ES2309343T3

ES2309343T3 - Preparacion de una proteina anticongelante.

Info

Publication number: ES2309343T3
Application number: ES03758088T
Authority: ES
Inventors: John William Unilever R & D Vlaardingen CHAPMAN; Teun Unilever R & D Vlaardingen VAN DE LAAR; Nigel Malcolm Unilever R & D Colworth LINDNER; Christiaan Unilever R & D Vlaardingen VISSER
Original assignee: Unilever NV
Current assignee: Unilever NV
Priority date: 2002-12-20
Filing date: 2003-11-03
Publication date: 2008-12-16
Anticipated expiration: 2023-11-03
Also published as: CN100383251C; AU2003274102A1; CN1729295A; EP1573017A1; WO2004057007A1; BRPI0315943B1; MY136665A; MXPA05006527A; NZ540743A; JP2006510368A; ZA200503977B; IL168654A; PT1573017E; US20070155956A1; ATE400662T1; CA2510378A1; AU2003274102B2; EP1573017B1; JP4546257B2; BR0315943A

Abstract

Un procedimiento para producir una proteína anticongelante de tipo III (AFP), comprendiendo este procedimiento la expresión en una célula huésped fúngica, que es deficiente en glicosilación de AFP de tipo III, en comparación con la cepa parental, una secuencia de un ácido nucleico que codifica la AFP, en la que la célula fúngica es una levadura que es una cepa mutante deficiente en pmt1 y/o en pmt2.

Description

Preparación de una proteína anticongelante.

Antecedentes de la invención

Las proteínas anticongelantes (AFP) son polipéptidos producidos por una amplia gama de especies, particularmente aquellas autóctonas de climas fríos, que tienen la capacidad de inhibir la congelación del agua o de materiales acuosos a temperaturas inferiores a 0ºC. En general, se piensa que estas proteínas funcionan mediante la interacción con, y la inhibición, de cristales de hielo, pero está claro ahora que existen diferentes clases de proteínas anticongelantes que podrían tener diferentes mecanismos de acción y diferentes efectos. Por ejemplo, además de provocar una histéresis térmica en el comportamiento congelación/fusión de los sistemas hielo/agua, las AFP pueden influir en la forma y el tamaño de los cristales de hielo formados cuando ocurre la congelación, e inhiben la recristalización del hielo. Más recientemente, se ha sugerido que estas proteínas se deberían conocer alternativamente como proteínas estructurantes del hielo (ISP) (Clarke, C.J., Buckley, S.L. y Lindner, N. Cryoletters., 23: 89-92 (2002)).

Estos atributos de las AFP significan que ellas pueden tener profundos efectos en propiedades, tales como la facilidad de producción, la textura y la estabilidad durante el almacenamiento, de distintas preparaciones congeladas y, en los últimos años, ha habido mucho interés en su posible aplicación comercial, especialmente en la industria alimenticia. Por ejemplo, el control de la dimensión de los cristales de hielo puede conducir a texturas particularmente favorables en los dulces congelados. La inclusión en la formulación de las AFP resulta también en mejoras en las propiedades de almacenamiento. Griffith and Vanya Ewart, en Biotechnology Advances, vol 13, pp. 375-402 (1995), han presentado una revisión de la expresión de AFP y de su uso potencial en la industria alimenticia.

Para estar bien capacitada para un propósito de este tipo, una AFP necesita combinar los efectos deseables en los materiales congelados en los que se incorpora, y la facilidad de su preparación a escala industrial. Este último requerimiento puede ser particularmente problemático debido a que muchas de las especies en las que se han identificado AFP no están fácilmente disponibles para su recogida y procesamiento industrial. Se ha observado que algunas AFP son muy susceptibles a la desnaturalización, lo que introduce graves restricciones en los procedimientos de aislamiento que se les puede aplicar. A la vista de estas dificultades, ha habido un considerable interés en la producción de AFP mediante la expresión de genes clonados que codifiquen estas proteínas en huéspedes de expresión más convenientes, tales como microorganismos o plantas que se cultiven y procesen fácilmente. Sin embargo, se ha comprobado que esto es problemático para muchas AFP: éstas a menudo se obtienen en un rendimiento bajo y algunas veces carecen de actividad.

Entre las AFP potencialmente más útiles que se han identificado está una AFP de tipo III de la faneca oceánica, que se ha designado como HPLC-12. Se ha encontrado que esta proteína es excelente por su capacidad de ayuda en el control de la forma y el tamaño de los cristales de hielo. Se ha mostrado, por ejemplo, que la proteína supera a las muy conocidas AFP de tipo I en los análisis de recristalización. Un propiedad ventajosa adicional que se identificó para la proteína HPLC-12 de tipo III es que, aunque no se producía en cantidades sustanciales en E. coli, se podía producir en un buen rendimiento por expresión de un gen clonado que codificaba su secuencia en una levadura transformada, proporcionando de esta forma una fuente potencialmente mucho más conveniente y económicamente viable para la producción a escala industrial, que el pez en el que la proteína se expresa de forma natural.

La glicosilación de las proteínas implica un gran número de enzimas y las deficiencias en una o más de ellas pueden alterar potencialmente el patrón de glicosilación. Una pérdida de actividad de la enzima responsable de la transferencia del primer residuo de azúcar a la proteína, podría evitar, potencialmente, cualquier glicosilación. De acuerdo con esto, el uso de una levadura mutante de este tipo, deficiente en la protein manosil transferasa (pmt), se ha sugerido como medio para superar el problema de glicosilación anormal de las proteínas expresadas de forma heteróloga (documento WO 94/04687). Sin embargo, la situación se complica por el hecho de que no existe sólo una enzima con esta función, sino varias con diferentes especificidades proteicas. Por ejemplo, en una revisión acerca de la O-manosilación de proteínas, Strahl-Bolsinger et al. (Biochimica et Biophysica Acta 1426: 297-307 (1999)) apuntan que de las diez proteínas O-glicosiladas estudiadas, seis son glicosiladas en levaduras por las enzimas Pmt1 y Pmt2, mientras que las otras cuatro muestran una disminución o falta de O-manosilación, exclusivamente en cepas en las que la actividad de la enzima Pmt4 se ha eliminado. No se ha observado que ninguna de las proteínas analizadas se hayan hipoglicosilado en otra clase de mutante en el que la actividad de la enzima Pmt3 se haya perdido, sin embargo esta mutación resultó en una O-manosilación reducida de la quitinasa en el fondo genético de una mutación doble pmt1pmt2. No se identificó una correlación entre la manosilación específica y ninguna secuencia o característica estructural del sustrato proteico, por lo que no es posible predecir que enzima, o enzimas, transferasa particular es la responsable probable de la iniciación de la glicosilación de ninguna proteína particular, tanto si es una proteína nativa de la especie que glicosila, como si es una proteína extraña producida mediante expresión heteróloga en la
misma.

