ES2253461T3 - Procedimiento y dispositivo para la determinacion de la especificidad del tejido y del adn que flota libre en tejidos corporales. - Google Patents

Abstract

Un procedimiento para detectar la presencia o ausencia de una patología en un tejido u órgano de un individuo, que comprende las siguientes etapas: a) determinar la cantidad de ADN total que flota libre en una muestra de fluido corporal obtenida de dicho individuo; b) determinar la cantidad de ADN que flota libre que se origina de dicho tejido u órgano en dicha muestra; c) determinar la presencia o ausencia de una patología en base a la cantidad total de ADN que flota libre y la fracción de ADN que flota libre que se origina de dicho tejido u órgano.

Description

Procedimiento y dispositivo para la determinación de la especificidad del tejido y del ADN que flota libre en tejidos corporales.

Antecedentes de la invención

Esta invención se refiere a procedimientos para detectar ácidos nucleicos que flotan libres, presentes en ácidos nucleicos unidos no celulares en fluidos corporales como fracciones de plasma o suero de sangre humana o animal o en cualquier otra muestra tisular obtenida del cuerpo humano o animal para diagnosticar una enfermedad proliferativa celular. Específicamente, la invención se refiere a la detección de niveles elevados de ácidos nucleicos en fluidos corporales. Además, la invención permite determinar la fuente del ADN enriquecido midiendo la proporción de ADN que se origina de un cierto órgano frente al ADN total de los otros órganos en una muestra de fluido corporal dada especificando el patrón de metilación del ADN. Esto puede hacerse con o sin aumentar la concentración de ADN de una muestra biológica dada. En una realización preferida, un análisis adicional de este patrón de metilación permite la detección de la presencia de tumores o enfermedades proliferativas de otro modo en dicho órgano.

Técnica anterior Ensayos basados en ADN para detectar cáncer

Pueden detectarse varias alteraciones genéticas como mutaciones en ciertos genes, pero también la pérdida de heterocigosidad e inestabilidad de microsatélites en ciertos loci en muestras de ADN de tejido tumoral. Estas alteraciones del ADN pueden detectarse en ADN obtenido de un tejido tumoral de un paciente. En algunos casos, se ha informado de que estas alteraciones también se encontraron en muestras de ADN de suero o sangre o el esputo de esos pacientes con tumor.

Se sabe que los fumadores de cigarrillos tiene secreciones bronquiales aumentadas que contienen células exfoliadas del árbol bronquial. Analizando estas células excretadas, podrían detectarse cambios citológicos pre-malignos varios años antes de un diagnostico clínico de cáncer pulmonar en pacientes con alto riesgo (Saccomanno y col. (1974) Cancer (Phila.), 33:256-270). Estos estudios no eran fácilmente reproducibles y necesitaban habilidades específicas en la persona que analizaba esas muestras. Por lo tanto, para potenciar el valor predictivo de las muestras de esputo, se ha sugerido el uso de ensayos moleculares, por ejemplo, para detectar mutaciones en el gen K-ras o alteraciones de microsatélites especificas para el tumor (Mao y col. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 9871-9875 y Mao y col. (1994) Cancer Res., 54: 1634-1637). Las mutaciones en K-ras así como en p53 se han detectado en fluidos corporales descubiertos en muestras citológicas del esputo y lavado bronquial de pacientes con cáncer de pulmón y fumadores crónicos (Kersting y col. (2000) J. Clin. Oncol., 18: 3221-3229 y Ahrendt y col. (1999) J. Natl. Cancer Inst. (Bethesda), 91: 332-339). Conociendo las secuencias de ácidos nucleicos de genes marcadores específicos implicados en cierto tipo de cáncer como, por ejemplo, cáncer de pulmón, se posibilitó el análisis de estas muestras de esputo y se permitió predecir el desarrollo de cáncer de pulmón en pacientes con alto riesgo. La información más relevante en esta materia puede encontrarse en la patente WO 95/16792 por Maurice Stroun, Philippe Anker y Valeri Vasioukhin. Sin embargo, estos procedimientos no son ideales ya que carecen de sensibilidad y el predominio global de estos cambios en cáncer de pulmón macrocítico es de menos del 25% (Palmisano y col. (2000), Cancer Res. 60: 5954-5958). Para el cáncer de próstata también se ha informado de que la inactivación del gen HPC2/ELAC2 mediante LOH es un suceso relativamente no habitual (Wu y col. (2001) Cancer Res 61: 8651-8653). Otro factor altamente correlacionado con la existencia de tumores es la hipermetilación de ciertos promotores y regiones promotoras.

Metilación

En las últimas décadas en biología molecular los estudios se han enfocado principalmente en los genes, la traducción de esos genes en ARN, y la trascripción del ARN en proteína. Ha habido un análisis más limitado de los mecanismos reguladores asociados al control génico. La regulación génica, por ejemplo, en qué fase de desarrollo del individuo se activa o inhibe un gen, y la naturaleza específica tisular de esta regulación son menos comprendidos. Sin embargo, puede correlacionarse con un alto grado de probabilidad al grado y naturaleza de metilación del gen o genoma. A partir de esta observación, es razonable inferir que las enfermedades genéticas patogénicas pueden detectarse a partir de patrones de metilación genéticos irregulares y esto se ha demostrado para varios casos. Además, esta invención describe un procedimiento de cómo determinar el origen del ADN en un fluido corporal analizando su patrón de metilación para detectar niveles aberrantes de ADN que derivan de un cierto órgano, indicando una enfermedad proliferativa celular de dicho órgano.

En eucariotas de orden superior, el ADN se metila casi exclusivamente en las citosinas localizadas 5' a guanosina en el dinucleótido CpG. Esta modificación tiene efectos reguladores importantes sobre la expresión génica, especialmente cuando están implicadas áreas ricas en CpG, conocidas como islas CpG, localizadas en las regiones promotoras de muchos genes. Aunque casi todas las islas asociadas a genes se protegen de la metilación en los cromosomas autosómicos, la metilación extensiva de islas CpG se ha asociado a la inactivación transcripcional de genes impresos seleccionados y genes en el cromosoma X inactivo de mujeres. La metilación aberrante de islas CpG normalmente no metiladas se ha descrito como un suceso frecuente en células inmortalizadas y transformadas, y se ha asociado a la inactivación transcripcional de genes supresores de tumores definidos en cánceres humanos.

Las células cancerosas humanas típicamente contienen genomas somáticamente alterados, caracterizados por mutación, amplificación, o deleción de genes críticos. Además, el molde de ADN de células cancerosas humanas a menudo muestra cambios somáticos en la metilación del ADN (E.R. Fearon, y col., Cell, 61: 759, 1990; P.A. Jones, y col., Cancer Res., 46: 461, 1986; R. Holliday, Science, 238: 163, 1987; A. De Bustros, y col., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 85: 5693, 1998; P. A. Jones, y col., Adv. Cancer Res., 54:1, 1990; S.B. Baylin, y col., Cancer Cells, 3: 383, 1991; M. Makos, y col., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 89: 1929, 1992; N. Ohtani-Fujita, y col., Oncogene, 8: 1063, 1993). Sin embargo, el papel preciso de la metilación anormal del ADN en tumorigénesis humana no se ha establecido. Las ADN metilasas transfieren grupos metilo desde el donante universal de metilo S-adenosil metionina a sitios específicos del ADN.

Se han atribuido varias funciones biológicas a las bases metiladas en el ADN. La función biológica más establecida es la protección del ADN de la digestión por enzimas de restricción afines. El fenómeno de modificación de la restricción se ha observado, hasta ahora, sólo en bacterias. Las células de mamíferos, sin embargo, tienen una metilasa diferente que metila exclusivamente restos de citosina en el ADN, que están al lado 5' de guanina (CpG). Se ha demostrado por varias líneas de evidencia que esta metilación juega un papel en la actividad génica, diferenciación celular, tumorigénesis, inactivación del cromosoma X, imprimación genómica y otros procesos biológicos principales (Razin, A., H., y Riggs, R. D. eds. en DNA Methylation Biochemistry and Biological Significance, Springer-Verlag, N.Y., 1984).

Aunque los mecanismos exactos por los que la metilación de ADN logra la trascripción del ADN son desconocidos, la relación entre enfermedad y metilación se ha documentado bien. La mala regulación de los genes puede predecirse comparando su patrón de metilación con patrones de expresión fenotípicamente "normales". A continuación se proporcionan casos de enfermedad asociada a patrones de metilación modificados, el papel específico de la metilación en cáncer se describe en el siguiente párrafo:

- Enfermedad de Hodgkin (Garcia JF y col, Loss of p16 protein expression associated with methylation of the p16INK4A gene is a frequent finding in Hodgkin's disease, Lab invest diciembre de 1999; 79 (12): 1453-9).

- Síndrome de Prader-Willi/Angelman (Zeschningh y col, Imprinted segments in the human genome: different DNA methylation patterns in the Prader Willi/Angelman syndrome region as determined by the genomic sequencing method, Human Mol. Genetics (1997) (6) 3 páginas 387-395).

- Síndrome ICF (Tuck-Muller y col., CMDNA hypomethylation and unusual chromosome instability in cell lines from ICF syndrome patients, Cytogenet Call Genet 2000; 89 (1-2): 121-8.

- Dermatofibroma (Chen TC y col, Dermatofibroma is a clonal proliferative disease, J Cutan Pathol enero de 2000; 27 (1): 36-9).

- Hipertensión (Lee SD y col, Monoclonal endothelial cell proliferation is present in primary but not secondary pulmonary hypertension, J clin Invest 1 de marzo de 1998, 101 (5): 927-34).

- Autismo (Klauck SM y col., Molecular genetic analysis of the FMR-1 gene in a large collection of autistic patients, Human Genet agosto de 1997; 100(2): 224-9).

- Síndrome X Frágil (Hornstra IK y col., High resolution methylation analysis of the FMR1 gene trinucleotide repeat region in fragile X syndrome, Hum Mol Genet octubre de 1993, 2(10): 1659-65).

- Enfermedad de Huntington (Ferluga J y col., posible organ and age related epigenetic factors in Huntington's disease and colorectal carcinoma, Med hypotheses mayo de 1989; 29(1); 51-4).

Todos los documentos citados en este documento se incorporan por la presente como referencia.

