ES2299431T3 - Electropolimeros fotoinjertables, su procedimiento de obtencion y sus aplicaciones como soportes de sondas de reconocimiento especifico en bioceptadores electronicos. - Google Patents
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Abstract
Monómero que tiene al menos una entidad electropolimerizable y al menos una unidad a la vez fotoactivable y fotoinjertable, seleccionado entre: n el monómero de pirrolbenzofenona de fórmula: (Ver fórmula) benzofenona pirrol en particular obtenido por reacción de ácido 3-benzoil-benzoico con 3-pirrol-1-propanol; n el monómero de 4-(2-aminoetil)fenolbenzofe-nona de fórmula: (Ver fórmula) en particular obtenido por reacción de 4-(2-aminoetil)fe-nol con ácido 4-benzoilbenzoico, n el monómero de indolbenzofenona de fórmula: (Ver fórmula) en particular obtenido por reacción de 3-(2-aminoetil)in-dol con ácido 4-benzoilbenzoico, n el monómero de vinilanilinabenzofenona de fórmula: (Ver fórmula) en particular obtenido por reacción de vinilanilina con ácido 4-benzoilbenzoico, n el monómero de azidofenilpirrol de fórmula: (Ver fórmula) en particular obtenido por reacción de 4-fluoro-3-nitro-fenilazida con aminobutilpirrol.
Description
Electropolímeros fotoinjertables, su
procedimiento de obtención y sus aplicaciones como soportes de
sondas de reconocimiento específico en biocaptadores
electrónicos.
El campo de la invención es el de los
electropolímeros y en particular el de su aplicación como materiales
constitutivos de biocaptores y de captores electroanalíticos.
La presente invención se relaciona con polímeros
obtenidos por electropolimerización, también denominados
electropolímeros, así como con su procedimiento de preparación. Los
monómeros y/u oligómeros implicados en este procedimiento están
también comprendidos en la presente invención. Esta última contempla
igualmente la utilización de estos electropolímeros como soportes
de anclaje de sondas de reconocimiento específico que forman parte
de biocaptores o de captores electroanalíticos, v.g.:
(micro)electrodos, captores de transistor con efecto de
campo, biopulgas, semiconductores, fibras ópticas conductoras...
La combinación de las propiedades de
reconocimiento molecular específico, incluso estereoespecífico, de
las macromoléculas biológicas con la extrema sensibilidad de
captores ópticos, electroquímicos o gravimétricos, condujo al
surgimiento de una nueva generación de herramientas analíticas: los
biocaptores. Desde hace tres decenios, el desarrollo de los
biocaptores conocía una expansión importante por sus potenciales
aplicaciones industriales en el campo del ambiente (calibración
in situ de contaminantes) y del análisis biomédico
(biocaptor portátil o de uso único, reemplazo de las pruebas ELISA).
Recientemente, el impulso de las tecnologías en microelectrónica ha
ofrecido nuevas oportunidades para la miniaturización de los
biocaptores. Los objetivos principales son los biocaptores
implantables o la asociación de varios biocaptores con el fin de
obtener simultáneamente informaciones sobre varios analitos. Así,
se pueden fabricar microcaptores por inmovilización de biomoléculas
en la superficie de una gran variedad de microtransductores, tales
como los multiplots de microelectrodo, los microelectrodos
interdigitados o los transistores con efecto de campo.
Estas biomoléculas (oligo- o
polinucleótidos-ADN-ARN, enzimas,
anticuerpos, antígenos, ácidos nucleicos peptídicos, oligo- o
polipéptidos) se comportan como sondas de reconocimiento específico,
por ejemplo por interacción afín de substancias biológicas diana
para análisis. La referencia a la biología para cualificar las
moléculas en cuestión no es exclusiva de otras moléculas análogas a
las moléculas de origen biológico en estricto sentido, pero
fabricadas por vía química sintética (v.g., quimeras).
La fabricación de microbiocaptores es
actualmente la apuesta de una dura competencia internacional, siendo
la ilustración perfecta la realización de biopulgas para la
secuenciación del ADN. La elaboración de varios millares de
"spots" de oligonucleótidos diferentes en posiciones
perfectamente localizadas sobre un soporte plano puede ser
utilizada para identificar y cuantificar ADN o ARN funcionalizados
por marcadores fluorescentes.
Sin embargo, un impedimento tecnológico reside
en la elaboración de los microbiocaptores. En efecto, la
inmovilización estable, reproducible y espacialmente controlada de
sondas de reconocimiento específico (por ejemplo, de
oligonucleótidos, de poliácidos nucleicos peptídicos o de
proteínas) con retención total de sus propiedades biológicas sigue
siendo un problema crucial. Efectivamente, la mayor parte de los
procedimientos convencionales de inmovilización de sondas, v.g.,
proteicas, como el entrecruzamiento, la injertación covalente o el
atrapamiento en geles o membranas, sufre de una débil
reproductibilidad y una mala resolución espacial.
Se desarrollaron otras aproximaciones de
inmovilización de sondas, por ejemplo proteicas, a partir de
tecnologías convencionales de impresión, el "screen printing"
y la "ink-jet deposition", que permiten una
localización precisa de la proteína. Sin embargo, la inmovilización
por atrapamiento de la proteína puede reducir la accesibilidad de
esta última y, por lo tanto, disminuir la eficacia de las
interacciones específicas de tipo oligonucleótidos complementarios,
anticuerpo-antígeno o
enzima-substrato.
Más recientemente, otro método ha puesto en
juego el depósito controlado de microvolúmenes (5 nl) que contienen
la proteína en emplazamientos precisos. En esta aproximación, los
problemas encontrados son problemas de evaporación que necesitan
trabajar en habitaciones de humedad controlada y problemas de
contaminación de un depósito con otro.
También se conoce el recurrir a la
fotolitografía de grupos fotoactivables para inmovilizar
biomoléculas sobre soportes comprendidos en microtransductores de
biocaptores.
Es así que el artículo de L.F. Rozsnyai, D.R.
Benson, S.P.A. Fodor y P.G. Schultz, Angew, Chem. Int. Ed. Engl. 31
(1992) 759, describe el anclaje covalente de anticuerpos sobre un
soporte de sílice funcionalizada por unidades fotoactivables de
tipo benzofenona. La funcionalización (o derivatización) de los
substratos de sílice es realizada con ayuda de
3-aminopropiltrietoxisilano protegido por grupos
t-butiloxicarbonil(Boc). Después de la
desprotección del silano de superficie, se copula un éster
N-hidroxisuccinimida del ácido
3-benzoilbenzoico al silano de superficie. Se
depositan entonces los anticuerpos que se han de injertar sobre el
soporte y se exponen estos últimos, a través de una máscara, a una
radiación luminosa que activará en las zonas descubiertas las zonas
de unión de la inmunoglobulina a los carbonilos de las unidades de
benzofenona fijadas sobre el soporte.
La solicitud de patente internacional PCT WO.
92/10092 describe una técnica de síntesis in situ de una red
de oligonucleótidos sobre un substrato de silicio silanizado con
ayuda de 3-aminopropiltrietoxisilano y protegido
por un grupo fotosensible de tipo
6-nitroveratrioxicarbonilo (NVOC). Según esta
técnica, se realiza una desprotección localizada del substrato por
exposición a la luz a través de una máscara. La zona o zonas
desprotegidas son entonces el asiento de reacciones de copulación
química, ya sea de los nucleótidos entre sí para formar
oligonucleótidos, ya sea de los nucleótidos con el soporte para
fijar sobre éste oligonucleótidos sintetizados
ex-situ a nucleótidos de cabeza en el marco
de la síntesis in situ de oligonucleótidos.
En estas técnicas fotolitográficas de
injertación de sondas sobre soporte, se controla el reparto
geométrico de dichas sondas gracias a fotomáscaras, pero los
inconvenientes mayores de esta técnica residen en la ausencia de
control del depósito de las unidades fotoactivables sobre el
soporte.
Una alternativa a estos métodos consiste en
inmovilizar sondas de reconocimiento específico, por ejemplo de
naturaleza proteica, por electropolimerización de un monómero, en
presencia de las sondas proteicas que se han de inmovilizar. Esto
conduce al enjaulamiento de las sondas proteicas en películas
poliméricas electrogeneradas. La localización de las sondas puede
ser espacialmente controlada gracias a las posibilidades de
abordamiento electroquímico de la película polimérica que ofrece el
método. A título ilustrativo, se puede citar el artículo de Serge
Cosnier (Can J. Chem. Eng., 76 (1998) 1000), que se relaciona con la
fabricación de biocaptores amperométricos por enjaulamiento en
películas de polipirrol funcionalizado. El procedimiento
electroquímico de inmovilización de enzimas descrito en este
artículo comprende dos etapas. La primera consiste en la adsorción
de una mezcla acuosa de enzima y de pirrol anfífilo sobre una
superficie de electrodo y la segunda etapa es la
electropolimerización de los monómeros adsorbidos.
El enjaulamiento de enzimas en electropolímeros
es también ilustrado por la patente americana Nº 5.286.364, que
divulga la electropolimerización de
1,3-diaminobenceno y de resorcinol. La enzima
inmovilizada en el electropolímero generado de manera localizada es
la glucosa-oxidasa.
Esta técnica de enjaulamiento de substancias
sensibles (sondas) de naturaleza proteica en películas poliméricas
electrogeneradas presenta el inconveniente de reducir radicalmente
la accesibilidad a la substancia inmovilizada. En particular, las
restricciones estéricas generadas por el polímero que rodea las
sondas proteicas u oligonucleotídicas pueden dificultar la
formación de las interacciones específicas de reconocimiento de tipo
antígeno-anticuerpo,
enzima-substrato o hibridación de oligonucleótidos
complementarios. Por consiguiente, la inmovilización electroquímica
de proteínas o de oligonucleótidos no resulta ser el método más
apropiado para la fabricación de biocaptores.
Una aproximación ligeramente diferente consiste
en electrogenerar un polímero que lleve grupos susceptibles de
generar una copulación covalente con una proteína. Así, se pudieron
inmovilizar enzimas y oligonucleótidos sobre polipirroles por
injertación química. Sin embargo, estas reacciones químicas pueden
desnaturalizar substancias sonda sensibles
(proteínas-polinucleótidos).
Una estrategia más prometedora de fijación de
sondas, por ejemplo proteicas u oligonucleotídicas, sobre películas
electrogeneradas es la inmovilización por medio de sistemas afines,
que preservan totalmente la actividad biológica de las proteínas.
Según esta estrategia, se procede a la electrogeneración de una
película polimérica funcionalizada por unidades de biotina. Debido
a las fuertes interacciones afines entre la biotina (peso molecular
= 250 D) y la avidina (peso molecular = 66.000 D), se puede formar
una monocapa de avidina espontáneamente en la superficie del
polímero, por simple inmersión del soporte, en el caso del
transductor, en una solución acosa de avidina. La fijación ulterior
de sondas biotiniladas (enzima, anticuerpo, antígeno,
oligonucleótidos, poliácido nucleico peptídico...) interviene
igualmente por simple inmersión del soporte, en el caso del
transductor, modificado por la avidina, en la solución acuosa de
substancia sonda escogida, siendo la constante de asociación entre
la avidina y las unidades de biotina: K_{a} = 10^{15} M^{-1}.
