25(4):681-691; gene defaseolina (Murai et al. (1983) Science 23:476-482;Sengopta-Gopalen et al. (1988) Proc Natl Acad Sci USA82:3320-3324). Ver também U.S. Patents 5.837.876;5.750.386; 5.633.363; 5.459.252; 5.401.836; 5.110.732; e5.023.179.

Promotores preferenciais de sementes incluem ambospromotores específicos de sementes ativos durante odesenvolvimento de sementes, assim como promotores degerminação de sementes ativos durante a germinação dasemente. Ver Thompson et al. (1989) BioEssays 10:108.Promotores preferenciais de semente incluem, mas não sãolimitados a, Ciml (mensagem induzida por citocinina) ;CZ19B1 (zeina de 19 kDa de milho); e milps (mio-inositol-1-fosfato sintase); (ver WO 00/11177 e U.S. Patent6.225.529). Para dicotiledôneas, promotores preferenciaisde semente incluem, mas não são limitados a, β-faseolina defeijão, napina, β-conglicinina, lectina de soja,cruciferina, e similares. Para monocotiledôneas,promotores de sementes incluem, mas não são limitados a,zeina de 15 kDa de milho, zeina de 22 kDa, gama zeina de 27kDa, waxy, shrunken 1, shrunken 2, globulina 1, oleosina, enucl. Ver também WO 00/12733, onde promotorespreferenciais de semente de genes endl e end2 sãodescritos.

Em exemplos adicionais, métodos são providos para toidentificar uma região reguladora transcricional eis em umorganismo. Uma região reguladora transcricional é qualquerelemento eis atuante que modula o nivel de um RNA. Taiselementos incluem, mas não são limitados a, um promotor, uraelemento de um promotor, um intensificador, um isolante, umíntron, ou uma região de terminação que é capaz de modularo nivel de RNA em uma célula. Os métodos podem ser usadospara gerar aparatos intensificadores ou promotores. Em umexemplo, o gene repórter ou marcador do sitio alvo éexpressado apenas quando insere outro gene próximo a(aparato intensificador) ou (aparato promotor). 0 padrãode expressão do gene repórter dependerá dos elementosintensificadores do gene próximo ou no qual o gene repórterse insere. Nesse exemplo, o sitio alvo introduzido nacélula ou organismo pode compreender um gene marcadoroperacionalmente ligado a um sitio de recombinação. Emexemplos específicos, o gene marcador é flanqueado porsítios de recombinação dissimilares e não recombinogênicos.

O gene marcador é tanto não operacionalmente ligado a umpromotor (aparato promotor) ou o gene marcador éoperacionalmente ligado a um promotor que não possuielementos intensificadores (aparato intensificador). Apósa inserção do sítio alvo no genoma da célula ou organismo,o padrão de expressão do gene' marcador é determinado paracada transformante. Quando um transformante com um padrãode expressão de gene marcador de interesse é encontrado, asseqüências aparato intensificadora/promotora podem serusadas como uma sonda para clonar o gene que possui aquelepadrão de expressão, ou alternativamente para identificar opromotor ou intensif icador regulando a expressão. -- Alémdisso, uma vez que um sítio alvo é integrado sob controletranscricional de um elemento regulador transcricional, osmétodos podem ser ainda empregados para introduzir umcassete de transferência tendo um polinuclèotídeo de'interesse naquele alvo na célula ou organismo. Um eventode recombinação entre o sítio alvo e o cassete detransferência; permitirão à seqüência de nucleotídeos deinteresse a vir sob o controle transcricional do elementopromotor e/ou intensificado. Ver, por exemplo, Geisler etal. (2002) Plant Physiol 130:1747-1753; Topping et al.(1997) Plant Cell 10:1713-245; Friedrich et al. (1991)Genes Dev 5:1513-23; Dunn et al. (2003) Appl EnvironMicrobiol 1197-1205; e von Melchner et al. (1992) Genes DevEm outros exemplos, o sítio alvo é construído para termúltiplos grupos funcionais de sítios de recombinaçãodissimilares e não recombinogênicos. Assim, múltiplosgenes ou polinucleotídeos podem ser arranjados ouordenados. Em exemplos específicos, esse método permite oarranjo de seqüências de interesse nas localidades precisasno genoma de uma céu lua ou organismo. Da mesma forma, umavez que um sítio alvo foi estabelecido em uma célula ouorganismo, sítios de recombinação adicionais podem serintroduzidos incorporando tais sítios no cassete detransferência. Assim, uma vez que um sítio alvo tenha seestabelecido, é possível, subseqüentemente, adicionarsítios ou alterar sítios através de recombinação. Taismétodos são descritos em detalhe em WO 99/25821.

Em um exemplo, métodos para combinar múltiploscassetes de transferência são . providos. 0 métodocompreende prover um sítio alvo compreendendo pelo menos umprimeiro e um segundo sítios de recombinação funcional,caracterizado pelo fato de que o primeiro e segundo sítiosde recombinação são dissimilares e não recombinogênicos comrespeito um ao outro. Um primeiro cassete de transferênciacompreendendo, na seguinte ordem, pelo menos o primeiro, umterceiro, e o segundo sítio de recombinação funcional éprovido, caracterizado pelo fato de que o primeiro e oterceiro sítios de recombinação do primeiro cassete detransferência flanqueiam um primeiro polinucleotídeo deinteresse, e caracterizado pelo fato de que o primeiro, osegundo, e o terceiro sítios de recombinação sãodissimilares e não recombinogênicos com respeito um aooutro, e uma primeira recombinase é provida, onde oprimeiro cassete de transferência está integrado no sitioalvo. Pelo menos um do primeiro, segundo, ou terceirosítios de recombinação compreendem um sítio de recombinaçãoFRT modificado funcional aqui provido.

Um segundo cassete de transferência compreendendo pelomenos o segundo e o terceiro sítios de recombinação éprovido, caracterizado pelo fato de que o segundo e oterceiro sítios de recombinação do segundo cassete detransferência flanqueia um segundo polinucleotídeo deinteresse e uma segunda é provida. A segunda recombinasereconhece e implementa recombinação no segundo e noterceiro sítios de recombinação e o segundo cassete detransferência é inserido no sítio alvo, de forma que,agora, o primeiro e o segundo cassetes de transferênciaseja combinados no sítio alvo. Em alguns exemplos, o sítioalvo está em - um organismo. Em outros exemplos, o sítioalvo está estavelmente incorporado no genoma do organismo,por exemplo uma planta. Nesse exemplo, múltiplospolinucleotídeos de interesse são arranjadas na posiçãoalvo pré-determinada no genoma do organismo.

Várias alterações podem ser feitas ao método dearranjar para alcançar o resultado desejado tendo asseqüências de nucleotídeos de interesse arranjadas. Porexemplo, é provido um sítio alvo compreendendo, na seguinteordem, pelo menos um primeiro, um segundo e um terceirositio de recombinação funcional, caracterizado pelo fato deque os sítios de recombinação são dissimilares e nãorecombinogênicos com respeito um ao outro. Um primeirocassete de transferência compreendendo pelo menos oprimeiro e segundo sítios de recombinação é provido,caracterizado pelo fato de que o primeiro e o segundosítios de recombinação do primeiro cassete de transferênciaflanqueiam um primeiro polinucleotídeo de interesse e umaprimeira recombinase é provida e reconhece e implementarecombinação no primeiro e segundo sítios de recombinação.Pelo menos um do primeiro, segundo, ou terceiro sítios derecombinação compreende um sítio de recombinação FRTmodificado funcional aqui provido.

Um segundo cassete de transferência compreendendo pelomenos o segundo e o terceiro sítios de recombinação éprovido, onde o segundo e o terceiro sítios de recombinaçãodo segundo cassete de transferência flanqueia um segundopolinucleotídeo de interesse. Uma segunda recombinase éprovida. A recombinase reconhece e implementa recombinaçãono segundo e no terceiro sítios de recombinação.

Em outros exemplos, métodos são providos para minimizaou eliminar a expressão resultante de integração randômicade seqüências de DNA no genoma de uma célula ou organismo,tais como uma planta. Esse método compreende prover a umacélula ou organismo tendo estavelmente incorporado em seugenoma um polinucleotídeo compreendendo o seguintescomponentes, na seguinte ordem: um promotor ativo nacélula ou organismo operacionalmente ligado a uma seqüênciaATG de inicio de tradução operacionalmente ligada a umsitio alvo compreendendo um primeiro e um segundo sítios derecombinação funcional, caracterizado pelo fato de que oprimeiro e segundo sítios de recombinação são dissimilarese não recombinogênicos com respeito um ao outro, e pelomenos um do primeiro ou segundo sítios de recombinaçãocompreende um sítio de recombinação FRT modificadofuncional aqui provido. Um cassete de transferênciacompreendendo um polinucleotídeo de interesse e o primeiroe o segundo sítios de recombinação é introduzido na célulaou organismo. A seqüência de início de tradução daseqüência de nucleotídeos de interesse no cassete detransferência foi substituída com o primeiro sítio derecombinação. Uma recombinase é provida que reconhece eimplementa recombinação nos sítios de recombinação. Arecombinação com o sítio alvo resulta no polinucleotídeo deinteresse sendo operacionalmente ligado ao sítio ATG deinício de tradução do sítio alvo contido nopolinucleotídeo. Operacionalmente ligado indica uma fusãofuncional entre elementos adjacentes, por exemplo a ligaçãoentre o início de tradução, um promotor, e/ou um sítio derecombinação indica que as seqüências são colocadas juntaspara gerar uma fusão em quadro' que resulta em um produtogênico corretamente expressado e funcional.

Em um exemplo, um cassete de transferênciacompreendendo RSc::S3(noATG)-RSd, inde RS representa umsítio de recombinação e S representa um polinucleotídeo deinteresse, é introduzido em uma planta tendo estavelmenteincorporado em seu genoma um polinucleotideo compreendendoPl-RSa-Sl-Tl-RSb-P2-ATG::RSc-S2(no ATG)-T2-RSd, onde Prepresenta um promotor, T representa um terminador, RSrepresenta um sitio de recombinação, e o símbolo :: indicaelementos adjacentes operacionalmente ligados. ATG::RSindica que as seqüências geram uma fusão em quadro queresulta em um produto gênico corretamente expressado efuncional. Uma recombinase apropriada é provida e arecombinação ocorre nos sítios de recombinação, do formaque a seqüência entre os sítios de recombinação do cassetede transferência substitua a seqüência entre os sítios derecombinação do sítio alvo, produzindo, dessa forma, umanova seqüência direcionalmente direcionada e reintegrada.O novo gene (S3) é agora dirigido para fora do promotor P2no sítio alvo. Projetar construtos sem um códon ATG deinício na seqüência de nucleotídeos de interesse resulta emuma probabilidade de expressão da seqüência introduzidaextremamente baixa se a integração aleatória ocorre, já queo cassete de transferência necessitaria se integrar atrásde uma região promotora endógena no quadro de leituracorreto.

Os sítios de recombinação FRT aqui providos podem serusados para excisar ou inverte um polinucleotideo deinteresse. Nesse método, um polinucleotideo é providocompreendendo, na seguinte ordem, um primeiro sítio derecombinação funcional, um polinucleotideo de interesse, eum segundo sítio de recombinação funcional, onde o primeiroe segundo sítios de recombinação são recombinogênicos comrespeito um ao outro. Dependendo da orientação dos sítiosde recombinação, o polinucleotídeo de interesse seráexcisado ou invertido quando a recombinase apropriada éprovida. Por exemplo, sítios de recombinação diretamenterepetidos permitirão a excisão do polinucleotídeo deinteresse e repetições invertidas permitirão uma inversãodo polinucleotídeo de interesse. Tais métodos podem serempregados tanto in vivo ou in vitro.

Métodos são também providos para a alteração dossítios de recombinação. O método provê conversão entresítios de recombinação diferentes e é baseado emestratégias mediadas por oligonucleotídeo previamentedescritas para fazer modificações de nucleotídeosespecíficas direcionadas em uma seqüência alvo especificadaextracromosômica ou genômica (Yoon- et al. (1996) Proc NatlAcad Sci USA 93:2071-207 6; Cole-Strauss et al. (1996)Science 273:138 6-138 9; W099/25853; W099/25821; e WO03/076574). Usando esses métodos, os sítios derecombinação podem ser direcionados e modificados de váriosmeios. Por exemplo, um sítio de recombinação poderia sermodificado de forma que o par funcional de sítios derecombinação dissimilares e não recombinogênicos é alteradopara gerar dois sítios de recombinação correspondentes erecombinogênicos. A expressão subseqüente ou concomitanteda recombinase apropriada em células com os sítiosmodificados correspondentes/recombinogênicos levariam aexcisão ou inversão das seqüências entre esses novos sítiosde recombinação, dependendo da orientação dos sítios, dessaforma, especificamente removendo ou desligando a expressãodas seqüências de DNA indesejáveis do construto previamentecriados contendo essas seqüências. Uma aplicação nãolimitante dessa abordagem seria, por exemplo, no caso de ummarcador de seleção que é requerido durante etapas iniciaisde um programa de melhoramento ou cruzamento reverso paramanter e selecionar plantas individuais preferidas, mas quenão é desejado no produto final. Várias moléculas deoligonucleotídeos para modificação direcionada de sítios derecombinação podem ser projetadas e irão variar dependendodo sítio de recombinação sendo direcionado.

Oligonucleotídeos exemplares projetados para modificarsítios de recombinação são descritos em W099/25821 e WO03/076574.

A conversão de sítios de recombinação podem ser tambémempregada nos métodos para arranjar vários polinucleotídeosno genoma de um organismo, tal como uma planta. Porexemplo, as capacidades do sistema podem ser estendidas porconversão in vivo de sítios de recombinação para criarnovos sítios, ao invés de re-introduzir novos sítios derecombinação no organismo. Por exemplo, a conversão desítios de recombinação dissimilares e não recombinogênicosflanqueando um marcador de seleção para sítios derecombinação correspondentes facilitaria a remoção de ummarcador de seleção, ou para permitir a re-utilização domesmo marcador de seleção em transformações futuras,provendo meios para reciclar marcadores de seleção. Umsitio de recombinação dissimilar com uma* freqüência derecombinação conhecida poderia ser também modificado insitu para um sitio de recombinação diferente com umafreqüência de recombinação similar ou alterada. Outrasmodificações para alterar a função, similaridade, ourecombinogencidade podem ser conseguidas.

Em outros exemplos, métodos para localizar sítios deintegração preferidos no genoma de uma célula ou organismosão providos. O método compreende introduzir, em umacélula ou organismo, um sítio alvo compreendendo umaseqüência de nucleotídeos operacionalmente ligada a umpromotor ativo no organismo. Em exemplos específicos, osítio alvo é flanqueado por um primeiro e um segundo sítiosde recombinação funcional, caracterizado pelo fato de que oprimeiro e o segundo sítios de recombinação sãodissimilares e não recombinogênicos com respeito um aooutro, e pelo menos um do primeiro e segundo sítios derecombinação compreende um sitio FRT modificado aquiprovido. 0 nível de expressão do polinucleotídeo édeterminado e o organismo expressando o polinucleotídeo éselecionado. A célula ou organismo ancorando esseconstruto de DNA pode ser então caracterizado parapotencial de integração sítio-específica, potencialagronômico, e número de cópias. Em outros exemplos, umcassete de transferência com o(s) sítio(s) de recombinaçãoapropriado(s) é introduzido na célula ou organismo tendo osítio alvo descrito acima. Uma recombinase que reconhece eimplementa recombinação nos sítios de recombinação éprovida.

Em outro exemplo, uma pluralidade de cópias dopolinucleotídeo de interesse é provida ao organismo, talcomo uma planta. Em alguns exemplos isso é conseguido pelaincorporação de um replicon extracromossômico no cassete detransferência (ver WO 99/25855). Em exemplos específicos,o cassete de transferência compreende um replicon e umpolinucleotídeo de interesse flanqueado por um primeiro esegundo sítios de recombinação diretamente repetidos,caracterizado pelo fato de que os sítios de recombinaçãosão recombinogênicos com respeito um ào outro. Quando umarecombinase apropriada é provida, o cassete detransferência flanqueado pelos primeiro e segundo sítiosde recombinação diretamente repetidos é excisado do genomado organismo, por exemplo uma. planta, produzindo umreplicon viável contendo o polinucleotídeo de interesse. Areplicação desse replicon resulta em um alto número decópias do replicon, o polinucleotídeo de interesse, e/ouprolonga a disponibilidade do cassete de transferência nacélula. Em outros exemplos, um terceiro sítio derecombinação funcional é presente entre o replicon e opolinucleotídeo de interesse, caracterizado pelo fato deque o terceiro e o primeiro sítios dè recombinação sãosítios funcionais e dissimilares e não recombinogênicos comrespeito um ao outro, e a presença da recombinaseapropriada permite a integração do polinucleotídeo deinteresse em um sítio alvo flanqueado pelo terceiro eprimeiro'sítios de recombinação. Em um exemplo, pelo menosum dos sítios de recombinação usados no método compreendeum sítio de recombinação FRT modificado funcional aquiprovido.

Um replicon compreende uma unidade autoreplicativaextracromossômica. O replicon pode se originar de umvírus, plasmídio ou célula e possui a capacidade deautoreplicação. Nesse exemplo, o cassete de transferênciacompreende ambos um replicon e o polinucleotídeo deinteresse. Em um exemplo, um organismo tendo um sítio alvoestavelmente incorporado em seu genoma é provido. Umcassete de transferência compreendendo em uma direção 5' a3' ou 3' a 5': um primeiro sítio de recombinação funcional,um replicon, um segundo sítio de recombinação funcional, opolinucleotídeo de interesse, e um terceiro sítio derecombinação funcional é provido. 0 primeiro e terceirosítios de recombinação desse cassete de transferência sãorepetidos diretamente, correspondentes e recombinogênicoscom respeito a cada um, e o segundo sítio de recombinação édissimilar e não recombinogênico com respeito ao primeiro eterceiro sítios de recombinação, caracterizado pelo fato deque pelo menos um do primeiro, segundo, ou terceiro sítiosde recombinação compreende um sítio de recombinação FRTmodificado funcional compreendendo uma seqüência deespaçamento, selecionada do grupo consistindo de SEQ IDNOS: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16,17, e 18. 0 cassete de transferência pode estar contido emum T-DNA. Em um exemplo, o replicon é um replicon viral.Um replicon viral é qualquer DNA ou RNA ' derivado de umvírus que passa por replicação episomal em uma célulahospedeira. Ele contém viral seqüências virais eisatuantes necessárias para replicação, por exemplo a origemde replicação. Ele pode conter ou não conter trans-atuantes seqüências virais necessárias para replicação. ODNA viral excisado é capaz de atuar como um replicon ouintermediário de replicação, tanto independentemente, oucom fatores fornecidos in trans. O DNA viral podecodificar ou não codificar partículas virais infecciosas eadicionalmente pode conter inserções, deleções,substituições, rearranjos ou outras modificações. O DNAviral pode conter DNA heterólogo. Nesse casa, DNAheterólogo refere-se a qualquer DNA não viral ou DNA de umvírus diferente. Por exemplo, o DNA heterólogo podecompreender um cassete de expressão para uma proteína ouRNA de interesse.

Replicons virais adequados para uso nos métodos ecomposições incluem aqueles de geminivírus, begomovírus,curtovírus, ou mastrevírus, vírus de banda de RNA (-),vírusde banda de RNA ( + ) , potivírus, potexvírus, e tobamovírus.Replicons virais podem incluir, também, aqueles de vírustendo um genoma de DNA circular ou intermediário dereplicação, tais como: vírus de mosaico de Abuitilon(AbMV), vírus de mosaico de mandioca africana (ACMV),banana vírus da listra (BSV), mosaico anão de feijão(BDMV), vírus de mosaico de feijão dourado (BGMV), víruscurly top de beterraba (BCTV), vírus western amarelo debeterraba (BWYV) o outros luteovirus, vírus latente demandioca (CLV), vírus etch de cravo (CERV), vírus demosaico de couve-flor (CaMV), vírus de mosaico clorisestriado (CSMV), virus da mancha amarela de commelina(CoYMV), virus de mosaico de pepino (CMV), vírus de mosaicode dália (DaMV), virus da listra de digitaria (DSV), vírusde mosaico de erva-de-São Pedro (FMV), viróide decrescimento (HSV), vírus da listra de milho (MSV), virus demosaico de mirabilias (MMV), vírus da listra de miscanthus(MiSV), virus de crescimento de tubérculo de batata (PSTV),virus da listra de panicum (PSV), virus de mosaico amarelode batata (PYMV), virus X de batata (PVX), virus tungrobaciliforme de arroz (RTBV), virus da mancha clorótica desoja (SoyCMV), Virus da folha enrolada de abóbora (SqLCV),Virus das bandas de vasos de morango (SVBV) , virus dalistra da cana-de-açúcar (SSV), virus da mancha de thistle(ThMV), virus de mosaico de tabaco (TMV), virus de mosaicodourado de tomate (TGMV), vírus da mancha de tomate (TMoV),virus da mancha anelada de tabaco (TobRV), virus anãoamarelo de tabaco (TobYDV), virus da folha enrolada detomate (TLCV), virus da folha enrolada amarela de tomate(TYLCV), virus da folha enrolada amarela de tomate-Thailand(TYLCV-t) e vírus anão de trigo (WDV) e derivados desses.Em alguns exemplos, o replicon viral pode ser de ACMV, MSV,WDV, TGMV ou TMV.

