EA030828B1 - Человеческие антитела к cd27, методы и применение - Google Patents

Abstract

Человеческие антитела, иммуноспецифические для человеческого CD27, способны блокировать связывание CD27 с его лигандом CD70 и нейтрализовать биологическую активность CD27, включая, но не ограничиваясь, следующее: внутриклеточное сигнализирование CD27, пролиферацию и активацию T-клеток, пролиферацию и дифференциацию B-клеток, образование бластных клеток плазмы и облегчение ответов антител, стимулирование опухолевых клеток при помощи CD70, а также выработку растворимых медиаторов из T- и B-клеток. Антитела могут быть использованы в диагностике или лечении заболеваний и состояний, ассоциируемых с активностью CD27.

Description

Настоящее изобретение относится к человеческим антителам к белку CD27 и методам их применения, в частности к человеческим антителам к белку человека CD27 и методам их применения в лечении воспалительных заболеваний.

Уровень техники

CD27 является трансмембранным белком 1-го типа и членом суперсемейства рецептора ФНО (TNFSF27), который экспрессируется в качестве поверхностного антигена на большинстве T-клеток, естественных киллерных клеток и антителосекретирующих плазматических клеток и B-клеток памяти. CD70 представляет собой цитокин, также называемый членом суперсемейства лигандов фактора некроза опухоли 7 (TNFSF7) и когнатным лигандом для CD27. Взаимодействия лиганда TNFSF с рецептором способны регулировать дифференциацию Т-зависимых B-клеток (Jacquot S. 2000 Immunol Res. 21(1):2330) и индуцируют апоптоз клеток в различных клетках.

CD27: результаты лигирования CD70 в активации канонических и неканонических NF-κβ сигнальных путей, что, в свою очередь, стимулирует пролиферацию B- и T-клеток, дифференциацию плазматических клеток и последующую секрецию антител (Yamamoto Н. 1998 J Immunol. 161(9):4753-9). Костимуляция CD27 при помощи ОХ40, 4-1ВВ также способствует выживанию активированных T-клеток (Croft M. 2003 Cytokine Growth Factor Rev. 14(3-4): 265-73), тем самым регулируя количество эффекторных клеток и T-клеток памяти, а также управляет функцией T-клеток, непосредственно стимулируя выработку цитокинов, таких как ИЛ-4 и интерферон-гамма или модулируя ответы T-клеток на действия других цитокинов, таких как ИЛ-2 и ИЛ-12.

Исследования, проведенные как на людях, так и животных, свидетельствуют о важной роли пути CD27:CD70 в различных иммунных заболеваниях, включая системную красную волчанку (SLE) (Doerner T.Lupus 2004 13 (5):283-9), ревматоидный артрит (Так Р.Р. et al., 1996 clin Immunol Immunopathol 80(2): 129-38) и рассеянный склероз (Hintzen R.Q. et al., 1991 J Neuroimmunol 35(1-3):211-7). С другой стороны, CD70, как сообщалось, экспрессируется в различной степени на злокачественных В-клетках, и комплекс CD70:CD27 способен опосредовать противоопухолевый ответ посредством активации противоопухолевого иммунитета и снижения роста опухоли (Borst J., Hendriks J and Xiao Y. 2005. Curr Opin Immunol. 17(3):275-81). CD27 также может контролировать накопление CD4+ и CD8+ T-клеток в местах инфекции (Hendricks et al., 2000 Nature Immunol 1, 433-440).

CD70 не экспрессируется на нормальных некроветворных клетках. Экспрессия CD70, по-видимому, временно ограничена антигенактивированными T- и B-клетками, и его экспрессия подавляется при прекращении антигенной стимуляции. Данные на экспериментальную модель на животных показывают, что CD70 может способствовать развитию иммунологических расстройств, таких как, например, ревматоидный артрит (Brugnoni et al., 1997 Immunol. Lett. 55:99-104), псориатический артрит (Brugnoni et al., 1997, Immunol. Lett. 55:99-104) и волчанка (Oelke et al., 2004, Arthritis Rheum. 50:1850-60). В дополнение к своей возможной роли в воспалительных ответах CD70 также экспрессируется на различных трансформированных клетках, включая B-клетки лимфомы, клетки Ходжкина и Рида-Штернберга, злокачественные клетки неврального происхождения и ряд карцином.

Агонистсвязывающие антитела к CD27, описанные в патенте WO 2008/051424 (Univ. South Hampton), были отмечены в качестве полезных для стимуляции T-клеточного иммунитета, и такие антитела имеют связывающий эпитоп, который обеспечивает их неизменность (отсутствие ингибирования) CD70.

В то время как исследования на грызунах, связанные с изменением CD27 и/или CD70, продемонстрировали потенциально важную роль взаимодействия этого лиганда рецептора, есть необходимость в создании человеческих антител, специфичных для человеческого CD27 и других блокирующих агентов взаимодействия CD27:CD70, которые могут оказывать клинически полезное цитотоксическое, цитостатическое или иммуномодулирующее действие на CD27-экспрессирующие клетки, в частности, не оказывая нежелательного агонистического воздействия на CD27-экспрессирующие клетки при отсутствии CD70. Такие соединения могут быть полезными лекарственными средствами для модулирования развития неопластических клеток или иммунных заболеваний, которые опосредованы CD27экспрессирующими клетками.

Изложение сущности изобретения

Настоящее изобретение предлагает человеческое моноклональное антитело, связывающееся с CD27, способное блокировать действия, связанные с взаимодействием CD27-CD70 с клетками, тканями или органами субъекта-носителя. Предлагаются последовательности аминокислот примерных моноклональных антител, связывающихся с CD27, которые кодируются нуклеиновыми кислотами для экспрессии в клетке-хозяине. Кроме того, CD27 моноклональное антитело данного изобретения определяет по меньшей мере три неперекрывающихся эпитопа на внеклеточном домене CD27, у которых при зацеплении с антителом данного изобретения предотвращается активация сигнального пути лигирования лиганда типа CD70 и нисходящей биологической активности.

Другим аспектом настоящего изобретения является выделенное анти-CD27 антитело, вступающее в реакцию с эпитопом белка CD27, определенного остатками между позициями 21-191 белка CD27.

- 1 030828

Другой аспект настоящего изобретения представляет собой выделенное антитело, имеющее последовательность вариабельного участка тяжелой цепи SEQ ID NO: 133, а также последовательность вариабельного участка легкой цепи SEQ ID NO: 143, включая варианты этих последовательностей, например консервативные замены.

Еще один аспект настоящего изобретения представляет собой выделенное антитело, имеющее CDR последовательности тяжелой цепи SEQ ID NO: 44 или 161, 47 и 58 и легкой цепи SEQ ID NO: 62, 68 и 75.

Другим аспектом настоящего изобретения является выделенный полинуклеотид, кодирующий антитело данного изобретения.

Таким образом, один аспект настоящего изобретения относится к сконструированному антителу, включающему сконструированные (например, гуманизированную или адаптированную к человеку) тяжелую и легкую цепи, где:

(1) вариабельный участок сконструированной тяжелой цепи содержит или получен из одного или нескольких участков, определяющих комплементарность (CDR) из тяжелой цепи мышиных антител С2177, С2191, С2192 и С2186 и каркасного участка из тяжелой цепи человеческого акцепторного антитела, а также дополнительно имеет одну или несколько замен остатков человеческого каркасного участка, а также (2) вариабельный участок сконструированной легкой цепи содержит один или несколько участков, определяющих комплементарность из легкой цепи мышиных антител С2177, С2191, С2192 и С2186 и каркасного участка из легкой цепи человеческого акцепторного антитела, а также дополнительно имеет одну или несколько замен остатков человеческого каркасного участка; и (3) сконструированное антитело специфически связывается с человеческим CD27 и препятствует его взаимодействию с CD70.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения сконструированное антитело может состоять из одной или нескольких CDR, которые затем конструируются при помощи одной или нескольких замен или делеций, например, те, которые на 90, 95, 98 или 99,5% идентичны одной или нескольким CDR антител С2177, С2191, С2192 и/или С2186.

Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к лечению или профилактике патологических состояний, связанных с биологической активностью CD27, путем введения терапевтически или профилактически эффективного количества антитела по настоящему изобретению, его части, или смеси антител по настоящему изобретению или их частей пациенту, который нуждается в таком лечении.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение включает эпитопы антигена в качестве компонента вакцины. Полипептиды или полинуклеотиды, кодирующие полипептидные эпитопы, описанные выше, включающие субфрагменты или трехмерные аналоги некоторых или всех из последовательностей под SEQ ID NO: 1 остатки 21-191 или консервативные изменения их, признаются антителами по данному изобретению. Полипептиды и полинуклеотиды могут быть использованы для активной иммунизации носителя, чтобы вызывать выработку антител против CD27, способных побороть или предотвратить патологические состояния, связанные с биологической активностью CD27.

Изобретение также относится к способам получения, очищения, разработки и упаковки антитела по изобретению для применения в лечении или профилактике патологических состояний, связанных с биологической активностью CD27, путем введения терапевтически или профилактически эффективного количества антитела или его части.

Краткое описание фигур

Фиг. 1 представляет собой график, показывающий эффекты антитела С2177 на пролиферацию Tклеток.

Фиг. 2 показывает кристаллическую структуру тройного комплекса CD27:С2177:С2191. N- и Сконцевые участки фрагмента CD27 помечены. Тяжелые цепи Fab-фрагментов темнее, чем их легкие цепи.

Фиг. 3 представляет собой схему контактов белка CD27 антитела С2177 с остатками белка CD27 (эпитопами), обведенными кругами и остатками антитела С2177 (паратопами) в прямоугольниках.

Фиг. 4 представляет собой схему контактов белка CD27-антитела С2191 с остатками белка CD27 (эпитопами), обведенными кругами и остатками антитела С2191 (паратопами) в прямоугольниках.

Подробное описание

Сокращения.

CDR - участок, определяющий комплементарность;

CFSE - карбоксифлуоресцеин диацетат, сукцинимидил эфир;

ECD - внеклеточный домен;

FR - каркасный участок;

H - тяжелая цепь;

GvHD - реакция трансплантат против хозяина;

L - легкая цепь;

IFN - интерферон (г, гамма);

- 2 030828

Ig - иммуноглобулин;

Mab - моноклональное антитело;

MMP - матриксная металлопротеиназа;

PBMC - мононуклеарные клетки периферической крови;

VL - вариабельный участок легкой цепи;

VH - вариабельный участок тяжелой цепи.

Определения.

В настоящем документе термин антитело включает в себя цельные антитела и любой антигенсвязывающий фрагмент или его одиночную цепь. Таким образом, антитело включает в себя любой белок или пептид, содержащий молекулу, которая содержит по меньшей мере часть молекулы иммуноглобулина, включая, но не ограничиваясь, содержащие по меньшей мере один участок, определяющий комплементарность (CDR) тяжелой или легкой цепи, или его лигандсвязывающую часть, вариабельный участок тяжелой цепи или легкой цепи, константный участок тяжелой цепи или легкой цепи, каркасный (FR) участок или любую его часть или по меньшей мере одну часть связывающего белка, которая может быть встроена в антитело настоящего изобретения. Предполагается, что термин антитело дополнительно охватывает антитела, фрагменты расщепления, их конкретные части и варианты, включая антителамиметики или антитела, содержащие фрагменты антител, имитирующие структуру и/или функцию антитела или его конкретного фрагмента или части, включая одноцепочечные и однодоменные антитела и их фрагменты. Функциональные фрагменты включают в себя антигенсвязывающие фрагменты для предварительно выбранной мишени. Примеры связывающих фрагментов, охватываемых термином антигенсвязывающая часть антитела, включают в себя (i) Fab-фрагмент - моновалентный фрагмент, состоящий из доменов VL, VH, CL и СН;

(ii) F(ab')₂-фрагмент - двухвалентный фрагмент, содержащий два Fab-фрагмента, связанных дисульфидным мостиком в шарнирной области;

(iii) Fd - фрагмент, состоящий из доменов VH и СН;

(iv) Fv - фрагмент, состоящий из доменов VL и VH одного плеча антитела;

(v) dAb - фрагмент (Ward et al. (1989 г.) Nature 341:544-546), состоящий из домена VH; и (vi) выделенный участок, определяющий комплементарность (CDR).

Кроме того, хотя два домена Fv-фрагмента (VL и VH) кодируются отдельными генами с использованием рекомбинантных способов, их можно соединять синтетическим линкером в единую белковую цепь со спаренными областями VL и VH, образующими моновалентные молекулы (известные как одноцепочечная Fv (scFv) (см., например, Bird et al. (I 988) Science 242:423-426, and Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad Sci. USA 85:5879-5883). Также предполагается, что такие одноцепочечные антитела также охватываются термином антигенсвязывающая часть антитела. Такие фрагменты антител получают с использованием традиционных методов, известных специалистам в данной области, а отбор фрагментов на возможность использования проводят таким же образом, как и интактные антитела. С другой стороны, можно использовать библиотеки конструктов scFv для отбора на антигенсвязывающую способность, а затем, используя традиционные методы, провести их сплайсинг с другими ДНК, кодирующими человеческие последовательности зародышевой линии. Одним из примеров такой библиотеки является HuCAL: Human Combinatorial Antibody Library (Knappik A. et al., J Mol Biol (2000 г.) 296 (1):57-86).

Термин CDR означает участок, определяющий комплементарность или гипервариабельный участок аминокислотного остатка антитела, который участвует в или отвечает за связывание с антигеном. Гипервариабельный участок или CDR человеческого подтипа IgG антитела содержит остатки аминокислот из остатков 24-34 (L1), 50-56 (L2) и 89-97 (L3) в вариабельном домене легкой цепи 31-35 (H1), 50-65 (H2) и 95-102 (H3) в вариабельном домене тяжелой цепи, как описано Kabat et al. (1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.) и/или те остатки из гипервариабельной петли (например, остатки 26-32 (L1), 50-52 (L2) и 91-96 (L3) в вариабельном домене легкой цепи и 26-32 (H1), 53-55 (H2) или текущее определение H2 Chothia 52-57 и 96-101 (H3) в вариабельном домене тяжелой цепи, как описано Chothia et al., J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987)).

Каркасный участок или остатки FR1-4 являются остатками вариабельного домена, отличающимися от и заключающимися в скобки гипервариабельные участки. В последнее время была разработана и широко внедрена универсальная система нумерации - международная информационная система ImMunoGeneTics® (IMGT) (LaFranc, et al., 2005 г., Nucl Acids Res. 33:D593-D597).

В настоящем документе CDR обозначают как по аминокислотной последовательности, так и по положению в легкой или тяжелой цепи в последовательной нумерации. Поскольку положение CDR в структуре вариабельного домена иммуноглобулина сохраняется между видами и присутствует в структурах, называемых петлями, с помощью системы нумерации, которая выравнивает последовательности вариабельного домена в соответствии со структурными особенностями, CDR и каркасные остатки легко идентифицируются. Эта информация используется в трансплантации и замене остатков CDR иммуноглобулинов одного вида на каркасный участок акцептора, как правило, из человеческого антитела.

Термин CD27 относится к суперсемейству человеческого рецептора ФНО (TNFSF27), продукту

- 3 030828 человеческого гена 939 (гена CD27), также именуемого человеческим рецептором CD27L, MGC20393, S152, Т14, T-клеточному активационному антигену CD27 и включает все варианты, изоформы и гомологи видов CD27. Экспрессированный человеческий CD27 (Национальный центр биотехнологической информации. Номер доступа NP 001233) является полипептидом 260 аминокислот, которые на N-конечном фрагменте имеют 20-аминокислотный сигнал секреции. Таким образом, антитела по данному изобретению в некоторых случаях могут вступать в перекрестную реакцию с CD27 других видов помимо человеческого. В других случаях антитела могут быть полностью специфичными для человеческого CD27 и не показывать видовую перекрестную реактивность или перекрестную реактивность других типов. Под биологической активностью CD27 подразумеваются любые нисходящие активности, возникающие в результате связывания и/или активации рецептора CD27 в результате активации CD27 одним или несколькими лигандами, в особенности полипептидами CD70 (TNFSF7, NP 001243) или другими лигандами, такими как SIVA. CD27 переобразует сигналы, что приводит к активации NF-κ-β и MAPK8/JNK. Адапторные белки TRAF2 и TRAF5 показали опосредование процесса сигнализирования данного рецептора. Биологические активности CD27 могут также возникать в результате связывания определенных процессированных форм CD27 или фрагментов CD27 с лигандами, которые сами по себе проявляют биологическую активность, например полипептид, состоящий из приблизительно 21-191 остатка непроцессированного белка, может связываться с CD70. Цитоплазматический концевой сегмент антигена CD27, остатки 213-260, связывается с N-концевым фрагментом белка SIVA (также именуемым фактором, индуцирующим апоптоз CD27BP; SIVA1, Siva-1, NP_006418 (175 аа)) и Siva-2, SIVA2, NP_068355 (110 aa).

Термин эпитоп означает белковую детерминанту, способную к специфическому связыванию с антителом. Эпитопы обычно состоят из химически активных поверхностно расположенных групп молекул, таких как аминокислотные или сахарные боковые цепи, а также обычно имеют специфическую трехмерную структуру, а также специфические зарядовые характеристики. Конформационные и неконформационные эпитопы различаются тем, что в присутствии денатурирующих растворителей теряется связывание с первыми, но не теряется связывание со вторыми.

Гуманизация (также именуемая реконструированием или CDR-трансплантацией) или инженерия включает установленные методы снижения иммуногенности моноклональных антител (mAbs) из ксеногенных источников (как правило, грызунов) и улучшения аффинности или эффекторной функции (ADCC, активация комплемента, связывание C1q). Сконструированное моноклональное антитело можно вырабатывать с использованием методов молекулярной биологии при помощи рандомизированных последовательностей, отображаемых фагом или синтезированных de novo. Например, с целью создания гуманизированного антитела с включенными участками CDR нечеловеческих видов проект может содержать вариации, такие как консервативные замены аминокислот в остатках CDR и обратную замену остатков нечеловеческого моноклонального антитела на человеческие каркасные участки (обратные мутации). Позиции можно различать или идентифицировать при помощи методов сравнения последовательностей, анализа согласованной последовательности или структурного анализа 3D структуры вариабельных участков. Существуют компьютерные программы, которые иллюстрируют и отображают возможные трехмерные конформационные структуры выбранных потенциальных последовательностей иммуноглобулинов. Изучение этих изображений позволяет проанализировать вероятную роль остатков в функционировании потенциальной последовательности иммуноглобулина, то есть провести анализ остатков, которые влияют на способность потенциального иммуноглобулина к связыванию со своим антигеном. Таким же образом или посредством алгоритмов выравнивания простых последовательностей (например, Clustal W) можно выбирать остатки FR (каркасного участка) из известных последовательностей атитела, которые можно найти в таких общедоступных базах данных, как VBASE или Kabat, а согласованные последовательности оптимизированы таким образом, что для целевого(-ых) антигена(-ов) архивируется желаемая характеристика антитела, такая как афинность. Поскольку наборы данных известных параметров структур антитела увеличиваются, тоже самое происходит с софистикацией и усовершенствованием данных технологий. Другим подходом к гуманизации является изменение только поверхностных остатков последовательностей грызунов с наиболее распространенными остатками, обнаруженными в человеческих моноклональных антителах, и называется термином изменение поверхности или венирование. На сегодняшний день известно и общедоступно большое количество последовательностей как человеческих, так и нечеловеческих иммуноглообулинов, которые применяются специалистами в данной области, например база данных и инструменты, разработанные LeFranc et al., можно найти под названием IMGT; веб-сайт, который курирует Национальный Центр Биологии США (NCBI); Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Dept. Health (1983), на сегодняшний день также значительно расширена и доступна в режиме онлайн, каждая из них включена в данный документ по ссылке. Гуманизацию или инженерию антител можно выполнять с использованем любого известного метода или разработанного с использованием информации о последовательностях человеческого иммуноглобулина. Такие методы описаны, например, в патентах Winter U.S. Pat No. 6982361 and Bowdish et al., WO 03/025019, содержания которых включены в данный документ по ссылке.

При использовании в настоящем документе K_D означает константу диссоциации, в частности K_D антитела для заданного антигена. Она представляет собой меру аффинности антитела к конкретной ми

- 4 030828 шени. Высокоаффинные антитела имеют K_D=10^-8 М или менее, более предпочтительно 10^-9 М или менее, еще более предпочтительно 10^-10 М или менее в отношении заданного антигена. Величиной, обратной K_D, является K_A, константа ассоциации. Предполагается, что используемые в настоящем документе термины k^, или k₂, или k_d означают скорость диссоциации конкретного взаимодействия антителоантиген. K_D - это отношение скорости диссоциации (k₂), также называемой скоростью диссоциации k_off, к скорости ассоциации (k₁) или скорости ассоциации k_on. Таким образом, величина K_D равна k₂/k₁ или k_off/k_on и выражается в виде молярной концентрации (М). Следовательно, чем меньше значение K_D, тем сильнее связывание. Таким образом, K_D, равный 10^-6 М (или 1 микроМ), указывает на более слабое связывание, чем при 10^-9 М (или 1 нМ). Эти значения можно рассчитать с использованием поверхностного плазмонного резонанса и/или метода Kinexa, как известно в данной области техники.

При использовании в настоящем документе термины моноклональное антитело или композиция моноклональных антител означают препарат молекул антитела мономолекулярной композиции. Композиция моноклональных антител отображает одну специфичность связывания и аффинность к конкретному эпитопу. Этот термин также включает в себя рекомбинантное антитело и рекомбинантное моноклональное антитело, так как все антитела получают, экспрессируют, создают или выделяют с использованием рекомбинантных средств, таких как (а) антитела, выделенные из животного или гибридомы, которые получают посредством слияния секретирующих антитело клеток животных с клеткамипартнерами слияния, (b) антитела, выделенные из клетки-хозяина, трансформированной для экспрессии антитела, например из трансфектомы, (с) антитела, выделенные из рекомбинантной, комбинаторной человеческой библиотеки антител или библиотеки антител другого вида, а также (d) антитела, полученные, экспрессированные, созданные или выделенные любыми иными средствами, включающими сплайсинг генных последовательностей иммуноглобулина с другими последовательностями ДНК. Предполагается, что при использовании в настоящем документе выделенное антитело означает антитело, по существу, свободное от других антител с различными характеристиками антигенной специфичности. Выделенное антитело, которое специфически связывается с эпитопом, изоформой или вариантом человеческого CD27, тем не менее, имеет перекрестную реактивность с другими родственными антигенами, например, других видов (например, видовых гомологов). Кроме того, изолированное антитело может быть практически свободным от постороннего клеточного материала и (или) химических веществ. В одном варианте осуществления настоящего изобретения выделенные моноклональные антитела, имеющие различные характеристики специфичности, комбинируются в композиции тщательно определенного состава.

Используемые в настоящем документе термины специфическое связывание, иммуноспецифическое связывание и связывается иммуноспецифически означают связывание антитела с заданным антигеном. Как правило, связывание антитела характеризуется константой диссоциации (KD) 10^-7 M или менее. Связывание с предопределенным антигеном происходит при KD, в два раза меньшей, чем KD связывания с неспецифичным антигеном (например, BSA, казеин или любой другой полипептид), отличным от предопределенного антигена. Фразы антитело, распознающее антиген и антитело, специфичное к антигену используют в настоящем документе на взаимозаменяемой основе с термином антитело, которое специфически связывается с антигеном. При использовании в настоящем документе высокоспецифичное связывание означает, что относительная K_D антитела к конкретному эпитопу-мишени по меньшей мере в 10 раз меньше, чем KD связывания этого антитела с другими лигандами.

При использовании в настоящем документе изотип означает класс антител (например, IgM или IgG), кодируемый генами константного участка тяжелой цепи. Некоторые классы антител дополнительно охватывают подклассы, которые также кодируются константными участками тяжелой цепи и дополнительно связываются с олигосахаридами по конкретным остаткам в доменах константного участка (например, IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4), что дополнительно задает биологические функции антитела. Например, в человеческом антителе изотипы IgG1, IgG3 и в меньшей степени IgG2 демонстрируют эффекторные функции, как и мышиные антитела IgG2a.

Под эффекторными функциями и выражением эффекторно положительный понимается то, что антитело содержит домены, отличные от специфичных антигенсвязывающих доменов, которые могут взаимодействовать с рецепторами или другими компонентами крови, такими как система комплемента, что ведет, например, к привлечению макрофагов и событиям, ведущим к разрушению клеток, связанных с антигенсвязывающими доменами антитела. Антитела обладают несколькими эффекторными функциями, опосредованными связыванием с эффекторными молекулами. Например, связывание компонента C1 комплемента с антителами активирует систему комплемента. Активация системы комплемента важна для опсонизации и лизиса клеточных патогенов. Активация системы комплемента стимулирует воспалительный ответ и также может быть вовлечена в развитие аутоиммунной гиперчувствительности. Дополнительно антитела связываются с клетками с помощью Fc-участка, причем сайт Fc-рецептора на Fcучастке антитела связывается с Fc-рецептором (FcR) на клетке. Существуют множество Fc-рецепторов, специфичных для различных классов антител, включая IgG (гамма-рецепторы), IgE (эта-рецепторы), IgA (альфа-рецепторы) и IgM (мю-рецепторы). Связывание антитела с Fc-рецепторами на поверхностях клеток инициирует множество важных разнообразных биологических реакций, включая поглощение и деструкцию покрытых антителами частиц, выведение иммунных комплексов, лизис покрытых антителами

- 5 030828 клеток-мишеней клетками-киллерами (это называется антителозависимой клеточноопосредованной цитотоксичностью или ADCC), высвобождение медиаторов воспаления, прохождение через плаценту и контроль продукции иммуноглобулинов.

1. Состав антитела по изобретению.

CD27-нейтрализующее антитело по изобретению представляет собой антитело, которое ингибирует, блокирует или препятствует по меньшей мере одной активности CD27 или связыванию с CD70 in vitro, in situ и/или in vivo и не способствует, не стимулирует, не индуцируют или не выступают в роли агониста активности CD27 или связывания лиганда и не имитирует связывания антител по нисходящему эффекту ОО27-лиганд лигирования, в частности взаимодействия CD70 с CD27, как сигнальной трансдукции в клетке-хозяине. Подходящее CD27-нейтрализующее антитело, определенная часть, или вариант может также дополнительно влиять по меньшей мере на одну активность или функцию CD27,такую как, без ограничения, РНК, ДНК или синтез белка, высвобождение белка, активация T-клеток, пролиферация или дифференциация B-клеток, секреция антитела, сигнализирование рецептора CD27, деградация CD27, связывание с лигандом CD27, индукция CD27 или CD70, синтез или секреция.

Лечение аутоиммунных заболеваний с повышенными эффекторными функциями Т- или B-клеток может быть полезным в отношении костимулирующей блокирующей активности пути CD27:CD70 ОЭ27-нейтрализующих антител по настоящему изобретению.

Настоящее изобретение основано на открытии античеловеческих CD27 моноклональных антител, способных ингибировать активацию CD27 лигандом CD70 и не способных к самоактивации в отсутствие стимулятора CD70. Были получены гибридомы и трансфектомы, способные секретировать такие антитела. Применялся анализ репортерного гена NF-κβ для определения нескольких потенциальных антител, способных ингибировать CD70-опосредованную активацию гена-репортера NF-κβ клеток-хозяев, экспрессирующих CD27. Во-вторых, антитела были охарактеризованы как неспособные индуцировать дозозависимую агонистическую активность при инкубации с CD27 в сочетании с клетками, трансфецированными репортером люциферазы при отсутствии стимулятора CD70. В-третьих, было показано, что антитела в зависимости от дозы ингибируют ОЭ70-зависимую пролиферацию человеческих наивных CD4 Tклеток. В-четвертых, полученные ОЭ27-нейтрализующие антитела, способны уменьшать CD70опосредованную стимуляцию генерации плазматических клеток из человеческих первичных B-клеток в зависимости от дозы. В-пятых, при исследовании антител к CD27 не наблюдалась значительная дозозависимая агонистическая активность в первичных T- или B-клетках.

Антитело по изобретению может препятствовать лигированию CD27:CD70, ингибировать как эффекторные функции T-клеток, так и дифференциацию B-клеток в плазматические клетки в культуре клеток и, таким образом, могут быть полезными для лечения иммуноопосредованных заболеваний, включая, но не ограничиваясь, следующие: ревматоидный артрит, системная красная волчанка, рассеянный склероз, воспалительное заболевание кишечника, болезнь Крона, хроническая обструктивная болезнь легких или другой синдром, патологию, заболевание или расстройство, связанные с аберрантными функциями или активацией клеточных популяций, экспрессирующих CD27. CD 27-связывающие антитела, описанные в данном документе, распознают по меньшей мере три отдельных участка на внеклеточном домене человеческого CD27, что указывает на дополнительное открытие нескольких мест на CD27, подходящих для нацеливания антител или других соединений с возможностями блокирования аналогичной функции. Таким образом, экспрессия и очистка антителосвязывающих доменов, представленных в данном документа в качестве аминокислотных последовательностей, дополнительно предлагает инструмент, который может быть средством для отбора новых молекул, проявляющих ОЭ27-нейтрализующую активность.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения античеловеческое CD27 антитело имеет связывающий участок, содержащий вариабельный участок легкой цепи (VL) или вариабельный участок тяжелой цепи (VH), имеющий аминокислотную последовательность, как показано в SEQ ID NO: 143 и 133 соответственно, и антитело которого или связывающая часть иммуноспецифически связывается с CD27. В другом варианте осуществления настоящего изобретения антитело или его часть, связывающая антиген, связывается с белком CD27, и, кроме того, антитела обладают указанными функциональными свойствами антител по изобретению, например связывание с иммобилизованным человеческим CD27;

ингибирование человеческого растворимого связывания CD27 с клетками, экспрессирующими CD70;

ингибирование человеческого CD70, опосредывающего сигнализирование CD27, измеренного с применением анализа репортерного гена NF-kB на уровне IC₅₀ менее 0,5 мкг/мл;

ингибирование ОЭ70-опосредованной пролиферации наивных T-клеток;

ингибирование ОЭ70-опосредованного образования бластных клеток плазмы из первичных Вклеток человека;

ингибирование человеческого ОЭ70-опосредованного высвобождения растворимого медиатора из первичных клеток или клеточных линий Т и В;

связывание с человеческим CD27 с K_D менее 100 нМ (10^-7 М);

- 6 030828 минимальная активации сигнализирования CD27 в отсутствие стимулятора CD70.

Поскольку хорошо известно в данной области техники, что CDR домены антител тяжелой и легкой цепей играют особенно важную роль в специфичности/аффинности привязки антитела к антигену, рекомбинантные антитела по изобретению, которые описываются здесь, предпочтительно содержат CDR тяжелой и легкой цепи из SEQ ID NO: 44 или 161, 47, 58; и 62, 68 и 75 соответственно. Такое антитело можно получить путем химического соединения различных частей (например, CDR, каркасный участок) антитела с использованием обычных методов путем подготовки и экспрессии (т.е. одной или нескольких) молекул нуклеиновой кислоты, которая кодирует антитело, с использованием обычных методов технологии рекомбинантной ДНК или с использованием любого другого подходящего метода.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения эпитоп, связанный с антителами по изобретению, содержит всего лишь пять из всех остатков 21-191 белка CD27, или его последовательность, кодирующую нуклеиновую кислоту, можно использовать для иммунизации пациента для выработки антител по изобретению непосредственно в носителе с целью лечения, профилактики или облегчения заболевания или симптомов заболевания, связанного с выработкой CD27.

2. Генерация CD27-нейтрализующих антител.

CD27-нейтрализирующее антитело, проявляющее желаемый спектр биоактивности, как приведено в качестве примера в данном документе, в качестве раскрытых и описанных антител может быть получено с использование различных методик, в том числе метода стандартной гибридизации соматических клеток (метод гибридомы) согласно Kohler и Milstein (1975) Nature 256:495. При получении гибридомы мышь или другое подходящее животное, например хомячка или макаку, иммунизируют описанным в настоящем документе способом, чтобы выделить лимфоциты, производящие или способные производить антитела, специфически связывающиеся с белками, используемыми для иммунизации. Альтернативно, лимфоциты можно иммунизировать in vitro. Затем проводят слияние лимфоцитов с клетками миеломы с использованием подходящего агента слияния, такого как полиэтиленгликоль, для образования клетки гибридомы (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, C.59-103 (Academic Press, 1986)).

CD27-нейтрализирующее антитело также можно дополнительно генерировать путем иммунизации трансгенных животных (например, мышей, крыс, хомяков, нечеловекоподобных приматов и т.п.), способных продуцировать спектр человеческих антител, как описано здесь и/или как известно в данной области техники. Клетки, продуцирующие человеческие антитела к CD27, можно выделить из организма таких животных и сделать бессмертными с помощью подходящих методов, например, таких, которые описаны в данном документе. В другом случае последовательности, кодирующие антитело, можно клонировать, ввести в подходящий вектор и использовать для трансфекции клетки-хозяина, чтобы экспрессировать и выделить антитела описанными в настоящем документе методами и другими методами, известными специалистам в данной области.

С помощью трансгенных мышей, несущих в зародышевых клетках локус человеческого иммуноглобулина (Ig), можно получить высокоаффинные полностью человеческие моноклональные антитела к ряду мишеней, в том числе к человеческим аутоантигенам, к которым нормальная человеческая иммунная система толерантна (Lonberg N. et al., US5569825, US6300129 and 1994, Nature 368:856-9; Green, L. et al., 1994, Nature Genet. 7:13-21; Green, L. & Jakobovits, 1998, Exp. Мед. 188:483-95; Lonberg N and Huszar D., 1995, Int. Rev. Immunol. 13:65-93; Kucherlapati, et al. US6713610; Bruggemann M. et al., 1991, Eur. J. Immunol. 21:1323-1326; Fishwild D. et al., 1996, Nat. Biotechnol. 14:845-851; Mendez M. et al., 1997, Nat. Genet. 15:146-156; Green L., 1999, J. Immunol. Methods 231:11-23; Yang X. et al., 1999, Cancer Res. 59:12361243; Bruggemann M. and Taussig M.J., Curr. Opin. Biotechnol. 8:455-458, 1997; Tomizuka et al., WO 02043478). Эндогенный локус иммуноглобулина у таких мышей можно разрушить или подвергнуть делеции, чтобы таким образом лишить животное способности образовывать антитела, кодируемые эндогенными генами. Кроме того, человеческие антитела к избранным антигенам можно заказать в компаниях, например в Abgenix, Inc. (Freemont, Calif.) или Medarex (San Jose, Calif.), которые изготовят их с помощью методов, описанных выше.

В варианте осуществления настоящего изобретения человеческое антитело выбрали из фаговой библиотеки, где фаг содержал гены человеческого иммуноглобулина, экспрессирующей связывающие домены человеческого антитела, например одноцепочечных антител (scFv) типа или других конструктов со спаренными или неспаренными вариабельными участками (Vaughan et al., Nature Biotechnology 14:309-314 (1996): Sheets et al., PITAS (USA) 95:6157-6162 (1998)); Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991)). Человеческие моноклональные антитела по данному изобретения можно приготовить с использованием методов фагового дисплея для скриннинга библиотек генов человеческих иммуноглобулинов. Такое применение метода фагового дисплея для выделения человеческих антител хорошо известно в данной области (см., например, патенты США: в патентах США №№ 5223409; 5403484 и 5571698 к Ladner et al.; патенты США №№ 5427908 и 5580717 к Dower et al.; патенты США №№ 5969108 и 6172197 к McCafferty et al.; патенты США №№ 5885793; 6521404; 6544731; 6555313; 6582915 и 6593081 к Griffiths et al.

Получение иммуногенных антигенов и моноклональных антител можно осуществить с использованием любой подходящей технологии, такой как выработка рекомбинантного белка. Иммуногенные анти

- 7 030828 гены можно вводить в организм животного в виде очищенного белка или смесей белков, в том числе цельных клеток или клеточных или тканевых экстрактов, или антиген можно создать de novo в теле животного из нуклеиновых кислот, кодирующих указанный антиген или его часть.

Как хорошо известно специалистам, выделенные нуклеиновые кислоты, составляющие предмет настоящего изобретения, могут быть получены с использованием: (а) рекомбинантных способов, (b) синтетических способов, (с) способов очистки или их сочетаний. ДНК, кодирующую моноклональные антитела, легко выделяют и секвенируют с использованием методов, известных в данной области техники (например, с использованием олигонуклеотидных зондов, которые способны специфически связываться с генами, кодирующими тяжелые и легкие цепи мышиных антител). При создании гибридом такие клетки могут служить источником такой ДНК. В альтернативном случае при использовании метода дисплея со слиянием кодирующей последовательности и продукта трансляции (например, фаговых или рибосомальных библиотек) селекция связующего звена и нуклеиновой кислоты упрощена. После фаговой селекции участки фага, кодирующие антитело, можно изолировать и использовать для синтеза целых антител, включая человеческие, или любых других желаемых антигенсвязывающих фрагментов и экспрессировать в любом желаемом хозяине, включая клетки млекопитающих, клетки насекомых, клетки растений, дрожжи и бактерии.

Гуманизированные антитела.

Кроме того, изобретение предлагает гуманизированный (сконструированное или адаптированное к человеку) иммуноглобулин (или антитело), который связывается с человеческим CD27. Гуманизированная форма иммуноглобулина имеет вариабельные каркасные участки, в основном из человеческого иммуноглобулина (называемого акцепторным иммуноглобулином) и CDR в основном из нечеловеческого моноклонального антитела, которое специфически связывается с CD27. Константный участок (участки) при наличии также, по существу, происходят от человеческого иммуноглобулина. Гуманизированные антитела показывают K_D для CD27, равную по меньшей мере приблизительно 10^-6 М (1 микроМ), приблизительно 10^-7 М (100 нМ) или ниже. Аффинность связывания гуманизированного антитела может быть больше или меньше, чем таковая у антител мыши, из которого они были получены. Для обеспечения изменения аффинности, например для повышения аффинности гуманизированного антитела к CD27, могут быть сделаны замены либо в остатках CDR, либо в человеческих остатках.

Замещение мышиных CDR на вариабельный каркасный участок домена человека, скорее всего, приведет к удержанию их правильной ориентации в пространстве, если вариабельный каркасный участок домена человека адаптирует такую же или аналогичную конформацию к мышиному вариабельному каркасному участку, из которого происходит CDR. Это достигается за счет получения человеческих вариабельных доменов антител человека, каркасные последовательности которых проявляют высокую степень идентичности последовательности с мышиными вариабельными доменами каркасных участков, из которых происходят CDR. Вариабельные участки каркаса тяжелой и легкой цепей могут происходить от тех же или других последовательностей человеческого антитела. Последовательности человеческого антитела могут представлять собой последовательности человеческих антител природного происхождения, могут быть получены из последовательностей человеческого иммуноглобулина зародышевой линии или могут быть общими типичными последовательностями из нескольких человеческих антител и/или последовательностей зародышевой линии.

Подходящие последовательности человеческого антитела определяют путем компьютерного сравнения аминокислотных последовательностей мышиных вариабельных участков с последовательностями известных человеческих антител. Сравнение проводится отдельно для тяжелой и легкой цепей, но принципы в обоих случаях аналогичны.

В одном примере аминокислотная последовательность ОЭ27-нейтрализующего моноклонального антитела используется для запроса в базу данных человеческих антител, составленную из общедоступных баз данных последовательностей антител. Вариабельные участки тяжелой цепи, раскрытые или описанные здесь, можно использовать для поиска человеческого вариабельного участка с самой высокой идентичностью последовательностей. Вариабельный участок легкой цепи, раскрытый или описанный здесь, также можно использовать для поиска человеческого вариабельного участка с самой высокой идентичностью последовательностей. ДНК-конструкцию, в которой участки, кодирующие CDR одного из вариабельных участков тяжелой цепи донора мышиного моноклонального антитела, перемещают в выбранную вариабельную последовательность человеческой тяжелой цепи, заменяя CDR человеческого вариабельногого участка, получают для каждого мышиного вариабельного участка.

Неестественное соседство мышиных участков CDR с человеческим вариабельным каркасным участком может приводить к неестественным конформационным ограничениям, которые, если их не скорректировать посредством замещения некоторых аминокислотных остатков, могут привести к потере аффинности связывания. Как отмечалось выше, гуманизированные антитела по изобретению содержат вариабельный каркасный участок в основном из человеческого иммуноглобулина, а также CDR, в основном из мышиного иммуноглобулина (например, мышиные антитела С2177, С2186, С2191 или С2192). После определения CDR мышиных антител и соответствующих последовательностей акцепторного иммуноглобулина человека следующим шагом является определение, какие (либо никаких) остатки этих

- 8 030828 компонентов следует заместить, чтобы оптимизировать свойства полученного гуманизированного антитела. В целом, замена аминокислотных остатков человека мышиными должна быть сведена к минимуму, поскольку введение мышиных остатков увеличивает риск того, что антитело может вызвать HAMAответ в организме человека. Аминокислоты для замещения выбирают на основе их возможного влияния на конформацию CDR и/или связывание с антигеном. Исследование такого возможного влияния можно провести путем моделирования, исследования характеристик аминокислот в конкретных позициях или эмпирического наблюдения эффектов замещения или мутагенеза конкретных аминокислот. Эмпирическим способом было обнаружено, что особенно удобно создать библиотеку вариантов последовательностей, которые можно проверять на требуемую активность, аффинность связывания или специфичность. Одним форматом создания такой библиотеки вариантов является вектор фагового дисплея. В альтернативном варианте осуществления варианты могут быть получены с использованием других способов изменения положения нуклеотидной последовательности, кодирующей целевые остатки в вариабельном домене.

Другой способ определения необходимости в дополнительных заменах и выбор аминокислотных остатков для замены может быть реализован с использованием компьютерного моделирования. Широко доступно компьютерное аппаратное и программное обеспечение для получения трехмерных изображений молекул иммуноглобулина. Как правило, молекулярные модели получают, начиная с рассчитанных структур иммуноглобулиновых цепей или их доменов. Моделируемые цепи сравнивают по сходству аминокислотной последовательности с цепями или доменами с рассчитанными трехмерными структурами, и цепи или домены, имеющие наибольшее сходство последовательности, отбирают в качестве исходных точек для построения молекулярной модели. Рассчитанные трехмерные структуры модифицируют, чтобы учесть различия между фактическими аминокислотами иммуноглобулиновых цепей или моделируемыми доменами, а также различия в исходной структуре. Затем модифицированные структуры собирают в составной иммуноглобулин. Наконец, модель уточняют путем минимизации энергии и проверки того, что все атомы находятся на соответствующих расстояниях друг от друга, а длины и углы связи находятся в допустимых с химической точки зрения пределах.

Обычно участки CDR в гуманизированных антителах являются в основном идентичными и чаще всего идентичны соответствующим участкам CDR в мышином антителе, из которого они были получены. Хотя это нежелательно, иногда возможно сделать одну или несколько консервативных аминокислотных замен остатков CDR без заметного влияния на аффинность связывания полученного гуманизированного иммуноглобулина. Иногда замены участков CDR могут повысить афинность связывания.