La inmovilización de sondas, por ejemplo proteicas, es así
realizada mediante un anclaje no desnaturalizante que confiere una
accesibilidad a la proteína.
El inconveniente mayor de este método
electroafín es la necesidad de utilizar sondas, en particular
proteínas, marcadas por funciones biotina, o sondas, en particular
proteínas, conjugadas a avidinas.
A modo de ilustración de estas técnicas
electroafines, se remitirá a los artículos siguientes:
- "Electrogeneration of biotinylated
functionalized polipirrols for the simple immobilization of
enzymes" S. Cosnier, B. Galland, C. Gondran y A. Le Pellec,
Electroanalysis, 10 (1998) 808.
-
"Poly(pyrrole-biotine): a new polymer for
biomolecule grafting on electrode superficies", S. Cosnier y A.
Le Pellec, Electrochim. Act, 44 (1999) 1833.
Se conocen también electropolímeros sobre los
cuales se injertan químicamente substancias sonda sensibles. Estos
electropolímeros portadores de sondas injertadas químicamente tienen
vocación para ser utilizados como medios de inmovilización de
sondas o de marcadores en biocaptores.
Es así que la solicitud de patente francesa
FR-A-2.703.359 se relaciona con un
copolímero electrógeno de tipo polipirrol en el que ciertos
monómeros de pirrol están substituidos por cadenas laterales
pendientes oligonucleotídicas, por medio de rotulas de
espaciamiento de tipo aminoetilo.
La solicitud de patente francesa
FR-A-2.750.136 contempla igualmente
polipirroles electrogenerados injertados, pero esta vez los
injertos oligonucleotídicos son portadores de una molécula activa
(hormona: ACTH o biotina).
La solicitud de patente europea
EP-A-314.009 divulga polímeros
electrogenerados de tipo poliditienilpirrol funcionalizados por
enzimas tales como la glucosa-oxidasa. La
injertación de la unidad funcionalizada puede ser realizada por
medio de una amina (protegida o no) portada por el núcleo de
pirrol.
La solicitud PCT WO 90/10.655 describe
electropolímeros de tipo poliacetileno-cis
injertados por enzimas de tipo glucosa-oxidasa, a
través de rótulas de espaciamiento del género benzoquinona
hidroxilada. Esta solicitud PCT divulga también polianilinas
electrogeneradas y funcionalizadas por indicadores reactivos de tipo
glucosa-oxidasa o cofactor corrector enzimático
(FAD).
La solicitud de patente francesa
FR-A-2.720.832 se relaciona con
electropolímeros de tipo politiofeno, polipirrol, polifenileno,
politiofeno-vinileno, polianilina o poliacetileno
sobre los cuales se han injertado péptidos biológicamente activos,
con vistas a una interacción específica con especies químicas o
biológicas de interés biológico o médico (hormonas, por ejemplo).
Esta injertación es realizada químicamente por medio de un brazo
espaciador de acetilo unido al átomo de carbono nº 3 del núcleo de
pirrol. Estos electropolímeros injertados pueden ser utilizados
como membranas electroactivas en biocaptores.
Todos estos electropolímeros conocidos sobre los
que se injertan químicamente moléculas sonda sensibles tienen
precisamente el inconveniente de ser obtenidos por procedimientos
químicos susceptibles de alterar las moléculas sonda que se han de
injertar. Además, es difícil en estos procedimientos controlar la
localización de los injertos. Por consiguiente, no es posible
realizar redes organizadas de sondas diferentes de reconocimiento
específico, integrables en biocaptores.
El balance que se impone como resultado de esta
revisión del estado de la técnica es, pues, que existe siempre una
necesidad aguda de un soporte polimérico susceptible de constituir
la membrana sensible de biocaptores, sabiendo que las
especificaciones buscadas para esta membrana (o este revestimiento
sensible) son:
\vskip1.000000\baselineskip
- poder ser portadora de sondas sensibles de
reconocimiento específico inmovilizadas de manera fiable y
duradera,
- hacer intervenir un modo de inmovilización de
las sondas sensibles que no conlleve perjuicios a su capacidad para
interaccionar específicamente con las moléculas diana que se han de
analizar,
- ser portadora de sondas sensibles (por ejemplo
proteínas, oligonucleótidos, poliácidos nucleicos peptídicos...)
que no resulten desnaturalizadas en la inmovilización,
- ofrecer la posibilidad de controlar fácilmente
la localización de las sondas para poder realizar redes de
sondas,
- poder ser obtenida de manera simple y
económica para poder ser industrializable.
\vskip1.000000\baselineskip
Uno de los objetivos esenciales de la presente
invención es paliar estas carencias proporcionando nuevos polímeros
sobre los cuales se pueden injertar fácilmente sondas de
reconocimiento específico, no desnaturalizadas, que tengan una
capacidad óptima de reacción con los analitos diana y cuya
localización sea controlable, debiendo estos nuevos polímeros
igualmente ser de un coste moderado.
Otro objetivo esencial de la invención es
proporcionar nuevos medios de inmovilización de sondas específicas
de tipo péptido, polinucleótido o poliácido nucleico peptídico, que
permitan una inmovilización estable, económica, no desnaturalizante
y espacialmente controlada de las sondas.
Otro objetivo esencial de la invención es
proporcionar procedimientos de preparación de los electropolímeros
antes contemplados que sean susceptibles de constituir un soporte de
inmovilización adaptado para sondas de reconocimiento específico
para (micro)biocaptores electrónicos.
Otro objetivo esencial de la invención es
proporcionar nuevos monómeros a partir de los cuales sean
susceptibles de ser obtenidos los polímeros antes contemplados.
Otro objetivo esencial de la invención es
proponer un procedimiento de fabricación de biocaptores que hace
intervenir la preparación de los electropolímeros antes
evocados.
Otro objetivo esencial de la invención es
proporcionar un biocaptor electrónico cuya membrana sensible está
constituida por los polímeros antes contemplados, sobre los cuales
se injertan sondas de reconocimiento específico.
Estos objetivos, entre otros, son alcanzados por
la presente invención, que concierne, en primer lugar, a nuevos
monómeros que comprenden al menos una entidad electropolimerizable y
al menos una unidad a la vez fotoactivable y fotoinjertable,
seleccionados entre:
\sqbullet el monómero de pirrolbenzofenona de
fórmula:
\vskip1.000000\baselineskip
en particular obtenido por reacción
de ácido 3-benzoil-benzoico con
3-pirrol-1-propanol;
\vskip1.000000\baselineskip
\sqbullet el monómero de
4-(2-aminoetil)fenolbenzo-fenona
de fórmula:
\vskip1.000000\baselineskip
en particular obtenido por reacción
de 4-(2-aminoetil)fenol con ácido
4-benzoilbenzoico;
\vskip1.000000\baselineskip
\sqbullet el monómero de indolbenzofenona de
fórmula:
\vskip1.000000\baselineskip
en particular obtenido por reacción
de 3-(2-aminoetil)indol con ácido
4-benzoilbenzoico,
\vskip1.000000\baselineskip
\sqbullet el monómero de
vinilanilinabenzofenona de fórmula:
\vskip1.000000\baselineskip
en particular obtenido por reacción
de vinilanilina con ácido
4-benzoilbenzoico,
\sqbullet el monómero de azidofenilpirrol de
fórmula
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en particular obtenido por reacción
de
4-fluoro-3-nitro-fenilazida
con aminobutilpirrol, así como los electropolímeros fotoinjertables
preparados a partir de tal
monómero.
Los electropolímeros según la invención pueden
ser preparados rápida y fácilmente en forma de películas,
controlando con precisión el espesor de la película por medio de la
carga eléctrica puesta en juego. Estos electropolímeros pueden ser
depositados sobre toda clase de soporte y en particular sobre
pequeñas superficies de electrodos de geometría compleja.
Con más precisión, en el sentido de la
invención, los electropolímeros son películas de polímeros orgánicos
obtenidas por oxidación o reducción electroquímica, en la
superficie de un electrodo, de monómeros bien adsorbidos sobre esta
superficie, bien solubilizados en un medio electrolítico acuoso u
orgánico.
Los electropolímeros no pueden formarse más que
sobre superficies conductoras o semiconductores capaces de
vehiculizar la carga eléctrica necesaria para la polimerización.
Esta característica permite contemplar un abordaje electroquímico.
Esto significa que, alimentando con corriente eléctrica ciertas
zonas del soporte conductor, con preferencia a otras, se puede
circunscribir la formación del polímero en estas zonas alimentadas
y obtener así zonas diferenciadas e independientes portadoras cada
una de una sonda fotoinjertada dada.
Los electropolímeros fotoinjertables según la
invención son apropiados para unirse de manera simple, económica,
reproducible y espacialmente controlada a sondas de reconocimiento
específico, que pueden ser proteínas, polinucleótidos, poliácidos
nucleicos peptídicos o análogos.
Tal inmovilización por fotoinjertación permite
librarse de recurrir a reactivos químicos eventualmente
desnaturalizantes. Además, la técnica es simple, puesto que las
sondas no necesitan ser pretratadas o funcionalizadas para poder
ser injertadas. Finalmente, se puede operar la injertación de manera
precisa y rápida, con ayuda de fotomáscaras.
A propósito de las unidades a la vez
fotoactivables y fotoinjertables de los electropolímeros según la
invención, conviene señalar que dichas unidades son seleccionadas
entre el grupo consistente en: las fenilazidas y los derivados de
benzofenona.
Según la invención, la benzofenona es una unidad
fotoactivable particularmente preferida.
De forma más general, se entiende en el sentido
de la invención por unidad fotoactivable: un grupo químico que,
bajo irradiación, se convierte en un compuesto altamente reactivo
susceptible de formar una unión covalente con los otros compuestos
en solución en medio orgánico o acuoso.
La proporción de unidades a la vez
fotoactivables y fotoinjertables de los electropolímeros según la
invención es un parámetro que permite caracterizarlos.
Así, es particularmente ventajoso que, según la
invención, al menos un 0,01% en número de sus (co)monómeros
constitutivos, preferiblemente al menos un 10% en número de sus
(co)monómeros constitutivos y más preferiblemente aún cada
uno de sus comonómeros constitutivos sean portadores de al menos una
unidad a la vez fotoactivable y fotoinjertable.
Naturalmente, los electropolímeros según la
invención pueden ser o bien homopolímeros o bien copolímeros.
Estos copolímeros pueden ser de tipo bloque o de
tipo estadístico.
Según una característica ventajosa de la
invención, los electropolímeros fotoinjertables a los que concierne
tienen un grado de polimerización DP_{n} comprendido entre 200 y
10^{7}, preferiblemente comprendido entre 10^{3} y 10^{7} y
más preferiblemente aún entre 10^{4} y 10^{7}.