Resumen de la invención

Los presentes inventores han encontrado ahora, sin embargo, que la proteína HPLC-12 de tipo III producida en levaduras tiene una actividad específica, medida en un ensayo de inhibición de la recristalización, que es menor que la de la proteína aislada de la sangre de la faneca oceánica. Los inventores han sido capaces de mostrar que esto es una consecuencia de la O-glicosilación de la proteína en levaduras, que no ocurre cuando la proteína nativa se produce en el pez. Sorprendentemente, sólo la no glicosilada por la especie es activa.

Esto es inesperado debido a que una evidencia experimental de este tipo, como es la que se refiere a las AFP, revela que no existe un patrón claro y consistente que relacione la glicosilación y la funcionalidad: de hecho algunas AFP están extensivamente glicosiladas de forma natural. Por ejemplo, DeVries et al. (Science 172: 1152 (1971)), describieron que la actividad de una AFP encontrada en el bacalao del norte y en los peces antárticos del suborden Notothenioidei, pierde su actividad si se eliminan los disacáridos colgantes. En otros casos, se ha mostrado que la glicosilación que ocurre de forma natural no es importante para la actividad AFP. Por ejemplo, Worrall et al. (Science 282: 115-117 (1998)) han encontrado que cuando se producía una AFP glicosilada de forma natural en zanahorias sin los glicanos de superficie, su actividad inhibidora de la recristalización no se afectaba. Los presentes inventores han apreciado una falta de dependencia de la glicosilación similar para la actividad AFP, incluso aunque esté presente de forma natural, en el caso de la AFP expresada de forma heteróloga en ray grass. Así, no existe una indicación clara de una relación general entre la glicosilación y la actividad, entre las AFP.

Además, como consecuencia de este hallazgo inesperado, los presentes inventores han sido capaces de idear un procedimiento para la supresión sustancial de esta glicosilación anormal de las AFP de tipo III, y por ello han proporcionado un medio para producir AFP de tipo III, tal como una proteína HPLC-12 de tipo III, que combina la conveniencia y la buena relación coste-eficiencia de las levaduras como organismo huésped, a la vez que se obtiene un producto con una potencia que se aproxima a la de la proteína nativa. Los presentes inventores han encontrado que por el uso de este procedimiento, se pueden aumentar tanto el rendimiento de la proteína recombinante, como la actividad específica de la proteína recombinante, esto es, la proteína se puede recuperar a partir de las células huésped, y de esta proteína, una proporción mayor es activa.

De acuerdo con esto, en un primer aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento para la producción de una proteína anticongelante de tipo III (AFP), comprendiendo este procedimiento la expresión en una célula huésped fúngica, que es deficiente en glicosilación de AFP de tipo III, en comparación con la cepa parental, de una secuencia de un ácido nucleico que codifica la AFP, en la que la célula huésped fúngica es una levadura que es una cepa mutante deficiente en pmt1 y/o deficiente en pmt2.

En una forma de realización preferida, la levadura es Saccharomyces cerevisiae.

En un aspecto relacionado, la presente invención proporciona también un procedimiento para aumentar la actividad anticongelante específica de una proteína anticongelante (AFP) de tipo III, o un equivalente funcional de la misma, cuando dicha proteína se prepara por expresión, en una especie fúngica heteróloga, de una secuencia de un ácido nucleico/gen que codifica la proteína, mediante la reducción del grado de glicosilación de la proteína.

Preferentemente, la actividad AFP específica se mide mediante un ensayo de inhibición de la recristalización del hielo.

En una forma de realización preferida, la reducción en la glicosilación de la proteína se consigue mediante la selección de una cepa de la especie que la expresa que es deficiente en la actividad de una o más enzimas implicadas en la glicosilación de la proteína, preferentemente una o más enzimas protein manosil transferasa.

Una cepa deficiente en glicosilación se selecciona, normalmente, entre la gama de estas cepas mediante el análisis de la AFP de tipo III que se produce cuando un gen que codifica dicha proteína se expresa en dichas cepas. Preferentemente, el análisis de las AFP de tipo III se basa en un ensayo de su actividad o funcionalidad AFP, más preferentemente, de su actividad inhibidora de la recristalización del hielo.

En un segundo aspecto, la presente invención proporciona una composición que comprende una proteína anticongelante de tipo III (AFP), en la que aproximadamente del 50% al 90% de la AFP está sin glicosilar. Preferentemente, la AFP de tipo III es HPLC-12 de tipo III.

En una forma de realización preferida, la composición se puede obtener, más preferentemente se obtiene, por el procedimiento del primer aspecto de la invención.

En un tercer aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento para la identificación de una cepa huésped fúngica capaz de expresar una AFP de tipo III, de forma que menos de aproximadamente el 50% de la AFP expresada esté glicosilada, comprendiendo este procedimiento:

i): proporcionar múltiples células huésped fúngicas que comprenden una secuencia de un ácido nucleico que dirige la expresión de la AFP en la célula huésped;

ii): cultivar las células huésped bajo condiciones que permitan la expresión de la AFP, y

iii): determinar el grado de glicosilación de la AFP expresada.

En una forma de realización preferida, las múltiples células huésped se han sometido a una etapa de mutagénesis.

Descripción detallada de la invención

La invención se basa en el descubrimiento de que cuando una proteína anticongelante HPLC-12 de tipo III se prepara por expresión, en un cepa de levaduras normal, de una secuencia de un ácido nucleico que codifica la proteína, una proporción sustancial del producto proteico secretado se ha glicosilado. Tal glicosilación no está presente en la proteína nativa, y los ensayos de inhibición de la recristalización en fracciones glicosiladas y no glicosiladas separada mostró, sorprendentemente, que la glicosilación eliminaba de forma efectiva la actividad AFP de la proteína.

A la vista de este sorprendente descubrimiento, los inventores han procedido a idear un procedimiento para aumentar la actividad específica de la proteína anticongelante HPLC-12 de tipo III, o un equivalente funcional de la misma, cuando dicha proteína se prepara por expresión, en una especie fúngica heteróloga, de una secuencia de un ácido nucleico que codifica la secuencia de la proteína, mediante la reducción del grado de glicosilación de la proteína.

A menos que se defina de otra forma, todos los términos técnicos y científicos usados en esta memoria descriptiva tienen el mismo significado que entendería, comúnmente, cualquier experto en la técnica (por ejemplo, en cultivos celulares, genética molecular, química de ácido nucleicos, técnicas de hibridación y bioquímica). Se utilizan técnicas estándar para los procedimientos moleculares, genéticos y bioquímicos (véase de forma general, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3ª edición (2001). Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. y Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology (1999) 4ª Ed, John Wiley & Sons, Inc., y la versión completa titulada Current Protocols in Molecular Biology, y procedimientos químicos.

