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ES2202142T3 - Nuevos alcaloides de tipo indolocarbazol obtenidos de una actinomiceto marino. - Google Patents

Nuevos alcaloides de tipo indolocarbazol obtenidos de una actinomiceto marino.

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Publication number
ES2202142T3
ES2202142T3 ES00940633T ES00940633T ES2202142T3 ES 2202142 T3 ES2202142 T3 ES 2202142T3 ES 00940633 T ES00940633 T ES 00940633T ES 00940633 T ES00940633 T ES 00940633T ES 2202142 T3 ES2202142 T3 ES 2202142T3
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ES
Spain
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hydrogen atom
carbon atoms
compound according
compound
Prior art date
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Expired - Lifetime
Application number
ES00940633T
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English (en)
Inventor
Dolores Pharma Mar S.A. Garcia Gravalos
Julia Instituto Biomar S.A. Perez
Librada Maria Instituto Biomar S.A. Canedo
Francisco Instituto Biomar S.A. Romero
Fernando Instituto Biomar S.A. Espliego
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Instituto Biomar SA
Original Assignee
Instituto Biomar SA
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Publication date
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Expired - Lifetime legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D498/00—Heterocyclic compounds containing in the condensed system at least one hetero ring having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms
    • C07D498/22—Heterocyclic compounds containing in the condensed system at least one hetero ring having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms in which the condensed system contains four or more hetero rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents

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  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
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Abstract

Compuestos de fórmula (1): en donde: R1 es un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo de entre 1 y 6 átomos de carbono o un grupo alcoxi de entre 1 y 6 átomos de carbono; y R2 es un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo de entre 1 y 6 átomos de carbono o un grupo alcoxi de entre 1 y 6 átomos de carbono; y las sales farmacéuticamente aceptables del mismo.

Description

Nuevos alcaloides de tipo indolocarbazol obtenidos de un actinomiceto marino.
Campo de la invención
Se han aislado nuevos alcaloides de tipo indolocarbazol a partir de un caldo de cultivo de un actinomiceto productor de estaurosporina (CLCO-002). En el presente documento se describe su producción por fermentación aeróbica bajo condiciones controladas de la cepa, y el aislamiento y la purificación de los compuestos. Los compuestos y el caldo de cultivo demuestran una actividad significativa frente a varias líneas de células cancerígenas.
Antecedentes de la invención
La familia de la isoenzima de la protein quinasa C (PKC) juega un papel clave en la transducción de la señal y la regulación celular (Y. Nishizuka, 1988). A partir de la observación de que los ésteres de forbol que favorecen los tumores son capaces de estimular la actividad de la PKC (Y. Nishizuka, 1984), se concluyó que los inhibidores de esta enzima pueden ser útiles para la quimioterapia del cáncer. Los inhibidores de la PKC han sido investigados de forma extensiva como fármacos potenciales para el tratamiento del cáncer.
La patente WO 94/04541 describe alcaloides de tipo indolocarbazol, algunos de los cuales son inhibidores de la protein quinasa. Los compuestos, así como alcaloides conocidos, tales como la estaurospina, pueden ser combinados con compuestos de tipo taxol y son útiles en el tratamiento del cáncer.
La patente JP-A-5-247055 describe derivados de estaurosporina que pueden ser obtenidos por reacción de la estaurosporina con un agente de alcoxicarbonilación. Los compuestos son útiles como agentes que incrementan el efecto antiúlcera.
Meyer y col. Int. J. Cancer, 43, 851-856 (1989) describen derivados de estaurosporina que pueden ser obtenidos por fermentación, en los que el grupo metilamino y, opcionalmente, el átomo de nitrógeno del pirrolidinilo están derivatizados.