Em outros exemplos, a inserção de um polinucleotideode interesse no genoma do organismo ocorre via um únicoevento de cross over. Por exemplo, o cassete detransferência pode compreender um primeiro sitio derecombinação, um replicou, um polinucleotideo de interesse,e um segundo sitio de recombinação. 0 primeiro e segundosítios de recombinação do cassete de transferência sãorecombinogênicos dissimilares ou correspondentes, ediretamente repetidos com respeito um ao outro. 0 sítioalvo pode compreender um único sítio de recombinação que érecombinogênico para um dos sítios de recombinação docassete de transferência. Tais sítios de recombinaçãorecombinogênico podem ser projetado de forma que eventos derecombinação integrativo são favorecidos por uma reação deexcisão. Tais sítios de recombinação recombinogênico sãoconhecidos, por exemplo, Albert et al. introduziu mudançasde nucleotídeo no elemento da esquerda de 13 pb (LE sítioIox mutante) ou elemento da direita de 13 pb (RE sítio Ioxmutante) do sítio lox. A recombinação entre o sítio Iox LEmutante e o sítio lox RE mutante produz o sítio IoxP detipo selvagem e um sítio mutante LE + RE que é pobrementereconhecido pela recombinase Cre, resultando em um eventode integração estável (Albert et al. (1995) Plant J 7:649-659). Ver também, por exemplo, Araki et al. (1997) NucleicAcids Res 25:868-872.

0 cassete de transferência é introduzido no organismocompreendendo o sítio alvo. Quando uma recombinaseapropriada é provida, um evento de recombinação entre ossítios de recombinação recombinogênicos do cassete detransferência ocorre. Esse evento resulta em excisão doreplicon, o que pode assumir uma forma circular. Areplicação da unidade replicon resulta em um alto número decópias do replicon no organismo e prolonga adisponibilidade do cassete de transferência na célula. Umsegundo evento de recombinação entre os sítios derecombinação recombinogênicos do sítio alvo e o cassete detransferência permite a integração estável da unidadereplicon e do polinucleotídeo de interesse no sítio alvo doorganismo.

Os métodos provêm inserção direcionada de umpolinucleotídeo de interesse. Se o polinucleotídeo deinteresse e introduzido em um organismo, ele pode provocarvárias mudanças no organismo, particularmente plantas,incluindo, mas não limitando-se a, modificação dacomposição de ácidos graxos na planta, alterar o conteúdode aminoácidos da planta, alterando a resistência apatógenos, e similares. Esses; resultados podem seralcançados provendo a expressão de produtos heterólogos,expressão aumentada de produtos endógenos em plantas, ouexpressão suprimida de produtos endógenos em plantas.

Categorias gerais de polinucleotídeos de interesseincluem por exemplo, aqueles genes envolvidos eminformação, tais como dedos de zinco, aqueles envolvidos emcomunicação, tais como quinases, e aqueles envolvidos emmanutenção, tais como proteína de choque de calor.Categorias mais específicas de transgenes incluem porexemplo, seqüências codificando traços para agronomia,resistência a insetos, resistência a doenças, resistência aherbicidás, esterilidade, característica de grãos, óleo,amido, carboidratos, fitato, proteínas, nutrientes,metabolismo, digestibilidade, tamanho de grão, carregamentode sacarose, e produtos comerciais. Traços, tais comoconteúdo de óleo, amido e proteína podem ser geneticamentealterados. Modificações incluem aumentar o conteúdo deácido oléico, óleos saturados e insaturados, aumentar osníveis de lisina e enxofre, prover aminoácidos essenciais,e também modificação de amido. Modificações em proteínahordotionina para alterar os níveis de aminoácidos sãodescritas em U.S. Patents 5.703.049, 5.885.801, 5.885.802,5.990.389. Outros exemplos são uma proteína de sementerica em lisina e/ou enxofre codificada pela albumina 2S desoja descrita em U.S. Patent 5.850.016, e o inibidor dequimotripsina de cevada, descrito em Williamson et al.(1987) Eur J Biochem 165:99-106.

Derivados das seqüências codificadoras podem serfeitos para aumentar o nível de aminoácidos pré-selecionados no polipeptídeo codificado. Por exemplo,polinucleotídeos codificando um polipeptídeo de altalisina de cevada (BHL) são derivados do inibidor dequimotripsina de cevada (WO 98/20133). Outras proteínasincluem proteínas vegetais ricas em metionina, tais como desementes de girassol (Lilley et al. (1989) Proceedings ofthe World Congress on Vegetable Protein Utilization inHuman Foods and Animal Feedstuffs, ed. Applewhite (AmericanOil Chemists Society, Champaign, Illinois), pp. 497-502);milho (Pedersen et al. (1986) J Biol Chem 261:6279;Kirihara et al. (1988) Gene 71:3); e arroz (Musumura et al.(1989) Plant Mol Biol 12:123).

Polinucleotideos de resistência a insetos podemcodificar resistência a pestes, tais como larva da raiz,broca, larva de traça européia, e similares. Taispolinucleotideos incluem, por exemplo, genes de proteínatóxica de Bacillus thuringiensis (U.S. Patents 5.366.892;5.747.450; 5.737.514; 5.723.756; 5.593.881; e Geiser et al.(1986) Gene 48:109); e similares.

Polinucleotideos codificando traços de resistência adoenças incluem genes de desintoxicação, tais como contrafumonosina (U.S. Patent 5.792.931); avirulência (avr) egenes de resistência a doenças (R) (Jones et al. (1994)Science 266:789; Martin et al. (1993) Science 262:1432; eMindrinos et al. (1994) Cell 78:1089); e similares.

Traços de resistência a herbicidas podem incluir genescodificando resistência a herbicidas que atuam para inibira ação de acetolactato sintase (ALS), em particular osherbicidas tipo sulfoniluréia, tais como clorosulfuron(e.g., as mutações S4 e/ou Hra em ALS); genes codificandoresistência a herbicidas que atuam para inibir a ação deglutamina sintase, tais como fosfinotricina ou basta (e.g.,o gene bar); glifosato (e.g., o gene EPSPS ou o gene GAT;ver, por exemplo, publicações de patente US20040082770 e WO03/092360) ou outros genes conhecidos. Resistência aantibióticos pode ser também provida, por exemplo o genenptll codifica resistência aos antibióticos canamicina egeneticina.

Genes de esterilidade podem ser também codificados emum cassete de expressão e provêm uma alternativa para aretirada de pendão física. Exemplos de genes usado em taismeios incluem genes preferenciais de tecido masculino egenes com fenótipos de esterilidade masculina, tais comoQM, descrito em U.S. Patent 5.583.210. Outros genesincluem quinases e aqueles codificando compostos tóxicos atanto desenvolvimento de gametófito masculino ou feminino.

Traços comerciais podem ser também codificados em umgene ou genes que poderiam,, por exemplo aumentar o amidopara produção de etanol, ou prover a expressão deproteínas. Outro uso comercial de plantas transformadas é aprodução de polímeros e bioplásticos, tal como descrito emU.S. Patent 5.602.321. Genes, tais como β-Ketotiolase,PHBase (polihidroxiburirato sintase), e acetoacetil-CoAredutase (ver Schubert et al. (1988) J Bacteriol 170:5837-5847) facilitam a expressão de polihidroxialcanoatos(PHAs).

A redução da atividade de genes específicos (tambémconhecidos como silenciamento gênico, ou supressão gênica)é desejável para diversos aspectos de engenharia genéticaem plantas. Várias técnicas para silenciamento de genessão bem conhecidas, incluindo, mas não limitando-se a,tecnologia antisenso (ver, e.g., Sheehy et al. (1988) ProcNatl Acad Sci USA 85:8805-8809; e U.S. Patents 5.107.065;5.453.566; e 5.759.829); co-supressão (e.g., Taylor (1997)Plant Cell 9:1245; Jorgensen (1990) Trends Biotech 8:340-344; Flavell (1994) Proe Natl Aead Sei USA 91:34 90-34 96;

Finnegan et al. (1994) Bio/Technology 12: 883-888; eNeuhuber et al. (1994) Mol Gen Genet 244:230-241);interferência de RNA (Napoli et al. (1990) Plant Cell2:279-289; U.S. Patent 5.034.323; Sharp (1999) Genes Dev13:139-141; Zamore et al. (2000) Cell 101:25-33; Javier(2003) Nature 425:257-263; e, Montgomery et al. (1998) ProeNatl Aead Sei USA 95:15502-15507), silenciamento gênicoinduzido por virus (Burton, et al. (2000) Plant Cell12:691-705; e Bauleombe (1999) Curr Op Plant Bio 2:109-113) ; ribozimas de direcionamento de RNA especifico(Haseloff et al. (1988) Nature 334: 585-591); estruturas(Smith et al. (2000) Nature 407:319-320; WO 99/53050; WO02/00904; e WO 98/53083); ribozimas (Steinecke et al.(1992) EMBO J 11:1525; U.S. Patent 4.987.071; e, Perrimanet al. (1993) Antisense Res Dev 3:253); modificaçãodirecionada mediada por oligonucleotideo (e.g., WO03/076574 e WO 99/25853); moléculas dedo de zincodirecionadas (e.g., WO 01/52620; WO 03/048345; e WO00/42219); e outros métodos ou combinações conhecidas dosmétodos acima.

Os polinucleotideos podem ser providos em um construtode DNA. Além disso, em exemplos específicos sítios derecombinação e/ou o polinucleotídeo codificando umarecombinase apropriada é também contido no construto deDNA. O cassete pode incluir seqüências reguladoras 5' e 3'operacionalmente ligadas ao polinucleotideo de interesse.Alternativamente, o construto de DNA flanqueado pelo sitiode recombinação apropriado pode não possuir os elementosreguladores 5' e/ou 3'. Nessa instância, o construto deDNA é projetado de forma que, na presença da recombinaseapropriada, um evento de recombinação no sitio alvo resultenas regiões reguladoras 5' e/ou 3' sendo operacionalmenteligadas às seqüências do construto de DNA. Seqüênciasintervenientes podem estar presentes entre elementosoperacionalmente ligados e não rompem a ligação funcional.O cassete pode conter, adicionalmente, pelo menos um geneadicional a ser introduzido no organismo.

Alternativamente, o(s) gene(s) adicional(is) pode serprovido em múltiplos construtos de DNA. Tal construto deDNA pode ser provido com uma pluralidade de sítios derestrição ou sítios de recombinação para inserção daseqüência de interesse a estar sob regulação transcricionaldas regiões, reguladoras. O cassete de expressão podeconter, adicionalmente, genes marcadores de seleção e/ourastreáveis.

Em alguns exemplos, o construto de DNA pode incluir nadireção 5' a 3' de transcrição, uma região de início detranscrição e tradução, um polinucleotideo de interesse, euma região de terminação de transcrição e traduçãotranscricional funcional no organismo de interesse. Emoutros exemplos, o construto de DNA compreende umpolinucleotideo de interesse 3' a um sítio de recombinação.Nesse exemplo, o sitio alvo pode compreender um promotor 5'para o sitio de recombinação correspondente, dessa forma,com a recombinação, a seqüência de nucleotideos deinteresse é operacionalmente ligada à seqüência promotora.

Os vários sitios de recombinação aqui providos podem serposicionados em qualquer lugar no construto de DNA,incluindo 5' UTR,3' UTR, regiões reguladoras, introns e/ouseqüência codificadora.

A região de inciação transcricional, o promotor, podeser nativa, análoga, estrangeira, ou heteróloga para oorganismo hospedeiro ou para o polinucleotideo deinteresse. Adicionalmente, o promotor pode ser a seqüêncianatural ou, alternativamente, uma seqüência sintética.

Tais construtos podem mudar os níveis de expressão dopolinucleotideo de interesse no organismo. A região determinação pode ser nativa ou heteróloga para a região deiniciação transcricional, pode ser nativa ou heterólogapara o polinucleotideo operacionalmente ligado deinteresse, ou pode ser nativa ou heteróloga para oorganismo hospedeiro. Regiões de terminação convenientesestão disponíveis a partir do plasmídio Ti de A.tumefaciens, tais como as regiões de terminação de octopinasintase e nopalina sintase. Ver também Guerineau et al.(1991) Mol Gen Genet 262:141-144/ Proudfoot (1991) Cell64:671-674; Sanfacon et al. (1991) Genes Dev 5:141-149;Mogen et al. (1990) Plant Cell 2 :1261-1272; Munroe et al.(1990) Gene 91:151-158; Bailas et al. (1989) Nucleic AcidsRes 17:7891-7903; e Joshi et al. (1987) Nucleic Acids Res15:9627-9639. A seqüência de nucleotídeós de interessepode ser também nativa ou análoga ou estrangeira ouheteróloga para o organismo hospedeiro.

Quando apropriado, o uso de códon na seqüência denucleotideos de interesse ou na recombinase pode sermodificado para expressão no organismo transformado. Porexemplo, os genes podem ser sintetizados usando códonspreferenciais de plantas para expressão melhorada. Ver, porexemplo, Campbell & Gowri (1990) Plant Physiol 92:1-11 parauma discussão de uso de códon preferencial de hospedeiro.Métodos estão disponíveis para genes sintetizastespreferenciais de plantas. Ver, por exemplo, U.S. Patents5.380.831, e 5.436.391, WO 99/25841, e Murray et al. (1989)Nucleic Acids Res 17:477-498.

Modificações adicionais de seqüências são conhecidaspara intensificar a expressão gênica em um hospedeirocelular. Essas incluem a eliminação de seqüênciascodificando sinais espuriosos de poliadenilação, sinais desítio de splice éxon-íntron, repetições tipo transposon, eoutras tais seqüências bem caracterizadas que podem serdeletérias à expressão gênica. 0 conteúdo G-C da seqüênciapode ser ajustada para níveis médias para um dadohospedeiro celular, como calculado por referência a genesconhecidos expressados na célula hospedeira. Quandopossível, a seqüência é modificada para evitar estruturashairpin de RNAm secundário previstas.O construto de DNA pode adicionalmente conterseqüências lider 5'. Tais seqüências líder podem atuarpara intensificar a tradução. Líderes de tradução sãoconhecidos e incluem líderes de picornavírus, por exemplo,líder EMCV (região 5' não codificadora deencefalomiocardite) (Elroy-Stein et al. (1989) Proc NatlAcad Sci USA 8 6:612 6-6130); líderes de potivírus, porexemplo, líder TEV (Vírus Etch de tabaco) (Gallie et al.(1995) Gene 165:233-238), líder MDMV (Vírus de mosaico anãodo milho) (Allison et al. (1986) Virology 154:9-20; e Konget al. (1988) Arch Virol 143:1791-1799), e proteínaimunoglobulina de cadeia pesada humana (BiP) (Macejak etal. (1991) Nature 353:90-94); líder não traduzido de capade proteína de RNAm de vírus de mosaico de alfafa (AMV RNA4) (Jobling et al. (1987) Nature 325:622-625); líder devírus de mosaico de tabaco (TMV) (Gallie et al. (1989) inMolecular Biology of RNA, ed. Cech (Liss, New York), pp.237-256); e líder de vírus clorótico de milho (MCMV)(Lomme-I et al. (1991) Virology 81:382-385). Ver também,Della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiol 84:965-968.Outros métodos ou seqüências conhecidas por intensificar atradução também podem ser utilizados, por exemplo, íntrons,e similares.

Na preparação do construto de DNA, os váriosfragmentos de DNA podem ser manipulados para posicionar asseqüências na orientação correta, se apropriado, no quadrode leitura correto. Nessa direção, adaptadores ou ligantespodem ser empregados para juntar os fragmentos de DNA ououtras manipulações podem ser envolvidas paira prover sitiosde restrição convenientes, remoção de DNA supérfluo,remoção de sitios de restrição, ou similares. Para essepropósito, mutagênese in vitro, reparo de primer,restrição, anelamento, re-substituições, transições e/outransversões, podem ser envolvidas.

Geralmente, o construto de DNA compreenderá um genemarcador de seleção para a seleção de células transformadas.Genes marcadores de seleção são utilizados para a seleção decélulas transformadas ou tecidos e foram discutidos emdetalhe aqui em outra parte, assim como, promotores deinteresse exemplares.

Os seguintes exemplos são oferecidos por meio deilustração e não por meio de limitação.

EXPERIMENTAL

Exemplo 1. Geração de bibliotecas compreendendosítios de recombinação FRT modificados.

Dois oligonucleotideos complementares degeneradoscontendo seqüências FRT, com as 6 posições centrais deespaçamento sendo randomicamente mutagenizadas, foramsintetizados na Synthetic Genetics (San Diego, CA):

Oligo -1:5'-

gccagcatgcaagcttgaattccgaagttcctatactNNNNNNagaataggaacttcgagatctggatccgcggaacg-3' (SEQ ID NO:52); 'e 01igo2: 5'-cgttccgcggat ccagatctcgaagtt cctat tctNNNNNNagtataggaact tcggaattcaagcttgcatgctggc-3' (SEQ ID NO:53).

A região de espaçamento é de 8 pb. Nesse experimento,a região central de 6 pb foi visada para modificação, eassim, os outros dois nucleotídeos são mantidos semmudança. Um pmol de oligo 1 e um pmol de oligo 2 foramanelados por desnaturação por calor a 95°C por 2 minutos,seguido por resfriamento gradual a temperatura ambiente.

Os oligonucleotideos anelados foram digeridos com EcoRI eBamHI e ligados nos sítios EcoRI/BamHI de um vetor derivadode pSportl, a qual 3 bases adicionais criaram um sitio derestrição HpaI (BRL Life Technologies, Gaithersburg, MD) eo vetor PHP13273 contendo um gene de resistênciaespectinomicina para criar duas bibliotecas de plasmídiosFRT modificados. Uma razão molar de 10:1 e 4:1 deoligonucleotídeo ane.lado para pSport e PHP13273 foi usadapara as respectivas reações de ligação. Sob essascondições de ligação, 10 de' 10. colônias randomicamenteescolhidas foram encontradas contendo uma inserçãomonomérica de um sitio FRT modificado. A biblioteca de FRTmodificado referida como "biblioteca A" está no vetorpSport e carrega o marcador resistente a antibióticoampicilina. A biblioteca de FRT modificado, referida como"biblioteca B" está no vetor PHP13273 e carrega o marcadorresistente a antibiótico espectinomicina. Um número totalde 15.904 colônias foi coletado para fazer uma biblioteca AFRT e 19.600 colônias foram coletadas para fazer umabiblioteca B FRT. Isso representou uma cobertura de 4x das6 posições centrais (4Ô=4096) no sitio FRT. DNA deplasmidio foi isolado dessas duas bibliotecas e usado parao rastreamento na escala de biblioteca.

Exemplo 2. Rastreamento na escala de biblioteca paraidentificar sítios de recombinação FRT modificadosrecombinogênicos.

Uma quantidade molar igual de DNA de cada dasbibliotecas FRT modificadas AeB foi misturada em um tubocontendo tampão de reação para recombinação in vitromediada por FLP. Uma reação de recombinação tipica de 20μ1compreende 25mM Tris-Cl a pH 7,5, IOmM MgCl2, 5mM DTT,5Ofmol DNA de biblioteca A, 50fmol DNA de biblioteca B, e2μl FLP (0,07pg/pl final). A reação é conduzida a 30°C, ealíquotas tomadas em vários pontos do tempo. Em cadamomento, alíquotas de 2μ1 foram tomadas e a reação cessoufervendo-se por 1 min com resfriamento gradual atemperatura ambiente. Tipicamente, amostras foram tomadasa 0, 2, 5, 10, 30, 60, e 90 minutos e poderiam ser usadaspara avaliar sítios FRT reativos rápidos vs lentos. Seapenas um ponto do tempo foi tomado, o ponto dos 90 minutosfoi usado.

Amostras de reação foram transferidas em células de E.coli DH5a de acordo com procedimentos padrão. Alíquotasiguais de cada mistura de transformação foram espalhadas emuma placa cada contendo tanto apenas ampicilina, apenasespectinomicina, ou contendo ambas ampicilina eespectinomicina. O DNA co-integrante recombinado comsucesso carregará ambos marcadores de seleção e, assim,após transferência em E. coli, irá conferir resistência aambas ampicilina e espectinomicina.