Estos electropolímeros pueden también definirse
por el número de moléculas monoméricas inmovilizadas por unidad de
superficie, que está preferiblemente comprendido entre 10^{-11} y
10^{-6} moles.cm^{-2} y más preferiblemente aún entre 5 x
10^{-9} y 10^{-8} moles.cm^{-2}; el espesor de la película
polimérica a 10^{-6} moles.cm^{-2} está comprendido entre 0,2 y
2 \mum.
Las propiedades electroquímicas de los polímeros
según la invención son otro medio para definirlos. Es así que por
voltametría cíclica se observa para los electropolímeros según la
invención una señal reversible característica de un sistema redox,
de un valor de tensión ventajosamente inferior o igual a 0 voltios,
preferiblemente inferior o igual a -1 voltio y más preferiblemente
aún comprendido entre -1,5 y -2,5 voltios. Esta señal es debida a
la presencia de la unidad fotoactivable. Además, estos polímeros
pueden ser polímeros conductores electrónicos; en este caso, la
cantidad de polímero electrogenerado sobre un soporte conductor
podrá ser determinada por la integración de la carga eléctrica
correspondiente a la electroactividad del polímero en la zona de
potencial comprendida entre -1V y + 1V.
La medición de la voltametría es realizada por
barrido de potencial entre los valores límites de, v.g.: 0 y - 2,5
voltios. El medio líquido conductor de medición está constituido,
por ejemplo, por CH_{3}CN + TBAP 0,1 M. La medición de la tensión
es realizada por referencia a un sistema Ag/Ag^{+} 10 mM en
CH_{3}CN.
Según un modo preferido de realización de la
invención, los electropolímero con los que se relaciona son
portadores sobre cada uno de sus monómeros constitutivos de una
unidad fotoactivable.
Las unidades fotoactivables pueden ser idénticas
o diferentes entre sí sobre una misma cadena polimérica y/o de una
cadena polimérica a otra. Según el modo preferido de realización,
las unidades fotoactivables son idénticas sobre todas las cadenas
poliméricas.
Por debajo de un DP_{n} del orden de 50, los
electropolímeros según la invención son preferiblemente denominados
"oligómeros".
Tratándose de su preparación, el procedimiento
preferido según la invención se caracteriza por consistir
esencialmente en:
\vskip1.000000\baselineskip
- utilizar al menos un tipo de monómeros
electropolimerizables;
- fijar sobre al menos una parte de los
(co)monómeros utilizados al menos una unidad fotoactivable
por (co)monómero;
- electropolimerizar los (co)monómeros,
realizándose preferiblemente esta electropolimerización sobre un
soporte conductor sometiendo los (co)monómeros a un barrido
de potencial y/o a una electrolisis de potencial impuesto
(cronoamperometría) o de corriente constante
(cronopotenciometría).
\vskip1.000000\baselineskip
Según que se deseen obtener homo- o copolímeros,
se utilizarán monómeros idénticos entre sí o comonómeros
pertenecientes al menos a dos especies diferentes.
En un modo particularmente preferido de
preparación, la electropolimerización de los monómeros o de los
comonómeros funcionalizados o no por al menos una unidad
fotoactivable es efectuada sobre un soporte conductor para formar
una película de electropolímero sobre toda la zona sometida al campo
eléctrico.
Es perfectamente contemplable, para un soporte
de electropolimerización dado, no alimentar con corriente eléctrica
más que ciertas zonas seleccionadas del soporte conductor. Se
realiza así un abordaje electroquimico que permite localizar el
electropolímero fotoinjertable en lugares bien precisos.
Ventajosamente, los (co)monómeros
copolimerizables utilizados con los monómeros según la invención son
seleccionados:
- \Box
- entre el subgrupo de los (co)monómeros conductores consistente en:
- -
- el acetileno, los pirroles, los tiofenos, los indoles, las anilinas, las azinas, los p-fenilenvinilenos, los p-fenilenos, los pirenos, los furanos, los selenofenos, las pirridazinas, los carbazoles y sus mezclas;
- \Box
- y/o entre el subgrupo de los (co)monómeros aislantes consistente en los fenoles, las orto-fenilendiaminas, los diclorofenolindofenoles y sus mezclas.
En el plano de la metodología, son contemplabes
varios procedimientos según la invención. Así, la etapa de
injertación interviene antes, durante o después de la etapa de
electropolimerización.
En el modo preferido de realización del
procedimiento, se efectúa la substitución de las unidades
fotoactivables y fotoinjertables sobre todos los monómeros de
partida antes de acometer la electropolimerización. Esta última
implica, pues, (co)monómeros conjugados cada uno a al menos
una unidad, preferiblemente una unidad fotoactivable y
fotoinjertable.
Según una variante, se podría realizar la
electropolimerización de los monómeros no substituidos por las
unidades fotoactivables y no hacer intervenir a esta substitución
más que sobre el polímero acabado.
Naturalmente, las dos variantes antes evocadas
son combinables.
La solución que consistiría en realizar
simultáneamente la electropolimerización y la substitución de las
unidades fotoactivables no es ciertamente la preferida, pero no
obstante no puede quedar excluida de la invención.
La electropolimerización es preferiblemente
realizada a partir de monómeros, pero puede contemplarse igualmente
utilizar oligómeros funcionalizados o no por unidades
fotoactivables, como productos de partida de la
electropolimerización, en combinación o no con monómeros o
(co)monómeros.
La electropolimerización es ventajosamente
realizada, en la práctica, en condiciones de presión y de
temperatura ambiente.
El soporte utilizado puede ser, por ejemplo:
electrodos metálicos (oro, platino, acero inoxidable), electrodos
de carbono vítreo o de grafito, electrodos transparentes (vidrio o
cuarzo recubierto de una película de oro, de TiO_{2} o de
SnO_{2}), electrodos volúmicos tales como fieltros de carbono,
polvos de carbono o de grafito, telas tejidas de metales como, por
ejemplo, aceros inoxidables, o geles nanoporosos de TiO_{2}.
Se vierte un medio líquido constituido por una
solución, una suspensión o una emulsión de (co)monómeros,
incluso de oligómeros, en fase acuosa u orgánica, sobre el soporte.
Se somete entonces este último a barridos repetitivos de potencial
(por ejemplo entre - 0,5 V y 1,2 V). Las zonas del soporte así
alimentadas son el asiento de la formación en superficie de una
película de electropolímero.
La presencia de la película de electropolímero
puede caracterizarse por voltametría cíclica.
El electropolímero obtenido está substituido por
unidades fotoactivables aptas para permitir la fotoinjertación de
biomoléculas sensibles o sondas de reconocimiento específico,
especialmente por interacción afín. La razón de substitución del
electropolímero en unidades fotoactivables que permiten el
fotoanclaje está comprendida entre el 0,01 y el 100%.
Los electropolímeros, (co)monómeros
presentados anteriormente y que tienen la propiedad de ser
fotoinjertables, constituyen otros objetos nuevos e inventivos
cuando llevan elementos fotoinjertados por medio de sus unidades
fotoactivables - de donde se deduce que la invención se relaciona
con polímeros, monómeros y oligómeros caracterizados por incluir
substituyentes fotoinjertados obtenidos por reacción de una o más
substancias con sus unidades fotoactivables, siendo preferiblemente
seleccionadas estas substancias entre las (macro)moléculas
biológicas y/o las quimeras de éstas y/o entre las unidades de
estas (macro)moléculas y/o de estas quimeras.
A modo de ejemplos de substancias
fotoinjertadas, se pueden citar los aminoácidos, los oligopéptidos,
los polipéptidos, las proteínas, las
gluco-proteínas, las lipoproteínas o también los
nucleótidos y oligonucleótidos, los polinucleótidos de tipo ARN o
ADN, de origen biológico o sintético, enzimas, coenzimas y
vitaminas.
Como ejemplos de quimeras de biomoléculas, se
pueden citar los (poli)ácidos nucleicos peptídicos, sitios
prostéticos de enzimas tales como metaloporfirinas,
isobacterioclorinas, corrinas, clorinas y anticuerpos artificiales
a base, por ejemplo, de polímero con impronta.
Según otros aspectos ventajosos de la invención,
la invención cubre también:
- polímeros o monómeros caracterizados por el
hecho de que las (macro)moléculas biológicas fotoinjertadas
antes citadas son seleccionadas entre el grupo consistente en
aminoácidos, oligopéptidos, polipéptidos, proteínas,
glucoproteínas, lipoproteínas, nucleótidos, oligonucleótidos,
polinucleótidos de tipo ARN o ADN, de origen biológico o sintético,
enzimas, coenzimas y vitaminas; de que las quimeras de biomoléculas
antes citadas son seleccionadas entre el grupo consistente en los
(poli)ácidos nucleicos peptídicos, los sitios prostéticos de
enzimas tales como metaloporfirinas, las isobacterioclorinas, las
corrinas, las clorinas y los anticuerpos artificiales a base, por
ejemplo, de polímeros con impronta;
- un monómero de pirrolbenzofenona de
fórmula:
en particular obtenido por reacción
de ácido 3-benzoilbenzoico con
3-pirrol-1-propanol;
- un monómero de
4-(2-aminoetil)fenolbenzofe-nona
de fórmula:
en particular obtenido por reacción
de 4-(2-aminoetil)fe-nol con
ácido
4-benzoilbenzoico;
- un monómero de indolbenzofenona de
fórmula:
en particular obtenido por reacción
de 3-(2-aminoetil)indol con ácido
4-benzoilbenzoico;
- un monómero de vinilanilinabenzofenona de
fórmula:
en particular obtenido por reacción
de vinilanilina con ácido
4-benzoilbenzoico;
- un monómero de azidofenilpirrol de
fórmula:
en particular obtenido por reacción
de
4-fluoro-3-nitro-fenilazida
con
aminobutilpirrol;
- un electropolímero fotoinjertable,
caracterizado por ser preparado a partir de un monómero según la
invención;
- una poli(pirrolbenzofenona) obtenida a
partir de la pirrolbenzofenona antes citada, preferiblemente
fotoinjertada con una substancia fotoinjertable tal como se define
en la descripción y en las reivindicaciones, aún mejor seleccionada
entre una proteína, preferiblemente la albúmina de suero bovino o
humano, una enzima, preferiblemente la glucosa oxidasa, una
biotina, preferiblemente el sistema afín
avidina-biotina, la tionina o un anticuerpo,
preferiblemente un anticuerpo de conejo (IgG);
- un polímero de polifenolbenzofenona obtenido a
partir del monómero fenolbenzofenona antes citado, preferiblemente
fotoinjertado por una substancia fotoinjertable tal como se define
en la descripción y en las reivindicaciones, aún mejor seleccionada
entre una enzima, preferiblemente la glucosa oxidasa;
- un polímero de poliindolbenzofenona obtenido a
partir del monómero indolbenzofenona antes citado, preferiblemente
fotoinjertado por una substancia fotoinjertable tal como se define
en la descripción y en las reivindicaciones;
- un polímero de polivinilbenzofenona obtenido a
partir del monómero vinilanilinabenzofenona antes citado,
preferiblemente que lleve una substancia fotoinjertable tal como se
define en la descripción y en las reivindicaciones;
- un polímero de polipirrolfenilazida obtenido a
partir de la fotopolimerización del fenilazidapirrol antes citado,
preferiblemente fotoinjertada por una substancia fotoinjertable tal
como se define en la descripción y en las reivindicaciones, aún
preferiblemente una enzima, en particular la glucosa oxidasa.