La patente US 5093330 describe derivados de estaurosporina N-sustituidos que pueden ser obtenidos por alquilación o acilación convencional de la quinasa C. Estos compuestos son inhibidores selectivos de la protein 
\hbox{quinasa C.}
De acuerdo con ello, un objetivo de la presente invención es proporcionar nuevos agentes antitumorales; estos compuestos son alcaloides con una actividad significativa frente a varias líneas de células cancerígenas.
Todavía otro objetivo de esta invención es proporcionar composiciones farmacéuticas para la administración a un paciente que precise el tratamiento utilizando los compuestos activos descritos en la presente invención.
Los productos microbianos son interesantes debido a que su producción industrial está bien establecida en la actualidad. Por consiguiente, otro objetivo de esta invención está dirigido a la producción de los compuestos activos y a su aislamiento y purificación a partir del caldo de fermentación resultante.
Breve exposición de la invención
Esta invención proporciona compuestos de fórmula (1).
1
en donde:
R^{1} es un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo de entre 1 y 6 átomos de carbono o un grupo alcoxi de entre 1 y 6 átomos de carbono; y
R^{2} es un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo de entre 1 y 6 átomos de carbono o un grupo alcoxi de entre 1 y 6 átomos de carbono;
y las sales farmacéuticamente aceptables del mismo.
En las definiciones de los grupos R^{1} y R^{2} en la fórmula (1), los grupos alquilo y la mitad alquilo del los grupos alcoxi son grupos alquilo de cadena lineal o ramificada de entre 1 y 6 átomos de carbono tales como metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, isobutilo, sec-butilo, tertbutilo, pentilo, neopentilo y hexilo.
Se prefiere que R^{1} y R^{2} representen de forma independiente un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo de entre 1 y 4 átomos de carbono, de forma particular un átomo de hidrógeno, un grupo metilo o un grupo etilo.
En una realización preferida la presente invención se refiere a la 4'-N-metil-5'-hidroxiestaurosporina (IB-97224) y a la 5'-hidroxiestaurosporina (IB-97225), con las fórmulas estructurales:
2
En esta invención también se describe el procedimiento de obtener compuestos de fórmula (1) o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos. El procedimiento comprende el cultivo de una cepa de un microorganismo capaz de producir un compuesto de fórmula (1), recuperar el compuesto de fórmula (1) del caldo de cultivo, y, opcionalmente salificar el compuesto recuperado.
Un procedimiento especialmente preferido para producir los compuestos IB- 97224 y IB-97225 comprende el cultivo de una cepa de un microorganismo capaz de producir IB-97224 y IB-97225 en un medio nutriente acuoso con fuentes de carbono y nitrógeno y sales asimilables, bajo condiciones aeróbicas de inmersión controladas. Los compuestos IB-97224 y IB- 97225 son recuperados y purificados a partir del caldo de cultivo.
El cultivo preferido es la cepa CLCO-002, y sus caracteres químicos, bioquímicos y morfológicos muestran que pertenece al grupo Actimomicetales. Otras cepas de actinomiceto también pueden ser utilizadas en el procedimiento de acuerdo con la invención.
Tal como se ha descrito anteriormente, se ha encontrado que los compuestos de fórmula (I), especialmente el IB-97224 y el IB-97225, tienen buena actividad frente a las líneas de células tumorales en murinos y humanos, incluyendo las P-3888D_{1}, HT-29, A-549 y SK-MEL-28.
Por consiguiente, la invención se refiere además al uso de un compuesto de fórmula (1), tal como se ha definido anteriormente, o a una sal farmacológicamente aceptable del mismo en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o profilaxis de tumores malignos en un mamífero.
La presente invención también se refiere a preparaciones farmacéuticas que contienen como ingrediente activo compuestos de fórmula (1), o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, junto con un soporte farmacéuticamente aceptable o diluyente así como el procedimiento para su preparación.