Aquelas colônias com resistência a ambos antibióticosforam escolhidas e o DNA de plasmidio foi preparado usandoo kit de preparação de DNA de plasmidio Montage 96-well HTP(Millipore, Billerica, MA USA) . Sitios FRT candidatosforam obtidos por PCR usando primers flanqueando sítios FRTrecombinados no DNA co-integrante. Os primers de PCR usadoforam primer Forward.: 5'-gcacatacaaatggacgaacgga-3 (SEQ IDNO:54) e primer Reverso: 5'-cctcttcgctattacgccagct-3' (SEQID NO:55). As condições de PCR foram como se segue: umciclo: 95°C, 1 min; 20 ciclos: 95°C, 30 seg; 61°C, 2 min; umciclo: 67°C, 3 min; Espera: 4°C. A seqüência dos sítios FRTcandidatos amplificados foi determinada por seqüenciamentoCycle (essencialmente como descrito em Slatko et al. (1993)DNA Sequencing. In, Current Protocols in Molecular

Biology, (ed. By Ausubel et al.) Ch. 7, pp 7.0.1-7.6.13.New York: John Wiley & Sons).

Exemplo 3. Métodos para. testar a eficiência deexcisão de sítios de recombinação FRT modificadosrecombinogênicos.

Para testar a eficiência de excisão mediada porreçombinase de um sítio FRT candidato, vetores de excisãoforam feitos, nos quais duas cópias de um sitio FRTmodificado recombinogênico candidato foram clonadas emorientação direta flanqueando a seqüência promotora deubiquitina de milho em pSport (BRL Life Technologies,Gaithersburg, MD) . Uma reação de excisão foi conduzida sobas seguintes condições: 3μ1 de minipreparado de DNA vetorde excisão (2mg/ml), Ιμΐ IOx tampão (250mM Tris-Cl a pH7,5, IOOmM MgCl2, 50mM DTT) , 5μ1 ddH20, e Ιμΐ FLP (0,72mg/ml) . A mistura de reação foi incubada a 30°C por 30min, fervida por 2 min, resfriada a temperatura ambiente,digerida com EcoRV e XhoI, e, então sujeita a eletroforesede gel de agarose.

EcoKV gera um único corte na espinha dorsal do vetorpSport, enquanto XhoI gera um único corte na seqüência depromotor de ubiquitina de milho. A dupla digestão do vetorde excisão não recombinado produz dois fragmentos de 4332pb e 769 pb. A dupla digestão do vetor produto, após aexcisão ocorrer, produz um fragmento adicional de 952pb.

Os fragmentos de DNA foram quantificados usando softwareQuantity One da Bio-Rad Laboratories. A medida que aexcisão ocorre, uma quantidade aumentada do fragmento de952 pb é produzida e menos do fragmento de 7 69 pb éproduzido. Assim, a razão do fragmento de 952 pb para ofragmento de 769 pb mede a eficiência absoluta de excisão.

Nesse experimento, eficiência relativa de excisão derecombinação (% eficiência de excisão) de um sitio FRT écalculada como a eficiência de excisão na presença de FLPnativa de levedura de um primeiro sitio FRT modificado comum segundo sitio FRT modificado divida pela eficiência deexcisão de um par de sítios FRT de tipo selvagem (SEQ IDNO:3 9) X 100%.

Vários sítios de recombinação FRT modificadosidentificados nos métodos do Exemplo 2 foram analisadospara sua habilidade de reter atividade biológica. A Tabela1 apresenta vários sítios de recombinação FRT modificadosfuncionais e sua eficiência relativa de recombinaçãodeterminada como destacado acima.

Tabela 1

<table>table see original document page 147</column></row><table><table>table see original document page 148</column></row><table>

*As seqüências de espaçamento foram flanqueadas peloelemento simétrico de tipo selvagem de 13 pares de baserelatado na Figura 1.

Exeaplo 4. Métodos para testar a eficiência de co-integração sítios de recombinação FRT modificadosrecombinogênicos.

O experimento foi conduzido como descrito no Exemplo2. Resumidamente, FRTl, 5, a 6 (SEQ ID NOS:39, 40, e 41)foram individualmente clonados em sítios EcoRI/BamHI dePHP13273 e modificaram o vetor pSportl. 50 fmol de DNA deFRTl em PHP13273 (Specr) foi misturado com 50 fmol de DNAde FRTl em pSportl modificado (Apr) em 20μ1 de tampão dereação contendo 25mM Tris-Cl a pH 7,5, IOmM MgCl2, 5mM DTT,e 2μ1 FLP (0,07μg/μl final) . A cada ponto de tempo,alíquotas de 2μ1 foram tomadas e a reação cessou fervendo-se por 1 min com resfriamento gradual a temperaturaambiente. Amostras de reação foram transferidas em célulasde Ε. coli DH5a de acordo com procedimentos padrão.Alíquotas iguais de cada mistura de transformação foramespalhadas em uma placa cada contendo ampicilina apenas,espectinomicina apenas, ou contendo ambas ampicilina eespectinomicina. O DNA co-integrado recombinado comsucesso via sítios FRTl carregará ambos marcadores deseleção e, assim, após a transferência em E. coli, iráconferir resistência a ambas ampicilina e espectinomicina.

Aquelas colônias com resistência a ambos antibióticos foramescolhidas e DNA de plasmídio co-integrado foi preparadopara análise adicional. Clones que são resistentes a ambosantibióticos, mas não abrigam DNA de plasmídio co-integradoforam subtraídos no cálculo da freqüência de co-integração.

A freqüência de co-integração de FRTl foi determinadacalculando-se a porcentagem de colônias abrigando DNA deplasmídio co-integrado dentre as colônias resistentes a umadas drogas antibióticas. Similarmente, a integração invitro de FRT5 ou FRT6 foi efetuadas e a freqüência de co-integração de FRT 5 ou FRT 6 foi determinadaconseqüentemente. Os resultados são apresentados na Tabela 2.

Tabela 2. Porcentagem de co-integrantes recuperados apartir de recombinação in vitro mediada por FLP (%)

<table>table see original document page 149</column></row><table><table>table see original document page 150</column></row><table>

Recombinação in vitro mediada por FLP foi efetuadacomo descrito anteriormente. Quando o DNA contendo sítiosFRT dissimilares é misturado na reação, tal como norastreamento em escala de biblioteca previamente descrito,a recombinação intermolecular entre dois sítios FRTcorrespondentes é adicionalmente reduzida. Em reaçõescontendo sítios FRTl apenas, sítios FRT5 apenas, ou sítiosFRT6 apenas, a recombinação entre sítios FRTl é deaproximadamente 10 vezes mais eficiente do que entre sítiosFRT5 e aproximadamente 4 vezes mais eficiente do que entresítios FRT6 (Tabela 2).

Nesse exemplo, DNA de plasmídio contendo três sítiosFRT diferentes (FRTl, FRT5, e FRT6), cada um residindo empSportl modificado carregando marcador de seleção Apr ePHP13273 carregando Specr, foram misturados na reação.Dentre FRTl, FRT5, e FRT6, dois sítios FRT diferentes nãorecombinam um com o outro. Na reação tendo quantidadeeqüimolar de DNA contendo sítios FRT de FRTl, FRT5, e FRT6,a eficiência de recombinação entre quaisquer dois sítiosFRT correspondentes é reduzida. Os resultados são

apresentados na Tabela 3. A freqüência de co-integraçãocombinada entre dois sítios FRTl, dois sítios FRT5, e doissítios FRT6 foi de 0,09% após 90 minutos, aproximadamente10 vezes menos do que da reação tendo apenas o sítio FRTl.A maioria dos co-integrantes é de recombinação via ossítios FRT mais eficientes, FRTl, na reação como indicadopelo fato de que todos os 10 co-integrantes randomicamenteescolhidos foram produtos de recombinação de sítios FRTl.Na reação tendo menos quantidade molar de DNA contendosítio FRTl (razão molar dentre FRTl, FRT 5, e FRT 6 é:0,04:1,00:1,00), a recombinação total foi adicionalmentereduzida. Ainda, nenhum dos 10 co-integrantesrandomicamente escolhidos foi produto de recombinação desítios FRTl.

Tabela 3

<table>table see original document page 151</column></row><table><table>table see original document page 152</column></row><table>

* O Marcador de seleção e a quantidade molar de DNA usadona reação estão incluídos nos parênteses.

Exeaplo 5: Transformação vegetal

A. Transformação por Bombardeamento de Partículas eRegeneração de Calo de Milho

Embriões imaturos de milho ; oriundos de estufa oucultivados no campo de plantas doadoras do tipo High typeII (HiII) são bombardeados com um polinucleotídeo isoladocompreendendo um sítio de recombinação, cassete detransferência, sítio alvo, e/ou recombinase aqui providos.Se o polinucleotídeo não inclui um marcador de seleção,outro polinucleotídeo contendo um gene marcador de seleçãopode ser co-precipitado nas partículas usadas parabombardeamento. Por exemplo, um plasmídio o gene PAT(Wohlleben et al. (1988) Gene 70:25-37) que confereresistência ao herbicida Bialaphos pode ser usado. Atransformação é efetuada com se segue.

As espigas são esterilizadas na sua superfície em 50%alvejante Chlorox mais 0,5% Micro detergente por 20minutos, e enxaguado duas vezes com água estéril. Osembriões imaturos são excisados e colocado com o eixo doembrião para baixo (lado do escutelo para cima), 25embriões por placa. Esses são cultivados em meio de ágar560L, 4 dias antes do bombardeamento no escuro. 0 meio560L é um meio baseado em N6 contendo vitaminas Eriksson's,tiamina, sacarose, 2,4-D, e nitrato de prata. No dia debombardeamento, os embriões são transferidos para meio 560Ypor 4 horas e são arranjados na zona alvo de 2,5 cm. Meio560Y é um meio altamente osmótico (560L com altaconcentração de sacarose).

Um vetor de plasmídio compreendendo um polinucleotideode interesse operacionalmente ligado ao promotorselecionado é construído. Esse DNA de plasmídio, mas DNAde plasmídio contendo um marcador de seleção PAT senecessário, é precipitado em pelotas de ouro de 1,0 μπ\(diâmetro médio) usando um procedimento de precipit açao comCaC12 com se segue: 100 μΐ preparado de partículas de ouro(0,6 mg) em água, 20 μΐ (2 μς) DNA em tampão TrisEDTA (1 μgtotal), 100 μΐ 2,5 M CaC12, 40 μΐ 0,1 M espermidina.

Cada reagente é adicionado seqüencialmente à suspensãode. partículas de ouro. A mistura final é brevementesonicada. Após o período de precipitação, os tubos sãocentrifugados brevemente, o líquido removido, lavados com500 μΐ 100% etanol, e centrifugados novamente por 30segundos. Novamente, o líquido é removido, e 60 μΐ 100%etanol é adicionado à pelota de partículas de ouro final.Para o bombardeamento de partículas com pistola, aspartículas ouro/DNA são brevemente sonicadas e 5 μΐcolocadas no centro de cada macrocarregador e deixadassecando por cerca de 2 minutos antes do bombardeamento.

As placas de amostras são bombardeadas a uma distânciade 8 cm a partir da tela de parada ao tecido, usando umapistola biolística DuPont de partículas de hélio. Todas asamostras recebem um único tiro a 650 PSI, com um total dedez alíquotas tiradas de cada tubo de preparadopartículas/DNA.

De quatro a 12 horas após o bombardeamento, osembriões são movidos para 560P (um meio de iniciação decalo pouco osmótico similar a 560L mas com menos nitrato deprata), por 3-7 dias, então transferidos a meio de seleção560R, um meio baseado em N6 similar a 560P contendoBialaphos a 3 mg/litro, e subcultivado a cada 2 semanas.

Após aproximadamente 10 semanas de seleção, clones de calossão amostrados para PCR e/ou atividade do polínucleotídeode interesse. Linhas positivas são transferidas para meio288J, um meio baseado em MS com menos sacarose e níveis dehormônio, para iniciar a regeneração vegetal. Seguindo oamadurecimento de embrião somático (2-4 semanas), embriõessomáticos bem desenvolvidos são transferidos para meio paragerminação e transferidos para a sala de cultura iluminada.

Aproximadamente 7-10 dias depois, as plântulas emdesenvolvimento são transferidas para meio em tubos por 7-dias até que as plântulas estejam bem estabelecidas. Asplantas são, então, transferidas para inserções emrecipientes (equivalente a pote de 2,5") contendo solo depote e cultivadas por 1 semana em uma câmara decrescimento, subseqüentemente cultivadas por 1-2 semanasadicionais na estufa, então transferidas para potesClassic™ 600 (1,6 galão) e cultivadas para maturidade. Asplantas são monitoradas para expressão do polinucleotideode interesse.

B. Transformação mediada por Agrobacterium eRegeneração de Calos de Milho

Para transformação de milho mediada por Agrobacterium,um polinucleotideo compreendendo um sitio de recombinação,cassete de transferência, sitio alvo, e/ou recombinase aquiprovidos é usado com o método de Zhao (U.S. Patent5.981.840).

Resumidamente, embriões imaturos são isolados de milhoe os embriões contatados com uma suspensão de Agrobacteriumcontendo um polinucleotideo de interesse, onde as bactériassão capazes de transferir a seqüência de nucleotideos deinteresse a pelo menos uma célula de pelo menos um dosembriões imaturos (etapa 1: a etapa de infecção). Nessaetapa, os embriões imaturos são imersos em uma suspensão deAgrobacterium para o início da inoculação. Os embriões sãoco-cultivados por um tempo com as Agrobacterium (etapa 2: aetapa de co-cultivo). Seguindo esse período de co-cultivo,uma etapa ótima de "descanso" pode ser efetuada (etapa 3:etapa de descanso). Os embriões imaturos são cultivados emmeio sólido com antibiótico, mas sem um agente de seleção,para eliminação de Agrobacterium e por uma fase de descansopara as células infectadas. Em seguida, os embriõesinoculados são cultivados em meio contendo um agenteseletivo e o cultivo de calos transformados é recuperado(etapa 4: a etapa de seleção). Os embriões imaturos sãocultivados em meio sólido com um agente seletivo resultandono crescimento seletivo de células transformadas. 0 caloé, então, regenerado em plantas (etapa 5: a etapa deregeneração), e os calos cultivados em meio seletivo sãocultivados em meio sólido para regenerar as plantas.

C. Transformação de Dicotiledôneas

Um polinucleotídeo compreendendo um sítio derecombinação, cassete de transferência, sítio alvo, e/ourecombinase aqui providos, pode ser introduzido em culturasembriogenias em suspensão de soja por bombardeamento departículas usando essencialmente os métodos descritos emParrott, et al. (1989) Plant Cell Rep. 7:615-617. Essemétodo, com modificações, é descrito abaixo.As sementes são removidas de vagens quando oscotilédones são de 3 a 5 mm em comprimento. As sementessão esterilizadas em uma solução alvejante (0,5%) por 15minutos, o que após esse tempo, as sementes são enxaguadascom água destilada estéril. Os cotilédones imaturos sãoexcisados, primeiro contando-se a porção da semente quecontém o eixo do embrião. Os cotilédones são, então,removidos das cobertura da semente gentilmente empurrando aextremidade distai da semente com a extremidade rombuda dalâmina do bisturi. Os cotilédones são, então, colocados emplacas de Petri (lado plano para cima) com meio deiniciação SBl (sais MS, vitaminas B5, 20 mg/L 2,4-D, 31,5g/L sacarose, 8 g/L TC Agar, pH 5,8). As placas de Petrisão incubadas no .claro (dia de 16 hrs; 75-80 μΕ) a 26°C.

Após 4 semanas de incubação, os cotilédones sãotransferidos para meio SBl fresco. Após duas semanasadicionais, embriões somáticos de estágio globular queexibem áreas proliferativas são excisado e transferidospara meio liquido FN Lite (Samoylov, et al. (1998) In VitroCell Dev. Biol.- Plant 34:8-13). Cerca de 10 a 12 pequenosagrupamentos de embriões somáticos são colocados em frascosde 250 ml contendo 35 ml de meios SB172. As culturas emsuspensão embriogênicas de soja são mantidas em 35 mL demeio liquido em um misturados rotativo, 150 rpm, a 26°C comluzes florescentes (20 μΕ) em um período de 16:8 horasdia/noite. As culturas são sub-cultivadas a cada duassemanas inoculando-se aproximadamente 35 mg de tecido em 35mL de meio líquido.As culturas em suspensão embriogênicas de soja são,então, transformadas usando bombardeamento de partículaspor pistola (Klein et al. (1987) Nature 327:70; U.S. PatentNo. 4.945.050). Um instrumento BioRad BiolisticàPDS1000/HE pode ser usado para essas transformações. Umgene marcador de seleção, que é usado para facilitartransformação de soja, é um gene quimérico composto depromotor 35S de Vírus de Mosaico de Couve-Flor (Odell etal. (1985) Nature 313:810-812), o gene de higromicinafosfotransferase de plasmídio pJR225 (de E. coli; Gritz etal. (1983) Gene 25:179-188) e a região 3' do gene denopalina sintase de T-DNA do plasmídio Ti de Agrobacteriumtumefaciens.

Para 50 μ! de uma suspensão de partículas de ouro de 1μπι a 60 mg/mL, é adicionado (em ordem) : 5 μΐ, DNA (1μg/μL) , 20 μΐ espermidina (0,1 Μ) , e 50 μΐ, CaC12 (2,5 M) .A preparação de partículas é agitadas por três minutos,girada em uma centrífuga por 10 segundos e o sobrenadanteremovido. As partículas cobertas por DNA são lavadas umaver em 400 μΙ, 70% etanol e ressuspendida em 40 μΐ de etanolanidro. A suspensão DNA/partículas é sonicadas três vezespor um segundo cada. Cinco μΐ, das partículas de ourocobertas por DNA são, então, carregadas em um discomacrocarregador.

Aproximadamente 300-400 mg de uma cultura em suspensãode duas semanas de idade são posicionados em uma placa depetri vazia de 60x15 mm e o líquido residual removido dotecido com uma pipeta. A pressão de ruptura de membrana édeterminada a 1100 psi e a câmara é evacuada a um vácuo de28 polegadas mercúrio. 0 tecido é posicionado a

aproximadamente 8 cm da tela de retenção, e é bombardeadotrês vezes. Após o bombardeamento, o tecido é divido aomeio e colocado de volta em 35 ml dé meio FN Lite.

De cinco a sete dias após o bombardeamento, o meioliquido é trocado por meio fresco. Onze dias após obombardeamento, o meio é trocado com meio fresco contendo50 mg/mL higromicina. Esse meio seletivo é refrescadosemanalmente. De sete a oito semanas após o

bombardeamento, o tecido verde transformado será observadocrescendo a partir de agrupamentos embriogênicos necróticosnão transformados. Tecido verde isolado é removido einoculado em frascos individuais para gerar novas culturasem suspensão embriogênicas clonalmente propagadas. Cadanova linha é tratada como um evento de transformaçãoindependente. Essas suspensões são, então, subcultivadas emantidas como agrupamentos de embriões imaturos, ou otecido é regenerado em plantas inteiras por amadurecimentoe germinação de embriões individuais.

D. Isolamento de DNA de Tecidos de Calo e Folha

Eventos de transformação putativos podem serrastreados para a presença do transgene. DNA genômico éextraído de calos ou folhas usando uma modificação dométodo de CTAB (brometo de cetiltrietilamônio, Sigma H5882)descrito por Stacey and Isaac (1994 In Methods in MolecularBiology Vol. 28, pp. 9-15, Ed. P.G. Isaac, Humana Press,Totowa, NJ) . Aproximadamente 100-200 mg de tecidocongelado sujo com pólvora em nitrogênio liquido ehomogeneizado em 1 ml de tampão de extração CTAB (2% CTAB,0,02 M EDTA, 0,1 M Tris-Cl pH 8, 1,4 M NaCl, 25 mM DTT) por30 min a 65°C. As amostras homogeneizadas são deixadasresfriando a temperatura ambiente por 15 min antes de serfeita uma extração de proteína simples com aproximadamente1 ml 24:1 v/v de clorofórmio:octanol. As amostras sãocentrifugadas por 7 min a 13.000 rpm e a camada superior desobrenadante coletada usando pontas de pipetas de bocalarga. DNA é precipitado a partir do sobrenadante porincubação em 95% etanol em gelo por 1 h. Filetes de DNAsão enroladas em um gancho de vidro, lavadas em 75% etanolcontendo 0,2 M acetato de sódio por 10 min, secadas com arpor 5 min e ressuspendidas em tampão TE. Cinco μΐ de RNAseA é adicionado às amostras e incubado a 37° C por 1 h.Para quantificação do DNA genômico, eletroforese de gel éefetuada usando um gel de agarose 0,8% em Ix tampão TBE.Um microlitro de cada das amostras é fracionado junto com200, 400, 600 e 800 ng μΐ-l λ de marcadores de DNA nãocortados.

