ES2206286T3 - Composciones que contienen formas solubles de hla-g en el tratamiento de patologias inflamatorias. - Google Patents
Composciones que contienen formas solubles de hla-g en el tratamiento de patologias inflamatorias.Info
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Abstract
Utilización de una composición esencialmente constituida por al menos una forma soluble de HLA-G y por al menos un vehículo farmacéuticamente aceptable, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de los estados patológicos inflamatorios de la piel.
Description
Composiciones que contienen formas solubles de
HLA-G en el tratamiento de patologías
inflamatorias.
La presente invención se refiere a la utilización
de las composiciones que contienen formas solubles de
HLA-G en el tratamiento de patologías de la piel y
especialmente de las dermatosis inflamatorias, al procedimiento de
obtención de dichas formas solubles de HLA-G, así
como a los anticuerpos dirigidos contra dichas formas solubles.
Los antígenos del complejo mayor de
histocompatibilidad (CMH), se dividen en diversas clases, los
antígenos de clase I (HLA-A, HLA-B y
HLA-C) que presentan 3 dominios globulares
(\alpha1, \alpha2 y \alpha3), y cuyo dominio \alpha3 está
asociado a la \beta2 microglobulina, los antígenos de clase II
(HLA-DP, HLA-DQ y
HLA-DR) y los antígenos de clase III
(complemento).
Los antígenos de clase I comprenden, además de
los antígenos mencionados, otros antígenos, llamados antígenos de
clase I no clásicos, y en particular los antígenos
HLA-E, HLA-F y
HLA-G; este último, en particular se expresa
mediante los trofoblastos extravellosos de la placenta humana
normal y las células epiteliales tímicas.
La secuencia del gen HLA-G (gen
HLA-6.0) se ha descrito por GERAGHTY et al.,
(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1987, 84,
9145-9149) : comprende 4396 pares de bases y
presenta una organización intrón/exón homóloga a la de los genes
HLA-A, -B y -C. Más concretamente, este gen
comprende 8 exones, 7 intrones y un extremo no traducido 3'; los 8
exones corresponden respectivamente a : exón 1 : secuencia señal,
exón 2 : dominio extracelular \alpha1, exón 3 : dominio
extracelular \alpha2, exón 4 : dominio extracelular \alpha3,
exón 5 : región transmembrana, exón 6 : dominio citoplásmico I,
exón 7 : dominio citoplásmico II (no traducido), exón 8 : dominio
citoplásmico (III) no traducido) y región 3' no traducida (GERAGHTY
et al., antes mencionado; ELLIS et al., J. Immunol.,
1990, 144, 731-735; KIRSZENBAUM M. et
al., Oncogeny of hematopoiesis. Aplastic anemia, Eds. E.
Gluckman, L. Coulombel, Colloque INSERM/John Libbey Eurotext Ltd).
Sin embargo el gen HLA-G difiere de los otros genes
de clase I, en que el codón de terminación de traducción, en fase,
se localiza en el segundo codón del exón 6; por consiguiente, la
región citoplásmica de la proteína codificada por este gen
HLA-6.0 es considerablemente más corta que la de las
regiones citoplásmicas de las proteínas HLA-A, -B y
-C.
Estos antígenos HLA-G son
esencialmente expresados por las células citotrofoblásticas de la
placenta y se considera que desempeñan una función en la protección
del feto (ausencia de rechazo por parte de la madre). Además, en la
medida en que el antígeno HLA-G es monomórfico,
también puede implicarse en el crecimiento o en la función de las
células placentarias (KOVATS et al., Science, 1990,
248, 220-223).
Otras investigaciones relativas a este antígeno
no clásico de clase I (ISHITANI et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 1992, 89, 3947-3951 han demostrado
que el tránscrito primario del gen HLA-G se puede
empalmar de varias maneras y produce al menos 3 ARNm maduros
distintos: el tránscrito primario de HLA-G
proporciona una copia completa (G1) de 1.200 pb, un fragmento de 900
pb (G2) y un fragmento de 600 pb (G3).
El tránscrito G1 no comprende el exón 7 y
corresponde a la secuencia descrita por ELLIS et al., (antes
mencionado), es decir que codifica una proteína que comprende una
secuencia líder, tres dominios externos, una región transmembrana y
una secuencia citoplásmica. El ARNm G2 no comprende el exón 3, es
decir que codifica una proteína en la que los dominios \alpha1 y
\alpha3 están directamente unidos; el ARNm G3 no contienen ni el
exón 3, ni el exón 4, es decir que codifica una proteína en la que
el dominio \alpha1 y la secuencia transmembrana están directamente
unidos.