В отличие от специфичных аминокислотных замен, рассматриваемых выше, каркасные участки гуманизированных иммуноглобулинов обычно в основном идентичны и чаще всего идентичны каркасным участкам человеческих антител, из которых они были получены. Разумеется, многие аминокислоты в каркасных участках вносят минимальный вклад или не вносят никакого вклада в специфичность или аффинность антитела. Таким образом, многие отдельные консервативные замены аминокислотных остатков каркасного участка практически не отражаются на специфичности или аффинности полученного гуманизированного иммуноглобулина.

Так как код является вырожденным, аминокислотную последовательность каждого иммуноглобулина будут кодировать различные нуклеотидные последовательности. Требуемую нуклеотидную последовательность можно получить твердофазным синтезом ДНК de nova или с помощью ПЦР-мутагенеза ранее полученного варианта требуемого полинуклеотида. Все нуклеиновые кислоты, кодирующие антитела, описанные в настоящей заявке, явным образом включены в настоящее изобретение.

Вариабельные сегменты гуманизированных антител, сконструированных вышеописанным способом, обычно соединены как минимум с частью константной области человеческого иммуноглобулина. В составе антитела будут константные участки и легкой, и тяжелой цепей. Константный участок тяжелой цепи обычно содержит домены CH1, шарнирный, CH2, CH3 и иногда CH4.

Гуманизированные антитела могут содержать константные домены любого типа из любого класса антител, включая IgM, IgG, IgD, IgA и IgE, а также любого подкласса (изотипа), включая IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4. Когда требуется, чтобы гуманизированное антитело показывало цитотоксическую активность, константный домен, как правило, представляет собой комплементсвязывающий константный домен, а класс, как правило, представляет собой IgG1. Когда такая цитотоксическая активность нежелательна, в качестве константного домена можно использовать IgG2. Гуманизированное антитело может содержать последовательности более чем из одного класса или изотипа.

В векторы экспрессии вставляют нуклеиновые кислоты, кодирующие гуманизированные вариабельные участки легкой и тяжелой цепей, необязательно соединенные с константными участками. Легкую и тяжелую цепи можно клонировать в одном или в разных векторах экспрессии. ДНК-сегменты, кодирующие иммуноглобулиновые цепи, функционально соединяют в векторе (векторах) экспрессии с контрольными последовательностями, обеспечивающими экспрессию иммуноглобулиновых полипептидов. Такие контрольные последовательности включают сигнальную последовательность, промотор, энхансер и последовательность терминатора транскрипции (см. Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 10029 (1989 г.); WO 90/07861, Co et al., J. Immunol. 148, 1149 (1992), которые включены во всей полноте в

- 9 030828 настоящий документ посредством ссылки).

Эффективность терапевтического белка может быть ограничена нежелательными иммунными реакциями. Нечеловеческие моноклональные антитела могут иметь значительные протяженности линейных аминокислотных последовательностей и локальные структурные конформации, способные вызвать у человека иммунный ответ. Первой попыткой снизить иммуногенность нечеловеческих антител было создание химер человеческо-мышиных антител, за которым последовала разработка методов гуманизации этих химер в конце 1980-х гг. (рассмотрено в публикации Almagro and Fransson, Front Biosci 13: 16191633, 2008).

Одним из наиболее часто используемых подходов гуманизации является так называемая трансплантация участков, определяющих комплементарность (CDR), в котором мышиные CDR трансплантируют на каркасные участки (FR) человеческого антитела. Тем не менее, применение этого метода чаще приводит, чем не приводит к существенной потере связывания с антигеном и, следовательно, к снижению иммуногенного потенциала препарата, изготовленного на основе антител. Следовательно, крайне важно использовать четкие принципы создания молекул антитела, проявляющего минимальные иммуногенные реакции и при этом сохраняющего связывающие и биофизические свойства материнской нечеловеческой молекулы при введении человеку.

Описана гуманизация двух мышиных моноклональных антител (mAb) 2177 и 2191 со специфичностью связывания с CD27. Каркасные участки (FR) этих антител были заменены каркасными участками человеческого гена зародышевой линии с использованием первого шага собственной технологии гуманизации Janssen под названием Адаптация человеческого каркасного участка (HFA), раскрытой в заявке на патент Raghunathan G., US20090118127 A1 и далее приведенной в качестве примера в публикации Fransson et al. (J Mol Biol 398:214-231, 2010). Данная технология обеспечивает набор моноклональных антител, специфичных для CD27 с улучшенными свойствами связывания и ингибирования относительно измеренных у родительских мышиных антител 2177 и 2191.

3. Способы применения анти-CD27 антитела.

Как подробно описано ниже, настоящее изобретение демонстрирует, что четыре выделенных моноклональных антитела (С2177, С2186, С2191 и С2192) связываются с тремя неперекрывающимися эпитопами на CD27 и отображают действие, ингибирующее CD27 in vitro и/или in vivo. Важно отметить, что реакционная способность моноклональных антител включает в себя способность блокировать взаимодействие CD27 с CD70 в зависимости от дозы, понижать сигнализацию CD27 в присутствии CD70, уменьшать выработку ИЛ-4 и IFNg T-клетками и ингибировать ОЭ70-зависимую пролиферацию человеческих наивных CD4 + Т-клеток, ОЭ70-зависимую пролиферацию B-клеток и генерацию плазматических клеток. Кроме того, отдельные антитела существенно не индуцируют активацию CD27 при отсутствии стимулятора CD70.

С учетом свойств моноклональных антител, как описано в настоящем изобретении, антитела или их антигенсвязывающие фрагменты подходят в качестве терапевтических и профилактических средств для лечения или профилактики CD27-ассоциированных состояний в организме человека и животных.

В общем, применение будет включать в себя введение терапевтически или профилактически эффективного количества одного или нескольких моноклональных антител или антигенсвязывающих фрагментов по данному изобретению или выбранных антител или молекул с аналогичным спектром связывания и биологической активности восприимчивому пациенту или такому, у которого проявляется состояние, в котором активность CD27, как известно, имеет патологические осложнения, например иммунологическое заболевание или рост опухоли и метастаз. Вводить можно любую активную форму антитела, в том числе фрагменты Fab и F(ab')2.

Предпочтительно использовать антитела, совместимые с видом реципиента, чтобы действие MAb не было слишком коротким или не индуцировало у субъекта иммунный ответ на MAb. Введенные моноклональные антитела могут демонстрировать некоторые вспомогательные функции, такие как связывание с Fc-рецепторами пациента и активацию механизмов ADCC, для того, чтобы истощить популяцию клеток-мишеней с использованием цитолитических или цитотоксичесих механизмов, или они могут быть разработаны с ограниченными или отсутствующими вторичными эффекторными функциями в целях сохранения популяции клеток-мишеней. Лечение индивидуумов может заключаться во введении терапевтически эффективного количества антител настоящего изобретения. Антитела могут быть в составе набора, описанного ниже. Антитела можно использовать или вводить в виде смесей, например, в равных количествах, или по отдельности, в определенной последовательности, или вводить все одновременно. При назначении пациенту антител или их фрагментов, способных связываться с CD27, или антитела, обеспечивающего защиту от CD27, требуется коррекция дозы лекарственного средства в зависимости от таких факторов, как возраст пациента, вес, рост, пол, общее состояние, предшествующий анамнез и т.д.

При похожей методике другим способом терапевтического применения моноклонального антитела настоящего изобретения может быть активная иммунизация пациента антиидиотипическим антителом к одному из представленных моноклональных антител. Иммунизация антиидиотипом, который имитирует структуру эпитопа, может вызвать активный ответ анти-CD27 (Linthicum D.S. and Farid N.R., Antiidiotypes, Receptors, and Molecular Mimicry (1988), с. 1-5 и 285-300).

- 10 030828

Более того, активную иммунизацию можно индуцировать, включив в состав вакцины один и более антигенных и(или) иммуногенных эпитопов. Вакцинацию в целях профилактики или терапии можно проводить орально или парентерально в количестве, достаточном для генерации реципиентом защитных антител к этим биологически активным участкам. Хозяина можно активно иммунизировать антигенным/иммуногенным пептидом в чистом виде, фрагментом этого пептида или модифицированной формой пептида. К N- или С-концу оригинального пептида или его части можно добавить одну и более аминокислот, отсутствующих в оригинальной последовательности белка. Такие дополнительные аминокислоты обычно включают для обеспечения взаимодействия пептида с другим пептидом, с белком-носителем или с подложкой. Аминокислоты, которые являются полезными для этих целей, включают тирозин, лизин, глутаминовую кислоту, аспарагиновую кислоту, цистеин и их производные. Можно использовать альтернативные методы модификации белка, например ИЩ-ацетилирование или COOH-концевое амидирование, чтобы обеспечить дополнительные средства для соединения или слияния пептида с другой молекулой белка или пептида или с подложкой.

Пациенты должны получать антитела, способные защищать от нежелательной биоактивности CD27, в количестве, достаточном для того, чтобы уменьшать, лечить или облегчать связанные с CD27 симптомы или патологии. Если при данной дозировке, способе введения и графике приема лекарственного средства возможно добиться облегчения симптомов, то количество лекарственного средства можно считать достаточным или терапевтически эффективным количеством. Ответную реакцию на введение антитела можно измерить, анализируя ткани, органы или клетки субъекта методами визуализации или получая образцы тканей и изучая их ex vivo. Вещество считается физиологически значимым, если его присутствие вызывает поддающиеся обнаружению изменения физиологии реципиента.

Терапевтические применения.

CD27-нейтрализующие антитела по настоящему изобретению, антигенсвязывающие фрагменты или их указанные варианты можно использовать для измерения или вызова действия в клетке, ткани, органе или животном (включая млекопитающих и людей), для диагностики, мониторинга, модулирования, лечения, облегчения, помощи в предотвращении заболеваемости или уменьшения симптомов состояния, опосредованного, затрагиваемого или модулированного CD27 или клетками, экспрессирующими CD27. Таким образом, предметом настоящего изобретения является также метод подавления или лечения по меньшей мере одного связанного с CD27 заболевания с помощью по меньшей мере одного антитела CD27 настоящего изобретения, в клетке, ткани, органе, организме животного или пациента, как известно специалистам в данной области или раскрыто в настоящем документе. Особые указания будут рассмотрены ниже.

Иммунологические заболевания.

Предметом настоящего изобретения является также метод подавления или лечения связанных с иммунитетом заболеваний в клетке, ткани, органе, организме животного или пациента, включая, но не ограничиваясь следующими:ревматоидный артрит, ювенильный ревматоидный артрит, ювенильный ревматоидный артрит с системным началом, псориатический артрит, анкилозирующий спондилит, язва желудка, серонегативные артропатии, остеоартрит, воспалительное заболевание кишечника, язвенный колит, системная красная волчанка, антифосфолипидный синдром, иридоциклит/увеит/ретробульбарный неврит, идиопатический пневмосклероз, системный васкулит/гранулематоз Вегенера, саркоидоз, орхит/процедуры реверсивной вазэктомии, аллергические/атопические заболевания, астма, аллергический ринит, атопический дерматит (экзема), аллергический контактный дерматит, аллергический конъюнктивит, гиперчувствительный пневмонит, трансплантаты, отторжение пересаженного органа, реакция трансплантат против хозяина, синдром системной воспалительной реакции, синдром сепсиса, грамположительный сепсис, грамотрицательный сепсис, негативный сепсис культуры, грибковый сепсис, нейтропеническая лихорадка, уросепсис, менингококкемия, травма/кровотечение, ожоги, облучение ионизирующим излучением, острый панкреатит, респираторный дистресс-синдром взрослых, ревматоидный артрит, спровоцированный алкоголем гепатит, хронические воспалительные патологии, болезнь Крона, серповидноклеточная анемия, сахарный диабет, нефроз, другие атопические заболевания, реакции гиперчувствительности, аллергический ринит, поллиноз, хронический аллергический ринит, конъюнктивит, эндометриоз, астма, крапивница, общая анафилактическая реакция, дерматит, пернициозная анемия, гемолитические болезни, тромбоцитопения, отторжение трансплантата любого органа или ткани, отторжение пересаженной почки, отторжение пересаженного сердца, отторжение пересаженной печени, отторжение пересаженной поджелудочной железы, отторжение пересаженного легкого, отторжение пересаженного костного мозга (ВМТ), отторжение кожных аллотрансплантатов, отторжение пересаженного хряща, отторжение пересаженной кости, отторжение пересаженной тонкой кишки, отторжение пересаженного эмбрионального тимуса, отторжение пересаженной околощитовидной железы, отторжение ксенотрансплантата любого органа или ткани, отторжение аллотрансплантата, антирецепторные реакции гиперчувствительности, базедова болезнь, болезнь Рейно, инсулинорезистентный диабет В-типа, астма, миастения гравис, опосредованная антителами цитотоксичность, реакции гиперчувствительности III типа, системная красная волчанка, POEMS-синдром (полинейропатия, органомегалия, эндокринопатия, моноклональная гаммопатия и кожные изменения), антифосфолипидный синдром, пузырчатка, склеро

- 11 030828 дермия, смешанное поражение соединительной ткани, идиопатическая болезнь Аддисона, сахарный диабет, хронический активный гепатит, первичный билиарный цирроз, витилиго, васкулит, посткардиотомный синдром, гиперчувствительность IV типа, контактный дерматит, гиперчувствительный пневмонит, отторжение аллотрансплантата, гранулема из-за внутриклеточных организмов, метаболическая или идиопатическая чувствительность к лекарствам, болезнь Вильсона, гемохроматоз, альфа-1антитрипсиновая недостаточность, диабетическая ретинопатия, тиреоидит Хашимото, остеопороз, нарушение функционирования гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой оси, первичный биллиарный цирроз, тиреоидит, энцефаломиелит, истощение, муковисцидоз, хроническое заболевание легких новорожденных, хроническая обструктивная болезнь легких (COPD), наследственный гемофагоцитарный лимфогистиоцитоз, дерматологические состояния, псориаз, алопеция, нефротический синдром, нефрит, гломерулярный нефрит, острая почечная недостаточность, гемодиализ, уремия, токсичность, преэклампсия и воспаление вследствие анти-CD3 терапии, терапии ОКТ3, цитокинами, химиотерапии, лучевой терапии (например, включая, но не ограничиваясь следующими: астении, анемии, кахексии и подобных заболеваний), хроническая интоксикация салицилатом.

Заболевания легких.

Настоящее изобретение также предлагает способ модуляции или лечения заболевания легких или плевры в клетке, ткани, органе, организме животного или пациента, включая, но не ограничиваясь, следующие: модуляция иммунного ответа на ассоциированные или вспомогательные клетки или клеточные процессы с вовлечением CD27, например пневмония; абсцесс легкого; профессиональные заболевания легких, вызванные агентами в форме пыли, газа или аэрозолей; астма, фиброзно-облитерирующий бронхиолит, дыхательная недостаточность, аллергические заболевания легких, включая аллергический пневмонит (экзогенный аллергический альвеолит), аллергический бронхолегочный аспергиллез и медикаментозная аллергия; респираторный дистресс-синдром у взрослых (ARDS), синдром Гудпасчера, хронические обструктивные болезни легких (ХОБЛ), идиопатические интерстициальные заболевания легких, такие как идиопатический легочный фиброз, саркоидоз, десквамативная интерстициальная пневмония, острая интерстициальная пневмония, интерстициальная болезнь легких, ассоциированная с респираторным бронхиолитом, идиопатический облитерирующий бронхиолит с организующейся пневмонией, лимфоцитарный интерстициальный пневмонит, гранулематоз из клеток Лангерганса, идиопатический легочный гемосидероз; острый бронхит, легочный альвеолярный протеиноз, бронхоэктаз, заболевания плевры, коллапс легкого, кистозный фиброз и опухоли легких, а также легочная эмболия.

Злокачественные заболевания.

Настоящее изобретение также предлагает способ модуляции или лечения злокачественного заболевания в клетке, ткани, органе, организме животного или пациента, включая, но не ограничиваясь, следующие: модуляция иммунного ответа на ассоциированные или вспомогательные клетки или клеточные процессы с вовлечением CD27 по меньшей мере одного из следующих: лейкоз, острый лейкоз, острый лимфобластный лейкоз, В-лимфобластный, либо Т-лимфобластный, либо FAB ОЛЛ, острый мелиелоидный лейкоз (ОМЛ), хронический мелиелоидный лейкоз (ХМЛ), хронический лимфоцитарный лейкоз (ХЛЛ), волосатоклеточный лейкоз, миелодиспластический синдром (МДС), лимфома, болезнь Ходжкина, злокачественная лимфома, неходжкинская лимфома, лимфома Беркитта, множественная миелома, солидные опухоли в качестве первичного или метастатического заболевания, саркома Капоши, колоректальная карцинома, карцинома поджелудочной железы, рак почки, рак легкого, включая мезотелиому, рак молочной железы, назофарингеальная карцинома, злокачественный гистиоцитоз, паранеопластический синдром/гиперкальциемия, связанная со злокачественным ростом, аденокарциномы, плоскоклеточные карциномы, саркомы, злокачественная меланома, в особенности метастатическая меланома, гемангиома, метастазирующая опухоль, связанная с раком резорбция костной ткани и связанная с раком боль в костях и т.п.

Сердечно-сосудистые заболевания.

Настоящее изобретение также относится к методу модулирования или лечения сердечнососудистого заболевания в клетках, тканях, органах, животных либо у пациентов, включая, но не ограничиваясь, следующие: модулирование иммунного ответа ассоциированным или вспомогательным клеткам или клеточным процессам, вовлекающим CD27, по меньшей мере одного из следующего ряда заболеваний: инфаркт миокарда, застойная сердечная недостаточность, инсульт, ишемический инсульт, кровоизлияние, артериосклероз, атеросклероз, рестеноз, диабетический артериосклероз, гипертония, артериальная гипертензия, вазоренальная гипертензия, обморок, шок, сифилис сердечно-сосудистой системы, сердечная недостаточность, легочное сердце, первичная легочная гипертензия, сердечная аритмия, предсердная экстрасистола, трепетание предсердий, фибрилляция предсердий (постоянная или пароксизмальная), постперфузионный синдром, воспаление на фоне искусственного кровообращения, хаотическая или мультифокальная предсердная тахикардия, регулярная тахикардия с узкими QRS-комплексами, специфические аритмии, фибрилляция желудочков, аритмии пучка Гиса, атриовентрикулярная блокада, блокада ножки пучка Гиса, ишемические нарушения миокарда, ишемическая болезнь сердца, стенокардия, инфаркт миокарда, кардиомиопатия, дилатационная застойная кардиомиопатия, рестриктивная кардиомиопатия, пороки сердца, эндокардит, заболевание перикарда, сердечные опухоли, аневризмы аорты

- 12 030828 и периферийных артерий, расслоение аорты, воспаление аорты, окклюзия брюшной аорты и ее ветвей, периферические сосудистые расстройства, окклюзионные расстройства артериального кровообращения, атеросклеротическое заболевание периферических артерий, облитерирующий тромбангиит, функциональные расстройства периферических артерий, явление и болезнь Рейно, акроцианоз, эритромелалгия, венозные заболевания, венозный тромбоз, варикозные вены, артериовенозная фистула, лимфедема, жировой отек, нестабильная стенокардия, реперфузионное повреждение, синдром полиорганной недостаточности после искусственного кровообращения, ишемически-реперфузионное повреждение и т. п.

Неврологические заболевания.

Настоящее изобретение также предлагает способ модуляции или лечения неврологического заболевания в клетке, ткани, органе, организме животного или пациента, включая, но не ограничиваясь, следующие: модуляция иммунного ответа на ассоциированные или вспомогательные клетки или клеточные процессы с вовлечением CD27 в одном из следующих заболеваний: нейродегенеративные заболевания, рассеянный склероз, мигрень, комплекс СПИД-деменция, демиелинизирующие заболевания, такие как рассеянный склероз и острый поперечный миелит; экстрапирамидные и мозжечковые расстройства, такие как поражения кортикоспинальной системы; расстройства базальных ганглиев или мозжечковые расстройства; гиперкинетические двигательные расстройства, такие как хорея Гентингтона и старческая хорея; двигательные расстройства, вызванные приемом лекарственных препаратов, таких как индуцированные лекарственные препараты, которые блокируют дофаминовые рецепторы ЦНС; гипокинетические двигательные расстройства, такие как болезнь Паркинсона; прогрессирующий надъядерный паралич; структурные поражения мозжечка; спинно-мозговые и мозжечковые дегенерации, такие как спинальные атаксии, атаксия Фридрейха, мозжечковые корковые дегенерации, дегенерации нескольких систем (синдром Мэнселла, Дежерина-Томаса, Шая-Драгера и Мачадо-Джозефа); системные нарушения (болезнь Рефсума, абеталипопротеинемия, атаксия, телеангиэктазия и митохондриальное мультисистемное расстройство); демиелинизирующие основные заболевания, таких как рассеянный склероз, острый поперечный миелит; и расстройства двигательной единицы, такие как нейрогенные мышечные атрофии (клеточная дегенерация переднего рога, такая как боковой амиотрофический склероз, спинальная мышечная атрофия у детей и ювенильная спинальная мышечная атрофия); болезнь Альцгеймера; синдром Дауна; болезнь диффузных телец Леви; старческая деменция, связанная с развитием телец Леви; синдром Вернике-Корсакова; хронический алкоголизм; болезнь Крейтцфельдта-Якоба; подострый склерозирующий панэнцефалит, болезнь Галлервордена-Шпатца; а также деменция боксеров и т. п. Такой способ может необязательно включать введение эффективного количества композиции или фармацевтической композиции, содержащей по меньшей мере одно антитело к TNF, указанную часть или вариант, в клетки, ткани, органы животным либо пациентам, которым требуется такого рода модулирование, лечение или терапия.

Другие способы терапевтического применения CD27-нейтрализующих антител.

В дополнение к описанным выше состояниям и заболеваниям настоящее изобретение также предлагает способ модуляции или лечения фиброзных состояний различной этиологии путем модуляции иммунного ответа на ассоциированные или вспомогательные клетки или клеточные процессы с вовлечением CD27, например фиброз печени (включая, но не ограничиваясь, следующие: алкогольный цирроз, вирусный цирроз печени, аутоиммунный гепатит); фиброз легких (включая, но не ограничиваясь, следующие: склеродермия, идиопатический фиброз легких); фиброз почек (включая, но не ограничиваясь, следующие:склеродермия, диабетической нефрит, клубочковой нефрит, волчаночный нефрит); кожный фиброз (включая, но не ограничиваясь, следующие: склеродермия, гипертрофические и келоидные рубцы, ожоги); миелофиброз; нейрофиброматоз; фиброма; кишечный фиброз; и фиброзные спайки, возникшие в результате хирургических процедур. Настоящее изобретение также предлагает способ модуляции, лечения или облегчения симптомов инфекционного заболевания в клетке, ткани, органе, организме животного или пациента путем модуляции иммунного ответа на ассоциированные или вспомогательные клетки или клеточные процессы с вовлечением CD27 в таких заболеваниях как, например, острые или хронические бактериальные инфекции, острые или хронические паразитарные или инфекционные процессы, включая бактериальные, вирусные и грибковые инфекции, ВИЧ-инфекцию/ВИЧ-нейропатию, менингит, гепатит (А, В, С или др.), септический артрит, перитонит, пневмония, воспаление надгортанника, кишечная палочка, болезнь Гассера, малярия, геморрагическая форма лихорадки денге, лейшманиоз, проказа, токсический шок, стрептококковый миозит, газовая гангрена, туберкулез, комплекс Mycobacterium avium, пневмоцистная пневмония, воспалительные заболевания органов таза, орхит/эпидидимит, легионелла, болезнь Лайма, грипп А, вирус Эпштейна-Барр, угрожающий жизни гемофагоцитарный синдром, энцефалит/вирусный менингит и т.д.

Все упомянутые работы (в том числе книги, патенты, опубликованные патентные заявки на патент и патентные заявки, одновременно находящиеся на рассмотрении) включены в текст данной заявки посредством ссылки.

Другие свойства изобретения будут описаны ниже в примерах воплощений, приведенных для иллюстрации изобретения и не ограничивающих его объем и сущность.

4. Фармацевтические композиции.

- 13 030828

Настоящее изобретение представляет стабильные композиции CD27-нейтрализирующих антител, которые предпочтительно представляют собой водный раствор на основе фосфатного буферного раствора или смешанного солевого раствора, а также растворы и композиции с консервантами, композиции с консервантами для многоразового использования, которые можно использовать в фармацевтических или ветеринарных целях, содержащие по меньшей мере одно CD27-нейтрализирующее антитело в фармацевтически приемлемой композиции. Допустимые для целей настоящего изобретения несущие среды и их композиция с возможностью введения других белков человека, например сывороточный альбумин человека, описаны, например, в публикации Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21-e изд, под ред. Troy D.B. ed., Lipincott Williams and Wilkins, Philadelphia, PA 2006 г., часть 5.

Для создания фармацевтической композиции, пригодной для эффективного введения, такие композиции должны содержать эффективное количество описанных выше соединений, вместе с подходящим количеством несущей среды. Для контроля продолжительности действия антител можно использовать дополнительные фармацевтические методы. С использованием полимеров, образующих комплексы или абсорбирующих компоненты, можно готовить препараты с контролируемым высвобождением. Другой возможный метод контроля продолжительности действия препаратов с контролируемым высвобождением - это включение компонентов настоящего изобретения в частицы полимерного материала, например полиэстера, полиаминокислот, гидрогелей, (поли)молочной кислоты или сополимера этилена с винилацетатом. В альтернативном варианте вместо включения агентов в полимерные частицы можно упаковывать их в микрокапсулы, изготовленные методом межфазной полимеризации, например в микрокапсулы из гидроксиметилцеллюлозы или желатина или поли(метилметацилата), или использовать антитела в коллоидных системах доставки, например в липосомах, микросферах из альбумина, микроэмульсиях, наночастицах и нанокапсулах или макроэмульсиях. Такие методы описаны в публикации Remington, указанной выше (2006).

5. Введение CD27-нейтрализующих антител.

По меньшей мере одно CD27-нейтрализующее антитело либо в стабильной рецептуре, либо с добавлением консервантов или растворов, описанных в настоящем документе, можно вводить пациенту в соответствии с настоящим изобретением с помощью различных способов введения, включая внутривенно (в/в), внутримышечно (в/м); подкожно (п/к); также есть трансдермальный, легочный, чрезслизистый пути введения, с использованием композиции в имплантате, осмотическом насосе, картридже, микронасосе или других средствах, признанных специалистами, всеобщеизвестными в данной области техники. В одном из способов введения CD27-нейтрализующих антител лекарственное вещество вводится внутривенно через ранее установленный катетер, снабженный инфузионным мешком. CD27-нейтрализующее антитело поставляется в 20-мл флаконах одноразового использования, таких как поставляемые компанией ImmunoGen, Inc. (Кембридж, Массачусетс). Каждый флакон содержит белок в концентрации от 0,05 до примерно 2,0 мг/мл в буферном растворе (pH 6,5±0,5), состоящем в основном из одноосновного фосфата калия (0,57 мг/мл), моногидрата одноосновного фосфата натрия (0,20 мг/мл), двухосновного фосфата натрия (0,555 мг/мл) и хлорида натрия (8,16 мг/мл) в очищенной воде согласно Фармакопее США. Лекарственное средство предварительно дважды отфильтровывается до вливания объема дозы в инфузионный мешок методом пропускания его через 5-мк фильтр с низкой способностью к связыванию белка, после чего вводится пациентам через внутренний 0,22 мкм фильтр в течение 8 ч подготовки. После инфузии внутривенную линию следует промыть жидкостью для обеспечения доставки полной дозы препарата. В целом, при системном введении антител желательно давать реципиенту дозу антител в диапазоне 1 - 100 нг/кг, 100 - 500 нг/кг, 500 нг/кг - 1 мкг/кг, 1 - 100 мкг/кг, 100 - 500 мкг/кг, 500 мкг/кг - 1 мг/кг, 1 50 мг/кг, 50 - 100 мг/кг, 100 - 500 мг/кг (веса тела реципиента), хотя возможно применение более низких или более высоких доз. Дозировки, составляющие около 1,0 мг/кг, уже могут быть в некоторой степени эффективными. Предпочтительной считается дозировка 5 мг/кг, хотя также предпочтительными считаются дозы до 50 мг/кг, особенно при терапевтическом применении. В иных случаях возможно введение указанного количества антител, не зависимого от веса тела пациента, например, в диапазоне 1 - 100 мкг, 1 - 100 мг или 1 - 100 г. Например, возможно направленное введение в ту или иную часть тела или полость, такое как внутрисуставное введение, внутрь бронха, внутрибрюшинное, внутрь капсулы, хряща, полости, интрацелиальное, внутрь мозжечка, желудочка мозга, внутрь толстой кишки, шейки, желудка, печени, миокарда, внутрь кости, таза, перикарда, полости живота, плевры, простаты, легких, внутрь прямой кишки, внутрь почки, сетчатки, позвоночника, суставной сумки, грудной клетки, внутрь матки, мочевого пузыря, внутрь поврежденной ткани, вагинально, ректально, за щеку, под язык, интраназально или трансдермально.

Лечить пациента можно однократной дозой или - что предпочтительнее - по схеме с многократным введением препарата, при этом первичный курс лечения может состоять из 1-10 доз, и далее через определенные промежутки времени так, чтобы иммунный ответ сохранялся или усиливался (например, через 1-4 месяца - вторая серия доз и при необходимости еще через несколько месяцев следующая серия). Примеры подходящих схем лечения включают: (i) 0, 1 месяц и 6 месяцев, (ii) 0, 7 дней и 1 месяц, (iii) 0 и 1 месяц, (iv) 0 и 6 месяцев или другие схемы, позволяющие получить желаемый ответ, при котором ожидается ослабление симптомов заболевания или степени тяжести заболевания.

- 14 030828

6. Готовые продукты, включающие CD27-нейтрализующее антитело.

Изобретение включает готовый продукт, содержащий вещества, пригодные для лечения расстройств, описанных выше, содержащие CD27-нейтрализующее антитело, контейнер и этикетку или листок-вкладыш на контейнере или прикрепленный к контейнеру. Готовое изделие предпочтительно содержит по меньшей мере один флакон, содержащий раствор по меньшей мере одного CD27нейтрализующего антитела с предписанными буферными растворами и/или консервантами, возможно в водном разбавителе, где указанный упаковочный материал содержит этикетку, которая указывает, что такой раствор может хранится в течение определенного периода времени. Изобретение может включать готовое изделие, включая упаковочный материал, первый флакон, содержащий лиофилизированное CD27-нейтрализующее антитело, и второй флакон, содержащий водный разбавитель установленного буферного раствора или консерванта, отличающийся тем, что упаковочный материал содержит этикетку, которая предоставляет инструкцию врачу или пациенту по восстановлению CD27-нейтрализующего антитела в водном разбавителе для приготовления раствора.

Подходящие контейнеры включают, например, бутылки, флаконы, шприцы и т. д. Контейнеры могут быть изготовлены из различных материалов, таких как стекло или пластик. Контейнер может иметь стерильный доступ через порт (например, контейнером может быть пакет раствора для внутривенного вливания или флакон с пробкой, дополнительно его можно проколоть иглой для подкожных инъекций).

По меньшей мере одним из активных веществ в композиции является CD27-нейтрализующее антитело. На этикетке или листке-вкладыше указано, что композиция используется для лечения по назначению, например СКВ. Листок-вкладыш здесь может указывать, что антитело или композиция используется для лечения состояния, которое не дает ответа или проявляет плохую ответную реакцию на лечение и использование стандартных методов оказания медицинской помощи, как указано в настоящем документе для конкретных заболеваний и диагнозов. В других вариантах осуществления настоящего изобретения листок-вкладыш может указывать, что антитело, антитело-конъюгат или композицию можно также использовать для лечения заболевания, характеризующегося необходимостью модулировать иммунный ответ клеточных процессов с вовлечением CD27.

Еще одним аспектом настоящего изобретения является набор для обнаружения CD27 в биологическом образце. В состав набора входят упаковки с одним или большим количеством антител, связывающихся с эпитопом CD27 и инструкции по использованию антител для связывания с образованием иммунологического CD27 комплекса, который затем можно обнаружить, при этом наличие или отсутствие иммунологического комплекса коррелирует с присутствием или отсутствием в образце CD27. Примеры упаковок: многолуночные планшеты, которые позволяют обнаруживать CD27 одновременно во многих образцах.

Хотя изобретение описано в общем виде, осуществления изобретения будут более подробно рассмотрены в приведенных далее примерах.

Пример 1. CD27: реагенты и методы.

С целью получения и тестирования CD27-связывающих моноклональных антител были получены конструкты белков, которые представляют собой всю длину человеческого CD70 и человеческого CD27, а также внеклеточного домена (ECD) человеческого CD27.

Человеческий CD27 (SEQ ID NO: 149) является трансмембранным белком 1-го типа, который состоит из сигнального пептида (остатки 1-20), внеклеточного (ECD, остатки 21-191), трансмембранного (ТМ, остатки 191-212) и внутриклеточного (ICD, остатки 213-260) доменов. Человеческий CD70 (SEQ ID NO: 2) - трансмембранный полипептид длиной в 193 аминокислот, состоящей из N-концевого фрагмента, внутриклеточного домена (ICD, остатки 1-17), трансмембранного (ТМ, остатки 18-38) и внеклеточного домена (ECD, остатки 39-193). Вся последовательность, кодирующая CD70, была клонально экспрессирована на поверхности клеток HEK293.

Для проведения анализа моноклональных антител методом ИФА и протеомного анализа прямого связывания аминокислоты 1-121 из ECD CD27 временно экспрессировали в клетках HEK293 с Сконцевым His6-tag пептидом и очищали с использованием хроматографии ионов металлов. Для анализа фагов методами пэннинг и ИФА аминокислоты 1-173 из ECD с С-концевым His6-tag экспрессировали с использованием HEK и очищали с использованием хроматографии с ионами металлов, за чем следовало применение вытеснительной хроматографии на колонке Superdex 75. Оба этих белка CD27 биотинилировали с использованием химического анализа NHS-эфира, направленного на аминовые остатки на белке. Для кристаллизации аминокислоты 1-101 с С-концевым His6-tag экспрессировали в системе бакуловируса и очищали с использованием хроматографии с ионами металлов Proteose, Inc. Для иммунизации мышей был приобретен белок CD27-FC компании R&D systems. Для некоторых исследований всю последовательность, кодирующую CD27, клонально экспрессировали на поверхности клеток HEK293.

Человеческий CD27 и клоны кДНК человеческого CD70 заказали в компании Open Biosystems. Для создания экспрессирующих конструкций использовали стандартные методы молекулярной биологии. Вкратце, открытые рамки считывания генов CD27 и CD70 амплифицировали при помощи ПЦР и клонировали в экспрессирующие векторы млекопитающих методом переваривания и лигирования рестрикционной эндонуклеазы или с использованием независимого от лигирования клонирования (LIC). Полно

- 15 030828 размерные гены CD27 и CD70 клонировали в экспрессирующие векторы и клонально экспрессировали на поверхности клеток млекопитающих. Внеклеточный домен CD27 клонировали в экспрессирующие векторы млекопитающих и временно экспрессировали в клетках HEK293 с гекса-his-концевым фрагментом.

Пример 2. Получение CD27-нейтрализующих антител.

Мышиные античеловеческие CD27 антитела получали методом гибридом по методу Kohler и Milstein (1975). Десять мышей С3Н/HeJ в возрасте 12-14 недель приобрели у компании Charles River Laboratories. Мышей иммунизировали подкожно (п/к) в основание хвоста (ОХ) с использованием 50 мкгм Hu CD27 Fc (R&D Systems) в сочетании с 0,33х10⁵ единицами мышиного интерферона-альфа и -бета (Biosource) в конечном объеме 100 мкл в первый день. На 2-й и 3-й день мышам вводили интерфероны подкожно в основание хвоста (с применением той же дозы, что и в 1-й день). Мышам вводили бустеринъекции с использованием 50 мкгм Hu CD27-Fc в сочетании с 50 мкгм антимышиного агонистического моноклонального антитела CD40 (R&D Systems, MAB440) методом подкожной инъекции в основание хвоста в ФСБ на 14-й день; за четыре дня до сбора клеток селезенки для слияния.

Для анализа титров был выполнен фазовый ИФА с захватом. Вкратце, планшетки (Nunc-Maxisorp) покрывали 0,1 мкгм козьего антимышиного Fc (Jackson Immunotech) и оставляли на ночь в бикарбонатном буфере при температуре 4°C. После этапов блокирования и промывки добавляли растворы сыворотки, и планшеты инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре. После этапов промывки планшеты инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре с 0,25 мкгм/мл биотинилированного Hu CD27-ECD в блокирующем буфере и зондировали с использованием HRP помеченного стрептавидина (Jackson Immunotech), разведенного в концентрации 1:40000 БСА/ФСБ в течение 30 мин при комнатной температуре. Планшеты промывали, как описано выше; затем добавляли раствор субстрата ОФД (Sigma fast tabs), инкубировали в течение 10 мин при комнатной температуре, проявление цвета субстрата останавливали добавлением 4N серной кислоты 25 мкл/лунку и измеряли поглощение при 490 нм.

Клеточный банк клеток несекретирующей мышиной миеломы для слияния был куплен в АТСС (# CRL-1646). Один замороженный флакон фолликулярных клеток оттаивали и перерастворяли в среде DMEM с (модифицированной) средой Glutamax™ (Invitrogen) с добавлением 10% (об/об) ФБС (Hyclone). В Charles River Laboratories клетки были выращены, криоконсервированы и были признаны стерильными и не содержащими микоплазмы. Клеточная линия С1833А (Centocor) также применялась при проведении данного слияния. Эта клеточная линия была получена на месте методом подавления экспрессии гена СНОР (БЯКХ) в фолликулярной клеточной линии, поэтому она требует роста в условиях селекции с использованием генетицина. Клетки обрабатывали так же, как описанные выше фолликуллярные, за исключением тех, которые выращивали в среде DMEM с использованием среды Glutamax™ (модифицированной) с добавлением 10% (об/об) ФБС (Hyclone) и 500 мкг/мл генетицина. Обе клеточные линии, как фолликулярная, так и С1833А, были подвергнуты синхронизации клеток до слияния. Вкратце, 1,5-2х10⁸ клеток высевали в 180 мл среды DMEM со средой Glutamax™ (модифицированной) с добавлением 0,25% (об./об.) ФБС (Hyclone) и инкубировали при температуре 37°C в течение 13 ч. Дополнительно 20 мл ФБС добавляли до конечной концентрации ФБС 10% и инкубировали до применения в течение дополнительных 13 ч при температуре 37°C. С1833А клетки постоянно находились под воздействием селекции генетицина в течение процесса синхронизации клеток. Клетки миеломы промывали в ФСБ, подсчитывали и определяли их жизнеспособность с помощью программного обеспечения Guava Viacount до слияния.

В день слияния животные были умерщвлены методом асфиксии CO2. Селезенки удаляли асептически и погружали в 10 мл холодного фосфатно-солевого буферного раствора (ФСБ), содержащего антибиотики (PSA) (Sigma).

Суспензию отдельных клеток спленоцитов приготавливали и подвергали РБК лизису с использованием РБК буфера для лизиса (Sigma). Промытые клетки были помечены для магнитной сортировки в соответствии с указаниями изготовителя с использованием антимышиных Thy1.2, антимышиных/человеческих CD11b и антимышиных IgM магнитных шариков (Miltenyi Biotec #130-049-101, 130149-601 и 130-047-301 соответственно), а затем сортировали с помощью инструмента AutoMacs Pro, запустив программу Deplete. Как непомеченные (блазмобласты, обогащенные B-клетками), так и помеченные фракции клеток собирали, затем подсчитывали с помощью Guava PCA. Положительно помеченные клетки выбрасывали. Непомеченные клетки были разделены пополам для слияния с обоими партнерами слияния, FO и С1833А. Слияния проводили при соотношении 1:1 мышиных миеломных клеток к жизнеспособным клеткам селезенки в соответствии с методом De St. Groth (J Immunological Methods. 35:1-21. 1980). Вкратце, клетки селезенки и миеломные клетки смешивали, осаждали и промывали один раз в 50 мл ФСБ. Осадок ресуспендировали в 1 мл раствора полиэтиленгликоля (ПЭГ) (2 г ПЭГ с молекулярной массой 4000, 2 мл DMEM и 0,4 мл DMSO) при температуре 37°C в течение 30 с. Клеточную/слитую смесь затем погружали в водяную баню при температуре 37°C в течение примерно 60 с и при мягком помешивании. Реакция слияния была остановлена путем медленного добавления DMEM при температуре 37°C в течение 1 мин. Слитые клетки оставляли в покое или на 5 мин при комнатной температуре, а

- 16 030828 затем центрифугировали при 150 мкг в течение 5 мин. Затем клетки перерастворяли в среде HAT [DMEM с Glutamax™ (модифицированной) с добавлением 20% ФСБ, 5% Ориген, 25 мкг/мл гентамицина (Sigma) и HAT (100 мкМ гипоксантина, 0,4 мкМ аминоптерина) и 16 мкМ тимидина (Sigma) и высевали в 96-луночные плоскодонные планшеты из полистирола для выращивания тканевых культур (Corning #3997) или метилцеллюлозную среду (StemCell Technologies, MediumD cat #03804), содержащую ~2,25 мкг/мл AF488 человеческого CD27 (Janssen Research & Development, LLC). Планшеты инкубировали в увлажненном инкубаторе при температуре 37°C с содержанием 7% СО₂ в течение 7-10 дней. Единичные колонии были отобраны из метилцеллюлозных планшет для скрининга с использованием ClonepixFL или под микроскопом при белом свете.

Пример 3. Биологическая активность рекомбинантных моноклональных антител.

Способность связывающих доменов из мышиных антител связываться с CD27 и блокировать определенные биоактивности CD27 была проанализирована с помощью различных анализов in vitro, как описано ниже.

Твердофазный ИФА использовали для скрининга гибридомных супернатантов на наличие антител, способных связываться с человеческим CD27. Планшеты (Nunc-Maxisorp #446612) покрывали и оставляли на ночь 4 мкг/мл Fab козьего антитела huFc (Jackson # 109-006-098) в бикарбонатном буфере O/N при температуре 4°C. Не промывая, лунки блокировали с использованием 200 мкл 0,4% (мас./об.) бычьего сывороточного альбумина (БСА) в ФСБ в течение 1 ч при комнатной температуре. После промывания с использованием 0,15М солевого раствора, содержащего 0,02% (мас./об.) Tween 20, на планшетки добавляли 50 мкл huCD27-Fc в 0,4% БСА/ФСБ в течение 1 ч при комнатной температуре. Снова после промывания 50 мкл неразбавленных супернатантов гибридомы инкубировали на покрытых планшетах в течение 30 мин при комнатной температуре. Планшеты промывали три раза, а затем инкубировали с использованием 50 мкл козьего антимышиного Fc HRP (Jackson #115-036-071), разбавленного в соотношении 1:10000, в течение 30 мин при комнатной температуре. Планшеты снова промывали и проявляли, как описано выше для оценки титров. Для оценки относительной связывающей способности моноклональных антител гибридомы проводили аналогичный анализ с использованием 384-луночных планшет MaxiSorp (NUNC 464718) с использованием серийно разведенных супернатантов гибридомы, нормализованных до начальной концентрации 5 мкг/мл. Этот анализ определил 386 положительных гибридом.