Ejemplos de composiciones farmacéuticas incluyen cualquier sólido (comprimidos, pastillas, cápsulas, gránulos, etc.) o líquido (soluciones, suspensiones o emulsiones) con una composición adecuada para la administración oral, tópica o parenteral, y pueden contener los compuestos puros o en combinación con cualquier soporte u otros compuestos farmacológicamente activos. Estas composiciones pueden precisar ser estériles cuando se administran por vía parenteral.
La dosis correcta de una composición farmacéutica variará de acuerdo con la formulación particular, el modo de aplicación, y el sitio particular, huésped y bacteria o tumor a tratar. También pueden ser tenidos en cuenta otros factores como la edad, el peso corporal, el sexo, la dieta el tiempo de administración, la velocidad de excreción, la condición del huésped, las combinaciones de fármacos, las sensibilidades a la reacción y la severidad de la enfermedad. La administración puede ser llevada a cabo de forma continua o periódicamente dentro de la dosis tolerada máxima.
Descripción detallada de la invención El organismo de producción
El microorganismo utilizado para la producción de estos nuevos compuestos es preferiblemente una cepa de actinomiceto, particularmente la cepa de actinomiceto CLCO-002, un cultivo del cual ha sido depositado en la Colección Española de Cultivos Tipo en la Universidad de Valencia, España, con el número de acceso CECT-3347. Este depósito ha sido realizado bajo las disposiciones del Tratado de Budapest y todas las restricciones en la asequibilidad del mismo al público serán mantenidas de forma irrevocable hasta la concesión de una patente basada en esta solicitud.
El organismo fue aislado de una esponja marina no identificada recogida en las aguas de las Islas Canarias.
Todos los cultivos fueron incubados a 27ºC y los registros de los resultados se hicieron semanalmente hasta los 21 días.
Una descripción del organismo es del modo siguiente:
Morfología
El medio de cultivo utilizado para este estudio fue el medio ISP No. 2, 4, 5 y 6 (Shirling y Gotlieb, 1966), el medio No. 172 de la ATCC (American Type Culture Collection Catalog, 1989), el Czapek Agar (Atlas, 1993), el Bennet Agar (Atlas, 1993), 1,5% del Water Agar (Luedemann). Todos los medios fueron suplementados con agua de mar artificial al 50%. Se estudió el crecimiento después de 21 días a 28ºC. Se observaron varias sombras de naranja. No se formó micelio aéreo. El micelio del substrato fue ramificado. No se observó ningún pigmento soluble.
Características fisiológicas
Para los estudios de utilización del carbono y el nitrógeno se utilizó el ISP-9 (Shirling & Gotlieb, 1966). Debido a la baja velocidad de crecimiento del CLCO-002 en el medio definido, los ensayos de utilización de carbono y nitrógeno mostraron un crecimiento residual con lo que no pudieron obtenerse resultados claros. Se determinó la resistencia al NaCl utilizando un medio ATTC 172 conteniendo concentraciones crecientes de NaCl. La concentración óptima de sal fue del 1%. No se observó ningún crecimiento con sal al 7%.
Composición química de la célula Aminoácidos
Se determinó el ácido diaminopimélico por el método de Hasegawa y col. (1983). El isómero meso del ácido 2,6-diaminopimélico estuvo presente en el hidrolizado de las células completas de la cepa CLCO-002.
Ácidos grasos
Se determinó el FAME por el método de Van der Auwera y col. (1986). La composición del FAME, así como la comparación con otras cepas similares se encuentra descrita en la Tabla 1.
Aunque el organismo depositado es claramente preferido, la presente invención no está restringida o limitada a esta cepa u organismo particular. Es la intención de los presentes inventores el incluir cualquier otro organismo, cepa o mutante productor dentro del alcance de esta invención.