Exemplo 6. Coapaxando a eficiência relativa derecombinação de seqüências FRT dissimilares em células demilho.Dois testes são provido que medem as taxas relativasde ativação de transgenes como um resultado da excisãomediada por FLP, que traz um promotor e transgene emproximidade funcional. O método pode ser usado paracaracterizar a eficiência de recombinação de tanto sítiosde recombinação correspondentes e/ou dissimilares e, dessaforma, determinar se os sítios são recombinogênicos ou nãorecombinogênicos um ao outro.'

Dois testes são discutidos abaixo: (A) pontuação deativação de Proteína Amarela Fluorescente (YFP) em célulasindividuais e (B) pontuação de atividade de luciferase.

A. Teste de Fluorescência

Três cassetes de expressão transgênicos (destacados naTabela 4) são introduzidos tanto em um tratamento de FRTteste ou um tratamento controle.

Tabela 4

<table>table see original document page 161</column></row><table>

YFP = proteína de fluorescência amarela ; CFP = proteína defluorescência ciano; CPN60 = promotor de chaparonina 60 demilho (Close (1993) Master's Thesis, Iowa StateUniversity).Em ambos tratamentos controle e FRT teste, os trêscassetes de expressão relevantes (ou apropriados) sãomisturados em razões equimolares, e introduzidos em célulasescutelares de embriões Hi-II imaturos usando métodos dedistribuição de partículas padrão. Após dois dias, osnúmeros de células ciano e amarelo fluorescentes sãocontados usando um estereomicroscópio epifluorescenteLeica. 0 número de células ciano fluorescentes é usadopara normalizar entre os tratamentos provendo uma medidarelativa de quantas células receberam DNA suficiente paraexpressar os transgenes. Para validar esse sistema deteste, FRTl é usado para o primeiro experimento. Como umtratamento controle, uma mistura dos seguintes trêsplasmídios é usada: Actina::Ciano FP::nos,

CPN60:FRTi:YFP:termo 35s, e Ubi::FLP::pinll. No tratamentocontrole, quando esses três plasmídios são co-introduzidose os números de células ciano e amarelas são pontuados doisdias mais tarde, os números de células ciano e amarelas napopulação é esperado de ser aproximadamente equivalente(1:1).

No tratamento FRT teste, quando FRTl é usado nocassete ativado por excisão (CPN60:FRTl:GUS:FRTl:YFP:termo35s), espera-se que aproximadamente 90-95% das célulasexpressando fluorescência ciano também expressefluorescência amarela, i.e. a excisão da região flanqueadapor FRTl é relativamente eficiente. Baseado em estudoprévios com FRT5, quando FRT5 é usado no cassete deexcisão, a freqüência de células ciano fluorescentes quetambém expressam a proteína fluorescente amarela é esperadapor cair a aproximadamente 15% daquela observada notratamento com FRTl.

O cassete ativado por excisão pode ser também usadopara determinar se dois sítios de recombinação FRTdissimilares são recombinogênicos ou não recombinogênicos.Para determinar se FRTl e FRT5 são recombinogênicos ôu nãorecombinogênicos com respeito um ao outro, um casseteativado por excisão compreendendoCPN60:FRTl:GUS:FRT5:YFP:termo 35s é construído. Comodestacado na Tabela 4, os três cassetes de expressão sãomisturado em razões equimolares-, e introduzidos em célulasescutelares de embriões Hi-II imaturos usando métodos dedistribuição de partículas padrão. Após dois dias, osnúmeros de células fluorescentes ciano e amarelas sãocontados usando um estereomicroscópio epifluorescenteLeica. 0 número de células fluorescentes cianò é usadopara normalizar entre os tratamentos, provendo uma medidarelativa de quantas células receberam. DNA suficiente paraexpressar os transgenes.

Quando o cassete de excisão compreende um sítio derecombinação FRTl e um sítio de recombinação FRT5, afreqüência de células ciano fluorescentes que tambémexpressam a proteína fluorescente amarela é esperada porcair a aproximadamente menos do que 1% daquela observadaquando um cassete de excisão compreendendo dois sítios derecombinação FRTl é empregado. Os sítios são, portanto,determinados por serem não recombinogênicos.

B. Teste baseado na ativação de atividade enzimáticade luciferase

O segundo sistema de teste usa, novamente, uma misturade plasmídios em quantidades equimolares, co-bombardeadasem células escutelares de embriões Hi-II imaturos. Paraesse teste, três plasmídios são apresentados na Tabela 5.

Tabela 5

<table>table see original document page 164</column></row><table>

FF = luciferase de vaga-lume; luciferase de Renilla(Minko et al. (1999) Mol. Gen. Genet. 262:421-425)Novamente, FRTl é usado para validar o sistema deteste. No tratamento controle, Actina:FRTl:FF-luciferase::nos, Nos::luciferase de Renilla::termo 35S, eUbi::FLP::pinll, são introduzidos em células escutelares eapós 2 dias, o tecido é extraído usando métodos e soluçõesprovidos no Kit Promega Dual-Iuciferase Assay Kit (Promega,Madison, WI 53711). Múltiplos escutelos sãoindividualmente extraídos, e os extratos seqüencialmentetestados para atividade de luciferase de vaga-lume e,então, de Renilla usando um Fluoroscan. Com essa misturade construtos, é esperado que a proteína luciferase devaga-lume expressada produza aproximadamente 5000 unidadesde luz relativas e a luciferase de Renilla produza cerca de15.000. Quando FRTl é usado no cassete ativado por excisão(Actina:FRTl:GUS:FRTlrluci de vaga-lume:termo 35s), aluciferase de vaga-lume é esperada por produzir cerca de4500 unidades de luz (cerca de 90% do tratamento controle).Quando FRT 5 é usado no cassete de excisão, a atividade deluciferase de vaga-lume é esperada por cair aaproximadamente 670 unidades de luz (~15% de FRT1).

Exenplo 7. Direcionando a inserção de umpolinucleotideo de interesse em milho

A. Estabelecendo uma Linha Alvo

Para avaliação de seqüências FRT para integração sítioespecífica, um sítio alvo é primeiro criado integrando-seestavelmente um polinucleotideo compreendendo um sítio alvotendo dois sítios de recombinação FRT funcionais, onde ossítios de recombinação são dissimilares e nãorecombinogênicos com respeito um ao outro. Essatransformação inicial é conseguida em germoplasma Hi-II (oulinhas intercruzadas) usando métodos padrão detransformação por Agrobacterium para milho (ver Exemplo5B). Por exemplo, para comparar a eficiência relativa deFRT5 e FRT87 no sistema de integração sitio especifico, osseguintes construtos são introduzidos separadamente emgermoplasma Hi-II:

PHP20807 :

RB- Ubi:Ubi-intron:FRTl:Proteína FluorescenteAmarela::pinlI/Ubi:Ubi-intron:

GAT::pinII/termo In2-1:GUS:FRT5:Os-Actina-íntron:Os-ActinaPro -LB

PHP20705:

RB- Ubi:Ubi-intron:FRTl:Proteína FluorescenteAmarela::pinII/Ubi:Ubi-intron:

GAT::pinll/termo In2-1:GUS:FRT87:Os-Actina-íntron:Os-ActinaPro -LB

Transformantes estáveis são selecionados procurando-secalos amarelos fluorescentes crescendo em meio contendoglifosato. Plantas são regeneradas e enviadas par aestufa. Amostras foliares são tomadas para análiseSouthern. Cópias únicas de plantas transgênicas sãocultivadas até a maturidade e cruzadas para Hi-II de tiposelvagem (ou linhas intercruzadas). Esses eventostransgênicos agora contêm o sítio alvo FRT1-5 ou FRT1-87, eestão prontos para recombinação sítio específica mediadapor recombinase.Β. Introdução do cassete de transferência usandobombardeamento de partículas.

Embriões imaturos da linha tendo os sítios alvo comoevidenciado por expressão de fluorescência amarela sãousados para a re-transformação subseqüente. Durante oprocesso de re-transformação, cassetes de transferência sãointroduzidos usando métodos padrão de bombardeamento departículas (e.g., ver Exemplo 5A) . Para plantasdescendentes que contêm o T-DNA integrado de PHP20705 (osítio alvo FRT1-FRT87), a seguinte inserção compreendendo ocassete de transferência é usada para re-transformaçãousando pistola de partículas:

PHP20915:

RB-Termo CaMV35S /FRTl:bar::pinII/Ubi:Ubi-íntron:luciferasede Renilla::pinll/ termo In2-1:Am-Cyanl:FRT87/TermoCaMV35S-LB.

Embriões imaturos descendentes que contêm o T-DNAintegrado de PHP20807 (o sítio alvo FRT1-FRT5) são re-transf ormadas usando a pistola de partículas com o seguinteplasmídio:

PHP20954:

RB- Termo CaMV35S /FRTl:bar::pinll/Ubi:Ubi-íntron : luciferase de Renilla::pinll/ termo In2-l:Am-Cyanl:FRT5/ Termo CaMV35S-LB.Para ambos plasmídios compreendendo o cassete detransferência (PHP20915 e PHP20954), os genes bar e Cyan FPnão possuem promotor. Para reduzir a probabilidade de que aintegração randômica resulte em expressão espuriosa dequalquer gene, o terminador CaMV35S foi colocado acima dositio FRTl. Cada desses plasmídios é co-transformado emembriões imaturos a partir de suas respectivas linhas alvojunto com o plasmídio PHP5096 (Ubi:Ubi-intron::FLPm::pinll). Tanto PHP20915 ou PHP20954 sãomisturado com o plasmídio contendo FLP (PHP5096), usando100 ng do plasmídios contendo FRT e 10 ng do plasmídio FLPpor bombardeamento.

Para preparar o DNA para distribuição, soluções de DNAsão adicionadas a 50 μΐ de uma solução de estoque departículas de ouro (0,1 μς/μΐ de partículas de ouro de 0,6mícron). Por exemplo, 10 μΐ de uma solução de PHP20915 ouPHP20954 a 0,1 μ9/μ1, e 10 μΐ de uma solução de PHP5096 a0.1 μς/μΐ são adicionados primeiro a 30 μΐ de água. Paraessa mistura de DNA, 50 μΐ da solução de estoque de ouro éadicionado e a mistura é brevemente sonicada. Em seguida,5 μΐ de TFX-50 (Promega Corp., 2800 Woods Hollow Road,Madison WI 53711) é adicionado e a mistura é colocada em umagitador de rotação a 100 rpm por 10 minutos. A mistura ébrevemente centrifugada para empelotar as partículas deoutro e remover o sobrenadante. Após a remoção do excessode solução de DNA/TFX, 120 μΐ de EtOH absoluto éadicionado, e 10 μΐ alíquotas são dispendidas nosmacrocarregadores tipicamente usados com a pistola departículas de hélio Dupont PDS-1000 Helium Particle Gun.As partículas de ouro com DNA aderido são deixadas secandonos carregadores e, então, essas são usadas parabombardeamento de partículas padrão. Após a distribuiçãode re-transformação do plasmídio tendo o cassete detransferência mais o plasmídio contendo FLP, os embriõesimaturos são colocados em meio 560P por duas semanas pararecuperar, e, então, movidos para meio contendo 3 mg/lbialaphos para seleção. A recombinação bem-sucedida emambos recombinação sítios alvo 5' (FRTl) e 3' (FRT87 ou 5)resultará na ativação de ambos gene bar e o gene deProteína Fluorescente Ciano, quando esses genes estruturaissão trazidos em proximidade funcional com os promotores deUbi ou Actina, respectivamente. Assim, os eventos corretosde integração sítio-específica serão selecionados baseadonos fenótipos recém ativados. Quando esses calos estãograndes o suficiente para amostragem, DNA genômico éextraído do tecido, e é analisado usando PCR para apresença de produtos que resultam de amplificação defragmentos usando primers que atravessam as junçõespromotor-gene recém formadas. Finalmente, amostrasfoliares são tiradas a partir de plantas regeneradas paraanálise Southern, para verificar a recombinação corretapara transferência do cassete doador no lócus genômicoalvo. Uma vez que Ioci recombinantes bem-sucedidos foramverificados, plantas são cultivadas até a maturidade ecruzadas ou autocruzadas.C. Introdução do cassete de transferência porcruzamento

Cassetes de transferência podem ser providos porcruzamento sexuado. Nesse exemplo, eventos transgênicosestáveis de cópia única de alvo são novamente usadoscontendo uma única cópia dos cassetes de T-DNAoriginalmente distribuídos de Agrobacterium contendoPHP207 05 ou PHP20807. Contudo, nesse método, eventosdoadores transgênicos estáveis são produzidos usandoqualquer dos dois vetores de T-DNA de Agrobacteriumapresentados abaixo.

1. 0 vetor doador que complementa PHP20705:

RB-Axigl::LEC1::pinII/Ubi Pro: Ubi-íntron::YFP::pinII/-LB eRB- In2::FLP::pinll- Termo CaMV35S/FRTl:bar::pinII/Ubi:Ubi-íntron: luciferase deRenilla:rpinll/ termo In2-1:Am-Cyanl:FRT87/ Termo CaMV35S -LB

2. 0 vetor doador que complementa PHP20807:

RB-Axigl::LECl::pinII/Ubi Pro: Ubi-íntron::YFP::pinII/-LB eRB-In2::FLP:rpinll- Termo CaMV35S /FRTl :bar::pinII/Ubi:Ubi-íntron: luciferase de Renilla::pinll/ termo In2-l:Am-Cyanl:FRT5/ Termo CaMV35S-LB

Para ambos plasmídios acima, os cassetes de expressãono primeiro T-DNA provêm meios de selecionar as linhastransgênicas doadores após transformação mediada porAgrobacterium. O segundo T-DNA provê os componentes paratroca de cassete mediada por cruzamento. Note que paraambos construtos, o cassete de expressão induzido por FLPestá for a dos sítios FRT e, assim, não é transferido parao sitio alvo com troca bem-sucedida.

Os eventos de recombinação tendo o cassete detransferência são selecionados por seleção visual paracrescimento vigoroso, calos amarelos fluorescentes,regenerados, cultivados até a maturidade e cruzados paraproduzir sementes doadoras tendo o cassete detransferência. Sementes de um evento alvo contendo ofragmento de T-DNA de PHP20705, assim como sementes de umevento"doador contendo o T-DNA de plasmídio doador #1 acimasão plantadas e cultivadas até a maturidade. Com aflorada, cruzamentos recíprocos são feitos entre as plantasalvo e doadoras. As sementes resultantes são plantadas erastreadas para fenótipos recém ativados que indicamrecombinação bem-sucedida nos dois sítios FRT dissimilares,nesse caso ativação de resistência a bialaphos indicativade recombinação correta em FRT.5 e ativação de fluorescênciaciano indicativa de recombinação correta em FRT87.Cruzamentos similares são feitos usando linhas alvo e detransferência geradas com PHP20807 e Plasmídio Doador #2,respectivamente.

Exexnplo 8. Transformação de Células BacterianasOs novos sítios de recombinação aqui providos podeser, também, avaliados e usados em células bacterianas,tais como E. coli. Várias linhas de células competentescomercialmente disponíveis e plasmídios bacterianos são bemconhecidas e prontamente disponíveis. Polinucleotídeosisolados para transformação e transformação de célulasbacterianas podem ser feitos por qualquer método conhecidona arte. Por exemplo, métodos de E. coli e outra célulabacteriana de transformação, preparação de plasmídio, e ouso de fagos são detalhados, por exemplo, em CurrentProtocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel et al. (eds.)(1994) a joint venture between Greene PublishingAssociates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc.). Porexemplo, um protocolo de. eletroporação eficiente (Tung &Chow, Current Protocols in Molecular Biologyr Supplement32, Fall 1995) é sumarizado abaixo.

Inocular IOOml de meio LB com 1 ml de cultura de E.coli de um dia para o outro. Incubar a 370C com agitamentovigoroso até que a cultura alcance ODôOO = 0,6. Chillcultura em gelo 30 min, células de pelotas porcentrifugação 4.000 χ g por 15 min a 4°C. Lavar as célulasde pelotas duas vezes com 50 ml de 10% glicerol frio comogelo. Após a lavagem final, ressuspender a pelota decélulas a um volume final de 0,2 ml em meio GYT frio comogelo (10% v/v glicerol; 0,125% w/v extrato de leveduras;0,25% w/v tritona). Eletroporar em cuvetes pré-resfriadousando as condições do fabricante, por exemplo 0,5 ng deDNA de plasmídio/transformação usando Gene Pulser (BioRad)ajustado a 25pF, 200 ohms, 2,5 kV. Imediatamente após aeletroporação, adicionar 1 ml de meio SOC e transferir ascélulas para um tubo de cultura. Incubar a 370C por 1 hr.Colocar as alíquotas em placas de células em placas de ágarseletivo e incubar de um dia para o outro a 37°C.

Exeaplo 9. Transformação de Leveduras

Os novos sítios de recombinação aqui providos podemser avaliados e usados em células de leveduras, das quais aFLP recombinase e sítios FRT foram inicialmente isoladas.Várias linhagens disponíveis comercialmente e/oupublicamente de S. cerevisiae estão disponíveis, assim comoestão os plasmídios usados para transformar essas células.Por exemplo, linhagens são disponibilizadas a partir daAmerican Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) einclui o inventário do Yeast Genet.ic Stock Center, que foipara à ATCC em 1998. Outras linhas de leveduras, tais comoS. :pombe e P. pastoris, e similares estão tambémdisponíveis. Por exemplo, métodos de transformação deleveduras, preparação de plasmídios, e similares sãodetalhados, por exemplo, em Current Protocols in MolecularBiology (F. M. Ausubel et al. (eds.) (1994) a joint venturebetween Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley &Sons, Inc., ver Unit 13 em particular). Métodos detransformação para leveduras incluem transformação poresferoplasto, eletroporação, e métodos de acetato de lítio.Um método de transformação versátil de alta eficiência paraleveduras é descrito por Gietz & Woods ((2002) MethodsEnzymol. 350:87-96) usando acetato de lítio', PEG 3500 e DNAcarregador.

Exemplo 10. Transformação de células de mamíferos

Os novos sítios de recombinação aqui providos podemser avaliados e usados em células de mamíferos, tais comoCHO, HeLa, BALB/c, fibroblastos, células troncos decamundongos embriônicos e similares. Várias linhas decélulas competentes comercialmente disponíveis e plasmídiossão bem conhecidas e prontamente disponíveis, por exemploda ATCC (Manassas, VA) . Polinucleotídeos isolados paratransformação e transformação de células de mamíferos podeser feita por qualquer método conhecido na arte. Porexemplo, métodos de transformação de células de mamíferos eoutras células eucariontes, preparação de plasmídios, e ouso de vírus estão detalhados, por exemplo, em CurrentProtocole in Molecular Biology (F. M. Ausubel et al. (eds.)(1994) a.· joint venture between Greene PublishingAssociates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., ver Unit 9 emparticular). Por exemplo, vários métodos estãodisponíveis, tais como transfecção por fosfato de cálcio,eletroporação, transfecção por DEAE-dextran, transfecçãomediada por lipossomo, microinjeção, assim como técnicas virais.Exemplo 11. Métodos para clonagem de recombinação invi tro

Nos exemplos A, B, e C abaixo, as duas moléculas deácido nucléico parentais (e.g., plasmidios) são chamadas de"inserção doadora" "vetor doador." A inserção doadoracontém um segmento que se ' tornará unido a uma novaseqüência contribuída pelo vetor doador. 0 evento derecombinação produz duas moléculas filhas: o primeiroreferido como o produto (o novo clone desejado) e o segundoreferido como o subproduto.

Nos exemplos abaixo, dois pares de plasmidios sãoconstruídos para realizar o método de clonagem derecombinação in vitro em duas vias diferentes. Um parplasmidios, Plasmídio A e plasmídio B, são construídos comum sítio FRT e um sítio lox, a ser usado com Cre e FLPrecombinase. O outro par de plasmidios, Plasmídio D ePlasmídio E, são conistruídos para conter o sito FRT (tiposelvagem) para FLP, e um segundo sítio FRT mutante (SEQ IDNO:40), que difere do sítio FRT de tipo selvagem em 3 de 30bases no total. Nesse exemplo, cada plasmídio compreendeum grupo de sítios de recombinação funcionaiscaracterizados pelo fato de que os sítios de recombinaçãosão dissimilares e não recombinogênicos com respeito um aooutro.Tampões:

Vários tampões conhecidos podem ser usados nasreações. Para enzimas de restrição, é recomendável usar ostampões recomendados pelo fabricante. Tampões alternativospodem ser prontamente encontrados na literatura ou podemser arquitetados por aqueles de conhecimento ordinário naarte. Um tampão exemplar para lambda integrase compreende50 mM Tris-HCl, a pH 7,5-7,8, 70 mM KCl, 5 mM espermidina,0,5 mM EDTA, e 0,25 mg/ml albumina de soro bovino, eopcionalmente, 10% glicerol. Um tampão exemplar para PlCre recombinase compreende 50 mM Tris-HCl a pH 7,5, 33 mMNaCl, 5 mM espermidina, e 0,5 mg/ml albumina de soro bovinoe um tampão exemplar para FLP é discutido acima no Exemplo2. Um tampão exemplar para Cre e FLP recombinasescompreende 50 mM Tris-HCL a pH 7,5, 70 mM NaCl, 2mM MgCl2,e 0,1 mg/ml BSA, (Buchholz et al. (1996) Nucleic Acids Res.24:4256-4262). O tampão para outras recombinases sitioespecificas é tanto conhecido na arte ou pode serdeterminado empiricamente pelos especialistas,particularmente à luz dos tampões acima descritos.