Según aún otro de sus aspectos, la presente
invención se relaciona con un procedimiento de fabricación de
biocaptores electrónicos del tipo de los que contienen al menos un
(micro)transductor que lleva al menos una membrana sensible
portadora de sondas de reconocimiento específico de moléculas diana
para analizar, caracterizado por realizar la membrana sensible
fijada sobre el soporte transductor a partir de al menos un polímero
tal como se ha descrito anteriormente y por injertar
(preferiblemente de manera localizada) las sondas de reconocimiento
específico sobre las unidades fotoactivables del polímero por
fotoactivación.
Estos biocaptores o estos elementos de
biocaptores pueden ser (micro)electrodos, dispositivos
semiconductores tales como transistores con efecto de campo o
también redes de microelectrodos interdigitados, cuarzos de
microequilibrio, fibras de carbono o de grafito micrométricos y
nanométricos y fibras ópticas recubiertas de una película
conductora.
Estos (micro)conductores son aptos para
servir de soporte para el crecimiento de los electropolímeros
fotoinjertables según la invención. Tan pronto como se forma el
electropolímero sobre el microtransductor en los lugares deseados,
se realiza la fotoinjertación. Con este fin, se irradia la película
electropolimérica, v.g., con ayuda de una lámpara, por ejemplo a
300-400 nm (según la unidad fotoactivable
considerada), en presencia de moléculas o biomoléculas para
injertar (sondas de reconocimiento específico). Se utilizan estas
moléculas o biomoléculas para injertar en forma de suspensión,
dispersión o solución en un medio orgánico o acuoso, de emulsión o
de solubilizados en micelas o micelas inversas.
Los dispositivos de irradiación son medios
conocidos per se. Es así perfectamente contemplable realizar
la irradiación de forma continua en un túnel a escala
industrial.
La presente invención se relaciona también con
un biocaptor electrónico del tipo de los que contienen al menos un
(micro)transductor que lleva al menos una membrana sensible
portadora de sondas de reconocimiento específico, caracterizado por
incluir la membrana sensible al menos un polímero tal como se ha
descrito anteriormente, sobre el que se fotoinjertan
(preferiblemente de manera localizada) substituyentes que
corresponden a las sondas de reconocimiento específico.
Los microtransductores sobre los que se pueden
inmovilizar biomoléculas gracias a los electropolímeros según la
invención pueden ser microelectrodos, microelectrodos
interdigitados, transistores con efecto de campo, biopulgas,
especialmente para la secuenciación del ADN y del ARN, o
proteínas.
Estas biopulgas pueden presentarse en forma de
redes matriciales de sondas de reconocimiento específico
constituidas, por ejemplo, por oligonucleótidos fijados de manera
localizada sobre estructuras aislantes/semiconductoras, que
funcionan sobre el principio del efecto de campo, por ejemplo.
La tecnología según la invención está
particularmente adaptada a la fabricación de este tipo de captores
gracias a estas capacidades de control espacial de la fijación de
las sondas por abordaje electroquímico y por su simplicidad de
injertación de las moléculas por fotoactivación y
fotoenmascaramiento.
A modo de otros ejemplos de biocaptores, se
pueden citar los immunocaptores de lectura óptica o eléctrica, pero
también los microequilibradores de cuarzo.
La invención se relaciona finalmente con un
soporte que forma electrodo, caracterizada por incluir en su
superficie al menos una capa de un polímero tal como se define en
la descripción y en las reivindicaciones.
La presente invención será mejor comprendida a
la luz de los ejemplos que siguen y que describen la obtención de
electropolímeros fotoinjertables, su caracterización, la injertación
de proteínas sobre estos electropolímeros y la caracterización de
los productos injertados obtenidos. Estos ejemplos permiten también
hacer resaltar todas las ventajas y las variantes de la
invención.
La Fig. 1 representa el espectro obtenido por
espectroscopía infrarroja (IR) del monómero de pirrolbenzofenona en
su forma líquida trazada en modo de transmisión.
La Fig. 2 es una curva que da la caracterización
electroquímica del monómero obtenido en el ejemplo 1.1, a saber, la
pirrolbenzofenona.
La Fig. 3 es un voltamograma que ilustra la
electropolimerización del monómero del ejemplo 1.1
pirrolbenzofenona.
La Fig. 4 es una curva de voltametría cíclica
obtenido sobre el electrodo revestido del electropolímero
fotoinjertable poli(pirrolbenzofenona) obtenido en el
ejemplo 2.
La Fig. 5 muestra 2 curvas que representan la
variación de la frecuencia F (Hz) en función del tiempo t
(\Delta), resultando esta variación de la inmovilización de
avidina (ejemplo 3.2) sobre cuarzos de microequilibrio modificados
por películas de poli(pirrolbenzofenona) y previamente en
contacto con una solución acuosa de biotina con irradiación
(- - - -) y sin irradiación
(- - - -).
La Fig. 6 representa el espectro de infrarrojos
de la película polimérica de polipirrolbenzofenona obtenida a
partir del monómero cuyo espectro IR se representa en la figura
1.
La Fig. 7 representa en la curva A la señal
electroquímica de la película polimérica de polipirrolbenzofenona
cuyo espectro de infrarrojos se muestra en la Fig. 6.
La Fig. 8 representa en la curva B la señal
electroquímica registrada con un electrodo desnudo por ciclaje de
potencial en una solución de tionina a 0,5 mM en acetonitrilo,
mientras que la señal electroquímica de la película de polímero de
polipirrolbenzofenona tras la fotoinjertación de la tionina como
especie electroactiva está representada en la curva C de la Fig.
8.
Las Fig. 9 y 10 representan respectivamente: la
Fig. 9 en la curva A la señal electroquímica de la película de
polipirrolbenzofenona, sin excitación luminosa, antes de remojar en
la solución de tionina a 0,5 mM en acetonitrilo, mientras que la
curva después del remojo o inmersión en esta solución está
representada por la curva B de la Fig. 10.
Las Fig. 11 y 12 representan respectivamente las
curvas de intensidad (I) en la ordenada en microamperios obtenida
por barrido de potencial en sistema redox Ag/Ag^{+} en abscisa de
la película de polipirrolbenzofenona antes del remojo o inmersión
(Fig. 11) en una solución de anticuerpos de conejo, o después de la
inmersión y de la irradiación (Fig. 12).
Las Fig. 13 y 14 son curvas similares a las de
las Figs. 11 y 12 respectivamente, sin excitación luminosa.
La Fig. 15 representa las curvas de
Koutecaky-Levich, en las cuales la recta que une los
cuadrados es la obtenida con el trazado I(E) de la Fig. 11 y
la curva que une los círculos es la obtenida con la curva
I(E) de la Fig. 12 tras remojo y excitación luminosa
(h\omega).
La Fig. 16 es una curva similar a la de la
figura 15, pero obtenida con los trazados I(E)
respectivamente de las Figs. 13 y 14, sin excitación luminosa.
Las Fig. 17 y 18 representan respectivamente las
señales electroquímicas de la película de
polipirrona-benzofenona antes del remojo (Fig. 17)
y después del remojo y de la irradiación (Fig. 18) en una solución
de anticuerpos de conejo (IgG de conejo).
Las Fig. 19 y 20 representan respectivamente
curvas antes del remojo (Fig. 19) y después del remojo sin
irradiación (Fig. 20) en las mismas condiciones que las de las
Figs. 17 y 18, a título comparativo con el fin de mostrar que la
modificación de la señal electroquímica DEm en solución es menor
para un electrodo no irradiado.
La Fig. 21 representa un espectro de RMN del
monómero de
4-(2-aminoetil)fenolbenzofenona.
La Fig. 22 representa en la curva A la señal
electroquímica del monómero del ejemplo 4 y que tiene un espectro
el RMN de la Fig. 21 cuando se hacen barridos sucesivos de potencial
entre 0 y 1 Voltio en un sistema redox Ag-AgCl y en
la curva B la señal obtenida por ciclaje en reducción en la misma
solución de monómero.
La Fig. 23 representa la curva de
intensidad/potencial obtenida tras barridos repetitivos de potencial
entre 0 y 1 voltio de un electrodo transferido a una solución
electrolítica exenta de monómero ciclado en el dominio de
electroactividad de la benzofenona.
La Fig. 24 representa la curva de la absorbancia
en función del tiempo, a 425 nm, de la actividad enzimática de un
electrodo revestido de una película de polipirrolbenzofenona sobre
la cual se ha fotoinjertado la enzima glucosa oxidasa, según el
ejemplo 5.1 que se dará a continuación, con el fin de mostrar la
conservación de la actividad enzimática del electrodo
modificado.
La Fig. 25 representa el espectro de RMN del
monómero de 3-(2-aminoetil)indolbenzofenona
de los ejemplos 6.1 y 6.2.
La Fig. 26 representa el espectro de RMN del
monómero de vinilanilinabenzofenona de los ejemplos 7.1 y 7.2.
La Fig. 27 representa el espectro de RMN del
monómero de
4-fluoro-3-nitrofenilazidaaminobutilpirrol
de los ejemplos 8-1 y 8-2.
La Fig. 28 representa el voltamograma de
polimerización del monómero objeto del espectro de RMN de la Fig.
27, mostrando en la parte anódica un pico irreversible a +0,95
V/Ag/Ag^{+} correspondiente a la oxidación del grupo pirrol.
La Fig. 29 representa en la curva A el signo del
electrodo sumergido en la solución de monómero de
4-fluoro-3-nitrofenilazidaaminobutilpirrol
sintetizado en el ejemplo 8-2 y polimerizado por
barrido repetitivo de potencial entre 0 y 0,90 V/Ag/Ag^{+},
mostrando la formación de polímero por la aparición y el crecimiento
de un sistema redox a + 0,4 V/Ag/Ag^{+} característico de la
electroactividad de las cadenas polipirrólicas.
La Fig. 30 representa en la curva B la señal del
electrodo objeto del experimento de la Fig. 29 tras una
electrooxidación de 2 mC y su transferencia a una solución
electrolítica exenta de monómero.
