ES2355980T3 - Polipeptidos para ensamblaje oligomerico de antigenos. - Google Patents

Abstract

Un polipéptido que comprende: (a) un dominio antigénicos; (b) un dominio de oligomerización; y (c) un dominio transmembrana, en el que los dominios (a), (b) y (c) no se encuentran todos juntos en el mismo polipéptido en la naturaleza y en el que el dominio (b) es un dominio de superenrollamiento de la adhesina NadA de Neisseria meningitidis.

Description

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se encuentra en el campo de la presentación de antígenos. Más particularmente, se refiere a la modificación de proteínas para permitir su expresión en forma oligomérica, por ejemplo, en la superficie de una célula. 5

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Muchos polipéptidos que son naturalmente inmunogénicos pierden esta propiedad cuando se expresan de forma recombinante. En algunos casos el polipéptido nativo tiene elementos estructurales que no se forman durante la expresión en un huésped heterólogo, por ejemplo, las modificaciones post-traduccionales pueden ser incorrectas, las interacciones intermoleculares que influyen en la conformación puede perderse, etc. Una causa adicional de 10 inmunogenicidad perdida es cuando un polipéptido (por ejemplo, un polipéptido expuesto en superficie) es oligomérico de forma natural y cuando esta estructura cuaternaria se requiere para inmunogenicidad (por ejemplo, cuando el polipéptido tiene epítopos que se presentan solamente cuando está presente una estructura oligomérica cuaternaria específica). La pérdida de estructura oligomérica puede significar que la proteína monomérica es menos inmunógena que su homólogo oligomérico nativo. 15

En otros casos el polipéptido nativo puede ser un polipéptido transmembrana que no es susceptible de expresión en un huésped recombinante. Estos problemas con frecuencia vistos cuando van a expresarse polipéptidos de eucariotas (incluyendo los de virus de eucariotas) en procariotas. Un modo de mejorar la expresión de polipéptidos transmembrana virales es retirar sus dominios transmembrana y expresar solamente los dominios extracelulares antigénicos {1}. Sin embargo, esta tecnología de “receptor soluble” sufre de nuevo pérdida de estructura cuaternaria. Si 20 existe un receptor nativo en una forma oligomérica en la superficie de un virus y la oligomerización surge de secuencias en la región transmembrana, el receptor soluble perderá su capacidad de oligomerizar y esta pérdida puede tener consecuencias funcionales, por ejemplo, pérdida de señalización o de avidez. La pérdida de actividad de unión, incluso aunque se conserve afinidad de unión, es un problema particular para antígenos, por ejemplo, los usados en vacunas.

Se han desvelado técnicas para proteínas que oligomerizan en las referencias 2 y 3. 25

Es objeto de la presente invención proporcionar modos de mejorar la expresión de polipéptidos y particularmente de polipéptidos antigénicos, por ejemplo, para conservar su estructura oligomérica.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

La invención se basa en un sistema para la expresión de polipéptidos antigénicos en forma oligomérica. El polipéptido antigénico se fusiona con un polipéptido de oligomerización de modo que el polipéptido de oligomerización 30 puede interaccionar con otros polipéptidos de oligomerización y proporcionar múltiples copias del polipéptido antigénico en proximidad estrecha en forma de un oligómero. La expresión de los polipéptidos en forma oligomérica de este modo puede mejorar su inmunogenicidad en comparación con una forma monomérica.

De este modo la invención proporciona un procedimiento para expresar un polipéptido de interés en una forma oligomérica recombinante, en el que el polipéptido de interés se fusiona con un polipéptido de oligomerización de modo 35 que puede asociarse una pluralidad de dominios de oligomerización para presentar el polipéptido de interés en forma oligomérica. En particular, el procedimiento puede aplicarse (a) para presentar el polipéptido oligomerizado en la superficie de una membrana, pero incluyendo una secuencia transmembrana en la estructura y (b) para presentar el polipéptido oligomerizado mediante el uso de elementos estructurales de una adhesina, tal como una adhesina bacteriana, por ejemplo, la adhesina NadA {4} de Neisseria meningitidis. 40

La invención puede aplicarse a cualquier polipéptido antigénico, incluyendo antígenos virales y no virales. Es particularmente adecuada para expresar polipéptidos de superficie en una forma oligomérica, tal como las partes extracelulares de proteínas de superficie que se encuentran de forma natural en una forma oligomérica. El polipéptido de interés puede ser el polipéptido de longitud completa o, como alternativa, puede ser un fragmento de un polipéptido de longitud completa, por ejemplo puede comprender uno o más dominios del polipéptido de longitud completa. 45

La invención proporciona un polipéptido que comprende: (a) un dominio antigénico; (b) un dominio de oligomerización; y (c) un dominio transmembrana, en el que los dominios (a), (b) y (c) no se encuentran juntos en el mismo polipéptido en la naturaleza (y, en particular, en el que los dominios (a) y (b) no se encuentran juntos en el mismo polipéptido en la naturaleza) y en el que el dominio (6) es un dominio de superenrollamiento de la adhesina NadA de Neisseria Meningitidis. Los dominios están en el orden (a)-(b)-(c), yendo del extremo C terminal al N terminal o del 50 extremo N terminal al C terminal. Es más habitual tener el dominio transmembrana en o cerca del extremo C terminal de la proteína.

La inclusión de un dominio transmembrana en el polipéptido permite que una pluralidad de dominios de oligomerización se asocien para presentar el polipéptido en forma oligomérica en la superficie de una membrana. Además de asociarse mediante sus dominios de oligomerización, los polipéptidos también pueden asociarse mediante interacción de sus dominios transmembrana dentro de una bicapa lipídica, manteniendo de este modo la estructura oligomérica. La inclusión de secuencias transmembrana también puede ayudar en el correcto plegamiento de algunos 5 antígenos. Los multímeros de la referencia 2 se diseñan para evitar la presencia de secuencias transmembrana.

La invención proporciona un polipéptido que comprende: (a) un dominio antigénico; y (b) un dominio de oligomerización de una adhesina, en el que los dominios (a) y (b) no se encuentran juntos en el mismo polipéptido en la naturaleza y en el que el dominio (b) es un dominio de superenrollamiento de la NadA de Neisseno meningitides. Los dominios están en el orden (a)-(b), yendo del extremo C terminal al N terminal o del extremo N terminal al C terminal. El 10 polipéptido generalmente incluirá secuencias además de (a) y (b). Para la presentación en superficie de polipéptidos antigénicos, por ejemplo, la invención generalmente implicará el uso de un dominio transmembrana además de un dominio de oligomerización, como se ha descrito anteriormente. La adhesina es preferentemente una adhesina bacteriana, más preferentemente una adhesina “Oca” y más preferentemente la adhesina NadA de Neisseria Meningitidis. 15

DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La Figura 1 ilustra la estructura de un monómero E2 de coronavirus SRAS.

La Figura 2 ilustra los dominios dentro de la proteína NadA de meningococos {4}.

La Figura 3 ilustra los dominios dentro de la proteína gp120 Env de VIH. La Figura 4 ilustra dominios dentro de NadA. La Figura 5 muestra proteínas híbridas que comprenden regiones tanto de Env como de NadA. La 20 Figura 6 muestra la composición de las construcciones de gp120-NadA (824aa) y gp140-NadA (741 aa).

La Figura 7 transferencias de Western de E. coli que expresan gp120-NadA y gp140-NadA.

La Figura 8 muestra SDS-PAGE de E.coli que expresa gp120-NadA y gp140-NadA.

Las Figuras 9-11 muestran análisis de FACS de E.coli que expresan gp120-NadA o gp140-NadA.

La Figura 12 muestra unión a CD4 dependiente de dosis por E.coli que expresa gp140-NadA. 25

Las Figuras 13-14 muestran el número de E.coli que expresan gp140-NadA que se unen a CD4.

La Figura 15 muestra análisis de FACS de unión a CD4 por E.coli que expresan gp140-NadA, con o sin preincubación con gp140 puro.

Las Figuras 16 y 17 muestran análisis de HPLC de complejos CD4/Env.

La Figura 18 muestra titulaciones de anticuerpos anti-gp140V2 según se determinaron mediante ELISA. La 30 línea horizontal punteada muestra la titulación pre-sangrado. Las flechas en el eje X muestran cuando se administraron las dosis de sensibilización y la “B” muestra la dosis de refuerzo. Las cuatro líneas de datos son, desde la parte superior a la inferior: el control negativo (-); OMV-gp140-NadA (■); OMV-gp120-NadA y gp140 (▲); y el control positivo de gp140 (•).

DESCRIPCIÓN DE LA LISTA DE SECUENCIAS 35

SEC ID Nº.

Descripción

1

Proteína de pico E2 de coronavirus de SRAS. Se muestran el péptido líder y el anclaje de membrana.

2

Dominio de cabeza globular de SEC ID Nº: 1

3-9

Híbridos NadA-gp 120

10

Secuencia gp140V2, expresada del péptido líder de NadA.

11

Péptido líder de NadA de meningococos (29 aa)

12

Secuencia de gp120 (475 aa)

13

Tronco de NadA (263 aa)

14

Engarce dipeptídico Gly-Ser (2 aa)

15

Anclaje de NadA (55 aa)

16

gp120V2 (448 aa)

17

Gp4 (171 aa)

18

Engarce dipeptídico Lys-Leu (2 aa)

19

Anclaje prolongado de NadA (74 aa)

20

Anclaje prolongado de NadA (108 aa)

21

Proteína 287 de Neisseria meningitidis

22

Proteína 936 de Neisseria meningitidis

23-25

Proteína 741 de Neisseria meningitidis (tres alelos)

26

Proteína 953 de Neisseria meningitidis

27

Engarce rico en Gly.

28

NadA

29

HadA

30

YadA

31

UspA2

32-33

Híbridos gp120-NadA

34-35

Híbridos gp140-NadA

36

gp120

37-38

Secuencias de trombina

39

gp140

40

Anclaje prolongado de NadA

41

SEC ID Nº: 13 + SEC ID Nº: 15

42-58

Adhesinas de la referencia 71

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

La invención expresa un antígeno de interés en forma de un polipéptido que comprende un dominio antigénico del antígeno y un dominio de oligomerización heteróloga. Los dominios de oligomerización en polipéptidos monoméricos individuales pueden asociarse y dar como resultado la formación de un oligómero en el que se presentan múltiples copias del dominio antigénico de interés próximas entre sí. 5

La invención se basa en parte en el principio de que las proteínas naturales pueden dividirse en dominios de plegamiento autónomo y que estos dominios pueden separarse y recombinarse sin pérdida de su función esencial {5,6}. De este modo el dominio de oligomerización, el dominio antigénico y cualquier otro dominio opcional (por ejemplo, dominios transmembrana, secuencias señal, etc.) pueden seleccionarse de acuerdo con su función y después combinarse sin pérdida de esa función. 10

Dominios de oligomerización

Un dominio de oligomerización es una secuencia de aminoácidos dentro de un polipéptido de la invención que forma una estructura que puede interaccionar con dominios de oligomerización (el mismo o diferentes) en otros polipéptidos (el mismo o diferentes) de modo que los polipéptidos se asocian de forma no covalente para formar oligómeros. 15

Los oligómeros de proteínas de origen natural (tanto hetero-oligómeros como homo-oligómeros) se asocian de una diversidad de maneras diferentes, por ejemplo, por asociación de láminas  en diferentes monómeros, por asociación de hélices  en diferentes monómeros, por asociación de parches de superficie hidrófobos, etc.

Un motivo estructural común implicado en la oligomerización de proteínas es el dominio de superenrollamiento. El motivo estructural de  hélice enrollado puede por sí mismo formar enrollamientos y dos, tres, cuatro o cinco hélices  5 pueden envolverse entre sí para formar una súper-hélice levógira conocida como el “superenrollamiento” {7-13}. La simplicidad del dominio de superenrollamiento le ha convertido en una selección popular para el diseño de proteínas quiméricas con estados de oligomerización definidos {10}.

En una estructura de superenrollamiento las hélices  interaccionan a través de restos hidrófobos que forman una banda apolar a lo largo de un lateral de cada hélice y también puede haber interacciones electrostáticas de 10 estabilización entre cadenas laterales en ambos lados de esta banda. Dentro de la repetición en héptada abcdefg de una hélice , la banda apolar se define por cadenas laterales hidrófobas en los restos a y d, estando cualquier interacción electrostática principalmente en los restos e y g. La posición a es más frecuentemente Leu, Ile o Ala y la posición d es habitualmente Leu o Ala. Los restos e y g son con frecuencia Glu o Gln, siendo Arg y Lys también prominentes en la posición g. Los restos cargados son comunes en las posiciones b, c y f puesto que estos restos están 15 en contacto con el disolvente. Existen excepciones a este patrón de héptada general, sin embargo, y a veces se encuentran restos de Pro dentro de la héptada. Dichas excepciones habitualmente tienen una significación funcional.

