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KR20060017635A - 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 레플리콘 벡터 및파라믹소바이러스 단백질 항원을 포함하는 면역원성 조성물 - Google Patents

베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 레플리콘 벡터 및파라믹소바이러스 단백질 항원을 포함하는 면역원성 조성물 Download PDF

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KR20060017635A
KR20060017635A KR1020057023359A KR20057023359A KR20060017635A KR 20060017635 A KR20060017635 A KR 20060017635A KR 1020057023359 A KR1020057023359 A KR 1020057023359A KR 20057023359 A KR20057023359 A KR 20057023359A KR 20060017635 A KR20060017635 A KR 20060017635A
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equine encephalitis
encephalitis virus
venezuelan equine
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KR1020057023359A
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제랄드 라울 코바크스
샤오양 모
니콜라오스 바실라키스
산지타 바르가바
티모시 조셉 잠브
스티븐 알렉산더 우뎀
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와이어쓰 홀딩스 코포레이션
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Abstract

자가 증식하는 융합 수포(fusogenic bleb)는 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 레플리콘 입자(VRP)의 집단으로 감염된 세포로부터 생산된다. 당해 수포의 자가 증식하는 융합 특성은 복제 결함 레플리콘 입자내로 혼입된 바이러스 융합 단백질을 암호화하는 이종 유전자의 발현으로부터 기원한다. 수득되는 수포는 심각한 세포병변 효과를 나타내는 세포의 상청액으로부터 수거할 수 있다. 당해 수포는 면역원성 조성물의 제조 및 파라인플루엔자 제3형과 같은 파라믹소바이러스에 대해 포유동물을 면역화시키는 각종 방법에 사용할 수 있다.
자가 증식하는 융합 수포, 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 레플리콘 입자, 파라인플루엔자 바이러스, 파라믹소바이러스, 면역원성 조성물.