Hipermetilación y cáncer

La metilación del ADN puede regular negativamente la expresión génica, y cuando lo hace de manera inapropiada puede conducir a la inactivación de genes supresores de tumores, por ejemplo y provocar cáncer. Por consiguiente, se ha demostrado frecuentemente que ciertas regiones del genoma se hipermetilan en tejido tumoral cuando este no es el caso de células no afectadas adyacentes. Un sistema bien investigado es la inactivación de GSTP1 (promotor 1 de glutatión-S-transferasa) por hipermetilación de islas CpG, la alteración somática del genoma más habitual ya presentada para cáncer de próstata humano, sucede temprano durante la carcinogénesis prostática humana y provoca una pérdida de la función cuidadora de GSTP1, dejando las células de la próstata con defensas inadecuadas frente a carcinógenos oxidantes y electrófilos. El diagnóstico genético de cáncer de próstata mediante la detección del estado de metilación del GSTP1 se ha descrito en la patente US 5.552.277. Otro ejemplo de muchos más se describe en el siguiente artículo: Yanagisawa Y y col. (2000), Methylation of the hMLH1 promoter in familial gastric cancer with microsatellite instability, Int J Cancer 85:50-3).

Un reciente ejemplo para la correlación entre hipermetilación y cáncer se da por Maruyama y col. donde se informa de una correlación positiva entre el índice de metilación medio de varios genes seleccionados y el pronóstico del desarrollo de cáncer de vejiga en diciembre de 2001 (Maruyama y col. (2001) Cancer Res 61: 8659-8663). La metilación de CDH1, FHIT, y un MI alto se asociaron con supervivencia acortada. El estado positivo de metilación de CDH1 se asoció independientemente a una mala supervivencia en análisis multivariados. Los autores concluyen que el perfil de metilación puede ser un nuevo biomarcador potencial de la predicción del riesgo en cáncer de vejiga, pero como sólo analizaron muestras de biopsia esto podría requerir operación quirúrgica en un paciente. Sin embargo, estudios más recientes han destacado la posibilidad de detectar la metilación de ADN en ADN de fluidos corporales en lugar del tejido tumoral en sí mismo.

Metilación del ADN en fluidos corporales

Por ejemplo, en ADN de células exfoliadas en muestras de esputo de pacientes con cáncer de pulmón o pacientes con alto riesgo, el promotor del gen supresor de tumores p16 y/o los promotores de O6-metilguanina-ADN metitransferasa podrían mostrar que están metilados de manera aberrante. La metilación aberrante podría detectarse en el ADN a partir del esputo en el 100% de los pacientes con carcinoma de pulmón de células escamosas hasta 3 años antes del diagnóstico clínico (Palmisano y col. (2000), Cancer Res. 60: 5954-5958).

Cuando el estado de metilación de la región promotora de p15 y p16 del ADN tumoral y se investigó el ADN de sangre (plasma, suero y muestras de capa leuco-plaquetaria) de pacientes con carcinoma hepatocelular, el 87% de los pacientes con metilación tumoral también mostraron ADN metilado en el torrente sanguíneo. Ninguna de las muestras de control fueron positivas a la metilación (Wong y col. (2000) Clin Cancer Res 6(9): 3516-3521). Además de un estudio sobre el cáncer de Cabeza y Cuello reveló una correlación entre la metilación del ADN del suero y la metilación de ADN de tumor del 42% (Sanchez-Cespedes y col. (2000) Cancer Res 60: 892-895).

El ADN metilado como marcador tumoral no sólo se restringe al esputo o al torrente sanguíneo, sino que puede -al menos en pacientes de carcinoma de próstata- también encontrarse en orina o muestras de eyaculación. En este estudio, el 94% de las muestras de ADN tumoral estaban metiladas, el 72% de las muestras de plasma o suero, el 50% de las muestras de eyaculación y el 36% de muestras de orina (después de masaje prostático para liberar las secreciones prostáticas) de pacientes con cáncer de próstata mientras que no se detectó metilación en muestras del grupo de control (Cairns y col. (2001) Clin Cancer Res 7: 2727-2730).

La detección de la metilación aberrante en una región promotora constituye un enfoque prometedor para usar ensayos marcadores basados en la metilación del ADN para una fácil detección de cánceres humanos habituales. Como la hipermetilación está implicada en un amplio intervalo de tipos de cáncer, se pueden imaginar varios enfoques similares para otros tipos de cáncer. Para una visión de conjunto, véase:

Esteller, M., Corn, P.G., Baylin, S.B., Herman, J.G. (2001). A Gene Hypermethylation Profile of Human Cancer. Cancer Res 61: 3225-3229

o para una selección de recientes publicaciones de la materia:

Byun, D-S., Lee, M-G, Chae, K-S., Ryu, B-G., Chi, S-G. (2001). Frequent Epigenetic Inactivation of RASSF1A by Aberrant Promoter Hypermethylation in Human Gastric Adenocarcinoma. Cancer Res 61: 7034-7038.

Agathanggelou A., Honorio S., Macartney D.P., Martinez A., Dallol A., Rader J., Fullwood P., Chauhan A., Walker R., Shaw J.A., Hosoe S., Lerman M.I., Minna J.D., Maher E.R., Latif F. (2001). Methylation associated inactivation of RASSF1A from region 3p21.3 in lung, breast and ovarian tumours. Oncogene, 20: 1509-1518.

Dong, S.M., Kim, H-S., Rha, S-H., Sidransky, D. (2001). Promoter Hypermethylation of Multiple Genes in Carcinoma of the Uterine Cervix. Clin Cancer Res 7: 1982-1986.

Herman J.G., Latif F., Weng Y.K., Lerman M.I., Zbar B., Liu S., y col (1994) Silencing of the VHL tumor suppressor gene by DNA methylation in renal carcinomas. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 9700-9704.

Usadel, H. A y col. (2002). Quantitative adenomatous polyposis coli promoter methylation analysis in tumor tissue, serum, and plasma patients with lung cancer.

Procedimientos para detector ADN metilado

En los párrafos previos se ha descrito el significado de la metilación en ciertas bases de citosina para la actividad génica, diferenciación celular, tumorigénesis, inactivación del cromosoma X, imprimación genómica y otros procedimientos biológicos principales (Razin, A., H., y Riggs, R.D. eds. en DNA Methylation Biochemistry and Biological Significance, Springer-Verlag, N.Y., 1984). La modificación de citosina en forma de metilación contiene información significativa. Es obvio que la identificación de 5-metilcitosina en una secuencia de ADN opuesta a una citosina no metilada es de gran importancia para analizar su papel adicional. Pero, como la 5-metilcitosina se comporta exactamente como una citosina en cuanto a lo que respecta a la preferencia de hibridación (una propiedad que depende del análisis de secuencia) no pueden identificarse sus posiciones por una reacción de secuenciación normal.

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Además, en una amplificación por PCR, esta información epigenética determinante, citosina metilada o citosina no metilada, se perderá completamente.

Se conocen varios procedimientos que resuelven este problema. Habitualmente, el ADN genómico se trata con un compuesto químico o enzima que conduce a una conversión de las bases de citosina, que permite posteriormente diferenciar las bases después. Algunas enzimas de restricción son capaces de diferenciar ADN metilado y no metilado.

Un procedimiento relativamente nuevo y actualmente el usado con más frecuencia para analizar ADN para 5-metilcitosina se basa en la reacción específica de bisulfito con citosina que, después de la hidrólisis alcalina posterior, se convierte en uracilo, mientras que 5-metilcitosina permanece sin modificar en estas condiciones (Shapiro y col. (1970) Nature 227: 1047). El uracilo corresponde a la timidina en su comportamiento de apareamiento de bases, mientras que 5-metilcitosina no cambia sus propiedades químicas con este tratamiento y corresponde a guanina. Por consiguiente, el ADN original se convierte de modo que la metilcitosina, que originalmente no podría distinguirse de la citosina por su comportamiento de hibridación, ahora puede detectarse como la única citosina restante usando técnicas de biología molecular "normales", por ejemplo, por amplificación e hibridación o secuenciación. Todas estas técnicas se basan en el apareamiento de bases que ahora puede explotarse completamente. Comparando las secuencias del ADN con y sin tratamiento con bisulfito permite una fácil identificación de aquellas bases que se han metilado.

Puede recogerse una visión de conjunto de los procedimientos conocidos adicionales para detectar 5-metilcitosina del siguiente artículo de revisión: Rein, T., DePamphilis, M.L., Zorbas, H., Nucleic Acids Res. 1998, 26, 2255.

En términos de sensibilidad, la técnica anterior se define por un procedimiento, que incluye el ADN a analizar en una matriz de agarosa, evitando de este modo la difusión y renaturalización del ADN (el bisulfito reacciona sólo con ADN de hélice única), y que reemplaza todas las etapas de precipitación y purificación con diálisis rápida (Olek A, Oswald J, Walter J. (1996) A modified and improved method for bisulphite based cytosine methylation analysis. Nucleic Acids Res. 24: 5064-6). Usando este procedimiento, es posible analizar células individuales, que ilustra el potencial del procedimiento.

Hasta la fecha, salvo pocas excepciones (por ejemplo, Zeschnigk M, Lich C, Buiting K, Doerfler W, Horsthemke B. (1997) A single-tube PCR test for the diagnosis of Angelman and Prader-Willi syndrome based on allelic methylation differences at the SNRPN locus. Eur J Hum Genet. 5: 94-8) la técnica con bisulfito sólo se usa en investigación. Siempre, sin embargo, se amplifican fragmentos específicos y cortos de un gen conocido después de un tratamiento con bisulfito y se secuencia completamente (Olek A, Walter J. (1997) The pre-implantation ontogeny of the H19 methyllation imprint. Nat Genet. 3: 257-6) o se delecionan las posiciones de citosina individuales por una reacción de extensión de cebador (Gonzalgo ML y Jones PA. (1997) Rapid quantitation of methylation differences at specific sites using methylation-sensitive single nucleotide primer extension (Ms-SNuPE). Nucleic Acids Res. 25: 2529-31, documento WO 95/00669) o por digestión enzimática (Xiong Z, Laird PW. (1997) COBRA: a sensitive and quantitative DNA methylation assay. Nucleic Acids Res. 25: 2532-4).

