Nothing Special   »   [go: up one dir, main page]

EA022841B1 - Получение гетерологичных полипептидов в микроводорослях, внеклеточные микроводорослевые тельца, композиции и способы их получения и применения - Google Patents

Получение гетерологичных полипептидов в микроводорослях, внеклеточные микроводорослевые тельца, композиции и способы их получения и применения Download PDF

Info

Publication number
EA022841B1
EA022841B1 EA201290567A EA201290567A EA022841B1 EA 022841 B1 EA022841 B1 EA 022841B1 EA 201290567 A EA201290567 A EA 201290567A EA 201290567 A EA201290567 A EA 201290567A EA 022841 B1 EA022841 B1 EA 022841B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
protein
sequence
recombinant
membrane
nucleic acid
Prior art date
Application number
EA201290567A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201290567A1 (ru
Inventor
Энн-Сесиль В. Бэйн
Джеймс Кейси Липмейер
Кирк Эмиль Эпт
Росс Эрик Циркль
Original Assignee
ДиЭсЭм АйПи АССЕТС Б.В.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ДиЭсЭм АйПи АССЕТС Б.В. filed Critical ДиЭсЭм АйПи АССЕТС Б.В.
Publication of EA201290567A1 publication Critical patent/EA201290567A1/ru
Publication of EA022841B1 publication Critical patent/EA022841B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/145—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/12—Unicellular algae; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5258—Virus-like particles
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16123—Virus like particles [VLP]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16151—Methods of production or purification of viral material
    • C12N2760/16152—Methods of production or purification of viral material relating to complementing cells and packaging systems for producing virus or viral particles
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01018—Exo-alpha-sialidase (3.2.1.18), i.e. trans-sialidase

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

Изобретение относится к рекомбинантным микроводорослевым клеткам и их применению для получения гетерологичного белка, способам получения гетерологичных полипептидов во внеклеточных микроводорослевых тельцах, внеклеточным микроводорослевым тельцам, содержащим гетерологичные полипептиды и к содержащим их композициям.

