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EP4355854A1 - Microcompartiments cellulaires de grande taille comprenant plusieurs cystes - Google Patents

Microcompartiments cellulaires de grande taille comprenant plusieurs cystes

Info

Publication number
EP4355854A1
EP4355854A1 EP22735136.8A EP22735136A EP4355854A1 EP 4355854 A1 EP4355854 A1 EP 4355854A1 EP 22735136 A EP22735136 A EP 22735136A EP 4355854 A1 EP4355854 A1 EP 4355854A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
cells
microcompartment
microcompartments
cell
hydrogel
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
EP22735136.8A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Maxime FEYEUX
Andréa LEONARD
Philippe Cohen
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Treefrog Therapeutics SAS
Original Assignee
Treefrog Therapeutics SAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from FR2106403A external-priority patent/FR3124193B3/fr
Application filed by Treefrog Therapeutics SAS filed Critical Treefrog Therapeutics SAS
Publication of EP4355854A1 publication Critical patent/EP4355854A1/fr
Pending legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/34—Internal compartments or partitions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0012—Cell encapsulation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/02—Form or structure of the vessel
    • C12M23/16—Microfluidic devices; Capillary tubes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M25/00—Means for supporting, enclosing or fixing the microorganisms, e.g. immunocoatings
    • C12M25/14—Scaffolds; Matrices
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M25/00—Means for supporting, enclosing or fixing the microorganisms, e.g. immunocoatings
    • C12M25/16—Particles; Beads; Granular material; Encapsulation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0696—Artificially induced pluripotent stem cells, e.g. iPS
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2513/00—3D culture
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/70—Polysaccharides
    • C12N2533/74—Alginate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2539/00—Supports and/or coatings for cell culture characterised by properties

Definitions

  • the invention relates to the cultivation of epithelial-like cells, such as three-dimensional pluripotent stem cells.
  • the culture of cells ex vivo is a field which is arousing growing interest.
  • the cultured cells can be of any type. They may be differentiated cells with different phenotypes, progenitor cells or stem cells.
  • An important advance in cell culture techniques is the introduction of three-dimensional culture systems. Three-dimensional cultures are in fact advantageously closer to natural systems in vivo, and can be used for numerous applications, in particular in the development of therapies.
  • a particularly suitable technology is that described in application WO2018/096277 which consists of three-dimensional cell microcompartments for the culture of stem cells.
  • existing 3D culture systems still have limitations in terms of cell yield and growth rate to even more closely approximate in vivo expansion rates and cycle times while maintaining of a stable epithelial phenotype.
  • the objective of the invention is to propose a cell culture solution in three dimensions meeting all of these needs and overcoming the drawbacks and limits of the prior art for an even more quantitative and always at least as qualitative culture.
  • maintaining a low seeding of cells makes it possible to increase the amplification factor between the seeding of the cells in the microcompartment and the harvesting of the microcompartment containing the amplified cells.
  • microcompartments comprising a few cells on seeding (1 to S in particular) die or restart their growth with a latency rate, which is detrimental to the yield of the culture and increases the duration required for encapsulated culture.
  • these problems are linked in particular to microcompartments of too small sizes, and in particular to microcompartments whose volume of the internal part is too small.
  • the subject of the invention is a three-dimensional cell microcompartment with an outer layer and an inner part, the inner part of which has sufficiently large dimensions to allow a high growth rate and a large quantity of cells at the time of harvesting of the microcompartment, starting from a low seeding of cells at the start.
  • the invention relates to a three-dimensional microcompartment of ovoid, cylindrical, spheroid or spherical or substantially ovoid, cylindrical, spheroid or spherical shape, comprising an outer hydrogel layer defining an inner part, said inner part comprising at least: - extracellular matrix elements, and
  • each cyst being formed by at least one layer of cells organized in three dimensions around a lumen, the smallest radius of the internal part of the microcompartment being at least 100 ⁇ m, preferably at least 200 ⁇ m .
  • Cells in each layer of cells organized in three dimensions around a lumen are cells capable of forming a cyst i.e. polarized cells with a basal face capable of forming tight junctions and expressing podocalyxin on the apical side (facing the lumen of the cyst). They are in particular epithelial cells or cells having an epithelial type morphology, human or animal.
  • the cells of each layer of cells organized in three dimensions around a lumen are preferably chosen from induced pluripotent strains (iPSC) and the following cells: glandular epithelial cells (e.g. mammary or salivary), renal epithelial cells, cells of intestinal epithelium (enterocytes), skin epithelium cells (keratinocytes), retinal pigment epithelium cells, epicardium cells, endocardium cells.
  • glandular epithelial cells e.g. mammary or salivary
  • renal epithelial cells e.g. mammary or salivary
  • keratinocytes skin epithelium cells
  • retinal pigment epithelium cells e.g., keratinocytes
  • epicardium cells e.g., endocardium cells.
  • such an arrangement in particular the presence of at least two cysts, makes it possible to increase the maximum number of cells contained in a microcompartment while preserving an epithelial phenotype around a lumen (cyst).
  • the size of the microcompartment according to the invention is chosen to allow the growth of several cysts while preserving a diffusion distance compatible with the physiology of the cells.
  • a subject of the invention is also a set of three-dimensional cell microcompartments comprising at least one cell microcompartment according to the invention, preferably in liquid suspension in a bioreactor.
  • microcompartments according to the invention can be useful for various applications and in particular in the prevention and/or treatment of pathologies.
  • the cellular microcompartments according to the invention can be obtained in particular by implementing a specific preparation process comprising the following steps:
  • step (b) mixing the cells from step (a) with extracellular matrix elements, in particular a biological or synthetic extracellular matrix,
  • the method according to the invention makes it possible to obtain microcompartments according to the invention with at least two cysts.
  • FIG. la is a diagram of a microcompartment according to the invention comprising several cysts of induced pluripotent stem cells. This diagram is a representation of the microcompartment presented in the photograph of FIG. [Fig. lb] is a phase contrast microscopy image of a microcompartment according to the invention.
  • FIG. 2a is a diagram of a series of microcompartments according to the invention.
  • FIG. 2b is a phase contrast microscopy image of a series of microcompartments according to the invention.
  • FIG. 3a is a diagram of a bioreactor containing a series of microcompartments according to the invention.
  • FIG. 3b is an image of a bioreactor containing a series of microcompartments according to the invention.
  • FIG. 4a is a diagram of the fusion of two cysts in a microcompartment according to the invention.
  • FIG. 4b is an image of the fusion of two cysts in a microcompartment according to the invention.
  • FIG. 5 is a representation of the results of tests on the amplification of pluripotent stem cells induced in microcompartments according to the invention.
  • alginate within the meaning of the invention is meant linear polysaccharides formed from b-D-mannuronate and a-L-guluronate, salts and derivatives thereof.
  • hydrogel capsule or “hydrogel microcompartment” within the meaning of the invention, is meant a three-dimensional structure formed from a matrix of polymer chains, swollen with a liquid and preferably water.
  • differentiated cells within the meaning of the invention is meant cells which exhibit a particular phenotype, as opposed to pluripotent stem cells which are not differentiated or progenitor cells which are in the process of differentiation.
  • epithelium cuboid, prismatic, squamous, or pseudostratified c' i.e. a layer of closely juxtaposed or contiguous cells, the majority of the cells of which contact the apical face and the basolateral face of the layer).
  • human cells within the meaning of the invention is meant human cells or immunologically humanized non-human mammalian cells. Even when this is not specified, the cells, stem cells, progenitor cells and tissues according to the invention consist of or are obtained from human cells or from immunologically humanized non-human mammalian cells.
  • mutant cell within the meaning of the invention, is meant a cell carrying at least one mutation.
  • progenitor cell within the meaning of the invention, is meant a stem cell already committed in cell differentiation but not yet differentiated.
  • embryonic stem cell within the meaning of the invention is meant a pluripotent stem cell of a cell derived from the internal cell mass of the blastocyst.
  • the pluripotency of embryonic stem cells can be assessed by the presence of markers such as the transcription factors OCT4, NANOG and SOX2 and surface markers such as SSEA3/4, Tra-1-60 and Tra-1-81.
  • the embryonic stem cells used in the context of the invention are obtained without destroying the embryo from which they originate, for example using the technique described in Chang et al. (Cell Stem Cell, 2008, 2(2)): 113-117).
  • human embryonic stem cells can be excluded.
  • pluripotent stem cell or “pluripotent cell” within the meaning of the invention, is meant a cell which has the capacity to form all the tissues present in the entire organism of origin, without however being able to form an entire organism by as such.
  • Human pluripotent stem cells may be called hPS in the present day. They may in particular be induced pluripotent stem cells (iPSC or hiPSC for human induced pluripotent stem cells), embryonic stem cells or MUSE cells (for “Multilineage-differentiating Stress Enduring”).
  • induced pluripotent stem cell within the meaning of the invention is meant a pluripotent stem cell induced to pluripotency by genetic reprogramming of differentiated somatic cells. These cells are notably positive for pluripotency markers, such as alkaline phosphatase staining and expression of NANOG, SOX2, OCT4 and SSEA3/4 proteins. Examples of methods for obtaining induced pluripotent stem cells are described in the articles Yu et al. (Science 2007, 318 (5858): 1917-1920), Takahashi et al (Cell, 207, 131(5): 861-872) and Nakagawa et al (Nat Biotechnol, 2008, 26(1): 101-106) .
  • layer of cells within the meaning of the invention is meant a monolayer of cells or epithelial layer.
  • cyst within the meaning of the invention is meant a three-dimensional arrangement in a monolayer of cells or in an epithelial, spherical layer, surrounding a central lumen.
  • Ferret diameter of a microcompartment is meant the distance “d” between two tangents to said microcompartment (or to said part), these two tangents being parallel, such that the entire projection of said microcompartment (or of said part) is comprised between these two parallel tangents.
  • a Ferret diameter of the internal part of the microcompartment is measured between two interfaces of the internal part and of the external layer of the microcompartment, that is to say the distance "d” between two tangents to said internal part, these two tangents being parallel, such that the entire projection of said internal part is comprised between these two parallel tangents.
  • variable thickness of a layer is meant in the sense of the invention the fact that the layer for the same microcompartment does not have the same thickness everywhere.
  • microcompartment or “capsule” within the meaning of the invention, is meant a partially or completely closed three-dimensional structure, containing several cells.
  • ⁇ culture medium within the meaning of the invention is meant a culture medium animated by internal movements.
  • mutation within the meaning of the invention, is meant a genetic or epigenetic mutation, preferably a functional mutation. It may in particular be a specific modification of the genetic sequence, a structural variant, an epigenetic modification, or a modification of the mitochondrial DNA.
  • “functional mutation” within the meaning of the invention is meant a transmissible genetic or epigenetic modification which confers a gain or loss of function or potential loss of function on the mutant cell concerned. It is preferentially a mutation resulting in a modification of the phenotype of the mutant cell concerned. Very preferably it is a change in the sequence of the genome and/or the epigenome which alters the therapeutic potential of a population of cells, either by increasing the risk associated with the therapy produced or by reducing the benefit provided by the therapy produced.
  • largest dimension of a microcompartment or of a cluster of cells or of a layer of cells within the meaning of the invention is meant the value of the largest Feret diameter of said microcompartment.
  • tissue or “biological tissue” within the meaning of the invention, is meant the common sense of tissue in biology, that is to say the intermediate level of organization between the cell and the organ.
  • a tissue is a set of similar cells of the same origin (most often from a common cell lineage, although they can find their origin by association of distinct cell lineages), grouped into clusters, networks or bundles (fibers) .
  • a tissue forms a functional whole, that is to say that its cells contribute to the same function.
  • Biological tissues regenerate regularly and are assembled together to form organs.
  • light or “lumen” within the meaning of the invention, is meant a volume of aqueous solution topologically surrounded by cells. Preferably, its content is not in diffusive equilibrium with the volume of convective liquid present outside the microcompartment.
  • smallest radius of the internal part of a microcompartment according to the invention is meant half the value of the smallest Ferret diameter of the internal part of the microcompartment.
  • average radius of the internal part of a microcompartment according to the invention is meant the average of the radii of the smallest compartment, each radius corresponding to half the value of a Ferret diameter of the internal part of the microcompartment.
  • the subject of the invention is therefore a three-dimensional microcompartment 10 of ovoid, cylindrical, spheroid or spherical or substantially ovoid, cylindrical, spheroid or spherical shape, comprising an outer layer 12 of hydrogel defining an inner part 14, said inner part 14 comprising at least :
  • each cyst being formed by at least one layer of cells 18 organized in three dimensions around a light 20.
  • the microcompartment is characterized in that the smallest radius of the internal part 14 is at least 100 miti, preferably at least 200 miti, in particular between 200 and 400 ⁇ m.
  • the microcompartment according to the invention comprises an outer layer of hydrogel.
  • the hydrogel used is biocompatible, that is to say it is not toxic to the cells.
  • the outer layer of hydrogel must allow the diffusion of oxygen and nutrients to supply the cells contained in the microcompartment and allow their survival.
  • the outer layer of hydrogel comprises at least alginate. It may consist exclusively of alginate.
  • the alginate may in particular be a sodium alginate, composed of 80% a-L-guluronate and 20% bD-mannuronate, with an average molecular mass of 100 to 400 kDa and a total concentration of between 0.5 and 5% by mass.
  • the outer hydrogel layer is cell-free.
  • the outer layer of hydrogel makes it possible in particular to protect the cells from the external environment, to limit the uncontrolled proliferation of the cells, and their differentiation in the event of differentiation.
  • the average thickness of outer layer 12 can be variable. It is preferably between 5 and 100 um, more preferably between 20 and 60 um. The ratio between the smallest radius of the internal part 14 and this thickness is preferably between 2 and 10.
  • an outer layer of hydrogel and extracellular matrix elements allows a uniform distribution of cells between the microcompartments.
  • this outer layer of hydrogel makes it possible to avoid fusions of microcompartments which are a major source of unfavorable variability for the phenotypic homogeneity of the cells.
  • the inner part 14, inside the outer hydrogel layer therefore comprises at least:
  • extracellular matrix elements 16 preferably in the form of an isotonic solution comprising extracellular matrix elements, in particular a biological or synthetic extracellular matrix, such as for example Matrigel ® , and
  • each cyst being formed by at least one layer of cells 18 organized in three dimensions around a light 20.
  • the extracellular matrix elements preferably comprise peptide or peptidomimetic sequences capable of binding to integrins. They are preferentially located in a layer between the cell cysts and the outer layer 12 of the hydrogel. These extracellular matrix elements were preferentially added during of the manufacture of the microcompartment and/or they were added to the microcompartment a posteriori and/or they were secreted or induced by the other constituents of the microcompartment.