En la técnica se conocen cientos de secuencias de dominio de superenrollamiento y puede usarse cualquier secuencia adecuada como un motivo de oligomerización con la invención, siempre que mantenga la capacidad de oligomerizar con otros dominios de superenrollamiento y que no destruya la función de los otros dominios dentro del 20 polipéptido. Se prefiere usar un dominio de superenrollamiento que se encuentre extracelularmente {14} y que actúe de forma natural como un dominio de oligomerización. Como alternativa a usar un dominio de superenrollamiento natural, pueden usarse dominios de superenrollamiento artificiales {15, 16}. El dominio (b) puede incluir una secuencia de cremallera de leucina o una secuencia de cremallera de alanina {17}.

El dominio de superenrollamiento usado en el polipéptido de la invención es preferentemente uno que forma un 25 trímero, de modo que el polipéptido de la invención también pueda ensamblarse en un trímero.

Son dominios de superenrollamiento preferidos los que se toman de proteínas transmembrana bacterianas. Un subconjunto preferido de proteínas transmembrana son las adhesinas (es decir, proteínas de superficie celular que median la adhesión con otras células o superficies) y particularmente adhesinas no fimbriales (por ejemplo, en la familia de adhesinas de superenrollamiento de oligomerización u “Oca”). Son secuencias transmembrana específicas las de la 30 adhesina de Yersinia enterocolitica YadA {69; por ejemplo, SEC ID Nº 30 en el presente documento u otras formas polimórficas en las bases de datos de secuencias}, la adhesina de Neisseria meningitidis NadA {4; por ejemplo, SEC ID Nº 28 en el presente documento, u otras formas polimórficas, por ejemplo, véase referencia 18}, proteína de superficie de Moraxella catarrhalis UspA2 {19,70; por ejemplo, SEC ID Nº 31 en el presente documento u otras formas polimórficas en las bases de datos de secuencias} y otras adhesinas, tales como la adhesina HadA de Haemophilus influenzae 35 biogrupo aegyptius {71; SEC ID Nº 29 en el presente documento} y las otras adhesinas desveladas como SEC ID Nº 42 a 58. De este modo el dominio (b) en el polipéptido de la invención puede comprender un fragmento de una de las secuencias de aminoácidos SEC ID Nº: 28 a 31 o 42 a 58 en el presente documento o puede comprender un fragmento de una secuencia de aminoácidos que tiene al menos m % de identidad con una o más de la SEC ID Nº 28-31 o 42-58, siendo m 50 o más (por ejemplo, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99,5 o más). El fragmento 40 puede ser al menos n aminoácidos consecutivos de una o más de las SEC ID Nº 28-31 ó 42-58, siendo n 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más). Estos polipéptidos incluyen variantes (por ejemplo, variantes alélicas, homólogos, ortólogos, parálogos, mutantes, etc.) de las SEC ID Nº 28-31 ó 42-58. Se prefiere usar adhesinas de dentro de las SEC ID Nº 28-31 y 42-58 en las que el límite entre la región de cabeza y las regiones de superenrollamiento se conoce. 45

Dentro de la secuencia de aminoácidos de un polipéptido que tiene una región de superenrollamiento, la naturaleza de repetición de héptadas de las hélices  significa que el límite del dominio de superenrollamiento puede determinarse con cierta precisión, pero el resto preciso en el que puede decirse que una disposición de superenrollamiento termina no se puede conocer con absoluta precisión. Esta falta de precisión absoluta no es un problema para practicar la invención, sin embargo, puesto que ensayos rutinarios pueden revelar si el 50 superenrollamiento requiere algún resto aminoacídico particular para el que pueda haber dudas. Incluso en ese caso, la invención no requiere que se conozcan los límites con precisión absoluta, puesto que el único requisito básico para la invención es que el dominio de superenrollamiento debería funcionar de un modo que permita al polipéptido oligomerizar con otros dominios de superenrollamiento sin destruir la función de los otros dominios dentro del polipéptido. Dentro de NadA, los límites del dominio de superenrollamiento se proporcionan en la referencia 4. 55

Otra clase de dominio de oligomerización que puede usarse con la invención se encuentra en la triple hélice

levógira conocida como la hélice de colágeno {20}. Estas secuencias que forman triple hélice implican una secuencia de repetición tripeptídica básica de 1Gly - 2Xaa - 3Xaa, en la que 2Xaa es con frecuencia Pro y 3Xaa es con frecuencia 4-hidroxiprolina. Aunque este motivo se conoce como la hélice de “colágeno”, se encuentra en muchas proteínas además del colágeno. El dominio de oligomerización puede por lo tanto ser una secuencia que comprende múltiples repeticiones del motivo de secuencia 1Gly - 2Xaa - 3Xaa, plegándose dicho motivo para formar una estructura helicoidal que puede 5 oligomerizar con las estructuras helicoidales correspondientes en otras cadenas polipeptídicas.

El colágeno también proporciona otra clase de dominio de oligomerización. La referencia 21 describe un motivo que se encuentra en el dominio no de colágeno 1 (NC1) del colágeno tipo X y este motivo puede usarse para la formación de trímeros y multímeros de mayor orden sin una triple hélice. Esta asociación trimérica es altamente termoestable sin enlaces disulfuro intermoleculares. El dominio de oligomerización puede por lo tanto comprender una 10 secuencia NC1.

Los dominios de oligomerización usados con la invención generalmente pueden mantener una estructura oligomérica sin la necesidad de formación de puentes disulfuro intermonoméricos, pero los oligómeros que contienen monómeros enlazados por disulfuro no se excluyen de la invención.

El dominio antigénico 15

Un dominio antigénico es una secuencia de aminoácidos dentro de un polipéptido de la invención que forma una estructura que puede unirse a un anticuerpo. El dominio antigénico se dispone de modo que no evite la actividad de oligomerización de un dominio de oligomerización asociado.

El domino antigénico del polipéptido puede derivar de cualquier antígeno polipeptídico adecuado. La invención puede usarse para preparar formas oligoméricas de polipéptidos que no son oligoméricos de forma natural o para 20 expresar de forma recombinante polipéptidos en una forma que imita su ensamblaje oligomérico natural. La invención puede usarse para presentar oligómeros de superficie de polipéptidos que se presentan de forma natural en una superficie celular o puede usarse para presentar polipéptidos no de superficie en un contexto de superficie. La invención puede usarse para presentar polipéptidos de bacterias, plantas, animales así como de virus.

La invención es particularmente adecuada para su uso con antígenos de superficie y/o antígenos que forman 25 de forma natural oligómeros. Los antígenos bacterianos y virales son fuentes preferidas de dominios antigénicos.

Un grupo preferido de antígenos son las glucoproteínas de superficie virales y en particular las de virus con envoltura. Las proteínas de superficie de virus con envoltura incluyen un domino transmembrana y un dominio extraviral (ectodominio), localizándose los determinantes antigénicos principales en la parte extraviral. Como se ha mencionado anteriormente se sabe que separa el dominio extraviral del dominio transmembrana {1} para proporcionar una forma 30 soluble del antígeno de membrana. De acuerdo con la presente invención el domino extraviral puede separarse del dominio transmembrana y recombinarse con dominios de aminoácidos heterólogos. Son dominios antigénicos preferidos para su uso con la invención dominios extraviarles de proteínas de superficie de virus con envoltura.

Las proteínas virales particulares de interés incluyen:

- Glucoproteínas de envoltura de retrovirus. Los retrovirus incluyen lentivirus y espumavirus. Los virus de interés 35 incluyen HTLV-I, HTLV-II, virus de la inmunodeficiencia felina (VIF), virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), virus de la inmunodeficiencia de simios (VIS), espumavirus del chimpancé y espumavirus humano. La glucoproteína Env de VIH tiene una región de fusión de superenrollamiento trimérico {22} y es de particular interés.

- Las glucoproteínas de envoltura de paramixoviridae, tales como las proteínas F. Paramixoviridae incluye (a) el 40 Paramixovirinae, que incluye Paramixovirus, Rubulavirus y Morbillivirus y (b) el Pneumovirinae, que incluye los Pneumovirus. Los virus de interés incluyen virus paragripal (PIV), paramixovirus humano, virus de la peste bovina, virus de la peste ovina, virus del sarampión, virus de las paperas, virus respiratorio sincitial (VRS), Virus Nipah, Virus Hendra, Morbilivirus Equino (MVE), Lyssavirus y virus de Menangle. Las glucoproteínas F de paramixovirus {23}, virus del sarampión {24} y VRS {25,26,27} tienen regiones de fusión de superenrollamiento 45 trimérico y son de particular interés.

- Las glucoproteínas de envoltura de filoviridae. Filoviridae incluye los virus Marburg y Ébola. La proteína Gp del virus Ébola forma trímeros de superenrollamiento {28} y es de particular interés.

- Las glucoproteínas de envoltura de ortomixoviridae. Ortomixoviridae incluye el virus de la gripe y los virus thogoto. La proteína hemaglutinina (HA) es la proteína de fusión del virus de la gripe y forma un trímero {29} 50 con un tallo de superenrollamiento {30}. HA es de particular interés.

- Las glucoproteínas de pico de coronaviridae. Coronaviridae incluye coronavirus y torovirus. Los virus de interés

incluyen los coronavirus humanos, el virus de la bronquitis infecciosa aviar, el virus de la peritonitis infecciosa felina, el virus de la hepatitis Murina, el virus de la diarrea epidémica porcina, el virus de la encéfalomielitis hemaglutinante porcina, virus de la gastroenteritis transmisible porcina y virus Berne. La proteína de pico (E2) de coronavirus de SRAS humano es una proteína de fusión viral de clase I {31} que se cree que forma trímeros y puede ser de interés. 5

- Las glucoproteínas de envoltura de rhabdoviridae. Rhabdoviridae incluye Rabdovirus, Vesiculovirus, Lyssavirus, Ephemerovirus, Cytorhabdovirus y Nucleorhabdovirus. Los virus de interés incluyen virus de la estomatitis vesicular, virus de la rabia, virus mokola, virus de la fiebre efímera bovina. Las proteínas G del virus de la rabia {32,33}, lisavirus {34} y virus mokola {34} forman trímeros en la superficie viral y son de particular interés.

- Las glucoproteínas de envoltura de togaviridae. Togaviridae incluye Alfavirus y Rubivirus. Los virus de interés 10 incluyen virus Sindbis, virus de la encefalitis del Este y del Oeste, virus del Bosque de Semliki, virus de la rubéola, virus Aura, virus Babanki, virus del Bosque de Barmah avis-A, virus bebaru, virus Buggy Creek, virus chikungunya, virus Everglades, virus Fort Morgan, virus getah, virus Highlands J, virus Kyzylagach, virus Mayaro, virus Middelburg, virus Mucambo, virus Ndumu, virus Ockelbo, virus o‟nyong-nyong, virus Pixuna, virus del Rio Ross, virus Sagiyama, virus Una, virus de la encefalitis equina de Venezuela y virus Whataroa. La 15 proteína de pico E1 del virus del Bosque de Semliki forma estructuras de superenrollamiento triméricas {35} y es responsable de fusión y por lo tanto es de interés particular.

- Las glucoproteínas de envoltura („E‟) de flaviviridae {36}. Flaviviridae incluye Flavivirus, Pestivirus y Hepacivirus. Los virus de interés incluyen el virus dengue, virus de la hepatitis C, virus de la fiebre amarilla, virus de la encefalitis japonesa, virus del Nilo occidental, virus de la encefalitis de San Luis, virus de la diarrea 20 bovina y virus de la encefalitis transmitida por garrapatas (TBE). Las proteínas E del virus del nilo occidental {37}, virus dengue {38}, virus de la fiebre amarilla {38} y virus de TBE {39} forman estructuras triméricas en la superficie viral y son de particular interés.

- Las glucoproteínas de envoltura de bunyaviridae. Bunyaviridae incluye Bunyavirus, Nairovirus, Flebovirus, Hantavirus y Tospovirus. Los virus de interés incluyen bunyavirus, virus de Bunyamwera, virus de la encefalitis 25 de California, virus La Cross, virus Hantaan, virus Sin Nombre, virus de la fiebre hemorrágica de Crimea, virus Siciliano de la fiebre de los flebótomos y virus de la fiebre del valle del Rift. Las proteínas de nucleocápsida de hantavirus forman superenrollamientos triméricos {40} y son de particular interés.