A. Clonagem de Recombinação Usando FLP recombinase

Dois plasmídios são construídos. O plasmídio doador(plasmídio A) compreende na seguinte ordem: um sítio FRTde tipo selvagem, uma marcador constitutivo tipo droga(resistência a cloramfenicol), uma origem de replicação, umgene constitutivamente expressado para a proteína tetrepressora (tetR), um sítio FRT 5, e um marcadorcondicional tipo droga (resistência a canamicina, cujaexpressão é controlada pelo operador/promotor do operon deresistência a tetraciclina de transposon TnlO). Células deE. coli contendo plasmidio A são resistentes acloramfenicol a 30 ng/ml, mas sensiveis a canamicina a 100p.g/ml.

O plasmidio doador de inserção (plasmidio B)compreende na seguinte ordem: o sitio FRT de tiposelvagem, uma marcador diferente tipo droga (resistência aampicilina) , o sitio FRT 5, uma origem, e um sitio declonagem múltipla.

Cerca de 75 ng de cada plasmidio AeB são misturadasem um volume total de 30 y.1 de tampão de reação FLP. Duasaliquotas de 10 ^il são transferidas para novos tubos. Umtubo recebe proteina FLP. Ambos tubos são incubados a 37°C por 30 minutos, então 70° C por 10 minutos. Aliquotas decada reação são diluidas e transformadas em DH5ct. Após aexpressão, aliquotas são colocadas em placas em 30 (ag/mlcloramfenicol; 100 ^ig/ml ampicilina mais 200 jig/mlmeticilina; ou 100 ^ig/ml canamicina.

Colônias que são resistentes a cloramfenicol,resistentes a ampicilina, e sensiveis a canamicina passarampela reação de recombinação e compreendem o vetor produtorecém gerado (plasmidio C) . O plasmidio C compreende naseguinte ordem: o sitio FRT de tipo selvagem, o marcadorconstitutivo tipo droga (resistência a cloramfenicol), aorigem de replicação, o gene constitutivamente expressadopara a proteína tet repressora (tetR) , o sitio FRT 5, e omarcador de resistência a ampicilina.

Para confirmar a estrutura do vetor produto (plasmidioC) , colônias que são resistentes a cloramfenicol,resistentes a ampicilina, e sensíveis a canamicina sãoescolhidas e inoculadas em meio contendo 100 ^ig/mlcanamicina. Minipreparados são realizados e os DNAsminipreparados são cortados com as enzimas de restriçãoapropriadas e eletroforisados. 0 plasmidio C pode seridentificado baseado no tamanho previsto para o plasmidioproduto e os fragmentos resultantes da digestão por enzimade restrição.

B. Clonagem de Recombinação Usando FLP recombinase eCre Recombinase

Os plasmidios desse método são análogos àqueles acima,exceto o Plasmidio D, o plasmidio vetor doador, contém umsitio IoxP no lugar do sitio FRT de tipo, e o Plasmidio E,o plasmidio doador de inserção, contém o sitio IoxP nolugar do sitio FRT de tipo selvagem.

Cerca de 500 ng de Plasmidio E e Plasmidio D sãoprecipitados por etanol e ressuspendidos em 40 \il de tampãoCre/FLP tampão de reação (descrito acima). As reações sãoincubadas a 37° C por 30 minutos e, então, a 70° C por 10minutos. Tampão TE (90 \xl; TE: 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1mM EDTA') é adicionado a cada reação, e 1 [il cada étransformado em E. coli DH5a. As misturas de transformaçãosão colocadas em placas em 100 ^ig/ml ampicilina mais 200jig/ml meticilina; 30 jxg/ml cloramf enicol; ou 100 ng/mlcanamicina.

As colônias que são resistentes a cloramfenicol,resistentes a ampicilina, e sensiveis a canamicina passarampela reação de recombinação e compreendem o vetor produtorecém gerado (plasmidio F) . O Plasmidio F compreende naseguinte ordem: o sitio IoxP de tipo selvagem, o marcadorconstitutivo tipo droga (resistência a cloramfenicol) , aorigem de replicação, o gene constitutivamente expressadopara a proteina tet repressora (tetR) , o sitio FRT 5, e omarcador de resistência a ampicilina.

Para confirmar a estrutura do.vetor produto (plasmidioF), as colônias que são resistentes a cloramfenicol,resistentes a ampicilina, e sensiveis a canamicina sãoescolhidas e inoculadas em meio contendo 100 ^ig/mlcanamicina. Minipreparados são realizados e DNAsminipreparados são cortados com as enzimas de restriçãoapropriadas e eletroforisados. 0 Plasmidio F pode seridentificado baseado no tamanho previsto para o plasmidioproduto e os fragmentos resultantes da digestão por enzimadé restrição.C. Clonagem de Recombinação In vitro para Subclonaro Gene de Cloramfenicol Acetil Transferase em um Vetor paraExpressão em Células Eueariontes

Um plasmidio doador de inserção, Plasmidio G, éconstruído, compreendendo na seguinte ordem: um sitio FRTde tipo selvagem, um gene de cloramfenicol acetil de E.coli sem um promotor, o sitio FRT 5, uma origem dereplicação, e um marcador constitutivo tipo droga(resistência a ampicilina).

Um plasmidio vetor doador, Plasmidio H, é construúdo,e compreende na seguinte ordem: gene de resistência acanamicina, origem de replicação, o promotor decitomegalovirus eucarionte, um sitio FRT de tipo selvagem,o gene constitutivamente expressado para a proteina tetrepressora (tetR), um gene de resistência a cloramfenicol,e o sitio FRT 5. Aliquotas de um microlitro de cadaplasmidio, tipicamente cerca de 50 ng de DNA minipreparadocru, são combinadas em uma reação de lOjnl contendo umtampão de reação FLP e FLP recombinase. Após a incubação a30° C por 30 minutos e 75° C por 10 minutos, um microlitroé transformado em linhagem DH5a de E. coli competente (LifeTechnologies, Inc.)- Aliquotas de transformações sãoespalhadas em placas de ágar contendo 200 }ig/ml canamicinae incubadas a 37° C de um dia para o outro. Um reaçãocontrole idêntica de outra forma contém o plasmidio vetordoador apenas.Para confirmar a estrutura do vetor produto (plasmidioI) , minipreparados são realizados e os DNAs minipreparadossão cortados com as enzimas de restrição apropriadas eeletroforisados. 0 Plasmidio I pode ser identificadobaseado no tamanho previsto para plasmidio produto e osfragmentes resultantes da digestão por enzima de restriçãopara confirmar a cloramfenicol acetil transferase sãoclonados abaixo do promotor CMV.

Todas publicações e aplicações de patentes mencionadasna especificação são indicativas do nivel daquelesespecialistas na arte a qual a invenção pertence. Todaspublicações e aplicações de patentes são aqui incorporadaspor referência na mesma extensão como se cada publicação eaplicação de patentes individual fossem especificamente eindividualmente indicadas a serem incorporadas porreferência.

Apesar da invenção precedente ser descrita em algumdetalhe por meio de ilustração e exemplo para propósitos declaridade de entendimento, será óbvio que certas mudanças emodificações podem ser praticadas no escopo dasreivindicações no apêndice.

Os artigos "um" e "uma" são aqui usados para referir-se a um ou mais de um (i.e., a pelo menos um) do objetogramatical do artigo. Por meio de exemplo, "um elemento"significa um ou mais de um elemento.LISTAGEM DE SEQÜÊNCIAS

<110> Requerente: Pioneer Hi-Bred International, Inc.

<120> Titulo: POLINUCLEOTÍDEO ISOLADO, MÉTODO PARA OBTENÇÃO DE UMACÉLULA TRANSFORMADA, MÉTODO PARA OBTENÇÃO DE UMA PLANTA TRANSFORMADA,MÉTODO DE PRODUÇÃO DE RECOMBINAÇÃO DE DNA DE SÍTIO ESPECÍFICO,BIBLIOTECA ISOLADA, MÉTODO DE GERAÇÃO DE BIBLIOTECA DE MOLÉCULAS EMÉTODO PARA SELECIONAR SÍTIO DE RECOMBINAÇÃO FRT MODIFICADO

Referência do documento: 1525-PCT

Documento de prioridade: US 60/700.225Data de depósito: 18-07-2005

Quantidade de SEQ ID NOs.: 74

Software: FastSEQ for Windows Version 4.0

SEQ ID NO.: 1

Comprimento: Comprimento: 8Tipo: DNA

Organismo: Seqüência artificialCaracterísticas:

Outras informações: Nova seqüência de espaçamento FRT do sitioFRT 12

<400> Seqüência: 1

tctatgta 8

<210> SEQ ID NO.: 2<211> Comprimento: 8<212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência artificial

<220> Características:

<223> Outras informações: Nova seqüência de espaçamento FRT do sitioFRT 57

<400> Seqüência: 2

ttttctaa 8

<210> SEQ ID NO.: 3<211> Comprimento: 8<212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência artificial

<220> Características:

<223> Outras informações: Nova seqüência de espaçamento FRT do sitioFRT 85

<400> Seqüência: 3tttcttga 8

<210> SEQ ID' NO. : 4<211> Comprimento: 8<212> Tipo: DNA<213> Organismo: Seqüência artificial

<130>

<150><151>

<160>

<170>

<210><211><212><213>

<220><223><223> Outras informações: Nova seqüência de espaçamento FRT do sitioFRT 87

<400> Seqüência: 4tttctgga 8

<210> SEQ ID NO.: 5<211> Comprimento: 8<212> Tipo: DNA<213> Organismo: Seqüência artificial

<220> Características:

<223> Outras informações: Nova seqüência de espaçamento FRT do sitioFRT 53

<400> Seqüência: 5tgtaaaaa

<210> SEQ ID NO.: 6

<211> Comprimento: 8

<212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência artificial

<220> Características:<223> Outras informações: Nova seqüência de espaçamento FRT do sítioFRT 62

<400> Seqüência: 6

tttaggta 8

<210> SEQ ID NO.: 7

<211> Comprimento: 8

<212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência artificial

<220> Características:

<223> Outras informações: Nova seqüência de espaçamento FRT do sítioFRT 78

<400> Seqüência: 7

tgaaaaga 8

<210> SEQ ID NO.: 8

<211> Comprimento: 8

<212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência artificial

<220> Características:

<223> Outras informações: Nova seqüência de espaçamento FRT do sítioFRT 34

<400> Seqüência: 8

tgtaatga 8

<210> SEQ ID NO.: 9<211> Comprimento: 8<212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência artificial<220> Características:<223> Outras informações: Nova seqüência de espaçamento FRT do sitioFRT 7 0

<400> Seqüência: 9tatacaaa 8

<210> SEQ ID NO.: 10<211> Comprimento: 8<212> Tipo: DNA<213> Organismo: Seqüência artificial

<220> Características:

<223> Outras informações: Nova seqüência de espaçamento FRT do sitioFRT 76

<400> Seqüência: 10ttccataa

<210> SEQ ID NO.: 11

<211> Comprimento: 8

<212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência artificial

<220> Características:

<223> Outras informações: Nova seqüência de espaçamento FRT do sitioFRT 89

<400> Seqüência: 11

tctctaga 8

<210> SEQ ID NO.: 12<211> Comprimento: 8<212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência artificial<220> Características:

<223> Outras informações: Nova seqüência de espaçamento FRT do sitioFRT 43

<400> Seqüência: 12

ttccgaga 8

<210> SEQ ID NO.: 13

<211> Comprimento: 8<212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência artificial

<220> Características:

<223> Outras informações: Nova seqüência de espaçamento FRT do sitioFRT 4 5

<400> Seqüência: 13

tctcttga 8

<210> SEQ ID NO.: 14<211> Comprimento: 8<212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência artificial<220> Características:<223> Outras informações: Nova seqüência de espaçamento FRT do sitioFRT 55

<400> Seqüência: 14tccacaga 8

<210> SEQ ID NO.: 15<211> Comprimento: 8<212> Tipo: DNA<213> Organismo: Seqüência artificial

<220> Características:

<223> Outras informações: Nova seqüência de espaçamento FRT do sitioFRT 65

<400> Seqüência: 15tgattgga

<210> SEQ ID NO.: 16

<211> Comprimento: 8

<212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência artificial

<220> Características:

<223> Outras informações: Nova seqüência de espaçamento FRT do sitioFRT 69

<400> Seqüência: 16

ttttgtga 8

<210> SEQ ID NO.: 17<211> Comprimento: 8<212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência artificial<220> Características:

<223> Outras informações: Nova seqüência de espaçamento FRT do sitioFRT 7 4

<400> Seqüência: 17

tgagagaa 8

<210> SEQ ID NO.: 18

<211> Comprimento: 8

<212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência artificial

<220> Características:

<223> Outras informações: Nova seqüência de espaçamento FRT do sitioFRT 8 6

<400> Seqüência: 18

tttctcga 8

<210> SEQ ID NO.: 19<211> Comprimento: 11<212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência artificial<220> Características:<223> Outras informações: Sítio de ligação FLP 5' (elemento desimetria) do sítio FRT do tipo selvagem

<400> Seqüência: 19agttcctata c 11

<210> SEQ ID NO.: 20<211> Comprimento: 11<212> Tipo: DNA<213> Organismo: Seqüência artificial

<220> Características:

<223> Outras informações: Sítio de ligação FLP 3' (elemento desimetria) do sítio FRT do tipo selvagem

<400> Seqüência: 20

gaataggaac t 11

<210> SEQ ID NO.: 21

<211> Comprimento: 30

<212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência artificial

<220> Características:<223> Outras informações: Novo sítio FRT 12 mínimo

<400> Seqüência: 21

agttcctata ctctatgtag aataggaact 30

<210> SEQ ID NO.: 22

<211> Comprimento: 30

<212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência artificial

<220> Características:

<223> Outras informações: Novo sítio FRT 57 mínimo

<400> Seqüência: 22

agttcctata cttttctaag aataggaact 30

<210> SEQ ID NO.: 23<211> Comprimento: 30<212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência artificial

<220> Características:

<223> Outras informações: Novo sítio FRT 85 mínimo

<400> Seqüência: 23agttcctata ctttcttgag aataggaact 30

<210> SEQ ID NO.: 24<211> Comprimento: 30<212> Tipo: DNA<213> Organismo: Seqüência artificial

<220> Características:

<223> Outras informações: Novo sítio FRT 87 mínimo

<400> Seqüência: 24

agttcctata ctttctggag aataggaact 30<210> SEQ ID NO.: 25<211> Comprimento: 30<212> Tipo: DNA<213> Organismo: Seqüência artificial

<220> Características:

<223> Outras informações: Novo sítio FRT 53 mínimo

<400> Seqüência: 25

agttcctata ctgtaaaaag aataggaact 30

<210> SEQ ID NO.: 26<211> Comprimento: 30<212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência artificial

<220> Características:

<223> Outras informações: Novo sítio FRT 62 mínimo<400> Seqüência: 26

agttcctata ctttaggtag aataggaact 30

<210> SEQ ID NO.: 27

<211> Comprimento: 30

<212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência artificial

<220> Características:<223> Outras informações: Novo sítio FRT 78 mínimo

<400> Seqüência: 27

agttcctata ctgaaaagag aataggaact 30

<210> SEQ ID NO.: 28

<211> Comprimento: 30

<212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência artificial

<220> Características:

<223> Outras informações: Novo sítio FRT 34 mínimo

<400> Seqüência: 28

agttcctata ctgtaatgag aataggaact 30

<210> SEQ ID NO.: 29<211> Comprimento: 30<212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência artificial<220> Características:

<223> Outras informações: Novo sítio FRT 70 mínimo

<400> Seqüência: 29agttcctata ctatacaaag aataggaact 30

<210> SEQ ID NO.: 30

<211> Comprimento: 30

<212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência artificial<220> Características:

<223> Outras informações: Novo sítio FRT 7 6 mínimo

<400> Seqüência: 30agttcctata cttccataag aataggaact 30

<210> SEQ ID NO.: 31<211> Comprimento: 30<212> Tipo: DNA<213> Organismo: Seqüência artificial

<220> Características:

<223> Outras informações: Novo sítio FRT 89 mínimo

<400> Seqüência: 31

agttcctata ctctctagag aataggaact 30

<210> SEQ ID NO.: 32

<211> Comprimento: 30

<212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência artificial

<220> Características:

<223> Outras informações: Novo sítio FRT 43 mínimo<400> Seqüência: 32

agttcctata cttccgagag aataggaact 30

<210> SEQ ID NO.: 33<211> Comprimento: 30<212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência artificial

<220> Características:<223> Outras informações: Novo sítio FRT 45 mínimo

<400> Seqüência: 33

agttcctata ctctcttgag aataggaact 30

<210> SEQ ID NO.: 34<211> Comprimento: 30<212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência artificial

<220> Características:

<223> Outras informações: Novo sítio FRT 55 mínimo

<400> Seqüência: 34

agttcctata ctccacagag aataggaact 30

<210> SEQ ID NO.: 35<211> Comprimento: 30<212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência artificial<220> Características:

<223> Outras informações: Novo sítio FRT 65 mínimo

<400> Seqüência: 35agttcctata ctgattggag aataggaact 30<210> SEQ ID NO.: 36<211> Comprimento: 30<212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência artificial

<220> Caracteristicas:

<223> Outras informações: Novo sitio FRT 69 minimo

<400> Seqüência: 36agttcctata cttttgtgag aataggaact 30

<210> SEQ ID NO.: 37<211> Comprimento: 30<212> Tipo: DNA<213> Organismo: Seqüência artificial

<220> Caracteristicas:

<223> Outras informações: Novo sitio FRT 74 minimo

<400> Seqüência: 37

agttcctata ctgagagaag aataggaact 30

<210> SEQ ID NO.: 38<211> Comprimento: 30<212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência artificial

<220> Características:

<223> Outras informações: Novo sitio FRT 86 minimo<400> Seqüência: 38

agttcctata ctttctcgag aataggaact 30

<210> SEQ ID NO.: 39

<211> Comprimento: 30

<212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência artificial

<220> Características:

<223> Outras informações: Sitio FRT do tipo selvagem minimo

<400> Seqüência: 39

agttcctata ctttctagag aataggaact 30

<210> SEQ ID NO.: 40

<211> Comprimento: 30

<212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência artificial

<220> Características:

<223> Outras informações: Sítio FRT5 mutante mínimo

<400> Seqüência: 40

agttcctata ctcttttgag aataggaact 30

<210> SEQ ID NO.: 41<211> Comprimento: 30<212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência artificial<220> Características:9/24

<223> Outras informações: Sítio FRT6 mutante mínimo<400> Seqüência: 41

agttcctata ctttttgaag aataggaact 30

<210> SEQ ID NO.: 42<211> Comprimento: 30<212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência artificial<220> Características:

<223> Outras informações: Sítio FRT7 mutante mínimo

<400> Seqüência: 42agttcctata cttattgaag aataggaact 30

<210> SEQ ID NO.: 43

<211> Comprimento: 8

<212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência artificial

<220> Características:

<zzu> características:

<223> Outras informações: Seqüência de espaçamento do sítio derecombinação FRT do tipo selvagem

<400> Seqüência: 43tttctaga

<210> SEQ ID NO.: 44

<211> Comprimento: 8

<212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência artificial

<220> Características:

<223> Outras informações: Seqüência de espaçamento do sítio derecombinação FRT5

<400> Seqüência: 44

cttttgaa 8

<210> SEQ ID NO.: 45<211> Comprimento: 1032<212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Bacteriófago Cl

<220> Características:

<221> Nome/chave: Nome/chave: CDS

<222> Localização: (1)...(1016)

<400> Seqüência: 45

atg tcc aat tta ctg acc gta cac caa aat ttg cct gca tta ccg gtc 48Met Ser Asn Leu Leu Thr Val His Gln Asn Leu Pro Ala Leu Pro Val1 5 10 15

