ES2254728T3 - Procedimiento de funcionalizacion de soportes solidos. - Google Patents
Procedimiento de funcionalizacion de soportes solidos.Info
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Abstract
Procedimiento de funcionalización de un soporte sólido que comprende en la superficie grupos funcionales hidroxilo o hidruro, que comprende las siguientes etapas: a) el injerto por fijación covalente de al menos una molécula bifuncional que comprende un grupo funcional ácido carboxílico protegido de la siguiente fórmula (I): A-X-COOR (I) en la cual: - A representa un grupo que permite la fijación covalente de la molécula bifuncional de fórmula (I) sobre los grupos funcionales hidroxilo o hidruro del soporte, - R representa un grupo protector del grupo funcional ácido carboxílico, - X representa una cadena hidrocarbonada en C2-C18, lineal o ramificada, saturada o insaturada, eventualmente interrumpida por uno diversos heteroátomos elegidos entre N, O y S; b) la desprotección de los grupos funcionales ácido carboxílico que no han sido desprotegidos durante la etapa a) de injerto; terminales, caracterizado porque la etapa a) se realiza a una temperatura entre 50ºC y 200ºC con un compuesto de fórmula (I) en el cual A es un grupo monofuncional y porque dicho procedimiento comprende, además, una etapa c) de pasivación de los grupos funcionales hidroxilo o hidruro residuales del soporte que no han reaccionado con dicha o dichas moléculas de fórmula (I).
Description
Procedimiento de funcionalización de soportes
sólidos.
La presente invención se refiere a un
procedimiento de funcionalización de soportes sólidos, a los
soportes sólidos funcionalizados obtenidos aplicando tal
procedimiento, a sus usos, en particular para la inmovilización de
moléculas biológicas, tales como ácidos nucleicos, polipéptidos,
lípidos, carbohidratos y hormonas.
Los soportes portadores de moléculas biológicas
inmovilizadas se utilizan ventajosamente para la detección el
reconocimiento de especies biológicas, pero otras aplicaciones de
estos soportes, como la síntesis o modificación química sobre
soporte o también la exaltación de reacciones biológicas sobre
soporte, son también posibles.
En el marco particular de la detección y del
reconocimiento de especies biológicas, es primordial poder disponer
de soportes sólidos funcionalizados que presentan un cierto número
de cualidades.
Estos soportes deben, en particular, permitir la
inmovilización reproducible de las moléculas biológicas de interés,
en la medida en que una inmovilización reproducible es condicional
de una detección ella misma reproducible.
Estos soportes deben igualmente permitir la
inmovilización de las moléculas biológicas de interés de manera
sensible. La sensibilidad de un soporte sólido funcionalizado
depende de la proporción de inmovilización y del procedimiento de
detección de una señal, pero también y sobre todo del nivel del
ruido de fondo (señal no específica). Una disminución del ruido de
fondo mejora la relación señal/ruido. En efecto, en un dispositivo
en el cual se detecta la presencia de especies biológicas en las
cercanías de la superficie, el ruido de fondo procede esencialmente
de la absorción no específica de moléculas distintas de las
moléculas biológicas de interés que se desean inmovilizar y que
conviene por lo tanto limitar.
Por otra parte, es importante poder disponer de
soportes sólidos funcionalizados reutilizables. En efecto la mayoría
de los soportes funcionalizados actualmente disponibles se califican
de desechables, lo que puede, evidentemente, ser considerado como
una ventaja por el usuario. Sin embargo, estos soportes son
desechables ya que no se puede simplemente utilizarlos varias veces,
particularmente a causa de la fuerte deriva de la señal medida. El
calificativo "desechable" se convierte entonces en sinónimo de
"calidad mediocre". La posibilidad de poder disponer de un
soporte reutilizable es de gran interés, puesto que autoriza el
análisis de diversas muestras biológicas con un único dispositivo,
lo que permite efectuar comparaciones cuantitativas. Además, los
soportes reutilizables autorizan la realización de diversas
mediciones en una misma muestra y permiten de este modo la mejora de
los resultados de un punto de vista estadístico, lo cual no se puede
considerar con un soporte desechable que deriva demasiado
rápidamente debido a la lama inmovilización de las moléculas
biológicas sobre el sopor-
te.
te.
Finalmente, sobre un soporte funcionalizado sobre
el cual se desearía localizar de manera precisa las especies
inmovilizadas sobre terminales, la etapa de inmovilización debe
realizarse de manera bien localizada y homogénea en la superficie de
los terminales, para evitar todo riesgo de rebabas o de
aureolas.
La inmovilización de moléculas biológicas sobre
soportes sólidos se efectúa generalmente en dos etapas
distintas:
- -
- una primera etapa de funcionalización de los soportes que consiste en una modificación química de su superficie por injerto de moléculas de síntesis (agentes de acoplamiento) que van a garantizar la fijación de las moléculas biológicas sobre el soporte;
- -
- una segunda etapa de inmovilización que consiste en establecer un enlace covalente entre las moléculas biológicas y estos soportes funcionalizados.
Con el fin de establecer tales enlaces
covalentes, se pueden establecer diferentes tipos de reacciones en
función de la naturaleza, por una parte del agente de acoplamiento y
de la molécula biológica que hay que inmovilizar por otra parte.
De este modo, en lo que se refiere a la fijación
de las proteínas o los oligonucleótidos (portadores de un brazo
espaciador amina), la reacción con la superficie hace intervenir
grupos funcionales amina. La fijación en superficie de tales grupos
funcionales está garantizada principalmente por enlaces de tipo
tiourea o amida. La formación de las tioureas se ha descrito en
particular en el artículo de Guo Z et al., Nucleic Acid
Research, 1994, 22, 5456-5465 y consiste en
activar superficies aminadas por moléculas azufradas tales como por
ejemplo el fenilenodiisotiocianato, y a continuación en hacer
reaccionar las moléculas sobre la superficie así activada. La
formación de los enlaces amida se obtiene por reacción de aminas
sobre ácidos carboxílicos en general por modificación química de un
soporte amina (por ejemplo por anhídrido succínico o una reacción de
polimerización) como se ha descrito por ejemplo en las patentes de
los Estados Unidos nº 5 919 523, 5 667 976 y 6 043 353.