- Las glucoproteínas de envoltura de arenaviridae. Arenaviridae incluye virus de la coriomeningitis linfocítica, virus ippy y virus lassa. 30

Estas proteínas pueden usarse en cualquier forma conocida por ejemplo, forma nativa, forma mutante, forma truncada, forma delecionada, etc. Por ejemplo, se conocen diversas formas de las proteínas Env de VIH, incluyendo proteínas modificadas y con dominio delecionado y todas estas diversas formas pueden usarse con la invención.

Cuando una proteína viral se presenta de forma natural en una forma escindida (por ejemplo gp160 en VIH, escindida a gp120/gp41; proteína de pico en coronavirus, escindida a S1/S2; etc.), la invención preferentemente usa al 35 producto escindido N terminal o la región extracelular como domino antigénico.

Dentro del grupo de las proteínas de superficie virales, un subgrupo preferido es el de los antígenos que forman oligómeros de forma natural en la superficie viral. Son antígenos particularmente preferidos las proteínas de fusión viral (o proteínas de pico), que habitualmente deben estar en forma oligomérica para ser fusogénicamente activas {41}. La invención proporciona una forma de presentar las partes antigénicas de estas proteínas en una forma oligomérica 40 nativa. Los dominios antigénicos preferidos para su uso con la invención son por lo tanto los dominios de cabeza globular de proteínas de fusión viral de virus con envoltura.

Las proteínas de fusión viral se describen habitualmente en términos de un domino de tronco y un domino de cabeza globular. El domino de cabeza extraviral contiene los determinantes antigénicos y el dominio de tronco transmembrana ancla la proteína a la envoltura del virión y media el ensamblaje trimérico nativo mediante sus motivos 45 de superenrollamiento. En el virión nativo el dominio de tronco y de cabeza pueden estar asociados de forma no covalente o covalente. Estos pueden formarse mediante escisión proteolítica de un polipéptido precursor, permaneciendo los productos de escisión asociados en la superficie del virión.

La proteína de pico E2 del coronavirus de SRAS es un polipéptido de fusión viral y su dominio de cabeza globular S1 puede usarse como un domino antigénico. Varias secuencias genómicas para la proteína E2 están 50 disponibles y la SEC ID Nº: 1 en el presente documento es una secuencia preferida. La cabeza globular dentro de SEC ID Nº: 1 está en torno a los restos 14 a 662 (SEC ID Nº: 2). De este modo el dominio (a) en el polipéptido de la invención puede comprender la secuencia de aminoácidos SEC ID Nº: 2 en el presente documento o puede comprender una secuencia de aminoácidos: (i) que tiene al menos m% de identidad con la SEC ID Nº: 2, siendo m 50 o más (por

ejemplo, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99,5 o más); y/o (ii) que es un fragmento de al menos n aminoácidos consecutivos de SEC ID Nº: 2, en el que n es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más). Estos polipéptidos incluyen variantes (por ejemplo, variantes alélicas, homólogos, ortólogos, parálogos, mutantes, etc.) de SEC ID Nº: 2. Los fragmentos preferidos de (ii) comprenden un epítopo de SEC ID Nº: 2, preferentemente un epítopo de linfocitos B. Los epítopos de linfocitos B 5 pueden identificarse de forma empírica o pueden predecirse por algoritmos. Otros fragmentos preferidos de (ii) carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo C terminal y/o uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 45 o más) del extremo N terminal de la secuencia de aminoácidos relevante de SEC ID Nº: 2.

Dentro de la secuencia de aminoácidos de un polipéptido de fusión viral, el límite del dominio de cabeza 10 globular puede no conocerse con precisión absoluta, pero esto no es un problema para practicar la invención. La secuencia globular puede identificarse inicialmente aproximadamente y después, si es necesario, pueden determinarse sus límites ensayando la antigenicidad de la primera aproximación con y sin restos aminoacídicos cercanos. Incluso en tal caso la invención no requiere que los límites se conozcan con absoluta precisión, puesto que el único requisito básico para la invención es que la secuencia deba funcionar de modo que conserve los determinantes antigénicos relevantes 15 de la proteína viral sin destruir la función de los otros dominios dentro del polipéptido viral sin destruir la función de los otros dominios dentro del polipéptido. La inclusión de aminoácidos de cabeza no globular extraños no perjudicará generalmente a esta función básica.

Otro grupo preferido de antígenos son proteínas de superficie bacteriana. Las bacterias específicas cuyas proteínas de superficie pueden manipularse por expresión oligomérica de acuerdo con la invención son: Neisseria 20 meningitidis, particularmente el serogrupo B; Neisseria gonorrhoeae; Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes; Streptococcus agalactiae; Staphylococcus aureus; Haemophilus influenzae, incluyendo tipo b y cepas no tipables; Moraxella catarrhalis; Helicobacter pylori; Chlamydia trachomatis; Chlamydia pneumoniae; Corynebacterium diphtheriae; Clostridium tetani; Bordetella pertussis; etc. La invención generalmente usará la reacción antigénica extracelular de una proteína de superficie bacteriana, omitiéndose cualquier secuencia transmembrana bacteriana. La 25 secuencia transmembrana de una proteína de superficie bacteriana puede identificarse fácilmente (si está presente) basándose en un reconocimiento de patrón, análisis de secuencia y homología.

El dominio (a) en el polipéptido de la invención puede comprender cualquiera de las siguientes secuencias de aminoácidos específicas o puede comprender una secuencia de aminoácidos: (i) que tiene al menos m% de identidad con una o más de las siguientes secuencias de aminoácidos, siendo m 50 o más (por ejemplo, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 30 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99,5 o más); y/o (ii) que es un fragmento de al menos n aminoácidos consecutivos de las siguientes secuencias de aminoácidos, en el que n es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más):

- Cuando el domino antigénico deriva de un antígeno de N. meningitidis, el domino (a) puede basarse en una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEC ID Nº: 21 a 26. 35

- Cuando el dominio antigénico deriva de un antígeno de S. pneumoniae, el domino (a) puede basarse en una secuencias de aminoácidos seleccionada de PhtA, PhtD, PhtB, PhtE, SpsA, LytB, LytC, LytA, Sp125, Sp101, Sp128, Sp130 y Sp133, como se desvela en la referencia 42.

- Cuando el dominio antigénico deriva de un antígeno de S. pyogenes o S. agalactiae, el domino (a) puede basarse en una secuencia de aminoácidos seleccionada de las secuencias de aminoácidos de estreptococos 40 desveladas en la referencia 43.

- Cuando el dominio antigénico deriva de un antígeno de S. aureus, el domino (a) puede basarse en una secuencia de aminoácidos seleccionada de las SEC ID pares Nº: 2 a 5642 en la referencia 44.

- Cuando el dominio antigénico deriva de un antígeno de H. influenzae, el domino (a) puede basarse en una secuencia de aminoácidos seleccionada de las SEC ID Nº: 2 a 5080 en la referencia 45. 45

- Cuando el dominio antigénico deriva de un antígeno de M. catarrhalis, el domino (a) puede basarse en una secuencia de aminoácidos seleccionada los antígenos desvelados en las referencias 46 a 58.

Estos polipéptidos incluyen variantes (por ejemplo, variante alélicas, homólogos, ortólogos, parálogos, mutantes, etc.). Los fragmentos preferidos de (ii) comprenden un epítopo de dichas secuencias de aminoácidos, preferentemente un epítopo de linfocitos B. Los epítopos de linfocitos B pueden identificarse de forma empírica o pueden 50 predecirse por algoritmos. Otros fragmentos preferidos de (ii) carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo C terminal y/o uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,10, 15, 20, 25, 45 o más) del extremo N terminal de las secuencias de aminoácidos.

Dentro de la secuencia de aminoácidos de un polipéptido de superficie bacteriana, el límite entre un dominio antigénico extracelular y un dominio transmembrana pueden no conocerse con precisión absoluta, pero esto no es un problema para la práctica de la invención. La secuencia antigénica inicialmente puede identificarse de forma aproximada y después, si es necesario, sus límites pueden determinarse ensayando la antigenicidad de la primera aproximación con y sin restos aminoacídicos cercanos. Incluso así, la invención no requiere que se conozcan los límites con precisión 5 absoluta, puesto que el único requisito básico para la invención es que la secuencia deba funcionar de modo que conserve los determinantes antigénicos relevantes de la proteína bacteriana sin destruir la función de los otros dominios dentro del polipéptido.

El dominio transmembrana

Los polipéptidos de la invención incluirán típicamente un dominio transmembrana que permite al polipéptido 10 localizarse dentro de una bicapa lipídica. Miles de secuencias transmembrana están disponibles para su uso con la invención. En términos generales, el dominio transmembrana de una proteína puede tomarse como una unidad completa y sustituirse por el dominio transmembrana de otra proteína, sin alterar la localización de membrana de la proteína.

Cuando está in situ dentro de una bicapa lipídica, la cadena de aminoácidos del dominio transmembrana 15 pasará a través de la bicapa lipídica al menos una vez, pero puede atravesarla varias veces (paso único o multi-paso). Si atraviesa la bicapa un número impar de veces entonces el comienzo del domino transmembrana estará en el lado opuesto de la bicapa del extremo del dominio transmembrana (y del dominio antigénico); si la atraviesa un número par de veces entonces el comienzo y el fin estarán en el mismo lado.

Los dominios transmembrana típicamente comprenden secuencias -helicoidales, aunque también se conocen 20 secuencias de cadenas  que abarcan membranas, así como secuencias  helicoidales que incluyen hélices formadoras de poros cortos incluidas en la membrana.

Una clase de dominio transmembrana que puede usarse con la invención se encuentra en los receptores de siete hélices transmembrana (familia 7-TMR). Como el nombre sugiere, el domino transmembrana de estas proteínas cruza la bicapa lipídica siete veces. Una base de datos exhaustiva de secuencias de la familia de 7-TMR humana se 25 encuentra en las referencias 59 y 60.

De forma más general, la base de datos de libre acceso TMbase {61,62} incluye detalles de proteínas transmembrana y sus dominios helicoidales que abarcan la membrana. Por el contrario, DB-NTMR {63} es una base de datos de las secuencias no transmembrana de proteínas transmembrana. TMPDB {64,65} es una base de datos de topologías transmembrana caracterizadas experimentalmente que se han determinado mediante cristalografía de rayos 30 X, NMR, técnica de fusión génica, procedimiento de accesibilidad de cisteína sustituida, experimento de glucosilación N-enlazada y otros procedimientos bioquímicos.

Pueden identificarse dominios transmembrana adicionales sometiendo las secuencias de aminoácidos a los muchos algoritmos de predicción de transmembrana que están disponibles, por ejemplo, HMMTOP, TMHMM, TMPred, PHDhtm, DAS, TMFinder, SOSUI, TMAP, MEMSAT y TOPPred2 {66,67}. 35

Dentro de la secuencia de aminoácidos de una proteína transmembrana, el límite del domino transmembrana puede no conocerse con absoluta precisión (por ejemplo, puede no estar claro si un resto aminoacídico particular debería clasificarse como parte de un dominio transmembrana o como parte de un dominio citoplasmático o extracelular), pero esto no es un problema para la práctica de la invención. La secuencia transmembrana puede identificarse inicialmente de forma aproximada y después, si es necesario, pueden determinarse sus límites ensayando 40 la secuencia y las formas truncadas como fusiones. Incluso así, la invención no requiere que se conozcan los límites con precisión absoluta, puesto que el único requisito básico para la invención es que la secuencia deba funcionar de modo que permita al polipéptido localizarse dentro de una bicapa lipídica sin destruir la función de los otros dominios dentro del polipéptido. La inclusión de aminoácidos no transmembrana extraños en uno o ambos lados de la membrana generalmente no perjudica esta función básica de la secuencia transmembrana. 45

Los dominios transmembrana pueden tomarse de polipéptido eucariotas o procariotas (por ejemplo, de plantas, animales, mamíferos, levaduras, bacterias Gram-negativas, bacterias Gram-positivas, virus, etc.) o, como alternativa, pueden usarse dominios transmembrana artificiales {por ejemplo 68}.