El empalme que prevalece para obtención del
antígeno HLA-G2 conlleva la unión de una adenina
(A) (procedente del dominio que codifica \alpha1) con una
secuencia AC (procedente del dominio codificante \alpha3), lo que
conlleva la creación de un codón AAC /asparagina) en lugar del
codón GAC (ácido aspártico), encontrado al inicio de la secuencia
que codifica el dominio \alpha3 en HLA-G1.
El empalme generado para la obtención de
HLA-G3 no conlleva la formación de un nuevo codón
en la zona de empalme.
Los Autores de este artículo también han
analizado las diferentes proteínas expresadas: los 3 ARNm se
traducen en proteína en la línea celular 221-G.
Algunos inventores han demostrado la existencia
de otras formas empalmadas de ARNm de HLA-G: el
tránscrito HLA-G4, que no incluye el exón 4; el
tránscrito HLA-G5, que incluye el intrón 4, entre
los exones 4 y 5, provocando así una modificación del marco de
lectura, durante la traducción de este tránscrito y en particular
la modificación del marco de lectura durante la traducción de este
tránscrito y en particular la aparición de un codón parada, después
del aminoácido 21 del intrón 4; y el tránscrito
HLA-G-G6 que posee en intrón 4 pero
que ha perdido el exón 3 (KIRSZENBAUM M. et al. Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 1994, 91, 4209-4213; Solicitud
Europea EP 0 677 582; KIRSZENBAUM M. et al., Human Immunol.,
1995, 43, 237-241; MOREAU P. et al., Human
Immunol., 1995, 43, 231-236); también han
demostrado que estos diferentes tránscritos se expresan en diversos
tipos de células humanas fetales y adultas, en particular en los
linfocitos (KIRSZENBAUM M. et al., Human Immunol.,
1995 antes mencionado; MOREAU P. et al., Human Immunol., 1995
antes mencionado).
Existen por consiguiente 6 ARNm
HLA-G diferentes que codifican potencialmente 6
isoformas proteicas de
HLA-G, de las cuales 4 son de membrana (HLA-G1, G2, G3 y G4) y dos solubles (G5, G6).
HLA-G, de las cuales 4 son de membrana (HLA-G1, G2, G3 y G4) y dos solubles (G5, G6).
Se ha demostrado que la expresión de dichas
isoformas proteicas de HLA-G aumentaba mediante el
interferón \gamma (Yang et al., J. Immunol., 1996,
156, 4224-4231).
La función inmunomoduladora ejercida por estas
moléculas HLA-G se ha descrito y los mecanismos
de esta función se han elucidado mediante la identificación de su
interacción con receptores inhibidores de la lisis presentes en las
células NK (receptores KIR) que conducen a una inhibición de las
funciones citotóxicas de estas células; por ejemplo N.
ROUAS-FREISS et al., (Proc. Nat. Acad. Sci.,
1997, 94, 5249-5254) han demostrado que las
células diana K562 (línea eritroleucémica humana) transfectadas por
el gen HLA-G estaban protegidas de la lisis por las
células NK. Estas células son habitualmente sensibles a las células
NK.
Algunos de los inventores han demostrado que las
células NK no expresan ningún tránscrito HLA-G
(Teyssier et al., Nat. Immunol., 1995, 14,
262-270), confirmando este resultado que los
productos de expresión del gen HLA-G desempeñan
verdaderamente una función en los estados de inmunotolerancia
fisiológica (gestación) o patológica en los que las células NK son
particularmente activas (enfermedades autoinmunes, transplantes) o
por el contrario se inhiben (presencia anormal de
HLA-G en ciertos tumores o durante infecciones
virales).
De este modo, algunos de los inventores también
han demostrado que algunos tumores expresan moléculas
HLA-G, lo que permite escapar a la vigilancia
inmunitaria (Paul et al., Proc. Nat. Acad. Sci., 1998,
95, 4510-4515).
Una de las patologías inflamatorias crónicas
frecuentes es la soriasis que se observa en el 2% de los individuos
de las poblaciones caucásicas. Aunque la enfermedad se caracteriza
por una hiperproliferación de los queratinocitos de la epidermis,
numerosos estudios fisiopatológicos han permitido demostrar que los
linfocitos T de subtipo Th1, que se infiltran en el sitio de las
lesiones y que producen interleuquina 2 (IL-2) e
interferón \gamma; (IFN\gamma), desempeñaban una función
preponderante en la patogénesis de esta enfermedad (Z.
Bata-Csorgo et al. J. Investigative
Dermatol., 1995, 89S-94S; Schlaak et al., J.