55 gat gca acg agt gat gag gtt cgc aag aac ctg atg gac atg ttc agg 96Asp Ala Thr Ser Asp Glu Val Arg Lys Asn Leu Met Asp Met Phe Arg20 25 30

gat cgc cag gcg ttt tct gag cat acc tgg aaa atg ctt ctg tcc gtt 14460 Asp Arg Gln Ala Phe Ser Glu His Thr Trp Lys Met Leu Leu Ser Val35 40 45tgc cgg tcg tgg gcg gca tgg tgc aag ttg aat aac cgg aaa tgg ttt 192

Cys Arg Ser Trp Ala Ala Trp Cys Lys Leu Asn Asn Arg Lys Trp Phe50 55 60

ccc gca gaa cct gaa gat gtt cgc gat tat ctt cta tat ctt cag gcg 240

Pro Ala Glu Pro Glu Asp Val Arg Asp Tyr Leu Leu Tyr Leu Gln Ala65 70 75 80

cgc ggt ctg gca gta aaa act ate cag caa cat ttg ggc cag cta aac 288Arg Gly Leu Ala Val Lys Thr Ile Gln Gln His Leu Gly Gln Leu Asn85 90 95

atg ctt cat cgt cgg tcc ggg ctg cca cga cca agt gac age aat gct 336Met Leu His Arg Arg Ser Gly Leu Pro Arg Pro Ser Asp Ser Asn Ala100 105 110

gtt tca ctg gtt atg cgg cgg ate cga aaa gaa aac gtt gat gcc ggt 384Val Ser Leu Val Met Arg Arg Ile Arg Lys Glu Asn Val Asp Ala Gly115 120 125

gaa cgt gca aaa cag gct cta gcg ttc gaa cgc act gat ttc gac cag 432Glu Arg Ala Lys Gln Ala Leu Ala Phe Glu Arg Thr Asp Phe Asp Gln130 135 140

gtt cgt tca ctc atg gaa aat age gat cgc tgc cag gat ata cgt aat 480

Val Arg Ser Leu Met Glu Asn Ser Asp Arg Cys Gln Asp Ile Arg Asn145 150 155 160

ctg gca ttt ctg ggg att gct tat aac acc ctg tta cgt ata gcc gaa 528Leu Ala Phe Leu Gly Ile Ala Tyr Asn Thr Leu Leu Arg Ile Ala Glu165 170 175

att gcc agg ate agg gtt aaa gat ate tca cgt act gac ggt ggg aga 57635 Ile Ala Arg Ile Arg Val Lys Asp Ile Ser Arg Thr Asp Gly Gly Arg180 185 190

atg tta ate cat att ggc aga acg aaa acg ctg gtt age acc gca ggt 624Met Leu Ile His Ile Gly Arg Thr Lys Thr Leu Val Ser Thr Ala Gly195 200 205

gta gag aag gca ctt age ctg ggg gta act aaa ctg gtc gag cga tgg 672Val Glu Lys Ala Leu Ser Leu Gly Val Thr Lys Leu Val Glu Arg Trp210 215 220

att tcc gtc tet ggt gta gct gat gat ccg aat aac tac ctg ttt tgc 720Ile Ser Val Ser Gly Val Ala Asp Asp Pro Asn Asn Tyr Leu Phe Cys225 230 235 240

cgg gtc aga aaa aat ggt gtt gcc gcg cca tet gcc acc age cag cta 768Arg Val Arg Lys Asn Gly Val Ala Ala Pro Ser Ala Thr Ser Gln Leu245 250 255

tca act cgc gcc ctg gaa ggg att ttt gaa gca act cat cga ttg att 81655 Ser Thr Arg Ala Leu Glu Gly Ile Phe Glu Ala Thr His Arg Leu Ile260 265 270

tac ggc gct aag gat gac tet ggt cag aga tac ctg gcc tgg tet gga 864Tyr Gly Ala Lys Asp Asp Ser Gly Gln Arg Tyr Leu Ala Trp Ser Gly275 280 285cac agt gcc cgt gtc gga gcc gcg cga gat atg gcc cgc gct gga gtt 912

His Ser Ala Arg Val Gly Ala Ala Arg- Asp Met Ala Arg Ala Gly Val

290 295 300

tca ata ccg gag ate atg caa gct ggt ggc tgg acc aat gta aat att 960

Ser Ile Pro Glu Ile Met Gln Ala Gly Gly Trp Thr Asn Val Asn Ile

305 310 315 320

gtc atg aac tat ate cgt aac ctg gat agt gaa aca ggg gea atg gtg 1008

Val Met Asn Tyr Ile Arg Asn Leu Asp Ser Glu Thr Gly Ala Met Val

325 330 335

cgc ctg et ggaagatggc gattag 1032

Arg Leu

<210> SEQ ID NO.: 46<211> Comprimento: 338<212> Tipo: PRT

<213> Organismo: Bacteriófago Cl

<400> Seqüência: 46

Met Ser Asn Leu Leu Thr Val His Gln Asn Leu Pro Ala Leu Pro Val

1 5 10 15

Asp Ala Thr Ser Asp Glu Val Arg Lys Asn Leu Met Asp Met Phe Arg25 20 25 30

Asp Arg Gln Ala Phe Ser Glu His Thr Trp Lys Met Leu Leu Ser Val

35 40 45

Cys Arg Ser Trp Ala Ala Trp Cys Lys Leu Asn Asn Arg Lys Trp Phe50 55 60

30 Pro Ala Glu Pro Glu Asp Val Arg Asp Tyr Leu Leu Tyr Leu Gln Ala65 70 75 80

Arg Gly Leu Ala Val Lys Thr Ile Gln Gln His Leu Gly Gln Leu Asn

85 90 95

Met Leu His Arg Arg Ser Gly Leu Pro Arg Pro Ser Asp Ser Asn Ala35 100 105 110

Val Ser Leu Val Met Arg Arg Ile Arg Lys Glu Asn Val Asp Ala Gly

115 120 125

Glu Arg Ala Lys Gln Ala Leu Ala Phe Glu Arg Thr Asp Phe Asp Gln130 135 140

40 Val Arg Ser Leu Met Glu Asn Ser Asp Arg Cys Gln Asp Ile Arg Asn145 150 155 160

Leu Ala Phe Leu Gly Ile Ala Tyr Asn Thr Leu Leu Arg Ile Ala Glu

165 170 175

Ile Ala Arg Ile Arg Val Lys Asp Ile Ser Arg Thr Asp Gly Gly Arg45 180 185 190

Met Leu Ile His Ile Gly Arg Thr Lys Thr Leu Val Ser Thr Ala Gly

195 200 205

Val Glu Lys Ala Leu Ser Leu Gly Val Thr Lys Leu Val Glu Arg Trp210 215 220

50 Ile Ser Val Ser Gly Val Ala Asp Asp Pro Asn Asn Tyr Leu Phe Cys225 230 235 240

Arg Val Arg Lys Asn Gly Val Ala Ala Pro Ser Ala Thr Ser Gln Leu

245 250 255

Ser Thr Arg Ala Leu Glu Gly Ile Phe Glu Ala Thr His Arg Leu Ile55 260 265 270

Tyr Gly Ala Lys Asp Asp Ser Gly Gln Arg Tyr Leu Ala Trp Ser Gly

275 280 285

His Ser Ala Arg Val Gly Ala Ala Arg Asp Met Ala Arg Ala Gly Val290 295 300

60 Ser Ile Pro Glu Ile Met Gln Ala Gly Gly Trp Thr Asn Val Asn Ile305 310 315 320Val Met Asn Tyr Ile Arg Asn Leu Asp Ser Glu Thr Gly Ala Met Val325 330 335

Arg Leu

<210> SEQ ID NO.: 47<211> Comprimento: 1032<212> Tipo: DNA<213> Organismo: Seqüência artificial

<220> Características:

<223> Outras informações: Seqüência de nucleotideo codificando proteínaCre a partir de Bacteriófago Pl tendo códons preferencialmente de milho(moCRE)

<221> Nome/chave: CDS<222> Localização: (1)

(1032)

<400> Seqüência: 47

atg tcc aac ctg ctc acg gtt cac cag aac ctt ccg gct ctt cca gtg

Met Ser Asn Leu Leu Thr Val His Gln Asn Leu Pro Ala Leu Pro Val1 5 10 15

gac gcg acg tcc gat gaa gtc agg aag aac ctc atg gac atg ttc cgcAsp Ala Thr Ser Asp Glu Val Arg Lys Asn Leu Met Asp Met Phe Arg20 25 30

96

gac agg caa gcg ttc age gag cac acc tgg aag atg ctg ctc tcc gtcAsp Arg Gln Ala Phe Ser Glu His Thr Trp Lys Met Leu Leu Ser Val35 40 45

144

tgc cgc tcc tgg gct gea tgg tgc aag ctg aac aac agg aag tgg ttcCys Arg Ser Trp Ala Ala Trp Cys Lys Leu Asn Asn Arg Lys Trp Phe50 55 60

192

ccc gct gag ccc gag gac gtg agg gat tac ctt ctg tac ctg caa gct 240

Pro Ala Glu Pro Glu Asp Val Arg Asp Tyr Leu Leu Tyr Leu Gln Ala

65 70 75 80

cgc ggg ctg gea gtg aag acc ate cag caa cac ctt gga caa ctg aac 288

Arg Gly Leu Ala Val Lys Thr Ile Gln Gln His Leu Gly Gln Leu Asn

85 90 95

atg ctt cac agg cgc tcc ggc ctc ccg cgc ccc age gac tcg aac gccMet Leu His Arg Arg Ser Gly Leu Pro Arg Pro Ser Asp Ser Asn Ala100 105 110

336

gtg age ctc gtc atg cgc cgc ate agg aag gaa aac gtc gat gcc ggcVal Ser Leu Val Met Arg Arg Ile Arg Lys Glu Asn Val Asp Ala Gly115 120 125

384

gaa agg gea aag cag gcc ctc gcg ttc gag agg acc gat ttc gac cagGlu Arg Ala Lys Gln Ala Leu Ala Phe Glu Arg Thr Asp Phe Asp Gln130 135 140

432

gtc cgc age ctg atg gag aac age gac agg tgc cag gac att agg aac 480

Val Arg Ser Leu Met Glu Asn Ser Asp Arg Cys Gln Asp Ile Arg Asn145 150 155 160

ctg gcg ttc ctc gga att gea tac aac acg ctc ctc agg ate gcg gaa 528Leu Ala Phe Leu Gly Ile Ala Tyr Asn Thr Leu Leu Arg Ile Ala Glu165 170 175

att gcc cgc att cgc gtg aag gac att age cgc acc gac ggc ggc aggIle Ala Arg Ile Arg Val Lys Asp Ile Ser Arg Thr Asp Gly Gly Arg180 185 190 576

atg ctt ate cac att ggc agg acc aag acg ctc gtt tcc acc gea ggcMet Leu Ile His Ile Gly Arg Thr Lys Thr Leu Val Ser Thr Ala Gly195 200 205 624

gtc gaa aag gcc ctc age ctc gga gtg acc aag ctc gtc gaa cgc tgg 672Val Glu Lys Ala Leu Ser Leu Gly Val Thr Lys Leu Val Glu Arg Trp210 215 220

ate tcc gtg tcc ggc gtc gcg gac gac cca aac aac tac ctc ttc tgc 720Ile Ser Val Ser Gly Val Ala Asp Asp Pro Asn Asn Tyr Leu Phe Cys225 230 235 240

cgc gtc cgc aag aac ggg gtg gct gcc cct age gcc acc age caa ctcArg Val Arg Lys Asn Gly Val Ala Ala Pro Ser Ala Thr Ser Gln Leu245 250 255 768

age acg agg gcc ttg gaa ggt att ttc gag gcc acc cac cgc ctg ateSer Thr Arg Ala Leu Glu Gly Ile Phe Glu Ala Thr His Arg Leu Ile260 265 270 816

tac ggc gcg aag gat gac age ggt caa cgc tac ctc gea tgg tcc gggTyr Gly Ala Lys Asp Asp Ser Gly Gln Arg Tyr Leu Ala Trp Ser Gly275 280 285 864

cac tcc gcc cgc gtt gga gct gct agg gac atg gcc cgc gcc ggt gtt 912His Ser Ala Arg Val Gly Ala Ala Arg Asp Met Ala Arg Ala Gly Val290 295 300

tcc ate ccc gaa ate atg cag gcg ggt gga tgg acg aac gtg aac att 960Ser Ile Pro Glu Ile Met Gln Ala Gly Gly Trp Thr Asn Val Asn Ile305 310 315 320

gtc atg aac tac att cgc aac ctt gac age gag acg ggc gea atg gttVal Met Asn Tyr Ile Arg Asn Leu Asp Ser Glu Thr Gly Ala Met Val325 330 335 1008

cgc ctc ctg gaa gat ggt gac tgaArg Leu Leu Glu Asp Gly Asp *340

1032

<210> SEQ ID NO.: 48

<211> Comprimento: 1260

<212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Saccharomyces cerevisiae

<220> Características:

<221> Nome/chave: CDS

<222> Localização: (1)...(1260)

<400> Seqüência: 48

atg cca caa ttt ggt ata tta tgt aaa aca cca cct aag gtg ctt gtt

Met Pro Gln Phe Gly Ile Leu Cys Lys Thr Pro Pro Lys Val Leu Val

1 5 10 15 48cgt cagArg Gln

tta tgtLeu Cys

gga acaGly Thr50

age aatSer Asn65

tac aagTyr Lys

att cctIle Pro

25 caa tetGln Ser

tca tcgSer Ser130

aaa geaLys Ala145

ata cta

Ile Leu

tta tac

Leu Tyr

age gatSer Asp

aag tatLys Tyr

210

age gttSer Val225

cca ctt

Pro Leu

aaa cga

ttt gtg gaaPhe Val Glu20

gct gct gaaAla Ala Glu35

gea ate aagAla Ile Lys

tcg ctg agtSer Leu Ser

acg caa aaaThr Gln Lys85

gct tgg gaaAla Trp Glu100

gat ate actAsp Ile Thr115

gaa gaa geaGlu Glu Ala

ctt cta agtLeu Leu Ser

aat tcg tttAsn Ser Phe165

caa ttc etcGln Phe Leu180

att aag aacIle Lys Asn195

ctg gga gtaLeu Gly Val

agt agg cacSer Arg His

gta tat ttgVal Tyr Leu245

gta aat agg

agg ttt gaaArg Phe Glu

cta acc tatLeu Thr Tyr40

aga gcc acaArg Ala Thr55

ttc gat attPhe Asp Ile70

gea aca attAla Thr Ile

ttt aca attPhe Thr Ile

gat att gtaAsp Ile Val120

gat aag ggaAsp Lys Gly135

gag ggt gaaGlu Gly Glu150

gag tat actGlu Tyr Thr

ttc cta gctPhe Leu Ala

gtt gat ccgVal Asp Pro200

ata ate cagIle Ile Gln215

ata tac ttcIle Tyr Phe230

gat gaa tttAsp Glu Phe

acc ggc aat

aga cct tcaArg Pro Ser25

tta tgt tggLeu Cys Trp

ttc atg agePhe Met Ser

gtc aat aaaVal Asn Lys75

ctg gaa gccLeu Glu Ala90

att cct tacIle Pro Tyr105

agt agt ttgSer Ser Leu

aat age cacAsn Ser His

age ate tggSer Ile Trp155

tcg aga tttSer Arg Phe170

act ttc ateThr Phe Ile185

aaa tca tttLys Ser Phe

tgt tta gtgCys Leu Val

ttt age geaPhe Ser Ala235

ttg agg aatLeu Arg Asn250

tet tca age

ggt gag aaaGly Glu Lys30

atg att acaMet Ile Thr45

tat aat actTyr Asn Thr60

tca ctc cagSer Leu Gln

tca tta aagSer Leu Lys

tat gga caaTyr Gly Gln110

caâ tta cagGln Leu Gln125

agt aaa aaaSer Lys Lys140

gag ate actGlu Ile Thr

aca aaa acaThr Lys Thr

aat tgt ggaAsn Cys Gly190

aaa tta gtcLys Leu Val205

aca gag acaThr Glu Thr220

agg ggt aggArg Gly Arg

tet gaa ccaSer Glu Pro

aat aaa cag

ata gea 96Ile Ala

cat aac 144His Asn

ate ata 192Ile Ile

ttt aaa 240Phe Lys80

aaa ttg 288Lys Leu95

aaa cat 336Lys His

ttc gaa 384Phe Glu

atg ctt 432Met Leu

gag aaa 480Glu Lys160

aaa act 528

Lys Thr

175

aga ttc 576Arg Phe

caa aat 624Gln Asn

aag aca 672Lys Thr

ate gat 720Ile Asp240

gtc cta 768Val Leu255

gaa tac 816Lys Arg Val Asn Arg Thr Gly Asn Ser Ser Ser Asn Lys Gln Glu Tyr260 265 270

caa tta tta aaa gat aac tta gtc aga tcg tac aat aaa gct ttg aag 864Gln Leu Leu Lys Asp Asn Leu Val Arg Ser Tyr Asn Lys Ala Leu Lys275 280 285

aaa aat gcg cct tat tca ate ttt gct ata aaa aat ggc cca aaa tet 912Lys Asn Ala Pro Tyr Ser Ile Phe Ala Ile Lys Asn Gly Pro Lys Ser290 295 300

cac att gga aga cat ttg atg acc tca ttt ctt tca atg aag ggc cta 960

His Ile Gly Arg His Leu Met Thr Ser Phe Leu Ser Met Lys Gly Leu

305 310 315 320

acg gag ttg act aat gtt gtg gga aat tgg age gat aag cgt gct tet 1008

Thr Glu Leu Thr Asn Val Val Gly Asn Trp Ser Asp Lys Arg Ala Ser

325 330 335

gcc gtg gcc agg aca acg tat act cat cag ata aca gea ata cct gat 1056Ala Val Ala Arg Thr Thr Tyr Thr His Gln Ile Thr Ala Ile Pro Asp340 345 350

cac tac ttc gea cta gtt tet cgg tac tat gea tat gat cca ata tca 1104His Tyr Phe Ala Leu Val Ser Arg Tyr Tyr Ala Tyr Asp Pro Ile Ser355 360 365

aag gaa atg ata gea ttg aag gat gag act aat cca att gag gag tgg 1152Lys Glu Met Ile Ala Leu Lys Asp Glu Thr Asn Pro Ile Glu Glu Trp370 375 380

cag cat ata gaa cag cta aag ggt agt gct gaa gga age ata cga tac 1200Gln His Ile Glu Gln Leu Lys Gly Ser Ala Glu Gly Ser Ile Arg Tyr385 390 395 400

ccc gea tgg aat ggg ata ata tca cag gag gta cta gac tac ctt tca 1248Pro Ala Trp Asn Gly Ile Ile Ser Gln Glu Val Leu Asp Tyr Leu Ser405 410 415

tcc tac ata aat 1260

Ser Tyr Ile Asn420

<210> SEQ ID NO.: 49<211> Comprimento: 420<212> Tipo: PRT

<213> Organismo: Saccharomyces cerevisiae

<400> Seqüência: 49Met Pro Gln Phe Gly Ile Leu Cys Lys Thr Pro Pro Lys Val Leu Val1 5 10 15