La Fig. 31 representa una curva de calibración
de la glucosa en medio acuoso con un electrodo revestido de una
película de polímero de poli[aminobutilpirrol] que lleva
unidades de
4-fluoro-3-nitrofenilazida
obtenidas por polimerización del monómero del ejemplo
8-2, en las condiciones del ejemplo
8-3 y sobre el cual se ha injertado la enzima
glucosa oxidasa en las condiciones del ejemplo 8-4,
en medio acuoso a + 600 mV/Ag/Ag^{+} con el fin de oxidar en la
superficie del electrodo las moléculas de H_{2}O_{2}
enzimáticamente generadas como se indica en el marco del ejemplo
8-4.
La Fig. 32 representa una curva de
Lineweaver-Burk de calibración con, en la ordenada,
la inversa de las intensidades expresadas en nanoamperio^{-1} y,
en la abscisa, la inversa de la concentración de glucosa expresada
en milimoles^{-1}, permitiendo acceder a la constante aparente de
Michaelis Menten, aquí obtenida como igual a 20 mM, similar a la de
la constante cinética de la enzima libre glucosa oxidasa en
solución.
Parte
I
Se prepara este monómero como se indica a
continuación:
Reacción del pirrol alcohol con ácido
3-benzoilbenzoico en presencia de DMAP.
Según un modo de realización actualmente
preferido, se pone a reaccionar ácido
3-benzoilbenzoico con
3-pirrol-1-propanol
en presencia de una cantidad catalítica de dimetilaminopirridina o
DMAP y preferiblemente en presencia de un agente activante, tal
como la diciclohexilcarbodiimina.
La reacción de síntesis es en la práctica la
siguiente:
Se disuelven 425 mg de ácido
3-benzoilbenzoico (2 mmoles) y 413 mg de
diciclohexilcarbodiimina (2 mmoles) en 20 ml de diclorometano y se
dejan en agitación durante 5 min. Se añaden entonces 208 mg de
3-pirrol-1-propanol
(1,66 mmoles) a la mezcla de reacción y se deja reaccionar durante 5
min. con agitación. Se añade entonces una cantidad catalítica de
dimetilaminopirridina o DMAP (81 mg, 0,66 mmoles). Se mantiene la
mezcla de reacción a 20ºC aproximadamente bajo agitación durante 48
horas.
Después de añadir agua y de extraer en
diclorometano, se evapora la solución orgánica bajo presión
reducida.
Se disuelve entonces el residuo en éter etílico
y se filtra la solución obtenida con el fin de eliminar los
productos insolubles. Después de evaporar el solvente, se
cromatografía el producto en una columna de sílice con
diclorometano como eluyente.
Se obtiene entonces el derivado pirrólico de la
benzofenona en forma de un aceite casi límpido con un rendimiento
de aproximadamente el 61%.
Tras la cromatografía, se confirmó la pureza de
la pirrolbenzofenona por RMN y espectro de masas.
H RMN (CD Cl_{3}) S (ppm) 2,20 (m, 2H), 4,1
(t, 2H), 4,29 (t, 2H), 6, 10 (t, 2H), 6,60 (t, 2H), 7,52 (m, 4H),
7,80 (d, 2H), 7,98 (d, 1H), 8,22 (d, 1H), 8,40 (s, 1H).
Espectrometría de masas por impacto electrónico:
333 (100%), 209 (14%), 152 (11%), 124 (21%).
Se trazó el espectro por espectroscopía de
infrarrojos (IR) del monómero de pirrolbenzofenona en su forma
liquida con ayuda de un dispositivo de reflexión especular, en modo
de transmisión, que se representa en la figura 1, aquí el
dispositivo de reflexión especular disponible en el mercado bajo la
denominación comercial Perkin-Elmer Spectrum GX FT
IR System, capaz de funcionar en modo de transmisión o en modo
reflexión especular.
Se analizaron las propiedades electroquímicas de
este producto por voltametría cíclica.
Como indica la Fig. 2 adjunta anterior, la
pirrolbenzofenona se oxida irreversiblemente a 1,06 V frente a
Ag/Ag^{+} 10 mM en CH_{3}CN. La oxidación irreversible de este
monómero consiste en la formación de un radical catiónico de
pirrol, 1ª etapa de un fenómeno de polimerización que conduce al
polipirrol.
Estos radicales pirrólicos se copulan entre sí
para dar uniones covalentes y liberar protones al medio
electrolítico. Esta liberación de protones queda ilustrada cuando
se hace un barrido de retorno por la aparición de un pico catódico
irreversible a aproximadamente 200 mV (Fig. 2). Este pico
corresponde a la reducción, en la superficie del electrodo de
platino, de los protones liberados del fenómeno de polimerización de
la pirrolbenzofenona. Tras copulación de dos radicales pirrólicos y
pérdida de dos protones que conduce a la rearomatización del
dímero, este último puede reaccionar de manera equivalente con un
radical catiónico de la pirrolbenzofenona. Por propagación
electroquímica continua, se genera así una cadena polipirrólica para
dar lugar a un polímero insoluble. En medio aprótico, siendo
estable el radical aniónico de la benzofenona, la benzofenona puede
reducirse reversiblemente a 1 electrón. Efectivamente, en el
dominio catódico, se observa una señal reversible a - 1,96 V (Fig.
2) correspondiente a la reducción monoelectrónica de la
pirrolbenzofenona.
Barridos repetitivos de potencial entre 0 y 0,86
V conllevan la formación de una película pirrólica en la superficie
del electrodo. Esta formación queda ilustrada por la aparición y el
crecimiento de un sistema redox a + 0,32 V característico de la
electroactividad de las cadenas polipirrólicas (véase la Fig. 3,
Electropolimerización de la pirrolbenzofenona 3,6 mM en CH_{3}CN
+ 0,1 M TBAP).
Se realiza ventajosamente la formación de la
película de poli(pirrolbenzofenona) en la superficie del
electrodo a un potencial constante igual a 900 mV/Ag/Ag^{+}.
Después de la transferencia del electrodo a una
solución de electrolito exenta de monómero, el voltamograma de este
electrodo presenta la electroactividad clásica de las películas
polipirrólicas en el dominio anódico. Además, la señal reversible
de la reducción de las unidades de benzofenona a E_{1/2} = - 1,96
V confirma la presencia de una película polimérica en la superficie
del electrodo (véase la Fig. 4: Voltametría cíclica del electrodo
tras la polimerización), así como la presencia de las unidades
fotoactivables en este polímero.
La integración de la carga relativa a la
oxidación de las cadenas polipirrólicas permite calcular la cantidad
de monómeros polimerizados en la superficie del electrodo. Operando
de esta manera, se obtiene una película de
poli(pirrolbenzofenona) correspondiente a 1,8 10^{-8}
moles.cm^{-2}.
Se caracterizan las películas de
poli(pirrolbenzofenona) obtenidas en la etapa 2.1 anterior
por electroquímica mediante espectroscopía de infrarrojos (IR), con
ayuda del dispositivo de reflexión especular antes citado. Este
método está adaptado al análisis de revestimientos de superficie, ya
que la importancia de la luz reflejada depende de la rugosidad de
superficie y de las propiedades de absorción de la muestra.
Se recuerda que, con el fin de observar los
cambios provocados por la polimerización, se trazó previamente el
espectro de IR del monómero en su forma líquida en modo de
transmisión y se representa en la figura 1.
Se representa el espectro de infrarrojos de la
película polimérica poli(pirrolbenzofenona) en la figura 6,
en modo de reflexión especular.
Se observa a partir de una comparación de las
figuras 1 y 6 que, debido a la utilización de dos métodos
diferentes, a saber, respectivamente, en transmisión en la figura 1
y en reflexión especular en la figura 6, y por el cambio de estado
del producto, respectivamente líquido y película, el espectro de la
figura 6 está mucho menos cargado y la intensidad de las rayas
obtenidas muy disminuida. La totalidad de los picos observados están
presentes sobre el espectro del monómero. Este espectro obtenido de
forma reproducible muestra que la película una vez formada conserva
los grupos funcionales necesarios para la injertación por
fotoactivación.
El grupo funcional benzofenona es conocido por
ser el precursor de la fotogeneración de birradicales cetona. Estos
birradicales son aceptores de hidrógeno y la eliminación de un
protón de las moléculas diana precede a la formación de una unión
covalente. Esta fotolisis realizada a 350 nanometros (nm) fue
ampliamente descrita en solución.
Según la presente invención, la eficacia de la
fotoinjertación sobre las películas de
poli(pirrolbenzofenona) fue evidenciada por
electroquímica.
Se utilizaron conteras de carbono vítreo,
recubiertas de una película de polipirrolbenzofenona (PP BP) formada
por el paso de 0,2 mC (miliculombios). Se sumergieron estas
conteras y se irradiaron durante dos horas mediante una lámpara de
mercurio de 250 W a través de un filtro IR con una intensidad de 100
mWcm^{-2}. La irradiación de luz entre 300 y 350 nm es realizada
en una solución orgánica de tionina 1 mM, desoxigenada previamente
por burbujeo de argón durante 30 min.
Se da el esquema de reacción de principio a
continuación:
Se registró la señal electroquímica de los
electrodos en acetonitrilo antes y después de la injertación. La
figura 7 representa en la curva A la señal electroquímica de la
película antes de la injertación de la especie electroactiva. La
figura 8 representa en la curva B la señal registrada con una
contera desnuda por ciclaje de potencial en una solución de tionina
a 0,5 mM en acetonitrilo. La curva C de la figura 8 representa la
señal electroquímica de la película después de la fotoinjertación de
la especie electroactiva.
La aparición de la señal casi reversible de la
reducción de la tionina en el voltamperograma del electrodo
modificado demuestra la presencia de la especie en el volumen de la
película. En efecto, la reducción electroquímica de la tionina no
puede intervenir más que en la superficie del electrodo y se propaga
entonces por salto de electrón entre sitios de tioninas
inmovilizadas.
El mismo experimento realizado sin excitación
luminosa de las conteras sumergidas (blanco) no acarrea modificación
significativa de la señal electroquímica de la película de
polímero.
La curva A obtenida antes del remojo está
representada en la figura 9 y la curva B obtenida después del remojo
o de la inmersión está representada en la figura 10.
La señal reversible de la reducción de las
unidades de benzofenona disminuyó ligeramente debido probablemente
a una fotodegradación; por el contrario, la señal de la tionina no
aparece. Esto demuestra claramente la necesidad de una
fotoactivación de la película para obtener una injertación química
de las sondas electroactivas.
La razón media de injertación de unidades de
tionina es evaluada en el 18% por comparación mediante la
integración de las cargas eléctricas de la cantidad de tionina
inmovilizada con respecto a la cantidad de benzofenona
polimerizada.
La determinación de la permeabilidad de
películas y de la cinética de transferencia de carga de un sistema
redox se basa en el trazado de curvas de intensidad/potencial
(I(E)) en régimen estacionario, de oxidación o de reducción
en la superficie de un electrodo de una especie electroactiva. Se
efectúan las mediciones sobre conteras de electrodos giratorios a
baja velocidad de barrido de tensión.