La funcionalización directa sobre soporte sólido
por ácidos carboxílicos se puede realizar por la formación de capas
autoensambladas de alcanotioles ácidos sobre depósitos de oro
(BONCHEBA M. et al., Langmuir, 1999, 15,
4317-4320; HUANGE E et al, Langmuir, 2000,
16 3272-3280) o bien también por reacciones
de hidrosililación sobre soportes de silicio (Strother T. et
al., J. Am. Chem. Soc., 2000, 122,
1205-1209); sin embargo, en este último caso, la
fijación de las biomoléculas implica reacciones de complejación.
En el caso particular de la inmovilización de
proteínas, ya se han propuesto soportes de cuarzo por un silano
portador de grupos éster que a continuación están desprotegidos
(Brennan J. D. et al., Can. J. Chem., 1994, 72,
721-728).
La modificación química de las moléculas
biológicas ha permitido también desarrollar otros procedimientos de
inmovilización. De este modo, se ha propuesto un procedimiento de
inmovilización electroquímica basada en la polimerización del pirrol
(Livache T. et. al., Biosensors & Bioelectronics, 1998,
13 629-634 y Garnier F. et al.
Synthetic Metals, 1999, 100, 89-94). Este
procedimiento permite la inmovilización de moléculas
(oligonucleótidos, péptidos) portadoras de residuos pirrolilo por un
enganche localizado, pero impone la utilización de soportes
conductores y necesita un procedimiento de direccionamiento
multiplexado.
Se ha propuesto también modificar
oligonucleótidos por un grupo dialdehído para permitir su fijación
en grupos funcionales hidrácida (Proudnikov D. et al.,
Analytical Biochemistry, 1998, 259, 34-41 y
Dubiley S. et al., Nucleic Acid Research, 1997, 25
2259-2265). Los soportes funcionalizados son, en
este caso, geles de poliacrilamida o de nitrocelulosa que forman
redes espesas y por lo tanto tridimensionales que tienen la ventaja
de aumentar, para una misma superficie, la densidad de los cordones
inmovilizados. Estos geles presentan, sin embargo, algunos límites
relativos a la dimensión de los terminales depositados y la
dimensión de los cordones de ADN que se pueden hidridar (Yershov G.
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 1996, 93,
4913-4918).
Finalmente, una vía cada vez más utilizada,
implica la reacción de oligonucleótidos portadores de un brazo
espaciador terminado por un grupo funcional tiol sobre superficies
funcionalizadas por haloacetatos (US 5 412 087 y Tang K et
al. Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU, 1999, 96,
10016-10020). El establecimiento de puntes disulfuro
o de enlaces tioéter, después de la adición de un grupo
piridilsulfuro sobre el oligonucleótido (WO 99/20640) es posible
sobre superficie funcionalizadas por tioles. Si los tioles parecen
bastante reactivos e insensibles a la humedad, estos grupos
funcionales son, sin embargo, delicados de utilizar puesto que
tienen tendencia a oxidarse en disulfuro. Una reducción previa del
disulfuro in situ es por lo tanto a menudo necesario para
esperar la obtención de los resultados reproducibles.
Existe por lo tanto un gran abanico de
posibilidades para desembocar en soportes funcionalizados que
permiten la inmovilización de moléculas biológicas de interés. Sin
embargo, a día de hoy, la obtención de soportes sólidos
funcionalizados reutilizables que permiten la inmovilización de
moléculas biológicas de interés de manera reproducible y sensible,
así como la detección de una señal limitando la relación señal/ruido
no se ha podido realizar de manera totalmente satisfactoria.
Por esta razón los inventores se han marcado como
objetivo proporcionar tales soportes y han puesto a punto lo que es
objeto de la presente invención.
La presente invención tiene como primer objeto un
procedimiento de funcionalización de un soporte sólido que comprende
en superficie funcionales hidroxilo o hidruro, que comprenden las
siguientes etapas:
a) el injerto por fijación covalente (sililación
o hidrosililación) de al menos una molécula bifuncional que
comprende un grupo funcional ácido carboxílico protegida de la
siguiente fórmula (I):
(I)A-X-COOR
en la
cual:
- -
- A representa un grupo que permite la fijación covalente de la molécula bifuncional de fórmula (I) sobre los grupos funcionales hidroxilo o hidruro del soporte,
- -
- R representa un grupo protector del grupo funcional ácido carboxílico,
- -
- X representa una cadena hidrocarbonada en C_{2}-C_{18}, lineal o ramificada, saturada o insaturada, eventualmente interrumpida por uno diversos heteroátomos elegidos entre N, O y S;
b) la desprotección de los grupos funcionales
ácido carboxílico que no han sido desprotegidas durante la etapa a)
de injerto,
caracterizado porque la etapa a) se realiza a una
temperatura entre 50ºC y 200ºC con un compuesto de fórmula (I) en el
cual A es un grupo monofuncional y porque dicho procedimiento
comprende, además, una etapa c) de pasivación de los grupos
funcionales hidroxilo o hidruro residuales del soporte que no han
reaccionado con dicha o dichas moléculas de fórmula (I). Según la
invención, la cadena hidrocarbonada de la molécula bifuncional de
fórmula (I) comprende de 2 a 18 átomos de carbono; tal longitud de
cadena (inferior a 20 átomos de carbono) no permite lleva a cabo un
soporte sólido que comprende una monocapa autoensamblada organizada
(SAM). En efecto, según A. ULMAN, Chem. Rev. 1996, 96,
1533-1554, la formación de SAM sobre soportes
sólidos con la ayuda de compuestos organosiliciados que comprenden
un extremo trifuncional (de tipo alquiltriclorosilano) es posible
cuando la cadena hidrocarbonada contiene al menos 20 átomos de
carbono.
Por el contrario, según la invención, la
utilización de moléculas de fórmula (I), en las cuales el grupo A
que permite la fijación de éstas en el soporte es monofuncional,
permite obtener capas mono o submonomoleculares densas de manera
reproducible. Además, las moléculas de fórmula (I) que están fijadas
en superficie del soporte tienen cada una su punto de anclaje
directamente en la superficie, contrariamente a las moléculas di- o
tri- funcionales que conducen a menudo a capas injertadas, rugosas y
mal definidas.
Los soportes sólidos que se pueden funcionalizar
según este procedimiento son superficies orgánicas (materiales
plásticos) o minerales, preferiblemente porosas o planas, de tipos
óxidos metálicos, sílice y sus derivados (vidrio, cuarzo,...), es
decir, toda superficie que presenta grupos funcionales hidroxilo en
superficie, así como los semiconductores de tipo silicio que
presentan hidruros en superficie (Si-H).