Все 386 CD27-специфичные гибридомы подвергали скринингу на способность ингибировать связывание huCD27 с huCD70 с использованием биохимических анализов связывания с IM-9 клетками, Влимфобластоидная клеточная линия показала эндогенную экспрессию человеческого CD70. Планшеты Maxisorp (VWR # 62409-314) покрывали рекомбинантным человеческим CD27/FC (R&D Systems, Cat# 382-CD) при 250 нг (нг/мл) и инкубировали в течение ночи при температуре 4°C. На следующий день планшеты блокировали блокирующим буферным раствором (Pierce, Cat # 37543), а затем промывали промывочным буферным раствором I, который содержит БСА без Ca++ и Mg++, 0,01% Tween-20. Контрольные смеси (мышиное моноклональное антитело к hCD27, R&D Systems, Cat# MAB382; изотипический контроль мышиного IgG1, R&D Systems, Cat# MAB002; изотипический контроль мышиного IgG2a, R&D Systems, Cat# MAB003) включали в каждый планшет. 50 мкл/лунку образца гибридомы или контрольных веществ смешивали с 50 мкл/лунку собранных IM-9 клеток, человеческой Влимфобластоидной клеточной линии (АТСС, CCL-159) и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре без встряхивания. В конце инкубации планшеты промывали промывочным буферным раствором II, чтобы удалить все несвязанные ячейки, а затем лизировали с использованием 50 мкл/лунку реагента Cell Titer Glo (Promega, Cat #G7571). Через 10 мин инкубации при встряхивании планшеты считывали на системе Envisionn (PerkinElmer, 2102 Multilabel reader). Полученный люминесцентный сигнал пропорционален количеству присутствующего ATP и непосредственно коррелирует с количеством живых клеток, присутствующих в захваченной лунке при связывании с CD27. На основе результатов биохимического анализа связывания около 50% CD27-специфических клонов были нейтрализующими.

Для устранения избытка нейтрализующих клонов проводили конкурентный анализ связывания для распределения антител по конкурентным группам. При проведении данного анализа супернатанты гибридомы оценивали по отдельности как реагенты захвата и обнаружения для каждой из положительных гибридом в панели. Антитела, образующие эффективные реагенты захвата/обнаружения друг с другом, скорее всего, идентифицируют пространственно разделенные эпитопы на белке CD27, таким образом, позволяя обоим антителам в то же время связываться с белком-мишенью. Группы клонов, обладающие аналогичными моделями активности по всей панели, вероятно, связываются с аналогичными эпитопами. Выбор клонов из различных групп, следовательно, предлагает антитела, идентифицирующие различные эпитопы. Вкратце, 384-луночные планшеты Nunc Maxisorp (464718) покрывали козьими антимышиными антителами Fc (JIR115-005-071) в покрывающем буфере в течение ночи при 4°C. Затем планшеты блокировали с использованием 0,4% БСА в ФСБ в течение 30 мин при комнатной температуре. На этом этапе и на всех последующих этапах планшеты промывали с использованием ФСБ, 0,02% Tween-20. Каждая лунка ряда (один ряд на супернатант) получила 20 мкл супернатанта (чистый супернатант использовали для начального скриннинга, а для повторного скриннинга подклоны нормализировали до 2 мкг/мл мАт) вместе с контрольными веществами (мышиный анти-huCD27, R&D Systems, Cat# MAB382;. мышиный

- 17 030828 изотопный контроль Cat#555439, Becton-Dickenson), затем инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре. После промывания 25 мкл немеченого Hu CD27-ECD-His-tag приготовили в ФСБ плюс 10% мышиной сыворотки (мышиная сыворотка Bioreclamation CD-1 партия № MSEBREC.18565) при 0,3 мкг/мл (или 0,8 мкг/мл для нормализированной концентрации) было добавлено во все лунки, затем их 30 мин инкубировали при комнатной температуре, затем промывали. Каждый супернатант добавляли вниз по колонке и инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре с использованием 25 мкл смеси, приготовленной следующим образом: (предварительно инкубированные супернатанты с козьим антимышиным антителом Fc HRP (Jackson 115-036-008), смесь 150 мкл козьего антимышиного антитела Fc HRP в соотношении 1:1000 с каждыми 1000 мкл супернатанта (для первичного скрининга) или 90 мкл в соотношении 1:2000 на 600 мкл супернатанта с доведением до 2 мкг/мл (для подклонов повторного скриннинга). Через 30 мин инкубации при комнатной температуре добавили 200 мкл 100%-ной нормальной мышиной сыворотки на мл и инкубировали еще 30 мин при комнатной температуре. Планшеты промывали, затем инкубировали в течение 15 мин при комнатной температуре с использованием 100 мкл/лунку цитрат-фосфатного раствора субстрата (0,1М лимонной кислоты и 0,2М фосфата натрия, 0,01% Н₂О₂ и 1 мг/мл ОФД). Проявление субстрата останавливали добавлением 25 мкл 4N серной кислоты, и измеряли поглощение при 490 нм с использованием автоматического спектрофотометра для прочтения планшет. Этот анализ связывания определил три группы, которые идентифицируют неперекрывающиеся позиции связывания на антигене huCD27. Отобранные антитела из всех трех групп были расширены для производства антител, очистки и дальнейшего тестирования в функциональных анализах.

Ингибирование клеточной сигнализации.

Связывание CD70 с CD27 вызывает сигнализацию, что приводит к нисходящей активации фактора транскрипции, NF-κβ. Был создан анализ репортера NF-κβ для дальнейшей характеристики антител. Анализ проводили в двух режимах: (1) для оценки антагонизма антител методом нейтрализации CD70, индуцированной активации CD27, и (2) для оценки агонизма антител методом активации сигнализации CD27 без лигирования CD70. HEK-293F клетки трансфицировали с общим количеством ДНК 36 нг, содержащей как человеческий CD27, так и конструкты люциферазы, под контролем промотора NF-κβ. Трансфектанты HEK-293F наносили на планшет 5x10 клеток на лунку в 40 мкл среды Freestyle (Gibco) на 96-луночные планшеты. Растворы CD27-нейтрализующих гибридомных моноклональных антител были добавлены на аналитический планшет в средах Freestyle (Gibco) для конечной концентрации 50 мкг/мл с разведением в соотношении 1:3, и планшеты инкубировали при температуре 37°C (95% O₂/5% CO₂) в течение 1 ч. Для анализа способности моноклональных антител гибридомы нейтрализовать сигнализацию CD70:CD27 окончательно облученные (4000 рад) эписомные клетки HEK-293B CD70 добавляли в концентрации 20% от числа трансфектантных клеток CD27 на аналитический планшет. Для тестирования активности агониста гибридомных моноклональных антител не проводилось добавление эписомальных клеток CD70. Аналитические планшеты инкубировали в течение ночи при температуре 37°C (95% O₂/5% CO₂) и проявляли с использованием системы для анализа люциферазы Steady-Glo® Luciferase Assay System (Promega) в соответствии с инструкциями производителя. Четыре CD27-нейтрализующих моноклональных антитела гибридомы, С2177, С2186, С2191 и С2192, которые в зависимости от дозы блокировали CD70-опосредованную сигнализацию CD27, не вызывая значительную дозозависимую агонистическую активацию рецептора CD27 в отсутствие стимулятора CD70, были выбраны для проведения дальнейшей характеристики. IC50S для блокирования связывания IM-9 клеток с опосредованной сигнализацией CD27 и CD70 в анализе гена-репортера NF-κβ для этих четырех антител приведены в табл. 1. Агонистическая активность в анализе гена-репортера NF-κβ показана как кратное увеличение сигнализации CD27 относительно постороннего контрольного изотипа антитела (мышиный IgG1 к крысиному белку ВМР) в отсутствие стимулятора CD70 при максимальной протестированной концентрации антител.

Афинность для CD27.

Антитела K_D С2177, С2186, С2191 и С2192 для мономерно растворимого CD27 при температуре 25°C были измерены с помощью Biacore и представлены в табл. 1. Анализы проводились на системе BIACORE 3000 (BIAcore, Inc.), инструменте поверхностного плазмонного резонанса (SPR). Образцы готовили в фосфатно-солевом буферном растворе Дульбекко с pH 7,4, содержащем 0,005% поверхностноактивного вещества (полисорбат 20). Козье анти-мышиное Fc-специфичное антитело (Jackson Immunoresearch laboratories Prod #115-005-071) было ковалентно присоединено на золотые поверхности, покрытые карбоксиметилдекстраном (СМ-5 Chip, Biacore). Сенсор перед иммобилизацией предварительно обрабатывали растворами 50 мМ NaOH, 100 мМ HCl и 0,1% додецилсульфата натрия с инъекцией деионизированной воды между этапами предварительной обработки. Антитела разбавили в 10 мМ буферного раствора ацетата натрия pH 4,5 и связали с карбоксиметилированной поверхностью декстрана сенсора согласно инструкции производителя в отношении химических процессов сопряжения аминов. Оставшиеся реакционноспособные группы на поверхности дезактивировали при помощи этаноламина-HCl. Моноклональные антитела были захвачены на поверхности датчика через домен Fc. Ассоциации ECD человеческого CD27, вводимые в возрастающих концентрациях (0,6-150 нм, 4-кратные серийные разведения),

- 18 030828 наблюдали в течение трех минут, а диссоциации - в течение 10 мин. Регенерация захвата поверхностей до исходной была оптимизирована с помощью двух трехсекундных воздействий 100 мм фосфорной кислоты. Данные обрабатывали с помощью программного обеспечения Scrubber, версия 1.1 г (BioLogic Software). Двойную субстракцию данных проводили для коррекции влияния буфера на шум от сигнала и инструмента. Кинетический анализ обработанных данных проводили с использованием программного обеспечения Biaevaluation 4.0.1 (GE Healthcare Bio-Sciences, Uppsala, Sweden). Профили связывания описывали при помощи модели связывания 1:1 с указанием моновалентного связывания CD27.

Таблица 1

мкАТ	Изотип	Biacore KD hM	IM-9 связывание г ICso мкг/мл	репортерный ген NF-κβ
ICso2 мкг/мл	Агонизм3 при 50 мкг/мл
С2177	mlgGl	3, 07	0, 063	0, 040	1,850
С2186	mlgGl	2,55	0, 059	0, 105	2,547
С2191	mlgGl	2, 62	0, 059	0, 080	3, 053
С2192	m!gG2a	0,21	0, 054	0,232	5, 394

¹ - IC₅₀ для ингибирования моноклональными антителами связывания IM-9 клеток с иммобилизованным CD27;

² - IC₅₀ для ингибирования моноклональными антителами в анализе гена-репортера;

- агонистическая активность моноклональных антител при 50 мкг/мл в отсутствие CD70, измеренная как кратное увеличение в сигнале гена-репортера по отношению к антителам изотипического контроля.

Ингибирование клеточной пролиферации.

Пролиферация T-клеток, субоптимально активированная в культуре с антителам анти-CDS плюс анти-CD28, усиливается CD70-лигированием CD27, экспрессируемого на T-клетках. Четыре мышиные нейтрализующие антитела оценивали по их способности ингибировать пролиферацию T-клеток в присутствии CD70 и индуцировать пролиферацию в отсутствие CD70. Замороженные CD4+ T-клетки были приобретены у AllCells, LLC. Клетки оттаивали и помещали в IMDM среду, содержащую 10% ФБС, 1% 1-глутамина и 1% пенициллина со стрептомицином. Перед посевом клеток антитело анти-CD3 (ОКТ3) наносили на U-образное дно планшеты в концентрации 1 мкг/мл в ФСБ в течение ночи при температуре 4°C. Клетки подсчитывали, доводили до концентрации 1х10⁶ клеток/мл и высевали при концентрации 1х10⁵ клеток/лунку. Растворимый анти-CD28 добавляли в качестве вторичного сигнала активации при концентрации 1 мкг/мл на лунку. Облученные (6000 рад) HEK-клетки, трансфицированные человеческим CD70 или только вектором (макетом), добавляли в соответствующие лунки по 2х10⁴ клетки/лунку (20%). Клетки стимулировали в течение 3 дней, 0,9 мкКи тимидина [метил-3Н] добавляли в лунки всех образцов, и клетки инкубировали в течение 18-24 ч. На четвертый день стимуляции клетки собирали на фильтровальный планшет с помощью сборщика клеток PE Filtermate Harvester. Планшету дали высохнуть и добавили 30 мкл MicroScint™-20 во все лунки образцов. Данные считывали с планшета с помощью PE TopCount NXT, и собранные данные были представлены в виде СРМ. Антитело С2177 показывает дозозависимое ингибирование CD70-опосредованной пролиферации T-клеток и очень слабую внутреннюю агонистическую активностью в отсутствие CD70 (фиг. 1). Аналогичные результаты были получены для антител С2186, С2191 и С2192. IC₅₀ и максимальный % ингибирования этих антител представлены в табл. 2. Ни одно из антител не показало последовательной стимуляции пролиферации в отсутствие лигирования CD70, что указывает на отсутствие внутренней агонистической активности.

Кроме того, антитела С2177, С2186, С2191 и С2192 показали дозозависимое ингибирование CD70опосредованной пролиферации Т-клеток согласно результатам измерений при проведении анализа с использованием CSFE (сукцинимидильного эфира карбоксифлуоресцеина) при отсутствии эффекта на пролиферацию в отсутствие стимулятора CD70. Замороженные CD3+ T-клетки были приобретены у AllCells, LLC. Клетки оттаивали и поместили в IMDM среду, содержащую 10% ФБС, 1% L-глутамина и 1% пенициллина со стрептомицином. Клетки предварительно пометили 2,5 мМ CFSE (Invitrogen), погасили добавлением ФБС и промыли T-клеточной средой. CFSE является красителем, который пассивно диффундирует в клетки и становится высокофлуоресцентным при связывании с внутриклеточными аминами. При деление клеток каждая дочерняя клетка будет содержать половину CFSE-метки материнской клетки, таким образом, пролиферацию клеток можно контролировать, отслеживания количество клеток с различной интенсивностью CFSE. Клетки доводили до концентрации 1х10⁶ клеток/мл и высевали 1х10⁵ клеток/лунку. Перед посевом клеток антитело анти-CD3 (ОКТ3) наносили на U-образное дно планшета при концентрации 0,5 мкг/мл в ФСБ в течение ночи при 4°C. Растворимый анти-CD28 добавляли в качестве вторичного сигнала активации при концентрации 1 мкг/мл на лунку. Облученные (6000 рад) HEKклетки, трансфицированные человеческим CD70 или только вектором (макетом), добавляли в соответствующие лунки по 2х10⁴ клетки/лунку (20%). Клетки стимулировали в течение 4 дней и анализировали с помощью анализа FACS для расчета разделенных клеток, содержащих различные уровни интенсивно

- 19 030828 стей CFSE-метки.

Ингибирование дифференциации бластных клеток плазмы.

CD27-нейтрализующие моноклональные антитела гибридомы были также протестированы методом анализа дифференциации бластных клеток плазмы с использованием первичных B-клеток человека. CD19+ В-лимфоциты человека, которые были негативно отобраны из периферической крови здоровых доноров (приобретенной у AllCells), культивировали в течение 6 дней при наличии либо 1 мкг/мл антитела анти-CD40 (клон МАВ89, Abcam) и 100 нг/мл интерлейкина 21 (Invitrogen), или 1 мкг/мл растворимого человеческого рекомбинантного CD40-лиганда, 2 мкг/мл усилителя для лиганда (оба Alexis Biochemicals) и 100 нг/мл интерлейкина 21 в 96-луночных планшетах при концентрации 10⁵ B-клеток на лунку. CD27-нейтрализующие антитела гибридомы или антитела для изотипического контроля добавляли при наличии или отсутствии 2х10⁴ облученных (6000 рад) CD70-экспрессирующих клеток HEK293 или МОСК-трансформированных клеток HEK293. CD27-нейтрализующие моноклональные антитела гибридомы и соответствующие изотипические контроли использовали при концентрации 25, 2,5 и 0,25 мкг/мл. На 6-й день образцы клеток анализировали методом потоковой цитометрии и иденцифицировали фракции бластных клеток плазмы как прямое светорассеяние/высокое, IgD минус, CD38 яркое, CD20 низкое. Эффект CD27-нейтрализующих моноклональных антител рассчитывали как частоту проявления бластных клеток плазмы в B-клеточных культурах, содержащих CD70-экспрессирующие клетки и моноклональные антитела гибридомы, нормированные к частоте бластных клеток плазмы в соответствующих B-клеточных культурах, содержащих ложнотрансфицированные клетки. Процент ингибирования моноклональными антителами С2177, С2186, С2191 или С2192 при концентрации 2,5 мкг/мл показан в табл.

2. Агонистическая активность при отсутствии стимулятора CD70 не наблюдалась ни для одного из этих моноклональных антител.

Таблица 2

МАЬ	Пролк IC50 мкг/мл	1ферация Т-клеток - CD4+ клеток Процент ингибирования при наивысшей концентрации (30 мкг/мл) (Среднее ± стандартная ошибка среднего)	Дифференция бластных клеток плазмы Процент ингибирования при концентрации 2,5 мкг/мл (Среднее ± стандартная ошибка среднего)
С2177	0,245	75,4+4,1 (п=6, 2 донора)	78+20 (п=4)
С2186	0, 775	65,3+4,4 (п=6, 2 донора)	93+27 (п=4)
С2191	0,3	58,3+6,0 (п=6, 2 донора)	105+9 (п=4)
С2192	0, 445	75,7+5,7 (п=6, 2 донора)	74+0 (п=2)

Пример 4. Картирование эпитопов и группировка.

Для более тщательной оценки первоначального связывания были проведены анализы конкуренции с использованием некоторых очищенных нейтрализующих моноклональных антител и с использованием CD27-нейтрализующего антитела, МАВ382 (R&D Systems). Вкратце, 5 мкл (10 мкг/мл) химерного белка CD27-FC (R&D Sysytems, Cat# 382-CD) наносили на планшет MSD HighBind (Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD) в течение 2 ч при комнатной температуре. В каждую лунку добавляли 5% блокирующего буфера A MSD (Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD) и инкубировали в течение 2 ч при комнатной температуре. Планшеты промывали три раза с использованием 0,1М буферного раствора HEPES, pH 7,4 с последующим добавлением смеси 10 нМ помеченного антитела CD27 с различными концентрациями конкурирующего антитела (1 нМ - 2 мкМ). Антитела были помечены с использованием NHS-эфира MSD Sulfo-Tagr™, аминореактивного N-гидроксисукцинимидного эфира, который соединяется с первичными аминогруппами белков для образования стабильной амидной связи. После 2-часовой инкубации при осторожном встряхивании при комнатной температуре планшеты промывали 3 раза с использованием 0,1М буферного раствора HEPES (pH 7,4). Буферный раствор MSD Read Buffer T четырехкратно разводили дистиллированной водой и вносили в лунки в объеме 150 мкл/лунку. Планшеты анализировали с использованием анализатора SECTOR Imager 6000, который определяет электрохемилюминесценцию при помощи меток Sulfo-Tag, которые излучают свет при электрохимической стимуляции, инициированной на электродных поверхностях микропланшеток MSD.

Исследования конкуренции определили три конкурирующие группы для антител, приведенные в табл. 3, подтверждая результаты начальных анализов связывания. С2179, С2192 и МАВ382 составляют первую группу; С2177, С2182, С2186 и С2193 - вторая группа; и С2191 составляет отдельную группу.

- 20 030828

Таблица 3

Конкурирующее	Помеченное антитело
	С2179	С2177	С2182	С2186	С2191
С2177	-	+	+	+	-
С2179	+	-	-	-	-
С2182	-	+ /-	+	+	-
С2186	-	+	+	+	-
С2191	-	-	-	-	+
С2192	+	-	+	+	-
С2193	-	+ /-	+	+	-
ΜΆΒ382	+	-	-	-	-

Пример 5. Идентификация эпитопов и паратопов методом рентгеновской кристаллографии.

Подробные эпитопы и паратопы антител С2177 и С2191 были определены путем совместной кристаллизации их соответствующих Fabs с ECD фрагментом CD27 (остатки 1-101) как определение тримерного комплекса и структуры методом рентгеновской кристаллографии. His-меченые химерные варианты (мышиный вариабельный домен, человеческий константный домен) С2177 Fab и С2191 Fab экспрессировали в клетках HEK293 и очищали с использованием афинной и вытеснительной хроматографии. His-меченый фрагмент ECD (остатки 1-101) человеческого CD27 затем очищали с использованием анионообменной хроматографии. Тройной комплекс CD27:C2177 Fab:C2191 Fab получали путем смешения CD27 с избытком Fab в молярном соотношении 1:1,25:1,25. Комплекс инкубировали в течение 2 ч при температуре 4°C, отделяли от незакомплексованных видов с использованием вытеснительной хроматографии и доводили до концентрации до 12 мг/мл в 20 мМ трис pH 8,5, 250 мМ NaCl. Кристаллизацию комплекса проводили с помощью метода диффузии пара в положении сидячих капель при температуре 20°C. Кристаллы комплекса были получены из 24% ПЭГ 3350, 0,2М раствора хлорида аммония, 0,1М трис-буфера, pH 8,5. Для рентгеновского сбора данных один кристалл смачивали в течение нескольких секунд в криозащитном растворе, содержащем раствор для кристаллизации с добавлением 20% глицерина и мгновенно замораживали в потоке азота при 100 К. Дифракционные данные собирали с использованием рентгеновского генератора Rigaku MicroMaxTM-007HF, оснащенного детектором Saturn 944 CCD и криоохлаждающей системой X-Stream 2000 (Rigaku), с вращением кристалла более 240° с экспозициями в течение 2 мин на 0,25° -изображение и обрабатывали с помощью программы XDS (Kabsch W., 2010. Acta Crystallogr. D66:125-132). Кристаллы принадлежат к моноклинной пространственной группе Р21 со следующими параметрами элементарной ячейки: a=141,1 A, b=53,0 A, c=143,4 А, α=90°, β=112,2°, γ=90°.

Кристаллическая структура тройного комплекса была определена при разрешении 3,5 А и очищена до кристаллографического R-фактора 26%. Fabs C2177 и С2191 связываются с CD27 на пространственно отличающихся неперекрывающихся эпитопах (фиг. 2). Fab C2177 связывается с N-концевым участком (расположенным дистально от поверхности клетки) CD27. Эпитоп покрывает 700 А2 и включает 9 остатков: K5, S6, P8, H11, W13, G16, K17, H36, R37 (фиг. 3). Паратоп определяется как остатки антител, контактирующие (в пределах 4 А) с антигеном. Паратоп С2177 включает 5 остатков из VL (Y31, Y36, Y53, N57, N96) и 9 остатков из VH (S31, W33, Y52, D55, D57, Y101, Y102, D104, Y105) (фиг. 3). Все 6 CDR вовлечены в процесс распознавания антигена. H36 и R37 являются центральными остатками эпитопа. Они накладываются на Y31 из VL и Y102 из VH; H36 также образует солевой мостик к D104 из VH.

С2191 Fab связывается с CD27 на боковой поверхности (фиг. 2) и покрывает 800 А2 поверхности. Эпитоп включает в себя 10 остатков: F28, D43, P44, I46, P47, G48, V49, H60, S63, H66. Паратоп С2191 включает 7 остатков из VL (Y34, F36, Y53, L54, R96, L98, W100) и 8 остатков из VH (S31, Y32, Y50, N57, Y59, R100, G101, N102) (фиг. 4). Взаимодействия антиген-антитело доминируют при гидрофобных взаимодействиях между остатками 44-49 CD27 и гидрофобным пэтчем CDR из VL.

Разное расположение эпитопов С2177 и С2191 предполагает различный механизм действия данных антител. С2191, вероятно, непосредственно конкурирует с ECD CD70 за перекрыване эпитопов на боковой поверхности CD27. Антитело С2177, наоборот, не вступает в борьбу за тот же эпитоп, а предотвращает подход клеток, несущих CD27 и CD70. Это наблюдение подтверждается тем фактом, что С2191 предотвращает связывание растворимого ECD CD70 с CD27, тогда как С2177 не предотвращает его.

Пример 6. Модулированние иммунного ответа от лимфоцита человека при помощи антитела.

Иммунодефицитная мышиная модель мыши NOD/SCID-IL2Rγ^null (NSG) была разработана с целью изучения аспектов контроля человеческой иммунной системы ответами T-клеток (Markus G Manz & James P Di Santo Renaissance for mouse models of human hematopoiesis and immunobiology Nature Immunology 10, 1039-1042 (2009)). Адоптивный перенос человеческого МНПК мышам с ослабленным иммунитетом (NSG) использовали для оценки влияния анти-CD27-антитела на приживление и/или пролиферацию клеток человека. Модель позволяет оценить эффект от нацеливания человеческого CD27 на выработку антител и опосредованные Т-клетками ответы.

Антитела С2177 и С2191 вводили в момент переноса клеток, а затем дважды в неделю в течение 3 недель. На 21-й день мышей умерщвляли, клетки крови и селезенки очищали и впоследствии характери

- 21 030828 зовали с помощью проточной цитометрии. CTLA4-Ig (Orencia, BMS) был включен в виде положительного контроля иммуносупрессии. Приживление/распределение человеческих клеток измеряли методом оценки наличия CD45+ клеток в образцах крови и селезенки.

Проводили тщательный мониторинг мышей, а время умерщвления определяли на основании симптомов XGVH в соответствии с руководящими принципами благополучия животных. Экспериментальные показатели использовали для оценки эффектов лечения с применением анти-CD27, которые включали массу тела (еженедельно дважды), наблюдаемые признаки по системе XGVH (еженедельно дважды), такие как положение тела, уровень активности, уход за поверхностью тела, кожные поражения (в частности, вокруг глаз и ушей) с использованием 1-5 балльной системы, абсолютное количество подмножеств человеческих клеток и статус активации с помощью анализа методом проточной цитометрии (1) введенных человеческих МКПК, (2) мышиной ПК (один раз в неделю) и (3) селезенки, а также костного мозга; определение общего человеческого Ig, IgM и IgG в сыворотке, селезенке и КМ с помощью анализа ИФА, а после умерщвления - проведение гистологического и иммуногистохимического анализа для определения уровня инфильтрации человеческих клеток в органах-мишенях, таких как печень, почки, легкие и селезенка. Группы лечения были следующими:

1. МКПК (20-40 миллионов клеток на мышь, и/п).

2. МКПК+CTLA4-Ig (10 мг/кг).

3. МКПК+антитело для изотопического контроля, дважды в неделю в течение 3 недель.

4. МКПК+анти-CD27 антитело, дважды в неделю в течение 3 недель.

Мыши, которым вводили моноклональные антитела анти-CD27 дозой 10 мг/кг, С2177 и С2191, (антитела гибридомы, химеризованные на человеческом IgG₄ (ala/ala, ser^pro) клеточном каркасе), имели меньшее статистически значимое количество человеческих CD45+ клеток в сравнении отдельно с МКПК или изотопическим контролем в МКПК, изолированного из образцов крови или селезенки.

Пример 7. Адаптация человеческого каркасного участка моноклональных антител С2177 и С2191.

Антигенсвязывающий участок, а также участки, используемые для передачи антигенной специфичности от антител С2177 и С2191 человеческим каркасным участкам, были повторно классифицированы, как указано в патенте, опубликованном Raghunathan G. US20090118127 A1, 2009. Вкратце, антигенсвязывающие участки определяли с использованием различных терминов (обзор в Almagro and Fransson, Front Biosci 13: 1619-1633, 2008). Термин Участки, определяющие комплементарность (CDRs) основывается на вариабельности последовательности (Wu and Kabat, J. Exp. Мед. 132:211-250, 1970). Существует 6 CDR; три для VH (H-CDR1, H-CDR2, H-CDR3) и 3 для VL (L-CDR1, L-CDR2, L-CDR3) (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5^th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991). Термин Гипервариабельные участки, HVR's, или HVL's относится к участкам вариабельного домена антитела, которые являются вариабельными в своей структуре, как определено в публикации Chothia и Lesk (Chothia and Lesk, Mol. Biol. 196:901-917, 1987). Существует шесть HVR, три для VH (H1, H2 и H3) и три для VL (L1, L2 и L3).

В методе адаптации человеческого каркасного участка участки, нацеленные на перенос специфичности нечеловеческих антител на человеческие каркасные участки (HFR) - это CDR, как определено в публикации Kabat (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5^th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991), за исключением участка, соответствующего CDR-1 из VH. Для этого участка переносят комбинацию CDR и HVL (расширенную CDR-1 из VH) из нечеловеческого антитела на человеческий каркасный участок (как указано в табл. 30, 31, 34, 35). Кроме того, были получены и протестированы варианты с более короткими перенесенными CDR-H2 (именуемые Kabat-7 [Raghunathan G. US20090118127 A1, 2009]).

Выбор человеческого FR.

Человеческие FR, определяемые как участки в вариабельных участках, не содержащиеся в антигенсвязывающем сайте, выбирали из репертуара функциональных человеческих генов зародышевой линии IGHV, IGKV, IGKJ и IGHJ. Репертуар последовательностей генов человеческой зародышевой линии был получен посредством поиска в базе данных IMGT (Kaas, et al., Nucl. Acids. Ост. 32, D208-D210, 2004; Lefranc M.-P et al., Nucl. Acids Res., 33, D593-D597, 2005) и составления всех аллелей 01 по состоянию на 01 октября 2007 года. Из этой компиляции удалили избыточные гены (на 100% идентичные на аминокислотном уровне), а также гены с непарными цистеиновыми остатками.

Первичный выбор человеческих последовательностей для HFR участка был основан на сходстве последовательности человеческих генов зародышевой IGHV линии с полноразмерным мышиным участком VH, включающим FR с 1 по 3, а также H-CDR-1 и H-CDR-2. На следующем этапе выбранные человеческие последовательности были упорядочены по рангам с использованием оценочной шкалы, которая учитывает как длину CDR, так и сходства CDR мышиных и человеческих последовательностей. Стандартную матрицу мутации, например матрицу замещения BLOSUM 62 (Henikoff and Henikoff, Proc Natl Acad Sci USA. 89, 10915-9, 1992), использовали для выравнивания по балльной шкале CDR мышиных и человеческих последовательностей, а также применяли большие штрафы при выявлении вставки и/или делеции в петлях CDR. FR-4 был выбран на основании сходства последовательностей генной зародышевой линии IGHJ (Kaas, et al., Nucl. Acids. Ост. 32, D208-D210, 2004; Lefranc M.-P. et al., Nucl. Acids Res.,

- 22 030828

33, D593-D597, 2005) с последовательностями мышиных антител С2177 и С2191. Аналогичную процедуру использовали для выбора человеческих FR для VL. Гены зародышевой линии IGVK использовали для выбора FR 1-3 и L-CDR 1-3. Гены зародышевой линии IGJK использовали для выбора FR-4.

В дополнение к критериям последовательностей для фрагментов Fv была создана гомологичная 3Dмодель с использованием программы моделирования (Sali and Blundell. J. Mol. Biol. 234: 779,1993) из программного пакета компании Accelrys, Inc. Модели использовали для анализа вариантов HFR, включая характеристику CDR и оценку проявляющих способностей. Дополнительные аспекты выбора вариантов HFR заключались к сведению к минимуму количества остатков метионина и триптофана, устранению потенциальных сайтов N-гликозилирования и поддержанию человеческой зародышевой линии с самым высоким профилем экспрессии in silico (de Wildt, J. Mol. Biol. 185: 895, 1999).

Для первого пути адаптации каркасного участка и оптимизации С2177 в библиотеку были включены шесть VH и четыре VL вариантов HFR. VH и VL варианты HFR были объединены по парам комбинаторным способом для получения 24 вариантов HFR плюс 10 контрольных пар всех вариантов HFR с прототипом V участка С2177 плюс материнской С2177 для получения в общей сложности 35 комбинаций. Аналогично для С2191 пять VH и четыре VL вариантов HFR были объединены по парам комбинаторным способом для получения 20 вариантов HFR плюс 9 контрольных пар всех вариантов HFR с прототипом V участка С2191 плюс материнской С2191 для получения в общей сложности 30 комбинаций. ДНК, кодирующая выбранные вариабельные домены, была перекомпонована с использованием стандартных методов для сборки всех моноклональных антител с человеческим IgG1 и константным участком kappa. Полученное контрольное химерное антитело С2177, отмеченное M40, состоит из вариабельных участков H7 и L18. Полученное контрольное химерное антитело С2191, отмеченное М41, состоит из вариабельных участков H10 и L20. Моноклональные антитела временно экспрессировали в 48-луночных планшетах в клетках HEK293B. Надосадочную жидкость из культур протестировали на экспрессию и активность связывания через 96 ч после трансфекции. Уровень экспрессии оценивали с использованием технологии Octet для измерения скорости связывания антител с биосенсорами белка А. Уровень экспрессии измеряли путем сравнения с эталонными образцами с известной концентрацией антител. Была собрана стандартная кривая из 8 точек, состоящая из серийного разведения антитела идентичного изотипа в соотношении 1:2, начиная с 100 мкг/мл. Биосенсоры гидратировали в течение 10 мин в выработанной среде, а скорость связывания стандартов и неизвестных образцов измеряли в течение 2 мин. Данные были проанализированы с использованием уравнения из 5 параметров взвешенного дозозавсимого эффекта и алгоритма скорости связывания начального наклона. Образцы с экспрессией 1 мкг/мл были разбавлены до 1 мкг/мл с использованием выработанной среды, а также был проведен скриннинг с использованием одной точки ИФА. Для данного анализа ИФА на 96-луночные черные планшеты maxisorp наносили 100 мкл козьих антител к человеческому IgG FC с концентрацией 4 мкг/мл, разведенных в карбонатнобикарбонатном буфере, pH 9.4, при температуре 4°C в течение ночи, затем промывали трижды промывным буферным раствором (0,05% раствор Tween-20 в ФСБ) и блокировали 300 мкл раствора StartingBlock (Thermo Scientific) в течение 1 ч с последующей промывкой, описанной выше. Образцы или стандарты разводили до концентрации 100 нг/мл в отработанной среде и 100 мкл добавили на планшет для анализа при комнатной температуре в течение 1 ч со встряхиванием. Планшеты промывали трижды и добавляли 50 мкл на лунку человеческого ECD CD27 с His-меткой при разведении 60 нг/мл в анализируемый буферный раствор (ФСБ с 1% и 0,05% Tween-20) и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. После промывки добавляли по 50 мкл в лунку конъюгированного с пероксидазой пентагистидина Qiagen с разведением 1:2000 в буферном растворе для анализа и инкубировали 1 ч при комнатной температуре со встряхиванием. Субстрат ВМ ChemiLum (ВМ Chemilum, POD, Roche) смешивали в соответствии с инструкциями производителя и после окончательной промывки на планшеты добавляли в объеме 50 мкл. Через 10 мин планшеты считывали на устройстве для прочтения планшетов Perkin Elmer Envision Reader.

Результаты скриннинга комбинаторной библиотеки С2177 показали, что все V-участки связываются с CD27 с разной силой. Несколько вариантов HFR показали более высокий сигнал связывания, чем материнская С2177, в то время как остальные показали связывание, которое было сравнимо или ниже материнского. Все VL связывались с антигеном на обнаруживаемых уровнях и не влияли на связывание вариантов HFR, выраженное на приемлемых уровнях, но ниже материнского. 24 антитела С2177 HFR (комбинации VH, VL) показали связывание с CD27 и экспрессию на уровне 1 мкг/мл.

Результаты скриннинга комбинаторной библиотеки С2191 показали, что все, кроме одного, VH связывались с CD27 с разными сигналами. Все VL показали связывание с CD27, за исключением объединенных в пары с VH. Несколько вариантов HFR показали более высокий сигнал связывания, чем материнская С2177, в то время как остальные показали связывание, которое было сравнимо или ниже материнского. 17 антител С2191 HFR (комбинации VH, VL) продемонстрировали связывание с CD27 и экспрессию >1 мкг/мл.

На основании относительной афинности связывания для CD27, измеренного методом ИФА, 15 С2177 и 11 С2191 вариантов были отобраны для проведения экспериментальной экспрессии и очистки. Экспериментальная экспрессия проводилась во временном режиме в клетках CHO-S при объеме 750 мл.

- 23 030828

Собранные супернатанты очищали хроматографией с белком А, и очищенные белки оценивали на аффинность и функциональную активность.

Афинности вариантов человеческих моноклональных антител HFR C2177 измеряли методом поверхностного плазмонного резонанса (SPR) с использованием матричной системы взаимодействия белков ProteOn XPR36 (BioRad). Скорости ассоциации и диссоциации CD27 измеряли для каждого варианта. Поверхность биосенсора получали путем ковалентного присоединения козьего античеловеческого антитела IgG (Fc) к поверхности чипа GLC (BioRad) с использованием инструкции производителя для аминосвязывающего химического анализа. Приблизительно 5000 ЕО (единиц ответа) антитела были иммобилизованы. Кинетические эксперименты проводились при температуре 25°C в рабочем буферном растворе (ФСБ, 0,01% Р20, 0,01% БСА). Серийные разведения 1:3 человеческого ECD CD27 готовили начиная с 300 нМ. Приблизительно 350 ЕО моноклонального антитела были получены на каждом канале сенсорного чипа. Изотипически сходный контроль антитела иммобилизировали и применяли в качестве эталонной поверхности. После захвата моноклонального антитела проводили трехминутную инъекцию (фаза ассоциации) раствора в концентрации антигена 30 мкл/мин, затем - 10-минутную инъекцию проточного буферного раствора (фаза диссоциации). Поверхность датчика регенеровали путем инъекции 0,85% фосфорной кислоты со скоростью 100 мкл/мин. Данные обрабатывали на программном обеспечении прибора. Проводили двойное эталонное вычитание данных, вычитая графики, полученные при инъекции буфера, из эталонных графиков, полученных при инъекциях анализируемых веществ. Затем проводили кинетический анализ данных с помощью модели связывания 1:1 Langmuir с точным соответствием. Результат для каждого моноклонального антитела сообщали в формате Ka (скорость ассоциации), Kd (скорость диссоциации), KD (равновесная константа диссоциации) и процент активности. Афинности вариантов С2177 HFR были аналогичными с материнским моноклональным антителом M40, показывая менее чем трехкратное изменение KD для всех вариантов. Аналогично, афинности вариантов человеческих моноклональных антител HFR C2191 показали менее чем двукратную разницу с материнским моноклональным антителом M41.

Биологическую активность вариантов HFR измеряли методом их ингибирования CD70опосредованной индукции NFk[^j> при проведении анализа репортерного гена люциферазы. HEK-клетки трансфицировали с использованием индуцируемого NFk[^j> вектора экспрессии люциферазы pGL4-32NFk[^j>-Li.ic2 (Promega) и плазмиды экспрессии CD27 или пустого вектора и инкубировали в течение ночи в среде экспрессии Freestyle (Gibco, #12338). На следующий день клетки помещали в 96-луночные культуральные планшеты по 40 мкл и 50000 клеток на лунку. Затем 40 мкл антител или контрольных растворов добавляли к клеткам с помощью серийного разведения 1:3, начиная с 30 мкг/мл конечной концентрации в лунке и инкубировали в течение от 1 до 2 ч. В течение данной инкубации эписомные клетки CD70 готовили для стимуляции. Вкратце, адгезивные клетки перерастворяли с использованием стандартных методов культивирования клеток и инкубировали в течение 1 ч с использованием митомицина С с концентрацией 25 мкг/мл, чтобы остановить рост клеток. После инкубации CD70+ клетки отмывали в среде, разбавляли и 40 мкл добавляли при концентрации 10000 клеток на лунку. Планшеты инкубировали в течение ночи. На следующий день реагент Steady Glo (Promega) был подготовлен в соответствии с инструкциями изготовителя и добавлен по 120 мкл в каждую лунку. Планшеты инкубировали при комнатной температуре в течение 20 мин при встряхивании. Люминесценцию измеряли с помощью считывающего устройства Perkin Elmer Envision Reader. IC₅₀ из вариантов С2177 HFR были аналогичны друг другу и материнскому моноклональному антителу М40 в диапазоне от 0,11 до 0,21 нМ. IC₅₀ из вариантов C2191HFR были аналогичны друг другу и материнскому моноклональному антителу М41 в диапазоне от 0,13 до 1,3 нМ.

Рассмотрение афинности, биологической активности и биофизических свойств привело к выбору варианта М69 С2177, состоящего из вариабельных участков H28 (SEQ ID NO: 111) и L35 (SEQ ID NO: 82), варианта М91 C2191, состоящего из вариабельных участков Н31 (SEQ ID NO: 131) и L42 (SEQ ID NO: 140), для созревания афинности. Обзор KD, выброс очистки, связывания с CD27 ECD для супернатантов клеточной культуры (ИФА), а также ингибирование (IC₅₀) из CD27-опосредованного ответа NFk[^j> CD70 для материнского М40 и его варианта М69 HFR, а также для материнского М41 и его варианта М91, приведены в табл. 4.

- 24 030828

Таблица 4

ИН белка	VH	VL	Протеон KD (нМ)	Вход (мг)	Сигнал ИФА	NFKp IC50 (нМ)
С2177 материнской М4 0	Н7	L18	0, 96	не определяется	1,00	0,14
Мб 9	Н2 8	L35	0,77	10, 08	1,09	0,11
С2191 материнский М41	НЮ	L20	10,3	не определяется	1,00	0,30
М91	Н31	L42	7,9	5, 64	1,09	0,28

Пример 8. Оптимизация моноклонального антитела М69 из С2177 HFR.

М69 имеет аффинность около 1 нМ к человеческому ECD CD27 и содержит одинаковое количество CDR, как и С2177 и HFA материнского CD27 M40. Оптимизация М69 включала множество библиотек для увеличения аффинности и удаления сайтов РТМ, введенных или идентифицированных в процессе.

Как описано в примере 9, параллельный подход к библиотеке фагового дисплея для HFR и оптимизация С2177 идентифицировали различие в пролине в позиции 52а CDR-H2. Эта позиция не была рандомизирована в проекте библиотеки. Совместная структура Fab С2177 и С2191 с CD27 (пример 5) указывает на то, что P52a не вовлечен прямым образом в процесс связывания с антигеном. Тем не менее, мутация на этой позиции может изменить конформацию петли CDR-H2 и способствовать более оптимальным взаимодействиям окружающих остатков D27 с CD27. Поэтому библиотека была создана, чтобы произвольно разнообразить P52a и его окружающие остатки Y52, G53 и D54 с использованием мутагенеза NNK (библиотека С27H28L2). Также во втором пути оптимизации мутация Y32 на F в CDR-L1 показала улучшенное связывание. Поэтому вторая библиотека была создана с произвольным разнообразием Y32 вместе с разнообразием в остатках Y30a, D30d, A50, которые располагаются в той же структурной плоскости, как и Y32 (библиотека C27L35L2).