Description

Настоящее изобретение относится к рекомбинантным микроводорослевым клеткам и их применению для получения гетерологичного полипептида, способам получения гетерологичных полипептидов во внеклеточных тельцах микроводорослей, внеклеточным тельцам микроводорослей, содержащим гетерологичные полипептиды, и композициям.
Уровень техники
Прогресс в биотехнологии и молекулярной биологии дал возможность получать в микробных, растительных и животных клетках белки, многие из которых ранее можно было получить лишь путем экстрагирования из тканей, крови или мочи людей и других животных. Биопрепараты, которые доступны для приобретения на сегодняшний день, обычно получают либо в клетках млекопитающих, таких как клетки яичника китайского хомячка (СНО), либо в микробных клетках, таких как линии клеток дрожжей или Е.соП.
Получение белков путем культивирования микроорганизмов обеспечивает несколько преимуществ по сравнению с существующими системами, например культурами клеток растений и животных. Например, процессы на основе культивирования микроорганизмов обеспечивают (ί) быстрое получение высокой концентрации белка; (ίί) возможность использования стерильных контролируемых условий продукции (например, условий надлежащей практики организации производства (СМР)); (ίίί) возможность использования простых ростовых сред определенного химического состава, обеспечивающих более простое культивирование и меньшее количество примесей; (ίν) отсутствие загрязнения патогенами человека или животных и (ν) простоту очистки белка (например, путем выделения из культуральных сред). Кроме того, оборудование для культивирования микроорганизмов (ферментирования) обычно дешевле сконструировать, чем оборудование для клеточных культур.
Микроводоросли, например траустохитриды, можно выращивать на стандартном оборудовании для культивирования микроорганизмов, с очень короткими циклами культивирования (например, 1-5 суток) с использованием недорогих сред определенного состава и минимальной очистки или без очистки. Кроме того, для некоторых микроводорослей, например БсЫ/осНуЭпищ продемонстрирована безопасность использования биомассы и липидов, выделенных из нее, для применения в качестве пищевых добавок. Например, обогащенное докозагексаеновой кислотой масло, содержащее триглицериды, полученное из этих микроорганизмов, получено от Управления по контролю продуктов питания и лекарственных средств США статус СКАБ (общепризнанно безопасного).
Было показано, что микроводоросли способны экспрессировать рекомбинантные белки. Например, в патенте США № 7001772 описаны первые рекомбинантные конструкции, подходящие для трансформирования траустохитрид, включая представителя рода БсЫ/осНуЗгшт. В данной публикации описаны, среди прочего, последовательности нуклеиновых кислот и аминокислот для ацетолактатсинтазы, промоторных и терминаторных областей ацетолактатсинтазы, промотора альфа-тубулина, промотора из системы поликетидсинтазы (РКБ) и промотора десатуразы жирных кислот БсН/осНуЗгшт. Далее, в публикациях США № 2006/0275904 и 2006/0286650, каждая из которых полностью включена в данное описание посредством ссылки, описаны последовательности промоторов и терминаторов актина, альфасубъединицы фактора элонгации трансляции 1 (ЕР1а) и глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (САРСН) БсЫ/осНу1г1ит.
Сохраняется потребность в разработке способов экспрессии гетерологичных полипептидов в микроводорослях, а также в альтернативных композициях для применения в терапии.
Краткое описание изобретения
Настоящее изобретение относится к способу получения вирусного белка, выбранного из группы, состоящей из белка гемагглютинина (НА), белка нейраминидазы (ΝΑ), гибридного белка (Р), гликопротеина (С), белка оболочки (Е-), гликопротеина размером 120 кДа (др120), гликопротеина размером 41 кДа (др41), белка матрикса и комбинаций перечисленных белков, включающий культивирование рекомбинантной микроводорослевой клетки в среде, причем рекомбинантная микроводорослевая клетка содержит молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую полинуклеотидную последовательность, которая кодирует вирусный белок, с получением вирусного белка. В некоторых вариантах реализации вирусный белок секретируется. В некоторых вариантах реализации вирусный белок выделяют из среды. В некоторых вариантах реализации вирусный белок накапливается в микроводорослевой клетке. В некоторых вариантах реализации вирусный белок накапливается в мембране клетки микроводоросли. В некоторых вариантах реализации вирусный белок представляет собой белок НА. В некоторых вариантах реализации последовательность белка НА по меньшей мере на 90% идентична последовательности БЕО ГО ΝΟ: 77. В некоторых вариантах реализации микроводорослевая клетка способна осуществлять посттрансляционный процессинг белка НА с получением полипептидов НА1 и НА2 в отсутствие экзогенной протеазы. В некоторых вариантах реализации вирусный белок представляет собой белок ΝΑ. В некоторых вариантах реализации последовательность белка ΝΑ по меньшей мере на 90% идентична последовательности БЕО ГО ΝΟ: 100. В некоторых вариантах реализации вирусный белок представляет собой гибридный белок. В некоторых вариантах реализации последовательность гибридного белка (Р) по меньшей мере на 90% идентична последовательности БЕО ГО ΝΟ: 102. В некоторых вариантах реализации вирусный бе- 1 022841 лок представляет собой О-белок. В некоторых вариантах реализации последовательность гликопротеина (О) по меньшей мере на 90% идентична последовательности 8ЕЦ ГО N0: 103. В некоторых вариантах реализации микроводорослевая клетка является представителем отряда ТНгаи81осНу1г1а1е8. В некоторых вариантах реализации микроводорослевая клетка представляет собой ЗсЫ/осНуОшт или ТЬтаи81осЬу1гшт. В некоторых вариантах реализации полинуклеотидная последовательность, кодирующая вирусный белок, дополнительно включает мембранный домен НА. В некоторых вариантах реализации молекула нуклеиновой кислоты дополнительно включает полинуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из 8ЕЦ ГО N0: 2, 8ЕЦ ГО N0: 3, 8ЕЦ ГО N0: 4, 8ЕЦ ГО N0: 38, 8ЕС) ГО N0: 42, 8ЕО ГО N0: 43, 8ЕО ГО N0: 44, 8ЕО ГО N0: 45, 8ЕО ГО N0: 46 и комбинаций перечисленных последовательностей.
Настоящее изобретение относится к изолированному вирусному белку, полученному любым из описанных выше способов.
Настоящее изобретение относится к рекомбинантной микроводорослевой клетке, содержащей молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую полинуклеотидную последовательность, которая кодирует вирусный белок, выбранный из группы, состоящей из белка гемагглютинина (НА), белка нейраминидазы (ИА), гибридного белка (гибридного белка), гликопротеина (О), белка оболочки (Е), гликопротеина размером 120 кДа (др120), гликопротеина размером 41 кДа (др41), белка матрикса и комбинаций перечисленных белков. В некоторых вариантах реализации вирусный белок представляет собой белок НА. В некоторых вариантах реализации последовательность белка НА по меньшей мере на 90% идентична последовательности 8ЕЦ ГО N0: 77. В некоторых вариантах реализации микроводорослевая клетка способна осуществлять посттрансляционный процессинг белка НА с получением полипептидов НА1 и НА2 в отсутствие экзогенной протеазы. В некоторых вариантах реализации вирусный белок представляет собой белок КА. В некоторых вариантах реализации последовательность белка NА по меньшей мере на 90% идентична последовательности 8ЕЦ ГО N0: 100. В некоторых вариантах реализации вирусный белок представляет собой гибридный белок. В некоторых вариантах реализации последовательность гибридного белка (Р) по меньшей мере на 90% идентична последовательности 8ЕЦ ГО N0: 102. В некоторых вариантах реализации вирусный белок представляет собой О-белок. В некоторых вариантах реализации последовательность гликопротеина (О) по меньшей мере на 90% идентична последовательности 8ЕЦ ГО N0: 103. В некоторых вариантах реализации микроводорослевая клетка является представителем отряда ТЬтаи81осЬу1т1а1е8. В некоторых вариантах реализации микроводорослевая клетка представляет собой 8сН|/осНу1г1ит или ТЬгаи81осйу1тшт. В некоторых вариантах реализации полинуклеотидная последовательность, кодирующая вирусный белок, дополнительно включает мембранный домен НА. В некоторых вариантах реализации молекула нуклеиновой кислоты дополнительно включает полинуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из: 8ЕЦ ГО N0: 2, 8ЕЦ ГО N0: 3, 8ЕС) ГО N0: 4, 8ЕС) ГО N0: 38, 8ЕС) ГО N0: 42, 8ЕС) ГО N0: 43, 8ЕС) ГО N0: 44, 8ЕС) ГО N0: 45, 8ЕЦ ГО N0: 46 и комбинаций перечисленных последовательностей.
Настоящее изобретение относится к способу получения внеклеточного микроводорослевого тельца, содержащего гетерологичный полипептид, указанный способ включает (а) экспрессирование гетерологичного полипептида в микроводорослевой клетке-хозяине, при этом указанный гетерологичный полипептид содержит мембранный домен; и (Ь) культивирование микроводорослевой клетки-хозяина в условиях, обеспечивающих образование внеклеточного тельца, содержащего гетерологичный полипептид, при этом внеклеточное тельце не соединено с плазматической мембраной клетки-хозяина.
Настоящее изобретение относится к способу получения композиции, содержащей внеклеточное микроводорослевое тельце и гетерологичный полипептид, причем указанный способ включает (а) экспрессию гетерологичного полипептида в микроводорослевой клетке-хозяине, при этом указанный гетерологичный полипептид содержит мембранный домен; и (Ь) культивирование микроводорослевой клетки-хозяина в условиях, обеспечивающих образование внеклеточного тельца, содержащего гетерологичный полипептид, при этом внеклеточное тельце не соединено с плазматической мембраной клеткихозяина, причем указанную композицию получают в виде культурального супернатанта, содержащего внеклеточное тельце. В некоторых вариантах реализации указанный способ дополнительно включает отделение культурального супернатанта от композиции и ресуспендирование внеклеточного тельца в водном жидком носителе. Настоящее изобретение направлено на композицию, полученную с помощью указанного способа.
В некоторых вариантах реализации способ получения внеклеточного микроводорослевого тельца и гетерологичного полипептида или способ получения композиции, содержащей внеклеточное микроводорослевое тельце и гетерологичный полипептид, включает клетку-хозяина, которая представляет собой клетку-хозяина ЕаЬупШ1ш1отусо1а. В некоторых вариантах реализации клетка-хозяин представляет собой клетку-хозяина 8с1и/ос11у1пшп или ТНгаи81осНу1г1ит.
Настоящее изобретение относится к внеклеточному тельцу микроводоросли, содержащему гетерологичный полипептид, при этом внеклеточное тельце не соединено с плазматической мембраной клетки микроводоросли. В некоторых вариантах реализации внеклеточное тельце представляет собой везикулу, мицеллу, фрагмент мембраны, агрегат мембран или их смесь. В некоторых вариантах реализации вне- 2 022841 клеточное тельце представляет собой смесь везикулы и фрагмента мембраны. В некоторых вариантах реализации внеклеточное тельце представляет собой везикулу. В некоторых вариантах реализации гетерологичный полипептид содержит мембранный домен. В некоторых вариантах реализации гетерологичный полипептид представляет собой гликопротеин. В некоторых вариантах реализации гликопротеин включает олигосахариды с высоким содержанием маннозы. В некоторых вариантах реализации гликопротеин по существу свободен от сиаловой кислоты.
Настоящее изобретение относится к композиции, содержащей внеклеточное тельце согласно любому из описанных пунктов формулы изобретения и водный жидкий носитель. В некоторых вариантах реализации водный жидкий носитель представляет собой культуральный супернатант.
Краткое описание чертежей
На фиг. 1 показана полинуклеотидная последовательность (БЕр ГО N0: 76), которая кодирует белок гемагглютинина (НА) вируса гриппа А (А/РиетЮ Ктсо/8/34/Моип1 Б1иа1 (Η1Ν1)), которую кодоноптимизировали для экспрессии в БсЫ/осНуЗгнип 8р. АТСС 20888.
На фиг. 2 показана карта плазмиды рСЬ0143.
На фиг. 3 показана процедура, использовавшаяся для анализа клона СЬ0143-9.
На фиг. 4 показана секреция белка НА трансгенным СЬ0143-9 БсЫ/осНуЦщт (Е).
На фиг. 4А показан выделенный рекомбинантный белок НА (указан стрелками) на окрашенных антителами против Η1Ν1 иммуноблотах супернатанта, полученного путем низкоскоростного центрифугирования (т.е. бесклеточного супернатанта (БКС)), культуры, выращенной при различных температурах (25, 27, 29°С) и рН (5,5, 6,0, 6,5, 7,0).
На фиг. 4В показан выделенный рекомбинантный белок НА на окрашенных кумасси гелях (Кумасси) и окрашенных антителами против Η1Ν1 иммуноблотах (ИБ: анти-НШ1) из фракции 60% сахарозы при невосстановительных или восстановительных условиях.
На фиг. 5 показана гемагглютинирующая активность рекомбинантного белка НА из трансгенного СБ0143-9 БсЫ/осНуйннп (Е).
На фиг. 5А показана гемагглютинирующая активность в бесклеточном супернатанте (БКС).
На фиг. 5В показана гемагглютинирующая активность в растворимой (Р) и нерастворимой (НР) фракциях.
[белка] обозначает концентрацию белка, снижающуюся слева направо с повышением разведения образцов;
- обозначает отрицательный контроль, в котором отсутствует НА;
+ обозначает положительный контроль гемагглютинина вируса гриппа;
С обозначает отрицательный контроль штамма БсП/осНуЦннп 8р. АТСС 20888 дикого типа;
Г АЕ обозначает единицу гемагглютинирующей активности с учетом кратности разведения образцов слева направо;
обозначает двукратное разведение образца в первой лунке; в каждой последующей лунке слева направо кратность разведения удваивается по сравнению с предыдущей лункой, таким образом, что кратность разведения от первой к последней лунке слева направо составляет 2,4, 8, 16, 32, 64, 128, 256, 512, 1024, 2048 и 4096.
На фиг. 6 показана экспрессия и гемагглютинирующая активность белка НА, присутствующего во фракции 60% сахарозы, для трансгенного СЬ0143-9 БсП/осНуйннп (Е).
На фиг. 6А показан выделенный рекомбинантный белок НА (указан стрелками) на окрашенном кумасси геле (Кумасси) и окрашенном антителами против НШ1 иммуноблоте (ИБ: анти-НШ1) из фракции 60% сахарозы.
На фиг. 6В показана соответствующая гемагглютинирующая активность.
- обозначает отрицательный контроль, в котором отсутствует НА;
+ обозначает положительный контроль белка НА вируса гриппа;
С обозначает отрицательный контроль штамма дикого типа БсН|/осйу1г1нт 8р. АТСС 20888;
ГАЕ обозначает единицу гемагглютинирующей активности с учетом кратности разведения образцов.
На фиг. 7 показан анализ пептидной последовательности выделенного рекомбинантного белка НА, которая была определена по всего 27 пептидам (аминокислоты, относящиеся к указанным пептидам, выделены жирным шрифтом), покрывающим около 42% всей белковой последовательности НА (БЕр ГО N0: 77). Полипептид НА1 был определен по всего 17 пептидам, а полипептид НА2 был определен по всего 9 пептидам.
На фиг. 8 показан окрашенный кумасси гель (Кумасси) и окрашенный антителами против НШ1 иммуноблот (ИБ: анти-НШ1), на которых представлено гликозилирование белка НА в БсЫ/осНуйннп. ЕпбоН и РNΟа8е Р обозначают ферментативные обработки фракции 60% сахарозы трансгенного СЬ0143-9 БсЫ/осНуйннп соответствующими ферментами.
БО обозначает трансгенный СЬ0143-9 БсП/осйуЦцпп. который инкубировали без обработки ферментами, но при тех же условиях, что и при обработке ЕпбоН и РNСа8е Р.
- 3 022841
На фиг. 9 показана концентрация общего белка из культурального супернатанта δείιίζοείινίπιιιη 8р. АТСС 20888 (г/л) с течением времени (ч).
На фиг. 10 показан ПААГ/ДСН общего белка из культурального супернатанта 8сЫζοсЬуΐ^^ит 8р. АТСС 20888 на дорожках 11-15, где супернатант собирали в пять из шести моментов времени, показанных на фиг. 9, в часы 37-68, исключая час 52. Полоски, идентифицированные как актин и гельзолин (путем пептидного секвенирования с помощью масс-спектрометрии), отмечены стрелками. На дорожку 11 загружали 2,4 мкг общего белка; в оставшиеся лунки загружали 5 мкг общего белка.
На фиг. 11 показаны негативно окрашенные везикулы из δείιίζοείινίπιιιη 8р. АТСС 20888 (С: 20888) и трансгенного СЬ0143-9 8сЫζοсЬуίήит (Е: СЬ0143-9).
На фиг. 12 показан иммуноблоттинг с антителами против Η1Ν1 с окрашиванием золотом везикул из δείιίζοείινίπιιιη 8р. АТСС 20888 (С: 20888) и трансгенного СЬ0143-9 δείιίζοείινίπιιιη (Е: СЬ0143-9).
На фиг. 13 показаны предсказанные на основании применения алгоритма 81диа1Р сигнальные якорные последовательности, нативные для δείιίζοείινίπιιιη. См., например, Веиб81еи е! а1., 1., Мо1. Βίο1. 340:783-795 (2004); №е18ещ Η. и Кгодй, А. Ргос. Ιηΐ. СоиТ. 1и1е11. 8у8!. Мо1. Вю1. 6:122-130 (1998); №е18еи, Η., е! а1., Рго1еш Еидшеегтд 12:3-9 (1999); Етаиие188ои, О. е! а1., №Циге Рго1осо18. 2:953-971 (2007).
На фиг. 14 показаны предсказанные мембранные белки I типа в 8с1Шос11у1пит на основании поиска в ВЬА8Т по базам данных геномных и Е8Т ДНК 8с1Шос11у1пит для генов с гомологией с известными мембранными белками I типа из других организмов и обладающих пронизывающими мембрану участками в самых дальних С-концевых областях белков. Предполагаемые пронизывающие мембрану участки показаны жирным шрифтом.
На фиг. 15 показана карта плазмиды рСЬ0120.
На фиг. 16 показана таблица использования кодонов для 8с^осйу!гшт.
На фиг. 17 показана карта плазмиды рСЬ0130.
На фиг. 18 показана карта плазмиды рСЬ0131.
На фиг. 19 показана карта плазмиды рСЬ0121.
На фиг. 20 показана карта плазмиды рСЬ0122.
На фиг. 21 показана полинуклеотидная последовательность (8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 92), которая кодирует белок изомеразы ксилозы Ху1А Р1готусе8 8р. Е2, соответствующий номеру доступа в СеиВаик САВ76571, оптимизированная для экспрессии в 8с^осйу!гшт 8р. АТСС 20888.
На фиг. 22 показана полинуклеотидная последовательность (8ЕЦ ГО ΝΟ: 93), которая кодирует белок киназы ксилулозы Ху1В Р1готусе8 8р. Е2, соответствующий номеру доступа в СеиВаик А1249910, оптимизированная для экспрессии в 8с1Шос11у1пит 8р. АТСС 20888.
На фиг. 23 показана карта плазмиды рСЬ0132.
На фиг. 24 показана карта плазмиды рСЬ0136.
На фиг. 25А показана карта плазмиды рСЬ0140.
На фиг. 25В показана карта плазмиды рСЬ0149.
На фиг. 26А показана полинуклеотидная последовательность (8ЕЦ ГО ΝΟ: 100), которая кодирует белок нейраминидазу (ИА) вируса гриппа А (А/Риейо К1со/8/34/Моии1 8шш (Η1Ν1)), оптимизированная для экспрессии в 8с^осйу1гшт 8р. АТСС 20888.
На фиг. 26В показана полинуклеотидная последовательность (8ЕЦ ГО ΝΟ: 101), которая кодирует белок NА вируса гриппа А (А/Риейо К1со/8/34/Моии1 81иа1 (Η1Ν1)) с меткой У5 на конце и полигистидиновой меткой, оптимизированная для экспрессии в 8с1Шос11у1пит 8р. АТСС 20888.
На фиг. 27 показана схема процедуры, используемой для анализа клонов СЬ0140 и СЬ0149.
На фиг. 28 показана нейраминидазная активность рекомбинантного белка NА из трансгенных штаммов СЬ0140-16, -17, -20, -21, -22, -23, -24, -26, -28 8с1Шос11у1пит. Активность определяли путем измерения флуоресценции 4-метилумбеллиферона, который возникает в результате гидролиза 4-метилумбеллиферил)-а-Ч-Н-ацетилнейрамината (4-МиНАЫА) сиалидазами (возбуждение (Возб.): 365 нм, эмиссия (Эм.): 450 нм). Активность выражена в виде относительных единиц флуоресценции (ОЕФ) на 1 мкг белка в концентрированном бесклеточном супернатанте (кБКС, самый левый столбик для каждого клона) и бесклеточном экстракте (БКЭ, самый правый столбик для каждого клона). Штамм дикого типа 8сЫζοсЬуίήит 8р. АТСС 20888 (-) и ПЦР-отрицательный штамм 8с1Шос11у1пит. трансформированный рСЬ0140 (27), которые выращивали и обрабатывали таким же способом, как и трансгенные штаммы, использовали в качестве отрицательных контролей.
На фиг. 29 показана частичная очистка рекомбинантного белка NА из трансгенного штамма СЬ0140-26 8сЫζοсЬуΐ^^ит. Нейраминидазная активность различных фракций показана на фиг. 29А.
КБКС обозначает концентрированный бесклеточный супернатант;
Ч обозначает кБКС, разбавленный промывочным буфером;
ПФ обозначает проточную фракцию;
С обозначает смыв;
Э обозначает элюат и кЭ обозначает концентрированную фракцию элюата.
- 4 022841
На фиг. 29В показан окрашенный кумасси гель (Кумасси) с 12,5 мкл каждой фракции. Стрелка указывает на бэнд, идентифицированный как белок ЫЛ. Для разделения белков применяли ПААГ/ДСН на 12% бис-трис-гелях ΝηΡΑΟΕ® Νονβχ® в электродном буфере 3-(Ы-морфолино)пропансульфоновой кислотой (МОПС) и ДСН.
На фиг. 30 показан анализ пептидной последовательности выделенного рекомбинантного белка ΝΑ, который был определен по всего 9 пептидам (выделены жирным красным шрифтом), покрывающим 25% белковой последовательности (8ЕО ГО N0: 100).
На фиг. 31 показаны нейраминидазные активности трансгенных штаммов СЬ0149-10, -11, -12 δείιίζοείινίπιιιη и соответствующий окрашенный кумасси гель (Кумасси) и иммуноблот, окрашенный антителами против У5 ((Иммуноблот: анти-У5).
На фиг. 31А показана нейраминидазная активность, которую определяли путем измерения флуоресценции 4-метилумбеллиферона, который возникает в результате гидролиза 4-ΜυΝΑΝΑ сиалидазами (Возб.: 365 нм, Эм.: 450 нм). Активность выражена в виде относительных единиц флуоресценции (ОЕФ) на 1 мкг белка в бесклеточном супернатанте (БКС). Штамм дикого типа δείιίζοείινίπιιιη 8р. АТСС 20888 (-), который выращивали и обрабатывали таким же способом, как и трансгенный штамм, использовали в качестве отрицательного контроля.
На фиг. 31В показан окрашенный кумасси гель и соответствующий иммуноблот, окрашенный антителами против У5, с 12,5 мкл БКС для 3 трансгенных штаммов СБ0149 δείιίζοείινίπιιιη (10, 11 и 12). Контрольный белок Ρο8ΐΐορθ™ использовали в качестве положительного контроля для антитела (+). Штамм дикого типа δΟιίζοΟίΥίπιιιη 8р. АТСС 20888 (-), который выращивали и обрабатывали таким же способом, как и трансгенный штамм, использовали в качестве отрицательного контроля.
На фиг. 32 показаны ферментативные активности НА и ΝΑ вируса гриппа в бесклеточном супернатанте трансгенного δείιίζοείιγίπιιιη. ^трансформированного клонами СБ0140 и СБ0143. Результаты представлены для клонов СБ0140-143-1, -3, -7, -13, -14, -15, -16, -17, -18, -19, -20.
На фиг. 32А показана нейраминидазная активность, которую определяли путем измерения флуоресценции 4-метилумбеллиферона, который возникает в результате гидролиза 4-ΜυΝΑΝΑ сиалидазами (Возб.: 365 нм, Эм.: 450 нм). Активность выражена в виде относительных единиц флуоресценции (ОЕФ) для 25 мкл БКС. Штамм дикого типа δείιίζοείιγίπιιιη 8р. АТСС 20888 (-), который выращивали и обрабатывали таким же способом, как и трансгенный штамм, использовали в качестве отрицательного контроля.
На фиг. 32В показана гемагглютинирующая активность.
- обозначает отрицательный контроль, в котором отсутствует НА;
+ обозначает положительный контроль НА вируса гриппа;
Г АЕ обозначает единицу гемагглютинирующей активности с учетом кратности разведения образцов.
Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение относится к способу получения гетерологичных полипептидов в микроводорослевых клетках-хозяевах. Настоящее изобретение также относится гетерологичным полипептидам, полученныем указанными способами, к микроводорослевым клеткам, содержащим гетерологичные полипептиды, и к композициям, содержащим гетерологичные полипептиды. Настоящее изобретение также относится к получению гетерологичных полипептидов в микроводорослевых клетках-хозяевах, при этом гетерологичные полипептиды связаны с внеклеточными тельцами микроводорослей, которые не соединены с плазматической мембраной клеток-хозяев. Настоящее изобретение также относится к получению внеклеточных микроводорослевых телец, содержащих гетерологичные полипептиды, а также к получению содержащих их композиций. Настоящее изобретение дополнительно относится к внеклеточным тельцам микроводорослей, содержащим гетерологичные полипептиды, содержащим их композициям и их применению.
Микроводорослевые клетки-хозяева.
Микроводоросли, также известные как микроскопические водоросли, часто обнаруживают в пресной воде и морских системах. Микроводоросли являются одноклеточными, но могут также расти цепочками и группами. Отдельные клетки имеют размер в диапазоне от нескольких микрометров до нескольких сотен микрометров. Так как такие клетки способны расти в водных суспензиях, они имеют хороший доступ к питательным веществам и водному окружению.
В некоторых вариантах реализации микроводорослевая клетка-хозяин представляет собой желтозеленую водоросль или страминопил.
В некоторых вариантах реализации микроводорослевая клетка-хозяин представляет собой представителя типа Είώγπη11η.ι1οιη\ΌοΐΗ. В некоторых вариантах реализации клетка-хозяин ^аЬу^^пΐЬи1οтусοίа представляет собой представитель отряда ТЪгаи8ЮсЪу1г1а1е8 или отряда ЬаЬуг1п1Ьи1а1е8. Согласно настоящему изобретению термин траустохитрид относится к любому представителю отряда ТЪгаи8ЮсЪу1па1е8, который включает семейство ТйгашЮсйуРтасеае, и термин лабиринтулид относится к любому представителю отряда ЬаЬуг1п1Ьи1а1е8, который включает семейство ЬаЬупЩШасеае. Предста- 5 022841 вители семейства ЬаЪуйп1ки1асеае ранее считали представителями отряда Ткгаи81оскуйла1е8, но при недавнем пересмотре таксономической классификации таких организмов семейство ЬаЪупйШасеае теперь считают представителем отряда ЬаЪуйп1ки1а1е8. Как ЬаЪуйп1ки1а1е8, так и Ткган8Юску1г1а1е8 считают представителями вида ЬаЪуйп1ки1отусо!а. Теоретики таксономии теперь обычно располагают обе данные группы микроорганизмов вместе с водорослями или с подобными водорослям протестами, происходящими от 8йатепорПе. Современное таксономическое положение траустохитрид и лабиринтулид резюмировано далее:
Царство: 81гатепорйа (хромисты).
Вид: ЬаЬуг1п1Ни1отусо1а (гетероконты).
Класс: ЬаЪуйп1ки1отусе1е8 ШаЬуппОпкае).
Отряд: ЬаЬуг1п1Ни1а1е5.
Семейство: ЬаЪуйп1ки1асеае.
Отряд: Ткгаи81оску1па1е8.
Семейство: Ткгаи81оску1пасеае.
Для целей настоящего изобретения штаммы, описанные как траустохитриды, включают следующие организмы: отряд: Ткгаи81оску1па1е8: семейство: Ткгаи81оску1пасеае: род: ТкгашЮскуОшт (виды: 8р. агиФтеп1а1е. аигеит, Ъеп1кюо1а, д1оЪо8ит, ктпек тойуит, ти1йгиШтеп1а1е, раскубегтит, ргокГегит, го8еит, 8йла1ит), Шкета (виды: 8р. атоеЪоШеа, кегдие1еп818, ттйа, ргоГипйа, гаФа1а, 8аПеп8, 8агкапапа, 8сЙ7оску1гор8, У18игдеп818, уогкеп818), 8ск|/оску1г1нт (виды: 8р. аддгедаШт, ктпасеит, тапдгоуек тшйит, ос1о8рогит), .Таропоскуйшт (виды: 8р. тайпит), АрктоскуОшт (виды: 8р. каНойЙ18, кегдие1еп818, ргоГипйа, 81оссШпо1), Аккогша (виды: 8р. сгоискй), или ЕПпа (виды: 8р. тап8а1Ъа, 8шоййса). Для целей настоящего изобретения, виды, описанные внутри рода Шкета, будут считать представителями рода Ткгаи81оскуйшт. Аигапйоскуйшт, ОЪ1оп§юкуйшт, Войуоскуйшт, Райейскуйшт и 8юуоШоскуйшт представляют собой дополнительные роды, входящие в вид ЬаЪуйп1ки1отусо1а в настоящем изобретении.
Штаммы, описанные в настоящем изобретении как лабиринтулы, включают следующие организмы: отряд: ЬаЪуйп1ки1а1е8, семейство: ЬаЪуйп1ки1асеае, род: ЬаЪугтШиЦ (виды: 8р. а1дег1еп818, соепосу8Й8, скайопи, тасгосу8Й8, тасгосу8Й8 айапйса, тасгосу8Й8 тасгосу8Й8, тайпа, тти1а, го8сойеп818, уа1капо\ак уйеШпа, уйеШпа расШса, укеШпа укеШпа, /орГн), ЬаЪуйп1ки1оШе8 (виды: 8р. каНойФ8, уогкеп818), ЬаЪуййкотуха (виды: 8р. тайпа), Э|р1оркгу8 (виды: 8р. агсНег1), Руггйо8оги8 (виды: 8р. таппш), 8огоФр1оркгу8 (виды: 8р. 8!егсогеа) или СЫатуйотуха (виды: 8р. 1аЬуг1п1Ни1о1бе8, топ(апа) (хотя на сегодняшний день нет согласия о точном таксономическом положении Руггйо8оги8, 8огоШр1оркгу8 или СЫатуйотуха).
Клетки микроводорослей вида ЬаЪуйп1ки1отусо1:а включают, но не ограничены перечисленными, депонированные штаммы РТА-10212, РТА-10213, РТА-10214, РТА-10215, РТА-9695, РТА-9696, РТА-9697, РТА-9698, РТА-10208, РТА-10209, РТА-10210, РТА-10211, микроорганизм, депонированный как 8АМ2179 (названный депонентом Шкета 8АМ2179), любые виды Ткган81оску1г1нт (включая бывшие виды Шкета, такие как У18игдеп818, ШатоеЪоШа, и.8агкайапа, ШргоГипйа, ШгаФа1а, Шттйа и Шкета 8р. ВР-5601), и включая Ткган81оску1г1нт 8йла1ит, Ткган8Юску1г1нт аигеит, Ткган8Юску1г1нт го8еит; и любые виды 1аропоску1г1нт.
Штаммы Ткган81оску1г1а1е8 включают, но не ограничены перечисленными, Ткган81оску1г1нт 8р. (23В) (АТСС 20891): Ткган8Юску1г1нт 8йла1ит (8сНпеШег) (АТСС 24473): Ткгаи81оскуйшт аигеит (Оо1Й81ет) (АТСС 34304): Ткгаи81оску1пит го8еит (Оо1Й81еш) (АТСС 28210) и .Таропоскуйшт 8р. (Ь1) (АТСС 28207).
8с1и/оску1пит включают, но не ограничены перечисленными, 8с1и/оску1пит аддгедаШт, 8ск17оскуйшт Итасшит, 8ск17оскуйшт 8р. (831) (АТСС 20888), 8ск17оскуйшт 8р. (88) (АТСС 20889), 8с1и/оску1пит 8р. (ЬС-КМ) (АТСС 18915), 8ск|/оску1г1нт 8р. (8К 21), депонированный штамм АТСС 28209 и депонированный штамм 1РО 32693 8ск|/оску1г1нт Итасшит.
В некоторых вариантах реализации клетка представляет собой 8ск|/оску1г1нт или Ткган81оску1г1нт. 8ск17оскуйшт могут размножаться как последовательным делением, так и путем образования спорангия, который в конечном счете высвобождает зооспоры. ТкгашЮскуйлит, тем не менее, размножается исключительно путем образования спорангия, который затем высвобождает зооспоры.
В некоторых вариантах реализации микроводорослевая клетка-хозяин представляет собой ЬаЪуйп1ки1ае (также называемые ЬаЪуйп1ки1отусе1е8). ЬаЪуйп1ки1ае образуют уникальные структуры, называемые эктоплазматическими сетями. Данные структуры представляют собой разветвленные, трубковидные удлинения плазматической мембраны, которые способствуют значительному увеличению площади поверхности плазматической мембраны. См., например, Регк1п8, Агск. М1кгоЪю1. 84:95-118 (1972): Регкш8, Сап. 1. Во!. 51:485-491 (1973). Эктоплазматические сети образуются из уникальной клеточной структуры, называемой сагеносомой или ботросомой. Эктоплазматическая сеть присоединяет клетки ЬаЪуйп1ки1ае к поверхностям и способна проникать в поверхности. См., например, Со1етап и Уе81а1, Сап. 1. М1сгоЪю1. 53:841-843 (1987) и Ройег, Мусо1од1а. 84:298-299 (1992) соответственно. Например, наблюдали, что 8сЫ7оскуйшт 8р. АТСС 20888 образовывали эктоплазматические сети, проникаю- 6 022841 щие в агар, когда при выращивании на твердых средах (данные не представлены). В таких примерах эктоплазматическая сеть, по-видимому, действует как псевдоризоид. Дополнительно, было обнаружено, что актиновые филаменты в большом количестве присутствуют в некоторых мембранных удлинениях эктоплазматической сети. См., например, Рге81оп, 1. Еикагуо!. МюгоЪю1. 52:461-475 (2005). На основании значимости актиновых филаментов для структур цитоскелета в других организмах ожидают, что элементы цитоскелета, такие как актин, играют роль в образовании и/или сохранении целостности мембранных удлинений эктоплазматической сети.
Дополнительные организмы, образующие псевдоризоидные удлинения, включают организмы, называемые хитридами, которые таксономически относят к различным группам, включая С11у1пбютуео1а. или Рйусотусек. Примеры родов включают СйуйДшш, СНуГОтусех. С1абосйу1шт, Ьасиккготусек, КЫ/орйубшт, КЫкорйусйбасеае, Ро/е11а, ϋΐρίύίιιιη и ЬоЪи1отусе8.
В некоторых вариантах реализации микроводорослевая клетка-хозяин содержит удлинения на мембране. В некоторых вариантах реализации микроводорослевая клетка-хозяин содержит псевдоризоид. В некоторых вариантах реализации микроводорослевая клетка-хозяин содержит эктоплазматическую сеть. В некоторых вариантах реализации микроводорослевая клетка-хозяин содержит сагеносому или ботросому.
В некоторых вариантах реализации микроводорослевая клетка-хозяин представляет собой траустохитрид. В некоторых вариантах реализации микроводорослевая клетка-хозяин представляет собой клетку 5с1и/ос11у1пит или ТЬгаи81осЬу1гшт.
В некоторых вариантах реализации микроводорослевая клетка-хозяин представляет собой лабиринтулид.
В некоторых вариантах реализации микроводорослевая клетка-хозяин представляет собой эукариота, способного осуществлять процессинг полипептидов посредством обычного секреторного пути, такого как представители вида ЕаЪугш1йи1отусо1а, включая ЗсЫ/осйуОшт, ТЬгаи81осйу1гшт и другие траустохитриды. Например, выяснили, что представители вида ЬаЪуг1п1Ни1отусо1а продуцируют меньше секретируемых в больших количествах белков, чем клетки СНО, что обеспечивает преимущество применения ЗсЫ/осЬуйщт, например, над клетками СНО. Вдобавок, в отличие от Е.сой, представители вида ЕаЪугш1йи1отусо1а, такие как ЗсП/осйуОшт, осуществляют гликозилирование белков, например Ν-связанное гликозилирование, которое необходимо для биологической активности некоторых белков. Установили, что Ν-связанное гликозилирование, обнаруженное у траустохитрид, таких как ЗсЫ/осЬуйщт, больше, чем гликозилирование у дрожжей, напоминает паттерны гликозилирования млекопитающих.
Эффективные условия культивирования для клетки-хозяина согласно настоящему изобретению включают, но не ограничены перечисленными, эффективные среды, биореактор, температуру, рН и содержание кислорода, которые позволяют получить продукцию белка и/или рекомбинацию. Эффективная среда относится к любой среде, в которой обычно культивируют клетку микроводоросли, такую как клетка ТЬгаи81осйу1па1е8, например клетка-хозяин 5сН|/осНу1г1пт. Такая среда обычно включает водную среду, содержащую источники ассимилируемого углерода, азота и фосфата, а также подходящие соли, минералы, металлы и другие питательные вещества, такие как витамины. Неограничивающие примеры подходящих сред и условий культивирования описаны в разделе Примеры. Неограничивающие условия культивирования, подходящие для микроорганизмов ТЬгаи81осйу1па1е8, также описаны в патенте США № 5340742, полностью включенном в данное описание посредством ссылки. Клетки согласно настоящему изобретению можно культивировать в обычных ферментационных биореакторах, встряхиваемых колбах, пробирках, микротитрационных планшетах и чашках Петри. Культивирование можно осуществить при температуре, рН и содержании кислорода, подходящих для рекомбинантной клетки.
В некоторых вариантах реализации микроводорослевая клетка-хозяин согласно настоящему изобретению сдержит рекомбинантный вектор, включающий последовательность нуклеиновых кислот, кодирующую селекционный маркер. В некоторых вариантах реализации селекционный маркер позволяет осуществить селекцию трансформированных микроорганизмов. Примеры основных селекционных маркеров включают ферменты, которые разрушают соединения с антибиотической или фунгицидной активностью, такие как, например, ген ЗН Ъ1е из 81ер1оа11о1еюйи8 Ыиби81апи8, который кодирует блеомицинсвязывающий белок, представленный в последовательности 5ЕО ГО N0: 5. Другой пример доминантного селекционного маркера включает последовательность ацетолактатсинтазы траустохитрид, такую как мутированный вариант полинуклеотидной последовательности 5Е0 ГО N0: 6. Ацетолактатсинтазу можно модифицировать, мутировать или другим образом выбрать, чтобы она была устойчива к ингибированию соединениями сульфонилмочевины, ингибиторами класса имидазолинонов и/или пиримидинилоксибензоатами. Типичные примеры последовательностей ацетолактатсинтазы траустохитрид включают, но не ограничены перечисленными, такие последовательности аминокислот, как 5Е0 ГО N0: 7, 5ЕС ГО N0: 8, 5Е0 ГО N0: 9, 5Е0 ГО N0: 10, или последовательность аминокислот, которая отличается от 5ЕС ГО N0: 7 делецией, вставкой или заменой аминокислоты в одном или более из следующих положений: 1160, 117А, 192Р, 200А, 251К, 358М, 383Ό, 592У, 595\ν или 599Р, и такие полинуклеотидные последовательности, как 5Е0 ГО N0: 11, ЗЕО ГО N0: 12 или 5Е0 ГО N0: 13, а также последовательно- 7 022841 сти, обладающие по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичности любой из представленных последовательностей. Дополнительные примеры селекционных маркеров, которые можно включить в рекомбинантный вектор для трансформирования клеток микроводорослей, включают ΖΕΟΟΙΝ™, паромомицин, гигромицин, бластицидин или любой другой подходящий маркер устойчивости.
Термин трансформация относится к любому способу, с помощью которого экзогенную молекулу нуклеиновой кислоты (т.е. рекомбинантную молекулу нуклеиновой кислоты) можно вставить в микробные клетки. В микробных системах термин трансформирование используют для описания наследуемого изменения в результате приобретения экзогенных нуклеиновых кислот микроорганизмом, и он, по существу, синонимичен термину трансфекция. Подходящие методики трансформации для введения экзогенных молекул нуклеиновых кислот в микроводорослевые клетки-хозяева включают, но не ограничены перечисленными, бомбардировку частицами, электропорацию, микроинъекцию, липофекцию, адсорбцию, инфекцию и слияние протопластов. Например, экзогенные молекулы нуклеиновых кислот, включая рекомбинантные векторы, можно ввести в клетку микроводоросли, которая находится в стационарной фазе роста, во время экспоненциальной фазы роста или когда клетки микроводорослей достигают оптической плотности от 1,5 до 2 при 600 нм. Микроводорослевую клетку-хозяина также можно предварительно обработать ферментом, обладающим протеазной активностью, перед включением молекулы нуклеиновой кислоты в указанную клетку-хозяина путем электропорации.
В некоторых вариантах реализации клетка-хозяин может быть генетически модифицирована путем введения или удаления генов, участвующих в биосинтетических путях, связанных с транспортом и/или синтезом углеводов, включая пути, участвующие в гликозилировании. Например, клетка-хозяин может быть модифицирована путем удаления эндогенных генов гликозилирования и/или встраивания генов гликозилирования человека или животного, чтобы обеспечить паттерны гликозилирования, которые более близко напоминают паттерны гликозилирования у людей. Описание изменения гликозилирования у дрожжей можно найти, например, в патенте США № 7029872 и публикациях США № 2004/0171826, 2004/0230042, 2006/0257399, 2006/0029604 и 2006/0040353. Клетка-хозяин согласно настоящему изобретению также включает клетку, в которой элемент вирусной РНК используют для повышения или регулирования экспрессии генов.
Системы экспрессии.