Los dominios transmembrana preferidos son los tomados de proteínas transmembrana bacterianas. Un subconjunto preferido de proteínas transmembrana son las adhesinas. Las secuencias transmembrana específicas para 50 su uso con la invención son las de adhesina YadA de Yersinia enterocolitica {69}, adhesina NadA de Neisseria meningitidis {4}, proteína de superficie UspA2 de Moraxella catarrhalis {70} y otras adhesinas {71}, tales como los dominios transmembrana de las SEC ID Nº: 42-58. De este modo el dominio (c) en el polipéptido de la invención puede comprender una de las secuencias de aminoácidos de NadA SEC ID Nº: 15, 19, 20 ó 40 en el presente documento o

puede comprender una secuencia de aminoácidos: (i) que tenga al menos m% de identidad con una o más de SEC ID Nº: 15, 19, 20 ó 40, siendo m 50 o más (por ejemplo, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99,5 o más); y/o (ii) que es un fragmento de al menos n aminoácidos consecutivos de una o más de las SEC ID Nº: 15, 19, 20 ó 40 en el que n es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más). Estos polipéptidos incluyen variantes (por ejemplo, variante alélicas, homólogos, ortólogos, parálogos, mutantes, 5 etc.) de las SEC ID Nº: 15, 19, 20 y 40. Los fragmentos preferidos de (ii) comprenden un epítopo de dichas una o más de las SEC ID Nº: 15, 19, 20 y 40, preferentemente un epítopo de linfocito B. Los epítopos de linfocitos B pueden identificarse de forma empírica o pueden predecirse por algoritmos. Otros fragmentos preferidos de (ii) carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo C terminal y/o uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,10, 15, 20, 25, 45 o más) del extremo N terminal de la secuencia de 10 aminoácidos relevante de la SEC ID Nº: 15, 19, 20 y 40.

Otros dominios transmembrana preferidos son los tomados de la misma proteína como dominio antigénico. De este modo los dominios (a) y (c) pueden ser de la misma proteína, pero siendo el domino de oligomerización de una proteína diferente. Por ejemplo, si el dominio antigénico es de la proteína de envoltura de un virus (por ejemplo VIH) entonces el dominio transmembrana también puede ser de esa proteína de envoltura. 15

Combinaciones preferidas de los dominios (a), (b) y (c)

Para los dominios (a), (b) y (c), se prefiere que al menos uno tenga un origen eucariota y al menos uno tenga un origen procariota. Como alternativa, al menos uno de (a), (b) y (c) puede ser un dominio artificial que no se encuentra en la naturaleza. Un virus se considera que es procariota o eucariota basándose en su huésped natural, por ejemplo, VIH es un eucariota, mientras que un bacteriófago es un procariota. 20

La invención es particularmente adecuada para presentación bacteriana de antígenos eucariotas. Se prefiere por lo tanto que el domino (c) sea de un procariota, tal como una bacteria, y que el dominio (a) sea de un eucariota y más particularmente de un virus eucariota. El domino (b) puede ser de un procariota o un eucariota, pero se prefiere usar una secuencia procariota.

En realizaciones preferidas, los dominios (b) y (c) son de la misma proteína procariota. Los dominios serán por 25 lo tanto con seguridad compatibles entre sí y sin necesidad de confirmación. Las proteínas superficiales bacterianas son una fuente preferida para los dominios (b) y (c), siendo útiles las adhesinas bacterianas. YadA, NadA, UspA2, las adhesinas de referencia 71 son fuentes adecuadas. La adhesina NadA es la más preferida y de este modo los dominios (b) y (c) pueden tener juntos una secuencia de aminoácidos tal como SEC ID Nº: 41.

Un polipéptido particularmente preferido de la invención comprende: (a) un domino antigénico de la proteína de 30 fusión viral de un virus eucariota con envoltura; (b) un dominio de superenrollamiento de una adhesina bacteriana; y (c) un dominio transmembrana de la misma adhesina bacteriana que en (b). Son ejemplos de dichas proteínas, que tienen dominios (b) y (c) de NadA de N. meningitidis y dominio (a) de VIH, las SEC ID Nº: 3, 4, 5, 6, 32 y 33.

Secuencias adicionales

Además de tener dominios (a), (b) y, opcionalmente, (c), los polipéptidos de la invención pueden incluir 35 secuencias adicionales.

Los polipéptidos pueden incluir un péptido líder o señal N terminal para dirigir el tráfico de proteínas. Estas estarán presentes en el polipéptido traducido de nueva síntesis, pero típicamente no estarán presentes en la forma madura del polipéptido, por ejemplo cuando está in situ dentro de un bicapa lipídica. Cuando se va a presentar una proteína en la superficie celular, entonces se prefiere un péptido líder que dirige las proteínas a la membrana en el 40 huésped de expresión. Para la expresión en E. coli entonces puede usarse convenientemente el péptido líder de NadA, pero están disponibles para el experto muchos otros péptidos líderes adecuados.

Los polipéptidos incluirán típicamente una secuencia citoplasmática que se prolonga hacia dentro desde el dominio (c). Esta secuencia citoplasmática se localizará típicamente en el extremo C terminal de dominio (c) y en el extremo C terminal del polipéptido completo. Las colas citoplasmáticas adecuadas están disponibles de proteínas 45 transmembrana. Por conveniencia, es normal usar la cola citoplasmática que se encuentra en la naturaleza con el dominio (c), aunque pueden, por supuesto, realizarse modificaciones de la secuencia de la cola nativa. Por lo tanto la secuencia citoplasmática puede comprender una secuencia de aminoácidos: (i) que tiene al menos m% de identidad con la cola citoplasmática natural, siendo m 50 o más (por ejemplo, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99,5 o más); y/o (ii) que es un fragmento de al menos n aminoácidos consecutivos de la cola citoplasmática, en el 50 que n es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12,14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más). Las colas pueden influir en el tráfico de proteínas.

Los polipéptidos pueden incluir secuencias de aminoácidos entre estos diversos dominios. Estas pueden ser

secuencias artificiales (por ejemplo para asistir en la manipulación de ADN o clonación, tales como sitios de restricción) o pueden tomarse de los mismos polipéptidos como dominios (a) a (c), por ejemplo puede usarse la secuencia que ya se encuentra entre un dominio transmembrana y una secuencia de superenrollamiento. Una secuencia de engarce artificial útil es GSGGGG (SEC ID Nº: 27), formándose el dipéptido Gly-Ser a partir de un sitio de restricción de BamH I, ayudando de este modo a la clonación y manipulación y siendo el tetrapéptido (Gly)4 un engarce de poliglicina típico 5 para la flexibilidad.

En general, por lo tanto, los polipéptidos de la invención tiene la fórmula NHrA-B-C-D-E-F-G-H-COOH en la que: -A- es una secuencia líder opcional; -B- es una secuencia engarce opcional; -C- es una secuencia antigénica; -D- es una secuencia de engarce opcional; -E- es una secuencia de superenrollamiento; -F- es una secuencia de engarce opcional; -G- es una secuencia transmembrana; y –H- es una cola citoplasmática opcional. 10

Las secuencias -A-, -B-, -D-, -F- y -H- típicamente serán cortas (por ejemplo 40 o menos aminoácidos es decir 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1). Los péptidos cortos pueden facilitar la clonación o la purificación (por ejemplo marcadores de histidina, es decir Hish en el que h = 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más).

Los polipéptidos pueden incluir una o más secuencias de reconocimiento de proteasa, permitiendo este modo 15 la liberación de partes deseadas del polipéptido (por ejemplo la parte extracelular) después de que se haya expresado, por ejemplo de modo que pueda expresarse una proteína de forma conveniente en la superficie celular, pero pueda liberarse después para su uso adicional. Una secuencia de reconocimiento de proteasa puede introducirse en diversas posiciones por ejemplo entre dominios (por ejemplo junto con un engarce) o puede insertarse dentro de los dominios. Una secuencia de reconocimiento de proteasa puede posicionarse entre el dominio de superenrollamiento y el dominio 20 antigénico, de modo que la proteasa libera el dominio antigénico e interrumpe la oligomerización o puede estar entre el dominio transmembrana y el dominio de superenrollamiento, de modo que la proteasa libera el polipéptido en forma oligomérica. Tener el sitio de escisión dentro del domino de superenrollamiento tendrá diversos efectos en la oligomerización dependiendo de la posición del sitio. De este modo una o más de las secuencias -D-, -E- y/o -F- en la fórmula anterior pueden incluir un sitio de reconocimiento de proteasa. Se prefiere incluir el sitio en la secuencia -F-. 25

La secuencia de reconocimiento de trombina es LVPR/GS (SEC ID Nº: 38) y esta puede insertarse por sí misma o junto con un engarce (por ejemplo. SEC ID Nº: 37). Otras proteasas y sus secuencias de reconocimiento se conocen bien en la técnica.

Preparación de vectores de ácido nucleico para la expresión de polipéptidos

Los polipéptidos de la invención pueden prepararse por diversos medios (por ejemplo expresión recombinante, 30 purificación a partir de cultivo celular, síntesis química, etc.) y en diversas formas (por ejemplo nativa, con compañeros de fusión, no glucosilada, lipidada, etc.). Se preparan preferentemente en forma sustancialmente pura (es decir sustancialmente sin otras proteínas bacterianas o de célula huésped.

El uso de un huésped recombínate es una vía preferida para la expresión de polipéptidos de acuerdo con la invención. El huésped incluirá una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido de la invención. Dichas 35 secuencias de ácidos nucleicos pueden prepararse por fusión, en fase, de secuencias que codifican los dominios separados de la proteína. Por ejemplo, fragmentos de ácido nucleico que codifican un dominio antigénico y un dominio de oligomerización pueden prepararse por síntesis química, por amplificación o por digestión. Después de cualquier tratamiento necesario para hacer a los fragmentos compatibles (por ejemplo, extremos romos, etc.) los fragmentos pueden ligarse de modo que sus secuencias codificantes estén en fase, para proporcionar una secuencia codificante 40 para el polipéptido completo. La secuencia codificante puede situarse en un vector de expresión cadena abajo de un promotor y usarse con el fin de la expresión.

Oligómeros

Dentro de los polipéptidos de la invención, los dominios de superenrollamiento confieren la capacidad de ensamblar en oligómeros, por ejemplo dímeros, trímeros, tetrámeros o pentámeros. 45

De este modo la invención proporciona una proteína oligomérica, que comprende polipéptidos oligomerizados de la invención. Las unidades monoméricas del oligómero pueden ser la misma o diferentes, por ejemplo, para una proteína dimérica, la invención proporciona tanto heterodímeros como homodímeros.

Pueden surgir hetero-oligómeros de varias maneras. Por ejemplo: los monómeros pueden tener los mismos dominios transmembrana y de superenrollamiento, pero diferentes dominios antigénicos; los monómeros pueden tener 50 los mismos dominios de superenrollamiento y antigénicos pero diferentes dominios transmembrana; los monómeros pueden tener los mismos dominios transmembrana y antigénicos, pero diferentes dominios de superenrollamiento; los monómeros pueden compartir sólo un domino en común; etc. La formación de superenrollamientos hetero-oligoméricos

se conoce {16}.

Los oligómeros preferidos de la invención son trímeros.

Huéspedes

La invención ofrece la conveniencia de expresar un polipéptido eucariota en un huésped procariota, sin perder el ensamblaje oligomérico del polipéptido eucariota nativo. El dominio antigénico del polipéptido será extracelular cuando 5 se exprese. De este modo la invención proporciona una célula huésped, expresando la célula huésped un polipéptido de la invención. El polipéptido se expresa preferentemente en la superficie de la célula huésped.

Se prefiere de este modo expresar los polipéptidos de la invención en un huésped procariota, tal como una bacteria. Escherichia coli es un huésped conveniente. Otros huéspedes adecuados incluyen Bacillus subtilis, Vibrio cholerae, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Neisseria lactamica, Neisseria cinerea, Mycobacteria (por ejemplo 10 M. tuberculosis), Shigella spp., Yersinia enterocolitica, Listeria monocytogenes, levaduras, etc. Estos huéspedes pueden manipularse para incorporar vías de glucosilación de eucariotas. En muchos casos, sin embargo, la falta de vías de glucosilación endógenas en huéspedes bacterianos es una ventaja, puesto que la glucosilación pueden enmascarar epítopos de linfocitos B y T inmunogénicamente importantes.

Inmunógenos 15

La invención se refiere a la expresión de polipéptidos antigénicos. Estos son adecuados para propósitos de inmunización, y el inmunógeno puede tomar diversas formas.

Por ejemplo, pueden purificarse polipéptidos completos para usarse como inmunógenos, en forma monomérica o, preferentemente, oligomérica. Cuando un polipéptido incluye un sitio de escisión de proteasa, los polipéptidos pueden tratarse con proteasa y después pueden usarse las partes extracelulares escindidas como inmunógenos. Cuando se 20 expresa un polipéptido en una célula, la célula en sí misma puede usarse como un inmunógeno, proporcionando el polipéptido expuesto en su superficie actividad inmunogénica. Como alternativa, pueden usarse vesículas de membrana exterior, o ampollas, que contienen polipéptidos expuestos, como inmunógenos.