Proteínas anticongelantes

Para los propósitos de esta invención, una proteína anticongelante es una proteína que tiene propiedades significativas de inhibición de la recristalización del hielo y es, por lo tanto, una proteína estructurante del hielo (ISP). Las propiedades de inhibición de la recristalización del hielo se pueden medir, de forma conveniente, mediante un ensayo "por impacto" modificado, como se describe en el documento WO 00/53029. Se puede definir capacidad inhibitoria significativa de la recristalización del hielo como, cuando una disolución del 0,01% en peso de la AFP en 30% en peso de sacarosa, enfriada rápidamente (al menos, \Delta50ºC por minuto) a -40ºC, calentada rápidamente (al menos, \Delta50ºC por minuto) a -6ºC y, posteriormente, mantenida a esta temperatura, resulta en un aumento en el tamaño promedio del cristal de hielo, a lo largo de una hora, inferior a 5 \mum. La actividad específica es una medida, por unidad de concentración de la AFP disuelta, de esta capacidad de la proteína para limitar el grado de incremento en tamaño de los cristales de hielo como resultado de recristalización, en un tiempo determinado.

Las proteínas anticongelantes según la presente invención son AFP de tipo III. Estas AFP se han identificado hasta la fecha en distintos peces polares de la familia Zoarcidae tales como Macrozoarces americanus (faneca de tipo angila, faneca oceánica) y Anarhichas lupus (pez lobo) - Barret, 2001, Int. J. Biochem. Cell Biol. 33: 105-117. Las AFP de tipo III tienen, normalmente, un peso molecular comprendido entre aproximadamente 6,5 y aproximadamente 14 kDa, una estructura secundaria en sandwich beta y una estructura terciaria globular.

Se han clonado distintos genes que codifican AFP de tipo III (Davies and Hew, FASEB J. 2460-2468, 1990). Una proteína AFP de tipo III particularmente preferida es la HPLC-12 de tipo III.

La secuencia de aminoácidos de la proteína HPLC-12 de tipo III de la faneca oceánica se muestra como SEC ID nº 1. Los polipéptidos de la proteína HPLC-12 de tipo III según la presente invención incluyen polipéptidos que tienen la secuencia de aminoácidos mostrada como SEC ID nº 1 y los equivalentes funcionales de la misma.

Por "equivalente funcional" se entiende cualquier polipéptido cuya secuencia tenga, al menos el 80%, más preferentemente al menos el 85%, 90% ó 95% de identidad de secuencia con la secuencia de la proteína HPLC-12 de tipo III mostrada en SEC ID nº 1 y que presente actividad AFP, en particular la actividad inhibidora de la recristalización del hielo (RI). Se prefiere que los equivalentes funcionales tengan, al menos, el 50% de la actividad RI de un polipéptido que tienen la secuencia de aminoácidos de la proteína HPLC-12 de tipo III como se muestra en la SEC ID nº 1, más preferentemente, al menos, el 60%, 70% ó 80% de la actividad RI de un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la proteína HPLC-12 de tipo III. La actividad RI se puede medir, de forma conveniente, mediante un ensayo "por impacto", como el descrito en el documento WO 00/53029.

Los cálculos de identidad de secuencia se realizan, normalmente, con la ayuda de programas de comparación de secuencia fácilmente disponibles. Estos programas de ordenador, comercialmente disponibles, pueden calcular el % de homología, generalmente el % de identidad, entre dos o más secuencias.

La mayoría de los procedimientos de comparación de secuencias están diseñados para producir alineamientos óptimos que tengan en consideración posibles inserciones o deleciones sin penalizar indebidamente la puntuación de homología global. Esto se consigue insertando "huecos" en el alineamiento de secuencia para tratar de maximizar la homología local.

Sin embargo, los procedimientos más complejos asignan "penalización por hueco" a cada hueco que ocurre en el alineamiento de forma que, para el mismo número de aminoácidos idénticos, un alineamiento de secuencia con los menos huecos posibles, que refleja una relación mayor entre las dos secuencias comparadas, alcanzará una puntuación más alta que una con muchos huecos. Normalmente, se usa un "coste de huecos afines" que penaliza con un coste relativamente alto la existencia de un hueco y tiene una penalización menor por cada residuo posterior en el hueco. Este es el sistema de puntuación de huecos usado más comúnmente. Las penalizaciones altas de los huecos producen, por supuesto, alineamientos optimizados con menos huecos. La mayoría de los programas de alineamiento permiten la modificación de las penalizaciones por hueco. Sin embargo, se prefiere el uso de valores por defecto cuando se usan programas informáticos de este tipo para la comparación de secuencias. Por ejemplo, cuando se usa el paquete informático GCG Wisconsin Bestfit (véase posteriormente), la penalización por defecto del hueco para las secuencias de aminoácidos es de -12 por hueco y -4 por cada extensión.

El cálculo máximo del % de homología, por tanto, requiere, en primer lugar, la producción de un alineamiento óptimo, que tenga en consideración las penalizaciones por hueco. Un programa informático adecuado para llevar a cabo un alineamiento de este tipo es el paquete informático GCG Wisconsin Bestfit (Universidad de Wisconsin, EE.UU.; Devereux et al., Nucleic Acids Research 12: 387, 1984). Los ejemplos de otros programas informáticos que pueden realizar comparaciones de secuencia incluyen, pero no se limitan a, el paquete informático BLAST (véase, Ausubel et al., 1999 ibid - Capítulo 18), FASTA (Atschul et al., J. Mol. Biol., 403-410, 1990) y el conjunto de herramientas para la comparación GENEWORKS. Tanto BLAST como FASTA están disponible para la búsqueda fuera de línea y en línea (véase Ausubel et al., 1999 ibid, páginas 7-58 a 7-60). Sin embargo, se prefiere el uso del programa GCG Bestfit.

Aunque el % de homología final se puede medir en términos de identidad, el proceso mismo de alineamiento no se basa, normalmente, en una comparación de todo-nada del par. En lugar de esto, generalmente se usa una matriz escalar de puntuaciones de similitud que asigna puntuaciones a la comparación de cada par, en base a su similitud química o a su distancia evolutiva. Un ejemplo de una matriz de este tipo, usada comúnmente, es la matriz BLOSUM62, la matriz por defecto para el conjunto de programas BLAST. Los programas GCG Wisconsin usan, generalmente, los valores por defecto públicos o una tabla de comparación de símbolos a medida si se suministra (véase, el manual del usuario para detalles adicionales). Se prefiere el uso de los valores por defecto públicos para el paquete informático GCG, o en el caso de otros programas informáticos, la matriz por defecto, tal como BLOSUM62.

Una vez que el programa informático ha producido un alineamiento óptimo, es posible calcular el % de homología, preferentemente el % de identidad de secuencia. El programa informático realiza esto, normalmente, como parte de la comparación se secuencias y genera un resultado numérico.