Invest. Dermatol.,1994, 102, 145-149);
Vogel et al., Eur. J. Biochem., 1995, 227,
143-149). Efectivamente, se ha demostrado que el
sobrenadante de clones de células T procedentes de lesiones de
soriasis eran capaces de inducir la hiperproliferación de la
epidermis (Strange et al., J. Invest. Dermatol., 1993,
101, 695-700). Igualmente, se ha demostrado
que el mantenimiento del fenotipo soriático de biopsias de pieles
humanas injertadas en los ratones SCID eran dependientes de la
inyección conjunta de los linfocitos T procedentes de dichas
lesiones (Gilhar et al., J. Invest. Dermatol., 1997,
109, 283-288).
La expresión de HLA-G en las
células de la piel y su potencial función en las patologías
asociadas ha sido estudiada por Ulbrecht et al. (Eur. J.
Immunol., 1994, 24, 176-180). Los autores de
este artículo que analizan únicamente la expresión de los
tránscritos de las isoformas de membrana de HLA-G y
en particular de la isoforma dominante HLA-G1
demuestran que se detecta entonces un bajo nivel de tránscritos
HLA-G en las biopsias de piel que presentan
lesiones de soriasis, los tránscritos de HLA-G están
o bien ausentes, o bien presentes en un nivel muy elevado en las
biopsias de piel sana procedentes de diferentes individuos. Estos
autores concluyen por consiguiente, que no existe ningún vínculo
evidente entre la expresión de HLA-G y las
patologías de la piel.
Los inventores han descubierto ahora que unas
formas solubles de HLA-G tienen una acción
terapéutica sobre unos estados patológicos inflamatorios de la
piel.
La presente invención tiene por objeto la
utilización de una composición esencialmente constituida por al
menos una forma soluble de HLA-G y por al menos un
vehículo farmacéuticamente aceptable (excipiente) para la
preparación de un medicamento para el tratamiento de los estados
patológicos inflamatorios de la piel.
Los excipientes asociados a dicha composición se
adaptan a la vía de administración deseada; se seleccionan entre los
excipientes conocidos por el experto en la materia.
Dichas HLA-G solubles se pueden
administrar ventajosamente por vía general (vía oral, vía
parenteral) o por vía local (administración tópica).
En este último caso, dicha composición se
presenta en forma de crema, de loción, de liposomas o de gel.
Los inventores han descubierto ahora, de manera
inesperada, la presencia en las lesiones inflamatorias de la piel,
a la vez de macrófagos que expresan la proteína
HLA-G localizados en las papilas de la dermis y de
linfocitos T CD3^{+} infiltrantes, que expresan un receptor
inhibidor de las funciones citotóxicas, reconocido por
HLA-G como por ejemplo el receptor ILT2.
Los inventores han demostrado que la isoforma de
membrana dominante HLA-G1 y la isoforma soluble
HLA-G5 se expresan únicamente en las lesiones
inflamatorias de la piel, mientras que no se detecta ninguna
proteína HLA-G en la piel sana.
\newpage
Los inventores han demostrado también que la
proteína HLA-G y en particular una isoforma que
comprende al menos el dominio \alpha1 de HLA-G es
capaz de inhibir las funciones de proliferación y las funciones
citotóxicas de los linfocitos T.
De este modo, los inventores han identificado por
consiguiente la función antiinflamatoria de la proteína
HLA-G y en particular de una composición
constituida por una forma soluble que puede difundir que comprende
al menos el dominio \alpha1 de HLA-G como por
ejemplo la isoforma HLA-G5, en el tratamiento de
las patologías inflamatorias de la piel.
Según la invención, dicha composición se adapta
particularmente al tratamiento de la soriasis.
Según una realización ventajosa de la invención,
dicha forma soluble de HLA-G se selecciona en el
grupo constituido por las isoformas de HLA-G
solubles que comprenden al menos un dominio extracelular
(\alpha1, \alpha2 o \alpha3) y las formas solubilizadas de
HLA-G1, HLA-G2,
HLA-G3 o HLA-G4 (isoformas de
membrana).
Dichas HLA-G solubles comprenden
al menos el dominio extracelular \alpha1.
Dichas formas solubles se producen
particularmente en un baculovirus.
Por lo que respecta a las formas de membrana, se
expresan ventajosamente en células eucariotas, según el
procedimiento descrito en la Solicitud Internacional PCT WO
98/37098, y a continuación se solubilizan por tratamiento de la
membrana (agente decapante, tal como la papaína) y purificación
adecuada, por ejemplo sobre columna de inmunoafinidad con
anticuerpos específicos.
Se entiende por forma soluble de
HLA-G, tanto las HLA-G solubles (que
no llevan dominio transmembrana) como las HLA-G de
membrana solubilizadas, por ejemplo en las condiciones precisadas
anteriormente.