  • the extracellular matrix elements preferably comprise a mixture of proteins and extracellular compounds necessary for the culture and the amplification of the cells.
  • the extracellular matrix elements comprise structural proteins, such as collagen, laminins, entactin, vitronectin, as well as growth factors, such as TGF-beta and/or EGF.
  • the inner part 14 may consist of or comprise Matrigel ® and / or Geltrex ® and / or a hydrogel type matrix of vegetable origin such as modified alginates or of synthetic origin or poly (N -isopropylacrylamide) and poly(ethylene glycol) (PNIPAAm-PEG) of the Mebiol ® type.
  • the presence of extracellular matrix elements promotes the adhesion of the initially encapsulated cells and contributes to obtaining and maintaining in the microcompartment at least two sources of separate cells which do not meet to each form a cyst.
  • the internal part 14 comprises an extracellular matrix.
  • the microcompartment comprises, in the internal part 14, extracellular matrix, it may be extracellular matrix secreted by the cells present in the microcompartment and/or extracellular matrix added at the time of preparation/manufacture of the microcompartment.
  • the solution containing extracellular matrix elements in particular if it is a natural (biological) or synthetic extracellular matrix, can form a gel.
  • the solution containing the extracellular matrix elements may optionally contain one or more cells.
  • the solution containing the extracellular matrix elements has a Young's modulus of between 0.05 and 3 kDa. Young's modulus can be measured by any method known to those skilled in the art, in particular by measuring the rheology of gels of the same composition as the intermediate layer or else by AFM (atomic force microscopy).
  • a solution containing the extracellular matrix elements (preferably a natural or synthetic extracellular matrix) with such Young's modulus values makes it possible to improve the maintenance of the cellular phenotype and the genomic integrity of the cells contained in this intermediate layer during the cell divisions.
  • Young's modulus (elasticity) favor the adhesion of the initially encapsulated cells and participate in obtaining and maintaining in the microcompartment at least two sources of separate cells which do not meet to form each a cyst.
  • the viscosity of the solution containing the extracellular matrix elements also promotes the adhesion of the initially encapsulated cells and participates in obtaining and maintaining in the microcompartment at least two sources of cells separated which do not meet to each form a cyst.
  • the inner part 14 can also comprise liquid zones without extracellular matrix elements. These liquid zones result from the equilibration by diffusion of the liquids present during the culture (initial seeding and change/renewal of possible media). This liquid zone is preferably mainly composed of culture media.
  • the outer layer of the microcompartment retains (at least partially) close to the cells, the factors and elements secreted by the latter, which reinforces the paracrine and autocrine effects within the microcompartment.
  • the internal part 14 of the microcompartment according to the invention comprises at least two cysts, each cyst being formed by at least one layer of cells 18 organized in three dimensions around a lumen 20.
  • Each cyst is formed by at least one layer of cells organized in three dimensions around a lumen, these human or animal cells preferentially excluding embryonic stem cells from human beings. These cells are cells capable of forming a cyst, i.e. polarized cells with a basal face capable of forming tight junctions and to express podocalyxin on the apical side (facing the lumen of the cyst).
  • each cyst is formed by at least one layer of cells that are epithelial or have an epithelial-like morphology.
  • the cells in each layer 18 are epithelial cells or cells having an epithelial-like morphology and capable of forming a cyst.
  • each cyst is formed by at least one layer of human or animal cells, organized in three dimensions around a lumen, chosen from induced pluripotent strains (iPSC) and the following cells: glandular epithelial cells (eg. breast or salivary cells), kidney epithelium cells, intestinal epithelium cells (enterocytes), skin epithelium cells (keratinocytes), retinal pigment epithelium cells, epicardium cells, endocardium.
  • glandular epithelial cells eg. breast or salivary cells
  • kidney epithelium cells eg. breast or salivary cells
  • intestinal epithelium cells e.g., intestinal epithelium cells (enterocytes)
  • keratinocytes skin epithelium cells
  • retinal pigment epithelium cells e.g., keratinocytes
  • epicardium cells e.g., endocardium.
  • a pluripotent stem cell means a cell that has the capacity to form all the tissues present in the entire organism of origin, without however being able to form an entire organism as such.
  • the pluripotent stem cells may be in particular induced pluripotent stem cells (IPS), MUSE (Multilineage-differentiating Stress Enduring) cells found in the skin and bone marrow of adult mammals, or embryonic stem cells (ES).
  • IPS induced pluripotent stem cells
  • MUSE Multilineage-differentiating Stress Enduring
  • the cells constituting each cyst are polarized.
  • the polarity of these cells within each cyst can be evidenced by the TJP-1 or ZO-1 proteins, both located on the inner/apical face of the pluripotent cell layer, which adjoins the lumen.
  • the cells encapsulated in the microcompartment are intended for use in cell therapy in humans, the cells may be immuno-compatible with the person intended to receive them to avoid any risk of rejection.
  • the cells present in the microcompartment carry few, if any, functional mutations.
  • the microcompartment according to the invention can contain at least 80, preferably at least 800, at least 1000, at least 5000, in particular at least 8000 cells, these cells being organized in the form of at least two cysts.
  • Each cyst formed by at least one layer of cells within the microcompartment is hollow, that is to say that it comprises a light or lumen.
  • the light is preferentially generated, at the time of the formation of the cyst, by the secretion of podocalyxin by the cells.
  • each cyst can contain a liquid, in particular culture medium and/or a liquid secreted by the cells.
  • a liquid in particular culture medium and/or a liquid secreted by the cells.
  • the presence of this hollow part allows the cells to have a small diffusive volume, the composition of which they can control, promoting cellular communication.
  • the internal part 14 is in equilibrium with the environment external to the microcompartment but can advantageously be enriched by the action of the cells with metabolic and/or secreted elements.
  • the presence of several cysts in the same microcompartment makes it possible to improve the reproducibility of the encapsulation process and by the same the reproducibility of the cell batches, improves the survival to the encapsulation and improves the amplification per unit of time.
  • the microcompartment can also comprise, in addition to the cysts, cells in suspension in the microcompartment.
  • each cyst present in the microcompartment was obtained by encapsulation in the internal part 14 of the microcompartments: from 1 to 30 cells, preferably from 1 to 10, in particular from 2 to 30 or from 3 to 30, in particular from 2 to 10 or from 3 to 10, more preferentially from 1 to 5, even more preferentially from 2 to 5 or from 3 to 5, preferentially at least 4 cells, and the smallest radius of the internal part 14 being at least 100 ⁇ m, preferably at least 200 ⁇ m.
  • the encapsulation of a controlled concentration of cells in a large size capsule (smallest radius of the internal part of the microcompartment of at least 100 ⁇ m) participates in obtaining at least two cysts in the microcompartment.
  • the internal part 14 of the microcompartments it is difficult to obtain two cysts with one cell, and it is preferable to encapsulate in the internal part 14 of the microcompartments at least 2 cells, preferably at least 3, even more preferably at least 4.
  • the encapsulation of a number of cells at the start greater than 30 is possible but less advantageous because it is difficult or even impossible (the probability decreases) to obtain two cysts with more than 20/25% by volume of cells in the internal part at the time of encapsulation, in particular because this limits the amplification capacity to X4 which is disadvantageous for the production of cell batches.
  • the cells present in the microcompartment according to the invention were preferably obtained after at least two cycles of cell division after the encapsulation in an outer layer of hydrogel of at least one cell.
  • the cells present in the microcompartment according to the invention have been obtained after at least 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 28, 30 cycles of cell division after encapsulation in an outer layer of hydrogel, preferentially of at least 2 cells, preferentially at least 3, even more preferentially at least 4, in particular between 2 and 30 cells.
  • the cells present in the microcompartment were obtained after at least six cycles of cell division after encapsulation of the cells in the outer hydrogel layer.
  • the number of cell divisions for implementing the method according to the invention is less than 300, even more preferably less than 200.
  • the microcompartment is obtained after at least 2 passes after encapsulation, more preferably at least 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 passes.
  • Each passage can last for example between 2 and 15 days, in particular between 3 and 10 days.
  • the microcompartment is obtained after at least one re-encapsulation, more preferably between 1 and 14 re-encapsulations, in particular between 2 and 7 re-encapsulations.
  • a re-encapsulation corresponds to a new pass and each encapsulation cycle corresponds to a pass.
  • all of the cells initially encapsulated in the microcompartment before the first cycle of cell division represents a volume less than 50% of the volume of the microcompartment in which they are encapsulated, more preferably less than 40%, 30%, 20%, 10% of the volume of the microcompartment in which they are encapsulated.
  • the cells present in the microcompartment according to the invention have been obtained after at least 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 28, 30 cycles of cell division, after encapsulation in an outer layer of hydrogel of cell(s) representing a volume less than 50% of the volume of the microcompartment in which they are encapsulated, plus preferably less than 40%, 30%, 20%, 10% of the volume of the microcompartment in which they are encapsulated.
  • the cells represent more than 50% by volume relative to the volume of the microcompartment, even more preferably more than 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% by volume relative to the volume of the microcompartment.
  • the volume of the internal part 14 preferably represents at least 20% of the total volume of the microcompartment, preferably at least 40%. This makes it possible to accommodate more cells after amplification, therefore more cysts and/or cysts of larger sizes.
  • the thickness of the layer of cells forming each cyst is preferentially between 6 and 200 mm, more preferentially between 6 and 60 ⁇ m.
  • the microcompartment according to the invention comprises at least one cyst resulting from the fusion of two cysts.
  • the cellular microcompartment according to the invention is closed or partially closed, ie the outer layer is closed or partially closed.
  • the microcompartment is closed.
  • the microcompartment according to the invention can be in any three-dimensional form, that is to say it can have the shape of any object in space.
  • the microcompartment can have any shape compatible with cell encapsulation.
  • the microcompartment according to the invention is in a spherical or elongated or substantially spherical or elongated shape. It can have the form of an ovoid, cylinder, spheroid or sphere or substantially that shape.
  • the external layer of the microcompartment that is to say the hydrogel layer, which gives its size and its shape to the microcompartment according to the invention.
  • the smallest dimension of the microcompartment according to the invention is between 202 ⁇ m and 1 mm, preferably between 202 ⁇ m and 700 ⁇ m, even more preferably 202 ⁇ m and 600 ⁇ m, in particular between 202 ⁇ m and 500 ⁇ m.
  • Its largest dimension is preferably greater than 202 ⁇ m, more preferably between 20 2 ⁇ m and 1 m, even more preferably between 20 2 ⁇ m and 50 cm.
  • the invention also relates to several microcompartments together.
  • the invention also relates to a set or series of microcompartments comprising at least two cellular microcompartments in three dimensions, characterized in that at least one microcompartment is a microcompartment according to the invention.
  • the series of microcompartments according to the invention is in a culture medium, in particular in an at least partially convective culture medium.
  • a culture medium suitable for cell culture can be used, and in particular phosphate buffer saline such as for example the medium “dulbecco's modified eagle medium” or “Roswell Park Memorial Institute medium” when the concentration of dissolved salts is compatible with the maintenance of the cross-linking of the alginate by the divalent cations.
  • the subject of the invention is a series of cellular microcompartments in a closed enclosure, such as a bioreactor, preferably in a culture medium in a closed enclosure, such as a bioreactor.
  • a closed enclosure such as a bioreactor
  • the microcompartments are placed in a culture medium in a closed bioreactor.
  • the set or series of microcompartments according to the invention preferably comprises between 2 and 10 16 microcompartments.
  • microcompartments according to one of the invention can be used for any application, in particular as a drug in cell therapy in humans or animals.
  • microcompartment according to the invention can optionally be frozen in order to be stored. It should then preferably be thawed before use. Process for obtaining microcompartments according to the invention
  • the invention also relates to a process for preparing microcompartments according to the invention.
  • the process for preparing a microcompartment or a set of microcompartments according to the invention may comprise the following steps:
  • step (b) mixing the cells from step (a) with extracellular matrix elements, in particular a biological or synthetic extracellular matrix, - (c) encapsulating the cell suspension in a layer of hydrogel so as to form a microcompartment of ovoid, cylindrical, spheroid or spherical or substantially ovoid, cylindrical, spheroid or spherical shape, comprising an outer hydrogel layer defining an inner part, the smallest radius or the mean radius of said inner part being at least 100 pm; - (d) cultivating the microcompartments obtained in an isotonic rinsing buffer, preferably for less than 30 minutes, then in a culture medium, preferably in a culture medium containing at least one cytoprotective factor, in particular an apoptosis inhibitor and/ or Rho/A kinases;
  • the number of cells encapsulated in each microcompartment in step c) is preferentially from 1 to 30 cells, in particular from 2 to 30 or from 3 to 30, preferentially from 1 to 10, in particular from 2 to 10 or from 3 to 10 , more preferably from 1 to 5, even more preferentially from 2 to 5 or from 3 to 5, preferentially at least 4 cells.
  • the encapsulation of a controlled concentration of cells in a large size capsule (smallest radius of the internal part of the microcompartment of at least 100 ⁇ m) participates in obtaining at least two cysts in the microcompartment.
  • Any culture medium suitable for culturing cells in particular pluripotent stem cells, can be used, and in particular saline phosphate buffer such as “Roswell Park Memorial Institute medium” or Mtesrl or E8 Essential for example.
  • the cytoprotective factor can for example be one or more inhibitor(s) of the RHO/ROCK (“Rho-associated protein kinase”) pathways and/or an apoptosis inhibitor known to those skilled in the art or any other known cytoprotective factor. of the skilled person.
  • the cytoprotective factor must make it possible to promote the survival of the cells, and in the case of the presence of an extracellular matrix, their adhesion of the cells to the extracellular matrix at the time of the formation of the outer layer of hydrogel around said extracellular matrix .
  • all of the cells initially encapsulated in step (c) preferably represent a volume of less than 50% of the volume of the microcompartment in which they are encapsulated, more preferably less than 40%, 30%, 20% , 10% of the volume of the microcompartment in which they are encapsulated.
  • the method according to the invention may comprise a step prior to step a) or b) of dissociation of the cells by chemical, enzymatic or mechanical dissociation.
  • This step is very preferentially necessary due to the fact that cells of epithelial type, in particular stem cells, are adherent cells.
  • the encapsulated cells are in suspension in the form of single cells and/or of clusters or set(s) of at least two cells (“cluster(s)”).
  • cluster(s) the single cell or cells represent less than 50% in number of all the cells initially encapsulated in step (b).
  • each cluster of cells initially encapsulated in step (c) has a largest dimension less than 20% of the largest dimension of a microcompartment in which it is encapsulated, even more preferably less than 10%.