El grupo monofuncional A puede particularmente
ser elegido entre los grupos
dialquil(dialquilamino)silano, dialquilhalogenosilano,
difenil(dialquilamino)silano, difenilhalogenosilano,
[(monoalquil), (monofenil), (dialquilamino)]-silano,
[(monoalquil), monofenil), (halogeno)]-silano,
alqueno, alquino y los compuestos organometálicos tales como
organomagnesianos o organolíticos.
El grupo protector R de las moléculas de fórmula
(I) anterior se puede elegir entre los grupos descritos en
Protectives groups in organic synthesis (T. W. GREENE et
al., 2ª edición, Wiley Interscience) tales como por ejemplo un
radical alquilo en C_{1}-C_{4} o un radical
cíclico.
Según una forma ventajosa de este procedimiento,
y cuando la superficie del soporte sólido presenta funciones
hidroxilo en superficie, las moléculas de fórmula (I) son
preferiblemente elegidas entre los compuestos organosiliciados de
la siguiente fórmula (Ia).
en la
cual:
- -
- A_{1} y A_{2} idénticos o diferentes, representan un radical alquilo en C_{1}-C_{4} o un grupo fenilo,
- -
- A_{3} representa un radical alcoxi en C_{1-}C_{4}, dialquil(C_{1}-C_{4})amino o un átomo de halógeno tal como el cloro,
- -
- R representa un grupo protector elegido entre los radicales alquilo en C_{1}-C_{4} y los radicales cíclicos tal como el radical bencilo,
- -
- n es un número entero comprendido entre 2 y 18.
Entre los radicales alquilo en
C_{1}-C_{4} definidos para A_{1} y A_{2}, se
pueden particularmente mencionar los radicales metilo, etilo,
propilo y butilo, prefiriéndose particularmente el radica
metilo.
Entre los radicales
dialquil(C_{1}-C_{4})amino
definidos para A_{3}, se pueden particularmente mencionar el
radical dimetilamino.
Entre los radicales alquilo en
C_{1}-C_{4} definidos para el grupo R, se pueden
particularmente mencionar los radicales metilo, etilo, isopropilo y
t-butilo, prefiriéndose particularmente el radica
t-butilo.
Según la invención, los compuestos de fórmula
(Ia) se eligen particularmente entre aquellos en los cuales:
- -
- A_{1} y A_{2}, idénticos, representan un radical metilo,
- -
- A_{3} representa un radical dimetilamino o un átomo de cloro,
- -
- n = 10, y
- -
- R representa un radical t-butilo
En el caso particular en el que A3 representa un
radical dimetilamino, la molécula correspondiente
(CH_{3})_{2}N-Si(CH_{3})_{2}-(CH2)_{10}-C-(O)-O-t-butilo),
que no es comercial, se pueden preparar según procedimientos
clásicos de esterificación del ácido undecilénico (Trost B. M. et
al. "Comprehensive organic synthesis", 1991,
6, Pergamon Press; Staab H. A. et al., "Azolides
in organic synthesis and biochemistry", 1998, Wiley Weinheim)
y de hidrosililación (Fleming I:"Comprehensive organic
synthesis" volumen III, Capítulo 13).
Según otra forma ventajosa de este procedimiento,
y cuando la superficie del soporte sólido presenta grupos
funcionales hidruro en superficie, las moléculas de fórmula (I) son
preferiblemente elegidas entre los alquenos, los alquinos, los
aldehídos, los peróxidos o también los compuestos organometálicos.
Entre estos compuestos, se prefieren particularmente los ésteres
metílico o t-butílico del ácido undecilénico.
Cuando la etapa a) es una etapa de sililación, se
puede realizar tanto en fase orgánica, acuosa, catalizada o no, que
en fase vapor.
Cuando se efectúa en fase orgánica, la etapa a)
comprende ventajosamente las siguientes etapas:
- i)
- la eliminación de los contaminantes del soporte sólido y la hidroxilación de su superficie,
- ii)
- la introducción en un disolvente elegido entre los disolventes hidrocarbonados no polares, los disolventes polares y sus mezclas, bajo atmósfera inerte, de un compuesto organosiliciado de fórmula general (Ia) tal como la definida anteriormente,
- iii)
- la silanización del soporte obtenido en la etapa i) por inmersión en la solución preparada en la etapa ii) y
- iv)
- el endurecimiento del soporte silanizado obtenido en la etapa iii), después de la evaporación del disolvente bajo atmósfera inerte y a una temperatura comprendida entre 50 y 200ºC, preferiblemente a 140ºC, durante una duración comprendida entre 2 y 72 horas, y
- v)
- la limpieza y el secado del soporte modificado obtenido en la etapa iv).
Por "contaminantes" del soporte sólido, se
entiende todo compuesto tal como grasa, polvos u otros, presente en
la superficie del soporte y que no forma parte de la estructura
química del propio soporte.
Según la naturaleza del soporte sólido, la etapa
i) se puede efectuar con la ayuda de uno o de diversos disolventes
y/o oxidantes y/o hidroxilantes (por ejemplo una mezcla
sulfoquímica), de un detergente (por ejemplo Hellmanex®), de un
tratamiento fotoquímico con ozono o cualquier otro tratamiento
apropiado.
Durante la etapa ii), la concentración del
compuesto organosiliciado de fórmula (Ia) en el disolvente está
preferiblemente comprendida entre 10^{-5} y 1 mol/litro.
Cuando la etapa a) es una etapa de
hidrosililación, y cuando el soporte sólido utilizado es un soporte
de vidrio o de sílice, dicha etapa a) comprende preferiblemente las
siguientes etapas:
- i)
- la eliminación de los contaminantes del soporte sólido y la hidratación de su superficie,
- ii)
- el lavado del soporte en un alcohol anhidro tal como metanol anhidro,
- iii)
- la puesta en contacto del soporte con un alqueno desoxigenado previamente en argón,
- iv)
- la hidrosililación del soporte por adición de un catalizador (catalizador de Séller o de Karstedt, etildicloroaluminio) durante 2 a 24 horas a una temperatura comprendida entre 90ºC y 200ºC.