Las mediciones de permeabilidad de una película
se basan en la determinación de la velocidad a la que el soluto
electroactivo se difunde a través de la película para oxidarse o
reducirse en la superficie del electrodo. Se realizan, pues, estas
mediciones con ayuda de sondas electroactivas susceptibles de
atravesar película con un tamaño adecuado. Si la película es
conductora, es necesario trabajar en un dominio de potencial en el
que el polímero no sea conductor o destruir la electroactividad de
la película con el fin de evitar interferencias. En efecto, la
película puede desempeñar el papel de mediador redox para la
oxidación o la reducción de las sondas electroactivas. Este aspecto
condiciona en parte la elección de las sondas: el potencial redox de
las especies debe encontrarse en un dominio para el cual la
película no sea conductora. El segundo criterio es el tamaño de las
sondas: las mediciones de permeabilidad son frecuentemente
realizadas con varias sondas cuyo bloqueo estérico difiere.
En el marco de la presente invención, los
inventores han escogido trabajar con el decametilferroceno (DMFc),
especie electroactiva cuya oxidación reversible tiene lugar en medio
orgánico a -100 mV/Ag/Ag^{+}.
Se obtuvieron las curvas de intensidad en
función del potencial (I(E)) con conteras de electrodos
giratorios de carbono vítreo recubiertas de una película de PPBP
(0,5 mC (miliculombios), antes y después de la inmersión en una
solución acuosa desoxigenada de anticuerpos de conejo (IgG) a una
concentración de 0,5 mgml^{-1}, e irradiada durante 2 horas, con
ayuda de una fuente de luz procedente de una lámpara de mercurio de
250 W a través de un filtro IR con una intensidad de 100
mWcm^{-2}.
Una vez aclarados, se sumergen los electrodos en
una solución de DMFc 0,5 mM en acetonitrilo y se registra la
corriente de oxidación de la sonda electroquímica en función del
potencial para diferentes velocidades de rotación de los
electrodos.
Los trazados obtenidos están representados,
respectivamente, en las figuras 11 (antes del remojo) y 12 (después
del remojo).
Se observa a partir de la consideración de las
figuras 11 y 12 que, después del remojo y de la irradiación, las
corrientes límite de difusión han disminuido y que el potencial de
oxidación de la sonda está desplazado hacia los valores más
elevados. Estos dos fenómenos pueden ser atribuidos a la presencia
de anticuerpos injertados en superficie, modificando la movilidad
de la sonda en la película resultante y la cinética de la
transferencia de carga del proceso electroquímico.
El mismo experimento realizado sin excitación
luminosa de las conteras sumergidas (remojo) no acarrea modificación
significativa de la corriente de oxidación de la sonda
electroquímica, como se muestra en las figuras 13 y 14,
respectivamente, antes del remojo y después del remojo o inmersión.
Esto demuestra que, en ausencia de irradiación luminosa, los
anticuerpos no se fijan.
En lo que concierne a las curvas I(E) de
las figuras 11 a 14, se recuerda que la determinación de la
permeabilidad es realizada con ayuda de las curvas de Koutecky -
Levich basadas en la ecuación siguiente:
C_{s}* concentración de la especie
electroactiva en solución
\omega velocidad de rotación del electrodo
giratorio
D_{s} coeficiente de difusión de la especie en
solución
D_{m} coeficiente de difusión de la especie en
la película
\delta_{m} espesor de la película
i_{lim} corriente límite de difusión
la permeabilidad corresponde a la razón
siguiente:
\gamma viscosidad cinemática de la
solución
n número de electrones intercambiados en el
proceso farádico
F faraday
A superficie del electrodo
K coeficiente de reparto de la especie entre la
película y la solución
\vskip1.000000\baselineskip
Las curvas representan la variación de la razón
C_{s}*/i_{lim} en función de 1/w^{1/2}. Conociendo n, F y A,
la ordenada en el origen permite obtener el valor de la
permeabilidad P_{m}.
Se obtiene i_{lim} trazando las curvas de
intensidad/potencial en régimen estacionario para diferentes
velocidades de rotación de electrodo.
La explotación de los trazados I(E)
anteriores permitió obtener las curvas de
Koutechy-Levich representadas en la figura 15,
donde la ordenada en el origen es inversamente proporcional a la
permeabilidad de las películas para la sonda.
Se observa por la figura 15 que después de la
injertación la permeabilidad de la película ha disminuido. Las
mismas curvas obtenidas con los trazados I(E) de un electrodo
no irradiado (figura 16) convergen hacia la misma ordenada en el
origen, lo que indica que la permeabilidad de la película no se ha
modificado por una simple inmersión o remojo de los electrodos en
la solución de anticuerpos.
La irradiación de una película de
poli(p-pirrolbenzofenona) conlleva, en
voltametría cíclica, una fuerte disminución (-54%) de la intensidad
del sistema redox a -2 V en relación a la función benzofenona. Este
fenómeno ilustra la desaparición de la función cetona y, por lo
tanto, la reactividad de este grupo bajo irradiación.
Al ser las macromoléculas biológicas solubles
casi exclusivamente en medio acuoso, se estudió la eficacia de la
injertación por irradiación en medio acuoso. Con este fin, se
utiliza en un primer tiempo la albúmina sérica bovina (ASB) como
proteína modelo. Se sumergieron electrodos modificados en una
solución acuosa de esta proteína y se irradiaron con una luz
procedente de una lámpara de mercurio de 250 W a través de un filtro
IR con una intensidad de 100 mWcm^{-2}.
Con el fin de detectar la inmovilización de
proteínas en la superficie de la película, se transfirieron estos
electrodos a un electrolito orgánico y se estudió la permeabilidad
de la película con ayuda de una sonda electroactiva (ferroceno).
Aparecía una disminución del 25% frente a la permeabilidad inicial,
confirmando la injertación de proteína. Hay que observar también
que esta disminución no se debe a una simple adsorción de la
proteína en la superficie de la película. En efecto, el mismo
experimento realizado sin irradiación no acarrea más que una
pérdida del 9% de la permeabilidad de la película.
Para confirmar estas posibilidades de
injertación, se realizó la irradiación de los electrodos,
modificados en las condiciones del ejemplo 3.3, en presencia de
otra proteína biológicamente activa: una enzima. Esta enzima, la
glucosa oxidasa o GOD, cataliza la oxidación de la glucosa a ácido
glucónico en ácido glucónico en presencia de dioxígeno, el cual se
reduce a H_{2}O_{2}.
Como el H_{2}O_{2} se oxida
electroquímicamente a un potencial de 0,6 V frente a ECS sobre un
electrodo de platino, esta reacción enzimática puede ir seguida de
una señal eléctrica. Por consiguiente, tras la irradiación el
electrodo modificado se transfiere a una solución acuosa y se
mantiene en un potencial de 0,6 V frente a ECS. En presencia de
glucosa, la enzima forma H_{2}O_{2}, el cual, a este potencial,
se oxida en la superficie en la superficie del electrodo de
platino, generando así una corriente eléctrica.
La respuesta amperométrica del electrodo a
adiciones de glucosa demuestra primeramente la posibilidad
fotoinjertar una enzima sobre este tipo de polímero conservando su
actividad biocatalítica frente a sus substratos. Esta respuesta
permite también establecer una curva de calibración de la glucosa
cuya pendiente de la parte lineal I (intensidad = f (concentración
de glucosa) indica la sensibilidad del captor: 3,37 mAM^{-1}
cm^{-2}.
El mismo experimento realizado sin irradiación
demuestra que la enzima puede adsorberse sobre la película
polimérica, pero la sensibilidad a la glucosa obtenida (0,56
mAM^{-1} cm^{-2}) es netamente inferior a la anterior. Esto
confirma la injertación de la enzima bajo irradiación de la película
de poli(pirrolbenzofenona).
\vskip1.000000\baselineskip
Se examinaron la eficacia de la fotoinjertación
y la accesibilidad de la biomolécula inmovilizada en la superficie
del polímero por mediciones gravimétricas con el sistema afín
avidina-biotina.
Se modificaron electrodos de oro que recubrían
cuarzos de microequilibrio mediante una película de
poli(pirrolbenzofenona) correspondiente a 2.10^{-9}
molcm^{-2}. Se pusieron en contacto dos cuarzos modificados con
una solución acuosa de biotina, siendo uno irradiado y el otro no.
Debido a las fuertes interacciones afines entre la biotina (una
vitamina, PM 250) y la avidina (una proteína, PM 66.000), la
asociación avidina-biotina se efectúa
espontáneamente. Las mediciones gravimétricas, en presencia de una
solución de avidina (0,5 mg/ml) indican una disminución de
frecuencia de 200 Hz y 70 Hz para, respectivamente, el polímero
irradiado y el polímero no irradiado (véase la Figura 4). Esto
corresponde a un aumento de masa en la superficie del polímero de
358 ngcm^{-2} en el caso de la irradiación y de 125 ng cm^{-2}
en ausencia de irradiación.
Ahora bien, la inmovilización de una monocapa
compacta de avidina corresponde teóricamente a un aumento de masa
de 362 ngcm^{-2}. Parece, pues, que la irradiación induce la
injertación eficaz de biotina en la superficie del polímero,
provocando un recubrimiento total de este último por una monocapa de
avidina. En ausencia de irradiación, y por lo tanto de
fotoinjertación de biotina, únicamente un 34% de la superficie del
polímero está recubierta de avidina.
Estos resultados demuestran también que la
biotina injertada conserva sus propiedades de reconocimiento frente
a la avidina y conserva, pues, una excelente accesibilidad, Las
mediciones gravimétricas demostraron que una monocapa de avidina
quedaba inmovilizada en la interfase
polímero-solución, o sea, 5,48 10^{-12}
moles.cm^{-2}. Por consiguiente, como mínimo se fotoinjertan 5,48
10^{-12} moles.cm^{-2} de biotina en la superficie del
polímero. Sabiendo que una monocapa de polímero puede aproximarse a
8 10^{-11} moles.cm^{-2}, esto conduce a una razón de
injertación mínima del 6%.
\vskip1.000000\baselineskip
Se sumergen conteras de carbono vítreo
recubiertas de una película de PPBP (0,5 mC) en una solución de
anticuerpos de conejo (IgG) desoxigenada por burbujeo de argón
durante 30 min. e irradiadas con ayuda de la misma luz procedente
de una lámpara de mercurio de 250 W durante dos horas.
Las voltametrías cíclicas de las Em en una
solución de DMFc (0,5 mM) fueron registradas antes y después de la
inmersión o del remojo.
Las curvas obtenidas son el objeto de las
figuras 17 y 18, respectivamente.
Se puede observar a partir de las figuras 17 y
18 que los voltamogramas presentan en el dominio de los potenciales
positivos la electroactividad clásica de las películas
polipirrólicas y, en el dominio de los potenciales negativos, la
oxidación irreversible del DMFc.
Esta señal desaparece completamente tras la
injertación de la película por los anticuerpos IgG de conejo.
La modificación de la señal electroquímica de
las Em en la solución de DMFc es menor para un electrodo no
irradiado, como muestran las curvas obtenidas sin irradiación que
constituyen el objeto de las figuras 19 y 20.