  • the cell clusters should not be too large in size compared to the size of the microcompartment because too large a size of these initial cell clusters could lead, during cell divisions, to earlier cell confluence in the capsule; this too early confluence of all or part of the capsules could lead to an increase in intracellular pressures and lead to cellular stress, impacting cell growth but also chromosomal segregation.
  • the method according to the invention comprises a step b) of mixing the cells with an extracellular matrix between step a) and step c).
  • this step b) can optionally be implemented before step (a) or else simultaneously with the encapsulation in step (c).
  • Step c) of encapsulation is implemented according to techniques known to those skilled in the art. Indeed, any method for producing cellular microcompartments containing, inside a hydrogel capsule, the extracellular matrix and cells can be used for the implementation of the preparation method according to the invention.
  • it is possible to prepare microcompartments by adapting the method and the microfluidic device described in Alessandri et al., 2016 (“A 3D printed microfluidic device for production offunctionalized hydrogel microcapsules for culture and differentiation ofhuman Neuronal Stem Cells (hNSC)”, Lab on a Chip, 2016, vol.16, no.9, p.1593-1604), following the steps described below.
  • step c) is implemented in a device capable of generating hydrogel capsules using a microfluidic chip.
  • the device can comprise syringe pumps for several solutions injected concentrically using a microfluidic injector which makes it possible to form a jet which splits into drops then collected in a calcium bath.
  • two or three solutions are loaded onto two or three syringe pumps:
  • hydrogel solution for example alginate
  • an isotonic intermediate solution preferably an isotonic solution not containing a divalent cation such as Ca 2+ Mg 2+ to avoid cross-linking of the hydrogel too early in the injector, such as for example a sorbitol solution, the solution from step b) comprising cells, culture medium and the extracellular matrix.
  • step b) comprising cells; These drops are collected in a calcium bath which crosslinks and/or gels the alginate solution to form the shell.
  • the hydrogel solution is preferably charged with a direct current at (between 1 and 10kV).
  • a grounded ring may optionally be placed at a distance from the tip of between 1mm and 20cm, preferably 3mm to 10cm, even more preferably 1cm to 5cm, from the tip in the plane perpendicular to the axis of the jet emerging from the microfluidic injector (coextrusion chip) to generate the electric field.
  • the solution is maintained at a temperature below 4° C. before being injected, to prevent the solution from gelling due to the presence of extracellular matrix elements.
  • the invention proposes in particular to modify the flow rate of the coextruded solutions and the final opening of the coextrusion chip.
  • flow rate is meant the flow rate of each solution which arrives at the injector.
  • final opening of the co-extrusion chip is meant the internal opening of the output channel of the chip.
  • the coextrusion chip (microfluidic injector) which passes from a value preferably between 50 and 120 ⁇ m for the standard sizes of capsules known from the prior art, to a diameter value comprised between 150 and 300 mm, preferably between 180 and 240 ⁇ m.
  • step (c) of encapsulation is carried out using a microfluidic injector whose final opening diameter is between 150 and 300 ⁇ m, preferably between 180 and 240 ⁇ m, and with the flow rate of each of the 3 solutions comprised between 45 and 150 mL/h, preferably between 45 and 110 mL/h.
  • this encapsulation is carried out by co-injection of three solutions:
  • an isotonic intermediate solution such as for example a sorbitol solution
  • step b) the solution resulting from step b) comprising cells, culture medium and the extracellular matrix, concentrically via a microfluidic injector which makes it possible to form a jet at the injector outlet consisting of the mixture of the three solutions, said jet splitting into drops, said drops being collected in a calcium bath which stiffens the hydrogel solution to form the outer layer of each microcompartment, the inner part of each drop being constituted by the solution resulting from step (b) comprising cells, culture medium and extracellular matrix.
  • steps (d), (e) and (f) are carried out with permanent or sequential stirring.
  • This agitation is important because it maintains the homogeneity of the culture environment and avoids the formation of any diffusive gradient. For example, it allows homogeneous control of the level of cellular oxygenation; thus avoiding the phenomena of necrosis linked to hypoxia, or oxidative stress linked to hyperoxia. By avoiding an increase in cell death and/or oxidative stress, agitation contributes to maintaining the genetic integrity of cells.
  • the method according to the invention is preferably implemented in a closed enclosure such as a closed bioreactor.
  • the number of cell division cycles in step (f) is at least 2, B, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 cell division cycles.
  • the microcompartment is obtained after at least 2 passes (one pass corresponding here to a complete cycle of steps (a), (b), and (e), optionally (c) and (d)), more preferably at least 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 passes.
  • Each passage can last for example between 2 and 15 days, in particular between 3 and 8 days.
  • the method according to the invention comprises at least one re-encapsulation of the cells after step (f), that is to say at least two encapsulation cycles.
  • each encapsulation cycle corresponds to one pass.
  • the number of cell divisions of the entire process (for all the passages) is at least 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30 cycles of cell division.
  • Each re-encapsulation may include:
  • the removal of the outer hydrogel layer can be carried out in particular by hydrolysis, dissolution, piercing and/or rupture by any means that is biocompatible, that is to say non-toxic for the cells.
  • removal can be achieved using phosphate buffered saline, a divalent ion chelator, an enzyme such as alginate lyase if the hydrogel includes alginate, and/or laser microdissection, and - a step of re-encapsulation of all or part of the cells or clusters of cells in a hydrogel capsule.
  • Re-encapsulation is a suitable means for increasing the cellular amplification obtained from the pluripotent stage, and reducing the risks of mutation.
  • the re-encapsulation consists in eliminating the outer layer of hydrogel, preferably in resuspending, in a partially or totally dissociated manner, the cells which were in the form of cysts in the microcompartments and in re-implementing the steps of the method.
  • the re-encapsulation comprises the following steps: - (i) removing the outer hydrogel layer,
  • step (iii) mixing the cells from step (a) with extracellular matrix elements, - (iv) encapsulating the cell solution in a layer of hydrogel so as to form an ovoid, cylindrical, spheroid-shaped microcompartment or spherical or substantially ovoid, cylindrical, spheroid or spherical, comprising an outer hydrogel layer defining an inner part, the smallest radius or the mean radius of said inner part being at least 100 ⁇ m; - (v) cultivating the microcompartments obtained in a culture medium containing at least one cytoprotective factor, in particular an inhibitor of apoptosis and/or Rho/A kinases,
  • Compartmentalization in microcompartments makes it possible to eliminate the microcompartments containing more mutated cells than the other capsules. Even if mutated cells grow rapidly they will reach capsular confluence which will contain their multiplication. Compartmentalization also makes it possible not to contaminate the entire cell population, and also to eliminate the capsules containing mutant cells, at any time, in particular before a re-encapsulation step. This sorting can be done either by online analysis, or by eliminating the capsules filled more quickly than the others, for example.
  • the encapsulated cells are differentiated cells which are reprogrammed into pluripotent cells inside the hydrogel capsule during the formation of the microcompartments.
  • the cell reprogramming agents can be added in step (a) and/or (b) and/or (c) and/or (d) and/or (ii) and/or (iii) and /or (iv) and/or (v).
  • these are cell reprogramming agents that are non-permeable with respect to the hydrogel layer.
  • the addition of reprogramming agents is particularly relevant when the initially encapsulated cells are differentiated cells which it is desired to dedifferentiate in particular up to the pluripotent stage.
  • reprogramming agents A person skilled in the art knows how to proceed with the reprogramming of a differentiated cell into a stem cell by reactivating the expression of the genes associated with the embryonic stage by means of specific factors, designated in the present invention as “reprogramming agents”.
  • reprogramming agents include the methods described in Takahashi et al., 2006 (“Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors” Cell, 2006 Vol 126, pages 663-676), Ban et al., 2009 (“Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome” Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci.
  • the reprogramming agents are advantageously co-encapsulated with the differentiated cells, so as to concentrate the product and promote contact with all of the cells.
  • reprogramming agents that are permeable to the hydrogel layer, it is possible to add said agents to the culture medium after the encapsulation step.
  • Reprogramming agents make it possible to impose on cells a succession of phenotypic changes up to the pluripotent stage.
  • the reprogramming step is carried out using specific culture media, favoring these phenotypic changes.
  • the cells are cultured in a first medium comprising 10% human serum, or bovine, in Eagle's minimum essential medium (DMEM) supplemented with a protein kinase serine/threonine receptor inhibitor (such as the product SB-431542 (C 22 H 16 N 4 O 3 )), one or more inhibitors of the RHO pathways /ROCK ("Rho-associated protein kinase"), such as thiazovivin and/or Y-27632, fibroblast growth factors, such as FGF-2, ascorbic acid and antibiotics, such as Trichostatin A (C 17 H 22 N 2 O 3 ).
  • DMEM Eagle's minimum essential medium
  • a protein kinase serine/threonine receptor inhibitor such as the product SB-431542 (C 22 H 16 N 4 O 3 )
  • ROCK Rho-associated protein kinase
  • fibroblast growth factors such as FGF-2
  • ascorbic acid such as Trichostatin A (C 17 H 22 N 2 O
  • step (a) and/or (ii) is preferably carried out for a time comprised between a few minutes and a few hours, preferably between 2 minutes and 2 hours, more preferably between 10 minutes and 1 hour.
  • Step (d) and/or (v) of culture with a cytoprotective factor is carried out for a time of between 2 and 48 hours, preferably for a time of between 6 and 24 hours, more preferably for a time of between 12 and 18 hours.
  • the rinsing step can be carried out by one or more rinsings, in successive culture media free of inhibitors of the RHO/ROCK pathways, less than 48 hours, preferably less than 24 hours, more preferably between 12 and 18 hours after the start of step (d) and/or (v).
  • At least one of the steps is carried out at a temperature adapted to the survival of the cells, comprised between 4 and 42°C.
  • the temperature during cell proliferation should preferably be between 32 and 37°C to avoid triggering mutations by lowering the performance of repair enzymes.
  • the temperature should be low (ideally about 4°C) to manage the stress of the cells in step (c).
  • the method according to the invention may comprise a step consisting in verifying the phenotype of the cells contained in the microcompartment. This verification can be carried out by identifying the expression by at least some of the cells contained in the microcompartment, of at least one gene specific for the desired phenotype.
  • the cellular microcompartments obtained according to the methods of the invention can then be frozen before any use.
  • the freezing is preferably carried out at a temperature between -190°C and -80°C.
  • Thawing can be done in a bath lukewarm water (preferably 37 degrees) so that the cells thaw fairly quickly.
  • the microcompartments according to the invention before their use can be maintained at more than 4°C for a limited period before their use, preferably between 4°C and 38°C.
  • the implementation of the method according to the invention makes it possible to obtain microcompartments comprising at least 80, preferably at least 800, at least 1000, at least 5000, in particular at least 8000 cells, these cells being organized in the form of at least least two cysts.
  • the 3-dimensional structure of the cells in the microcompartment and the low or even zero percentage of isolated cells during encapsulation reduces chromosomal desegregation and consequently reduces the appearance of new mutagenesis.
  • the invention especially promotes amplification with a high amplification factor, which consequently reduces the culture time and the number of divisions to obtain a very large number of cells, and therefore limits new mutagenesis.
  • the protection of the cells thanks to the outer layer and the presence of extracellular matrix elements decreases chromosomal desegregation and limits the mechanical stress of the cells, and consequently decreases the appearance of new mutagenesis.
  • the presence of several cysts in each microcompartment also makes it possible to promote initial cell survival and smooth growth asynchronies.
  • Figures 1a and 1b show hollow hydrogel capsules allowing the growth of several human pluripotent stem cell cysts in the central microcompartment.
  • Figures 2a and 2b show a microscopy image, at D6.5 post encapsulation showing a plurality of hollow alginate capsules containing human pluripotent stem cells.
  • the scale bar is 500um.
  • the microcompartments according to the invention comprise several colonies of 3D stem cells. These colonies all present a homogeneous cystic configuration with an average diameter of 170um. On average, we observed 2.6 colonies (cysts) per capsule at this stage of the culture.
  • Figures 3a and 3b show a plurality of multi-cyst capsules cultured in suspension in a bioreactor.
  • Encapsulation of hiPSCs and suspension culture were performed for 2 separate cycles.
  • the target oxygen level of 20% dissolved oxygen is described as a hypoxic condition (unlike bioreactors with a 100% dissolved oxygen level which are described as normoxic).
  • a fed batch strategy i.e. renewal of the culture medium by subtraction/addition of medium at regular intervals, was applied, leading to an increase in the volume of work and a decrease in the concentration of the capsules relative to the total volume.
  • Cell density can be expressed in millions of cells per milliliter of capsules.
  • the volume of the harvested capsule is measured in a graduated glass cylinder. The number of cells measured can be related to this previously measured capsule volume to deduce a cell concentration per capsule volume.
  • the viability was evaluated by the nucleocounter NC-3000 (Chemometech). Decapsulated and dissociated cells were fixed and stained for OCT4, SOX2 and NANOG and analyzed by flow cytometry, BD Accuri C6 plus. The results for the amplification factor are also shown in Figure 5.
  • FIG. 4b is represented a series of photos taken from a video-microscopy of a capsule comprising several cysts according to the invention.
  • the observation is carried out in transmission with an IM Nikon bio-station with a lOx objective.
  • the average outer diameter of the quasi-spherical capsule is 288 ⁇ m as indicated by the 100 ⁇ m scale bar.
  • the initial image was taken 4 days after encapsulation.
  • the sequence illustrates the growth of multiple colonies of pluripotent stem cells in a hollow hydrogel capsule. These colonies are cultured in a closed 3D microcompartment, defined externally by a layer of cross-linked alginate.
  • the inner compartment is described as hollow, in the sense that it contains no cross-linked alginate.
  • the internal compartment containing the cells also contains the extracellular matrix (here Matrigel ® ) which is visible under microscopy by a granulosity different from that of alginate.
  • the volume injected into the internal microcompartments comes from 50% of the cell/matrix mix and 50% of an isomolar solution of sorbitol (cf. method).
  • the internal space is at least 50% liquid.
  • the 3 colonies have a homogeneous cystic configuration with respective diameters of 76 um, 100 um and 78 um (cyst at the bottom right of the image).
  • the epithelial thickness of these cysts is respectively 10um 13um and 12um. It is observed that the 2 cysts at the top left of the capsule gradually come into contact and merge their internal lumens as well as their epithelia. This results in a larger stem cell colony which also has a circular and symmetrical cystic structure.
  • the use of progressively degradable extracellular matrices such as Matrigel further allows the cells to grow in a more permissive 3D environment than during encapsulation in a bead full of hydrogel; and thus makes it possible to maintain an epithelial cystic structure despite the forces generated by cell multiplication.
  • the partially liquid hollow intracapsular space of this large capsule allows 3D stem cell colonies to grow while preserving a stable cystic epithelial phenotype.