Otra técnica para detector la hipermetilación es la llamada PCR específica de metilación (MSP) (Herman JG. Graff JR, Myohanen S, Nelkin BD y Baylin SB. (1996), Methylation-specifis PCR: a novel PCR assay for methylation status of CpG islands. Proc Natl Acad Sci U S A. 93: 9821-6). La técnica se basa en el uso de cebadores que diferencian entre una secuencia metilada y una no metilada si se aplica después de tratamiento con bisulfito de dicha secuencia de ADN. El cebador contiene una guanina en la posición correspondiente a la citosina en cuyo caso después del tratamiento con bisulfito sólo se unirá si la posición estaba metilada. O el cebador contiene una adenina en la posición de citosina correspondiente y por lo tanto sólo se une a dicha secuencia de ADN después de tratamiento con bisulfito si la citosina no estaba metilada y por tanto se ha alterado por el tratamiento con bisulfito de modo que hibrida con adenina. Con el uso de estos cebadores, pueden producirse amplicones que dependen específicamente del estado de metilación de una cierta citosina y como tales indicarán su estado de metilación.

Otra nueva técnica es la detección de metilación mediante PCR con Taqman, también conocida como MethylLight (documento WO 00/70090). Con esta técnica llega a ser factible determinar el estado de metilación de posiciones únicas o de varias posiciones directamente durante PCR, sin tener que analizar los productos de PCR en una etapa adicional.

Además, también se ha descrito la detección por hibridación (Olek y col., documento WO 99/28498). Publicaciones adicionales enfocadas al uso de la técnica con bisulfito para la detección de metilación en genes individuales son: Grigg G, Clark S. (1994) Sequencing 5-methylcytosine residues in genomic DNA. Bioessays 16: 431-6; Zeschnigk M, Schmitz B, Dittrich B, Buiting K, Hosthemke B, Doerfler W. (1997) Imprinted segments in the human genome: different DNA methylation patterns in the Prader-Willi/Angelman syndrome region as determined by the genomic sequencing method. Hum Mol Genet. 6: 387-95; Feil R, Charlton J, Bird AP, Walter J, Reik W. (1994) Methylation analysis on individual chromosomes: improved protocol for bisulphite genomic sequencing. Nucleic Acids Res. 22: 695-6; Martin V, Ribieras S, Song-Wang X, Rio MC, Dante R. (1995) Genomic sequencing indicates a correlation between DNA hypomethylation in the 5' region of the pS2 gene and its expression in human breast cancer cell lines. Gene 157: 261-4; documentos WO 97/46705, WO 95/15373 y WO 97/45560.

Niveles Elevados de ADN en circulación

Otra propiedad característica del cáncer y otras enfermedades proliferativas celulares es una cantidad aumentada de ADN en circulación flotando libre en sangre y/o suero. También la muerte celular provocada por, por ejemplo, dosis tóxicas de lipopolisacárido bacteriano, HgCl2, CCl4, ciclofosfamida e hidroxiurea desencadena la liberación de productos del catabolismo de cromatina, particularmente de ADN en espacios extracelulares. Se ha demostrado que al menos estos son responsables de la liberación de ADN extracelular en el plasma en ratones, en una relación dependiente de dosis. Por tanto, se sugirió el uso de la cuantificación de ADN extracelular para investigar los fenómenos de muerte celular in vivo inducidos por agentes tóxicos y fármacos (Bret y col. (1990) Toxicology 61(3): 283-92).

Se sabe que el contenido de ADN en plasma refleja la cantidad de muerte celular que sucede en el cuerpo en conjunto y está aumentado durante procesos patológicos destructivos, incluyendo cáncer. Los contenidos de ADN aumentados en suero se han encontrado en correlación con Lupus Sistémico Eritematoso (Leon y col. (1997) Cancer Res. 37: 646-650), enfermedad gastrointestinal maligna (Shapiro y col. (1983), Cancer 51:2116-2120), cáncer pancreático (Anker y col. (1999), Cancer Metastasis Rev. 18: 65-73) y cáncer de pulmón (Maebo A. (1990), Jap J Thoraic Dis 28: 1085-1091 y Fournié y col. (1995), Cancer Let 2: 221-227). Mientras que un ser humano sano tiene niveles de ADN flotando libre en el intervalo de 2-30 ng/ml, pacientes con cáncer, más específicamente pacientes con Lupus Sistémico Eritematoso en un estudio temprano de 1977 mostró niveles de hasta 180 ng/ml. (Leon y col. (1977) Cancer Res. 37: 646-650). En una publicación de Jahr y col. se muestra una tabla que describe los niveles de ADN en plasma de 23 pacientes agrupados en 12 grupos tumorales diferentes. En el caso más extremo el nivel de ADN se vio aumentado 100x en comparación con el valor medio de nivel de ADN en pacientes sanos. Se concluyó que los niveles elevados de ADN en circulación parecen ser un aspecto característico de la mayoría, pero no de todas las enfermedades de carcinoma. El nivel determinado de ADN en circulación solo podría no estar correlacionado con el tipo de cáncer o el estado clínico. Pero debe decirse que en el estudio de Jahr no se han realizado más de 4 repeticiones de un tumor cualquiera (Jahr y col. (2001), Cancer Res 61: 1659-1655).

Jahr y col. intentaron analizar cuanto de este ADN en circulación se origina de células tumorales. Se ha informado a partir de estudios basados en cambios de microsatélites específicos de tumor que casi todo el ADN en plasma en circulación se originó de células tumorales (Goessl C. y col. (1998) Cancer Res., 58: 4728-4732). Otros estudios, por el contrario, detectaron ADN de tipo silvestre en el plasma de casi todos los pacientes con cáncer. Para ser capaces de distinguir entre ADN tumoral y ADN no tumoral determinaron el estado de metilación del ADN, asumiendo que el ADN metilado derivaba del tejido tumoral sólo y el ADN no metilado de células sanas. Se descubrió que cuando el ADN contado en plasma era muy alto, el porcentaje de metilación era bastante bajo, mientras que cuando el nivel de ADN era más bajo el porcentaje de ADN metilado estaba -en un caso al menos- hasta por encima del 90%. Los autores acentúan el hecho de que sería difícil investigar si el ADN no metilado se origina del tejido tumoral adyacente o de alguna otra fuente "porque los marcadores de ADN que distinguen tipos celulares definidos no están disponibles". En este artículo, se analiza la evidencia que mantiene la idea de que el ADN en circulación se origina de células apoptóticas y necróticas.

Aunque el mecanismo exacto de la liberación de ADN en circulación aún tiene que ser demostrado, se ha propuesto una liberación activa de ADN en circulación a partir de células altamente proliferativas (Anker y col. (1999), Cancer Metastasis Rev. 18: 65-73). En este documento, los autores analizan porqué el origen del ADN en circulación en el torrente sanguíneo de pacientes con cáncer lo más probable es que sea "liberación activa", en lugar de lisis a partir de células cancerosas en circulación, necrosis o apoptosis.

Botezatu y col. describieron cómo detectar ADN extracelular en la orina y cómo analizar este ADN para diagnosticar cáncer (Botezatu y col. (2000) Genetic analysis of DNA excreted in urine: a new approach for detecting specific genomic DNA sequences from dying cells in an organism. Clin Chem 46: 1078-1084). Aunque un trabajo previo que ilustra el uso diagnóstico de orina para la detección de cáncer (Mao L. (1996) Genetic alterations as clonal markers for bladder cancer detection in urine. J Cell Biochem Suppl 25: 191-196 y Eisenberger y col. (1999) Diagnosis of renal cancer by molecular urinalysis. J Natl Cancer Inst 91: 2028-2032), los tipos de cáncer elegidos por Botezatu y col. concretamente carcinomas pancreático y colorrectal, no son de origen urológico. El trabajo previo ha indicado que las células de cáncer pancreático y colorrectal (Anker y col. (1997) K-ras mutations are found in DNA extracted from the plasma of patients with colorectal cancer. Gastroenterology 112: 1114-1120) pueden liberar ADN tumoral al plasma, los nuevos resultados por Botezatu y col. van un paso por delante sugiriendo que el ADN tumoral, después de su liberación en el torrente sanguíneo, se excretara en la orina en tamaños suficientemente grandes para el análisis por PCR y por tanto son aplicables a las técnicas de cómo determinar los patrones de metilación.

Los datos de Botazatu y col. incluyen sólo pacientes con enfermedades relativamente avanzadas (fases III y IV), la aplicabilidad del análisis del ADN de orina para la detección de malignidades no urológicas aun tiene que demostrarse en estudios futuros (Lo y col. (2000) Molecular Testing of Urine: Catching DNA on the Way Out. Clinical Chemistry 46: 1039-1040).

Procedimientos de cuantificación de ácidos nucleicos

Actualmente determinar las concentraciones de ADN de muestras de ADN cromosómico en bruto o plasmídico purificado es una etapa esencial en manipulaciones cuantitativas de ADN. Dos tipos de procedimientos se usan ampliamente para medir la cantidad de ácido nucleico en una preparación. Si la muestra es pura (es decir, sin cantidades significativas de contaminantes tales como proteínas, fenol, agarosa u otros ácidos nucleicos), la medida espectrofotométrica de la cantidad de irradiación ultravioleta absorbida por las bases es simple y precisa. Dos técnicas diferentes dependen de los análisis espectrofotométricos y/o fluorométricos, por ejemplo, para determinar la concentración de una muestra diluida de ADN plasmídico purificado por dos pases a través de un gradiente de centrifugación de bromuro de etidio-cloruro de cesio (EtBr-CsCl). La muestra puede ensayarse en un espectrofotómetro LKB Biochrom Ultrospec II, por ejemplo, para absorbancia a longitudes de onda de 260 nm y 280 nm, o puede ensayarse para emisión de 460 nm en el mini-fluorómetro Hoefer TKO 100 en presencia de bisbencimidazol, un colorante fluorescente conocido como Hoechst H 33258 (fabricado por American Hoechst Corporation), que tiene un máximo de excitación a 356 nm y un máximo de emisión de 458 nm cuando se une a ADN (Labarca y Paigen (1980) Anal. Biochem. 102, 344-352). El espectrofotómetro detecta la absorbancia debida al ARN así como al ADN, mientras que el colorante Hoechst usado en el fluorómetro interacciona específicamente con restos de adenosina y timidina del ADN. Debido a la naturaleza altamente especifica del colorante Hoechst, el mini-fluorómetro parece ser más preciso para la cuantificación de ADN cromosómico en bruto, pero menos fiable para ADN de plásmidos y/u otro ADN de complejidad limitada.