La inmunización con membranas celulares (de células intactas („vacunas de vector bacteriano‟), que pueden estar vivas o muertas o preparaciones de membrana derivadas de las células) que incluye los polipéptidos de la 25 invención es una vía preferida. Las células huésped que contienen ácido nucleico de la invención y que expresan polipéptidos de la invención pueden usarse como vehículos de suministro, por ejemplo, bacterias comensales {72}. Esto es particularmente útil para el suministro a superficies mucosas, incluyendo administración oral, particularmente si se explotan los trofismos naturales de una célula intacta para el suministro in vivo. Los huéspedes bacterianos preferidos se definen genéticamente se atenúan y/o se toleran bien por un receptor animal o humano. Los huéspedes preferidos para 30 inmunización de este modo incluyen vacunas de vector de Salmonella oral viva, Yersinia enterocolitica, Shigella spp., Vibrio cholerae, Mycobacterium cepa BCG y Listeria monocytogenes.

Ácidos nucleicos

La invención también proporciona ácido nucleico que codifica los polipéptidos de la invención. Adicionalmente, la invención proporciona ácido nucleico que puede hibridar con este ácido nucleico, preferentemente en condiciones de 35 “alta rigurosidad” (por ejemplo 65ºC en una solución de SSC 0,1x, SDS 0,5%).

El ácido nucleico de acuerdo con la invención puede prepararse de muchas formas (por ejemplo por síntesis química, a partir de bibliotecas genómicas o de ADNc, del organismo en sí mismo, etc.) y puede tomar diversas formas (por ejemplo monocatenario, bicatenario, vectores, sondas, etc.). Se preparan preferentemente en forma sustancialmente pura (es decir, sustancialmente sin otros ácidos nucleicos bacterianos o de célula huésped). 40

La expresión “ácido nucleico” incluye ADN y ARN, y también sus análogos, tales como los que contienen cadenas principales modificadas (por ejemplo, fosforotioatos, etc.) y también ácidos péptidonucleicos (APN), etc. La invención incluye ácido nucleico que comprende secuencias complementarias a las descritas anteriormente (por ejemplo para propósitos de exploración con sondas o antisentido).

Composiciones inmunogénicas y medicamentos 45

La invención proporciona una composición que comprende un polipéptido y/o un ácido nucleico de la invención. Las composiciones de la invención son preferentemente composiciones inmunogénicas y más preferentemente son composiciones de vacuna. Las vacunas de acuerdo con la invención pueden ser profilácticas (es decir para prevenir la infección) o terapéuticas (es decir para tratar la infección), pero típicamente serán profilácticas.

El pH de la composición está preferentemente entre 6 y 8, preferentemente aproximadamente 7. El pH puede 50

mantenerse mediante el uso de un tampón. La composición puede ser estéril y/o sin pirógenos. La composición puede ser isotónica con respecto a seres humanos.

La invención también proporciona una composición de la invención para su uso como un medicamento. El medicamento es preferentemente capaz de inducir una respuesta inmune en un mamífero (es decir es una composición inmunogénica) y es más preferentemente una vacuna. 5

La invención también proporciona el uso de uno o más (por ejemplo 2, 3, 4, 5, 6) de los polipéptidos de la invención en la preparación de un medicamento para inducir una respuesta inmune en un mamífero. El medicamento es preferentemente una vacuna.

La invención también proporciona un procedimiento para inducir una respuesta inmune en un mamífero que comprende la etapa de administrar una cantidad eficaz de una composición de la invención. La respuesta inmune es 10 preferentemente protectora y preferentemente implica inmunidad mediada por anticuerpos y/o por células. El procedimiento puede inducir una respuesta de refuerzo.

El mamífero es preferentemente un ser humano. Cuando la vacuna es para su uso profiláctico, el ser humano es preferentemente un niño (por ejemplo un niño en edad de empezar a caminar o lactante) o un adolescente; cuando la vacuna es para su uso terapéutico, el ser humano es preferentemente un adolescente o un adulto. Una vacuna dirigida a 15 niños también puede administrarse a adultos, por ejemplo, para evaluar seguridad, dosificación, inmunogenicidad, etc.

Una forma de comprobar la eficacia del tratamiento terapéutico implica controlar las infecciones después de la administración de la composición de la invención. Un modo de comprobar la eficacia del tratamiento profiláctico implica controlar las respuestas inmunes frente a los polipéptidos después de la administración de la composición.

Las composiciones de la invención generalmente se administrarán directamente a un paciente. El suministro 20 directo puede conseguirse mediante inyección parenteral (por ejemplo por vía subcutánea, vía intraperitoneal, vía intravenosa, vía intramuscular o en el espacio intersticial de un tejido) o por administración rectal, oral (por ejemplo comprimido, pulverización), vaginal, tópica, transdérmica {por ejemplo véase referencia 73} o transcutánea {por ejemplo véanse referencias 74 y 75}, intranasal {por ejemplo véase la referencia 76}, ocular, ótica, pulmonar o mucosa de otro tipo. 25

La invención puede usarse para inducir inmunidad sistémica y/o mucosa.

El tratamiento de dosificación puede ser en un programa de dosis única o un programa de dosis múltiple. Pueden usarse múltiples dosis en un primer programa de inmunización y/o en un programa de inmunización de refuerzo. En un programa de dosis múltiple las diversas dosis pueden proporcionarse por la misma o diferentes vías por ejemplo una sensibilización parenteral y un refuerzo mucoso, una sensibilización mucosa y un refuerzo parenteral, etc. 30

Las infecciones afectan a diversas áreas del cuerpo y por lo tanto las composiciones de la invención pueden prepararse en diversas formas. Por ejemplo, las composiciones pueden prepararse como inyectables, como soluciones o suspensiones líquidas. Las formas sólidas adecuadas para la solución en, o suspensión en, vehículos líquidos antes de la inyección también pueden prepararse (por ejemplo una composición liofilizada). La composición puede prepararse para su administración tópica, por ejemplo, como una pomada, crema o polvo. La composición puede prepararse para 35 su administración oral, por ejemplo, como un comprimido o cápsula, como una pulverización o como un jarabe (opcionalmente con sabor). La composición puede prepararse para administración pulmonar, por ejemplo, como un inhalador, usando un polvo fino o un pulverizador. La composición puede prepararse como un supositorio o pesario. La composición puede prepararse para administración nasal, ótica u ocular, por ejemplo, como gotas. La composición puede estar en forma de kit, diseñado de modo que se reconstituye una composición combinada justo antes de su 40 administración a un paciente. Dichos kits pueden comprende uno o más antígenos en forma líquida y uno o más antígenos liofilizados.

Las composiciones inmunogénicas usadas como vacunas comprenden una cantidad inmunológicamente eficaz de antígeno o antígenos, así como cualquier otro componente, según se necesite. Por “cantidad inmunológicamente eficaz” se entiende que la administración de esa cantidad a un individuo, en dosis única o como parte de una serie, es 45 eficaz para el tratamiento o prevención. Esta cantidad varía dependiendo de la salud y condición física del individuo a tratar, la edad, el grupo taxonómico del individuo a tratar (por ejemplo primate no humano, primate, etc.), la capacidad del sistema inmune del individuo para sintetizar anticuerpos, el grado de protección deseado, la formulación de la vacuna, la evaluación del doctor a cargo de la situación médica y otros factores relevantes. Se espera que la cantidad disminuya en un intervalo relativamente amplio que puede determinarse a través de ensayos rutinarios. 50

Componentes adicionales de la composición

La composición de la invención típicamente, además de los componentes mencionados anteriormente, comprenderá uno o más “vehículos farmacéuticamente aceptables”, que incluyen cualquier vehículo que no induce por

sí mismo la producción de anticuerpos perjudiciales para el individuo que recibe la composición. Los vehículos adecuados son típicamente macromoléculas grandes, que se metabolizan lentamente tales como proteínas, polisacáridos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos y agregados lipídicos (tales como gotas pequeñas de aceite o liposomas). Dichos vehículos se conocen bien para los expertos en la materia. Las vacunas también pueden contener diluyentes, tales como agua, solución salina, glicerol, etc. 5 Adicionalmente, pueden estar presentes sustancias adyuvantes, tales como agentes humectantes o emulsionantes, sustancias tamponantes de pH y similares. Un análisis minucioso de excipientes farmacéuticamente aceptables está disponible en la referencia 77.

Las composiciones de la invención pueden administrarse junto con agentes inmunorreguladores. En particular, las composiciones incluirán habitualmente uno o más adyuvantes. Dichos adyuvantes incluyen, pero sin limitación: 10

A. Composiciones que contienen minerales

Las composiciones que contienen minerales adecuadas para su uso como adyuvantes en la invención incluyen sales minerales, tales como sales de aluminio y sales de calcio. La invención incluye sales minerales tales como hidróxido (por ejemplo oxihidróxidos), fosfatos (por ejemplo hidroxifosfatos, ortofosfatos), sulfatos, etc. {por ejemplo véanse los capítulos 8 y 9 de la referencia 78} o mezclas de diferentes compuestos minerales, tomando los compuestos 15 cualquier forma adecuada, (por ejemplo gel, cristalina, amorfa, etc.) y prefiriéndose la adsorción. Las composiciones que contienen minerales pueden también formularse como una partícula de sal metálica {79}.

B. Emulsiones Oleosas

Las composiciones de emulsión oleosa adecuadas para su uso como adyuvantes en la invención incluyen emulsiones de escualeno-agua, tales como MF59 {Capítulo 10 de la referencia 78; véase también referencia 80} 20 (Escualeno al 5%, Tween 80 al 0,5% y Span 85 al 0,5%, formulados en partículas submicrométricas usando un microfluidizador). También puede usarse adyuvante completo de Freund (CFA) y adyuvante incompleto de Freund (IFA).

C. Formulaciones de saponina {capítulo 22 de la referencia 78}

También pueden usarse formulaciones de saponina como adyuvantes en la invención. Las saponinas son un grupo heterólogo de glucósidos de esterol y glucósidos de triterpenoides que se encuentran en la corteza, hojas, tallos, 25 raíces e incluso flores de una amplia serie de especies vegetales. La saponina de la corteza del árbol Quillaia saponaria Molina se ha estudiado ampliamente como adyuvante. La saponina también puede obtenerse en el mercado de Smilax ornata (zarzaparrilla), Gypsophilla paniculata (velo de novia) y Saponaria officianalis (jabonera). Las formulaciones adyuvantes de saponina incluyen formulaciones purificadas, tales como QS21, así como formulaciones lipídicas, tales como ISCOM. QS21 se comercializa como Stimulon™. 30

Las composiciones de saponina se han purificado usando HPLC y RP-HPLC. Se han identificado las fracciones específicas purificadas usando estas técnicas, incluyendo QS7, QS17, QS18, QS21, QH-A, QH-B y QH-C. Preferentemente, la saponina es QS21. Un procedimiento de producción de QS21 se desvela en la referencia 81. Las formulaciones de saponina también pueden comprender un esterol, tal como un colesterol {82}.

Las combinaciones de saponinas y colesteroles pueden usarse para formar partículas únicas llamadas 35 complejos inmunoestimulantes (ISCOM) {capítulo 23 de la referencia 78}. Los ISCOM típicamente también incluyen un fosfolípido tal como una fosfatidiletanolamina o fosfatidilcolina. Puede usarse cualquier saponina conocida en ISCOM. Preferentemente, el ISCOM incluye uno o más de QuiIA, QHA y QHC. Los ISCOM se describen adicionalmente en las referencias 82-84. Opcionalmente, los ISCOM pueden estar desprovistos de un detergente adicional {85}.

Puede encontrarse una revisión del desarrollo de adyuvantes basados en saponina en las referencias 86 y 87. 40

D. Virosomas y partículas de tipo virus

También pueden usarse virosomas y partículas tipo virus (VLP) como adyuvantes en la invención. Estas estructuras generalmente contienen una o más proteínas de un virus opcionalmente combinadas o formuladas con un fosfolípido. Generalmente son no patogénicas, no replicantes y generalmente no contienen nada del genoma viral nativo. Las proteínas virales pueden producirse o aislarse de forma recombinante a partir de virus completos. Estas 45 proteínas virales adecuadas para su uso en virosomas o VLP incluyen proteínas derivadas del virus de la gripe (tales como HA o NA), el virus de la Hepatitis B (tal como proteínas del núcleo o la cápsida), virus de la Hepatitis E, virus del sarampión, virus Sindbis, Rotavirus, virus de la Glosopeda, Retrovirus, virus Norwalk, virus del Papiloma humano, VIH, fagos de ARN, fago Q (tal como proteínas de la cubierta), fago GA, fago fr, fago AP205 y Ty (tal como proteína p1 de retrotransposón de Ty). Las VLP se analizan adicionalmente en las referencias 88-93. Los virosomas se analizan 50 adicionalmente en, por ejemplo, la referencia 94.