En una forma de realización altamente preferida, el polipéptido AFP está unido a una secuencia señal que dirige la secreción de la AFP de tipo III por la célula huésped. Las secuencias señal adecuadas incluyen la secuencia señal de la invertasa de S. cerevisiae y la pre-secuencia del factor \alpha de apareamiento de S. cerevisiae.

La AFP se podría fusionar a una secuencia heteróloga para formar una proteína de fusión, que sirva de ayuda en la extracción y la purificación. Los ejemplos de parejas para proteínas de fusión incluyen glutatión-S-tansferasa (GST), hexahistidina, GAL4 (dominios de activación transcripcional y/o unión a ADN) y \beta-galactosidasa. Podría ser conveniente incluir un sitio de rotura proteolítica entre la pareja de la proteína de fusión y la secuencia de la proteína de interés que permita la eliminación de secuencias de la proteína de fusión. Preferentemente, la proteína de fusión no impedirá la actividad RI de la AFP. Sin embargo, para la producción de una AFP para su uso en la preparación de productos alimenticios, es preferible evitar el uso de parejas de fusión.

Ácidos nucleicos que codifican AFP y vectores de expresión

El procedimiento de la invención comprende la expresión de una AFP de tipo III en un huésped fúngico deficiente en glicosilación. Esto se lleva a cabo introduciendo en el huésped fúngico una secuencia de un ácido nucleico, normalmente un vector de expresión que codifica la AFP de tipo III, junto con las secuencias requeridas para dirigir la expresión de la AFP de tipo III en la célula huésped. Así, las secuencias del ácido nucleico que codifica una AFP de tipo III se incorporan, generalmente, en un vector de ácido nucleico recombinante que se puede replicar, adecuado para su introducción en una célula huésped fúngica. La secuencia de ácido nucleico que codifica una AFP de tipo III podría ser, por ejemplo, una secuencia de ADNc, una secuencia de ADN genómico, una secuencia de ADN híbrido, o una secuencia de ADN sintético o semi-sintético. Se prefiere el uso de un ADNc al de un ADN genómico.

La secuencia de ácido nucleico, que codifica la AFP de tipo III, está operablemente unida a una secuencia control que es capaz de promover la expresión de la secuencia codificadora por la célula huésped, esto es, el vector es un vector de expresión. El término "operablemente unido" significa que los componentes descritos están en una relación que les permite funcionar de la forma prevista. Una secuencia reguladora "operablemente unida" a una secuencia codificadora se une de tal forma que la expresión de la secuencia codificadora se lleva a cabo bajo condiciones compatibles con las secuencias control.

Las secuencias control incluirán secuencias tales como promotores y, opcionalmente, elementos potenciadores de la transcripción. Preferentemente, el promotor es un promotor fuerte, tal como un promotor GAPDH de S. cerevisiae o el promotor GAL7. Los promotores podrían ser constitutivos tal como el promotor GAPDH, o inducibles tal como el promotor GAL7.

El vector de ácido nucleico se transforma en un huésped fúngico adecuado utilizando técnicas estándar, tal como choque térmico o electroporación, para proporcionar la expresión de la AFP de tipo III. Este proceso podría comprender el cultivo de una célula huésped transformada con un vector de expresión, como se describió anteriormente, bajo condiciones que proporcionen la expresión por el vector de la secuencia codificadora que codifica la AFP de tipo III y recuperando, de forma opcional, la proteína expresada.

Un procedimiento adecuado para la expresión del polipéptido HPLC-12 de tipo III en S. cerevisiae se describe en el documento WO 97/02343, excepto que la célula huésped será deficiente en glicosilación como se describe más adelante.

Cuando la AFP de tipo III no está unida a una secuencia señal, la proteína se puede recuperar a partir de las células huésped por técnicas estándar, tales como el lisado de las células y la purificación de la proteína recombinante a partir del lisado celular. Cuando se usa una secuencia señal, la proteína se puede recuperar en el sobrenadante de cultivo.

Células huésped fúngicas con glicosilación reducida

Una reducción en la glicosilación de la AFP se alcanza, normalmente, por inhibición, o evitando, la actividad de los productos génicos, tales como enzimas, implicados en las rutas de glicosilación de la célula huésped. Preferentemente, dicha glicosilación es O-glicosilación, entendiéndose por tal la unión de restos de carbohidrato colgantes a un residuo de serina y/o treonina en la superficie de la proteína.

En una forma de realización preferida, la reducción en la glicosilación se lleva a cabo mediante la selección de una cepa del organismo de expresión que sea deficiente en la actividad de una o más enzimas implicadas en la glicosilación de proteínas. Preferentemente, dicha enzima es una implicada en la unión de un residuo de azúcar directamente a una cadena lateral de un aminoácido de la proteína sustrato. Más preferido es una enzima implicada en la unión de un residuo manosilo al grupo hidroxilo de un residuo de serina o treonina de la proteína sustrato (O-glicosilación). Debido a que, normalmente, existen varias de estas enzimas activas en una cepa fúngica determinada, es necesario seleccionar específicamente cepas deficientes en la actividad de las enzimas específicas que son efectivas en la glicosilación de la proteína HPLC-12 de tipo III.

La cepa huésped es, normalmente, deficiente en la actividad de una enzima de interés debido a una o más mutaciones en el gen correspondiente. La mutación podría estar en la secuencia codificadora, tal como una inserción, deleción o sustitución que afecte a la actividad, conformación y/o estabilidad del polipéptido resultante. La mutación podría estar, también, en las secuencias de control de la regulación, tal como el promotor y/o la región 5' no traducida, conduciendo a una reducción en la expresión del producto génico. Sin embargo, también es posible que la actividad de una enzima de interés se afecte por una mutación en otro producto génico que interaccione con la enzima de interés.

Normalmente, una cepa adecuada para la expresión se selecciona entre las cepas mutantes deficientes en glicosilación que ya se habían identificado en las especies en las que se va a llevar a cabo la expresión. En el caso de expresión en S. cerevisiae, por ejemplo, se han identificado al menos cuatro genes que codifican proteínas implicadas en la transferencia de un residuo manosilo a residuos de serina o treonina de la proteína, designándose dichos genes como pmt1, pmt2, pmt3 y pmt4. Los presentes inventores fueron capaces de investigar mutantes en los que se sabía que la actividad de uno o más de estos genes está alterada. De esta forma, ellos fueron capaces de determinar que la alteración de pmt1 o pmt2 era efectiva para reducir el grado de glicosilación de la proteína HPLC-12 de tipo III secretada. Se encontró que el rendimiento de la proteína secretada se afectaba también por mutaciones y se encontró que la alteración del gen más preferida para los propósitos de esta invención era la de pmt1, debido a que esto produce el rendimiento más alto la proteína HPLC-12 de tipo III activa no glicosilada. En contraste con esto, la alteración del gen pmt4 no tenía un efecto apreciable en el grado de glicosilación o en el rendimiento.

