ES2367210T3 - Métodos de ms para evaluar glicanos. - Google Patents

Abstract

Un método para identificar glicanos sulfatados en una mezcla de glicanos, que comprende los pasos de: proporcionar un espectro de masas para una mezcla de glicanos; determinar, para múltiples pares de picos de masa en el espectro de masas separados por dos unidades de masa, [M] y [M+2], la proporción de las intensidades de las señales [M+2]/[M] para cada par; e identificar un pico de masa asociado con un primer glicano como el de un glicano sulfatado cuando al menos la proporción de [M+2]/[M] asociada con el primer glicano sea mayor que la proporción de [M+2]/[M] asociada con los picos de masa que corresponden a uno o más glicanos similares mediante un umbral seleccionado.

Description

Antecedentes

La sulfatación es una de las modificaciones más comunes presentes en los restos de carbohidratos de las glicoproteínas y puede desempeñar un papel importante en la función biológica de una glicoproteína. Por ejemplo, existe constancia de que los glicanos sulfatados están implicados en varios eventos de reconocimiento biológico tales como la migración de linfocitos y la eliminación de las hormonas pituitarias de la circulación. La fosforilación es otra modificación común de los carbohidratos que puede afectar significativamente a la función biológica de una glicoproteína. Sin embargo, los grupos fosfato y sulfato tienen esencialmente la misma masa (80 Da). Como resultado, suele ser difícil diferenciar las especies sulfatadas de las fosforiladas. Por lo tanto, se necesitan técnicas que puedan detectar especies de glicano sulfatadas y/o fosforiladas, y se necesitan en particular técnicas que puedan distinguir ambas especies.

Resumen

En varios aspectos, la presente descripción proporciona métodos para identificar glicanos sulfatados en una mezcla de glicanos. En algunas realizaciones, los métodos descritos en la presente utilizan la distribución de la abundancia isotópica natural del azufre, que contiene una proporción de S34 : S32 de aproximadamente el 4.5%, para, por ejemplo, facilitar la identificación de glicanos sulfatados, distinguir los glicanos fosforilados de los sulfatados y/o determinar la cantidad de sulfatación con relación a una o más modificaciones postraduccionales adicionales.

En ciertas realizaciones, se somete una muestra que comprende una mezcla de glicanos a un análisis de masas para generar un espectro de masas de al menos una porción de la mezcla. Un espectro de masas comprende una lista de señales de masa (también denominadas picos de masa). Cada señal de masa tiene una intensidad asociada (relacionada con la abundancia del ión) y una masa asociada (relacionada, por ejemplo, con la proporción de la masa en función de la carga (m/z) del ión).

Algunos métodos comparan la intensidad de la señal de la señal de un ión que aparece en una unidad de masa [M] con la de la señal de un ión que aparece en una unidad de masa [M+2], por ejemplo, cuando la escala de masa se proporciona en unidades de masa atómica (uma), la señal de masa en M (uma) se compara con la de M + 2 uma. Dicha comparación de las intensidades de las señales se puede repetir para una pluralidad de pares de picos de masas. Los picos de masa que corresponden a los glicanos sulfatados se identifican en función de al menos la proporción de las intensidades de las señales entre los iones [M] y [M+2] entre especies de carbohidratos similares. Los pares de señales de masa ([M+2], [M]) de los glicanos que contienen proporciones de [M+2]/[M] más elevadas se identifican como glicanos sulfatados. En varias realizaciones, esta asignación se confirma de manera adicional con métodos que someten una porción de la mezcla de glicanos a un análisis con una técnica de espectrometría de masas con más de una dimensión analítica, por ejemplo, LC-MS, MS/MS, etc. En otra realización preferida, esta asignación se confirma de manera adicional con métodos que comparan la distribución isotópica de las especies con un espectro de masas teórico de un glicano modelo.

En varios aspectos, se proporcionan métodos para identificar glicanos sulfatados en una mezcla de glicanos, que comprenden los pasos de: (a) proporcionar un espectro de masas para una mezcla de glicanos; (b) determinar, para múltiples pares de picos de masa en el espectro de masas separados por dos unidades de masa, [M] y [M+2], la proporción de las intensidades de las señales [M+2]/[M] para cada par; y (c) identificar un pico de masa asociado con un primer glicano como el de un glicano sulfatado cuando al menos la proporción de [M+2]/[M] asociada con el primer glicano sea mayor que la proporción de [M+2]/[M] asociada con los picos de masa que corresponden a uno o más glicanos similares mediante un umbral seleccionado. En varias realizaciones, el umbral seleccionado es aquel en que la proporción de [M+2]/[M] del primer glicano con relación a uno o más glicanos similares diferentes es mayor que aproximadamente uno o más de los siguientes: (a) un factor de aproximadamente 1.1; (b) un factor de aproximadamente 1.2; (c) un factor de aproximadamente 1.5; (d) un valor de 0.02; y (e) un valor de 0.04.

En varios aspectos, se proporcionan métodos para identificar glicanos sulfatados en una mezcla de glicanos, que comprenden los pasos de: (a) proporcionar un espectro de masas para una mezcla de glicanos; (b) determinar, para múltiples pares de picos de masa en el espectro de masas separados por dos unidades de masa, [M] y [M+2], la proporción de las intensidades de las señales [M+2]/[M] para cada par; y (c) identificar un pico de masa como procedente de un glicano sulfatado en función de al menos la distribución de las proporciones de [M+2]/[M] de tres o más glicanos similares. En varias realizaciones, los picos de masa que presentan unas proporciones de [M+2]/[M] con la moda de valor más elevado de una distribución bimodal de las proporciones de [M+2]/[M] para tres o más glicanos similares se identifican como procedentes de un glicano sulfatado.

La intensidad de la señal de una señal de masa se puede determinar, por ejemplo, a partir de uno o más de los siguientes: (a) la intensidad de la señal de masa máxima de un intervalo determinado de unidades de masa; (b) la intensidad de la señal de masa media de un intervalo determinado de unidades de masa; (c) el área asociada con el pico de masa de un intervalo determinado de unidades de masa; y (d) combinaciones de dos o más de estos. El intervalo determinado de unidades de masa se puede basar en, por ejemplo, una o más de las siguientes: la anchura a media altura (FWHM, por sus siglas en inglés) de un pico, la resolución de masas de un espectrómetro de masas, etc.

En varias realizaciones de la presente descripción, en primer lugar se procesa el espectro de masas para eliminar el ruido electrónico y/o para corregir la línea base de dicho espectro de masas, antes de determinar las intensidades de las señales. La eliminación del ruido electrónico y la corrección de la línea base se pueden llevar a cabo utilizando cualquier método adecuado conocido en la materia. En varias realizaciones, las intensidades de las señales se corrigen frente a las variaciones en la respuesta dinámica, la resolución, etc. del espectrómetro de masas, antes de comparar las intensidades de las señales.

En varias realizaciones, los métodos utilizan la diferencia en la distribución de la abundancia isotópica natural entre el azufre y el fósforo para diferenciar las estructuras sulfatadas de las fosforiladas. Por ejemplo, la proporción de la abundancia isotópica natural de S34 : S32 es de aproximadamente 4.5:100, o del 4.5%, y por lo tanto las señales de masa originadas por glicanos sulfatados deberían producir un pico satélite en aproximadamente [M+2] y una proporción de [M+2]/[M] mayor, mientras que los picos asociados con estructuras fosforiladas no deberían mostrar sustancialmente dicha correlación entre las intensidades de los picos en [M] y [M+2].

Lo precedente, así como otros aspectos, realizaciones y características de las invenciones de la presente se pueden comprender mejor a partir de la siguiente descripción, junto con los dibujos que la acompañan. Las figuras de los dibujos no están necesariamente a escala, en su lugar se pone énfasis en la ilustración de los principios de la descripción.

Breve descripción de los dibujos

Las Figuras 1A y 1B proporcionan, respectivamente, ilustraciones esquemáticas de las estructuras modelo de Nacetilglucosamina y 6-sulfato de N-acetilglucosamina, para ilustrar las diferencias en la distribución isotópica debido a la presencia del resto sulfato.

Las Figuras 2A y 2B son espectros de masa que comparan la distribución isotópica del disacárido no sulfatado ∆UHNAC, Figura 2A, con la del disacárido sulfatado ∆U-HNAC6S, Figura 2B.

Las Figuras 3A y 3B proporcionan espectros de masas y comparan la distribución isotópica de un N-glicano complejo sulfatado NeuAc1 Fuc1 Gal1 Man3 GlcNAc5 Sulfato2, Figura 3A, con la de un glicano unido a través de N complejo no sulfatado NeuAc1 Fuc1 Gal3 Man3 GlcNAc5, Figura 3B.

Definiciones

Alrededor de, Aproximadamente, Ca.: Según se utilizan en la presente, los términos “alrededor de”, “aproximadamente” o “ca.”, cuando se aplican a uno o más valores de interés, se refieren a un valor que es similar a un valor de referencia determinado. En ciertas realizaciones, los términos “alrededor de”, “aproximadamente” o “ca.” se refieren a un intervalo de valores que se encuentran dentro del 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% o menos del valor de referencia determinado.

Muestra biológica: La expresión “muestra biológica”, según se utiliza en la presente, se refiere a cualquier muestra sólida o fluida obtenida de, o bien excretada o secretada por, cualquier célula u organismo vivo, incluidos, sin carácter limitante, los cultivos de tejidos, bioreactores, tejidos humanos o animales, plantas, frutas, vegetales, microorganismos unicelulares (tales como bacterias y levaduras) y organismos multicelulares. Por ejemplo, una muestra biológica puede ser un fluido biológico obtenido a partir de, por ejemplo, sangre, plasma, suero, orina, bilis, fluido seminal, fluido cerebroespinal, humor vítreo o acuoso, o cualquier secreción corporal, un trasudado, un exudado (por ejemplo, el fluido obtenido de un absceso o cualquier otro punto de infección o inflamación) o un fluido obtenido a partir de una articulación (por ejemplo, una articulación normal o un articulación afectada por una enfermedad tal como artritis reumatoide, osteoartritis, gota o artritis séptica). Una muestra biológica también puede ser, por ejemplo, una muestra obtenida a partir de un órgano o tejido (incluida una muestra de una biopsia o autopsia), puede comprender células (tanto células primarias como células cultivadas), medio acondicionado por cualquier célula, tejido u órgano, y cultivo de tejidos.