Кроме того, была проведена оценка петель CDR-H3 и CDR-L1 с использованием библиотек ограниченного разнообразия. Табл. 5 и 6 показывают структуру данных библиотек.

Таблица 5

Проект созревания аффинности с ограниченным разнообразием для CDR-H3 (C27H28L3)

Материнская аминокислота VH и позиция	Различие
Ser95	A, S
Asp96	A, D
Tyr97	A, D,S,Y
Туг98	A, D,S,Y
Gly99	A, G
AsplOO	A, D
TyrlOOa	A, D,S,Y
GlylOOb	A, G
PhelOOc	A, F,S,V
AlalOl	A, G
Tyrl02	A, D,S,Y

Таблица 6

Проект созревания аффинности с ограниченным разнообразием для CDR-L1 (C27L35L3)

Материнская аминокислота VH и позиция	Различие
Lys24	Α,Κ,Ε, Τ
Ala25	A, G
Ser26	A, S
Gln27	A,Q,E,P
Ser28	A, S
Val29	A,V
Asp30	A, D
ТугЗОа	A, D, S
Ala30b	A, G
Gly30c	A, G
Asp30d	A, D
Ser31	A, S
Tyr32	A, D, S
Met33	Α,Μ,Τ,V
Asn34	A,N, D, T

- 25 030828

Библиотеки Fab были созданы в системе pIX фагового дисплея Fab, как описано в патенте WO 2009/085462, Shi et al., J Mol Biol 397: 385-396 (2010) and Tornetta et al., J Immunol Methods 360: 39-46 (2010), с внесением минимальных изменений в сайты рестрикционных ферментов. Эти библиотеки разделяли методом пэннинга относительно CD27-ECD в соответствии со схемами пэннинга, известными в данной области техники, например, такими как описано в патенте WO 2009/085462 и в публикации Shi et al., J Mol Biol 397: 385-396 (2010), направленными на увеличение афинности методом выбора более низкой скорости диссоциации или более высокой скорости ассоциации. Фаги получали с помощью инфекции фага-помощника. Связывающие фаги извлекали путем добавления гранул с образованием комплекса гранула/антиген/фаг. После последней отмывки фаг высвобождали путем инфицирования экспоненциально растущих клеток Escherichia coli TG-1. Фаг снова получали и подвергали дополнительным циклам пэннинга.

Для последующего скриннинга ДНК приготавливали из хранимых в глицерине циклов пэннинга фагов, а ген pIX отделяли методом переваривания NheI/SpeI. После повторного лигирования ДНК трансформировали в клетки TG-1 и выращивали на планшетах LB/Agar в течение ночи. На следующий день собирали колонии, выросшие за ночь, и культуры использовали: (i) для проведения ПЦР колонии и секвенирования V-участков, а также (ii) для индукции получения Fab. Для получения Fab выросшую за ночь культуру разводили 10-100-кратно в новой среде и выращивали в течение 5-6 ч при 37°C. Получение Fab индуцировали путем добавления свежей среды, содержащей IPTG, и культуры выращивали в течение ночи при 30°C. На следующий день культуры осаждали, а супернатанты, содержащие растворимые Fabбелки, использовали для ИФА на Fab. Для проведения анализа ИФА растворимые Fab-белки захватывали на планшеты с помощью поликлонального антитела анти-Fd(CH1). После отмывки и блокирования добавляли биотинилированный человеческий ECD CD27 в концентрации 0,2 нМ. Такая концентрация позволяет ранжировать Fab-варианты, определенные как процентное отношение связывания материнского антитела, причем определено, что материнский Fab, находящийся в качестве контроля на всех планшетах, имеет 100% связывание. Биотинилированный CD27 ECD обнаруживали стрептавидином, конъюгированным с HRP и анализом хемилюминисценции планшетов в спектрофотометре. При такой концентрации CD27 возможно ранжирование Fab-вариантов, нормализированных до материнской Fab. При помощи данного критерия были выбраны 10 тяжелых и 6 легких цепей, связывающих человеческий CD27 на 100% или более относительно М69 Fab.

Из библиотеки CDR-H2 (C27H28L2) материнский Y преимущественно выбирали в положении 52, что указывает на предпочтение для этого остатка. В положении 52а P был заменен на остатки A, S, V и G среди Fab с лучшей активностью связывания. В положении 53 был выбран материнский G вместе с R и N. В положении 54 восстанавливали только материнский D. Девять клонов из этой библиотеки (табл. 7) субклонировали в векторы IgG для экспрессии и характеристики как моноклональных антител.

Таблица 7

Девять V_H клонов, выбранных из полного разнообразия библиотеки C27H28L2

Единственным разнообразием, которое восстанавливали для библиотеки CDR-H3 (C27H28L3), было S95A и A101G. Один клон из этой библиотеки, содержащей обе мутации (табл. 8), субклонировали в векторы IgG для экспрессии и характеристики в качестве моноклонального антитела.

Таблица 8

Единственный V_H клон, выбранный из C27H28L3

№ пептида	S95	D96	Y97	Y98	Θ99	D100	YlOOa	GlOOb	FlOOc	A101	Y102
Н236	А	D	Y	Y	G	D	Y	G	F	G	Y

Для библиотеки L-CDR1, состоящей из четырех позиций (C27L35L2), положение 30а показало обогащение материнских Y и W. В положении 30d остатки S, H и E были обогащены вместе с материнским D. В положении 32 материнский Y был заменен на F и W. В положении 50 было отдано предпочтение T над материнским A. В целом, лучшие клоны имели более гидрофобные боковые цепи по сравнению с материнскими. Пять клонов из этой библиотеки (табл. 9) субклонировали в векторы IgG для экспрессии и характеристики в качестве моноклональных антител.

Для полной библиотеки CDR-L1 с ограниченным разнообразием (C27L35L3) была восстановлена

- 26 030828 только одна последовательность с единственным отличием от материнской, поскольку Y32 был заменен на F, аналогично описанной выше VL библиотеке с четырьмя положениями. Эта полная библиотека CDR-L1 не включала F в положении 32, и, таким образом, восстановленный клон вероятнее всего является контаминантом из библиотеки VL, состоящей из четырех позиций. Этот клон (L255) субклонировали в векторы IgG для экспрессии и характеристики в качестве моноклонального антитела (табл. 9).

Таблица 9

Шесть VL клонов, выбранных из C27L35L1 и C27L35L2

№ пептида	Y30a	D30d	Y32	A50
L255	Y	D	F	A
L256	Y	D	W	V
L257	Y	D	W	T
L258	Y	S	F	T
L260	W	H	W	T
L261	Y	S	F	E

6-вариантные легкие цепи были объединены в пары с 10-вариантными тяжелыми цепями, чтобы получить 60 комбинаций, которые которые экспрессировали клетки HEK293F. Супернатанты подвергали скринингу на предмет уровня экспрессии, связывания с человеческим CD27 ECD, как было измерено при проведении анализа ИФА, а также афинности, как было измерено с использованием инструмента ProteOn. Уровень экспрессии всех вариантов был достаточным для целей проведения скрининга. Для некоторых вариантов афинность была увеличена до 40 раз. Два моноклональных антитела М596 и М600 были отобраны для дальнейшего мутагенеза, чтобы устранить возможные сайты посттрансляционной модификации. Комбинации цепей VH и VL для этих моноклональных антител приведены в табл. 10. Антитела отличаются только двумя остатками в их легких цепях.

Таблица 10

Объединение в пары тяжелых и легких цепей выбранных созревших доминантов аффинности С2177

Идентификатор антитела	Идентификатор пептида легкой цепи	CDR-L1 (SEQ ID NO)	CDR-L2 (SEQ ID NO)	Идентификатор пептида тяжелой цепи	CDR-H2 (SEQ ID NO)
M596	L257	KASQSVDYAGDS WMN (26)	TASNLES (39)	Н239	RIYAGDGDTN (остатки 1-10 из 15)
M600	L255	KASQSVDYAGDS FMN (25)	AASNLES (37)	Н239	RIYAGDGDTN (остатки 1-10 из 15)

М596 отличается от материнской молекулы, М69, в трех положениях: Р52аА в CDR-H2, Y32W в CDR-L1 и А50Т в CDR-L2. М600 отличается от М69 в двух положениях: мутация Р52аА в CDR-H2 и Y32F в CDR-L1.

Три разделенных сайта потенциальной посттрансляционной модификации были определены в М596 и М600. Существует потенциальный N-связанный сайт гликозилирования в положении N58 в CDR-H2 и два потенциальных сайта изомеризации в CDR-H2 и CDR-L1, кодированные DG и DS соответственно. Кроме того, М596 содержит остаток триптофана незародышевой линии в CDR-L1, который может быть подвержен окислению.

С целью устранения риска гликозилирования были созданы три отдельные единичные замены в N58 и одна в S60 (табл. 11). Конструкты экспрессировали в клетках HEK293Е, супернатанты оценивали на аффинность к CD27 с использованием инструмента ProteOn. Все варианты имели аффинности, близкие к материнским, которые составляли 25 и 49 пМ для М596 и М600 соответственно. Варианты М680 и М678, которые оба происходят из М600, были отобраны для оценки дальнейших замещений с целью устранения сайтов изомеризации. Варианты М680 и М678 имеют A в положениях 60 и 58 соответственно и имеют дополнительное преимущество в нехватке триптофана в CDR-L1, который присутствовал в материнском М596.

Таблица 11

Материнская аминокислота VH и ПОЗИЦИЯ	Разнообразие
Asn58	N, A, R, Т
Ser60	S, А

Для оценки влияния мутации потенциальных сайтов изомеризации в М678 и М680 была разработана небольшая библиотека, чтобы параллельно удалить оба сайта. Каждая мутация была заменена индивидуально на CDR-H2 тяжелых цепей или CDR-L1 общей легкой цепи, а затем объединена в пары в комбинаторной библиотеке. Разнообразие этой библиотеки представлено в табл. 12.

- 27 030828

Таблица 12

Материнская аминокислота VH и ПОЗИЦИЯ	Разнообразие
Asp54	D, Е
Gly55	G, А
Материнская аминокислота VL и ПОЗИЦИЯ	Разноо бразие
Asp34	D, Е

Были экспрессированы данные моноклональные антитела и была оценена аффинность как для вариантов сайтов гликозилирования. Мутация D34E в потенциальном сайте изомеризации CDR-L1 привела к последовательному двукратному увеличению афинности, и, следовательно, этот сайт был успешно удален. Мутация D54E в потенциальном сайте изомеризации CDR-H2 снизила аффинность более чем в десять раз. Однако мутация G55A существенно не повлияла на аффинность. Варианты М703 и М706 сохраняют аффинность материнского М600 и имеют пониженный риск воздействия на функции из РТМ. Табл. 13 показывает выбранные варианты из каждой стадии оценки РТМ-рисков, объединение в пары их тяжелых и легких цепей, афинность и изменения последовательности в CDR. Мутация, выбранная для удаления потенциального сайта гликозилирования, подчеркнута. Мутации для удаления двух потенциальных сайтов изомеризации выделены жирным шрифтом и подчеркнуты двойной линией.

Таблица 13

шАЬ ID	VH	VL	KD (пМ)	CDR-H2 (SEQ ID NO)	CDR-L1 (SEQ ID NO)
М596	Н239	L257	25	RIYAGDGDTNYS PS FQG (165)	KASQSVDYAGDSWMN (26)
М600	Н239	L255	49	RIYAGDGDTNYS PS FQG (165)	KASQSVDYAGDSFMN (25)
М678	Н259	L255	53	RIYAGDGDTAYS PS FQG (166)	KASQSVDYAGDSFMN (25)
М680	Н260	L255	30	RIYAGDGDTNYAPSFQG (167)	KASQSVDYAGDSFMN (25)
М703	Н270	L267	28	RIYAGDGDTAYS PS FQG (168)	KASQSVDYAGDSFMN (29)
М7 0 6	Н272	L267	13	RIYAGDGDTNYAPSFQG (169)	KAS Q SVDYAGDS FMN (2 9)

Пример 9. Комбинированные HFR и оптимизация моноклональных антител С2177.

В этом подходе ограниченный набор вариантов HFR оценивали в формате Fab на предмет экспрессии, отображения pIX и связывания, а затем лучших кандидатов продвигали для оптимизации. CDR из С2177 были адаптированы к человеческим каркасным участкам в две тяжелые цепи VH5-51 (SEQ ID NO: 102 H24) и VH1-46 (SEQ ID NO: 106 H25) и две легкие цепи Vk4-1 и Vk012 (SEQ ID NO: 90 L36). Эти вариабельные домены HFA были соединены попарно в матрицу 2x2 в качестве Fabc человеческим CH1 и Ck константными участками в векторе дисплея фагов Fab pIX. Вариант VH1-46/Vk012 (M55, H25/L36) показал связывание с CD27 и хорошие характеристики отображения и был выбран для создания библиотек созревания аффинности.

Библиотеки Fab для отображения pIX фагов были созданы, как описано выше в примере 8. На основе экспериментальных совместных структур CD27 с С2191 и С2177 (пример 5) библиотеки разнообразия были разработаны в остатках CDR в и вокруг паратопов антител. Акцент на изменении был сделан в CDR-L1, L3 и H2. В общей сложности 4-6 остатков в пределах отдельного CDR были диверсифицированы с использованием кодона NNK, кодирующего для всех 20 аминокислот. Размер каждой библиотеки оценивали в <6x10⁷ вариантов, что может быть охвачено стандартными методиками рестрикционного клонирования библиотек. Табл. 14 показывает остатки, которые были подвергнуты полной диверсификации в различных библиотеках CDR.

Таблица 14

Проект (структура) библиотеки созревания аффинности С2177

VH CDR	Материнская аминокислота и позиция
CDR-H2	Y52
G53
D54
D56
N58

- 28 030828

Fab библиотеки, отображаемые на белке IX оболочки фага, разделяли методом пэннинга на биотинилированный hCD27ECD/Fc. Фаг получали с использованием инфекции фага-хелпера плазмидной библиотеки вариантов. Связующие фаги извлекали путем добавления покрытых стрептавидином магнитных гранул для создания комплекса гранула/антиген/фаг. После последней отмывки фаг высвобождали путем инфицирования экспоненциально растущих клеток Escherichia coli MC1061F. Фаг снова получали и подвергали дополнительным циклам пэннинга. Растворимый Fab из выбранных клонов был выработан и оценен на предмет активности связывания, как описано для пути 1. Результаты были получены только из библиотек CDR-L1 и CDR-L2. 21 клон из этих двух библиотек продемонстрировал связывание больше, чем у материнских HFR Fab. Клоны, содержащие С или М в самых разнообразных последовательностях, были отбракованы. Десять Fab конвертировали для экспрессии на фоне IgG4SPAAa/kappa для дальнейшего исследования. Тяжелая цепь IgG4PAA - это человеческий IgG4, содержащий замену серина на пролин в шарнирной области (Angal et al., Mol Immunol 30: 105 (1993) и замены аланина в двух позициях в CH2 (ML Alegre et al., Transplantation; 57: 1537-43 (1994)). Моноклональные антитела получали в клетках HEK293Е в качестве реплик Fab и в виде матрицы из комбинаций тяжелых и легких цепей. Аффинность измеряли на приборе ProteOn с использованием культуральных супернатантов (табл. 15). Мутация P52a на Q (M158) или S (M157) в CDR-H2 уменьшила K_D в 6 раз по сравнению с материнским моноклональным антителом (М159). Мутация Y36F в CDR-L1 (М149) уменьшила K_D в 4 раза, а добавление мутаций G33H и D34E (М155) привело к 6-кратному уменьшению K_D. Комбинация мутации P52S либо с Y36F (М160), либо с Y36F плюс G33H и D34E уменьшила K_D в 20 раз до 100 пМ. Комбинации замен в M158, M160 и M166 были отобраны для дальнейшей характеристики.

Таблица 15

Первоначальная панель моноклональных антител, происходящая из библиотек мутации Fabs

Идентификатор белка ДНК	H&L	CDR-H2 (SEQ ID NO)	CDR-L1 (SEQ ID NO)	Kd (hM)
М149	H25,L219	RIYPGDGDTNYNGKFKG (3)	KASQSVDYAGDSFMN (25)	0, 54
М150	Н25,L218	RIYPGDGDTNYNGKFKG (3)	KASQSVDYFGDSLMN (32)	4,04
М151	H25,L224	RIYPGDGDTNYNGKFKG (3)	KASQSVDYYNSSFMN (36)	1,07
М152	H25,L223	RIYPGDGDTNYNGKFKG (3)	KASQSVDYWSDSFMN (35)	1,54
М153	H25,L222	RIYPGDGDTNYNGKFKG (3)	KASQSVDYVGTSFMN (34)	1,41
М154	H25,L221	RIYPGDGDTNYNGKFKG (3)	KASQSVDYFRTSFMN (33)	1,56
М155	H25,L217	RIYPGDGDTNYNGKFKG (3)	KASQSVDYAHESFMN (31)	0, 37
М156	H25,L216	RIYPGDGDTNYNGKFKG (3)	KASQSVDYFSESFMN (170)	0, 71

- 29 030828

М157	H197,L220	RIYQGDGDTNYNGKFKG (22)	KASQSVDYAGDSYMN (24)	0, 39
М158	H196,L220	RIYSGDGDTNYNGKFKG (19)	KASQSVDYAGDSYMN (24)	0, 36
М159	H25,L220	RIYPGDGDTNYNGKFKG (3)	KASQSVDYAGDSYMN (24)	2,23
М160	H196,L219	RIYSGDGDTNYNGKFKG (19)	KASQSVDYAGDSFMN (25)	0, 12
М161	H196,L218	RIYSGDGDTNYNGKFKG (19)	KASQSVDYFGDSLMN (32)	1,34
М162	H196,L224	RIYSGDGDTNYNGKFKG (19)	KASQSVDYYNSSFMN (36)	0, 43
М163	H196,L223	RIYSGDGDTNYNGKFKG (19)	KASQSVDYWSDSFMN (35)	0, 30
М164	H196,L222	RIYSGDGDTNYNGKFKG (19)	KASQSVDYVGTSFMN (34)	0,27
М165	H196,L221	RIYSGDGDTNYNGKFKG (19)	KASQSVDYFRTSFMN (33)	0, 18
М166	H196,L217	RIYSGDGDTNYNGKFKG (19)	KASQSVDYAHESFMN (31)	0, 10
М167	H196,L216	RIYSGDGDTNYNGKFKG (19)	KASQSVDYFSESFMN (170)	0, 91

Белки M158, M160 и M166 производили в 750 мл культуры клеток HEK293, очищали и анализировали на кинетику связывания с CD27-His на аппарате Biacore. Значения K_D были на 1 лог выше, чем измеренные при помощи аппарата ProteOn с неочищенными супернатантами, но показали одинаковые значения по отношению друг к другу (табл. 16).

Таблица 16

Идентификатор mAh	kBKJI. (M-ls I)	k .(s1)	KD (ПМ)
M158	(1,5±0,03)E + 06	(6,6±1,7)E-04	4391114
M160	(1,6+0,15)E+06	(1,8+0,01)E-04	117+11
M166	(1,62+0,04)E+06	(2,03+0,16)E-04	126+11

При повторной оценке оригинальных комбинаций HFA, V_H, адаптированные VH5-51, показали значение K_D в 2 раза меньше значений каркаса VH1-46. Мутация P52aS в H-CDR2 была введена в VH5-51 VH для создания H221. H221 экспрессировали легкие цепи L220, L219 и L217 из материнского моноклонального антитела HFA (M159) и аффинность улучшила варианты M160 и M166 соответственно для получения моноклональных антител М171, М169 и М170. Измерения кинетики при помощи аппарата BIAcore на очищенных моноклональных антителах показали двукратное улучшение KD по сравнению с соответствующими вариантами VH1-46 (сравните табл. 16 и 17).

Таблица 17

Идентификатор mAh	Идентификатор белка H/L	КЕКЛ,сред. (M“1s-1)	Квыкл · сред, (s’1)	Ko сред. (nM)
M169	H221,L219	(1,48+0,13)E+06	(1,02+0,07)E-04	69+8
M170	H221,L217	1,66E+06	1,16E-04	70
M171	H221,L220	1,53E+06	3,58E-04	234

Анализ последовательностей М160, М169 и М170 выявил потенциальный сайт изомеризации на D54-G55 и потенциальный сайт дезаминирования на N61-G62 в CDR-H2 из Н196 и H221. Кроме того, потенциальный сайт изомеризации был выявлен на D34 в CDR-L1 из L219. Мутации были введены с целью удаления этих сайтов и оценены по их влиянию на активность (табл. 18). Очищенные моноклональные антитела были проанализированы на аффинность к CD27-His на аппарате ProteOn. Мутации либо не имели вообще никакого эффекта, либо не имели положительного эффекта на K_D. Например, как М668, так и М671 имели K_D почти в 2 раза ниже, чем их материнские моноклональные антитела, M160 и СМ 169 соответственно.

- 30 030828

Таблица 18

Варианты моноклональных антител с мутированными последовательностями РТМ

Материнское моноклональное антитело	Идентификатор шАЬ	Идентификатор белка H/L	CDR-H2 (SEQ ID NO)	CDR-L1 (SEQ ID NO)	kEKJI. сред. (M_1s1)	квыкл. сред. (S’1)	KD сред. (nM)
М160	М160	H196,L219	RIYSGDGDTNY NGKFKG(19)	KASQSVDYAG DSFMN (25)	2,07E+06	2,23E-04	108
М166	М166	H196,L217	RIYSGDGDTNY NGKFKG(19)	KASQSVDYAH ESFMN (31)	l,84E+06	2,34E-04	127
М169	М169	H221,L219	RIYSGDGDTNY NGKFKG(19)	KASQSVDYAG DSFMN (25)	2,36E+06	l,39E-04	59
М160	М668	H255,L266	RIYSGDADTNY AQKFKG (20)	KASQSVDYAG ESFMN (29)	2Д4Е+06	l,29E-04	60
М160	М669	H256,L266	RIYSGDADTNY NQKFKG(21)	KASQSVDYAG ESFMN (29)	2Д9Е+06	l,45E-04	58
М169	М670	H257,L266	RIYSGDADTNY AQKFKG (20)	KASQSVDYAG ESFMN (29)	l,73E+06	1ДЗЕ-04	65
М169	М671	H258,L266	RIYSGDADTNY NQKFKG(21)	KASQSVDYAG ESFMN (29)	2,52E+06	9,73E-05	39
М166	М672	H255,L217	RIYSGDADTNY AQKFKG (20)	KASQSVDYAG ESFMN (29)	l,83E+06	2,64E-04	144
М166	М673	H256,L217	RIYSGDADTNY NQKFKG(21)	KASQSVDYAG ESFMN (29)	l,89E+06	l,89E-04	100

Пример 10. Оптимизация моноклонального антитела М91 из С2191 HFR.

Методы, применяемые для оптимизации М91 (H31/L42), были такими же, как описано в примере 8, если не указано иначе. Сканирование аланина/зародышевой линии CDR из С2191 проводилось в формате Fab для оценки позиций, важных для взаимодействия с CD27 с использованием материнских V_H и V_L участков С2191 в формате Fab с константными человеческими Ch1 и Ck участками. Библиотеки заменяли остатки в CDR аланином или остатком соответствующей последовательности зародышевой линии. Некоторые позиции в CDR были исключены, поскольку они имели низкую степень проявления или не проявлялись под воздействием растворителя при моделировании, а затем на определенной структуре (пример 5). Предполагаемые соматические мутации мутировали к первоначальному виду, к аминокислотам мышиной зародышевой линии, для оценки их вклада в аффинность антител. Вкратце, мышиные V участки клонировали в вектор дисплея Fab pIX, и было проведено тестирование связывания материнского с биотинилированным человеческим белком CD27 - ECD методом ИФА. Одиночные мутации (в соответствии с проектом библиотеки) были введены с помощью мутагенеза, направленного на сайт, что было проведено соответственно описанному в публикации Stratagene (La Jolla, CA, USA). Мутантов с подтвержденными последовательностями тщательно отбирали на новые планшеты и выращивали вместе с материнским Fab и отрицательным контролем Fabs. Окончательные варианты отдельных аминокслотных замен были получены в Е. coli, а затем был проведен их скрининг на экспрессию и связывание с CD27 методом ИФА. Сигналы экспрессии и связывания для материнских клонов были усреднены и установлены на 1,0, а сигналы мутантов были нормализованы относительно материнских. Две формы антигена использовали при проведении анализов методом ИФА: CD27 ECD (остатки 1-173) и химеру CD27 ECDFc (R&D Systems).

Результаты этого сканирования в сочетании с совместной кристаллической структурой послужили основой для проектирования библиотек созревания аффинности. Для тяжелой цепи позиции, выбранные для изменения, были следующими: Т33 в H-CDR1 и Y50, S52, S52a N56 и Y58 в CDR-H2 (табл. 23). Т33 не является контактным остатком, но мутация Т33А улучшила связывание. Позиции S52 и S52A не являются контактными остатками, но замены в сканировании показали некоторое повышение связывания. Тирозины в положениях 50 и 58 являются контактными сайтами и замены на этих сайтах были выбраны в параллельном пути оптимизации, описанном в примере 11. Позиция N56 не оценивалась в сканировании аланина/зародышевой линии, но она является контактным сайтом и прилегает к Т33, S52 и S52a в кристаллической структуре. Для легкой цепи были выбраны следующие позиции для изменения: 30а, S30b, G30c и Y30d в CDR-L1 и L50 и N53 в CDR-L2 (табл. 23). Ни один из этих остатков не контактирует с антигеном непосредственно, но они примыкают к контактирующим остаткам, которые, как показало сканирование, имеют существенное негативное влияние на связывание. Мутация L50A имела умеренное действие на связывание и в кристаллической структуре является единственным остатком в CDR-L2, который, возможно, контактирует с антигеном. Кроме того, N53 был выбран для ограниченной диверсификации. Были созданы две параллельные библиотеки: одна с Y30d, мутирующим до W, и другая с Y30d,

- 31 030828 который сохранился как Y, так как W может сделать паратоп более гидрофобным и, следовательно, менее способным к проявлению. Табл. 19 и 20, приведенные ниже, показывают проекты библиотек созревания афинности VH и VL для М91.

Таблица 19

2191	НС CDR1	НС CDR2
Контакт с антигеном?	НЕТ	ДА	НЕТ	НЕТ	ДА	ДА
Положение в тяжелой цепи (SEQ ID NO: 131)	ТЗЗ	Y50	S52	S52a	N5 6	Y58
Положение в тяжелой цепи (SEQ ID NO: 131)	ТЗЗ	Y50	S52	S53	N57	Y59
Диверсификация последовательности	Все 20 аминокислот	Y	Все 2 0 аминокислот	Все 20 аминокислот	Все 20 аминокислот	Y
А	I
W	L
Н	W

Таблица 20

2191	LC CDR1	LC CDR2
Контакт с антигеном	HET	НЕТ	НЕТ	ДА	ДА	НЕТ
Положение в LC (SEQ ID NO: 140)	T30a	S30b	G30c	Y30d	L50	N53
Положение LC (SEQ ID NO: 140)	T31	S32	G33	Y34	L54	N57
Диверсификация последовательности	Bee 20	Все 2 0	G	Y*	Все 2 0	Н
амино-	амино-	R	W*	амино-	К
кислот	кислот			кислот	R

* - были созданы две отдельные библиотеки, содержащие либо Y, либо W в данной позиции.

Fab библиотеки, отображаемые на белке IX оболочки фага, разделяли методом пэннинга на биотинилированный CD27-ECD. Было отобрано всего 12 вариантов тяжелых и 12 вариантов легких цепей, которые связывались с CD27 в равной степени или лучше, чем материнский химерный Fab из С2191. Варианты были преобразованы в IgG1/K антитела, вырабатываемые в клетках HEK293B в виде 144 комбинаций, и супернатанты культуры оценивали на предмет связывания с использованием ProteOn. Для некоторых вариантов наблюдались значительные (100-кратные) увеличения аффинности. Из 144 пар VH и VL для дополнительной характеризации были выбраны 8 (табл. 21). Эти моноклональные антитела были разделены на три подгруппы. Варианты из группы 1, которые имеют одну и ту же тяжелую цепь (H227, SEQ ID NO: 133), объединяли в пары с четырьмя различными легкими цепями, в то время как варианты группы 2 и группы 3, каждая из которых имеет по одной легкой цепи, объединяли в пары с двумя различными тяжелыми цепями. Четыре выбранные легкие цепи менялись на всех четырех позициях, диверсифицированных в CDR-L1 (RASKSVSX1X2X3X4SFMH) (SEQ ID NO: 158); где Xj - это А, B, Н или L; X2 - это D, G, V или W; X₃ - это G или R; и Х₄ - это W или Y). Они также менялись в обеих позициях, диверсифицированных в CDR-L2 (X₁ASX₂LES) (SEQ ID NO:171); где X₁ - это L или V; и где Х₂ - это K, N или R). CDR-L3 не был изменен из последовательности L42 (SEQ ID NO: 140) и представляет собой QHSRELPWT.

Таблица 21

Объединение попарно последовательностей тяжелых и легких цепей из выбранных 2191 созревших доминантов афинности

Идентификатор антитела	Идентификатор пептида легкой цепи	CDR-L1 (SEQ Ш NO:)	CDR-L2 (SEQID NO:)	Идентификатор пептида тяжелой цепи	CDR-H1 (SEQ IDNO:)	CDR-H2 (SEQ И) NO:)
М427	C27L244	RASKSVSAW GYSFMH (60)	VASRLES (68)	С27Н227	GFTFSSYGMS (44)	YIDEGGGQTIYP DSVKG (47)
М429	C27L245	RASKSVSHVR WSFMH (61)	LASKLES (69)	С27Н227	GFTFSSYGMS (44)	YIDEGGGQTIYP DSVKG (47)
М488	C27L249	RASKSVSEGR WSFMH (62)	VASRLES (68)	С27Н227	GFTFSSYGMS (44)	YIDEGGGQTIYP DSVKG (47)

- 32 030828

M489

C27L250

C27L249

C27L250

C27L250

C27L249

RASKSVSLDR

WSFMH (63)

RASKSVSEGR

WSFMH (62)

RASKSVSLDR

WSFMH (63)

RASKSVSLDR

WSFMH (63)

RASKSVSEGR

WSFMH (62)

LASNLES

GFTFSSYGMS (44)

VASRLES

GFTFSSYSMS

LASNLES

GFTFSSYSMS

LASNLES

GFTFSSYSMS

VASRLES

GFTFSSYGMS (44)

YIDEGGGQTIYP

DSVKG(47)

YIDAGGGFTIYP

DSVKG(48)

YIDAGGGFTIYP

DSVKG(48)

HIDAGGGRTWY

PDSVKG(49)

YIDRGGGVTIYP

DSVKG(50)

Эти восемь вариантов были получены путем временной экспрессии в клетках HEK293B в объеме 750 мл. Собранные супернатанты очищали с помощью хроматографии белка А, и каждый вариант анализировали с использованием метода SDS-PAGE и SE-HPLC для определения чистоты образца и процентного содержания мономера в очищенной пробе. Все варианты имели значение чистоты более чем 90% и значение содержания мономеров также было более чем 90%. Для оценки свойств ассоциации антител удерживающие факторы (k') были определены путем выполнения перекрестного взаимодействия хроматографии для каждого очищенного варианта (Jacobs S.A., Wu S.J., Feng Y., Bethea D & O'Neil KT (2010) Cross-interaction chromatography: a rapid method to identify highly soluble monoclonal antibody candidates. Pharm Res 27, 65-71). В этом способе образец антител пропускали через колонку в сочетании с человеческим IgG и оценивали на предмет удерживания по сравнению с контрольными антителами. Кратко, 50 мг человеческого IgG (Sigma Aldrich) соединяли с колонкой NHS-сефароза объемом 1 мл (GE Healthcare) в соответствии с инструкциями производителя. Несвязанный IgG удаляли путем отмывки 0,1М Tris, pH 8, 0,5М NaCl, а непрореагировавшие группы NHS блокировали тем же буферным раствором. Эффективность связывания определяли путем измерения концентрации белка, оставшегося в непрореагировавшем связывающем буфере и смывах, с использованием набора Coomassie Plus Assay Kit (Thermo Pierce) и вычитания этого значения из количества белка до иммобилизации. Контрольную колонку также получали с использованием того же протокола, но без конъюгации IgG к смоле. Контрольную колонку сначала обрабатывали на приборе для ВЭЖХ Dionex UltiMate 3000 после достижения равновесия в условиях ФБС, pH 7 и при скорости потока 0,1 мл/мин. Сначала на колонку наносили 20 мкл маточного раствора белка, чтобы обеспечить блокировку неспецифических сайтов связывания, после чего наносили 20 мкл 10% ацетона для проверки целостности колонки. Образцы для анализа разводили до концентрации 0,1 мг/мл в ФСБ, pH 7. 20 мкл каждого образца наносили на каждую колонку и оставляли для обработки со скоростью 0,1 мл/мин в течение 30 мин. Регистрировали время удержания, и для каждого варианта рассчитывали коэффициент удержания (k'). Значение к рассчитывали как разницу времени удерживания на колонке с IgG и пустой колонке. Все варианты очищали до достижения чистоты более чем 90% на основе SDSPAGE и вытеснительной хроматографии. Все значения k рассчитывали так, чтобы они были меньше чем 0,3, что свидетельствует о хороших свойствах раствора (табл. 22).

Таблица 22

Анализ серии очищенных созревших вариантов

Идентификатор антитела	НС	LC	Конц. (мг/мл)	Восст ановление общего белка	Мономер, %	гель	к’
М427	Н227	L244	1,42	15,63	100	ок	0,02
М429	Н227	L245	0,97	10,21	100	ок	0,07
М488	Н227	L249	2,00	27,06	98,9	ок	0,07
М489	Н227	L250	1,59	23,03	100	ок	0,17
М492	Н228	L249	2,07	27,96	97,4	ок	0,25
М493	Н228	L250	0,58	8,12	100	ок	0,24
М501	Н231	L250	2,01	26,08	100	ок	0,28
М526	Н222	L249	0,90	10,74	100	ок	0,10

Восемь различных моноклональных антител и материнский HFR были оценены на предмет их аффинности к CD27 ECD с использованием BIAcore, а также их IC₅₀ в анализе κβ-репортера. Кинетические константы и аффинность измеряли с использованием BIAcore. В табл. 23 обобщены данные, собранные по этим вариантам. Сигнал экспрессии и ИФА на связывание с CD27 согласно измерениям от начальных малых супернатантов культуры также включены в эту таблицу.

- 33 030828

Таблица 23

Сводные данные подмножеств библиотеки С2191 AM

Идентификатор белка	Экспрессия (мкг/мл)	Сигнал ИФА	Μ'κβ ICso (нМ)	ka	kd	Kd (пМ)
М41	не определяется	не определяется	45	6,20Е+05	8,44Е-03	13650
М427	14,6	0,93	19	7,18Е+05	3,00Е-05	41,7
М429	16,1	0,86	42	6,62Е+05	2,02Е-05	30,4
М488	20,7	0, 92	23	1,01Е+06	3,96Е-05	39,4
М489	24,2	0,96	41	9,06Е+05	2,18Е-05	24,1
М492	20,1	0,77	15	1,03Е+06	1,47Е-04	142, 0
М493	24,5	0,85	14	7,23Е+05	1,05Е-04	145, 0
М501	30,9	0,77	4	8,31Е+05	6,16Е-О5	74,2
М526	14,3	0, 69	6	1,00Е+06	1,71Е-04	171, 0

Пример 11. Комбинированный HFR и оптимизация моноклонального антитела С2191.

В этом подходе ограниченный набор вариантов HFR оценивали в формате Fab на предмет экспрессии, дисплея pIX и связывания, а затем лучших кандидатов продвигали для оптимизации. CDR из С2191 были адаптированы к человеческому каркасному участку в две тяжелые цепи (VH3-23 и VH3-11) и две легкие цепи (Vk4-1 и Vk012). Эти вариабельные домены HFA были соединены попарно в матрицу 2x2 в качестве Fabc с человеческими CH1 и Ck константными участками в векторе дисплея фагов Fab pIX. Вариант VH3-23/Vk012 (H39 (SEQ ID NO: 145)) и L40 (SEQ ID NO: 137) показал связывание с CD27 и хорошие характеристики отображения и был выбран для создания библиотек созревания аффинности. Этот Fab называется материнским.

Для выбора антител с улучшенной аффинностью несколько остатков во всех CDR, кроме CDR-H3 из Н39, были полностью диверсифицированы с помощью вырожденных кодонов NNK (табл. 24). Каждая библиотека CDR создавалась отдельно и подвергалась фаговому разделению методом пэннинга для выбора созревших вариантов аффинности.

Таблица 24

Проект библиотеки созревания аффинности для вариантов С2191

VH CDR	Материнская аминокислота и позиция
CDR-H2	Y50
S52
S53
N56
Y58
CDR-H3	Н95
R96
G97
N98
Р99
VL CDR	Материнская аминокислота и позиция
CDR-L1	ТЗОа
S30b
G30c
Y30d
F32
CDR-L2	L50
А51
S52
N53
L54
Е55
S56
CDR-L3	Н90
R92
Е93
L94
Y96

Библиотеки С2191 с разнообразием в CDR-H2, CDR-L1 или CDR-L2 выпустили 50 уникальных Fab с улучшенным связыванием с человеческим CD27 относительно материнского HFR Fab, как измерено методом ИФА по одной точке. Данные клоны затем ранжировали по нескольким точкам методом ИФА,

- 34 030828 и было выбрано 17 клонов для конвертации на человеческий IgG4alaala/kappa для дальнейшей характеристики (табл. 25).

Таблица 25 Fab с созревшей аффинностью, выбранные для конвертации на IgG

Идентификатор Fab	Идентификатор белка НС	Идентификатор белка LC	CDR-H2 (SEQ II) NO:)	CDR-L1 (SEQ Ш NO:)	CDR-L2 (SEQ ID NO:)
Материнский	Н39	L40	YISSGGGNTYYP DSVKG (46)	RASKS VSTSGYSFMH (59)	LASNLES (67)
F116	Н39	L59	YISSGGGNTYYP DSVKG (46)	RASKS VSTSGYSFMH (59)	VGNRLED (70)
F119	Н39	L62	YISSGGGNTYYP DSVKG (46)	RASKS VSTSGYSFMH (59)	VGDRRQE (71)
F178	Н145	L40	YISGGGGQTLYP DSVKG (54)	RASKS VSTSGYSFMH (59)	LASNLES (67)
F18	Н40	L40	AIDHGGGRTYYP DSVKG (51)	RASKS VSTSGYSFMH (59)	LASNLES (67)
F19	Н41	L40	AIDHGGGRTWYP DSVKG (52)	RASKS VSTSGYSFMH (59)	LASNLES (67)
F243	Н39	L124	YISSGGGNTYYP DSVKG (46)	RASKS VSTSGYSFMH (59)	VGSRMAF (72)
F250	Н39	L131	YISSGGGNTYYP DSVKG (46)	RASKS VSTSGYSFMH (59)	VGDRANW (73)
F256	Н39	L137	YISSGGGNTYYP DSVKG (46)	RASKS VSTSGYSFMH (59)	VGSRLDY (74)
F279	Н39	L160	YISSGGGNTYYP DSVKG (46)	RASKSVSYVRWSFMH (64)	LASNLES (67)
F291	Н39	L172	YISSGGGNTYYP DSVKG (46)	RASKS VSHIRWSFMH (65)	LASNLES (67)
F292	Н39	L173	YISSGGGNTYYP DSVKG (46)	RASKS VSHVRWSFMH (61)	LASNLES (67)
F295	Н39	L176	YISSGGGNTYYP DSVKG (46)	RASKS VSTSGYSFMH (59)	VADRVEV (173)
F297	Н190	L40	TIDRGGGSTWYP DSVKG (55)	RASKS VSTSGYSFMH (59)	LASNLES (67)
F298	Н191	L40	AIDGGGGATYYP DSVKG (56)	RASKS VSTSGYSFMH (59)	LASNLES (67)
F299	Н192	L40	VIDHGGGSTHYP DSVKG (57)	RASKS VSTSGYSFMH (59)	LASNLES (67)
F302	Н39	L179	YISSGGGNTYYP DSVKG (46)	RASKSVSLIRWSFMH (172)	LASNLES (67)
F57	Н79	L40	AIDHGGGQTLYP DSVKG (53)	RASKS VSTSGYSFMH (59)	LASNLES (67)

Моноклональные антитела IgG1/k mAbs были созданы в виде реплик Fabs и в виде матрицы вариабельных участков тяжелых и легких цепей (табл. 26), а также протестированы на предмет аффинности и свойств раствора. Форма моноклонального антитела материнского Fab обозначается как М131. М141 и М408 были выбраны для дальнейшей характеризации.

Таблица 26

Моноклональные антитела, полученные из созревания аффинности Fab

Идентификатор Fab	Идентификатор тАЬ	Н & Идентификатор белка L
Материнский	М131	Н39,	L40
F18	М132	Н40,	L40
F57	М133	Н79,	L40
F298	М134	Н191,	L40
F299	М135	Н192,	L40
F292	М136	Н39,	L173
F279	М137	Н39,	L160
F256	М138	Н39,	L137
Комбинация	М139	С27Н40,	, L173
Комбинация	М140	С27Н40,	, L160
Комбинация	М141	С27Н79,	, L173
Комбинация	М142	С27Н79,	, L160
Комбинация	М143	С27Н191	, L160
Комбинация	М144	С27Н191	, L173
Комбинация	М145	С27Н192	, L173
Комбинация	М146	Н192,	L160
Комбинация	М408	Н192,	L137

Пример 12. Характеризация моноклональных антител с созревшей аффинностью.

Выбранные моноклональные антитела с созревшей аффинностью, полученные из материнских С2177 и С2191 антител гибридом, оптимизировали кодоном, вводили в другой вектор для достижения двойной экспрессии тяжелых и легких цепей, экспрессирующих в клеточной культуре CHO-GS, а затем очищали для дальнейшей характеризации. Идентификаторы этих антител в отношении зрелых вариантов, описанных в приведенных выше примерах, показаны в табл. 27.