E. Derivados bacterianos o microbianos

Los adyuvantes adecuados para su uso en la invención incluyen derivados bacterianos o microbianos tales como derivados no tóxicos de lipopolisacárido enterobacteriano (LPS), derivados de Lípido A, oligonucleótidos inmunoestimuladores y toxinas de ribosilación de ADP y derivados detoxificados de los mismos.

Los derivados no tóxicos de LPS incluyen monofosforil lípido A (MPL) y MPL 3-O-desacilado (3dMPL). 3dMPL 5 es una mezcla de lípido A monofosforilo 3 des-O-acilado con 4, 5 ó 6 cadenas aciladas. Una forma de “partícula pequeña” preferida de lípido A monofosforilo 3 Des-O-acilado se desvela en la referencia 95. Dichas “partículas pequeñas” de 3dMPL son suficientemente pequeñas para filtrarse de forma estéril a través de una membrana de 0,22 m {95}. Otros derivados no tóxicos de LPS incluyen miméticos de lípido A monofosforilo tales como derivados de aminoalquil glucosaminida fosfato por ejemplo RC-529 {96,97}. 10

Los derivados de lípido A incluyen derivados de lípido A de Escherichia coli tales como OM-174. OM-174 se describe por ejemplo en las referencias 98 y 99.

Los oligonucleótidos inmunoestimuladores adecuados para su uso como adyuvantes en la invención incluyen secuencias de nucleótidos que contienen un motivo CpG (una secuencia dinucleotídica que contiene una citosina no metilada unida mediante un enlace fosfato a una guanosina). Los ARN bicatenarios y oligonucleótidos que contienen 15 secuencias palindrómicas o poli(dG) también se ha demostrado que son inmunoestimuladores.

Los CpG pueden incluir modificaciones de nucleótidos/análogos tales como una modificación de fosforotioato y pueden ser bicatenarios o monocatenarios. Las referencias 100, 101 y 102 desvelan posibles sustituciones análogas, por ejemplo, reemplazo de guanosina con 2‟-desoxi-7-desazaguanosina. El efecto adyuvante de oligonucleótidos CpG se analiza adicionalmente en la referencias 103-108. 20

La secuencia CpG puede dirigirse a TLR9, tal como el motivo GTCGTT o TTCGTT {109}. La secuencia CpG puede ser específica para inducir una respuesta inmune Th1, tal como un ODN CpG-A, o puede ser más específico para inducir una respuesta de linfocitos B, tal como un ODN CpG-B. Los ODN CpG-A y CpG-B se analizan en las referencias 110-112. Preferentemente el CpG es un ODN CpG-A.

Preferentemente, el oligonucleótido CpG se construye de modo que el extremo 5‟ es accesible para 25 reconocimiento de receptor. Opcionalmente, pueden unirse dos secuencias de oligonucleótidos CpG a sus extremos 3‟ para formar “inmunómeros”. Véase, por ejemplo, las referencias 109 y 113-115.

Pueden usarse toxinas ribosilantes de ADP bacteriano y derivados detoxificados de las mismas como adyuvantes en la invención. Preferentemente, la proteína derivan de E. coli (enterotoxina inestable al calor de E. coli “LT”), cólera (“CT”), o pertussis (“PT”). El uso de toxinas ribosilantes de ADP detoxificadas como adyuvantes mucosos 30 se describen en la referencia 116 y como adyuvantes parenterales en la referencia 117. La toxina o toxoide está preferentemente en forma de una holotoxina, que comprende las subunidades A y B. Preferentemente, la subunidad A contiene una mutación detoxificante; preferentemente la subunidad B no está mutada. Preferentemente, el adyuvante es un mutante de LT destoxificado tal como LT-K63, LT-R72 y LT-G192. El uso de toxinas ribosilantes de ADP y derivados detoxificados de las mismas, particularmente LT-K63 y LT-R72, como adyuvantes puede encontrarse en las referencias 35 118-125. La referencia numérica para sustituciones de aminoácidos se basa preferentemente en los alineamientos de las subunidades A y B de toxinas ribosilantes de ADP expuestas en la referencia 126, incorporado específicamente en el presente documento por referencia en su totalidad.

F. Inmunoduladores humanos

Los inmunomoduladores humanos adecuados para su uso como adyuvantes en la invención incluyen citocinas, 40 tales como interleucinas (por ejemplo, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12 {127}, etc.) {128}, interferones (por ejemplo, interferón-), factor estimulador de colonias de macrófagos y factor de necrosis tumoral.

G. Bioadhesivos y Mucoadhesivos

También pueden usarse bioadhesivos y mucoadhesivos como adyuvantes en la invención. Los bioadhesivos adecuados incluyen microesferas de ácido hialurónico esterificado {129} o mucoadhesivos tales como derivados 45 reticulados de poli(ácido acrílico), alcohol de polivinilo, polivinil pirrolidona, polisacáridos y carboximetilcelulosa. También pueden usarse quitosán y derivados del mismo como adyuvantes en la invención {130}.

H. Micropartículas

También pueden usarse micropartículas como adyuvantes en la invención. Se prefieren micropartículas (es decir una partícula de 100 nm a 150 m de diámetro, más preferentemente de 200 nm a 30 m de diámetro y más 50 preferentemente de 500 nm a 10 m de diámetro) formadas a partir de materiales que son biodegradables y no

tóxicos (por ejemplo, un poli(-hidroxi ácido), un ácido polihidroxibutírico, un poliortoéster, un polianhídrido, una policaprolactona, etc.), con poli(lactida-co-glicolida), opcionalmente tratadas para tener una superficie cargada negativamente (por ejemplo con SDS) o una superficie cargada positivamente (por ejemplo con un detergente catiónico, tal como CTAB).

I. Liposomas (Capítulos 13 y 14 de la referencia 78) 5

Se describen ejemplos de formulaciones de liposomas adecuados para su uso como adyuvantes en las referencias 131-133.

J. Formulaciones de éter de polioxietileno y éster de polioxietileno

Los adyuvantes adecuados para su uso en la invención incluyen éteres de polioxietileno y ésteres de polioxietileno {134}. Dichas formulaciones incluyen adicionalmente tensioactivos de éster de sorbitán de polioxietileno en 10 combinación con un octoxinol {135} así como tensioactivos de éteres o ésteres de alquilo de polioxietileno en combinación con al menos un tensioactivo no iónico adicional tal como un octoxinol {136}. Los éteres de polioxietileno preferidos se seleccionan del siguiente grupo: éter de polioxietilen-9-laurilo (laureth 9), éter de polioxietilen-9-esteoril., éter de polioxietilen-8-esteorilo, éter de polioxietilen-4-laurilo, éter de polioxietilen-35-laurilo y éter de polioxietilen-23-laurilo. 15

K. Polifosfaceno (PCPP)

Se describen formulaciones de PCPP, por ejemplo, en la referencias 137 y 138.

L. Péptidos de muramilo

Los ejemplos de péptidos de muramilo adecuados para su uso como adyuvantes en la invención incluyen N-acetil-muramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-MDP), N-acetilnormuramil-L-alanil-D-isoglutamina (nor-MDP) y N-20 acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutaminil-L-alanina-2-(1‟-2‟-dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforiloxi)-etilamina (MTP-PE).

M. Compuestos de Imidazoquinolona.

Los ejemplos de compuestos de imidazoquinolona adecuados para su uso como adyuvantes en la invención incluyen Imiquamod y sus homólogos (por ejemplo “Resiquimod 3M”), descritos adicionalmente en las referencias 139 y 140. 25

La invención también puede comprender combinaciones de aspectos de uno o más de los adyuvantes identificados anteriormente. Por ejemplo, pueden usarse las siguientes composiciones adyuvantes en la invención: (1) una saponina y una emulsión de aceite en agua {141}; (2) una saponina (por ejemplo QS21) + un derivado no tóxico de LPS (por ejemplo 3dMPL) {142}; (3) una saponina (por ejemplo QS21) + un derivado no tóxico de LPS (por ejemplo 3dMPL) + un colesterol; (4) una saponina (por ejemplo QS21) + 3dMPL + IL-12 (opcionalmente + un esterol) {143}; (5) 30 combinaciones de 3dMPL con, por ejemplo, QS21 y/o emulsiones de aceite en agua {144}; (6) SAF, que contiene escualeno al 10%, Tween 80™ al 0,4%, polímero de bloque de pluronic L121 al 5% y thr-MDP, microfluidizado en una emulsión submicrométrica o agitado en vórtex para generar una emulsión de mayor tamaño de partícula. (7) sistema adyuvante Ribi™ (RAS), (Ribi Immunochem) que contiene escualeno al 2%, Tween 80 al 0,2% y uno o más componentes de la pared celular bacteriana del grupo que consiste en monofosforilípido A (MPL), dimicolato de 35 trehalosa (TDM) y esqueleto de la pared celular (CWS), preferentemente MPL + CWS (Detox™); y (8) una o más sales minerales (tales como una sal de aluminio) más un derivado no tóxico de LPS (tal como 3dMPL).

Otras sustancias que actúan como agentes inmunoestimulantes se desvelan en el capítulo 7 de la referencia 78.

Antígenos adicionales 40

Además de contener polipéptidos de la invención, las composiciones de la invención también pueden incluir uno o más antígenos adicionales. Los antígenos adicionales para inclusión pueden ser, por ejemplo:

- antígenos de Helicobacter pylori tales como CagA {145 a 148}, VacA {149, 150}, NAP {151, 152, 153}, HopX {por ejemplo 154}, HopY {por ejemplo 154} y/o ureasa.

- un antígeno proteico del serogrupo B de N. meningitidis, tal como los de las referencias 155 a 161. 45

- una preparación de vesícula de membrana exterior (OMV) del serogrupo B de N. meningitidis, tal como los desvelados en las referencias 162 a 165, etc.

- un antígeno sacárido del serogrupo C de N. meningitidis, tal como el oligosacárido desvelado en la referencia

166 del serogrupo C {véase también la referencia 167}.

- un antígeno sacárido de Streptococcus pneumoniae {por ejemplo 168, 169, 170}.

- un antígeno del virus de la hepatitis A, tal como virus inactivado {por ejemplo 171, 172}.

- un antígeno del virus de la hepatitis B, tal como los antígenos de superficie y/o núcleo {por ejemplo 172, 173}.

- un antígeno del virus de la hepatitis C {por ejemplo 174}. 5

- un antígeno de difteria, tal como un toxoide de difteria {por ejemplo capítulo 3 de la referencia 175} por ejemplo el mutante CRM197 {por ejemplo 176}.

- un antígeno de tétanos, tal como un toxoide de tétanos {por ejemplo capítulo 4 de la referencia 175}.

- un antígeno de Bordetella pertussis, tal como holotoxina de pertussis (PT) y hemaglutinina filamentosa (FHA) de B. pertussis, opcionalmente también en combinación con pertactina y/o aglutinógenos 2 y 3 {por ejemplo 10 177 y 178}.

- un antígeno de pertussis celular.

- un antígeno sacárido de Haemophilus influenzae B {por ejemplo 167}.

- un antígeno de N. gonorrhoeae {por ejemplo 155,156, 157}.

- un antígeno de Chlamydia pneumoniae {por ejemplo 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185}. 15

- un antígeno de Chlamydia trachomatis {por ejemplo 186}.

- un antígeno de Porphyromonas gingivalis {por ejemplo 187}.

- antígeno o antígenos de la polio {por ejemplo 188, 189) tales como IPV o OPV.

- antígeno o antígenos de la rabia {por ejemplo 190} tal como virus inactivado liofilizado {por ejemplo 191, RabAvert™}. 20

- antígenos de sarampión, paperas y/o rubéola {por ejemplo capítulos 9, 10 y 11 de la referencia 175}.

- antígeno o antígenos de la virus de la gripe {por ejemplo capítulos 19 de la referencia 175}, tal como las proteínas de superficie hemaglutinina y/o neuraminidasa.

- antígeno o antígenos de un paramixovirus tal como virus respiratorio sincitial (VRS {192, 193}) y/o virus paragripal (PIV3 {194}). 25

- un antígeno de Moraxella catarrhalis {por ejemplo 195}.