Система экспрессии, использованная для экспрессии гетерологичного полипептида в микроводорослевой клетке-хозяине, включает регуляторные элементы контроля, которые активны в клетках микроводорослей. В некоторых вариантах реализации система экспрессии включает регуляторные элементы контроля, которые активны в клетках ЬаЪугт1Ьи1отусо1а. В некоторых вариантах реализации система экспрессии включает регуляторные элементы контроля, которые активны в клетках траустохитрид. В некоторых вариантах реализации система экспрессии включает регуляторные элементы контроля, которые активны в БсЫ/осНуТпит или ТЬгаи81осЬу1гшт. Многие регуляторные элементы контроля, включая различные промоторы, активны во множестве различных видов. Следовательно, регуляторные последовательности можно использовать в типе клеток, идентичном клетке, из которой их выделили, или можно использовать в типе клеток, который отличен от клетки, из которой их выделили. При разработке и конструировании таких кассет экспрессии применяют стандартные методики молекулярной биологии, известные специалистам в данной области. См., например, 8атЪгоок с1 а1., 2001, Мо1еси1аг С1отп§: А ЬаЪога1огу Мапиа1, 3-е изд
В некоторых вариантах реализации система экспрессии, использованная для получения гетерологичного полипептида в клетках микроводорослей, включает регуляторные элементы, которые получены из последовательностей ЕаЪуг1п1ки1отусо1а. В некоторых вариантах реализации система экспрессии, использованная для получения гетерологичных полипептидов в клетках микроводорослей, включает регуляторные элементы, которые получены из последовательностей, не принадлежащих ЬаЪугт1Ьи1отусо1а, включая последовательности, полученные из последовательностей водорослей, не относящихся к ЬаЪугт1Ьи1отусо1а. В некоторых вариантах реализации система экспрессии включает полинуклеотидную последовательность, кодирующую гетерологичный полипептид, при этом указанная полинуклеотидная последовательность связана с любой последовательностью промотора, любой последовательностью терминатора и/или любыми другими регуляторными последовательностями, которые способны функционировать в микроводорослевой клетке-хозяине. Можно применять индуцибельные или конститутивно активные последовательности. Подходящие регуляторные элементы контроля также включают любые из регуляторных контролирующих элементов, связанных с молекулами нуклеиновых кислот, описанными в данном документе.
Настоящее изобретение также относится к кассете экспрессии для экспрессии гетерологичного полипептида в микроводорослевой клетке-хозяине. Настоящее изобретение также относится к любым из описанных выше клеток-хозяев, содержащих кассету экспрессии для экспрессии гетерологичного полипептида в указанной клетке-хозяине. В некоторых вариантах реализации система экспрессии включает кассету экспрессии, содержащую генетические элементы, такие как, по меньшей мере, промотор, кодирующая последовательность и терминаторный участок, функционально связанные таким образом, что
- 8 022841 они способны функционировать в клетке-хозяине. В некоторых вариантах реализации указанная кассета экспрессии включает по меньшей мере одну из выделенных молекул нуклеиновых кислот согласно настоящему изобретению, описанных в данном описании. В некоторых вариантах реализации все генетические элементы кассеты экспрессии представляют собой последовательности, связанные с выделенными молекулами нуклеиновых кислот. В некоторых вариантах реализации контролирующие последовательности представляют собой индуцибельные последовательности. В некоторых вариантах реализации последовательность нуклеиновых кислот, кодирующая гетерологичный полипептид, интегрируется в геном клетки-хозяина. В некоторых вариантах реализации последовательность нуклеиновых кислот, кодирующая гетерологичный полипептид, стабильно интегрирована в геном клетки-хозяина.
В некоторых вариантах реализации выделенная последовательность нуклеиновых кислот, кодирующая гетерологичный полипептид, который нужно экспрессировать, функционально связана с последовательностью промотора и/или с последовательностью терминатора, обе из которых способны функционировать в клетке-хозяине. Последовательность промотора и/или терминатора, с которой функционально связана выделенная последовательность нуклеиновых кислот, кодирующая гетерологичный полипептид, который нужно экспрессировать, может включать любую последовательность промотора и/или терминатора, включая, но не ограничиваясь перечисленными, последовательности нуклеиновых кислот, описанные в данном документе, регуляторные последовательности, описанные в патенте США № 7001772, регуляторные последовательности, описанные в публикациях США № 2006/0275904 и 2006/0286650, регуляторную последовательность, описанную в публикации США № 2010/0233760 и \УО 2010/107709, или другие регуляторные последовательности, способные функционировать в клеткехозяине, которая ими трансформирована, которые функционально связаны с выделенной полинуклеотидной последовательностью, кодирующей гетерологичный полипептид. В некоторых вариантах реализации последовательность нуклеиновых кислот, кодирующая гетерологичный полипептид, кодоноптимизирована для использования в определенной микроводорослевой клетке-хозяине, чтобы максимизировать эффективность трансляции.
Настоящее изобретение также относится к рекомбинантным векторам, содержащим кассету экспрессии согласно настоящему изобретению. Рекомбинантные векторы включают, но не ограничены перечисленными, плазмиды, фаги и вирусы. В некоторых вариантах реализации рекомбинантный вектор представляет собой линеаризованный вектор. В некоторых вариантах реализации рекомбинантный вектор представляет собой вектор экспрессии. В данном описании формулировка вектор экспрессии относится к вектору, который подходит для получения кодируемого им продукта (например, интересующего белка). В некоторых вариантах реализации последовательность нуклеиновых кислот, кодирующую продукт, который нужно получить, вставляют в рекомбинантный вектор для получения рекомбинантной молекулы нуклеиновой кислоты. Последовательность нуклеиновых кислот, кодирующую гетерологичный полипептид, который нужно получить, вставляют в вектор таким образом, что указанная последовательность нуклеиновых кислот оказывается функционально связанной с регуляторными последовательностями в векторе (например, с промотором ТЬгаи81осйу1г1а1е8), которые обеспечивают возможность транскрипции и трансляции последовательности нуклеиновых кислот внутри рекомбинантного микроорганизма. В некоторых вариантах реализации селектируемый маркер, включая любой из селектируемых маркеров, описанных в данном документе, позволяет осуществлять селекцию рекомбинантного микроорганизма, в который успешно включили рекомбинантную молекулу нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению.
В некоторых вариантах реализации гетерологичный полипептид, продуцируемый клеткойхозяином согласно настоящему изобретению, получают в промышленном масштабе. Промышленный масштаб включает получение гетерологичного полипептида из микроорганизма, которого выращивали в аэрируемом ферментере объемом >100, >1000, >10000 или >100000 л. В некоторых вариантах реализации получение в промышленном масштабе осуществляют в аэрируемом ферментере с перемешиванием.
В некоторых вариантах реализации гетерологичный полипептид, продуцируемый клеткойхозяином согласно настоящему изобретению, может накапливаться внутри клетки или может секретироваться из клетки, например, в культуральную среду в виде растворимого гетерологичного полипептида.
В некоторых вариантах реализации гетерологичный полипептид, полученный согласно настоящему изобретению, выделяют из клетки, из культуральной среды или из ферментационной среды, в которой выращивали указанную клетку. В некоторых вариантах реализации гетерологичный полипептид представляет собой секретируемый гетерологичный полипептид, который выделяют из культуральных сред в виде растворимого гетерологичного полипептида. В некоторых вариантах реализации гетерологичный полипептид представляет собой секретируемый белок, содержащий сигнальный пептид.
В некоторых вариантах реализации гетерологичный полипептид, полученный согласно настоящему изобретению, содержит нацеливающий сигнал, направляющий его прикрепление в эндоплазматическом ретикулуме, направляющий его внеклеточную секрецию или направляющий его в другие органеллы или клеточные компартменты. В некоторых вариантах реализации гетерологичный полипептид содержит сигнальный пептид. В некоторых вариантах реализации гетерологичный полипептид содержит сигнальный пептид транспортера Να/Ρί-ΙΙΠ2 или транспортного белка 8ес1. В некоторых вариантах реализации
- 9 022841 сигнальный пептид включает последовательность аминокислот 8ЕЭ ГО N0: 1 или 8ЕЦ ГО N0: 37. В некоторых вариантах реализации гетерологичный полипептид, содержащий сигнальный пептид, имеющий последовательность аминокислот 8ЕЭ ГО N0: 1 или 8ЕЦ ГО N0: 37, секретируется в культуральную среду. В некоторых вариантах реализации сигнальный пептид отщепляется от белка в процессе секреции, в результате чего образуется зрелая форма белка.
В некоторых вариантах реализации гетерологичный полипептид, продуцируемый клеткойхозяином согласно настоящему изобретению, гликозилирован. В некоторых вариантах реализации паттерн гликозилирования гетерологичного полипептида, полученного согласно настоящему изобретению, более близко напоминает паттерны гликозилирования млекопитающего, чем у белков, полученных в дрожжах или Е.соП. В некоторых вариантах реализации гетерологичный полипептид, продуцируемый микроводорослевой клеткой-хозяином согласно настоящему изобретению, включает паттерн ^связанного гликозилирования. Гликозилированные белки, используемые для терапевтических целей, с меньшей вероятностью вызывают иммунные ответы против гликоформы, если их паттерны гликозилирования аналогичны паттернам гликозилирования, обнаруживаемым в испытуемом организме. Наоборот, гликозилированные белки обладающие связями или сахарами, которые не свойственны испытуемому организму, с большей вероятностью будут антигенными. Эффекторные функции также можно модулировать с помощью определенных гликоформ. Например, 1§С может опосредовать про- или противовоспалительные реакции в зависимости от отсутствия или присутствия соответственно концевых сиаловых кислот на гликоформах Ре-области (Капеко с1 а1., 8сюпсс. 313:670-3 (2006)).
Настоящее изобретение дополнительно относится к способу получения рекомбинантного гетерологичного полипептида, причем указанный способ включает культивирование рекомбинантной микроводорослевой клетки-хозяина согласно настоящему изобретению при условиях, достаточных для экспрессии полинуклеотидной последовательности, кодирующей гетерологичный полипептид. В некоторых вариантах реализации рекомбинантный гетерологичный полипептид секретируется из клетки-хозяина, и его выделяют из культуральной среды. В некоторых вариантах реализации гетерологичный полипептид, который секретируется из клетки, содержит сигнальный пептид для секреции. В зависимости от системы вектора и хозяина, используемой для его получения, рекомбинантный гетерологичный полипептид согласно настоящему изобретению может оставаться внутри рекомбинантной клетки, может секретироваться в ферментационную среду, может секретироваться в пространство между двумя клеточными мембранами или может оставаться на наружной поверхности клеточной мембраны. В данном описании формулировка выделение белка относится к сбору ферментационной среды, содержащей указанный белок, и не обязательно подразумевает дополнительные этапы разделения или очистки. Гетерологичные полипептиды, полученные способом согласно настоящему изобретению, можно очистить, применяя целый ряд стандартных методик очистки белка, таких как, но не ограничиваясь перечисленными, аффинная хроматография, ионообменная хроматография, фильтрация, электрофорез, хроматография гидрофобных взаимодействий, гель-фильтрационная хроматография, хроматография с обращенными фазами, хроматография по сродству конканавалина А, хроматофокусировка и дифференциальное растворение. В некоторых вариантах реализации гетерологичные полипептиды, полученные способом согласно настоящему изобретению, выделяли по существу в чистом виде. В данном описании по существу чистый относится к чистоте, которая позволяет эффективное использование гетерологичного полипептида в качестве промышленного продукта. В некоторых вариантах реализации рекомбинантный гетерологичный полипептид накапливается внутри клетки, и его выделяют из клетки. В некоторых вариантах реализации клетка-хозяин согласно указанному способу представляет собой траустохитрид. В некоторых вариантах реализации клетка-хозяин согласно указанному способу представляет собой 8с1и/ос11у1пит или ТЬтаикЮсНуШит. В некоторых вариантах реализации рекомбинантный гетерологичный полипептид представляет собой терапевтический белок, пищевой фермент или промышленный фермент. В некоторых вариантах реализации рекомбинантная микроводорослевая клетка-хозяин представляет собой 8с1й/ос11у1пит и рекомбинантный гетерологичный полипептид представляет собой терапевтический белок, который содержит сигнальную последовательность для секреции.
В некоторых вариантах реализации рекомбинантный вектор согласно настоящему изобретению представляет собой нацеливающий вектор. В данном описании формулировка нацеливающий вектор относится к вектору, который применяют для доставки определенной молекулы нуклеиновой кислоты в рекомбинантную клетку, при этом указанную молекулу нуклеиновой кислоты используют для удаления или инактивирования эндогенного гена внутри клетки-хозяина (т.е. используют для направленного разрушения гена или нокаутной технологии). Такой вектор также известен как нокаутный вектор. В некоторых вариантах реализации часть нацеливающего вектора обладает последовательностью нуклеиновых кислот, которая гомологична последовательности нуклеиновых кислот целевого гена в клетке-хозяине (т.е. гена, который направлен на удаление или инактивацию). В некоторых вариантах реализации молекула нуклеиновой кислоты, вставленная в вектор (т.е. вставка), гомологична целевому гену. В некоторых вариантах реализации последовательность нуклеиновых кислот векторной вставки разработана таким образом, что она связывается с целевым геном так, что целевой ген и вставка подвергаются гомологичной рекомбинации, посредством которой эндогенный целевой ген удаляется, инактивируется или атте- 10 022841 нуируется (т.е. путем мутирования или удаления по меньшей мере части эндогенного целевого гена).
Изолированные молекулы нуклеиновых кислот/
В соответствии с настоящим изобретением изолированная молекула нуклеиновой кислоты представляет собой молекулу нуклеиновой кислоты, которую удалили из естественного окружения (т.е. которую подвергли манипулированию человеком), при этом ее естественное окружение представляет собой геном или хромосому, в которой указанная молекула нуклеиновой кислоты встречается в природе. По существу, изолированная не обязательно отражает степень, до которой молекула нуклеиновой кислоты была очищена, но указывает на то, что молекула не включает весь геном или всю хромосому, в которой указанная молекула нуклеиновой кислоты встречается в природе.
Изолированная молекула нуклеиновой кислоты может включать ДНК, РНК (например, мРНК) или производные либо ДНК, либо РНК (например, кДНК). Хотя формулировка молекула нуклеиновой кислоты, главным образом, относится к физической молекуле нуклеиновой кислоты и формулировки последовательность нуклеиновых кислот или полинуклеотидная последовательность, главным образом, относятся к последовательности нуклеотидов в молекуле нуклеиновой кислоты, указанные формулировки используют взаимозаменяемо, в частности, в отношении молекулы нуклеиновой кислоты, полинуклеотидной последовательности или последовательности нуклеиновой кислоты, которая способна кодировать гетерологичный полипептид. В некоторых вариантах реализации изолированную молекулу нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению получают, применяя технологию рекомбинантной ДНК (например, амплификацию путем полимеразной цепной реакции (ПЦР), клонирование) или химический синтез. Изолированные молекулы нуклеиновых кислот включают природные молекулы нуклеиновых кислот и их гомологи, включая, но не ограничиваясь перечисленными, природные аллельные варианты и модифицированные молекулы нуклеиновых кислот, в которых нуклеотиды были вставлены, удалены, замещены и/или инвертированы таким образом, что такие модификации обеспечивают желательное влияние на последовательность, функцию и/или биологическую активность кодируемого гетерологичного полипептида.
Последовательность нуклеиновых кислот, комплементарная последовательности промотора, последовательности терминатора, последовательности сигнального пептида или любой другой последовательности, относится к последовательности нуклеиновых кислот нити нуклеиновой кислоты, которая комплементарна нити с последовательностью промотора, последовательностью терминатора, последовательностью сигнального пептида или любой другой последовательностью. Должно быть очевидно, что двунитевая ДНК включает однонитевую ДНК и комплементарную ей нить, обладающую последовательностью, которая комплементарна указанной однонитевой ДНК. По существу, молекулы нуклеиновых кислот могут быть либо двунитевыми, либо однонитевыми и включают такие молекулы нуклеиновых кислот, которые образуют стабильные гибриды в жестких условиях гибридизации с последовательностью согласно настоящему изобретению и/или с последовательностью, комплементарной последовательности согласно настоящему изобретению. Способы определения комплементарной последовательности известны специалистам в данной области.
Термин полипептид включает однонитевые полипептидные молекулы, а также комплексы множества полипептидов, в которых отдельные составляющие комплекс полипептиды связаны с помощью ковалентных или нековалентных способов. Согласно настоящему изобретению изолированный полипептид представляет собой полипептид, который удалили от естественного окружения (т.е. который подвергли манипулированию человеком), и он может включать, например, очищенные белки, очищенные пептиды, частично очищенные белки, частично очищенные пептиды, полученные рекомбинантным способом белки или пептиды и полученные синтетическим способом белки или пептиды.
В данном описании рекомбинантный микроорганизм обладает геномом, который был модифицирован (т.е. мутирован или изменен) по сравнению с нормальной (т.е. дикого типа или встречающейся в природе) формой путем применения рекомбинантной технологии. Рекомбинантный микроорганизм согласно настоящему изобретению может включать микроорганизм, в котором молекулы нуклеиновых кислот были вставлены, удалены или модифицированы (т.е. мутированы, например, путем вставки, делеции, замены и/или инверсии нуклеотидов) таким образом, что такая модификация или модификации обеспечивают желательный эффект в микроорганизме. В данном описании генетические модификации, которые приводят к снижению экспрессии генов, функции гена или функции продукта гена (т.е. белка, кодируемого данным геном), можно называть инактивацией (полной или частичной), делецией, нарушением, блокировкой или понижающей регуляцией гена. Например, генетическая модификация гена, которая приводит к снижению функции белка, кодируемого таким геном, может произойти в результате полной делеции гена (т.е. ген отсутствует в рекомбинантном микроорганизме и, следовательно, белок отсутствует в рекомбинантном микроорганизме), мутации в гене, которая приводит к неполной трансляции или отсутствию трансляции белка (например, белок не экспрессируется), или мутации в гене, которая снижает или нарушает природную функцию белка (например, экспрессируется белок, который обладает пониженной активностью или не обладает активностью (например, ферментативной активностью или действием)). Генетические модификации, которые приводят к повышению экспрессии или функции генов, можно называть усилением, чрезмерной продукцией, чрезмерной экспрессией, активацией, стиму- 11 022841 лированием, увеличением или повышающей регуляцией гена.
Промоторы.
Промотор представляет собой участок ДНК, который направляет транскрипцию связанного с ним кодирующего участка.
В некоторых вариантах реализации промотор получен из микроорганизма вида ЬаЬупп11ш1отусо1а. В некоторых вариантах реализации промотор получают из траустохитрид, включая, но не ограничиваясь перечисленными, микроорганизм, депонированный как 8АМ2179 (названный депонентом Шкета 8АМ2179), микроорганизм рода Шкета или ТЬташФскуйгит, или 8с1и/ос11у1пит. 8с1й/ос11у1гйип включают, но не ограничены перечисленными, 8с1й/ос11у1пит аддгеда1ит, 8с1и/ос11у1пит Итасшит, 8с1й/ос11у1гиип 8р. (831) (АтСс 20888), 8с1й/ос11у1гиип 8р. (88) (АТСС 20889), 8с1й/ос11у1гиип 8р. (ЬС-ΚΜ) (АТСС 18915), БсЫ/осНуЦщт 8р. (8К 21), депонированный штамм АТСС 28209 БсЫ/осНуЦщт и депонированный штамм 1РО 32693 8с1й/ос11у1пит.
Промотор может обладать промоторной активностью, по меньшей мере, у траустохитрид и включает полноразмерные последовательности промотора и их функциональные фрагменты, слитые последовательности и гомологи встречающегося в природе промотора. Гомолог промотора отличается от встречающегося в природе промотора тем, что по меньшей мере один, два, три или несколько нуклеотидов были удалены, вставлены, инвертированы, замещены и/или дериватизированы. Г омолог промотора может сохранять активность в качестве промотора, по меньшей мере, у траустохитрид, хотя активность может быть повышена, снижена или может стать зависимой от некоторых стимулов. Промоторы могут содержать один или более элементов последовательности, которые придают регуляторный контроль над экспрессией в зависимости от стадии развития и типа ткани.
В некоторых вариантах реализации изолированная молекула нуклеиновой кислоты, описанная в данном документе, содержит промотор ОгГС РИГА РК8 (промотор ОгГС РК8; также известный как промотор РГА3), как, например, полинуклеотидная последовательность, представленная в 8Еф ΙΌ N0: 3. Промотор ОгГС РК8 включает гомолог промотора ОгГС РК8, который достаточно схож с встречающейся в природе последовательностью промотора ОгГС РК8, таким образом, что последовательность нуклеиновых кислот указанного гомолога способна гибридизоваться при умеренно, высоко или очень высоко жестких условиях с последовательностью, комплементарной последовательности нуклеиновых кислот встречающегося в природе промотора ОгГС РК8, такого как, например, 8Еф ГО NО: 3 или промотор ОгГС рСЬ0001, депонированный в АТСС под номером доступа РТА-9615.
В некоторых вариантах реализации изолированная молекула нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению содержит короткий промотор ЕГ1 (короткий ЕГ1 или ЕР1-К промотор) или длинный промотор ЕР1 (длинный ЕР1 или ЕР1-Д промотор), такой как, например, короткий промотор ЕР1, представленный последовательностью 8Еф ГО NО: 42, или длинный промотор ЕР1, представленный последовательностью 8Еф ГО NО: 43. Короткий или длинный промотор ЕР1 включает гомолог короткого или длинного промотора ЕР1, который достаточно схож с встречающейся в природе короткой и/или длинной последовательностью промотора ЕР1, соответственно, таким образом, что последовательность нуклеиновых кислот гомолога способна гибридизоваться при умеренно, высоко или очень высоко жестких условиях с последовательностью, комплементарной последовательности нуклеиновых кислот встречающегося в природе короткого и/или длинного промотора ЕР1, такого как, например, 8Еф ГО NО: 42 и/или 8Еф ГО NО: 43 соответственно, или длинный промотор ЕР1 рАВ0018, депонированный в АТСС под номером доступа РТА-9616.
В некоторых вариантах реализации изолированная молекула нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению содержит короткий промотор 608 (608 короткий или 608-К промотор) или длинный промотор 608 (608 длинный или 608-Д промотор), такой как, например, короткий промотор 608, представленный последовательностью 8Еф ГО NО: 44, или длинный промотор 608, который имеет полинуклеотидную последовательность, представленную 8Еф ГО NО: 45. В некоторых вариантах реализации короткий или длинный промотор 608 включает гомолог короткого или длинного промотора 608, который достаточно схож с встречающейся в природе последовательностью короткого или длинного промотора 608 соответственно, таким образом, что последовательность нуклеиновых кислот гомолога способна гибридизоваться при умеренно, высоко или очень высоко жестких условиях с последовательностью, комплементарной последовательности нуклеиновых кислот встречающегося в природе короткого и/или длинного промотора 608, такого как, например, 8Еф ГО NО: 44 и/или 8Еф ГО NО: 45 соответственно, или длинный промотор 608 рАВ0011, депонированный в АТСС под номером доступа РТА-9614.
В некоторых вариантах реализации изолированная молекула нуклеиновой кислоты содержит промотор 8ес1 (промотор 8ес1), например, как полинуклеотидная последовательность, представленная 8Еф ГО NО: 46. В некоторых вариантах реализации промотор 8ес1 включает гомолог промотора 8ес1, который достаточно схож с встречающейся в природе последовательностью промотора 8ес1, таким образом, что последовательность нуклеиновых кислот гомолога способна гибридизоваться при умеренно, высоко или очень высоко жестких условиях с последовательностью, комплементарной последовательности нуклеиновых кислот встречающегося в природе промотора 8ес1, такого как, например, 8Еф ГО NО: 46, или промотор 8ес1 рАВ0022, депонированный в АТСС под номером доступа РТА-9613.
- 12 022841
Терминаторы.
Терминаторный участок представляет собой участок генетической последовательности, который отмечает конец последовательности гена в геномной ДНК для транскрипции.
В некоторых вариантах реализации терминаторный участок получен из микроорганизма вида ЬаЬупп11ш1отуео1а. В некоторых вариантах реализации терминаторный участок получен из траустохитрид. В некоторых вариантах реализации терминаторный участок получен из ЗсИШосНуйинп или ТНгащЮсНуйпнп. 3сЬ^ζοсЬуΐ^^ит включают, но не ограничены перечисленными, Зс^осйуйгит аддгедаШт, ЗсИШосНуйинп йтасшит, ЗсИшосНуйинп 8р. (831) (АТСС 20888), ЗсИшосНуйинп 8р. (38) (АТСС 20889), ЗсИшосНуйинп 8р. (ЬС-КМ) (АТСС 18915), ЗсИшосНуйинп 8р. (ЗК 21), депонированный штамм АТСС 28209 и депонированный штамм ΙΡΘ 32693. В некоторых вариантах реализации терминаторный участок представляет собой гетерологичный терминаторный участок, такой как, например, гетерологичный терминаторный участок ЗУ40.
Терминаторный участок может обладать терминирующей активностью, по меньшей мере, у траустохитрид и включает полноразмерные последовательности терминатора и их функциональные фрагменты, слитые последовательности и гомологи встречающегося в природе участка терминатора. Гомолог терминатора отличается от встречающегося в природе терминатора тем, что по меньшей мере один или несколько, но не ограничиваясь одним или несколькими, нуклеотидов были удалены, вставлены, инвертированы, замещены и/или дериватизированы. В некоторых вариантах реализации гомологи терминатора сохраняют активность в качестве участков терминатора, по меньшей мере, в траустохитридах, хотя эта активность может быть повышена, снижена или может быть зависимой от каких-либо стимулов.
В некоторых вариантах реализации изолированная молекула нуклеиновой кислоты может содержать терминаторный участок гена ОгГС РИГА РКЗ (терминаторный участок ОгГС РКЗ, также известный как терминатор РГА3) как, например, полинуклеотидная последовательность, представленная ЗЕО ГО N0: 4. Терминаторный участок, описанный в последовательности ЗЕО ГО N0: 4, представляет собой встречающуюся в природе последовательность терминатора (дикого типа) из микроорганизма траустохитриды и, в частности, представляет собой терминаторный участок ОгГС РКЗ Зс^осйуйгит и назван терминирующий элемент 1 ОгГС. В некоторых вариантах реализации терминаторный участок ОгГС РКЗ включает гомолог участка терминатора ОгГС РКЗ, который достаточно схож с встречающимся в природе участком терминатора ОгГС РИГА РКЗ, таким образом, что последовательность нуклеиновых кислот гомолога способна гибридизоваться при умеренно, высоко или очень высоко жестких условиях с последовательностью, комплементарной последовательности нуклеиновых кислот встречающегося в природе участка терминатора ОгГС РКЗ, такого как, например, ЗЕО ГО NО: 4 или терминаторный участок ОгГС рАВ0011, депонированный в АТСС под номером доступа РТА-9614.
Сигнальные пептиды.
В некоторых вариантах реализации изолированная молекула нуклеиновой кислоты может содержать полинуклеотидную последовательность, кодирующую сигнальный пептид секретируемого белка из микроорганизма вида РаЪупп1йи1отусо1а. В некоторых вариантах реализации микроорганизм представляет собой траустохитрид. В некоторых вариантах реализации микроорганизм представляет собой ЗсИшосНуйинп или Тйгаи81осйу1г1ит.
Сигнальный пептид может обладать активностью сигнала секреции в траустохитридах и включает полноразмерные пептиды и их функциональные фрагменты, гибридные пептиды и гомологи встречающегося в природе сигнального пептида. Гомолог сигнального пептида отличается от встречающегося в природе сигнального пептида тем, что по меньшей мере одна или несколько, но не ограничиваясь одной или несколькими, аминокислот были удалены (например, укороченная версия белка, такая как пептид или фрагмент), вставлены, инвертированы, замещены и/или дериватизированы (например, путем гликозилирования, фосфорилирования, ацетилирования, миристилирования, пренилирования, пальмитирования, амидирования и/или добавления гликозилфосфатидилинозита). В некоторых вариантах реализации гомологи сигнального пептида сохраняют активность в качестве сигнала, по меньшей мере, в траустохитридах, хотя эта активность может быть повышена, снижена или может стать зависимой от некоторых стимулов.
В некоторых вариантах реализации изолированная молекула нуклеиновой кислоты содержит полинуклеотидную последовательность, кодирующую сигнальный пептид белка-транспортера №-1/РСПЪ2. Сигнальный пептид белка-транспортера №-1/РЕПЪ2 обладает сигнальной нацеливающей активностью, по меньшей мере, для белка-транспортера №-1/Р1-ПЪ2. по меньшей мере, в траустохитридах и включает полноразмерные пептиды и их функциональные фрагменты, гибридные пептиды и гомологи встречающегося в природе сигнального пептида белка-транспортера №-1/РСПЪ2. В некоторых вариантах реализации сигнальный пептид белка-транспортера №/Р1-ПЪ2 имеет последовательность аминокислот, представленную последовательностью ЗЕО ГО NО: 1. В некоторых вариантах реализации сигнальный пептид белкатранспортера №/Р1-ПЪ2 имеет последовательность аминокислот, представленную последовательностью ЗЕО ГО NО: 15. В некоторых вариантах реализации изолированная молекула нуклеиновой кислоты содержит полинуклеотидную последовательность, кодирующую изолированную последовательность аминокислот, включающую функциональный фрагмент с последовательностью ЗЕО ГО NО: 1 или
- 13 022841 δΕΟ ΙΌ N0: 15, который функционирует как сигнальный пептид, по меньшей мере, для белкатранспортера Να/Ρί-ΙΙΕ2. по меньшей мере, в траустохитридах. В некоторых вариантах реализации изолированная молекула нуклеиновой кислоты включает последовательность δΕΟ ΙΌ N0: 2.
Настоящее изобретение также относится к изолированному полипептиду, содержащему последовательность аминокислот сигнального пептида транспортера Να/Ρί-ΙΙΕ2.
В некоторых вариантах реализации изолированная молекула нуклеиновой кислоты содержит полинуклеотидную последовательность, кодирующую сигнальный пептид альфа-1,6-маннозилтрансферазы (ЛЬС12). Сигнальный пептид ЛЬС12 может обладать сигнальной нацеливающей активностью, по меньшей мере, для белка ЛЬС12, по меньшей мере, в траустохитридах и включает полноразмерные пептиды и их функциональные фрагменты, гибридные пептиды и гомологи встречающегося в природе сигнального пептида ЛЬС12. В некоторых вариантах реализации сигнальный пептид ЛЬС12 имеет последовательность аминокислот, представленную последовательностью δΕΟ ΙΌ N0: 59. В некоторых вариантах реализации изолированная молекула нуклеиновой кислоты содержит полинуклеотидную последовательность, кодирующую изолированную последовательность аминокислот, включающую функциональный фрагмент с последовательностью δΕΟ ΙΌ N0: 59, который функционирует как сигнальный пептид, по меньшей мере, для белка ЛЬС12, по меньшей мере, в траустохитридах. В некоторых вариантах реализации изолированная молекула нуклеиновой кислоты включает последовательность δΕΟ ΙΌ N0: 60.
Настоящее изобретение также относится к изолированному полипептиду, содержащему последовательность аминокислот сигнального пептида ЛЬС12.
В некоторых вариантах реализации изолированная молекула нуклеиновой кислоты содержит полинуклеотидную последовательность, кодирующую сигнальный пептид связывающего иммуноглобулин белка (ΒίΡ). Сигнальный пептид ΒίΡ может обладать сигнальной нацеливающей активностью, по меньшей мере, для белка ΒίΡ, по меньшей мере, в траустохитридах и включает полноразмерные пептиды и их функциональные фрагменты, гибридные пептиды и гомологи встречающегося в природе сигнального пептида ΒίΡ. В некоторых вариантах реализации сигнальный пептид ΒίΡ имеет последовательность аминокислот, представленную последовательностью δΕΟ ΙΌ N0: 61. В некоторых вариантах реализации изолированная молекула нуклеиновой кислоты содержит полинуклеотидную последовательность, кодирующую изолированную последовательность аминокислот, включающую функциональный фрагмент с последовательностью δΕΟ ΙΌ N0: 61, который функционирует как сигнальный пептид, по меньшей мере, для белка ΒίΡ, по меньшей мере, в траустохитридах. В некоторых вариантах реализации изолированная молекула нуклеиновой кислоты включает последовательность δΕΟ ΙΌ N0: 62.
Настоящее изобретение также относится к изолированному полипептиду, содержащему последовательность аминокислот сигнального пептида ΒίΡ.
В некоторых вариантах реализации изолированная молекула нуклеиновой кислоты содержит полинуклеотидную последовательность, кодирующую сигнальный пептид альфа-1,3-глюкозидазы (0Εδ2). Сигнальный пептид 0Εδ2 может обладать сигнальной нацеливающей активностью, по меньшей мере, для белка 0Εδ2, по меньшей мере, в траустохитридах и включает полноразмерные пептиды и их функциональные фрагменты, гибридные пептиды и гомологи встречающегося в природе сигнального пептида 0Εδ2. В некоторых вариантах реализации сигнальный пептид 0Εδ2 имеет последовательность аминокислот, представленную последовательностью δΕΟ ΙΌ N0: 63. В некоторых вариантах реализации изолированная молекула нуклеиновой кислоты содержит полинуклеотидную последовательность, кодирующую изолированную последовательность аминокислот, включающую функциональный фрагмент с последовательностью δΕΟ ΙΌ N0: 63, который функционирует как сигнальный пептид, по меньшей мере, для белка 0Εδ2, по меньшей мере, в траустохитридах. В некоторых вариантах реализации изолированная молекула нуклеиновой кислоты включает последовательность δΕΟ ΙΌ N0: 64.
Настоящее изобретение также относится к изолированному полипептиду, содержащему последовательность аминокислот сигнального пептида 0Εδ2.
В некоторых вариантах реализации изолированная молекула нуклеиновой кислоты содержит полинуклеотидную последовательность, кодирующую сигнальный пептид альфа-1,3-1,6-маннозидазаподобного белка. Сигнальный пептид альфа-1,3-1,6-маннозидаза-подобного белка может обладать сигнальной нацеливающей активностью, по меньшей мере, для альфа-1,3-1,6-маннозидаза-подобного белка, по меньшей мере, в траустохитридах и включает полноразмерные пептиды и их функциональные фрагменты, гибридные пептиды и гомологи встречающегося в природе сигнального пептида альфа-1,3-1,6-маннозидаза-подобного белка. В некоторых вариантах реализации сигнальный пептид альфа-1,3-1,6-маннозидаза-подобного белка имеет последовательность аминокислот, представленную последовательностью δΕΟ ΙΌ N0: 65. В некоторых вариантах реализации изолированная молекула нуклеиновой кислоты содержит полинуклеотидную последовательность, кодирующую изолированную последовательность аминокислот, включающую функциональный фрагмент с последовательностью δΕΟ ΙΌ N0: 65, который функционирует как сигнальный пептид, по меньшей мере, для альфа-1,3-1,6-маннозидаза-подобного белка, по меньшей мере, в траустохитридах. В некоторых вариантах реализации изолированная молекула нуклеиновой кислоты включает последовательность δΕΕ) ΙΌ N0: 66.
- 14 022841
Настоящее изобретение также относится к изолированному полипептиду, содержащему последовательность аминокислот сигнального пептида альфа-1,3-1,6-маннозидаза-подобного белка.
В некоторых вариантах реализации изолированная молекула нуклеиновой кислоты содержит полинуклеотидную последовательность, кодирующую сигнальный пептид альфа-1,3-1,6-маннозидазаподобного белка 1. Сигнальный пептид альфа-1,3-1,6-маннозидаза-подобного белка 1 может обладать сигнальной нацеливающей активностью, по меньшей мере, для альфа-1,3-1,6-маннозидаза-подобного белка 1, по меньшей мере, в траустохитридах и включает полноразмерные пептиды и их функциональные фрагменты, гибридные пептиды и гомологи встречающегося в природе сигнального пептида альфа1,3-1,6-маннозидаза-подобного белка 1. В некоторых вариантах реализации сигнальный пептид альфа1,3-1,6-маннозидаза-подобного белка 1 имеет последовательность аминокислот, представленную последовательностью 5>ЕО ГО N0: 67. В некоторых вариантах реализации изолированная молекула нуклеиновой кислоты содержит полинуклеотидную последовательность, кодирующую изолированную последовательность аминокислот, включающую функциональный фрагмент с последовательностью 5>Е0 ГО N0: 67, который функционирует как сигнальный пептид, по меньшей мере, для альфа-1,3-1,6-маннозидаза-подобного белка 1, по меньшей мере, в траустохитридах. В некоторых вариантах реализации изолированная молекула нуклеиновой кислоты включает последовательность 5ЕС) ГО N0: 68.
Настоящее изобретение также относится к изолированному полипептиду, содержащему последовательность аминокислот сигнального пептида альфа-1,3-1,6-маннозидаза-подобного белка 1.