- 35 030828

Таблица 27

Материнский	Идентификатор пДНК	Идентификатор единичного гена ДНК	Идентификатор пептида LC	Идентификатор пептида НС
2191	429	696	27L245	27Н227
2191	492	695	27L249	27Н228
2191	488	694	27L249	27Н227
2191	141	707	27Н79	27L173
2191	408	708	27Н192	27L137
2177	703	709	27Н270	27L267
2177	706	710	27Н272	27L267
2177	671	711	27Н258	27L266
2177	668	713	27Н255	27L266

Обобщенные данные для этих моноклональных антител представлены ниже для анализа K_D с использованием Biacore, и IC₅₀ измерен при проведении анализа репортерного гена NF-κβ (табл. 28 и 2). Для данного анализа репортерного гена NF-κβ клетки HEK-293F трансфецировали в общей сложности 36 нг ДНК, содержащей как конструкты человеческого CD27, так и конструкт люциферазы под контролем промотора NF-κβ. Трансфектанты HEK-293F высевали при концентрации 5х10⁴ клеток на лунку и в 40 мкл среды Freestyle (Gibco) на 96-луночные планшеты. Растворы гибридомных моноклональных анител анти-CD27 добавляли на аналитический планшет в средах Freestyle для конечной концентрации 50 мкг/мл с разведением в соотношении 1:3, и планшеты инкубировали при температуре 37° (5% CO₂) в течение 1 ч. Для тестирования способности моноклональных антител нейтрализовать сигнализирование CD70:CD27 добавляли временно облученные (4000 рад) эписомальные клетки I I1:K2931: CD70 при концентрации 20% от количества трансфектантных клеток на планшет. Для тестирования агонистческой активности гибридомных моноклональных антител добавление эписомальных клеток CD70 не проводилось. Аналитические планшеты инкубировали в течение ночи при температуре 37°C (5% CO₂) и проявляли с использованием системы для анализа люциферазы Steady-GloO Luciferase Assay System (Promega) в соответствии с инструкциями производителя.

Таблица 28

Характеризация зрелых вариантов, полученных из С2191
мкАТ	ка (1/Мс)	kd (I/O	Kd (пМ)	Анализ NFκβ ICso (пМ)
материнская химера С2191 (М41)	4,35Е+05	0,0103	23678	2300
М694	4,80Е+05	7,60Е-05	105	420
М695	5,10Е+05	1,70Е-04	202	250
М696	3,70Е+05	2,1Е-05	57	330
М7 07	5,85Е+05	1,24Е-04	213	260
М708	6,430Е+05	2,25Е-04	350	260

Таблица 29

Характеризация зрелых вариантов, полученных из С2177
мкАТ	ка (1/Мс)	kd (I/O	Kd (пМ)	Анализ NFκβ 1С50 (пМ)
материнская химера С2177 (1440)	1,06Е+06	1,32Е-03	1240	466
М709	2,30Е+06	5,89Е-05	26	272
М710	2,55Е+06	4,88Е-05	19	320
М711	1,97Е+05	5,82Е-05	30	258
М713	2,06Е+05	1,16Е-05	56	296

Последовательности CDR и V участков.

- 36 030828

Таблица 30

2177 путь 1

VH		CDR-H1 (SEQ ID NO:)	CDR-H2 (SEQ ID NO:)	CDR-H3 (SEQ ID NO:)
		Кабат	Кабат	Кабат
Н7	материнский М4 0	SSWMN (1)	RIYPGDGDTNYNGKFKG (3)	SDYYGDYGFAY (23)
		Расширенный CDR-H1	Кабат-7 (+2 HFR остатки для демонстрации мутаций РМТ)	Кабат
Н28	HFR(M69)	GYAFSSSWMN (2)	RIYPGDGDTNYS (4)	SDYYGDYGFAY (23)
Н236		GYAFSSSWMN(2)	RIYPGDGDTNYS	ADYYGDYGFGY (162)
Н237		GYAFSSSWMN(2)	RIFVRDGDTNYS (5)	SDYYGDYGFAY (23)
Н238		GYAFSSSWMN(2)	RIYVGDGDTNYS (6)	SDYYGDYGFAY (23)
Н239	М596, М600	GYAFSSSWMN(2)	RIYAGDGDTNYS (7)	SDYYGDYGFAY (23)
Н240		GYAFSSSWMN(2)	RIYARDGDTNYS (8)	SDYYGDYGFAY (23)
Н241		GYAFSSSWMN(2)	RIYGRDGDTNYS (9)	SDYYGDYGFAY (23)
Н242		GYAFSSSWMN(2)	RIYANDGDTNYS (10)	SDYYGDYGFAY (23)
Н243		GYAFSSSWMN(2)	RIYGGDGDTNYS (11)	SDYYGDYGFAY (23)
Н244		GYAFSSSWMN(2)	RIYSGDGDTNYS (12)	SDYYGDYGFAY (23)
Н245		GYAFSSSWMN(2)	RIYSRDGDTNYS (13)	SDYYGDYGFAY (23)
Н259	М678	GYAFSSSWMN(2)	RIYAGDGDTAYS (14)	SDYYGDYGFAY (23)
Н260	М680	GYAFSSSWMN(2)	RIYAGDGDTNYA (15)	SDYYGDYGFAY (23)
Н270	М703=М709	GYAFSSSWMN(2)	RIYAGDADTAYS (16)	SDYYGDYGFAY (23)
Н272	М706=М710	GYAFSSSWMN(2)	RIYAGDADTNYA (17)	SDYYGDYGFAY (23)
			RIX1X2X3DX4DTX5YX6 (151)

Для последовательности SEQ ID NO:151 X₁ представляет собой F или Y; X₂ представляет собой A, G, S или V; X₃ представляет собой G, N или R; X₄ представляет собой А или G; X₅ представляет собой А или N; а X₆ представляет собой А или S.

- 37 030828

Таблица 31

2177 путь 2

VH		CDR-H1 (SEQ ID NO:)	CDR-H2 (SEQ ID NO:)	CDR-H3 (SEQ ID NO:)
		Кабат	Кабат	Кабат
Н7	материнский М4 0	SSWMN (1)	RIYPGDGDTNYNGKFKG (3)	SDYYGDYGFAY (23)
Н24 Н221 Н257 Н258 Н25 Н196 Н255 Н256 Н197	HFR(M50) М169, М170, М171 М670 М671=М711 HFR (М55); М149-156; М159 М158; М160167 М668=М713; М672; М669; М673 М157	Расширенный CDR-H1 GYAFSSSWMN (2) GYAFSSSWMN (2) GYAFSSSWMN (2) GYAFSSSWMN (2) GYAFSSSWMN (2) GYAFSSSWMN (2) GYAFSSSWMN (2) GYAFSSSWMN (2) GYAFSSSWMN (2)	Kabat-7 (оставшийся CDR одинаковый в мышином варианте и HFR) RIYPGDGDTNYNGKFKG (18) RIYSGDGDTNYNGKFKG (19) RIYSGDADTNYAQKFKG (20) RIYSGDADTNYNQKFKG (21) RIYPGDGDTNYNGKFKG (18) RIYSGDGDTNYNGKFKG (19) RIYSGDADTNYAQKFKG (20) RIYSGDADTNYNQKFKG (21) RIYQGDGDTNYNGKFKG (22)	Кабат SDYYGDYGFAY (23) SDYYGDYGFAY (23) SDYYGDYGFAY (23) SDYYGDYGFAY (23) SDYYGDYGFAY (23) SDYYGDYGFAY (23) SDYYGDYGFAY (23) SDYYGDYGFAY (23) SDYYGDYGFAY (23)
			RIYX1GDX2DTNYX3X4KFKG (152)

Для последовательности SEQ ID NO:152 X₁ представляет собой Р, Q или S; X₂ представляет собой А или G; X₃ представляет собой А или N; X₄ представляет собой G или Q.

Таблица 32

2177 путь 1

VL		CDR-L1 (SEQ ID NO:)	CDR-L2 (SEQ ID NO:)	CDR-L3 (SEQ ID NO:)
		Кабат	Кабат	Кабат
L18	материнский мышиный M40	KASQSVDYAGDSYM N (24)	AASNLES (37)	QQSNEDPYT (41)
L35	HFR (M69)	KASQSVDYAGDSYM N (24)	AASNLES (37)	QQSNEDPYT (41)
L255	M600; M67 8; M680	KASQSVDYAGDSFM N (25)	AASNLES (37)	QQSNEDPYT (41)
L256		KASQSVDYAGDSWM N (26)	VASNLES (38)	QQSNEDPYT (41)
L257	M5 96	KASQSVDYAGDSWM N (26)	TASNLES (39)	QQSNEDPYT (41)
L258		KASQSVDYAGSSFM N (27)	TASNLES (39)	QQSNEDPYT (41)
L260		KASQSVDWAGHSWM N (28)	TASNLES (39)	QQSNEDPYT (41)
L261		KASQSVDYAGSSFM N (27)	EASNLES (40)	QQSNEDPYT (41)
L2 67	M703=M709; M706=M710	KASQSVDYAGESFM N (29)	AASNLES (37)	QQSNEDPYT (41)
		KASQSVDX!AGX2SX 3MN (153)	XiASNLES (154)

Для последовательности SEQ ID NO:153 X₁ представляет собой W или Y; X₂ представляет собой D, E, S или Н; X₃ представляет собой F, W или Y.

Для последовательности SEQ ID NO: 154 X₁ представляет собой А, Е, Т или V.

- 38 030828

Таблица 33

2177 путь 2

VL		CDR-L1 (SEQ ID NO:)	CDR-L2 (SEQ ID NO:)	CDR-L3 (SEQ ID NO:)
		Кабат	Кабат	Кабат
L18	материнский мышиный М40	KASQSVDYAGDSYMN (24)	AASNLES (37)	QQSNEDPYT (41)
L36	HFR (М55; М5 0)	KASQSVDYAGDSYMN (24)	AASNLES (37)	QQSNEDPYT (41)
L216	М15 6; Ml67	KASQSVDYFSESYMN (30)	AASNLES (37)	QQSNEDPYT (41)
L217	М155; М166; М17 0; М672; М673	KASQSVDYAHESFMN (31)	AASNLES (37)	QQSNEDPYT (41)
L218	М150; М161	KASQSVDYFGDSLMN (32)	AASNLES (37)	QQSNEDPYT (41)
L219	М149; М160; М169	KASQSVDYAGDSFMN (25)	AASNLES (37)	QQSNEDPYT (41)
L266	М668=М713; М669; М670; М671=М711;	KASQSVDYAGESFMN (31)	AASNLES (37)	QQSNEDPYT (41)
L220	М157; М171; М158; М159	KASQSVDYAGDSYMN (24)	AASNLES (37)	QQSNEDPYT (41)
L221	М154	KASQSVDYFRTSFMN (33)	AASNLES (37)	QQSNEDPYT (41)
L222	М153	KASQSVDYVGTSFMN (34)	AASNLES (37)	QQSNEDPYT (41)
L223	М152; М163	KASQSVDYWSDSFMN (35)	AASNLES (37)	QQSNEDPYT (41)
L224	М151; М162	KASQSVDYYNSSFMN (36)	AASNLES (37)	QQSNEDPYT (41)
		KASQSVDYX1X2X3MSX4MN (155)

Для последовательности SEQ ID NO:155 Х₁ представляет собой A, F, V, W или Y; Х₂ представляет собой G, H, N, R или S; Х₃ представляет собой D, E, S или Т; Х₄ представляет собой F, L или Y.

Таблица 34

2191 путь 1

VH		CDR-H1 (SEQ ID NO:)	CDR-H2 (SEQ ID NO:)	CDR-H3 (SEQ ID NO: )
		Кабат	Кабат	Кабат
H10	материнский M41	SYTMS (42)	YISSGGGNTYYPDSVKG (46)	HRGNPFDY (58)
		Pa сширенный CDR-Hl	Кабат	Кабат
H31	HFR (M91)	GFTFSSYTMS (43)	YISSGGGNTYYPDSVKG (46)	HRGNPFDY (58)
H227	M427, M429=M696; M488=M694; M489	GFTFSSYGMS (44)	YIDEGGGQTIY PDSVKG (47)	HRGNPFDY (58)
H228	M492=M695; M493	GFTFSSYSMS (45)	YIDAGGGFTIY PDSVKG (48)	HRGNPFDY (58)
H231	M5 01	GFTFSSYSMS (45)	HIDAGGGRTWYPDSVKG (49)	HRGNPFDY (58)
H222	M526	GFTFSSYGMS (44)	YIDRGGGVTIY PDSVKG (50)	HRGNPFDY (58)
H227	Определенный Кабат CDR-H1	SYGMS (161)
			X1IX2X3GGGX4TX5YPDSVKG (156)

Для последовательности SEQ ID N0:156 Х₁ представляет собой Н или Y; Х₂ представляет собой D

- 39 030828 или S; X₃ представляет собой А, Е, R или S; а Х₄ представляет собой I, W или Y.

Таблица 35

2191 путь 2

VH		CDR-H1 (SEQ ID NO :)	CDR-H2 (SEQ ID NO:)	CDR-H3 (SEQ ID NO:)
		Кабат	Кабат	Кабат
ню	материнский М41	SYTMS (42)	YISSGGGNTYYPDSVKG (46)	HRGNPFDY (58)
Н39	HFR ; М131; М136-138	GFTFSSYTMS (43)	YISSGGGNTYYPDSVKG (46)	HRGNPFDY (58)
Н40	М132; М139; Ml 4 0	GFTFSSYTMS (43)	AIDHGGGRTYYPDSVKG (51)	HRGNPFDY (58)
Н41		GFTFSSYTMS (43)	AIDHGGGRTWYPDSVKG (52)	HRGNPFDY (58)
Н7 9	М133; М141=М707; М142	GFTFSSYTMS (43)	AIDHGGGQTLYPDSVKG (53)	HRGNPFDY (58)
Н145		GFTFSSYTMS (43)	YISGGGGQTLYPDSVKG (54)	HRGNPFDY (58)
Н190		GFTFSSYTMS (43)	TIDRGGGSTWYPDSVKG (55)	HRGNPFDY (58)
Н191	М134; М143; Ml 4 4;	GFTFSSYTMS (43)	AIDGGGGATYYPDSVKG (56)	HRGNPFDY (58)
Н192	М135; М145; Ml 4 6 ; М408=М708	GFTFSSYTMS (43)	VIDHGGGSTHYPDSVKG (57)	HRGNPFDY (58)
			X1IX2X3GGGX4TX5YPDSVKG (157)

Для последовательности SEQ ID NO:157 X₁ представляет собой А, Т, V или Y; X₂ представляет собой D или S; X₃ представляет собой G, H, R или S; X₄ представляет собой A, N, Q, R или S; а X₅ представляет собой Н, L, W или Y.

Таблица 36

2191 путь 1

VL		CDR-L1 (SEQ ID NO:)	CDR-L2 (SEQ ID NO:)	CDR-L3 (SEQ ID NO: )
		Кабат	Кабат	Кабат
L20	материнский	RASKSVSTSGYSFMH	LASNLES	QHSRELPWT (75)
	мышиный M41	(59)	(67)
L42	HFR (M91)	RASKSVSTSGYSFMH	LASNLES	QHSRELPWT (75)
		(59)	(67)
L244	M427	RASKSVSAWGYSFMH	VASRLES	QHSRELPWT (75)
		(60)	(68)
L245	M429=M696	RASKSVSHVRWS FMH	LASKLES	QHSRELPWT (75)
		(61)	(69)
L249	M488=M694;	RASKSVSEGRWS FMH	VASRLES	QHSRELPWT (75)
	M492=M695;	(62)	(68)
	M526
L250	M489; M493;	RASKSVSLDRWS FMH	LASNLES	QHSRELPWT (75)
	M501	(63)	(67)
		RASKSVSX!X2X3X4SFMH
		(158)

Для последовательности SEQ ID NO: 158 X₁ представляет собой А, Е, Н, L, Т или Y; X₂ представляет собой D, G, I, S, V или W; X₃ представляет собой G или R; a X₄ представляет собой W или Y.

- 40 030828

Таблица 37

2191 путь 2

VL		CDR-L1 (SEQ ID NO: )	CDR-L2 (SEQ ID NO:)	CDR-L3 (SEQ ID NO:)
		Кабат	Кабат	Кабат
L20	материнский мышиный М41	RASKSVSTSGYSFMH (59)	LASNLES (67)	QHSRELPWT (75)
L59		RASKSVSTSGYSFMH (59)	VGNRLED (70)	QHSRELPWT (75)
L62		RASKSVSTSGYSFMH (59)	VGDRRQE (71)	QHSRELPWT (75)
L124		RASKSVSTSGYSFMH (59)	VGSRMAF (72)	QHSRELPWT (75)
L131		RASKSVSTSGYSFMH (59)	VGDRANW (73)	QHSRELPWT (75)
L137	М13 8; М408=М708	RASKSVSTSGYSFMH (59)	VGSRLDY (74)	QHSRELPWT (75)
L160	М137; М160; М142; М143; М146	RASKSVSYVRWS FMH (64)	LASNLES (67)	QHSRELPWT (75)
L172		RASKSVSHIRWSFMH (65)	LASNLES	QHSRELPWT (75)
L173	М136; М139; М141=М707; М144; М145	RASKSVSHVRWSFMH (66)	LASNLES	QHSRELPWT (75)

Таблица 38

Последовательности вариабельных участков белков , и антител

SEQ ID NO	Клон	Последовательность (последовательности CDR подчеркнуты)	Характеристики или происхождение	Комментарии
174	Человеческий CD27 ECD	TPAPKSCPERHYWAQGKLCCQMCEPGTFL VKDCDQHRKAAQCDPCIPGVSFSPDHHTR PHCESCRHCNSGLLVRNCTITANAECACR NGWQCRDKECTECDPLPNPSLTARSSQAL SPHPQPTHLPYVSEMLEARTAGHMQTLAD FRQLPARTLSTHWPPQRSLCSSDFIRILH ННННН	ECD: 1-173, His6
175	Человеческий CD27 без ECD	TPAPKSCPERHYWAQGKLCCQMCEPGTFL VKDCDQHRKAAQCDPCIPGVSFSPDHHTR PHCESCRHCNSGLLVRNCTITANAECACR NGWQCRDKECTECDPLPNPSLTARSSQAL SPHPQLEVLFQGPHHHHHH	ECD: 1-121, сайт расщепления, His6
176	Человеческий CD27 без ECD	TPAPKSCPERHYWAQGKLCCQMCEPGTFL VKDCDQHRKAAQCDPCIPGVSFSPDHHTR PHCESCRHCNSGLLVRNCTITANAECACR NGWQCRDKECTECDGGHHHH	ECD:1-101	Proteos
150	Человеческий CD70 ECD	MPEEGSGCSVRRRPYGCVLRALVPLVAGL VICLWCIQRFAQAQQQLPLESLGWDVAE LQLNHTGPQQDPRLYWQGGPALGRS FLHG PELDKGQLRIHRDGIYMVHIQVTLAICSS TTASRHHPTTLAVGICSPASRSISLLRLS FHQGCTIASQRLTPLARGDTLCTNLTGTL LPSRNTDETFFGVQWVRP	ECD
76	С2186 Вариабельный участок тяжелой цепи (НС)	QVQLQQPGAELVKPGASVKLSCKASGYTF TNYWMNWVKQ RP GRGLEWIGRIΗ P S D S ET		МЫШИНЫЙ
HYNQNFKSKATLTVDKSSSTAYIQLSSLT
SEDSAVYYCARPVLYGDYGFPCWGQGTLV TVSA
77	С2186 Вариабельный участок легкой цепи (LC)	DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSV DYDGDSYMNWYQQKPGQPPKLLIYAASNL		мышиный
ESGIPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDA ATYYCQQSNEDPYTFGGGTKLEIK

78	С2192 Вариабельный участок тяжелой цепи (НС)	QVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYAF SSSWMNWVKQRPGKGLEWIGRIYPGDGDT		МЫШИНЫЙ
NYNGKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLT
SEDSAVYFCARRWDGGNYFFDYWGQGTTL TVSS
79	С2192 Вариабельный участок легкой цепи (LC)	DIVMTQSHKFMSTSVGDRVSITCMASQDV GTAVAWYQRRPGQSPKLLIYWTSTRHTGV PDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLADYF CQQYSSYPLTFGSGTKLEIK		мышиный
80	С2177 Вариабельный участок тяжелой цепи (НС)	QVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYAF SSSWMNWVKQRPGKGLEWIGRIYPGDGDT	H7	мышиный
NYNGKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLT
SEDSAVYFCARSDYYGDYGFAYWGQGTLV TVSA
81	С2177 Вариабельный участок легкой цепи (LC)	DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSV DYAGDSYMNWYQQKPGQPPKLLIYAASNL	L18	мышиный
ESGIPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDA ATYYCQQSNEDPYTFGGGTKLEIK
82	L35	DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKASQSV DYAGDSYMNWYQQKPGQPPKLLIYAASNL	4-1/2	HFR выбранный для С2177 AM пути 1
ESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDV AVYYCQQSNEDPYTFGQGTKLEIK
83	L255	DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKASQSV DYAGDSFMNWYQQKPGQPPKLLIYAASNL		VL в клонах М584, М600 AM; в вариантах М678, Мб 80 РТМ
ESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDV AVYYCQQSNEDPYTFGQGTKLEIK
84	L256	DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKASQSV DYAGDSWMNWYQQKPGQPPKLLIYVASNL		созревааффинности С2177
ESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDV AVYYCQQSNEDPYTFGQGTKLEIK
85	L257	DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKASQSV DYAGDSWMNWYQQKPGQPPKLLIYTASNL		VL в клонах М558, М596 AM
ESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLLAEDV AVYYCQQSNEDPYTFGQGTKLEIK
86	L258	DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKASQSV DYAGSSFMNWYQQKPGQPPKLLIYTASNL		путь 1 созревания афинности С2177
ESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDV AVYYCQQSNEDPYTFGQGTKLEIK
87	L260	DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKASQSV DWAGHSWMNWYQQKPGQPPKLLIYTASNL		путь 1 созревания афинности С2177
ESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDV AVYYCQQSNEDPYTFGQGTKLEIK
88	L261	DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKASQSV DYAGSSFMNWYQQKPGQPPKLLIYEASNL		путь 1 созревания афинности С2177
ESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDV AVYYCQQSNEDPYTFGQGTKLEIK
89	L267	DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKASQSV DYAGESFMNWYQQKPGQPPKLLIYAASNL		VL в вариантах М703, М706 РТМ
ESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDV AVYYCQQSNEDPYTFGQGTKLEIK
90	L36	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQSV DYAGDSYMNWYQQKPGKAPKLLIYAASNL	012/2	HFR выбранный для С2177 AM пути 2
ESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDF ATYYCQQSNEDPYTFGQGTKLEIK
91	L216	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQSV DYFSESYMNWYQQKPGKAPKLLIYAASNL		С2177 AM путь 2
ESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDF ATYYCQQSNEDPYTFGQGTKVEIK
92	L217	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQSV DYAHESFMNWYQQKPGKAPKLLIYAASNL		VL в клоне М166 AM
ESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDF ATYYCQQSNEDPYTFGQGTKVEIK
93	L218	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQSV DYFGDSLMNWYQQKPGKAPKLLIYAASNL		С2177 AM путь 2
ESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDF ATYYCQQSNEDPYTFGQGTKVEIK
94	L219	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQSV DYAGDSFMNWYQQKPGKAPKLLIYAASNL		VL в клонах М160, М169 AM
ESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDF ATYYCQQSNEDPYTFGQGTKVEIK
95	L219 РТМ	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQSV DYAGESFMNWYQQKPGKAPKLLIYAASNL		VL в вариантах М668, М669, М670, Мб 71 РТМ
ESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDF ATYYCQQSNEDPYTFGQGTKVEIK

96	L266	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQSV DYAGeSFMNWYQQKPGKAPKLLIYAASNL ESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDF ATYYCQQSNEDPYTFGQGTKVEIK		VL в вариантах M668, M669, M670, Мб 71 PTM
97	L220	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQSV DYAGDSYMNWYQQKPGKAPKLLIYAASNL ESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDF ATYYCQQSNEDPYTFGQGTKVEIK		VL в клоне М158 AM
98	L221	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQSV DYFRTSFMNWYQQKPGKAPKLLIYAASNL ESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDF ATYYCQQSNEDPYTFGQGTKVEIK		С2177 AM путь 2
99	L222	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQSV DYVGTSFMNWYQQKPGKAPKLLIYAASNL ESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDF ATYYCQQSNEDPYTFGQGTKVEIK		С2177 AM путь 2
100	L223	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQSV DYWSDSFMNWYQQKPGKAPKLLIYAASNL ESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDF ATYYCQQSNEDPYTFGQGTKVEIK		С2177 AM путь 2
101	L224	DIQMTQ S P S S L SASVGDRVAIT CKASQSV DYYNSSFMNWYQQKPGKAPKLLIYAASNL ESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDF ATYYCQQSNEDPYTFGQGTKVEIK		С2177 AM путь 2
102	H24	EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYAF SSSWMNWVRQMPGKGLEWMGRIYPGDGDT NYNGKFKGQVTISADKSISTAYLQWSSLK ASDTAMYYCARSDYYGDYGFAYWGQGTLV TVSS	IGHV5-51/4	Выбранный HFR С2177 AM
103	H221	EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYAF SSSWMNWVRQMPGKGLEWMGRIYSGDGDT NYNGKFKGQVTISADKSISTAYLQWSSLK ASDTAMYYCARSDYYGDYGFAYWGQGTLV TVSS		VH в клонах Ml 69 AM
104	H257	EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYAF SSSWMNWVRQMPGKGLEWMGRIYSGDaDT NYaqKFKGQVTISADKSISTAYLQWSSLK ASDTAMYYCARSDYYGDYGFAYWGQGTLV TVSS		VH в варианте Мб 70 PTM
105	H258	EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYAF SSSWMNWVRQMPGKGLEWMGRIYSGDaDT NYNqKFKGQVTISADKSISTAYLQWSSLK ASDTAMYYCARSDYYGDYGFAYWGQGTLV TVSS		VH в варианте Мб 71 PTM
106	H25	QVQ LVQ S GAEVKK P GASVKVS C KAS GYAF SSSWMNWVRQAPGQGLEWMGRIYPGDGDT NYNGKFKGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLR SEDTAVYYCARSDYYGDYGFAYWGQGTLV TVSS	IGHV1-46/4	HFR, выбранный для С2177 AM, путь
107	H196	QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYAF SSSWMNWVRQAPGQGLEWMGRIYSGDGDT NYNGKFKGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLR SEDTAVYYCARSDYYGDYGFAYWGQGTLV TVSS		VH в клонах М158, М160 AM
108	H255	QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYAF SSSWMNWVRQAPGQGLEWMGRIYSGDADT NYAQKFKGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLR SEDTAVYYCARSDYYGDYGFAYWGQGTLV TVSS		VH в вариантах М668, Мб 72 РТМ
109	H256	QVQLVQ S GAEVKK P GASVKVS C KAS GYAF SSSWMNWVRQAPGQGLEWMGRIYSGDADT NYNQKFKGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLR SEDTAVYYCARSDYYGDYGFAYWGQGTLV TVSS		VH в вариантах М669, Мб 73 РТМ
110	H197	QVQ LVQ S GAEVKK P GASVKVS C KAS GYAF S S SWMNWVRQAPGQGLEWMGRIYQGDGDT NYNGKFKGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLR SEDTAVYYCARSDYYGDYGFAYWGQGTLV TVSS		КЛОН С2177 ΆΜ
111	H2 8	EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYAF SSSWMNWVRQMPGKGLEWMGRIYPGDGDT NYS P S FQGQVTISADKSISTAYLQWS S LK ASDTAMYYCARSDYYGDYGFAYWGQGTLV TVSS	IGHV5-51c/4	HFR, выбранный для созревания аффинности С2177 (AM) путь 1

112	Н236	EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYAF SSSWMNWVRQMPGKGLEWMGRIYPGDGDT		VH в клоне M584 AM путь 1
NYS P S FQGQVTISADKSISTAYLQWS S LK ASDTAMYYCARADYYGDYGFGYWGQGTLV TVSS
113	Н237	EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYAF S S SWMNWVRQMPGKGLEWMGRIFVRDGDT		клон C2177 AM путь 1
NYS P S FQGQVTISADKSISTAYLQWS S LK ASDTAMYYCARSDYYGDYGFAYWGQGTLV TVSS
114	Н238	EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYAF S S SWMNWVRQMPGKGLEWMGRIYVGDGDT		клон С2177 AM путь 1
NYS P S FQGQVTISADKSISTAYLQWS S LK ASDTAMYYCARSDYYGDYGFAYWGQGTLV TVSS
115	Н239	EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYAF S S SWMNWVRQMPGKGLEWMGRIYAGDGDT		VH в клоне М596 AM путь 1
NYS P S FQGQVTISADKSISTAYLQWS S LK ASDTAMYYCARSDYYGDYGFAYWGQGTLV TVSS
116	Н240	EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYAF S S SWMNWVRQMPGKGLEWMGRIYARDGDT		VH в клонах М558, М600 AM, путь 1
NYS P S FQGQVTISADKSISTAYLQWS S LK ASDTAMYYCARSDYYGDYGFAYWGQGTLV TVSS
117	Н241	EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYAF S S SWMNWVRQMPGKGLEWMGRIYGRDGDT		клон С2177 AM путь 1
NYS P S FQGQVTISADKSISTAYLQWS S LK ASDTAMYYCARSDYYGDYGFAYWGQGTLV TVSS
118	Н242	EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYAF S S SWMNWVRQMPGKGLEWMGRIYANDGDT		клон С2177 AM путь 1
NYS P S FQGQVTISADKSISTAYLQWS S LK ASDTAMYYCARSDYYGDYGFAYWGQGTLV TVSS
119	Н243	EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYAF S S SWMNWVRQMPGKGLEWMGRIYGGDGDT		клон С2177 AM путь 1
NYS P S FQGQVTISADKSISTAYLQWS S LK ASDTAMYYCARSDYYGDYGFAYWGQGTLV TVSS
120	Н244	EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYAF SSSWMNWVRQMPGKGLEWMGRIYSGDGDT		клон V2177 AM путь 1
NYS P S FQGQVTISADKSISTAYLQWS S LK ASDTAMYYCARSDYYGDYGFAYWGQGTLV TVSS
121	Н245	EVQLVQSVAEVKKPGESLKISCKGSGYAF SSSWMNWVRQMPGKGLEWMGRIYSRDGDT		клон С2177 AM путь 1
NYS P S FQGQVTISADKSISTAYLQWS S LK ASDTAMYYCARSDYYGDYGFAYWGQGTLV TVSS
122	Н259	EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYAF S S SWMNWVRQMPGKGLEWMGRIYAGDGDT		VH в мутанте М678 РТМ
AYS P S FQGQVTISADKSISTAYLQWS SLK ASDTAMYYCARSDYYGDYGFAYWGQGTLV TVSS
123	Н260	EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYAF S S SWMNWVRQMPGKGLEWMGRIYAGDGDT		VH в мутанте М680 РТМ
NYAP S FQGQVTISADKSISTAYLQWS S LK ASDTAMYYCARSDYYGDYGFAYWGQGTLV TVSS
124	Н270	EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYAF S S SWMNWVRQMPGKGLEWMGRIYAGDADT		VH в мутанте М703 РТМ
AYS P S FQGQVTISADKSISTAYLQWS S LK ASDTAMYYCARSDYYGDYGFAYWGQGTLV TVSS
125	Н272	EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYAF S S SWMNWVRQMPGKGLEWMGRIYAGDADT		VH в мутанте М706 РТМ
NYAP S FQGQVTISADKSISTAYLQWS S LK ASDTAMYYCARSDYYGDYGFAYWGQGTLV TVSS

Таблица 39

SEQ ID	Клон	Последовательность	Характеристики или происхождение	Комментарии
126	C2191 Вариабель ный	EVKLVESGGGLVKPGGSLKLSCA ASGFTFSSYTMSWVRQTPEKRLE WVAYISSGGGNTYYPDSVKGRFT	НЮ	мышиный
участок тяжелой цепи	ISRDNARNTLYLQMSSLRSEDTA MYYCSRHRGNPFDYWGQGTTLTV
	(НС)	SS
	С2191	DIVLTQSPASLAVSLGQRATISC
	Вариабельный	RASKSVSTSGYSFMHWYQQKPGQ
127	участок	PPKLLIYLASNLESGVPARFSGS	L20	мышиный
	легкой цепи	GSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYC
	(LC)	QHSRELPWTFGGGTKLEIK
		EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCA ASGFTFSSYTMSWVRQAPGKGLE		HFR,
		WVSYISSGGGNTYYPDSVKGRFT	IGHV3-23/4	выбран-
128	НЗО	ISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTA VYYCARHRGNPFDYWGQGTLVTV	ный для С2191 AM
		SS		путь 2
		EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCA		VH в
		ASGFTFSSYTMSWVRQAPGKGLE		варианте
129	Н79	WVSAIDHGGGQTLYPDSVKGRFT ISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTA		М141 AM, путь 2.
		VYYCARHRGNPFDYWGQGTLVTV		Таблица
		SS		29
		EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCA		VH в
		ASGFTFSSYTMSWVRQAPGKGLE		варианте
130	Н192	WVSVIDHGGGSTHYPDSVKGRFT ISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTA		М408 AM, путь 2.
		VYYCARHRGNPFDYWGQGTLVTV		Таблица
		SS		29
131	Н31	QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCA ASGFTFSSYTMSWIRQAPGKGLE WVSYISSGGGNTYYPDSVKGRFT ISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTA VYYCARHRGNPFDYWGQGTLVTV SS QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCA	IGHV3-11/4	HFR выбранный для С2191 AM путь 1
		ASGFTFSSYGMSWIRQAPGKGLE		VH в
132	Н222	WVSYIDRGGGVTIYPDSVKGRFT		варианте
ISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTA		М526 AM,
		VYYCARHRGNPFDYWGQGTLVTV		путь 1
		SS
133	Н227	QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCA ASGFTFSSYGMSWIRQAPGKGLE WVSYIDEGGGQTIYPDSVKGRFT ISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTA VYYCARHRGNPFDYWGQGTLVTV SS		VH в вариантах М427, М429, М488, М489 AM, путь 1
134	Н228	QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCA ASGFTFSSYSMSWIRQAPGKGLE WVSYIDAGGGFTIYPDSVKGRFT ISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTA VYYCARHRGNPFDYWGQGTLVTV SS QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCA		VH в вариантах М492, М493 AM, путь 1
		ASGFTFSSYSMSWIRQAPGKGLE		VH в
135	Н231	WVSHIDAGGGRTWYPDSVKGRFT ISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTA		варианте М501 AM,
		VYYCARHRGNPFDYWGQGTLVTV		путь 1
		SS
		QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCA
136	Н232	ASG FT FS SY PMSWIRQAPGKGLE WVSHIATGGGNTYYPDSVKGRFT ISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTA VYYCARHRGNPFDYWGQGTLVTV SS		клон С2191 AM, путь 1

- 45 030828

137	L40	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC RASKSVSTSGYSFMHWYQQKPGK	IGKVO12/1	HFR, выбранный для C2191 AM, путь 2
APKLLIYLASNLESGVPSRFSGS GSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QHSRELPWTFGQGTKVEIK
138	L137	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC RASKSVSTSGYSFMHWYQQKPGK APKLLIYVGSRLDYGVPSRFSGS GSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QHSRELPWTFGQGTKVEIK		VL в варианте M408 AM, путь 2. Таблица 29
139	L173	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC RAS KSVS HVRWS FMHWYQQKPGK APKLLIYLASNLESGVPSRFSGS GSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QHSRELPWTFGQGTKVEIK		VL в варианте М141 AM, путь 2. Таблица 29
		DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC		HFR,
		RASKSVSTSGYSFMHWYQQKPGK		выбран-
140	L42	APKLLIYLASNLESGVPSRFSGS	IGKVO8/1	ный для
		GSGTDFTFTISSLQPEDIATYYC		С2191 AM
		QHSRELPWTFGQGTKVEIK		путь 1
141	L244	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC RASKSVSAWGYSFMHWYQQKPGK APKLLIYVASRLESGVPSRFSGS GSGTDFTFTISSLQPEDIATYYC QHSRELPWTFGQGTKVEIK		VL в варианте М427 AM, путь 1
142	L245	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC RAS KSVS HVRWS FMHWYQQKPGK APKLLIYLASKLESGVPSRFSGS GSGTDFTFTISSLQPEDIATYYC QHSRELPWTFGQGTKVEIK		VL в варианте М429 AM, путь 1
143	L249	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC RASKSVSEGRWSFMHWYQQKPGK APKLLIYVASRLESGVPSRFSGS GSGTDFTFTISSLQPEDIATYYC QHSRELPWTFGQGTKVEIK		VL в вариантах М488, М492, М526 AM, путь 1
144	L250	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC RASKSVSLDRWSFMHWYQQKPGK APKLLIYLASNLESGVPSRFSGS GSGTDFTFTISSLQPEDIATYYC QHSRELPWTFGQGTKVEIK		VL в вариантах М489, М493, М501 AM, путь 1
		EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCA		HFR; VH в
		ASGFTFSSYTMSWVRQAPGKGLE		М131;
145	Н39	WVSYISSGGGNTYYPDSVKGRFT ISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTA		клоны М136-138
		VYYCARHRGNPFDYWGQGTLVTV		AM, путь
		SS		2
		EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCA		VH в
		ASGFTFSSYTMSWVRQAPGKGLE		М132;
146	Н40	WVSAIDHGGGRTYYPDSVKGRFT ISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTA		М13 9; клоны
		VYYCARHRGNPFDYWGQGTLVTV		М140 AM,
		SS		путь 2
		EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCA		VH в
		ASGFTFSSYTMSWVRQAPGKGLE		М134;
147	Н191	WVSAIDGGGGATYYPDSVKGRFT ISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTA		М143; М14 4;
		VYYCARHRGNPFDYWGQGTLVTV		клоны AM,
		SS		путь 2
				VL в
148	L160	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC RASKSVSYVRWSFMHWYQQKPGK APKLLIYLASNLESGVPSRFSGS GSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QHSRELPWTFGQGTKVEIK		М137; М160; М142; М143; клоны М146, путь 2

- 46 030828

Белки CD27 и CD70

Таблица 40

SEQ ID NO	Описание	Характеристики, аббревиатуры
149	Человеческий CD27 прополипептид	1-20 сигнал, 21-191 внеклеточный домен, 192-212 трансмембранный, 213260 внутриклеточный TPAPKSCPER HYWAQGKLCC QMCEPGTFLV KDCDQHRKAA QCDPCIPGVS FSPDHHTRPH CESCRHCNSG LLVRNCTITA NAECACRNGW QCRDKECTEC DPLPNPSLTA RSSQALSPHP QPTHLPYVSE MLEARTAGHM QTLADFRQLP ARTLSTHWPP QRSLCSSDFI RILVIFSGMF LVFTLAGALF LHQRRKYRSN KGESPVEPAE PCRYSCPREE EGSTIPIQED YRKPEPACSP
150	Человеческий CD70 прополипептид	1-17 внутриклеточный, 18-38 трансмембранный и 39-193 внеклеточный MPEEGSGCSV RRRPYGCVLR AALVPLVAGL VICLVVCIQR FAQAQQQLPL ESLGWDVAEL QLNHTGPQQD PRLYWQGGPA LGRSFLHGPE LDKGQLRIHR DGIYMVHIQV TLAICSSTTA SRHHPTTLAV GICSPASRSI SLLRLSFHQG CTIASQRLTP LARGDTLCTN LTGTLLPSRN TDETFFGVQW VRP

Таблица 41

Последовательности константных участков антитела

Описание	Последовательность	SEQ ID NO:
Константный участок человеческой тяжелой цепи IgG4 А1а/А1а Ser - Pro	astkgpsvfplapcsrstsestaalgclvkdyfpepvt vswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslsswtvpsssl gt ktyt cnvdhkps nt kvdkrve s kygppcppcpapea aggpsvf lfppkpkdtlmisrtpevtcwvdvsqedpe vqf nwyvdgvevhnaktkpreeqf nstyrwsvltvlh qdwlngkeykckvsnkglpssiektiskakgqprepqv ytlppsqeemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngq pennykttppvldsdgsfflysrltvdksrwqegnvfs csvmhealhnhytqkslslslgk	159
Константный участок человеческой легкой цепи kappa	rtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreak vqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlsk adyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec	160

- 47 030828

Таблица 42

Нуклеотидные последовательности антитела

Описание	Последовательность	SEQ ID NO:
Последовательность , кодирующая легкую цепь (кодирует последовательность легкой цепи SEQ ID N0: 160)	GACATCCAGATGACCCAGAGCCCCAGCAGCCTGAGCGCCAGC GTGGGCGACCGGGTGACCATCACCTGCCGGGCCAGCAAGAGC GTGAGCGAGGGGCGATGGAGCTTCATGCACTGGTACCAGCAG AAGCCCGGCAAGGCCCCCAAGCTGCTGATCTACGTGGCCAGC AGACTGGAGAGCGGCGTGCCCAGCCGGTTCAGCGGCAGCGGC AGCGGCACCGACTTCACCTTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCC GAGGACATCGCCACCTACTACTGCCAGCACAGCCGGGAGCTG CCCTGGACCTTCGGCCAGGGCACCAAGGTGGAGATCAAGCGT ACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGAT GAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTG AATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTG GATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACA GAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACC CTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTAC GCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACA	163
Последовательность , коодирующая тяжелую цепь (кодирует последовательность тяжелой цепи SEQ ID N0: 159)	AAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT CAGGTGCAGCTGGTGGAGAGCGGCGGCGGCCTGGTGAAGCCC GGCGGCAGCCTGCGGCTGAGCTGCGCCGCCAGCGGCTTCACC TTCAGCAGCTACGGGATGAGCTGGATCCGGCAGGCCCCCGGC AAGGGCCTGGAGTGGGTGAGCTACATCGATGAGGGCGGCGGC CAGACCATCTACCCCGACAGCGTGAAGGGCCGGTTCACCATC AGCCGGGACAACGCCAAGAACAGCCTGTACCTGCAGATGAAC AGCCTGCGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCCGG CACCGGGGCAACCCCTTCGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTG GTGACCGTGAGCAGCGCTTCCACCAAGGGCCCATCCGTCTTC CCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCC GCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTG ACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCAC ACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTC AGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACGAAA ACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAG GTGGACAAGAGAGTTGAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCCA CCATGCCCAGCACCTGAGGCCGCCGGGGGACCATCAGTCTTC CTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGG ACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAA GACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAG GTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAAC AGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAG GACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAAC AAAGGCCTCCCGTCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCC AAAGGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCA TCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGC CTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGG GAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCT CCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAGG CTAACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGGAATGTCTTC TCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACA CAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCTGGGTAAA	164

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110>	Janssen Biotech, Inc.
<120>	Человеческие анитела к CD27, методы и применение
<130>	JBI5001USNP
<140> <141>	Переуступка прав 2013-03-14
<150> <151>	61611332 2012-03-15
<160>	176

<170>	Патент, версия 3.5
<210> <211> <212> <213>	1 5 PRT Синтетическая последовательность