Glicoproteína de la superficie celular: Según se utiliza en la presente, la expresión “glicoproteína de la superficie celular” se refiere a una glicoproteína, al menos una porción de la cual está presente en la superficie exterior de una célula. En algunas realizaciones, una glicoproteína de la superficie celular es una proteína que está situada en la superficie celular de manera tal que al menos una de las estructuras de glicano esté presente en la superficie exterior de la célula.

Glicano de la superficie celular: Un “glicano de la superficie celular” es un glicano que está presente en la superficie exterior de una célula. En muchas realizaciones de la presente descripción, un glicano de la superficie celular está unido covalentemente a un polipéptido como parte de una glicoproteína de la superficie celular. Un glicano de la superficie celular también puede estar unido a un lípido de la membrana celular.

Glicano: Como se reconoce en la materia y se utiliza en la presente, los “glicanos” son azúcares. Los glicanos pueden ser monómeros o polímeros de restos de azúcares, aunque suelen contener al menos tres azúcares, y pueden ser lineales o ramificados. Un glicano puede incluir restos de azúcares naturales (por ejemplo, glucosa, Nacetilglucosamina, ácido N-acetilneuramínico, galactosa, manosa, fucosa, hexosa, arabinosa, ribosa, xilosa, etc.) y/o azúcares modificados (por ejemplo, 2’-fluororibosa, 2’-desoxiribosa, fosfomanosa, 6’-sulfo-N-acetilglucosamina, etc.). El término “glicano” incluye homo y heteropolímeros de restos de azúcares. El término “glicano” también engloba el componente de glicano de un glicoconjugado (por ejemplo, de una glicoproteína, un glicolípido, un proteoglicano, etc.). El término también engloba glicanos libres, incluidos los glicanos que han sido escindidos o liberados de un glicoconjugado.

Preparado de glicanos: La expresión “preparado de glicanos”, según se utiliza en la presente, se refiere a un conjunto de glicanos obtenidos de acuerdo con un método de producción particular. En algunas realizaciones, el “preparado de glicanos” se refiere a un conjunto de glicanos obtenidos a partir de un preparado de glicoproteínas (remítase a la definición de “preparado de glicoproteínas” más adelante).

Glicoconjugado: El término “glicoconjugado”, según se utiliza en la presente, engloba todas las moléculas en las cuales al menos un resto de azúcar está unido covalentemente a al menos un resto distinto. El término engloba específicamente todas las biomoléculas con restos de azúcares unidos covalentemente e incluye, por ejemplo, Nglicoproteínas, O-glicoproteínas, glicolípidos, proteoglicanos, etc.

Glicoforma: El término “glicoforma” se utiliza en la presente para referirse a una forma particular de un glicoconjugado. Esto es, cuando el mismo resto del esqueleto (por ejemplo, un polipéptido, lípido, etc.) que forma parte de un glicoconjugado tiene el potencial de unirse a diferentes glicanos o conjuntos de glicanos, entonces cada versión diferente del glicoconjugado (es decir, cuando el esqueleto se une a un conjunto de glicanos particular) se denominará una “glicoforma”.

Glicolípido: El término “glicolípido”, según se utiliza en la presente, se refiere a un lípido que contiene uno o más restos de azúcares (es decir, glicanos) unidos covalentemente. El (los) resto(s) de azúcar(es) puede(n) estar en forma de monosacáridos, disacáridos, oligosacáridos y/o polisacáridos. El (los) resto(s) de azúcar(es) puede(n) comprender una cadena única no ramificada de restos de azúcares o puede(n) estar comprendido(s) por una o más cadenas ramificadas. En ciertas realizaciones, los restos de azúcares pueden incluir grupos sulfato y/o fosfato. En ciertas realizaciones, las glicoproteínas contienen restos de azúcares unidos a través de O; en ciertas realizaciones, las glicoproteínas contienen restos de azúcares unidos a través de N.

Glicoproteína: Según se utiliza en la presente, el término “glicoproteína” se refiere a una proteína que contiene un esqueleto peptídico unido covalentemente a uno o más restos de azúcares (es decir, glicanos). Como sobreentenderán los expertos en la materia, el esqueleto peptídico suele comprender una cadena lineal de restos de aminoácidos. En ciertas realizaciones, el esqueleto peptídico atraviesa la membrana celular, de manera que comprende una porción de transmembrana y una porción extracelular. En ciertas realizaciones, un esqueleto peptídico de una glicoproteína que atraviesa la membrana celular comprende una porción intracelular, una porción de transmembrana y una porción extracelular. En ciertas realizaciones, los métodos de la presente descripción comprenden escindir una glicoproteína de la superficie celular con una proteasa para liberar la porción extracelular de la glicoproteína, o una porción de esta, donde dicha exposición no rompe sustancialmente la membrana celular. El (los) resto(s) de azúcar(es) puede(n) estar en forma de monosacáridos, disacáridos, oligosacáridos y/o polisacáridos. El (los) resto(s) de azúcar(es) puede(n) comprender una cadena única no ramificada de restos de azúcares o puede(n) comprender una o más cadenas ramificadas. En ciertas realizaciones, los restos de azúcares pueden incluir grupos sulfato y/o fosfato. Como alternativa o adicionalmente, los restos de azúcares pueden incluir acetilo, glicolilo, propilo u otras modificaciones de alquilo. En ciertas realizaciones, las glicoproteínas contienen restos de azúcares unidos a través de O; en ciertas realizaciones, las glicoproteínas contienen restos de azúcares unidos a través de N. En ciertas realizaciones, los métodos descritos en la presente comprenden un paso de análisis de cualquiera de los siguientes componentes o de todos ellos: las glicoproteínas de la superficie celular, los fragmentos liberados (por ejemplo, glicopéptidos) de las glicoproteínas de la superficie celular, los glicanos de la superficie celular unidos a las glicoproteínas de la superficie celular, los esqueletos peptídicos de las glicoproteínas de la superficie celular, los fragmentos de dichas glicoproteínas, los glicanos y/o los esqueletos peptídicos y combinaciones de estos.

Glicosidasa: El término “glicosidasa”, según se utiliza en la presente, se refiere a un agente que rompe un enlace covalente entre los azúcares secuenciales de un glicano o entre el azúcar y el resto del esqueleto (por ejemplo, entre el azúcar y el esqueleto peptídico de una glicoproteína). En algunas realizaciones, una glicosidasa es una enzima. En ciertas realizaciones, una glicosidasa es una proteína (por ejemplo, una enzima proteica) que comprende una o más cadenas polipeptídicas. En ciertas realizaciones, una glicosidasa es un agente de escisión químico (por ejemplo, hidrazina, borohidruro de sodio, ácido trifluorometansuolfónico, etc. y combinaciones de estos).

Patrón de glicosilación: Según se utiliza en la presente, la expresión “patrón de glicosilación” se refiere a un conjunto de estructuras de glicanos presentes en una muestra particular. Por ejemplo, un glicoconjugado particular (por ejemplo, una glicoproteína) o un conjunto de glicoconjugados (por ejemplo, un conjunto de glicoproteínas) tendrá un patrón de glicosilación. En algunas realizaciones, se hace referencia al patrón de glicosilación de los glicanos de la superficie celular. Un patrón de glicosilación se puede caracterizar, por ejemplo, por las identidades de los glicanos, las cantidades (absolutas o relativas) de glicanos individuales o glicanos de tipos particulares, el grado de ocupación de los sitios de glicosilación, etc. o combinaciones de dichos parámetros.

Preparado de glicoproteínas: Un “preparado de glicoproteínas”, según se utiliza esta expresión en la presente, se refiere a un conjunto de moléculas de glicoproteínas individuales, cada una de las cuales comprende un polipéptido con una secuencia de aminoácidos particular (dicha secuencia de aminoácidos incluye al menos un sitio de glicosilación) y al menos un glicano unido covalentemente a dicho sitio de glicosilación. Las moléculas individuales de una glicoproteína particular de un preparado de glicoproteínas suelen tener secuencias de aminoácidos idénticas, pero pueden diferir en la ocupación de dicho sitio de glicosilación y/o en la identidad de los glicanos unidos a dicho sitio de glicosilación. Esto es, un preparado de glicoproteínas puede contener solo una glicoforma única de una glicoproteína particular, aunque más habitualmente contiene una pluralidad de glicoformas. Diferentes preparados de la misma glicoproteína pueden diferir en la identidad de las glicoformas presentes (por ejemplo, una glicoforma presente en un preparado puede no estar presente en otro) y/o en las cantidades relativas de las diferentes glicoformas.

N-glicano: El término “N-glicano”, según se utiliza en la presente, se refiere a un polímero de azúcares que se ha liberado de un glicoconjugado, pero que estaba inicialmente unido al glicoconjugado a través de un enlace de nitrógeno (remítase a la definición de “glicano unido a través de N” a continuación).

Glicanos unidos a través de N: Los glicanos unidos a través de N son glicanos que están unidos a un glicoconjugado a través de un enlace de nitrógeno. Existe una gran variedad de glicanos unidos a través de N, aunque se suelen basar en el núcleo común del pentasacárido (Man)3(GlcNAc)(GlcNAc).

O-glicano: El término “O-glicano”, según se utiliza en la presente, se refiere a un polímero de azúcares que se ha liberado de un glicoconjugado, pero que estaba inicialmente unido al glicoconjugado a través de un enlace de oxígeno (remítase a la definición de “glicano unido a través de O” a continuación).