3
4
Fermentación
La cepa CLCO-002, cuando se cultiva bajo condiciones controladas en un medio adecuado produce los compuestos IB-97224 e IB-97225. Esta cepa se hace crecer en un medio nutriente acuoso, bajo condiciones aeróbica y mesofílicas, preferiblemente entre 22ºC y 35ºC a un pH comprendido entre 6,0 y 8,0. Pueden utilizarse una amplia variedad de medio de cultivo líquidos para el cultivo del organismo, medio útiles son aquellos que incluyen una fuente de carbón asimilable, tal como almidón, dextrina, molasas de azúcar, glicerol, glucosa y similares, como fuente de nitrógeno asimilable tal como proteínas, hidrolisatos de proteína, comidas desengrasadas, maíz remojado, y similares, y aniones y cationes inorgánicos útiles tales como sodio, magnesio, potasio, amonio, sulfato, cloruro, fosfato, carbonato, y similares. También pueden añadirse trazas de elementos. La aireación se consigue de forma preferible proporcionando aire al medio de fermentación. La agitación es proporcionada por un impulsor mecánico. Se ha encontrado que los tanques de fermentación convencionales están bien equipados para llevar a cabo el cultivo de este organismo. Puede precisarse la adición de nutrientes y el control del pH, así como de agentes antiespumantes, durante las varias etapas de fermentación para incrementar la producción e evitar la formación de espuma.
Las etapas requeridas necesarias para la producción de estos compuestos por el organismo preferido son:
Empezar con la congelación o liofilización del micelio. Obtener la masa de micelio cultivando las células iniciales en frascos de agitación con un medio de cultivo conteniendo algunos de los ingredientes descritos anteriormente a temperaturas mesofílicas y en condiciones aeróbicas, esta etapa puede ser repetida varias veces, si es preciso, y el material recogido puede ser utilizado como un inoculo para sembrar uno o varios tanques de fermentación con cualquier medio de cultivo apropiado, si se desea estos tanques pueden ser utilizados también como inóculo, y esta etapa puede ser repetida varios veces cuando se precise, o puede servir como la etapa de producción, dependiendo del volumen de caldo precisado. La etapa de producción puede durar entre muy pocos días hasta más de una semana, dependiendo de la cepa, de las etapas del inoculo, de la temperatura y otras condiciones. Una vez que la fermentación ha alcanzado su máximo rendimiento puede ser recogido para el aislamiento de los nuevos compuestos.
El medio de producción puede ser diferente que el utilizado como inóculo. En la Tabla 2 se describen los medios típicos que pueden ser utilizados para inóculo y la producción de estos nuevos compuestos:
TABLA 2
Medio del inóculo (g/litro) Medio de producción (g/litro)
Dextrosa 5 Dextrosa 5
Almidón 20 Dextrina 20
Extracto de buey 3 Comida de habas de soja 3
Extracto de levadura 5 Extracto de levadura 5
Peptona 5 Peptona 1
CaCO_{3} 4 CaCO_{3} 4
NaCl 4 NaCl 5
Na_{2}SO_{4} 1 Na_{2}SO_{4} 2,5
KC1 0,5 KC1 0,5
MgC1_{2} 2 MgCl_{2} 0,5
K_{2}HPO_{4} 0,5 K_{2}HPO_{4} 0,5
(NH_{4})_{2}SO_{4} 0,5
Agua del grifo hasta 1 000 ml
Se puede hacer un seguimiento de la producción de estos compuestos por el ensayo del caldo completo frente al A-549 o cualquier otra célula sensible o por HPLC o cualquier otro método con suficiente sensibilidad.
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Aislamiento del IB-97224 y del IB-97225
Los alcaloides IB-97224 e IB-97225 pueden ser aislados de la masa del micelio por extracción con una mezcla adecuada de disolventes tal como CHCl_{3} : CH_{3}OH : H_{2}O. La actividad está concentrada en la capa inferior. Los extractos de repetidas extracciones pueden ser combinados y evaporados a sequedad a vacío.
La separación y purificación del IB-97224 y del IB-97225 a partir del extracto del crudo activo puede ser llevado a cabo por el uso de la combinación adecuada de las técnicas cromatográficas convencionales.