Preferiblemente, dicha composición, administrada
por vía tópica, comprende entre 0,1 y 5 \mug/ml, preferiblemente
entre 0,5 y 2,5 \mug/ml de forma soluble de
HLA-G.
La presente invención se refiere también a un
procedimiento de preparación de una HLA-G soluble,
caracterizado porque comprende las siguientes etapas:
- infección conjunta de células de insectos por
un baculovirus que contienen el ADNc de la \beta2M y otro
baculovirus que contiene la cadena \alpha de una isoforma soluble
de HLA-G;
- cultivo de las células transfectadas de
insectos, y
- recogida de los sobrenadantes y purificación de
la isoforma de HLA-G soluble expresada.
Según una realización ventajosa de dicho
procedimiento, dicha isoforma de HLA-G soluble se
purifica con la ayuda de un anticuerpo específico de las isoformas
de HLA-G solubles.
Según una disposición ventajosa de esta
realización, dicho anticuerpo se obtiene por inmunización de
mamíferos no humanos, tales como conejos con un péptido inmunógeno
constituido por un péptido sintético de 21 aminoácidos, que
corresponde a la parte C-terminal codificada por el
intrón 4 de las formas solubles HLA-G cuya
secuencia es SKEGDGGIMSVRESRSLSEDL (SEQ ID Nº : 1) acoplado a la
proteína portadora KLH.
Además de las disposiciones anteriores, la
invención comprende también otras disposiciones, que se harán
evidente en la siguiente descripción, que se refiere a ejemplos de
realización del procedimiento objeto de la presente invención, así
como a los dibujos adjuntos, en los que:
- Las figuras 1 y 2 muestran la presencia de los
ARN de las diferentes isoformas de HLA-G en las
lesiones de soriasis, por comparación con la piel sana.
- La figura 3 muestra la presencia del ARN
especifico de la isoforma HLA-G5 en las lesiones de
soriasis, por comparación con la piel sana.
- La figura 4 muestra la actividad inhibidora de
las isoformas HLA-G en células asesinas naturales
(células NK) presentes en la sangre periférica; esta figura
comprende en la abscisa la isoforma estudiada y en la ordenada, el
porcentaje de lisis específico. Se utilizan células M8 (células de
líneas de melanoma HLA de clase I^{+}, clase II^{-})
transfectadas bien con el vector solo (M8-pCDNA)
(Invitrogen), bien con los vectores que contienen el ADNc que
codifica HLA-G1
(M8-HLA-G1). el ADNc que codifica
HLA-G2 (M8-HLA-G2),
el ADNc que codifica HLA-G3
(M8-HLA-G3), el ADNc que codifica
HLA-G4 (M8-HLA-G4)
como dianas (T). Se utilizan células mononucleadas de sangre
periférica PB-MC como células efectoras (E). Los
resultados se expresan en porcentajes de lisis, registrados en 4
horas en un ensayo de liberación de cromo 51 (^{51}Cr);
- La figura 5 muestra la actividad inhibidora de
las isoformas HLA-G sobre una línea de linfocitos T
CD8+ restringida para HLA-A2 que presenta un péptido
viral procedente de la matriz del virus de la influenza, posiciones
58 a 66; esta figura comprende en la abscisa la isoforma estudiada
y en la ordenada el porcentaje de lisis específico; la relación de
células efectoras/células diana es de 15:1.
Se ha de entender sin embargo, que estos ejemplos
se dan únicamente a título ilustrativo del objeto de la invención,
no constituyendo en modo alguno una limitación de éste.
La isoforma soluble HLA-G5 cuya
estructura se compone de 3 dominios extracelulares \alpha1,
\alpha2 y \alpha3 asociada a la \beta2- microglobulina
(\beta2M), procede de un tránscrito alternativo que tiene un
codón de parada en el intrón 4 del gen HLA-G. La
producción de una proteína HLA-G soluble
recombinante recurre a una infección conjunta de células de
insectos mediante un baculovirus que contienen el ADN complementario
de la \beta2M y de otro baculovirus que contienen el ADNc de la
cadena \alpha de HLA-G5. Esto permite
efectivamente obtener la forma fisiológica
HLA-G5/\beta2M.
La secuencia de ADN codificante \beta2M se
inserta en los sitios BgIII-Kpnl del vector de
transferencia pTen12 (Quantum). El clon recombinante se verifica
por digestión enzimática, y a continuación se amplifica y esteriliza
para la transfección conjunta con el ADN del baculovirus BacTen
linealizado.
