ES2265488T3

ES2265488T3 - Composiciones inmunizantes y metodos de uso.

Info

Publication number: ES2265488T3
Application number: ES02705685T
Authority: ES
Inventors: Daryll A. Emery; Darren E. Straub; Donavan E. Zammert; Gayla K. Kallevig
Original assignee: Epitopix LLC
Current assignee: Epitopix LLC
Priority date: 2001-01-03
Filing date: 2002-01-03
Publication date: 2007-02-16
Anticipated expiration: 2022-01-03
Also published as: US20040197350A1; US20170087238A1; MXPA03006038A; US20110200616A1; US7138124B2; NZ526786A; US20030211118A1; CA2708949C; US20110200637A1; US7138125B2; US20120195899A1; US20030036639A1; DE60210413T2; US8575315B2; DE60210413D1; BR0206293B1; BR0206293A; US20120195898A1; US8993252B2; US20090081236A1

Abstract

Una composición que comprende: al menos dos polipéptidos receptores de sideróforos (SRPs) aislados a partir de un microorganismo gram negativo; al menos dos porinas aisladas a partir de un microorganismo gram negativo; y lipopolisacáridos (LPS) a una concentración no mayor de aproximadamente 100 unidades de endotoxina por mililitro (EU/ml).

Description

Composiciones inmunizantes y métodos de uso.

Antecedentes

El impacto económico de las enfermedades infecciosas sobre la producción animal es bien conocido. Las enfermedades infecciosas reducen las ganancias, incrementan los costos de producción, y ponen en peligro toda la salubridad de los productos alimenticios, y también tienen un efecto sobre el desempeño, la salud y el bienestar del animal. Dicho estado de enfermedad puede reducir el rendimiento y la calidad de la leche, dando como resultado grandes pérdidas económicas para los productores lácteos. En algunos casos, las enfermedades infecciosas microbianas pueden causar morbilidad y mortalidad entre los recién nacidos, los juveniles (p.e.: la camada de reemplazo), o los animales adultos.

La industria agrícola en la actualidad depende de terapias de antibióticos y vacunas para reducir las pérdidas causadas por las enfermedades infecciosas clínicas y subclínicas, incluyendo enfermedades gastrointestinales, enfermedades respiratorias, y enfermedades sistémicas. Sin embargo, para determinadas dolencias, los antibióticos son infectivos, pueden prolongar la dolencia, o inducir un estado de portador. Las vacunas han demostrado, con frecuencia, ser un medio eficaz para el control de las enfermedades infecciosas, pero las preocupaciones acerca de los efectos adversos o la falta de protección contra múltiples microbios han constituido una deficiencia importante de las vacunas actuales. Por ejemplo, se encuentran disponibles vacunas que contienen uno o más inmunógenos de un género, especie, o cepa específicos de un microorganismo; sin embargo, pocas, si existe alguna, proporcionan protección cruzada, o estimulan la inmunidad de forma amplia contra múltiples cepas, especies o géneros de microbios.

Las vacunas que contienen moléculas obtenidas a partir de bacterias gram negativas incluyen, por lo regular, niveles contaminantes de lipopolisacárido (LPS), un componente de la membrana externa de la gran mayoría de las bacterias gram negativas. La presencia de LPS en un producto inyectable puede producir como resultado una respuesta inflamatoria en el sitio de la inyección, que puede producir inflamación, dolor y, con frecuencia, la formación de un granuloma en el lugar de la inyección. En casos raros, puede producir un shock anafiláctico y la muerte. Esta respuesta inflamatoria no específica en un animal de cría puede producir como resultado pérdidas económicas significativas, debido a las marcas y cicatrices de los restos del animal que, con frecuencia, resultan cortados durante el procesamiento, lo que se traduce en la pérdida del producto y el descenso de la calidad de los restos. Aunque existen métodos para la remoción del LPS de las composiciones, tal cosa, con frecuencia, no es posible para el caso de vacunas que incluyen células completas. Además, debido a los elevados costos de la remoción del LPS de las soluciones, con frecuencia no resulta práctico desde el punto de vista económico eliminar el LPS de las vacunas para su uso en animales no humanos.

Resumen de la invención

La presencia de LPS en las vacunas animales tiene un significativo impacto económico. Sin embargo, la renuencia de los campesinos a pagar elevados precios por las vacunas ha impedido el uso de métodos, existentes, pero costosos para la remoción de LPS. Por tanto, existe una necesidad mantenida, pero no resuelta de crear métodos para la producción económica de composiciones que contengan moléculas provenientes de bacterias gram negativas que incluyan bajas cantidades de LPS contaminantes. La presente invención constituye un avance en la técnica de aislar, de manera económica, polipéptidos a partir de bacterias gram negativas con bajos niveles de LPS contaminantes. O sea, la presente invención proporciona métodos para aislar polipéptidos de membrana externa. El método incluye proporcionar una bacteria gram negativa, destruir la bacteria gram negativa en un tampón, solubilizar la bacteria gram negativa destruida, y aislar moléculas a partir de la bacteria gram negativa, cuyas moléculas aisladas incluyen polipéptidos de la membrana externa que comprenden al menos dos polipéptidos receptores de sideróforo (SRPs) y al menos dos porinas, y LPS a una concentración no mayor que aproximadamente 10.0 unidades de endotoxina por mililitro (EU/ml). Durante la destrucción, la bacteria gram negativa puede encontrarse presente en el tampón a una concentración entre 720 gramos de bacteria por 1.000 mililitros de tampón y 1.080 gramos de bacteria por 1.000 mililitros de tampón. La solubilización de la bacteria gram negativa puede tomar un tiempo mayor que 24 horas. La solubilización de la bacteria gram negativa puede tener lugar en una solución que contenga sarcosina, en la cual la proporción de sarcosina por gramo en peso de bacteria gram negativa destruida se encuentra entre aproximadamente 0,8 gramos de sarcosina por aproximadamente 4,5 gramos de bacteria gram negativa destruida y aproximadamente 1,2 gramos de sarcosina por aproximadamente 4,5 gramos de bacteria gram negativa destruida.

La presente invención se dirige también a una composición que incluye al menos dos SRPs aislados a partir de una bacteria gram negativa, al menos dos porinas aisladas de la bacteria gram negativa, y LPS a una concentración no mayor que aproximadamente 10.0 EU/ml. La composición puede incluir también un portador farmacéuticamente aceptable. La bacteria gram negativa puede ser un enteropatógeno, de preferencia, un miembro de la familia Enterobacteriaceae, con mayor preferencia un miembro de la tribu de las Escherichieae o las Salmonelleae, con la mayor preferencia, Salmonella spp. o Escherichia coli. Los al menos dos SRPs pueden tener masa moleculares entre aproximadamente 60 kDa y aproximadamente 100 kDa, y las al menos 2 porinas pueden tener masas moleculares entre aproximadamente 30 kDa y aproximadamente 43 kDa.

La presente invención también representa un avance en la técnica de estimular la inmunidad contra múltiples cepas, especies, o géneros de microorganismos. O sea, la presente invención también proporciona el uso de la composición en la fabricación de medicamentos para inducir la producción de anticuerpos en un animal. Una cantidad efectiva de una composición de la presente invención que incluya además un portador farmacéuticamente aceptable se destina a su administración en un animal, siendo que la composición induce, en el animal, anticuerpos que se unen de manera específica a al menos un SRP, o al menos a una porina. La bacteria gram negativa puede ser un enteropatógeno, de preferencia, un miembro de la familia Enterobacteriaceae, con mayor preferencia un miembro de la tribu de las Escherichieae o las Salmonelleae, con la mayor preferencia, Salmonella spp. o Escherichia coli. El animal puede ser aviar, bovino, caprino, porcino, u ovino. Cuando el animal es un bovino, el bovino puede presentar un fenotipo de, por ejemplo, conteo bajo de células somáticas, producción de leche incrementada, deposiciones fecales disminuidas, o incremento de peso.

La presente invención también está dirigida al uso de composiciones en la producción de medicamentos para inducir la producción de anticuerpos en un animal, en el caso en que una cantidad eficaz de una composición destinada a la administración a un animal comprende al menos cuatro SRPs aislados de una bacteria gram positiva y un portador farmacéuticamente aceptable, en el caso en que la composición induce, en el animal, anticuerpos contra el SRP. La bacteria gram positiva puede ser miembro de la familia Micrococcaceae, por ejemplo, Staphylococcus aureus. Los SRPs pueden tener masas moleculares entre alrededor de 60 kDa y alrededor de 100 kDa.

La presente invención también proporciona el uso de composiciones en la producción de medicamentos para tratar dolencias en un animal que incluyen, por ejemplo, un elevado conteo de células somáticas, deposiciones fecales conteniendo una bacteria en el tracto intestinal de un animal, baja producción de leche, mastitis en una animal productor de leche y metritis en un animal. Las composiciones son para administrarse a un animal que padece, o se encuentra en riesgo de padecer una dolencia, cuyas composiciones incluyen, también, un portador farmacéuticamente aceptable.

Breve descripción de las figuras

Figura 1. Comparación de aislamientos de Salmonella y respuesta serológica a la vacunación en vacas lecheras. Porciento de aislamiento positivo, porciento de vacas lecheras con deposiciones de Salmonella bredeny, vacunadas; respuesta de anticuerpos (O.D.), densidad óptica a 405 nm de la respuesta de anticuerpos medida mediante un ELISA. Las barras corresponden al eje y que se encuentra a la izquierda (Porciento de aislamiento positivo) y los diamantes vacíos corresponden al eje y de la derecha (Respuesta de anticuerpos (O.D.))

Figura 2. Conteo de las células somáticas de vacas individuales, realizado por la Asociación de Mejoramiento del Ganado Lechero (DHIA), antes y después de la primera vacunación. Conteo promedio de célulasX1.000, conteo promedio de células somáticas multiplicado por 1.000; Vacas muestreadas, identificación de cada una de las 51 vacas; Pre-Vac, conteo promedio de célulasX1.000 de cada vaca antes de la vacunación; Post-Vac, conteo promedio de células X 1.000 de cada vaca después de la vacunación.

Figura 3. Libras acumuladas de leche producidas antes y después de la tercera vacunación. Promedio de tanque (1 Ibs), libras de leche producida por una vaca lechera. Las áreas sombreadas "Antes de la vacunación" y "1,2% Después de la vacunación" representan la diferencia en porciento de producción de leche antes y después de la tercera vacunación.

Figura 4. Promedio acumulativo del grupo, que muestra las libras de leche producidas antes y después de la vacunación por vacas lecheras. Libras de leche, libras de leche producidas por todas las vacas lecheras, promediadas a lo largo del período de un mes. El área sombreada representa le elevación de la producción de leche durante la vacunación.

Figura 5. Costo mensual promedio en uso de antibióticos antes y después de la vacunación. El 5.1% de reducción se refiere a la reducción de los costos después de la vacunación.

Figura 6. Producción semanal promedio de leche entre vacas vacunadas y no vacunadas que se encuentran en su primera lactación. Producción Semanal de leche/Grupo, producción semanal de leche (en libras) del grupo control y de las vacas vacunadas.

Figura 7. Producción semanal promedio de leche entre vacas frescas vacunadas y no vacunadas. Producción Semanal de leche/Grupo, producción semanal de leche (en libras) del grupo control y de las vacas vacunadas.

Figura 8. Conteo mensual promedio de células somáticas (DHIA) entre vacas vacunadas y no vacunadas en su primera lactación.

Figura 9. Conteo mensual promedio de células somáticas (DHIA) entre vacas frescas vacunadas y no vacunadas.

Figura 10. Respuesta serológica de novillos vacunados con respecto a controles no vacunados. Densidad óptica media (O.D.), 405 nm; P3-Vacunados y P5-Vacunados, novillos vacunados en los grupos 3 y 5, respectivamente; P4-control y P6-control, novillos no vacunados en los grupos 4 y 6, respectivamente; Tiempo de muestreo, semanas transcurridas desde la primera vacunación.

Descripción detallada de las realizaciones preferidas de la invención Composiciones

Un aspecto de la presente invención proporciona composiciones que incluyen polipéptidos receptores (SRPs) y porinas obtenidas a partir de un microorganismo. A menos que se especifique otra cosa, el término "microorganismo" incluye tanto microorganismos gram positivos como gram negativos. Tal como se utiliza en este documento, el término "polipéptido" se refiere a un polímero de aminoácidos unidos por enlace peptídico y no hace referencia a una longitud específica de un polímero de aminoácidos. Así, por ejemplo, los términos péptido, oligopéptido, proteína y enzima, se encuentran incluidos dentro de la definición de polipéptido. Este término también incluye modificaciones posteriores a la expresión del polipéptido, por ejemplo, glicosilaciones, acetilaciones, fosforilaciones y similares. Un polipéptido puede producirse mediante técnicas recombinantes, o ser sintetizado por métodos químicos o enzimáticos. De preferencia, los polipéptidos de las composiciones de la presente invención se encuentran aislados. Un polipéptido "aislado" se refiere a un polipéptido que ha sido extraído de su entorno natural, producido mediante técnicas recombinantes, o sintetizado química o enzimáticamente. A menos que se especifique otra cosa, "un", "el" y, "al menos uno" se utilizan de forma intercambiable y significan uno o más de uno.

Los microorganimos gram negativos apropiados para su empleo en la obtención de SRPs son aquellos capaces de producir SRPs cuando se incuban en condiciones de bajo hierro. Las condiciones de bajo hierro se describen en este documento. Tales microorganismos gram negativos incluyen enteropatógenos, de preferencia miembros de la familia Enterobacteriaceae, con más preferencia, miembros de la familia Enterobacteriaceae que sean miembros de la tribu Eschericheae o Salmonelleae, con mayor preferencia aun, E. coli o Salmonella spp. Ejemplos de enteropatógenos preferidos incluyen miembros de la familia Enterobacteriaceae, miembros de la familia Vibrionaceae (incluyendo, por ejemplo, Vibrio cholerae), y Campylobacter spp. (incluyendo, por ejemplo, C. jejuni). Ejemplos de miembros preferidos de la familia Enterobacteriaceae incluyen, por ejemplo, E. coli, Shigella spp., Salmonella spp., Proteus spp., Klebsiella spp. (por ejemplo, Klebsiella pneumoniae), Serratia spp. Y Yersinia spp. Los ejemplos preferidos de Salmonella spp. incluyen Salmonella enterica serovars., Bredeney, Dublin, Agona, Blockley, Enteriditis, Typhimurium, Hadar, Heidelberg, Montevideo, Muenster, Newport senftenberg, Salmonella cholerasius, y S. typhi. Salmonella enterica serovars Bredeney, Dublin y Typhimurium son denominadas aquí Salmonella bredeney, S. dublin, y S. typhimurium, respectivamente. Ejemplos preferidos de cepas de E. coli incluyen, por ejemplo, E. coli, serotipos O1a 02a, 078, y 0157, los serotipos O:H diferentes incluyen 0104, 0111, 026, 0113, 091, y las cepas hemolíticas de E. coli enterotoxigénica, tales como K88^{+}, F4^{+}, F18ab^{+}, y F18ac^{+}. Tal como se utiliza aquí, el término "cepa" se refiere a miembros de una especie de microorganismos cuyos miembros tienen diferentes genotipos y/o fenotipos. Otros microorganismos gram negativos incluyen miembros de la familia Pasteurellaceae, de preferencia Pasteurella spp., con más preferencia, Pasteurella multocida y Pasteurella haemolytica, y miembros de la familia Pseudomonaceae, de preferencia Pseudomonas spp., con más preferencia, Pseudomonas aeruginosa. Aun, otros microorganismos gram negativos incluyen Actinobacillus spp., Haemophilus spp., Myxobacteria spp., Sporocytophaga spp., Chondrococcus spp., Cytopahaga spp., Flexibacter spp., Flavobacterium spp., Aeromonas spp., entre otras bacterias gram negativas.

Los microorganismos gram positivos de lso cuales pueden obtenerse polipéptidos incluyen miembros de la familia Micrococcaceae, de preferencia, Staphylococcus spp., con mayor preferencia, Staphylococcus aureus. Otros microorganismos gram positivos incluyen miembros de la familia Deinococcaceae, de preferencia, Streptococcus dysgalatiae. Otros microorganismos gram positivos de los cuales pueden aislarse polipéptidos incluyen Bacillus spp., Clostridium spp., Corynebacterium spp., Erysipelothrix spp., Listeria spp., y Mycobacterium spp., Erysipelothrix spp., y Clostridium spp.

Estos microorganismos pueden obtenerse, comercialmente, de un depósito tal como la American Type Culture Collection (ATCC). Además, tales microorganismos pueden obtenerse fácilmente mediante técnicas de aislamiento conocidas y usadas en la técnica. Los microorganismos pueden derivarse de un animal infectado, como un aislamiento de campo y pueden muestrearse en busca de la producción de SRPs, e introducirse directamente en condiciones de bajo hierro, o almacenados para uso futuro, por ejemplo, en un depósito congelado desde aproximadamente -20ºC hasta aproximadamente -95ºC, de preferencia desde aproximadamente -40ºC hasta aproximadamente -50ºC, en medio bacteriológico que contenga 20% de glicerol, u otro medio semejante.

La presente invención proporciona composiciones que incluyen al menos dos, de preferencia, al menos tres polipéptidos receptores de sideróforos (SRPs). Los SRPs de los microorganismos gram negativos son polipéptidos presentes en la membrana externa de los microorganismos gram negativos, y los SRPs de los microorganismos gram positivos son polipéptidos presentes en la membrana de los microorganismos gram positivos. En algunos aspectos de la invención, los SRPs se expresan en un microorganismo a altos niveles cuando el microorganismo es expuesto a condiciones de bajo hierro, y se expresan a niveles sustancialmente inferiores cuando el microorganismo es expuesto a condiciones de elevado hierro. De preferencia, los SRPs se expresan en un microorganismo cuando el microorganismo es expuesto a condiciones de bajo hierro, y no se expresa a niveles detectables cuando el microorganismo es expuesto a condiciones de elevado hierro. En el presente documento se describen en detalle las condiciones de bajo hierro y las condiciones de elevado hierro. Sin intentar quedar limitados por la teoría, se piensa que los SRPs de las presentes composiciones son receptores de sideróforos que se unen a hierro. Ejemplos de receptores de sideróforos expresados por microorganismos gram negativos incluyen, por ejemplo, receptores para la toma de aerobactina, enterobactina, citrato férrico, ferricromo, rhodotorulic, y coprógeno, así como receptores para las transferrinas (por ejemplo, las serotransferrinas, la lactotransferrina, y la ovotransferrina), y para otras proteínas de unión (véase, por ejemplo, Emery et al., U.S. Patent 5.830.479, y Crichton, Microbial Iron Uptake and Intracellular Release. In: Inorganic Biochemistry of Iron Metabolism, Burgess, (de). Ellis Horwood Limited, Chichester, England, 59-76 (1991)).

De preferencia, los SRPs de las composiciones de la presente invención tienen actividad inmunogénica. "Actividad inmunogénica" se refiere a la capacidad de un polipéptido de producir una respuesta inmunológica en un animal. Una respuesta inmunológica a un polipéptido es el desarrollo, en un animal, de una respuesta inmune al polipéptido, mediada por células o anticuerpos. Usualmente, una respuesta inmunológica incluye, pero no se limita a uno o más de los efectos siguientes: la producción de anticuerpos, células B, células T auxiliares, células T supresoras, y/o células T citotóxicas, dirigidas a un epítopo o epítopos del polipéptido. "Epítopo" designa al sitio de un antígeno al cual responden las células B y/o las células T específicas para producir anticuerpos.