В некоторых вариантах реализации изолированная молекула нуклеиновой кислоты содержит полинуклеотидную последовательность, кодирующую сигнальный пептид альфа-1,2-маннозидаза-подобного белка. Сигнальный пептид альфа-1,2-маннозидаза-подобного белка может обладать сигнальной нацеливающей активностью, по меньшей мере, для альфа-1,2-маннозидаза-подобного белка, по меньшей мере, в траустохитридах и включает полноразмерные пептиды и их функциональные фрагменты, гибридные пептиды и гомологи встречающегося в природе сигнального пептида альфа-1,2-маннозидаза-подобного белка. В некоторых вариантах реализации сигнальный пептид альфа-1,2-маннозидаза-подобного белка имеет последовательность аминокислот, представленную последовательностью 5>Е0 ГО N0: 69. В некоторых вариантах реализации изолированная молекула нуклеиновой кислоты содержит полинуклеотидную последовательность, кодирующую изолированную последовательность аминокислот, включающую функциональный фрагмент с последовательностью 5>Е0 ГО N0: 69, который функционирует как сигнальный пептид, по меньшей мере, для альфа-1,2-маннозидаза-подобного белка, по меньшей мере, в траустохитридах. В некоторых вариантах реализации изолированная молекула нуклеиновой кислоты включает последовательность 5>Е0 ГО N0: 70.
Настоящее изобретение также относится к изолированному полипептиду, содержащему последовательность аминокислот сигнального пептида альфа-1,2-маннозидаза-подобного белка.
В некоторых вариантах реализации изолированная молекула нуклеиновой кислоты содержит полинуклеотидную последовательность, кодирующую сигнальный пептид бета-ксилозидаза-подобного белка. Сигнальный пептид бета-ксилозидаза-подобного белка может обладать сигнальной нацеливающей активностью, по меньшей мере, для бета-ксилозидаза-подобного белка, по меньшей мере, в траустохитридах и включает полноразмерные пептиды и их функциональные фрагменты, гибридные пептиды и гомологи встречающегося в природе сигнального пептида бета-ксилозидаза-подобного белка. В некоторых вариантах реализации сигнальный пептид бета-ксилозидаза-подобного белка имеет последовательность аминокислот, представленную последовательностью 5>Е0 ГО N0: 71. В некоторых вариантах реализации изолированная молекула нуклеиновой кислоты содержит полинуклеотидную последовательность, кодирующую изолированную последовательность аминокислот, включающую функциональный фрагмент с последовательностью 5>Е0 ГО N0: 71, который функционирует как сигнальный пептид, по меньшей мере, для бета-ксилозидаза-подобного белка, по меньшей мере, в траустохитридах. В некоторых вариантах реализации изолированная молекула нуклеиновой кислоты включает последовательность 5>Е0 ГО N0: 72.
Настоящее изобретение также относится к изолированному полипептиду, содержащему последовательность аминокислот сигнального пептида бета-ксилозидаза-подобного белка.
В некоторых вариантах реализации изолированная молекула нуклеиновой кислоты содержит полинуклеотидную последовательность, кодирующую сигнальный пептид каротин-синтазы. Сигнальный пептид каротин-синтазы может обладать сигнальной нацеливающей активностью, по меньшей мере, для белка каротин-синтазы, по меньшей мере, в траустохитридах и включает полноразмерные пептиды и их функциональные фрагменты, гибридные пептиды и гомологи встречающегося в природе сигнального пептида каротин-синтазы. В некоторых вариантах реализации сигнальный пептид каротин-синтазы имеет последовательность аминокислот, представленную последовательностью 5>Е0 ГО N0: 73. В некоторых вариантах реализации изолированная молекула нуклеиновой кислоты содержит полинуклеотидную последовательность, кодирующую изолированную последовательность аминокислот, включающую функциональный фрагмент с последовательностью 5>Е0 ГО N0: 73, который функционирует как сигнальный пептид, по меньшей мере, для белка каротин-синтазы, по меньшей мере, в траустохитридах. В некоторых вариантах реализации изолированная молекула нуклеиновой кислоты включает последовательность
- 15 022841
БЕО ΙΌ ΝΟ: 74.
Настоящее изобретение также относится к изолированному полипептиду, содержащему последовательность аминокислот сигнального пептида каротин-синтазы.
В некоторых вариантах реализации изолированная молекула нуклеиновой кислоты содержит полинуклеотидную последовательность, кодирующую сигнальный пептид белка Бес1 (Бес1). Сигнальный пептид Бес1 может обладать сигнальной секреторной активностью, по меньшей мере, для белка Бес1, по меньшей мере, в траустохитридах и включает полноразмерные пептиды и их функциональные фрагменты, гибридные пептиды и гомологи встречающегося в природе сигнального пептида Бес1. В некоторых вариантах реализации сигнальный пептид Бес1 представлен последовательностью БЕО ΙΌ ΝΟ: 37. В некоторых вариантах реализации изолированная молекула нуклеиновой кислоты содержит полинуклеотидную последовательность, кодирующую изолированную последовательность аминокислот, включающую функциональный фрагмент с последовательностью БЕО ГО ΝΟ: 37, который функционирует как сигнальный пептид, по меньшей мере, для белка Бес1, по меньшей мере, в траустохитридах. В некоторых вариантах реализации изолированная молекула нуклеиновой кислоты включает последовательность БЕО ГО ΝΟ: 38.
Настоящее изобретение также относится к изолированному полипептиду, содержащему последовательность аминокислот сигнального пептида Бес1.
В некоторых вариантах реализации изолированная молекула нуклеиновой кислоты может содержать последовательность промотора, последовательность терминатора и/или последовательность сигнального пептида, которая по меньшей мере на 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентична любой из последовательностей промотора, терминатора и/или сигнального пептида, описанного в данном документе.
В некоторых вариантах реализации изолированная молекула нуклеиновой кислоты включает промотор ΟιΓί, короткий промотор ЕР1, длинный промотор ЕР1, короткий промотор 60Б, длинный промотор 60Б, промотор Бес1, терминаторный участок ΟιΓί РКБ, последовательность, кодирующую сигнальный пептид белка-транспортера Να/Ρί-ΙΙό2, или последовательность, кодирующую сигнальный пептид транспортного белка Бес1, которые функционально связаны с 5'-концом последовательности нуклеиновых кислот, кодирующей гетерологичный полипептид. Рекомбинантные векторы (включая, но не ограничиваясь, векторы экспрессии), кассеты экспрессии и клетки-хозяева также могут содержать промотор ΟΓί, короткий промотор ЕР1, длинный промотор ЕР1, короткий промотор 60Б, длинный промотор 60Б, промотор Бес1, терминаторный участок ΟιΓί РКБ, последовательность, кодирующую сигнальный пептид белка-транспортера №/Р1-11Ъ2, или последовательность, кодирующую сигнальный пептид транспортного белка Бес1, которые функционально связаны с 5'-концом последовательности нуклеиновых кислот, кодирующей гетерологичный полипептид.
В данном описании, если не указано иное, указание процента (%) идентичности (и % идентичный) относится к оценке гомологии, которую осуществляют, применяя (1) поиск гомологии в ВЬАБТ 2.0 Вамс ВЬАБТ с помощью ЫаЧр для поиска аминокислот и ЫаЧп для поиска нуклеиновых кислот со стандартными параметрами по умолчанию, при этом запрашиваемую последовательность фильтруют по умолчанию на участки низкой сложности (см., например, АГОсНиЕ Б., е1 а1., ШсЫс Аашб Кез. 25:3389-3402 (1997), которая полностью включена в данное описание посредством ссылки); (2) выравнивание с помощью ВЬАБТ 2, используя параметры, описанные ниже; (3) и/или РБГВЬАБТ (ВЬАБТ с позиционноспецифичными итерациями) со стандартными параметрами по умолчанию. Стоит отметить, что вследствие некоторых различий в стандартных параметрах между ВЬАБТ 2.0 Вамс ВЬАБТ и ВЬАБТ 2, у двух определенных последовательностей может обнаружиться существенная гомология при применении программы ВЬАБТ 2, тогда как поиск, выполненный в ВЬАБТ 2.0 Вамс ВЬАБТ с применением одной из последовательностей в качестве запрашиваемой последовательности может не идентифицировать вторую последовательность среди максимально совпадающих. Кроме того, в РБ1-ВЬАБТ предусмотрена автоматизированная, удобная в обращении версия профиля поиска, что обеспечивает более чувствительный способ определения гомологов последовательностей. Программа сначала осуществляет поиск в базе данных с помощью ВЬАБТ с использованием гэпов. Программа РБ1-ВЬАБТ использует полученную информацию о любых существенных выравниваниях для создания позиционно-специфичной матрицы замен, которая заменяет запрашиваемую последовательность для следующего раунда поиска в базе данных. Следовательно, должно быть очевидно, что процент идентичности можно определить, применяя любую из данных программ.
Две определенные последовательности можно выровнять друг с другом, применяя выравнивание последовательностей ВЬАБТ 2, как описано, например, у Таΐи8оνа и Маббеи, РЕМБ М1сгоЪю1. Ьей. 174:247-250 (1999), которая полностью включена в данное описание посредством ссылки. Выравнивание последовательностей с помощью ВЬАБТ 2 осуществляют, применяя ЫаЧр или Ъ1аз1п, используя алгоритм ВЬАБТ 2.0 для осуществления поиска в ВЬАБТ с использованием гэпов (ВЬАБТ 2.0) гомологии между двумя последовательностями, с позволением включения гэпов (делеций и вставок) в полученном в результате этого выравнивании. В некоторых вариантах реализации выравнивание последовательностей в ВЬАБТ 2 осуществляют, применяя стандартные параметры по умолчанию, описанные далее.
- 16 022841
Для Ыа51п. с применением матрицы 0 ВЬО8ИМ62:
Награда за совпадение = 1.
Штраф за несовпадение = -2.
Штрафы за открытие гэпа (5) и продление гэпа (2), сокращение гэпа на х (50), ожидается (10), длина слова (11), фильтр (включен).
Для Ыакф, с применением матрицы 0 ВЬО8ИМ62:
Штрафы за открытие гэпа (11) и продление гэпа (1), сокращение гэпа на х (50), ожидается (10), длина слова (3), фильтр (включен).
В данном описании условия гибридизации относятся к стандартным условиям гибридизации, в которых молекулы нуклеиновых кислот используют для идентификации аналогичных молекул нуклеиновых кислот. См., например, ЗатЪгоок 1. и Ки88е11 Ό. (2001), Мо1еси1аг С1ошп§: А ЬаЪогаЮгу Мапиа1, 3-е изд. Со1б Зргшд НагЪог ЬаЪогаЮгу Рге88, Колд Спринг Харбор, Нью-Йорк, которое полностью включено в данное описание посредством ссылки. Вдобавок, формулы для вычисления подходящих условий гибридизации и промывки, чтобы добиться гибридизации, позволяющей различные степени несовпадения нуклеотидов, описаны, например, у Меткой е1 а1., Апа1. ВюсЬет. 138:267-284 (1984), которая полностью включена в данное описание посредством ссылки. Специалист в данной области может применять формулы, описанные у Меткой е1 а1., например, для вычисления подходящих условий гибридизации и промывки, чтобы добиться определенных уровней несовпадения нуклеотидов. Такие условия будут изменяться в зависимости от того, образовались ли гибриды ДНК:РНК или ДНК:ДНК. Рассчитанные температуры плавления для гибридов ДНК:ДНК меньше на 10°С, чем для гибридов ДНК:РНК. В определенных вариантах реализации строгие условия гибридизации для гибридов ДНК:ДНК включают гибридизацию при ионной силе 6Х 88С (0,9 М Ν·ι') и при температуре между 20 и 35°С (низкая строгость), между 28 и 40°С (большая строгость) и между 35 и 45°С (еще большая строгость), при подходящих условиях промывки. В определенных вариантах реализации строгие условия гибридизации для гибридов ДНК:РНК включают гибридизацию при ионной силе 6Х 88С (0,9 М Ν·ι') и при температуре между 30 и 45°С, между 38 и 50°С и между 45 и 55°С, при условиях промывки аналогичной строгости. Данные значения получают на основании вычисления температуры плавления для молекул, больших приблизительно 100 нуклеотидов, при 0% формамида и при содержании С+С пар приблизительно 40%. В качестве альтернативы Тт можно рассчитать опытным путем, как описано у ЗатЪгоок е1 а1. Обычно условия промывки должны быть настолько строгими, насколько это возможно, и должны подходить для выбранных условий гибридизации. Например, условия гибридизации могут включать комбинацию условий содержания соли и температуры, которая приблизительно на 20-25°С ниже рассчитанной Тт для конкретного гибрида, и условия промывки обычно включают комбинацию условий содержания соли и температуры, которая приблизительно на 12-20°С ниже рассчитанной Тт для конкретного гибрида. Один пример условий гибридизации, подходящих для применения для гибридов ДНК:ДНК, включает гибридизацию в течение 2-24 ч в 6Х 88С (50% формамида) при 42°С, а затем этапы промывки, которые включают одну или более промывок при комнатной температуре в 2Х 88С, а затем дополнительные промывки при более высоких температурах и более низкой ионной силе (например, по меньшей мере одну промывку при 37°С в 0,1Х-0,5Х 88С, а затем по меньшей мере одну промывку при 68°С в 0,1Х-0,5Х 88С).
Г етерологичные полипептиды.
Термин гетерологичный в данном документе относится к последовательности, которая не встречается в природе в микроводорослевой клетке-хозяине. В некоторых вариантах реализации гетерологичные полипептиды, продуцируемые рекомбинантной клеткой-хозяином согласно настоящему изобретению включают, но не ограничены перечисленными, терапевтические белки. Терапевтический белок в данном документе включает белки, которые полезны для лечения или предупреждения заболеваний, состояний или расстройств у животных и людей.
В некоторых вариантах реализации терапевтические белки включают, но не ограничены перечисленными, биологически активные белки, например ферменты, антитела или антигенные белки.
В некоторых вариантах реализации гетерологичные полипептиды, продуцируемые рекомбинантной клеткой-хозяином согласно настоящему изобретению, включают, но не ограничены промышленными ферментами. Промышленные ферменты включают, но не ограничены перечисленными, ферменты, которые используют при производстве, получении, сохранении, мобилизации питательных веществ или переработке продуктов, включая пищевые, медицинские, химические, механические и другие промышленные продукты.
В некоторых вариантах реализации гетерологичные полипептиды, продуцируемые рекомбинантной клеткой-хозяином согласно настоящему изобретению, включают ауксотрофный маркер, доминантный селекционный маркер (такой как, например, фермент, который снижает активность антибиотика) или другой белок, вовлеченный в селекцию трансформантов, белок, который функционирует как репортер, фермент, вовлеченный в гликозилирование белка, и фермент, вовлеченный в метаболизм клетки.
В некоторых вариантах реализации гетерологичный полипептид, продуцируемый рекомбинантной клеткой-хозяином согласно настоящему изобретению, включает вирусный белок, выбранный из группы,
- 17 022841 состоящей из белка Н или НА (гемагглютинина), белка N или ΝΑ (нейраминидазы), гибридного белка (Р), гликопротеина (С), белка Е или епу (белка оболочки), др120 (гликопротеина размером 120 кДа) и др41 (гликопротеина размером 41 кДа). В некоторых вариантах реализации гетерологичный полипептид, продуцируемый рекомбинантной клеткой-хозяином согласно настоящему изобретению, представляет собой вирусный белок матрикса. В некоторых вариантах реализации гетерологичный полипептид, продуцируемый рекомбинантной клеткой-хозяином согласно настоящему изобретению, представляет собой вирусный белок матрикса, выбранный из группы, состоящей из М1, М2 (мембранный белок канала), Сад и комбинации перечисленных. В некоторых вариантах реализации НА, ΝΑ, Р, С, Е, др120, др41 или белок матрикса получены из вирусного источника, например из вируса гриппа или вируса кори.
Грипп представляет собой основную причину смертей у человека, связанных с заражением респираторным вирусом. Обычные симптомы включают жар, боль в горле, одышку и мышечную боль и др. Вирусы гриппа представляют собой оболочечные вирусы, которые отпочковываются от плазматической мембраны инфицированных клеток млекопитающих и птиц. Их классифицируют на типы А, В или С на основании присутствующих нуклеопротеидов и антигенных белков матрикса. Вирусы гриппа типа А дополнительно подразделяются на подтипы в зависимости от комбинации присутствующих поверхностных гликопротеинов НА и ΝΑ. НА представляет собой антигенный гликопротеин и играет роль в связывании вируса с клетками, которые становятся инфицированными. NΑ удаляет концевые остатки сиаловой кислоты из гликановых цепей на клетке-хозяине и белках вирусной поверхности, что предотвращает аггрегацию вируса и способствует подвижности вируса.
Белок вируса гриппа НА представляет собой гомотример с карманом, связывающим рецептор, на глобулярной головке каждого мономера, и белок вируса гриппа NΑ представляет собой тетрамер с ферментативно активным сайтом на головке каждого мономера. На сегодняшний день идентифицировано 16 подтипов НА (Н1-Н16) и 9 подтипов NΑ (Ν1-Ν9). Каждый вирус гриппа типа А презентирует один тип гликопротеина НА и один тип гликопротеина NΑ. Как правило, каждый подтип проявляет видоспецифичность; например, известно, что все подтипы НА и NΑ заражают птиц, тогда как было показано, что только подтипы Н1, Н2, Н3, Н5, Н7, Н9, Н10, Ν1, Ν2, Ν3 и Ν7 заражают людей. Вирусы гриппа характеризуют по типу НА и NΑ, которые они несут, например НДО1, Н5Ш. НШ2, НШ3, Н2Ш. Н3Ш. Н4Ж>. Н5№, Н5Ж, Н5Ж, Н6Ж, 47Ν7, Н8М, Н9Ю, Н10Ю, Н1Ш2, Н1Ш9, Н12Ж, Н13ГО, Н15ГО, Н16Ю и т.д. Подтипы дополнительно подразделяются на штаммы; каждый выделенный генетически отличный вирус, как правило, считают отдельным штаммом, например грипп Л/РиегЮ Р|со/8/34/Моип1 §1па1 (НШ1) и грипп А/У1е1иат/1203/2004(Н5Ш). В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения НА получают из вируса гриппа, например НА получают из вируса гриппа типа А, вируса гриппа типа В или из подтипа вируса гриппа типа А, выбранного из группы, состоящей из Н1, Н2, Н3, Н4, Н5, Н6, Н7, Н8, Н9, Н10, Н11, Н12, Н13, Н14, Н15 и Н16. В другом варианте реализации НА получают из вируса гриппа типа А, выбранного из группы, состоящей из Н1, Н2, Н3, Н5, Н6, Н7 и Н9. В одном варианте реализации НА получают из подтипа вируса гриппа Н1Ш.
Белок НА вируса гриппа транслируется в клетках в виде единого белка, который после отщепления сигнального пептида представляет собой белок с молекулярной массой приблизительно 62 кДа (согласно предсказанной трансляции), называемый НА0 (т.е. белок-предшественник гемагглютинина). Для активации вируса белок-предшественник гемагглютинина (НА0) должен быть расщеплен трипсин-подобной сериновой эндопротеазой в определенном сайте, обычно кодируемом одной основной аминокислотой (обычно аргинином) между полипептидами НА1 и НА2 белка. В конкретном примере штамма А/РиегЮ Кюо/8/34 такое расщепление осуществляют между аргинином в положении 343 и глицином в положении 344. После расщепления двух связанных дисульфидной связью полипептидов получают зрелые формы субъединиц белка, что является необходимым условием для конформационного изменения, необходимого для слияния, и, следовательно, для инфекционной способности вируса.
В некоторых вариантах реализации белок НА согласно настоящему изобретению расщепляется, например белок НА0 согласно настоящему изобретению расщепляется на НА1 и НА2. В некоторых вариантах реализации экспрессия белка НА в микроводорослевой клетке-хозяине, такой как БсЫ/осйуйтит, приводит к правильному расщеплению белка НА0 на способные функционировать полипептиды НА1 и НА2 без добавления экзогенной протеазы. Такое расщепление гемагглютинина в системе экспрессии беспозвоночных без добавления экзогенной протеазы ранее не было продемонстрировано.
Вирусный гибридный белок может содержать трансмембранный домен, один раз пронизывающий мембрану, рядом с С-концом. гибридный белок можно расщепить на два пептида в сайте расщепления фурином (аминокислота 109). Первая часть белка, обозначенная Р2, включает Ν-концевой участок целого гибридного белка. Оставшуюся часть вирусного гибридного белка, содержащую С-концевой участок гибридного белка, обозначают Р1. К участкам Р1 и/или Р2 можно отдельно присоединить гетерологичные последовательности, такие как, например, последовательность, кодирующая гетерологичный сигнальный пептид. Векторы, содержащие участки Р1 и Р2 вирусного гибридного белка, можно экспрессировать отдельно или в комбинации. Вектор, экспрессирующий целый гибридный белок, можно экспрессировать совместно с ферментом фурином, который расщепит белок в сайте расщепления фурином. В качестве альтернативы, последовательность, кодирующую сайт расщепления фурином гибридного белка,
- 18 022841 можно заменить на последовательность, кодирующую сайт расщепления альтернативной протеазой, которая распознается и расщепляется отличной протеазой. Гибридный белок, содержащий сайт расщепления альтернативной протеазой, можно экспрессировать совместно с соответствующей протеазой, которая распознает и расщепляет сайт расщепления альтернативной протеазой.
В некоторых вариантах реализации НА, ΝΑ, Р, С, Ε, др120, др41 или белок матрикса представляет собой полноразмерный белок, его фрагмент, вариант, производное или аналог. В некоторых вариантах реализации НА, ΝΑ, Р, С, Ε, др120, др41 или белок матрикса представляет собой полипептид, содержащий последовательность аминокислот, или полинуклеотид, кодирующий полипептид, содержащий последовательность аминокислот по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99 или на 100% идентичную известной последовательности соответствующих вирусных белков, при этом указанный полипептид способен узнаваться антителом, которое специфично связывается с известной последовательностью. Последовательность НА, например, может представлять собой полноразмерный белок НА, который состоит, по существу, из внеклеточного (ЕСН) домена, трансмембранного (ТМ) домена и цитоплазматического (СУТ) домена; или фрагмент целого белка НА, который состоит, по существу, из полипептида НА1 и полипептида НА2, например, полученный в результате расщепления полноразмерного НА; или фрагмент целого белка НА, который состоит, по существу, из полипептида НА1, полипептида НА2 и домена ТМ; или фрагмент целого белка НА, который состоит, по существу, из домена СУТ; или фрагмент целого белка НА, который состоит, по существу, из домена ТМ; или фрагмент целого белка НА, который состоит, по существу, из полипептида НА1; или фрагмент целого белка НА, который состоит, по существу, из полипептида НА2. Последовательность НА также может включать сайт расщепления НА1/НА2. Сайт расщепления НА1/НА2 может располагаться между полипептидами НА1 и НА2, но также может располагаться в любом порядке относительно других последовательностей полинуклеотидной или полипептидной конструкции. Вирусные белки можно получить из патогенного штамма вируса.
В некоторых вариантах реализации гетерологичный полипептид согласно настоящему изобретению представляет собой гибридный полипептид, включающий полноразмерный НА, ΝΧ Р, С, Ε, др120, др41 или белок матрикса, или его фрагмент, вариант, производное или аналог.
В некоторых вариантах реализации гетерологичный полипептид представляет собой гибридный полипептид, включающий полипептид НА0, полипептид НА1, полипептид НА2, домен ТМ, их фрагменты и комбинации. В некоторых вариантах реализации гетерологичный полипептид включает комбинации двух или более из полипептида НА1, полипептида НА2, домена ТМ или их фрагментов из различных подтипов или различных штаммов вируса, например, из различных подтипов или штаммов вируса гриппа. В некоторых вариантах реализации гетерологичный полипептид включает комбинации двух или более из полипептида НА1, полипептида НА2, домена ТМ или их фрагментов из различных вирусов, например, из вируса гриппа и вируса кори.
Гемагглютинирующую активность можно определить путем измерения агглютинации эритроцитов. Гемагглютинация и последующая преципитация эритроцитов происходит в результате адсорбции гемагглютининов на поверхности эритроцитов. В процессе гемагглютинации образуются кластеры эритроцитов, различимые невооруженным глазом как скопления, комки и/или сгустки. Гемагглютинация вызывается взаимодействием агглютиногенов, присутствующих в эритроцитах, с плазмой, которая содержит агглютинины. Каждому агглютиногену соответствует определенный агглютинин. Реакцию гемагглютинации используют, например, для определения активности антисыворотки или типа вируса. Различают активную гемагтлютинацию, которая вызывается непосредственным действием агента на красные кровяные клетки, и пассивную гемагглютинацию, вызванную антисывороткой, специфичной к антигену, ранее адсорбированному на эритроцитах. Величину гемагглютинирующей активности в образце можно измерить, например, в единицах гемагглютинирующей активности (ГАЕ). Гемагглютинация может быть вызвана, например, полисахаридами бактерий, вызывающих туберкулез, чуму и туляремию, полисахаридами кишечной палочки и вирусами гриппа, свинки, пневмонии белой мыши, гриппом свиней и лошадей, противооспенной вакциной, желтой лихорадкой и другими вызывающими гемагглютинацию заболеваниями.
Внеклеточные микроводорослевые тельца.
Настоящее изобретение также относится к внеклеточному тельцу микроводоросли, при этом внеклеточное тельце не соединено с плазматической мембраной. Под формулировкой не соединено с плазматической мембраной понимают, что внеклеточное микроводорослевое тельце не присоединено к плазматической мембране клетки-хозяина. В некоторых вариантах реализации внеклеточное тельце представляет собой мембрану. В некоторых вариантах реализации внеклеточное тельце представляет собой везикулу, мицеллу, фрагмент мембраны, агрегат мембран или их смесь. Термин везикула в данном описании относится к замкнутой структуре, содержащей липидный бислой (элементарной мембране), например к пузырьковой структуре, образованной клеточной мембраной. Термин агрегат мембран в данном описании относится к любому скоплению мембранных структур, которые соединились в единую массу. Агрегат мембран может представлять собой скопление одного типа мембранных структур,
- 19 022841 таких как, но не ограничиваясь перечисленными, скопление мембранных везикул, или может представлять собой скопление более чем одного типа мембранных структур, таких как, но не ограничиваясь перечисленными, скопление по меньшей мере двух из везикулы, мицеллы или фрагмента мембраны. Термин фрагмент мембраны в данном описании относится к любой части мембраны, способной включать гетерологичный полипептид, описанный в данном документе. В некоторых вариантах реализации фрагмент мембраны представляет собой мембранный слой. В некоторых вариантах реализации внеклеточное тельце представляет собой смесь везикулы и фрагмента мембраны. В некоторых вариантах реализации внеклеточное тельце представляет собой везикулу. В некоторых вариантах реализации везикула представляет собой схлопнувшуюся везикулу. В некоторых вариантах реализации везикула представляет собой подобную вирусу частицу. В некоторых вариантах реализации внеклеточное тельце представляет собой агрегат биологических материалов, содержащий нативные и гетерологичные полипептиды, продуцированные клеткой-хозяином. В некоторых вариантах реализации внеклеточное тельце представляет собой агрегат нативных и гетерологичных полипептидов. В некоторых вариантах реализации внеклеточное тельце представляет собой агрегат гетерологичных полипептидов.
В некоторых вариантах реализации эктоплазматическая сеть микроводорослевой клетки-хозяина фрагментируется в процессе культивирования микроводорослевой клетки-хозяина, что приводит к образованию внеклеточного микроводорослевого тельца. В некоторых вариантах реализации внеклеточное микроводорослевое тельце образуется путем фрагментации эктоплазматической сети микроводорослевой клетки-хозяина в результате действия гидродинамических сил в перемешиваемых средах, которые физически срезают мембранные удлинения эктоплазматической сети.
В некоторых вариантах реализации внеклеточное микроводорослевое тельце образуется при выпячивании мембраны микроводоросли, например, но не ограничиваясь перечисленными, при выпячивании плазматической мембраны, эктоплазматической сети, псевдоризоида или их комбинации, при этом выпяченная мембрана отделяется от плазматической мембраны.
В некоторых вариантах реализации внеклеточные микроводорослевые тельца представляют собой везикулы или мицеллы, обладающие различными диаметрами, фрагменты мембран, обладающие различными длинами, или их комбинацию.
В некоторых вариантах реализации внеклеточное тельце представляет собой везикулу, обладающую диаметром 10-2500 нм, 10-2000 нм, 10-1500 нм, 10-1000 нм, 10-500 нм, 10-300 нм, 10-200 нм, 10-100 нм, 10-50 нм, 20-2500 нм, 20-2000 нм, 20-1500 нм, 20-1000 нм, 20-500 нм, 20-300 нм, 20-200 нм, 20-100 нм, 50-2500 нм, 50-2000 нм, 50-1500 нм, 50-1000 нм, 50-500 нм, 50-300 нм, 50-200 нм, 50-100 нм, 100-2500 нм, 100-2000 нм, 100-1500 нм, 100-1000 нм, 100-500 нм, 100-300 нм, 100-200 нм, 500-2500 нм, 500-2000 нм, 500-1500 нм, 500-1000 нм, 2000 нм или менее, 1500 нм или менее, 1000 нм или менее, 500 нм или менее, 400 нм или менее, 300 нм или менее, 200 нм или менее, 100 нм или менее или 50 нм или менее.
Неограничивающие условия ферментации для получения внеклеточных микроводорослевых телец из траустохитридовых клеток-хозяев представлены в таблице.
- 20 022841
Среды
Ингредиент Концентрация Диапазоны
Ν328Ο4 г/л 13,62 0 - 50, 15-45 или 25-35
К28О4 г/л 0,72 0 - 25, 0,1 - 10 или 0,5 - 5
КС1 г/л 0,56 0-5,0,25 - 3 или 0,5 - 2
М§8О4'7Н2О г/л 2,27 0 -10, 1 - 8 или 2-6
(ΝΗ4)28Ο4 г/л 17,5 0 - 50, 0,25 - 30 или 5 - 20
СаС12-2Н2О г/л 0,19 0,1-5,0,1-3 или 0,15-1
КН2РО4 г/л 6,0 0-20, 0,1 - 10 или 1 - 7
После автоклавирования (металлы )
Лимонная кислота мг/л 3,50 0,1 - 5000, 1 - 3000 или 3 - 2500
Ре8О4'7Н2О мг/л 51,5 0,1 - 1000, 1 -500 или 5-100
МпС12'4Н2О мг/л 3,10 0,1 - 100, 1 -50 или 2-25
Ζη8Ο4·7Η2Ο мг/л 6,20 0,1 - 100, 1 - 50 или 2-25
СоС12-6Н2О мг/л 0,04 0-1,0,001-0,1 или 0,01-0,1
Иа2МоО4'2Н2О мг/л 0,04 0,001 - 1,0,005 - 0,5 или 0,01 - 0,1
Си8О45Н2О мг/л 2,07 0,1 - 100, 0,5 - 50 или 1 -25
Νϊ8Ο4·6Η2Ο мг/л 2,07 0,1 - 100,0,5-50 или 1 -25
После автоклавирования (витамины)
Тиамин** мг/л 9,75 0,1 - 100, 1 -50 или 5-25
Витамин В12** мг/л 0,16 0,01 - 100, 0,05 -5 или 0,1 - 1,0
Са'Л - пантотенат* * мг/л 3,33 0,1 - 100,0,1 -50 или 1 -10
** стерилизовали посредством фильтрации и добавили после автоклавирования
После автоклавирования (углерод)
Глюкоза г/л 20,0
Азотистое питание:
Ингредиент Концентрация
ΝΗ4ΟΗ мл/л 23,6
- 150, 10 - 100 или 20 - 50
5- 150, 10- 100,15-50
Обычные условия культивирования для получения внеклеточных микроводорослевых телец описаны далее:
рН : 5,5 - 9,5, 6,5 - 8,0 или 6,3 - 7,3 температура: 15 ’С - 45 ’С, 18 °С-35 ’С или 20 ’С - 30 С растворенный кислород: 0,1% - 100% насыщение, 5% - 50% насыщение или 10% 30% насыщение контролируемый уровень глюкозы: 5 г/л -100 г/л, 10 г/л - 40 г/л или 15 г/л - 35 г/л.
В некоторых вариантах реализации внеклеточное микроводорослевое тельце получают в клеткехозяине ЬаЪутт1Ьи1отусо1а. В некоторых вариантах реализации внеклеточное микроводорослевое тельце получают в клетке-хозяине ЬаЪутт1Ъи1ае. В некоторых вариантах реализации внеклеточное микроводо- 21 022841 рослевое тельце получают в траустохитридной клетке-хозяине. В некоторых вариантах реализации внеклеточное микроводорослевое тельце получают в δсЪ^ζοсЪуΐ^^ит или ТЪгаи8ЮсЪу1гшт.
Настоящее изобретение также направлено на внеклеточное микроводорослевое тельце, содержащее гетерологичный полипептид, при этом внеклеточное тельце не соединено с плазматической мембраной микроводорослевой клетки-хозяина.
В некоторых вариантах реализации внеклеточное микроводорослевое тельце согласно настоящему изобретению содержит полипептид, который также связан с плазматической мембраной микроводорослевой клетки-хозяина. В некоторых вариантах реализации полипептид, связанный с плазматической мембраной микроводорослевой клетки-хозяина, включает нативный мембранный полипептид, гетерологичный полипептид и их комбинацию.
В некоторых вариантах реализации гетерологичный полипептид содержится внутри внеклеточного микроводорослевого тельца.
В некоторых вариантах реализации гетерологичный полипептид содержит мембранный домен. Термин мембранный домен в данном описании относится к любому домену внутри полипептида, который нацеливает полипептид на заякоревание в мембране и/или позволяет полипептиду поддерживать связь с мембраной, и включает, но не ограничен перечисленными, трансмембранный домен (например, участок, один или множество раз пронизывающий мембрану), интегральный монотопный домен, сигнальную якорную последовательность, сигнальную последовательность доставки в ЭР, Ν-концевой, или внутренний, или С-концевой сигнал остановки процесса переноса, гликозилфосфатидилинозитоловый якорь и комбинации перечисленных. Мембранный домен может быть расположен в любом положении в полипептиде, включая Ν-конец, С-конец или середину полипептида. Мембранный домен может обеспечивать постоянное или временное присоединение полипептида к мембране. В некоторых вариантах реализации мембранный домен можно отщепить от мембранного белка. В некоторых вариантах реализации мембранный домен представляет собой сигнальную якорную последовательность. В некоторых вариантах реализации мембранный домен представляет собой любую из сигнальных якорных последовательностей, показанных на фиг. 13, или якорную последовательность, полученную из них. В некоторых вариантах реализации мембранный домен представляет собой вирусную сигнальную якорную последовательность.
В некоторых вариантах реализации гетерологичный полипептид представляет собой полипептид, который по природе содержит мембранный домен. В некоторых вариантах реализации гетерологичный полипептид по природе не содержит мембранный домен, но был рекомбинантно слит с мембранным доменом. В некоторых вариантах реализации гетерологичный полипептид представляет собой в противном случае растворимый белок, который был слит с мембранным доменом.
В некоторых вариантах реализации мембранный домен представляет собой мембранный домен микроводорослей. В некоторых вариантах реализации мембранный домен представляет собой мембранный домен ^аЬу^^ηίЪи1οтусοΐа. В некоторых вариантах реализации мембранный домен представляет собой мембранный домен траустохитрид. В некоторых вариантах реализации мембранный домен представляет собой мембранный домен δΟιίζοΟινΙπιιιη или ТЪгаи8ЮсЪу(гшт. В некоторых вариантах реализации мембранный домен включает сигнальную якорную последовательность из альфа-1,3-маннозил-бета1,2-01сЫас-трансфераза-1-подобного белка 1 δсЪ^ζοсЪуΐ^^ит (δΕΟ ΙΌ N0: 78), бета-1,2-ксилозилтрансфераза-подобного белка 1 δсЪ^ζοсЪуί^^ит (δΕΟ ΙΌ N0: 80), бета-1,4-ксилозидазаподобного белка δсЪ^ζοсЪуΐ^^ит (δΕΟ ΙΌ N0: 82) или галактозилтрансфераза-подобного белка 5 δсЪ^ζοсЪуί^^ит (δΕΟ ΙΌ N0: 84).
В некоторых вариантах реализации гетерологичный полипептид представляет собой мембранный белок. Термин мембранный белок в данном описании относится к любому белку, присоединенному или связанному с клеточной мембраной. У С’1юи и Е1гой, Ргсйепъ: δίΓίκΟιίΌ, Рипс(юп апй Оепейс8, 34:137153 (1999), описано, например, что мембранные белки можно классифицировать на различные основные типы.
1) Мембранные белки Ι типа: данные белки содержат один трансмембранный домен в зрелом белке. Ν-конец внеклеточный, а С-конец - цитоплазматический. Ν-конец таких белков обычно содержит классическую последовательность сигнального пептида, которая направляет белок на импорт в ЭР. Указанные белки подразделяются на тип 1а (содержащий отщепляемую сигнальную последовательность) и тип 1Ь (без отщепляемой сигнальной последовательности). Примеры мембранных белков I типа включают, но не ограничены перечисленными, НА вируса гриппа, рецептор инсулина, гликофорин, рецептор ЛННП и вирусные 0-белки.
2) Мембранные белки ΙΙ типа: у данных белков, содержащих один трансмембранный домен, С-конец внеклеточный, а Ν-конец - цитоплазматический. На Ν-конце может находиться сигнальная якорная последовательность. Примеры белков этого типа включают, но не ограничены перечисленными, нейраминидазу вируса гриппа, галактозилтрансферазу аппарата Гольджи, сиалилтрансферазу аппарата Гольджи, предшественник сахаразы-изомальтазы, асиалогликопротеиновый рецептор и рецептор трансферрина.
3) Белки, множество раз пронизывающие мембрану: в мембранных белках Ι и ΙΙ типа полипептид
- 22 022841 пересекает липидный бислой один раз, тогда как в белках, множество раз пронизывающих мембрану, полипептид пересекает мембрану множество раз. Трансмембранные белки, множество раз пронизывающие мембрану, также подразделяются на типы 111а и ШЬ. Белки типа 111а содержат отщепляемые сигнальные последовательности. Аминоконцы белков типа 111Ь выходят на внешнюю поверхность мембраны, но не содержат отщепляемой сигнальной последовательности. Белки типа 111а включают, но не ограничены перечисленными, пептиды М и Ь фотореакционного центра. Белки типа 111Ь включают, но не ограничены перечисленными, цитохром Р450 и лидерную пептидазу Е.соН. Дополнительные примеры трансмембранных белков, множество раз пронизывающих мембрану, представляют собой мембранные транспортеры, такие как транспортеры сахаров (глюкозы, ксилозы) и ионные транспортеры.
4) Мембранные белки, заякоренные с помощью липидной цепи: данные белки связаны с мембранным бислоем посредством одной или более ковалентно присоединенных цепей жирных кислот или других типов липидных цепей, называемых пренильными группами.
5) ГФИ-заякоренные мембранные белки: данные белки связаны с мембраной посредством гликозилфосфатидилинозитолового якоря (ГФИ).
6) Периферические мембранные белки: данные белки связаны с мембраной не напрямую, путем нековалентных взаимодействий с другими мембранными белками.
В некоторых вариантах реализации мембранный домен представляет собой мембранный домен белка НА.
В некоторых вариантах реализации гетерологичный полипептид содержит нативную сигнальную якорную последовательность или нативный мембранный домен из полипептида дикого типа, соответствующего гетерологичному полипептиду. В некоторых вариантах реализации гетерологичный полипептид слит с гетерологичной сигнальной якорной последовательностью или гетерологичным мембранным доменом, которые отличны от нативной сигнальной якорной последовательности или нативного мембранного домена. В некоторых вариантах реализации гетерологичный полипептид содержит гетерологичную сигнальную якорную последовательность или гетерологичный мембранный домен, тогда как полипептид дикого типа, соответствующий указанному гетерологичному полипептиду, не содержит какой-либо сигнальной якорной последовательности или мембранного домена. В некоторых вариантах реализации гетерологичный полипептид содержит сигнальную якорную последовательность 8с1и/осНу1пи1п. В некоторых вариантах реализации гетерологичный полипептид содержит мембранный домен НА. В некоторых вариантах реализации гетерологичный полипептид представляет собой терапевтический полипептид.