Según la invención, la etapa de injertado a)
permite fijar una cantidad de moléculas de fórmula (I) comprendida
entre 1 y 8 \mumol/m^{2} de sustrato.
Preferiblemente, la etapa de injertado debe dejar
intacta la protección del ácido carboxílico de la molécula
bifuncional de fórmula (I) para garantizar un mejor orden de la capa
injertada, la densidad de injertado, así como la reproducibilidad de
la reacción. Sin embargo, en algunos casos, se produce una
desprotección de los grupos funcionales ácido carboxílico durante
algunas reacciones de hidrosililación o bien cuando se utiliza un
clorosilano como compuesto de fórmula (Ia).
Cuando se termina la etapa de injertado a), es
por lo tanto necesario desproteger los grupos funcionales ácido
carboxílico que no se hubiesen desprotegido durante la etapa de
injertado.
Según una primera variante del procedimiento
según la invención, la etapa de desprotección b) se puede realizar
en condiciones suaves según un procedimiento que consiste en formar
un éster de sililo, fácilmente hidrolizable en agua, preferiblemente
haciendo reaccionar el soporte con un silano de la siguiente fórmula
(II):
(II)(alquil \
C_{1}-C_{4})_{3}-Si-Y
en la cual Y representa un átomo de
halógeno tal como yodo, bromo o
cloro.
La utilización de una pequeña molécula de silano
de fórmula (II) presenta la ventaja de completar la cobertura del
soporte (pasivación) puesto que esta pequeña molécula de silano
reacciona igualmente con los grupos funcionales hidroxilo residuales
del soporte que no han reaccionado con las moléculas bifuncionales
de fórmula (I) a lo largo de la reacción de injertado o que están
formados por hidroxilación de los hidruros sobre el silicio durante
la etapa de hidrosilación.
La formación de estos ésteres se puede
obtener:
- -
- bien por reacción del soporte y de un yodotrialquilsilano tal como el yodotrimetilsilano en un disolvente orgánico anhidro (tal como el cloroformo o el diclorometano) a temperatura ambiente o calentando hasta una temperatura de aproximadamente 60ºC.
- -
- Bien por reacción del soporte y del clorotrimetilsilano en presencia de yoduro de odio en el acetonitrilo o acetona anhidra a temperatura ambiente o a aproximadamente 40ºC.
En este caso, la etapa c) de pasivación se
encuentra por lo tanto realizada de manera simultánea por la etapa
b).
Según una segunda variante del procedimiento
según la invención, la etapa b) es una desprotección térmica. Este
procedimiento de desprotección se puede aplicar a algunos ésteres de
ácido carboxílico tales como los ésteres isopropílico y
t-butílico.
Esta desprotección térmica se puede realizar por
tratamiento del soporte funcionalizado a una temperatura comprendida
entre 250 y 280ºC durante 30 a 60 minutos, en atmósfera inerte
(argón o nitrógeno por ejemplo).
Esta etapa de desprotección térmica, realizada
después de la etapa de sililación o de hidrosililación, permite
generar in situ, por simple elevación de la temperatura, el
grupo funcional ácido carboxílico en superficie.
Ventajosamente, esta etapa de desprotección
térmica se puede realizar por lo tanto de manera simultánea a la
etapa a) por simple elevación de la temperatura al final de la etapa
a).
Igualmente de manera ventajosa, la desprotección
térmica se puede realizar de manera localizada, elevando localmente
la temperatura, por ejemplo con la ayuda de un haz láser o de
cualquier medio apropiado, de manera a definir zonas activables
rodeadas de zonas en las cuales los grupos funcionales ácido
carboxílico permanecen protegidas.
Según la invención, la desprotección de los
grupos funcionales ácido carboxílico se realiza preferiblemente por
formación de un éster de sililo, puesto que este procedimiento
permite a la vez generar grupos funcionales ácido carboxílico en
condiciones suaves y bloquear los grupos funcionales hidroxilo
residuales del soporte (etapa de pasivación del soporte), lo que
permite a continuación limitar la adsorción no específica de las
moléculas sobre el soporte. Es en efecto,
la adsorción no específica delas moléculas biológicas la que es responsable del ruido de fondo durante la detección.
la adsorción no específica delas moléculas biológicas la que es responsable del ruido de fondo durante la detección.
Por consiguiente, cuando la desprotección de los
grupos funcionales ácido carboxílico se realiza de manera térmica,
se efectúa a continuación la etapa de pasivación de los grupos
funcionales hidroxilo o hidruro del soporte haciendo por ejemplo
reaccionar éste con un silano de fórmula (II) tal como se describe
anteriormente o por cualquier otro procedimiento clásicamente
conocido por el experto en la técnica tal como por ejemplo por
reacción del soporte con el hexametildisilano o bien también según
un procedimiento de adsorción fuerte de pequeñas moléculas tales
como el metanol.
Cuando las etapas de desprotección de los grupos
funcionales ácido carboxílico y de pasivación del soporte se
terminan, los soportes funcionalizados se lavan con agua y se secan
por ejemplo mediante un chorro de aire comprimido.
La invención tiene también por objeto el soporte
sólido funcionalizado obtenido aplicando el procedimiento de
funcionalización conforme a la invención y tal como se ha descrito
anteriormente.
Estos soportes funcionalizados permiten la
inmovilización reproducible de moléculas biológicas de interés a la
vez que limitan la adsorción no específica de moléculas y por lo
tanto aumentando la relación señal/ruido durante la detección.
Permiten igualmente la limitación de las rebabas y de las aureolas
de los depósitos localizados por el control de la extensión de las
gotas de reactivos.
Estos soportes funcionalizados pueden
particularmente utilizarse para la inmovilización, por fijación
covalente de moléculas biológicas de interés portadoras de grupos
funcionales amina o hidroxilo, tales como ácidos nucleicos,
polipéptidos (proteínas, enzimas), lípidos, carbohidratos u
hormonas.
En el sentido de la presente invención y en lo
que sigue, se entiende por "ácidos nucleicos" tanto
oligonucleótidos como ADN o ARN, o también ácidos nucleicos con
esqueleto o con bases modificados, tales como los ácidos nucleicos
peptídicos (PNA): Peptide Nucleic Acids) que hacen intervenir
enlaces peptídicos en lugar de los enlaces fosfodiésteres.