Si la cantidad de ADN o ARN es muy pequeña o si la muestra contiene cantidades significativas de impurezas, la cantidad de ácido nucleico puede estimarse a partir de la intensidad de fluorescencia emitida por moléculas de bromuro de etidio intercaladas en el ADN (Sambrook; Fritsh y Maniatis (1989) Molecular Cloning - A laboratory manual (segunda edición) 3: E.5). Una aplicación simple de este enfoque general es el uso de placas de agarosa con EtBr. Las muestras de ADN de 2-10 \mul se salpican sobre agarosa al 1% que contiene 0,5 \mug/ml de EtBr en una placa Petri. Después, la placa se expone a luz UV y se fotografía. Otra variación es mezclar 5-10 \mul de una solución de 0,5 \mug/ml de EtBr con 10 \mul de ADN salpicado sobre un envoltorio de película plástica o un cubreobjetos de vidrio tratado con silicona colocado en la parte superior de un transiluminador UV. La ventaja de este procedimiento es que las muestras de ADN con solo 1-10 ng de ADN pueden cuantificarse en minutos. La desventaja es la intercalación del colorante con el ARN así como el ADN y su limitación a ADN de doble hélice.

Otros procedimientos para cuantificar el ADN son, por ejemplo, el kit de cuantificación de ácidos nucleicos DNA Dipstick^{[TM]}, de Invitrogen, que se reivindica que es suficientemente sensible para detectar solo 0,1 ng/\mul de ácido nucleico. Desafortunadamente, el procedimiento no puede usarse con muestras que contienen más de 10 ng/\mul de ácidos nucleicos (véase: Trends in Biochemical Sciences 19, 46-47).

Procedimientos de detección de ADN específico

Los procedimientos para detectar y cuantificar ácidos nucleicos específicos se usan en la detección de microorganismos, virus y moléculas biológicas. Por tanto, se usan en medicina humana y veterinaria, procesamiento de alimentos y ensayo medioambiental. Adicionalmente, la detección y/o cuantificación de biomoléculas específicas a partir de muestras biológicas (por ejemplo, tejido, esputo, orina, sangre, semen, saliva), tiene aplicaciones en ciencia forense, tal como la identificación y exclusión de sospechosos criminales y ensayos de paternidad así como diagnósticos médicos. Sin embargo, la mayoría de dichos procedimientos se basa en 2 técnicas: hibridación y PCR. Ambas cuales detectan y cuantifican una cierta parte específica del ADN genómico.

Se conoce la hibridación como uno de los procedimientos para detectar un ácido nucleico que tiene una secuencia de bases específica (mencionada a partir de ahora como "ácido nucleico diana"). Este procedimiento emplea una sonda oligonucleotídica que tiene una secuencia de bases capaz de hibridar con el ácido nucleico diana como sonda de detección para formar un híbrido, y realizar la detección del ácido nucleico diana para detectar el híbrido a través de diversos medios de detección.

En la patente de Estados Unidos 6.228.592 queda mencionado el inconveniente de esta técnica, especialmente cuando se intenta aplicar para detectar una secuencia específica en un medio circundante como un fluido biológicamente activo o especialmente en una célula viva. Cuando se introduce una sonda de detección en el citoplasma, a) se moverá rápidamente al núcleo y b) la sonda o el híbrido entre la sonda de detección y el ácido nucleico diana se digiere rápidamente por diversos tipos de nucleasas que existen en el citoplasma, que hacen la detección del ácido nucleico diana difícil. Esto puede superarse usando una sonda oligonucleotídica que tiene una secuencia de bases capaz de hibridar con la secuencia de bases especifica de un ácido nucleico diana, que está unido a una molécula impermeable de membrana nuclear mediante un engarce y está marcado con un colorante fluorescente; formando un híbrido entre el ácido nucleico diana y la sonda. Un cambio en la fluorescencia del colorante fluorescente debido a la formación del híbrido, detecta de este modo la existencia del ácido nucleico diana en el citoplasma de una célula viva o cualquier otra contaminación de fondo con ADNasas.

Otro tipo de procedimiento para la detección de ácidos nucleicos hibridados tiene la ventaja de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). El procedimiento de PCR es bien conocido en la técnica (Patentes de Estados Unidos Nº 4.683.195, 4.683.202, y 4.800.159). Para resumir brevemente una PCR, los cebadores de ácido nucleico, complementarios a cadenas opuestas de una secuencia diana de amplificación de ácido nucleico, se dejan hibridar a la muestra desnaturalizada. Una ADN polimerasa (típicamente estable al calor) prolonga el dúplex de ADN desde el cebador hibridado. El procedimiento se repite para amplificar el ácido nucleico diana. Si los cebadores de ácido nucleico no hibridan con la muestra, entonces no hay producto de PCR amplificado correspondiente. En este caso, el cebador de PCR funciona como sonda de hibridación. Los procedimientos basados en PCR son de uso limitado para la detección de ácido nucleico de secuencia desconocida.

En un procedimiento de PCR el producto de ácido nucleico amplificado puede detectarse por varios modos, por ejemplo, incorporación de un nucleótido marcado en una cadena amplificada usando cebadores marcados. Los cebadores usados en PCR se han marcado con radioactividad, colorantes fluorescentes, digoxigenina, peroxidasa de rábano rusticano, fosfatasa alcalina, ésteres de acridinio, biotina y ureasa de fríjol canavalia. Los productos de PCR fabricados con cebadores no marcados pueden detectarse de otros modos, tales como separación en gel electroforético seguido por visualización basada en colorante.

Las técnicas de fluorescencia también son conocidas para la detección de híbridos de ácido nucleico. La Patente de Estados Unidos Nº 5.691.146 describe el uso de sondas de hibridación fluorescentes que tienen la fluorescencia apagada salvo que hibriden con la secuencia de ácido nucleico diana. La Patente de Estados Unidos Nº 5.723.591 describe sondas de hibridación fluorescentes que tienen fluorescencia apagada hasta que hibridan con la secuencia de ácido nucleico diana, o hasta que la sonda se digiere. Dichas técnicas proporcionan información acerca de la hibridación, y son de grados variados de utilidad para la determinación de variaciones de bases únicas en las secuencias. Algunas técnicas de fluorescencia implican digestión de un híbrido de ácido nucleico en una dirección 5' a 3' para liberar una señal fluorescente desde la proximidad de un interruptor de fluorescencia, por ejemplo, TaqMan.RTM (Perkin Elmer; Patente de Estados Unidos Nº 5.691.146 y 5.876.930).

Se ha descrito de varios modos el control de PCR a tiempo real usando fluorescencia. En primer lugar, la unión del ADN de doble hélice a colorantes fluorescentes específicos tales como bromuro de etidio permite el control de la acumulación de producto de PCR por correlación con la fluorescencia aumentada. Un segundo procedimiento de detección, la escisión de exonucleasa mediada por polimerasa utiliza la actividad 5' exonucleasa de polimerasas tales como Taq. Se marca una sonda oligonucleotídica que es complementaria al producto de PCR, aún distinta del cebador de PCR con un par FRET de modo que la molécula donante se apaga por una molécula aceptora. Durante la amplificación por PCR, la 5' exonucleasa procede a digerir la sonda, separando el par FRET y conduciendo a fluorescencia aumentada. Una variación de esta tecnología usa un ácido nucleico donde el par FRET está apagado de manera interna por ejemplo, teniendo una conformación en horquilla. Después de la hibridación a una secuencia de interés, el par FRET se separa y la molécula donante se separa y la molécula donante emite fluorescencia. Esta tecnología puede usarse, por ejemplo, para el análisis de SNP.

Una tecnología alternativa se basa en el uso de dos especies de sondas de hibridación, cada una marcada con un miembro de un par FRET. Después de la hibridación de ambas sondas a la secuencia diana en proximidad adecuada, se emite una señal fluorescente. Otra vez, esta tecnología puede usarse para la detección de SNP.

Una ventaja principal del uso de dichas tecnologías de PCR basadas en FRET es que la reacción puede controlarse en un tubo de reacción cerrado, adecuado para su uso en producción alta y media y reducir la probabilidad de contaminación.

Procedimientos de extracción y detección de ADN en fluidos corporales

Los procedimientos para la detección de ADN en circulación se describen en varios artículos. En la mayoría de los casos para separar el ADN de la muestra biológica los científicos dependen de un kit suministrado por Qiagen, llamado QIAamp Blood Kit (Qiagen, Hilden, Alemania):

Por ejemplo en Jahr y col. (2001), Cancer Res 61: 1659-1655: "Después de separar el plasma de las células sanguíneas por centrifugación a 3000 g durante 20 minutos el ADN del plasma sanguíneo puede extraerse usando el QIAamp Blood Kit (Qiagen, Hilden, Alemania) usando el protocolo de sangre y fluido corporal que se menciona en Wong y col. (1999), Cancer Res 59: 71-73 y Lo y col. (1998) Am. J. Genet. 62: 768-775".

Wong y col. (1999), Cancer Res 59: 71-73: "Las muestras sanguíneas se centrifugan a 3000 g y el plasma y el suero se retiran cuidadosamente de los tubos que contienen EDTA y claros, respectivamente, y se transfieren a tubos de polipropileno claros. La fracción de capa leuco-plaquetaria de los tubos que contienen EDTA también se recogieron para estudiar la presencia de células tumorales en circulación en la sangre periférica. Las muestras se almacenaron a -70ºC ó -20ºC hasta el procesamiento adicional. El ADN de las muestras de plasma y suero se extrajo usando un QIAamp Blood Kit (Qiagen, Hilden, Alemania) usando el protocolo de sangre y fluido corporal recomendado por el fabricante (Chen y col., (1996). Microsatellite alterations in plasma DNA of small cell lung cancer patients. Nat Med 2: 1033-1035)".

Chen y col.: "Se trató tejido congelado fresco con SDS y proteinasa K seguido por extracción con fenol y cloroformo. El tejido embebido en parafina se raspó de los portaobjetos y se lavó en xilol para retirar la parafina. Después de la adicción de un volumen de etanol, la mezcla se centrifugó, y el sedimento se digirió con proteinasa K y SDS, seguido de extracción con fenol y cloroformo. El ADN de Linfocito Control y de plasma se purificó en columnas Qiagen (Qiamp Blood Kit, Basel, Suiza) de acuerdo con el "protocolo de sangre y fluido corporal". El plasma (1-3 ml) se pasó en la misma columna. Después de la purificación, 1 ml de plasma produce una media de 39 ng de ADN".

Las cantidades de ADN en plasma pueden determinarse por PCR competitiva de acuerdo con el procedimiento de Diviacco y col. (1992) Gene 122: 313-320, usando, por ejemplo, el locus de Lamina B2 como ejemplo típico para un gen de copia única. La molécula competidora que lleva un inserto de 20-pb se obtuvo directamente de dos productos de amplificación por el procedimiento de extensión solapante (Diviacco y col. (1992) Gene 122: 313-320).