Glicanos unidos a través de O: Los glicanos unidos a través de O son glicanos que están unidos a un glicoconjugado a través de un enlace de oxígeno. Los glicanos unidos a través de O suelen estar unidos al grupo hidroxilo de Lserina (Ser) o L-treonina (Thr) de las glicoproteínas mediante N-acetil-D-galactosamina (GalNAc) o mediante Nacetil-D-glucosamina (GlcNAc). Algunos glicanos unidos a través de O también contienen modificaciones tales como acetilación y sulfatación. En algunos casos, los glicanos unidos a través de O están unidos al grupo hidroxilo de Lserina (Ser) o L-treonina (Thr) de las glicoproteínas mediante fucosa o manosa.

Fosforilación: Según se utiliza en la presente, el término “fosforilación” se refiere al proceso de añadir covalentemente uno o más grupos fosfato a una molécula (por ejemplo, a un glicano).

Proteasa: El término “proteasa”, según se utiliza en la presente, se refiere a un agente que rompe un enlace peptídico entre los aminoácidos secuenciales de una cadena polipeptídica. En algunas realizaciones, una proteasa es una enzima (es decir, una enzima proteolítica). En ciertas realizaciones, una proteasa es una proteína (por ejemplo, una enzima proteica) que comprende una o más cadenas polipeptídicas. En ciertas realizaciones, una proteasa es un agente de escisión químico.

Proteína: En general, una “proteína” es un polipéptido (es decir, una cadena de al menos dos aminoácidos unidos entre sí mediante enlaces peptídicos). Las proteínas pueden incluir restos que no sean aminoácidos (por ejemplo, pueden ser glicoproteínas) y/o se pueden, si no, procesar o modificar. Los expertos en la materia sobreentenderán que una “proteína” puede ser una cadena polipeptídica completa, como sería producida por una célula (con una secuencia de señales o sin ella), o puede ser una porción funcional de esta. Los expertos sobreentenderán además que una proteína puede incluir en algunas ocasiones más de una cadena polipeptídica, que se une, por ejemplo, mediante uno o más enlaces disulfuro o se asocia de otras maneras.

Ácido siálico: La expresión “ácido siálico”, según se utiliza en la presente, es una expresión genérica para los derivados N- u O-sustituidos del ácido neuramínico, el cual es un monosacárido de nueve carbonos. En un ácido siálico, el grupo amino del ácido neuramínico suele contener un grupo acetilo o un grupo glicolilo. Los sustituyentes hidroxilo presentes en el ácido siálico se pueden modificar mediante acetilación, metilación, sulfatación y fosforilación. El ácido siálico predominante es el ácido N-acetilneuramínico (Neu5Ac). Los ácidos siálicos confieren una carga negativa a los glicanos, porque el grupo carboxilo tiende a disociar un protón en el pH fisiológico. A continuación se muestran algunos ejemplos de ácidos siálicos desprotonados:

imagen1

ácido N-acetilneuramínico (Neu5Ac) ácido neuramínico (Neu)

Sustancialmente: Según se utiliza en la presente, el término “sustancialmente” se refiere a la condición cualitativa de exhibir un grado o extensión total o casi total de una característica o propiedad de interés. Una experto en la materia de biología sobreentenderá que los fenómenos biológicos y químicos raramente, o nunca, se completan y/o evolucionan hasta completarse o alcanzan o evitan un resultado absoluto. Por lo tanto, el término “sustancialmente” se utiliza en la presente para englobar la falta potencial de finalización inherente a muchos fenómenos biológicos y químicos. Para dar solamente un ejemplo particular, cuando se menciona que un tratamiento no rompe “sustancialmente” las membranas celulares, se pretende indicar que todas las membranas celulares o la mayoría de ellas permanecen intactas durante y después del tratamiento, por ejemplo, de manera que las glicoproteínas o glicopéptidos intracelulares, por lo tanto, no se liberen de las células. En ciertas realizaciones, el término “sustancialmente”, cuando se aplica a las membranas celulares que no se han roto, se refiere a una condición donde el 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% o menos de las células sometidas a un tratamiento particular exhiben una rotura apreciable de la membrana celular. En ciertas realizaciones, el término “sustancialmente”, cuando se aplica a las membranas celulares que no se han roto, se refiere a una condición donde ninguna de las células sometidas a un tratamiento particular exhibe una rotura apreciable de la membrana celular.

Descripción detallada de ciertas realizaciones

En varios aspectos, la presente descripción proporciona métodos para identificar glicanos sulfatados en una mezcla de glicanos. En varias realizaciones, los métodos de la presente descripción se pueden utilizar para facilitar la identificación de carbohidratos sulfatados en una mezcla compleja de carbohidratos. En varias realizaciones, los métodos pueden proporcionar la cuantificación de los glicanos y/o carbohidratos sulfatados.

En varios aspectos, los métodos de la presente descripción se pueden aplicar a mezclas de glicanos que comprenden glicanos libres en solución, glicanos escindidos (por ejemplo, mediante métodos enzimáticos, químicos, etc.) de un péptido, proteína, lípido, etc., glicanos en una proteína, péptido, lípido, etc. y/o mezclas que comprenden combinaciones de estos.

Los métodos de las invenciones de la presente se pueden aplicar en muchas áreas. Por ejemplo, en varias realizaciones, se proporcionan métodos para diferenciar glicanos sulfatados de glicanos fosforilados.

En varias realizaciones, los métodos comprenden los pasos de: someter una muestra que comprende una mezcla de glicanos a un análisis de masas para generar un espectro de masas de al menos una porción de la mezcla; comparar la intensidad de la señal de un ión en [M] unidades de masa con la de un ión en [M+2] unidades de masa; repetir la comparación para una pluralidad de pares [M] y [M+2] diferentes; e identificar como glicanos sulfatados aquellos que presentan una proporción de [M+2]/[M] mayor con relación a uno o más glicanos similares diferentes.

En varias realizaciones, se identifica un glicano como glicano sulfatado cuando su proporción de [M+2]/[M] con relación a uno o más glicanos similares diferentes es mayor que uno o más de los siguientes: (a) un factor de aproximadamente 1.1; (b) un factor de aproximadamente 1.2; (c) un factor de aproximadamente 1.5; (d) un valor de 0.02; y (e) un valor de 0.04. Por ejemplo, considere un glicano de masa nominal M1 con una proporción de las intensidades de las señales [M1+2]/[M1] = Y y un glicano similar de masa nominal Mc con una proporción de las intensidades de las señales [Mc+2]/[Mc] = Z; en varias realizaciones, el glicano M1 se identifica como un glicano sulfatado cuando se cumple uno o más de los siguientes: (a) Y/Z es mayor de aproximadamente 1.1; (b) Y/Z es mayor de aproximadamente 1.2; (c) Y/Z es mayor de aproximadamente 1.5; (d) Y es mayor de aproximadamente Z + 0.2; y (e) Y es mayor de aproximadamente Z + 0.4.

En varias realizaciones, se identifica un glicano como glicano sulfatado cuando su proporción de [M+2]/[M] con relación a dos o más glicanos similares diferentes es más de una desviación estándar mayor que la proporción de [M+2]/[M] de otros glicanos similares. En varias realizaciones, los glicanos sulfatados se distinguen de los glicanos no sulfatados de estructura similar por la presencia de una distribución bimodal de los valores de [M+2]/[M], donde las señales de masa asociadas con la moda de valor más elevado de la distribución se identifican como glicanos sulfatados.

Las Figuras 2A-B y 3A-B ilustran ejemplos de la identificación de glicanos sulfatados mediante la comparación de las proporciones de [M+2]/[M] de glicanos similares. En las Figuras 2A-B, se presentan los espectros de masas en un formato solo de intensidad para el disacárido no sulfatado ∆U-HNAC, Figura 2A, y el disacárido sulfatado ∆UHNAC6S, Figura 2B. La proporción de [M+2]/[M] del glicano sulfatado fue de aproximadamente 0.089 (o del 8.9%), en comparación con la de un glicano similar no sulfatado, que fue de aproximadamente 0.04 (4%). En las Figuras 2A-B, la proporción de [M+2]/[M] del glicano sulfatado es mayor que la proporción de [M+2]/[M] del glicano no sulfatado en un valor de aproximadamente 0.04 y a la vez en un factor superior a aproximadamente 1.5.

En las Figuras 3A-B, se presentan los espectros de masas de dos glicanos de estructura similar, un glicano sulfatado (el N-glicano complejo NeuAc1 Fuc1 Gal1 Man3 GlcNAc5 Sulfato2), Figura 3A, y un glicano no sulfatado (el glicano unido a través de N complejo NeuAc1 Fuc1 Gal3 Man3 GlcNAc5), Figura 3B. La proporción de [M+2]/[M] del glicano sulfatado fue de aproximadamente 0.091 (o del 91%) y la de un glicano similar no sulfatado fue de aproximadamente 0.75 (75%). En las Figuras 3A-B, la proporción de [M+2]/[M] del glicano sulfatado es mayor que la proporción de [M+2]/[M] del glicano no sulfatado en un valor de aproximadamente 0.16 y a la vez en un factor superior a aproximadamente 1.2.

Se sobreentenderá que, aunque las intensidades relativas de una señal de masa en [M] y [M+2] se discuten en cuanto a la proporción de [M+2]/[M], la proporción de [M]/[M+2] también se puede utilizar, entendiéndose que los glicanos sulfatados se identificarán con proporciones menores. También se sobreentenderá que los datos primarios utilizados para construir un espectro de masas no necesariamente presentarán la forma de señal frente a masa, sino que también pueden presentar la forma de señal frente a algún otro parámetro. Por ejemplo, en un espectrómetro de masas de tiempo de vuelo (TOF, por sus siglas en inglés), los datos primarios se obtienen como la señal frente al tiempo de vuelo de los iones hacia el detector. A continuación, el tiempo de vuelo se relaciona con la masa del ión mediante una función de calibración, por ejemplo, el tiempo de vuelo es una función lineal de la raíz cuadrada de la masa del ión. En un espectrómetro de masas de resonancia ciclotrónica de iones con transformada de Fourier (FTICR, por sus siglas en inglés), los datos primarios se obtienen esencialmente en forma de la intensidad de señal en función de la frecuencia ciclotrónica y a continuación la frecuencia se relaciona con la masa del ión mediante una función de calibración.