- un antígeno de Streptococcus agalactiae (estreptococo de grupo B) {por ejemplo 196, 197}.

- un antígeno de Streptococcus pyogenes (estreptococo de grupo A) {por ejemplo 197, 198, 199}.

- un antígeno de Staphylococcus aureus {por ejemplo 200}.

- un antígeno de Bacillus anthracis {por ejemplo 201, 202, 203}. 30

- un antígeno de un virus de la familia flaviviridae (género flavivirus), tal como del virus de la fiebre amarilla, el virus de la encefalitis Japonesa, cuatro serotipos de virus Dengue, virus de la encefalitis transmitida por garrapatas, virus del Nilo Occidental.

- una antígeno de pestivirus, tal como de virus de la fiebre porcina clásica, virus de la diarrea viral bovina y/o virus de la enfermedad de la frontera. 35

- un antígeno de parvovirus, por ejemplo de parvovirus B19.

- un proteína priónica (por ejemplo la proteína priónica CJD)

- una proteína amiloide, tal como un péptido beta {204}.

- un antígeno de cáncer, tal como los enumerados en la Tabla 1 de la referencia 205 o en las tablas 3 y 4 de la referencia 206. 40

La composición puede comprender uno o más de estos antígenos adicionales. Se prefiere que las combinaciones de antígenos se basen en características compartidas, por ejemplo, antígenos asociados con enfermedades respiratorias, antígenos asociados con enfermedades entéricas, antígenos asociados con enfermedades de transmisión sexual, etc.

Cuando se usa un antígeno sacárido o de carbohidrato, se conjuga preferentemente con una proteína vehículo 5 para mejorar la inmunogenicidad {por ejemplo referencias 207 a 216}. Las proteínas vehículo preferidas son toxinas o toxoides bacterianos, tales como los toxoides de difteria o tétanos. Los toxoides de difteria CRM197 se prefieren particularmente {217}. Otros polipéptidos vehículo incluyen la proteína de membrana exterior de N. meningitidis {218}, péptidos sintéticos {219, 220}, proteínas de choque térmico {221, 222}, proteínas de pertussis {223, 224}, proteína D de H. influenzae {225}, citocinas {226}, linfocinas {226}, hormonas {226}, factores de crecimiento {226}, toxina A o B de C. 10 difficile {227}, proteínas de captación de hierro {228}, etc. Pueden conjugarse diferentes sacáridos con el mismo o distinto tipo de proteína vehículo. Puede usarse cualquier reacción de conjugación adecuada, con cualquier engarce adecuado cuando se necesite.

Como una alternativa al uso de antígenos proteicos en la composición de la invención, pueden usarse ácidos nucleicos que codifican el antígeno {por ejemplo referencias 229 a 237}. Los componentes proteicos de la composición 15 de la invención pueden reemplazarse de este modo por ácido nucleico (preferentemente ADN, por ejemplo, en forma de un plásmido) que codifica la proteína.

Procedimientos

La invención también proporciona un procedimiento para producir un polipéptido de la invención, que comprende la etapa de cultivar una célula huésped transformada con ácido nucleico de la invención en condiciones que 20 inducen expresión de polipéptidos.

La invención proporciona un procedimiento para producir un polipéptido de la invención, que comprende la etapa de sintetizar al menos parte del polipéptido por medios químicos.

La invención proporciona un procedimiento para producir un ácido nucleico de la invención, que comprende la etapa de amplificar el ácido nucleico usando un procedimiento de amplificación basado en cebador (por ejemplo PCR). 25

La invención proporciona un procedimiento para producir ácido nucleico de la invención, que comprende la etapa de sintetizar al menos parte del ácido nucleico por medios químicos

General

La expresión “que comprende” abarca “que incluye” así como “que consiste en“, por ejemplo una composición “que comprende” X puede consistir exclusivamente en X o puede incluir algo adicional, por ejemplo X + Y. 30

El término “aproximadamente” en relación a un valor numérico x significa, por ejemplo, x  10%.

La palabra “sustancialmente” no excluye “completamente”, por ejemplo la composición que está “sustancialmente sin” Y puede estar completamente sin Y. Cuando sea necesario, la palabra “sustancialmente” puede omitirse de la definición de la invención.

Las referencias a un porcentaje de identidad de secuencia entre dos secuencias de aminoácidos significan que, 35 cuando se alinean, ese porcentaje de aminoácidos son los mismos en la comparación de las dos secuencias. Este alineamiento y el porcentaje de homología o identidad de secuencia puede determinarse usando programas informáticos conocidos en la técnica, por ejemplo, los descritos en la sección 7.7.18 de la referencia 238. Se determina un alineamiento preferido mediante el algoritmo de búsqueda de homología de Smith-Waterman que usa una búsqueda de hueco afín con una penalización de hueco abierto de 12 y una penalización de extensión de hueco de 2, matriz 40 BLOSUM de 62. El algoritmo de búsqueda de homología de Smith-Waterman se desvela en la referencia 239.

En ciertas realizaciones, la invención no abarca un polipéptido en el que: (a) el domino de oligomerización es la adhesina NadA de N. meningitidis, o un fragmento de la misma, y (b) el domino antigénico es la proteína S1 de coronavirus de SRAS o un fragmento de la misma. De forma similar, en ciertas realizaciones la invención no abarca ácido nucleico que codifica dicho polipéptido. Estos polipéptidos y ácidos nucleicos se desvelan en la referencia 240 y 45 por lo tanto se excluyen de ciertas realizaciones de la presente invención.

MODOS PARA LLEVAR A CABO LA INVENCIÓN

Identificación de adhesinas bacterianas

Se han identificado antígenos asociados con virulencia implicados en la adhesión en varias bacterias {71}, y los dominios de tronco de estos antígenos pueden usarse con secuencias antigénicas heterólogas de acuerdo con la 50

invención.

Se han identificado antígenos en: Haemophilus influenzae biogrupo aegyptius (‟HadA‟, SEC ID Nº: 29); Escherichia coli K1 (SEC ID Nº: 42 y 43) y también en la cepa EDL933 de EHEC; Actinobacillus actinomycetemcomitans (SEC ID Nº: 44); Haemophilus somnus (SEC ID Nº: 45); Haemophilus ducreyi (SEC ID Nº: 46); E. coli EPEC cepa E2348/69 (SEC ID Nº: 47 y 48); E. coli EAEC cepa 042 (SEC ID Nº: 49 y 50); E. coli uropatogénica (SEC ID Nº: 51); 5 Shigella flexneri (SEC ID Nº: 52); Brucella melitensis (SEC ID Nº: 53); Brucella suis (SEC ID Nº: 54); Ralstonia solanacearum (SEC ID Nº: 55); Sinorhizobium meliloti (SEC ID Nº: 56); Bradorhizobium japonicum (SEC ID Nº: 57); y Burkholderia fungorum (SEC ID Nº: 58).

Las posiciones de estos elementos en las SEC ID Nº: 29 y 42-58 son las siguientes:

SEC ID

Organismo Longitud Líder Cabeza Superenrollamiento Anclaje

29

H. aegyptius 256 1-26 27-55 56-184 185-256

42

EHEC 338 1-23 24-207 208-266 267-338

43

1588 1-53 54-1515* 1516-1588

44

A. actinomycetemcomitans 295 1-25 26-150 151-222 223-295

45

H. somnus 452 1-26 27-158 159-378 379-452

46

M. ducreyi 273 1-21 22-198* 199-273

47

EPEC 338 1-24 25-209 210-266 267-338

48

577 1-504* 505-577

49

EAEC 717 1-23 24-109 110-645 646-717

50

1743 1-53 54-1670* 1679-1743

51

UPEC 1778 1-53 54-1705* 1706-1778

52

S. flexneri 990 1-917* 918-990

53

B. melitensis 227 1-27 28-122 123-154 155-227

54

B. suis 311 1-27 28-206 207-238 239-311

55

R. solanacearum 1309 1-230* 231-708 1239-1309

56

S. meliloti 1291 1-1219* 1220-1291

57

B. japonicum 372 1-72 73-300* 301-372

58

B. fungorum 3399 1-57 58-3328* 3329-3399

* El límite entre los dominios está menos diferenciado para algunas de estas adhesinas

Proteína de pico de coronavirus de SRAS 10

La proteína de pico E2 del coronavirus de SRAS se ha indicado. Una secuencia de aminoácidos de esta proteína se proporciona en el presente documento como SEC ID Nº:1. Se proporciona una predicción de la estructura secundaria a continuación, representando C un enrollamiento, representando H una hélice, y representando E una secuencia extendida:

Proteína de la envoltura de VIH

La glucoproteína de la envoltura de VIH se expresa como gp160 del genoma de VIH y se escinde de forma post-traduccional para dar gp120 y gp41, que permanecen asociadas. La proteína 120 es el domino extracelular de la

envoltura y la proteína gp41 es la proteína transmembrana de la envoltura. Las proteínas asociadas forman trímeros en la superficie del virión, pero la gp120 expresada de forma recombinante es monomérica. Para aumentar la inmunogenicidad de la proteína de la envoltura, se ha expresado en E. coli como un trímero no glucosilado mediante el uso de estructuras de oligomerización de NadA.

La secuencia de la proteína de envoltura hasta, pero sin incluir, su secuencia transmembrana (opcionalmente 5 con deleción de la región V2 hipervariable de 30 aa, que es aa 133-162 de SEC ID Nº: 12, reemplazado por Gly-Ala-Gly, para dar gp140V2 {241}) se usó como un dominio antigénico en combinación con la región de anclaje de la proteína NadA de N. meningitidis, unida por el tronco de NadA o de 160 (es decir gp41). Se construyeron varias formas diferentes de esta secuencia híbrida, con un péptido líder NadA (SEC ID Nº: 11). Se proporcionan las siete secuencias como las SEC ID Nº 3 a 9 y se describen en más detalle en la siguiente tabla: 10

SEC ID Nº:

Longitud (aa) Descripción del polipéptido (SEC ID Nº constituyentes, de N terminal a C terminal)

3

824 11-12-14-13-15

4

769 11-12-14-13

5

797 11-16-14-13-15

6

742 11-16-14-13

7

705 11-16-17-18-15

8

724 11-16-17-18-19

9

758 11-16-17-18-20

De este modo todas las SEC ID Nº 3-9 incluyen un péptido líder derivado de NadA (SEC ID Nº: 11), un domino de envoltura antigénico (SEC ID Nº: 12 o 16) y una región de superenrollamiento (de la envoltura de VIH (SEC ID Nº: 17) o de NadA (SEC ID Nº: 13), con un engarce dipéptido (SEC ID Nº: 14 ó 18) entre secuencias virales y bacterianas. Las SEC ID Nº 3, 5, 7, 8 y 9 también incluyen secuencias de anclaje transmembrana (SEC ID Nº 15, 19 y 20) derivadas de NadA. 15

También se construyó una octava secuencia de 648 aa (SEC ID Nº: 10, compuesta de las SEC ID Nº 11-16-17 de N terminal a C terminal, es decir, las mismas que SEC ID Nº 7-9, pero sin las partes de anclaje C terminales de NadA). Estas construcciones se muestran en las Figuras 3-5.

En experimentos adicionales, se construyeron polipéptidos mediante el reemplazo de (a) la cabeza de NadA con la subunidad gp120 („gp120-NadA‟) o (b) la cabeza y el tronco de NadA con la gp140 completa („gp140-NadA‟). Estas 20 construcciones se muestran en la Figura 6 (SEC ID Nº: 32-35):

SEC ID Nº:

Longitud Descripción del polipéptido

32

824 aa 1-29: líder de NadA (SEC ID Nº: 11) aa 30-504: gp120 (SEC ID Nº: 36) aa 505-506: dipéptido Gly-Ser (SEC ID Nº: 14) aa 507-824: tronco y anclaje de NadA (SEC ID Nº: 13 + SEC ID Nº: 15)

33

837 aa 1-29: líder de NadA (SEC ID Nº: 11) aa 30-504: gp120 (SEC ID Nº: 36) aa 505-506: dipéptido Gly-Ser (SEC ID Nº: 14) aa 507-734 & 748-837: tronco y anclaje de NadA (SEC ID Nº:13 + 15) aa 735-747: secuencia de escisión de trombina (SEC ID Nº: 37)

34

741 aa 1-29: líder de NadA (SEC ID Nº: 11) aa 30-665: gp140 (mut3-5) (SEC ID Nº: 39) aa 666-667: dipéptido Lys-Leu (SEC ID Nº: 18) aa 668-741: anclaje de NadA (SEC ID Nº: 19)

35

768 aa 1-29: líder de NadA (SEC ID Nº: 11) aa 30-665: gp140 (mut3-5) (SEC ID Nº: 39) aa 666-678: secuencia de escisión de trombina (SEC ID Nº: 37) aa 679-768: anclaje de NadA (SEC ID Nº: 40)

Los polipéptidos gp120-NadA y gp140-NadA se expresaron en E. coli BL21(DE3) usando el sistema pET. La expresión y localización en E.coli se ensayaron mediante SDS-PAGE y análisis de transferencia de western en lisado celular total y en vesículas de membrana exterior. Como se muestra en la Figura 7, una transferencia de western de lisado celular total que usa anticuerpo anti-NadA revela la expresión de la proteína en formas monoméricas y oligoméricas. Además, las proteínas también se ven en SDS-PAGE de vesículas de membrana exterior, lo que muestra 5 que las proteínas se transportan de forma eficaz a la superficie de E.coli (Figura 8). La proteína gp140-NadA también se vio en el sobrenadante del cultivo.