В некоторых вариантах реализации мембранный домен представляет собой мембранный домен из любого из мембранных белков I типа, показанных на фиг. 14, или мембранный домен, полученный из него. В некоторых вариантах реализации гетерологичный полипептид согласно настоящему изобретению представляет собой гибридный полипептид, содержащий пронизывающий мембрану участок на С-конце из любого из мембранных белков, показанных на фиг. 14. В некоторых вариантах реализации С-концевая сторона пронизывающего мембрану участка дополнительно модифицирована путем замены на аналогичный участок из вирусного белка.
В некоторых вариантах реализации гетерологичный полипептид представляет собой гликопротеин. В некоторых вариантах реализации гетерологичный полипептид обладает паттерном гликозилирования, характерным для экспрессии в клетке БаЬуг1п1Ни1отусо1а. В некоторых вариантах реализации гетерологичный полипептид обладает паттерном гликозилирования, характерным для экспрессии в клетке траустохитрид. В некоторых вариантах реализации гетерологичный полипептид, который экспрессируется в микроводорослевой клетке-хозяине, представляет собой гликопротеин, обладающий паттерном гликозилирования, который более близко напоминает паттерны гликозилирования у млекопитающего, чем паттерны у белков, полученных в дрожжах или Е.соН. В некоторых вариантах реализации паттерн гликозилирования включает паттерн N-связанного гликозилирования. В некоторых вариантах реализации гликопротеин включает олигосахариды с высоким содержанием маннозы. В некоторых вариантах реализации гликопротеин, по существу свободен от сиаловой кислоты. Термин по существу свободен от сиаловой кислоты в данном описании означает содержание сиаловой кислоты менее чем 10%, менее чем 9%, менее чем 8%, менее чем 7%, менее чем 6%, менее чем 5%, менее чем 4%, менее чем 3%, менее чем 2% или менее чем 1%. В некоторых вариантах реализации сиаловая кислота отсутствует в гликопротеине.
В некоторых вариантах реализации внеклеточное микроводорослевое тельце согласно настоящему изобретению, содержащее гетерологичный полипептид, получают в коммерческом или промышленном масштабе.
Настоящее изобретение также относится к композиции, содержащей любое из внеклеточных микроводорослевых телец согласно настоящему изобретению, описанных в данном документе, и водный жидкий носитель.
В некоторых вариантах реализации внеклеточное микроводорослевое тельце согласно настоящему изобретению, содержащее гетерологичный полипептид, выделяют из культуральной среды или ферментационной среды, в которой выращивали микроводорослевую клетку-хозяина. В некоторых вариантах реализации внеклеточное микроводорослевое тельце согласно настоящему изобретению можно выделить
- 23 022841 по существу чистом в виде. В данном описании по существу чистый относится к чистоте, которая позволяет эффективное применение внеклеточного микроводорослевого тельца в качестве коммерческого или промышленного продукта.
Настоящее изобретение также относится к способу получения внеклеточного микроводорослевого тельца, содержащего гетерологичный полипептид, указанный способ включает:
(a) экспрессию гетерологичного полипептида в микроводорослевой клетке-хозяине, при этом указанный гетерологичный полипептид содержит мембранный домен; и (b) культивирование клетки-хозяина в условиях культивирования, обеспечивающих образование внеклеточного микроводорослевого тельца, содержащего гетерологичный полипептид, при этом внеклеточное тельце не соединено с плазматической мембраной клетки-хозяина.
Настоящее изобретение также относится к способу получения композиции, содержащей внеклеточное микроводорослевое тельце и гетерологичный полипептид, указанный способ включает:
(a) экспрессирование гетерологичного полипептида в микроводорослевой клетке-хозяине, при этом указанный гетерологичный полипептид содержит мембранный домен; и (b) культивирование клетки-хозяина в условиях культивирования, обеспечивающих образование внеклеточного микроводорослевого тельца, содержащего гетерологичный полипептид, при этом внеклеточное тельце не соединено с плазматической мембраной клетки-хозяина, и при этом указанную композицию получают в виде культурального супернатанта, содержащего внеклеточное тельце.
В некоторых вариантах реализации указанный способ дополнительно включает удаление культурального супернатанта и ресуспендирование внеклеточного тельца в водном жидком носителе. В некоторых вариантах реализации композицию применяют в качестве вакцины.
Внеклеточные микроводорослевые тельца, содержащие вирусные полипептиды.
Белки оболочки вируса представляют собой мембранные белки, которые формируют наружный слой вирусных частиц. При синтезе данных белков используют мембранные домены, такие как клеточные нацеливающие сигналы, чтобы направить белки на плазматическую мембрану. Белки оболочки подразделяются на несколько основных групп, которые включают, но не ограничены перечисленными, белки Н или НА (гемагглютинин), белки N или NΑ (нейраминидазу), Р (гибридные белки), С (гликопротеин), белок Е или еиу (белок оболочки), др120 (гликопротеин размером 120 кДа) и др41 (гликопротеин размером 41 кДа). Структурные белки, которые обычно называют белками матрикса, служат для стабилизации вируса. Белки матрикса включают, но не ограничены перечисленными, М1, М2 (мембранный белок канала) и Сад. Как белки оболочки, так и белки матрикса могут участвовать в сборке и функционировании вируса. Например, экспрессия белков оболочки вируса отдельно или в сочетании с вирусными белками матрикса может привести к образованию вирусоподобных частиц (ВПЧ).
Вирусные вакцины часто получают из инактивированных или аттенуированных препаратов вирусных культур в соответствии с заболеванием, которое они должны предотвращать, и, как правило, в них сохраняется вирусный материал, такой как вирусный генетический материал. Как правило, вирус культивируют в том же типе клеток, который вирус может заразить в природе, или в близком типе клеток. Такая культура клеток дорого стоит и часто ее сложно получать в промышленном масштабе. Для решения данной проблемы некоторые определенные вирусные антигены, вместо этого, экспрессируют в трансгенном хозяине, которого может быть дешевле культивировать и легче получать в промышленном масштабе. Тем не менее, вирусные белки обычно представляют собой интегральные мембранные белки, присутствующие в вирусной оболочке. Так как мембранные белки очень трудно получать в больших количествах, данные вирусные белки, как правило, модифицируют, чтобы получить растворимую форму белков. Данные белки оболочки вируса важны для формирования иммунитета у хозяина, но многие попытки экспрессировать их целиком или частично в гетерологичных системах имели ограниченный успех, предположительно потому, что белок должен быть презентирован иммунной системе в составе вирусной оболочки, чтобы быть достаточно иммуногенным. Таким образом, существует потребность в новых системах гетерологичной экспрессии, таких как системы экспрессии согласно настоящему изобретению, которые можно применять в промышленном масштабе и которые способны презентировать вирусные антигены, свободные или по существу свободные от связанного вирусного материала, такого как вирусный генетический материал, отличного от желательных вирусных антигенов. Термин по существу свободный от связанного вирусного материала в данном описании означает количество связанного вирусного материала менее чем 10%, менее чем 9%, менее чем 8%, менее чем 7%, менее чем 5%, менее чем 4%, менее чем 3%, менее чем 2% или менее чем 1%.
В некоторых вариантах реализации внеклеточное микроводорослевое тельце включает гетерологичный полипептид, который представляет собой вирусный гликопротеин, выбранный из группы, состоящей из белка Н или НА (гемагглютинина), белка N или NА (нейраминидазы), гибридного белка (Р), С (гликопротеина), белка Е или еиу (белка оболочки), др120 (гликопротеина размером 120 кДа) и др41 (гликопротеина размером 41 кДа) и комбинации перечисленных белков. В некоторых вариантах реализации внеклеточное микроводорослевое тельце содержит гетерологичный полипептид, который представляет собой вирусный белок матрикса. В некоторых вариантах реализации внеклеточное микроводорослевое тельце содержит вирусный белок матрикса, выбранный из группы, состоящей из М1, М2 (мембран- 24 022841 ного белка канала) Сад и комбинации перечисленных. В некоторых вариантах реализации внеклеточное микроводорослевое тельце содержит комбинацию двух или более вирусных белков, выбранных из группы, состоящей из белка Н или ΗА (гемагглютинина), белка Ν или NА (нейраминидазы), гибридного белка (Р), С (гликопротеина), белка Е или еиу (белка оболочки), др120 (гликопротеина размером 120 кДа) и др41 (гликопротеина размером 41 кДа) и вирусного белка матрикса.
В некоторых вариантах реализации внеклеточные микроводорослевые тельца согласно настоящему изобретению содержат вирусные гликопротеины, в которых отсутствует сиаловая кислота, которая, в противном случае, препятствовала бы накоплению или функционированию белка.
В некоторых вариантах реализации внеклеточное микроводорослевое тельце представляет собой
ВПЧ.
Термин ВПЧ в данном описании относится к частицам, которые морфологически сходны с инфекционным вирусом, и которые могут образовываться путем спонтанной самосборки вирусных белков, когда вирусные белки экспрессируются в избыточном количестве. ВПЧ были получены в клетках дрожжей, насекомых и млекопитающих и оказались эффективным и более безопасным типом субъединичной вакцины, так как они имитируют полную структуру вирусных частиц, но при этом не содержат инфекционный генетический материал. Данный тип системы доставки вакцины эффективно стимулировал клеточные и гуморальные ответы.
Исследования на парамиксовирусах показали, что полученные при совместном экспрессировании вирусных белков ВПЧ были очень похожи по размеру и плотности на настоящие вирионы. Экспрессия белка матрикса (М) отдельно была необходима и достаточна для образования ВПЧ. Для парамиксовируса экспрессия ΗΝ отдельно приводила к очень низкой эффективности образования ВПЧ. Других белков отдельно было недостаточно для отпочковывания вируса ньюкаслской болезни (ВНБ). ΗΝ представляет собой мембранный гликопротеин II типа, который присутствует на вирионе и поверхностях инфицированных клеток в виде тетрамерного выступа. См., например, Со11ш8 Р.Ь. и Мойе! С., I. Уио1. 65:23622371 (1991); МГОа А.М. е! а1., I. Вю1. С1ет. 268:21425-21431 (1993) и Ид Ч. е! а1., I. Се11. Вю. 109:32733289 (1989). Взаимодействия с М-белком отвечали за включение белков ΗΝ и ΝΈ в ВПЧ. См., например, Раи!иа е! а1., I. Уйо1оду, 50:11062-11073 (2006).
ВПЧ вируса гепатита В (ИВУ) или вируса папилломы человека (ИРУ) представляют собой простые ВПЧ, которые не имеют оболочки и которые продуцируются в результате экспрессии одного или двух капсидных белков. Более сложные ВПЧ, которые не имеют оболочки, включают такие частицы, как ВПЧ, разработанные для африканской катаральной лихорадки. В данном случае, четыре из основных структурных белков вируса африканской катаральной лихорадки (ВТУ, семейство Кеоутбае) экспрессировали одновременно в клетках насекомых. Также были получены ВПЧ из вирусов с липидными оболочками (например, вируса гепатита С и гриппа А). Также существуют ВПЧ-подобные структуры, такие как самособирающиеся полипептидные наночастицы (8АР^, которые могут повторно представлять антигенные эпитопы. Их использовали для разработки потенциальной вакцины против малярии. См., например, КаЬа 8.А. е! а1., I. ^тииоР 183 (11):7268-7277 (2009).
ВПЧ обладают существенными преимуществами, состоящими в том, что они способны вызывать иммунитет, сравнимый с живыми аттенуированными или инактивированными вирусами, кроме того, их считают высокоиммуногенными благодаря тому, что они имеют форму частиц, и тому, что они презентируют поверхностные эпитопы плотно повторяющимся массивом. Например, предполагают, что В-клетки специфично распознают антигены в форме частиц с расстояниями между эпитопами от 50 до 100 А как чужеродные. См. ВасЬтаи е! а1., 8^1^, 262:1448 (1993). ВПЧ также обладают размером частиц, который считают значительно способствующим их поглощению дендритными клетками и макрофагами. Вдобавок, частицы от 20 до 200 нм свободно диффундируют в лимфатические узлы, тогда как частицы от 500 до 2000 нм не могут туда проникнуть. Существует по меньшей мере две одобренные для применения людьми вакцины ВПЧ: вакцина против вируса гепатита В (ЯВУ) и вакцина против вируса папилломы человека (КРУ). Тем не менее, ВПЧ на основе вируса, такие как ВПЧ на основе бакуловируса, часто содержат большие количества вирусного материала, что требует дополнительной очистки ВПЧ.
В некоторых вариантах реализации внеклеточное микроводорослевое тельце представляет собой ВПЧ, содержащую вирусный гликопротеин, выбранный из группы, состоящей из белка Н или ΗА (гемагглютинина), белка Ν или NА (нейраминидазы), гибридного белка (гибридного белка), С-белка (гликопротеина), белка Е или еиу (белка оболочки), др120 (гликопротеина размером 120 кДа) и др41 (гликопротеина размером 41 кДа) и комбинации перечисленных белков. В некоторых вариантах реализации внеклеточное микроводорослевое тельце представляет собой ВПЧ, содержащую вирусный белок матрикса. В некоторых вариантах реализации внеклеточное микроводорослевое тельце представляет собой ВПЧ, содержащую вирусный белок матрикса, выбранный из группы, состоящей из М1, М2 (мембранного белка канала), Сад и комбинации перечисленных белков. В некоторых вариантах реализации внеклеточное микроводорослевое тельце представляет собой ВПЧ, содержащую комбинацию двух или более вирусных белков, выбранных из группы, состоящей из белка Н или ΗА (гемагглютинина), белка Ν или NА (нейраминидазы), гибридного белка (Р), С (гликопротеина), белка Е или еиу (белка оболочки), др120 (гликопротеина размером 120 кДа) и др41 (гликопротеина размером 41 кДа) и вирусного белка матрикса.
- 25 022841
Способы применения внеклеточных микроводорослевых телец.
В некоторых вариантах реализации внеклеточное микроводорослевое тельце согласно настоящему изобретению можно применять в качестве носителя для белковой активности или функции. В некоторых вариантах реализации белковая активность или функция связана с гетерологичным полипептидом, присутствующим внутри или на поверхности внеклеточного тельца. В некоторых вариантах реализации гетерологичный полипептид представляет собой мембранный белок. В некоторых вариантах реализации белковая активность или функция связана с полипептидом, который связывается с мембранным белком, присутствующим во внеклеточном тельце. В некоторых вариантах реализации белок не способен функционировать в растворимой форме, но способен функционировать, являясь частью внеклеточного тельца согласно настоящему изобретению. В некоторых вариантах реализации внеклеточное микроводорослевое тельце, содержащее транспортер сахара (такой как, например, транспортер ксилозы, сахарозы или глюкозы), можно применять для очистки от следовых количеств сахара сред, содержащих смеси сахаров или других низкомолекулярных растворенных веществ, путем захвата сахара внутрь везикул, которые затем можно отделить с помощью различных способов, включая фильтрацию или центрифугирование.
Настоящее изобретение также включает применение любого из внеклеточных микроводорослевых телец согласно настоящему изобретению, содержащих гетерологичный полипептид, и композиций с ними, в терапии животных или людей, от предупредительной терапии до лечения заболеваний.
Термины лечить и лечение относятся как к терапевтическому лечению, так и к профилактическим или предупредительным мерам, при этом задачей является предупреждение или замедление (уменьшение) нежелательного физиологического состояния, заболевания или нарушения, или получение полезных или желательных клинических результатов. Для целей настоящего изобретения полезные или желательные клинические результаты включают, но не ограничены перечисленными, облегчение или устранение симптомов или признаков, связанных с состоянием, заболеванием или нарушением; уменьшение степени развития состояния, заболевания или нарушения; стабилизирование состояния, заболевания или нарушения (т.е. когда состояние, заболевание или расстройство не ухудшается); задержку начала или прогрессирования состояния, заболевания или нарушения; снижение выраженности состояния, заболевания или нарушения; ремиссию (либо частичную, либо полную, и либо детектируемую, либо недетектируемую) состояния, заболевания или нарушения; или коррекцию или улучшение состояния, заболевания или нарушения. Лечение включает получение клинически значимого ответа без возникновения избыточных побочных эффектов. Лечение также включает продление времени выживания по сравнению с ожидаемым при отсутствии лечения.
В некоторых вариантах реализации любое из внеклеточных микроводорослевых телец согласно настоящему изобретению, содержащих гетерологичный полипептид, получают в культуральном супернатанте для непосредственного применения в качестве вакцины для животного или человека.
В некоторых вариантах реализации внеклеточное микроводорослевое тельце, содержащее гетерологичный полипептид, очищают согласно требованиям целевого способа применения, например введения в качестве вакцины. Для применения в качестве обычной вакцины у человека супернатант, полученный путем низкоскоростного центрифугирования, подвергнут первичной очистке путем концентрирования (например, с помощью тангенциальной поточной фильтрации, а затем ультрафильтрации), хроматографического разделения (например, с помощью анионообменной хроматографии), гель-фильтрации и стерилизации (например, путем фильтрации через стерильный 0,2 мкм фильтр). В некоторых вариантах реализации в вакцине согласно настоящему изобретению отсутствуют потенциально аллергенные белки, такие как, например, яичный белок. В некоторых вариантах реализации в вакцине, содержащей внеклеточное тельце согласно настоящему изобретению, отсутствует любой вирусный материал, отличный от вирусного полипептида, связанного с внеклеточным тельцем.
Согласно описанным способам внеклеточное микроводорослевое тельце, содержащее гетерологичный полипептид, или композицию, содержащую тельце, можно вводить, например, внутримышечным (в/м), внутривенным (в/в), подкожным (п/к) или внутрилегочным путями. Другие подходящие пути введения включают, но не ограничены перечисленными, введение внутритрахеальным, трансдермальным, внутриглазным, интраназальным, ингаляционным, внутриполостным, внутрипротоковым (например, в поджелудочную железу) и интрапаренхиматозным (например, в любую ткань) путем. Трансдермальная доставка включает, но не ограничена внутрикожным (например, в дерму или эпидерму), трансдермальным (например, чрескожным) и чресслизистым (например, в или через кожу или слизистую ткань) введением. Внутриполостное введение включает, но не ограничено введением в ротовую, вагинальную, ректальную, назальную, перитонеальную и кишечную полости, а также, интратекальным (например, в позвоночный канал), интравентрикулярным (например, в желудочки мозга или в желудочки сердца), внутрипредсердным (например, в предсердие) и субарахноидальным (например, в субарахноидальное пространство мозга) введением.
В некоторых вариантах реализации настоящее изобретение включает композиции, содержащие внеклеточное микроводорослевое тельце, которое содержит гетерологичный полипептид. В некоторых вариантах реализации композиция содержит водный жидкий носитель. В дополнительных вариантах реализации водный жидкий носитель представляет собой культуральный супернатант. В некоторых ва- 26 022841 риантах реализации композиции согласно настоящему изобретению содержат обычные фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества, известные в данной области, такие как, но не ограничиваясь перечисленными, человечий сывороточный альбумин, ионообменники, оксид алюминия, лецитин, буферные вещества, такие как фосфаты, глицин, сорбиновая кислота, сорбат калия и соли или электролиты, такие как сульфат протамина, а также вспомогательные вещества, перечисленные, например, в РетищЮп: ТНе Заепсе апб Ргасйсе оГ Рйагтасу, 21-е изд. (2005).
Любой из вариантов реализации, описанных в данном документе, который направлен на внеклеточное микроводорослевое тельце, в качестве альтернативы может быть направлен на внеклеточное тельце хитриды.
Наиболее эффективный способ введения и схема приема лекарственного средства для композиций согласно настоящему изобретению зависит от тяжести и течения заболевания, состояния здоровья субъекта и его реакции на лечение, а также от мнения лечащего врача. Соответственно, дозировки композиций должны титроваться в зависимости от конкретного субъекта. Тем не менее, эффективная доза композиций согласно настоящему изобретению может находиться в диапазоне 1-2000 мг/кг, 1-1500 мг/кг, 1-1000 мг/кг, 1-500 мг/кг, 1-250 мг/кг, 1-100 мг/кг, 1-50 мг/кг, 1-25 мг/кг, 1-10 мг/кг, 500-2000 мг/кг, 500-1500 мг/кг, 500-1000 мг/кг, 100-2000 мг/кг, 100-1500 мг/кг, 100-1000 мг/кг или 100-500 мг/кг.
После прочтения описания настоящего изобретения в целом дополнительное понимание можно получить путем обращения к примерам, приведенным в данном описании. Данные примеры приведены исключительно для иллюстрирования и не предполагаются ограничивающими настоящее изобретение.
Пример 1. Конструирование вектора экспрессии рСЬ0143.
Синтезировали вектор экспрессии рСЬ0143 (фиг. 2) и последовательность проверили путем секвенирования по Сенгеру с помощью ΟΝΛ 2.0 (Менло Парк, Калифорния). Вектор рСЬ0143 содержал промотор из гена фактора элонгации-1 (ЕГ1) 3сН^ζοсНуΐ^^ит, чтобы направлять экспрессию трансгена НА, терминатор ОгГС (также известный как терминатор РГА3), следующий за трансгеном НА, и кассету с селекционным маркером, придающим устойчивость к антибиотику паромомицину.
ЗЕО ГО NО: 76 (фиг. 1) кодирует белок НА вируса гриппа А (А/Риейо Р|со/8/34/МоиШ Зша1 (Η1Ν1)). Белковая последовательность совпадает с последовательностью в ОепВапк под номером доступа ААМ75158. Определенную последовательность нуклеиновых кислот ЗЕО ГО NО: 76 подвергали оптимизации кодонов и синтезировали для экспрессии в ЗсИшосНуйшт с помощью ^NА 2.0, руководствуясь таблицей использования кодонов 3сН^ζοсНуΐ^^ит, показанной на фиг. 16. Также получали конструкт, используя альтернативный сигнальный пептид, при этом сигнальный пептид с последовательностью ЗЕО ГО NО: 76 (первый 51 нуклеотид) удаляли и заменяли на полинуклеотидную последовательность, кодирующую сигнальный пептид Зес1 ЗсИшосНуйшт (ЗЕО ГО NО: 38).
Пример 2. Экспрессия и исследование белка НА, продуцируемого в 3сН^ζοсНуΐ^^ит.
3сН^ζοсНуΐ^^ит 8р. АТСС 20888 использовали в качестве клетки-хозяина для трансформации вектором рСЬ0143 с помощью устройства для бомбардировки частицами В1оЙ8Йс™ (ВюКай, Геркулес, Калифорния). Вкратце, культуры ЗсИшосНуйшт 8р. АТСС 20888 выращивали в среде М2В, состоящей из 10 г/л глюкозы, 0,8 г/л (NΗ4)23О4, 5 г/л №2ЗО4, 2 г/л МдЗО4-7Н2О, 0,5 г/л КН2РО4, 0,5 г/л КС1, 0,1 г/л СаС12-2Н2О, 0,1 М МЕЗ (рН 6,0), 0,1% композиции металлов РВ26 Ме!а18 и 0,1% композиции витаминов РВ26 Уйатш8 (об./об.). Витамины РВ26 состояли из 50 мг/мл витамина В12, 100 мкг/мл тиамина и 100 мкг/мл Са-пантотената. рН металлов РВ26 подводили до 4,5, и металлы РВ26 состояли из 3 г/л РеЗО4-7Н2О, 1 г/л МпС12-4Н2О, 800 мг/мл 2пЗО4-7Н2О, 20 мг/мл СоС12-6Н2О, 10 мг/мл №2МоО4-2Н2О, 600 мг/мл СиЗО4-5Н2О и 800 мг/мл №ЗО4-6Н2О. Концентрированные растворы РВ26 отдельно стерилизовали путем фильтрации и добавляли в питательную среду после автоклавирования. Глюкозу, КН2РО4 и СаС12-2Н2О автоклавировали отдельно от остальных ингредиентов питательной среды перед смешиванием, чтобы предотвратить выпадение солей и карамелизацию углеводов. Все ингредиенты среды приобретали в Зщта СНетюа1 (Сент-Луис, Миссури). Культуры ЗсИшосНуйшт выращивали до логарифмической фазы и трансформировали с помощью устройства для бомбардировки частицами ВюЙ8Йс™ (ВюКай, Геркулес, Калифорния). Процедура трансформации ВюЙ8Йс™ была, по существу, такой же, как описано ранее (см. Ар! е! а1., 1. Се11. Зск 115 (РО 21):4061-9 (1996) и патент США № 7001772). Селекцию первичных трансформантов проводили на твердых средах М2В, содержащих 20 г/л агара (У^К, Западный Честер, Пенсильвания), 10 мкг/мл сульфометурон-метила (ЗММ) (СНет. Зегуюе, Западный Честер, Пенсильвания) после 2-6 дней инкубирования при 27°С.
Геномную ДНК из первичных трансформантов рСЬ0143 экстрагировали, очищали и использовали в качестве матрицы для ПЦР, чтобы проверить присутствие трансгена.
Протокол экстрагирования геномной ДНК ЗсИШосНуйшт. Трансформанты ЗсИшосНуйшт выращивали в 50 мл среды. 25 мл культуры в стерильных условиях переносили пипеткой в 50 мл коническую пробирку и центрифугировали в течение 4 мин при 3000д для получения осадка. Супернатант удаляли и осадок хранили при -80°С до использования. Осадок ресуспендировали приблизительно в 4-5 объемах раствора, состоящего из 20 мМ Тп8 рН 8, 10 мМ БЭТА, 50 мМ №С1, 0,5% ДСН и 100 мкг/мл протеиназы К в 50 мл конической пробирке. Осадок инкубировали при 50°С при плавном покачивании в течение 1 ч.
- 27 022841
После лизирования добавляли 100 мкг/мл РНКазы А и раствор оставляли на качалке в течение 10 мин при 37°С. Затем добавляли 2 объема смеси фенол:хлороформ:изоамиловый спирт и раствор оставляли на качалке при комнатной температуре в течение 1 ч, а затем центрифугировали при 8000д в течение 15 мин. Переносили супернатант в чистую пробирку. Снова добавляли 2 объема смеси фенол:хлороформ:изоамиловый спирт и раствор оставляли на качалке при комнатной температуре в течение 1 ч, а затем центрифугировали при 8000д в течение 15 мин и переносили супернатант в чистую пробирку. К полученному супернатанту добавляли равный объем хлороформа и раствор оставляли на качалке при комнатной температуре в течение 30 мин. Раствор центрифугировали при 8000д в течение 15 мин и переносили супернатант в чистую пробирку. К полученному супернатанту добавляли равный объем хлороформа и раствор оставляли на качалке при комнатной температуре в течение 30 мин. Раствор центрифугировали при 8000д в течение 15 мин и переносили супернатант в чистую пробирку. В супернатант добавляли 0,3 объема 3 М №ГОАс и 2 объема 100% ЕЮН, затем оставляли на качалке в течение нескольких минут. ДНК наматывали на стерильную стеклянную палочку и погружали в 70 % ЕЮН на 1-2 мин. ДНК переносили в микроцентрифужную пробирку объемом 1,7 мл и позволяли ей высохнуть на воздухе в течение 10 мин. В ДНК добавляли до 0,5 мл предварительно нагретого ЕВ и помещали ее на 4°С на ночь.
Замороженные маточные растворы трансгенного БсЫ/осНуЦйнп (трансформированного рСЬ0143) выращивали в М50-20 до достижения конфлюэнтности, а затем оставляли размножиться во встряхиваемых 50 мл колбах с отбойниками при 27°С, 200 об/мин в течение 48 ч, если не указано иное, в среде, содержащей следующие компоненты (на 1 л):
№28О4 13,62 г
К28О4 0,72 г
КС1 0,56 г
М§304, 7Н2О 2,27 г
(ΝΗ4)23Ο4 3 г
СаС12, 2Н2О 0,19 г
М8О моногидрат 3 г
МЕЗ 21,4 г
КН2РО4 0,4 г
Объем доводили до 900 мл деионизованной Н20 и рН подводили до 6,5, если не указано иное, перед автоклавированием в течение 35 мин. Затем добавляли в среду стерилизованные путем фильтрации глюкозу (50 г/л), витамины (2 мл/л) и металлические микроэлементы (2 мл/л) и подводили объем до одного литра. В растворе витаминов содержалось 0,16 г/л витамина В12, 9,75 г/л тиамина и 3,33 г/л Сапантотената. В растворе металлических микроэлементов (рН 2,5) содержался 1,00 г/л лимонной кислоты, 5,15 г/л РеБО4-7Н2О, 1,55 г/л МпС12-4Н20, 1,55 г/л 2пБ04-7Н20, 0,02 г/л СоС12-6Н20, 0,02 г/л №2Мо04-2Н20, 1,035 г/л СиБ04-5Н20 и 1,035 г/л №Б04-6Н20.
Культуры БсЫ/осНуЧгшт переносили в 50 мл конические пробирки и центрифугировали при 3000д или 4500д в течение 15 мин. См. фиг. 3. Супернатант, полученный в результате такого центрифугирования, названный бесклеточным супернатантом (БКС), использовали для анализа методом иммуноблоттинга и анализа гемагглютинирующей активности.
Бесклеточный супернатант (БКС) дополнительно подвергали ультрацентрифугированию при 100000д в течение 1 ч. См. фиг. 3. Полученный в результате этого осадок (нерастворимая фракция или НР), содержащий белок НА, ресуспендировали в ФБР, рН 7,4. Полученную суспензию центрифугировали (120000д,18 ч, 4°С) в ступенчатом градиенте плотности сахарозы, содержащем растворы сахарозы от 15 до 60%. См. фиг. 3. Фракцию с 60% сахарозой, содержащую белок НА, использовали для анализа пептидной последовательности, анализа гликозилирования, а также анализа методом электронной микроскопии.
Анализ методом иммуноблоттинга.
Экспрессию рекомбинантного белка НА из трансгенного СЬ0143-9 БсН/осНуЕйнп (Е) проверили путем анализа методом иммуноблоттинга в соответствии со стандартной процедурой иммуноблотинга. Белки из бесклеточного супернатанта (БКС) разделяли путем электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (ПААГ/ДСН) на 12% бис-трис-геле NиРАСЕ® №уе.\® (1пуйтодеп, Карлсбад, Калифорния) при восстановительных условиях с электродным буфером МОПС-ДСН, если не указано иное. Белки затем окрашивали кумасси бриллиантовым синим (Б1тр1уВ1ие БаГе Б1аЙ1, 1пуйтодеп, Карлсбад, Калифорния) или переносили на поливинилиденфторидную мембрану и исследовали на присутствие белка НА с помощью антисыворотки кролика против вируса гриппа А/Риейо Рлсо/8/34 (НШ1) (разведение 1:1000, подарок от доктора А1Ьей Э.М.Е. 081егНаи8; РоисЫег Р.А.М. е1 а1., 1. Уйо1. 79:28142822 (2005)), а затем вторичного антитела против 1§С (Рс) кролика, связанного с щелочной фосфатазой (разведение 1:2000, № Б3731, Рготеда Сотротайоп, Мэдисон, Висконсин). Мембрану затем обрабатывали
- 28 022841 раствором 5-бром-4-хлор-3-индоил-фосфат/нитросинего тетразолия (ВС1Р/НБТ), следуя инструкции производителя (КРЬ, Гейтерсберг, Мэриленд). Окрашенные антителами против НШ1 иммуноблоты трансгенной СЬ0143-9 δοϊιίζοοίινίπιιιη (Е), которую выращивали при различных рН (5,5, 6,0, 6,5 и 7,0) и различных температурах (25, 27, 29°С), показаны на фиг. 4А. В качестве отрицательного контроля (С) использовали штамм дикого типа δοϊιίζοοίινίπιιιη 8р. АТСС 20888. Рекомбинантный белок НА обнаружили в бесклеточном супернатанте при рН 6,5 (фиг. 4А) и наибольшую гемагглютинирующую активность обнаружили при рН 6,5, 27°С (фиг. 4А). Гели, окрашенные кумасси бриллиантовым синим (Кумасси), и соответствующие окрашенные антителами против НШ1 иммуноблоты (ИБ: анти-НШ1) для СБ0143-9 (Е), который выращивали при рН 6,5, 27°С, показаны на фиг. 4В, при невосстановительных и восстановительных условиях. В качестве отрицательного контроля (С) использовали штамм дикого типа δοϊιίζοοίινίπιιιη 8р. АТСС 20888.
Активность НА.
Активность белка НА, продуцированного δοϊιίζοοίινίπιιιη. оценивали путем анализа гемагглютинирующей активности. Функциональный белок НА проявляет гемагглютинирующую активность, которую легко обнаружить с помощью стандартного анализа гемагглютинирующей активности. Вкратце, в 96-луночном микротитрационном планшете готовили 50 мкл двукратные разведения в ФБР супернатанта, полученного путем низкоскоростного центрифугирования. Затем в каждую лунку добавляли равный объем приблизительно 1% раствора эритроцитов цыпленка (р1Мдега1б 1иби8Нте8, Актон, Массачусетс) на ФБР, рН 7,4, а затем инкубировали при комнатной температуре в течение 30 мин. Затем визуально анализировали степень агглютинации. Единицу гемагглютинирующей активности (ГАЕ) определяли как наибольшее разведение, которое вызывало видимую гемагглютинацию в лунке.
Типичная обнаруженная активность составляла порядка 512 ГАЕ в бесклеточном супернатанте трансгенного СБ0143-9 ЗсН^ζοсЬуΐ^^ит (Е) (фиг. 5А). ФБР или штамм дикого типа ЗсН^ζοсЬуΐ^^ит 8р. АТСС 20888 (С), который выращивали и получали таким же способом, как и трансгенные штаммы, использовали в качестве отрицательных контролей, и у них не обнаружили гемагглютинирующей активности. Рекомбинантный белок НА из вируса гриппа А/У1с1пат/1203/2004 (Н5М) (Ρτοΐβίη §шеисе8 ίΥΓροΓαΙίοη, Мериден, Коннектикут, разведение 1:1000 на ФБР) использовали в качестве положительного контроля (+).
Исследование растворимых и нерастворимых фракций бесклеточного супернатанта трансгенного штамма СБ0143-9 ЗсН^ζοсЬуΐ^^ит путем анализа гемагглютинации показал, что белок НА обнаруживается преимущественно в нерастворимой фракции (фиг. 5В). Типичная обнаруженная активность составляла порядка 16 ГАЕ в растворимой фракции (Р) и 256 ГАЕ в нерастворимой фракции (НР).
Уровни активности белка НА в 2 л культурах продемонстрировали активность, близкую к активности для культур в качалочных колбах при культивировании в тех же средах при постоянном рН, равном 6,5.
В отдельном эксперименте нативный сигнальный пептид НА удаляли и заменяли на сигнальный пептид Зес1 δΟιίζοΟινΙπιιιη (5ЕО ГО N0: 37, кодируемый 5>ЕО ГО N0: 38). Трансгенный §сН^ζοсЬуί^^ит, полученный с использованием данной альтернативной конструкции, проявил гемагглютинирующую активность и распределение рекомбинантного белка, аналогичные наблюдаемым для трансгенного §сН^ζοсЬуί^шт, содержащего конструкцию рСЬ0143 (данные не представлены).
Анализ пептидной последовательности.
Нерастворимую фракцию (НР), полученную в результате центрифугирования бесклеточного супернатанта при 100000д, дополнительно фракционировали на градиенте плотности сахарозы и фракции, содержащие белок НА, что определяли путем анализа гемагглютинирующей активности (фиг. 6В), разделяли с помощью электрофореза в ПААГ/ДСН и окрашивали кумасси бриллиантовым синим или переносили на поливинилиденфторидную (РУЭР) мембрану и осуществляли иммуноблотинг с антисывороткой кролика против НШ1 (фиг. 6А), как описано выше. Полоски, соответствующие перекрестной реакции на иммуноблоте (НА1 и НА2), вырезали из окрашенного кумасси бриллиантовым синим геля и осуществляли анализ пептидной последовательности. Вкратце, интересующие полоски промывали/обесцвечивали в 50% этаноле, 5% уксусной кислоте. Кусочки геля затем обезвоживали в ацетонитриле, сушили в центрифужном вакуумном концентраторе ЗреебУас® (ТНетю р18Нет Заеибйс, 1ис., Уолтем, Массачусетс) и расщепляли трипсином путем добавления 5 мкл 10 нг/мкл трипсина в 50 мМ бикарбонате аммония и инкубирования в течение ночи при комнатной температуре. Образовавшиеся пептиды экстрагировали из полиакриламида двумя аликвотами по 30 мкл 50% ацетонитрила с 5% муравьиной кислотой. Полученные экстракты объединяли и выпаривали до <10 мкл в ЗреебУас®, а затем ресуспендировали в 1% уксусной кислоте до получения конечного объема, приблизительно равного 30 мкл, для анализа методом ЖХ/МС. Для ЖХ/МС использовали систему масс-спектрометра на основе линейной ионной ловушки Р1иш§аи™ БТОТМ (ТНетю Е1ес1гои ^ιροταίίοη, Уолтем, Массачусетс). Для ВЭЖХ использовали заполненную колонку размером 9 смх75 мкм С18 для капиллярной хроматографии с обращенными фазами РНетп-юиех йфПег™ (ΡЬеиοтеиеx, Торранс, Калифорния). Затем наносили мкл объемы экстракта и элюировали пептиды с колонки с помощью градиента ацетонитрил/0,1 % муравьиная кисло- 29 022841 та при скорости потока, равной 0,25 мкл/мин, и вводили в подключенный источник масс-спектрометра. Микроэлектрораспылительный источник ионов использовали в режиме при 2,5 кВ. Фрагментирование анализировали, применяя эксперимент по контролю селективных реакций (8ΚΜ), в котором массспектрометр разделяет серию отношений массы к заряду (т/ζ) на протяжении всего эксперимента ЖХ. Паттерн фрагментации целевых пептидов затем использовали для получения хроматограмм. Определяли площади пиков для каждого пептида и нормировали на внутренний стандарт. Внутренними стандартами для данного анализа служили белки, распространенность которых неизменна среди исследуемых образцов. Окончательное сравнение двух систем осуществляли путем сравнения нормированных соотношений пиков для каждого белка. Затем осуществляли анализ спектральных данных индуцированной столкновениями диссоциации с помощью базы данных NСВI. Белок НА был определен по всего 27 пептидам, покрывающим более 42% белковой последовательности.
Конкретные пептиды, которые были секвенированы, выделены жирным шрифтом на фиг. 7. В частности, НА1 был определен всего по 17 пептидам и НА2 был определен всего по 9 пептидам. Это соответствует тому, что Ν-конец полипептида НА был укорочен перед положением 397. Расположение идентифицированных пептидов для НА1 и НА2 показано на всей последовательности аминокислот белка НА. Предполагаемый сайт расщепления в НА расположен между аминокислотами 343 и 344 (показан как ΚΛΟ). Выделенная курсивом пептидная последовательность, начинающаяся в положении аминокислоты 402, связана с полипептидом НА2, но она также встречалась в пептидах, идентифицированных в НА1, вероятно, вследствие присутствия следовых примесей пептидов НА2 в вырезанном бэнде НА1. См., например, фиг. 3 у ^τί§1ΐ е! а1., ВМС 0епотю8, 10:61 (2009).
Анализ гликозилирования.
Присутствие гликанов на белке НА оценивали с помощью ферментативной обработки. Фракцию с 60% сахарозой трансгенного 8с^ос1у1тшт СБ0143-9 расщепляли с помощью ЕиИоН или РNΟа8е Р, следуя инструкциям производителя (№те Еп§1апИ Вю1аЪ8, Ипсуич, Массачусетс). Удаление гликанов затем идентифицировали по ожидаемому изменению подвижности при разделении белков с помощью ПААГ/ДСН на 12% бис-трис-гелях NцРАΟЕ® №уе\® (1пуЦтодеп, Карлсбад, Калифорния) с электродным буфером МОПС-ДСН, с последующим окрашиванием кумасси бриллиантовым синим (Кумасси), или путем иммуноблотинга с антисывороткой против НШ1 (ИБ: анти-НШ1) (фиг. 8). Отрицательным контролем ферментативной обработки служило инкубирование трансгенного 8с^осЬу!гшт СЬ0143-9 без ферментов (БО = без обработки). По меньшей мере пять различных разновидностей молекул можно идентифицировать на иммуноблоте на уровне НА1 и два различных разновидности - на иммуноблоте на уровне НА2. Это соответствует нескольким сайтам гликозилирования на НА1 и одному сайту гликозилирования на НА2, что соответствует литературным данным.
Пример 3. Исследование белков из культуральных супернатантов 8с1^ос11у1пит.
8с1^ос11у1пит 8р. АТСС 20888 выращивали при обычных условиях ферментации, описанных выше. Образцы культурального супернатанта собирали с интервалами в 4 ч с 20 до 52 ч культивирования, с последним сбором в 68 ч.
Общий белок в культуральном супернатанте для каждого образца определяли с помощью стандартного метода Брэдфорд. См. фиг. 9.
Белки выделяли из образцов культурального супернатанта через 37, 40, 44, 48 и 68 ч, применяя способ, показанный на фиг. 3. Гель ПААГ/ДСН с белками показан на фиг. 10. На дорожку 11 загружали 2,4 мкг общего белка, на оставшиеся дорожки загружали по 5 мкг общего белка. Интенсивные полоски, идентифицированные как актин или гельсолин (путем пептидного секвенирования с помощью массспектрометрии), отмечены стрелками на фиг. 10.