De acuerdo con esto, la invención proporciona un procedimiento para la preparación de la proteína HPLC-12 de tipo III, o un equivalente funcional de la misma, con una actividad AFP específica aumentada (en comparación con la obtenida cuando la proteína se produce en la cepa parental) mediante la expresión de una secuencia de nucleótidos que codifica dicha proteína en una cepa huésped fúngica deficiente en la actividad de las enzimas codificadas por uno o más de los genes pmt1 y pmt2, u homólogos de los mismos. Preferentemente, el gen alterado es pmt1.

En este contexto, el término "homólogo" del mismo, significa un gen que codifica un producto génico que tiene la misma función que los productos génicos pmt1 y pmt2.

En una forma de realización preferida, la célula huésped fúngica es una célula de Saccharomyces cerevisiae con un gen pmt1 alterado y/o un gen pmt2 alterado.

El grado de glicosilación de la proteína HPLC-12 de tipo III, producida por cualquier cepa de expresión elegida, se puede calibrar fácilmente por procedimientos que son sensibles al aumento en el peso molecular de la proteína modificada. Por ejemplo, la masa adicional de los glicanos unidos se detecta fácilmente en SDS-PAGE. Una ayuda adicional para la aplicación de este procedimiento sería el uso de una preparación de anticuerpo, específico de HPLC-12, para realizar un Western blot, en el que se detectan específicamente las bandas correspondientes a AFP (glicosiladas y no glicosiladas), suprimiéndose el fondo de otras proteínas. Esto permite la identificación de cepas que son efectivas en la supresión de la glicosilación de la proteína HPLC-12, por ejemplo, sin necesidad de purificar la proteína HPLC-12 a partir del medio en el que se ha secretado. Los anticuerpos monoclonales o policlonales adecuados se pueden preparar fácilmente por procedimientos convencionales. Alternativamente, el nivel de la proteína HPLC-12 de tipo III glicosilada y no glicosilada se puede determinar usando HPLC de fase reversa. Además, se puede usar el sistema de HPLC acoplado a espectrometría de masas para investigar glicoformas específicas.

Los presentes inventores usaron procedimientos tales como electroforesis en gel con SDS, Western blot, análisis por HPLC y HPLC acoplado a espectrometría de masas para identificar la cepas de S. cerevisiae preferidas para la producción de la proteína HPLC-12 de tipo III. Esto se podría extender fácilmente para investigar cepas mutantes adicionales de esta o de otras especies, con el fin de buscar huéspedes de expresión todavía más efectivos. Alternativamente, se podría usar un ensayo basado en las propiedades de inhibición de la recristalización de una preparación que contenga la proteína HPLC-12 de tipo III, al menos parcialmente purificada, para detectar las condiciones o las cepas que producen un buen rendimiento de proteína activa.

Mediante la identificación de la ausencia de glicosilación como criterio clave para determinar la utilidad del producto como proteína anticongelante y, de esta forma, proporcionar procedimientos convenientes para ensayar esto, los inventores han proporcionado así un procedimiento general para identificar cepas fúngicas adecuadas para la producción de una proteína HPLC-12 de tipo III activa con un buen rendimiento.

En S. cerevisiae existen otros genes distintos que se han identificado, cuyos productos de expresión son enzimas implicadas en etapas posteriores de la glicosilación y que, en algunos casos, están implicadas en O- y N-glicosilación (Strahl-Bolsinger et al. (Biochimica et Biophysica Acta 1426: 297-307 (1999)). Los mutantes en los que estos genes se han alterado podrían también, en principio, investigarse para calibrar si son adecuados para la producción de la proteína HPLC-12 de tipo III o de un equivalente funcional.

El procedimiento se podría extender también a otras especies. En algunos casos los mutantes deficientes en glicosilación ya se han descrito y en otros casos se podrían identificar fácilmente. Por ejemplo, el documento WO 94/04687 describe el clonaje de un homólogo de pmt1 de otra levadura, Kluyveromyces lactis. Esto se llevó a cabo fácilmente por PCR, usando cebadores diseñados utilizando la información de la secuencia del gen de Saccharomyces. Los autores continúan para describir como la secuenciación del gen del Kluyveromyces lactis podría permitir la construcción de un mutante para esta especie. La misma estrategia se podría aplicar de forma directa a otros hongos. A la vista del descubrimiento de los presentes inventores de que las enzimas codificadas por pmt1 y pmt2 son las más efectivas en la glicosilación de la proteína HPLC-12 de tipo III en Saccharomyces, es probable que las proteínas homólogas de estos fueran dianas adecuadas para la alteración en otras especies. Una vez que se han adquirido de esta forma los candidatos adecuados a mutantes de glicosilación, o si es necesario, se han construido para otras especies fúngicas, la misma estrategia ejemplificada por los autores para Saccharomyces, se podría aplicar para identificar la cepa en la que se pueda obtener el mejor rendimiento de una proteína HPLC-12 de tipo III activa.

En una forma de realización, las células huésped deficientes en glicosilación adecuadas se pueden obtener sometiendo una población de células huésped a mutagénesis para obtener una población mutante de células huésped y, posteriormente, realizar una criba de la población de células, como se describió anteriormente, para detectar células defectivas en glicosilación de proteínas, en particular de glicosilación de una AFP de tipo III. La mutagénesis de las células se puede llevar a cabo usando técnicas estándar tales como mutagénesis al azar usando, por ejemplo, productos químicos que dañan el ADN o irradiación con rayos UV/X, o mutagénesis dirigida usando, por ejemplo, cebadores específicos de genes pmt conocidos en una especie fúngica, dirigidos a una secuencia homóloga en otra especie.

La especie en la que se lleva a cabo la expresión podría se cualquier especie fúngica adecuada, incluyendo levaduras tales como (pero sin limitarse a) aquellas de los géneros Saccharomyces, Kluyveromyces, Pichia, Hansenula, Candida, Schizosaccharomyces y similares, y especies filamentosas tales como (pero sin limitarse a) aquellas del género Aspergillus, Trichoderma, Mucor, Neurospora, Fusarium y similares. Preferentemente, las especie seleccionada es una levadura, más preferentemente un especie de Saccharomyces tal como Saccharomyces cerevisiae. Se ha mostrado que la glicosilación anormal es una característica de la expresión de genes heterólogos en muchos de estos géneros.

Sin embargo, en una forma de realización alternativa, podría ser deseable usar una cepa huésped fúngica de una especie que normalmente no lleve a cabo O-glicosilación significativa. Así, el término "deficiente en glicosilación" en el contexto de la presente invención, no está limitado a células huésped que se han manipulado genéticamente para reducir la glicosilación de proteínas. No obstante, normalmente una célula deficiente en glicosilación es una que comprende mutaciones en uno o más genes implicados en la glicosilación de proteínas.

Composiciones AFP

El procedimiento de la invención hace posible obtener preparaciones altamente activas del tipo de las AFP de tipo III que contienen una alta proporción de la AFP no glicosilada.