La secuencia que codifica la molécula
HLA-G5 se inserta en los sitios
BgIII-Kpn1 del vector de transferencia pTen12. El
clon recombinante se verifica por digestión enzimática, y a
continuación se amplifica y se esteriliza para la transfección
conjunta con el ADN del baculovirus BacTen (Quantum)
linealizado.
La primera etapa consiste en obtener baculovirus
recombinantes HLA-G5A por una parte, y \beta2M por
otra parte. Los dos vectores de transferencia que llevan los genes
\beta2M y HLA-G5A se colocan en presencia de
BacTen lineal para transfectar conjuntamente las células de insecto
Sf9 en cultivo. Los sobrenadantes de transfección conjunta se
recogen y se realiza una clonación por zonas de lisis para aislar
los clones de los baculovirus recombinantes. Para garantizar la
calidad de la construcción, se extrae el ADN de los clones virales
y se verifica la inserción del gen en el buen locus viral
por PCR. Se han obtenido seis clones para cada una de las
construcciones y cada uno ha servido para infectar de nuevo
células Sf9. Los sobrenadantes de cultivo así como las células se
han recuperado a continuación, después una centrifugación. Esta
proteína se purifica por inmunoafinidad mediante anticuerpos
PAG5-6 (véase el ejemplo 4). Se verifica la
estructura de la proteína por transferencia Western a la vez con
anticuerpos PAG5-6
(anti-HLA-G5) y anticuerpos B1G6
(Immunotech) (anti-\beta2M) específicos
respectivamente de la forma soluble HLA-G5 y de la
\beta2M. Entre los 6 clones que producen HLA-G5 y
los 4 que producen \beta2M, se ha seleccionado uno de cada. Se ha
utilizado Un clon HLA-G5\alpha y un clon
\beta2M para infectar conjuntamente células Sf9. Mediante el
análisis por transferencia Western e inmunoprecipitación con un
anticuerpo conformacional W6/32 (IgG2a, anti-cadenas
\alpha de HLA de clase I asociadas a la
\beta2-m (Sigma)), se puede demostrar que el
sobrenadante de esta infección conjunta contiene la proteína
HLA-G5 asociada a la \beta2M; ésta presenta de
este modo una forma próxima a la forma fisiológica. Estas células
Sf9 permiten por lo tanto la obtención de grandes cantidades de
proteína soluble HLA-G5.
Se han analizado biopsias de piel que presentan
placas típicas de lesiones de soriasis crónica, procedentes de
pacientes que han seguido ningún tratamiento local o general en los
15 días anteriores al día de la biopsia.
Se han utilizado biopsias de piel sanas
procedentes de pacientes que han sido sometidos a una cirugía
mamaria reductora como testigo negativo.
Las muestras se separan en dos, una parte se
congela inmediatamente en nitrógeno líquido para el análisis
mediante RT-PCR y la parte restante se incluye en el
OCT (Miles Inc Diagnostics Division) para el análisis
inmunohistoquímico.
Los ARN mensajeros se extraen de biopsias
congeladas de 6 especímenes de piel lesionada por soriasis
(Pso1-Pso6, figuras 1 y 3) y de 4 especímenes de
piel normal (piel sana 1-Piel sana 4, figuras 2 y 3)
en las siguientes condiciones; las muestras se ponen en presencia
del reactivo RNA Now (Biogentex, Inc.) y se homogeneizan con
la ayuda del homogeneizador ultraturrax (IKA Labortechnic),
según las recomendaciones del fabricante. La calidad del ARN
extraído se verifica por electroforesis en gel de agarosa al 1,5%
en condiciones desnaturalizantes. 5 \mug se transcriben
inversamente a ADNc mediante un cebador oligo dT de 12 a 18
oligonucleótidos (Gibco BRL) y de la transcriptasa inversa del
virus de Moloney (M-MLV, durante 1 a 42 horas. A
continuación, el ADNc obtenido se amplifica por PCR con, por una
parte cebadores que reconocen el conjunto de los tránscritos
HLA-G [cebador G.257 (exón 2) y 3G.U (extremo 3' no
traducido)] utilizados para la amplificación PCR de los tránscritos
HLA-G correspondientes a las diferentes isoformas
conocidas de HLA-G (figuras 1 y 2) y por otra parte
cebadores específicos de la secuencia HLA-G5
soluble, a saber los cebadores G.526 y G.i4b (figura 3).