Se observa que la corriente de oxidación de la
sonda disminuyó ligeramente, mientras que desaparecía por completo
para un electrodo irradiado.
El conjunto de los resultados obtenidos tiende a
probar que la inmovilización de diferentes moléculas es posible en
la superficie de las películas de PPBP. Esta inmovilización
necesita, sin embargo, una excitación luminosa de las
películas.
Un simple remojo no conlleva modificación.
Este producto no tiene, pues, interacción de
tipo adsorción, sino la formación fotoactivada de uniones
covalentes.
Parte
II
La fórmula de este monómero recientemente
sintetizado es la siguiente:
En un matraz de 50 ml bajo argón, se introducen
452 mg de ácido 4-benzoilbenzoico (2 mmoles) y 412
mg de 1,3-diciclohexilcarbodiimida (DCC) en 20 ml
de CH_{2}Cl_{2} y se realiza una agitación durante 5
minutos.
Se añaden entonces 264 mg (2 mmoles) de
4-(2-aminoetil)fenol o tiramina y se agita
durante 5 min.
Se añaden luego 80 mg de dimetilaminopiridina
(DMAP) y se continúa agitando durante 5 días.
Se vuelven a añadir 50 ml de agua y se extrae
después con 3 veces 50 ml de CH_{2}Cl_{2}. Se evapora entonces
el CH_{2}Cl_{2} y se lava el producto obtenido con metanol.
\vskip1.000000\baselineskip
Tras evaporación a sequedad, el análisis de RMN
del producto obtenido muestra que consiste en una mezcla de dos
productos mayoritariamente presentes, el derivado fenólico de la
benzofenona de la fórmula anterior y un subproducto de la fórmula
siguiente:
Se llega a la separación de estos dos productos
por cromatografía en columna de sílice, eluyendo con
diclorometano/hexano/metanol 90/5/5 en volumen.
El espectro de RMN del monómero
4-(2-aminoetil)fenolbenzofenona está
representado en la figura 21.
Se obtuvieron 167 mg del producto de la
invención buscado, lo que corresponde a un rendimiento del 22%
molar.
\vskip1.000000\baselineskip
Se analizaron las propiedades electroquímicas
del monómero de
4-(2-aminoetil)fenolbenzofenona por
voltametría cíclica sobre contera de carbono vítreo.
Se disuelve el monómero en metanol que contiene
0,1 M de NaOH y 0,1 M de LiClO_{4}.
La figura 22 representa en la curva A la señal
electroquímica del monómero cuando se realizan barridos sucesivos
de potencial entre 0 y IV en relación a Ag-AgCl.
En el primer barrido, se observa un intenso pico
anódico irreversible a 0,4 V correspondiente a la oxidación de los
grupos fenólicos.
En el curso de los ciclos siguientes, esta señal
disminuye y luego desaparece.
Este fenómeno es debido a la formación en la
superficie del electrodo de una película polifenólica aislante,
resultante de la polimerización de los radicales generados por
electrones.
Antes de esta polimerización, la figura 22
representa en la curva B la señal obtenida por ciclaje en reducción
en la misma solución de monómeros. Se observa un pico catódico
irreversible correspondiente a la reducción de las unidades de
benzofenona.
Después de barridos repetitivos de potencial
entre 0 y 1V, se transfiere el electrodo a una solución
electrolítica exenta de monómero y se cicla en el dominio de la
electroactividad de la benzofenona, para obtener la curva de
intensidad (I) en relación al potencial V o E, llamada I (V o E
representado en la figura 23).
Como se constata a partir de la figura 23,
aparece un pico catódico irreversible correspondiente a la reducción
de las unidades de benzofenona que demuestra la presencia de estas
últimas en la superficie del electrodo y, por lo tanto, la
formación de una película polimérica.
Estos resultados demuestran igualmente que es
posible electrogenerar en la superficie de un electrodo, por
ciclaje electroquímico oxidante, películas de polifenol substituidas
por unidades de benzofenona.
Además, contrariamente a las películas
polipirrólicas objeto de los ejemplos 1 a 3, las películas de
polifenoles objeto del presente ejemplo 4 son aislantes.
Las condiciones de fotoinjertación de una enzima
en la superficie del polímero son idénticas a las utilizadas para
la película de polipirrolbenzofenona del ejemplo 3 anterior.
Los electrodos son sumergidos e irradiados dos
horas en la solución de glucosa oxidasa (2 mg/ml) desoxigenada.
La actividad de la enzima inmovilizada en la
superficie de los electrodos fue medida por un método
espectrofotométrico clásico de las oxidasas.
La oxidación enzimática de la glucosa por la
glucosa oxidasa (abreviada como GOD) conduce a la formación de
H_{2}O_{2}.
glucosa +
GOD(FAD) \rightarrow gluconolactona +
GOD(FADH_{2})GOD(FADH_{2}) + O_{2}
\rightarrow GOD(FAD) +
H_{2}O_{2}
En presencia de peroxidasa de rábano silvestre
(HRP), H_{2}O_{2} oxida enzimáticamente la
orto-toluidina.
Esta especie cromógena se oxida a un producto
cromóforo, especie absorbente a 425 nm.
Se sigue la variación de absorbancia de la
o-toluidina en función del tiempo y se convierte en
actividad enzimática.
Los espectros llevan una parte lineal para la
cual la etapa limitante es la producción de H_{2}O_{2} por la
glucosa oxidasa.
Al poner esta última en condiciones saturantes
de glucosa, la pendiente de la parte lineal representa la velocidad
máxima de la catálisis enzimática.
Con el fin de determinar la actividad enzimática
del electrodo modificado, se sumerge este último en una solución de
LiClO_{4} 0,1 M, pH 6,8, que contiene 250 mM de glucosa, 2 U/ml de
peroxidasa y 0,2 mM de o-toluidina.
Se mide la absorbancia en función del tiempo a
425 nm del medio de reacción de manera continua y se obtiene la
curva objeto de la figura 24 con, en la abscisa, el tiempo en
minutos y, en la ordenada, la absorbancia expresada en densidad
óptica (DO).
\global\parskip0.900000\baselineskip
Se observa a partir de la figura 24 que la
pendiente de la parte lineal es igual a 6m DO.min^{-1}, lo que
corresponde a una actividad enzimática para el electrodo modificado
de 68 mU.
Esta actividad enzimática demuestra la
posibilidad de una fotoinmovilización de proteína sobre una película
de polifenol funcionalizada por unidades de benzofenona.
Se realiza en la práctica la preparación del
monómero de
3-(2-aminoetil)indolbenzofenona.
\vskip1.000000\baselineskip
En un matraz de 50 ml bajo argón, se introducen
452 mg (2 mmoles) de ácido 4-benzoilbenzoico y 412
mg de DCC en 20 ml de CH_{2}Cl_{2} y se agita durante 30
minutos.
Se añaden 320 mg de
3-(2-aminoetil)indol o triptamina y se
continúa agitando durante 5 minutos.
Se añaden entonces 80 mg de DMAP y se agita
durante 1 semana.
Se añaden 50 ml de agua y luego se extrae con 3
veces 50 ml de CH_{2}Cl_{2}. se seca la fase orgánica sobre
Na_{2}SO_{4} y se evapora luego el solvente en un evaporador
rotatorio bajo presión reducida y se efectúan un lavado con etanol
y después una cromatografía en sílice (diclorometano/hexano/metanol:
86/10/4 en volumen).
El rendimiento del producto de la fórmula
indicada en 6.1 es del 68% molar.
\vskip1.000000\baselineskip
Se procede a un análisis de RMN clásica y se da
el espectro de RMN en la figura 25.
\vskip1.000000\baselineskip
De manera similar a los ejemplos anteriores, se
realiza un estudio electroquímico por voltametría cíclica del
monómero (2 mM) en acetonitrilo, que indica un prepico a 0,9 v
seguido de un pico anódico irreversible a 1,16 v correspondiente a
la oxidación irreversible del grupo indol.
En reducción, se observa un sistema de picos
reversibles a E_{1/2} = -1,8V.
Este sistema redox corresponde a la reducción de
la unidad de benzofenona.
La modificación de la superficie del electrodo
es realizada por electrolisis a potencial controlado de 0,8 V o por
barridos repetitivos de potencial en el dominio de
0-0,9 V.
Tras transferencia a una solución de
acetonitrilo exenta de monómero, el voltamograma del electrodo
modificado presenta un sistema reversible a E_{1/2} = -0,6 V
debido a la electroactividad de la película de poliindol, así como
un sistema reversible a E_{1/2} = -1,8 V correspondiente a las
unidades de benzofenona inmovilizadas.
Esto demuestra la formación de una película
polimérica de poliindol que contiene grupos benzofenona.
Por consiguiente, la funcionalización de la
benzofenona por una unidad de indol electropolimerizable permite
obtener películas poliméricas de poliindol por electrooxidación.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Como ejemplo de monómero de tipo
vinilbenzofenona, se prepara en la práctica el monómero de
vinilanilinabenzofenona.
En un matraz de 50 ml bajo argón, se introducen
452 mg (2 mmoles) de ácido 4-benzoilbenzoico y 412
mg de DCC en 20 ml de CH_{2}Cl_{2} y se agita durante 30
minutos.
Se añaden entonces 267 mg de vinilanilina (2,2
mmoles) y se agita aún durante 5 minutos.
Se añaden luego 80 mg de DMAP y se agita aún
durante 5 días.
Se añaden 50 ml de agua y se extrae después con
3 veces 50 ml de CH_{2}Cl_{2}. Se seca la fase orgánica sobre
Na_{2}SO_{4}.
Se realiza una cromatografía en sílice
(diclorometano/hexano/metanol: 86/10/4 en volumen) y se aísla el
producto de vinilanilinabenzofenona de la fórmula indicada en 7.1
con un rendimiento del 22%.
\vskip1.000000\baselineskip
Se realiza un análisis de RMN de manera clásica
y se obtiene el espectro de RMN de la figura 26.
\vskip1.000000\baselineskip
De forma similar a la preparación de los
polímeros producidos en los ejemplos anteriores, el voltamograma de
la vinilbenzofenona, 2 mmoles en acetonitrilo, muestra claramente en
el dominio de los potenciales negativos un pico catódico
irreversible a -1,88 V correspondiente a la reducción de la unidad
de benzofenona.
Esta reducción va seguida de una transferencia
electrónica que conduce a la formación del radical vinílico asiento
de la polimerización.
Barridos repetitivos de potencial en el dominio:
0-2,4 V conllevan la formación de una película
polimérica de polivinilbenzofenona en la superficie de un
electrodo.
Aparte de la electroactividad de la benzofenona,
el electrodo modificado exhibe un sistema de picos casi reversible
hacia -0,15 V debido a la electroactividad de la película
polivinílica funcionalizada.
Por consiguiente, la funcionalización de la
unidad fotoactivable por un grupo vinilo constituye otra vía de
polimerización electroquímica de las benzofenonas en forma de
películas polivinílicas.