Se conoce en la técnica, que los receptores a sideróforos, por lo regular, epítopos que son conservados en los SRPs de diferentes especies y diferentes géneros de microorganismos (ver, por ejemplo, Emerly et al. (U.S. Patent 5.830.479) y el Ejemplo 8). Por ejemplo, se ha encontrado que anticuerpos producidos contra la proteína receptora de aerobactina de una especie, cepa o género de la familia Enterobacteriaceae (por ejemplo, E. coli, Salmonella spp., Klebsiella spp.) exhiben reacción cruzada con otros microorganismos de la misma familia. Especies de Pseudomonas de la familia Pseudomonadaceae también expresan proteínas receptoras a sideróforos, que pueden ser aisladas como se describe en este documento y producir anticuerpos que exhiban reacción cruzada con las proteínas receptoras de E. coli, Salmonella spp., y Klebsiella spp., entre otros miembros de la familia Enterobacteriaceae. Además, se ha encontrado que anticuerpos producidos contra los SRPs de Salmonella y contra los SRPs de E. coli exhiben reacción cruzada con el microorganismo gram positivo Staphylococcus aureus (ver Ejemplo 11).

Una composición de la presente invención puede contener dos, de preferencia, al menos tres, SRPs aisladas de uno o más géneros o de una o más especies de microorganismos. En algunos aspectos de la presente invención, de preferencia, los SRPs de una composición se obtienen de múltiples especies del mismo género de microorganismo, o a partir de múltiples cepas de la misma especie de microorganismo. La presente invención también incluye composiciones que contienen SRPs aislados de al menos un microorganismo gram negativo y, al menos, un microorganismo gram positivo. De preferencia, los pesos moleculares de los SRPs, determinados mediante separación de los SRPs utilizando una electroforesis en gel de poliacrilamida con 12% de dodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE), en condiciones reductoras y desnaturalizantes, se encuentran desde aproximadamente 60 kDa (kiloDaltons) hasta aproximadamente 100 kDa, con mayor preferencia, entre aproximadamente 65 kDa y aproximadamente 95 kDa.

Por lo regular, especies diferentes de Salmonella, produce, cada una, tres SRPs. Se cree que los tres SRPs producidos por Salmonella spp. Son receptores para los sideróforos enteroquelina, aerobactina y ferricromo. De preferencia, se combinan los SRPs obtenidos a partir de S. dublin y S. typhimurium. De preferencia, los pesos moleculares de los SRPs aislados de Salmonella, determinados mediante separación de los SRPs utilizando una electroforesis en 12% de SDS-PAGE, en condiciones reductoras y desnaturalizantes, se encuentran desde aproximadamente 60 kDa hasta aproximadamente 100 kDa, con mayor preferencia, entre aproximadamente 65 kDa y aproximadamente 95 kDa. Con mayor preferencia, los pesos moleculares de los SRPs aislados de Salmonella son como sigue: entre aproximadamente 87 kDa y aproximadamente 91 kDa, de preferencia, aproximadamente 89 kDa; entre aproximadamente 82 kDa y aproximadamente 86 kDa, de preferencia aproximadamente 84 kDa; y entre aproximadamente 69 kDa y aproximadamente 75 kDa, de preferencia aproximadamente 72 kDa.

Se ha encontrado que E. coli produce 2, 3, 4 ó 6 SRPs, en dependencia del serotipo. De preferencia, una composición que incluya SRPs de E. coli, incluye, con preferencia creciente, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, o al menos seis SRPs aislados a partir de E. coli. Se pueden combinar SRPs aislados de varias cepas de E. coli. De preferencia, los pesos moleculares de los SRPs aislados de una E. coli, determinados mediante separación de los SRPs utilizando una electroforesis 12% (SDS-PAGE), en condiciones reductoras y desnaturalizantes, se encuentran desde aproximadamente 60 kDa hasta aproximadamente 100 kDa, con mayor preferencia, entre aproximadamente 65 kDa y aproximadamente 95 kDa. Con mayor preferencia, en una composición que incluye SRPs aislados de una E. coli, los SRPs tienen pesos moleculares seleccionados desde aproximadamente 91 kDa hasta aproximadamente 93 kDa, de preferencia, aproximadamente 92 kDa; entre aproximadamente 88 kDa y aproximadamente 90 kDa, de preferencia aproximadamente 89 kDa; entre aproximadamente 82 kDa y aproximadamente 86 kDa, de preferencia aproximadamente 84 kDa; entre aproximadamente 76 kDa y aproximadamente 80 kDa, de preferencia aproximadamente 78 kDa; entre aproximadamente 73 kDa y aproximadamente 75 kDa, de preferencia aproximadamente 74 kDa; y entre aproximadamente 71 kDa y aproximadamente 73 kDa, de preferencia, aproximadamente 72 kDa. Una composición preferida, que incluye SRPs aislados a partir de E. coli es aislada a partir de la E. coli depositada en la American Type Culture Collection, 10801 University Blvd. Manassas, Va., 20110-2209, USA, el 29 de diciembre de 1994, designada ATCC #55652. El depósito se realizó bajo el Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional de Microorganismos con Propósitos de Procedimiento de Patente.

Se ha encontrado que aislamientos de campo de la bacteria gram positiva Staphylococcus aureus producen al menos aproximadamente 4 SRPs. De preferencia, cuando las composiciones incluyen SRPs de S. aureus, los SRPs son aislados a partir de al menos una especie de S. aureus, con mayor preferencia, a partir de una especie de S. aureus. De preferencia, el S. aureus es aislado a partir de un ave de corral que padece una enfermedad causada por S. aureus. De preferencia, los pesos moleculares de cuatro de los SRPs aislados a partir de un S. aureus, determinados mediante separación de los SRPs utilizando una electroforesis 10% (SDS-PAGE), en condiciones reductoras y desnaturalizantes, se encuentran desde aproximadamente 60 kDa hasta aproximadamente 100 kDa, con mayor preferencia, entre aproximadamente 65 kDa y aproximadamente 95 kDa. Con mayor preferencia, los pesos moleculares de los SRPs aislados de S. aureus son como sigue: entre aproximadamente 88 kDa y aproximadamente 92 kDa, de preferencia, aproximadamente 90 kDa; entre aproximadamente 82 kDa y aproximadamente 86 kDa, de preferencia aproximadamente 84 kDa; entre aproximadamente 70 kDa y aproximadamente 74 kDa, de preferencia aproximadamente 72 kDa; y entre aproximadamente 64 kDa y aproximadamente 68 kDa, de preferencia, aproximadamente 66 kDa. De preferencia, los pesos moleculares de los otros tres SRPs aislados a partir de S. aureus se encuentran entre aproximadamente 35 kDa y aproximadamente 37 kDa, de preferencia aproximadamente 36 kDa; entre aproximadamente 30 kDa y aproximadamente 34 kDa, de preferencia, aproximadamente 32 kDa; y entre aproximadamente 20 kDa y aproximadamente 24 kDa, de preferencia, aproximadamente 22 kDa. De preferencia, un S. aureus del cual se aíslan los SRPs se obtiene a partir de un ave, por ejemplo un pollo o un pavo que muestre síntomas de una enfermedad causada por el S. aureus, por ejemplo, septicemia.

De preferencia, los SRPs de la presente composición pueden identificarse utilizando anticuerpos que se unan específicamente a SRPs. Tal como se usa en este documento, un anticuerpo que puede "unirse específicamente" a un polipéptido es un anticuerpo que interactúa con el epítopo del antígeno que induce la síntesis del anticuerpo, o interactúa con un epítopo estructuralmente relacionado. Tales anticuerpos pueden obtenerse utilizando la cepa de E. coli con la designación ATCC #55652. Por lo regular, la ATCC #55652 se cultiva en condiciones de bajo hierro, y los SRPs se aíslan de la cepa como se describe en el Ejemplo 1, o como describen, por ejemplo, Emery et al. (U.S. Patent 5.830.479). A continuación se obtiene un anticuerpo que se une de manera específica a los SRPs utilizando los métodos de laboratorio para producir anticuerpos policlonales y monoclonales. Tales métodos de laboratorio son rutinarios y se conocen en la técnica (ver, por ejemplo, Harlow, E. et al. Atibodies: A laboratory manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (1988) y Ausubel, R.M., ed. Current Protocols in Molecular Biology (1994)). Los métodos para determinar si los SRPs de las presente composiciones se unen de manera específica a anticuerpos obtenidos mediante el empleo de SRPs aislados de la ATCC #55652 son rutinarios y conocidos en la técnica incluyen, por ejemplo, western inmunoblot y ELISA.

Las composiciones de la presente invención también incluyen dos polipéptidos de porinas. Los polipéptidos de porinas son proteínas de transmembrana formadoras de poros de la membrana externa de los microorganismos gram negativos. Las bacterias gram negativas poseen una pared celular con una fina capa de membrana de péptidoglicano en la cual los pequeños compuestos hidrofóbicos pueden difundir a través de la membrana externa mediante la vía de la porina. Los microorganismos gram positivos poseen una gruesa capa de péptidoglicano, que es porosa y no forma una barrera a la permeabilidad en la superficie. Se ha aceptado ampliamente que las bacterias gram positivas no poseen proteínas formadoras de poro bien definidas, en comparación con las bacterias gram negativas. No obstante, evidencias recientes muestran la identificación de actividad formadora de canales en algunos miembros de la familia Corynebacteriaceae. A diferencia de los SRPs, la expresión de las porinas no cambia en respuesta al nivel de hierro presente en el medio en el cual se cultiva el microorganismo, y la expresión de las porinas es típicamente constitutiva. Sin intentar quedar limitados por la teoría, se piensa que las porinas de las presentes composiciones son polipéptidos que producen poros o canales que permiten el paso de moléculas a través de la membrana externa de los microorganismos gram negativos (ver, por ejemplo, Nikaido y Vaara, Outer Membrane, En: Escherichia coli and Salmonella typhimurium, Cellular and Molecular Biology, Neidhardt et al., (eds.) American Society for Microbiology, Washington, D. C., pp. 7-22 (1987)) y la membrana de los microorganismos gram positivos. Por ejemplo, se cree que las porinas producidas por los microorganismos gram negativos pueden incluir a OmpA, OmpC, OmpD, OmpF, o PhoE. Las porinas se encuentran relativamente conservadas entre las bacterias gram negativas, y desempeñan un papel en la unión de hierro. Por ejemplo, OmpF y OmpC unen lactoferrina (Erdei et al., Infect. Immun., 62, 1234-1240 (1994), en tanto que OmpA une ferricromo (Coulton et al., J. Gen. Microbiol., 110, 211-220 (1979)). Se ha encontrado que los anticuerpos de la fase temprana de una infección, particularmente de la clase IgM exhiben reacción cruzada con porinas de E. coli., Salmonella, Pasteurella, Pseudomonas y Klebsiella, y unen lactoferrina y/o ferricromo, evitando que se encuentra accesible una fuente de hierro para el crecimiento de los microorganismos. Los anticuerpos contra dichos polipéptidos también se unen a las porinas en la superficie para incrementar la lisis de las bacterias mediada por opsonización y/o complemento.

Una composición de la presente invención puede contener al menos dos porinas aisladas de uno o más géneros o de una o más especies de microorganismo. En algunos aspectos de la presente invención, de preferencia las porinas de una composición se obtienen a partir de múltiples especies de microorganismos del mismo género de microorganismos, o a partir de múltiples cepas de la misma especie de microorganismos. En algunos aspectos de la presente invención, de preferencia las porinas de la composición se derivan del mismo microorganismo a partir del cual se aislaron los SRPs de la composición.

De preferencia, las porinas de las composiciones de la presente invención poseen actividad inmunogénica. Las porinas de la presente composición actúan como un adyuvante para incrementar la respuesta inmune de un animal a las porinas y los SRPs presentes en una composición de la presente invención, cuando es administrada a un animal como se describe en este documento.

De preferencia, los pesos moleculares de las porinas de las composiciones de la presente invención, determinados mediante la separación de las porinas utilizando un gel SDS-PAGE aproximadamente al 12%, bajo condiciones reductoras y desnaturalizantes, se encuentran entre aproximadamente 30 kDa y aproximadamente 43 kDa, con mayor preferencia, entre aproximadamente 33 kDa y aproximadamente 40 kDa. De preferencia, las porinas se obtienen a partir de un microorganismo gram negativo. Por lo regular, las diferentes especies de Salmonella produce, cada una, al menos dos porinas. De preferencia, cuando las composiciones incluyen porinas obtenidas a partir de una Salmonella, las porinas son aisladas a partir de una especie de Salmonella. De preferencia, los pesos moleculares de las porinas aisladas a partir de Salmonella spp. Se encuentran entre aproximadamente 37 kDa y aproximadamente 40 kDa, con mayor preferencia, entre aproximadamente 38 kDa y aproximadamente 39 kDa. Por lo regular E. coli produce al menos dos porinas. De preferencia, los pesos moleculares de las porinas aisladas a partir de E. coli se encuentran entre aproximadamente 33 kDa y aproximadamente 39 kDa, con mayor preferencia, entre aproximadamente 34 kDa y aproximadamente 38 kDa.

De preferencia, las porinas de las presentes composiciones pueden identificarse usando anticuerpos que se unen específicamente a las porinas. Tales anticuerpos pueden producirse utilizando la cepa de E. coli con la denominación ATCC #55652. Por lo regular, ATCC #55652 se cultiva en condiciones de bajo hierro, y las porinas se extraen de la cepa como se describe en el Ejemplo 1, o como se describe en Emery et al. (U.S. Patent 5.830.479). a continuación se producen anticuerpos que se unen específicamente a las porinas. Los métodos de laboratorio para producir anticuerpos monoclonales y policlonales son rutinarios y conocidos en la técnica (ver, por ejemplo, Harlow, E. et. al. Antibodies: A laboratory manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (1988) y Ausubel, R.M., ed. Current Protocols in Molecular Biology (1994)). Los métodos para determinar si las porinas de las presentes composiciones se unen de manera específica a anticuerpos producidos mediante porinas aisladas a partir de ATCC #55652 son rutinarios y conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, western inmunoblot y ELISA.

De preferencia, las composiciones de la presente invención incluyen bajas concentraciones, con mayor preferencia, concentraciones indetectables, de lipopolisacáridos (LPS). LPS es un componente de la membrana externa de la mayoría de los microorganismos gram negativos (ver, por ejemplo, Nikaido y Vaara, Outer Membrane, E, Escherichia coli y Salmonella typhymurium, Cellular and Molecular Biology, Neidhardt et al., (eds.) American Society for Microbiology, Washington, D.C., pp. 7-22 (1987)), e incluyen, por lo regular, polisacáridos (cadena O-específica, núcleos interno y externo) y la región lipídica A. El componente lipídico A de los LPS es el componente con mayor actividad biológica de la estructura de los LPS, y provoca un amplio espectro de efectos fisiopatológicos en los mamíferos. Los efectos más dramáticos son fiebre, coagulación intravascular dispersa, activación del complemento, shock de hipotensión y muerte. Los LPS desempeñan un papel importante en la activación de varios tipos celulares, particularmente los de origen linfoide. Dicha activación tiene como resultado la producción de una variedad impresionante de mediadores endógenos que, a su vez, activan el sistema del complemento, imposibilitan la función mitocondrial, activan la actividad lisosomal, estimulan la actividad de las prostaglandinas, y provocan citotoxicidad de los macrófagos y actividad tumoricida. Esta actividad inmunoestimulatoria no específica de los LPS puede estimular la formación de un granuloma en el lugar de la administración de las composiciones que contienen LPS. Tales reacciones pueden provocar un estrés indebido en el animal, debido al cual, el animal puede rechazar el agua y los alimentos durante un período de tiempo, y puede exasperar las dolencias infecciosas del animal. Además, la formación de un granuloma en el lugar de la inyección puede incrementar la probabilidad de una posible disminución de la calidad de los restos debido a cicatrices o marcas del tejido en el lugar de la inyección (ver, por ejemplo, Rae, Injection Site Reactions, disponible en www.animal.ufl.edu/short94/rae.htm).

Las concentraciones de LPS pueden determinarse utilizando métodos de rutina conocidos en la técnica. Tales métodos, por lo regular, incluyen mediciones de la unión de cromóforos a LPS (ver, por ejemplo, Keler y Nowotny, Analyt Biochem., 156, 189 (1986)) o el uso de una prueba de lisado de amebocitos de Limulus (LAL) (ver, por ejemplo, Endotoxins and Their Detection With the Limulus Amebocyte Test, Alan R. Liss, Inc., 150 Fifth Avenue, New York, NY (1982)). Existen cuatro métodos básicos comercialmente disponibles que se utilizan por lo regular con una prueba de LAL: la prueba de coagulación de gel; la prueba turbidimétrica (espectrofotométrica); la prueba colorimétrica; y la prueba cromogénica. Un ejemplo de un ensayo de coagulación de gel se encuentra disponible bajo el nombre comercial E-TOX-ATE (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO; ver Sigma Technical Bulletin No. 210). Por lo regular, las condiciones de ensayo incluyen poner en contacto la composición con una preparación que contenga un lisado de los amebocitos circulantes del cangrejo herradura Limulus polyphemus. Cuando se expone a LPS, el lisado incrementa la opacidad y la viscosidad, y puede gelificar. Se le añade al lisado alrededor de 0,1 mililitro de la composición. Por lo regular, el pH de la composición se encuentra entre 6 y 8, de preferencia, entre 6,8 y 7,5. La mezcla de la composición y el lisado se incuba durante aproximadamente 1 hora sin agitación a alrededor de 37ºC. Luego de la incubación, la mezcla se observa para determina si ocurrió gelificación de la mezcla. La gelificación indica la presencia de endotoxina. Para determinar la cantidad de endotoxina presente en la composición, se preparan diluciones de soluciones estándar de endotoxina y se prueban al mismo tiempo que es probada la composición. Las soluciones estándar de endotoxina se encuentran comercialmente disponibles de, por ejemplo, Sigma Chemical (Catalog No. 210-SE) y U.S. Pharmacopeia (Rockville, MD, Catalog No. 235503). En orden creciente de preferencia, una composición de la presente invención contiene no más de aproximadamente 10,0 unidades de endotoxina por mililitro (EU/ml), no más de aproximadamente 5,0 EU/ml, no más de aproximadamente 1,0 EU/ml, no más de aproximadamente 0,5 EU/ml, no más de aproximadamente 0,2 EU/ml, no más de aproximadamente 0,1 EU/ml, con la mayor preferencia, no más de aproximadamente 0,05 EU/ml. Una unidad de endotoxina (EU) se define en comparación con el Estándar de Referencia de Endotoxina actual de la FDA, Lot EC-5. Un vial de lot EC-5 contiene 10.000 EU. Por lo general, alrededor de 1 nanogramo (ng) de LPS puro equivale a entre aproximadamente 5 y aproximadamente 10 unidades de endotoxina.

Las composiciones de la presente invención incluyen además, de manera opcional, un portador farmacéuticamente aceptable. "Farmacéuticamente aceptable" hace referencia a un diluyente, portador, excipiente, sal, etc., que es compatible con los otros ingredientes de la composición y no es deletéreo para el receptor de la misma. Por lo regular, las composiciones incluyen un portador aceptable cuando la composición es utilizada como se describe a continuación en "Métodos de uso." Las composiciones de la presente invención pueden estar formuladas en preparaciones farmacéuticas en una variedad de formas adaptadas a la vía de administración seleccionada, de preferencia, vías adecuadas para estimular una respuesta inmune a un antígeno. Por tanto, una composición de la presente invención puede administrarse a través de vías conocidas que incluyen, por ejemplo, la oral; la parenteral incluyendo la intradérmica, la subcutánea, la intramuscular, la intravenosa, la intraperitoneal, etc., y tópicamente, como por vía intranasal, intrapulmonar, intramamaria, intravaginal, intrauterina, etc. Se encuentra previsto que una composición pueda administrarse a una superficie mucosal, tal como, la administración a la mucosa nasal o respiratoria (p.e.: spray o aerosol), para estimular la inmunidad mucosal, como la producción de anticuerpos IgA, en todo el cuerpo del animal.

Una composición de la presente invención también puede administrarse a través de un implante de liberación sostenida o demorada. Se conocen implantes adecuados. Algunos ejemplos de implantes adecuados para el uso de acuerdo a la invención se presentan en Emery y Straub (WO 01/37810). Pueden producirse implantes suficientemente pequeños como para ser administrados mediante aerosol o spray. Los implantes también incluyen nanoesferas y microesferas.