Más concretamente, los diferentes cebadores y
sondas utilizados son, por consiguiente, los siguientes:
- G.526 (exón 3) y G3.U (3' UT) para las
isoformas G1, G4 y G5;
- G.526 (exón 3) y G.i4b (intrón 4) para la
isoforma G5;
- G.3 (cubriendo parcialmente los exones 2 y 4)
y G3.U (3' UT) para las isoformas G2 y G6;
- G.3-4 (cubriendo parcialmente
los exones 2 y 5) y G3.U (3' UT) para la isoforma G3.
Las condiciones de PCR son las siguientes: 1
minutos a 90ºC, 90 segundos a 65ºC (61ºC para el par de cebadores
G.526 y G.i4b) y 2 minutos a 72ºC, durante 35 ciclos. Los productos
PCR se separan por electroforesis en gel de agarosa al 1,5%.
Los tránscritos de la
\beta-actina se amplifican conjuntamente, durante
16 ciclos, con la ayuda de cebadores específicos
(Clon-tech) para normalizar la cantidad de ARN entre
las diferentes muestras.
Los productos PCR se transfieren a continuación
sobre una membrana de nylon (Hybond N^{+,} Amersham),
hibridados con una sonda radiomarcada y se cuantifica la intensidad
de la señal de hibridación por densitometría.
Las sondas HLA-G específicas son
las siguientes:
- GR específica del exón 2 que reconocen todos
los tránscritos de HLA-G y
- G.I4 F específica del intrón, que no reconoce
más que el tránscrito HLA-G5.
Los cebadores y las sondas anteriores se
describen en P. MOREAU et al., C.R. Acad. Sci. Paris,
Sciences de la vie/Life Sciences, 1995; 318,
837-42).
El ADNc de las células de coriocarcinoma
JEG-3 (ATCC), que posee un nivel de transcripción
elevado de HLA-G se utilizan como testigo positivo.
En los ensayos anteriores, la línea JEG-3 se
cultiva en un medio DMEM (Sigma) suplementado con suero de ternero
fetal al 10%, inactivado por calor, antibióticos y
L-glutamina 2 mM. Las líneas celulares no contienen
micoplasmas.
Las bandas HLA-G específicas se
revelan por hibridación con la sonda GR-específica,
localizada en el exón 2. Los productos de la PCR, amplificados
conjuntamente durante la misma reacción, con los cebadores de la
\beta-actina se detectan en la misma membrana con
la ayuda de una sonda \beta-actina.
Los resultados se muestran en las figuras 1 a
4.
Los tránscritos de HLA-G se
detectan en todas las muestras de piel lesionada que presentan
lesiones de soriasis y en únicamente 2 de las 4 muestrasde piel
sana. Salvo una muestra (muestra 3), sólo se detectan los
tránscritos que corresponden a las isoformas HLA-G1
y HLA-G5 en las muestras de piel lesionada. En las
biopsias de piel lesionada de 6 enfermos que tiene soriasis, existe
un nivel transcripcional HLA-G muy elevado, en
particular en lo relativo a la isoforma G1/G5 (p<0,05; figuras 1
y 3).
En estas muestras, la señal de la isoforma
HLA-G5 soluble está ausente en los cuatro
especímenes de pieles normales (figura 3), pero se encuentra en 3 de
los 6 sujetos que presentan una soriasis (figura 3).
\newpage
El conjunto de los resultados muestra que el
nivel de los tránscritos HLA-G1 y G5 es más elevado
en las biopsias de piel que presentan lesiones de soriasis que en
las muestras de piel sana y que el tránscrito HLA-G5
se expresa únicamente en las biopsias de piel que presentan lesiones
de soriasis.
Se han realizado cortes con criostato a partir de
las muestras congeladas y a continuación los cortes se han
deshidratado en acetona -20ºC durante 20 minutos y se han secado al
aire libre.
El inmunomarcaje se realiza con la ayuda del kit
Dako EnVision+System Peroxidase (AEC), (Dako) según las
instrucciones del fabricante.
Los anticuerpos utilizados son los
siguientes:
- 87G y O1G específicos de HLA-G
(HLA-G1 a -G5) y 16G1 específico de
HLA-G5 (D. Geraghty, Fred Hutchinson Cancer Research
Center, Seattle, EE.UU.),
- 4H84 específico de las isoformas de
HLA-G en forma desnaturalizada (M. Mc Master, San
Francisco, EE.UU.),
- anti-ILT2 que reconoce un KIR
implicado en la relación con HLA-G (Navarro et
al., Eur. J; Immunol., 1999, 29, 277-283),
- W6/32: antígeno de clase I del CMH (Sigma),
- Anti-CD3 (Sigma),
- Anti-CD 14 (Sigma),
- IgG2a de ratón: anticuerpo control (Sigma).
Los marcajes dobles se realizan con los
siguientes pares de anticuerpos:
- 87G y anti-CD68
- 87G y anti-CD11c (Dako)
- anti-ILT2 y
anti-CD3.