Пример 4. Негативное окрашивание и электронная микроскопия образцов культурального супернатанта.
8с1^ос11у1гиип 8р. АТСС 20888 (контроль) и трансгенный СЬ0143-9 8с^ос1у1тшт (экспериментальный клон) выращивали в колбе в обычных условиях, описанных выше. Культуры переносили в 50 мл конические пробирки и центрифугировали при 3000д или 4500д в течение 15 мин. Полученный бесклеточный супернатант дополнительно ультрацентрифугировали при 100000д в течение 1 ч и полученный осадок ресуспендировали в ФБР, рН 7,4. Полученную суспензию центрифугировали в ступенчатом градиенте от 15 до 60% сахарозы (120000д, 18 ч, 4°С) и 60% фракцию использовали для негативного окрашивания и исследования с помощью электронной микроскопии.
Исследование с помощью электронной микроскопии контрольного материала показало, что негативно окрашенный материал содержал смесь фрагментов мембран, агрегатов мембран и везикул (в совокупности названных внеклеточными тельцами) в диапазоне от сотен нанометров в диаметре до <50 нм. См. фиг. 11. Форма везикул изменялась от круглой до удлиненной (трубковидной), и границы везикул были гладкими или неровными. Внутреннее пространство везикул бледно окрашивалось, позволяя предложить присутствие органического материала. Везикулы большего размера имели утолщенные мембраны, что позволяет предположить, что границы везикул наложились при получении препарата. Агрегаты и фрагменты мембран сильно различались по форме и размерам. Материал мембран, вероятно, образовался из эктоплазматической сети, на что указывает сильная связь с актином мембран, очищенных путем ульт- 30 022841 рацентрифугирования.
Аналогично, исследования с помощью электронной микроскопии негативного окрашенного материала бесклеточных супернатантов культуры трансгенного СЬ0143-9 БсЫ/осНуЦцпп, экспрессирующего гетерологичный белок, показали, что указанный материал представлял собой смесь фрагментов мембран, агрегатов мембран и везикул в диапазоне от сотен нанометров в диаметре до <50 нм. См. фиг. 11.
На данном материале также осуществляли иммунолокализацию, как описано у Реткшз е1 а1., ί. У1то1. 52:7201-7211 (2008), применяя антисыворотку против Η1Ν1, описанную для анализа методом иммуноблоттинга в примере 22, и частицы золота размером 12 нм. Тельца, состоящие из внеклеточных мембран, выделенные из трансгенного СЬ0143-9 БсЫ/осНуЗгшт, сильно окрасились частицами золота, присоединенными к антисыворотке (фиг. 12), указывая на то, что указанное антитело узнавало белок НА, присутствующий во внеклеточных тельцах. В областях, в которых отсутствовал материал мембран, наблюдали минимальный фоновый сигнал. С внеклеточными тельцами, выделенными из контрольного материала, связалось незначительное количество или вообще не связалось частиц золота (фиг. 12).
Пример 5. Конструирование векторов экспрессии транспортера ксилозы, ксилозаизомеразы и киназы ксилулозы.
Вектор рАВ0018 (АТСС под номером доступа РТА-9616) расщепляли с помощью ΗίηάΙΙΙ, обрабатывали нуклеазой фасоли золотистой, очищали, а затем дополнительно расщепляли с помощью ΚρηΙ, получая четыре фрагмента различных размеров. Фрагмент размером 2552 п.о. выделяли с помощью стандартных методик электрофореза в агарозном геле и очищали, применяя промышленные наборы по очистке ДНК. Затем осуществляли второй этап расщепления рАВ0018 рестриктазами РтеI и Κρη. Фрагмент размером 6732 п.о. выделяли и очищали после расщепления, а затем лигировали с фрагментом размером 2552 п.о. Продукт лигирования затем использовали для трансформирования приобретенных штаммов компетентных клеток ΌΗ5-α Е.соП (ΙηνίΠΌ^η), используя протокол производителя. Плазмиды из устойчивых к ампициллину клонов размножали, очищали, а затем проверяли с помощью расщепления рестриктазами или ПЦР, чтобы подтвердить, что в результате лигирования получили ожидаемые плазмидные структуры. Одну проверенную плазмиду обозначили рСЬ0120. См. фиг. 15.
Последовательности, кодирующие белок-транспортер ксилозы СХБ1 СааФба иНегтеФа (номер доступа в СеиВаик А1875406) и белок-транспортер ксилозы А15§17010 АтаЫ6орз13 ИаНаш (номер доступа в СеиВаик ВТ015128), кодон-оптимизировали и синтезировали (В1ие Негст ВОйсНио^у, Ботелл, Вашингтон), руководствуясь таблицей использования кодонов БсЫ/осНуЗгшт, показанной на фиг. 16. БЕО ΙΌ ΝΟ: 94 представляет собой кодон-оптимизированную последовательность нуклеиновых кислот СБХ1, тогда как БЕО ГО ΝΟ: 95 представляет собой кодон-оптимизированную последовательность нуклеиновых кислот А15§17010.
БЕО ГО ΝΟ: 94 и БЕО ГО ΝΟ: 95 соответственно клонировали в рСЬ0120, используя сайты рестрикции ВатШ и NάеI на 5'- и 3'-конце соответственно, для вставки и лигирования согласно стандартным методикам. Карты полученных векторов, рСЬ0130 и рСЬ0131, показаны на фиг. 17 и 18 соответственно.
Векторы рСЬ0121 и рСЬ0122 получали путем лигирования фрагмента размером 5095 п.о., который высвобождался из рСЬ0120 при расщеплении рестриктазами НшбШ и Крик с синтетическими кассетами селектируемых маркеров, разработанными для придания устойчивости либо к зеоцину, либо к паромомицину. Данные кассеты состояли из промотора альфа тубулина, чтобы запускать экспрессию либо гена зП Ъ1е (для зеоцина), либо гена ир1 (для паромомицина). В качестве терминатора для транскриптов обоих генов селектируемых маркеров служил терминатор БУ40. Полная последовательность векторов рСЬ0121 и рСЬ0122 представлена в БЕО ГО ΝΟ: 90 и БЕО ГО ΝΟ: 91 соответственно. Карты векторов рСЬ0121 и рСЬ0122 показаны на фиг. 19 и 20 соответственно.
Последовательности, кодирующие ксилозаизомеразу РПотусез зр. Е2 (САВ76571) и киназу ксилулозы РПотусез зр. Е2 (А1249910), кодон-оптимизировали и синтезировали (В1ие Негст ВОЩсНиоН^у, Ботелл, Вашингтон), руководствуясь таблицей использования кодонов БсЫ/осНуЗгшт, показанной на фиг. 16. Ху1А (БЕО ГО ΝΟ: 92) представляет собой кодон-оптимизированную последовательность нуклеиновых кислот САВ76571 (фиг. 21), тогда как Ху1В (БЕО ГО ΝΟ: 93) представляет собой кодоноптимизированную последовательность нуклеиновых кислот А1249910 (фиг. 22).
БЕО ГО ΝΟ: 92 клонировали в вектор рСЬ0121 и полученный вектор обозначали рСЬ0132 (фиг. 23), а БЕО ГО ΝΟ: 21 клонировали в вектор рСЬ0122 путем вставки в сайты ВатШ и NάеI и полученный вектор обозначали рСЬ0136 (фиг. 24).
Пример 6. Экспрессия и характеристика белков транспортера ксилозы, ксилозаизомеразы и исследование ксилулозы, полученных в БсЫ/осПуПшт.
Бс1й/ос11у1пит зр. АТСС 20888 использовали в качестве клетки-хозяина для трансформирования вектором рСЬ0130, рС^ 131, рСЬ0132 или рСЬ0136 в отдельности.
Электропорация с предварительной обработкой ферментами. Клетки выращивали в 50 мл среды М50-20 (см. публикацию США № 2008/0022422) на шейкере при 200 об/мин в течение 2 дней при 30°С. Клетки разбавляли до 1:100 в среде М2В (см. следующий абзац) и выращивали в течение ночи (16-24 ч), позволяя им достичь середины логарифмической фазы роста (ΟΌ600 составляла 1,5-2,5). Клетки центрифугировали в 50 мл конической пробирке в течение 5 мин при 3000д. Супернатант удаляли и клетки ре- 31 022841 суспендировали в подходящем объеме 1 М маннита, рН 5,5, до достижения конечной концентрации 2 единицы ОЭ600. 5 мл аликвоту клеток помещали в 25 мл качалочную колбу и добавляли туда 10 мМ СаС12 (1,0 М концентрированный раствор, стерилизованный путем фильтрации) и 0,25 мг/мл протеазы XIV (концентрированный раствор 10 мг/мл, стерилизованный путем фильтрации; БЦта-АИпсН, СентЛуис, Миссури). Колбы инкубировали на шейкере при 30°С и 100 об/мин в течение 4 ч. За клетками наблюдали под микроскопом, чтобы определять степень протопластирования, при этом предпочтительно исследовали отдельные клетки. Клетки центрифугировали в течение 5 мин при 2500д в пробирках с круглым дном (т.е. 14 мл пробирки Ра1соп, ΒΌ Вюкаепсек, Сан-Хосе, Калифорния). Супернатант удаляли и клетки аккуратно ресуспендировали в 5 мл ледяного 10% глицерина. Клетки повторно центрифугировали в течение 5 мин при 2500д в пробирках с круглым дном. Супернатант удаляли и клетки аккуратно ресуспендировали в 500 мкл ледяного 10% глицерина, применяя наконечники с широким отверстием для взятия пробы. Аликвоту клеток 90 мкл добавляли в предварительно охлажденную кювету для электропоратора (кювета Сепе Рикег®, межэлектродное расстояние 0,2 см, Вю-Рай, Геркулес, Калифорния). В кювету добавляли от 1 мкг до 5 мкг ДНК (в объеме, меньшем или равном 10 мкл), аккуратно перемешивали наконечником пипетки и помещали в лед на 5 мин. Клетки электропорировали при 200 Ом (сопротивление), 25 мкФ (емкость) и 500 В. В кювету незамедлительно добавляли 0,5 мл среды М50-20. Клетки затем переносили в 4,5 мл среды М50-20 в 25 мл качалочную колбу и инкубировали в течение 2-3 ч при 30°С и 100 об/мин на шейкере. Клетки центрифугировали в течение 5 мин при 2500д в пробирках с круглым дном.
Супернатант удаляли и осадок клеток ресуспендировали в 0,5 мл среды М50-20. Клетки высевали на подходящее количество (от 2 до 5) чашек со средой М2В при подходящей селекции (при необходимости) и инкубировали при 30°С.
Среда М2В состояла из 10 г/л глюкозы, 0,8 г/л (ΝΉ4)2δΟ4, 5 г/л №-ьБО+ 2 г/л МдБО4-7Н2О, 0,5 г/л КН2РО4, 0,5 г/л КС1, 0,1 г/л СаС12-2Н2О, 0,1 М ΜΕδ (рН 6,0), 0,1% металлов РВ26 и 0,1% витаминов РВ26 (об./об.). Витамины РВ26 состояли из 50 мг/мл витамина В12, 100 мкг/мл тиамина и 100 мкг/мл Са-пантотената. Металлы РВ26 (рН подводили до 4,5) состояли из 3 г/л РеБО4-7Н2О, 1 г/л МпС12-4Н2О, 800 мг/мл ΖпδΟ4·7Н2Ο, 20 мг/мл СоС12-6Н2О, 10 мг/мл №2МоО4-2Н2О, 600 мг/мл СиБО4-5Н2О и 800 мг/мл №БО4-6Н2О. Концентрированные растворы РВ26 стерилизовали отдельно путем фильтрации и добавляли в питательную среду после автоклавирования. Глюкозу, КН2РО4 и СаС12-2Н2О автоклавировали отдельно от остальных ингредиентов питательной среды перед смешиванием, чтобы предотвратить выпадение солей и карамелизацию углеводов. Все ингредиенты среды приобретали в БЦта С11еписа1 (Сент-Луис, Миссури).
Осуществляли селекцию трансформантов по росту на твердых средах, содержащих подходящий антибиотик. От 20 до 100 первичных трансформантов для каждого вектора пересевали на твердую среду ксилоза-ББРМ, которая аналогична среде ББРМ (описанной ниже), за исключением того, что она содержит ксилозу вместо глюкозы в качестве единственного источника углерода, и антибиотик в нее не добавлен. Не наблюдали роста каких-либо клонов при данных условиях.
Среда ББРМ: 50 г/л глюкозы, 13,6 г/л Νι;δ(% 0,7 г/л К2БО4, 0,36 г/л КС1, 2,3 г/л М§БО4-7Н2О, 0,1 М ΜΕδ (рН 6,0), 1,2 г/л (NН4)2δΟ4, 0,13 г/л моноглутамата натрия, 0,056 г/л КН2РО4 и 0,2 г/л СаС12-2Н2О. Витамины добавляли до концентрации 1 мл/л из концентрированного раствора, состоящего из 0,16 г/л витамина В12, 9,7 г/л тиамина и 3,3 г/л Са-пантотената. Металлические микроэлементы добавляли до концентрации 2 мл/л из концентрированного раствора, состоящего из 1 г/л лимонной кислоты, 5,2 г/л РеБО4-7Н2О, 1,5 г/л МпС12-4Н2О, 1,5 г/л ΖпδΟ4·7Н2Ο, 0,02 г/л СаС12-6Н2О, 0,02 г/л №2МоО4-2Н2О, 1,0 г/л СиБО4-5Н2О и 1,0 г/л №БО4-6Н2О, рН подводили до 2,5.
Геномную ДНК экстрагировали из первичных трансформантов рСЬ0130 и рСЬ0131, очищали и использовали в качестве матрицы для ПЦР, чтобы проверить присутствие трансгена.
Экстрагирование геномной ДНК осуществляли, как описано в примере 2.
В качестве альтернативы, после инкубирования с РНКазой А, ДНК дополнительно очищали, применяя колонку Ц1адеп Сепопис Ер 500/С (Ц1адеп, 1пс ИБА, Валенсия, Калифорния), следуя протоколу производителя.
ПЦР.
Праймеры, использованные для обнаружения трансгена СХБ1, представляли собой 5'СЬ0130 (ССТСССССССССТССТСТТ) (БНО ГО Ш: 96) и 3'СЬ0130 (СССССССТТСТССТССТТСС) (δΕΟ ΙΌ NΟ: 97). Праймеры, использованные для обнаружения трансгена А!5§17010, представляли собой 5'СЬ0131 (СТАСТСССТТСТТССССССАТССТ) (БНО ΙΌ 98) и 3'СЬ0131 (ССССССАССАТАСССАСААССА) (БИО ГО Ш: 99).
Комбинации рСЬ0130, рСЬ0132 и рСЬ0136 вместе (группа рСЬ01310) или рСЬ0131, рСЬ0132 и рСЬ0136 вместе (группа рСЬ0131) использовали для котрансформирования штамма дикого типа Бс1й/оскуйгит (АТСС 20888). Трансформанты высевали непосредственно на твердую среду ксилоза-ББРМ и через 3-5 недель колонии снимали и позволяли им дополнительно размножиться в жидкой среде ксилозаББРМ. Несколько раундов последовательного переноса в содержащую ксилозу жидкую среду увеличи- 32 022841 вали скорости роста трансформантов. Котрансформанты группы рСЬ0130 или группы рСЬ0131 также высевали на твердую среду 88РМ, содержащую либо 8ММ, либо зеоцин, либо паромомицин. Все трансформанты, которые высевали на данные среды, были устойчивы к каждому исследованному антибиотику, что указывает на то, что трансформанты несли все три соответствующих вектора. ЗсЫ/осНуЗпит, трансформированные транспортером ксилозы, ксилозаизомеразой и киназой ксилулозы, обладали способностью расти в средах, содержащих ксилозу в качестве единственного источника углерода.
В следующем эксперименте осуществляли вестерн-блоттинг как бесклеточного экстракта, так и бесклеточного супернатанта из культур в качалочной колбе отобранных 8ММ-устойчивых трансформантов клонов (трансформанты рСЬ0130 или рСЬ0131 отдельно, или котрансформанты группы рСЬ0130, или котрансформанты группы рСЬ0131), и показали, что оба транспортера экспрессируются и обнаруживаются в обеих фракциях, указывая на то, что данные связанные с мембраной белки связаны с внеклеточными везикулами способом, аналогичным наблюдаемому для других мембранных белков, описанных в данном документе. Дополнительно осуществляли вестерн-блоттинг, с помощью которого показали экспрессию ксилозаизомеразы и киназы ксилулозы в бесклеточных экстрактах для всех клонов, в которых ожидали их присутствие. Внеклеточные тельца, такие как везикулы, содержащие транспортеры ксилозы, можно применять для очистки от следовых количеств ксилозы сред, содержащих смеси сахаров или других низкомолекулярных растворенных веществ, путем захвата указанного сахара внутрь везикул, которые затем можно отделить с помощью различных способов, включая фильтрацию или центрифугирование.
Пример 7. Конструирование векторов экспрессии рСЬ0140 и рСЬ0149.
Вектор рСЬ0120 расщепляли с помощью ВатН1 и №е1, в результате чего получили два фрагмента длиной 837 пар оснований (п.о.) и 8454 п.о. Фрагмент длиной 8454 п.о. фракционировали с помощью стандартных методик электрофореза в агарозном геле, очищали, применяя промышленные наборы по очистке ДНК, и лигировали с синтетической последовательностью (8ЕЦ ГО N0: 100 или
8ЕЦ ГО N0: 101; см. фиг. 26), которую также предварительно расщепляли с помощью ВатН1 и №е1. 8ЕЦ ГО N0: 100 (фиг. 26) кодирует белок ΝΑ вируса гриппа А (А/Риейо Клсо/8/34/Моип1 81па1(НШ1)). Последовательность белка совпадала с последовательностью в СепВапк под номером доступа ΝΡ040981. Последовательность нуклеиновых кислот 8ЕЦ ГО N0: 100 кодон-оптимизировали и синтезировали для экспрессии в 8с1й/ос11у1пит с помощью ^NΑ 2.0, руководствуясь таблицей использования кодонов ЗсН/осНуЦипп, показанной на фиг. 16. 8ЕЦ ГО N0: 101 (фиг. 26) кодирует тот же белок NΑ, что и 8ЕЦ ГО N0: 100, но включает последовательность ледовательность на С-конце кодирующего участка.
Продукт лигирования затем использовали для трансформирования приобретенных штаммов компетентных клеток ЭН5-а Е.соИ (ЗпуНгодеп, Карлсбад, Калифорния), используя протокол производителя. Данные плазмиды затем проверяли путем расщепления рестриктазами или ПЦР, чтобы подтвердить, что в результате лигирования получили ожидаемые плазмидные структуры. Плазмидные векторы, полученные в результате данной процедуры, проверяли, применяя секвенирование по Сенгеру, с помощью ^NΑ 2.0 (Менло Парк, Калифорния) и обозначили рСЬ0140 (фиг. 25А), включающий 8ЕЦ ГО N0: 100, и рСЬ0149 (фиг. 25В), включающий 8ЕЦ ГО N0: 101. Векторы рСЬ0140 и рСЬ0149 содержали промотор гена фактора элонгации-1 (ЕР1) 8с1й/ос11у1пит для запуска экспрессии трансгена NΑ, терминатор 0гГС (также известный как терминатор РРА3), следующий за трансгеном NΑ, и кассету селекционного маркера, придающего устойчивость к сульфометуронметилу.
Пример 8. Экспрессия и исследование белка NΑ, продуцируемого в 8с1и/ос11у1пит.
8с1и/ос11у1пит 8р. АТСС 20888 использовали в качестве клетки-хозяина для трансформации векторами рСЬ0140 и рСЬ0149 с помощью устройства для бомбардировки частицами ВюЖЬс™ (ВюКаб, Геркулес, Калифорния), как описано в примере 2. Осуществляли селекцию трансформантов по росту на твердых средах, содержащих соответствующий антибиотик. Экстрагировали геномную ДНК из первичных трансформантов, очищали и использовали в качестве матрицы для ПЦР, чтобы проверить присутствие трансгена, как описано ранее (пример 2).
Замороженные маточные растворы трансгенного 8сЫ/осНу1г1ит (трансформированного рСЬ0140 и рСЬ0149) выращивали в М50-20 до достижения конфлюэнтности, а затем позволяли размножиться в 50 мл встряхиваемых колбах с отбойниками, как описано в примере 2.
Культуры 8с1и/ос11у1пит переносили в 50 мл конические пробирки и центрифугировали при 3000д в течение 15 мин. См. фиг. 27. Супернатант, полученный в результате такого центрифугирования, называли бесклеточным супернатантом (БКС). Фракцию БКС концентрировали до 50-100 раз, применяя гравиоконцентраторы СеШпргер™ (МПИроге, Биллерика, Массачусетс), и называли концентрированным бесклеточным супернатантом (кБКС). Осадок клеток, полученный в результате центрифугирования, промывали водой и замораживали в жидком азоте перед ресуспендированием в лизирующем буфере массой, в два раза превышающей массу осадка (лизирующий буфер состоял из 50 мМ фосфата натрия (рН 7,4), 1 мМ ЕОТА, 5% глицерина и 1 мМ свежего фенилметилсульфонилфторида) с 0,5 мм стеклянными гранулами, массой, в два раза превышающей массу осадка (81дта, Сент-Луис, Миссури). Смесь с осадком клеток затем лизировали путем встряхивания при 4°С на вортексе для множества пробирок
- 33 022841 (У^К, Западный Честер, Пенсильвания) при максимальной скорости в течение 3 ч. Полученный в результате этого клеточный лизат затем центрифугировали при 5500д в течение 10 мин при 4°С. Полученный супернатант сохраняли и повторно центрифугировали при 5500д в течение 10 мин при 4°С. Полученный супернатант называют в данном описании бесклеточным экстрактом (БКЭ). Концентрацию белка определяли в кБКС и БКЭ с помощью стандартного метода Брэдфорд (Вю-Каб, Геркулес, Калифорния). Данные фракции использовали для анализов нейраминидазной активности, а также для анализа методом иммуноблоттинга.
Функциональный белок NА вируса гриппа демонстрировал нейраминидазную активность, которую можно обнаружить с помощью стандартного флуориметрического анализа NА-активности, основанного на гидролизе субстрата (4-метилумбеллиферил)-а-О-Н-ацетилнейрамината натрия (4-ΜυNАNА) (81дтаА16псН. Сент-Луис, Миссури) сиалидазами с получением свободного 4-метилумбеллиферона, который флюоресцирует на 450 нм после возбуждения на 365 нм. Вкратце, БКС, кБКС или БКЭ трансгенных штаммов 8с1и/ос11у1пит анализировали, следуя процедуре, описанной у РоНет е1 а1., Апа1. ВюсНет. 94:287-296 (1979), используя 25 мкл БКС и 75 мкл 40 мкМ 4-ΜυNАNА или 75 мкл дистиллированной деминерализированной воды (66Н20) для контролей. Реакционные смеси инкубировали в течение 30 мин при 37°С и флуоресценцию измеряли с помощью многорежимного планшет-ридера РЬи081ат 0теда (ВМО ЬАВТЕСН, Оффенбург, Германия).
Типичные значения активности, наблюдаемые в концентрированных бесклеточных супернатантах (кБКС) и бесклеточных экстрактах (БКЭ) для 9 трансгенных штаммов 8сН17осНу1тшт, трансформированных СБ0140, представлены на фиг. 28. Штамм дикого типа 8с1й/осНу1пит 8р. АТСС 20888 и ПЦРотрицательный штамм 8сН|/осНу1г1пт, трансформированный рСЬ0140 (27), который выращивали и получали таким же способом, как и трансгенные штаммы, использовали в качестве отрицательных контролей. Более высокую активность обнаружили у концентрированного бесклеточного супернатанта, что указывает на успешную экспрессию и секрецию функциональной нейраминидазы вируса гриппа из 8с1й/осНу1пит во внешнюю среду.
Анализ пептидной последовательности.
Трансгенный штамм 8сЫ/осНу1г1пт СБ0140-26 использовали для частичной очистки белка NА вируса гриппа, чтобы подтвердить его успешную экспрессию и секрецию путем анализа пептидной последовательности. Применяли процедуру очистки, описанную у Тагщап е1 а1., ЛТУ, 14(1):75-82 (2008), а затем измеряли активность NА (фиг. 29А), как описано выше. Вкратце, бесклеточный супернатант трансгенного штамма СБ0140-26 дополнительно центрифугировали при 100000д в течение 1 ч при 4°С. Полученный в результате этого супернатант концентрировали в 100 раз (фракция кБКС на фиг. 29А), применяя гравиоконцентраторы СепРгртер (МННроте, Биллерика, Массачусетс), и снова разбавляли до исходного объема (фракция Ό на фиг. 29А) буфером, содержащим 0,1 М бикарбонат натрия (рН 9,1) и 0,1% ТгПоп Х-100. Этот разбавленный образец использовали для очистки с помощью аффинной хроматографии. Агарозой, модифицированной N-(п-аминофенил)оксаминовой кислотой (81дта-А16г1сН, СентЛуис, Миссури), наполняли колонку ΡΌ-10 (ВюКаб, Геркулес, Калифорния), активировали путем промывки 6 объемами колонки (ОК) буфера, содержащего 0,1 М бикарбонат натрия (рН 9,1) и 0,1% ТгПоп Х-100, а затем 5 ОК буфера, содержащего 0,05 М ацетат натрия, рН 5,5, и 0,1% ТгПоп Х-100. Разбавленный образец (фракция Ό) загружали на колонку; несвязавшиеся материалы удаляли путем промывки колонки 10 ОК буфера, содержащего 0,15 М ацетат натрия и 0,1% ТгПоп Х-100 (фракция С на фиг. 29А). Связанный NА элюировали с колонки 5 ОК буфера, содержащего 0,1 М бикарбонат натрия и 0,1% ТгПоп Х-100, и 2 мМ СаС12 (фракция Э на фиг. 29А). Обогащенный NА раствор фракции Э концентрировали приблизительно до 10% исходного объема, применяя центрифужный концентратор с отсечкой по молекулярной массе 10 кДа с получением фракции кЭ.
Белки из каждой фракции разделяли путем электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (ПААГ/ДСН) на 12% бис-трис-геле №РАОЕ® Шуех® ОпуПгодеп, Карлсбад, Калифорния) при восстановительных условиях с электродным буфером МОПС-ДСН. Белки затем окрашивали кумасси бриллиантовым синим (81тр1уВ1ие 8аГе 81а1п, 1пуНтодеп, Карлсбад, Калифорния). Полоски белков, видимые на дорожке кЭ (фиг. 29В), вырезали из окрашенного кумасси бриллиантовым синим геля и осуществляли анализ пептидной последовательности, как описано в примере 2. Бэнд белка, содержащий белок NА (указан стрелкой на дорожке кЭ), был определен по всего 9 пептидам (113 аминокислотам), покрывающим 25% белковой последовательности. Конкретные пептиды, которые секвенировали, выделены жирным шрифтом на фиг. 30.
Анализ методом иммуноблоттинга.
Экспрессию рекомбинантного белка NА из трансгенного 8с1й/осНу1пит СБ0149 (клоны 10, 11, 12) проверяли путем анализа методом иммуноблоттинга после стандартной процедуры иммуноблотинга (фиг. 31В). Белки из бесклеточного супернатанта (БКС) разделяли путем электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (ПААГ/ДСН) на 12% бис-трис-геле №РАОЕ® №уех® (ЗпуПгодеп, Карлсбад, Калифорния) при восстановительных условиях с электродным буфером МОПС-ДСН. Белки затем окрашивали кумасси бриллиантовым синим (81тр1уВ1ие 8аГе 81ат, 1пуНтодеп,
- 34 022841
Карлсбад, Калифорния) или переносили на поливинилиденфторидную мембрану и исследовали на присутствие белка NΑ с помощью моноклонального антитела мыши против У5, конъюгированного с АР (разведение 1:1000, № 962-25, 1пуйгодеп, Карлсбад, Калифорния).
Мембрану затем обрабатывали раствором 5-бром-4-хлор-3-индоил-фосфата/нитросинего тетразолия (ВСГР/ΝΒΤ), следуя инструкции производителя (КРЬ, Гейтерсберг, Мэриленд). Рекомбинантный белок NΑ обнаружили в бесклеточном супернатанте клона 11 (фиг. 31В). Отрицательным контролем служил штамм дикого типа ЗсЫ/осНуЧгннп 8р. АТСС 20888. Положительным контролем (+) служил белок для контроля антитела Ро8Йоре™ (№Р900-50, 1пуйгодеп, Карлсбад, Калифорния). Соответствующая нейраминидазная активность представлена на фиг. 31А.
Пример 9. Одновременная экспрессия НА и NΑ вируса гриппа в 8сЫ/осйу1г1нт.
5>с1й/ос11у1пит 8р. АТСС 20888 использовали в качестве клетки-хозяина для одновременной трансформации векторами рСЬ0140 (фиг. 25А) и рСЬ0143 (фиг. 2) с помощью устройства для бомбардировки частицами В1о118Йс™ (ВюРай, Геркулес, Калифорния), как описано в примере 2.
Замороженные маточные растворы трансгенного ЗсЫ/осНуЧпит (трансформированного рСЬ0140 и рСЬ0143) культивировали и обрабатывали, как описано в примере 2. Гемагглютинирующую и нейраминидазную активности измеряли, как описано в примерах 2 и 7 соответственно, и полученные значения показаны на фиг. 32. Трансгенный ЗсЫ/осНуЧпиит трансформированный рСЬ0140 и рСЬ0143, продемонстрировал активности, связанные с НА и NΑ.
Пример 10. Экспрессия и исследование внеклеточных телец, содержащих гибридный вируса парагриппа, продуцированный в 5>с1й/ос11у1пит.
ЗсЫ/осНуЧгннп 8р. АТСС 20888 использовали в качестве клетки-хозяина для трансформирования вектором, содержащим последовательность, которая кодирует гибридный белок штамма №Н 47885 вируса парагриппа 3 человека (номер доступа в СепВапк Р06828). Типичная последовательность гибридного белка (Р) представлена в §ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 102. Некоторые клетки трансформировали вектором, содержащим последовательность, кодирующую нативную последовательность сигнального пептида, связанного с Р-белком. Другие клетки трансформировали вектором, содержащим последовательность, кодирующую отличную последовательность сигнального пептида (такую как, например, сигнальная якорная последовательность ЗсЫ/осйуйтит), которая слита с последовательностью, кодирующей гибридный белок, так что гибридный белок экспрессируется с гетерологичной последовательностью сигнального пептида. Другие клетки трансформировали вектором, содержащим последовательность, кодирующую отличный мембранный домен (такой как, например, мембранный домен НА), которая гибридизована с последовательностью, кодирующей гибридный белок, так что гибридный белок экспрессируется с гетерологичным мембранным доменом, гибридный белок содержит трансмембранный домен, один раз пронизывающий мембрану, рядом с С-концом. гибридный белок можно расщепить на два пептида в сайте расщепления фурином (аминокислота 109). Первая часть белка, обозначенная Р2, содержит Ν-концевую часть целого гибридного белка. Участок Р2 можно слить в отдельности с последовательностями, кодирующими гетерологичные сигнальные пептиды. Оставшуюся часть вирусного гибридного белка, содержащую С-концевую часть гибридного белка, обозначили Р1. Участок Р1 может быть отдельно гибридизован с последовательностями, кодирующими гетерологичные сигнальные пептиды. Векторы, содержащие участки Р1 и Р2 вирусного гибридного белка, можно экспрессировать отдельно или совместно. Вектор, экспрессирующий целый гибридный белок, можно экспрессировать совместно с ферментом фурином, который расщепит указанный белок в сайте расщепления фурином. В качестве альтернативы, последовательность, кодирующую сайт расщепления фурином гибридного белка, можно заменить на последовательность, кодирующую сайт расщепления альтернативной протеазой, которая распознается и расщепляется другой протеазой. Гибридный белок, содержащий сайт расщепления другой протеазой, можно экспрессировать совместно с соответствующей протеазой, которая распознает и расщепляет в сайте расщепления другой протеазой.
Осуществляли трансформацию, и выращивали и размножали замороженные маточные растворы согласно любому из способов, описанных в данном документе. Культуры 5>с1й/ос11у1пит переносили в 50 мл конические пробирки и центрифугировали при 3000д или 4500д в течение 15 мин с получением супернатанта путем низкоскоростного центрифугирования. Супернатант, полученный путем низкоскоростного центрифугирования, дополнительно подвергали ультрацентрифугированию при 100000д в течение 1 ч. См. фиг. 3. Полученный в результате этого осадок нерастворимой фракции, содержащей гибридный белок, ресуспендировали в фосфатно-солевом буферном растворе (ФБР) и использовали для анализа пептидной последовательности, а также анализа гликозилирования, как описано в примере 2.
Экспрессию гибридного белка из трансгенного ЗсЫ/осНуЧгннп проверяли путем анализа методом иммуноблоттинга после стандартной процедуры иммуноблотинга, описанной в примере 2, применяя антисыворотку против гибридного белка и вторичное антитело при подходящих разведениях. Рекомбинантный гибридный белок обнаружили в супернатанте, полученном путем низкоскоростного центрифугирования, и в нерастворимой фракции. Дополнительно, рекомбинантный гибридный белок обнаружили в бесклеточных экстрактах из трансгенного ЗсЮ/осНуМит экспрессирующего гибридный белок.
- 35 022841
Активность гибридного белка, полученного в 8с1ихосНу1гшт, оценивали путем анализа активности гибридного белка. Функциональный гибридный белок проявлял активность гибридного белка, которую легко детектировали с помощью стандартного анализа активности гибридного белка.
Осуществляли исследование методом электронной микроскопии, применяя негативно окрашенный материал, полученный согласно примеру 4, чтобы подтвердить присутствие внеклеточных телец. Осуществляли иммунное окрашивание золотом, чтобы подтвердить связь белка с тельцами, состоящими из внеклеточных мембран.
Пример 11. Экспрессия и исследование внеклеточных телец, содержащих гликопротеин (С) вируса везикулярного стоматита, полученный в 8с1и/ос11у1пит.
8с1и/ос11у1пит 8р. АТСС 20888 использовали в качестве клетки-хозяина для трансформации вектором, содержащим последовательность, которая кодирует гликопротеин вируса везикулярного стоматита (У8У-С). Типичная последовательность У8У-С-белка представлена в 8ЕЦ ГО N0: 103 (номер доступа в СепВапк М35214). Некоторые клетки трансформировали вектором, содержащим последовательность, кодирующую нативную последовательность сигнального пептида, связанного с У8У-С. Другие клетки трансформировали вектором, содержащим последовательность, кодирующую отличную последовательность сигнального пептида (такую как, например, сигнальная якорная последовательность 8сЫ/осЬу1гшт), которая слита с последовательностью, кодирующей У8У-С, так что У8У-С экспрессируется с гетерологичной последовательностью сигнального пептида. Другие клетки трансформировали вектором, содержащим последовательность, кодирующую отличный мембранный домен (такой как, например, мембранный домен НА), которая слита с последовательностью, кодирующей У8У-С, так что У8У-С экспрессируется с гетерологичным мембранным доменом. Осуществляли трансформирование и выращивали и размножали Замороженные маточные растворы согласно любому из способов, описанных в данном документе. Культуры 8с1й/ос11у1пит переносили в 50 мл конические пробирки и центрифугировали при 3000д или 4500д в течение 15 мин с получением супернатанта путем низкоскоростного центрифугирования. Супернатант, полученный путем низкоскоростного центрифугирования, дополнительно подвергали ультрацентрифугированию при 100000д в течение 1 ч. См. фиг. 3. Полученный в результате этого осадок нерастворимой фракции, содержащей У8У-С, ресуспендировали в фосфатно-солевом буферном растворе (ФБР) и использовали для анализа пептидной последовательности, а также анализа гликозилирования, как описано в примере 2.
Экспрессию У8У-гликопротеин из трансгенного 8сЫ/осНу1г1ит проверяли путем анализа методом иммуноблоттинга после стандартной процедуры иммуноблотинга, описанной в примере 2, применяя антисыворотку против У8У-С-белка и вторичное антитело при подходящих разведениях. Рекомбинантный У8У-гликопротеин обнаружили в супернатанте, полученном путем низкоскоростного центрифугирования, и в нерастворимой фракции. Дополнительно, рекомбинантный У8У-гликопротеин обнаружили в бесклеточных экстрактах из трансгенного 8сЫ7осЬу1тшт, экспрессирующего У8У-С-белок.
Активность У8У-С, полученного в 8сЫ7осЬу1тшт, оценивали путем анализа активности У8У-С. Функциональный У8У-гликопротеин проявлял активность У8У-С, которую легко детектировали с помощью стандартного анализа активности У8У-С.
Осуществляли исследование методом электронной микроскопии, применяя негативно окрашенный материал, полученный согласно примеру 4, чтобы подтвердить присутствие внеклеточных телец. Осуществляли иммунное окрашивание золотом, чтобы подтвердить связь белка с тельцами, состоящими из внеклеточных мембран.
Пример 12. Экспрессия и исследование внеклеточных телец, содержащих белки, гибридизованные с еСРР, продуцируемые в 8сЫ/осНу1г1ит.
Трансформирование 8с1и/ос11у1пит 8р. АТСС 20888 векторами, содержащими полинуклеотидную последовательность, кодирующую еСРР, и экспрессия еСРР в трансформированных 8с1й/ос11у1пит были описана ранее. См. публикацию США № 2010/0233760 и \У0 2010/107709, которые полностью включены в данное описание посредством ссылки.
В следующем эксперименте 8с1й/ос11у1пит 8р. АТСС 20888 использовали в качестве клеткихозяина для трансформации вектором, содержащим последовательность, которая кодирует гибридный белок, состоящий из еСРР и мембранного домена, такого как, например, мембранный домен из 8с1и/ос11у1пит или вирусный мембранный домен, такой как мембранный домен НА. Типичные мембранные домены 8с1и/ос11у1пит представлены на фиг. 13 и 14. Осуществляли трансформирование и выращивали и размножали замороженные маточные растворы согласно любому из способов, описанных в данном документе. Культуры 8с1и/ос11у1пит переносили в 50 мл конические пробирки и центрифугировали при 3000д или 4500д в течение 15 мин с получением супернатанта путем низкоскоростного центрифугирования. Супернатант, полученный путем низкоскоростного центрифугирования, дополнительно подвергали ультрацентрифугированию при 100000д в течение 1 ч. См. фиг. 3. Полученный в результате этого осадок нерастворимой фракции, содержащей слитый с еСРР белок из трансгенного 8сЫ7осЬу1гшт, ресуспендировали в фосфатно-солевом буферном растворе (ФБР) и использовали для анализа пептидной последовательности, а также анализа гликозилирования, как описано в примере 2.
Экспрессию гибридного с еСРР белка в трансгенном 8сЫ/осНу1г1ит проверяли путем анализа мето- 36 022841 дом иммуноблоттинга после стандартной процедуры иммуноблотинга, описанной в примере 2, применяя антисыворотку против слитого с еСРΡ белка и вторичное антитело при подходящих разведениях. Рекомбинантный слитый с еСРΡ белок обнаружили в супернатанте, полученном путем низкоскоростного центрифугирования, и в нерастворимой фракции. Дополнительно, рекомбинантный слитый с еСРΡ белок обнаружили в бесклеточных экстрактах из трансгенного δсЬ^ζοсЬуί^^ит, экспрессирующего слитый с еСРΡ белок.
Активность гибридного белка, содержащего еСРΡ, полученного в δсЬ^ζοсЬуΐ^^ит, оценивали путем анализа активности слитого с еСРΡ белка. Функциональный слитый с еСРΡ белок проявлял активность слитого с еСРΡ белка, которую легко детектировали с помощью стандартного анализа активности слитого с еСРΡ белка.
Осуществляли исследование методом электронной микроскопии, применяя негативно окрашенный материал, полученный согласно примеру 4, чтобы подтвердить присутствие внеклеточных телец. Осуществляли иммунное окрашивание золотом, чтобы подтвердить связь белка с тельцами, состоящими из внеклеточных мембран.
Пример 13. Детектирование гетерологичных полипептидов, полученных в культурах траустохитрид.
Получали культуру траустохитридной клетки-хозяина, содержащей по меньшей мере один гетерологичный полипептид, в ферментере при подходящих условиях ферментации. В ферментер загружали среды, содержащие, например, углерод (глюкозу), азот, фосфор, соли, металлические микроэлементы и витамины. Ферментер инокулировали обычной посевной культурой, затем культивировали в течение 72120 ч и подавали углеродную подпитку (например, глюкозу). Углеродная подпитка подавалась и потреблялась на протяжении всей ферментации. Через 72-120 ч, содержимое ферментера собирали и питательную среду центрифугировали для отделения биомассы от супернатанта.
Содержание белка для биомассы и бесклеточного супернатанта определяли с помощью стандартных тестов, таких как метод Брэдфорд или биуретовый анализ с использованием бицинхониновой кислоты (ВСА). Белки дополнительно анализировали с помощью стандартного ПААГ/ДСН и вестернблоттинга, чтобы определить экспрессию гетерологичного полипептида(ов) в соответствующих фракциях биомассы и бесклеточного супернатанта. С помощью обычных процедур окрашивания (например, негативного окрашивания и иммунного окрашивания золотом) и последующего исследования методом электронной микроскопии было показано, что гетерологичный полипептид(ы), содержащий мембранные домены, связан с внеклеточными тельцами микроводорослей.
Пример 14. Получение вирусоподобных частиц из культур микроводорослей.
Один или более полипептидов оболочки вируса гетерологично экспрессировали в микроводорослевой клетке-хозяине в условиях, описанных выше, таким образом, что вирусные полипептиды локализовались во внеклеточных тельцах микроводорослей, полученных при указанных условиях культивирования. При избыточной экспрессии с применением подходящих условий культивирования и регуляторных контролирующих элементов, полипептиды оболочки вируса во внеклеточных тельцах микроводорослей самопроизвольно собирались в частицы, которые были морфологически сходны с инфекционным вирусом.
Аналогично, один или более полипептидов оболочки вируса и один или более полипептидов матрикса вируса гетерологично экспрессировали в микроводорослевой клетке-хозяине в условиях, описанных выше, таким образом, что вирусные полипептиды локализовались во внеклеточных тельцах микроводорослей, полученных при указанных условиях культивирования. При избыточной экспрессии с применением подходящих условий культивирования и регуляторных контролирующих элементов, вирусные полипептиды во внеклеточных тельцах микроводорослей самопроизвольно собирались в частицы, которые были морфологически сходны с инфекционным вирусом.
Все из различных аспектов, вариантов реализации и возможностей выбора, описанных в данном документе, можно объединить в любом и всех вариантах.
Все публикации, патенты и заявки на патент, упомянутые в данном описании, включены в данное описание посредством ссылки в такой же степени, как если бы каждая отдельная публикация, патент или заявка на патент была конкретно и отдельно указаны как включенные посредством ссылки.