  • the stability of this phenotype allows a good phenotypic homogeneity of the cells produced and a robust/reliable bioproduction process, Illustrating the persistence of the epithelial phenotype during the growth of several cysts
  • Figure 4a illustrates a "multi-cyst" sequence fusion into capsules: - A: Self-organization and luminogenesis of 3D colonies of stem cells inside the microcompartment. Formation of encapsulated stem cell cysts

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Abstract

L'invention concerne un microcompartiment cellulaire en trois dimensions ou un ensemble de microcompartiments cellulaires en trois dimensions de forme ovoïde, cylindrique, sphéroïde ou sphérique ou sensiblement ovoïde, cylindrique, sphéroïde ou sphérique, comprenant une couche externe en hydrogel définissant une partie interne (14), ladite partie interne comprenant au moins : - des éléments de matrice extracellulaire, et - au moins deux cystes, chaque cyste étant formé par au moins une couche de cellules humaines ou animales organisée en trois dimensions autour d'une lumière, le plus petit rayon ou le rayon moyen de la partie interne étant d'au moins 100 µm. L'invention a également pour objet un procédé de préparation d'un tel microcompartiment ou ensemble de microcompartiment.

Description

Microcompartiments cellulaires de grande taille comprenant plusieurs cystes
Domaine technique
L'invention concerne la culture de cellules de type épithéliales, telles que des cellules souches pluripotentes en trois dimensions.
Art antérieur La culture de cellules ex vivo est un domaine qui suscite un intérêt croissant. Les cellules cultivées peuvent être de tout type. Il peut s'agir aussi bien de cellules différenciées avec différents phénotypes, de cellules progénitrices que de cellules souches. Une avancée importante dans les techniques de culture cellulaire est l'introduction de systèmes de culture tridimensionnels. Les cultures en trois dimensions sont en effet avantageusement plus proches des systèmes naturels in vivo, et peuvent être utilisées pour de nombreuses applications en particulier dans le développement de thérapies. Une technologie particulièrement adaptée est celle décrite dans la demande WO2018 /096277 qui consiste en des microcompartiments cellulaires en trois dimensions pour la culture de cellules souches. Toutefois, malgré leur efficacité, les systèmes de culture 3D existants présentent encore des limites en termes de rendement et de taux de croissance des cellules pour se rapprocher encore plus des taux d'expansion in vivo et de la durée des cycles tout en assurant le maintien d'un phénotype épithélial stable.
L'objectif de l'invention est de proposer une solution de culture cellulaire en trois dimensions répondant à l'ensemble de ces besoins et palliant les inconvénients et limites de l'art antérieur pour une culture encore plus quantitative et toujours au moins aussi qualitative.
Résumé de l'invention
En travaillant sur le développement de microcompartiments cellulaires pour la culture en 3D de cellules épithéliales ou ayant une morphologie de type épithéliale et aptes à former des cystes, telles que des cellules souches pluripotentes, les inventeurs ont mis au point un système permettant d'augmenter le nombre maximal de cellules contenues dans un microcompartiment organisées autour d'une lumière (cyste) tout en conservant un phénotype épithélial
Selon l'invention, le maintien d'un ensemencement faible de cellules permet d'augmenter le facteur d'amplification entre l'ensemencement des cellules dans le microcompartiment et la récolte du microcompartiment contenant les cellules amplifiées. Or, dans les systèmes existants, des microcompartiments comprenant quelques cellules à l'ensemencement (1 à S en particulier) meurent ou relancent leur croissance avec un taux de latence ce qui nuit au rendement de la culture et augmente la durée nécessaire de culture encapsulée.
Selon l'invention, ces problématiques sont liées en particulier à des microcompartiments de trop petites tailles, et notamment à des microcompartiments dont le volume de la partie interne est trop faible.
Aussi l'invention a pour objet un microcompartiment cellulaire en trois dimensions avec une couche externe et une partie interne, dont la partie interne a des dimensions suffisamment importantes pour permettre un taux de croissance important et une grande quantité de cellules au moment de la récolte du microcompartiment, en partant d'un faible ensemencement de cellules au départ.
En particulier, l'invention vise un microcompartiment en trois dimensions de forme ovoïde, cylindrique, sphéroïde ou sphérique ou sensiblement ovoïde, cylindrique, sphéroïde ou sphérique, comprenant une couche externe en hydrogel définissant une partie interne, ladite partie interne comprenant au moins : - des éléments de matrice extracellulaire, et
- au moins deux cystes, chaque cyste étant formé par au moins une couche de cellules organisée en trois dimensions autour d'une lumière, le plus petit rayon de la partie interne du microcompartiment étant d'au moins 100 pm, préférentiellement au moins 200 pm. Les cellules de chaque couche de cellules organisées en trois dimensions autour d'une lumière sont des cellules capables de former un cyste c'est-à-dire des cellules polarisées avec une face basale capables de former des jonctions serrées et d'exprimer la podocalyxin sur la face apicale (faisant face à la lumière du cyste). Il s'agit en particulier de cellules épithéliales ou ayant une morphologie de type épithéliale, humaines ou animales. Les cellules de chaque couche de cellules organisées en trois dimensions autour d'une lumière sont préférentiellement choisies parmi les souches pluripotentes induites (iPSC) et les cellules suivantes : cellules d'épithéliums glandulaires (par ex. mammaires ou salivaires), cellules d'épithélium rénal, cellules de l'épithélium intestinal (entérocytes), cellules de l'épithélium de la peau (kératinocytes), cellules de l'épithélium pigmentaire rétinien, cellules de l'épicarde, cellules de l'endocarde.
Avantageusement un tel agencement, en particulier la présence d'au moins deux cystes, permet d'augmenter le nombre maximal de cellules contenues dans un microcompartiment tout en conservant un phénotype épithélial autour d'une lumière (cyste). La taille du microcompartiment selon l'invention est choisi pour permettre la croissance de plusieurs cystes tout en préservant une distance de diffusion compatible avec la physiologie des cellules.
L'invention a également pour objet un ensemble de microcompartiments cellulaires en trois dimensions comprenant au moins un microcompartiment cellulaire selon l'invention, préférentiellement en suspension liquide dans un bioréacteur.
Les microcompartiments selon l'invention peuvent être utiles pour différentes applications et notamment dans la prévention et/ou le traitement de pathologies.
Les microcompartiments cellulaires selon l'invention peuvent être obtenus en particulier par la mise en œuvre d'un procédé de préparation spécifique comprenant les étapes suivantes :
- (a) incuber des cellules dans un milieu de culture, préférentiellement dans un milieu de culture contenant au moins un facteur cyto protecteur, notamment un inhibiteur de l'apoptose et/ou des Rho/A kinases,
- (b) mélanger les cellules issues de l'étape (a) avec des éléments de matrice extracellulaire, notamment une matrice extracellulaire biologique ou de synthèse,
- (c) encapsuler la suspension de cellules dans une couche d'hydrogel de façon à former un microcompartiment de forme ovoïde, cylindrique, sphéroïde ou sphérique ou sensiblement ovoïde, cylindrique, sphéroïde ou sphérique, comprenant une couche externe en hydrogel définissant une partie interne, le plus petit rayon de ladite partie interne étant d'au moins 100 pm ;
(d) cultiver les microcompartiments obtenus dans un tampon de rinçage isotonique, préférentiellement moins de 30 minutes, puis dans un milieu de culture, préférentiellement dans un milieu de culture contenant au moins un facteur cyto protecteur, notamment un inhibiteur de l'apoptose et/ou des Rho/A kinases ;
- (e) préférentiellement rincer les microcompartiments, de manière à éliminer le facteur cytoprotecteur (inhibiteur de l'apoptose et/ou des Rho/A kinases), préférentiellement dans un délai de 48h après encapsulation, encore plus préférentiellement dans un délai de 24h;
- (f) cultiver les microcompartiments pendant au moins deux cycles de division cellulaire (amplification), préférentiellement entre 1 et 60 jours, entre 1 et 30 jours, entre 1 et 20 jours, encore plus préférentiellement entre 2 et 30 jours, entre 2 et 20 jours, entre 3 et 30 jours, entre 3 et 20 jours, notamment entre 4 et 7 jours, en particulier entre 5 et 7 jours, dans un milieu de culture dépourvu de facteur cytoprotecteur, et
- (g) optionnellement récupérer les microcompartiments cellulaires obtenus.
Le procédé selon l'invention permet d'obtenir des microcompartiments selon l'invention avec au moins deux cystes.
D'autres caractéristiques et avantages ressortiront de la description détaillée de l'invention et des exemples qui vont suivre.
Brève description des figures
[Fig. la] est un schéma d'un microcompartiment selon l'invention comprenant plusieurs cystes de cellules souches pluripotentes induites. Ce schéma est une représentation du microcompartiment présenté sur la photographie de la figure lb. [Fig. lb] est une image de microscopie a contraste de phase d'un microcompartiment selon l'invention.
[[Fig. 2a] est un schéma d'une série de microcompartiments selon l'invention.
[Fig. 2b] est une image de microscopie a contraste de phase d'une série de microcompartiments selon l'invention. [Fig. 3a] est un schéma d'un bioréacteur contenant une série de microcompartiments selon l'invention.
[Fig. 3b] est une image d'un bioréacteur contenant une série de microcompartiments selon l'invention. [Fig. 4a] est un schéma de la fusion de deux cystes dans un microcompartiment selon l'invention.
[Fig. 4b] est une image de la fusion de deux cystes dans un microcompartiment selon l'invention. [Fig. 5] est une représentation des résultats d'essais sur l'amplification de cellules souches pluripotentes induites dans des microcompartiments selon l'invention.
Description détaillée de l'invention
Définitions
Par « alginate » au sens de l'invention, on entend des polysaccharides linéaires formés à partir de b-D-mannuronate et a-L-guluronate, des sels et des dérivés de ceux-ci.
Par « capsule en hydrogel » ou « microcompartiment en hydrogel » au sens de l'invention, on entend une structure tridimensionnelle formée à partir d'une matrice de chaînes polymères, gonflée par un liquide et préférentiellement de l'eau.
Par cellules « différenciées » au sens de l'invention on entend des cellules qui présentent un phénotype particulier, par opposition à des cellules souches pluripotentes qui ne sont pas différenciées ou des cellules progénitrices qui sont en cours de différenciation.
Par « cellules épithéliales » ou « cellules de type épithéliales » au sens de l'invention on entend des cellules humaines ou animales associées les unes aux autres grâce à des jonctions intercellulaires structurant un épithélium simple (cuboïde, prismatique, squameux, ou pseudostratifié c'est-à-dire une assise de cellules étroitement juxtaposées ou jointive dont la majorité des cellules contactent la face apicale et la face basolatérale de l'assise).
Par « cellules humaines » au sens de l'invention on entend des cellules humaines ou des cellules de mammifères non humains immunologiquement humanisées. Même lorsque cela n'est pas précisé, les cellules, les cellules souches, les cellules progénitrices et les tissus selon l'invention sont constitués ou sont obtenus à partir de cellules humaines ou à partir de cellules de mammifères non humains immunologiquement humanisées.
Par « cellule mutante » au sens de l'invention, on entend une cellule porteuse d'au moins une mutation.
Par « cellule progénitrice » au sens de l'invention, on entend une cellule souche déjà engagée dans la différenciation cellulaire mais pas encore différenciée.
Par « cellule souche embryonnaire » au sens de l'invention on entend une cellule souche pluripotente de cellule dérivée de la masse cellulaire interne du blastocyste. La pluripotence des cellules souches embryonnaires peut être évaluée par la présence de marqueurs tels que les facteurs de transcription OCT4, NANOG et SOX2 et des marqueurs de surface comme SSEA3/4, Tra-1-60 et Tra-1-81. Les cellules souches embryonnaires utilisées dans le cadre de l'invention sont obtenues sans destruction de l'embryon dont elles sont issues, par exemple à l'aide de la technique décrite dans Chang et al. (Cell Stem Cell, 2008, 2(2)) : 113-117). Eventuellement les cellules souches embryonnaires d'êtres humains peuvent être exclues.
Par « cellule souche pluripotente » ou « cellule pluripotente » au sens de l'invention, on entend une cellule qui a la capacité de former tous les tissus présents dans l'organisme d'origine entier, sans pour autant pouvoir former un organisme entier en tant que tel. Les cellules souches pluripotentes humaines peuvent être appelées hPS dans la prCésente demaine. Il peut s'agir en particulier de cellules souches pluripotentes induites (iPSC ou hiPSC pour les cellules souches pluripotentes induites humaines), de cellules souches embryonnaires ou de cellules MUSE (pour « Multilineage-differentiating Stress Enduring »).
Par « cellule souche pluripotente induite » au sens de l'invention on entend une cellule souche pluripotente induite à la pluripotence par reprogrammation génétique de cellules somatiques différenciées. Ces cellules sont notamment positives pour les marqueurs de pluripotence, comme la coloration à la phosphatase alcaline et l'expression des protéines NANOG, SOX2, OCT4 et SSEA3/4. Des exemples de procédés permettant l'obtention de cellules souches pluripotentes induites sont décrits dans les articles Yu et al. (Science 2007, 318 (5858) : 1917- 1920), Takahashi et al (Cell, 207, 131(5) : 861-872) et Nakagawa et al (Nat Biotechnol, 2008, 26(1) : 101-106).
Par « couche de cellules » au sens de l'invention on entend une monocouche de cellules ou assise épithéliale.
Par « cyste » au sens de l'invention on entend un agencement tridimensionnel en monocouche de cellules ou en assise épithéliale, sphérique, entourant un lumen central.
Par « diamètre de Feret » d'un microcompartiment (ou d'une partie d'un microcompartiment) selon l'invention, on entend la distance « d » comprise entre deux tangentes audit microcompartiment (ou à ladite partie), ces deux tangentes étant parallèles, de telle sorte que l'ensemble de la projection dudit microcompartiment (ou de ladite partie) soit compris entre ces deux tangentes parallèles. Un diamètre de Ferret de la partie interne du microcompartiment est mesuré entre deux interfaces de la partie interne et de la couche externe du microcompartiment, c'est-à-dire la distance « d » comprise entre deux tangentes à ladite partie interne, ces deux tangentes étant parallèles, de telle sorte que l'ensemble de la projection de ladite partie interne soit compris entre ces deux tangentes parallèles.
Par « épaisseur variable » d'une couche, on entend au sens de l'invention le fait que la couche pour un même microcompartiment, n'a pas la même épaisseur partout.
Par « microcompartiment » ou « capsule » au sens de l'invention, on entend une structure tridimensionnelle partiellement ou totalement close, contenant plusieurs cellules.