Una composición de la presente invención se administra en una cantidad suficiente para proporcionar una respuesta inmunológica a los SRPs y/o porinas presentes en la composición, y/o incrementar las características de desempeño. Las características de desempeño se describen con mayor detalle en el presente documento. La cantidad del polipéptido presente en una composición de la presente invención puede variar. Por ejemplo, la dosificación de polipéptido puede encontrarse entre aproximadamente 0,01 microgramos (\mug) y aproximadamente 300 miligramos (mg), por lo regular, entre aproximadamente 0,1 mg y 10 mg. Para una composición inyectable (p.e.: subcutánea, intramuscular, etc), es preferible que el polipéptido presente en la composición se encuentre en una cantidad tal que el total del volumen de la composición administrada sea de aproximadamente 0,5 ml a aproximadamente 5,0 ml, por lo regular, aproximadamente 1,0-2,0 ml. La cantidad administrada variará en dependencia de diversos factores, que incluyen los polipéptidos específicos seleccionados, el peso, la condición física y la edad del animal, y la vía de administración. Por tanto, el peso absoluto del polipéptido incluido en una unidad dada de dosificación puede variar grandemente, y depende de factores tales como la especie, la edad, el peso y la condición física del animal, así como, del método de administración. Tales factores puede determinarlos una persona versada en la técnica. Otros ejemplos de dosificaciones adecuadas para la invención se presentan en Emery et al. (U.S. Patent 6.027.736).

Las formulaciones pueden presentarse convenientemente en forma de unidad de dosificación y pueden prepararse mediante métodos bien conocidos en la técnica de farmacia. Todos los métodos de preparación de una composición que comprenda un portador farmacéuticamente aceptable incluyen la etapa de asociar el compuesto activo (p.e., SRPs y/o porinas como se describe en el presente documento) con un portador que consiste en uno o más ingredientes adicionales. En general, las formulaciones se preparan mediante la asociación uniforme e íntima del compuesto activo en asociación con un portador líquido, un portador sólido finamente dividido, o ambos, y a continuación, de ser necesario, dar al producto la formulación adecuada.

Una composición que incluye un portador farmacéuticamente aceptable puede incluir también un adyuvante. Un "adyuvante" se refiere a un agente que puede actuar de manera no específica para estimular una respuesta inmune ante un antígeno particular reduciendo, de esa forma, la cantidad de antígeno necesaria en cualquier composición de inmunización, y/o la frecuencia de inyección necesaria para generar una respuesta inmune adecuada ante el antígeno de interés. Los adyuvantes pueden incluir, por ejemplo, IL-1, IL-2, emulsificantes, muramil dipéptidos, bromuro de dimetildiocradecilamonio (DDA), avridina, hidróxido de aluminio, aceites, saponinas, alfa-tocoferol, polisacáridos, parafinas emulsificantes (disponibles bajo el nombre comercial EMULSIGEN de MVP Laboratories, Ralston, Nebraska), ISA-70, RIBI y otras sustancias conocidas en la técnica.

En otra realización, una composición de la invención, que incluya un portador farmacéuticamente aceptable puede incluir un modificador de la respuesta biológica, como, por ejemplo, IL-2, IL-4 y/o IL-6, TNF, TNF-alfa, IFN-gamma, y otras citoquinas que ejercen su acción sobre las células inmunes. Una composición inmunizante también puede incluir un antibiótico, un preservante, un antioxidante, un agente quelante, etc. Tales componentes son conocidos en la técnica.

Otro aspecto de la presente invención proporciona métodos mejorados para la obtención de SRPs a partir de microorganismos gram negativos y métodos mejorados para la obtención de polipéptidos de porinas a partir de microorganismos gram negativos. Los métodos comprenden proporcionar un microorganismo gram-negativo, destruir el microorganismo, solubilizar el microorganismo, y aislar los polipéptidos.

Un microorganismo gram negativo a ser proporcionado en los métodos se incuba bajo condiciones que estimulan la expresión de los SRPs. Tal como se usa en el presente documento, la frase "condiciones de bajo hierro" se refiere a un ambiente, por lo regular un medio bacteriológico que contiene cantidades de hierro libre que provocan que el microorganismo exprese los SRPs. Tal como se usa en el presente documento, la frase "condiciones de elevado hierro" se refiere a un ambiente bacteriológico que contiene cantidades de hierro libre que provocan que el microorganismo no exprese los SRPs. De preferencia, las condiciones de bajo hierro son el resultado de la adición al medio de un compuesto quelante de hierro, y las condiciones de elevado hierro ocurren cuando no se encuentra un quelante en el medio. Ejemplos de quelantes de hierro incluyen al 2,2'-dipidril (también conocido en la técnica como \alpha,\alpha'-bipidril), la 8-hidroxiquinilina, el ácido etiléndiamin-di-O-hidroxifenilacético (EDDHA), el metanosulfonato de desferrioxiamina (desferol), la transferrina, la lactoferrina, la ovotransferrina, los sideróforos biológicos, tales como los catecolatos y los hidroxiamatos, y el citrato. De preferencia, se utiliza el 2,2'-dipiridil. Por lo regular, el 2,2'-dipiridil se añade al medio a una concentración de aproximadamente 25 microgramos/mililitro (\mug/ml), con mayor preferencia, aproximadamente 50 \mug/ml, con la mayor preferencia, aproximadamente 100 \mug/ml. Los medios usados para incubar los microorganismos no son críticos y varían en dependencia del microorganismo. Por ejemplo, cuando el microorganismo es Salmonella spp. O E. coli, se pueden utilizar lisado tríptico de soya o infusión de cerebro y corazón. El volumen de los medios usados para incubar el microorganismo puede variar. Cuando un microorganismo se evalúa, en busca de su capacidad para producir SRPs y porinas, los microorganismos pueden cultivarse en un volumen adecuado, por ejemplo, 10 mililitros a 1 litro de medio. Cuando un microorganismo se cultiva para obtener SRPs y porinas a ser usadas en, por ejemplo, administración a animales, los microorganismos pueden cultivarse en un fermentador, para permitir la extracción de cantidades superiores de polipéptidos. Los métodos para cultivar microorganismos en un fermentador son rutinarios y conocidos en la técnica. Las condiciones usadas para cultivar un microorganismo incluyen, de preferencia, un quelante de hierro, de preferencia, 2,2'-dipiridil, un pH entre aproximadamente 6,5 y aproximadamente 7,5, de preferencia entre 6,9 y 7,1 y una temperatura de aproximadamente 37ºC. De manera opcional, cuando se usa un fermentador, el oxígeno disuelto se mantiene entre aproximadamente 20% y aproximadamente 40%, de preferencia, aproximadamente 30%, pero puede variar en dependencia de los requerimiento metabólicos del organismo.

Después del cultivo, el microorganismo gram negativo que va a proporcionarse en el método se colecta. La recolección incluye la concentración del microorganismo en un volumen menor y su suspensión en un medio diferente del medio de cultivo. Los métodos para concentrar un microorganismo son rutinarios y conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, la centrifugación. Por lo regular, el microorganismo concentrado se suspende en cantidades decrecientes de tampón. De preferencia, el tampón final incluye un quelante de metales, de preferencia, ácido etiléndiamino tetraacético (EDTA), que también contribuye a la liberación del lipopolisacárido de la pared celular. De preferencia, el tampón final también minimiza la degradación proteolítica. Esto puede lograrse mediante la fijación del tampón final a un pH igual o mayor que aproximadamente 8,0, de preferencia al menos alrededor de 8,5, y/o incluyendo uno o más inhibidores de proteinasas (p.e., fenilmetanosulfonil fluoruro). Opcionalmente y de preferencia, el microorganismo concentrado se congela a -20ºC o una temperatura inferior hasta su destrucción.

Los microorganismos gram negativos pueden destruirse utilizando métodos físicos, químicos o mecánicos rutinarios y conocidos en la técnica, que incluyen, por ejemplo, la prensa francesa, la sonicación, o la homogeneización. De preferencia, se usa la homogeneización. Como se le usa en el presente documento, el término "destrucción" se refiere a la pérdida de la integridad celular. La destrucción de un microorganismo puede conseguirse mediante métodos que son rutinarios y conocidos en la técnica que incluyen, por ejemplo, cambios de la densidad óptica. Por lo regular un microorganismo se somete a destrucción hasta que la densidad óptica se mantenga constante ante la continuación de la destrucción. Por ejemplo, si se mide el porciento de transmitancia, el microorganismo se destruye hasta que el porciento de transmitancia deje de incrementarse ante el mantenimiento de la destrucción. De preferencia, el microorgansimo se encuentra en un tampón que minimiza la degradación proteolítica. De preferencia, el microorganismo se encuentra en el tampón a una concentración entre aproximadamente 720 gramos de microorganismo por 1.000 mililitros de tampón y aproximadamente 1.080 gramos de microorganismo por 1.000 mililitros de tampón, con mayor preferencia, entre aproximadamente 810 gramos de microorganismo por 1.000 mililitros de tampón y aproximadamente 990 gramos de microorganismo por 1.000 mililitros de tampón, con la mayor preferencia, aproximadamente 900 gramos de microorganismo por 1.000 mililitros de tampón. La temperatura durante la destrucción se mantiene baja, por lo regular, de preferencia a 4ºC, para contribuir a minimizar la degradación proteolítica.

El microorganismo destruido se solubiliza en un detergente, por ejemplo, un detergente aniónico, zwiteriónico, no iónico o catiónico. De preferencia, el detergente es sarcosina, con mayor preferencia, lauroil de sodio sarcosinato. Tal como se usa en el presente documento, el término "solubilizar" se refiere a la disolución de los materiales celulares (p.e., polipéptidos, ácidos nucleicos, carbohidratos) en la fase acuosa del tampón en el cual fue destruido el microorganismo, y la formación de agregados de materiales celulares insolubles. Las condiciones para la solubilización, de preferencia, tienen como consecuencia la agregación de los SRPs y las porinas en agregados insolubles. La capacidad de producir agregados insolubles fue inesperada, y proporciona una manera económica de extraer los SRPs y las porinas.

De preferencia, la sarcosina se añade de forma tal que la proporción de sarcosina por gramo de peso del microorganismo destruido se encuentra entre aproximadamente 0,8 gramos de sarcosina por aproximadamente 4,5 gramos de masa del precipitado y aproximadamente 1,2 gramos de sarcosina por aproximadamente 4,5 gramos de masa del precipitado. La solubilización del microorganismo puede medirse mediante métodos que son rutinarios y conocidos en la técnica, que incluyen, por ejemplo, cambios de la densidad óptica. Por lo regular, a un microorganismo destruido se le permite solubilizar hasta que el porciento de transmitancia a aproximadamente 540 nm se encuentra entre aproximadamente 25% y aproximadamente 30%. De preferencia, se permite la ocurrencia de la solubilización durante al menos aproximadamente 24 horas, con mayor preferencia, al menos aproximadamente 48 horas, con la mayor preferencia, al menos aproximadamente 60 horas. La temperatura durante la destrucción se mantiene, por lo regular, baja, de preferencia, a aproximadamente 4ºC.

Los agregados insolubles que incluyen a los SRPs y las porinas pueden extraerse mediante métodos rutinarios y conocidos en la técnica. De preferencia, los agregados insolubles se aislan mediante centrifugación. Por lo regular, la centrifugación de los polipéptidos de la membrana externa, que son insolubles en detergentes requiere fuerzas de centrifugación de al menos 50.000 x g, por lo regular, aproximadamente 100.000 x g. La utilización de tales fuerzas de centrifugación demanda el uso de ultracentrífugas, y el escalado para el procesamiento de grandes volúmenes de muestra es, generalmente, difícil y no económico con este tipo de centrífugas. Sorprendente e inesperadamente, los métodos descritos en el presente documento proporcionan medios para la producción de agregados insolubles de suficiente tamaño para permitir el uso de fuerzas de centrifugación significativamente inferiores (por ejemplo, aproximadamente 46.000 x g). Los métodos para el procesamiento de grandes volúmenes a estas fuerzas de centrifugación inferiores se encuentran disponibles y son conocidos en la técnica. Por tanto, los agregados insolubles pueden extraerse a un costo significativamente menor.

Opcionalmente, y de preferencia, se elimina la sarcosina de los SRPs y las porinas aisladas. Los métodos para eliminar la sarcosina de los polipéptidos aislados se conocen en la técnica e incluyen, por ejemplo, la diafiltración, la precipitación, la cromatografía de interacciones hidrofóbicas, de intercambio iónico, y/o de afinidad, y la ultrafiltración y el lavado de los polipéptidos en alcohol mediante diafiltración. Después del aislamiento, los polipéptidos se resuspenden en tampón y se almacenan a baja temperatura, por ejemplo, a -20ºC o inferior.

Otra observación inesperada fue que este método para obtener SRPs y porinas a partir de un microorganismo gram negativo también produjo SRPs y porinas que contenían bajos niveles de LPS. El LPS es un potente inmunoestimulante, y cuando se encuentra presente en composiciones que se administran a los animales, especialmente a los mamíferos, puede producir disminución de ciertas características de desempeño, y/o reacciones en el lugar de la inyección que pueden tener como consecuencia una disminución de la calidad de los restos debido a cicatrices o marcas del tejido en el lugar de la inyección. La capacidad para extraer SRPs y porinas con bajos niveles de LPS produce una disminución de las pérdidas económicas asociadas con la administración de preparaciones obtenidas a partir de microorganismos gram negativos. La disminución de la cantidad de LPS tiene como consecuencia una disminución de la pérdida o disminución de la calidad de los restos en la matanza, y decrecimientos menores de las características de desempeño.

Los SRPs también pueden aislarse a partir de microorganismos gram positivos, utilizando métodos que se conocen en la técnica. La extracción de SRPs a partir de microorganismos gram positivos puede lograrse como se describe, por ejemplo en Hussain et al. Infect. Immun., 67, 6688-6690 (1999); Trivier et al., FEMS Microbiol. Lett., 127, 195-199 (1995); Heinrichs et al., J. Bacteriol., 181, 1436-1443 (1999).

Métodos de uso

Un aspecto de la presente invención se dirige, además, al uso de las composiciones de la presente invención en la producción de medicamentos para el tratamiento de varias dolencias. Una cantidad efectiva de la composición es para su administración al animal. De preferencia, Las composiciones incluyen LPS a una concentración, en orden creciente de preferencia, no mayor de aproximadamente 10,0 unidades de endotoxina por mililitro (EU/ml), no mayor de aproximadamente 5,0 EU/ml, no mayor de aproximadamente 1,0 EU/ml, no mayor de aproximadamente 0,5 EU/ml, no mayor de aproximadamente 0.1 EU/ml, con la mayor preferencia, no mayor de aproximadamente 0,05 EU/ml. De preferencia, la composición también incluye un portador farmacéuticamente aceptable. El animal puede ser, por ejemplo, un ave de corral (incluyendo, por ejemplo, pollos o pavos), un bovino (incluyendo, por ejemplo, vacas), caprino (incluyendo, por ejemplo, chivos), ovino (incluyendo, por ejemplo, ovejas), porcino (incluyendo, por ejemplo, cerdos), bisontes (incluyendo, por ejemplo, búfalos), animales de compañía (incluyendo, por ejemplo, caballos), miembros de la familia Cervidae (incluyendo, por ejemplo ciervos, alces, caribúes y renos), y humanos.

En algunos aspectos, los medicamentos pueden usarse para administraciones adicionales (p.e., una o más administraciones de estímulo) de las composiciones al animal para incrementar o estimular la respuesta inmune secundaria. Se puede administrar un estímulo entre aproximadamente una semana y aproximadamente ocho semanas, de preferencia, entre aproximadamente dos y aproximadamente 4 semanas, después de la primera administración de la composición. Los estímulos subsiguientes pueden administrarse una, dos, tres, cuatro, o más veces anualmente. Se espera que no sea necesario un estímulo anual, ya que el animal será retado en el campo mediante la exposición a microorganismos que expresan SRPs y/o porinas que poseen epítopos que son idénticos a o están relacionados a nivel estructural con los epítopos presentes en los SRPs y/o las porinas de la composición administrada al animal.

En un aspecto, la invención se dirige al uso de composiciones para la producción de medicamentos para la inducción de la producción de anticuerpos en un animal. Los anticuerpos producidos incluyen anticuerpos que se unen específicamente a al menos un polipéptido (un SRP y/o una porina) presente en la composición. En este aspecto de la invención, una "cantidad efectiva" es una cantidad eficaz en conseguir la producción de anticuerpos en el animal. Puede determinarse si un animal ha producido anticuerpos que se unen específicamente a polipéptidos presentes en una composición de la presente invención como se describe en el presente documento.

El método puede utilizarse para producir anticuerpos que se unen específicamente a polipéptidos, de preferencia, SRPs y/o porinas, presentes en la superficie de un microorganismo diferente del microorganismo a partir del cual se extrajeron los SRPs y las porinas de la composición. Como se discute en el presente documento, los SRPs y las porinas, por lo regular, presentan epítopos que se conservan en los SRPs y las porinas de diferentes especies y diferentes géneros de microorganismos. Por tanto, cabe esperar que los anticuerpos producidos utilizando SRPs y porinas de un microorganismo, se unan a SRPs y/o porinas presentes en otros microorganismos (ver, por ejemplo, Ejemplos 8 y 10) y proporcionen un amplio espectro de protección contra organismos gram positivos y gram negativos. Ejemplos de microorganismos gram positivos a los cuales se unen específicamente los anticuerpos son miembros de la familia Micrococcaceae, miembros de la familia Deinococcaceae, u otros microorganismos gram positivos, como se describe en la sección "Composiciones." De preferencia, los microorganismos gram positivos a los que se unen los anticuerpos son Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae, Streptococcus uberis, Streptococcus bovis y Streptococcus dysgalatiae, Streptococcus zooepidermicus, y Streptococcus equi, con la mayor preferencia, Streptococcus aureus. Ejemplos de microorganismos gram negativos a los que el anticuerpo se une específicamente son los enteropatógenos, con mayor preferencia, miembros de la familia Enterobacteriaceae, con mayor preferencia aun, miembros de las tribus Enterobacteriaceae de Escherichieae y Salmonelleae, como se describe en la sección "Composiciones." Con la mayor preferencia, los microorganismos gram negativos a los cuales se unen específicamente los anticuerpos son Salmonella spp. Y E. coli.

En un aspecto alternativo, los métodos para inducir la producción de un anticuerpo en un animal incluyen la administración de una composición preparada a partir, por ejemplo, de una Escherichiae coli modificada, tal como un mutante R virulento, como por ejemplo E. coli J5 (disponible comercialmente a partir de ATCC como ATCC #43745; descrita por Overbeck et al., J. Clin. Microbiol., 25, 1009-1013 (1987)), o Salmonella minnesota (disponible comercialmente a partir de ATCC, como ATCC #49284; como describen Sanderson et al., J. Bacteriol, 119, 753-759, 760-764 (1974)) que carecen de las cadenas laterales del oligosacárido externo del LPS. En un animal no inmunizado, las cadenas laterales del oligosacárido externo tienden a enmascarar los SRPs de la membrana celular, de manera que el sistema inmune no reconoce los SRPs y la producción de títulos de anticuerpos anti SRPs se deprime. Por tanto, para incrementar la capacidad de estimulación inmune de una composición inmunizante producida a partir de células bacterianas intactas, para producir una respuesta inmune anti SRP, la membrana celular puede ser alterada químicamente para eliminar las cadenas laterales de aligosacáridos que interfieren o se puede utilizar un organismo mutante tal como E. coli J5, como se mencionó anteriormente. Las células modificadas químicamente o los mutantes se cultivan a continuación bajo condiciones de restricción de hierro para incrementar la producción de SRP, como se describe, por ejemplo, en la U.S. Patent No. 6.027.736.