Claims (13)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Способ получения вирусного белка гемагглютинина (НА), включающий обеспечение рекомбинантной микроводорослевой клетки, содержащей молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую (1) полинуклеотидную последовательность, которая кодирует вирусный белок НА, содержащий мембранный домен НА; и (2) регуляторные элементы контроля, которые являются активными;
    культивирование указанной рекомбинантной микроводорослевой клетки в среде таким образом, что вирусный белок НА секретируется в среду; и выделение секретированного рекомбинантного вирусного белка НА из среды.
  2. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанный рекомбинантный вирусный белок НА представляет собой полноразмерный вирусный белок НА.
  3. 3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что указанный рекомбинантный вирусный белок НА представляет собой белок вируса гриппа НА.
  4. 4. Способ по п.3, отличающийся тем, что белок вируса гриппа НА выбирают из белков вируса гриппа НА следующих типов: Н1, Н2, Н3, Н4, Н5, Н6, Н7, Н8, Н9, Н10, Н11, Н12, Н13, Н14, Н15 и Н16.
  5. 5. Способ по п.3, отличающийся тем, что белок вируса гриппа НА выбирают из белков вируса гриппа НА следующих типов: Н1, Н2, Н3, Н5, Н6, Н7 и Н9.
  6. 6. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанный рекомбинантный вирусный белок НА представляет собой полноразмерный белок вируса гриппа НА.
  7. 7. Способ по п.1, отличающийся тем, что последовательность рекомбинантного вирусного белка НА по меньшей мере на 90% идентична последовательности δΕΟ ΙΌ N0: 77.
  8. 8. Способ по п.1, отличающийся тем, что рекомбинантный вирусный белок НА имеет последовательность δΕΟ ΙΌ N0: 77.
  9. 9. Способ по п.1, отличающийся тем, что рекомбинантный вирусный белок НА расщепляется с получением фрагментов НА1 и НА2 в культуральной среде в отсутствие экзогенной протеазы.
  10. 10. Способ по п.1, отличающийся тем, что микроводорослевая клетка представляет собой представителя отряда ТНгаи8ЮсНу1г1а1е8.
  11. 11. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанная микроводорослевая клетка представляет собой клетку δсЪ^ζοсЪуΐ^^ит или ТЪгашЮсЪуЪтит.
  12. 12. Способ приготовления композиции вакцины, включающий обеспечение рекомбинантного вирусного белка НА, полученного способом по любому из пп.1-11; и создание на основе указанного рекомбинантного вирусного белка НА композиции вакцины для введения с помощью по меньшей мере одного способа, выбранного из внутримышечного, внутривенного, подкожного, внутрилегочного, внутритрахеального, трансдермального, внутриглазного, интраназального, ингаляционного, внутриполостного, внутрипротокового и интрапаренхиматозного введения.
  13. 13. Рекомбинантная микроводорослевая клетка, включающая молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую (1) полинуклеотидную последовательность, которая кодирует вирусный белок НА, содержащий мембранный домен НА; и (2) регуляторные элементы контроля, которые являются активными.
EA201290567A 2009-12-28 2010-12-28 Получение гетерологичных полипептидов в микроводорослях, внеклеточные микроводорослевые тельца, композиции и способы их получения и применения EA022841B1 (ru)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US29044109P 2009-12-28 2009-12-28
US29046909P 2009-12-28 2009-12-28
US41335310P 2010-11-12 2010-11-12
PCT/US2010/062276 WO2011090731A1 (en) 2009-12-28 2010-12-28 Production of heterologous polypeptides in microalgae, microalgal extracellular bodies, compositions, and methods of making and uses thereof