Así, la presente invención proporciona una composición que comprende, al menos, el 50% en peso de una AFP de tipo III no glicosilada, como porcentaje de la AFP de tipo III total, que se puede obtener por expresión de una secuencia de un ácido nucleico que codifica la AFP de tipo III en una célula huésped fúngica deficiente en glicosilación. Preferentemente, la composición comprende, al menos, aproximadamente el 60%, 65% o 80% en peso de la AFP de tipo III no glicosilada, calculado como porcentaje de la AFP de tipo III total.

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De acuerdo con esto, la composición de la invención comprende también menos del 50% en peso de una AFP de tipo III glicosilada, calculado como porcentaje de la AFP de tipo III total, más preferentemente, menos de aproximadamente el 40, 35, 30 o 20%. Expresado de forma alternativa, una composición de la invención comprende una AFP de tipo III no glicosilada y una AFP de tipo III glicosilada en una relación en peso de 1:1 a 100:1, más preferentemente de 1,5:1 a 100:1, lo más preferible de 2:1, 3:1 ó 4:1 a 100:1. Debido a que la AFP de tipo III se expresa en un huésped fúngico, mejor que en un huésped procariota, habrá generalmente al menos cantidades traza de proteínas AFP de tipo III glicosiladas, que no estarían presentes en AFP de tipo III expresadas en una célula huésped procariota.

En una forma de realización preferida, la composición de la invención comprende del 50 al 99% en peso de AFP de tipo III que carecen de O-glicosilación.

Además, se prefiere que la composición sea, al menos 30% pura, respecto a las AFP de tipo III (independientemente del tipo de glicosilación), en base al contenido total de proteína, más preferentemente al menos 40, 50 ó 60% pura. Cuando la AFP se va a usar para aplicaciones cosméticas o farmacéuticas, se prefiere que la AFP sea al menos 90% pura, respecto de las AFP de tipo III (independientemente del tipo de glicosilación), en base al contenido total de proteína, más preferentemente al menos un 95,98 o un 99% pura.

La presente invención se describirá ahora en referencia a los siguientes ejemplos que son sólo ilustrativos y no limitantes. Los ejemplos se refieren a las figuras:

Descripción de las figuras

La Figura 1a es una representación esquemática del módulo de integración rana usado en los ejemplos. El módulo contiene las siguientes secuencias:

1-26: NTS1 - espaciador no trascrito de rana de S. cerevisiae

127-2186: ADN del cromosoma IX de S. cerevisiae

114-348: ora 1 parcial = proteína hipotética

485-916: subunidad P de la RNAsa

1165-1959: similitud débil a glucosidasa, exo sialidasa, mucinas

2103-2165: orf cuestionable

2165-2096: activador transcripcional del metabolismo aminoácidos de azufre

2397-2197: proteína anticongelante de tipo III HPLC-12

2457-2398: ISS - secuencia señal de SUC2 (Invertasa) de S. cerevisiae

2775-2486: PgaI7 - promotor GAL7 de S. cerevisiae (sintético)

4009-2801: LEU2d - LEU2d de S. cerevisiae

4100-4413: 2u - fragmento del plásmido 2u de S. cerevisiae (no funcional)

4420-5460: NTS2 - espaciador no trascrito de rDNA de S. cerevisiae

55461-5581: 5S - ARN 5S de rDNA de S. cerevisiae

5582-6238: espaciador no trascrito de rDNA de S. cerevisiae

La Figura 1b es una representación esquemática del plásmido pUR3993

La Figura 2 muestra un cromatograma de HPLC.

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Ejemplos

Ejemplo 1

Determinación de la actividad de inhibición de la recristalización de las formas glicosilada y no glicosilada de la AFP de tipo III HPLC-12 producida por Saccharomyces cerevisiae

Las fracciones enriquecidas con AFP de tipo III glicosilada y no glicosilada se prepararon a partir de caldo de fermentación.

El caldo de fermentación que contenía la AFP de tipo III HPLC-12 (15 ml) se transfirió mediante una pipeta a tubos cónicos individuales, se le añadieron 10 ml de etanol refrigerado y se mezcló durante 5 segundos.

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Cuando el pH era inferior a 6,0, éste se corregía con 1M NaOH. Posteriormente, el tubo se dejó en hielo durante, al menos 20 minutos, o durante toda la noche en un congelador, antes de su centrifugación a una temperatura de 5ºC, durante 5 minutos a 3000 rpm. Posteriormente, se decantó el sobrenadante en tubos cónicos individuales. El precipitado se lavó por la adición de 40% de etanol a pH 6,0, se mezcló y se colocó en hielo durante, al menos 20 minutos, o durante toda la noche en un congelador y, posteriormente, se centrifugó como antes. Finalmente, el precipitado se lavó con agua Ultrapura en un frasco, pesado previamente, se congeló y se secó por liofilización.

Los sobrenadantes anteriores se decantaron en botellas de centrifugación, pesadas previamente, y se centrifugaron de nuevo a aproximadamente 4000 rpm de mínimo a 20 minutos. Los sobrenadantes se transfirieron a frascos individuales de fondo redondo para evaporación rotatoria. Se eliminó el etanol del sobrenadante por evaporación rotatoria sin que la temperatura del baño de agua excediera de 35ºC. Después de la eliminación del etanol, el sobrenadante acuoso se transfirió a un frasco, pesado previamente, se congeló y se eliminó el agua por liofilización.

El contenido de AFP de tipo III glicosilada y no glicosilada de las preparaciones resultantes de la liofilización se muestran en la Tabla 1.

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TABLA 1 Perfiles de la AFP de tipo III del precipitado de etanol y del sobrenadante liofilizados

1

Mientras que el precipitado de etanol todavía contenía algún material no glicosilado, el sobrenadante estaba altamente enriquecido en material glicosilado (41% de las proteínas totales), en comparación con el componente no glicosilado (0,4% de las proteínas totales).

Ensayo de inhibición de la recristalización (RI)

La inhibición de la recristalización de HPLC12 glicosilada se usó para determinar la actividad de la AFP de tipo III glicosilada y no glicosilada. Se preparó una muestra del 0,0004% de proteína en una disolución del 30% de glucosa y se midió en el ensayo RI (3 repeticiones). Se midieron también dos muestras control: una disolución del 30% de sacarosa (esto es, que no contenía AFP) y 0,0004% de HPLC12 no glicosilada. Los resultados se presenten como el cambio en el tamaño medio de los cristales de hielo después de sufrir recristalización a -6ºC durante 1 hora (Tabla 2).

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TABLA 2 Resultados de inhibición de RI

2

Los resultados anteriores muestran que la AFP de tipo III HPLC-12 no glicosilada es activa ya que reduce significativamente la cantidad de crecimiento en comparación con la disolución de sacarosa control. Sin embargo, la proteína HPLC12 glicosilada muestra el mismo crecimiento que un disolución de sacarosa. Por lo tanto, la AFP de tipo III HPLC-12 glicosilada no tienen efecto en la recristalización, esto es, es inactiva.