En otro aspecto, la presente invención se dirige al uso de composiciones en la producción de medicamentos para el tratamiento de determinadas dolencias en el animal, que pueden ser causadas por, o asociadas a, un microorganismo. Tales condiciones incluyen, por ejemplo, infecciones por microorganismos gram negativos e infecciones por organismos gram positivos. Ejemplos de las dolencias causadas por infecciones microbianas incluyen la mastitis, la deposición fecal de un microorganismo, la metritis, la inflamación de las mucosas, las infecciones intrauterinas, enfermedad de odema, la enteritis, las infecciones reproductivas crónicas, la laminitis y la Chlamydiosis, Colibacilosis, Ehrlichiosis, Leptospirosis, Pasteurellosis, Pseudotuberculosis, Salmonellosis agudas o crónicas. Ejemplos de dolencias que pueden ser causadas por infecciones microbianas incluyen la afectación de las características de desempeño, tales como la disminución de la producción de leche, elevados conteos de células somáticas, y pérdida de peso. El uso de medicamentos para el tratamiento de dichas condiciones puede ser profiláctico o, de manera alternativa, puede iniciarse después del desarrollo de una de las dolencias descritas aquí. El tratamiento profiláctico, por ejemplo, que comienza antes de que el individuo manifieste síntomas de una dolencia causada por un microorganismo, se entiende, en este documento, como el tratamiento de un individuo que se encuentra "en riesgo" de desarrollar la enfermedad. Por lo regular, un animal "en riesgo" de desarrollar una dolencia es un animal que se encuentra en un área en la cual se ha diagnosticado la dolencia y/o tiene probabilidad ser expuesto a un microorganismo que causa dicha dolencia. Por lo tanto, la administración de una composición puede llevarse a cabo antes, durante o después de la ocurrencia de las dolencias descritas en el presente documento. El tratamiento iniciado después del desarrollo de una dolencia puede dar como resultado una disminución de la severidad de los síntomas de una de las dolencias, o puede eliminar totalmente los síntomas. De preferencia, la administración de un compuesto se lleva a cabo con anterioridad a la ocurrencia de las dolencias descritas en el presente documento. En este aspecto de la invención, una "cantidad efectiva" es una cantidad efectiva para prevenir la manifestación de los síntomas de una enfermedad, disminuir la severidad de los síntomas de una enfermedad, y/o eliminar completamente los síntomas. Las potencia de una composición de la presente invención puede evaluarse de acuerdo a métodos estándar, establecidos por 9 CFR \NAK 113. Por ejemplo, 9 CFR \NAK 113.120(c) y 9 CFR \NAK 113.123(c) describen métodos estándar para la determinación de la potencia de una composición contra una referencia estándar bacteriana de Salmonella typhimurium y Salmonella dublin, respectivamente. Los métodos para determinar si un animal posee las dolencias presentadas en este documento y los síntomas asociados con las dolencias son rutinarios y conocidos en la técnica.

En un aspecto, la invención también se dirige al uso de una composición en la preparación de un medicamento para el tratamiento de una infección por un microorganismo gram negativo, y/o una infección gram positiva en un animal. El medicamento incluye una cantidad efectiva de la composición de la presente invención para su administración a un animal que padece, o se encuentra en riesgo de padecer, una infección gram negativa o gram positiva, y está determinado si, al menos un síntoma de la infección se reduce.

En otro aspecto, la invención facilita el uso de una composición para la producción de un medicamento para el tratamiento de la mastitis en animales productores de leche, tales como el ganado vacuno. El medicamento incluye una cantidad efectiva de la composición de la presente invención para su administración a un animal productor de leche que padece, o se encuentra en riesgo de padecer, mastitis, y se determina si, al menos, un síntoma de la mastitis se reduce. Mastitis se refiere a la inflamación de las glándulas mamarias. Se caracteriza por cambios físicos, químicos, y usualmente bacteriológicos en la leche y cambios patológicos en el tejido glandular. Estos cambios glandulares, con frecuencia, tienen como resultado un número de dolencias sintomáticas, tales como decoloración de la leche, presencia de coágulos y presencia de gran cantidad de leucocitos. Clínicamente, la mastitis produce inflamación, aumento de temperatura, dolor, esclerosis, en las glándulas mamarias, que provocan, con frecuencia, deformaciones en la ubre. En muchos casos, el diagnóstico de las infecciones subclínicas depende en gran medida de las pruebas indirectas que dependen del contenido de leucocitos en la leche, y del conteo de células somáticas (SCC). Los organismos que más comúnmente infectan la ubre se clasifican en dos grupos: 1) patógenos contagiosos y 2) patógenos ambientales. Ejemplos de patógenos contagiosos incluyen, por ejemplo, Staphylococcus aureus y Streptococcus agalactiae. Ejemplos de patógenos ambientales incluyen los coliformes, tales como, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca, Enterococcusfaecium Emerococcms faecalis, Enterobacter aerogenes, y Streptococci tales como S. uberis, S. bovis y S. dysgalactiae. Ejemplos de otras bacterias gram negativas que pueden causar mastitis incluyen Aerobacter spp., Bacteroides spp., Campylobacter spp., Citrobacter spp., Enterobacter spp., Erwinia spp., Escherichia spp., Fusobacterium spp., Klebsiella spp., Leptospira spp., Mycoplasma spp., Pasteurella spp., Providencia spp., Pseudomonas spp., Proteus spp., Serratia spp., Salmonella spp. y Yersinia spp. De preferencia, el medicamento que contiene la composición de la presente invención tratará la mastitis provocada por un microorganismo gram positivo o un microorganismo gram negativo. De preferencia, los microorganismos gram positivos que causan mastitis que pueden tratarse utilizando la presente invención son miembros de la familia Micrococcaceae, miembros de la familia Deinococcaceae, u otros microorganismos gram positivos, como se describe en la sección "Composiciones." Con mayor preferencia, los microorganismos gram positivos son Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae, Streptococcus uberis, Strptococcus bovis y Streptococcus dysgalatiae y Streptococcus equi, con la mayor preferencia, Staphylococcus aureus. De preferencia, los microorganismos gram negativos causantes de mastitis que pueden tratarse utilizando la presente invención son enteropatógenos, con mayor preferencia, miembros de la familia Enterobacteriaceae, de las tribus Escherichieae o Salmonelleae, como se describe en la sección "Composiciones." Con la mayor preferencia, los microorganismos gram negativos son Salmonella spp. y E. coli.

En otro aspecto más, la invención brinda el uso de una composición en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la metritis en un animal, preferentemente, en ganado vacuno. El medicamento incluye una cantidad efectiva de la composición de la presente invención para su administración a un animal que padece, o se encuentra en riesgo de padecer, metritis, y está determinado si, al menos, uno de los síntomas de la metritis se reduce. La metritis es una inflamación del útero después del parto y, con frecuencia, es causada por una placenta retenida. La metritis subclínica en un animal es, con frecuencia, indicativa de una disminución de las características de desempeño, incluyendo, por ejemplo, una disminución de la producción de leche, una disminución de la fertilidad y una pérdida de peso del animal.

En otro aspecto, la invención se dirige a la utilización de una composición en la producción de un medicamento para el tratamiento de elevados conteos de células somáticas en la leche de un animal, de preferencia, una vaca. El medicamento incluye una cantidad efectiva de la composición de la presente invención, para su administración a un animal productor de leche que padece, o se encuentra en riesgo de padecer, conteos elevados de células somáticas, y está determinado si el conteo de células somáticas en la leche obtenida del animal contiene un conteo reducido de células somáticas en comparación con la leche obtenida a partir del animal antes de recibir la composición. En otro aspecto, la invención se dirige al uso de una composición en la preparación de un medicamento para la reducción del conteo de células somáticas en la leche de un animal. Sorprendente e inesperadamente, la disminución en el conteo de células somáticas en animales que reciben SRPs y porinas obtenidas a partir de Salmonella, en apariencia, no estuvo relacionada con la enfermedad clínica provocada por Salmonella (ver la sección de resultados del Ejemplo 7, y el Ejemplo 8). El conteo de células somáticas (SCC) es una medida, comúnmente utilizada, de la calidad de la leche. Las células somáticas incluyen leucocitos del animal, y por lo regular se presentan en bajos niveles en la leche normal. Elevados niveles de células somáticas en la leche, por ejemplo, al menos aproximadamente 250.000 células por mililitro de leche, de preferencia, al menos alrededor de 400.000 células por mililitro de leche, indican calidad disminuida de la leche. Elevados niveles de células somáticas en la leche pueden indicar una infección (mastitis), pero pueden no estar asociados a una infección (ver Ejemplo 8). El SCC se monitorea, por lo regular, por parte de plantas de procesamiento de leche, que utilizan métodos que son rutinarios en la técnica. En un aspecto, la invención es particularmente ventajosa para la reducción de los conteos de células somáticas de la leche que se encuentran en los animales productores de leche infectados con un microorganismo de las familias Acholeplasmataceae, Bacteroidaceae, Enterobacteriaceae, Leptospiraceae, Micrococcaceae, Mycoplasmataceae, Mycobacteriaceae, Neisseriaceae, Pasteurellaceae, Pseudomonadaceae, Spirochaetaceae, o Vibronaceae. De preferencia, el SCC se reduce, en orden creciente de preferencia, a menos de aproximadamente 750.000 células/ml, menos de aproximadamente 600.000 células/ml, menos de aproximadamente 400.000 células/ml, con la mayor preferencia, menos de aproximadamente 250.000 células/ml. Los microorganismos gram positivos que causan niveles aumentados de SCC, que pueden ser tratados usando el presente método son miembros de la familia Micrococcaceae, miembros de la familia Deinococcaceae, u otros microorganismos gram positivos, como se describe en la sección titulada "Composiciones." De preferencia, los microorganismos gram positivos son Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae, Streptococcus uberis, Streptococcus bovis y Streptococcus dysgalatiae y Streptococcus equi, con la mayor preferencia, Staphylococcus aureus. Los microorganismos gram negativos que provocan SCC incrementado, que pueden ser tratados utilizando el presente método son enteropatógenos, con mayor preferencia, miembros de la familia Enterobacteriaceae, con mayor preferencia aún, miembros de las tribus de Enterobacteriaceae Escherichieae o Salmonelleae, como se describe en la sección titulada "Composiciones." Con la mayor preferencia, los microorganismos gram negativos a los cuales se unen específicamente los anticuerpos son Salmonella spp. y E.coli.

En otro aspecto, la invención se dirige al uso de una composición en la preparación de un medicamento para el tratamiento de la baja producción de leche por parte de un animal productor de leche, de preferencia, una vaca. El medicamento es para la administración de una cantidad efectiva de la composición de la presente invención a un animal productor de leche que padece, o se encuentra en riesgo de padecer, baja producción de leche, y está determinado si la producción de leche del animal se incrementa en comparación con la producción de leche del animal antes de recibir la composición. En otro aspecto, la invención se dirige al uso de una composición en la preparación de un medicamento para incrementar la producción de leche en un animal productor de leche, preferentemente, una vaca. El medicamento es para la administración de una composición de la presente invención a un animal productor de leche, y está determinado si la producción de leche por parte del animal se incrementa en comparación con la producción de leche del animal antes de recibir la composición. De preferencia, la producción de leche de un animal productor de leche antes de la administración de la composición de la presente invención se incrementa en al menos aproximadamente 1%, con mayor preferencia, al menos aproximadamente 3%, con la mayor preferencia, al menos aproximadamente 6%. De preferencia, la producción de leche de una vaca se determina antes de la administración y aproximadamente 2 semanas, con mayor preferencia, aproximadamente 8 semanas, con la mayor preferencia, aproximadamente 16 semanas antes de la administración de la composición.

En otro aspecto diferente, la invención se dirige al uso de una composición en la preparación de un medicamento para el tratamiento de la colonización intestinal por un microorganismo, de preferencia, un enteropatógeno. La colonización intestinal por un enteropatógeno se determina, por lo regular, mediante la medición de la deposición fecal de un microorganismo por parte del animal. El medicamento para tratar la colonización intestinal por un enteropatógeno incluye una cantidad efectiva de la composición de la presente invención para su administración a un animal que padece, o se encuentra en riesgo de padecer, deposiciones fecales de un enteropatógeno, y está determinado si las deposiciones fecales de un enteropatógeno han disminuido en comparación con las deposiciones fecales del microorganismo por parte del animal antes de recibir la composición. La deposición fecal puede medirse mediante métodos que son rutinarios y conocidos en la técnica. Muchos de los animales infectados con un enteropatógeno, por ejemplo, Salmonella spp. O E. coli, depondrán el microorganismo en sus heces o excreciones corporales. Cuando el microorganismo es Salmonella, esta deposición puede servir como fuente para una Salmonellosis crónica en el grupo. De preferencia, el microorganismo es E. coli o una Salmonella spp., con mayor preferencia, es una Salmonella spp. De preferencia, el microorganismo incluye un polipéptido (por ejemplo, un SRP y/o una porina) que comprende un epítopo que tiene relación estructural con un epítopo presente en un SRP y/o una porina presente en la composición administrada al animal. De preferencia, el nivel de deposición fecal se reduce aproximadamente 10 veces, con mayor preferencia, aproximadamente 100 veces, con mayor preferencia aun, aproximadamente 1.000 veces. Con la mayor preferencia, el nivel
de deposición fecal de un enteropatógeno se reduce hasta niveles en los cuales, el enteropatógeno ya no es detectable.

La presente invención también se dirige al uso de una composición en la preparación de un medicamento para incrementar la calidad de la leche. Los indicadores de baja calidad de la leche incluyen, por ejemplo, conteo de células somáticas de al menos aproximadamente 250.000 células por mililitro de leche, de preferencia, al menos aproximadamente 400.000 células por mililitro de leche, y contaminación microbiana de la leche. El medicamento incluye una cantidad efectiva de la composición de la presente invención para su administración a un animal, y está determinado si la calidad de la leche de un animal productor de leche se incrementa en comparación con la calidad de la leche del animal productor de leche antes de recibir la composición.

La leche producida por estos animales resulta en la presencia, en la leche, de anticuerpos dirigidos contra los SRPs y las porinas, y estos anticuerpos disminuirán la capacidad de los microorganismos que presentan SRPs con reactividad cruzada y/o porinas con reactividad cruzada de multiplicarse en la leche.

Una composición de la invención puede utilizarse para proporcionar inmunización activa o pasiva contra infección bacteriana. Por regla general, la composición puede administrarse a un animal para proporcionarle inmunización activa. Sin embargo, la composición también puede usarse para inducir la producción de productos inmunes, tales como anticuerpos, que pueden colectarse a partir del animal productor, y administrarse a otro animal para proporcionarle inmunidad pasiva. Los componentes inmunes, tales como anticuerpos pueden colectarse para preparar composiciones de anticuerpos a partir del suero, el plasma, la sangre, el calostro, etc., para terapias de inmunización pasiva. También se pueden preparar composiciones de anticuerpos que contengan anticuerpos monoclonales y/o antiidiotípicos utilizando métodos conocidos. Las composiciones pasivas de anticuerpos, y fragmentos de los mismos, p.e., scFv, Fab, F(ab')_{2} o Fv u otras formas modificadas de los mismos pueden administrarse a los receptores en forma de suero, plasma, calostro y otros similares, utilizando métodos conocidos, y ser esparcidos secos o liofilizados para su uso posterior en forma concentrada o reconstituida. Las preparaciones de inmunización pasiva pueden ser particularmente ventajosas para el tratamiento de enfermedad sistémica aguda, o la inmunización pasiva de animales jóvenes que no logran adquirir niveles adecuados de inmunidad pasiva a través del calostro materno.

Otro aspecto de la presente invención proporciona métodos para la detección de anticuerpos que se unen específicamente a polipéptidos de las composiciones de la presente invención. Estos métodos son útiles para, por ejemplo, detectar si un animal posee anticuerpos que se unen específicamente a polipéptidos de las composiciones de la presente invención, y diagnosticar si un animal puede padecer una dolencia producida por un microorganismo que expresa SRPs y/o porinas de las composiciones descritas en el presente documento. De preferencia, tales sistemas de diagnóstico se presentan en forma de kit. Los métodos incluyen poner en contacto un anticuerpo con una preparación que incluye polipéptidos presentes en una composición de la presente invención que resultan en una mezcla. De preferencia, el anticuerpo se presenta en una muestra biológica, con mayor preferencia, sangre, leche, o calostro. El método, además, comprende la incubación de la mezcla bajo condiciones que permitan la unión específica del anticuerpo al polipéptido para formar un complejo polipéptido-anticuerpo. Tal como se usa en el presente documento, el término "complejo polipéptido-anticuerpo" designa el complejo que resulta cuando un anticuerpo se une de forma específica a un polipéptido. La preparación que comprende los polipéptidos presentes en una composición de la presente invención puede incluir también reactivos, por ejemplo, un tampón, que proporcionen condiciones adecuadas para la formación del complejo polipéptido-anticuerpo. El complejo polipéptido-anticuerpo, puede detectarse a continuación. La detección de los anticuerpos es conocida en la técnica y puede incluir, por ejemplo, la inmunofluorescencia y la peroxidasa.

Los métodos para la detección de la presencia de anticuerpos que se unen específicamente a los polipéptidos de las composiciones de la presente invención pueden usarse en varios formatos que se han empleado para detectar anticuerpos, y que incluyen el radioinmunoensayo y el ELISA.

La presente invención también proporciona un kit para la detección de anticuerpos que se unen específicamente a polipéptidos de las composiciones de la presente invención. El kit incluye al menos dos SRPs y al menos dos porinas en un material de empaquetamiento adecuado, en una cantidad suficiente par al menos un ensayo. De manera opcional, se incluyen también otros reactivos, tales como tampones y soluciones necesarias para llevar a cabo la invención. Por lo regular, también se incluyen instrucciones para el uso de los polipéptidos empaquetados.

Tal como se usa en el presente documento, el término "material de empaquetamiento" designa a una o más estructuras físicas utilizadas para albergar el contenido del kit. El material de empaquetamiento se construye utilizando métodos bien conocidos, de preferencia, para proporcionar un ambiente estéril, libre de contaminantes. El material de empaquetamiento tiene una etiqueta que indica que los polipéptidos pueden utilizarse para la detección de SRPs y/o porinas. Además, el material de empaquetamiento contiene instrucciones que indican de qué manera los materiales del kit se utilizan para detectar SRPs y porinas. Tal como se utiliza en el presente documento, el término "paquete" designa una matriz sólida o material como vidrio, plástico, papel, lámina, o similares, capaces de contener a los polipéptidos dentro de límites fijos. Por tanto, por ejemplo, un paquete puede ser un pocillo de una placa para microtitulación, al cual se han fijado cantidades microgramométricas de polipéptidos. Las "instrucciones para el uso", por lo común, incluyen una expresión tangible que describe las concentraciones de reactivos, o al menos un parámetro de ensayo del método, tal como las cantidades relativas de reactivos y muestra que deben ser mezcladas, períodos de tiempo de mantenimiento para las mezclas de reactivos/muestras, temperatura, condiciones de tampón, y similares.

Ejemplos

Se evaluaron composiciones que incluyen proteínas receptoras de sideróforos y porinas obtenidas a partir de Salmonella para determinar su eficacia contra un reto virulento en ratón, y para el control de la Salmonellosis en el ganado productor de leche y carne. La eficacia de la composición se evaluó mediante la colecta de datos de los parámetros siguientes: en primer lugar, se evaluó la potencia de las composiciones inmunizantes contra un reto virulento in vivo en ratón, y en segundo lugar, se evaluó la eficacia en el ganado comercial productor de leche y carne, mediante el análisis de la respuesta serológica a la vacunación, la eliminación de Salmonella analizada en las deposiciones fecales, la reducción de la morbilidad y la mortalidad, la reducción d ellas células somáticas en la leche, la producción total de leche, y el examen de los lugares de las inyecciones después de cada vacunación.

Ejemplo 1 Producción y Aislamiento de Proteínas Receptoras de sideróforos y Porinas

Las bacterias gram negativas que pertenecen a las familias Enterobacteriaceae y Pseudomonaceae, así como otras bacterias gram negativas pueden cultivarse bajo condiciones de fermentación controladas, de manera que expresen proteínas receptoras de sideróforos y porinas y, de manera opcional, proteínas reguladas por hierro, en la membrana externa. Las bacterias pueden colectarse mediante métodos convencionales y, a continuación, pueden aislarse las proteínas de la membrana externa para utilizarlas como inmunógenos en una composición de una vacuna que se describe en detalles en el ejemplo siguiente.