<220>

<223> Вариабельная последовательность тяжелой цепи CDR <400>1

Ser Ser Trp Met Asn

<210> <211> <212> <213>

2 10 PRT Синтетическая последовательность

<220>

<223> Вариабельная последовательность тяжелой цепи CDR <400>2

Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Ser Trp Met Asn

510 <210>3 <211>17 <212> PRT <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> Вариабельная последовательность тяжелой цепи CDR <400> 3

Arg Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe Lys 1 5 10 15

Gly

- 49 030828

<210> <211> <212> <213>

4 12 PRT Синтетическая последовательность

<220> <223>	Вариабельная последовательность тяжелой цепи
<400>	4

Arg Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Ser

1	5 10
<210> <211> <212> <213>	5 12 PRT Синтетическая последовательность

<220> <223>	Вариабельная последовательность тяжелой цепи CDR
<400>	5

Arg Ile Phe Val Arg Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Ser

1	5 10
<210> <211> <212> <213>	6 12 PRT Синтетическая последовательность

<220> <223>	Вариабельная последовательность тяжелой цепи CDR
<400>	6

Arg Ile Tyr Val Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Ser

1	5 10
<210> <211> <212> <213>	7 12 PRT Синтетическая последовательность

<220> <223>	Вариабельная последовательность тяжелой цепи CDR
<400>	7

Arg Ile Tyr Ala Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Ser

1	5 10
<210> <211> <212> <213>	8 12 PRT Синтетическая последовательность

<220>

- 50 030828 <223> Вариабельная последовательность тяжелой цепи CDR <400>8

Arg Ile Tyr Ala Arg Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Ser

510 <210>9 <211> 12 <212> PRT <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> Вариабельная последовательность тяжелой цепи CDR <400> 9

Arg Ile Tyr Gly Arg Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Ser

5 10 <210> 10 <211> 12 <212> PRT <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> Вариабельная последовательность тяжелой цепи CDR <400> 10

Arg Ile Tyr Ala Asn Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Ser

5 10 <210> 11 <211> 12 <212> PRT <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> Вариабельная последовательность тяжелой цепи CDR <400> 11

Arg Ile Tyr Gly Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Ser

5 10 <210> 12 <211> 12 <212> PRT <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> Вариабельная последовательность тяжелой цепи CDR <400> 12

Arg Ile Tyr Ser Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Ser

5 10

- 51 030828

<210> <211> <212> <213>

13 12 PRT Синтетическая последовательность

<220> <223>	Вариабельная последовательность тяжелой цепи CDR
<400>	13

Arg Ile Tyr Ser Arg Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Ser

1	5 10
<210> <211> <212> <213>	14 12 PRT Синтетическая последовательность

<220> <223>	Вариабельная последовательность тяжелой цепи CDR
<400>	14

Arg Ile Tyr Ala Gly Asp Gly Asp Thr Ala Tyr Ser

1	5 10
<210> <211> <212> <213>	15 12 PRT Синтетическая последовательность

<220> <223>	Вариабельная последовательность тяжелой цепи CDR
<400>	15

Arg Ile Tyr Ala Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Ala

1	5 10
<210> <211> <212> <213>	16 12 PRT Синтетическая последовательность

<220> <223>	Вариабельная последовательность тяжелой цепи CDR
<400>	16

Arg Ile Tyr Ala Gly Asp Ala Asp Thr Ala Tyr Ser

1	5 10
<210> <211> <212> <213>	17 12 PRT Синтетическая последовательность

<220>

- 52 030828

<223>	Вариабельная последовательность	тяжелой	цепи	CDR
<400>	17
Arg Ile	Tyr Ala Gly Asp Ala Asp Thr Asn	Tyr Ala
1	5 10
<210>	18
<211>	17
<212>	PRT
<213>	Синтетическая последовательность
<220>
<223>	Вариабельная последовательность	тяжелой	цепи	CDR
<400>	18
Arg Ile	Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn	Tyr Asn	Gly	Lys	Phe Lys
1	5 10				15
Gly

<210> 19 <211> 17 <212> PRT <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> Вариабельная последовательность тяжелой цепи CDR <400>19

Arg Ile Tyr Ser Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe Lys

5 1015

Gly <210> 20 <211>17 <212> PRT <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> Вариабельная последовательность тяжелой цепи CDR <400> 20

Arg Ile Tyr Ser Gly Asp Ala Asp Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Lys

5 10 15

Gly <210> 21

- 53 030828 <211> 17 <212> PRT <213> Синтетическая последовательность <220>

<223>	Вариабельная последовательность	тяжелой цепи	CDR
<400>	21
Arg Ile	Tyr Ser Gly Asp Ala Asp	Thr Asn	Tyr Asn Gln	Lys	Phe Lys
1	5	10			15
Gly

<210> 22 <211> 17 <212> PRT <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> Вариабельная последовательность тяжелой цепи CDR <400>22

Arg Ile Tyr Gln Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe Lys

5 1015

Gly <210>23 <211> 11 <212> PRT <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> Вариабельная последовательность тяжелой цепи CDR <400>23

Ser Asp Tyr Tyr Gly Asp Tyr Gly Phe Ala Tyr

510

<210> <211> <212> <213>

24 15 PRT Синтетическая последовательность

<220>

<223> Вариабельная последовательность легкой цепи CDR <400>24

Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Ala Gly Asp Ser Tyr Met

510

Asn

- 54 030828 <210> 25 <211> 15 <212> PRT <213> Синтетическая последовательность <220>

<223>	Вариабельная последовательность	легкой цепи	CDR
<400>	25
Lys Ala	Ser Gln Ser Val	Asp Tyr Ala Gly	Asp Ser Phe	Met	Asn
1	5	10			15

<210> 26 <211> 15 <212> PRT <213> Синтетическая последовательность <220>

<223>

Вариабельная последовательность легкой цепи CDR <400>26

Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Ala Gly Asp Ser Trp Met

510

Asn

<210>	27
<211>	15
<212>	PRT
<213>	Синтетическая	последовательность
<220>
<223>	Вариабельная	последовательность	легкой цепи	CDR
<400>	27
Lys Ala	Ser Gln Ser Val Asp Tyr Ala Gly	Ser Ser Phe	Met	Asn
1	5	10			15

<210> 28 <211>15 <212> PRT <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> Вариабельная последовательность легкой цепи CDR <400> 28

Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Trp Ala Gly His Ser Trp Met Asn

5 10 15

<210>	29
<211>	15
<212>	PRT
<213>	Синтетическая	последовательность
<220> <223>	Вариабельная	последовательность легкой цепи CDR

- 55 030828 <400>29

Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Ala Gly Glu Ser Phe Met

510

Asn <210>30 <211>15 <212> PRT <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> Вариабельная последовательность легкой цепи CDR <400> 30

Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Phe Ser Glu Ser Tyr Met Asn 1 5 10 15

<210>	31
<211>	15
<212>	PRT
<213>	Синтетическая	последовательность
<220>
<223>	Вариабельная	последовательность	легкой цепи	CDR
<400>	31
Lys Ala	Ser Gln Ser Val Asp Tyr Ala His	Glu Ser Phe	Met	Asn
1	5	10			15

<210>	32
<211>	15
<212>	PRT
<213>	Синтетическая	последовательность
<220>
<223>	Вариабельная	последовательность	легкой цепи	CDR
<400>	32
Lys Ala	Ser Gln Ser Val Asp Tyr Phe Gly	Asp Ser Leu	Met	Asn
1	5	10			15

<210>	33
<211>	15
<212>	PRT
<213>	Синтетическая	последовательность
<220>
<223>	Вариабельная	последовательность	легкой цепи	CDR
<400>	33
Lys Ala	Ser Gln Ser Val Asp Tyr Phe Arg	Thr Ser Phe	Met	Asn
1	5	10			15

- 56 030828 <210> 34 <211> 15 <212> PRT <213> Синтетическая последовательность <220>

<223>	Вариабельная последовательность	легкой цепи	CDR
<400>	34
Lys Ala	Ser Gln Ser Val Asp Tyr Val	Gly	Thr Ser Phe	Met	Asn
1	5	10			15

<210>	35
<211>	15
<212>	PRT
<213>	Синтетическая	последовательность
<220>
<223>	Вариабельная	последовательность	легкой	цепи	CDR
<400>	35
Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Trp Ser	Asp Ser	Phe	Met	Asn
1	5	10				15
<210>	36
<211>	15
<212>	PRT
<213>	Синтетическая	последовательность
<220>
<223>	Вариабельная	последовательность	легкой	цепи	CDR
<400>	36
Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Tyr Asn	Ser Ser	Phe	Met	Asn
1	5	10				15
<210>	37
<211>	7
<212>	PRT
<213>	Синтетическая	последовательность
<220>
<223>	Вариабельная	последовательность	легкой	цепи	CDR

<400> 37

Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser

5

<210> <211> <212> <213>

38 7 PRT Синтетическая последовательность

<220> <223>

CD27 Sequence

- 57 030828 <400>38

Val Ala Ser Asn Leu Glu Ser <210>39 <211>7 <212> PRT <213> Синтетическая последовательность <220>

<223>	Вариабельная	последовательность	легкой	цепи	CDR
<400>	39
Thr Ala Ser Asn Leu Glu Ser
1	5
<210>	40
<211>	7
<212>	PRT
<213>	Синтетическая	последовательность
<220>
<223>	Вариабельная	последовательность	легкой	цепи	CDR
<400>	40

Glu Ala Ser Asn Leu Glu Ser <210>41 <211>9 <212> PRT <213> Синтетическая последовательность <220>

<223>	Вариабельная последовательность	легкой	цепи	CDR
<400>	41
Gln Gln Ser Asn Glu Asp Pro Tyr Thr
1	5
<210>	42
<211>	5
<212>	PRT
<213>	Синтетическая последовательность
<220>
<223>	Вариабельная последовательность	тяжелой	цепи	CDR

<400> 42

Ser Tyr Thr Met Ser

- 58 030828

<210> <211> <212> <213>

43 10 PRT Синтетическая последовательность

<220>

<223> Вариабельная последовательность тяжелой цепи CDR <400>43

Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Thr Met Ser

510

<210> <211> <212> <213>

44 10 PRT Синтетическая последовательность

<220>

<223> Вариабельная последовательность тяжелой цепи CDR <400>44

Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly Met Ser

510

<210> <211> <212> <213>

45 10 PRT Синтетическая последовательность

<220>

<223> Вариабельная последовательность тяжелой цепи CDR <400>45

Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ser Met Ser

510 <210>46 <211>17 <212> PRT <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> Вариабельная последовательность тяжелой цепи CDR <400>46

Tyr Ile Ser Ser Gly Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys 1 5 1015

Gly <210>47 <211>17 <212> PRT

- 59 030828 <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> Вариабельная последовательность тяжелой цепи CDR <400>47

Tyr Ile Asp Glu Gly Gly Gly Gln Thr Ile Tyr Pro Asp Ser Val Lys 1 5 1015

Gly <210>48 <211>17 <212> PRT <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> Вариабельная последовательность тяжелой цепи CDR <400>48

Tyr Ile Asp Ala Gly Gly Gly Phe Thr Ile Tyr Pro Asp Ser Val Lys 1 5 1015

Gly <210>49 <211>17 <212> PRT <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> Вариабельная последовательность тяжелой цепи CDR <400>49

His Ile Asp Ala Gly Gly Gly Arg Thr Trp Tyr Pro Asp Ser Val Lys

5 1015

Gly <210>50 <211>17 <212> PRT <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> Вариабельная последовательность тяжелой цепи CDR <400> 50

Tyr Ile Asp Arg Gly Gly Gly Val Thr Ile Tyr Pro Asp Ser Val Lys 1 5 10 15

- 60 030828

Gly <210>51 <211>17 <212> PRT <213> Синтетическая последовательность <220>

<223>	Вариабельная	последовательность	тяжелой цепи	CDR
<400>	51
Ala Ile	Asp His Gly	Gly Gly Arg Thr Tyr	Tyr Pro Asp	Ser	Val Lys
1	5	10			15

Gly <210>52 <211>17 <212> PRT <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> Вариабельная последовательность тяжелой цепи CDR <400>52

Ala Ile Asp His Gly Gly Gly Arg Thr Trp Tyr Pro Asp Ser Val Lys

5 1015

Gly <210>53 <211>17 <212> PRT <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> Вариабельная последовательность тяжелой цепи CDR <400>53

Ala Ile Asp His Gly Gly Gly Gln Thr Leu Tyr Pro Asp Ser Val Lys

5 1015

Gly <210>54 <211>17 <212> PRT

- 61 030828 <213> Синтетическая последовательность <220>

<223>	Вариабельная	последовательность	тяжелой	цепи	CDR
<400>	54
Tyr Ile	Ser Gly Gly	Gly Gly Gln Thr Leu	Tyr Pro	Asp	Ser	Val Lys
1	5	10				15

Gly <210> 55 <211> 17 <212> PRT <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> Вариабельная последовательность тяжелой цепи CDR <400>55

Thr Ile Asp Arg Gly Gly Gly Ser Thr Trp Tyr Pro Asp Ser Val Lys

5 1015

Gly <210>56 <211>17 <212> PRT <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> Вариабельная последовательность тяжелой цепи CDR <400> 56

Ala Ile Asp Gly Gly Gly Gly Ala Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys

5 10 15

Gly

<210> <211> <212> <213>	57 8 PRT Синтетическая	последовательность
<220>
<223>	Вариабельная	последовательность тяжелой цепи CDR
<400>	57
His Arg	Gly Asn Pro	Phe Asp Tyr
1	5
		- 62 -

<210> 58 <211> 15 <212> PRT <213> Синтетическая последовательность <220>

<223>	Вариабельная	последовательность	тяжелой	цепи	CDR
<400>	58
Arg Ala	Ser Lys Ser	Val Ser Thr Ser Gly	Tyr	Ser	Phe	Met	His
1	5	10					15
<210>	59
<211>	15
<212>	PRT
<213>	Синтетическая	последовательность
<220>
<223>	Вариабельная	последовательность	легкой	цепи	CDR
<400>	59
Arg Ala	Ser Lys Ser	Val Ser Ala Trp Gly	Tyr	Ser	Phe	Met	His
1	5	10					15
<210>	60
<211>	15
<212>	PRT
<213>	Синтетическая	последовательность
<220>
<223>	Вариабельная	последовательность	легкой	цепи	CDR
<400>	60
Arg Ala	Ser Lys Ser	Val Ser Ala Trp Gly	Tyr	Ser	Phe	Met	His
1	5	10					15

<210>	61
<211>	15
<212>	PRT
<213>	Синтетическая	последовательность
<220>
<223>	Вариабельная	последовательность	легкой цепи	CDR
<400>	61
Arg Ala	. Ser Lys Ser Val Ser Glu Gly Arg	Trp Ser Phe	Met	His
1	5	10			15

<210> <211> <212> <213>

62 15 PRT Синтетическая последовательность

- 63 030828 <220>

<223> Вариабельная последовательность легкой цепи CDR <400> 62

Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Leu Asp Arg

5 10

Trp Ser Phe Met

His

<210>	63
<211>	15
<212>	PRT
<213>	Синтетическая	последовательность
<220>
<223>	Вариабельная	последовательность	легкой цепи	CDR
<400>	63
Arg Ala	. Ser Lys Ser Val Ser Leu Asp Arg	Trp Ser Phe	Met	His
1	5	10			15

<210>	64
<211>	15
<212>	PRT
<213>	Синтетическая	последовательность
<220>
<223>	Вариабельная	последовательность	легкой цепи	CDR
<400>	64
Arg Ala	Ser Lys Ser Val Ser Tyr Val Arg	Trp Ser Phe	Met	His
1	5	10			15

<210>	65
<211>	15
<212>	PRT
<213>	Синтетическая	последовательность
<220>
<223>	Вариабельная	последовательность	легкой цепи	CDR
<400>	65
Arg Ala	Ser Lys Ser Val Ser His Ile Arg	Trp Ser Phe	Met	His
1	5	10			15

<210>	66
<211>	15
<212>	PRT
<213>	Синтетическая	последовательность
<220>
<223>	Вариабельная	последовательность	легкой цепи	CDR
<400>	66
Arg Ala	Ser Lys Ser Val Ser His Val Arg	Trp Ser Phe	Met	His
1	5	10			15

- 64 030828 <210> 67 <211> 7 <212> PRT <213> Синтетическая последовательность <220>

<223>	Вариабельная последовательность	легкой	цепи	CDR
<400>	67
Leu Ala	Ser Asn Leu Glu Ser
1	5
<210>	68
<211>	7
<212>	PRT
<213>	Синтетическая последовательность
<220>
<223>	Вариабельная последовательность	легкой	цепи	CDR
<400>	68
Leu Ala	Ser Lys Leu Glu Ser
1	5
<210>	69
<211>	7
<212>	PRT
<213>	Синтетическая последовательность
<220>
<223>	Вариабельная последовательность	легкой	цепи	CDR
<400>	69
Leu Ala	Ser Lys Leu Glu Ser
1	5
<210>	70
<211>	7
<212>	PRT
<213>	Синтетическая последовательность
<220>
<223>	Вариабельная последовательность	легкой	цепи	CDR

<400> 70

Val Gly Asn Arg Leu Glu Asp

5

<210> <211> <212> <213>

71 7 PRT Синтетическая последовательность

- 65 030828 <220>

<223>

Вариабельная последовательность легкой цепи CDR <400> 71

Val Gly Asp Arg Arg Gln Glu

5

<210> <211> <212> <213>	72 7 PRT Синтетическая	последовательность
<220>
<223>	Вариабельная	последовательность легкой цепи CDR
<400>	72
Val Gly Ser Arg Met Ala Phe
1	5

<210> <211> <212> <213>	73 7 PRT Синтетическая	последовательность
<220>
<223>	Вариабельная	последовательность легкой цепи CDR
<400>	73
Val Gly Asp Arg Ala Asn Trp
1	5

<210> <211> <212> <213>	74 7 PRT Синтетическая	последовательность
<220>
<223>	Вариабельная	последовательность легкой цепи CDR
<400>	74
Val Gly Ser Arg Leu	Asp Tyr
1	5

<210> <211> <212> <213>	75 9 PRT Синтетическая	последовательность
<220>
<223>	Вариабельная	последовательность легкой цепи CDR
<400>	75
Gln His	Ser Arg Glu	Leu Pro Trp Thr
1	5

- 66 030828 <210> 76 <211> 120 <212> PRT <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> CDR Вариабельная последовательность тяжелой цепи <400> 76

Gln 1

Val

Gln Leu

Gln 5

Gln Pro

Gly Ala Glu 10

Leu Val

Lys

Pro

Gly 15

Ala

Ser

Val

Lys

Leu

Ser

Cys

Lys

Ala

Ser

Gly

Tyr

Thr

Phe

Thr

Asn

Tyr

20

25

30

Trp

Met

Asn

Trp

Val

Lys

Gln

Arg

Pro

Gly

Arg

Gly

Leu

Glu

Trp

Ile

35

40

45

Gly

Arg

Ile

His

Pro

Ser

Asp

Ser

Glu

Thr

His

Tyr

Asn

Gln

Asn

Phe

50

55

60

Lys

Ser

Lys

Ala

Thr

Leu

Thr

Val

Asp

Lys

Ser

Ser

Ser

Thr

Ala

Tyr

65

70

75

80

Ile

Gln

Leu

Ser

Ser

Leu

Thr

Ser

Glu

Asp

Ser

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Arg

Pro

Val

Leu

Tyr

Gly

Asp

Tyr

Gly

Phe

Pro

Cys

Trp

Gly

Gln

100

105

110

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

Ala

115

120

<210> 77 <211> 111 <212> PRT <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> Вариабельная последовательность легкой цепи <400> 77

Asp 1

Ile

Val

Leu

Thr Gln 5

Ser

Pro

Ala

Ser 10

Leu

Ala

Val

Ser

Leu Gly 15

Gln

Arg

Ala

Thr

Ile

Ser

Cys

Lys

Ala

Ser

Gln

Ser

Val

Asp

Tyr

Asp

20

25

30

Gly

Asp

Ser

Tyr

Met

Asn

Trp

Tyr

Gln

Gln

Lys

Pro

Gly

Gln

Pro

Pro

- 67 030828

40 45

Lys

Leu 50

Leu

Ile

Tyr Ala

Ala 55

Ser Asn

Leu

Glu

Ser 60

Gly

Ile

Pro

Ala

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Asn

Ile

His

65

70

75

80

Pro

Val

Glu

Glu

Glu

Asp

Ala

Ala

Thr

Tyr

Tyr

Cys

Gln

Gln

Ser

Asn

85

90

95

Glu

Asp

Pro

Tyr

Thr

Phe

Gly

Gly

Gly

Thr

Lys

Leu

Glu

Ile

Lys

100

105

110

<210> 78 <211> 120 <212> PRT <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> CDR Вариабельная последовательность тяжелой цепи <400>78

Gln 1

Val

Gln Leu

Gln 5

Gln Ser

Gly Pro Glu 10

Leu Val

Lys

Pro

Gly 15

Ala

Ser

Val

Lys

Ile

Ser

Cys

Lys

Ala

Ser

Gly

Tyr

Ala

Phe

Ser

Ser

Ser

20

25

30

Trp

Met

Asn

Trp

Val

Lys

Gln

Arg

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Ile

35

40

45

Gly

Arg

Ile

Tyr

Pro

Gly

Asp

Gly

Asp

Thr

Asn

Tyr

Asn

Gly

Lys

Phe

50

55

60

Lys

Gly

Lys

Ala

Thr

Leu

Thr

Ala

Asp

Lys

Ser

Ser

Ser

Thr

Ala

Tyr

65

70

75

80

Met

Gln

Leu

Ser

Ser

Leu

Thr

Ser

Glu

Asp

Ser

Ala

Val

Tyr

Phe

Cys

85

90

95

Ala

Arg

Arg

Trp

Asp

Gly

Gly

Asn

Tyr

Phe

Phe

Asp

Tyr

Trp

Gly

Gln

100

105

110

Gly

Thr

Thr

Leu

Thr

Val

Ser

Ser

115

120

<210>79 <211>107

- 68 030828 <212> PRT <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> Вариабельная последовательность легкой цепи <400> 79

Asp 1

Ile

Val

Met

Thr 5

Gln

Ser

His

Lys

Phe 10

Met

Ser Thr

Ser

Val 15

Gly

Asp

Arg

Val

Ser

Ile

Thr

Cys

Met

Ala

Ser

Gln

Asp

Val

Gly

Thr

Ala

20

25

30

Val

Ala

Trp

Tyr

Gln

Arg

Arg

Pro

Gly

Gln

Ser

Pro

Lys

Leu

Leu

Ile

35

40

45

Tyr

Trp

Thr

Ser

Thr

Arg

His

Thr

Gly

Val

Pro

Asp

Arg

Phe

Thr

Gly

50

55

60

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

Asn

Val

Gln

Ser

65

70

75

80

Glu

Asp

Leu

Ala

Asp

Tyr

Phe

Cys

Gln

Gln

Tyr

Ser

Ser

Tyr

Pro

Leu

85

90

95

Thr

Phe

Gly

Ser

Gly

Thr

Lys

Leu

Glu

Ile

Lys

100

105

<210> 80 <211> 120 <212> PRT <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> CDR Вариабельная последовательность тяжелой цепи <400> 80

Gln Val 1

Gln Leu Gln Gln 5

Ser

Gly Pro

Glu 10

Leu

Val

Lys

Pro

Gly 15

Ala

Ser

Val

Lys

Ile

Ser

Cys

Lys

Ala

Ser

Gly

Tyr

Ala

Phe

Ser

Ser

Ser

20

25

30

Trp

Met

Asn

Trp

Val

Lys

Gln

Arg

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Ile

35

40

45

Gly

Arg

Ile

Tyr

Pro

Gly

Asp

Gly

Asp

Thr

Asn

Tyr

Asn

Gly

Lys

Phe

50

55

60

Lys

Gly

Lys

Ala

Thr

Leu

Thr

Ala

Asp

Lys

Ser

Ser

Ser

Thr

Ala

Tyr

- 69 030828

70 75 80

Met

Gln

Leu

Ser

Ser 85

Leu

Thr

Ser

Glu

Asp 90

Ser

Ala

Val

Tyr

Phe 95

Cys

Ala

Arg

Ser

Asp

Tyr

Tyr

Gly

Asp

Tyr

Gly

Phe

Ala

Tyr

Trp

Gly

Gln

100

105

110

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

Ala

115

120

<210> 81 <211> 111 <212> PRT <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> Вариабельная последовательность легкой цепи <400> 81

Asp 1

Ile Val

Leu

Thr 5

Gln

Ser

Pro

Ala

Ser 10

Leu Ala

Val

Ser

Leu 15

Gly

Gln

Arg

Ala

Thr

Ile

Ser

Cys

Lys

Ala

Ser

Gln

Ser

Val

Asp

Tyr

Ala

20

25

30

Gly

Asp

Ser

Tyr

Met

Asn

Trp

Tyr

Gln

Gln

Lys

Pro

Gly

Gln

Pro

Pro

35

40

45

Lys

Leu

Leu

Ile

Tyr

Ala

Ala

Ser

Asn

Leu

Glu

Ser

Gly

Ile

Pro

Ala

50

55

60

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Asn

Ile

His

65

70

75

80

Pro

Val

Glu

Glu

Glu

Asp

Ala

Ala

Thr

Tyr

Tyr

Cys

Gln

Gln

Ser

Asn

85

90

95

Glu

Asp

Pro

Tyr

Thr

Phe

Gly

Gly

Gly

Thr

Lys

Leu

Glu

Ile

Lys

100

105

110

<210> 82 <211> 111 <212> PRT <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> Вариабельная последовательность легкой цепи <400> 82

- 70 030828

Asp 1

Ile Val

Met

Thr 5

Gln

Ser

Pro

Asp

Ser 10

Leu Ala

Val

Ser

Leu 15

Gly

Glu

Arg

Ala

Thr

Ile

Asn

Cys

Lys

Ala

Ser

Gln

Ser

Val

Asp

Tyr

Ala

20

25

30

Gly

Asp

Ser

Tyr

Met

Asn

Trp

Tyr

Gln

Gln

Lys

Pro

Gly

Gln

Pro

Pro

35

40

45

Lys

Leu

Leu

Ile

Tyr

Ala

Ala

Ser

Asn

Leu

Glu

Ser

Gly

Val

Pro

Asp

50

55

60

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

65

70

75

80

Ser

Leu

Gln

Ala

Glu

Asp

Val

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

Gln

Gln

Ser

Asn

85

90

95

Glu

Asp

Pro

Tyr

Thr

Phe

Gly

Gln

Gly

Thr

Lys

Leu

Glu

Ile

Lys

100

105

110

<210> 83 <211> 111 <212> PRT <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> Вариабельная последовательность легкой цепи <400> 83

Asp 1

Ile

Val

Met

Thr 5

Gln

Ser

Pro

Asp

Ser 10

Leu Ala

Val

Ser

Leu 15

Gly

Glu

Arg

Ala

Thr

Ile

Asn

Cys

Lys

Ala

Ser

Gln

Ser

Val

Asp

Tyr

Ala

20

25

30

Gly

Asp

Ser

Phe

Met

Asn

Trp

Tyr

Gln

Gln

Lys

Pro

Gly

Gln

Pro

Pro

35

40

45

Lys

Leu

Leu

Ile

Tyr

Ala

Ala

Ser

Asn

Leu

Glu

Ser

Gly

Val

Pro

Asp

50

55

60

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

65

70

75

80

Ser

Leu

Gln

Ala

Glu

Asp

Val

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

Gln

Gln

Ser

Asn

85

90

95

Glu

Asp

Pro

Tyr

Thr

Phe

Gly

Gln

Gly

Thr

Lys

Leu

Glu

Ile

Lys

- 71 030828

100

105

110 <210> 84 <211> 111 <212> PRT <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> Вариабельная последовательность легкой цепи <400> 84

Asp 1

Ile Val

Met

Thr 5

Gln

Ser

Pro

Asp

Ser 10

Leu Ala

Val

Ser

Leu 15

Gly

Glu

Arg

Ala

Thr

Ile

Asn

Cys

Lys

Ala

Ser

Gln

Ser

Val

Asp

Tyr

Ala

20

25

30

Gly

Asp

Ser

Trp

Met

Asn

Trp

Tyr

Gln

Gln

Lys

Pro

Gly

Gln

Pro

Pro

35

40

45

Lys

Leu

Leu

Ile

Tyr

Val

Ala

Ser

Asn

Leu

Glu

Ser

Gly

Val

Pro

Asp

50

55

60

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

65

70

75

80

Ser

Leu

Gln

Ala

Glu

Asp

Val

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

Gln

Gln

Ser

Asn

85

90

95

Glu

Asp

Pro

Tyr

Thr

Phe

Gly

Gln

Gly

Thr

Lys

Leu

Glu

Ile

Lys

100

105

110

<210> 85 <211> 111 <212> PRT <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> Вариабельная последовательность легкой цепи <400> 85

Asp 1

Ile

Val

Met

Thr 5

Gln

Ser

Pro

Asp

Ser 10

Leu

Ala

Val

Ser

Leu Gly 15

Glu

Arg

Ala

Thr

Ile

Asn

Cys

Lys

Ala

Ser

Gln

Ser

Val

Asp

Tyr

Ala

20

25

30

Gly

Asp

Ser

Trp

Met

Asn

Trp

Tyr

Gln

Gln

Lys

Pro

Gly

Gln

Pro

Pro

35

40

45

- 72 030828

Lys

Leu 50

Leu

Ile

Tyr

Thr Ala 55

Ser

Asn

Leu

Glu

Ser 60

Gly

Val

Pro

Asp

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

65

70

75

80

Ser

Leu

Leu

Ala

Glu

Asp

Val

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

Gln

Gln

Ser

Asn

85

90

95

Glu

Asp

Pro

Tyr

Thr

Phe

Gly

Gln

Gly

Thr

Lys

Leu

Glu

Ile

Lys

100

105

110

<210> 86 <211> 111 <212> PRT <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> Вариабельная последовательность легкой цепи <400> 86

Asp 1

Ile Val

Met

Thr 5

Gln

Ser

Pro

Asp

Ser 10

Leu Ala

Val

Ser

Leu 15

Gly

Glu

Arg

Ala

Thr

Ile

Asn

Cys

Lys

Ala

Ser

Gln

Ser

Val

Asp

Trp

Ala

20

25

30

Gly

His

Ser

Trp

Met

Asn

Trp

Tyr

Gln

Gln

Lys

Pro

Gly

Gln

Pro

Pro

35

40

45

Lys

Leu

Leu

Ile

Tyr

Thr

Ala

Ser

Asn

Leu

Glu

Ser

Gly

Val

Pro

Asp

50

55

60

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

65

70

75

80

Ser

Leu

Gln

Ala

Glu

Asp

Val

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

Gln

Gln

Ser

Asn

85

90

95

Glu

Asp

Pro

Tyr

Thr

Phe

Gly

Gln

Gly

Thr

Lys

Leu

Glu

Ile

Lys

100

105

110

<210> 87 <211> 111 <212> PRT <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> Вариабельная последовательность легкой цепи <400> 87

- 73 030828

Asp 1

Ile Val

Met

Thr 5

Gln

Ser

Pro

Asp

Ser 10

Leu Ala

Val

Ser

Leu 15

Gly

Glu

Arg

Ala

Thr

Ile

Asn

Cys

Lys

Ala

Ser

Gln

Ser

Val

Asp

Trp

Ala

20

25

30

Gly

His

Ser

Trp

Met

Asn

Trp

Tyr

Gln

Gln

Lys

Pro

Gly

Gln

Pro

Pro

35

40

45

Lys

Leu

Leu

Ile

Tyr

Thr

Ala

Ser

Asn

Leu

Glu

Ser

Gly

Val

Pro

Asp

50

55

60

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

65

70

75

80

Ser

Leu

Gln

Ala

Glu

Asp

Val

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

Gln

Gln

Ser

Asn

85

90

95

Glu

Asp

Pro

Tyr

Thr

Phe

Gly

Gln

Gly

Thr

Lys

Leu

Glu

Ile

Lys

100

105

110

<210> 88 <211> 111 <212> PRT <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> Вариабельная последовательность легкой цепи <400> 88

Asp 1

Ile

Val

Met

Thr 5

Gln

Ser

Pro Asp

Ser 10

Leu Ala

Val

Ser

Leu 15

Gly

Glu

Arg

Ala

Thr

Ile

Asn

Cys

Lys

Ala

Ser

Gln

Ser

Val

Asp

Tyr

Ala

20

25

30

Gly

Ser

Ser

Phe

Met

Asn

Trp

Tyr

Gln

Gln

Lys

Pro

Gly

Gln

Pro

Pro

35

40

45

Lys

Leu

Leu

Ile

Tyr

Glu

Ala

Ser

Asn

Leu

Glu

Ser

Gly

Val

Pro

Asp

50

55

60

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

65

70

75

80

Ser

Leu

Gln

Ala

Glu

Asp

Val

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

Gln

Gln

Ser

Asn

85

90

95

- 74 030828

Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110 <210> 89 <211> 111 <212> PRT <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> Вариабельная последовательность легкой цепи <400> 89

Asp 1

Ile Val

Met

Thr 5

Gln

Ser

Pro

Asp

Ser 10

Leu Ala

Val

Ser

Leu 15

Gly

Glu

Arg

Ala

Thr

Ile

Asn

Cys

Lys

Ala

Ser

Gln

Ser

Val

Asp

Tyr

Ala

20

25

30

Gly

Glu

Ser

Phe

Met

Asn

Trp

Tyr

Gln

Gln

Lys

Pro

Gly

Gln

Pro

Pro

35

40

45

Lys

Leu

Leu

Ile

Tyr

Ala

Ala

Ser

Asn

Leu

Glu

Ser

Gly

Val

Pro

Asp

50

55

60

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

65

70

75

80

Ser

Leu

Gln

Ala

Glu

Asp

Val

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

Gln

Gln

Ser

Asn

85

90

95

Glu

Asp

Pro

Tyr

Thr

Phe

Gly

Gln

Gly

Thr

Lys

Leu

Glu

Ile

Lys

100

105

110

<210> 90 <211> 111 <212> PRT <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> Вариабельная последовательность легкой цепи <400> 90

Asp 1

Ile

Gln

Met

Thr Gln 5

Ser

Pro

Ser

Ser 10

Leu

Ser

Ala

Ser

Val 15

Gly

Asp

Arg

Val

Thr

Ile

Thr

Cys

Lys

Ala

Ser

Gln

Ser

Val

Asp

Tyr

Ala

20

25

30

Gly

Asp

Ser

Tyr

Met

Asn

Trp

Tyr

Gln

Gln

Lys

Pro

Gly

Lys

Ala

Pro

35

40

45

- 75 030828

Lys

Leu 50

Leu

Ile

Tyr

Ala

Ala 55

Ser

Asn

Leu

Glu

Ser Gly 60

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

65

70

75

80

Ser

Leu

Gln

Pro

Glu

Asp

Phe

Ala

Thr

Tyr

Tyr

Cys

Gln

Gln

Ser

Asn

85

90

95

Glu

Asp

Pro

Tyr

Thr

Phe

Gly

Gln

Gly

Thr

Lys

Leu

Glu

Ile

Lys

100

105

110

<210> 91 <211> 111 <212> PRT <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> Вариабельная последовательность легкой цепи <400> 91

Asp 1

Ile

Gln

Met

Thr 5

Gln

Ser

Pro

Ser

Ser 10

Leu

Ser

Ala

Ser

Val 15

Gly

Asp

Arg

Val

Thr

Ile

Thr

Cys

Lys

Ala

Ser

Gln

Ser

Val

Asp

Tyr

Phe

20

25

30

Ser

Glu

Ser

Tyr

Met

Asn

Trp

Tyr

Gln

Gln

Lys

Pro

Gly

Lys

Ala

Pro

35

40

45

Lys

Leu

Leu

Ile

Tyr

Ala

Ala

Ser

Asn

Leu

Glu

Ser

Gly

Val

Pro

Ser

50

55

60

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

65

70

75

80

Ser

Leu

Gln

Pro

Glu

Asp

Phe

Ala

Thr

Tyr

Tyr

Cys

Gln

Gln

Ser

Asn

85

90

95

Glu

Asp

Pro

Tyr

Thr

Phe

Gly

Gln

Gly

Thr

Lys

Val

Glu

Ile

Lys

100

105

110

<210> 92 <211> 111 <212> PRT <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> Вариабельная последовательность легкой цепи

- 76 030828 <400> 92

Asp 1

Ile

Gln

Met

Thr 5

Gln

Ser

Pro

Ser

Ser 10

Leu

Ser

Ala

Ser

Val 15

Gly

Asp

Arg

Val

Thr

Ile

Thr

Cys

Lys

Ala

Ser

Gln

Ser

Val

Asp

Tyr

Ala

20

25

30

His

Glu

Ser

Phe

Met

Asn

Trp

Tyr

Gln

Gln

Lys

Pro

Gly

Lys

Ala

Pro

35

40

45

Lys

Leu

Leu

Ile

Tyr

Ala

Ala

Ser

Asn

Leu

Glu

Ser

Gly

Val

Pro

Ser

50

55

60

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

65

70

75

80

Ser

Leu

Gln

Pro

Glu

Asp

Phe

Ala

Thr

Tyr

Tyr

Cys

Gln

Gln

Ser

Asn

85

90

95

Glu

Asp

Pro

Tyr

Thr

Phe

Gly

Gln

Gly

Thr

Lys

Val

Glu

Ile

Lys

100

105

110

<210> 93 <211> 111 <212> PRT <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> Вариабельная последовательность легкой цепи <400> 93

Asp 1

Ile

Gln

Met

Thr 5

Gln

Ser

Pro

Ser

Ser 10

Leu

Ser

Ala

Ser

Val 15

Gly

Asp

Arg

Val

Thr

Ile

Thr

Cys

Lys

Ala

Ser

Gln

Ser

Val

Asp

Tyr

Phe

20

25

30

Gly

Asp

Ser

Leu

Met

Asn

Trp

Tyr

Gln

Gln

Lys

Pro

Gly

Lys

Ala

Pro

35

40

45

Lys

Leu

Leu

Ile

Tyr

Ala

Ala

Ser

Asn

Leu

Glu

Ser

Gly

Val

Pro

Ser

50

55

60

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

65

70

75

80

Ser

Leu

Gln

Pro

Glu

Asp

Phe

Ala

Thr

Tyr

Tyr

Cys

Gln

Gln

Ser

Asn

85

90

95

- 77 030828

Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110 <210> 94 <211> 111 <212> PRT <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> Вариабельная последовательность легкой цепи <400> 94

Asp 1

Ile

Gln

Met

Thr 5

Gln

Ser

Pro

Ser

Ser 10

Leu

Ser

Ala

Ser

Val 15

Gly

Asp

Arg

Val

Thr

Ile

Thr

Cys

Lys

Ala

Ser

Gln

Ser

Val

Asp

Tyr

Ala

20

25

30

Gly

Asp

Ser

Phe

Met

Asn

Trp

Tyr

Gln

Gln

Lys

Pro

Gly

Lys

Ala

Pro

35

40

45

Lys

Leu

Leu

Ile

Tyr

Ala

Ala

Ser

Asn

Leu

Glu

Ser

Gly

Val

Pro

Ser

50

55

60

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

65

70

75

80

Ser

Leu

Gln

Pro

Glu

Asp

Phe

Ala

Thr

Tyr

Tyr

Cys

Gln

Gln

Ser

Asn

85

90

95

Glu

Asp

Pro

Tyr

Thr

Phe

Gly

Gln

Gly

Thr

Lys

Val

Glu

Ile

Lys

100

105

110

<210> 95

<211> <212> <213>

111 PRT Синтетическая последовательность

<220>

<223> Вариабельная последовательность легкой цепи <400> 95

Asp 1

Ile

Gln

Met

Thr Gln 5

Ser

Pro

Ser

Ser 10

Leu

Ser

Ala

Ser

Val 15

Gly

Asp

Arg

Val

Thr

Ile

Thr

Cys

Lys

Ala

Ser

Gln

Ser

Val

Asp

Tyr

Ala

20

25

30

Gly

Glu

Ser

Phe

Met

Asn

Trp

Tyr

Gln

Gln

Lys

Pro

Gly

Lys

Ala

Pro

35

40

45

- 78 030828

Lys

Leu 50

Leu

Ile

Tyr

Ala

Ala 55

Ser

Asn

Leu

Glu

Ser Gly 60

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

65

70

75

80

Ser

Leu

Gln

Pro

Glu

Asp

Phe

Ala

Thr

Tyr

Tyr

Cys

Gln

Gln

Ser

Asn

85

90

95

Glu

Asp

Pro

Tyr

Thr

Phe

Gly

Gln

Gly

Thr

Lys

Val

Glu

Ile

Lys

100

105

110

<210> 96 <211> 111 <212> PRT <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> Вариабельная последовательность легкой цепи <400> 96

Asp 1

Ile

Gln

Met

Thr 5

Gln

Ser

Pro

Ser

Ser 10

Leu

Ser

Ala

Ser

Val 15

Gly

Asp

Arg

Val

Thr

Ile

Thr

Cys

Lys

Ala

Ser

Gln

Ser

Val

Asp

Tyr

Ala

20

25

30

Gly

Glu

Ser

Phe

Met

Asn

Trp

Tyr

Gln

Gln

Lys

Pro

Gly

Lys

Ala

Pro

35

40

45

Lys

Leu

Leu

Ile

Tyr

Ala

Ala

Ser

Asn

Leu

Glu

Ser

Gly

Val

Pro

Ser

50

55

60

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

65

70

75

80

Ser

Leu

Gln

Pro

Glu

Asp

Phe

Ala

Thr

Tyr

Tyr

Cys

Gln

Gln

Ser

Asn

85

90

95

Glu

Asp

Pro

Tyr

Thr

Phe

Gly

Gln

Gly

Thr

Lys

Val

Glu

Ile

Lys

100

105

110

<210> 97 <211> 111 <212> PRT <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> Вариабельная последовательность легкой цепи

- 79 030828 <400> 97

Asp 1

Ile

Gln

Met

Thr 5

Gln

Ser

Pro

Ser

Ser 10

Leu

Ser

Ala

Ser

Val 15

Gly

Asp

Arg

Val

Thr

Ile

Thr

Cys

Lys

Ala

Ser

Gln

Ser

Val

Asp

Tyr

Ala

20

25

30

Gly

Asp

Ser

Tyr

Met

Asn

Trp

Tyr

Gln

Gln

Lys

Pro

Gly

Lys

Ala

Pro

35

40

45

Lys

Leu

Leu

Ile

Tyr

Ala

Ala

Ser

Asn

Leu

Glu

Ser

Gly

Val

Pro

Ser

50

55

60

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

65

70

75

80

Ser

Leu

Gln

Pro

Glu

Asp

Phe

Ala

Thr

Tyr

Tyr

Cys

Gln

Gln

Ser

Asn

85

90

95

Glu

Asp

Pro

Tyr

Thr

Phe

Gly

Gln

Gly

Thr

Lys

Val

Glu

Ile

Lys

100

105

110

<210> 98 <211> 111 <212> PRT <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> Вариабельная последовательность легкой цепи <400> 98