Par « milieu de culture convectif » au sens de l'invention on entend un milieu de culture animé par des mouvements internes.
Par « mutation » au sens de l'invention, on entend une mutation génétique ou épigénétique, préférentiellement une mutation fonctionnelle. Il peut s'agir en particulier d'une modification ponctuelle de la séquence génétique, d'un variant structurel, d'une modification épigénétique, ou d'une modification de l'ADN mitochondrial.
Par « mutation fonctionnelle » au sens de l'invention, on entend une modification génétique ou épigénétique transmissible qui confère un gain ou perte de fonction ou perte de fonction potentielle à cellule mutante concernée. Il s'agit préférentiellement d'une mutation entraînant une modification du phénotype de la cellule mutante concernée. Très préférentiellement il s'agit d'un changement de la séquence du génome et/ou de l'épigénome qui altère le potentiel thérapeutique d'une population de cellules, soit en augmentant le risque associé à la thérapie produite soit en diminuant le bénéfice apporté par la thérapie produite.
Par « plus grande dimension » d'un microcompartiment ou d'un amas de cellule ou d'une couche de cellules au sens de l'invention, on entend la valeur du plus grand diamètre de Feret dudit microcompartiment.
Par « plus petite dimension » d'un microcompartiment ou d'une couche de cellules au sens de l'invention, on entend la valeur du plus petit diamètre de Feret dudit microcompartiment. Par « tissu » ou « tissu biologique »au sens de l'invention, on entend le sens commun de tissu en biologie c'est-à-dire le niveau d'organisation intermédiaire entre la cellule et l'organe. Un tissu est un ensemble de cellules semblables et de même origine (le plus souvent issus d'un lignage cellulaire commun, bien qu'elles puissent trouver leur origine par association de lignages cellulaires distincts), regroupées en amas, réseau ou faisceau (fibre). Un tissu forme un ensemble fonctionnel, c'est-à-dire que ses cellules concourent à une même fonction. Les tissus biologiques se régénèrent régulièrement et sont assemblés entre eux pour former des organes.
Par« lumière » ou « lumen » au sens de l'invention, on entend un volume de solution aqueuse topologiquement entouré de cellules. Préférentiellement son contenu n'est pas en équilibre diffusif avec le volume de liquide convectif présent à l'extérieur du microcompartiment.
Par « plus petit rayon » de la partie interne d'un microcompartiment selon l'invention, on entend la moitié de la valeur du plus petit diamètre de Ferret de la partie interne du microcompartiment. Par « rayon moyen » de la partie interne d'un microcompartiment selon l'invention, on entend la moyenne des rayons du plus petit compartiment, chaque rayon correspondant la moitié de la valeur d'un diamètre de Ferret de la partie interne du microcompartiment.
Microcompartiments cellulaires
L'invention a donc pour objet un microcompartiment 10 en trois dimensions de forme ovoïde, cylindrique, sphéroïde ou sphérique ou sensiblement ovoïde, cylindrique, sphéroïde ou sphérique, comprenant une couche externe 12 en hydrogel définissant une partie interne 14, ladite partie interne 14 comprenant au moins :
- des éléments de matrice extracellulaire 16, et
- au moins deux cystes, chaque cyste étant formé par au moins une couche de cellules 18 organisée en trois dimensions autour d'une lumière 20.
Préférentiellement le microcompartiment est caractérisé en ce que le plus petit rayon de la partie interne 14 est d'au moins 100 miti, préférentiellement d'au moins 200 miti, en particulier entre 200 et 400pm.
Le microcompartiment selon l'invention comprend une couche externe en hydrogel. Préférentiellement l'hydrogel utilisé est biocompatible, c'est-à-dire qu'il n'est pas toxique pour les cellules. La couche externe d'hydrogel doit permettre la diffusion d'oxygène et de nutriment pour alimenter les cellules contenues dans le microcompartiment et permettre leur survie. Selon un mode de réalisation, la couche externe d'hydrogel comprend au moins de l'alginate. Elle peut être constituée exclusivement d'alginate. L'alginate peut être en particulier un alginate de sodium, composé à 80% d'a-L-guluronate et 20% de b-D-mannuronate, avec une masse moléculaire moyenne de 100 à 400 kDa et une concentration totale comprise entre 0,5 et 5% en masse. La couche externe en hydrogel est dépourvue de cellules.
La couche externe d'hydrogel permet notamment de protéger les cellules du milieu extérieur, de limiter la prolifération incontrôlée des cellules, et leur différenciation en cas de différenciation.
L'épaisseur moyenne de couche externe 12 peut être variable. Elle est préférentiellement comprise entre 5 et lOOum, plus préférentiellement entre 20 et 60um. Le ratio entre le plus petit rayon de la partie interne 14 et cette épaisseur est préférentiellement comprise entre 2 et 10.
La présence d'une couche externe d'hydrogel et d'éléments de matrice extracellulaire (préférentiellement une matrice extracellulaire) permet une distribution uniforme des cellules entre les microcompartiments. Par ailleurs cette couche externe d'hydrogel permet d'éviter les fusions de microcompartiments qui sont une source majeure de variabilité défavorable pour l'homogénéité phénotypique des cellules.
La partie interne 14, à l'intérieur de la couche externe en hydrogel, comprend donc au moins :
- des éléments de matrice extracellulaire 16, préférentiellement sous forme d'une solution isotonique comprenant des éléments de matrice extracellulaire, en particulier une matrice extracellulaire biologique ou de synthèse, comme par exemple du Matrigel®, et
- au moins deux cystes, chaque cyste étant formé par au moins une couche de cellules 18 organisée en trois dimensions autour d'une lumière 20.
Les éléments de matrice extracellulaire comprennent préférentiellement des séquences peptidiques ou peptidomimétiques capables de se lier aux intégrines. Ils sont préférentiellement situés dans une couche entre les cystes de cellules et la couche externe 12 en hydrogel. Ces éléments de matrice extracellulaire ont préférentiellement été ajoutés lors de la fabrication du microcompartiment et/ou ils ont été ajoutés dans le microcompartiment a posteriori et/ou ils ont été sécrétés ou induits par les autres constituants du microcompartiment.
Les éléments de matrice extracellulaire comprennent préférentiellement un mélange de protéines et de composés extracellulaires nécessaires à la culture et à l'amplification des cellules. Préférentiellement, les éléments de matrice extracellulaire comprennent des protéines structurelles, telles que du collagène, des laminines, de l'entactine, de la vitronectine, ainsi que des facteurs de croissance, tels que du TGF-béta et/ou de l'EGF. Selon une variante, la partie interne 14 peut consister en ou comprendre du Matrigel® et/ou de la Geltrex® et/ou une matrice type hydrogel d'origine végétale comme des alginates modifiés ou d'origine synthétique ou de copolymère de poly(N-isopropylacrylamide) et de poly(éthylène glycol) (PNIPAAm-PEG) type Mebiol®. La présence d'éléments de matrice extracellulaire favorise l'adhérence des cellules encapsulées initialement et participe à l'obtention et au maintien dans la microcompartiment d'au moins deux sources de cellules séparées qui ne se rencontrent pas pour former chacune un cyste.
Selon un mode de réalisation préféré, la partie interne 14 comprend une matrice extracellulaire.
Si le microcompartiment comprend dans la partie interne 14, de la matrice extracellulaire, il peut s'agir de matrice extracellulaire sécrétée par les cellules présentes dans le microcompartiment et/ou de la matrice extracellulaire ajoutée au moment de la préparation/fabrication du microcompartiment.
Selon une variante, la solution contenant des éléments de matrice extracellulaire, en particulier s'il s'agit d'une matrice extracellulaire naturelle (biologique) ou de synthèse, peut former un gel.
Au niveau de la surface de la solution contenant les éléments de matrice extracellulaire (préférentiellement une matrice extracellulaire naturelle ou de synthèse) en contact avec une couche de cellules, la solution contenant les éléments de matrice extracellulaire (préférentiellement une matrice extracellulaire naturelle ou de synthèse) peut éventuellement contenir une ou plusieurs cellules.
Préférentiellement la solution contenant les éléments de matrice extracellulaire (préférentiellement une matrice extracellulaire naturelle ou de synthèse) présente un module d'Young compris entre 0,05 et 3 kDa. Le module d'Young peut être mesuré par toute méthode connue de l'homme du métier, en particulier par mesure de la rhéologie de gels de même composition que la couche intermédiaire ou bien par AFM (microscopie à force atomique).
Une solution contenant les éléments de matrice extracellulaire (préférentiellement une matrice extracellulaire naturelle ou de synthèse) avec de telles valeurs de module d'Young permet d'améliorer le maintien du phénotype cellulaire et l'intégrité génomique des cellules contenues dans cette couche intermédiaire pendant les divisions cellulaires.
De plus, de telles valeurs de module d'Young (élasticité) favorisent l'adhérence des cellules encapsulées initialement et participe à l'obtention et au maintien dans le microcompartiment d'au moins deux sources de cellules séparées qui ne se rencontrent pas pour former chacune un cyste. La viscosité de la solution contenant les éléments de matrice extracellulaire (préférentiellement une matrice extracellulaire de synthèse ou naturelle) favorise également l'adhérence des cellules encapsulées initialement et participe à l'obtention et au maintien dans le microcompartiment d'au moins deux sources de cellules séparées qui ne se rencontrent pas pour former chacune un cyste.
La partie interne 14 peut comprendre également des zones liquides sans éléments de matrice extracellulaire. Ces zones liquides résultent de l'équilibration par diffusion des liquides présents lors de la culture (ensemencement initial et changement/renouvellement de milieux éventuels). Cette zone liquide est préférentiellement majoritairement composée de milieux de culture. Avantageusement, la couche externe du microcompartiment retient (au moins partiellement) à proximité des cellules, les facteurs et éléments sécrétés par celles-ci ce qui renforce les effets paracrines et autocrine au sein du microcompartiment.
La partie interne 14 du microcompartiment selon l'invention comprend au moins deux cystes, chaque cyste étant formé par au moins une couche de cellules 18 organisée en trois dimensions autour d'une lumière 20.
Chaque cyste est formé par au moins une couche de cellules organisées en trois dimensions autour d'une lumière, ces cellules humaines ou animales préférentiellement à l'exclusion de cellules souches embryonnaires d'êtres humains. Ces cellules sont des cellules capables de former un cyste c'est-à-dire des cellules polarisées avec une face basale capables de former des jonctions serrées et d'exprimer la podocalyxin sur la face apicale (faisant face à la lumière du cyste). Dans un mode de réalisation préféré, chaque cyste est formé par au moins une couche de cellules épithéliales ou ayant une morphologie de type épithéliale. Dans un mode de réalisation préféré, les cellules de chaque couche 18 sont des cellules épithéliales ou ayant une morphologie de type épithéliale et capables de former un cyste.
Préférentiellement, chaque cyste est formé par au moins une couche de cellules humains ou animales, organisées en trois dimensions autour d'une lumière, choisies parmi les souches pluripotentes induites (iPSC) et les cellules suivantes : cellules d'épithéliums glandulaires (par ex. mammaires ou salivaires), cellules d'épithélium rénal, cellules de l'épithélium intestinal (entérocytes), cellules de l'épithélium de la peau (kératinocytes), cellules de l'épithélium pigmentaire rétinien, cellules de l'épicarde, cellules de l'endocarde.
Une cellule souche pluripotente, ou cellule pluripotente, s'entend d'une cellule qui a la capacité de former tous les tissus présents dans l'organisme d'origine entier, sans pour autant pouvoir former un organisme entier en tant que tel. Les cellules souches pluripotentes peuvent être en particulier des cellules souches pluripotentes induites (IPS), des cellules MUSE (« Multilineage-differentiating Stress Enduring ») que l'on trouve dans la peau et la moelle osseuse des mammifères adultes, ou des cellules souches embryonnaires (ES).
Préférentiellement, les cellules constituant chaque cyste sont polarisées. La polarité de ces cellules à l'intérieur de chaque cyste peut être mise en évidence par les protéines TJP-1 ou ZO- 1, toutes deux localisées sur la face interne/apicale de la couche de cellules pluripotentes, qui jouxte la lumière.
Si les cellules encapsulées dans le microcompartiment sont destinées à être utilisées en thérapie cellulaire chez l'être humain, les cellules peuvent être immuno-compatibles avec la personne destinée à les recevoir pour éviter tout risque de rejet.
Les cellules présentes dans le microcompartiment sont porteuses de peu, voire d'aucune mutation fonctionnelle.
Le microcompartiment selon l'invention peut contenir au moins 80, préférentiellement au moins 800, au moins 1000, au moins 5000, notamment au moins 8 000 cellules, ces cellules étant organisées sous forme d'au moins deux cystes.
Chaque cyste formé par au moins une couche de cellules au sein du microcompartiment est creux, c'est-à-dire qu'il comporte une lumière ou lumen. La lumière est préférentiellement générée, au moment de la formation du cyste, par la sécrétion de podocalyxin par les cellules.
La lumière de chaque cyste peut contenir un liquide, notamment du milieu de culture et/ou un liquide sécrété par les cellules. Avantageusement la présence de cette partie creuse permet aux cellules de disposer d'un petit volume diffusif dont elles peuvent contrôler la composition, favorisant une communication cellulaire. Par ailleurs la partie interne 14 est en équilibre avec le milieu externe au microcompartiment mais peut avantageusement s'enrichir par l'action des cellules d'éléments métaboliques et/ou sécrétés.
La conformation sous forme de cyste permet de réduire les pressions subies par les cellules par rapport aux cultures 2D ou en agrégats. Cette configuration permet de diminuer la mortalité cellulaire, d'augmenter le facteur d'amplification de la culture. Par conséquence cela permet de réduire le nombre de passages et dissociations nécessaires ; de réduire le temps en culture nécessaire pour atteindre le nombre de cellules final nécessaire. Collectivement ces améliorations participent aussi au maintien de l'intégrité génétique des cellules dans les microcompartiments.
Avantageusement, la présence de plusieurs cystes dans un même microcompartiment permet d'améliorer la reproductibilité du processus d'encapsulation et par la même la reproductibilité des lots cellulaires, améliore la survie à l'encapsulation et améliore l'amplification par unité de temps.
Le microcompartiment peut comprendre également, en plus des cystes, des cellules en suspension dans le microcompartiment.