La cuantificación de moldes competitivos puede obtenerse por medida de DO260. Una cantidad fijada de ADN de plasma puede mezclarse con cantidades en aumento del molde competidor. Para PCR competitiva, se necesita diseñar dos cebadores adicionales. Después de la amplificación por PCR y PAGE, dos productos se corresponden de manera evidente con los moles genómico y competidor. Las proporciones de los productos amplificados reflejan de manera precisa la concentración inicial de ADN genómico frente a la del competidor añadido. La cuantificación de las bandas competidora y genómica puede obtenerse por exploración densitométrica del gel teñido con bromuro de etidio.

Los resultados obtenidos por medio de PCR competitiva pueden confirmarse por cuantificación con el ADN del kit de control en el Sistema LightCycler (Roche Diagnostics) usando el ADN del Kit de Control LightCycler para amplificar 110 pb del gen de la Beta-globina humana. El amplicón puede detectarse por fluorescencia usando un par específico de sondas de hibridación (LC-Red 640).

Se usó un enfoque similar por Lee y col. para cuantificar el ADN genómico de ADN de muestras de suero y plasma usando reactivos de un kit de ensayo de VIH (HIV Monitor Assay, Roche Molecular Systems, Emeryville, CA). Inmediatamente después de descongelarlas, las muestras de plasma y suero se microcentrifugan a velocidad máxima (Microfuga II, Beckman Instruments) durante 5 minutos para producir plasma o suero limpio, agregados libres y precipitados no específicos. Se retiró el plasma y/o suero (100 \mul) y se depositó en un tubo de microcentrífuga de
1,5 ml que contenía 300 \mul de reactivos de reactivo de lisis de trabajo. El tubo después se agitó vigorosamente durante 3-5 segundos y se incubó a temperatura ambiente durante 10-15 minutos. Después de la incubación, se añadieron
400 \mul de isopropanol al 100 por cien en cada tubo, que después se agitaron durante 3-5 segundos y se microcentrifugaron a 10000 g (Microfuga II de 12000 rpm, Beckman Instruments) durante 15 a 30 minutos a temperatura ambiente. El sobrenadante se retiró y se añadió 1 ml de etanol al 70 por ciento a cada tubo; estas etapas vinieron seguidas por microcentrifugación a 10.000 g durante 5-10 minutos a temperatura ambiente. El sobrenadante se retiró y después los sedimentos de ADN se dejaron durante una noche a temperatura ambiente para evaporar cualquier etanol restante. El sedimento se resuspendió en 100 \mul de solución A de PCR (KCl 100 mM, Tris 10 mM, MgCl_{2} 2,5 mM; pH 8,3) y solución B de PCR (Tris 10 mM, MgCl_{2} 2,5 mM, Tween 20 al 1%, Nonidet P-40 al 1%; pH 8,3).

El ADN purificado se amplifico con cebadores HLA DQ-alfa o cebadores del cromosoma Y humano. Se prepararon curvas patrón y se incluyeron para la cuantificación en cada amplificación (Lee y col. (2001) Transfusion 41: 276-282).

En la patente US 6156504 (Gocke y col.), que también se refiere a la detección de ácido nucleico extracelular asociado a tumor en fracciones de plasma o suero, se da una visión de conjunto de varios procedimientos sobre cómo extraer y detectar ADN en circulación en muestras de sangre y suero.

Para determinar la concentración de ADN en una muestra de orina, las muestras necesitan ser frescas, porque la orina humana contiene actividad nucleasa (Botezatu y col. 2000). Las muestra frescas se centrifugan 10 minutos a 800 g y el ADN se aísla del sobrenadante como se describe por Labarca y Paigen (Labarca y Paigen (1980) Anal Biochem 102: 344-352).

En resumen, el objetivo de la técnica es desarrollar más y más ensayos basados en ácido nucleico para detectar la presencia o ausencia de una proteína que indique tumor o ADNc de genes relacionados con tumor, los llamados genes marcadores en sangre u otros fluidos corporales. La detección de alteraciones específicas de cáncer de genes implicados en carcinogénesis, como mutaciones o deleciones oncogénicas, mutaciones o deleciones en genes supresores de tumores, o alteraciones de microsatélites, entonces permitirán una predicción de que el paciente tiene un tumor o no (por ejemplo, patente WO 95/16792 o US 5.952.170 (Stroun y col.)). En una fase avanzada el objetivo será producir un kit que permita al científico explorar todas las muestras en poco tiempo con alta precisión. Estos kits no solo serán de interés para medicina preventiva mejorada y detección temprana de cáncer si no también para controlar el comportamiento de los tumores después de terapia.

Además, la detección de hipermetilación de ciertos genes, especialmente de ciertas regiones promotoras, se ha reconocido como un indicador importante de la presencia o ausencia de un tumor. Hasta donde se sabe, hasta ahora todos los estudios que se ocupan del análisis de metilación se fijan en el estado de metilación de ciertos genes marcadores, sólo. Se sabe que estos genes juegan un papel en la regulación de carcinogénesis o en otras palabras, se cree que determinan el encendido y apagado de tumorigénesis. Es más avanzado el conocimiento de la metilación y cáncer de próstata. Por tanto, se ha patentado un procedimiento que emplea el análisis de metilación de un cierto gen marcador (GSTP1) que indica cáncer de próstata usando ADN de un fluido corporal (documento US 5.552.277). La determinación del estado de metilación de ciertos genes indicadores aún por identificar, podría incluso llegar a ser una herramienta útil para predecir la sensibilidad de un paciente a quimioterapia y radioterapia (Hanna y col. (2001) Cancer Res 61: 2376-2380). Por otro lado, todos los enfoques de exploración están limitados a ciertos tipos de cáncer. Esto se debe a que todos están limitados en que buscan ciertos genes marcadores, que son altamente específicos para un tipo de cáncer. La invención descrita en la patente de US 6.156.504 (Gocke y col.) también se refiere a la detección de ácido nucleico extracelular en fracciones de plasma o suero, pero la patente sólo cubre un procedimiento para detectar ácido nucleico de K-ras extracelular mutado en sangre. Este es otro ejemplo de la dependencia de la mayoría de los ensayos en genes marcadores específicos, en este caso el oncogén K-ras. Para varios tipos de cáncer se cree que estos genes aún no son conocidos. Además, en una exploración temprana, cuando no hay razón de asumir que el paciente padece de un tipo especifico de cáncer, una exploración requeriría ensayar cada alteración génica posible conocida hasta ahora. Esto puede considerarse como no factible.

Por otro lado, las enfermedades proliferativas celulares provocan que aumenten los niveles de ADN extracelular en sangre y en otros fluidos corporales. Hasta donde se sabe, la cuantificación de ADN extracelular en seres humanos nunca se ha usado para predecir el riesgo de un paciente de tener una enfermedad proliferativa celular como, por ejemplo, cáncer. Se han publicado algunos informes donde los niveles elevados de ADN en circulación en sangre de pacientes de cáncer se mencionan, pero estos únicamente se utilizaron como fuente para ADN accesible más fácil para analizar sus propiedades adicionalmente (Jahr y col. 2001). También se sabe que estas moléculas de ADN se originaban del tejido donde las células se están muriendo, por cualquier razón (como se ha analizado anteriormente). No obstante, hasta ahora ha habido una ausencia de conocimiento para determinar el origen del ADN y por lo tanto no era posible relacionar el resultado general de niveles en ADN aumentados en un fluido corporal como sangre al riesgo de una enfermedad proliferativa celular en un cierto órgano. Esta ausencia se ha debido a la falta de disponibilidad de marcadores específicos titulares (Jahr y col. 2001), que permitirán una determinación del origen del ADN. Este es exactamente el hueco que la invención es capaz de
cerrar.

En resumen, el primer resultado de un análisis de un fluido corporal a partir de una exploración sería una información acerca del nivel de ADN en circulación. En casos en los que este está elevado por encima de los normales (media de gente sana), que hasta ahora no se ha visto como factor de riesgo significativo en sí mismo, ahora conduciría a un análisis adicional en términos de análisis de metilación. Sin tener que hacer suposiciones de qué tipo de cáncer podría ser responsable de la emisión de esos niveles de ADN y sin necesitar emplear ensayos de ciertos genes mascadores con la invención, se podrá revelar el origen del ADN. Esto se basa en el descubrimiento de patrones de metilación específicos de tejido. Con estos, se podrá interpretar un cierto patrón de metilación como perteneciente a un cierto tipo tisular.

Por lo tanto, un objeto de la presente invención es proporcionar un procedimiento que posibilita a) una predicción de que el paciente tiene probabilidad de sufrir de una enfermedad proliferativa celular a partir de la determinación del nivel de ADN en circulación flotando libre en su sangre u otro fluido corporal, y b) una predicción, de qué tejido está liberando el ADN y por lo tanto es probable de tener la enfermedad.

Breve descripcion de la invención

La presente invención proporciona un procedimiento para determinar la presencia o ausencia de una afección medica como cáncer u otra enfermedad proliferativa celular. El procedimiento emplea varias etapas comenzando con la retirada de una muestra de la persona en forma de una muestra tisular o un fluido biológico como sangre, suero, orina u otros fluidos definidos a continuación y finalizando con la interpretación conclusiva de los datos a partir del análisis del patrón de metilación del ADN capturado de dicha muestra, que da información de la probabilidad de que la persona padezca de dicha enfermedad. El procedimiento se basa en la cuantificación de ADN flotando libre en dicho fluido biológico y la determinación posterior de su estado de metilación. Determinando esto ultimo, permite decidir de dónde (como de qué órgano) se originan los niveles potencialmente potenciados de ADN. Esto permite predecir si el individuo tiene una enfermedad proliferativa celular como, por ejemplo, cáncer en dicho órgano. Para validar esto, la siguiente etapa podría emplear, por ejemplo, un ensayo adaptado para la expresión de un gen marcador que indica enfermedad específico de dicho órgano o tejido.