En varias realizaciones, se predicen estructuras potenciales de glicanos para una o más señales de masa asociadas con un glicano y las estructuras predichas se comparan para determinar qué señales de masa pueden proceder de glicanos similares y se utilizan para determinar qué proporciones de las intensidades de las señales [M+2]/[M] se comparan. Por ejemplo, se puede comparar el grupo de familias de los glicanos predichos para establecer el grado de similitud.

En varias realizaciones, dos glicanos son similares cuando pertenecen a la misma familia de glicanos. En varias realizaciones, dos glicanos son similares cuando las masas de los glicanos son de ± 20% (por ejemplo, de ± 15%, ± 10%, ± 5%) la una de la otra. En varias realizaciones preferidas, dos glicanos son similares cuando pertenecen a la misma familia de glicanos y las masas de los glicanos son de ± 20% (por ejemplo, de ± 15%, ± 10%, ± 5%) la una de la otra.

Los ejemplos de familias de glicanos incluyen, sin carácter limitante, (a) monosacáridos, (b) polisacáridos, (c) glicanos ramificados, (d) glicanos lineales, (e) glicanos unidos a través de N, (f) glicanos unidos a través de O, etc. Los ejemplos de varias familias de glicanos unidos a través de N incluyen, sin carácter limitante, (a) la familia A2 (oligosacáridos unidos a través de N biantenarios disialilados, incluidos los glicanos A1 (oligosacáridos unidos a través de N biantenarios monosialilados), glicanos NA2 (oligosacáridos unidos a través de N biantenarios sin restos sialilo), glicanos NGA2 (oligosacáridos unidos a través de N biantenarios sin restos sialilo ni galactilo), glicanos M3N2, etc.); (b) la familia A2F (oligosacáridos unidos a través de N biantenarios disialilados con núcleo de fucosa, incluidos los glicanos A1F (oligosacáridos unidos a través de N biantenarios monosialilados con núcleo de fucosa), glicanos NA2F (oligosacáridos unidos a través de N biantenarios sin restos sialilo y con núcleo de fucosa), glicanos NGA2F (oligosacáridos unidos a través de N biantenarios disialilados sin restos sialilo ni galactilo y con núcleo de fucosa), etc.); (c) la familia A3 (por ejemplo, glicanos completamente sialilados en los restos galactosilo terminales no reductores, pero que se diferencian en la distribución de restos sialilo unidos en a2,3 y a2,6, y en la unión de una de las galactosas; incluidos los glicanos NA3 (oligosacáridos unidos a través de N triantenarios y sin restos sialilo derivados de un glicano A3) y los glicanos NGA3 (oligosacáridos unidos a través de N triantenarios y sin restos galactilo derivados de un glicano NA3), etc.); (d) la familia A4 (glicanos derivados de oligosacáridos unidos a través de N tetraantenarios, incluidos los glicanos NA4 (oligosacáridos unidos a través de N tetraantenarios sin restos sialilo), glicanos NGA4 (oligosacáridos unidos a través de N tetraantenarios sin restos sialilo ni galactilo derivados de glicanos NA4), etc.); y (e) la familia de glicanos oligomanosa (por ejemplo, los glicanos Man-5, Man-6, Man-7, Man8, Man-9, etc.).

Por ejemplo, compare los espectros de masas de las Figuras 3A y B de dos glicanos A3 similares, el N-glicano complejo NeuAc1 Fuc1 Gal1 Man3 GlcNAc5 Sulfato2, Figura 3A, y el glicano unido a través de N complejo NeuAc1 Fuc1 Gal3 Man3 GlcNAc5, Figura 3B. Según indican los diagramas de la Figuras 3A y B, ambos glicanos comparten una estructura A3 y, más concretamente, un estructura de familia NGA3F. Además, los dos glicanos representados tienen masas que difieren en aproximadamente el 7% la una de la otra.

En varias realizaciones, los métodos comprenden someter una porción de una mezcla de glicanos a un análisis con una técnica de espectrometría de masas, donde los picos de masa identificados como procedentes de un glicano sulfatado se someten a más de una dimensión analítica para determinar la presencia de azufre. En varias realizaciones, los picos de masa identificados como procedentes de un glicano sulfatado se someten a un análisis de MS/MS, por ejemplo, empleando disociación inducida por colisión (CID, por sus siglas en inglés) para determinar la presencia de azufre.

Los métodos de las invenciones de la presente se pueden llevar a cabo con una amplia variedad de instrumentos y técnicas de espectrometría de masas, incluidos, sin carácter limitante, MALDI-TOF-MS, MALDI-TOF-TOF-MS, LCMS, LC-MS/MS, mediante ESI-MS de infusión directa, etc. Se prefiere el uso de un espectrómetro de masas de alta resolución, por ejemplo, de una resolución mejor de aproximadamente 1 uma.

Se pueden utilizar una amplia variedad de técnicas para ionizar las moléculas de la mezcla de glicanos que se someten al análisis, incluidas, sin carácter limitante, la ionización por desorción mediante láser asistida por matriz (MALDI, por sus siglas en inglés) y la ionización por electronebulización (ESI). Se suele preferir que la fuente y las condiciones de ionización se seleccionen para prevenir sustancialmente la escisión de los grupos sulfato en la fuente del espectrómetro de masas.

Los métodos de la presente descripción se pueden aplicar a los glicanos obtenidos a partir de una amplia variedad de fuentes, incluidas, sin carácter limitante, las formulaciones terapéuticas y las muestras biológicas. Según se utiliza en la presente, la expresión “muestra biológica” se refiere a cualquier muestra sólida o fluida obtenida de, o bien excretada o secretada por, cualquier célula u organismo vivo, incluidos, sin carácter limitante, los cultivos de tejidos, tejidos humanos o animales, plantas, frutas, vegetales, microorganismos unicelulares (tales como bacterias y levaduras) y organismos multicelulares. Por ejemplo, una muestra biológica puede ser un fluido biológico obtenido a partir de, por ejemplo, sangre, plasma, suero, orina, bilis, fluido seminal, fluido cerebroespinal, humor vítreo o acuoso, o cualquier secreción corporal, un trasudado, un exudado (por ejemplo, el fluido obtenido de un absceso o cualquier otro punto de infección o inflamación) o un fluido obtenido a partir de una articulación (por ejemplo, una articulación normal o un articulación afectada por una enfermedad tal como artritis reumatoide, osteoartritis, gota o artritis séptica). Una muestra biológica también puede ser, por ejemplo, una muestra obtenida a partir de un órgano

o tejido (incluida una muestra de una biopsia o autopsia), puede comprender células (tanto células primarias como células cultivadas), medio acondicionado por cualquier célula, tejido u órgano, y cultivo de tejidos.

En varias realizaciones, los métodos facilitan la detección de estructuras de glicano sulfatadas presentes en una mezcla en niveles bajos. Por ejemplo, en varias realizaciones, se pueden detectar estructuras de glicano sulfatadas que están presentes en niveles bajos de femtomoles (fmol).

En varias realizaciones, los métodos de la presente descripción se pueden utilizar para ampliar el intervalo dinámico de una técnica de espectrometría de masas para la detección de glicanos sulfatados. Por ejemplo, en varias realizaciones, los métodos se pueden utilizar para detectar la presencia de uno o más productos indeseados o contaminantes en un preparado farmacéutico o terapéutico, presentes en unas concentraciones cuatro órdenes de magnitud por debajo de la concentración global de glicanos en la muestra. En varias realizaciones, los métodos se pueden utilizar para monitorizar un proceso de obtención de un preparado farmacéutico o terapéutico para detectar concentraciones bajas de glicanos sulfatados indeseados, por ejemplo, antes de que contaminen el preparado farmacéutico o terapéutico. En varias realizaciones, los métodos se pueden utilizar para detectar biomarcadores que indican, por ejemplo, un estadio de una enfermedad, antes de que aparezcan los síntomas y/o que el estadio de la enfermedad evolucione para dar lugar a una afección menos tratable o intratable, mediante la detección de uno o más glicanos sulfatados específicos y/o el cambio de la concentración de dichos glicanos en función del tiempo.

Aplicaciones

Se sobreentenderá que las técnicas descritas en la presente se pueden utilizar en varias aplicaciones. En general, estas técnicas son útiles en cualquier aplicación que implique la caracterización estructural de glicanos sulfatados, particularmente cuando sea deseable distinguir glicanos sulfatados de otros glicanos.

Los métodos de la presente descripción se pueden aplicar a glicanos obtenidos a partir de una amplia variedad de fuentes, incluidas, sin carácter limitante, las formulaciones terapéuticas y las muestras biológicas. Una muestra biológica puede someterse a uno o más análisis y/o pasos de purificación antes o después de ser analizada de acuerdo con la presente descripción. Para dar solamente unos pocos ejemplos, en algunas realizaciones, una muestra biológica se trata con una o más proteasas y/o glicosidasas (por ejemplo, para que se liberen los glicanos); en algunas realizaciones, los glicanos de una muestra biológica se marcan con uno o más marcadores detectables u otros agentes que puedan facilitar el análisis mediante, por ejemplo, espectroscopia de masas o RMN. Se pueden aplicar varios pasos de separación y/o aislamiento a una muestra biológica de acuerdo con la presente descripción.

Los métodos de la presente descripción se pueden utilizar para analizar glicanos que se encuentren en varios estados, por ejemplo, glicanos libres, glicoconjugados (por ejemplo, glicopéptidos, glicolípidos, proteoglicanos, etc.), glicanos asociados a la célula (por ejemplo, glicanos asociados a la membrana celular, al citoplasma, al núcleo, etc.); glicanos asociados con componentes celulares, extracelulares, intracelulares y/o subcelulares (por ejemplo, proteínas); glicanos en el espacio extracelular (por ejemplo, un medio de cultivo celular), etc.