Se aisló Salmonella dublin a partir de terneros Holstein en un lote comercial que mostraba síntomas clínicos de Salmonellosis, y se le designó MS010207. El aislamiento se serotipó por el Minnesota Poultry Testing Laboratory, (Wilmar, MN). Se preparó un stock semilla patrón del organismo mediante la inoculación de 100 ml de caldo tríptico de soya (Difco Laboratories, Detroit, MI) que contenía 50 microgramos por mililitro (\mug/ml) de 2,2-depiridil (Sigma-Aldrich St. Louis, MO). Se mantuvo el cultivo mediante agitación a 200 rpm durante 6 horas a 37ºC. Se colectaron las bacterias mediante centrifugación a 10.000 x g. El precipitado bacteriano se resuspendió en 20 ml de solución salina fisiológica (0,85%) que contenía 20% de glicerol. La suspensión bacteriana se trasvasó, garantizando la esterilidad, a viales 20-2 ml y se conservó a -90ºC. La semilla patrón se expandió para obtener una semilla de trabajo, que se utilizó para la producción de las proteínas receptoras de sideróforos y las porinas. Se desarrolló un proceso de producción a gran escala, que incluía la fermentación, la recolección de las bacterias, su destrucción, su solubilización, su concentración, diafiltración y aislamiento del producto final.

Fermentación

Se utilizó un vial criogénico de la semilla de trabajo (1 ml a 10^{9} CFU/ml) para inocular 500 ml de caldo tríptico de soya (TSB) sin dextrosa (Difco) precalentado a 37ºC, que contenía 50 microgramos de 2,2-dipiridil (Sigma), 2,7 gramos de extracto BiTek de levadura (Difco) y glicerol (3% vol/vol). Se incubó el cultivo a 37ºC durante 12 horas con agitación a 200 rpm, después de lo cual se inoculó en 2 litros del medio anterior y se le permitió crecer durante 4 horas más a 37ºC. Este cultivo se utilizó para inocular un fermentador Virtis con agitación superior, (Virtis, Gardiner, NY) cargado con 13 litros del medio descrito anteriormente. El pH se mantuvo constante entre 6,9 y 7,1 mediante titulación automática con NaOH al 30% y Hcl al 10%. La velocidad de agitación se ajustó a 400 rpm, y el cultivo se aereó con 11 litros de aire/minuto a 37ºC. Se controló la formación de espuma mediante la adición automática de 11 ml de desespumante (Mazu DF 204 Chem/Serv, Minneapolis, MN). Se permitió el crecimiento constante del cultivo en estas condiciones durante 4 horas, después de lo cual se bombeó, garantizando la esterilidad, en un fermentador de 150 litros (W. B. Moore, Easton, PA). El fermentador se cargó con 115 litros de caldo tríptico de soya sin dextrosa (3.750,0 gramos), extracto BiTek de levadura (625 gramos), glicerol (3750 ml), 2,2-dipiridil (3,13 gramos) y desespumante Mazu DF 204 (100 ml). Los parámetros de la fermentación fueron los siguientes: el oxígeno disuelto (DO) se mantuvo a 30% +/- 10% mediante un incremento de la agitación a 220 rpm, junto a 60 litros de aire/minuto y 10 libras por pulgada cuadrada (psi) de presión trasera. El pH se mantuvo constante entre 6,9 y 7,1 mediante titulación automática con NaOH 30% y HCL 10%. La temperatura se mantuvo a 37ºC. A las 4,5 horas (OD_{540} 8-9) de la fermentación, se suplementó el cultivo con nutrientes adicionales mediante la adición de 7 litros de medio que contenía 1.875 gramos de TSB sin dextrosa, 313 gramos de extracto de levadura, 3,13 gramos de 2,2-dipiridil y 1.875 ml de glicerol. La velocidad de flujo se ajustó a 29 ml/minuto, al tiempo que la agitación se incrementó a 675 rpm. Al finalizar la adición (hora 8,5), se continuó la fermentación por tres horas adicionales, en cuyo momento, se terminó la fermentación mediante la disminución de la temperatura del fermentador a 10ºC (OD_{540} 35-40 en una dilución 1:1000). El cultivó se transfirió, manteniendo la esterilidad, a un tanque de 200 litros (LEE Process Systems and Equipment, modelo 2000LDBT) en preparación para la colecta.

Colecta

El fermentado bacteriano se concentró y se lavó utilizando un Maxiset-25 de flujo tangencial Pall Filtron (Pall Filtron Corporation, Northboro, MA), equipado con dos filtros de canal abierto de 30 pies^{2} Alpha 300-K, No. de catálogo AS300C5, (Pall Filtron), conectado a una bomba de alimentación Waukesha, modelo U-60 (Waukesha Cherry-Burrell, Delevan, WI). El volumen original de 125 litros se redujo a 25 litros (2,5 litros/minuto) mediante una presión de entrada del filtro de 15 psi y una presión de retentato de 0 psi. El retentato bacteriano se ajustó de vuelta hasta los 50 litros utilizando solución salina fisiológica (0,85%) y luego se concentró nuevamente hasta 15 litros para contribuir a eliminar cualesquiera proteínas exógenas contaminantes, etc. El retentato (15 litros) se ajustó a 35 litros utilizando tampón de shock osmótico estéril (OMS) que contenía 7,26 gramos/litro de Tris-base y 0,93 gramos/litro de EDTA ajustado a ph 8,5. El EDTA en el OMS sirve para eliminar gran parte del LPS de la pared celular, mientras que el pH elevado evita gran parte de la degradación proteolítica luego del congelamiento y la destrucción. Se pueden utilizar inhibidores de proteasas en lugar de, o además de, un pH elevado. El retentato se mezcló a fondo dentro del tanque de 200 litros, mediante un mezclador magnético en el fondo del mismo. El retentato se transfirió (3,5 litros), garantizando la esterilidad, para contenedores Nalgene de 4 litros No. 2122, y se colocó en un congelador a -20ºC para su almacenamiento. La masa del precipitado se calculó mediante la centrifugación de muestras de 30 ml del cultivo fermentado y del colectado final. En breve, se centrifugaron tubos cónicos Nalgene de 50 ml, prepesados, a 39.000 x g, durante 90 minutos en una centrífuga Beckman J2-21, que utilizaba un rotor JA-21 (Beckman Instruments, Palo Alto CA). Al final de la corrida, el sobrenadante se decantó y se pesaron nuevamente los tubos. Se calculó la masa del precipitado para cada etapa. El proceso de fermentación rindió un precipitado con masa húmeda de 9,0 kilogramos.

Destrucción (Homogeneización)

Se descongelaron hasta 4ºC veinte kilogramos de células bacterianas congeladas en OMS (20 kg de masa de precipitado). La suspensión del cultivo líquido, de cada contenedor se aspiró de manera aséptica hacia un tanque de procesamiento cubierto, que retiene el vapor, de 250 litros (Lee, modelo 259LU) con un mezclador montado en la parte superior (Eastern, modelo TME-1/2, EMI Incorporated, Clinton, CT), que contenía 222 litros de OMS a pH 8,5, con 0,1 gramos/litro de timerosal, como preservante. Se determinó el volumen de OMS dividiendo la masa del precipitado entre 900 y multiplicando por 10 el cociente para obtener el volumen de homogeneización en litros (gramos de masa de precipitado/900 x 10 = litros de volumen de homogeneización). Toda la suspensión bacteriana se enfrió a 4ºC con mezcla continua durante 18 horas a 200 rpm, en cuyo momento, se destruyó mediante homogeneización. Brevemente, el tanque de 250 litros que contenía la suspensión bacteriana se conectó a un Homogeneizador Rannie, modelo 12,51 H, (APV Systems, Rosemont, IL). Se conectó un segundo tanque de procesamiento, de 250 litros cubierto (vacío) al homogeneizador, de manera que el fluido en el tanque de procesamiento pudiese pasar a través del homogeneizador, y hacia el tanque vacío, y de vuelta, permitiendo múltiples pases de homogeneización manteniendo el sistema cerrado. La temperatura durante la homogeneización se mantuvo a 4ºC. Al final de cada pase, el fluido se hizo circular a través de una bomba Waukesha, modelo 10 DO a 70 psi, a través del homogeneizador (160 galones/hora), y de regreso al tanque de origen, mientras que la presión de homogeneización se ajustó a 13.500 psi. Antes del primer pase, se extrajeron dos muestras de pre-homogeneización del homogeneizador, para establecer una línea base para la determinación del grado de destrucción, y el monitoreo del pH. El grado de destrucción se monitoreó mediante la transmitancia (%T a 540 nm a una dilución 1:100), en comparación con la muestra no homogenizada. El número de pases a través del homogeneizador se estandarizó para diferentes organismos, sobre la base de la integridad de la pared celular y la variación del grado de destrucción, que mostró una correlación directa con la eficiencia de la solubilización y la calidad del producto final. Por ejemplo, la destrucción de la Salmonella pasada tres veces a través del homogeneizador dio como resultado un porciento de transmitancia entre 78-83%T para una dilución 1:100. E. coli, con la misma masa de precipitado y OD iniciales produjo un %T de 86-91%T (para una dilución de 1:100) después del tercer pase. Se ha observado que las bacterias difieren en la integridad de la pared celular y son diferentes en la capacidad de destrucción bajo condiciones idénticas. Esta variación puede tener influencia sobre el grado y eficiencia de la solubilización y de la recuperación de SRPs y porinas de la membrana externa. En general, se pasaron las células a través del homogeneizador hasta que la transmitancia no se incrementó con un pase adicional.

Después de la homogeneización, se añadió a la solución bacteriana homogenizada Lauroil Sarcosinato de sodio (Hamptosyl L-30, Chem/Serv), garantizando la esterilidad, para su solubilización. La cantidad de Sarcosina (30%) añadida igualó 0,0664 veces el volumen de solubilización, en litros, (1,0 gramo de sarcosina/4,5 gramos de masa de precipitado). Se sacó el tanque del homogeneizador y se colocó en un ciclo de enfriamiento a 4ºC y se mezcló a 240 rpm durante 60-70 horas. Este período de tiempo fue importante para la solubilización total. Se descubrió que el incremento del tiempo de solubilización en OMS a un pH elevado (8,0-8,5) provocaba que los SRPs y las porinas se agregasen, formando grandes agregados insolubles que eran fácilmente eliminados mediante centrifugación. La OD óptima luego de la solubilización se encontraba, con frecuencia entre 25-30%T a 540 nm.

Colecta de las proteínas

Las proteínas receptoras de sideróforos y las porinas agregadas dentro de l fluido del proceso de solubilización se colectaron mediante centrifugación utilizando centrífugas Sharples T-1, (Alfa, Laval Separations, Warminster, PA). Brevemente, el tanque del homogenato solubilizado se usó para alimentar seis centrífugas Sharples a una velocidad de alimentación de 250 ml/minuto, a 17 psi, a una fuerza centrífuga de 46.000 x g. Se colectó el efluente en un segundo tanque de procesamiento cubierto de 250 litros, mediante un lazo cerrado estéril, que permitía múltiples pase a través de las centrífugas a la vez que mantenía el sistema cerrado. La temperatura durante la filtración se mantuvo a 4ºC. El homogenato solubilizado se pasó ocho veces a través de las centrífugas. Se colectó 50% de la proteína después del segundo pase, en cuyo momento, el fluido solubilizado se concentró a 1/3 de su volumen original, lo cual acortó el tiempo del proceso para los 6 pases siguientes. Brevemente, el tanque del homogenato solubilizado se desconectó, garantizando la esterilidad, de las centrífugas, y se conectó a un ensamblado Millipore Pellicon de filtro de flujo tangencial (Millipore Corporation, Bedford, MA), equipado con un filtro de pantalla de canal de 25 pies^{2}, serie Alpha 10K Centrasette, conectado a una bomba de alimentación Waukesha, modelo U30, para su concentración. Después de la concentración, se continuó la centrifugación hasta el completamiento del proceso. Se colectó proteína después de cada pase. La proteína se colectó, se resuspendió, y se dispensó en 50 litros de tampón Tris, de pH 8,5, que contenía 0,3% de formulina (Sigma), como preservante.

Diafiltración

La suspensión de proteína se lavó mediante diafiltración a 4ºC para eliminar cualquier sarcosina contaminante que pudiera quedar unida a la proteína. Brevemente, los 50 litros de proteína se aspiraron, garantizando la esterilidad, a un tanque de procesamiento de 200 litros, que contenía 50 litros de tampón Tris, de pH 8,5, equipado con un mezclador Dayton, modelo 2Z846 (Dayto Electric, Chicago, IL) montado en la parte inferior, que rotaba a 125 rpm. El tanque de procesamiento se conectó, garantizando la esterilidad, a un ensamblaje Millipore Pellicon, de filtro de flujo tangencial (Millipore Corporation), equipado con un filtro de pantalla de canal de 25 pies^{2}, serie Alpha 10K Centrasette, conectado a una bomba de alimentación Waukesha, modelo U30. La solución de proteína de 100 litros se concentró mediante filtración, hasta un volumen objetivo de 5,45 veces la masa del precipitado, en cuyo momento, se añadió lentamente al concentrado tampón Tris de pH 7,4, que contenía 5% de alcohol isipropílico, para la eliminación de la sarcosina unida, sin comprometimiento de la inmunogenicidad de la proteína. Se continuó la diafiltración hasta que el pH se estabilizó en 7,4, en cuyo momento se añadieron lentamente 50 litros de tampón Tris de pH 7,4, mediante diafiltración, para eliminar el alcohol residual. A continuación, la suspensión de proteína se concentró hasta aproximadamente 25 litros. El concentrado de proteínas (3,5 litros) se vertió, garantizando la asepsia, en contenedores de 4 litros de Nalgene y se colocó en un congelador a -20ºC para su almacenamiento.

Este proceso produce una composición de SRPs y porinas extremadamente pura, con la eliminación casi completa de LPS, con muy poco o ningún residuo de sarcosina. La proteína se examinó, mediante SDS-PAGE, para evaluar su pureza y perfil de bandas, contaminación bacteriana, sarcosina residual, y LPS. El perfil de bandas del producto terminado mostró patrones consistentes al ser examinado mediante electroforesis. La composición se evaluó en busca de sarcosina mediante el uso de una prueba de difusión en gel de agar modificada, en la cual se incorporaron glóbulos rojos de oveja (5%) a la base de agar (1,5%). Se cortaron pozos en el agar, y se colocaron en dichos pozos muestras del producto final, junto a muestras control de concentraciones conocidas de sarcosina, a 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 1,0 y 2,0%. Se incubó el gel a 25ºC durante 24 horas y se determinó el grado de hemólisis en comparación con los controles. El proceso eliminó los niveles de sarcosina detectables por debajo de 0,05% que, a dicha concentración, mostró una hemólisis mínima en las muestras de control.

Se eliminó el LPS por debajo de niveles detectables, como demostró una prueba de lisado de amebocitos de Limulus (LAL), disponible bajo el nombre comercial de E-TOXATE (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO).

Ejemplo 2 Estudio de vacunación y reto de ratones

Se determinó la eficacia de una vacuna de Salmonella dublin, consistente en proteínas receptoras de sideróforos (SRPs) y porinas contra un reto virulento vivo en ratones, como se describe en 9CFR 113.123. Se distribuyeron sesenta ratones CF-1 hembras obtenidos de los Harlan Breeding Laboratories (Indianapolis, IN), con pesos entre 16 y 22 gramos, de manera equitativa en 6 jaulas de ratón de policarbonato (Ancore Corporation, Bellmore, NY) y se designaron como grupos 1 al 6.

La composición que contenía proteínas receptoras de sideróforos y porinas se preparó como se describió en el Ejemplo 1, a partir de un aislamiento de Salmonella dublin de ganado de campo, originado de un grupo de vacas Lecheras Holstein que mostraban síntomas clínicos de Salmonellosis.

Los SRPs tenían pesos moleculares de 89 kDa, 84 kDa, 72 kDa, y las porinas tenían pesos moleculares de 38-39 kDa, tal como reveló el examen mediante un SDS-PAGE al 12%. Los SRPs y las porinas, en un volumen de 8,3 ml (6,034 \mug/ml) se resuspendieron un 69,2 ml de suero salino fisiológico (0,85%). La suspensión acuosa de proteínas (77,5 ml) se emulsificó en 22,5 ml de EMULSIGEN (MVP Laboratories, Ralston, Nebraska), mediante un vaso de homogeneización IKA Ultra Turrax T-50 (IKA, Cincinnati, OH), para dar una dosis final de 125 \mug de proteínas totales en un volumen inyectable de 0,25 ml, a una concentración de adyuvante del 22,5% vol/vol. La dosis para ratones se ajustó para que equivaliese a una dosis de campo de 1.000 \mug en un volumen de 2 ml.

Se probó la potencia de la vacuna a cuatro concentraciones diferentes, no diluida (Grupo-1), 1:10 (volumen del solvente:volumen de la solución de proteína) (Grupo-2), 1:100 (Grupo-3), y 1:1000 (Grupo-4), en comparación con dos grupos control; un grupo retado no vacunado (Grupo-5), y un grupo no retado no vacunado (Grupo-6). Se utilizó EMULSIGEN como solvente para diluir la vacuna patrón a una concentración de 22,5%, preparada con solución salina fisiológica. Los ratones se vacunaron intraperitonealmente, y se revacunaron 14 días después de la primera vacunación. El volumen administrado fue de 0,25 cc.

Catorce días después de la segunda vacunación, los ratones de los grupos 1-5 se retaron intraperitonealmente con 1,7 x 10^{8} unidades formadoras de colonia (CFU)de un aislamiento virulento de Salmonella dublin. El aislamiento (IRP SCC Serial) se obtuvo de The Center of Veterinary Biologics-Laboratory, United States Department of Agriculture, Ames, IA. Se registró la mortalidad diariamente durante dos semanas a partir del reto. La tabla 1, a continuación, muestra la mortalidad entre los ratones vacunados y no vacunados, con posterioridad al reto.

TABLA 1

Mortalidad de los ratones vacunados y no vacunados con posterioridad al reto con Salmonella dublin
Grupos	# de ratones	# de muertos	Porciento de
			mortalidad (%)
Grupo-1 (no diluida)	10	0/10	0
Grupo-2 (1:10)	10	1/10	10
Grupo-3 (1:100)	10	3/10	50
Grupo-4 (1:1000)	10	5/10	60
Grupo-5 (no vacunados/retados)	10	10/10	100
Grupo-6 (no vacunados/no retados)	10	0/10	0

Diez (100%) de los ratones no vacunados (Grupo-5) murieron en los catorce días posteriores al reto (Tabla 1). Por el contrario, ninguno de los ratones del grupo-1, a los que se aplicó la vacuna no diluida, murió. Todas las diluciones de la vacuna de prueba mostraron elevados grados de protección, en comparación con el grupo-5, de ratones no vacunados/retados. Ninguno de los ratones del grupo-6 murió, lo que evidencia que no hubo transmisión horizontal del organismo entre los grupos.

Ejemplo 3 Preparación de una composición inmunizante a partir de Salmonella bredeney

Se aisló y se serotipó Salmonella bredeney a partir de un grupo de ganado vacuno lechero de Minesotta, con historial de elevada mortalidad de animales adultos y terneros, morbilidad y pérdida de producción debida a esta cepa bacteriana, y se le designó MS010914. Se aislaron los SRPs y las porinas como se describió en el Ejemplo 1. Se observaron tres SRPs de elevado peso molecular, 89 kDa, 84 kDa y 72 kDa en una electroforesis en gel de poliacrilamida con 12% de dodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE). Se aislaron, además tres proteínas de bajo peso molecular reguladas por hierro (IRPs), en las regiones de 37 kDa, 32 kDa y 29 kDa, aproximadamente. Las porinas purificadas a partir de los aislamientos propagados mostraron pesos moleculares en el rango de 38-39 kDa.