Arg Gln Phe Val Glu Arg Phe Glu Arg Pro Ser Gly Glu Lys Ile Ala

20 25 30

Leu Cys Ala Ala Glu Leu Thr Tyr Leu Cys Trp Met Ile Thr His Asn55 35 40 45

Gly Thr Ala Ile Lys Arg Ala Thr Phe Met Ser Tyr Asn Thr Ile Ile

50 55 60

Ser Asn Ser Leu Ser Phe Asp Ile Val Asn Lys Ser Leu Gln Phe Lys65 70 75 80

60 Tyr Lys Thr Gln Lys Ala Thr Ile Leu Glu Ala Ser Leu Lys Lys Leu

85 90 95Ile Pro Ala Trp Glu Phe Thr Ile Ile Pro Tyr Tyr Gly Gln Lys His 100 105 110 Gln Ser Asp Ile Thr Asp Ile Val Ser Ser Leu Gln Leu Gln Phe Glu 115 120 125 Ser Ser Glu Glu Ala Asp Lys Gly Asn Ser His Ser Lys Lys Met Leu 130 135 140 Lys Ala Leu Leu Ser Glu Gly Glu Ser Ile Trp Glu Ile Thr Glu Lys145 150 155 160Ile Leu Asn Ser Phe Glu Tyr Thr Ser Arg Phe Thr Lys Thr Lys Thr 165 170 175 Leu Tyr Gln Phe Leu Phe Leu Ala Thr Phe Ile Asn Cys Gly Arg Phe 180 185 190 Ser Asp Ile Lys Asn Val Asp Pro Lys Ser Phe Lys Leu Val Gln Asn 195 200 205 Lys Tyr Leu Gly Val Ile Ile Gln Cys Leu Val Thr Glu Thr Lys Thr 210 215 220 Ser Val Ser Arg His Ile Tyr Phe Phe Ser Ala Arg Gly Arg Ile Asp225 230 235 240Pro Leu Val Tyr Leu Asp Glu Phe Leu Arg Asn Ser Glu Pro Val Leu 245 250 255 Lys Arg Val Asn Arg Thr Gly Asn Ser Ser Ser Asn Lys Gln Glu Tyr 260 265 270 Gln Leu Leu Lys Asp Asn Leu Val Arg Ser Tyr Asn Lys Ala Leu Lys 275 280 285 Lys Asn Ala Pro Tyr Ser Ile Phe Ala Ile Lys Asn Gly Pro Lys Ser 290 295 300 His Ile Gly Arg His Leu Met Thr Ser Phe Leu Ser Met Lys Gly Leu305 310 315 320Thr Glu Leu Thr Asn Val Val Gly Asn Trp Ser Asp Lys Arg Ala Ser 325 330 335 Ala Val Ala Arg Thr Thr Tyr Thr His Gln Ile Thr Ala Ile Pro Asp 340 345 350 His Tyr Phe Ala Leu Val Ser Arg Tyr Tyr Ala Tyr Asp Pro Ile Ser 355 360 365 Lys Glu Met Ile Ala Leu Lys Asp Glu Thr Asn Pro Ile Glu Glu Trp 370 375 380 Gln His Ile Glu Gln Leu Lys Gly Ser Ala Glu Gly Ser Ile Arg Tyr385 390 395 400Pro Ala Trp Asn Gly Ile Ile Ser Gln Glu Val Leu Asp Tyr Leu Ser

405 410 415

Ser Tyr Ile Asn420

<210> SEQ ID NO.: 50<211> Comprimento: 1260<212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência artificial<220> Características:

<223> Outras informações: Seqüência de nucleotideo tendo códonspreferencialmente de milho codificando FLP recombinase (FLPm)

<221> Nome/chave: CDS

<222> Localização: (1)...(1260)

<400> Seqüência: 50

atg ccc cag ttc gac ate ctc tgc aag acc ccc ccc aag gtg ctc gtg 48

Met Pro Gln Phe Asp Ile Leu Cys Lys Thr Pro Pro Lys Val Leu Val

15 10 15

agg cag ttc gtg gag agg ttc gag agg ccc tcc ggc gag aag ate gcc 96Arg Gln

ctc tgcLeu Cys

ggc accGly Thr50

tcc aacSer Asn65

tac aagTyr Lys

ate cccIle Pro

cag tccGln Ser

tcc tcc

Ser Ser

130

aag gcc

Lys Ala145

ate ctc

Ile Leu

ctc tacLeu Tyr

tca gac

Ser Asp

aag tac

Lys Tyr

210

tcc gtg

Ser Val225

ccc CtC

Pro Leu

aag aggLys Arg

Phe Val Glu

gcc gcc gagAla Ala Glu

gcc att aagAla Ile Lys

tcc ctc tccSer Leu Ser

acc cag aagThr Gln Lys85

gcc tgg gagAla Trp Glu100

gac ate accAsp Ile Thr115

gag gag gctGlu Glu Ala

ctc ctc tccLeu Leu Ser

aac tcc ttcAsn Ser Phe165

cag ttc ctcGln Phe Leu180

ate aag aacIle Lys Asn195

ctc ggc gtgLeu Gly Val

tcc agg cacSer Arg His

gtg tac ctcVal Tyr Leu245

gtg aac aggVal Asn Arg

Arg Phe Glu

ctc acc tacLeu Thr Tyr

agg gcc accArg Ala Thr

ttc gac atePhe Asp Ile70

gcc acc ateAla Thr Ile

ttc acc atePhe Thr Ile

gac ate gtgAsp Ile Val120

gac aag ggcAsp Lys Gly135

gag ggc gagGlu Gly Glu150

gag tac accGlu Tyr Thr

ttc ctc gccPhe Leu Ala

gtg gac cccVal Asp Pro200

ate ate cagIle Ile Gln215

ate tac ttcIle Tyr Phe230

gac gag ttcAsp Glu Phe

acc ggc aacThr Gly Asn

Arg Pro Ser

ctc tgc tggLeu Cys Trp

ttc atg tcaPhe Met Ser

gtg aac aagVal Asn Lys

ctc gag gccLeu Glu Ala90

ate ccc tacIle Pro Tyr105

tca tcc ctcSer Ser Leu

aac tcc cacAsn Ser His

tcc ate tggSer Ile Trp155

tcc agg ttcSer Arg Phe170

acc ttc ateThr Phe Ile185

aag tcc ttcLys Ser Phe

tgc ctc gtgCys Leu Val

ttc tcc gctPhe Ser Ala235

ctc agg aacLeu Arg Asn250

tcc tcc tccSer Ser Ser

Gly Glu Lys

atg ate accMet Ile Thr

tac aac accTyr Asn Thr

tcc ctc cagSer Leu Gln

tcc ctc aagSer Leu Lys

tac ggc cagTyr Gly Gln110

cag ctt cagGln Leu Gln125

tcc aag aagSer Lys Lys140

gag ate accGlu Ile Thr

act aag accThr Lys Thr

aac tgc ggcAsn Cys Gly190

aag ctc gtgLys Leu Val205

acc gag accThr Glu Thr220

cgc ggc aggArg Gly Arg

tca gag cccSer Glu Pro

aac aag cagAsn Lys Gln

Ile Ala

cac aac 144His Asn

ate ate 192Ile Ile

ttc aaa 240Phe Lys

aag ctc 288Lys Leu

aag cac 336Lys His

ttc gag 384Phe Glu

atg ctg 432Met Leu

gag aag 480Glu Lys160

aag acc 528

Lys Thr

175

agg ttc 576Arg Phe

cag aac 624Gln Asn

aag acc 672Lys Thr

ate gac 720Ile Asp240

gtg ctc 768Val Leu255

gag tac 816Glu Tyr260 265 270

cag ctc ctc aag gac aac ctc gtg agg tcc tac aac aag gcc ctc aag 864Gln Leu Leu Lys Asp Asn Leu Val Arg Ser Tyr Asn Lys Ala Leu Lys275 280 285

aag aac gcc ccc tac tcc ate ttc gcc ate aag aac ggc ccc aag tcc 912Lys Asn Ala Pro Tyr Ser Ile Phe Ala Ile Lys Asn Gly Pro Lys Ser290 295 300

cac ate ggt agg cac ctc atg acc tcc ttc ctc tca atg aag ggc ctc 960His Ile Gly Arg His Leu Met Thr Ser Phe Leu Ser Met Lys Gly Leu305 310 315 320

15 acc gag ctc acc aac gtg gtg ggc aac tgg tcc gac aag agg gcc tcc 1008Thr Glu Leu Thr Asn Val Val Gly Asn Trp Ser Asp Lys Arg Ala Ser325 330 335

gcc gtg gcc agg acc acc tac acc cac cag ate acc gcc ate ccc gac 105620 Ala Val Ala Arg Thr Thr Tyr Thr His Gln Ile Thr Ala Ile Pro Asp340 345 350

cac tac ttc gcc ctc gtg tca agg tac tac gcc tac gac ccc ate tcc 1104His Tyr Phe Ala Leu Val Ser Arg Tyr Tyr Ala Tyr Asp Pro Ile Ser355 360 365

aag gag atg ate gcc ctc aag gac gag act aac ccc ate gag gag tgg 1152

Lys Glu Met Ile Ala Leu Lys Asp Glu Thr Asn Pro Ile Glu Glu Trp370 375 380

cag cac ate gag cag ctc aag ggc tcc gcc gag ggc tcc ate agg tac 1200

Gln His Ile Glu Gln Leu Lys Gly Ser Ala Glu Gly Ser Ile Arg Tyr385 390 395 400

ccc gcc tgg aac ggc ate ate tcc cag gag gtg ctc gac tac ctc tcc 1248Pro Ala Trp Asn Gly Ile Ile Ser Gln Glu Val Leu Asp Tyr Leu Ser405 410 415

tcc tac ate aac 1260

Ser Tyr Ile Asn420

<210> SEQ ID NO.: 51<211> Comprimento: 78<212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência artificial

<220> Características:

<223> Outras informações: Iniciador de oligonucleotideo

<221> Nome/chave: misc_feature

<222> Localização: 38, 39, 40, 41, 42, 43

<223> Outras informações: n = A, T, C ou G

<400> Seqüência: 51

gccagcatgc aagcttgaat tccgaagttc ctatactnnn nnnagaatag gaacttcgag 60atctggatcc gcggaacg 78

<210> SEQ ID NO.: 52<211> Comprimento: 78<212> Tipo: DNA<213> Organismo: Seqüência artificial

<220> Características:

<223> Outras informações: Iniciador de oligonucleotideo

<221> Nome/chave: misc_feature

<222> Localização: 36, 37, 38, 39, 40, 41

<223> Outras informações: n = A, T, C ou G

<400> Seqüência: 52

cgttccgcgg atccagatct cgaagttcct attctnnnnn nagtatagga acttcggaat 60tcaagcttgc atgctggc 78

<210> SEQ ID NO.: 53

<211> Comprimento: 23

<212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência artificial

<220> Características:

<223> Outras informações: Iniciador de oligonucleotideo

<400> Seqüência: 53

gcacatacaa atggacgaac gga 23

<210> SEQ ID NO.: 54

<211> Comprimento: 22

<212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência artificial

<220> Características:

<223> Outras informações: Iniciador de oligonucleotideo

<400> Seqüência: 54

cctcttcgct attacgccag et 22

<210> SEQ ID NO.: 55<211> Comprimento: 8<212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência artificial<220> Características:

<223> Outras informações: Seqüência de espaçamento do sítio FRT6

<400> Seqüência: 55tttttgaa

<210> SEQ ID NO.: 56

<211> Comprimento: 8

<212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência artificial

<220> Características:

<223> Outras informações: Seqüência de espaçamento do sítio FRT7

<400> Seqüência: 56ttattgaa

<210> SEQ ID NO.: 57<211> Comprimento: 8<212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência artificial<220> Características:

<223> Outras informações: Seqüência de espaçamento do sítio FRT22s deWO 01/23545

<400> Seqüência: 57

tatctaga 8

<210> SEQ ID NO.: 58

<211> Comprimento: 8

<212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência artificial

<220> Características:<223> Outras informações: Seqüência de espaçamento do sítio FRT72s deWO 01/23545

<400> Seqüência: 58

tttctaca 8

<210> SEQ ID NO.: 59<211> Comprimento: 8<212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência artificial

<220> Características:

<223> Outras informações: Seqüência de espaçamento do sítio FRT3s de WO01/23545

<400> Seqüência: 59

tatttgaa 8

<210> SEQ ID NO.: 60<211> Comprimento: 8<212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência artificial

<220> Características:

<223> Outras informações: Seqüência de espaçamento do sítio FRT2161s deWO 01/23545

<400> Seqüência: 60

tctctgga 8

<210> SEQ ID NO.: 61<211> Comprimento: 8<212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência artificial

<220> Características:

<223> Outras informações: Seqüência de espaçamento do sítio FRT2151s deWO 01/23545

<400> Seqüência: 61tctccaga 8

<210> SEQ ID NO.: 62<211> Comprimento: 8<212> Tipo: DNA<213> Organismo: Seqüência artificial<220> Características:

<223> Outras informações: Seqüência de espaçamento do sitio FRT2272s deWO 01/23545

<400> Seqüência: 62

tatctaca 8

<210> SEQ ID NO.: 63<211> Comprimento: 8<212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência artificial

<220> Características:

<223> Outras informações: Seqüência de espaçamento do sitio FRT2262s deWO 01/23545

<400> Seqüência: 63

tatcttga 8

<210> SEQ ID NO.: 64

<211> Comprimento: 8

<212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência artificial

<220> Características:

<223> Outras informações: Seqüência de espaçamento do sitio FRT2373s deWO 01/23545

<400> Seqüência: 64tgtctata 8

<210> SEQ ID NO.: 65

<211> Comprimento: 30

<212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência artificial

<220> Características:

<223> Outras informações: Sitio FRT f22 minimo de WO 01/23545

<400> Seqüência: 65

agttcctata ctatctagag aataggaact 30

<210> SEQ ID NO.: 66<211> Comprimento: 30<212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência artificial

<220> Características:

<223> Outras informações: Sítio FRT f72 mínimo de WO 01/23545<400> Seqüência: 66

agttcctata ctttctacag aataggaact 30

<210> SEQ ID NO.: 67

<211> Comprimento: 30

<212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência artificial

<220> Características:

<223> Outras informações: Sítio FRT f3 mínimo de WO 01/23545<400> Seqüência: 67

agttcctata ctatttgaag aataggaact 30

<210> SEQ ID NO.: 68<211> Comprimento: 30<212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência artificial

<220> Características:<223> Outras informações: Sitio FRT f2161 mínimo de WO 01/23545

<400> Seqüência: 68

agttcctata ctctctggag aataggaact 30

<210> SEQ ID NO.: 69<211> Comprimento: 30<212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência artificial

<220> Características:

<223> Outras informações: Sítio FRT f2151 mínimo de WO 01/2354555

<400> Seqüência: 69

agttcctata ctctccagag aataggaact 30

<210> SEQ ID NO.: 70<211> Comprimento: 30<212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência artificial<220> Características:

<223> Outras informações: Sítio FRT f2272 mínimo de WO 01/23545

<400> Seqüência: 70agttcctata ctatctacag aataggaact 30

<210> SEQ ID NO.: 71

<211> Comprimento: 30

<212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência artificial

<220> Características:

<223> Outras informações: Sítio FRT f2262 mínimo de WO 01/23545

<400> Seqüência: 71

agttcctata ctatcttgag aataggaact 30

<210> SEQ ID NO.: 72

<211> Comprimento: 30

<212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência artificial

<220> Características:

<223> Outras informações: Sítio FRT f2373 mínimo de WO 01/23545<400> Seqüência: 72

agttcctata ctgtctatag aataggaact 30

<210> SEQ ID NO.: 73<211> Comprimento: 343<212> Tipo: PRT<213> Organismo: Bacteriófago Cl

<220> Características:

<223> Outras informações: Polipeptideo Cre codificado pela SEQ ID NO:47

<400> Seqüência: 73

Met Ser Asn Leu Leu Thr Val His Gln Asn Leu Pro Ala Leu Pro Val15 10 15

Asp Ala Thr Ser Asp Glu Val Arg Lys Asn Leu Met Asp Met Phe Arg20 25 30

Asp Arg Gln Ala Phe Ser Glu His Thr Trp Lys Met Leu Leu Ser Val

35 40 45

Cys Arg Ser Trp Ala Ala Trp Cys Lys Leu Asn Asn Arg Lys Trp Phe50 55 60

Pro Ala Glu Pro Glu Asp Val Arg Asp Tyr Leu Leu Tyr Leu Gln Ala65 70 75 80

Arg Gly Leu Ala Val Lys Thr Ile Gln Gln His Leu Gly Gln Leu Asn85 90 95

Met Leu His Arg Arg Ser Gly Leu Pro Arg Pro Ser Asp Ser Asn Ala

100 105 110

Val Ser Leu Val Met Arg Arg Ile Arg Lys Glu Asn Val Asp Ala Gly115 120 125

Glu Arg Ala Lys Gln Ala Leu Ala Phe Glu Arg Thr Asp Phe Asp Gln130 135 140

Val Arg Ser Leu Met Glu Asn Ser Asp Arg Cys Gln Asp Ile Arg Asn145 150 155 160

Leu Ala Phe Leu Gly Ile Ala Tyr Asn Thr Leu Leu Arg Ile Ala Glu165 170 175

Ile Ala Arg Ile Arg Val Lys Asp Ile Ser Arg Thr Asp Gly Gly Arg

180 185 190

Met Leu Ile His Ile Gly Arg Thr Lys Thr Leu Val Ser Thr Ala Gly195 200 205

Val Glu Lys Ala Leu Ser Leu Gly Val Thr Lys Leu Val Glu Arg Trp210 215 220

Ile Ser Val Ser Gly Val Ala Asp Asp Pro Asn Asn Tyr Leu Phe Cys225 230 235 240

Arg Val Arg Lys Asn Gly Val Ala Ala Pro Ser Ala Thr Ser Gln Leu245 250 255

Ser Thr Arg Ala Leu Glu Gly Ile Phe Glu Ala Thr His Arg Leu Ile

260 265 270

Tyr Gly Ala Lys Asp Asp Ser Gly Gln Arg Tyr Leu Ala Trp Ser Gly275 280 285

His Ser Ala Arg Val Gly Ala Ala Arg Asp Met Ala Arg Ala Gly Val290 295 300

Ser Ile Pro Glu Ile Met Gln Ala Gly Gly Trp Thr Asn Val Asn Ile305 310 315 320

Val Met Asn Tyr Ile Arg Asn Leu Asp Ser Glu Thr Gly Ala Met Val325 330 335

Arg Leu Leu Glu Asp Gly Asp340

<210> SEQ ID NO.: 74<211> Comprimento: 420<212> Tipo: PRT

<213> Organismo: Saccharomyces cerevisiae

<220> Características:<223> Outras informações: Polipetídeo FLP codificado pela SEQ ID NO: 50<400> Seqüência: 74

Met Pro Gln Phe Asp Ile Leu Cys Lys Thr Pro Pro Lys Val Leu Val

15 10 15

Arg Gln Phe Val Glu Arg Phe Glu Arg Pro Ser Gly Glu Lys Ile Ala20 25 30

Leu Cys Ala Ala Glu Leu Thr Tyr Leu Cys Trp Met Ile Thr His Asn

35 40 45

Gly Thr Ala Ile Lys Arg Ala Thr Phe Met Ser Tyr Asn Thr Ile Ile50 55 60

Ser Asn Ser Leu Ser Phe Asp Ile Val Asn Lys Ser Leu Gln Phe Lys65 70 75 80

Tyr Lys Thr Gln Lys Ala Thr Ile Leu Glu Ala Ser Leu Lys Lys Leu

85 90 95

Ile Pro Ala Trp Glu Phe Thr Ile Ile Pro Tyr Tyr Gly Gln Lys His100 105 110

Gln Ser Asp Ile Thr Asp Ile Val Ser Ser Leu Gln Leu Gln Phe Glu

115 120 125

Ser Ser Glu Glu Ala Asp Lys Gly Asn Ser His Ser Lys Lys Met Leu130 135 140

Lys Ala Leu Leu Ser Glu Gly Glu Ser Ile Trp Glu Ile Thr Glu Lys145 150 155 160

Ile Leu Asn Ser Phe Glu Tyr Thr Ser Arg Phe Thr Lys Thr Lys Thr

165 170 175

Leu Tyr Gln Phe Leu Phe Leu Ala Thr Phe Ile Asn Cys Gly Arg Phe180 185 190

Ser Asp Ile Lys Asn Val Asp Pro Lys Ser Phe Lys Leu Val Gln Asn

195 200 205

Lys Tyr Leu Gly Val Ile Ile Gln Cys Leu Val Thr Glu Thr Lys Thr210 215 220

Ser Val Ser Arg His Ile Tyr Phe Phe Ser Ala Arg Gly Arg Ile Asp225 230 235 240

Pro Leu Val Tyr Leu Asp Glu Phe Leu Arg Asn Ser Glu Pro Val Leu

245 250 255

Lys Arg Val Asn Arg Thr Gly Asn Ser Ser Ser Asn Lys Gln Glu Tyr260 265 270

Gln Leu Leu Lys Asp Asn Leu Val Arg Ser Tyr Asn Lys Ala Leu Lys

275 280 285

Lys Asn Ala Pro Tyr Ser Ile Phe Ala Ile Lys Asn Gly Pro Lys Ser290 295 300

His Ile Gly Arg His Leu Met Thr Ser Phe Leu Ser Met Lys Gly Leu305 310 315 320

Thr Glu Leu Thr Asn Val Val Gly Asn Trp Ser Asp Lys Arg Ala Ser

325 330 335

Ala Val Ala Arg Thr Thr Tyr Thr His Gln Ile Thr Ala Ile Pro Asp340 345 350

His Tyr Phe Ala Leu Val Ser Arg Tyr Tyr Ala Tyr Asp Pro Ile Ser

355 360 365

Lys Glu Met Ile Ala Leu Lys Asp Glu Thr Asn Pro Ile Glu Glu Trp370 375 380

Gln His Ile Glu Gln Leu Lys Gly Ser Ala Glu Gly Ser Ile Arg Tyr385 390 395 400

Pro Ala Trp Asn Gly Ile Ile Ser Gln Glu Val Leu Asp Tyr Leu Ser405 410 415

Ser Tyr Ile Asn420

Claims (66)

1. Polinucleotideo isolado, caracterizado pelo fato deque compreende uma seqüência de nucleotideos compreendendopelo menos um primeiro sitio de recombinação FRT, oprimeiro sitio de recombinação FRT compreende uma seqüênciade espaçamento selecionada do grupo consistindo de SEQ IDNOs: 1, 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17e 18.