Asp 1

Ile

Gln

Met

Thr 5

Gln

Ser

Pro

Ser

Ser 10

Leu

Ser

Ala

Ser

Val 15

Gly

Asp

Arg

Val

Thr

Ile

Thr

Cys

Lys

Ala

Ser

Gln

Ser

Val

Asp

Tyr

Phe

20

25

30

Arg

Thr

Ser

Phe

Met

Asn

Trp

Tyr

Gln

Gln

Lys

Pro

Gly

Lys

Ala

Pro

35

40

45

Lys

Leu

Leu

Ile

Tyr

Ala

Ala

Ser

Asn

Leu

Glu

Ser

Gly

Val

Pro

Ser

50

55

60

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

65

70

75

80

Ser

Leu

Gln

Pro

Glu

Asp

Phe

Ala

Thr

Tyr

Tyr

Cys

Gln

Gln

Ser

Asn

90 95

- 80 030828

Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110 <210> 99 <211> 111 <212> PRT <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> Вариабельная последовательность легкой цепи <400> 99

Asp 1

Ile

Gln

Met

Thr 5

Gln

Ser

Pro

Ser

Ser 10

Leu

Ser

Ala

Ser

Val 15

Gly

Asp

Arg

Val

Thr

Ile

Thr

Cys

Lys

Ala

Ser

Gln

Ser

Val

Asp

Tyr

Val

20

25

30

Gly

Thr

Ser

Phe

Met

Asn

Trp

Tyr

Gln

Gln

Lys

Pro

Gly

Lys

Ala

Pro

35

40

45

Lys

Leu

Leu

Ile

Tyr

Ala

Ala

Ser

Asn

Leu

Glu

Ser

Gly

Val

Pro

Ser

50

55

60

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

65

70

75

80

Ser

Leu

Gln

Pro

Glu

Asp

Phe

Ala

Thr

Tyr

Tyr

Cys

Gln

Gln

Ser

Asn

85

90

95

Glu

Asp

Pro

Tyr

Thr

Phe

Gly

Gln

Gly

Thr

Lys

Val

Glu

Ile

Lys

100

105

110

<210> 100 <211> 111 <212> PRT <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> Вариабельная последовательность легкой цепи <400> 100

Asp 1

Ile

Gln

Met

Thr Gln 5

Ser

Pro

Ser

Ser 10

Leu

Ser

Ala

Ser

Val 15

Gly

Asp

Arg

Val

Thr

Ile

Thr

Cys

Lys

Ala

Ser

Gln

Ser

Val

Asp

Tyr

Trp

20

25

30

Ser

Asp

Ser

Phe

Met

Asn

Trp

Tyr

Gln

Gln

Lys

Pro

Gly

Lys

Ala

Pro

- 81 030828

40 45

Lys

Leu 50

Leu

Ile

Tyr

Ala

Ala 55

Ser

Asn

Leu

Glu

Ser Gly 60

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

65

70

75

80

Ser

Leu

Gln

Pro

Glu

Asp

Phe

Ala

Thr

Tyr

Tyr

Cys

Gln

Gln

Ser

Asn

85

90

95

Glu

Asp

Pro

Tyr

Thr

Phe

Gly

Gln

Gly

Thr

Lys

Val

Glu

Ile

Lys

100

105

110

<210> <211> <212> <213>

101 111 PRT Синтетическая последовательность

<220>

<223> Вариабельная последовательность легкой цепи <400> 101

Asp 1

Ile

Gln

Met

Thr 5

Gln

Ser

Pro

Ser

Ser 10

Leu

Ser

Ala

Ser

Val 15

Gly

Asp

Arg

Val

Ala

Ile

Thr

Cys

Lys

Ala

Ser

Gln

Ser

Val

Asp

Tyr

Tyr

20

25

30

Asn

Ser

Ser

Phe

Met

Asn

Trp

Tyr

Gln

Gln

Lys

Pro

Gly

Lys

Ala

Pro

35

40

45

Lys

Leu

Leu

Ile

Tyr

Ala

Ala

Ser

Asn

Leu

Glu

Ser

Gly

Val

Pro

Ser

50

55

60

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

65

70

75

80

Ser

Leu

Gln

Pro

Glu

Asp

Phe

Ala

Thr

Tyr

Tyr

Cys

Gln

Gln

Ser

Asn

85

90

95

Glu

Asp

Pro

Tyr

Thr

Phe

Gly

Gln

Gly

Thr

Lys

Val

Glu

Ile

Lys

100

105

110

<210>	102
<211>	120
<212>	PRT
<213>	Синтетическая последовательность
<220>

- 82 030828 <223> CDR Вариабельная последовательность тяжелой цепи <400> 102

Glu 1

Val

Gln Leu

Val 5

Gln

Ser Gly Ala Glu 10

Val

Lys

Lys

Pro

Gly 15

Glu

Ser

Leu

Lys

Ile

Ser

Cys

Lys

Gly

Ser

Gly

Tyr

Ala

Phe

Ser

Ser

Ser

20

25

30

Trp

Met

Asn

Trp

Val

Arg

Gln

Met

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Met

35

40

45

Gly

Arg

Ile

Tyr

Pro

Gly

Asp

Gly

Asp

Thr

Asn

Tyr

Asn

Gly

Lys

Phe

50

55

60

Lys

Gly

Gln

Val

Thr

Ile

Ser

Ala

Asp

Lys

Ser

Ile

Ser

Thr

Ala

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gln

Trp

Ser

Ser

Leu

Lys

Ala

Ser

Asp

Thr

Ala

Met

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Arg

Ser

Asp

Tyr

Tyr

Gly

Asp

Tyr

Gly

Phe

Ala

Tyr

Trp

Gly

Gln

100

105

110

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

Ser

115

120

<210> 103 <211> 120 <212> PRT <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> CDR Вариабельная последовательность тяжелой цепи <400> 103

Glu Val 1

Gln

Leu Val 5

Gln

Ser Gly

Ala Glu Val 10

Lys

Lys

Pro

Gly 15

Glu

Ser

Leu

Lys

Ile

Ser

Cys

Lys

Gly

Ser

Gly

Tyr

Ala

Phe

Ser

Ser

Ser

20

25

30

Trp

Met

Asn

Trp

Val

Arg

Gln

Met

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Met

35

40

45

Gly

Arg

Ile

Tyr

Ser

Gly

Asp

Gly

Asp

Thr

Asn

Tyr

Asn

Gly

Lys

Phe

50

55

60

Lys

Gly

Gln

Val

Thr

Ile

Ser

Ala

Asp

Lys

Ser

Ile

Ser

Thr

Ala

Tyr

- 83 030828

70 75 80

Leu

Gln

Trp

Ser

Ser Leu Lys 85

Ala

Ser

Asp 90

Thr

Ala

Met

Tyr

Tyr 95

Cys

Ala

Arg

Ser

Asp

Tyr

Tyr

Gly

Asp

Tyr

Gly

Phe

Ala

Tyr

Trp

Gly

Gln

100

105

110

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

Ser

115

120

<210> 104 <211> 120 <212> PRT <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> CDR Вариабельная последовательность тяжелой цепи <400> 104

Glu 1

Val

Gln Leu

Val 5

Gln

Ser Gly Ala Glu 10

Val

Lys

Lys

Pro

Gly 15

Glu

Ser

Leu

Lys

Ile

Ser

Cys

Lys

Gly

Ser

Gly

Tyr

Ala

Phe

Ser

Ser

Ser

20

25

30

Trp

Met

Asn

Trp

Val

Arg

Gln

Met

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Met

35

40

45

Gly

Arg

Ile

Tyr

Ser

Gly

Asp

Ala

Asp

Thr

Asn

Tyr

Ala

Gln

Lys

Phe

50

55

60

Lys

Gly

Gln

Val

Thr

Ile

Ser

Ala

Asp

Lys

Ser

Ile

Ser

Thr

Ala

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gln

Trp

Ser

Ser

Leu

Lys

Ala

Ser

Asp

Thr

Ala

Met

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Arg

Ser

Asp

Tyr

Tyr

Gly

Asp

Tyr

Gly

Phe

Ala

Tyr

Trp

Gly

Gln

100

105

110

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

Ser

115

120

<210>	105
<211>	120
<212>	PRT
<213>	Синтетическая последовательность
<220>

- 84 030828 <223> CDR Вариабельная последовательность тяжелой цепи <400> 105

Glu 1

Val

Gln Leu

Val 5

Gln

Ser Gly Ala Glu 10

Val

Lys

Lys

Pro

Gly 15

Glu

Ser

Leu

Lys

Ile

Ser

Cys

Lys

Gly

Ser

Gly

Tyr

Ala

Phe

Ser

Ser

Ser

20

25

30

Trp

Met

Asn

Trp

Val

Arg

Gln

Met

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Met

35

40

45

Gly

Arg

Ile

Tyr

Ser

Gly

Asp

Ala

Asp

Thr

Asn

Tyr

Asn

Gln

Lys

Phe

50

55

60

Lys

Gly

Gln

Val

Thr

Ile

Ser

Ala

Asp

Lys

Ser

Ile

Ser

Thr

Ala

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gln

Trp

Ser

Ser

Leu

Lys

Ala

Ser

Asp

Thr

Ala

Met

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Arg

Ser

Asp

Tyr

Tyr

Gly

Asp

Tyr

Gly

Phe

Ala

Tyr

Trp

Gly

Gln

100

105

110

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

Ser

115

120

<210> 106 <211> 120 <212> PRT <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> CDR Вариабельная последовательность тяжелой цепи <400> 106

Gln Val 1

Gln

Leu Val 5

Gln

Ser Gly

Ala Glu Val 10

Lys

Lys

Pro

Gly 15

Ala

Ser

Val

Lys

Val

Ser

Cys

Lys

Ala

Ser

Gly

Tyr

Ala

Phe

Ser

Ser

Ser

20

25

30

Trp

Met

Asn

Trp

Val

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Gln

Gly

Leu

Glu

Trp

Met

35

40

45

Gly

Arg

Ile

Tyr

Pro

Gly

Asp

Gly

Asp

Thr

Asn

Tyr

Asn

Gly

Lys

Phe

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Val

Thr

Met

Thr

Arg

Asp

Thr

Ser

Thr

Ser

Thr

Val

Tyr

- 85 030828

70 75 80

Met

Glu

Leu

Ser

Ser 85

Leu Arg

Ser

Glu Asp 90

Thr Ala

Val

Tyr

Tyr 95

Cys

Ala

Arg

Ser

Asp

Tyr

Tyr

Gly

Asp

Tyr

Gly

Phe

Ala

Tyr

Trp

Gly

Gln

100

105

110

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

Ser

115

120

<210> 107 <211> 120 <212> PRT <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> CDR Вариабельная последовательность тяжелой цепи <400> 107

Gln Val 1

Gln Leu Val 5

Gln Ser

Gly Ala

Glu Val 10

Lys

Lys

Pro

Gly 15

Ala

Ser

Val

Lys

Val

Ser

Cys

Lys

Ala

Ser

Gly

Tyr

Ala

Phe

Ser

Ser

Ser

20

25

30

Trp

Met

Asn

Trp

Val

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Gln

Gly

Leu

Glu

Trp

Met

35

40

45

Gly

Arg

Ile

Tyr

Ser

Gly

Asp

Gly

Asp

Thr

Asn

Tyr

Asn

Gly

Lys

Phe

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Val

Thr

Met

Thr

Arg

Asp

Thr

Ser

Thr

Ser

Thr

Val

Tyr

65

70

75

80

Met

Glu

Leu

Ser

Ser

Leu

Arg

Ser

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Arg

Ser

Asp

Tyr

Tyr

Gly

Asp

Tyr

Gly

Phe

Ala

Tyr

Trp

Gly

Gln

100

105

110

Gly Thr Leu Val Thr Val

115

Ser Ser

120 <210> 108 <211> 120 <212> PRT <213> Синтетическая последовательность <220>

- 86 030828 <223> CDR Вариабельная последовательность тяжелой цепи <400> 108

Gln 1

Val

Gln Leu

Val 5

Gln

Ser Gly Ala Glu 10

Val

Lys

Lys

Pro

Gly 15

Ala

Ser

Val

Lys

Val

Ser

Cys

Lys

Ala

Ser

Gly

Tyr

Ala

Phe

Ser

Ser

Ser

20

25

30

Trp

Met

Asn

Trp

Val

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Gln

Gly

Leu

Glu

Trp

Met

35

40

45

Gly

Arg

Ile

Tyr

Ser

Gly

Asp

Ala

Asp

Thr

Asn

Tyr

Ala

Gln

Lys

Phe

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Val

Thr

Met

Thr

Arg

Asp

Thr

Ser

Thr

Ser

Thr

Val

Tyr

65

70

75

80

Met

Glu

Leu

Ser

Ser

Leu

Arg

Ser

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Arg

Ser

Asp

Tyr

Tyr

Gly

Asp

Tyr

Gly

Phe

Ala

Tyr

Trp

Gly

Gln

100

105

110

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

Ser

115

120

<210> 109 <211> 120 <212> PRT <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> CDR Вариабельная последовательность тяжелой цепи <400> 109

Gln Val 1

Gln

Leu Val 5

Gln

Ser Gly

Ala Glu Val 10

Lys

Lys

Pro

Gly 15

Ala

Ser

Val

Lys

Val

Ser

Cys

Lys

Ala

Ser

Gly

Tyr

Ala

Phe

Ser

Ser

Ser

20

25

30

Trp

Met

Asn

Trp

Val

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Gln

Gly

Leu

Glu

Trp

Met

35

40

45

Gly

Arg

Ile

Tyr

Ser

Gly

Asp

Ala

Asp

Thr

Asn

Tyr

Asn

Gln

Lys

Phe

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Val

Thr

Met

Thr

Arg

Asp

Thr

Ser

Thr

Ser

Thr

Val

Tyr

- 87 030828

70 75 80

Met

Glu

Leu

Ser

Ser 85

Leu Arg

Ser

Glu Asp 90

Thr Ala

Val

Tyr

Tyr 95

Cys

Ala

Arg

Ser

Asp

Tyr

Tyr

Gly

Asp

Tyr

Gly

Phe

Ala

Tyr

Trp

Gly

Gln

100

105

110

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

Ser

115

120

<210> 110 <211> 120 <212> PRT <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> CDR Вариабельная последовательность тяжелой цепи <400> 110

Gln 1

Val

Gln Leu

Val 5

Gln

Ser Gly Ala Glu 10

Val

Lys

Lys

Pro

Gly 15

Ala

Ser

Val

Lys

Val

Ser

Cys

Lys

Ala

Ser

Gly

Tyr

Ala

Phe

Ser

Ser

Ser

20

25

30

Trp

Met

Asn

Trp

Val

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Gln

Gly

Leu

Glu

Trp

Met

35

40

45

Gly

Arg

Ile

Tyr

Gln

Gly

Asp

Gly

Asp

Thr

Asn

Tyr

Asn

Gly

Lys

Phe

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Val

Thr

Met

Thr

Arg

Asp

Thr

Ser

Thr

Ser

Thr

Val

Tyr

65

70

75

80

Met

Glu

Leu

Ser

Ser

Leu

Arg

Ser

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Arg

Ser

Asp

Tyr

Tyr

Gly

Asp

Tyr

Gly

Phe

Ala

Tyr

Trp

Gly

Gln

100

105

110

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

Ser

115

120

<210>	111
<211>	120
<212>	PRT
<213>	Синтетическая последовательность
<220>

- 88 030828 <223> CDR Вариабельная последовательность тяжелой цепи <400> 111

Glu 1

Val

Gln Leu

Val 5

Gln

Ser Gly Ala Glu 10

Val

Lys

Lys

Pro

Gly 15

Glu

Ser

Leu

Lys

Ile

Ser

Cys

Lys

Gly

Ser

Gly

Tyr

Ala

Phe

Ser

Ser

Ser

20

25

30

Trp

Met

Asn

Trp

Val

Arg

Gln

Met

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Met

35

40

45

Gly

Arg

Ile

Tyr

Pro

Gly

Asp

Gly

Asp

Thr

Asn

Tyr

Ser

Pro

Ser

Phe

50

55

60

Gln

Gly

Gln

Val

Thr

Ile

Ser

Ala

Asp

Lys

Ser

Ile

Ser

Thr

Ala

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gln

Trp

Ser

Ser

Leu

Lys

Ala

Ser

Asp

Thr

Ala

Met

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Arg

Ser

Asp

Tyr

Tyr

Gly

Asp

Tyr

Gly

Phe

Ala

Tyr

Trp

Gly

Gln

100

105

110

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

Ser

115

120

<210> 112 <211> 120 <212> PRT <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> CDR Вариабельная последовательность тяжелой цепи <400> 112

Glu Val 1

Gln

Leu Val 5

Gln

Ser Gly

Ala Glu Val 10

Lys

Lys

Pro

Gly 15

Glu

Ser

Leu

Lys

Ile

Ser

Cys

Lys

Gly

Ser

Gly

Tyr

Ala

Phe

Ser

Ser

Ser

20

25

30

Trp

Met

Asn

Trp

Val

Arg

Gln

Met

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Met

35

40

45

Gly

Arg

Ile

Tyr

Pro

Gly

Asp

Gly

Asp

Thr

Asn

Tyr

Ser

Pro

Ser

Phe

50

55

60

Gln

Gly

Gln

Val

Thr

Ile

Ser

Ala

Asp

Lys

Ser

Ile

Ser

Thr

Ala

Tyr

- 89 030828

70 75 80

Leu

Gln

Trp

Ser

Ser Leu Lys 85

Ala

Ser

Asp 90

Thr

Ala

Met

Tyr

Tyr 95

Cys

Ala

Arg

Ala

Asp

Tyr

Tyr

Gly

Asp

Tyr

Gly

Phe

Gly

Tyr

Trp

Gly

Gln

100

105

110

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

Ser

115

120

<210> 113 <211> 120 <212> PRT <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> CDR Вариабельная последовательность тяжелой цепи <400> 113

Glu 1

Val

Gln Leu

Val 5

Gln

Ser Gly Ala Glu 10

Val

Lys

Lys

Pro

Gly 15

Glu

Ser

Leu

Lys

Ile

Ser

Cys

Lys

Gly

Ser

Gly

Tyr

Ala

Phe

Ser

Ser

Ser

20

25

30

Trp

Met

Asn

Trp

Val

Arg

Gln

Met

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Met

35

40

45

Gly

Arg

Ile

Phe

Val

Arg

Asp

Gly

Asp

Thr

Asn

Tyr

Ser

Pro

Ser

Phe

50

55

60

Gln

Gly

Gln

Val

Thr

Ile

Ser

Ala

Asp

Lys

Ser

Ile

Ser

Thr

Ala

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gln

Trp

Ser

Ser

Leu

Lys

Ala

Ser

Asp

Thr

Ala

Met

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Arg

Ser

Asp

Tyr

Tyr

Gly

Asp

Tyr

Gly

Phe

Ala

Tyr

Trp

Gly

Gln

100

105

110

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

Ser

115

120

<210>	114
<211>	120
<212>	PRT
<213>	Синтетическая последовательность
<220>

- 90 030828 <223> CDR Вариабельная последовательность тяжелой цепи <400> 114

Glu 1

Val

Gln Leu

Val 5

Gln

Ser Gly Ala Glu 10

Val

Lys

Lys

Pro

Gly 15

Glu

Ser

Leu

Lys

Ile

Ser

Cys

Lys

Gly

Ser

Gly

Tyr

Ala

Phe

Ser

Ser

Ser

20

25

30

Trp

Met

Asn

Trp

Val

Arg

Gln

Met

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Met

35

40

45

Gly

Arg

Ile

Tyr

Val

Gly

Asp

Gly

Asp

Thr

Asn

Tyr

Ser

Pro

Ser

Phe

50

55

60

Gln

Gly

Gln

Val

Thr

Ile

Ser

Ala

Asp

Lys

Ser

Ile

Ser

Thr

Ala

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gln

Trp

Ser

Ser

Leu

Lys

Ala

Ser

Asp

Thr

Ala

Met

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Arg

Ser

Asp

Tyr

Tyr

Gly

Asp

Tyr

Gly

Phe

Ala

Tyr

Trp

Gly

Gln

100

105

110

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

Ser

115

120

<210> 115 <211> 120 <212> PRT <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> CDR Вариабельная последовательность тяжелой цепи <400> 115

Glu Val 1

Gln

Leu Val 5

Gln

Ser Gly

Ala Glu Val 10

Lys

Lys

Pro

Gly 15

Glu

Ser

Leu

Lys

Ile

Ser

Cys

Lys

Gly

Ser

Gly

Tyr

Ala

Phe

Ser

Ser

Ser

20

25

30

Trp

Met

Asn

Trp

Val

Arg

Gln

Met

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Met

35

40

45

Gly

Arg

Ile

Tyr

Ala

Gly

Asp

Gly

Asp

Thr

Asn

Tyr

Ser

Pro

Ser

Phe

50

55

60

Gln

Gly

Gln

Val

Thr

Ile

Ser

Ala

Asp

Lys

Ser

Ile

Ser

Thr

Ala

Tyr

- 91 030828

70 75 80

Leu

Gln

Trp

Ser

Ser Leu Lys 85

Ala

Ser

Asp 90

Thr

Ala

Met

Tyr

Tyr 95

Cys

Ala

Arg

Ser

Asp

Tyr

Tyr

Gly

Asp

Tyr

Gly

Phe

Ala

Tyr

Trp

Gly

Gln

100

105

110

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

Ser

115

120

<210> 116 <211> 120 <212> PRT <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> CDR Вариабельная последовательность тяжелой цепи <400> 116

Glu 1

Val

Gln Leu

Val 5

Gln

Ser Gly Ala Glu 10

Val

Lys

Lys

Pro

Gly 15

Glu

Ser

Leu

Lys

Ile

Ser

Cys

Lys

Gly

Ser

Gly

Tyr

Ala

Phe

Ser

Ser

Ser

20

25

30

Trp

Met

Asn

Trp

Val

Arg

Gln

Met

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Met

35

40

45

Gly

Arg

Ile

Tyr

Ala

Arg

Asp

Gly

Asp

Thr

Asn

Tyr

Ser

Pro

Ser

Phe

50

55

60

Gln

Gly

Gln

Val

Thr

Ile

Ser

Ala

Asp

Lys

Ser

Ile

Ser

Thr

Ala

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gln

Trp

Ser

Ser

Leu

Lys

Ala

Ser

Asp

Thr

Ala

Met

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Arg

Ser

Asp

Tyr

Tyr

Gly

Asp

Tyr

Gly

Phe

Ala

Tyr

Trp

Gly

Gln

100

105

110

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

Ser

115

120

<210>	117
<211>	120
<212>	PRT
<213>	Синтетическая последовательность
<220>

- 92 030828 <223> CDR Вариабельная последовательность тяжелой цепи <400> 117

Glu 1

Val

Gln Leu

Val 5

Gln

Ser Gly Ala Glu 10

Val

Lys

Lys

Pro

Gly 15

Glu

Ser

Leu

Lys

Ile

Ser

Cys

Lys

Gly

Ser

Gly

Tyr

Ala

Phe

Ser

Ser

Ser

20

25

30

Trp

Met

Asn

Trp

Val

Arg

Gln

Met

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Met

35

40

45

Gly

Arg

Ile

Tyr

Gly

Arg

Asp

Gly

Asp

Thr

Asn

Tyr

Ser

Pro

Ser

Phe

50

55

60

Gln

Gly

Gln

Val

Thr

Ile

Ser

Ala

Asp

Lys

Ser

Ile

Ser

Thr

Ala

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gln

Trp

Ser

Ser

Leu

Lys

Ala

Ser

Asp

Thr

Ala

Met

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Arg

Ser

Asp

Tyr

Tyr

Gly

Asp

Tyr

Gly

Phe

Ala

Tyr

Trp

Gly

Gln

100

105

110

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

Ser

115

120

<210> 118 <211> 120 <212> PRT <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> CDR Вариабельная последовательность тяжелой цепи <400> 118

Glu Val 1

Gln

Leu Val 5

Gln

Ser Gly

Ala Glu Val 10

Lys

Lys

Pro

Gly 15

Glu

Ser

Leu

Lys

Ile

Ser

Cys

Lys

Gly

Ser

Gly

Tyr

Ala

Phe

Ser

Ser

Ser

20

25

30

Trp

Met

Asn

Trp

Val

Arg

Gln

Met

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Met

35

40

45

Gly

Arg

Ile

Tyr

Ala

Asn

Asp

Gly

Asp

Thr

Asn

Tyr

Ser

Pro

Ser

Phe

50

55

60

Gln

Gly

Gln

Val

Thr

Ile

Ser

Ala

Asp

Lys

Ser

Ile

Ser

Thr

Ala

Tyr

- 93 030828

70 75 80

Leu

Gln

Trp

Ser

Ser Leu Lys 85

Ala

Ser

Asp 90

Thr

Ala

Met

Tyr

Tyr 95

Cys

Ala

Arg

Ser

Asp

Tyr

Tyr

Gly

Asp

Tyr

Gly

Phe

Ala

Tyr

Trp

Gly

Gln

100

105

110

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

Ser

115

120

<210> 119 <211> 120 <212> PRT <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> CDR Вариабельная последовательность тяжелой цепи <400> 119

Glu 1

Val

Gln Leu

Val 5

Gln

Ser Gly Ala Glu 10

Val

Lys

Lys

Pro

Gly 15

Glu

Ser

Leu

Lys

Ile

Ser

Cys

Lys

Gly

Ser

Gly

Tyr

Ala

Phe

Ser

Ser

Ser

20

25

30

Trp

Met

Asn

Trp

Val

Arg

Gln

Met

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Met

35

40

45

Gly

Arg

Ile

Tyr

Gly

Gly

Asp

Gly

Asp

Thr

Asn

Tyr

Ser

Pro

Ser

Phe

50

55

60

Gln

Gly

Gln

Val

Thr

Ile

Ser

Ala

Asp

Lys

Ser

Ile

Ser

Thr

Ala

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gln

Trp

Ser

Ser

Leu

Lys

Ala

Ser

Asp

Thr

Ala

Met

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Arg

Ser

Asp

Tyr

Tyr

Gly

Asp

Tyr

Gly

Phe

Ala

Tyr

Trp

Gly

Gln

100

105

110

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

Ser

115

120

<210>	120
<211>	120
<212>	PRT
<213>	Синтетическая последовательность
<220>

- 94 030828 <223> CDR Вариабельная последовательность тяжелой цепи <400> 120

Glu 1

Val

Gln Leu

Val 5

Gln

Ser Gly Ala Glu 10

Val

Lys

Lys

Pro

Gly 15

Glu

Ser

Leu

Lys

Ile

Ser

Cys

Lys

Gly

Ser

Gly

Tyr

Ala

Phe

Ser

Ser

Ser

20

25

30

Trp

Met

Asn

Trp

Val

Arg

Gln

Met

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Met

35

40

45

Gly

Arg

Ile

Tyr

Ser

Gly

Asp

Gly

Asp

Thr

Asn

Tyr

Ser

Pro

Ser

Phe

50

55

60

Gln

Gly

Gln

Val

Thr

Ile

Ser

Ala

Asp

Lys

Ser

Ile

Ser

Thr

Ala

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gln

Trp

Ser

Ser

Leu

Lys

Ala

Ser

Asp

Thr

Ala

Met

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Arg

Ser

Asp

Tyr

Tyr

Gly

Asp

Tyr

Gly

Phe

Ala

Tyr

Trp

Gly

Gln

100

105

110

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

Ser

115

120

<210> 121 <211> 120 <212> PRT <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> CDR Вариабельная последовательность тяжелой цепи <400> 121

Glu Val 1

Gln Leu

Val 5

Gln

Ser Val

Ala Glu 10

Val

Lys

Lys

Pro

Gly 15

Glu

Ser

Leu

Lys

Ile

Ser

Cys

Lys

Gly

Ser

Gly

Tyr

Ala

Phe

Ser

Ser

Ser

20

25

30

Trp

Met

Asn

Trp

Val

Arg

Gln

Met

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Met

35

40

45

Gly

Arg

Ile

Tyr

Ser

Arg

Asp

Gly

Asp

Thr

Asn

Tyr

Ser

Pro

Ser

Phe

50

55

60

Gln

Gly

Gln

Val

Thr

Ile

Ser

Ala

Asp

Lys

Ser

Ile

Ser

Thr

Ala

Tyr

- 95 030828

70 75 80

Leu

Gln

Trp

Ser

Ser Leu Lys 85

Ala

Ser

Asp 90

Thr

Ala

Met

Tyr

Tyr 95

Cys

Ala

Arg

Ser

Asp

Tyr

Tyr

Gly

Asp

Tyr

Gly

Phe

Ala

Tyr

Trp

Gly

Gln

100

105

110

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

Ser

115

120

<210> 122 <211> 120 <212> PRT <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> CDR Вариабельная последовательность тяжелой цепи <400> 122

Glu 1

Val

Gln Leu

Val 5

Gln

Ser Gly Ala Glu 10

Val

Lys

Lys

Pro

Gly 15

Glu

Ser

Leu

Lys

Ile

Ser

Cys

Lys

Gly

Ser

Gly

Tyr

Ala

Phe

Ser

Ser

Ser

20

25

30

Trp

Met

Asn

Trp

Val

Arg

Gln

Met

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Met

35

40

45

Gly

Arg

Ile

Tyr

Ala

Gly

Asp

Gly

Asp

Thr

Ala

Tyr

Ser

Pro

Ser

Phe

50

55

60

Gln

Gly

Gln

Val

Thr

Ile

Ser

Ala

Asp

Lys

Ser

Ile

Ser

Thr

Ala

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gln

Trp

Ser

Ser

Leu

Lys

Ala

Ser

Asp

Thr

Ala

Met

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Arg

Ser

Asp

Tyr

Tyr

Gly

Asp

Tyr

Gly

Phe

Ala

Tyr

Trp

Gly

Gln

100

105

110

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

Ser

115

120

<210>	123
<211>	120
<212>	PRT
<213>	Синтетическая последовательность
<220>

- 96 030828 <223> CDR Вариабельная последовательность тяжелой цепи <400> 123

Glu 1

Val

Gln Leu

Val 5

Gln

Ser Gly Ala Glu 10

Val

Lys

Lys

Pro

Gly 15

Glu

Ser

Leu

Lys

Ile

Ser

Cys

Lys

Gly

Ser

Gly

Tyr

Ala

Phe

Ser

Ser

Ser

20

25

30

Trp

Met

Asn

Trp

Val

Arg

Gln

Met

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Met

35

40

45

Gly

Arg

Ile

Tyr

Ala

Gly

Asp

Gly

Asp

Thr

Asn

Tyr

Ala

Pro

Ser

Phe

50

55

60

Gln

Gly

Gln

Val

Thr

Ile

Ser

Ala

Asp

Lys

Ser

Ile

Ser

Thr

Ala

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gln

Trp

Ser

Ser

Leu

Lys

Ala

Ser

Asp

Thr

Ala

Met

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Arg

Ser

Asp

Tyr

Tyr

Gly

Asp

Tyr

Gly

Phe

Ala

Tyr

Trp

Gly

Gln

100

105

110

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

Ser

115

120

<210> 124 <211> 120 <212> PRT <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> CDR Вариабельная последовательность тяжелой цепи <400> 124

Glu Val 1

Gln

Leu Val 5

Gln

Ser Gly

Ala Glu Val 10

Lys

Lys

Pro

Gly 15

Glu

Ser

Leu

Lys

Ile

Ser

Cys

Lys

Gly

Ser

Gly

Tyr

Ala

Phe

Ser

Ser

Ser

20

25

30

Trp

Met

Asn

Trp

Val

Arg

Gln

Met

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Met

35

40

45

Gly

Arg

Ile

Tyr

Ala

Gly

Asp

Ala

Asp

Thr

Ala

Tyr

Ser

Pro

Ser

Phe

50

55

60

Gln

Gly

Gln

Val

Thr

Ile

Ser

Ala

Asp

Lys

Ser

Ile

Ser

Thr

Ala

Tyr

- 97 030828

70 75 80

Leu

Gln

Trp

Ser

Ser Leu Lys 85

Ala

Ser

Asp 90

Thr

Ala

Met

Tyr

Tyr 95

Cys

Ala

Arg

Ser

Asp

Tyr

Tyr

Gly

Asp

Tyr

Gly

Phe

Ala

Tyr

Trp

Gly

Gln

100

105

110

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

Ser

115

120

<210> 125 <211> 120 <212> PRT <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> CDR Вариабельная последовательность тяжелой цепи <400> 125

Glu 1

Val

Gln Leu

Val 5

Gln

Ser Gly Ala Glu 10

Val

Lys

Lys

Pro

Gly 15

Glu

Ser

Leu

Lys

Ile

Ser

Cys

Lys

Gly

Ser

Gly

Tyr

Ala

Phe

Ser

Ser

Ser

20

25

30

Trp

Met

Asn

Trp

Val

Arg

Gln

Met

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Met

35

40

45

Gly

Arg

Ile

Tyr

Ala

Gly

Asp

Ala

Asp

Thr

Asn

Tyr

Ala

Pro

Ser

Phe

50

55

60

Gln

Gly

Gln

Val

Thr

Ile

Ser

Ala

Asp

Lys

Ser

Ile

Ser

Thr

Ala

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gln

Trp

Ser

Ser

Leu

Lys

Ala

Ser

Asp

Thr

Ala

Met

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Arg

Ser

Asp

Tyr

Tyr

Gly

Asp

Tyr

Gly

Phe

Ala

Tyr

Trp

Gly

Gln

100

105

110

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

Ser

115

120

<210>	126
<211>	117
<212>	PRT
<213>	Синтетическая последовательность
<220>

- 98 030828 <223> CDR Вариабельная последовательность тяжелой цепи <400> 126

Glu 1

Val

Lys

Leu

Val 5

Glu

Ser

Gly

Gly

Gly Leu Val 10

Lys

Pro

Gly 15

Gly

Ser

Leu

Lys

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr

Phe

Ser

Ser

Tyr

20

25

30

Thr

Met

Ser

Trp

Val

Arg

Gln

Thr

Pro

Glu

Lys

Arg

Leu

Glu

Trp

Val

35

40

45

Ala

Tyr

Ile

Ser

Ser

Gly

Gly

Gly

Asn

Thr

Tyr

Tyr

Pro

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Asn

Ala

Arg

Asn

Thr

Leu

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gln

Met

Ser

Ser

Leu

Arg

Ser

Glu

Asp

Thr

Ala

Met

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ser

Arg

His

Arg

Gly

Asn

Pro

Phe

Asp

Tyr

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Thr

100

105

110

Leu

Thr

Val

Ser

Ser

115 <210> 127 <211> 111 <212> PRT <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> Вариабельная последовательность легкой цепи <400> 127

Asp 1

Ile

Val

Leu

Thr 5

Gln

Ser

Pro

Ala

Ser 10

Leu

Ala

Val

Ser

Leu Gly 15

Gln

Arg

Ala

Thr

Ile

Ser

Cys

Arg

Ala

Ser

Lys

Ser

Val

Ser

Thr

Ser

20

25

30

Gly

Tyr

Ser

Phe

Met

His

Trp

Tyr

Gln

Gln

Lys

Pro

Gly

Gln

Pro

Pro

35

40

45

Lys

Leu

Leu

Ile

Tyr

Leu

Ala

Ser

Asn

Leu

Glu

Ser

Gly

Val

Pro

Ala

50

55

60

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Asn

Ile

His

- 99 030828

70 75 80

Pro

Val

Glu Glu

Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys

Gln His

Ser Arg 95

85

90

Glu

Leu

Pro

Trp

Thr

Phe

Gly

Gly

Gly

Thr

Lys

Leu

Glu

Ile

Lys

100

105

110

<210> 128 <211> 117 <212> PRT <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> CDR Вариабельная последовательность тяжелой цепи <400> 128

Glu 1

Val

Gln

Leu Leu Glu 5

Ser

Gly

Gly Gly 10

Leu

Val

Gln

Pro

Gly 15

Gly

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr

Phe

Ser

Ser

Tyr

20

25

30

Thr

Met

Ser

Trp

Val

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Val

35

40

45

Ser

Tyr

Ile

Ser

Ser

Gly

Gly

Gly

Asn

Thr

Tyr

Tyr

Pro

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Asn

Ser

Lys

Asn

Thr

Leu

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Lys

His

Arg

Gly

Asn

Pro

Phe

Asp

Tyr

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Leu

100

105

110

Val

Thr

Val

Ser

Ser

115 <210>

<211>

<212>

<213>

129

117

PRT

Синтетическая последовательность <220>

<223>

CDR Вариабельная последовательность тяжелой цепи <400> 129

- 100 030828

Glu 1

Val

Gln

Leu Leu Glu 5

Ser

Gly

Gly Gly 10

Leu

Val

Gln

Pro

Gly 15

Gly

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr

Phe

Ser

Ser

Tyr

20

25

30

Thr

Met

Ser

Trp

Val

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Val

35

40

45

Ser

Ala

Ile

Asp

His

Gly

Gly

Gly

Gln

Thr

Leu

Tyr

Pro

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Asn

Ser

Lys

Asn

Thr

Leu

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Arg

His

Arg

Gly

Asn

Pro

Phe

Asp

Tyr

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Leu

100

105

110

Val

Thr

Val

Ser

Ser

115 <210> 130 <211> 117 <212> PRT <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> CDR Вариабельная последовательность тяжелой цепи <400> 130

Glu 1

Val

Gln

Leu

Leu Glu 5

Ser Gly Gly

Gly 10

Leu

Val

Gln

Pro

Gly 15

Gly

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr

Phe

Ser

Ser

Tyr

20

25

30

Thr

Met

Ser

Trp

Val

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Val

35

40

45

Ser

Val

Ile

Asp

His

Gly

Gly

Gly

Ser

Thr

His

Tyr

Pro

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Asn

Ser

Lys

Asn

Thr

Leu

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

- 101 030828

Ala Arg His

Arg Gly Asn Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105110

Val Thr Val Ser Ser

115 <210>131 <211>117 <212> PRT <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> CDR Вариабельная последовательность тяжелой цепи <400> 131

Gln 1

Val

Gln

Leu

Val 5

Glu

Ser Gly

Gly Gly 10

Leu

Val

Lys

Pro

Gly 15

Gly

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr

Phe

Ser

Ser

Tyr

20

25

30

Thr

Met

Ser

Trp

Ile

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Val

35

40

45

Ser

Tyr

Ile

Ser

Ser

Gly

Gly

Gly

Asn

Thr

Tyr

Tyr

Pro

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Asn

Ala

Lys

Asn

Ser

Leu

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Arg

His

Arg

Gly

Asn

Pro

Phe

Asp

Tyr

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Leu

100

105

110

Val

Thr

Val

Ser

Ser

115 <210>

<211>

<212>

<213>

132

117

PRT

Синтетическая последовательность <220>

<223>

CDR Вариабельная последовательность тяжелой цепи <400> 132

- 102 030828

Gln 1

Val

Gln

Leu

Val 5

Glu

Ser Gly

Gly Gly 10

Leu

Val

Lys

Pro

Gly 15

Gly

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr

Phe

Ser

Ser

Tyr

20

25

30

Gly

Met

Ser

Trp

Ile

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Val

35

40

45

Ser

Tyr

Ile

Asp

Arg

Gly

Gly

Gly

Val

Thr

Ile

Tyr

Pro

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Asn

Ala

Lys

Asn

Ser

Leu

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Arg

His

Arg

Gly

Asn

Pro

Phe

Asp

Tyr

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Leu

100

105

110

Val

Thr

Val

Ser

Ser

115 <210> 133 <211> 117 <212> PRT <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> CDR Вариабельная последовательность тяжелой цепи <400> 133

Gln 1

Val

Gln Leu Val 5

Glu

Ser

Gly

Gly

Gly 10

Leu

Val

Lys

Pro

Gly 15

Gly

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr

Phe

Ser

Ser

Tyr

20

25

30

Gly

Met

Ser

Trp

Ile

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Val

35

40

45

Ser

Tyr

Ile

Asp

Glu

Gly

Gly

Gly

Gln

Thr

Ile

Tyr

Pro

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Asn

Ala

Lys

Asn

Ser

Leu

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

- 103 030828

Ala Arg His

Arg Gly Asn Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105110

Val Thr Val Ser Ser

115 <210>134 <211>117 <212> PRT <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> CDR Вариабельная последовательность тяжелой цепи <400> 134

Gln 1

Val

Gln

Leu

Val 5

Glu

Ser Gly

Gly Gly 10

Leu

Val

Lys

Pro

Gly 15

Gly

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr

Phe

Ser

Ser

Tyr

20

25

30

Ser

Met

Ser

Trp

Ile

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Val

35

40

45

Ser

Tyr

Ile

Asp

Ala

Gly

Gly

Gly

Phe

Thr

Ile

Tyr

Pro

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Asn

Ala

Lys

Asn

Ser

Leu

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Arg

His

Arg

Gly

Asn

Pro

Phe

Asp

Tyr

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Leu

100

105

110

Val

Thr

Val

Ser

Ser

115 <210>

<211>

<212>

<213>

135

117

PRT

Синтетическая последовательность <220>

<223>

CDR Вариабельная последовательность тяжелой цепи <400> 135

- 104 030828

Gln 1

Val

Gln

Leu

Val 5

Glu

Ser Gly

Gly Gly 10

Leu

Val

Lys

Pro

Gly 15

Gly

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr

Phe

Ser

Ser

Tyr

20

25

30

Ser

Met

Ser

Trp

Ile

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Val

35

40

45

Ser

His

Ile

Asp

Ala

Gly

Gly

Gly

Arg

Thr

Trp

Tyr

Pro

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Asn

Ala

Lys

Asn

Ser

Leu

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Arg

His

Arg

Gly

Asn

Pro

Phe

Asp

Tyr

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Leu

100

105

110

Val

Thr

Val

Ser

Ser

115 <210> 136 <211> 117 <212> PRT <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> CDR Вариабельная последовательность тяжелой цепи <400> 136

Gln 1

Val

Gln Leu Val 5

Glu

Ser

Gly

Gly

Gly 10

Leu

Val

Lys

Pro

Gly 15

Gly

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr

Phe

Ser

Ser

Tyr

20

25

30

Pro

Met

Ser

Trp

Ile

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Val

35

40

45

Ser

His

Ile

Ala

Thr

Gly

Gly

Gly

Asn

Thr

Tyr

Tyr

Pro

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Asn

Ala

Lys

Asn

Ser

Leu

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

- 105 030828

Ala Arg His

Arg Gly Asn Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115 <210> 137 <211> 111 <212> PRT <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> Вариабельная последовательность легкой цепи <400> 137