Selon un mode de réalisation chaque cyste présent dans le microcompartiment a été obtenu par l'encapsulation dans la partie interne 14 des microcompartiments : de 1 à 30 cellules, préférentiellement de 1 à 10, en particulier de 2 à 30 ou de 3 à 30, notamment de 2 à 10 ou de 3 à 10, plus préférentiellement de 1 à 5, encore plus préférentiellement de 2 à 5 ou de 3 à 5, préférentiellement au moins 4 cellules, et le plus petit rayon de la partie interne 14 étant d'au moins 100 miti, préférentiellement d'au moins 200 pm. L'encapsulation d'une concentration contrôlée de cellules dans une capsule de grande taille (plus petit rayon de la partie interne du microcompartiment d'au moins 100 pm) participe à l'obtention d'au moins deux cystes dans le microcompartiment. Il est difficile d'obtenir deux cystes avec une seule cellule, et il est préférable d'encapsuler dans la partie interne 14 des microcompartiments au moins 2 cellules, préférentiellement au moins 3, encore plus préférentiellement au moins 4. L'encapsulation d'un nombre de cellules au départ supérieur à 30 est possible mais moins avantageuse car il est difficile voire impossible (la probabilité baisse) d'obtenir deux cystes avec plus de 20/25% en volumes de cellules dans la partie interne au moment de l'encapsulation, notamment car cela limite la capacité d'amplification à X4 ce qui est désavantageux pour la production de lots cellulaires. Selon l'invention il est préférable qu'il y ait au moins deux sources de cellules séparées qui ne se rencontrent pas pour former chacune un cyste.
Les cellules présentes dans le microcompartiment selon l'invention ont été préférentiellement obtenues après au moins deux cycles de division cellulaire après l'encapsulation dans une couche externe d'hydrogel d'au moins une cellule.
De façon préférée, les cellules présentes dans le microcompartiment selon l'invention ont été obtenues après au moins 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 28, 30 cycles de division cellulaire après l'encapsulation dans une couche externe d'hydrogel, préférentiellement d'au moins 2 cellules, préférentiellement au moins 3, encore plus préférentiellement au moins 4, notamment entre 2 et 30 cellules. Par exemple, les cellules présentes dans le microcompartiment ont été obtenues après au moins six cycles de division cellulaire après l'encapsulation des cellules dans la couche externe en hydrogel.
Préférentiellement le nombre de divisions cellulaires pour la mise en oeuvre du procédé selon l'invention est inférieur à 300, encore plus préférentiellement inférieur à 200.
Préférentiellement le microcompartiment est obtenu après au moins 2 passages après l'encapsulation, plus préférentiellement au moins 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 passages. Chaque passage peut durer par exemple entre 2 et 15 jours, notamment entre 3 et 10 jours.
De façon préférée le microcompartiment est obtenu après au moins une ré-encapsulation, plus préférentiellement entre 1 et 14 ré-encapsulations, notamment entre 2 et 7 ré encapsulations. Très préférentiellement une ré-encapsulation correspond à un nouveau passage et chaque cycle d'encapsulation correspond à un passage.
Préférentiellement la totalité des cellules encapsulées initialement dans le microcompartiment avant le premier cycle de division cellulaire représente un volume inférieur à 50% du volume du microcompartiment dans lequel elles sont encapsulées, plus préférentiellement inférieur à 40%, 30%, 20%, 10% du volume du microcompartiment dans lequel elles sont encapsulées.
Ainsi, selon l'un mode de réalisation, les cellules présentes dans le microcompartiment selon l'invention ont été obtenues après au moins 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 28, 30 cycles de division cellulaire, après l'encapsulation dans une couche externe d'hydrogel de cellule(s) représentant un volume inférieur à 50% du volume du microcompartiment dans lequel elles sont encapsulées, plus préférentiellement inférieur à 40%, 30%, 20%, 10% du volume du microcompartiment dans lequel elles sont encapsulées.
Préférentiellement, dans le microcompartiment selon l'invention, les cellules représentent plus de 50% en volume par rapport au volume du microcompartiment, encore plus préférentiellement plus de 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% en volume par rapport au volume du microcompartiment.
Dans le microcompartiment selon l'invention, le volume de la partie interne 14 représente préférentiellement au moins 20% du volume total du microcompartiment, préférentiellement au moins 40%. Ceci permet d'accueillir plus de cellules après amplification, donc plus de cystes et/ou des cystes de plus grandes tailles.
L'épaisseur la couche de cellules formant chaque cyste est préférentiellement comprise entre 6 et 200 miti, plus préférentiellement entre 6 et 60pm.
Selon une variante représentée sur la figure 4a et sur la figure 4b, au moins deux cystes peuvent fusionner entre eux. Dans ce cas le microcompartiment selon l'invention comprend au moins un cyste est issu de la fusion de deux cystes.
Le microcompartiment cellulaire selon l'invention est clos ou partiellement clos, c'est à dire que la couche externe est close ou partiellement close. Préférentiellement le microcompartiment est clos.
Le microcompartiment selon l'invention peut se présenter sous toute forme en trois dimensions, c'est-à-dire qu'il peut avoir la forme de tout objet de l'espace. Le microcompartiment peut avoir n'importe quelle forme compatible avec l'encapsulation de cellules. Préférentiellement le microcompartiment selon l'invention se présente sous une forme sphérique ou allongée ou sensiblement sphérique ou allongée. Il peut avoir la forme d'un ovoïde, d'un cylindre, d'un sphéroïde ou d'une sphère ou sensiblement cette forme.
C'est la couche externe du microcompartiment, c'est-à-dire la couche d'hydrogel, qui confère sa taille et sa forme au microcompartiment selon l'invention. Préférentiellement la plus petite dimension du microcompartiment selon l'invention est comprise entre 202 pm et 1 mm, préférentiellement entre 202 pm et 700 pm, encore plus préférentiellement 202 pm et 600 pm, notamment entre 202pm et 500 pm.
Sa plus grande dimension est préférentiellement supérieure à 202pm, plus préférentiellement comprise entre 202pm et lm, encore plus préférentiellement entre 202pm et 50cm.
L'invention a également pour objet plusieurs microcompartiments ensemble.
L'invention a également pour objet un ensemble ou série de microcompartiments comprenant au moins deux microcompartiments cellulaires en trois dimensions, caractérisé en ce qu'au moins un microcompartiment est un microcompartiment selon l'invention.
De façon préférée, la série de microcompartiments selon l'invention est dans un milieu de culture, en particulier dans un milieu de culture au moins partiellement convectif. Tout milieu de culture adapté à la culture de cellules peut être utilisé, et notamment du tampon phosphate salin tel que par exemple le milieu « dulbecco's modified eagle medium » ou « Roswell Park Memorial Institute medium » dès lors que la concentration en sels dissouts est compatible avec le maintien de la réticulation de l'alginate par les cations divalents.
Selon un mode de réalisation particulièrement adapté, l'invention a pour objet une série de microcompartiments cellulaires dans une enceinte close, telle qu'un bioréacteur, préférentiellement dans un milieu de culture dans une enceinte close, telle qu'un bioréacteur. Ainsi, préférentiellement, les microcompartiments sont disposés dans un milieu de culture dans un bioréacteur clos.
L'ensemble ou série de microcompartiments selon l'invention comprend préférentiellement entre 2 et 1016 microcompartiments.
Les microcompartiments selon l'une l'invention peuvent être utilisés pour toutes applications, en particulier comme médicament en thérapie cellulaire chez l'homme ou l'animal.
Le microcompartiment selon l'invention peut être éventuellement congelé pour être stocké. Il devra ensuite être préférentiellement décongelé avant son utilisation. Procédé d'obtention de microcompartiments selon l'invention
L'invention vise également un procédé de préparation de microcompartiments selon l'invention.
Le procédé de préparation d'un microcompartiment ou d'un ensemble de microcompartiments selon l'invention, peut comprendre les étapes suivantes :
- (a) incuber des cellules humaines ou animales dans un milieu de culture contenant au moins un facteur cytoprotecteur, notamment un inhibiteur de l'apoptose et/ou des Rho/A kinases,
- (b) mélanger les cellules issues de l'étape (a) avec des éléments de matrice extracellulaire, notamment une matrice extracellulaire biologique ou de synthèse, - (c) encapsuler la suspension de cellules dans une couche d'hydrogel de façon à former un microcompartiment de forme ovoïde, cylindrique, sphéroïde ou sphérique ou sensiblement ovoïde, cylindrique, sphéroïde ou sphérique, comprenant une couche externe en hydrogel définissant une partie interne , le plus petit rayon ou le rayon moyen de ladite partie interne étant d'au moins 100 pm ; - (d) cultiver les microcompartiments obtenus dans un tampon de rinçage isotonique, préférentiellement moins de 30 minutes, puis dans un milieu de culture, préférentiellement dans un milieu de culture contenant au moins un facteur cytoprotecteur, notamment un inhibiteur de l'apoptose et/ou des Rho/A kinases;
- (e) préférentiellement rincer les microcompartiments, de manière à éliminer le facteur cytoprotecteur (inhibiteur de l'apoptose et/ou des Rho/A kinases), préférentiellement dans un délai de 48h après encapsulation, encore plus préférentiellement dans un délai de 24h;
- (f) cultiver les microcompartiments pendant au moins deux cycles de division cellulaire (amplification), préférentiellement entre 1 et 20 jours, encore plus préférentiellement entre 2 et 10 jours, notamment entre 5 et 7 jours, dans un milieu de culture dépourvu de facteur cytoprotecteur (inhibiteur d'apoptose et/ou des Rho/A kinases), et
- (g) optionnellement récupérer les microcompartiments cellulaires obtenus.
Le nombre de cellules encapsulées dans chaque microcompartiment à l'étape c) est préférentiellement de 1 à 30 cellules, en particulier de 2 à 30 ou de 3 à 30, préférentiellement de 1 à 10, notamment de 2 à 10 ou de 3 à 10, plus préférentiellement de 1 à 5, encore plus préférentiellement de 2 à 5 ou de 3 à 5, préférentiellement au moins 4 cellules. L'encapsulation d'une concentration contrôlée de cellules dans une capsule de grande taille (plus petit rayon de la partie interne du microcompartiment d'au moins 100 pm) participe à l'obtention d'au moins deux cystes dans le microcompartiment. Il est difficile d'obtenir deux cystes avec une seule cellule, et il est préférable d'encapsuler dans la partie interne 14 des microcompartiments au moins 2 cellules, préférentiellement au moins 3, encore plus préférentiellement au moins 4. L'encapsulation d'un nombre de cellules au départ supérieur à 30 est possible mais moins avantageuse car il est difficile voire impossible (la probabilité baisse) d'obtenir deux cystes avec plus de 20/25% en volumes de cellules dans la partie interne au moment de l'encapsulation, notamment car cela limite la capacité d'amplification à X4 ce qui est désavantageux pour la production de lots cellulaires. Selon l'invention il est préférable qu'il y ait au moins deux sources de cellules séparées qui ne se rencontrent pas pour former chacune un cyste.
Tout milieu de culture adapté à la culture de cellules, notamment de cellules souches pluripotentes peut être utilisé, et notamment du tampon phosphate salin tel que le milieu « Roswell Park Memorial Institute medium » ou Mtesrl ou E8 Essential par exemple.
Le facteur cytoprotecteur peut par exemple être un ou plusieurs inhibiteur(s) des voies RHO/ROCK (« Rho-associated protein kinase ») et/ou un inhibiteur de l'apoptose connu de l'homme du métier ou tout autre facteur cytoprotecteur connu de l'homme du métier. Le facteur cytoprotecteur doit permettre de promouvoir la survie des cellules, et dans le cas de la présence d'une matrice extracellulaire, leur adhérence des cellules à la matrice extracellulaire au moment de la formation de la couche externe d'hydrogel autour de ladite matrice extracellulaire.
Dans le procédé selon l'invention la totalité des cellules encapsulées initialement à l'étape (c) représentent préférentiellement un volume inférieur à 50% du volume du microcompartiment dans lequel elles sont encapsulées, plus préférentiellement inférieur à 40%, 30%, 20%, 10% du volume du microcompartiment dans lequel elles sont encapsulées.
Le procédé selon l'invention peut comprendre une étape préalable à l'étape a) ou b) de dissociation des cellules par une dissociation chimique, enzymatique ou mécanique. Cette étape est très préférentiellement nécessaire du fait que les cellules de types épithéliales, notamment les cellules souches, sont des cellules adhérentes. Les cellules encapsulées sont en suspension sous forme de cellules uniques et/ou d'amas ou ensemble(s) d'au moins deux cellules (« cluster(s) »). De façon préférée, lorsqu'il y a au moins 3 cellules la ou les cellules uniques représentent moins de 50% en nombre de la totalité des cellules encapsulées initialement à l'étape (b). En effet il est préférable d'encapsuler des amas de cellules car cela diminue les distorsions de ségrégation chromosomique et mauvaises ségrégations chromosomiques et par conséquent diminue l'apparition de nouvelles mutagenèses et participe au maintien l'intégrité génomique des cellules, car les cellules isolées risquent de mourir par manque d'interaction cellules-cellules et que la dissociation complète de cellules entraîne des anomalies génétiques majorées.
Préférentiellement chaque amas de cellules encapsulé initialement à l'étape (c) a une plus grande dimension inférieure à 20% de la plusgrande dimension d'un microcompartiment dans lequel il est encapsulé, encore plus préférentiellement inférieure à 10%. En effet les amas de cellules ne doivent pas avoir une trop grande taille par rapport à la taille du microcompartiment car un dimension trop grande de ces amas cellulaires initiaux, pourrait entraîner, lors des divisions cellulaires, une confluence cellulaire plus précoce dans la capsule ; cette confluence trop précoce de toute ou partie des capsules, pourrait entraîner une augmentation des pressions intracellulaires et entraîner un stress cellulaire, impactant la croissance cellulaire mais également la ségrégation chromosomique.
Le procédé selon l'invention comprend une étape b) de mélange des cellules à une matrice extracellulaire entre l'étape a) et l'étape c). Selon une variante, cette étape b) peut éventuellement être mise en œuvre avant l'étape (a) ou bien simultanément à l'encapsulation à l'étape (c).
L'étape c) d'encapsulation est mise en œuvre selon les techniques connues de l'homme du métier. En effet, toute méthode de production de microcompartiments cellulaires contenant à l'intérieur d'une capsule d'hydrogel de la matrice extracellulaire et des cellules peut être utilisée pour la mise en œuvre du procédé de préparation selon l'invention. Notamment, il est possible de préparer des microcompartiments en adaptant la méthode et le dispositif microfluidique décrits dans Alessandri et al., 2016 (« A 3D printed microfluidic device for production offunctionalized hydrogel microcapsules for culture and différentiation ofhuman Neuronal Stem Cells (hNSC) », Lab on a Chip, 2016, vol. 16, no. 9, p. 1593-1604), conformément aux étapes décrites ci-dessous. Préférentiellement l'étape c) est mise en œuvre dans un dispositif capable de générer des capsules d'hydrogel à l'aide d'une puce microfluidique. Par exemple le dispositif peut comprendre des pousses seringues pour plusieurs solutions injectées de manière concentrique grâce à un injecteur microfluidique qui permet de former un jet qui se fractionne en gouttes collectées ensuite dans un bain de calcium. Selon un mode de réalisation particulièrement adapté, deux ou trois solutions sont chargées sur deux ou trois pousse- seringues :
- une solution d'hydrogel, par exemple d'alginate,
- optionnellement une solution intermédiaire isotonique préférentiellement une solution isotonique ne contenant pas de cation divalent tel que Ca2+ Mg2+ pour éviter une réticulation de l'hydrogel trop précoce dans l'injecteur, telle que par exemple une solution de sorbitol, la solution issue de l'étape b) comprenant des cellules, du milieu de culture et la matrice extracellulaire.