Para confirmar exposición en superficie celular de las proteínas, se analizaron las E. coli mediante FACS en células completas de bacterias. Los anticuerpos contra NadA (policlonal) y contra el epítopo conservado de C4 de gp120 (monoclonal) se usaron para la proteína gp120-NadA y, como se muestra en la Figura 9, se confirmó expresión en 10 superficie. Los anticuerpos contra NadA (policlonal) y contra un epítopo de gp41 (monoclonal 2F5) se usaron para la proteína gp140-NadA y se confirmó expresión en superficie (Figura 10).

Para investigar el plegamiento, se midió la afinidad por CD4 de las proteínas. Las E. coli se incubaron con CD4 soluble durante 1 hora a 37ºC y se detectó la unión mediante FACS usando un anticuerpo anti-CD4 monoclonal. Las Figuras 13 y 14 muestran el porcentaje de E. coli con gp140-NadA que son capaces de unirse a CD4. Como se muestra 15 en la Figura 11, las E. coli que expresaban cualquiera de las proteínas fueron capaces de unirse a CD4. La unión dependiente de dosis también se vio, como se muestra en la Figura 12 para gp140-NadA. Además, la pre-incubación de la CD4 con gp140 glucosilada inhibe la unión (Figura 15).

Se obtuvo confirmación de la interacción entre CD4 y gp140-NadA usando un ensayo de unión del receptor basado en HPLC con CD4 marcado con fluorescencia (CD4-FITC). Un experimento de control positivo (Figura 16) 20 mostró que CD4-FITC por sí solo tiene un tiempo de retención de 8,3 minutos que se reduce a 7,0 minutos en presencia de gp120 de VIH glucosilado purificado. Como se muestra en la Figura 17, la incubación del CD4 con el sobrenadante de cultivo de gp140-NadA (Figura 8, columna derecha) dio como resultado una reducción del tiempo de retención de CD4 a 5,2 minutos, lo que indica formación de un complejo entre gp140-NadA y CD4.

Para confirmar que los dominios Env mantienen propiedades inmunogénicas, se usaron preparaciones de 25 membrana exterior enriquecidas con las proteínas de Env-NadA recombinantes para inmunizar animales usando una estrategia de sensibilización-refuerzo. Se sensibilizaron dos o tres conejos por grupo los días 0, 21, 35 y 49 con preparaciones de vesícula de membrana exterior de E.coli/gp120-NadA, E.coli/gp140-NadA y E.coli/pET (control negativo), usando un adyuvante de hidróxido de aluminio. Se usó gp140 glucosilada (purificada de células humanas) como control positivo en combinación con un adyuvante MF59. 30

El grupo inmunizado con gp120-NadA se reforzó el día 49 con ectodominio de Env glucosilado completo (gp140V2) para seleccionar anticuerpos que pueden unirse al pico viral nativo. Los sueros se analizaron del día 35 (punto dos), 49 (punto tres) y 64 (sangrado) por ELISA y ensayo de neutralización.

Los resultados mostraron que la inmunización con OMV gp120-NadA inducía anticuerpos capaces de reconocer el gp140V2 glucosilado en ELISA (Figura 18). Estos sueros se ensayaron con respecto a su capacidad para 35 neutralizar aislados de VIH-1. Los títulos a los que la dilución en suero redujo las unidades de luminiscencia relativa el 50% en comparación con pocillos de control de virus fueron los siguientes:

Antígeno

Punto tres de suero (día 49) Sangrado de sueros (día 64)

Nº 7 - 1:34

Antígeno

Punto tres de suero (día 49) Sangrado de sueros (día 64)

OMV/gp120-NadA

Nº 8 1:80 1:950

Nº 9 - 1:185

Gp140deltaV2

Nº 17 1:2154 nd

Nº 18 1:3590 nd

Los sueros contra gp120-NadA OMV fueron capaces de neutralizar el aislado SF162 de VIH-1 homólogo a una dilución considerable. Por el contrario, la inmunización con OMV gp140-NadA produjo menores títulos de anticuerpos y estos anticuerpos no fueron capaces de neutralizar anticuerpos contra la cepa homóloga.

Por lo tanto el uso de dominios de oligomerización y transmembrana de NadA permite la expresión en superficie celular de la proteína de envoltura de VIH en E.coli en forma oligomérica de unión a CD4 no glucosilado. 5

REFERENCIAS (los contenidos de las cuales se incorporan en el presente documento por referencia)

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{218} documento EP-A-0372501

{219} documento EP-A-0378881 20

{220} documento EP-A-0427347

{221} documento WO93117712

{222} documento WO94/03208

{223} documento WO98/58668

{224} documento EP-A-0471177 25

{225} documento WO00/56360

{226} documento WO91/01146

{227} documento WO00/61761

{228} documento WO01/72337

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LISTA DE SECUENCIAS

SEC ID Nº: 1 -

10

SEC ID Nº: 2 -

SEC ID Nº: 3 -

SEC ID Nº: 4 -

SEC ID Nº: 5 -

SEC ID Nº: 6 - 5

SEC ID Nº: 7 -

SEC ID Nº: 8 -

SEC ID Nº: 9 -

SEC ID Nº: 10 - 5

SEC ID Nº: 11 -

SEC ID Nº: 12 -

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SEC ID Nº: 13 -

SEC ID Nº: 14 -

SEC ID Nº: 15 -

SEC ID Nº: 16-

SEC ID Nº: 17 - 5

SEC ID Nº: 18 -

SEC ID Nº: 19 -

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SEC ID Nº: 20 -

SEC ID Nº: 21 -

SEC ID Nº: 22 - 15

SEC ID Nº: 23 -

SEC ID Nº: 24 -

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SEC ID Nº: 25 -

SEC ID Nº: 26 -

SEC ID Nº: 27 - 5

SEC ID Nº: 28 -

SEC ID Nº: 29 -

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SEC ID Nº: 30 -

SEC ID Nº: 31 -

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SEC ID Nº: 32 -

SEC ID Nº: 33 -

SEC ID Nº: 34 -

SEC ID Nº: 35 - 5

SEC ID Nº: 36 -

SEC ID Nº: 37 -

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SEC ID Nº: 38 -

SEC ID Nº: 39 -

SEC ID Nº: 40 -

SEC ID Nº: 41 - 5

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SEC ID Nº: 44 -

SEC ID Nº: 45 -

SEC ID Nº: 46 -

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SEC ID Nº: 48 - 5

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SEC ID Nº: 50 -

SEC ID Nº: 51 -

SEC ID Nº: 52 -

SEC ID Nº: 53 - 5

SEC ID Nº: 54 -

SEC ID Nº: 55 -

SEC ID Nº: 56 -

SEC ID Nº: 57 - 5

SEC ID Nº: 58 -

Claims (21)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un polipéptido que comprende: (a) un dominio antigénicos; (b) un dominio de oligomerización; y (c) un dominio transmembrana, en el que los dominios (a), (b) y (c) no se encuentran todos juntos en el mismo polipéptido en la naturaleza y en el que el dominio (b) es un dominio de superenrollamiento de la adhesina NadA de Neisseria meningitidis. 5
2. 2. El polipéptido de cualquier reivindicación precedente, en el que el dominio antigénico es un antígeno de superficie de una bacteria o virus.
3. 3. El polipéptido de la reivindicación 2, en el que el dominio antigénico comprende el dominio extraviral de una proteína de fusión viral.
4. 4. El polipéptido de la reivindicación 3, en el que la proteína de fusión se selecciona del grupo que consiste en: la 10 proteína Env de un retrovirus; la proteína F de un paramixovirus; la proteína Gp del virus Ébola; la proteína hemaglutinina del virus de la gripe; las proteínas de pico de un coronavirus; la glucoproteína del virus de la rabia (RVG); la proteína de fusión de un arbovirus; las proteínas de fusión de un togaviridae; la proteína de fusión de un flaviviridae; la proteína de fusión de un alfavirus; la proteína E del virus del dengue; la proteína E del virus de la hepatitis C; la proteína E del virus de la fiebre amarilla; la proteína E del virus de la encefalitis japonesa; la proteína E del virus del Nilo 15 Occidental; la proteína E del virus de la encefalitis transportada por garrapatas (TBE); la proteína de fusión del virus del sarampión; la proteína de pico E1 del virus del Bosque de Semliki; la proteína de fusión de un bunyaviridae; y la proteína de fusión de un arenaviridae.
5. 5. El polipéptido de la reivindicación 4, en el que la proteína de fusión es la proteína de la envoltura del VIH.
6. 6. El polipéptido de la reivindicación 4, en el que el dominio antigénico es del producto de escisión N terminal del 20 polipéptido de fusión.
7. 7. El polipéptido de la reivindicación 2, en el que el dominio antigénico es de una proteína de superficie de una bacteria seleccionada del grupo que consiste en: Neisseria meningitidis; Neisseria gonorrhoeae; Streptococcus pneumoniae; Streptococcus pyogenes; Streptococcus agalactiae; Staphylococcus aureus; Haemophilus influenza; Moraxella catarrhalis; Helicobacter pylori; Chlamydia trachomatis; y Chlamydia pneumoniae. 25
8. 8. El polipéptido de cualquier reivindicación precedente, en el que el dominio transmembrana es de una proteína transmembrana bacteriana.
9. 9. El polipéptido de cualquier reivindicación precedente, en el que los dominios (b) y (c) son de NadA de Neisseria meningitidis.
10. 10. El polipéptido de cualquier reivindicación precedente, en el que al menos uno de (a) y (c) tiene un origen 30 eucariota y al menos otro de (a) y (c) tiene un origen procariota.
11. 11. El polipéptido de la reivindicación 9, en el que el dominio (c) es de un procariota y el dominio (a) es de un virus de eucariota.
12. 12. Un polipéptido que comprende: (a) un dominio antigénico de la proteína de fusión viral de un virus de eucariota con envoltura; (b) un dominio de superenrollamiento de NadA de Neisseria meningitidis y (c) un dominio transmembrana 35 de la misma adhesina bacteriana que (b).
13. 13. Un polipéptido de la fórmula NH2-A-B-C-D-E-F-G-H-COOH en el que: A es una secuencia líder opcional; B es una secuencia de engarce opcional; C es una secuencia antigénica; D es una secuencia de engarce opcional; E es una secuencia de superenrollamiento de NadA de Neisseria meningitidis, es una secuencia de engarce opcional; G es una secuencia transmembrana; y H es una cola citoplasmática opcional. 40
14. 14. Ácido nucleico que codifica el polipéptido de cualquier reivindicación precedente.
15. 15. Una proteína oligomérica, que comprende polipéptidos oligomerizados de una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 13.
16. 16. La proteína oligomérica de la reivindicación 15, que es un trímero.
17. 17. Una célula huésped, expresando la célula huésped el polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 45 13 en su superficie.
18. 18. La célula huésped de la reivindicación 17, en la que la célula está seleccionada del grupo que consiste en: Escherichia coli, Bacillus subtilis, Vibrio cholerae, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Neisseria lactamica,

    Neisseria cinerea, Mycobacterium, Shigella spp., Yersinia enterocolitica, y Listeria monocytogenes.
19. 19. Un preparación de membrana derivada de la célula huésped de la reivindicación 17 o reivindicación 18 que comprende el polipéptido de las reivindicaciones 1-13.
20. 20. Una composición farmacéutica que comprende el polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, el ácido nucleico de la reivindicación 14, la proteína de la reivindicación 15 o reivindicación 16, la célula huésped de la 5 reivindicación 17 o reivindicación 18 o la preparación de membrana de la reivindicación 19.
21. 21. La composición de la reivindicación 20 para su uso en la inducción de una respuesta inmune en un mamífero.