Los métodos de la presente descripción se pueden utilizar en uno o más estadios del desarrollo del proceso de producción de un preparado terapéutico u otra glicoproteína de interés comercialmente relevante. Los ejemplos sin carácter limitante de dichos estadios del desarrollo del proceso que pueden utilizar los métodos de la presente descripción incluyen la selección celular, selección clonal, optimización del medio, condiciones de cultivo, condiciones del proceso y/o procedimiento de purificación. Los expertos en la materia conocerán otros estadios del desarrollo del proceso.

La presente descripción también se puede utilizar para monitorizar el grado y/o el tipo de glicosilación que tiene lugar en un cultivo celular particular, de manera que se pueda ajustar o posiblemente terminar el cultivo para, por ejemplo, obtener un patrón de glicosilación deseado particular o para evitar el desarrollo de un patrón de glicosilación indeseado particular.

La presente descripción también se puede utilizar para evaluar las características de glicosilación de células o líneas celulares que se vayan a utilizar en la producción de una glicoproteína deseada particular (por ejemplo, incluso antes de que las células o líneas celulares se hayan modificado para producir la glicoproteína, o para producir la glicoproteína a una escala comercialmente relevante).

Por ejemplo, cuando la glicoproteína objetivo sea una glicoproteína terapéutica, por ejemplo, que haya sido sometida a una revisión regulatoria en uno o más países, a menudo será deseable monitorizar los cultivos para evaluar la posibilidad de que generen un producto con un patrón de glicosilación tan parecido como sea posible al patrón de glicosilación establecido para el producto farmacéutico, tanto si se produce mediante exactamente la misma ruta como si no. Según se utiliza en la presente, “parecido” se refiere a un patrón de glicosilación con una correlación de al menos aproximadamente el 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99% con el patrón de glicosilación establecido para el producto farmacéutico. En dichas realizaciones, se suelen tomar muestras del cultivo de producción en múltiples tiempos y se comparan con un estándar establecido o con un cultivo de control para evaluar la glicosilación relativa.

En algunas realizaciones de la presente descripción, un patrón de glicosilación deseado será más extenso. Por ejemplo, en algunas realizaciones, un patrón de glicosilación deseado muestra una ocupación elevada de los sitios de glicosilación (por ejemplo, superior a aproximadamente el 60%, a aproximadamente el 65%, a aproximadamente el 70%, a aproximadamente el 75%, a aproximadamente el 80%, a aproximadamente el 85%, a aproximadamente el 90%, a aproximadamente el 95%, a aproximadamente el 98%, a aproximadamente el 99% o superior); en algunas realizaciones, un patrón de glicosilación deseado muestra un grado elevado de ramificación (por ejemplo, más de aproximadamente el 60%, de aproximadamente el 65%, de aproximadamente el 70%, de aproximadamente el 75%, de aproximadamente el 80%, de aproximadamente el 85%, de aproximadamente el 90%, de aproximadamente el 95%, de aproximadamente el 98%, de aproximadamente el 99% o más tienen estructuras tri- o tetraantenarias).

En algunas realizaciones de la presente descripción, un patrón de glicosilación deseado será menos extenso. Por ejemplo, en algunas realizaciones, un patrón de glicosilación de la superficie celular deseado muestra una ocupación baja de los sitios de glicosilación (por ejemplo, inferior a aproximadamente el 50%, a aproximadamente el 45%, a aproximadamente el 40%, a aproximadamente el 35%, a aproximadamente el 30%, a aproximadamente el 25%, a aproximadamente el 20%, a aproximadamente el 15%, a aproximadamente el 10%, a aproximadamente el 5%, a aproximadamente el 1% o inferior); y/o un grado bajo de ramificación (por ejemplo, menos de aproximadamente el 20%, de aproximadamente el 15%, de aproximadamente el 10%, de aproximadamente el 5%, de aproximadamente el 1% o menos tienen estructuras tri- o tetraantenarias).

En algunas realizaciones, un patrón de glicosilación deseado será más extenso en algunos aspectos y menos extenso en otros. Por ejemplo, puede ser deseable emplear una línea celular que tenga tendencia a producir glicoproteínas con cadenas de oligosacáridos largas y no ramificadas. Como alternativa, puede ser deseable emplear una línea celular que tenga tendencia a producir glicoproteínas con cadenas de oligosacáridos cortas y muy ramificadas.

En algunas realizaciones, se enriquecerá un patrón de glicosilación deseado para un tipo particular de estructura de glicano. Por ejemplo, en algunas realizaciones, un patrón de glicosilación deseado tendrá niveles bajos (por ejemplo, inferiores a aproximadamente el 20%, a aproximadamente el 15%, a aproximadamente el 10%, a aproximadamente el 5%, a aproximadamente el 1% o inferiores) de estructuras híbridas o de alto contenido en manosa, niveles elevados (por ejemplo, superiores a aproximadamente el 60%, a aproximadamente el 65%, a aproximadamente el 70%, a aproximadamente el 75%, a aproximadamente el 80%, a aproximadamente el 85%, a aproximadamente el 90%, a aproximadamente el 95%, a aproximadamente el 98%, a aproximadamente el 99% o superiores) de estructuras de alto contenido en manosa, niveles elevados (por ejemplo, superiores a aproximadamente el 60%, a aproximadamente el 65%, a aproximadamente el 70%, a aproximadamente el 75%, a aproximadamente el 80%, a aproximadamente el 85%, a aproximadamente el 90%, a aproximadamente el 95%, a aproximadamente el 98%, a aproximadamente el 99% o superiores; por ejemplo, al menos una por glicoproteína) de estructuras fosforiladas de alto contenido en manosa, o niveles bajos (por ejemplo, inferiores a aproximadamente el 20%, a aproximadamente el 15%, a aproximadamente el 10%, a aproximadamente el 5%, a aproximadamente el 1% o inferiores) de estructuras fosforiladas de alto contenido en manosa.

En algunas realizaciones, un patrón de glicosilación deseado incluirá al menos aproximadamente un ácido siálico. En algunas realizaciones, un patrón de glicosilación deseado incluirá un nivel elevado (por ejemplo, superior a aproximadamente el 60%, a aproximadamente el 65%, a aproximadamente el 70%, a aproximadamente el 75%, a aproximadamente el 80%, a aproximadamente el 85%, a aproximadamente el 90%, a aproximadamente el 95%, a aproximadamente el 98%, a aproximadamente el 99% o superior) de restos terminales sialilados. En algunas realizaciones, un patrón de glicosilación deseado que incluya sialilación mostrará al menos aproximadamente el 85%, aproximadamente el 90%, aproximadamente el 95%, aproximadamente el 98%, aproximadamente el 99% o más de ácido N-acetilneuramínico y/o menos de aproximadamente el 20%, de aproximadamente el 15%, de aproximadamente el 10%, de aproximadamente el 5%, de aproximadamente el 1% o menos de ácido Nglicolilneuramínico.

En algunas realizaciones, un patrón de glicosilación deseado muestra especificidad en la elongación de las ramificaciones (por ejemplo, más de aproximadamente el 60%, de aproximadamente el 65%, de aproximadamente el 70%, de aproximadamente el 75%, de aproximadamente el 80%, de aproximadamente el 85%, de aproximadamente el 90%, de aproximadamente el 95%, de aproximadamente el 98%, de aproximadamente el 99%

o más de la extensión está en ramificaciones de manosa α1,6; o más de aproximadamente el 60%, de aproximadamente el 65%, de aproximadamente el 70%, de aproximadamente el 75%, de aproximadamente el 80%, de aproximadamente el 85%, de aproximadamente el 90%, de aproximadamente el 95%, de aproximadamente el 98%, de aproximadamente el 99% o más de la extensión está en ramificaciones de manosa α1,3).

En algunas realizaciones, un patrón de glicosilación deseado incluirá un nivel bajo (por ejemplo, inferior a aproximadamente el 20%, a aproximadamente el 15%, a aproximadamente el 10%, a aproximadamente el 5%, a aproximadamente el 1% o inferior) o un nivel elevado (por ejemplo, superior a aproximadamente el 60%, a aproximadamente el 65%, a aproximadamente el 70%, a aproximadamente el 75%, a aproximadamente el 80%, a aproximadamente el 85%, a aproximadamente el 90%, a aproximadamente el 95%, a aproximadamente el 98%, a aproximadamente el 99% o superior) de fucosilación en el núcleo.

En algunas realizaciones, un patrón de glicosilación deseado incluirá un nivel bajo (por ejemplo, inferior a aproximadamente el 20%, a aproximadamente el 15%, a aproximadamente el 10%, a aproximadamente el 5%, a aproximadamente el 1% o inferior) o un nivel elevado (por ejemplo, superior a aproximadamente el 60%, a aproximadamente el 65%, a aproximadamente el 70%, a aproximadamente el 75%, a aproximadamente el 80%, a aproximadamente el 85%, a aproximadamente el 90%, a aproximadamente el 95%, a aproximadamente el 98%, a aproximadamente el 99% o superior) de un glicano sulfatado.

En algunas realizaciones, un patrón de glicosilación deseado incluirá un nivel bajo (por ejemplo, inferior a aproximadamente el 20%, a aproximadamente el 15%, a aproximadamente el 10%, a aproximadamente el 5%, a aproximadamente el 1% o inferior) o un nivel elevado (por ejemplo, superior a aproximadamente el 60%, a aproximadamente el 65%, a aproximadamente el 70%, a aproximadamente el 75%, a aproximadamente el 80%, a aproximadamente el 85%, a aproximadamente el 90%, a aproximadamente el 95%, a aproximadamente el 98%, a aproximadamente el 99% o superior) de un glicano fosforilado.

En algunas realizaciones, un patrón de glicosilación deseado incluirá un nivel bajo (por ejemplo, inferior a aproximadamente el 20%, a aproximadamente el 15%, a aproximadamente el 10%, a aproximadamente el 5%, a aproximadamente el 1% o inferior) o un nivel elevado (por ejemplo, superior a aproximadamente el 60%, a aproximadamente el 65%, a aproximadamente el 70%, a aproximadamente el 75%, a aproximadamente el 80%, a aproximadamente el 85%, a aproximadamente el 90%, a aproximadamente el 95%, a aproximadamente el 98%, a aproximadamente el 99% o superior) de un ácido siálico unido a una N-acetilglucosamina.