Ejemplo 2

Preparación de mutantes deficientes en proteín manosil transferasa (pmt)

Se construyeron mutantes deficientes pmt en Saccharomyces cerevisiae VWK 18gal1 (MATa, leu2, gal1: URA3, ura3) utilizando el sistema de alteración de genes cre/lox descrito por Guldener et al. (Nucleic Acids Res 24(13): 2519-24, 1996). Se prepararon fragmentos de ADN con pequeños fragmentos homólogos laterales por PCR, utilizando el módulo loxP-KanloxP. La integración correcta del módulo se verificó por diagnóstico por PCR y, posteriormente, se eliminó el gen Kan por expresión de la recombinasa cre. La eliminación correcta del módulo, que resultó en un gen delecionado permaneciendo un sitio loxP, se verificó por diagnostico por PCR.

Se construyeron las siguientes deleciones:

pmt1 (201, 2350)::lox P

pmt2 (50, 2229)::lox P

pmt3 (09, 2289)::lox P

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Ejemplo 3

Construcción de cepas mutantes de Saccharomyces transformadas con un gen que codifica la AFP de tipo III HPLC-12

Para construir una cepa capaz de expresar AFP de forma controlada y eficiente, los mutantes pmt de la cepa huésped S. cerevisiae VWK18gal1 se transformaron con múltiples copias de un módulo de expresión ISP derivado del plásmido pUR3993, diseñado para integrarse en el locus rDNA, como describieron Lopes et al. (Gene 1989, Jul 15; 79(2): 199-206). El módulo de integración rDNA se escindió del plásmido completo por digestión con HpaI y el fragmento, de aproximadamente 6283 pb, se introdujo en la cepa huésped por transformación usando el procedimiento de acetato de litio (Gietz R.D. y Woods R.A., Methods Enzymol 350: 87-96, 2002).

El módulo de integración rDNA detallado y el plásmido pUR3993 se muestran en las figuras 1(a) y (b) respectivamente. Los transformantes se seleccionaron por su capacidad para crecer en medio mínimo sin leucina y se realizó una criba para detectar producción de AFP durante su crecimiento en medio que contenía glucosa como fuente de carbono y galactosa como inductor.

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Ejemplo 4

Determinación del contenido en la AFP de tipo III HPLC-12 en muestras de fermentación

Los componentes de la muestra se separaron por HPLC en fase reversa usando una columna C18 y el contenido en la AFP de tipo III HPLC-12 se determinó por detección UV a 214 nm, respecto a un patrón purificado.

Aparato

AKTA Explorer XT 10

Equilibrio analítico

Material de vidrio variado

Pipetas variadas (mínimo clase b)

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Reactivos

Agua ultrapura: sistema de agua de Millipore

Acetonitrilo: calidad de HPLC, UV lejano

Ácido trifluoracético (TFA): calidad de HPLC

Isopropanol: calidad de HPLC

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Preparación de eluyentes Eluyente A: 0,05% de TFA en agua ultrapura

Se diluyó 1 ml de TFA en dos litros con agua Ultrapura y se mezcló

Preparación de eluyente B: 0,05% de TFA en acetonitrilo

Se diluyó un volumen de 0,5 ml de TFA hasta un litro con acetonitrilo.

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Para preparar las muestras, un volumen o peso del material bajo análisis se pipeteó/pesó de forma precisa, en triplicado, en un frasco volumétrico de 50 ml individual, y se llevó hasta el volumen con el eluyente A. Las muestras se filtraron antes de analizarse usando las condiciones AKTA especificadas a continuación. Se usó AFP de tipo III no glicosilada purificada como patrón de cuantificación. Un cromatograma de una muestra de fermentación típica se muestra en la figura 2.

Las condiciones de HPLC usadas para el análisis de AFP de tipo III son como sigue:

3

El sistema de cromatografía AKTA Explorer 10XT disponía de un tomador de muestras automático A900 y de un detector con triple longitud de onda. La cuantificación se llevó a cabo usando la señal a 214 nm. Se usaron otras longitudes de onda, tales como 254 y 280 nm, con el propósito de identificación.

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Ejemplo 5

Efecto de la deleción pmt sobre la producción de la AFP de tipo III HPLC-12 en fermentadores a escala laboratorio

Se llevaron a cabo fermentaciones con cada mutante para determinar el efecto de la deleción en la producción de AFP en comparación con la cepa parental sin ninguna deficiencia pmt. Las fermentaciones se llevaron a cabo como se detalla a continuación.

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Preparación de inóculo

Un matraz para agitación que contenía 50 ml de medio constituido por 6,7 g/l de YNB (caldo de nutrientes para levaduras) sin aminoácidos (Difco) y 5 g/l de glucosa.1ac (Avebe) se inoculó con 1,4 ml de la cepa almacenada en glicerol y se incubó durante 48 horas, a 30ºC, a 120 rpm. Posteriormente, el inóculo se transfirió a un matraz para agitación que contenía 500 ml de medio constituido por 10 g/l de extracto de levadura (Difco), 20 g/l de Bacto peptona (Difco) y 20 g/l de glucosa.1ac, seguido por una incubación durante 24 horas, a 30ºC, a 120 rpm.

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Fermentaciones en mezcla alimentada

Los 5,5 l de medio de la mezcla estaban constituidos por 22 g/kg de glucosa.1 ac, 10 g/kg de extracto de levadura KatG (Ohly), 2,1 g/kg de KH_{2}PO_{4}, 0,6 g/kg de MgSO_{4}.7 H_{2}O, 0,4 g/kg de Struktol J673 (Schill & Seilacher), 10 g/kg de trazas de metal Egli (una disolución 100x de 5,5 g/l de CaCl_{2}.2 H_{2}O, 3,73 g/l de FeSO_{4}. 7 H_{2}O, 0,14 g/l de MnSO_{4}. 1 H_{2}O, 1,35 g/l de ZnSO_{4}. 7 H_{2}O, 0,4 g/l de CuSO_{4}. 5 H_{2}O, 0,45 g/l de CoCl_{2}. 6 H_{2}O, 0,25 g/l de NaMoO_{4}. 2 H_{2}O, 0,4 g/l de H_{3}BO_{3}, 0,25 g/l de KI, 30 g/l de NaEDTA), 1 g/kg de vitaminas Egli (una disolución 1000x de 5 g/l de tiamina, 47 g/l meso-inositol, 1,2 g/l de piridoxina, 23 g/l de ácido pantoténico, 0,05 g/l de biotina). Los 4 l de medio de alimentación contenían 440 g/kg de glucosa.1 ac, 3 g/l de galactosa (Duchefa), 25 g/kg de extracto de levadura, 12 g/kg de KH_{2}PO_{4}, 2,5 g/kg de MgSO_{4}. 7 H_{2}O, 0,8 g/kg de Struktol J673, 20 g/kg de metales traza Egli, 2 g/kg de vitaminas Egli.