El fraccionamiento puede ser guiado por la actividad antitumoral de las fracciones, o por la visualización por TLC (cromatografía de capa fina) con vanillina en H_{2}SO_{4} concentrado, o por HPLC (cromatografía líquida de alta resolución) analítica con un detector de fotodiodo direccional. Los análisis de HPLC se llevaron a acabo a temperatura ambiente (Waters RMC 8 x 10, 8C18 cartucho de 10\mum) utilizando como fase móvil acetonitrilo-bicarbonato sódico 0,025M pH=3 (75 : 25) y una velocidad de flujo de 2 ml/min. y se registró a 290 nm. Los compuestos de interés mostraron tiempos de retención de entre 3,92 y 3,29 minutos para el IB-97224 y el IB-97225 respectivamente.
Los datos espectroscópicos que se dan a continuación permiten identificar los compuestos como IB-97224 y IB-97225. Los diferentes átomos son numerados utilizando el sistema numérico que se indica a continuación. Se utilizan las siguientes abreviaciones:
Espectros de IR: w: débil; m: media; s: fuerte; br: ancha.
Espectros de RMN: s: singulete; d: doblete; t: triplete; dd: doblete de dobletes.
5
4'-N-metil-5'-hidroxiestaurosporina (IB-97224) (R^{2}=Me)
IR (KBr) \nu_{max}/cm^{-1}: 3406 (s, br), 3070 (m), 2925 (s), 2852 (m), 1915 (w, br), 1664 (s), 1583 (s), 1450 (m), 1415 (m), 1391 (s), 1351 (s), 1319 (s), 1281 (s), 1249 (s), 1236 (m), 1223 (m), 1181 (m), 1150 (m), 1117 (s), 1103 (s), 1066 (s), 1018 (m), 988 (m), 887 (w), 835 (w), 816 (w), 742 (s), 698 (w), 664 (w), 636 (w), 609 (w).
^{1}H RMN (300 MHz, CDC1_{3}), \delta/ppm: 9,43 (1H, d, J 7,7 Hz, C4H), 7,90 (1H, d, J 7,7 Hz, C8H), 7,76 (1H, d, J 7. 7 Hz, C11H), 7,64 (1H, d, J 7. 7 Hz, C1H), 7. 53 (1H, t, J 7. 7 Hz, C2H), 7,45 (1H, t, J 7,7 Hz, C10H), 7,38 (1H, t, J 7. 7 Hz, C3H), 7,34 (1H, t, J 7. 7 Hz, C9H), 6,52 (1H, s, C6'H), 6,50 (1H, s, N6H), 4,99 (1H, s, C7H), 4,43 (1H, d, J 9,9 Hz, C5'H), 3. 95 (1H, s, C3H), 3,02 (1H, d, J 9,9 Hz. C4'H), 2,48 (3H. s. CH_{3}), 2,37 (6H, s, N4' (CH_{3})_{2}), 2,03 (3H, s, CH_{3}O).
^{13}C RMN (75 MHz, CDCl_{3}), 173,65 (C5), 137,86 (Clla), 137,12 (C13a), 131,94 (C7a), 130,64 (C12a), 126,79 (C12b), 126,13 (C4), 125,46 (C2), 124,94 (C10), 124,54 (C7c), 123,22 (C4a), 121,49 (C8), 120,43 (C9), 119,98 (C3), 118,89 (C4c), 115,86 (C4b), 114,14 (C7b), 111,46 (C 11), 108,97 (C1), 94,92 (C2'), 91,54 (C6'), 79,30 (C3'), 69. 50 (C5'), 66,75 (C4'), 58,36 (CH_{3}0), 45,79 (C7), 41,67 (N4' (CH_{3})_{2}), 28,00 (CH_{3}).