Se prepararon dos composiciones a partir de los SRPs con pesos moleculares de 89 kDa, 84 kDa, y 72 kDa, los IRPs con pesos moleculares de 37 kDa, 32 kDa, y 29 kDa, y las porinas con pesos moleculares de 38-39 kDa. Las proteínas blanco se emulsionaron en las siguientes formulaciones vacunales, para proporcionar una dosis total de aproximadamente 1.000 \mug. En la primera composición, llamada Vac-1, se añadieron lentamente 50 ml de antígeno (4,35 miligramos/mililitro (mg/ml)), con agitación, a 40 ml de hidróxido de aluminio al 25% (Rehydagel-HPA, Reheis, NJ), preparados en 270 ml de solución salina fisiológica. La suspensión de antígeno/hidróxido de aluminio se agitó durante 24 horas a 4ºC. A continuación, la solución de antígeno/hidróxido de aluminio se emulsionó en 40 ml de EMULSIGEN, para producir una dosis final de 1.000 \mug de proteína total, en un volumen inyectable de 2 ml.

En una segunda composición, llamada Vac-2, se mezclaron 217,25 mg de antígeno SRP en 270 ml de solución salina fisiológica. La solución de antígeno se emulsionó en 80 ml de EMULSIGEN para producir una dosis final de 1.000 \mug de proteínas totales en un volumen inyectable de 2 ml.

Ejemplo 4 Pre-examen de las composiciones inmunizantes

Con el objetivo de determinar la existencia de posibles efectos colaterales (p.e., reducción de la producción de leche, reacciones adversas de los tejidos, etc.) se administraron primeramente las vacunas del Ejemplo 3 a animales en diferentes etapas de la producción: 2 vacas en lactación, 2 vacas adultas fuera de la etapa de lactación, y dos terneros. Dos días antes del pre-examen, se seleccionaron dos vacas en estado de lactación para determinar su producción diaria de leche. Se monitoreó también la producción de leche de cada vaca en cada uno de los dos ordeños diarios durante dos días consecutivos (48 horas) después de la vacunación, para determinar si existía alguna pérdida en la producción causada por la vacunación. Se repitió el monitoreo en un único ordeño de cada vaca en el séptimo día, Las dos vacas en estado de lactación recibieron 2 ml de Vac-1 por vía subcutánea en la región cervical. Además, a otras dos vacas fuera del estado de lactación se les administró 2,0 ml de Vac-2 por vía subcutánea en la región cervical, y a dos terneros se les administró 1,0 ml de Vac-1 por vía subcutánea en la región cervical, y se monitoreó a los animales durante 7 días en busca de una posibles reacción adversa.

No se observó ninguna reacción adversa en los tejidos en ninguno de los lugares de inyección de los 6 animales a los que se suministró las vacunas de pre-examen. Además, no hubo una disminución apreciable de la producción de leche de las vacas en estado de lactación a los 2 y 7 días después de la vacunación.

Ejemplo 5 Inmunización del grupo

Después de la terminación del estudio del Ejemplo 4, se administraron composiciones inmunizantes de Vac-1 y Vac-2 al grupo completo. El grupo estaba formado por 55 vacas produciendo leche, 52 vacas fuera de la etapa de lactación y 18 terneros con edades que oscilaban entre 6 meses y 12 meses. El ganado en estado de lactación recibió 2,0 ml de Vac-1; el ganado fuera de la etapa de lactación recibió 2,0 ml de Vac-2; los terneros mayores de seis meses y menores de 12 meses recibieron 1,0 ml de Vac-1; y los terneros mayores de 12 meses de edad recibieron 1,0 ml de Vac-2 (ver Tabla 2). Todas las inyecciones se administraron por vía subcutánea, en la región cervical.

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TABLA 2 Calendario de eventos

Día de estudio	Descripción de los eventos
Pre-examen	\begin{minipage}[t]{120mm} Vacunadas 2 vacas en estado de lactación, 2 vacas fuera de la etapa de lactación y 2 terneros. Monitoreada la producción de leche y las reacciones adversas.\end{minipage}
\begin{minipage}[t]{28mm} Primera vacunación {}\hskip1cm Día 0\end{minipage}	\begin{minipage}[t]{120mm} Vacunadas todas las vacas en estado de lactación y fuera de la etapa de lactación (2 ml) excepto los terneros, menores de 12 meses, que recibieron 1 ml y 2 ml los mayores de 12 meses. Colectadas muestras de sangre y heces de las vacas en estado de lactación.\end{minipage}
Semana 3	\begin{minipage}[t]{120mm} Colectadas muestras de sangre y heces de las vacas en estado de lactación, examinados los lugares de las inyecciones.\end{minipage}
\begin{minipage}[t]{30mm} Segunda vacunación {}\hskip0.02cm Semana 5 Semana 5\end{minipage}	\begin{minipage}[t]{120mm} Vacunadas todas las vacas en estado de lactación y fuera de la etapa de lactación (2 ml) excepto los terneros, menores de 12 meses, que recibieron 1 ml y 2 ml los mayores de 12 meses.\end{minipage}
Semana 7	\begin{minipage}[t]{120mm} Colectadas muestras de sangre y heces y examinados los lugares de las inyecciones.\end{minipage}
Semana 11	\begin{minipage}[t]{120mm} Colectadas muestras de sangre y heces y examinados los lugares de las inyecciones.\end{minipage}

TABLA 2 (continuación)

Día de estudio	Descripción de los eventos
\begin{minipage}[t]{32mm} {}\hskip0.0cm Tercera vacunación Semana 19 Semana 19\end{minipage}	\begin{minipage}[t]{120mm} Vacunadas todas las vacas en estado de lactación y fuera de la etapa de lactación (2 ml) excepto los terneros, menores de 12 meses, que recibieron 1 ml y 2 ml los mayores de 12 meses.\end{minipage}
Semana 21	Colectadas muestras de sangre y heces y examinados los lugares de las inyecciones.
Semana 35	Colectadas muestras de sangre y heces.
Semana 44	Colectadas muestras de sangre y heces.

Treinta y cinco días después de la primera vacunación, a todos los animales se les administró una segunda dosis (estimulante) por vía subcutánea, en la región cervical. Para la dosis del estimulante, todas las vacas en estado de lactación recibieron 2,0 ml de Vac-1, las vacas fuera de la etapa de lactación recibieron 2,0 ml de Vac-2; los terneros entre 6 y 12 meses recibieron 1,0 ml de Vac-1; y los animales de 12 meses o más de edad recibieron 1,0 ml de Vac-2. El cronograma de eventos se muestra en la Tabla 2.

Sobre la base de la ausencia de reacción y la seguridad observada de las composiciones inmunizantes, se vacunó el grupo una tercera vez, 19 semanas después de la primera vacunación (Tabla 2). Las proteínas blanco se emulsionaron en una única formulación usada en todas las vacas, que se denomina aquí, Vac-3. Brevemente, se mezclaron 300 mg de antígenos (SRP y porinas) en 250,96 ml de solución salina fisiológica. La solución de antígeno se emulsionó en 80 ml de EMULSIGEN para producir una dosis final de 1.000 \mug de proteína total a una concentración de EMULSIGEN de 22,5%, en un volumen inyectables de 2 ml. Todas las vacas en estado de lactación y fuera de la etapa de lactación recibieron una inyección intramuscular de 2 ml, mientras que los terneros de 6 meses de edad o más, recibieron una inyección intramuscular de 1 ml.

Ejemplo 6 Colecta de muestras de sangre y heces y conteo de células somáticas

Se colectaron muestras de sangre a partir de veinte vacas en estado de lactación en el día inicial de la inmunización (día 0) y, nuevamente, en las semanas 3, 7, 11, 21, 35, y 44 después de la inmunización inicial. Además, se tomaron muestras fecales de todas las vacas en estado de lactación el día de la inmunización (día 0) y, nuevamente, en las semanas 3, 7, 11, 21, 35 y 44 después de la inmunización (Tabla 2).

Toda la sangre se colectó en tubos de colecta vacutainer de 13 \times 75 mm, estériles, marca SST No. 369783, (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ). Después de la coagulación, los tubos con sangre se centrifugaron a 800 x g durante 30 minutos y se congelaron a -20ºC hasta el momento del análisis.

Las muestras individuales de heces se tomaron de manera aséptica, mediante la extracción rectal, utilizando guantes estériles hasta el hombro, y se colocaron en sacos plásticos con cierre, estériles. Se colocaron diez gramos de heces de cada muestra en 90 ml de caldo de tetrationato (Difco), y se incubaron durante 24 horas a 37ºC. Cada muestra se colocó en sulfito de bismuto, verde brillante y agar XLD (Difco), como medio selectivo diferencial para la identificación de la presencia de Salmonella. En todos los aislamientos sospechosos se confirmó la presencia de Salmonella mediante el uso de antisuero Salmonella O (poli A-I y Vi) con una prueba de aglutinación en lámina. Brevemente, se toma una colonia de un plato, y se mezcla con una gota de antisuero poli O. Este se mezcla durante 30 segundos, y si aglutina, se confirma la sospecha. Los aislamientos confirmados de Salmonella se enviaron al Minnesota Poultry Testing Laboratory (MPTL), Willmar, MN, para el serotipado.

Los conteos de células somáticas por mililitro de leche, los llevó a cabo la Dairy Herd Improvement Association (DHIA, Buffalo, MN) mediante métodos estándar. Las células somáticas que se contaron fueron los glóbulos blancos presentes en la leche.

Ejemplo 7 Ensayo de inmunoabsorción ligada a enzima (ELISA)

Un Ensayo de inmunoabsorción ligada a enzima (ELISA) monitoreó la respuesta serológica a la vacuna. Los SRPs altamente conservados obtenidos a partir de Salmonella bredeney, con pesos moleculares de 89 kDa, 84 kDa, y 72 kDa se purificaron utilizando geles de poliacrilamida. Brevemente, las bandas correspondientes a los SRPs (89 kDa, 84 kDa, y 72 kDa) se cortaron de los geles no teñidos utilizando una carrilera indicadora teñida, para determinar la localización de las bandas, que se cortaron del gel original y se tiñeron. La elución de la proteína del gel macerado se llevó a cabo de acuerdo con la recomendación de los productores, utilizando un electro-eluidor, modelo 422 (Bio-Rad, Laboratories, Hercules, CA). Estas proteínas se utilizaron, entonces, como moléculas de captura en una prueba de ELISA indirecta.

Se levantó antisuero policlonal contra la composición vacunal del Ejemplo 4. Brevemente, al composición vacunal, que contenía SRPs y porinas de Salmonella bredeney se inoculó por vía subcutánea a dos terneros Holstein adultos (dosis de 2 ml con 1000 \mug de proteína total). Cada ternero recibió, en total, tres vacunaciones, separadas por 21 días. Catorce días después de la tercera vacunación se colectaron 20 ml de sangre de la vena caudal de las vacas vacunadas. Además, se obtuvo suero control negativo (20 ml), a partir de dos vacas no vacunadas. El suero hiperinmune, y el suero negativo se obtuvieron mediante centrifugación (800 x g) de la sangre coagulada. Los sueros hiperinmune y control se absorbieron con células bacterianas enteras, muertas, de Salmonella bredeney, cultivadas en medio con hierro (BHI que contenía 200 \mug de cloruro férrico), durante 1 hora, a 4ºC.

Se precipitaron 20 mililitros de los sueros negativo y control durante 6 horas, usando sulfato de amonio (60% de saturación), disuelto en tampón fosfato a 0,02 M, de pH 7,0 a 4ºC. Se colectó el precipitado mediante centrifugación a 8000 x g durante veinte minutos. El precipitado se resuspendió en 20 ml de tampón fosfato a 50 mM, de pH 7,2, y se dializó utilizando un tubo de diálisis MWCO 100.000 (Pierce, Rockford, IL) contra tampón a 0,02 M, de pH 7,2. El material dializado se concentró 10 veces utilizando un equipo de ultrafiltración Diaflo, modelo 8200 con una membrana MWCO 50.000 (Amicon). Los dializados positivos y del control negativo se alicuotaron en muestras de 100 \mul y se congelaron a -90ºC.

Las concentraciones de trabajo óptimas del SRP y el conjugado se determinaron mediante varias titulaciones en cuadrículas utilizando los dializados positivo y del control negativo. A continuación se estableció una curva de predicción para calcular los títulos del ELISA de SRP a una dilución de 1:500. Todas las pruebas posteriores se realizaron a una única dilución del suero (1:500) y los títulos de SRP se calcularon a partir del promedio de los valores de las pruebas de absorbancia duplicadas.

Se llevó a cabo el ELISA mediante la adición de 100 \mul de SRP diluidos de Salmonella en tampón carbonato 0,05 M (pH 9,6) a cada uno de los pozos de una placa de microtitulación de 96 pozos, de fondo plano, fácil de lavar (Corning, Corning, NY). Luego de la incubación durante toda la noche a 4ºC, se eliminó el exceso de SRP y se lavó la placa. Todas las etapas posteriores de lavado se realizaron tres veces con solución salina tamponeada con fosfato (pH 7,4) con 0,05% de Tween-20. Se bloquearon las placas durante una hora a 37ºC, con 4% de gelatina de pez (Sigma) en PBS y luego se lavaron.

Se ensayaron muestras de suero del Ejemplo 4 duplicadas, en paralelo, en diluciones únicas, utilizando 100 \mul/pozo y se incubaron durante 45 minutos a 37ºC. Las primeras dos filas de cada placa contenían las muestras de los controles positivos y negativos, mientras que el resto de las placas se utilizó para las muestras ensayadas. La placa se incubó durante 45 minutos a 37ºC mientras se agitaba a 200 rpm. Después de lavar, se añadió a cada pozo 100 \mul de conjugado de fosfatasa alcalina (Monoclonal anti-bovine IgG clone BG-18, Sigma) a una dilución de 1:15.000. Después de la incubación durante 45 minutos a 37ºC, las placas se lavaron y se añadió 100 \mul de sustrato p-nitrofenil fosfato (pNPP) (Sigma), a cada pozo. Se permitió la reacción del sustrato durante 2 horas a 37ºC mientras se agitaba a 100 rpm. Se terminó la reacción mediante la adición de 25 \mul de NaOH 3N. Se leyó la absorbancia a 405 nm.

Resultados de los Ejemplos 3-7

La Figura 1 muestra la historia acumulativa de la prevalencia de Salmonella en las deposiciones comparada con la respuesta serológica a la vacunación de las vacas en estado de lactación. Como se describió en el Ejemplo 5, se vacunó al grupo el día de la inmunización inicial (Día 0) y, nuevamente, a las 5 y 19 semanas después de la primera vacunación. Se tomaron muestras de sangre y de heces de todas las vacas en estado de lactación en las semanas 0, 3, 7, 11, 21, 35, y 44. Brevemente, las composiciones inmunizantes consistentes en Vac-1 y Vac-2 se les aplicaron a todas las vacas (N=125) del grupo en el día de la inmunización inicial, día 0 (Tabla 1). Solo se monitorearon las vacas en estado de lactación a lo largo de la prueba experimental. A todas las vacas en estado de lactación se les administró por vía subcutánea 2 ml de Vac-1. La prevalencia de Salmonella en las deposiciones en las muestras fecales tomadas a las vacas en estado de lactación (N=55) en el día 0 revelaron un rendimiento de aislamiento de 85,4% (Figura 1). Se serotiparon todos los aislamientos de Salmonella y se encontró que correspondían a Salmonella bredeney.

Durante este mismo período, el conteo de células somáticas determinado mediante DHIA fue de 1.492.000 células por mililitro de leche (Tabla 3), el más elevado de que se tenga noticia en la historia de la granja.

TABLA 3

Conteo de células somáticas (SCC)^{1} de vacas individuales antes y después de la vacunación
SCC antes/después de la vacunación^{2}	SCC antes/después de la vacunación
ID de la	SCC X 1000	ID de la	SCC X 1000	ID de la	SCC X 1000	ID de la	SCC X 1000
vaca		vaca		vaca		vaca
1	1980/3930	14	570/680	27	970/160	40	40/50
2	9990/3870	15	63/520	28	1150/130	41	140/50
3	1230/3370	16	460/460	29	140/120	42	210/40
4	1240/2090	17	9990/450	30	50/120	43	70/40
5	4390/1980	18	3890/360	31	660/120	44	80/30
6	5510/1660	19	160/350	32	450/1120	45	90/30
7	2090/1550	20	570/290	33	380/110	46	110/30
8	870/1170	21	7070/250	34	220/100	47	230/30
9	3020/960	22	210/240	35	350/100	48	3200/20
10	2620/950	23	230/220	36	70/90	49	20/20
11	1040/780	24	50/210	37	890/60	50	50/20
12	1330/720	25	190/190	38	700/60	51	40/10
13	120/720	26	540/180	39	100/50	Promedio SCC 1492/585
^{1} Número de células somáticas por mililitro de leche.
^{2} \begin{minipage}[t]{155mm} Las muestras tomadas antes de la vacunación se tomaron en julio (año 2, inmediatamente antes de la vacunación), y las muestras tomadas después de la vacunación (año 2) se tomaron en agosto (P=0,0068).\end{minipage}

Tres semanas después de la vacunación, las muestras fecales tomadas a todas las vacas en estado de lactación (N=54) no mostraron cambios significativos en la prevalencia de Salmonella en las deposiciones, la cual permaneció en 87%, (Figura 1). No obstante, el conteo de células somáticas cayó a 585.000 células por mililitro. Esto se representa gráfica y numéricamente en la Figura 2 y en la tabla 3, que muestra el conteo de células somáticas DHIA de vacas individuales antes y después de la primera vacunación. Hubo una caída de 61,0% en el conteo de células somáticas con un grado de significación de P=0,0068. Esta afectación altamente significativa se registró sin mejoras en el manejo y/o cambios ambientales. Un año después de la primera vacunación la media acumulativa de 12 meses en el conteo de células somáticas fue de 417.000 células por mililitro de leche. En contraste con esto, el promedio de los 12 meses anteriores a la vacunación fue de 660.000 células por mililitro de leche. Esto representa un 37% de disminución en las células somáticas después de la vacunación. Resulta interesante especular que, debido a la naturaleza conservada de estas proteínas, las mismas indujeron un grado de protección cruzada contra otras bacterias gram negativas o gram positivas responsables de la mastitis contagiosa y/o ambiental.

Se examinaron los lugares de las inyecciones de todos los terneros y las vacas en estado de lactación, 14 días después de la primera vacunación. Ninguna de las vacas examinadas mostró ninguna reacción adversa del tejido en el lugar de la inyección mediante el examen físico. Además, no se produjo una pérdida apreciable de leche en la producción debido a la vacunación.

Cinco semanas después de la primera vacunación al grupo se le administró un estimulante (Tabla 2). Catorce días después de la segunda vacunación (Semana 7) se registró una caída de 21,2% en la prevalencia de Salmonella en las deposiciones, con un número de aislamientos positivos de 35, entre el total de 54 muestras, o 64,8% del grupo positivo para Salmonella en contraste con una prevalencia previa de 86% (Figura 1). El rendimiento de los aislamientos continuó disminuyendo y, hacia la oncena semana, la prevalencia en las deposiciones era de 47,1%, o 24 aislamientos positivos de 51 vacas muestreadas. Esto representó una reducción de 52,9% en el número de aislamientos positivos de Salmonella. Los exámenes físicos de los lugares de las inyecciones no mostraron reacciones adversas de Iso tejidos en ninguno de los terneros y/o las vacas en estado de lactación examinadas. Sin embargo, la segunda vacunación tuvo como resultado una disminución de aproximadamente 2% en la producción de leche, que comenzó 24 horas después de la vacunación, pero continuó durante menos de dos días. En este punto, los datos muestran que las composiciones vacunales fueron compatibles con los tejidos y redundaron en pérdidas mínimas de la producción de leche. Además, Iso datos indicaron una correlación directa entre la disminución de la prevalencia de Salmonella en las deposiciones y el incremento de la respuesta de anticuerpos a SRP.