En algunas realizaciones, un patrón de glicosilación deseado incluirá un nivel bajo (por ejemplo, inferior a aproximadamente el 20%, a aproximadamente el 15%, a aproximadamente el 10%, a aproximadamente el 5%, a aproximadamente el 1% o inferior) o un nivel elevado (por ejemplo, superior a aproximadamente el 60%, a aproximadamente el 65%, a aproximadamente el 70%, a aproximadamente el 75%, a aproximadamente el 80%, a aproximadamente el 85%, a aproximadamente el 90%, a aproximadamente el 95%, a aproximadamente el 98%, a aproximadamente el 99% o superior) de un glicano acetilado.

Tanto si se monitoriza la producción de una proteína objetivo particular con fines de control de calidad como si no, la presente descripción se puede utilizar, por ejemplo, para monitorizar la glicosilación en estadios particulares del desarrollo o en condiciones de crecimiento particulares.

5 En algunas realizaciones particulares, los métodos descritos en la presente se pueden utilizar para caracterizar y/o controlar o comparar la calidad de productos terapéuticos. Para dar solamente un ejemplo, las metodologías de la presente se pueden utilizar para evaluar la glicosilación en células que producen un producto proteico terapéutico. Concretamente, dado que la glicosilación puede afectar a menudo a la actividad, biodisponibilidad u otras características de un producto proteico terapéutico, los métodos para evaluar la glicosilación celular durante la

10 producción de dicho producto proteico terapéutico son particularmente deseables. Entre otras cosas, la presente descripción puede facilitar los análisis a tiempo real de la glicosilación en sistemas de producción de proteínas terapéuticas.

Los productos glicoproteicos terapéuticos representativos, cuya producción y/o calidad se puede monitorizar de

15 acuerdo con la presente descripción, incluyen, por ejemplo, varios agentes hematológicos (que incluyen, por ejemplo, eritropoyetinas, factores que coagulan la sangre, etc.), interferones, factores estimulantes de colonias, anticuerpos, enzimas y hormonas.

Los productos glicoproteicos terapéuticos representativos que se pueden adquirir de proveedores comerciales 20 incluyen, por ejemplo:

Producto proteico

Fármaco de referencia

interferón gamma-1b

Actimmune®

alteplasa; activador tisular del plasminógeno

Activase®/Cathflo®

factor antihemofílico recombinante

Advate

albúmina humana

Albuterin®

laronidasa

Aldurazyme®

interferón alfa-N3, derivado de leucocitos humanos

Alferon N®

factor antihemofílico humano

Alphanate®

factor IX de coagulación humano filtrado con un filtro contra virus

AlphaNine® SD

alefacept; proteína de fusión dimérica recombinanate LFA3-Ig

Amevive®

bivalirudina

Angiomax®

darbepoetina alfa

AranespTM

bevacizumab

AvastinTM

interferón beta-1a; recombinante

Avonex®

factor de coagulación IX

BeneFixTM

interferón beta-1b

Betaseron®

tositumomab

Bexxar®

factor antihemofílico

BioclateTM

hormona del crecimiento humano

BioTropinTM

toxina botulínica tipo A

Botox

alemtuzumab

Campath®

acritumomab; marcado con tecnecio-99

CEA-Scam®

alglucerasa; forma modificada de la beta-glucocerebrosidasa

Ceredase®

imiglucerasa; forma recombinante de la beta-glucocerebrosidasa

Cerezyme®

crotalidae polivalente inmune Fab, ovino

CroFabaTM

digoxina inmune Fab, ovino

DigiFabTM

rasburicasa

Elitek®

etanercept

Enbrel®

epoyetina alfa

Epogen®

Producto proteico

Fármaco de referencia

cetuximab

ErbituxTM

algasidasa beta

Fabrazyme®

urofolitropina

Fertinex®

folitropina beta

FollistimTM

teriparatida

Forteo®

somatropina humana

GenoTropin®

glucagón

GlucaGen®

folitropina alfa

Gonal-F®

factor antihemofílico

Helixate®

factor antihemofílico; factor XIII

Hemofil®

insulina

Humalog®

complejo humano de factor antihemofílico/factor von Willebrand

Humate-P®

somatotropina

Humatrope®

adalimumab

HUMIRA®

insulina humana

Humulin®

hialuronidasa humana recombinante

HylenexTM

interferón alfacón-1

Infergen®

eptifibatida

IntergrilinTM

alfa-interferón

Intron A®

palifermina

Kepivance

anakinra

KineretTM

factor antihemofílico

Kogenate®FS

insulina glargina

Lantus®

factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos

Leukine®/Leukine® Líquido

lutropina alfa, para inyección

Luveris

lipoproteína OspA

LYMErixTM

ranibizumab

Lucentis®

gemtuzumab ozogamicina

MylotargTM

galsulfasa

NaglazymeTM

nesiritida

Natrecor®

pegfilgrastim

NeulastaTM

oprelvekin

Neumega®

filgrastim

Neupogen®

fanolesomab

NeutroSpecTM (anteriormente LeuTech®)

somatropina [ADNr]

Norditropin®/Norditropin Nordiflex®

insulina; suspensión de zinc

Novolin L®

insulina; suspensión isofánica

Novolin N®

insulina, normal

Novolin R®

insulina

Novolin®

factor de coagulación VIIa

NovoSeven®

somatropina

Nutropin®

inmunoglobulina intravenosa

Octagam®

Producto proteico

Fármaco de referencia

PEG-L-asparaginasa

Oncaspar®

abatacept, proteína de fusión soluble completamente humana

OrenciaTM

muromomab-CD3

Orthoclone OKT3®

gonadotropina coriónica humana

Ovidrel®

peginterferón alfa-2a

Pegasys®

versión pegilada del interferón alfa-2b

PEG-IntronTM

abarelix (suspensión inyectable); antagonista de la hormona liberadora de gonadotropinas

PlenaxisTM

epoyetina alfa

Procrit®

aldesleukina

Proleukin, IL-2®

somatrem

Protropin®

dornasa alfa

Pulmozyme®

efalizumab; bloqueador de células T reversible selectivo

RaptivaTM

combinación de ribavirina e interferón alfa

RebetronTM

interferón beta 1a

Rebif®

factor antihemofílico

Recombinate®

factor antihemofílico/FAHr

ReFacto®

lepirudina

Refludan®

infliximab

Remicade®

abciximab

ReoProTM

reteplasa

RetavaseTM

rituximab

RituxanTM

interferón alfa-2a

Roferon-A®

somatropina

Saizen®

secretina porcina sintética

SecreFloTM

basiliximab

Simulect®

eculizumab

Soliris®

pegvisomant

Somavert®

palivizumab; AcM humanizado producido por recombinación

SynagisTM

tirotropina alfa

Thyrogen®

tenecteplasa

TNKasaTM

natalizumab

Tysabri®

soluciones de inmunoglobulina humana intravenosa al 5% y al 10%

Venoglobulin-S®

interferón alfa-n1, linfoblasto

Wellferon®

drotrecogina alfa

XigrisTM

omalizumab; anticuerpo monoclonal humanizado derivado de ADN recombinante que actúa sobre la inmunoglobulina E

Xolair®

daclizumab

Zenapax®

ibritumomab tiuxetán

ZevalinTM

somatotropina

ZorbtiveTM (Serostim®)

En algunas realizaciones, la descripción proporciona métodos en los cuales se comparan glicanos de diferentes fuentes o muestras entre sí. En algunos de estos ejemplos, se obtienen múltiples muestras de la misma fuente en

13

función del tiempo, para monitorizar los cambios en los patrones de glicosilación (y concretamente en los patrones de glicosilación de la superficie celular). En algunas realizaciones, una de las muestras es una muestra antigua o un registro de una muestra antigua.

En algunas realizaciones, se comparan glicanos de muestras de diferentes cultivos celulares preparados en condiciones que difieren en uno o más parámetros seleccionados (por ejemplo, el tipo de célula, tipo de cultivo [por ejemplo, alimentación en continuo frente a alimentación en lotes, etc.], condiciones de cultivo [por ejemplo, tipo de medio, presencia o concentración de un componente particular de un (unos) medio(s) particular(es), osmolaridad, pH, temperatura, tiempo o grado de cambio de uno o más componentes tales como la osmolaridad, el pH, la temperatura, etc.], tiempo de cultivo, pasos de aislamiento, etc.) pero que son idénticos por lo demás, para determinar los efectos del parámetro seleccionado sobre los patrones de N-glicosilación. En ciertas realizaciones, se comparan glicanos de muestras de diferentes cultivos celulares preparados en condiciones que difieren en un único parámetro seleccionado, para determinar los efectos del único parámetro seleccionado sobre los patrones de glicosilación. Por lo tanto, entre otras aplicaciones, el uso de las técnicas según se describe en la presente puede facilitar la determinación de los efectos de parámetros particulares sobre los patrones de glicosilación en las células.

En algunas realizaciones, se comparan glicanos de diferentes lotes de una glicoproteína de interés (por ejemplo, una glicoproteína terapéutica), tanto si se han preparado mediante el mismo método o mediante métodos diferentes, y tanto si se han preparado simultáneamente o de forma separada. En dichas realizaciones, la presente descripción facilita el control de calidad del preparado de glicoproteínas. Como alternativa o de manera adicional, algunas de estas realizaciones facilitan la monitorización del progreso de un cultivo particular que produce una glicoproteína de interés (por ejemplo, cuando se toman muestras del cultivo en diferentes tiempos y se analizan y comparan entre sí). En algunos ejemplos, se obtienen múltiples muestras de una misma fuente en función del tiempo, para monitorizar los cambios de los patrones de glicosilación. En algunas realizaciones, se toman muestras que contienen glicanos en intervalos de aproximadamente 30 segundos, de aproximadamente 1 minuto, de aproximadamente 2 minutos, de aproximadamente 5 minutos, de aproximadamente 10 minutos, de aproximadamente 30 minutos, de aproximadamente 1 hora, de aproximadamente 2 horas, de aproximadamente 3 horas, de aproximadamente 4 horas, de aproximadamente 5 horas, de aproximadamente 10 horas, de aproximadamente 12 horas o de aproximadamente 18 horas, o en intervalos incluso más largos. En algunas realizaciones, las muestras que contienen glicanos se toman en intervalos irregulares. En algunas realizaciones, las muestras que contienen glicanos se toman en intervalos de 5 horas.