Las condiciones utilizadas son las siguientes;
después de la incubación con suero normal de cabra, los cortes se
incuban con el primer anticuerpo (87G o anti-ILT2)
durante 60 minutos, se lavan, y continuación se incuban con un
anticuerpo de cabra anti-IgG de ratón acoplado al
rojo Texas. A continuación los cortes se lavan y se incuban durante
30 minutos con el segundo anticuerpo acoplado al isotiocianato de
fluoresceína (FITC); anticuerpo anti-CD68 o
anti-CD11c, cuando el primer anticuerpo es 87G o el
anticuerpo anti-CD3, cuando el primer anticuerpo es
anti-ILT2.
En los cortes controles, el primer anticuerpo
(87G o anti-ILT2) se sustituye por el anticuerpo
control (IgG2a de ratón).
Los cortes se analizan a continuación por
microscopía confocal de láser.
Al utilizar el anticuerpo 87G o el anticuerpo O1G
que reconocen todas las isoformas de HLA-G, no se
detecta ninguna expresión de la proteína HLA-G en
las muestras de piel sana. Por el contrario, en las 9 muestras de
piel que presentan lesiones de soriasis, la expresión de
HLA-G se detecta en las células de las papilas de la
dermis. El nivel de expresión de HLA-G es variable
según las muestras; es elevado en algunas muestras. Además, en dos
muestras únicamente, la expresión de HLA-G se
detecta también en la epidermis, en zonas cercanas al infiltrado de
células inflamatorias de la dermis, bien en los focos aislados de
células inflamatorias o en algunos queratinocitos. La localización
de HLA-G en estos pocos queratinocitos está
aparentemente vinculada a la difusión de la isoforma
HLA-G5 a partir de las células de la dermis que
expresan dicha isoforma.
Al utilizar el anticuerpo 16G1 que reconoce
específicamente la isoforma HLA-G5 soluble, se
detecta también un marcaje específica de las células de las papilas
de la dermis.
Los marcajes dobles con el anticuerpo 87G y el
anticuerpo anti-CD3 o el anticuerpo
anti-CD14 muestran que HLA-G está
localizada conjuntamente en las células que expresan CD14, por el
contrario no se ha observado ninguna localización conjunta de
HLA-G con los linfocitos T (CD3^{+}).
El marcaje de los cortes seriados de las muestras
de piel que presentan lesiones de soriasis con los anticuerpos 87G y
anti-CD68 o anti-CD11c que reconocen
específicamente los macrófagos, demuestran que la casi totalidad de
las células que expresan HLA-G expresan también CD68
y CD11c y por consiguiente son macrófagos.
El marcaje de las biopsias de piel que presentan
lesiones de soriasis con el anticuerpo anti-ILT2
muestra la presencia de un infiltrado denso en la dermis
superficial. Por el contrario, no se detecta ningún marcaje en la
dermis de las muestras de piel sana. Además, unos experimentos de
doble marcaje con el anticuerpo anti-CD3 y
anti-ILT2 muestran la presencia de algunas células
doblemente marcadas en las papilas de la dermis.
En resumen, el conjunto de los resultados
presentados anteriormente muestra que:
- en la piel sana la expresión de los ARN
HLA-G es baja o indetectable y la proteína
HLA-G está ausente,
- en las lesiones de soriasis, existe una mayor
expresión de los ARN y de la proteína de las isoformas
HLA-G1 y -G5,
- en las lesiones de soriasis le expresión de
HLA-G se localiza en los macrófagos y
- en las lesiones de soriasis, los linfocitos T
infiltrantes expresan un receptor inhibidor de las funciones
citotóxicas reconocido por HLA-G (receptor
ILT2).
Estos resultados muestran la presencia en las
lesiones de soriasis, a la vez de células que expresan
HLA-G (macrófagos de las papilas de la dermis) y de
células infiltrantes responsables de las lesiones de soriasis
(linfocitos T CD3^{+}, que expresan un receptor inhibidor de las
funciones citotóxicas reconocido por HLA-G
(receptor ILT2).
Por consiguiente, estos resultados demuestran la
función directa de HLA-G y en particular de la
isoforma de membrana predominante HLA-G1 y de la
isoforma soluble que puede difundir HLA-G5 en la
regulación local de los fenómenos T dependientes responsables de la
soriasis.