UV (75: 25 CH_{3}CN/0,025 M Na_{2}HPO_{4} pH 3), \lambda_{max}/nm: 370, 354, 334, 320, 291, 242, 206.
m/z (Bombardeo Atómico Rápido) 497,2 (MH^{+}).
5'-Hidroxiestaurosporina (IB-97225) (R^{2}=H)
IR (KBr) \nu_{max}/cm^{-1}: 3415 (s, br), 3070 (m), 2931 (m), 2851 (m), 1991 (w, br), 1664 (s), 1583 (m), 1453 (s), 1416 (m), 1392 (m), 1352 (s), 1317 (s), 1280 (m), 1248 (m), 1236 (m), 1225 (m), 1151 (m), 1130 (m), 1118 (m), 1064 (m), 1036 (m), 1017 (m), 973 (w), 927 (w), 896 (w), 860 (w), 836 (w), 814 (w), 772 (m), 746 (s), 651 (w), 638 (w).
^{1}H RMN 300 MHz, CDCl_{3}), \delta/ppm: 9,40 (1H, d, J 7,4 Hz. C4H), 7,89 (1H, d, J 7,4 Hz, C8H), 7,85 (1H, d, 7,4, CllS, 7,53 (1H, d. J 8,1 Hz, C1H), 7,44 (2H, t, J 7,4 Hz, C2H & C10H), 7,31 (2H, t, J 7,4 Hz, C3H & C9H), 6,49 (1H, d, J 1,2 Hz, C6'H), 6,43 (1H, s, N6H), 4,98 (1H, s, C7H), 4,26 (1H, dd, J 6,8 Hz, 1,2 Hz, C5'H), 4,14 (1H, d, J 2,8 Hz, C3'H), 3,09 (1H, dd, J 6,8 Hz, 2,8 Hz, C4'H), 2,71 (3H, s, CH_{3}O), 2,45 (3H, s, CH_{3}), 2,17 (3H, s, CH_{3}N4').
^{13}C RMN (75 MHz, CDCl_{3}), \delta/ppm: 173,81 (C5), 138,86 (Clla), 137,05 (C13a), 132,17 (C7a), 130,50 (C12a), 126,89 (C12b), 126,13 (C4), 125,33 (C2), 124,67 (C10), 124,52 (C7c), 123,24 (C4a), 121,01 (C8), 120,32 (C9), 119,92 (C3), 118,56 (C4c), 115,64 (C4b), 114,19 (C7b), 113,50 (C11), 108,10 (C1), 92,37 (C2'), 88,38 (C6'), 80,14 (C3'), 70,03 (C5'), 60,11 (C4'), 59,02 (CH_{3}0), 45,88 (C7), 33,68 (CH_{3}N4'), 28,96 (CH_{3}).
UV (75: 25 CH_{3}CN/0,025 M Na_{2}HPO_{4} pH 3), \lambda_{max}/nm: 370, 354, 334, 320, 291, 242, 206.
m/z (Bombardeo Atómico Rápido) 483,2 (MH^{+}).
Actividad Biológica
Se han determinado las actividades antitumorales de los compuestos IB- 97224 y IB-97225 in vitro en cultivos celulares de leucemia P-388D_{1} en ratón, carcinoma A-549 de pulmón humano, carcinoma HT-29 de colon humano y melanoma SK-MEL-28 humana. El procedimiento se llevó a cabo utilizando la metodología descrita por Bergeron, y col. (1984), y por Schroeder, y col.(1981).
La presente invención se ilustrará además con referencia a los siguientes ejemplos los cuales son de ayuda a la presente invención, pero que no se construyen como limitantes de la misma. Todos los porcentajes descritos en el presente documento, a no ser que se especifique de otra forma, se presentan en peso. Todas las temperaturas son expresadas en grados Celsius. Todas las incubaciones son llevadas a cabo a 28ºC y los frascos son agitados en un agitador orbital. Todos los medios y recipientes se agitan en un agitador orbital. Todos los medios y recipientes son estériles y todos los cultivos se procesan de forma aséptica.