Los métodos de la presente descripción se pueden utilizar en uno o más estadios del desarrollo del proceso de producción de una glicoproteína terapéutica u otra glicoproteína comercialmente relevante de interés. Los ejemplos sin carácter limitante de dichos estadios del desarrollo del proceso que pueden utilizar los métodos de la presente descripción incluyen la selección celular, selección clonal, optimización del medio, condiciones de cultivo, condiciones del proceso y/o procedimiento de purificación. Los expertos en la materia conocerán otros estadios del desarrollo del proceso.

En cualquiera de estas realizaciones, se pueden registrar las características del análisis de los glicanos, por ejemplo, en un registro de control de calidad. Según se ha indicado anteriormente, en algunas realizaciones, la comparación se realiza con un registro antiguo de un lote anterior o estándar y/o con una muestra de referencia de una glicoproteína.

En ciertas realizaciones, la presente descripción se puede utilizar en estudios para modificar las características de glicosilación de una célula, por ejemplo, para establecer una línea celular y/o las condiciones de cultivo con una o más características de glicosilación deseables. A continuación, dicha línea celular y/o condiciones de cultivo se pueden utilizar, si se desea, para producir un glicoconjugado objetivo particular (por ejemplo, una glicoproteína), para el cual se espera que dicha(s) característica(s) de glicosilación sea(n) beneficiosa(s).

En ciertas realizaciones, las técnicas de la presente descripción se aplican a los glicanos presentes en la superficie celular. En algunas de estas realizaciones, los glicanos analizados están sustancialmente exentos de glicanos que no estén en la superficie celular. En algunas de estas realizaciones, los glicanos analizados, cuando estén presentes en la superficie celular, estarán presentes en el contexto de uno o más glicoconjugados de la superficie celular (por ejemplo, glicoproteínas o glicolípidos).

En algunas realizaciones particulares, se analizan los glicanos de la superficie celular para evaluar la glicosilación de una o más glicoproteínas objetivo de interés, particularmente cuando dichas glicoproteínas objetivo no son glicoproteínas de la superficie celular. Dichas realizaciones pueden permitir la monitorización de la glicosilación de una glicoproteína objetivo sin aislar la glicoproteína en sí. En ciertas realizaciones, la presente descripción proporciona métodos de utilización de los glicanos de la superficie celular como una lectura o una representación de las estructuras de glicano en una glicoproteína expresada de interés. En ciertas realizaciones, dichos métodos incluyen, sin carácter limitante, medidas de control de calidad del producto después del proceso, en el lote, de selección o in situ. Dichos métodos pueden proporcionar una medida independiente del patrón de glicosilación de una glicoproteína producida de interés, utilizando un producto secundario de la reacción de producción (por ejemplo, las células) sin necesidad de destruir ninguna glicoproteína producida. Además, los métodos de la presente descripción permiten evitar el esfuerzo necesario para aislar el producto y la selección potencial de glicoformas del producto que puede ocurrir durante el aislamiento.

En ciertas realizaciones, las técnicas de la presente invención se aplican a glicanos que se secretan a partir de las células. En algunas de estas realizaciones, los glicanos analizados son producidos por las células en el contexto de un glicoconjugado (por ejemplo, una glicoproteína o un glicolípido).

De acuerdo con la presente descripción, las técnicas descritas en la presente se pueden utilizar para detectar glicanos deseables o no deseables, por ejemplo, para detectar o cuantificar la presencia de uno o más contaminantes en un producto, o para detectar o cuantificar la presencia de una o más especies activas o deseadas.

En varias realizaciones, los métodos se pueden utilizar para detectar biomarcadores que indican, por ejemplo, un estadio de una enfermedad, antes de que aparezcan los síntomas y/o que el estadio de la enfermedad evolucione para dar lugar a una afección menos tratable o intratable, mediante la detección de uno o más glicanos específicos, cuya presencia o nivel (tanto absoluto como relativo) se puede correlacionar con un estadio particular de la enfermedad (incluida la vulnerabilidad a una enfermedad particular), y/o el cambio de la concentración de dichos glicanos en función del tiempo.

En ciertas realizaciones, los métodos descritos en la presente facilitan la detección de niveles muy bajos de glicanos presentes en una fuente (por ejemplo, una muestra biológica, un preparado de glicanos, etc.). En dichas realizaciones, es posible detectar y/u opcionalmente cuantificar los niveles de glicanos presentes inferiores a aproximadamente el 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1.5%, 1%, 0.75%, 0.5%, 0.25%, 0.1%, 0.075%, 0.05%, 0.025% o 0.01% en una población de glicanos. En algunas realizaciones, es posible detectar y/u opcionalmente cuantificar los niveles de glicanos comprendidos entre el 0.1% y el 5%, por ejemplo, entre el 0.1% y el 2%, por ejemplo, entre el 0.1% y el 1% en un preparado de glicanos. En ciertas realizaciones, es posible detectar y/u opcionalmente cuantificar los niveles de glicanos de la superficie celular de entre aproximadamente 0.1 fmol y aproximadamente 1 mmol.

En algunas realizaciones, los métodos descritos en la presente permiten detectar niveles bajos de uniones particulares presentes en una población de glicanos. Por ejemplo, los métodos de la presente permiten detectar uniones particulares presentes en niveles inferiores al 10%, inferiores al 5%, inferiores al 4%, inferiores al 3%, inferiores al 2%, inferiores al 1.5%, inferiores al 1%, inferiores al 0.75%, inferiores al 0.5%, inferiores al 0.25%, inferiores al 0.1%, inferiores al 0.075%, inferiores al 0.05%, inferiores al 0.025% o inferiores al 0.01% en una población de glicanos.

En algunas realizaciones, los métodos descritos en la presente permiten detectar niveles relativos de especies de glicanos individuales en una población de glicanos. Por ejemplo, el área debajo de cada pico de un cromatógrafo líquido se puede medir y expresar como un porcentaje del total. Este tipo de análisis proporciona una cantidad porcentual relativa de cada especie de glicano en una población de glicanos.

En algunas realizaciones, las técnicas descritas en la presente se pueden combinar con una o más tecnologías diferentes para detectar, analizar y/o aislar glicanos o glicoconjugados. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, los glicanos se analizan de acuerdo con la presente descripción utilizando uno o más métodos disponibles (para obtener solamente unos pocos ejemplos, remítase a Anal. Biochem. 350(1):1, 2006 de Anumula; Anal. Biochem. 179:162, 1989 de Klein et al.; y/o Carbohydrate Analysis” High Performance Liquid Chromatography and Capillary Electrophoresis, Ed. Z. E1 Rassi, páginas 181-209, 1995 de Townsend, R.R.). Por ejemplo, en algunas realizaciones, los glicanos se caracterizan utilizando uno o más de los siguientes: métodos cromatográficos, métodos electroforéticos, métodos de resonancia magnética nuclear y combinaciones de estos. Los ejemplos de estos métodos incluyen, por ejemplo, RMN, espectrometría de masas, cromatografía líquida, cromatografía bidimensional, SDS-PAGE, marcaje de anticuerpos, marcaje de lectina, cuantificación de monosacáridos, electroforesis capilar, electroforesis de carbohidratos asistida por fluoróforos (FACE), cromatografía electrocinética micelar (MEKC), tratamientos con exoglicosidasas o endoglicosidasas y combinaciones de estos. Los expertos en la materia conocen otros métodos que se pueden utilizar para caracterizar glicanos, junto con los métodos IMAC descritos en la presente.

En algunas realizaciones, la estructura y la composición de los glicanos se pueden analizar mediante métodos cromatográficos, que incluyen, sin carácter limitante, cromatografía líquida (LC), cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), cromatografía líquida de ultra resolución (UPLC), cromatografía de capa fina (TLC), cromatografía en columna de amidas y combinaciones de estas.

En algunas realizaciones, la estructura y la composición de los glicanos se pueden analizar mediante espectroscopia de masas (MS) y métodos relacionados, que incluyen, sin carácter limitante, MS combinada, LC-MS, LC-MS/MS, espectroscopia de masas de ionización por desorción mediante láser asistida por matriz (MALDI-MS), espectroscopia de masas con transformada de Fourier (FTMS), separación por movilidad de iones con espectrometría de masas (IMS-MS), disociación de transferencia electrónica (ETD-MS), y combinaciones de estos.

En algunas realizaciones, la estructura y la composición de los glicanos se pueden analizar mediante métodos electroforéticos, que incluyen, sin carácter limitante, electroforesis capilar (CE), CE-MS, electroforesis en gel, electroforesis en gel de agarosa, electroforesis en gel de acrilamida, electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE) seguida de un análisis Western blot utilizando anticuerpos que reconocen estructuras de glicanos específicas, y combinaciones de estos.

En algunas realizaciones, la estructura y la composición de los glicanos se pueden analizar mediante resonancia magnética nuclear (RMN) y métodos relacionados, que incluyen, sin carácter limitante, RMN unidimensional (RMN 1D), RMN bidimensional (RMN 2D), espectroscopia de RMN de correlación con giro del ángulo magnético (RMN COSY), espectroscopia de RMN de correlación total (RMN TOCSY), RMN heteronuclear de coherencia cuántica única (RMN HSQC), RMN heteronuclear de coherencia cuántica múltiple (RMN HMQC), espectroscopia de RMN con efecto rotacional nuclear Overhauser (RMN ROESY), espectroscopia de efecto nuclear Overhauser (RMN NOESY) y combinaciones de estos.