2. Polinucleotideo isolado de acordo com a reivindicação-1, caracterizado pelo fato de que o sitio de recombinaçãoFRT compreende, a SEQ ID NO: 21, 22, 23, 25, 26, 27, 28, 29,-30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37 ou 38.

3. Polinucleotideo isolado de acordo com a reivindicação-1, caracterizado pelo fato de que. o polinucleotideocompreende ainda um segundo sitio de recombinação.

4. Polinucleotideo isolado de acordo com a reivindicação-3, caracterizado pelo fato de que o segundo sitio derecombinação é selecionado do grupo consistindo de sitioFRT, sitio LOX e sítio att.

5. Polinucleotideo isolado de acordo com a reivindicação-4, caracterizado pelo fato de que o sitio FRT é selecionadodo grupo consistindo de sítio FRT do tipo selvagem e sítioFRT modificado, e o sítio LOX é selecionado do grupoconsistindo de sítio LOX do tipo selvagem e sítio LOXmodificado, e o sitio att é selecionado do grupoconsistindo de sitio att do tipo selvagem e sitio attmodificado.

6. Polinucleotideo isolado de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o segundo sitio derecombinação compreende um polinucleotideo selecionado dogrupo consistindo de SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,- 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 21, 22, 23, 24, 25, 26,- 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37 e 38.

7. Polinucleotideo isolado de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o segundo sitio derecombinação é diferente e não-recombinogênico, com relaçãoao primeiro sitio de recombinação FRT.

8. Polinucleotideo isolado de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o primeiro sitio derecombinação FRT e o segundo sitio .de recombinação sãositios de recombinação correspondentes.

9. Polinucleotideo isolado, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que . o polinucleotideocompreende um primeiro promotor convergente, o primeirositio de recombinação, o segundo sitio de recombinação e umsegundo promotor convergente..

10. Polinucleotideo isolado de acordo com a^ reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o polinucleotideocompreende um primeiro promotor convergente, o primeirositio de recombinação, uma primeira seqüência depolinucleotideos de interesse operacionalmente ligada aoprimeiro promotor convergente, um segundo polinucleotideode interesse operacionalmente ligado ao segundo promotorconvergente, o segundo sitio de recombinação e o segundopromotor convergente

11. Método para obtenção de uma célula transformadacaracterizado pelo fato de compreender a transformação dacélula com o polinucleotideo como definido em qualquer umadas reivindicações 1 a 10 e cultivo da dita célula sobcondições de crescimento.

12. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizadopelo fato de que a célula apresenta ainda, incorporadaestavelmente em seu genoma, uma molécula de ácido nucléicocodificando uma FLP recombinase.

13. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizadopelo fato de que a molécula de ácido nucléico codifica umavariante biologicamente ativa da FLP recombinase.

14. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações-11 a 13, caracterizado pelo fato de que a célula é de umaplanta.

15. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações- 11 a 14, caracterizado pelo fato de que o polinucleotideo éintegrado estavelmente no genoma da célula.

16. Método de acordo com a reivindicação 15, caracterizadopelo fato de que a célula é de uma planta monocotiledôneaou dicotiledônea.

17. Método de acordo com a reivindicação 16, caracterizadopelo fato de que a célula de planta é de milho, cevada,milheto, trigo, arroz, sorgo, centeio, soja, cánola,alfafa, girassol, açafrão, tabaco, Arabidopsis ou algodão.

18. Método de obtenção de uma planta transformadacaracterizado pelo fato de compreender a transformação deuma célula de acordo com o método definido em qualquer umadas reivindicações 11 a 17 e adicionalmente, compreender aregeneração da planta transformada.

19. Método de. produção de uma recombinação de DNA de sitioespecifico, caracterizado pelo fato de que compreende:a) prover um primeiro DNA compreendendo um primeirositio de recombinação de sitio especifico, em queo primeiro sitio de recombinação de sitioespecifico compreende um polinucleotideoselecionado do grupo consistindo de:i) sitio de recombinação FRT compreendendo umaregião de espaçamento selecionada do grupoconsistindo de SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 5, 6, 7,-8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 e 18; eii) sitio de recombinação FRT selecionado dogrupo consistindo de SEQ ID NOs: 21, 22, 23,-25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35,-36, 37 e 38;b) prover um segundo DNA compreendendo um segundositio de recombinação de sitio especifico, o qualé recombinogênico com o primeiro sitio derecombinação de sitio especifico; ec) prover uma recombinase de. sitio especifico, aqual catalisa . uma recombinação de sitioespecifico entre os primeiro e segundo sitios derecombinação de sitio especifico.

20. Método de acordo com a reivindicação 19, caracterizadopelo fato de que o primeiro DNA e o segundo DNA sãoprovidos em uma única molécula de polinucleotidéo.

21. Método de acordo com a reivindicação 19 ou .20,caracterizado' pelo fato de que o primeiro sitio derecombinação de sitio especifico e o segundo sitio derecombinação de sitio especifico são sitioscorrespondentes.

22. Método de acordo com a reivindicação 19 ou 20,caracterizado pelo fato de que o primeiro sitio derecombinação de sitio especifico e o segundo sitio derecombinação de sitio especifico são sitios diferentes.

23. Método de acordo com a reivindicação 20 ou 21,caracterizado pelo. fato de que o primeiro sitio derecombinação de sitio especifico e o segundo sitio derecombinação de sitio especifico são orientados diretamenteum ao outro.

24. Método de acordo com a reivindicação 23, caracterizadopelo fato de que os primeiro e segundo sitios derecombinação de sitio especifico flanqueiam um primeiropolinucleotideo de interesse, em que o provimento darecombinase de sitio especifico excisa o primeiropolinucleotideo de interesse.

25. Método de acordo com a reivindicação 24, caracterizadopelo fato de que a excisão do primeiro polinucleotideo deinteresse ativa a expressão do segundo polinucleotideo deinteresse.

26. Método de acordo com a reivindicação 20 ou 21,caracterizado pelo fato de que o primeiro sitio derecombinação de sitio especifico e o segundo sitio derecombinação de sitio especifico estão em orientação opostaum ao outro.

27. Método de acordo com a reivindicação 26, caracterizadopelo fato de que os primeiro e segundo sitios derecombinação de sitio especifico flanqueiam um primeiropolinucleotideo de interesse, em que o provimento darecombinase de sitio especifico inverte o primeiropolinucleotideo de interesse.

28. Método de acordo com a reivindicação 27, caracterizadopelo fato de que a inversão do primeiro polinucleotideo deinteresse ativa a expressão do primeiro polinucleotideo deinteresse.

29. Método de acordo com a reivindicação 27, caracterizadopelo fato de que a inversão do primeiro polinucleotideo deinteresse ativa a expressão do segundo polinucleotideo deinteresse.

30. Método de acordo com a reivindicação 19, caracterizadopelo fato de que o - primeiro DNA é provido em um primeiropolinucleotideo e o segundo DNA é provido em um segundopolinucleotideo, em que os primeiro e segundopolinucleotideos são moléculas separadas.

31. Método de acordo com a reivindicação 30, caracterizadopelo fato de que o segundo polinucleotideo é uma moléculacircular.

32. Método de acordo com a reivindicação 30, caracterizadopelo fato de que o segundo polinucleotideo compreende aindaum polinucleotideo de interesse.

33. Método de acordo com a reivindicação 19, caracterizadopelo fato de que compreende:a) prover um polinucleotideo compreendendo oprimeiro sitio de recombinação FRT e o segundositio de recombinação, em que o segundo sitio derecombinação é um sitio FRT;b) prover uma FLP recombinase, sob condições taisque a FLP recombinase implemente um evento deexcisão mediado por recombinase; ec) determinar a eficiência da excisão dos primeiro esegundo sitios de recombinação FRT.

34. Método de acordo com a reivindicação 33, caracterizadopelo fato de que os primeiro e segundo sitios derecombinação FRT são. sitios de recombinaçãocorrespondentes.

35. Método de acordo com a reivindicação 19, caracterizadopelo fato de que compreende:a) prover o primeiro sitio de recombinação FRT;b) prover ò segundo sitio de recombinação, em que osegundo sitio de recombinação é um sitio FRT, oqual é diferente do primeiro sitio derecombinação FRT;c) prover uma FLP recombinase, sob condições taisque a FLP recombinase implementa um evento derecombinação; ed) analisar o evento de recombinação, paradeterminar se os primeiro e segundo sitios derecombinação são não-recombinogênicos.

36. Método de acordo com a reivindicação 19, caracterizadopelo fato de que compreende:a) prover um sitio-alvo compreendendo o primeirositio de recombinação FRT;b) prover um cassette de transferência compreendendoum segundo sitio .de recombinação e umpolinucleotideo de interesse, em que os primeiroe segundo sitios de recombinação sãorecombinogênicos, com relação um ao outro; ec) prover uma recombinase, em que a recombinasereconhece e implementa a recombinação nosprimeiro e segundo sitios de recombinação, e opolinucleotideo de interesse é inserido no sitio-alvo.

37. Método de acordo com a reivindicação 36, caracterizadopelo fato de que o sitio-alvo é incorporado estavelmente nogenoma de uma célula.

38. Método de acordo com a reivindicação 19, caracterizadopelo fato de que compreende:a) prover um sitio-alvo compreendendo o primeirositio FRT e o segundo sitio de recombinação, emque os primeiro e segundo sitios de recombinaçãosão diferentes e não-recombinogênicos, comrelação um ao outro;b) prover um cassette de transferência compreendendoum polinucleotideo de interesse, em que opolinucleotideo de interesse é flanqueado pelosprimeiro e segundo sitios de recombinação; ec) prover uma recombinase, em que a recombinasereconhece e implementa a recombinação nosprimeiro e segundo sitios de recombinação, e opolinucleotideo de interesse é inserido no sitio-alvo.

39. Método de acordo com a reivindicação 38, caracterizadopelo fato de que o sitio-alvo compreende um segundopolinucleotídeo de interesse, flanqueado pelos primeiro esegundo sitios de recombinação.

40. Método de acordo com a reivindicação 38, caracterizadopelo fato de que o sitio-alvo é incorporado estavelmente nogenoma de uma célula.

41. Método de acordo c.om a reivindicação 38, caracterizadopelo fato de que compreende:a) prover um sitio-alvo operacionalmente ligado a umprimeiro e a um segundo promotor, em que osprimeiro e segundo promotores estão em umaorientação convergente;b) prover um cassette de transferênciacompreendendo, na seguinte ordem, o primeirositio de recombinação funcional, um primeiropolinucleotideo de interesse orientado na direção-5' a 3' , um segundo polinucleotideo de interesseorientado na direção 3' a 5' e o segundo sitio derecombinação funcional; ec) prover uma .recombinase, em que a inserção docassete de transferência no sitio-alvo resulta noprimeiro polinucleotideo de interesse sendooperacionalmente ligado no primeiro promotorconvergente e no segundo polinucleotideo deinteresse sendo operacionalmente ligado nosegundo promotor.convergente.

42. Método de acordo com a reivindicação. 19, caracterizadopelo fato de que compreende:a) prover um sitio-alvo compreendendo o primeirositio FRT e o segundo sitio de recombinação, emque os primeiro e segundo sitios de recombinaçãosão diferentes e . não-recombinogênicos, comrelação um ao outro;b) prover um primeiro cassete de transferênciacompreendendo, na seguinte ordem, o primeiro, umterceiro e o segundo sitio de recombinação, emque o primeiro e o terceiro sitio de recombinaçãodo primeiro cassete de transferência flanqueiamum primeiro polinucleotideo de interesse, e osprimeiro, segundo e terceiro sitios derecombinação são diferentes . e não-recombinogênicos, com relação um ao outro.c) prover uma primeira recombinase, em que aprimeira recombinase reconhece e implementa arecombinação nos primeiro e segundo sitios derecombinação;d) prover um segundo, cassete de transferênciacompreendendo os segundo e terceiro sitios derecombinação, em que os segundo e terceiro sitiosde recombinação do segundo cassete detransferência flanqueiam um segundopolinucleotideo de interesse; ee) prover uma segunda recombinase, em que a segundarecombinase reconhece e implementa a recombinaçãonos primeiro e segundo sitios de recombinação, emque os primeiro e segundo cassetes detransferência estão integrados no sitio-alvo.

43. Método de acordo com a reivindicação 19, caracterizadopelo fato de que compreende:a) prover um sitio-alvo compreendendo, na seguinteordem, pelo menos o primeiro sitio derecombinação FRT, o segundo sitio de recombinaçãoe um terceiro sitio de recombinação, em que osprimeiro, segundo e terceiro sitios derecombinação são diferentes e não-recombinogênicos, com relação um ao outro;b) prover ' um primeiro cassete de transferênciacompreendendo um primeiro polinucleotideo deinteresse,, flanqueado pelos primeiro e segundositios de recombinação;c) prover uma primeira recombinase, em que aprimeira recombinase reconhece e implementa arecombinação nos primeiro e segundo sitios derecombinação;d) prover um segundo cassete de transferênciacompreendendo um segundo polinucleotideo deinteresse,-flanqueado por pelo menos os segundo eterceiro sitios de recombinação; ee) prover uma segunda recombinase, em que a segundarecombinase reconhece e implementa a recombinaçãonos segundo e terceiro sitios de recombinação, emque os primeiro e segundo cassetes detransferência estão integrados no sitio-alvo.

44. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações-19 a 43, caracterizado pelo fato de que o segundo sitio derecombinação de sitio especifico é um sitio de recombinaçãoFRT: modificado selecionado do grupo consistindo de SEQ IDNOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16,-17, 18, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33,-34, .35, 36, 37 e 38.

45. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações-19 a 44, caracterizado pelo fato de que a recombinação desitio especifico ocorre in vivo.

46. Método de acordo com a reivindicaçãopelo fato de que ã recombinação de sitioem uma célula eucariótica.

47. Método de acordo com a reivindicação 46, caracterizado,pelo fato de que a célula eucariótica é uma célula deplanta.

48. Método de acordo com a reivindicação 47, caracterizadopelo fato de que a célula de planta é de uma plantaselecionada do qrupo consistindo de milho, arroz, trigo,cevada, milheto, sorgo, centeio, soja, alfafa, canola,Arabidopsis, tabaco, girassol, algodão e açafrão.

49. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações- 19 a 48, caracterizado pelo fato de que o provimento doprimeiro sitio de recombinaçãó, do segundo sitio derecombinação ou da recombinase compreende umatransformação.

50. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações- 19 a 49, caracterizado pelo fato de que o provimento doprimeiro sitio de recombinação, do segundo sitio derecombinação ou da recombinase compreende cruzamentosexual.

51. Método de acordo, com qualquer uma das reivindicações- 19 a 50, caracterizado pelo. fato de que o primeiro sitio derecombinação é incorporado estavelmente no genoma de umacélula.

52. Biblioteca isolada, caracterizada pelo fato de quecompreende uma população de plasmideos, em que cadaplasmideo na população compreende um primeiro marcadorselecionável comum, e cada plasmideo na populaçãocompreende ura membro de uma população de sitios derecombinação FRT modificados, em que cada membro dapopulação de sitios de recombinação FRT modificadoscompreende uma região de espaçamento compreendendo pelomenos uma alteração de nucleotideo na SEQ ID NO: 43, em quea população de plasmideos compreende pelo menos cerca de 100 membros distintos da população de plasmideos.

53. Biblioteca isolada de acordo com a reivindicação 52,caracterizada pelo fato de que os sitios de recombinaçãoFRT modificados da população-são recombinogênicos.

54. Biblioteca isolada de acordo com a reivindicação 52 ou 53, caracterizada pelo fato de que os sitios derecombinação FRT modificados não incluem sitios derecombinação FRT modificados com uma região de espaçamentoselecionada do grupo consistindo das SEQ ID NOs: 4, 44, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63 e 64.

55. Biblioteca isolada de acordo com qualquer uma dasreivindicações 52 a 54, caracterizada pelo fato de que apopulação de plasmideos compreende pelo menos um sitiorecombinogênico FRT modificado selecionado do grupoconsistindo de:a) um polinucleotideo compreendendo uma região deespaçamento selecionada do grupo consistindo dasSEQ ID NOs: 1, 2, 3, 5-, 6, 7, 8, 9, 10, 11, - 12, 13, 14, 15, 16, 17 e 18; eb) um sitio recombinogênico FRT modificadoselecionado do grupo consistindo das SEQ ID NOs:- 21, 22, 23, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33,- 34, 35, 36, 37 e 38.

56. Kit, caracterizado pelo fato de que compreende apopulação de plasmideos como definida em qualquer uma dasreivindicações 52 a 55, compreendendo ainda uma segundapopulação de plasmideos, em que cada plasmideo na segundapopulação compreende um segundo marcador selecionávelcomum, em que os primeiro e segundo marcadoresselecionáveis são distintos, e cada plasmideo na segundapopulação compreende um membro da população de sitios derecombinação FRT modificados.

57. Kit de acordo com a reivindicação 56, caracterizadopelo fato de que o kit compreende ainda uma FLP recombinaseou um polinucleotideo codificando a FLP recombinase.

58. Kit de acordo com a reivindicação 56 ou 57,caracterizado pelo fato de que pelo menos um membro daprimeira população, da segunda população ou de ambas aspopulações de sitios de recombinação FRT modificadoscompreende:a) região de espaçamento selecionada do grupoconsistindo das SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 5, 6, 7, 8,- 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 e 18; eb) sitio recombinogênico FRT modificado selecionadodo grupo consistindo das SEQ ID NOs: 21, 22, 23,- 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36,- 37 e 38.

59. Kit de acordo com qualquer uma das reivindicações 56 a 58, caracterizado pelo fato de que cada membro das primeirae segunda populações de sitios de recombinação FRTmodificados é recombinogênico.

60. Método de geração de uma biblioteca de moléculas,caracterizado pelo fato de que compreende:a) fornecer uma população de sitios de recombinaçãoFRT modificados, em que cada membro da populaçãode sitios de recombinação FRT modificadoscompreende uma região de espaçamentocompreendendo pelo menos uma alteração denucleotideo na SEQ ID NO: 43; eb) contatar a população de sitios de recombinaçãoFRT modificados com uma população de plasmideostendo um marcador selecionável comum, sobcondições para a inserção da população de sitiosde recombinação FRT modificados na população deplasmideos, de modo que cada plasmideo dapopulação compreende um único membro da populaçãode sitios de recombinação FRT modificados, paragerar uma biblioteca de moléculas.

61. Método para selecionar um sitio de recombinação FRTmodificado, caracterizado pelo fato de que compreende:a) fornecer uma primeira população de plasmideos, emque cada plasmideo na primeira populaçãocompreende um primeiro marcador selecionávelcomum e cada plasmideo na primeira populaçãocompreende um membro de uma população de sitiosde recombinação FRT modificados, em que cadamembro da população de sitios de recombinação FRTmodificados randomizados compreende uma região deespaçamento compreendendo pelo menos umaalteração de nucleotideo na SEQ ID NO: 43;b) -fornecer uma segunda população de plasmideos, emque cada plasmideo na segunda populaçãocompreende um . segundo marcador selecionávelcomum, em que os primeiro e segundo marcadoresselecionáveis são distintos e cada plasmideo nasegunda \ população compreende um membro dapopulação de sitios de recombinação FRTmodificados;c) combinar a primeira população de plasmideos com asegunda população de plasmideos, na presença deuma FLP recombinase, sob condições em que podeocorrer uma recombinação de sitio especifico; ed) selecionar um plasmideo co-integrantécompreendendo os primeiro e segundo marcadoresselecionáveis, o plasmideo co-integrantecompreendendo o sitio de recombinação FRTmodificado.

62. Método de acordo com a reivindicação 61, caracterizadopelo fato de que o plasmideo co-integrante compreende umsitio de recombinação FRT modificado funcional.

63. Método de acordo com a reivindicação 61 ou 62,caracterizado pelo fato de que compreende ainda isolar oplasmideo co-integrante..

64. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações- 61 a 63, caracterizado pelo. fato de que compreende ainda acaracterização do sitio de recombinação FRT modificado doplasmideo co-integrante.

65. Método de acordo com a reivindicação 64, caracterizadopelo fato de que a caracterização do sitio de recombinaçãoFRT modificado compreende um método selecionado do grupoconsistindo da determinação da eficiência da excisão,determinação da especificidade de recombinação esequenciamento do sitio de recombinação FRT modificado.

66. Método de acordo com a rèivindicação 60, caracterizadopelo fato de que as primeira e segunda populações deplasmídeos são combinadas em uma razão equimolar.