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201290567A1 EA201290567A1 (ru) 2013-02-28
EA022841B1 true EA022841B1 (ru) 2016-03-31

Family

ID=44307127

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201290567A EA022841B1 (ru) 2009-12-28 2010-12-28 Получение гетерологичных полипептидов в микроводорослях, внеклеточные микроводорослевые тельца, композиции и способы их получения и применения

Country Status (9)

Country Link
US (3) US20110189228A1 (ru)
EP (3) EP4130273B1 (ru)
JP (3) JP6339548B2 (ru)
CN (2) CN102822343B (ru)
AU (4) AU2010343095B2 (ru)
CA (3) CA3153553A1 (ru)
EA (1) EA022841B1 (ru)
IN (1) IN2012DN06277A (ru)
WO (1) WO2011090731A1 (ru)

Families Citing this family (38)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TWI377253B (en) 2001-04-16 2012-11-21 Martek Biosciences Corp Product and process for transformation of thraustochytriales microorganisms
JP2012520676A (ja) 2009-03-16 2012-09-10 マーテック バイオサイエンシーズ コーポレーション ラビリンチュラ菌門の微生物におけるタンパク質作製
EP2519258B1 (en) * 2009-12-28 2017-07-26 Merial Ltd. Recombinant ndv antigen and uses thereof
IN2012DN06278A (ru) * 2009-12-28 2015-09-25 Dsm Ip Assets Bv
EP2444495A1 (en) * 2010-10-20 2012-04-25 Algenics Secretion of recombinant polypeptides in the extracellular medium of diatoms
CN107630017A (zh) 2011-03-07 2018-01-26 Dsm营养产品股份公司 工程化破囊壶菌属微生物
BR112014004188A2 (pt) 2011-08-24 2017-03-21 Novozymes Inc método para obter transformantes positivos de uma célula hospedeira fúngica filamentosa, célula hospedeira fúngica filamentosa, método para produzir múltiplos polipeptídeos recombinantes, e, construto em tandem
BR112015001344A2 (pt) 2012-07-24 2017-07-04 Bp Corp North America Inc xilose isomerases e seus usos
WO2014045191A2 (en) * 2012-09-18 2014-03-27 Myko Tech Private Limited Extracellular polysaccharides from labyrinthulomycetes with broad-spectrum antiviral activities
ES2870093T3 (es) 2014-10-02 2021-10-26 Evonik Operations Gmbh Biomasa que contiene PUFA con estabilidad celular elevada y su empleo para la producción de piensos
EP3200604B1 (de) 2014-10-02 2021-11-03 Evonik Operations GmbH Verfahren zur herstellung eines futtermittels
WO2016050554A1 (de) 2014-10-02 2016-04-07 Evonik Degussa Gmbh Pufas enthaltendes futtermittel mit hoher abriebfestigkeit und hoher wasserstabilität
DK3200606T3 (da) * 2014-10-02 2021-06-21 Evonik Operations Gmbh Fremgangsmåde til fremstilling af et fodermiddel, der indeholder pufa'er, ved ekstrusion af en biomasse, der indeholder pufa'er, af typen labyrinthulomycetes
US9932599B2 (en) 2015-03-02 2018-04-03 Synthetic Genomics, Inc. Regulatory elements from labyrinthulomycetes microorganisms
AU2016293487B2 (en) 2015-07-13 2021-07-01 MARA Renewables Corporation Enhancing microalgal metabolism of xylose
FR3038913B1 (fr) * 2015-07-17 2020-05-01 Fermentalg Biomasse de thraustochytrides, procede de culture et utilisations
CN109890964A (zh) * 2016-09-09 2019-06-14 康奈尔大学 核酸、蛋白和小分子在玻璃体囊泡体中的递送
US10633454B2 (en) 2016-11-01 2020-04-28 Conagen Inc. Expression of modified glycoproteins and glycopeptides
US10954280B2 (en) 2016-11-27 2021-03-23 Triton Algae Innovations, Inc. Method of purification of recombinant osteopontin from micro algae
EP3762485A4 (en) * 2018-03-05 2021-12-08 Conagen Inc. ORGANISMS AND PROCESSES FOR THE PRODUCTION OF LOW SULPHATION GLYCOMOLECULES
JP7424288B2 (ja) 2018-06-27 2024-01-30 住友電気工業株式会社 フレキシブルプリント配線板の原形体、フレキシブルプリント配線板の製造方法、集光型太陽光発電モジュール、及び、発光モジュール
WO2020061550A1 (en) 2018-09-21 2020-03-26 Aufbau Medical Innovations Limited Compositions and methods for glaucoma
CN109161576B (zh) * 2018-09-26 2020-08-07 武汉中科光谷绿色生物技术有限公司 促进枯草芽孢杆菌发酵生产n-乙酰神经氨酸的方法
JPWO2021100642A1 (ru) * 2019-11-21 2021-05-27
IT201900024580A1 (it) 2019-12-18 2021-06-18 Consiglio Nazionale Ricerche Vescicole extracellulari da microalghe
CN111363045B (zh) * 2020-02-18 2021-12-17 厦门大学 一种流感、hiv嵌合蛋白及嵌合病毒疫苗的制备方法
CN111621471B (zh) * 2020-06-12 2022-03-11 成都世联康健生物科技有限公司 一种软组织胞外囊泡的提取方法及应用
JP2022028997A (ja) * 2020-07-31 2022-02-17 株式会社三洋物産 遊技機
CN112452506A (zh) * 2020-11-06 2021-03-09 五原县沃丰生物科技有限责任公司 一种培养基粉末的生产方法
US11175293B1 (en) 2021-01-04 2021-11-16 University Of Utah Research Foundation Rapid assay for detection of SARS-CoV-2 antibodies
US20240287443A1 (en) * 2021-06-24 2024-08-29 Reliance Industries Limited Recombinant algae and production of spider silk protein from the recombinant algae
CN113698451B (zh) * 2021-08-02 2023-04-11 广东海洋大学 一种微藻多肽及其制备方法和应用
IL312502A (en) 2021-11-05 2024-07-01 Sanofi Sa Hybrid multivalent influenza vaccines containing hemagglutinin and neuraminidase and methods of using them
KR20240105412A (ko) 2021-11-05 2024-07-05 사노피 파스퇴르 인크 재조합 헤마글루티닌과 뉴라미니다제를 포함하는 다가 인플루엔자 백신 및 이의 사용 방법
EP4440608A1 (en) 2021-11-30 2024-10-09 Sanofi Pasteur Inc. Human metapneumovirus vaccines
WO2023232976A1 (en) * 2022-06-03 2023-12-07 Ags Therapeutics Sas Extracellular vesicles from genetically-modified microalgae containing endogenously-loaded cargo, their preparation, and uses
WO2023242605A1 (en) 2022-06-14 2023-12-21 Támogatott Kutatócsoportok Irodája Extracellular vesicles for use in therapy
CN115992052A (zh) * 2022-11-18 2023-04-21 暨南大学 一种微藻类外泌体、其制备方法和应用

Family Cites Families (45)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4659669A (en) * 1981-03-02 1987-04-21 Regents Of The Univ. Of California Microbial expression of human influenza hemagglutinin proteins
US4537769A (en) * 1982-04-06 1985-08-27 American Cyanamid Company Stabilization of influenza virus vaccine
US4752473A (en) * 1984-10-12 1988-06-21 The Regents Of The University Of California Expression of glycosylated human influenza hemagglutinin proteins
US5340742A (en) 1988-09-07 1994-08-23 Omegatech Inc. Process for growing thraustochytrium and schizochytrium using non-chloride salts to produce a microfloral biomass having omega-3-highly unsaturated fatty acids
US5762939A (en) * 1993-09-13 1998-06-09 Mg-Pmc, Llc Method for producing influenza hemagglutinin multivalent vaccines using baculovirus
CA2180965C (en) * 1994-01-11 2010-05-11 Tom Maria Deroo Influenza vaccine
US5824309A (en) * 1995-12-05 1998-10-20 University Of Massachusetts Recombinant gas vesicles and uses thereof
US8003772B2 (en) 1999-01-14 2011-08-23 Martek Biosciences Corporation Chimeric PUFA polyketide synthase systems and uses thereof
KR20000075076A (ko) * 1999-05-28 2000-12-15 최태진 형질전환된 미세조류를 이용하여 외래 단백질을 생산하는 방법
EP1294892B1 (en) * 2000-06-23 2007-10-17 Wyeth Holdings Corporation Assembly of wild-type and chimeric influenza virus-like particles (vlps)
US7795002B2 (en) 2000-06-28 2010-09-14 Glycofi, Inc. Production of galactosylated glycoproteins in lower eukaryotes
PT1522590E (pt) 2000-06-28 2009-10-26 Glycofi Inc Métodos para a produção de glicoproteínas modificadas
US7625756B2 (en) 2000-06-28 2009-12-01 GycoFi, Inc. Expression of class 2 mannosidase and class III mannosidase in lower eukaryotic cells
US20060029604A1 (en) 2000-06-28 2006-02-09 Gerngross Tillman U Immunoglobulins comprising predominantly a GlcNAc2Man3GlcNAc2 glycoform
US20060257399A1 (en) 2000-06-28 2006-11-16 Glycofi, Inc. Immunoglobulins comprising predominantly a Man5GIcNAc2 glycoform
TWI377253B (en) * 2001-04-16 2012-11-21 Martek Biosciences Corp Product and process for transformation of thraustochytriales microorganisms
AU2007249124B2 (en) * 2001-04-16 2012-05-17 Dsm Ip Assets B.V. Product and process for transformation of thraustochytriales microorganisms
WO2003068933A2 (en) * 2002-02-14 2003-08-21 Novavax, Inc. Optimization of gene sequences of virus-like particles for expression in insect cells
US20060121447A1 (en) * 2002-04-12 2006-06-08 Ilaria Capua Purified subfragment codifying for neuroaminidase, recombinant neuroaminidase and its use in zooprophylaxis
US20060088909A1 (en) * 2002-05-17 2006-04-27 Compans Richard W Virus-like particles, methods of preparation, and immunogenic compositions
US7332299B2 (en) * 2003-02-20 2008-02-19 Glycofi, Inc. Endomannosidases in the modification of glycoproteins in eukaryotes
US20070026076A1 (en) * 2003-02-24 2007-02-01 Tzyy-Choou Wu Molecular vaccines employing nucleic acid encoding anti-apoptotic proteins
KR20060017635A (ko) * 2003-06-05 2006-02-24 와이어쓰 홀딩스 코포레이션 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 레플리콘 벡터 및파라믹소바이러스 단백질 항원을 포함하는 면역원성 조성물
CA2568015C (en) * 2004-05-25 2013-08-27 Medimmune Vaccines, Inc. Influenza hemagglutinin and neuraminidase variants
WO2006013572A2 (en) * 2004-08-05 2006-02-09 Ben Gurion University Of The Negev Research And Development Authority Red microalgae expressing exogenous polypeptides and methods of generating and utilizing same
CA2594040A1 (en) * 2005-01-06 2006-07-13 The Johns Hopkins University Rna interference that blocks expression of pro-apoptotic proteins potentiates immunity induced by dna and transfected dendritic cell vaccines
JP4796786B2 (ja) * 2005-04-28 2011-10-19 富士フイルム株式会社 ラビリンチュラ類を形質転換可能なベクター
JP4796787B2 (ja) * 2005-04-28 2011-10-19 富士フイルム株式会社 ラビリンチュラ類への遺伝子導入法
US9216212B2 (en) * 2005-08-05 2015-12-22 University Of Massachusetts Virus-like particles as vaccines for paramyxovirus
US20070042001A1 (en) * 2005-08-16 2007-02-22 Hawaii Biotech, Inc. Influenza recombinant subunit vaccine
CA2642644A1 (en) * 2006-02-16 2007-09-07 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Se Cretary, Department Of Health And Human Services Antiviral agents and vaccines against influenza
EP2476432B1 (en) * 2006-03-07 2015-08-19 Vaxinnate Corporation Compositions that include hemagglutinin, methods of making and methods of use thereof
US20070245431A1 (en) * 2006-03-15 2007-10-18 Martek Biosciences Corporation Polyunsaturated fatty acid production in heterologous organisms using pufa polyketide synthase systems
WO2007130327A2 (en) * 2006-05-01 2007-11-15 Technovax, Inc. Influenza virus-like particle (vlp) compositions
CA2657955A1 (en) * 2006-07-27 2008-08-07 Ligocyte Pharmaceuticals, Inc. Chimeric virus-like particles
WO2008024844A2 (en) * 2006-08-22 2008-02-28 The Johns Hopkins University Anticancer combination therapies
CA2615372A1 (en) * 2007-07-13 2009-01-13 Marc-Andre D'aoust Influenza virus-like particles (vlps) comprising hemagglutinin
EP2238253B1 (en) * 2007-11-27 2012-09-12 Medicago Inc. Recombinant influenza virus-like particles (vlps) produced in transgenic plants expressing hemagglutinin
EP2090648A1 (en) * 2008-02-12 2009-08-19 Institut Francais de Recherche pour l'Exploitation de la Mere(Ifremer) Production of glycosylated polypeptides in microalgae
KR20090096890A (ko) * 2008-03-10 2009-09-15 전남대학교산학협력단 대장균에서 조류인플루엔자 바이러스의 뉴라미니다제 ｎ1을발현하기 위한 벡터 및 방법, 이의 사용방법, 및뉴라미니다제 저해제
FR2928926B1 (fr) * 2008-03-18 2015-08-21 Centre Nat Rech Scient Polynucleotides et polypeptides chimeriques permettant la secretion d'un polypeptide d'interet en association avec des exosomes et leur utilisation pour la production de compositions immunogenes
WO2009117502A2 (en) * 2008-03-19 2009-09-24 Hexion Specialty Chemicals, Inc Modifier for concrete and cement formulations and methods of preparing the same
JP2012520676A (ja) 2009-03-16 2012-09-10 マーテック バイオサイエンシーズ コーポレーション ラビリンチュラ菌門の微生物におけるタンパク質作製
IN2012DN06278A (ru) * 2009-12-28 2015-09-25 Dsm Ip Assets Bv
EP2519258B1 (en) * 2009-12-28 2017-07-26 Merial Ltd. Recombinant ndv antigen and uses thereof

Also Published As

Publication number Publication date
CA2785971A1 (en) 2011-07-28
JP2020096635A (ja) 2020-06-25
AU2019206054B2 (en) 2022-03-10
US20150110826A1 (en) 2015-04-23
JP2013515503A (ja) 2013-05-09
EP4130273B1 (en) 2024-06-12
AU2010343095B2 (en) 2017-01-05
JP6666950B2 (ja) 2020-03-18
EP2519635A1 (en) 2012-11-07
US20110189228A1 (en) 2011-08-04
EP2519635B1 (en) 2018-11-21
AU2010343095A1 (en) 2012-08-09
CA3028175A1 (en) 2011-07-28
IN2012DN06277A (ru) 2015-09-25
AU2017202195A1 (en) 2017-04-20
AU2022203980A1 (en) 2022-06-30
JP5838496B2 (ja) 2016-01-06
EA201290567A1 (ru) 2013-02-28
CN102822343A (zh) 2012-12-12
EP4130273C0 (en) 2024-06-12
WO2011090731A1 (en) 2011-07-28
AU2019206054A1 (en) 2019-08-08
EP3505632B1 (en) 2022-08-03
JP6339548B2 (ja) 2018-06-06
AU2017202195B2 (en) 2019-04-18
EP4130273A1 (en) 2023-02-08
CA3153553A1 (en) 2011-07-28
US20200063174A1 (en) 2020-02-27
CA2785971C (en) 2019-02-12
EP2519635A4 (en) 2013-06-26
CN107746869A (zh) 2018-03-02
JP2023101420A (ja) 2023-07-20
CA3028175C (en) 2022-05-24
JP2018121660A (ja) 2018-08-09
EP3505632A1 (en) 2019-07-03
JP2016047055A (ja) 2016-04-07
CN102822343B (zh) 2017-10-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA022841B1 (ru) Получение гетерологичных полипептидов в микроводорослях, внеклеточные микроводорослевые тельца, композиции и способы их получения и применения
JP5838473B2 (ja) 微細藻類におけるヘマグルチニン−ノイラミニダーゼタンパク質の産生方法
CN113845576B (zh) 重组猫疱疹病毒1型gB-gD蛋白及其应用
CN106636015B (zh) 一种嵌合型新城疫病毒样颗粒的制备方法
EP3420076B1 (en) Methods of producing and characterizing virus vaccine and virus vaccine composition
RU2445357C1 (ru) Рекомбинантный штамм дрожжей pichia angusta - продуцент капсидного белка l1 вируса папилломы человека типа 16
KR102400570B1 (ko) 톡소포자충 정점막 항원 1을 포함하는 바이러스-유사입자 및 이를 이용한 백신
CN112094354B (zh) 副鸡禽杆菌基因工程亚单位疫苗、其制备方法及应用
KR102402971B1 (ko) 말라리아 원충의 메로조이트 표면 단백질-9을 포함하는 바이러스-유사입자 및 이를 이용한 백신
RU2676160C1 (ru) Рекомбинантный штамм дрожжей Hansenula polymorpha - продуцент главного капсидного белка L1 вируса папилломы человека типа 11
RU2546240C1 (ru) РЕКОМБИНАНТНЫЙ ШТАММ ДРОЖЖЕЙ Hansenula polymorpha - ПРОДУЦЕНТ ГЛАВНОГО КАПСИДНОГО БЕЛКА L1 ВИРУСА ПАПИЛЛОМЫ ЧЕЛОВЕКА ТИПА 56
KR102536927B1 (ko) 말라리아 원충의 메로조이트 표면 단백질-8을 포함하는 바이러스-유사입자 및 이를 이용한 백신
KR102568329B1 (ko) 조류인플루엔자 뉴라미니다아제를 포함하는 바이러스-유사입자 및 이를 이용한 범용 백신
JP5838496B6 (ja) 微細藻類における異種ポリペプチド、微細藻類細胞外体、組成物の産生、ならびにそれらの作製および使用の方法
RU2445358C1 (ru) Рекомбинантный штамм дрожжей pichia angusta - продуцент капсидного белка l1 вируса папилломы человека типа 18
CN118812671A (zh) 一种氨基酸序列、自复制mRNA序列及一种狂犬病毒saRNA疫苗