Les trois solutions sont co-injectées (injectées simultanément) de manière concentrique grâce à un injecteur microfluidique ou puce microfluidique qui permet de former un jet qui se fractionne en gouttes dont la couche extérieure est la solution d'hydrogel et le cœur la solution de l'étape b) comprenant des cellules ; Ces gouttes sont collectées dans un bain de calcium qui réticule et/ou gélifie la solution d'alginate pour former la coque.
Pour améliorer la mono-dispersité des microcompartiments cellulaires, la solution d'hydrogel est préférentiellement chargée avec un courant continu à (entre 1 et lOkV). Un anneau à la masse peut éventuellement être disposé à une distance de la pointe comprise entre 1mm et 20 cm, préférentiellement 3mm à 10 cm, encore plus préférentiellement 1cm à 5cm, de la pointe dans le plan perpendiculaire à l'axe du jet sortant de l'injecteur microfluidique (puce de coextrusion) pour générer le champ électrique.
Préférentiellement la solution est maintenue à une température inférieure à 4°C avant d'être injectée, pour éviter que la solution ne gélifie du fait de la présence d'éléments de matrice extracellulaire.
Selon l'invention, il est nécessaire de générer des capsules dont la partie interne a un rayon moyen ou plus petit rayon d'au moins lOOpm. Pour générer des capsules avec de telles dimensions avec une puce de coextrusion (injecteur microfluidique ou puce microfluidique) l'invention propose notamment de modifier le débit des solutions coextrudées et l'ouverture finale de la puce de co-extrusion. Par débit on entend le débit de de chaque solution qui arrive à l'injecteur. Par ouverture finale de la puce de co-extrusion, on entend l'ouverture interne du canal de sortie de la puce.
- pour le débit : on passe préférentiellement d'une valeur comprise entre 20 et 40 ml/h pour chaque solution coextrudée pour les tailles standards de capsules connues de l'art antérieur, à une valeur comprise entre 45 et 150 mL/h, préférentiellement entre 45 et 110 mL par heure pour une variante de l'invention,
- pour le diamètre de l'ouverture finale de la puce de coextrusion (injecteur microfluidique) qui passe d'une valeur préférentiellement comprise entre 50 et 120 pm pour les tailles standards de capsules connues de l'art antérieur, à une valeur de diamètre comprise entre 150 et 300 miti, préférentiellement entre 180 et 240 pm.
Ainsi, selon un mode de réalisation particulier l'étape (c) d'encapsulation est réalisée à l'aide d'un injecteur microfluidique dont le diamètre d'ouverture finale est compris entre 150 et 300 pm, préférentiellement entre 180 et 240 pm, et avec le débit de chacune des 3 solutions compris entre 45 et 150 mL/h, préférentiellement entre 45 et 110 mL/h. Selon un mode de réalisation, cette encapsulation est réalisée par co-injection de trois solutions :
- une solution d'hydrogel,
- une solution intermédiaire isotonique telle que par exemple une solution de sorbitol,
- la solution issue de l'étape b) comprenant des cellules, du milieu de culture et la matrice extracellulaire, de manière concentrique via un injecteur microfluidique qui permet de former un jet en sortie d'injecteur constitué du mélange des trois solutions, ledit jet se fractionnant en gouttes, lesdites gouttes étant collectées dans un bain de calcium qui rigidifie la solution d'hydrogel pour former la couche externe de chaque microcompartiment, la partie interne de chaque goutte étant constituée par la solution issue de l'étape (b) comprenant des cellules, du milieu de culture et la matrice extracellulaire.
Très préférentiellement, les étapes (d), (e) et (f) sont mises en oeuvre sous agitation permanente ou séquentielle. Cette agitation est importante car elle maintient l'homogénéité de l'environnement de culture et évite la formation de tout gradient diffusif. Par exemple, elle permet un contrôle homogène de niveau d'oxygénation cellulaire ; évitant ainsi les phénomènes de nécrose lié à l'hypoxie, ou de stress oxydatif lié à l'hyperoxie. En évitant une augmentation de la mortalité cellulaire et/ou du stress oxydatif, l'agitation participe au maintien de l'intégrité génétique des cellules.
Le procédé selon l'invention est préférentiellement mis en oeuvre d'une enceinte close tel qu'un bioréacteur clos.
Le nombre cycles de divisions cellulaires à l'étape (f) est d'au moins 2, B, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 cycles de division cellulaire. Préférentiellement le microcompartiment est obtenu après au moins 2 passages (un passage correspondant ici à un cycle complet des étapes (a), (b), et (e), optionnellement (c) et (d)), plus préférentiellement au moins 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 passages. Chaque passage peut durer par exemple entre 2 et 15 jours, notamment entre 3 et 8 jours.
Dans une variante préférée, le procédé selon l'invention comprend au moins une ré- encapsulation des cellules après l'étape (f), c'est-à-dire au moins deux cycles d'encapsulation. Préférentiellement chaque cycle d'encapsulation correspond à un passage. Dans cette variante du procédé (au moins une ré-encapsulation des cellules après l'étape (e)) le nombre de divisions cellulaires de l'ensemble du procédé (pour l'ensemble des passages) est d'au moins 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30 cycles de division cellulaire. Dans un procédé selon l'invention il peut y avoir plusieurs ré-encapsulations, préférentiellement entre 1 et 100, notamment entre 1 et 10 ré-encapsulation(s).
Chaque ré-encapsulation peut comprendre :
- une étape qui consiste à dissocier le microcompartiment ou la série de microcompartiments pour obtenir une suspension de cellules ou une suspension d'amas de cellules ; l'élimination de la couche externe en hydrogel peut être réalisée notamment par hydrolyse, dissolution, perçage et/ou rupture par tout moyen biocompatible, c'est-à-dire non toxique pour les cellules. Par exemple, l'élimination peut être réalisée en utilisant un tampon phosphate salin, un chélateur d'ions divalents, une enzyme comme l'alginate lyase si l'hydrogel comprend de l'alginate et/ou la microdissection laser, et - une étape de ré-encapsulation de tout ou partie des cellules ou amas de cellules dans une capsule d'hydrogel. La ré-encapsulation est un moyen adapté pour une augmentation de l'amplification cellulaire obtenue depuis l'étape pluripotente, et diminuer les risques de mutation. La ré-encapsulation consiste à éliminer la couche externe d'hydrogel, préférentiellement à remettre en suspension de manière partiellement ou totalement dissociées les cellules qui étaient sous forme de cystes dans les microcompartiments et à remettre en oeuvre les étapes du procédé.
Selon un mode de réalisation la ré-encapsulation comprend les étapes suivantes : - (i) éliminer la couche externe en hydrogel,
- (ii) remettre en suspension les cellules qui étaient contenues dans le microcompartiment de façon à obtenir des cellules uniques et/ou au moins un ensemble ou amas de cellules dans un milieu de culture contenant au moins un facteur cytoprotecteur,
- (iii) mélanger les cellules issues de l'étape (a) avec des éléments de matrice extracellulaire, - (iv) encapsuler la solution de cellules dans une couche d'hydrogel de façon à former un microcompartiment de forme ovoïde, cylindrique, sphéroïde ou sphérique ou sensiblement ovoïde, cylindrique, sphéroïde ou sphérique, comprenant une couche externe en hydrogel définissant une partie interne , le plus petit rayon ou le rayon moyen de ladite partie interne étant d'au moins 100 pm ; - (v) cultiver les microcompartiments obtenus dans un milieu de culture contenant au moins un facteur cytoprotecteur, notamment un inhibiteur de l'apoptose et/ou des Rho/A kinases,
- (vi) préférentiellement rincer les microcompartiments, de manière à le facteur cytoprotecteur ;
- (vii) cultiver les microcompartiments dans un milieu de culture dépourvu de facteur cytoprotecteur, pendant au moins un cycle de division cellulaire, et
- (viii) optionnellement récupérer les microcompartiments cellulaires obtenus.
La compartimentalisation dans des microcompartiments permet d'éliminer les microcompartiments contenant d'avantage de cellules mutées que les autres capsules. Même si les cellules mutées ont une croissance rapide elles vont atteindre la confluence capsulaire qui va contenir leur multiplication. La compartimentalisation permet aussi de ne pas contaminer l'intégralité de la population cellulaire, et également d'éliminer les capsules contenant des cellules mutantes, à tout moment, en particulier avant une étape de ré encapsulation. Ce tri peut être fait soit par analyse en ligne, soit par élimination des capsules remplies plus rapidement que les autres par exemple.
Selon une variante de l'invention, les cellules encapsulées sont des cellules différenciées qui sont reprogrammées en cellules pluripotentes à l'intérieur de la capsule d'hydrogel lors de la formation des microcompartiments. Selon une variante, les agents de reprogrammation cellulaire peuvent être ajoutés à l'étape (a) et/ou (b) et/ou (c) et/ou (d) et/ou (ii) et/ou (iii) et/ou (iv) et/ou (v). Préférentiellement il s'agit d'agents de reprogrammation cellulaire non perméants vis-à-vis de la couche d'hydrogel. L'ajout d'agents de reprogrammation est particulièrement pertinent lorsque les cellules encapsulées initialement sont des cellules différenciées que l'on veut dédifférencier notamment jusqu'au stade pluripotent. L'homme du métier sait procéder à la reprogrammation d'une cellule différenciée en une cellule souche en réactivant l'expression des gènes associés au stade embryonnaire au moyen de facteurs spécifiques, désignés dans la présente invention comme « agents de reprogrammation ». A titre d'exemples, on peut citer les méthodes décrites dans Takahashi et al., 2006 (« Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors » Cell, 2006 Vol 126, pages 663-676), Ban et al., 2009 (« Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome » Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 2009 ; 85(8):348-62) et dans la demande internationale W02010/105311 ayant pour titre « Production of reprogrammed pluripotent cells ». Les agents de reprogrammation sont avantageusement co-encapsulés avec les cellules différenciées, de manière à concentrer le produit et à favoriser le contact avec l'ensemble des cellules. Dans le cas d'agents de reprogrammation perméants à la couche d'hydrogel, il est possible d'ajouter lesdits agents dans le milieu de culture après l'étape d'encapsulation. Les agents de reprogrammation permettent d'imposer aux cellules une succession de changements phénotypiques jusqu'au stade pluripotent. Avantageusement, l'étape de reprogrammation est réalisée en utilisant des milieux de culture spécifiques, favorisant ces changements phénotypiques. Par exemple, les cellules sont mis en culture dans un premier milieu comprenant 10% de sérum humain, ou bovin, dans un milieu minimum essentiel de Eagle (DMEM) supplémenté avec un inhibiteur des récepteurs sérine/thréonine protéine kinase (tel que le produit SB-431542 (C22H16N4O3)), un ou plusieurs inhibiteurs des voies RHO/ROCK (« Rho-associated protein kinase »), tels que du thiazovivin et/ou Y-27632, des facteurs de croissance des fibroblastes, tel que du FGF-2, de l'acide ascorbique et des antibiotiques, tels que la Trichostatin A (C17H22N2O3). Puis le milieu de culture est remplacé par du milieu favorisant la multiplication des cellules pluripotentes, tel que le milieu mTeSR®l.
L'incubation de l'étape (a) et/ou (ii) est conduite préférentiellement pendant un temps compris entre quelques minutes et quelques heures, préférentiellement entre 2 minutes et 2 heures, plus préférentiellement entre 10 minutes et 1 heure.
L'étape (d) et/ou (v) de culture avec un facteur cytoprotecteur est conduite pendant un temps compris entre 2 et 48 heures, préférentiellement pendant un temps compris entre 6 et 24 heures, plus préférentiellement pendant un temps compris entre 12 et 18 heures.
L'étape de rinçage peut être réalisée par un ou plusieurs rinçages, dans des milieux de culture successifs exempts d'inhibiteurs des voies RHO/ROCK, moins de 48h, préférentiellement moins de 24 heures, plus préférentiellement entre 12 et 18 heures après le début de l'étape (d) et/ou (v).
Dans un mode de mise en oeuvre, au moins une des étapes (préférentiellement toutes les étapes) est réalisée à une température adaptée à la survie des cellules, comprise entre 4 et 42°C. La température lors de la prolifération cellulaire doit être préférentiellement entre 32 et 37°C pour éviter de déclencher des mutations en baissant la performance des enzymes de réparation. De même, de façon préférée, la température doit être basse (idéalement environ 4°C) pour gérer le stress des cellules à l'étape (c).
À tout moment, le procédé selon l'invention peut comprendre une étape consistant à vérifier le phénotype des cellules contenues dans le microcompartiment. Cette vérification peut être réalisée en identifiant l'expression par au moins une partie des cellules contenues dans le microcompartiment, d'au moins un gène spécifique du phénotype recherché.
Les microcompartiments cellulaires obtenus selon les procédés de l'invention peuvent ensuite être congelés avant toute utilisation. La congélation est préférentiellement réalisée à une température comprise entre -190°C et -80°C. La décongélation peut être réalisée dans un bain d'eau tiède (37 degrés préférentiellement) pour que les cellules décongèlent assez rapidement. Les microcompartiments selon l'invention avant leur utilisation peuvent être maintenus à plus de 4°C pendant une durée limitée avant leur utilisation, préférentiellement entre 4°C et 38°C. La mise en oeuvre du procédé selon l'invention, permet d'obtenir des microcompartiments comprenant au moins 80, préférentiellement au moins 800, au moins 1000, au moins 5000, notamment au moins 8000 cellules, ces cellules étant organisées sous forme d'au moins deux cystes.
Avantageusement, la structure en 3 dimensions des cellules dans le microcompartiment et le pourcentage faible voir nul de cellules isolées lors de l'encapsulation (la majorité des cellules étant encapsulées sous forme d'amas de cellules), diminue la déségrégation chromosomique et par conséquent diminue l'apparition de nouvelles mutagenèses.
L'invention favorise surtout l'amplification avec un facteur d'amplification élevé, ce qui par conséquent diminue le temps de culture et le nombre de divisions pour obtenir un nombre de cellules très important, et limite donc de nouvelles mutagenèses.