Las fermentaciones en mezcla alimentada se realizaron en bioreactores estándar con un volumen de trabajo de 10 litros. Se midió el oxígeno disuelto (DO_{2}) con un electrodo Ingold DO_{2} (Mettler-Toledo) y se controló mediante ajuste automático de la velocidad de una turbina Rushton de 6-hojas hasta una velocidad máxima de 1000 rpm. El pH se midió con un electrodo de gel Ingold Impro 3100 (Mettler-Toledo) y se controló usando 3M ácido fosfórico (Baker) y 12,5% v/v de amoniaco (Merck). La temperatura se midió mediante un electrodo PT100 y se controló mediante una camisa de enfriamiento y conducciones de enfriamiento y calentamiento

La fase de mezcla comenzó por transferencia de 500 ml del inóculo totalmente crecido al medio de mezcla. La temperatura se mantuvo a 30ºC y el flujo de aire a 2 l/min. El DO_{2} se controló por encima del 30%, pH a 5,0. Cuando la señal de etanol en la descarga gaseosa decreció por debajo de 300 ppm, comenzó la fase de alimentación. En la fase de alimentación, la temperatura descendió a 21ºC y el flujo de aire se estableció a 6 l/min. La velocidad de alimentación se aplicó según el perfil exponencial requerido para mantener una velocidad de crecimiento de 0,06 1/h. La alimentación exponencial continuó hasta que el nivel de DO_{2} en el fermentador disminuyó por debajo del 15%, manteniéndose a partir de ese momento lineal la velocidad de alimentación.

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TABLA 3 Rendimientos de la AFP de tipo III HPLC-12 glicosilada y no glicosilada determinada por HPLC de fase reversa

4

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El rendimiento de la AFP total después de 60 horas de fermentación y el efecto de la deleción pmt sobre la productividad de la AFP no glicosilada se determinaron usando HPLC de fase reversa y se muestra en la tabla 3.

Los datos en la tabla 3 muestran que la deleción de pmt1 o pmt2 resulta en un aumento en el % de la AFP no glicosilada producida, en comparación con la cepa parental. Aunque el rendimiento de AFP total está ligeramente disminuido para ambos mutantes, pmt1 y pmt2, el rendimiento de la fracción no glicosilada aumentó debido a la disminución de la actividad de glicosilación, resultando en un aumento global de 2,3 veces y 1,9 veces en la fracción AFP no glicosilada para pmt1 y pmt2, respectivamente. En contraste con esto, la deleción de pmt4, aparentemente, tenía un efecto pequeño o no tenía efecto sobre el % de producto no glicosilado generado pero parecía disminuir ligeramente el rendimiento global de AFP. Una comparación de los perfiles de las proteínas de la cepa parental y del mutante pmt1 en gel con SDS, mostró que la cepa original no deficiente contenía las formas de AFP glicosiladas y no glicosiladas, mientras que el mutante pmt1 producía predominantemente AFP no glicosilada (datos no mostrados). Se obtuvieron resultados similares a partir de los experimentos de criba en matraz agitado.

Esto proporciona un procedimiento de cribado relativamente rápido para identificar las cepas con una capacidad reducida para glicosilar la proteína AFP.

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Ejemplo 6

Análisis de los patrones de glicosilación de la AFP de tipo III HPLC-12 secretada por la cepa mutante transformada

La investigación de los patrones de las glicoformas de la AFP de tipo III del mutante pmt1, en comparación con la cepa original no deficiente, se realizaron por HPLC-MS. El grado de glicosilación y la abundancia relativa de AFP respecto a sus glicoformas principales (AFP con 5-13 unidades de manosa) se comparó usando las respuestas en espectrometría de masas de detección de iones seleccionados (SIM) de sus respectivos iones moleculares protonados más abundantes. La detección se realizó mediante espectrometría de masas por ionización por electropulverización positiva. La separación se llevó a cato mediante elución en gradiente usando una columna de HPLC de fase reversa como se describe a continuación.

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Aparato y reactivos

módulo 1050 HPLC (Hewlett Packard)

espectrómetro de masas Quattro I (VG, ahora Micromass)

columna PRP1 4,6 x 250 mm (Hamilton)

agua Ultrapura - Sistema de agua Millipore-Q

gradiente de acetonitrilo de calidad de HPLC

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Preparación de las fases móviles por HPLC

A: 1% ácido acético en agua

B: 1% de ácido acético en una disolución acuosa del 80% de acetonitrilo

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Preparación de las muestras

Se realizó una dilución de 1 en 50 de las muestras en agua (1 g en 50 ml de agua) y éstas se filtraron (filtro de jeringa de 0,45 \mum o menor) antes del análisis.

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(Tabla pasa a página siguiente)

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Condiciones del equipo

5

Se aplicó una velocidad de división de 1/5 después de la separación cromatográfica para suministrar 200 \mul/min al espectrómetro de masas

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El espectrómetro de masas Quattrol

6

La Tabla 4 muestra que el rendimiento de la AFP de tipo III no glicosilada aumenta del 23% al 67% usando la cepa pmt1 y que, aunque el nivel del producto glicosilado se reduce, el patrón de glicosilación es similar al que se obtiene a partir de la cepa parental no deficiente.

TABLA 4

7

Las distintas modificaciones y variaciones de los procedimientos y sistemas de la invención descritos, serán evidentes para los expertos en la técnica sin alejarse del alcance de la invención. Aunque la invención se ha descrito en conexión con formas de realización preferidas específicas, se debe entender que la invención, según se reivindica, no debe limitarse indebidamente por tales formas de realización específicas. De hecho, se pretende que distintas modificaciones de las formas descritas para llevar a cabo la invención, que son evidentes para los expertos en biología molecular o en áreas relacionadas, estén en el alcance de las siguientes reivindicaciones.

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<210> 1

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<211> 66

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<212> PRT

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<213> Macrozoarces americanus

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<400> 1

8

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(La proteína anticongelante de tipo III HPLC-12 se identifica específicamente mediante el número de acceso P19614 en la base de datos de proteínas Swiss-Prot).

Claims

1. Un procedimiento para producir una proteína anticongelante de tipo III (AFP), comprendiendo este procedimiento la expresión en una célula huésped fúngica, que es deficiente en glicosilación de AFP de tipo III, en comparación con la cepa parental, una secuencia de un ácido nucleico que codifica la AFP, en la que la célula fúngica es una levadura que es una cepa mutante deficiente en pmt1 y/o en pmt2.

2. Un procedimiento según la reivindicación 1, en el que la levadura es Saccharomyces cerevisiae.

3. Un procedimiento según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que la AFP de tipo III es HPLC-12 de tipo III.