Ejemplos

Ejemplo 1: Identificación de un glicano sulfatado en una mezcla

En varias realizaciones, los métodos de la presente descripción se pueden aplicar a mezclas de glicanos. Por ejemplo, se prepara una mezcla de glicanos para ESI utilizando un disolvente portador de metanol:agua, que puede contener un tampón adecuado, ácido, etc. A continuación, la mezcla de glicanos se introduce en el aparato de ESIMS (por ejemplo, un instrumento API-III o API QSTARTM de MDS Sciex/Applied Biosystems, un instrumento LCQTM Classic de ThermoFinnigan, etc., que opera en modo de ión positivo) de manera sustancialmente continuada, tal como mediante cromatografía líquida o inyección a baja presión con un estándar de calibración de masas. El espectro de masas generado se simplifica para múltiples cargas y el espectro simplificado se analiza con un software de detección de picos. Se selecciona una ventana de masas de interés y se identifican los picos como señales de glicanos potenciales por comparación con masas de glicanos predichas teóricamente. Para cada pico de glicano por encima de un cierto umbral, se determina la señal de cualquier pico en [M+2] y se calcula la proporción de [M+2]/[M]. A continuación, los picos de glicanos con una proporción de [M+2]/[M] mayor con relación a uno o más glicanos similares diferentes se identifican como glicanos sulfatados.

Las Figuras 3A y 3B proporcionan un ejemplo de dichos datos y dicha comparación. La proporción de [M+2]/[M] de un pico de glicano de un glicano sulfatado (N-glicano complejo NeuAc1 Fuc1 Gal1 Man3 GlcNAc5 Sulfato2) que aparece en la ventana de masas de aproximadamente 2265 uma a aproximadamente 2297 uma se compara con la proporción de [M+2]/[M] de un pico de glicano de un glicano no sulfatado (glicano unido a través de N complejo NeuAc1 Fuc1 Gal3 Man3 GlcNAc5) en la ventana de masas de aproximadamente 2430 uma a aproximadamente 2462 uma. La proporción de [M+2]/[M] del glicano sulfatado fue de aproximadamente 0.091 (o del 91%) y la de un glicano similar no sulfatado fue de aproximadamente 0.75 (75%), y la proporción de [M+2]/[M] del glicano sulfatado fue mayor que la proporción de [M+2]/[M] del glicano no sulfatado en un valor de aproximadamente 0.16 en y a la vez en un factor superior a aproximadamente 1.2, de manera que se identificó el glicano en la ventana de aproximadamente 2265 uma a aproximadamente 2297 uma como un glicano sulfatado.

REFERENCIAS

(1)

Jiang, Hui; Irungu, Janet; Desaire, Heather. “Enhanced detection of sulfated glycosylation sites in glycoproteins”,

J.

Amer. Soc. Mass Spectrom. (2005), 16(3), páginas 340-348.

(2)

Irungu, Janet; Dalpathado, Dilusha, S.; Go, Eden P.; Jiang, Hui; Ha, Hy-Vy; Bousfield, George R.; Desaire, Heather. “Method for Characterizing Sulfated Glycoproteins in a Glycosylation Site-Specific Fashion, Using Ion Pairing and Tandem Mass Spectrometry”, Anal. Chem. (2006), 78(4), páginas 1181-1190.

(3)

Balagurunathan Kuberan, Miroslaw Lech, Lijuan Zhang, Zhengliang L. Wu, David L. Beeler y Robert D. Rosenberg. “Analysis of Heparan Sulfate Oligosaccharides with Ion Pair-Reverse Phase Capillary High Performance Liquid Chromatography-Microelectrospray Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry”, J. Am. Chem. Soc. (2002), 124, páginas 8707-8718.

(4)

Shi, D.-H. Stone, Hendrickson, Chistopher L. y Marshall, Alan G. “Counting individual sulfur atoms in a protein by ultrahigh-resolution Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry: Experimental resolution of isotopic fine structure in proteins”, Proc. Natl. Acad. Sci. (1998), 95, páginas 11532-11537.

Los encabezados de las secciones utilizados en la presente tienen solamente fines organizativos y no se deben interpretar en ningún caso como limitantes del contenido descrito.

Claims (18)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un método para identificar glicanos sulfatados en una mezcla de glicanos, que comprende los pasos de:

   proporcionar un espectro de masas para una mezcla de glicanos; determinar, para múltiples pares de picos de masa en el espectro de masas separados por dos unidades de masa,

   [M] y [M+2], la proporción de las intensidades de las señales [M+2]/[M] para cada par; e identificar un pico de masa asociado con un primer glicano como el de un glicano sulfatado cuando al menos la proporción de [M+2]/[M] asociada con el primer glicano sea mayor que la proporción de [M+2]/[M] asociada con los picos de masa que corresponden a uno o más glicanos similares mediante un umbral seleccionado.

2. 2.

   El método de la reivindicación 1, donde la mezcla de glicanos comprende uno o más de los siguientes: glicanos libres, glicanos derivatizados, glicanos tratados enzimáticamente, glicanos que son productos de escisión y glicanos unidos a una proteína, péptido o lípido sustancialmente intactos, y mezclas que comprenden combinaciones de estos.

3. 3.

   El método de la reivindicación 1, donde la mezcla de glicanos comprende glicanos sulfatados y glicanos fosforilados.

4. 4.

   El método de la reivindicación 1, que comprende identificar la presencia de un glicano específico de interés cuando al menos la proporción de [M+2]/[M] asociada con el pico de masa del glicano específico es mayor que la proporción de [M+2]/[M] asociada con los picos de masa que corresponden a uno o más glicanos similares mediante un umbral seleccionado.

5. 5.

   El método de la reivindicación 1, donde dichos glicanos similares son sustancialmente de la misma familia de glicanos que el primer glicano.

6. 6.

   El método de la reivindicación 1, donde dichos glicanos similares tienen masas de aproximadamente ± el 20% de la masa del primer glicano.

7. 7.

   El método de la reivindicación 1, donde el umbral seleccionado es una proporción de [M+2]/[M] asociada con el primer glicano que es aproximadamente 1.1 veces mayor que la proporción de [M+2]/[M] de uno o más de los glicanos similares.

8. 8.

   El método de la reivindicación 1, donde el umbral seleccionado es una proporción de [M+2]/[M] asociada con el primer glicano que es mayor que la proporción de [M+2]/[M] de uno o más de los glicanos similares en un valor de aproximadamente 0.02.

9. 9.

   El método de la reivindicación 1, donde los glicanos se definen como carbohidratos (monosacáridos o polisacáridos), lineales o ramificados, libres o liberados a partir de glicoproteínas, proteoglicanos y glicolípidos de muestras tales como: formulaciones terapéuticas, fluidos corporales (tales como suero, plasma, saliva, fluido seminal, orina, fluido cerebroespinal, etc.), material de la superficie celular, matriz extracelular, material intracelular, cultivo tisular, bioreactores, tejidos animales o humanos, plantas, frutas o verduras.

10. 10.

    El método de la reivindicación 1, donde la intensidad de la señal se define como la intensidad de un pico de masa, el área total debajo de un pico de masa o un porcentaje del área debajo de un pico de masa.

11. 11.

    Un método para identificar glicanos sulfatados en una mezcla de glicanos, que comprende los pasos de:

    proporcionar un espectro de masas para una mezcla de glicanos; determinar, para múltiples pares de picos de masa en el espectro de masas separados por dos unidades de masa,

    [M] y [M+2], la proporción de las intensidades de las señales [M+2]/[M] para cada par; e identificar un pico de masa como procedente de un glicano sulfatado en función de al menos la distribución de las proporciones de [M+2]/[M] de tres o más glicanos similares.

12. 12.

    El método de la reivindicación 11, donde el paso de identificación de un pico de masa como procedente de un glicano sulfatado comprende identificar como glicanos sulfatados los picos de masa que presentan unas proporciones de [M+2]/[M] con la moda de valor más elevado de una distribución bimodal de las proporciones de [M+2]/[M] para tres o más glicanos similares.

13. 13.

    El método de la reivindicación 11, donde la mezcla de glicanos comprende uno o más de los siguientes: glicanos libres, glicanos derivatizados, glicanos tratados enzimáticamente, glicanos que son productos de escisión y glicanos unidos a una proteína, péptido o lípido sustancialmente intactos, y mezclas que comprenden combinaciones de estos.

14. 14.

    El método de la reivindicación 11, donde la mezcla de glicanos comprende glicanos sulfatados y glicanos fosforilados.

15. 15.

    El método de la reivindicación 11, que comprende identificar la presencia de un glicano específico de interés

    5 cuando al menos la proporción de [M+2]/[M] asociada con el pico de masa del glicano específico es mayor que la proporción de [M+2]/[M] asociada con los picos de masa que corresponden a uno o más glicanos similares mediante un umbral seleccionado.
16. 16. El método de la reivindicación 11, donde uno o más glicanos similares son sustancialmente de la misma familia 10 de glicanos que el primer glicano.
17. 17. Un método para identificar glicanos sulfatados en una mezcla de glicanos, que comprende los pasos de: proporcionar un espectro de masas para una mezcla de glicanos; determinar, para al menos un par de picos de masa en el espectro de masas separados por dos unidades de masa, [M] y [M+2], la proporción de las intensidades

    15 de las señales [M+2]/[M]; e identificar un pico de masa asociado con el glicano como el de un glicano sulfatado cuando al menos la proporción de [M+2]/[M] asociada con el glicano sea similar a la proporción de [M+2]/[M] de un espectro de masas generado por ordenador para un glicano sulfatado teórico.
18. 18. El método de la reivindicación 17, donde la proporción de [M+2]/[M] determinada asociada con el glicano es

    20 similar a la proporción de [M+2]/[M] de un espectro de masas generado por ordenador para un glicano sulfatado teórico, cuando la proporción de masa determinada y la generada por ordenador difieren en hasta ± el 20% la una de la otra.