Para estimular una mayor respuesta de anticuerpos a SRP, se vacunó al grupo una tercera vez, catorce semanas después de la segunda vacunación (Semana 19, Tabla 2). La concentración de proteínas de la vacuna permaneció igual (1000 \mug/2 cc de dosis), pero el adyuvante (EMULSIGEN) se incrementó a 22,5% vol/vol. Se tomaron muestras de sangre y heces 14 días después de la vacunación (Semana 21, Tabla 2). La prevalencia de Salmonella en las deposiciones disminuyó al 45%, o sea, solo 28 vacas de 61 muestreadas fueron positivas para Salmonella (Figura 1). Todas estas muestras se serotiparon, y se encontró que se trataba de Salmonella bredeney. En este mismo período, se examinaron los lugares de las inyecciones de cada vaca en estado de lactación, y menos de 5% desarrollaron un granuloma que medía aproximadamente 1 centímetro X 1 centímetro. Estos granulomas se reabsorbieron en los 21 días siguientes a la inyección.

En la Figura 3 se muestran las libras de leche de la producción acumulativa antes y después de la tercera vacunación. Después de la tercera vacunación la caída de la producción de leche registró un mínimo de 6,9%. Esta pérdida en la producción fue, aparentemente, transiente en el grupo, y duró menos de cuatro días, en cuyo momento el grupo recuperó su producción normal. De hecho, después de la tercera vacunación, la producción de leche en la parte restante del mes se incrementó en 1,2% con respecto a la producción antes de la vacunación (Figura 3). Este incremento en la producción de leche fue consistente y comenzó inmediatamente después de la primera vacunación. Por ejemplo, el promedio DHIA del grupo para 45 vacas en el mes de diciembre (año 1, antes de la vacunación) fue de 16.787 libras de leche (Figura 4 y tabla 4). La salud general y el desempeño general del grupo se incrementaron después de cada vacunación. Catorce días después de la tercera vacunación (diciembre) el promedio del grupo para 53 vacas fue de 18.047 libras de leche producidas (Figura 4 y Tabla 3). Esto representó un incremento del 7,0% por vaca o un promedio de 1.260 libras anuales. Además, la producción anual de leche un año después de la vacunación fue de 965.472 libras, en comparación con 740.855 libras producidas antes de la vacunación. Esto representó un incremento del 6% en el total de libras de leche producidas.

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TABLA 4

Resumen anual del grupo a partir del inicio del primer aislamiento de Salmonella
Promedio DHI de todo el grupo
Año muestreado (año 1)	Año muestreado (año 2)	Año muestreado (año 3)
Fecha^{1}	DIM^{2}	Ordeñadas^{3}	Lbs^{4}	Fecha	DIM	Ordeñadas	Lbs	Fecha	DIM	Ordeñadas	Lbs
Ene	183	49	15563	Ene	201	50	16535	Ene	241	55	18703
Feb	170	58	15795	Feb	171	57	16258	Feb	260	54	18776
Mar	173	56	15725	Mar	155	62	16310	Mar	251	54	18516
Abr	192	53	15643	Abr	163	60	16409	Abr	227	55	18261
May	217	51	15584	May	157	63	16421	May	220	52	18068
Jun	229	49	15467	Jun	165	64	16574
Jul	244	51	15503	Jul	161	56	16849
Ago	280	51	15841	Ago	182	56	17080
N/D	N/D	N/D	N/D	N/D	207	56	17329
Oct	300	48	16315	Oct	231	54	17570
Nov	291	48	16606	Nov	N/D	N/D	N/D
Dic	264	45	16787	Dic	53	53	18047
^{1} \begin{minipage}[t]{155mm} Fecha: año 1, año anterior a la vacunación; año 2, año durante el cual las vacas recibieron la vacunación; año 3, año después de la vacunación de las vacas.\end{minipage}
^{2} DIM, días en leche.
^{3} Ordeñadas, número de vacas ordeñadas durante el período.
^{4} Lbs., total de libras de leche producidas durante el período.

La Figura 5 muestra el promedio del costo mensual por concepto de uso de antibióticos, calculado 12 meses después de la primera vacunación, en comparación con los 12 meses anteriores a la vacunación. El costo mensual promedio en uso de antibióticos antes de la vacunación, o durante el curso de la Salmonellosis fue \textdollar284,65, en comparación con \textdollar144,05 después de la vacunación. Esto representó un 51% de reducción en el costo de antibióticos.

Al comienzo del primer aislamiento de Salmonella bredeney (enero, año 1), según el diagnóstico clínico de este grupo, aproximadamente 21 vacas adultas y 36 terneros murieron de Salmonellosis clínica. Esta mortalidad tuvo lugar a pesar de la vacunación del grupo tres veces en el período de un año, utilizando una vacuna comercial de célula completa de Salmonella dublin y Salmonella typhimurium. El grupo se encontraba al día en todas las vacunas virales y bacterianas de rutina. Después de la primera vacunación con la composición descrita en el Ejemplo 3, la mortalidad y la morbilidad prácticamente cesaron. En el período de los seis meses posteriores a la primera vacunación, solo murieron tres terneros. Ninguno de los terneros muertos durante este período tuvo un diagnóstico de Salmonella. No ha habido ninguna mortalidad ni entre las vacas fuera de la etapa de lactación (secas), ni entre las vacas en estado de lactación y/o los terneros en este grupo, desde la primera vacunación contra Salmonella. A partir de estos datos parecería que la vacuna indujo un alto grado de inmunidad humoral contra los retos de campo, al tiempo que proporcionó inmunidad pasiva a los terneros recién nacidos. También resultó evidente en este estudio de campo, que, a medida que la respuesta serológica a la vacunación se incrementaba, disminuía la prevalencia de Salmonella en las deposiciones. Resulta interesante destacar que el título de anticuerpos continuaba incrementándose 25 semanas después de la tercera vacunación. Este continuo incremento del título podía deberse a los retos clínicos de campo por parte de Salmonella u otra bacteria gram negativa que expresase estas proteínas altamente conservadas durante las infecciones subclínicas.

La vacunación mejoró el estado general de salud y el estado de desempeño del grupo, como se observó por la disminución de la mortalidad, la disminución del conteo de células somáticas y el incremento en la producción de leche. También mejoró la salud de los terneros, ya que los mismos se comportaron con más vivacidad al nacer, consumieron el calostro de manera agresiva y no desarrollaron ningún síntoma significativo de diarrea. Además, se observó un decrecimiento de la metritis clínica en las vacas nuevas que se reincorporaron a la producción después del destete. Estas vacas se vacunaron antes de comenzar la etapa de lactación, y se les dio la dosis de estimulación antes del destete. Aparentemente, la vacunación disminuyó la incidencia de la metritis clínica durante el período posterior al destete. Esto se observó, primeramente, mediante la toma de muestras fecales para el aislamiento de Salmonella, en que la palpación rectal y la uterina pudieron realizarse al mismo tiempo. La incidencia de la metritis decreció dramáticamente después de la vacunación, en comparación con años anteriores.

La composición vacunal demostró ser muy compatible con los tejidos. Ninguna de las vacas vacunadas mostró ninguna reacción adversa del tejido en el lugar de la inyección, no ninguna señal física de estrés, tal como depresión, letargia, pérdida de la producción de leche, etc. La compatibilidad de la composición vacunal probablemente se deba a la pureza y la ausencia de lipopolisacáridos (LPS) contaminantes. Se ha mostrado que los LPS son responsables de gran parte de las reacciones de los tejidos en las vacunas convencionales, tales como las de célula entera. Se encontró que la presencia de LPS en el antígeno patrón del Ejemplo 3 era negativa, según lo arrojado por el ensayo de lisado de amebocitos de Limulus (SIGMA, Chemical Company, St. Louis MO).

Ejemplo 8 El efecto de la vacunación de vacas primerizas y vacas en la primera etapa de lactación

Una vacuna subunitaria, consistente en SRPs y porinas, derivadas de Salmonella dublin (denominación de la cepa MS010207) y Salmonella typhimurium (denominación de la cepa MS010427) se administró a dos grupos de vacas en estado de lactación en un estudio de campo controlado dentro de una gran masa de ganado productor de leche. El ganado comprendía 500 vacas separadas en cinco corrales de pasto libre (100 vacas/corral), según los días de producción de leche o período de lactación. Se seleccionaron dos grupos de vacas para el estudio: vacas recién paridas (de 30-90 días postparto) y vacas de elevada producción (vacas en el primer período de lactación). Las vacas recibieron dos vacunaciones subcutáneas con 28 días de separación una de la otra. La prueba experimental analizó la seguridad de la composición inmunizante, sobre la base de la reactividad del tejido al material inyectado en el lugar de la inyección, el efecto de la vacunación sobre la producción de leche, la prevalencia de Salmonella y el conteo de células somáticas entre vacas vacunadas y no vacunadas. Se colectaron los datos acerca del desempeño y el estado fisiológico de las vacas individuales mediante un sistema electrónico integrado de identificación de las vacas.

Preparación de una composición inmunizante a partir de Salmonella dublin y Salmonella typhimurium

Se preparó la composición inmunizante como se describe en el Ejemplo 3, con las modificaciones siguientes. Se colectaron tres SRPs de alto peso molecular, a aproximadamente 89 kDa, 84 kDa y 72 kDa, y porinas en el rango de 38-39 kDa a partir de cada uno de los dos aislamientos. Las IRPs de más bajo peso molecular (37 kDa, 32 kDa y 29 kDa) expresadas por S. bredeney bajo las condiciones de restricción de hierro del Ejemplo 3 tuvieron baja expresión en S. dublin y/o S. typhimurium y no quedaron presentes en el patrón final de antígeno de acuerdo a los resultados de un SDS-PAGE al 10%. Sin embargo, el perfil de bandas superior (89 kDa, 84 kDa y 72 kDa) de los dos aislamientos fue idéntico al de S. bredeney del Ejemplo 3. La composición inmunizante consistía en concentraciones iguales de SRPs de S. dublin y S. typhimurium, de manera que la dosis total era de 1000 \mug, o sea, 500 \mug de cada aislamiento. La solución de antígeno se emulsionó en EMULSIGEN (22,5% vol/vol), como se describió anteriormente en el Ejemplo 3.

Prevacunación

Se determinó el estado de exposición a Salmonella del grupo treinta días antes de la vacunación. Se colectaron las muestras fecales a partir de cada vaca individual, como se describe en el Ejemplo 6. El número total de muestras colectadas fue 144 (60 de vacas recién paridas y 84 de vacas productoras de leche). Se encontró Salmonella en 50% de las vacas recién paridas y 27% de las vacas en la primera etapa de lactación. Se encontraron tres serotipos; S. anatum, S. uganda y S. meleagridis; no se detectaron S. dublin ni S. typhimurium. Se encontró que los perfiles de SRPs y porinas de estos aislamientos eran idénticos a las bandas de S. dublin, S. typhimurium y S. bredeney. Dada la elevada incidencia de S. dublin y S. typhimurium en la especie bovina y la naturaleza conservada de estas proteínas se decidió utilizar estos antígenos en la composición vacunal para obtener mayor claridad acerca de la naturaleza de la protección cruzada de las mismas.

Inmunización de vacas recién paridas y vacas en la primera etapa de lactación

Se vacunó al cincuenta porciento de las vacas en la primera etapa de lactación (42 de 84) y al 50% de las vacas recién paridas (30 de 60). Las vacas restantes de cada grupo se mantuvieron como controles no vacunados. Brevemente, se colocaron vacas seleccionadas al azar de cada grupo en un gran poste de sujección. A cada vaca se le aplicó una inyección intramuscular de 2 ml de la vacuna. Además, se tomaron muestras fecales de todas las vacas de cada grupo mediante extracción rectal en el momento de la primera vacunación. Todos los aislamientos sospechosos se serotiparon como se describió en el Ejemplo 6. Se determinó el conteo de células somáticas y la producción de leche de cada vaca, con anterioridad a la primera vacunación, con el objetivo de establecer una tendencia histórica de comportamiento. Se monitoreó la producción de leche de cada vaca individual, diariamente, así como el estado de salud general y las reacciones adversas a la vacunación. La DHIA monitoreó mensualmente el conteo de células somáticas. A las vacas vacunadas se les administró una segunda vacunación (Estimulación) cuatro semanas después de la primera vacunación. Las vacas de prueba vacunadas y no vacunadas del grupo se identificaron mediante marcas en las orejas y se monitoreó la producción de leche mediante un sistema electrónico de identificación de las vacas que utilizaba un trasmisor, colgado de una cuerda del pescuezo de las vacas. Se monitoreó el desempeño general de las vacas vacunadas y no vacunadas a través de todo el estudio experimental.

Resultados

Se examinó el lugar de la inyección de las vacas vacunadas 14 días después de la primera y la segunda vacunación. Ninguna de las vacas vacunadas mostró ninguna reacción adversa del tejido a la vacuna en el lugar de la inyección. No hubo ninguna inflamación visible ni nódulo definido en ninguna de las vacas examinadas. Además, las observaciones diarias de estas vacas no mostraron cambios visibles en el comportamiento y/o la actividad.

Las muestras fecales tomadas a partir de ambos grupos el día de la primera vacunación revelaron una disminución significativa en la prevalencia de Salmonella en las deposiciones, en comparación con muestras tomadas treinta días antes de la vacunación. El rendimiento del aislamiento en el grupo de vacas recién paridas disminuyó al 27%, mientras que, en las vacas en la primera etapa de lactación había disminuido al 8%. De hecho, el rendimiento del aislamiento de Salmonella en la segunda vacunación no mostró diferencias entre grupos. Solo se colectaron en ambos grupos cinco aislamientos de Salmonella, tres entre las vacas recién paridas y 2 a partir del grupo de vacas en la primera etapa de lactación. No hubo diferencias en la prevalencia de Salmonella en las deposiciones entre las vacas vacunadas y no vacunadas en ninguno de los grupos.

Se monitoreó el rendimiento de leche por vaca diariamente en ambos grupos. La Figura 6 muestra los promedios mensuales de producción de leche entre las vacas vacunadas y las vacas no vacunadas en la primera etapa de lactación. No hubo diferencias estadísticamente significativas en el rendimiento de leche de la primera vacunación (semana 1) a la segunda vacunación (semana 2) en comparación con las vacas no vacunadas (P=0,435), y desde la segunda vacunación (semana 5) hasta la decimosexta semana de producción (P=0,07) como se representa gráficamente en la Figura 6. Sin embargo, en el grupo de vacas recién paridas, la producción de leche se incrementó de manera estadísticamente significativa en las vacas vacunadas después de cada vacunación, en comparación con el grupo no vacunado (Figura 7). El grado de significación desde la primera vacunación hasta la segunda vacunación fue P=0,06, y se incrementó dramáticamente desde la segunda vacunación hasta la decimosexta semana de producción (P=0,000000067). Dieciséis semanas después de la primera vacunación, las libras de leche promedio producidas por vaca en el grupo vacunado era 60,3 libras, en comparación con 56,4 libras en los controles no vacunados. Esto representó un 6,5% de incremento en la producción de leche sobre el grupo control, o una ventaja de 3,9 libras/vaca.

El conteo de células somáticas también sufrió los efectos positivos de la vacunación, tanto en las vacas recién paridas, como en las vacas en la primera etapa de lactación. La Figura 8 muestra el promedio mensual (DHIA) de conteos de células somáticas entre las vacas en la primera etapa de lactación vacunadas y no vacunadas, comenzando a partir de la primera vacunación, hasta las 16 semanas de producción. Los datos muestran que el grupo vacunado tuvo un 30,0% de diferencia en el conteo promedio de células somáticas, con un grado de significación de P=0,036, en comparación con el grupo control no vacunado. Esta reducción en el conteo de células somáticas acusó una diferencia más dramática en el caso de las vacas recién paridas vacunadas, como se ilustra en la Figura 9. Los datos muestran que el nivel de células somáticas disminuyó en 58,8% (P=0,02) en las vacas vacunadas, en comparación con el grupo no vacunado.

La diferencia en el desempeño entre las vacas recién paridas y las vacas en la primera etapa de lactación pueden haberse debido a diferencias en el estado de salud de las vacas. Por lo regular, las vacas recién paridas se encuentran bajo un nivel de estrés mayor, como consecuencia de su estado fisiológico, que las otras vacas en producción, lo que las predispone a una mayor amenaza por parte de las enfermedades. El estrés, con frecuencia, puede elevar la propensión a una dolencia que puede tener efectos sobre la salud y el desempeño generales del animal. Resulta interesante resaltar que no hubo diferencias estadísticamente significativas en la producción de leche entre las vacas vacunadas y no vacunadas en la primera etapa de lactación, por el contrario de lo que sucedió con las vacas recién paridas vacunadas. Aparentemente, la vacuna tuvo un efecto positivo sobre el estado de salud de las vacas recién paridas vacunadas, como se puede apreciar a través del incremento en la producción de leche. Este desempeño mejorado, aparentemente no estaba relacionado con la dolencia clínica provocada por la Salmonella, dado que el rendimiento del aislamiento disminuyó de manera natural y no hubo diferencias en la prevalencia entre vacas vacunadas y no vacunadas. Además, la composición vacunal contenía los inmunógenos derivados de Salmonella dublin y Salmonella typhimurium y no a partir de los aislamientos encontrados en el grupo. Dada la naturaleza conservada de estas proteínas entre las bacterias gram negativas y gram positivas resulta altamente probable que la vacuna indujese un grado de protección cruzada contra otras bacterias que expresasen estas proteínas, permitiendo un mejor desempeño del
animal.

Ejemplo 9 Inmunización de novillos de pie de cría para el control de Salmonella, Ensayo 1

Un pie de cría comercial, con una historia de Salmonellosis se utilizó en un estudio de campo controlado para evaluar la eficacia de una composición inmunizante que contenía SRPs y porinas obtenidas a partir de Salmonella dublin. El ensayo experimental examinó la seguridad de la composición inmunizante basada en la reactividad de los tejidos al material inyectado, en el lugar de la inyección, la respuesta serológica a la vacunación y la prevalencia de Salmonella en las deposiciones.

El pie de cría, consistente en 500 novillos Holstein se separó en instalaciones de cría en base a la edad y el peso de los novillos. El ensayo experimental se inició con terneros pequeños (N=150) con un peso promedio de aproximadamente 150 libras. Se distribuyeron los novillos al azar en diez grupos separados (1-10), de manera que cada grupo contenía 15 novillos. Se utilizaron marcas de oreja para identificar los novillos de cada grupo. Se determinó el estado de la exposición a Salmonella antes de la primera vacunación. Se tomaron muestras fecales individuales da todos los novillos para determinar la prevalencia de Salmonella en las deposiciones. Se procesaron las muestras como se describió con anterioridad en el Ejemplo 6. Se obtuvo Salmonella de 56% de las 150 muestras tomadas. Se identificaron tres serotipos diferentes: S. dublin, S. uganda y S. muenster. El serotipo predominante fue Salmonella dublin, que se encontró en el grupo con 67% de representatividad.

Se identificaron los novillos positivos para Salmonella de cada grupo y se distribuyeron ante cuatro grupos (P3, P4, P5, y P6), de manera que cada grupo contenía la misma cantidad de novillos positivos y negativos. Por tanto, cada grupo contenía 8 novillos positivos para Salmonella y 7 novillos negativos para Salmonella, de manera que el 53,3% de cada grupo era positivo para Salmonella.

Se preparó la composición inmunizante a partir de los SRPs de S. dublin, de peso molecular de 89 kDa, 84 kDa, y 72 kDa, y porinas con pesos moleculares de 38-39 kDa. Las proteínas blanco se emulsionaron en EMULSIGEN (22,5% vol/vol) para proporcionar una dosis de proteína total de 1000 \mug en un volumen inyectable de 2 ml, como se describió anteriormente.

Los novillos de los grupos 3 y 5 recibieron dos inyecciones intramusculares separadas por 28 días. Los novillos en los grupos 4 y 6 permanecieron como controles no vacunados. Se tomó sangre de 12 novillos de cada grupo el día 0 (Primera vacunación) y, de nuevo, a las 2, 4, y 6 semanas posteriores, para monitorear la respuesta serológica a la vacunación. Se colectaron muestras fecales individuales a partir de cada novillo, como se describió en el Ejemplo 6, el día de la primera vacunación y, de nuevo, a las 2 y 6 semanas.