La utilización de las células transfectadas con
cada una de las isoformas HLA-G1, -G2, -G3 o G4 como
células diana frente a células inmunocompetentes asesinas naturales
presentes en la sangre periférica permite demostrar que cada una de
las isoformas es capaz de inhibir la actividad citotóxica de las
células asesinas naturales (Figura 4). Estos experimentos se han
efectuado en más de diez donantes voluntarios sanos y la
significatividad de la inhibición ejercida por cada una de las
isoformas se ha validado mediante ensayos estadísticos (Figura
4).
En los ensayos similares de citotoxicidad in
vitro realizados con las mismas células diana frente a células
T CD8^{+}restringidas por el CMH y específicas de un péptido
antigénico también han demostrado que cada una de las isoformas
HLA-G1, -G2, -G3 y -G4 inhibe de manera
significativa la actividad citotóxica de estas células T (figura
5).
Sobre la base de la estructura de la isoforma
HLA-G3 constituida únicamente por el dominio
extracelular \alpha1 que posee todas las propiedades inhibidoras
descritas anteriormente, se puede llegar a la conclusión de la
funcionalidad de este dominio. Este dominio contiene por
consiguiente el motivo funcional de HLA-G y se
podrá por lo tanto utilizar como agente farmacológico para una
inmunotolerancia.
La función de HLA-G y en
particular de la isoforma de membrana predominante
HLA-G1 y de la isoforma soluble que puede difundir
HLA-G5 en la regulación local de los fenómenos T
dependientes responsables de la soriasis se ha demostrado en el
ejemplo 2.
La función de HLA-G y en
particular del dominio \alpha1 de dichas isoformas en la
inhibición de las funciones T se ha demostrado anteriormente.
Por consiguiente, el conjunto de los resultados
indica que una composición farmacéutica que contiene dicha isoforma
HLA-G en particular en forma soluble que puede
difundir, como la isoforma HLA-G5, presenta una
función protectora en el tratamiento de la soriasis.
La inmunización de conejos con un péptido
inmunógeno constituido por unpéptido sintético de 21 aminoácidos,
que corresponde a la arte C-terminal codificada por
el intrón 4 des las formas solubles HLA-G cuya
secuencia es SKEGDGGIMSVRESRSLSEDL (SEQ ID Nº : 1) acoplado a la
proteína portadora KLH permite obtener un suero policlonal que
reconoce específicamente las formas solubles de
HLA-G (HLA-G5 y
HLA-G6) por las técnicas de inmunoprecipitación,
inmunoimprenta (Transferencia Western), inmunohistoquímica e
inmunoenzimática de tipo ELISA. Este suero se ha purificado en
columna de afinidad (proteína G- Sefarosa) y puede servir a la vez
para la detección, la titración y la purificación de las formas
solubles HLA-G.
Claims (7)
1. Utilización de una composición esencialmente
constituida por al menos una forma soluble de HLA-G
y por al menos un vehículo farmacéuticamente aceptable, para la
preparación de un medicamento para el tratamiento de los estados
patológicos inflamatorios de la piel.
2. Utilización según la reivindicación 1,
caracterizada porque dicha forma soluble de
HLA-G se selecciona en el grupo constituido por las
isoformas de HLA-G solubles que comprenden al menos
el dominio extracelular \alpha1 y las formas solubilizadas de
HLA-G1, HLA-G2,
HLA-G3 o HLA-G4.
3. Utilización según la reivindicación 1 o la
reivindicación 2, caracterizada porque dicha composición
comprende entre 0,1 y 5 \mug/ml, preferiblemente entre 0,5 y 2,5
\mug/ml de forma soluble de HLA-G.
4. Procedimiento de preparación de una
HLA-G soluble, caracterizado porque comprende
las siguientes etapas:
- infección conjunta de células de insectos por
un baculovirus que contiene el ADN de la \beta_{2}M y otro
baculovirus que contiene la cadena \alpha de una isoforma de
HLA-G soluble;
- cultivo de las células transfectadas de
insectos, y
- recogida de los sobrenadantes y purificación de
la isoforma de HLA-G soluble expresada.
5. Procedimiento según la reivindicación 4,
caracterizado porque dicha isoforma de HLA-G
soluble se purifica mediante un anticuerpo específico de las
isoformas de HLA-G soluble.
6. Procedimiento según la reivindicación 5,
caracterizado porque dicho anticuerpo se obtiene por
inmunización de mamíferos no humanos, en particular los conejos con
un péptido inmunógeno de SEQ ID Nº : 1 acoplado a la proteína
portadora KLH.
7. Anticuerpo
anti-HLA-G soluble,
caracterizado porque se obtiene por inmunización de mamíferos
no humanos, en particular los conejos con un péptido inmunógeno
constituido por un péptido sintético de 21 aminoácidos de SEQ ID Nº
: 1 acoplado a la proteína portadora KLH.
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