La presente invención tiene por lo tanto por
objeto, un procedimiento de inmovilización de moléculas biológicas
sobre soporte sólido funcionalizado, caracterizado porque comprende
las siguientes etapas:
- a)
- la preparación de un soporte sólido funcionalizado que comprende grupos funcionales ácido carboxílico terminales en forma de éster según el procedimiento tal como se ha definido anteriormente,
- b)
- la desprotección y la activación de los grupos funcionales ácido carboxílico terminales,
- c)
- la puesta en contacto del soporte sólido modificado obtenido en la etapa a) o b) con una o diversas soluciones aplicadas localmente, en uno o diversos disolventes, de la(s) molécula(s) biológica(s) que hay que inmovilizar, llevando dichas moléculas biológicas en uno de sus extremos un grupo funcional amina o hidroxilo o un brazo espaciador funcionalizado por un grupo funcional amina primaria,
- d)
- la evaporación del disolvente para provocar la fijación covalente de la(s) molécula(s) biológica(s) en grupos funcionales ácido carboxílico,
- e)
- la inactivación de los grupos funcionales ácido carboxílico activadas que no han reaccionado con las moléculas biológicas con la ayuda de una amina en fase gaseosa o en solución, y
- f)
- el lavado del soporte sólido sobre el cual se inmovilizan dichas moléculas biológicas.
La etapa b) de activación de los grupos
funcionales ácido carboxílico se puede por ejemplo efectuar con la
ayuda de una solución de N-hidroxisuccinimida, de
carbonildiimidazol o de carbodiimida, o también de cualquier otro
reactivo de activación apropiado y conocido por el experto en la
técnica.
A título de ejemplo, esta etapa de activación se
puede realizar en presencia de carbonildiimidazol (O,1 M) en
tetrahidrofurano (THF) anhidro, en dos horas aproximadamente a
temperatura ambiente. Este tipo de activación permite
particularmente obtener superficies activadas muy reactivas respecto
de reactivos nucleófilos (aminas, alcoholes, agua). En este caso, se
hacen reaccionar las moléculas biológicas en disolventes anhidros en
presencia de una amina terciaria como la trietilamina para
garantizar la presencia de la forma amino del grupo funcional de las
moléculas biológicas.
Durante la etapa c), la concentración de la o las
soluciones de moléculas biológicas está preferiblemente comprendida
entre 10^{-6} a 10^{-3} mol/l.
Durante la etapa c), se entiende que, para
solubilizar las moléculas biológicas, se podría utilizar cualquier
disolvente acuoso o anhidro que permita una buena disolución de
estas últimas y un control posterior de la evaporación de la
solución. La naturaleza del disolvente se deberá elegir,
evidentemente, en función de la naturaleza de la molécula biológica
que hay que aislar. Se pueden mencionar, a título de ejemplo y de
manera no limitativa los tampones fosfato, el dimetilsulfóxido
(DMSO), el acetonitrilo anhidro o igualmente una mezcla
acetonitrilo/agua.
Cada solución de moléculas biológicas que hay que
inmovilizar se puede depositar en un lugar determinado del soporte
por un medio adaptado de microdeposición.
De este modo, cuando la reacción de
inmovilización se realiza en condiciones anhidras, por ejemplo para
inmovilizar oligonucleótidos, es por ejemplo posible utilizar DMSO
anhidro. La reacción será conducida, evidentemente, en atmósfera
anhidra. En este caso, los oligonucleótidos están preferiblemente
presentes en el seno de la solución a una concentración comprendida
entre 10^{-5} y 10^{-3} mol/l.
Los cordones de ADN y los oligonucleótidos son
solubles en solución acuosa en cualquier proporción. Por
consiguiente, cuando se desea inmovilizar este tipo de moléculas
biológicas, la etapa de inmovilización se realiza preferiblemente en
condición acuosa. La activación de los grupos funcionales ácido
carboxílico por N-hidroxisuccinimida permite
trabajar en condición acuosa.
Según la invención, la etapa d) de inmovilización
de las moléculas biológicas por evaporación del disolvente, es
crucial para el buen desarrollo del procedimiento de inmovilización,
puesto que permite el injertado covalente de las moléculas
biológicas de interés sobre el soporte funcionalizado. En efecto, el
procedimiento de inmovilización según la invención aplica
preferiblemente soluciones muy diluidas de moléculas biológicas (del
orden de 10^{-6} a 10^{-3} mol/l) cuya detección sería a
continuación imposible si no se efectuase el injerto por enlace
covalente. Preferiblemente, esta etapa de evaporación se realiza
lentamente, es decir, durante un tiempo comprendido entre 1y 10
horas aproximadamente.
Cuando la etapa de inmovilización está terminada,
se procede a continuación a la inactivación de los grupos
funcionales ácido carboxílico activada que han reaccionado con las
moléculas biológicas, con la ayuda de una amina gaseosa o en
solución (etapa e)).
Esta etapa de inactivación permite evitar los
problemas de rebaba de las gotas, de contaminación o de polución
durante las siguientes etapas, también se puede denominar
"capping".
Según una forma de realización ventajosa del
procedimiento de inmovilización conforme a la invención, esta etapa
de inactivación se realiza haciendo reaccionar, en fase gaseosa,
metilamina o dimetilamina, preferiblemente dimetilamina durante 15 a
45 minutos.
Esta etapa de inactivación puede fácilmente
permitir tratar diversos soportes de manera simultánea.
Según otra forma de realización ventajosa de este
procedimiento, la etapa de inactivación se realiza únicamente en
zonas predefinidas de un mismo soporte, estando las zonas que no
deben ser inactivadas, previamente protegidas por ejemplo por gotas
de agua, disolventes orgánicos o aceite mineral.
La desactivación de las zonas no protegidas
permite entonces crear una red de zonas activadas o reactivables y
de zonas químicamente inertes.
Esta forma de realización del procedimiento
permite desembocar en soportes espacialmente resueltos que pueden
por ejemplo obtenerse por depósitos de gotas de agua sobre una
superficie que comprende grupos funcionales ácido carboxílico
activadas (por ejemplo con carbonildiimidazol)seguido de la
etapa de inactivación de las superficies accesibles por una amina en
fase gaseosa, y a continuación de un lavado del soporte. Las zonas
inactivadas por las gotas de agua pueden a continuación ser
reactivadas antes de la etapa de fijación covalente de las moléculas
bioló-
gicas.
gicas.