Se examinaron los lugares de las inyecciones de cada novillo vacunado 14 días después de la primera y la segunda vacunación. Ninguno de los novillos vacunados mostró ninguna reacción adversa del tejido en el lugar de la inyección. Además, Las observaciones diarias de estos novillos no mostraron cambios visibles en el comportamiento y/o la actividad en comparación con los grupos no vacunados. La Figura 10 muestra la respuesta serológica de novillos vacunados en comparación con los controles no vacunados, evaluadas mediante el ELISA del ejemplo 7. La vacuna indujo elevados títulos de anticuerpos a los SRPs después de cada vacunación. Se registró una elevación del título después de la primera vacunación, que declinó dos semanas después, pero continuó incrementándose después de la segunda vacunación, lo que demuestra claramente que se indujo una respuesta secundaria.

La Tabla 5 muestra la prevalencia de Salmonella en las deposiciones entre los grupos vacunado y no vacunado. Las muestras fecales tomadas a cada novillo el día de la primera vacunación (semana 0) demostraron que hubo una disminución significativa en la prevalencia de Salmonella en las deposiciones en todos los grupos experimentales, en comparación con las muestras tomadas antes de la vacunación (Tabla 5). La disminución de la prevalencia en las deposiciones continuó a todo lo largo de la duración del período de muestreo en todos los grupos experimentales. Sin embargo, la prevalencia en las deposiciones 14 días después de la última vacunación mostró diferencias significativas entre el grupo vacunado en comparación con los controles no vacunados. Hubo un porcentaje mayor de novillos positivos a Salmonella (29%) en el grupo 6 en comparación con los grupos no vacunados, que mostraron solo 6,7%.

TABLA 5

Prevalencia de Salmonella en las deposiciones entre grupos vacunados y no vacunados
Tiempo de muestreo	Grupo 3 Vacunado	Grupo 4 Control	Grupo 5 Vacunado	Grupo 6 Control
Prevacunación	53.3%	53.3%	53.3%	53.3%
0	33%	40%	47%	43%
2 semanas	27%	13%	13%	36%
6 semanas	6.7%	13%	6.7%	29%

Ejemplo 10 Inmunización de novillos de pie de cría para el control de Salmonella Ensayo 2

Se utilizó el pie de cría comercial del Ejemplo 9 en un estudio de campo controlado para proporcionar nuevos datos acerca de la eficacia de una composición inmunizante, consistente en SRPs y porinas obtenidas a partir de Salmonella dublin y Salmonella typhimurium. El ensayo experimental consistió en el análisis de la seguridad de la composición inmunizante, basada en la reactividad de los tejidos al material inyectado, en el lugar de la inyección, la respuesta serológica a la vacunación, y la prevalencia de Salmonella en las deposiciones.

Al concluir el experimento del Ejemplo 9, se limpiaron, sanearon y desinfectaron las instalaciones, y se dejaron vacías durante dos semanas con anterioridad a la llegada de un nuevo grupo de novillos. Se tomaron muestras ambientales (N=2) de cada grupo para evaluar la incidencia de Salmonella. Se cultivaron las cepas como se describió anteriormente en el Ejemplo 6. Se encontró que todas las muestras ambientales eran negativas para Salmonella. Ciento cincuenta (N=150) novillos Holstein de 4 meses, con un peso promedio de 300 libras se transportaron en camión desde Idaho. Después de su llegada, los novillos se descargaron del camión, se les marcaron las orejas para su identificación y se distribuyeron aleatoriamente en diez grupos separados (1-10), de manera que cada grupo estaba constituido por 15 novillos. Una semana después de su llegada, se determinó el estado de exposición a Salmonella, antes de efectuar la primera vacunación. Se tomaron muestras fecales individuales de todos los novillos para determinar la prevalencia de Salmonella en las deposiciones. Se procesaron las muestras como se describió anteriormente en el Ejemplo 6. Se encontró que las 150 muestras tomadas eran negativas para Salmonella. En base a esta información, se preparó una composición vacunal a partir de dos aislamientos de Salmonella (S. dublin (denominación de la cepa, MS010207) y Salmonella typhimurium (denominación de la cepa, MS010427)).

Se prepararon las composiciones inmunizantes a partir de los SRPs de S. dublin y S. typhimurium con pesos moleculares en el rango de 89 kDa, 84 kDa, 72 kDa y porinas con pesos moleculares en el rango de 38-39 kDa. Se absorbieron las proteínas (500 \mug de cada aislamiento) en hidróxido de aluminio (25% vol/vol) para proporcionar una dosis total de proteínas de 1000 \mug en un volumen inyectable de 2 ml.

Como anteriormente, los novillos de los grupos 3 y 5 recibieron dos vacunaciones intramoleculares, separadas 28 días una de otra. Los novillos de los grupos 4 y 6 permanecieron como controles no vacunados. Se tomó sangre de 12 novillos de cada grupo en el día 0 (primera vacunación) y, nuevamente, a las 2, 4 y 6 semanas posteriores, para monitorear la respuesta serológica a la vacunación. Se colectaron muestras fecales individuales de cada novillo, como se describe en el Ejemplo 6, el día de la primera vacunación y, nuevamente, a las 2 y 6 semanas.

Se examinaron, como antes, los lugares de la inyección de cada novillo vacunado, catorce días después de la primera y segunda vacunaciones. Ninguno de los novillos vacunados mostró ninguna reacción adversa del tejido en el lugar de la inyección, usando hidróxido de aluminio como adyuvante. Además, las observaciones diarias de estos novillos no mostraron cambios visibles de comportamiento y/o actividad, en comparación con los grupos no vacunados. Se determinó la respuesta serológica a la vacuna como se ha descrito en el presente documento, y se comparó con los controles no vacunados. La vacuna indujo elevados títulos de anticuerpos para SRPs después de cada vacunación, que fueron comparables a los del Ejemplo 9. Hubo un incremento del título después de la primera vacunación, que disminuyó dos semanas después, pero continuó incrementándose después de la segunda vacunación.

Se tomaron muestras fecales de todos los novillos en el momento de la primera vacunación y, nuevamente, a las 2 y 6 semanas después de la vacunación. No se aisló Salmonella a partir de ninguna de las muestras tomadas durante el período de muestreo. Además, las muestras ambientales (N=2) tomadas a partir de cada grupo durante el período de 6 semanas, fueron negativas para Salmonella.

Nueve semanas después de la primera vacunación se pesaron por separado los novillos de los grupos vacunados y los grupos control. El peso promedio de los novillos de los grupos control fue de 730,5 Ibs (Grupo 4) y 745, 6 Ibs (Grupo 6) (Tabla 6) con una promedio de peso entre los dos grupos de 738,0 Ibs. Por el contrario, el peso promedio de los novillos vacunados fue de 767,7 Ibs (Grupo 3) y 761,8 Ibs (Grupo 5) (Tabla 6) con un promedio de peso combinado de 764,8 Ibs. Hubo una ventaja de 26,7 libras en los novillos vacunados en comparación con los novillos de los grupos no vacunados, con un grado de significación de P=0,018. Esta ganancia de peso mejorada aparentemente no estuvo relacionada con la enfermedad clínica causada por Salmonella, dado que dicho organismo no se detectó en ninguno de los novillos examinados. Se cree que la naturaleza conservada de las proteínas presentes en la composición vacunal indujeron un grado de protección cruzada contra otras bacterias que expresan estas proteínas, suavizando enfermedades subclínicas, y permitiendo al animal un mejor desempeño, como se aprecia a partir de las diferencias de peso entre los dos grupos.

TABLA 6

Comparación de los pesos individuales entre los novillos vacunados y no vacunados,
9 semanas después de la primera vacunación
Peso de los novillos	Peso de los novillos	Peso de los novillos	Peso de los novillos
vacunados del Grupo 3,	control del Grupo 4,	vacunados del Grupo 5,	control del Grupo 6,
en libras	en libras	en libras	en libras
742	682	816	724
889	723	717	812
750	595	716	756
712	705	811	735
844	737	801	779
794	725	740	717
769	780	796	744
755	752	758	670
698	811	785	749
772	706	785	775
746	778	743	729
744	725	764	819
697	741	719	712
809	744	775	688
795	752	701	775
Media=767	Media=730.5	Media=761.8	Media=745.6
DE^{1}=52.7 CV^{2}=6.9	DE=49.7 CV=6.8	DE=37.6 CV=4.9	DE=41.9 CV=5.7
^{1} DE, desviación estándar
^{2} CV, coeficiente de variación

Ejemplo 11 Purificación de proteínas receptoras de sideróforos a partir de Staphylococcus aureus de origen humano y aviar

Se evaluaron dos aislamientos de campo de Staphylococcus aureus y tres aislamientos adicionales obtenidos a partir de la American Type Culture Collection ATCC (aislamientos 8432, 11371, y 19636) para determinar la expresión de proteínas receptoras de sideróforos. Se realizaron aislamientos de campo provenientes de pavos, extraídos de la articulación del corvejón de aves enfermas. El aislamiento ATCC 8432 también era de origen aviar, en tanto los aislamientos 11371 y 19636 eran de origen humano. Todas las bacterias se cultivaron en caldo de infusión de cerebro y corazón (BHI, Difco), en medios carentes de, y/o suplementados con, hierro. En los medios carentes de hierro, se eliminó el hierro químicamente, mediante el uso de 2'2'-dipiridil a 175 mM, mientras que los medios suplementados con hierro, contenían cloruro de hierro 200 \muM. Las bacterias se cultivaron en 10 ml de BHI durante 8 horas a 37ºC, con agitación a 400 rpm. A las 8 horas de incubación, se tomo 1,0 ml del cultivo, y se lavó en 10 volúmenes de solución salina fisiológica mediante centrifugación (10.000 x g) durante 10 minutos. Se resuspendió el precipitado en 100 microlitros (\mul) de solución salina con 1 mg de lisostafina (Sigma, St. Louis, MO), y se incubó la suspensión a 37ºC durante 2 horas. La suspensión bacteriana se centrifugó a 12.000 x g durante 1 minuto. Se colectó el sobrenadante y se centrifugó nuevamente a 20.000 x g durante 40 minutos. El precipitado bacteriano se resuspendió en 100 \mul de solución salina con tampón tris (TBS) a pH 7,4. Los precipitados bacterianos resuspendidos a partir de los diferentes aislamientos se resolvieron mediante SDS-PAGE a 12% y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa y se probaron para evaluar su reactividad cruzada con suero para los SRPs de bacterias gram negativas. Se utilizaron sueros policlonales hiperinmunes absorbidos de conejo contra SRPs purificados a partir de E. coli y/o S. typhimurium como sondas para el inmunoblot de los SRPs de S. aureus.

Los patrones de SDS-PAGE de las proteínas de los extractos de membrana externa de los aislamientos de Staphylococcus aureus mostraron diferentes patrones de expresión de SRP entre los aislamientos de campo los aislamientos ATCC. Los aislamientos de campo obtenidos a partir de pavo, cultivados bajo las condiciones de restricción de hierro presentaron cuatro proteínas con pesos moleculares entre 66-90 kDa (específicamente, 90 kDa, 84 kDa, 72 kDa y 66 kDa) y también en las regiones de aproximadamente 36 kDa, 32 kDa y 22 kDa. Los aislamientos ATCC mostraron un único SRP en el rango de 40-55 kDa (42 kDa) y en el rango de 36 kDa. Ninguno de los aislamientos ATCC mostró un SRP en la región de 66-90 kDa, incluyendo el aislamiento 8432, de origen aviar.

El análisis por Western blot de los SRPs aislados a partir de los aislamientos de campo de S. aureus se llevó a cabo mediante un ensayo que utilizaba como sonda suero levantado contra los SRPs de Salmonella (89 kDa, 84 kDa y 72 kDa) y/o E. coli (89 kDa, 84 kDa, 78 kDa, y 72 kDa). Los sueros reaccionaron fuertemente con las proteínas en el rango de 66-90 kDa, pero no con las proteínas de peso molecular menor (o sea, 36 kDa, 32 kDa y 22 kDa). Los sueros de Salmonella también reaccionaron con una proteína en el rango de 31 kDa que, aparentemente, era similar a la proteína de 31 kDa de las proteínas de transmembrana de las bacterias gram negativas.

Estos datos indican que S. aureus expresó SRPs que se encuentran en un rango de peso molecular similar que los de las bacterias gram negativas y que los anticuerpos levantados contra los SRPs de las bacterias gram negativas muestran reacción cruzada entre al menos dos familias diferentes de bacterias. Esta composición se utilizó para vacunar animales como se describió en el presente documento, y se determinó la capacidad de la composición para proteger a los animales de los retos homólogos y heterólogos, así como la capacidad de la composición para mejorar las características de desempeño del animal.

Claims

1. Una composición que comprende:

: al menos dos polipéptidos receptores de sideróforos (SRPs) aislados a partir de un microorganismo gram negativo;

: al menos dos porinas aisladas a partir de un microorganismo gram negativo; y

: lipopolisacáridos (LPS) a una concentración no mayor de aproximadamente 100 unidades de endotoxina por mililitro (EU/ml).

2. El uso de una composición que comprende:

: al menos dos SRPs aislados a partir de un microorganismo gram negativo;

: LPS a una concentración no mayor de aproximadamente 10,0 EU/ml en la producción de un medicamento para inducir la producción de anticuerpos en un animal.

3. El uso de una composición que comprende:

: al menos dos SRPs aislados a partir de un microorganismo gram negativo;

: LPS a una concentración no mayor de aproximadamente 10,0 EU/ml en la producción de un medicamento para el tratamiento de un animal productor de leche que tiene, o se encuentra en riesgo de, tener un elevado conteo de células somáticas.

4. El uso de una composición que comprende:

: al menos dos SRPs aisladas a partir de un microorganismo gram negativo;

: LPS a una concentración no mayor de aproximadamente 10,0 EU/ml en la producción de un medicamento para la reducción la deposición de un microorganismo en el tracto intestinal de un animal.

5. El uso de una composición que comprende:

: al menos dos SRPs aisladas a partir de un microorganismo gram negativo;

: al menos dos porinas aisladas a partir del microorganismo gram negativo; y

: LPS a una concentración no mayor de 10,0 EU/ml en la producción de un medicamento para el tratamiento de un animal por baja producción de leche.

6. El uso de una composición que comprende:

: al menos dos SRPs aislados a partir de un microorganismo gram negativo;

: al menos dos porinas aisladas del microorganismo gram negativo; y

: LPS a una concentración no mayor de aproximadamente 10,0 EU/ml en la producción de un medicamento para el tratamiento de la mastitis en un animal productor de leche.

7. El uso de una composición que comprende:

: al menos dos SRPs aislados a partir de un microorganismo gram negativo;

: LPS a una concentración no mayor de aproximadamente 10,0 EU/ml en la producción de un medicamento para el tratamiento de la metritis en un animal.

8. La composición de la reivindicación 1 que comprende además un portador farmacéuticamente aceptable.

9. La composición de la reivindicación 1 o el uso de cualquiera de las reivindicaciones 2, 3, 4, 5, 6 o 7 en los que el microorganismo gram negativo es un enteropatógeno, de preferencia un miembro de la familia Enterobacteriaceae, de preferencia, un miembro de la tribu Escherichieae o Salmonelleae, de preferencia, Salmonella spp. O Escherichia coli.

10. La composición de la reivindicación 1 o el uso de cualquiera de las reivindicaciones 2, 4, 5, 6 o 7 en las que las al menos dos SRPs poseen pesos moleculares entre aproximadamente 60 kDa y aproximadamente 100 kDa.

11. La composición de la reivindicación 1 o el uso de cualquiera de las reivindicaciones 2, 4, 5, 6 o 7 en las que las al menos dos porinas poseen pesos moleculares entre aproximadamente 30 kDa y aproximadamente 43 kDa.

12. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 2 ó 4, en las que el animal es un animal de compañía, un ave, un bovino, un caprino, un porcino o un ovino.

13. El uso de la reivindicación 2 en la que el animal es un bovino, y en la que el bovino presenta un fenotipo seleccionado a partir del grupo que comprende el conteo disminuido de células somáticas, incremento en la producción de leche, disminución de las deposiciones fecales y aumento de peso.

14. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 3, 4, 5, 6 o 7 en la que el animal es un bovino.

15. El uso de la reivindicación 4 en la que el microorganismo presente en el tracto intestinal del animal es un microorganismo gram negativo o un microorganismo gram positivo.

16. El uso de una composición que comprende:

: al menos cuatro SRPs aislados a partir de un microorganismo gram positivo;

: en la producción de un medicamento para la inducción de la producción de anticuerpos en un animal.

17. El uso de la reivindicación 16 en la que el microorganismo gram positivo es un miembro de la familia Micrococcaceae, de preferencia Staphylococcus aureus.

18. El uso de la reivindicación 16 en la que las al menos dos SRPs poseen pesos moleculares entre aproximadamente 60 kDa y aproximadamente 100 kDa.

19. Un método para el aislamiento de polipéptidos de membrana externa, cuyo método incluye:

: proporcionar un microorganismo gram negativo;

: destruir el microorganismo gram negativo en un tampón;

: solubilizar el microorganismo gram negativo destruido; y

: aislar moléculas del microorganismo gram negativo; en las que las moléculas aisladas incluyen polipéptidos de la membrana externa, que incluyen al menos dos SRPs y al menos dos porinas, y LPS a una concentración no mayor de aproximadamente 10,0 EU/ml.

20. Un método de acuerdo a la reivindicación 19, en el que se permite que ocurra la inhibición del microorganismo gram negativo destruido durante al menos 24 horas.

21. Un método para el aislamiento de polipéptidos de membrana externa, cuyo método incluye:

: proporcionar un microorganismo gram negativo;

: destruir el microorganismo gram negativo en un tampón;

: solubilizar el microorganismo gram negativo destruido, de preferencia por un período mayor de 24 horas, de preferencia en una solución que incluya sarcosina, en la que la proporción de sarcosina por gramo de peso del microorganismo gram negativo destruido se encuentra entre aproximadamente 0,8 gramos de sarcosina por aproximadamente 4,5 gramos de microorganismo gram negativo destruido y aproximadamente 1,2 gramos de sarcosina por aproximadamente 4,5 gramos de microorganismo gram negativo destruido; y

: aislar moléculas a partir del microorganismo gram negativo, cuyas moléculas aisladas incluyen polipéptidos de membrana externa que incluyen al menos dos SRPs y al menos dos porinas.

22. Un método para el aislamiento de polipéptidos de membrana externa, cuyo método incluye:

: proporcionar un microorganismo gram negativo;

: destruir el microorganismo gram negativo en un tampón, donde el microorganismo se presenta en el tampón a una concentración entre aproximadamente 720 gramos de microorganismo por 1.000 mililitros de tampón y aproximadamente 1.080 gramos de microorganismo por 1.000 mililitros de tampón;

: solubilizar el microorganismo gram negativo; y

: aislar las moléculas del microorganismo gram negativo, donde las moléculas aisladas incluyen polipéptidos de membrana externa que incluyen al menos dos SRPs y al menos dos porinas.

23. El método de cualquiera de las reivindicaciones 21 ó 22, donde las moléculas aisladas, además comprenden LPS a una concentración no mayor de aproximadamente 10,0 EU/ml.

24. El método de la reivindicación 22 en la solubilización incluye:

: solubilizar el microorganismo gram negativo, de preferencia durante un período mayor de aproximadamente 24 horas, de preferencia en una solución que comprende sarcosina,

: donde la proporción de sarcosina por gramo de peso de microorganismo gram negativo destruido se encuentra entre aproximadamente 0,8 gramos de sarcosina por aproximadamente 4,5 gramos de microorganismo gram negativo destruido y aproximadamente 1,2 gramos de sarcosina por aproximadamente 4,5 gramos de microorganismo gram negativo.

25. Una composición de acuerdo a la reivindicación 1 para su uso como medicamento.