Asp 1

Ile

Gln

Met

Thr 5

Gln

Ser

Pro

Ser

Ser 10

Leu

Ser

Ala

Ser

Val 15

Gly

Asp

Arg

Val

Thr

Ile

Thr

Cys

Arg

Ala

Ser

Lys

Ser

Val

Ser

Thr

Ser

20

25

30

Gly

Tyr

Ser

Phe

Met

His

Trp

Tyr

Gln

Gln

Lys

Pro

Gly

Lys

Ala

Pro

35

40

45

Lys

Leu

Leu

Ile

Tyr

Leu

Ala

Ser

Asn

Leu

Glu

Ser

Gly

Val

Pro

Ser

50

55

60

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

65

70

75

80

Ser

Leu

Gln

Pro

Glu

Asp

Phe

Ala

Thr

Tyr

Tyr

Cys

Gln

His

Ser

Arg

85

90

95

Glu

Leu

Pro

Trp

Thr

Phe

Gly

Gln

Gly

Thr

Lys

Val

Glu

Ile

Lys

100

105

110

<210>	138
<211>	111
<212>	PRT
<213>	Синтетическая	последовательность
<220>
<223>	Вариабельная	последовательность легкой цепи
<400>	138
Asp Ile	Gln Met Thr	Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala	Ser Val Gly
1	5	10	15

- 106 030828

Asp Arg Val

Thr 20

Ile

Thr Cys

Arg

Ala 25

Ser

Lys

Ser

Val

Ser 30

Thr

Ser

Gly

Tyr

Ser

Phe

Met

His

Trp

Tyr

Gln

Gln

Lys

Pro

Gly

Lys

Ala

Pro

35

40

45

Lys

Leu

Leu

Ile

Tyr

Val

Gly

Ser

Arg

Leu

Asp

Tyr

Gly

Val

Pro

Ser

50

55

60

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

65

70

75

80

Ser

Leu

Gln

Pro

Glu

Asp

Phe

Ala

Thr

Tyr

Tyr

Cys

Gln

His

Ser

Arg

85

90

95

Glu

Leu

Pro

Trp

Thr

Phe

Gly

Gln

Gly

Thr

Lys

Val

Glu

Ile

Lys

100

105

110

<210> 139 <211> 111 <212> PRT <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> Вариабельная последовательность легкой цепи <400> 139

Asp 1

Ile

Gln

Met

Thr 5

Gln

Ser

Pro

Ser

Ser 10

Leu

Ser

Ala

Ser

Val 15

Gly

Asp

Arg

Val

Thr

Ile

Thr

Cys

Arg

Ala

Ser

Lys

Ser

Val

Ser

His

Val

20

25

30

Arg

Trp

Ser

Phe

Met

His

Trp

Tyr

Gln

Gln

Lys

Pro

Gly

Lys

Ala

Pro

35

40

45

Lys

Leu

Leu

Ile

Tyr

Leu

Ala

Ser

Asn

Leu

Glu

Ser

Gly

Val

Pro

Ser

50

55

60

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

65

70

75

80

Ser

Leu

Gln

Pro

Glu

Asp

Phe

Ala

Thr

Tyr

Tyr

Cys

Gln

His

Ser

Arg

85

90

95

Glu

Leu

Pro

Trp

Thr

Phe

Gly

Gln

Gly

Thr

Lys

Val

Glu

Ile

Lys

100

105

110

<210> 140

- 107 030828 <211> 111 <212> PRT <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> Вариабельная последовательность легкой цепи <400> 140

Asp 1

Ile

Gln

Met

Thr 5

Gln

Ser

Pro

Ser

Ser 10

Leu

Ser

Ala

Ser

Val 15

Gly

Asp

Arg

Val

Thr

Ile

Thr

Cys

Arg

Ala

Ser

Lys

Ser

Val

Ser

Thr

Ser

20

25

30

Gly

Tyr

Ser

Phe

Met

His

Trp

Tyr

Gln

Gln

Lys

Pro

Gly

Lys

Ala

Pro

35

40

45

Lys

Leu

Leu

Ile

Tyr

Leu

Ala

Ser

Asn

Leu

Glu

Ser

Gly

Val

Pro

Ser

50

55

60

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Phe

Thr

Ile

Ser

65

70

75

80

Ser

Leu

Gln

Pro

Glu

Asp

Ile

Ala

Thr

Tyr

Tyr

Cys

Gln

His

Ser

Arg

85

90

95

Glu

Leu

Pro

Trp

Thr

Phe

Gly

Gln

Gly

Thr

Lys

Val

Glu

Ile

Lys

100

105

110

<210> 141 <211> 111 <212> PRT <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> Вариабельная последовательность легкой цепи <400> 141

Asp 1

Ile

Gln

Met

Thr 5

Gln

Ser

Pro

Ser

Ser 10

Leu

Ser

Ala

Ser

Val 15

Gly

Asp

Arg

Val

Thr

Ile

Thr

Cys

Arg

Ala

Ser

Lys

Ser

Val

Ser

Ala

Trp

20

25

30

Gly

Tyr

Ser

Phe

Met

His

Trp

Tyr

Gln

Gln

Lys

Pro

Gly

Lys

Ala

Pro

35

40

45

Lys

Leu

Leu

Ile

Tyr

Val

Ala

Ser

Arg

Leu

Glu

Ser

Gly

Val

Pro

Ser

50

55

60

- 108 030828

Arg 65

Phe

Ser

Gly

Ser Gly 70

Ser Gly

Thr

Asp

Phe 75

Thr

Phe

Thr

Ile

Ser 80

Ser

Leu

Gln

Pro

Glu

Asp

Ile

Ala

Thr

Tyr

Tyr

Cys

Gln

His

Ser

Arg

85

90

95

Glu

Leu

Pro

Trp

Thr

Phe

Gly

Gln

Gly

Thr

Lys

Val

Glu

Ile

Lys

100

105

110

<210> 142 <211> 111 <212> PRT <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> Вариабельная последовательность легкой цепи <400> 142

Asp 1

Ile

Gln

Met

Thr 5

Gln

Ser

Pro

Ser

Ser 10

Leu

Ser

Ala

Ser

Val 15

Gly

Asp

Arg

Val

Thr

Ile

Thr

Cys

Arg

Ala

Ser

Lys

Ser

Val

Ser

His

Val

20

25

30

Arg

Trp

Ser

Phe

Met

His

Trp

Tyr

Gln

Gln

Lys

Pro

Gly

Lys

Ala

Pro

35

40

45

Lys

Leu

Leu

Ile

Tyr

Leu

Ala

Ser

Lys

Leu

Glu

Ser

Gly

Val

Pro

Ser

50

55

60

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Phe

Thr

Ile

Ser

65

70

75

80

Ser

Leu

Gln

Pro

Glu

Asp

Ile

Ala

Thr

Tyr

Tyr

Cys

Gln

His

Ser

Arg

85

90

95

Glu

Leu

Pro

Trp

Thr

Phe

Gly

Gln

Gly

Thr

Lys

Val

Glu

Ile

Lys

100

105

110

<210>	143
<211>	111
<212>	PRT
<213>	Синтетическая	последовательность
<220>
<223>	Вариабельная	последовательность легкой цепи
<400>	143
Asp Ile	Gln Met Thr	Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala	Ser Val Gly
1	5	10	15

- 109 030828

Asp Arg Val

Thr 20

Ile

Thr Cys

Arg

Ala 25

Ser

Lys

Ser

Val

Ser 30

Glu

Gly

Arg

Trp

Ser

Phe

Met

His

Trp

Tyr

Gln

Gln

Lys

Pro

Gly

Lys

Ala

Pro

35

40

45

Lys

Leu

Leu

Ile

Tyr

Val

Ala

Ser

Arg

Leu

Glu

Ser

Gly

Val

Pro

Ser

50

55

60

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Phe

Thr

Ile

Ser

65

70

75

80

Ser

Leu

Gln

Pro

Glu

Asp

Ile

Ala

Thr

Tyr

Tyr

Cys

Gln

His

Ser

Arg

85

90

95

Glu

Leu

Pro

Trp

Thr

Phe

Gly

Gln

Gly

Thr

Lys

Val

Glu

Ile

Lys

100

105

110

<210> 144 <211> 111 <212> PRT <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> Вариабельная последовательность легкой цепи <400> 144

Asp 1

Ile

Gln

Met

Thr 5

Gln

Ser

Pro

Ser

Ser 10

Leu

Ser

Ala

Ser

Val 15

Gly

Asp

Arg

Val

Thr

Ile

Thr

Cys

Arg

Ala

Ser

Lys

Ser

Val

Ser

Leu

Asp

20

25

30

Arg

Trp

Ser

Phe

Met

His

Trp

Tyr

Gln

Gln

Lys

Pro

Gly

Lys

Ala

Pro

35

40

45

Lys

Leu

Leu

Ile

Tyr

Leu

Ala

Ser

Asn

Leu

Glu

Ser

Gly

Val

Pro

Ser

50

55

60

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Phe

Thr

Ile

Ser

65

70

75

80

Ser

Leu

Gln

Pro

Glu

Asp

Ile

Ala

Thr

Tyr

Tyr

Cys

Gln

His

Ser

Arg

85

90

95

Glu

Leu

Pro

Trp

Thr

Phe

Gly

Gln

Gly

Thr

Lys

Val

Glu

Ile

Lys

100

105

110

- 110 030828

<210> <211> <212> <213>

145 117 PRT Синтетическая последовательность

<220>

<223> CDR Вариабельная последовательность тяжелой цепи <400>145

Glu 1

Val

Gln

Leu Leu Glu 5

Ser

Gly

Gly Gly 10

Leu

Val

Gln

Pro

Gly 15

Gly

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr

Phe

Ser

Ser

Tyr

20

25

30

Thr

Met

Ser

Trp

Val

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Val

35

40

45

Ser

Tyr

Ile

Ser

Ser

Gly

Gly

Gly

Asn

Thr

Tyr

Tyr

Pro

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Asn

Ser

Lys

Asn

Thr

Leu

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Arg

His

Arg

Gly

Asn

Pro

Phe

Asp

Tyr

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Leu

100

105

110

Val

Thr

Val

Ser

Ser

115 <210>146 <211>117 <212> PRT <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> CDR Вариабельная последовательность тяжелой цепи <400> 146

Glu 1

Val

Gln Leu

Leu 5

Glu

Ser

Gly Gly Gly Leu 10

Val

Gln

Pro

Gly 15

Gly

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr

Phe

Ser

Ser

Tyr

20

25

30

Thr

Met

Ser

Trp

Val

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Val

35

40

45

- 111 030828

Ser

Ala 50

Ile

Asp

His

Gly

Gly 55

Gly

Arg Thr Tyr

Tyr 60

Pro

Asp

Ser

Val

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Asn

Ser

Lys

Asn

Thr

Leu

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Arg

His

Arg

Gly

Asn

Pro

Phe

Asp

Tyr

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Leu

100

105

110

Val

Thr

Val

Ser

Ser

115 <210> 147 <211> 117 <212> PRT <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> CDR Вариабельная последовательность тяжелой цепи <400> 147

Glu 1

Val

Gln Leu

Leu Glu 5

Ser

Gly Gly

Gly 10

Leu

Val

Gln

Pro

Gly 15

Gly

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr

Phe

Ser

Ser

Tyr

20

25

30

Thr

Met

Ser

Trp

Val

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Val

35

40

45

Ser

Ala

Ile

Asp

Gly

Gly

Gly

Gly

Ala

Thr

Tyr

Tyr

Pro

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Asn

Ser

Lys

Asn

Thr

Leu

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Arg

His

Arg

Gly

Asn

Pro

Phe

Asp

Tyr

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

Leu

100

105

110

Val Thr Val Ser Ser

115

- 112 030828

<210> <211> <212> <213>

148 111 PRT Синтетическая последовательность

<220>

<223> Вариабельная последовательность легкой цепи <400> 148

Asp 1

Ile

Gln

Met

Thr 5

Gln

Ser

Pro

Ser

Ser 10

Leu

Ser

Ala

Ser

Val 15

Gly

Asp

Arg

Val

Thr

Ile

Thr

Cys

Arg

Ala

Ser

Lys

Ser

Val

Ser

Tyr

Val

20

25

30

Arg

Trp

Ser

Phe

Met

His

Trp

Tyr

Gln

Gln

Lys

Pro

Gly

Lys

Ala

Pro

35

40

45

Lys

Leu

Leu

Ile

Tyr

Leu

Ala

Ser

Asn

Leu

Glu

Ser

Gly

Val

Pro

Ser

50

55

60

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

65

70

75

80

Ser

Leu

Gln

Pro

Glu

Asp

Phe

Ala

Thr

Tyr

Tyr

Cys

Gln

His

Ser

Arg

85

90

95

Glu

Leu

Pro

Trp

Thr

Phe

Gly

Gln

Gly

Thr

Lys

Val

Glu

Ile

Lys

100

105

110

<210>

149

<211>

240

<212>

PRT

<213>

Homo

sapiens

<400>

149

Thr

Pro

Ala

Pro

Lys

Ser

Cys

Pro

Glu

Arg

His

Tyr

Trp

Ala

Gln

Gly

1

5

10

15

Lys

Leu

Cys

Cys

Gln

Met

Cys

Glu

Pro

Gly

Thr

Phe

Leu

Val

Lys

Asp

20

25

30

Cys

Asp

Gln

His

Arg

Lys

Ala

Ala

Gln

Cys

Asp

Pro

Cys

Ile

Pro

Gly

35

40

45

Val

Ser

Phe

Ser

Pro

Asp

His

His

Thr

Arg

Pro

His

Cys

Glu

Ser

Cys

50

55

60

Arg

His

Cys

Asn

Ser

Gly

Leu

Leu

Val

Arg

Asn

Cys

Thr

Ile

Thr

Ala

70 75 80

- 113 030828

Asn

Ala Glu

Cys

Ala 85

Cys

Arg Asn

Gly

Trp 90

Gln

Cys

Arg

Asp

Lys 95

Glu

Cys

Thr

Glu

Cys

Asp

Pro

Leu

Pro

Asn

Pro

Ser

Leu

Thr

Ala

Arg

Ser

100

105

110

Ser

Gln

Ala

Leu

Ser

Pro

His

Pro

Gln

Pro

Thr

His

Leu

Pro

Tyr

Val

115

120

125

Ser

Glu

Met

Leu

Glu

Ala

Arg

Thr

Ala

Gly

His

Met

Gln

Thr

Leu

Ala

130

135

140

Asp

Phe

Arg

Gln

Leu

Pro

Ala

Arg

Thr

Leu

Ser

Thr

His

Trp

Pro

Pro

145

150

155

160

Gln

Arg

Ser

Leu

Cys

Ser

Ser

Asp

Phe

Ile

Arg

Ile

Leu

Val

Ile

Phe

165

170

175

Ser

Gly

Met

Phe

Leu

Val

Phe

Thr

Leu

Ala

Gly

Ala

Leu

Phe

Leu

His

180

185

190

Gln

Arg

Arg

Lys

Tyr

Arg

Ser

Asn

Lys

Gly

Glu

Ser

Pro

Val

Glu

Pro

195

200

205

Ala

Glu

Pro

Cys

Arg

Tyr

Ser

Cys

Pro

Arg

Glu

Glu

Glu

Gly

Ser

Thr

210

215

220

Ile

Pro

Ile

Gln

Glu

Asp

Tyr

Arg

Lys

Pro

Glu

Pro

Ala

Cys

Ser

Pro

225

230

235

240

<210>

150

<211>

193

<212>

PRT

<213>

Homo

sapiens

<400>

150

Met

Pro

Glu

Glu

Gly

Ser

Gly

Cys

Ser

Val

Arg

Arg

Arg

Pro

Tyr

Gly

1

5

10

15

Cys

Val

Leu

Arg

Ala

Ala

Leu

Val

Pro

Leu

Val

Ala

Gly

Leu

Val

Ile

20

25

30

Cys

Leu

Val

Val

Cys

Ile

Gln

Arg

Phe

Ala

Gln

Ala

Gln

Gln

Gln

Leu

35

40

45

Pro

Leu

Glu

Ser

Leu

Gly

Trp

Asp

Val

Ala

Glu

Leu

Gln

Leu

Asn

His

50

55

60

- 114 030828

Thr 65

Gly

Pro

Gln Gln Asp 70

Pro

Arg

Leu

Tyr

Trp 75

Gln

Gly

Gly

Pro

Ala 80

Leu

Gly

Arg

Ser

Phe

Leu

His

Gly

Pro

Glu

Leu

Asp

Lys

Gly

Gln

Leu

85

90

95

Arg

Ile

His

Arg

Asp

Gly

Ile

Tyr

Met

Val

His

Ile

Gln

Val

Thr

Leu

100

105

110

Ala

Ile

Cys

Ser

Ser

Thr

Thr

Ala

Ser

Arg

His

His

Pro

Thr

Thr

Leu

115

120

125

Ala

Val

Gly

Ile

Cys

Ser

Pro

Ala

Ser

Arg

Ser

Ile

Ser

Leu

Leu

Arg

130

135

140

Leu

Ser

Phe

His

Gln

Gly

Cys

Thr

Ile

Ala

Ser

Gln

Arg

Leu

Thr

Pro

145

150

155

160

Leu

Ala

Arg

Gly

Asp

Thr

Leu

Cys

Thr

Asn

Leu

Thr

Gly

Thr

Leu

Leu

165

170

175

Pro

Ser

Arg

Asn

Thr

Asp

Glu

Thr

Phe

Phe

Gly

Val

Gln

Trp

Val

Arg

180

185

190

Pro <210> 151 <211> 12 <212> PRT <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> Вариабельная последовательность тяжелой цепи CDR

<220> <221> <222>	Xaa (3).	может .(3)	представлять	собой	любую	природную	аминокислоту
<220> <221> <222>	Xaa (4).	может .(4)	представлять	собой	любую	природную	аминокислоту
<220> <221> <222>	Xaa (5).	может .(5)	представлять	собой	любую	природную	аминокислоту
<220> <221> <222>	Xaa (7).	может .(7)	представлять	собой	любую	природную	аминокислоту

- 115 030828

<220> <221> <222>	Xaa (10)	может 1..(10)	представлять	собой	любую	природную	аминокислоту
<220> <221> <222>	Xaa (12)	может ..(12)	представлять 1	собой	любую	природную	аминокислоту
<400>	151

Arg Ile Xaa Xaa Xaa Asp Xaa Asp Thr Xaa Tyr Xaa

510 <210>152 <211>17 <212> PRT <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> Вариабельная последовательность тяжелой цепи CDR

<220> <221> <222>	Xaa (4).	может .(4)	представлять
<220>
<221>	Xaa	может	представлять
<222>	(7).	.(7)
<220>
<221>	Xaa	может	представлять
<222>	(12)	..(12)	1
<220>
<221>	Xaa	может	представлять
<222>	(13)	..(13)	1

<400> 152

собой	любую	природную	аминокислоту
собой	любую	природную	аминокислоту
собой	любую	природную	аминокислоту
собой	любую	природную	аминокислоту

Arg Ile Tyr Xaa Gly Asp Xaa Asp Thr Asn Tyr Xaa Xaa Lys Phe Lys

5 10 15

Gly

<210>	153
<211>	13
<212>	PRT
<213>	Синтетическая	последовательность
<220> <223>	Вариабельная	последовательность легкой цепи CDR

<220>

<221> Xaa может представлять собой любую природную аминокислоту <222> (8)..(8) <220>

- 116 030828

<221> <222>	Xaa (11)	может 1..(11)	представлять	собой	любую	природную	аминокислоту
<220> <221> <222>	Xaa (13)	может 1..(13)	представлять 1	собой	любую	природную	аминокислоту
<400>	153

Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Xaa Ala

Gly Xaa Ser Xaa

<210>	154
<211>	7
<212>	PRT
<213>	Синтетическая	последовательность
<220>
<223>	Вариабельная	последовательность легкой цепи CDR

<220>

<221> Xaa может представлять собой любую природную аминокислоту <222> (1)..(1) <400>154

Xaa Ala Ser Asn Leu Glu Ser

<210>	155
<211>	16
<212>	PRT
<213>	Синтетическая	последовательность
<220> <223>	Вариабельная	последовательность легкой цепи CDR

<220> <221> <222>	Xaa (9),	может . .(9)	представлять
<220>
<221>	Xaa	может	представлять
<222>	(10)	..(10)
<220>
<221>	Xaa	может	представлять
<222>	(11)	..(11)
<220>
<221>	Xaa	может	представлять
<222>	(14)	..(14)	1

<400> 155

собой	любую	природную	аминокислоту
собой	любую	природную	аминокислоту
собой	любую	природную	аминокислоту
собой	любую	природную	аминокислоту

Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Xaa

5

Xaa Xaa Met Ser Xaa Met Asn

15

- 117 030828 <210> 156 <211> 17 <212> PRT <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> Вариабельная последовательность тяжелой цепи CDR <220>

<221> <222>	Xaa (1).	может .(1)	представлять	собой	любую	природную	аминокислоту
<220> <221> <222>	Xaa (3).	может .(3)	представлять	собой	любую	природную	аминокислоту
<220> <221> <222>	Xaa (4).	может .(4)	представлять	собой	любую	природную	аминокислоту
<220> <221> <222>	Xaa (8).	может .(8)	представлять	собой	любую	природную	аминокислоту
<220> <221> <222>	Xaa (10)	может ..(10)	представлять 1	собой	любую	природную	аминокислоту

<400> 156

Xaa Ile Xaa Xaa Gly Gly Gly Xaa Thr Xaa Tyr Pro Asp Ser Val Lys

5 1015

Gly <210>157 <211>17 <212> PRT <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> Вариабельная последовательность тяжелой цепи CDR

<220> <221> <222>	Xaa (1).	может . .(1)	представлять	собой	любую	природную	аминокислоту
<220> <221> <222>	Xaa (3).	может .(3)	представлять	собой	любую	природную	аминокислоту
<220> <221> <222>	Xaa (4).	может .(4)	представлять	собой	любую	природную	аминокислоту
<220> <221> <222>	Xaa (8).	может .(8)	представлять	собой	любую	природную	аминокислоту

- 118 030828 <220>

<221> Xaa может представлять собой любую природную аминокислоту <222> (10)..(10) <400>157

Xaa Ile Xaa Xaa Gly Gly Gly Xaa Thr Xaa Tyr Pro Asp Ser Val Lys

5 1015

Gly

<210>	158
<211>	15
<212>	PRT
<213>	Синтетическая	последовательность
<220> <223>	Вариабельная	последовательность легкой цепи CDR

<220>

<221> <222>	Xaa (8).	может .(8)	представлять	собой	любую	природную	аминокислоту
<220> <221> <222>	Xaa (9),	может . .(9)	представлять	собой	любую	природную	аминокислоту
<220> <221> <222>	Xaa (10)	может ..(10)	представлять	собой	любую	природную	аминокислоту
<220> <221> <222>	Xaa (11)	может ..(11)	представлять 1	собой	любую	природную	аминокислоту

<400> 158

Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Ser Phe Met His

5 1015 <210>159 <211>327 <212> PRT <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> Константный участок тяжелой цепи

<400>

159

Ala

Ser

Thr

Lys

Gly

Pro

Ser

Val

Phe

Pro

Leu

Ala

Pro

Cys

Ser

Arg

1

5

10

15

Ser

Thr

Ser

Glu

Ser

Thr

Ala

Ala

Leu

Gly

Cys

Leu

Val

Lys

Asp

Tyr

20

25

30

- 119 030828

Phe

Pro

Glu 35

Pro

Val

Thr Val

Ser 40

Trp

Asn

Ser

Gly

Ala 45

Leu

Thr

Ser

Gly

Val

His

Thr

Phe

Pro

Ala

Val

Leu

Gln

Ser

Ser

Gly

Leu

Tyr

Ser

50

55

60

Leu

Ser

Ser

Val

Val

Thr

Val

Pro

Ser

Ser

Ser

Leu

Gly

Thr

Lys

Thr

65

70

75

80

Tyr

Thr

Cys

Asn

Val

Asp

His

Lys

Pro

Ser

Asn

Thr

Lys

Val

Asp

Lys

85

90

95

Arg

Val

Glu

Ser

Lys

Tyr

Gly

Pro

Pro

Cys

Pro

Pro

Cys

Pro

Ala

Pro

100

105

110

Glu

Ala

Ala

Gly

Gly

Pro

Ser

Val

Phe

Leu

Phe

Pro

Pro

Lys

Pro

Lys

115

120

125

Asp

Thr

Leu

Met

Ile

Ser

Arg

Thr

Pro

Glu

Val

Thr

Cys

Val

Val

Val

130

135

140

Asp

Val

Ser

Gln

Glu

Asp

Pro

Glu

Val

Gln

Phe

Asn

Trp

Tyr

Val

Asp

145

150

155

160

Gly

Val

Glu

Val

His

Asn

Ala

Lys

Thr

Lys

Pro

Arg

Glu

Glu

Gln

Phe

165

170

175

Asn

Ser

Thr

Tyr

Arg

Val

Val

Ser

Val

Leu

Thr

Val

Leu

His

Gln

Asp

180

185

190

Trp

Leu

Asn

Gly

Lys

Glu

Tyr

Lys

Cys

Lys

Val

Ser

Asn

Lys

Gly

Leu

195

200

205

Pro

Ser

Ser

Ile

Glu

Lys

Thr

Ile

Ser

Lys

Ala

Lys

Gly

Gln

Pro

Arg

210

215

220

Glu

Pro

Gln

Val

Tyr

Thr

Leu

Pro

Pro

Ser

Gln

Glu

Glu

Met

Thr

Lys

225

230

235

240

Asn

Gln

Val

Ser

Leu

Thr

Cys

Leu

Val

Lys

Gly

Phe

Tyr

Pro

Ser

Asp

245

250

255

Ile

Ala

Val

Glu

Trp

Glu

Ser

Asn

Gly

Gln

Pro

Glu

Asn

Asn

Tyr

Lys

260

265

270

Thr

Thr

Pro

Pro

Val

Leu

Asp

Ser

Asp

Gly

Ser

Phe

Phe

Leu

Tyr

Ser

275

280

285

- 120 030828

Arg

Leu 290

Thr

Val

Asp

Lys

Ser 295

Arg

Trp

Gln

Glu

Gly 300

Asn

Val

Phe

Ser

Cys 305

Ser

Val

Met

His

Glu 310

Ala

Leu

His

Asn

His 315

Tyr

Thr

Gln

Lys

Ser 320

Leu

Ser

Leu

Ser

Leu 325

Gly

Lys

<210>	160
<211>	107
<212>	PRT
<213>	Синтетическая последовательность
<220>
<223>	Константный участок легкой цепи
<400>	160

Arg 1

Thr

Val

Ala

Ala 5

Pro

Ser

Val

Phe

Ile 10

Phe

Pro

Pro

Ser

Asp 15

Glu

Gln

Leu

Lys

Ser

Gly

Thr

Ala

Ser

Val

Val

Cys

Leu

Leu

Asn

Asn

Phe

20

25

30

Tyr

Pro

Arg

Glu

Ala

Lys

Val

Gln

Trp

Lys

Val

Asp

Asn

Ala

Leu

Gln

35

40

45

Ser

Gly

Asn

Ser

Gln

Glu

Ser

Val

Thr

Glu

Gln

Asp

Ser

Lys

Asp

Ser

50

55

60

Thr

Tyr

Ser

Leu

Ser

Ser

Thr

Leu

Thr

Leu

Ser

Lys

Ala

Asp

Tyr

Glu

65

70

75

80

Lys

His

Lys

Val

Tyr

Ala

Cys

Glu

Val

Thr

His

Gln

Gly

Leu

Ser

Ser

85

90

95

Pro

Val

Thr

Lys

Ser

Phe

Asn

Arg

Gly

Glu

Cys

100

105

<210> 161 <211> 5 <212> PRT <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> Вариабельная последовательность тяжелой цепи CDR <400> 161

Ser Tyr Gly Met Ser

- 121 030828 <210> 162 <211> 11 <212> PRT <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> Вариабельная последовательность тяжелой цепи CDR <400>162

Ala Asp Tyr Tyr Gly Asp Tyr Gly Phe Gly Tyr

510 <210>163 <211>654 <212> ДНК <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> Последовательность легкой цепи антитела <400> 163

gacatccaga	tgacccagag	ccccagcagc	ctgagcgcca	gcgtgggcga	ccgggtgacc	60
atcacctgcc	gggccagcaa	gagcgtgagc	gaggggcgat	ggagcttcat	gcactggtac	120
cagcagaagc	ccggcaaggc	ccccaagctg	ctgatctacg	tggccagcag	actggagagc	180
ggcgtgccca	gccggttcag	cggcagcggc	agcggcaccg	acttcacctt	caccatcagc	240
agcctgcagc	ccgaggacat	cgccacctac	tactgccagc	acagccggga	gctgccctgg	300
accttcggcc	agggcaccaa	ggtggagatc	aagcgtacgg	tggctgcacc	atctgtcttc	360
atcttcccgc	catctgatga	gcagttgaaa	tctggaactg	cctctgttgt	gtgcctgctg	420
aataacttct	atcccagaga	ggccaaagta	cagtggaagg	tggataacgc	cctccaatcg	480
ggtaactccc	aggagagtgt	cacagagcag	gacagcaagg	acagcaccta	cagcctcagc	540
agcaccctga	cgctgagcaa	agcagactac	gagaaacaca	aagtctacgc	ctgcgaagtc	600
acccatcagg	gcctgagctc	gcccgtcaca	aagagcttca	acaggggaga	gtgt	654

<210> 164 <211> 1332 <212> ДНК <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> Последовательность тяжелой цепи антитела <400> 164

caggtgcagc	tggtggagag	cggcggcggc	ctggtgaagc	ccggcggcag	cctgcggctg	60
agctgcgccg	ccagcggctt	caccttcagc	agctacggga	tgagctggat	ccggcaggcc	120
cccggcaagg	gcctggagtg	ggtgagctac	atcgatgagg	gcggcggcca	gaccatctac	180

- 122 030828

cccgacagcg	tgaagggccg	gttcaccatc	agccgggaca	acgccaagaa	cagcctgtac	240
ctgcagatga	acagcctgcg	ggccgaggac	accgccgtgt	actactgcgc	ccggcaccgg	300
ggcaacccct	tcgactactg	gggccagggc	accctggtga	ccgtgagcag	cgcttccacc	360
aagggcccat	ccgtcttccc	cctggcgccc	tgctccagga	gcacctccga	gagcacagcc	420
gccctgggct	gcctggtcaa	ggactacttc	cccgaaccgg	tgacggtgtc	gtggaactca	480
ggcgccctga	ccagcggcgt	gcacaccttc	ccggctgtcc	tacagtcctc	aggactctac	540
tccctcagca	gcgtggtgac	cgtgccctcc	agcagcttgg	gcacgaaaac	ctacacctgc	600
aacgtagatc	acaagcccag	caacaccaag	gtggacaaga	gagttgagtc	caaatatggt	660
cccccatgcc	caccatgccc	agcacctgag	gccgccgggg	gaccatcagt	cttcctgttc	720
cccccaaaac	ccaaggacac	tctcatgatc	tcccggaccc	ctgaggtcac	gtgcgtggtg	780
gtggacgtga	gccaggaaga	ccccgaggtc	cagttcaact	ggtacgtgga	tggcgtggag	840
gtgcataatg	ccaagacaaa	gccgcgggag	gagcagttca	acagcacgta	ccgtgtggtc	900
agcgtcctca	ccgtcctgca	ccaggactgg	ctgaacggca	aggagtacaa	gtgcaaggtc	960
tccaacaaag	gcctcccgtc	ctccatcgag	aaaaccatct	ccaaagccaa	agggcagccc	1020
cgagagccac	aggtgtacac	cctgccccca	tcccaggagg	agatgaccaa	gaaccaggtc	1080
agcctgacct	gcctggtcaa	aggcttctac	cccagcgaca	tcgccgtgga	gtgggagagc	1140
aatgggcagc	cggagaacaa	ctacaagacc	acgcctcccg	tgctggactc	cgacggctcc	1200
ttcttcctct	acagcaggct	aaccgtggac	aagagcaggt	ggcaggaggg	gaatgtcttc	1260
tcatgctccg	tgatgcatga	ggctctgcac	aaccactaca	cacagaagag	cctctccctg	1320
tctctgggta	aa					1332

<210> 165 <211> 17 <212> PRT <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> Вариабельная последовательность тяжелой цепи <400>165

Arg Ile Tyr Ala Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Ser Pro Ser Phe Gln

5 1015

Gly <210> 166 <211>17 <212> PRT

- 123 030828 <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> Вариабельная последовательность тяжелой цепи <400>166

Arg Ile Tyr Ala Gly Asp Gly Asp Thr Ala Tyr Ser Pro Ser Phe Gln

5 1015

Gly <210>167 <211>17 <212> PRT <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> Вариабельная последовательность тяжелой цепи <400>167

Arg Ile Tyr Ala Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Ala Pro Ser Phe Gln

5 1015

Gly <210> 168 <211>17 <212> PRT <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> Вариабельная последовательность тяжелой цепи <400>168

Arg Ile Tyr Ala Gly Asp Ala Asp Thr Ala Tyr Ser Pro Ser Phe Gln

5 1015

Gly <210>169 <211>17 <212> PRT <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> Вариабельная последовательность тяжелой цепи <400> 169

Arg Ile Tyr Ala Gly Asp Ala Asp Thr Asn Tyr Ala Pro Ser Phe Gln

5 10 15

- 124 030828

Gly <210>170 <211>15 <212> PRT <213> Синтетическая последовательность <220>

<223>	Вариабельная последовательность	легкой цепи	CDR
<400>	170
Lys Ala	Ser Gln Ser Val Asp Tyr Phe	Ser	Glu Ser Phe	Met	Asn
1	5	10			15

<210>	171
<211>	7
<212>	PRT
<213>	Синтетическая	последовательность
<220> <223>	Вариабельная	последовательность легкой цепи CDR

<220>

<221> ПРОЧИЕ ПРИЛОЖЕНИЯ

<222>	(1).	. .(1)
<223>	Xaa	может представлять	собой	любую	природную	аминокислоту
<220>
<221>	ПРОЧИЕ ПРИЛОЖЕНИЯ
<222>	(4).	.(4)
<223>	Xaa	может представлять	собой	любую	природную	аминокислоту

<400> 171

Xaa Ala Ser Xaa Leu Glu Ser <210>172 <211>15 <212> PRT <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> Вариабельная последовательность легкой цепи CDR <400> 172

Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Leu Ile Arg Trp Ser Phe Met His 1 5 10 15

<210> <211> <212> <213>

173 7 PRT Синтетическая последовательность

- 125 030828 <220>

<223> Вариабельная последовательность легкой цепи CDR <400>173

Val Ala Asp Arg Val Glu Val <210>174 <211>179 <212> PRT <213> Homo sapiens <400>174

Thr 1

Pro

Ala

Pro

Lys 5

Ser

Cys

Pro

Glu

Arg 10

His

Tyr

Trp

Ala

Gln 15

Gly

Lys

Leu

Cys

Cys

Gln

Met

Cys

Glu

Pro

Gly

Thr

Phe

Leu

Val

Lys

Asp

20

25

30

Cys

Asp

Gln

His

Arg

Lys

Ala

Ala

Gln

Cys

Asp

Pro

Cys

Ile

Pro

Gly

35

40

45

Val

Ser

Phe

Ser

Pro

Asp

His

His

Thr

Arg

Pro

His

Cys

Glu

Ser

Cys

50

55

60

Arg

His

Cys

Asn

Ser

Gly

Leu

Leu

Val

Arg

Asn

Cys

Thr

Ile

Thr

Ala

65

70

75

80

Asn

Ala

Glu

Cys

Ala

Cys

Arg

Asn

Gly

Trp

Gln

Cys

Arg

Asp

Lys

Glu

85

90

95

Cys

Thr

Glu

Cys

Asp

Pro

Leu

Pro

Asn

Pro

Ser

Leu

Thr

Ala

Arg

Ser

100

105

110

Ser

Gln

Ala

Leu

Ser

Pro

His

Pro

Gln

Pro

Thr

His

Leu

Pro

Tyr

Val

115

120

125

Ser

Glu

Met

Leu

Glu

Ala

Arg

Thr

Ala

Gly

His

Met

Gln

Thr

Leu

Ala

130

135

140

Asp

Phe

Arg

Gln

Leu

Pro

Ala

Arg

Thr

Leu

Ser

Thr

His

Trp

Pro

Pro

145

150

155

160

Gln

Arg

Ser

Leu

Cys

Ser

Ser

Asp

Phe

Ile

Arg

Ile

Leu

His

His

His

165

170

175

His His His

- 126 030828 <210>175 <211>135 <212> PRT <213> Homo sapiens <400>175

Thr 1

Pro

Ala

Pro

Lys 5

Ser

Cys

Pro

Glu

Arg 10

His

Tyr

Trp

Ala

Gln 15

Gly

Lys

Leu

Cys

Cys

Gln

Met

Cys

Glu

Pro

Gly

Thr

Phe

Leu

Val

Lys

Asp

20

25

30

Cys

Asp

Gln

His

Arg

Lys

Ala

Ala

Gln

Cys

Asp

Pro

Cys

Ile

Pro

Gly

35

40

45

Val

Ser

Phe

Ser

Pro

Asp

His

His

Thr

Arg

Pro

His

Cys

Glu

Ser

Cys

50

55

60

Arg

His

Cys

Asn

Ser

Gly

Leu

Leu

Val

Arg

Asn

Cys

Thr

Ile

Thr

Ala

65

70

75

80

Asn

Ala

Glu

Cys

Ala

Cys

Arg

Asn

Gly

Trp

Gln

Cys

Arg

Asp

Lys

Glu

85

90

95

Cys

Thr

Glu

Cys

Asp

Pro

Leu

Pro

Asn

Pro

Ser

Leu

Thr

Ala

Arg

Ser

100

105

110

Ser

Gln

Ala

Leu

Ser

Pro

His

Pro

Gln

Leu

Glu

Val

Leu

Phe

Gln

Gly

115

120

125

Pro

His

His

His

His

His

His

130

135

<210>

176

<211>

107

<212>

PRT

<213>

Homo

sapiens

<400>

176

Thr

Pro

Ala

Pro

Lys

Ser

Cys

Pro

Glu

Arg

His

Tyr

Trp

Ala

Gln

Gly

1

5

10

15

Lys

Leu

Cys

Cys

Gln

Met

Cys

Glu

Pro

Gly

Thr

Phe

Leu

Val

Lys

Asp

20

25

30

Cys

Asp

Gln

His

Arg

Lys

Ala

Ala

Gln

Cys

Asp

Pro

Cys

Ile

Pro

Gly

35

40

45

- 127 030828

Val

Ser 50

Phe

Ser

Pro

Asp

His 55

His

Thr

Arg

Pro

His 60

Cys

Glu

Ser

Cys

Arg

His

Cys

Asn

Ser

Gly

Leu

Leu

Val

Arg

Asn

Cys

Thr

Ile

Thr

Ala

65

70

75

80

Asn

Ala

Glu

Cys

Ala

Cys

Arg

Asn

Gly

Trp

Gln

Cys

Arg

Asp

Lys

Glu

85

90

95

Cys

Thr

Glu

Cys

Asp

Gly

Gly

His

His

His

His

100

105

Claims (19)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Изолированное человеческое антитело против CD27 или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие вариабельный участок легкой цепи и вариабельный участок тяжелой цепи, указанный вариабельный участок легкой цепи, содержит аминокислотную последовательность CDRL1 SEQ ID NO: 62;

   аминокислотную последовательность CDRL2 SEQ ID NO: 68 и аминокислотную последовательность CDRL3 из SEQ ID NO: 75, и указанный вариабельный участок тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность CDRH1, выбранную из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO: 44 и 161;

   аминокислотную последовательность CDRH2 SEQ ID NO: 47 и аминокислотную последовательность CDRH2 SEQ ID NO: 58.
2. 2. Выделенное человеческое антитело против CD27 или его антигенсвязывающий фрагмент по п.1, содержащие аминокислотную последовательность вариабельного участка легкой цепи и аминокислотную последовательность вариабельного участка тяжелой цепи, где аминокислотная последовательность вариабельного участка легкой цепи содержит SEQ ID NO: 143 и аминокислотная последовательность вариабельного участка тяжелой цепи содержит SEQ ID NO: 133.
3. 3. Выделенное антитело по п.1 или 2, дополнительно содержащее константный участок тяжелой цепи IgG4 и константный участок легкой цепи IgG4.
4. 4. Выделенное антитело по п.3, отличающееся тем, что константный участок тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 159 и константный участок легкой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 160.
5. 5. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-4, отличающееся тем, что указанное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связываются с человеческим CD27 с K_D 1х10^-7 M или менее, как определено поверхностным плазмонным резонансом.
6. 6. Набор для лечения заболевания, связанного с CD27, включающий фармацевтически приемлемую лекарственную форму, содержащую антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-4.
7. 7. Набор для детекции CD27 в биологическом образце, включающий фармацевтически приемлемую лекарственную форму, содержащую антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-4.
8. 8. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-4.
9. 9. Выделенный вектор или векторы для экспресии антитела против CD27 или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп.1-4, содержащие выделенную молекулу нуклеиновой кислоты по п.8.
10. 10. Прокариотическая или эукариотическая клетка-хозяин для получения антитела против CD27 или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп.1-4, содержащая изолированный вектор нуклеиновой кислоты или векторы по п.9.
11. 11. Клетка-хозяин по п.10, где клетка-хозяин представляет собой по меньшей мере одну клетку, выбранную из COS-1, COS-7, HEK293, BHK21, CHO, BSC-1, Hep G2, 653, SP2/0, 293, HeLa, миеломных или лимфомных клеток, либо их производных, иммортализованных или трансформированных клеток.
12. 12. Способ получения антитела против CD27 или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп.1-4, содержащий включение молекулы нуклеиновой кислоты по п.8 в вектор, трансформирующий

    - 128 030828 клетку-хозяина, трансгенное животное или трансгенное растение для экспрессии антитела или его антигенсвязывающего фрагмента и выделения экспрессированного антитела или его антигенсвязывающего фрагмента из указанной клетки.
13. 13. Средство для диагностики состояния, связанного с CD27, в клетке, ткани, органе или организме животного, содержащее по меньшей мере одно антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-4.
14. 14. Лекарственное средство для лечения состояния, связанного с CD27, у животного или человека, содержащее эффективное количество антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп.1-4.
15. 15. Способ лечения пациента-человека, страдающего заболеванием или расстройством, связанным с взаимодействием CD27-CD70, включающий стадию введения указанному пациенту терапевтически эффективного количества лекарственного средства по п.14.
16. 16. Способ по п.15, где заболевание или расстройство, связанное с взаимодействием CD27-CD70, представляет собой воспалительное заболевание.
17. 17. Способ по п.16, где воспалительным заболеванием является системная красная волчанка.
18. 18. Способ по п.15, где расстройство выбрано из группы, состоящей из заболевания легких или плевральной системы, заболевания сердечно-сосудистой системы, инфекционного заболевания и паразитарной инфекции.
19. 19. Способ по п.15, где лекарственное средство ингибирует пролиферацию наивных T-клеток путем ингибирования активации CD27 на указанной T-клетке человека в присутствии белка CD70 человека или части белка CD70 человека.

    С-кон.

    Фиг. 2

    - 129 030828

    Фиг. 4

    О