La etapa final f) de lavado está destinada a
desorber las moléculas que no se hubiesen fijado de manera covalente
al soporte funcionalizado conforme a la invención para obtener una
densidad reproducible de moléculas biológicas fijadas en
superficie.
Esta etapa de lavado se realiza preferiblemente
sometiendo dicho soporte a etapas sucesivas de lavados cada vez más
rigurosas, que varían por ejemplo de un lavado con agua a una
temperatura de aproximadamente 80ºC durante aproximadamente una hora
a un lavado en una solución acuosa de dodecil sulfato de sodio (SDS)
concentrada, por ejemplo al 10%, a una temperatura de
aproximadamente 80ºC durante aproximadamente 1 hora, seguida
eventualmente de una sonicación de algunos minutos.
La reutilización de los soportes está
condicionada por la obtención de señales reproducibles. Esta etapa
de lavado garantiza una función relativa a la reutilización de estos
soportes ya que permite garantizar que los soportes no liberarán de
nuevo moléculas durante las eventuales siguientes etapas
detección.
Aunque esta etapa de lavado tenga como
consecuencia la eliminación de un determinado número de moléculas
biológicas no fijadas covalentemente, y, por consiguiente, la
reducción del nivel de inmovilización, por lo tanto la intensidad de
la señal de detección, permite también disminuir el nivel de
adsorción y por l tanto el ruido de fondo durante la detección. El
balance global de esta etapa de lavado es por lo tanto la mejora de
la relación señal/ruido así como de la reproducibilidad de la
medición.
La presente invención tiene igualmente por objeto
los soportes sólidos obtenidos aplicando el procedimiento de
inmovilización según la invención, es decir, los soportes sólidos
sobre los cuales están inmovilizadas por fijación covalente las
moléculas biológicas de interés.
Estos soportes sólidos pueden también utilizarse
como herramientas de análisis (diagnóstico, secuenciación, etc,...)
que como herramientas de preparación (aislamiento, separación de
moléculas complejas) o de revestimiento de superficies con
propiedades específicas (revestimientos por cromatografías,
revestimientos "activos" tales como revestimientos
antiestáticos, antibacterianos, etc...).
Encuentra por lo tanto aplicaciones en numerosos
campos tales como:
- -
- la síntesis sobre soportes sólidos,
- -
- la separación y la purificación de moléculas (electroforesis, cromatografía),
- -
- en biología molecular, en particular cuando las moléculas biológicas inmovilizadas son enzimas,
- -
- a título de biodetectores ("immunoassays", técnica de análisis de ADN basados en los "microarrays" por ejemplo la secuenciación por hibridación SBH, single nucleotide polymorphism (SNP y el diagnóstico biomédico).
La utilización de soportes sólidos
funcionalizados según la presente invención permite inmovilizar
diferentes tipos de moléculas biológicas y por lo tanto preparar
diferentes tipos de micromatrices como micromatrices de ácidos
nucleicos tales como micromatrices ADN, micromatrices de
polipéptidos tales como micromatrices de proteínas, etc...
La invención de soportes sólidos modificados
según la presente invención es particularmente ventajosa para la
preparación de micromatrices, concretamente soportes sobre los
cuales se fijan, da manera covalente, un conjunto de ADN, de
secuencias conocidas en un orden bien preciso, pudiéndose reutilizar
estas micromatrices numerosas veces. Tales micromatrices de ADN
permiten, por hibridación de los ADN inmovilizad sobre el soporte
con ácidos nucleicos u oligonucleótidos dianas, determinar la
secuencia de estas moléculas dianas o seguir la expresión de genes.
Las aplicaciones son numerosas: descubrimiento de nuevos genes,
nuevos medicamentos, realización de diagnósticos, estudios de
toxicidad, etc.
La presente invención tiene por lo tanto por
objeto una micromatriz de ácidos nucleicos o de poplipéptidos,
caracterizado porque se obtiene por el procedimiento de
inmovilización de moléculas biológicas según la presente invención,
en el que dichas moléculas biológicas son ácidos nucleicos o
polipéptidos.
Las micromatrices de ácidos nucleicos o de
polipéptidos según la invención presentan la ventaja de ser
estables y por lo tanto de poder reutilizarse numerosas veces, en
particular las micromatrices de ADN se pueden reutilizar en
numerosos ciclos de hibridación y de desnaturalización.
Además de las disposiciones que preceden, la
invención comprende también otras disposiciones que se harán
evidentes en la siguiente descripción, que se refiere a un ejemplo
de funcionalización de soporte sólido, a un ejemplo de
inmovilización de oligonucleótidos así como a un ejemplo que
evidencia la reproducibilidad del procedimiento de inmovilización
según la invención.
Se ha de entender, sin embargo, que estos
ejemplos se dan únicamente a título de ilustración del objeto de la
invención, no constituyendo en modo alguno una limitación.
Ejemplo
1
Se sumergen láminas de vidrio (76 x 26 mm) en una
solución de ácido sulfúrico y de agua oxigenada (7/3 v/v) a 80ºC
durante una hora. Las láminas se enjuagan abundantemente en agua
ultrapura y a continuación se secan mediante una pistola de gas. A
continuación se colocan en un reactor de vidrio.
El reactor que contiene láminas de vidrio se
calienta a 140ºC durante una hora al vacío y a continuación durante
una hora bajo un barrido de gas inerte seco (argón, nitrógeno). El
reactor se enfría a continuación en un baño de agua helada y se
inyectan 150 ml de pentano de manera cubrir la superficie de las
muestras. Se inyecta a continuación 300 \mul de silano.
El pentano se evapora a continuación al vacío, y
a continuación el reactor se calienta a 140ºC y se barre mediante
una corriente de gas inerte (argón o nitrógeno) durante 12
horas.
Al término de la silanización, las láminas de
vidrio se lavan en tetrahidrofurano (THF) bajo ultrasonidos, antes
de ser almacenadas o experimentar las otras etapas de
funcionalización.
Ejemplo
2
Las láminas de vidrio funcionalizadas obtenidas
anteriormente en el ejemplo 1 se secan en atmósfera inerte a 140ºC
durante 12 horas. Después del enfriamiento, se sumergen en una
solución de diclorometano (DCM) previamente secado sobre alumina, y
a continuación se inyecta yodotrimetilsilano en cantidad suficiente
para alcanzar una concentración de 0,1 M. La hidrólisis se lleva a
cabo durante una noche a temperatura ambiente. Al término de la
reacción, las láminas se lavan con agua desionizada y se secan con
un chorro de aire comprimido.