La idea de combinar el análisis cuantitativo de ADN en una muestra biológica como sangre con el análisis posterior de su estado de metilación para predecir su origen es nuevo y conduce a nuevas posibilidades de exploración de grandes poblaciones para signos muy tempranos de, por ejemplo, cáncer, incluso antes de fases clínicas, cuando aún no son apreciables otros síntomas. Como detección temprana es la etapa más importante para combatir una enfermedad como cáncer, este procedimiento proporciona una mejora importante hacia un combate exitoso frente a estas enfermedades. Además, el procedimiento puede emplearse para controlar la progresión de un tumor después de tratamiento y permite, por tanto, optimizar la dosificación de dicho tratamiento o ajustar a un diferente tratamiento en un paciente de manera específica de individuo.

Descripción detallada de la invención

"Fluido corporal" en este documento se refiere a una mezcla de macromoléculas obtenidas de un organismo. Este incluye, aunque sin limitación, sangre, plasma sanguíneo, suero sanguíneo, orina, esputo, eyaculación, semen, lagrimas, sudor, saliva, fluido linfático, lavado bronquial, efusión pleural, fluido peritoneal, fluido meníngeo, fluido amniótico, fluido glandular, aspirados con aguja fina, fluido aspirado del pezón, fluido medular, fluido conjuntivo, fluido vaginal, jugo duodenal, jugo pancreático, bilis y fluido cerebromedular. Esto también incluye fracciones separadas de manera experimental de todos lo precedente. "Fluido corporal" también incluye soluciones o mezclas que contienen material sólido homogeneizado, tal como heces.

Un "agente especifico de metilo" en este documento se refiere a cualquier interacción o reacción química o enzimática con ácidos nucleicos de un modo tal que diferencia entre una nucleobase metilada y una no metilada. Funcionando específicamente en una o en la otra o interaccionando con ambas de un modo diferente será fácil, por procedimientos disponibles hoy en día, diferenciar entre estas nucleobases de lo que ha sido antes de la interacción con dichos "agentes específicos de metilo". Los ejemplos para el tratamiento con un "agente especifico de metilo" son el llamado "tratamiento con bisulfito" o tratamiento con enzimas de restricción sensibles a metilación.

El termino "tratamiento con bisulfito" se refiere al procedimiento habitualmente conocido por el especialista en la técnica. Los ejemplos para el tratamiento pueden encontrarse, por ejemplo, en varias referencias citadas en este documento.

En el contexto de la presente invención, el término "hibridación" debe entenderse como una unión de un oligonucleótido a una secuencia completamente complementaria a lo largo de las líneas de los apareamientos de bases de Watson y Crick en la muestra de ADN, formando una estructura dúplex.

Un aspecto de la invención es detectar la presencia o ausencia y el control de una enfermedad en un individuo, siendo especificada la enfermedad por los niveles aumentados que se muestran, del ADN unido no celular libre en un fluido corporal como se ha definido anteriormente. En una realización preferida de esta invención, esta enfermedad es una enfermedad proliferativa celular o neoplásica. En una realización especialmente preferida de esta invención, la enfermedad es un tipo de cáncer.

La presente invención proporciona un procedimiento para el análisis de ácidos nucleicos en circulación. Se describe un medio para distinguir entre tejidos sanos (o enfermos) de diferentes fuentes en un cuerpo humano. Se describe que los patrones de metilación típicos de ciertos genes pueden correlacionarse de manera positiva con ciertos órganos y tejidos. Esto permite la identificación del origen de ADN que flota libre, o en otras palabras, determinar la fuente orgánica de estos ácidos nucleicos en circulación. Esto se hacer por un ensayo que detecta la metilación de sitios CpG específicos por análisis con enzimas de restricción, o usando un procedimiento basado en ácidos nucleicos.

La invención, por lo tanto proporciona un medio para el diagnóstico, pronóstico, determinación de fase y determinación del grado del cáncer mejorados, a nivel molecular, empleando la capacidad de diferenciar entre fuentes de ADN que flota libre en fluidos corporales. Además, esta nueva herramienta ayudará a descubrir la razón real para el aumento de ácidos nucleicos en sangre o suero, por ejemplo.

Además, la invención descrita proporciona mejoras sobre el objetivo de la técnica en que los actuales procedimientos de análisis de metilación están basados en análisis histológicos y citológicos que requieren una biopsia que proporciona una cantidad suficiente de tejido. El procedimiento de acuerdo con la presente invención puede usarse para la clasificación de muestras fácilmente accesibles como fluidos corporales que no requieren una biopsia.

La invención proporciona adicionalmente un procedimiento para detectar la fuente orgánica de ácidos nucleicos, que se caracteriza en que ciertos genes se ponen en contacto con un reactivo o serie de reactivos capaces de distinguir entre dinucleótidos CpG metilados y no metilados en secuencias diana dadas.

La presente invención, hace disponible adicionalmente un procedimiento para determinar parámetros genéticos y/o epigenéticos de ADN genómico.

En una realización preferida, el procedimiento comprende las siguientes etapas, que se describen con referencia a la Figura 1 que muestra un organigrama del procedimiento preferido de acuerdo con la presente invención:

En la primera etapa del procedimiento, se retira una muestra de un paciente o individuo en forma de dichos fluidos corporales (como se ha definido anteriormente). La retirada de dicha muestra puede hacerse de cualquier modo conocido por un especialista en la técnica. La descripción detallada puede encontrarse en artículos técnicos determinantes y libros de texto que describen el estado de la técnica. Esto incluye, aunque no se limita, a punción ventricular, también conocida como recogida como CSF, un procedimiento para obtener una muestra de fluido cerebromedular (CSF); toracentesis, que se refiere a insertar una aguja entre las costillas en la cavidad pectoral, usando un anestésico local para obtener el fluido de efusión pleural; anmiocentesis, que se refiere a un procedimiento realizado insertando una aguja hueca a través de la pared abdominal en el útero y retirando una pequeña cantidad de fluido de la bolsa que rodea al feto; pero también orina, esperma y recogida de esputo.

En una realización preferida, las muestras se obtienen de cualquier fluido corporal mencionado en la anterior definición. En una realización preferida adicional, las muestras se obtienen de sangre completa, suero sanguíneo, orina, saliva o eyaculación de dicho individuo.

En una segunda etapa, los ácidos nucleicos extracelulares del fluido corporal se cuantifican. En este propósito, los ácidos nucleicos que flotan libres pueden extraerse y/o separarse del ARN si es necesario. Sin embargo, las siguientes etapas también se posibilitan sin hacer ningún tratamiento mencionado anteriormente. Además, el ADN puede purificarse, o acondicionarse y prepararse de otro modo, antes de la cuantificación. La purificación puede hacerse, por ejemplo, en columnas Qiagen, suministradas en el Qiamp Blood Kit como se describe en Chen y col. (1996) (Nature medicine 2, 1033-1035). La cuantificación puede tener lugar inmediatamente después de la retirada de la muestra o después de un tiempo no especificado de almacenamiento de dicha muestra. En una realización preferida del procedimiento, el ADN que flota libre se separará del ADN unido a la célula mediante centrifugación después de que se haya determinado la cantidad de ADN total en dicha muestra (incluyendo unido a la célula) o también sin determinar el ADN unido a la célula.

Cualquier procedimiento mencionado en la etapa 2, puede hacerse por medios que son convencionales para los especialistas en la técnica, incluyendo estos el uso de lisados con detergente, sonicación y agitación con vórtice con perlas de vidrio. En una realización preferida, la muestra también se acondiciona por medio de conservación, como calentando o añadiendo compuestos químicos para desactivar o inhibir desoxirribonucleasas u otras enzimas que degradan ácidos nucleicos; almacenamiento a temperaturas reducidas (por debajo de temperatura ambiente) o no reducidas; enfriamiento; calentamiento; la adicción de detergentes; filtración y/o centrifugación. Por ejemplo, la muestra puede tratarse con proteinasa K (de Boehringer Mannheim) y dodecil sulfato sódico a 48ºC durante una noche antes de separar el ADN como se describe en Eisenberger y col (1999) (J Natl Cancer Inst 91: 2028-2032) de muestras de suero.

Además, el acondicionamiento en este contexto comprende aplicar procedimientos para concentrar el ADN en dicha muestra. Estos procedimientos pueden ser uno o varios de los procedimientos mencionados en la descripción de la técnica anterior y pueden ser cualquiera de los medios que son convencionales para los especialistas en la técnica. Algunos de ellos se describen en detalle en el Apéndice E del manual de laboratorio bien conocido de Sambrook, Fritsch y Maniatis (1989) Molecular Cloning - A Laboratory Manual (segunda edición): precipitation of DNA in microfuge tubes, precipitation of RNA with etanol, concentrating nucleic acids by extraction with butanol (vol 2: E.12, E. 15 y E. 16 respectivamente).

En realizaciones preferidas, el acondicionamiento también puede referirse a cualquier tipo de tratamiento químico, como la adición de un anticoagulante, tratamiento con agentes reductores, tratamiento con agentes químicos intercalantes o agentes químicos que forman enlaces covalentes con el ADN.

En una realización preferida, el ADN puede escindirse antes del tratamiento químico, esto puede hacerse por cualquier medio convencional en el objetivo de la técnica, en particular con endonucleasas de restricción.

La cuantificación del ADN que flota libre también puede hacerse por cualquier medio que es convencional para un especialista en la técnica. Las técnicas habitualmente usadas se basan en análisis espectrofotométricos y/o fluorométricos, por ejemplo: la concentración de una muestra diluida de ADN plasmídico purificada por dos pases a través de un gradiente de centrifugación de bromuro de etidio-cloruro de cesio (EtBr-CsCI) puede determinarse en un, por ejemplo, espectrofotómetro LKB Biochrom Ultrospec II para la absorbancia de longitudes de onda de 260 nm y 280 nm, o puede ensayarse para una emisión de 460 nm en el minifluorómetro Hoefer TKO 100 en presencia de bisbencimidazol, un colorante fluorescente conocido como Hoechst H 33258 (fabricado por American Hoechst Corporation), que tiene un máximo de excitación a 356 nm y un máximo de emisión de 458 cuando se une a ADN (Labarca y Paigen (1980) Anal. Biochem. 102, 344-352). El espectrofotómetro detecta la absorbancia debida al ARN así como al ADN, mientras que el colorante Hoechst usado en el fluorómetro interacciona específicamente con restos de adenosina y timidina del ADN. En una realización preferida, se usa el kit de cuantificación de ácido nucleico DNA Dipstick^{[TM]} de Invitrogen, que se reivindica que es suficientemente sensible para detectar solo 0,1 ng/\mul de ácido nucleico. Desafortunadamente, el procedimiento no puede usarse con muestras que contienen más de 10 ng/\mul de ácidos nucleicos (Trends in Biochemical Sciences 19, 46-47).