Ejemplo 1
Cultivo de Reserva: Se preservó en estado de congelación el caldo completo de un cultivo puro de la cepa CLCO-002 en glicerol al 20%.
Inóculo: Se utilizó un cultivo congelado o un cultivo de agar inclinado con buen crecimiento (5% vol.) para sembrar 100 ml del medio de sembrado descrito previamente contenido en un frasco de agitación de 250 cc. Se incubó el frasco durante 48 hr. Se sembraron 500 ml del mismo medio en un frasco de tipo Erlenmeyer de 2 L con un 10% del inóculo de la primera etapa. Se incubó el frasco durante 48 h.
Fermentación: Con 2,5 L del inóculo de la segunda etapa se sembraron 50 L del medio de producción ya descrito en un tanque de fermentación de 75 L. La fermentación se llevó a cabo durante 96 horas con una agitación de 400 rpm y un flujo de aire de 0,5 V/V. M.
Seguimiento de la producción de metabolitos secundarios por ensayo del caldo completo frente al A-549 o por HPLC.
Aislamiento: Se filtraron 10 L del caldo recogido completo para separar la biomasa y otros sólidos. La masa micelial se extrajo dos veces con una mezcla de disolventes (2,4 1) de CHC1_{3}:CH_{3}OH:H_{2}O (2:1:1), y se concentró la actividad en la capa inferior. Se concentró el disolvente orgánico y se evaporó a sequedad a vacío para obtener 3,2 g del extracto crudo. Se cromatografió el extracto en una columna "de tipo flash a vacío" sobre gel de sílice. Después del lavado con una mezcla de n-hexano-acetato de etilo 1: 1, se eluyó la columna con un gradiente acetato de etilo-metanol. Se controló el progreso de la elución por la citotoxicidad frente a las células A-539 y se siguió por TLC (cloroformo- metanol 9: 1) y HPLC analítica de fase reversa con fotodiodo direccional. Se consiguió una purificación adicional de las fracciones activas (250 mg) por cromatografía de columna sobre gel de sílice y se eluyó la actividad con cloroformo-metanol 92: 8 y 95: 5. Se cromatografió cada una de estas fracciones en una columna de fase reversa de C18 y se eluyó con metanol-agua 65: 35 para obtener 12 mg de estaurosporina, 4 mg de IB- 97224, y 8 mg de
IB-97225.
\newpage
Actividad Biológica: Las células antitumorales utilizadas fueron las P- 388D_{1} (cultivo en suspensión de un neoplasma limfoideo de las DBA/2 de ratón), A-549 (cultivo en monocapa de un carcinoma de pulmón macrocítico de humano), HT-29 (cultivo en monocapa de un carcinoma de colon en humano), y SK-MEL-28 (cultivo en monocapa de un melanoma en humano). Las células P-388D_{1} fueron sembradas en pocillos de 16 mm a 1 x 10^{4} célula por pocillo en alícuotas de 1 ml de MEM 5FCS conteniendo la concentración de fármaco indicada. Se sembró un grupo separado de cultivos sin fármaco como control del crecimiento para asegurar que las células permanecían en la fase exponencial de crecimiento. Todas las determinaciones se llevaron a cabo por duplicado. Después de tres días de incubación a 37ºC en una atmósfera de CO_{2} al 10%, con una humedad del 98%, se calculó la IC_{50} por comparación del crecimiento en pocillos con fármaco con el crecimiento en pocillos control sin el fármaco. Se sembraron células A-549, HT-29, y SK-MEL-28 en pocillos de 16 mm a 2 x 10^{4} células por pocillo en alícuotas de 1 ml de MEM 10FCS conteniendo la concentración de fármaco indicada. Se sembró un grupo separado de cultivos sin fármaco como control del crecimiento para asegurar que las células permanecieron en una fase exponencial de crecimiento. Todas las determinaciones se llevaron a cabo por duplicado. Después de tres días de incubación a 37ºC en una atmósfera con un 10% de C0_{2} con una humedad del 98%, el pocillo se tintó con violeta de cristal al 0,1%. Se calculó la IC_{50} por comparación del crecimiento en pocillos con fármaco respecto al crecimiento en pocillos control sin el fármaco.