Las láminas se secan a 140ºC en argón durante dos
horas. Después del enfriamiento, se sumergen en una solución de THF
anhidro que contiene N-hidroxisuccinimida (0,1 M) y
diisopropilcarbodiimida (0,1 M). La activación se lleva a cabo
durante 5 horas a temperatura ambiente. A continuación, las láminas
se enjuagan con THF anhidro y luego se almacenan en atmósfera inerte
en la oscuridad.
Los oligonucleótidos (25 madres, portadores de un
brazo espaciador funcionalizado por un grupo funcional amina
(C_{6}-NH_{2})), se solubilizan en tampón
fosfato PBS (Phosphate-Buffered Saline) de pH 8,5.
Se recubren unas superficies de 1 cm^{2} con 50 \mul de solución
de oligonucleótidos. Después de la evaporación lenta del tampón PBS
a una temperatura de 50ºC, las láminas se inactivan por bloqueo
(capping) de los grupos funcionales ácido que no hubiesen
reaccionado con los grupos funcionales amina de los brazos
espaciadores de los oligonucleótidos. Para esto, las láminas se
tratan con metilamina en fase gaseosa durante 30 minutos.
Para terminar, las superficies se lavan en baños
sucesivos cada vez más rigurosas: agua ultrapura a 100ºC durante 45
minutos, a continuación SDS al 10% a 80ºC durante 45 minutos, y
finalmente SDS al 10% baños ultrasonidos durante 5 minutos.
Ejemplo
3
Se han utilizado diferentes láminas de vidrio
funcionalizadas según el procedimiento descrito anteriormente en el
ejemplo 1 y activadas con N-hidroxisuccinimida según
el procedimiento descrito anteriormente en el ejemplo 2 para
inmovilizar 1 \mul de soluciones de oligonucleótidos a 12
\mumol/l (25 madres, portadores en posición 3' de un brazo
espaciador que comprende un grupo funcional amina primaria).
Después del lavado y la hibridación de la
secuencia complementaria, los resultados relativos al número de
cordones hibridados por cm^{2} sobre tres láminas diferentes,
después de un lavado con tampón SSC 1X (Saline Sodium Citrate) que
es una dilución al 1/20 de un tampón SSC 20X que contiene una mezcla
de NaCl (3 M) y de citrato sódico (3 M), a una temperatura de 47ºC
durante 45 minutos, eran las siguientes (datos cuantitativos
obtenidos por marcación radiactiva al ^{32}P):
- -
- lámina nº 1: 2,20.10^{10}
- -
- lámina nº 2: 2,26.10^{10}
- -
- lámina nº 3: 2,23.10^{10}
Estos resultados ponen en evidencia la gran
reproducibilidad del procedimiento de inmovilización según la
invención.
En otra lámina de vidrio, una primera hibridación
con un doble cordón PCR de 60 pares de bases ha proporcionado una
hibridación del orden de 3,95.10^{8} cordones/cm^{2}. Después de
la desnaturalización y la rehibridación en condiciones idénticas a
las tres láminas anteriores, se obtuvo una densidad de 2,6 10^{10}
cordones de oligonucleótidos/cm^{2}.
El conjunto de estos resultados demuestra, por
consiguiente, la gran reproducibilidad de las láminas entre los
lotes así como la posibilidad de reutilizar los soportes sin pérdida
de señal.
Claims (24)
1. Procedimiento de funcionalización de un
soporte sólido que comprende en la superficie grupos funcionales
hidroxilo o hidruro, que comprende las siguientes etapas:
a) el injerto por fijación covalente de al menos
una molécula bifuncional que comprende un grupo funcional ácido
carboxílico protegido de la siguiente fórmula (I):
(I)A-X-COOR
en la
cual:
- -
- A representa un grupo que permite la fijación covalente de la molécula bifuncional de fórmula (I) sobre los grupos funcionales hidroxilo o hidruro del soporte,
- -
- R representa un grupo protector del grupo funcional ácido carboxílico,
- -
- X representa una cadena hidrocarbonada en C_{2}-C_{18}, lineal o ramificada, saturada o insaturada, eventualmente interrumpida por uno diversos heteroátomos elegidos entre N, O y S;
b) la desprotección de los grupos funcionales
ácido carboxílico que no han sido desprotegidos durante la etapa a)
de injerto; terminales,
caracterizado porque la
etapa a) se realiza a una temperatura entre 50ºC y 200ºC con un
compuesto de fórmula (I) en el cual A es un grupo monofuncional y
porque dicho procedimiento comprende, además, una etapa c) de
pasivación de los grupos funcionales hidroxilo o hidruro residuales
del soporte que no han reaccionado con dicha o dichas moléculas de
fórmula
(I).
2. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque los soportes sólidos se eligen entre las
materias plásticas, los óxidos metálicos, la sílice y sus derivados
y los semiconductores.
3. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2,
caracterizado porque el grupo monofuncional A se elige entre
los grupos dialquil(dialquilamino)silano,
dialquilhalogenosilano, difenil(dialquilamino)silano,
difenilhalogenosilano, [(monoalquil), (monofenil),
(dialquilamino)]-silano, [(monoalquil), monofenil),
(halogeno)]-silano, alqueno, alquino y los
compuestos organometálicos.
4. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el grupo
protector R es un radical alquilo en C_{1}-C_{4}
o un radical cíclico.
5. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la
superficie del soporte sólido presenta grupos funcionales hidroxilo
en superficie y porque las moléculas de fórmula (I) son elegidos
entre los compuestos organosiliciados de la siguiente fórmula
(Ia).
en la
cual:
- -
- A_{1} y A_{2} idénticos o diferentes, representan un radical alquilo en C_{1}-C_{4} o fenilo,
- -
- A_{3} representa un radical alcoxi en C_{1-}C_{4}, dialquil(C_{1}-C_{4})amino o un átomo de halógeno tal como el cloro,
- -
- R representa un grupo protector elegido entre los radicales alquilo en C_{1}-C_{4} y los radicales cíclicos,
- -
- n es un número entero comprendido entre 2 y 18.