La cantidad total de ADN que flota libre puede medirse, por ejemplo, intercalando colorantes fluorescentes u otros colorantes que cambian sus propiedades de fluorescencia cuando se unen al ADN, y también por hibridación de sondas especificas de ADN incluyendo, aunque sin limitación, oligonucleótidos u oligómeros de PNA (ácido nucleico peptídico), ensayos de PCR a tiempo real u otros procedimientos de amplificación a tiempo real, absorbancia UV-Vis o en procedimientos generales de amplificación con determinación posterior de la cantidad de producto
formado.

En una tercera etapa, se determina al patrón de metilación del ADN que flota libre para descubrir de dónde se origina la mayoría del ADN.

Para hacer esto, la muestra de ácido nucleico primero se trata con un "agente especifico de metilo" como, aunque sin limitación, bisulfito o con, por ejemplo, enzimas de restricción sensibles a metilación. En una realización preferida, los ácidos nucleicos extracelulares se tratan químicamente de un modo tal que las bases de citosina que no están metiladas en la posición 5' se convierten en uracilo, timina, u otra base que es distinta de citosina en términos de comportamiento de hibridación. Esto se entenderá como tratamiento con un "agente especifico de metilo". Dicha conversión química puede tener lugar en cualquier formato convencional en la técnica. Esto incluye, aunque sin limitación, modificación en gel de agarosa o en disolventes desnaturalizantes. El ácido nucleico puede estar, pero no tiene que estar, concentrado y/o acondicionado de otro modo antes de que se trate dicha muestra de ácido nucleico con dicho agente. En esta tercera etapa del procedimiento, se prefiere que el tratamiento de ácido nucleicos extracelulares descrito anteriormente se realice con bisulfito (sulfito, disulfito) e hidrólisis alcalina posterior, que provoca una conversión de nucleobases de citosina no-metiladas a uracilo o a otra base que es distinta de citosina en términos de comportamiento de apareamiento de bases.

El ADN de doble hélice preferiblemente se desnaturaliza. Esto puede tomar la forma de una desnaturalización por calor realizada a temperaturas variables. La temperatura de desnaturalización generalmente depende del tampón pero para ADN de alto peso molecular puede ser de hasta 90ºC. Sin embargo, el análisis puede ser sobre fragmentos más pequeños que no requieren dichas altas temperaturas. Además, según transcurre la reacción y los restos de citosina se convierten a uracilo, la complementariedad entre las cadenas disminuye. Por lo tanto, un protocolo de reacción cíclica puede constar de temperaturas de desnaturalización variables.

Entonces, la conversión con bisulfito consta de dos etapas importantes, la sulfonación de la citosina y la desaminación posterior. Los equilibrios de la reacción están en el lado correcto de dos temperaturas diferentes para cada fase de la reacción. Las temperaturas y longitud a las que cada fase se realiza puede variar de acuerdo con la necesidad específica de la situación. Sin embargo, una variante preferida del procedimiento comprende un cambio de temperatura de 4ºC (10 minutos) a 50ºC (20 minutos). Esta forma de tratamiento con bisulfito está establecida en la técnica con referencia al documento WO 99/28498.

Dicha conversión química puede tener lugar en cualquier formato convencional en la técnica. Esto incluye, aunque sin limitación, la modificación en gel de agarosa, en disolventes desnaturalizantes o en capilares.

En realizaciones preferidas, la conversión con bisulfito en gel de agarosa se hará como se describe por Olek y col, Nucl. Acids. Res. 1996, 24, 5064-5066. El fragmento de ADN se sumerge en gel de agarosa y la conversión de citosina a un ácido tiene lugar con hidrogenosulfito y un eliminador radical. Después el ADN puede amplificarse sin necesidad de etapas de purificación adicionales.

Además, las modificaciones específicas en dichos ácidos nucleicos provocadas por dicho tratamiento se detectan por el uso de los procedimientos convencionales como se describe a continuación.

Para varios órganos y tejido sanos se han identificado ciertos sitios CpG y se describe en esta invención que están específicamente metilados. A partir de la combinación de diferentes ácidos nucleicos que circulan en el fluido corporal, estos sitios se ensayan para su estado de metilación. Esto se hace de un modo descrito a continuación: Los fragmentos del ADN pretratados químicamente se amplifican, usando conjuntos de oligonucleótidos cebadores y, preferiblemente, una polimerasa estable al calor. A causa de consideraciones estadísticas y prácticas, preferiblemente se amplifican más de diez fragmentos diferentes que tienen una longitud de 100-2000 pares de bases. La amplificación de varios segmentos de ADN puede realizarse de manera simultánea en uno y el mismo vaso de precipitado de reacción. Habitualmente, la amplificación se realiza por medio de una reacción en cadena de la polimerasa (PCR).

El procedimiento también puede estar posibilitado por el uso de cebadores alternativos, siendo obvio el diseño de dichos cebadores para un especialista en la técnica. Estos deben incluir al menos dos oligonucleótidos cuyas secuencias son cada complementarias inversas o idénticas a un segmento de al menos 18 pares de bases de longitud de las secuencias de bases. Dichos oligonucleótidos cebadores preferiblemente se caracterizan en que no contienen ningún dinucleótido CpG. En una realización particularmente preferida del procedimiento, la secuencia de dichos oligonucleótidos cebadores se diseñan de modo que hibridan selectivamente a y amplifican, sólo el ADN especifico de tejido de interés, minimizando de este modo la amplificación de ADN de fondo o no relevante. En el contexto de la presente invención, el ADN de fondo se entiende como ADN genómico que no tiene un patrón de metilación especifico de tejido relevante, en este caso, siendo el tejido relevante un tejido fuera del conjunto para el que se han encontrado genes marcadores, tanto sanos como enfermos.

De acuerdo con la presente invención, se prefiere que al menos un oligonucleótido cebador esté unido a una fase sólida durante la amplificación. Las secuencias oligonucleotídicas diferentes pueden ordenarse en una fase sólida plana en forma de un enrejado rectangular o hexagonal, estando preferiblemente la superficie en fase sólida compuesta de silicona, vidrio, poliestireno, aluminio, acero, hierro, cobre, níquel, plata, u oro, siendo posible usar también otros materiales tales como nitrocelulosa o plástico.

Los fragmentos obtenidos por medio de la amplificación, pueden llevar un marcador directa o indirectamente detectable. Se prefieren marcadores en forma de marcadores de fluorescencia, radionúclidos, o fragmentos de moléculas extraíbles que tienen una masa típica que puede detectarse en un espectrómetro de masas, siendo preferidos los fragmentos que se producen que tienen una carga neta positiva o negativa única para una mejor detectabilidad en el espectrómetro de masas. La detección puede realizarse y visualizarse por medio de espectrometría de masas por desorción/ionización con láser asistida por matriz (MALDI) o usando espectrometría de masas con electronebulización (IEN).

Los amplificados obtenidos se hibridan posteriormente en una serie o un conjunto de oligonucleótidos y/o sondas de PNA (ácido nucleico peptídico). En este contexto, la hibridación tiene lugar en el modo descrito a continuación. El conjunto de sondas usado durante la hibridación está compuesto preferiblemente de al menos 10 oligonucleótidos o PNA-oligómeros. En el procedimiento, los amplificados sirven como sondas, que hibridan con oligonucleótidos unidos previamente a una fase sólida. Los fragmentos no hibridados se retiran posteriormente. Dichos oligonucleótidos contienen al menos una secuencia de bases que tiene una longitud de 10 nucleótidos que es complementaria inversa o idéntica a un segmento de las secuencias de bases especificadas en el apéndice, conteniendo el segmento al menos un dinucleótido CpG. La citosina del dinucleótido CpG es del 5º al 9º nucleótido del extremo 5' del oligómero de 10 monómeros. Existe un oligonucleótido par cada dinucleótido CpG. Dichos PNA-oligómeros contienen al menos una secuencia de bases que tiene una longitud de 9 nucleótidos que es complementaria inversa o idéntica a un segmento de las secuencias de bases especificadas en el apéndice, conteniendo el segmento al menos un dinucleótido CpG. La citosina del dinucleótido CpG es del 4º al 6º nucleótido observado en el extremo 5' del oligómero de 9 monómeros. Preferiblemente, existe un oligonucleótido para cada dinucleótido CpG.

En la siguiente etapa, se retiran los amplificados no hibridados.

En la etapa final de este procedimiento, se detectan los amplificados hibridados. En este contexto, se prefiere que los marcadores unidos a los amplificados sean identificables en cada posición de la fase sólida en la que está localizada la secuencia oligonucleotídica.

De acuerdo con la presente invención, se prefiere que los marcadores de los amplificados sean marcadores de fluorescencia, radionúclidos, o fragmentos de moléculas extraíbles que tienen una masa típica que puede detectarse en un espectrómetro de masas. Se prefiere el espectrómetro de masas para la detección de los amplificados, fragmentos de los amplificados o de sondas que son complementarias a los amplificados, siendo posibles para la detección a realizar y visualizar por medio de espectrometría de masas por desorción/ionización con láser asistida por matriz (MALDI) o usando espectrometría de masas con electronebulización (IEN). Los fragmentos producidos pueden tener una carga neta positiva o negativa única para una mejor detectabilidad en el espectrómetro de masas.

Los patrones de metilación encontrados en la muestra ensayada se identificarán como pertenecientes a un cierto tejido u órgano. Esto se hace comprobando el patrón de metilación de ciertos genes marcadores específicos de órgano o comparando el patrón de metilación de un intervalo más amplio de varios genes con el patrón de los mismos genes cuando se extraen de diferentes tejidos u órganos. Un conjunto de datos individuales se compara con los datos recibidos en estudios previos o en un conjunto de datos obtenido en un experimento paralelo sobre un fluido de control.

Este análisis revelará la predominancia de una cierta fuente de ADN. Mediante la cantidad de ADN que flota libre que se origina de este tejido, específico en que muestra un cierto estado de metilación especifico, se determina la cantidad total relativa de ADN que flota libre.