\vskip1.000000\baselineskip
Parte
III
Como ejemplo de otras unidades fotoactivables,
se ejemplifican aquí los grupos azida.
En el ejemplo preferido, el grupo azida será
funcionalizado a un pirrol como unidad electropolimerizable.
A continuación, se da la fórmula de este nuevo
compuesto:
En un matraz de 25 ml, se introducen 207 mg de
aminobutilpirrol (1,5 mmoles) en 5 ml de THF seco. Se añaden
entonces 250 mg (1,37 mmoles) de
4-fluoro-3-nitrofenilazida
en 5 ml de THF seco, con agitación durante 30 minutos. Se realiza
la evaporación del THF y la disolución del precipitado obtenido en 7
ml de H_{2}O. Se añaden entonces 7 ml de NaOH 1M.
Se realiza después una extracción con dos veces
15 ml de acetato de etilo y luego se realiza un secado de la
solución de acetato de etilo sobre Na_{2}SO_{4} y después una
cromatografía de ésta en las mismas condiciones de cromatografía
que en los ejemplos anteriores, para obtener el producto de la
fórmula indicada en 8.1 con un rendimiento del 54% molar.
\vskip1.000000\baselineskip
Tras la cromatografía, se confirmaron la pureza
del producto y su fórmula química por RMN. En la figura 27 se da el
espectro de RMN.
\vskip1.000000\baselineskip
Se analizaron las propiedades electroquímicas
del monómero por voltametría cíclica sobre contera de carbono
vítreo. Se disuelve el monómero al abrigo de la luz en acetonitrilo
(1,5 mM). Como muestra la figura 28, el voltamograma presenta en la
parte anódica un pico irreversible a +0,95 V/Ag/Ag^{+}
correspondiente a la oxidación del grupo pirrol.
En el dominio catódico, se observan varias ondas
de reducción irreversible (-1,4; -1,5 y -1,7 V/Ag/Ag^{+}), que
pueden corresponder a reducciones sucesivas del grupo nitro.
Se realizó la formación de películas pirrólicas
por barridos repetitivos de potencial entre 0 y 0,90 V/Ag/Ag^{+}.
Esta formación queda ilustrada por la aparición y el crecimiento de
un sistema redox a +0,4 V/Ag/Ag^{+} característico de la
electroactividad de las cadenas polipirrólicas y la curva obtenida
forma el objeto de la figura 29, curva A.
Las películas pueden también formarse por
electrolisis a potencial controlado (0,9 V/Ag/Ag^{+}). La curva
obtenida está representada en la figura 30, curva B, que presenta la
señal del electrodo después de una electrooxidación de 2 mC y su
transferencia a una solución electrolítica exenta de monómero. El
voltamograma de este electrodo muestra claramente la
electroactividad clásica de las películas pirrólicas en el dominio
anódico.
Estos primeros resultados muestran que es
posible electrogenerar en la superficie del electrodo películas de
polímero a partir de una solución orgánica de monómero de
azidopirrol. Las películas obtenidas de forma reproducible son
hidrofóbicas, resistentes y de espesor controlable.
\vskip1.000000\baselineskip
Como para las unidades de benzofenona, las
azidas, preferiblemente las arilazidas, son precursores de la
fotogeneración de radicales.
Por fotolisis, la formación de intermediarios
nitrenos altamente reactivos conduce a la formación de una unión
covalente entre el intermediario fotogenerado y la biomolécula.
Se formaron películas de polipirrol por
electrolisis (2 mC) de potencial impuesto, sobre electrodo de
platino.
Los polímeros obtenidos, protegidos de la luz,
fueron transferidos a una solución acuosa de enzima glucosa oxidasa
o GOD a razón de 1 mg/ml e irradiados durante dos horas bajo una luz
(300-350 nm) procedente de una lámpara de mercurio
de 250 W.
Después de aclarar los electrodos, se determinó
su actividad enzimática según el método utilizado para los
electrodos modificados por polipirrolbenzofenona.
La pendiente de la parte lineal de la curva de
absorbancia en función del tiempo de la o-toluidina
es igual a 0,38 mDo/min, lo que corresponde a una actividad
enzimática del electrodo de 22 mU/cm^{2}. Esta actividad
enzimática de la película polipirrólica funcionalizada por unidades
de azido demuestra la presencia de moléculas de enzima inmovilizada
por fotoinjertación.
Se acometió la dosificación amperométrica de la
glucosa en medio acuoso con los electrodos injertados a + 600
Mv/Ag/AgCl con el fin de oxidar en la superficie del electrodo las
moléculas de H_{2}O_{2} enzimáticamente generadas. Se presenta
una curva de calibración de la glucosa en la figura 31.
Como se observa a partir de la figura 31, la
respuesta amperométrica del electrodo modificado a adiciones de
glucosa presenta una parte lineal de pendiente igual a 40
PA/M/cm^{2} para una concentración inferior a 8 Mm. Más allá de
esta concentración, la curva se encorva para tender hacia un valor
correspondiente a la corriente máxima del biocaptor (I_{max} =
120 nA) cuando se saturan las enzimas de substrato.
La forma de la curva de calibración obtenida es
similar a la de una curva que describe una catálisis enzimática de
tipo Michaelis-Menten. Considerando que en el
proceso enzimático de detección del substrato la etapa enzimática
es la etapa limitante, la intensidad de la respuesta amperométrica
puede asimilada a la velocidad de la reacción enzimática. En esta
hipótesis, la modelización de la respuesta del biocaptor es
realizada con ayuda de la representación de
Lineweaver-Burk.
donde:
I: intensidad de la respuesta amperométrica del
biocaptor
I_{max}: intensidad máxima de la respuesta
amperométrica del biocaptor en presencia de una concentración
saturante de substrato
K^{app}/_{m}: constante aparente de
Michaëlis, característica del conjunto del biomaterial
C: concentración de glucosa.
\vskip1.000000\baselineskip
Como se observa a partir de la figura 32, esta
modificación permite acceder a la constante aparente de
Michaelis-Menten, a saber K^{app}/_{m}.
El valor K^{app}/_{m} obtenido es igual a 20
mM, como resulta de la figura 32, y es similar al de la constante
cinética de la enzima libre en solución. Esta similitud de valor es
representativa de la baja restricción impuesta a las enzimas
fotoinjertadas en la superficie de un polímero con respecto a
enzimas encapsuladas en el seno de un material.
El conjunto de estos resultados muestran la
eficacia de la fotoinjertación de biomoléculas por irradiación de
los sitios de azidas electropolimerizadas.
Parece, pues, que el sitio pirrólico permite la
obtención, bajo electrolisis de potencial controlado, de una
película de polímero hidrofóbica, resistente y de espesor
controlable, funcionalizada por unidades de azida que conservan su
propiedad de fotoinjertación bajo irradiación.
Claims (9)
1. Monómero que tiene al menos una entidad
electropolimerizable y al menos una unidad a la vez fotoactivable y
fotoinjertable, seleccionado entre:
\sqbullet el monómero de pirrolbenzofenona de
fórmula:
en particular obtenido por reacción
de ácido 3-benzoil-benzoico con
3-pirrol-1-propanol;
\sqbullet el monómero de
4-(2-aminoetil)fenolbenzofenona de
fórmula:
en particular obtenido por reacción
de 4-(2-aminoetil)fenol con ácido
4-benzoilbenzoico,
\sqbullet el monómero de indolbenzofenona de
fórmula:
en particular obtenido por reacción
de 3-(2-aminoetil)indol con ácido
4-benzoilbenzoico,
\sqbullet el monómero de
vinilanilinabenzofenona de fórmula:
en particular obtenido por reacción
de vinilanilina con ácido
4-benzoilbenzoico,
\sqbullet el monómero de azidofenilpirrol de
fórmula:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en particular obtenido por reacción
de
4-fluoro-3-nitro-fenilazida
con
aminobutilpirrol.
2. Electropolímero fotoinjertable,
caracterizado por ser preparado a partir de un monómero tal
como se ha definido en la reivindicación 1.
3. Electropolímero según la reivindicación 2, o
monómero según la reivindicación 1, caracterizado por estar
fotoinjertado con una substancia fotoinjertable seleccionada entre
las (macro)moléculas biológicas y/o las quimeras de éstas
y/o entre las unidades de estas (macro)moléculas y/o de estas
quimeras.
4. Electropolímero según la reivindicación 2, o
monómero según la reivindicación 1, caracterizado por estar
fotoinjertado con una substancia fotoinjertable seleccionada entre
las (macro)moléculas siguientes: aminoácidos, oligopéptidos,
polipéptidos, proteínas, gluco-proteínas,
lipoproteínas, nucleótidos, oligonucleótidos, polinucleótidos de
tipo ARN o ADN, de origen biológico o sintético, enzimas, coenzimas
y vitaminas; o las quimeras de las biomoléculas siguientes:
poliácidos nucleicos peptídicos, sitios prostéticos de enzimas tales
como metaloporfirinas, isobacterioclorinas, corrinas, clorinas y
anticuerpos artificiales a base, por ejemplo, de polímeros con
impronta.
5. Poli(pirrolbenzofenona) obtenida a
partir del monómero de pirrolbenzofenona de fórmula:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
fotoinjertado con una substancia
fotoinjertable seleccionada entre una proteína, preferiblemente la
albumine sérica bovina o humana; una enzima, preferiblemente la
glucosa oxidasa; una biotina, preferiblemente el sistema afín
avidina-biotina; la tionina; o un anticuerpo,
preferiblemente un anticuerpo de conejo
(IgG).
6. Polímero de polifenolbenzofenona obtenido a
partir del monómero de
4-(2-aminoetil)fenolbenzofenona de
fórmula:
\vskip1.000000\baselineskip
o del monómero de azidofenilpirrol
de
fórmula:
fotoinjertado con una enzima
fotoinjertable, preferiblemente la glucosa
oxidasa.
7. Procedimiento de fabricación de biocaptores
electrónicos del tipo de los que contienen al menos un
(micro)transductor que lleva al menos una membrana sensible
portadora de sondas de reconocimiento específico de moléculas diana
para analizar, caracterizado por preparar la membrana
sensible fijada sobre el soporte transductor a partir de al menos
un polímero según la reivindicación 2 y por injertar
(preferiblemente de manera localizada), las sondas de
reconocimiento específico sobre las unidades fotoactivables del
polímero por fotoactivación.
8. Biocaptor electrónico del tipo de los que
contienen al menos un (micro)transductor que lleva al menos
una membrana sensible portadora de sondas de reconocimiento
específico, caracterizado por contener la membrana sensible
al menos un polímero según la reivindicación 2, sobre el que se
fotoinjertan (preferiblemente de manera localizada) substituyentes
que corresponden a las sondas de reconocimiento específico.
9. Soporte que forma electrodo,
caracterizado por contener en su superficie al menos una capa
de un polímero según una de las reivindicaciones 2 a 6.
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