En la Tabla 3 se presenta la actividad expresada como IC_{50} (\muM)
TABLA 3
Línea Celular IC_{50} (\muM)
IB-97224 IB-97225
P388D_{1} 0,04 0,02
A-549 0,002 0,002
HT-29 0,004 0,004
SK-MEL-28 0,004 0,002
Referencias citadas
En el presente documento se han citado las siguientes referencias, las cuales se incorporan al mismo por referencia:
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Nishizuka, Y., Nature 308: 693-698, 1984
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Atlas R. M., Handbook of Microbiological Media, 1993 CRC Inc. Boca Raton, Florida. USA
Luedemann G. M. Personal Communication
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Van der Auwera P., Labbe M., Mayberry W. R., Ferguson K. P., y Lambe D. W. Jr., J. Microbiol. Methods 4: 265-275, 1986
Bergeron y col., Biochem. Biophys. Res. Comm., 121: 848-854, 1984
Schroeder y col., J. Med. Chem., 24: 1078, 1981

Claims (17)

1. Compuestos de fórmula (1):
6
en donde:
R^{1} es un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo de entre 1 y 6 átomos de carbono o un grupo alcoxi de entre 1 y 6 átomos de carbono; y
R^{2} es un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo de entre 1 y 6 átomos de carbono o un grupo alcoxi de entre 1 y 6 átomos de carbono;
y las sales farmacéuticamente aceptables del mismo.
2. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, en donde R^{1} es un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo de entre 1 y 4 átomos de carbono.
3. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 2, en donde R^{1} es un átomo de hidrógeno, un grupo metilo, o un grupo etilo.
4. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 3, en donde R^{1} es un átomo de hidrógeno.
5. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, en donde R^{2} es un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo de entre 1 y 4 átomos de carbono.
6. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 5, en donde R^{2} es un átomo de hidrógeno, un grupo metilo, o un grupo etilo.
7. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 6, en donde R^{2} es un átomo de hidrógeno o un grupo metilo.
8. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, en donde:
R^{1} es un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo de entre 1 y 4 átomos de carbono, y
R^{2} es un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo de entre 1 y 4 átomos de carbono.
9. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 8, en donde:
R^{1} es un átomo de hidrógeno, un grupo metilo, o un grupo etilo; y
R^{2} es un átomo de hidrógeno, un grupo metilo, o un grupo etilo.
10. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, en donde R^{1} es un átomo de hidrógeno y R^{2} es un grupo metilo.
11. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, en donde R^{1} y R^{2} son ambos átomos de hidrógeno.
12. Un procedimiento para la producción de un compuesto de fórmula (1), tal como se ha definido en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, que comprende cultivar una cepa de un microorganismo capaz de producir un compuesto de fórmula (1), recuperar el compuesto de fórmula (1) del caldo de cultivo, y, opcionalmente, salificar el compuesto recuperado.
13. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 12, en donde el microorganismo es una cepa actinomiceto.
14. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 13, en donde el microorganismo es la cepa actinomiceto CLCO-002 (CECT-3347)
15. Una composición farmacéutica que contiene como un ingrediente activo un compuesto de fórmula (1) tal como se ha definido en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, conjuntamente con un soporte o diluyente farmacéuticamente aceptable.
16. Un compuesto de fórmula (1) tal como se ha definido en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para su uso como un medicamento.
17. El uso de un compuesto de fórmula (1) tal como se ha definido en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o la profilaxis de tumores malignos en un mamífero.
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