En una cuarta etapa, la presencia o ausencia de una afección médica en dicho órgano se determina comparando el resultado de ensayo individual, con respecto a la proporción de un ADN de una fuente única a la cantidad de ADN total, con el conjunto de datos que se extrajo en estudios previos propios. Esto se basa en la proporción de la fracción de ADN que flota libre que se origina de un tejido u órgano especifico y la cantidad total de ADN que flota libre. En base a estos resultados es posible identificar pacientes con cantidades anormales de ADN de un cierto órgano o tejido, como aumentado en más del 10% por encima de un valor definido como "normal", en sus fluidos corporales. En una realización preferida, es posible identificar de manera positiva pacientes con niveles de ADN que flota libre aumentado en al menos, aunque sin limitación, un 20% por encima de un valor definido como normal. En una realización preferida adicional es posible identificar pacientes con un nivel aumentado de ADN que flota libre, especificado como aumentado en al menos, aunque sin limitación, un 40% por encima del normal.

Además, y de manera más importante, dichos análisis no sólo dirán que el nivel de ADN de los pacientes está aumentado sino que también revelará la posible causa del mismo, especificando de dónde viene el ADN extracelular. Esto dará al doctor o clínico implicado una herramienta valiosa para identificar una enfermedad en sus días muy tempranos, incluso antes de que pudieran suceder síntomas apreciables.

La invención proporciona un procedimiento descrito anteriormente caracterizado en que se encuentra que dicho patrón de metilación es específico para dicho órgano o tejido con respecto a otros órganos o tejidos.

En una realización preferida, el procedimiento se caracteriza en que se encuentra que dicho patrón de metilación es especifico para dicho órgano o tejido con respecto a patrones de metilación que pueden encontrarse en ADN de otros órganos o tejidos, especificados por el hecho de que no se encuentra en otros órganos o tejidos que están implicados en la afección médica de interés y por lo tanto independientes de la afección médica con la que podría diagnosticarse al paciente.

En una realización preferida adicional, el procedimiento se caracteriza en que se encuentra que dicho patrón de metilación es específico para dicho órgano o tejido con respecto a otros órganos o tejidos cuando la afección medica del paciente está diagnosticada que es un tumor u otra enfermedad proliferativa celular.

La invención proporciona un procedimiento para determinar la fracción de ADN que flota libre en un fluido corporal que se origina de un órgano o tejido de interés, caracterizado en que se realizan las siguientes etapas: Primero, retirar la muestra de fluido corporal de dicho individuo como se ha descrito anteriormente; segundo, detectar la cantidad de ADN total que flota libre en dicha muestra como se ha descrito anteriormente; tercero, determinar la cantidad de ADN que flota libre que se origina de un tejido u órgano especifico determinando la cantidad de ADN que flota libre que tiene un patrón de metilación característico para un tejido especifico que se determinó previamente; cuarto, determinar la fracción de ADN total que flota libre que se origina de dicho tejido u órgano; quinto, concluir si hay un nivel anormal de ADN total que flota libre, si este ADN se origina de dicho tejido u órgano y sexto, concluir si está presente una afección médica asociada con este tejido u órgano.

En una realización adicional, la invención proporciona un procedimiento para determinar la fracción de ADN que flota libre en un fluido corporal que se origina de un órgano o tejido de interés, caracterizado en que se realizan las siguientes etapas: Primero, retirar una muestra de fluido corporal de dicho individuo; segundo, acondicionar dicha muestra para preparar la unión del ADN que flota libre a una superficie; tercero, detectar la cantidad de ADN total que flota libre midiendo la cantidad de ADN unido a dicha superficie; cuarto, someter dicha superficie con el ADN inmovilizado a un tratamiento químico y/o enzimático que convierte todas las citosinas no metiladas del ADN en uracilo pero dejando las citosinas metiladas en la posición 5 sin cambiar como se ha descrito anteriormente; quinto, amplificar el ADN tratado; sexto, analizar varias posiciones en dicho ADN tratado y determinar la cantidad de ADN que tiene un patrón de metilación de ADN especifico de tejido que se determinó previamente; séptimo, determinar la fracción de ADN total que flota libre que se origina de dicho tejido u órgano.

En una realización adicional, el procedimiento incluye las siguientes etapas: Si hay un nivel anormal de ADN total que flota libre se concluye si este ADN se origina de dicho tejido u órgano y si está presente una afección medica asociada con este tejido u órgano.

La presente invención también se refiere a un procedimiento para diagnosticar una enfermedad o afección medica que comprende cualquiera de los procedimientos que se describen en esta invención.

Además, se describe un medio para producir un dispositivo para determinar la cantidad total de ADN que flota libre en un fluido corporal, comprendiendo una superficie para unir ADN que flota en un volumen de muestra de fluido corporal y un medio para detectar la cantidad de ADN unida a esta superficie sólida. El dispositivo se caracteriza adicionalmente en que comprende una cámara para hospedar la superficie y los reactivos para modificar química o enzimáticamente el ADN unido a dicha superficie y un medio para controlar y ajustar la temperatura en esta cámara.

Dicha superficie puede ser la misma descrita y usada en el kit DNA DipStick^{TM} (suministrado por Invitrogen) o de otros medios que posibilitan que el ADN se una de manera selectiva a un material aplicado a algún tipo no especificado de vehículo, que podría ser móvil o estar fijado. La unión puede, por ejemplo, estar basada en la hibridación no especifica de ácidos nucleicos. La cuantificación del ADN unido a dicha superficie puede realizarse por cualquier medio convencional para un especialista en la técnica o, por ejemplo, siguiendo las instrucciones dadas en el kit DNA DipStick^{TM}. Además, se describe un medio de cómo producir una cámara o tipo similar de medio cerrado para hospedar dicha superficie junto con los reactivos y/o enzimas necesarias para modificar el ADN unido a dicha superficie sólida.

El medio para controlar y ajustar la temperatura en esta cámara puede hacerse por un medio que es convencional para cualquier especialista en la técnica, por ejemplo, fijando un termómetro electrónico o cualquier dispositivo capaz de leer la temperatura y conectarlo a un chip programado para reaccionar de un cierto modo encendiendo una unidad de enfriamiento o calentamiento.

Sin embargo, un kit también puede contener sólo partes de los componentes mencionados anteriormente y pueden no incluir el dispositivo. Puede estar compuesto, por ejemplo, por un reactivo que contiene bisulfito, un conjunto de oligonucleótidos cebadores que contienen al menos dos oligonucleótidos cuyas secuencias en cada caso corresponden a o son complementarias a un segmento de 18 bases de longitud de una secuencia de bases especifica, oligonucleótidos y/o PNA (ácido nucleico peptídico)-oligómeros así como instrucciones para realizar y evaluar el procedimiento descrito.

Claims (12)

1. Un procedimiento para detectar la presencia o ausencia de una patología en un tejido u órgano de un individuo, que comprende las siguientes etapas:

a)

determinar la cantidad de ADN total que flota libre en una muestra de fluido corporal obtenida de dicho individuo;

b)

determinar la cantidad de ADN que flota libre que se origina de dicho tejido u órgano en dicha muestra;

c)

determinar la presencia o ausencia de una patología en base a la cantidad total de ADN que flota libre y la fracción de ADN que flota libre que se origina de dicho tejido u órgano.

2. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado en que la muestra se acondiciona antes de detectar la cantidad de ADN que flota libre.

3. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 2, caracterizado en que la muestra se acondiciona por medio de centrifugación, filtración, calentamiento, enfriamiento, concentración o tratamiento químico.

4. Un procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado en que la cantidad de ADN que se origina de un cierto órgano o tejido se determina analizando un patrón de metilación de ADN que es característico para dicho órgano o tejido.

5. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 4, caracterizado en que dicho patrón de metilación se encuentra en dicho órgano o tejido y no en otros órganos o tejidos implicados en la patología de interés.

6. Un procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado en que la patología es un tumor u otra enfermedad proliferativa celular.

7. Un procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado en que las muestras se obtienen de fluidos corporales como sangre completa, plasma sanguíneo, suero sanguíneo, orina, esputo, eyaculación, semen, lágrimas, sudor, saliva, fluido linfático, lavado bronquial, efusión pleural, fluido peritoneal, fluido meníngeo, fluido amniótico, fluido glandular, aspirados con aguja fina, fluido aspirado del pezón, fluido medular, fluido conjuntivo, fluido vaginal, jugo duodenal, jugo pancreático, bilis y fluido cerebromedular de dicho individuo.

8. Un procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado en que el patrón de metilación se determina sometiendo el ADN a un tratamiento químico o enzimático que convierte todas las citosinas no metiladas del ADN en uracilo pero que deja las citosinas metiladas en la posición 5 sin cambiar.

9. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la etapa b) comprende

I)

determinar la cantidad de ADN que flota libre que se origino de dicho tejido u órgano determinando la cantidad de ADN que flota libre que tiene un patrón de metilación de ADN característico de tejido u órgano

II)

determinar la fracción de ADN total que flota libre que se origina de dicho tejido u órgano;

y en el que la etapa c) comprende

III)

concluir, si hay un nivel anormal de ADN que flota libre que se origina de dicho tejido u órgano; y

IV)

concluir si está presente una patología asociada a dicho órgano o tejido.

10. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende las siguientes etapas

a)

acondicionar una muestra de fluido corporal obtenida de un individuo para preparar la unión del ADN que flota libre a una superficie;

b)

unir al menos una parte de dicho ADN a dicha superficie;

c)

detectar la cantidad de ADN total que flota libre midiendo la cantidad de ADN unido a dicha superficie;

d)

someter dicha superficie que comprende dicho ADN unido a un tratamiento químico y/o enzimático que convierte todas las citosinas no metiladas del ADN en uracilo pero que deja las citosinas metiladas en posición 5 sin cambiar;

e)

amplificar el ADN tratado;

f)

analizar varias posiciones en dicho ADN tratado y determinar la cantidad de ADN que tiene un patrón de metilación de ADN característico de tejido u órgano; y

g)

determinar la fracción de ADN total que flota libre que se origina de dicho tejido u órgano.

11. El procedimiento de la reivindicación 10, caracterizado en que se realizan las siguientes etapas adicionales:

h)

concluir, si este ADN se origina de dicho tejido u órgano, si hay un nivel anormal de ADN que flota libre; y

i)

concluir, si está presente una patología asociada a dicho tejido u órgano.

12. Un procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado en que la cantidad total de ADN que flota libre se mide intercalando colorantes fluorescentes u otros colorantes que cambian sus propiedades de fluorescencia cuando se unen al ADN, por hibridación con sondas especificas de ADN incluyendo, aunque sin limitación, oligonucleótidos u oligómeros de PNA, ensayos de PCR a tiempo real u otros procedimientos de amplificación a tiempo real, absorbancia UV-Vis o en general, procedimientos de amplificación con determinación posterior de la cantidad de producto formado.