6. Procedimiento según la reivindicación 5,
caracterizado porque los compuestos de fórmula (Ia) se eligen
particularmente entre aquellos en los cuales:
- -
- A_{1} y A_{2}, idénticos, representan un radical metilo,
- -
- A_{3} representa un radical dimetilamino o un átomo de cloro,
- -
- n = 10, y
- -
- R representa un radical t-butilo
7. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque la superficie
del soporte sólido presenta grupos funcionales hidruro en superficie
y porque las moléculas de fórmula (I) son elegidas entre los
alquenos, los alquinos, los aldehídos, los peróxidos o también los
compuestos organometálicos.
8. Procedimiento según la reivindicación 7,
caracterizado porque los compuestos de fórmula (I) se eligen
entre los ésteres metílico o t-butílico del ácido
undecilénico.
9. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque la etapa a) es
una etapa de sililación en fase orgánica que comprende las
siguientes etapas:
- i)
- la eliminación de los contaminantes del soporte sólido y la hidroxilación de su superficie,
- ii)
- la introducción en un disolvente elegido entre los disolventes hidrocarbonados no polares, los disolventes polares y sus mezclas, en atmósfera inerte, de un compuesto organosiliciado de fórmula general (Ia) tal como la definida anteriormente,
- iii)
- la silanización del soporte obtenido en la etapa i) por inmersión en la solución preparada en la etapa ii) y
- iv)
- el endurecimiento del soporte silanizado obtenido en la etapa iii), después de la evaporación del disolvente en atmósfera inerte y a una temperatura comprendida entre 50 y 200ºC, preferiblemente a 140ºC, durante una duración comprendida entre 2 y 72 horas, y
- v)
- la limpieza y el secado del soporte modificado obtenido en la etapa iv).
10. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, 7 ó 8, caracterizado porque el
soporte sólido es un soporte de vidrio o de sílice y porque la etapa
a) es una etapa de hidrosililación, que comprende las siguientes
etapas:
- i)
- la eliminación de los contaminantes del soporte sólido y la hidratación de su superficie,
- ii)
- el lavado del soporte en un alcohol anhidro tal como metanol anhidro,
- iii)
- la puesta en contacto del soporte con un alqueno desoxigenado previamente en argón,
- iv)
- la hidrosililación del soporte por adición de un catalizador durante 2 a 24 horas a una temperatura comprendida entre 90ºC y 200ºC.
11. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la etapa de
desprotección b) se realiza por formación de un éster de sililo
haciendo reaccionar el soporte con un silano de la siguiente fórmula
(II):
(II)(alquil \
C_{1}-C_{4})_{3}-Si-Y
en la cual Y representa un átomo de
halógeno tal como yodo, bromo o
cloro.
12. Procedimiento según la reivindicación 11,
caracterizado porque la formación del éster de sililo se
obtiene:
- -
- bien por reacción del soporte y de un yodotrialquilsilano en un disolvente orgánico anhidro a temperatura ambiente o calentando hasta una temperatura de aproximadamente 60ºC,
- -
- bien por reacción del soporte y del clorotrimetilsilano en presencia de yoduro de sodio en el acetonitrilo o acetona anhidra a temperatura ambiente o a aproximadamente 40ºC.
13. Procedimiento según la reivindicación 11 ó
12, caracterizado porque la etapa c) es realizada de manera
simultánea por la etapa b).
14. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque la etapa b) es
una etapa de desprotección térmica.
15. Procedimiento según la reivindicación 14,
caracterizado porque la etapa de desprotección térmica se
realiza de manera simultánea a la etapa a) por simple elevación de
la temperatura al final de la etapa a).
16. Soporte sólido funcionalizado obtenido según
una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15.
17. Uso de al menos un soporte sólido
funcionalizado tal como se define en la reivindicación 16, para la
inmovilización por fijación covalente, de moléculas biológicas de
interés portadoras de grupos funcionales amina o hidroxilo.
18. Uso según la reivindicación 17,
caracterizado porque las moléculas biológicas se eligen entre
los ácidos nucleicos, los polipéptidos, los lípidos, los
carbohidratos y las hormonas.
19. Procedimiento de inmovilización de moléculas
biológicas sobre un soporte sólido funcionalizado,
caracterizado porque comprende las siguientes etapas:
- a)
- la preparación de un soporte sólido funcionalizado que comprende grupos funcionales ácido carboxílico terminales en forma de éster según el procedimiento tal como se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15,
- b)
- la desprotección y la activación de los grupos funcionales ácido carboxílico terminales,
- c)
- la puesta en contacto del soporte sólido modificado obtenido en la etapa a) o b) con una o diversas soluciones aplicadas localmente, en uno o diversos disolventes, de la(s) molécula(s) biológica(s) que hay que inmovilizar, llevando dichas moléculas biológicas en uno de sus extremos un grupo funcional amina o un grupo funcional hidroxilo o un brazo espaciador funcionalizado por un grupo funcional amina primaria,
- d)
- la evaporación del disolvente para provocar la fijación covalente de la(s) molécula(s) biológica(s) en grupos funcionales ácido carboxílico,
- e)
- la inactivación de los grupos funcionales ácido carboxílico activadas que no han reaccionado con las moléculas biológicas con la ayuda de una amina en fase gaseosa o en solución, y
- f)
- el lavado del soporte sólido sobre el cual se inmovilizan dichas moléculas biológicas.
20. Procedimiento según la reivindicación 10 ó
20, caracterizado porque la etapa e) se elige entre la
metilamina y la dimetilamina
21. Procedimiento según la reivindicación 19 ó
20, caracterizado porque la etapa e) está realizada
únicamente en zonas predefinidas de un mismo soporte, estando las
zonas que no deben ser inactivadas, previamente protegidas.
22. Soporte sólido obtenido según el
procedimiento de inmovilización tal como se define en una cualquiera
de las reivindicaciones 19 a 21.
23. Soporte sólido según la reivindicación 22,
caracterizado porque las moléculas biológicas inmovilizadas
son ácidos nucleicos o polipéptidos y porque constituye una
micromatriz de ácidos nucleicos o de polipéptidos.
24. Uso de un soporte sólido tal como se ha
definido en la reivindicación 22 ó 23, para
- -
- la síntesis sobre soportes sólidos,
- -
- la separación y la purificación de moléculas,
- -
- en biología molecular, en particular cuando las moléculas biológicas inmovilizadas son enzimas, o también
- -
- a título de biodetectores.
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