La protection des cellules grâce à la couche externe et la présence d'éléments de matrice extracellulaire diminue la déségrégation chromosomique et limite le stress mécanique des cellules, et par conséquent diminue l'apparition de nouvelles mutagenèses.
Avantageusement la présence de plusieurs cystes dans chaque microcompartiment permet également de favoriser la survie cellulaire initiale et lisse les asynchronies de croissance.
L'invention est à présent illustrée par un exemple et des résultats
Les figures la et lb montrent des capsules d'hydrogel creuses permettant la croissance de plusieurs cystes de cellules souches pluripotentes humaines dans le microcompartiment central. Les figures 2a et 2b montrent une image de microscopie, à J6,5 post encapsulation montrant une pluralité de capsules d'alginates creuses contenant des cellules souches pluripotentes humaines. La barre d'échelle est de 500um. Les microcompartiments selon l'invention comprennent plusieurs colonies de cellules souches 3D. Ces colonies présentent toutes une configuration cystique homogène avec un diamètre moyen de 170um. En moyenne, on observe 2,6 colonies (cystes) par capsule à ce stade de la culture.
Les figures 3a et 3 b montrent une pluralité de capsules multi cystes cultivées en suspension en bioréacteur.
Les paramètres clés et résultats d'un exemple d'encapsulation selon l'invention dans un bioréacteur de 10 litres sont donnés dans le tableau 1 ci-après.
[Tableau 1]
L'encapsulation des hiPSCs et la culture en suspension ont été réalisées pendant 2 cycles séparés. Le niveau d'oxygène cible de 20% d'oxygène dissous est décrit comme une condition hypoxique (à l'inverse des bioréacteurs avec un niveau d'oxygène dissous de 100% qui sont décrits comme normoxiques). Une stratégie d'alimentation par lots (« fed batch »), c'est-à- dire un renouvellement du milieu de culture par soustraction/ajout de milieu à intervalles réguliers, a été appliquée, entraînant une augmentation du volume de travail et une diminution de la concentration des capsules rapporté au volume total. La densité cellulaire peut être exprimée en millions de cellules par millilitre de capsules. Le volume de la capsule récoltée est mesuré dans un cylindre de verre gradué. Le nombre de cellules mesuré peut être rapporté à ce volume de capsule précédemment mesuré pour en déduire une concentration de cellule par volume de capsule. Le facteur d'amplification (AF) est définit tel que AF=N(t0+Dt)/N(t0), où N(t0) et N(t0+Dt) sont le nombre de cellules initiales à tO et tO+Dt respectivement. Le niveau de doublement de la population (PDL) est défini comme PDL(t)= In(AF) / ln(2). Le temps de doublement de la population (PDT) est défini tel que PDT(t)=Dt / PDL où Dt est le temps en culture.
La viabilité a été évaluée par le nucleocounter NC-3000 (Chemometech). Les cellules décapsulées et dissociées ont été fixées et colorées pour OCT4, SOX2 et NANOG et analysées par cytométrie de flux, BD Accuri C6 plus. Les résultats concernant le facteur d'amplification sont également présentés sur la figure 5.
Sur la figure 4b est représentée une série de photos issues d'une vidéo-microscopie d'une capsule comprenant plusieurs cystes selon l'invention.
L'observation est réalisée en transmission avec une bio-station IM Nikon avec un objectif lOx. Le diamètre externe moyen de la capsule quasi-sphérique est de 288um comme indiqué par la barre d'échelle de lOOum. Le cliché initial a été réalisé 4 jours après l'encapsulation. La séquence illustre la croissance de plusieurs colonies de cellules souches pluripotentes dans une capsule d'hydrogel creuse. Ces colonies sont cultivées dans un microcompartiment 3D clos, définit extérieurement par une couche d'alginate réticulé. Le compartiment interne est décrit comme étant creux, dans le sens où il ne contient pas d'alginate réticulé. Le compartiment interne contenant les cellules contient également de la matrice extracellulaire (ici Matrigel®) qui est visible en microscopie par une granulosité différente de celle de l'alginate.
Lors de l'encapsulation le volume injecté dans les microcompartiments internes est issu à 50% du mix cellules/matrice et à 50% d'une solution isomolaire de sorbitol (cf. méthode). Ainsi l'espace interne est à minima 50% liquide. Initialement les 3 colonies ont une configuration cystique homogène avec des diamètres respectifs de 76um, lOOum et 78um (cyste en bas à droite de l'image). A ce stade initial l'épaisseur épithéliale de ces cystes est respectivement de lOum 13um et 12um. On observe que les 2 cystes en haut à gauche de la capsule, rentrent progressivement en contact et fusionnent leurs lumières interne ainsi que leurs épithéliums. Il en résulte une colonie de cellules souches de plus grande dimension qui a également une structure cystique circulaire et symétrique.
54h après le début de l'observation (images de droites avant dernière ligne de la figure 4b), les 2 colonies cystiques présentes dans la capsule entrent en contact. A ce stade les diamètres de ces cystes sont de 232 et 175um. Les épaisseurs respectives de la couche cellulaire de ces cystes sont respectivement de 36 et 24um. On observe que le contact entre ces colonies n'est pas suivi d'une fusion des lumières ou des épithéliums. La limite entre ces 2 structures reste clairement identifiable sur le dernier et 12eme cliché (75ème heure).
On observe un décalage de 20um vers la gauche de la plus grande des colonies qui semble repoussée par la petite colonie. Malgré un léger aplatissement de la zone de contacts entre les 2 colonies, leurs structures cystiques symétriques restent cependant maintenues pour chacune des 2 colonies, avec des épaisseurs de couche cellulaire homogène de 50 et 40um respectivement. Cette croissance des colonies encapsulées et leur habilité vraisemblable à se repoussées dans l'espace capsulaire interne est facilité par le caractère au moins partiellement liquide de cet espace creux interne. De plus, l'utilisation de matrices extracellulaires progressivement dégradable comme le Matrigel, permet encore d'avantage aux cellules de croître dans un environnement 3D plus permissif que lors d'une encapsulation en bille pleine d'hydrogel ; et permet ainsi de maintenir une structure cystique épithélial malgré les forces générées par la multiplication cellulaire.
Au total, l'espace intra-capsulaire creux partiellement liquide de cette capsule de grande taille permet aux colonies de cellules souches 3D de croître tout en préservant un phénotype épithélial cystique stable. La stabilité de ce phénotype, permet une bonne homogénéité phénotypique des cellules produites et un procédé de bioproduction robuste/fiable, Illustrant la persistance du phénotype épithélial lors de la croissance de plusieurs cystes
La figure 4a illustre une séquence « multi-cyste » fusion en capsules : - A : Auto-organisation et luminogenèse de colonies 3D de cellules souches à l'intérieur du microcompartiment. Formation des cystes de cellules souches encapsulés
- B : Croissance des Cystes de cellules souches : augmentation progressive du diamètre du cyste, diamètre de la lumière et épaisseur du cyste. - C : Les cystes rentrent en contact
- D : Les cystes fusionnent leurs couches cellulaires
- E : Les cystes fusionnent également leurs lumières internes et il en résulte un unique cyste de taille plus importante.

Claims

Revendications
[Revendication 1] Microcompartiment (10) en trois dimensions de forme ovoïde, cylindrique, sphéroïde ou sphérique ou sensiblement ovoïde, cylindrique, sphéroïde ou sphérique, comprenant une couche externe (12) en hydrogel définissant une partie interne (14), ladite partie interne (14) comprenant au moins :
- des éléments de matrice extracellulaire (16), et
- au moins deux cystes, chaque cyste étant formé par au moins une couche de cellules humaines ou animales (18), à l'exclusion de cellules souches embryonnaires d'êtres humains, organisée en trois dimensions autour d'une lumière (20), le plus petit rayon de la partie interne (14) étant d'au moins 100 pm.
[Revendication 2] Microcompartiment (10) selon la précédente revendication, caractérisé en ce que les cellules de chaque couche (18) sont des cellules épithéliales ou ayant une morphologie de type épithéliale et capables de former un cyste.
[Revendication 3] Microcompartiment (10) selon l'une des précédentes revendications, caractérisé en ce que les cellules de chaque couche (18) sont choisies parmi les cellules souches pluripotentes induites (iPSC) et les cellules suivantes : cellules d'épithéliums glandulaires, cellules d'épithélium rénal, cellules de l'épithélium intestinal, cellules de l'épithélium de la peau, cellules de l'épithélium pigmentaire rétinien, cellules de l'épicarde, cellules de l'endocarde.
[Revendication 4] Microcompartiment (10) selon l'une des précédentes revendications, caractérisé en ce que la partie interne (14) comprend également des zones liquides sans éléments de matrice extracellulaire.
[Revendication 5] Microcompartiment selon l'une des précédentes revendications, caractérisé en ce que le plus petit rayon de la partie interne (14) est d'au moins 200 pm.
[Revendication 6] Microcompartiment selon l'une des précédentes revendications, caractérisé en ce que le volume de la partie interne (14) représente au moins 20% du volume total du microcompartiment, préférentiellement au moins 40%.
[Revendication 7] Microcompartiment selon l'une des précédentes revendications, caractérisé en ce qu'il est clos.
[Revendication 8] Microcompartiment selon l'une des précédentes revendications, caractérisé en ce que la couche externe comprend de l'alginate.
[Revendication 9] Microcompartiment cellulaire selon l'une des précédentes revendications, caractérisé en ce qu'au moins un cyste est issu de la fusion de deux cystes.
[Revendication 10] Microcompartiment selon l'une des précédentes revendications, caractérisé en ce que les cellules présentes dans le microcompartiment ont été obtenues par l'encapsulation dans la partie interne d'une couche externe d'hydrogel, de 2 à 30 cellules.
[Revendication 11] Microcompartiment selon l'une des précédentes revendications, pour son utilisation comme médicament.
[Revendication 12] Ensemble de microcompartiments comprenant au moins deux microcompartiments cellulaires en trois dimensions, caractérisé en ce qu'au moins un microcompartiment est un microcompartiment selon l'une des revendications 1 à 10.
[Revendication 13] Ensemble de microcompartiments selon la précédente revendication, caractérisé en ce que les microcompartiments sont disposés dans un milieu de culture dans un bioréacteur.
[Revendication 14] Procédé de préparation d'un microcompartiment cellulaire selon l'une des revendications 1 à 10 ou d'un ensemble de microcompartiments cellulaires selon l'une des revendications 12 à 13, comprenant les étapes suivantes :
- (a) incuber des cellules humaines ou animales dans un milieu de culture contenant au moins un facteur cytoprotecteur,
- (b) mélanger les cellules issues de l'étape (a) avec des éléments de matrice extracellulaire, préférentiellement une matrice extracellulaire biologique ou de synthèse,
- (c) encapsuler la suspension de cellules dans une couche d'hydrogel de façon à former un microcompartiment de forme ovoïde, cylindrique, sphéroïde ou sphérique ou sensiblement ovoïde, cylindrique, sphéroïde ou sphérique, comprenant une couche externe en hydrogel définissant une partie interne, le plus petit rayon ou le rayon moyen de ladite partie interne étant d'au moins 100 pm ;
- (d) cultiver les microcompartiments obtenus dans un tampon de rinçage isotonique, puis dans un milieu de culture, préférentiellement dans un milieu de culture contenant au moins un facteur cytoprotecteur,
- (e) préférentiellement rincer les microcompartiments, de manière à éliminer le facteur cytoprotecteur ;
- (f) cultiver les microcompartiments pendant au moins deux cycles de division cellulaire (amplification), préférentiellement entre 1 et 20 jours, encore plus préférentiellement entre 2 et 10 jours, notamment entre 5 et 7 jours, dans un milieu de culture dépourvu de facteur cytoprotecteur, et
- (g) optionnellement récupérer les microcompartiments cellulaires obtenus.
[Revendication 15] Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce que l'étape c) est réalisée par co-injection de deux ou trois solutions :
- une solution d'hydrogel,
- éventuellement une solution intermédiaire isotonique,
- la solution issue de l'étape b) comprenant des cellules, du milieu de culture et la matrice extracellulaire, de manière concentrique via un injecteur microfluidique qui permet de former un jet en sortie d'injecteur constitué du mélange des solutions, ledit jet se fractionnant en gouttes, lesdites gouttes étant collectées dans un bain de calcium qui rigidifie la solution d'hydrogel pour former la couche externe de chaque microcompartiment, la partie interne de chaque goutte étant constituée par la solution issue de l'étape (b) comprenant des cellules, du milieu de culture et la matrice extracellulaire.
[Revendication 16] Procédé selon la revendication 15, caractérisé en ce que le diamètre d'ouverture finale de l'injecteur microfluidique est compris entre 150 et 300 miti, préférentiellement entre 180 et 240 miti, et le débit de chacune des solutions est compris entre 45 et 150 mL/h, préférentiellement entre 45 et 110 mL/h.
[Revendication 17] Procédé selon l'une des revendications 14 à 16, caractérisé en ce que la totalité des cellules encapsulées initialement à l'étape (c) représente un volume inférieur à 50% du volume du microcompartiment dans lequel elles sont encapsulées.
[Revendication 18] Procédé selon l'une des revendications 14 à 17, caractérisé en ce que l'étape b) de mélange des cellules à une matrice extracellulaire, est réalisée soit entre l'étape (a) et l'étape (c), soit simultanément à l'encapsulation à l'étape (c).
[Revendication 19] Procédé selon l'une des revendications 14 à 18, caractérisé en ce que les étapes (d), (e) et (f) sont mises en oeuvre sous agitation permanente ou séquentielle.
[Revendication 20] Procédé selon l'une des revendications 14 à 19, caractérisé en ce qu'il est mis en oeuvre dans un bioréacteur.
[Revendication 21] Procédé selon l'une des revendications 14 à 20, caractérisé en ce que préalablement ou simultanément à l'étape (a), le procédé comprend une étape de dissociation des cellules par une dissociation chimique, enzymatique ou mécanique.
[Revendication 22] Procédé selon l'une des revendications 14 à 21, caractérisé en ce que le procédé comprend au moins une ré-encapsulation des cellules après l'étape (f).
[Revendication 23] Procédé selon la revendication 22, caractérisé en ce que chaque ré encapsulation correspond à un passage.
[Revendication 24] Procédé selon l'une des revendications 22 ou 23, caractérisé en ce que chaque ré-encapsulation consiste à éliminer la couche externe d'hydrogel, préférentiellement à remettre en suspension de manière partiellement ou totalement dissociées, les cellules qui étaient sous forme de cystes dans les microcompartiments et à remettre en oeuvre les étapes du procédé.
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