Description

베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 레플리콘 벡터 및 파라믹소바이러스 단백질 항원을 포함하는 면역원성 조성물{Immunogenic compositions comprising Venezuelan Equine Encephalitis virus replicon vectors and paramyxovirus protein antigens}
본 발명은 파라인플루엔자 바이러스 제3형과 같은 파라믹소바이러스에 의해 유발된 감염성 질병을 치료 또는 예방하기 위한 면역원성 조성물의 분야에 관한 것이다. 본 발명은 또한 재조합 DNA 및 숙주 세포내에서 외래 유전자를 발현시키는 방법의 분야에 관한 것이다.
파라믹소바이러스는 막이 극도로 감염성이고, 유행성이며 질병을 유발할 수 있는 외피보유, 네가티브-센스의, 비-분절화된 일본쇄 RNA 바이러스이다. 예로는 풍진 바이러스, 볼거리 바이러스, 호흡기 합포체 바이러스 및 파라인플루엔자 바이러스가 포함된다. 풍진 바이러스와 같은 파라믹소바이러스를 근절하기 위한 노력으로 세계 보건 기구(World Health Organization: WHO)에 의해 집중된 노력이 이루어지고 있다. 뉴캐슬병 바이러스와 같은 기타 파라믹소바이러스는 농장 동물 집단 에 피해를 주고 있다.
미국에서, 호흡기 합포체 바이러스(RSV) 및 파라인플루엔자 바이러스(PIV) 제1형, 제2형, 제3형 및 제4형은 어린이 및 성인에서 호흡기병에 대한 병원치료의 주요 원인이다. 예를 들어, RSV 및 PIV는 함께 어린이에 있어 세기관지염 및 후두염의 원인의 대부분을 차지한다. 유사하게, RSV 및 PIV는 어린이에 있어 폐렴 및 독감-유사 병의 경우의 거의 반을 차지한다. 또한, 이들 바이러스 둘다는 에어로졸 소적을 통해 전달될 수 있으므로 원내 감염에 관여한다.
사람 건강 및 세계 경제에 대한 RSV 및 PIV의 영향을 완화시키기위한 시도는 30년 이상 동안 거의 성공을 이루지 못한채 이루어지고 있다. 예를 들어, RSV에 있어서의 백신 개발은 포르말린 불활성화시킨 전 바이러스(whole virus) RSV 백신의 사용시 불만족스러운 결과로 인해 초기에 장애가 되었다. 이러한 사건에서, 포르말린으로 불활성화시킨 전 바이러스로 면역화된 사람은 면역화이후 몇가지 심각한 질병에 직면하였다[참조: Kim et al., Am. J. Epidermiol. 89:422-434(1969)]. 효율적인 포름알데하이드로 불활성화시킨 PIV 및 RSV 백신을 제조하기 위한 앞서의 시도는 감염에 대한 적절한 보호를 제공하는데 실패하였다[참조: Clin, J., et al., Am. J. Epidemiol. 89:449-463(1969)].
현재 2개의 약독화된 생 백신 후보물인, PIV3(JS 균주)의 냉-계대배양된 유도체(cp45) 및 소 파라인플루엔자 바이러스 제3형이 임상 평가중에 있다[참조: Jones, T., Current Opinion in Investigational Drugs, 2(7):890-892 (2001)]. 그 결과, cp45는 유망한 PIV3 백신으로 고려되고 있다.
RSV 및 PIV 연구의 다른 중요한 측면은 노인 또는 폐렴 및 하부 호흡기 감염과 같은 의학 상태에 있는 사람에게서 질병 합병증을 예방하는 것에 있다. 이와 관련하여, 영향받는 환자 집단에 투여하기 위한 벡터에 기초하는 정제된 단백질 항원을 개발하기 위한 시도가 있어왔다[참조: Crowe, J. E., et al. Virus Genes 13(3): 26-273 (1996)].
각종의 벡터가 파라믹소비리다애(Paramyxoviridae) 과 바이러스의 이종 유전자를 혼입시키고 발현시키는 능력에 대해 시험되어 왔다. 이들은 예를 들면, 야생형 백시니아 또는 약독화된 변형된 안카라 백시니아(MVA)[참조: Durbin et al., Vaccine 16: 1234-1330 (1998); Elango, N., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 1906-1910 (1986)] 복제 적격 사람 아데노바이러스 벡터[참조: Mittal S. K., et al., Intervirology 41 (6): 253-260 (1998)], 베시큘라 스토마티티스 바이러스(VSV) [참조: Kahn S. J., J. Virol 75 (22): 11079-87 (2001)], 셈리키 포레스트 바이러스(SFV)[참조: Peroulis, l., et al., Archives of Virology, 144: 107-116 (1999)], PIV1/2 또는 풍진 바이러스 게놈을 지닌 강력한 벡터로서 사람 PIV3 자체[참조: Skiadopoulos M. H., et al. Virology 29(1) : 136-152 (2002)] 및 사람 PIV3 게놈을 지닌 소 PIV3[참조: Haller A. A., et al. J. Virology 74 (24): 11626-35 (2000)]를 포함한다. 모든 상기 벡터를 사용한 전임상 연구는 상응하는 병원체에 대한 유망한 보호 효능을 나타내었다.
RSV 및 PIV 질병의 유병율 및 중증도와 백신을 제조하기 위한 다수의 선행 시도에도 불구하고, 이들 감염을 예방하기 위한 면역원성 조성물은 현재 존재하지 않는다. 따라서, RSV, PIV 및 기타 파마믹소바이러스에 대한 보호 면역을 유발하는 방법 및 면역원성 조성물이 요구되고 있다.
발명의 요약
본 발명은 RSV 및 PIV와 같은 파라믹소바이러스에 대해 포유동물을 면역화시키기 위한 면역원성 조성물에 관한 것이다. 더욱 특히, 본 발명은 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 레플리카제 유전자, 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 레플리카제 단백질, 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 E1 당단백질, 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 E2 당단백질, 파라인플루엔자 바이러스 제3형 F 당단백질 유전자 및 파라인플루엔자 바이러스 제3형 HN 당단백질 유전자를 포함하는 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 레플리콘 입자(VRP)의 집단을 포함하는 면역원성 조성물에 관한 것이다. 특정의 양태에서, 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 레플리콘 입자는 BHK 배양된 세포의 단층을 감염시키는데 사용하는 경우, 세포병변 효과를 유발한다. 다른 양태에서, 레플리콘 입자로 감염된 세포로부터의 상청액은, 감염되지 않은 세포 단층으로 이전되는 경우 레플리콘 입자의 부재하에서 세포병변 효과를 유발한다. 특정 양태에서, BHK 배양된 세포에서의 세포병변 효과는 합포체 형성, 단층 파열 또는 아폽토시스(apoptosis)이다. 추가의 다른 양태에서, 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 레플리콘 입자(VRP)의 집단은 검출가능한 복제 적격 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스를 함유하지 않는다. 하나의 양태에서, 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 레플리콘 입자는 포유동물 숙주에서 보호성 면역 반응을 유발한다. 특정의 양태에서, 보호성 면역 반응 은 포유동물 숙주에서 파라인플루엔자 바이러스 제3형에 의한 하부 호흡기도의 감염을 예방한다. 다른 양태에서, 보호성 면역 반응은 포유동물 숙주에서 파라인플루엔자 바이러스 제3형에 의한 상부 호흡기도의 감염의 중증도를 경감시킨다. 특정 양태에서, 면역원성 조성물은 또한 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 보조제를 함유한다.
하나의 양태에서, 본 발명은 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 레플리카제 유전자, 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 레플리카제 단백질, 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 E1 당단백질, 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 E2 당단백질을 포함하는 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 레플리콘 입자(VRP), 및 하나 이상의 파라믹소바이러스 당단백질 유전자를 포함하는 면역원성 조성물을 제공한다. 특정 양태에서, 파라믹소바이러스는 파라인플루엔자 바이러스 제1형, 파라인플루엔자 바이러스 제2형, 파라인플루엔자 바이러스 제3형, 파라인플루엔자 바이러스 제4형 및 호흡기 합포체 바이러스로 이루어진 그룹 중에서 선택된다. 다른 양태에서, 파라믹소바이러스 당단백질은 파라인플루엔자 바이러스 제1형 HN, 파라인플루엔자 바이러스 제1형 F, 파라인플루엔자 바이러스 제2형 HN, 파라인플루엔자 바이러스 제2형 F, 파라인플루엔자바이러스 제3형 HN, 파라인플루엔자 바이러스 제3형 F, 파라인플루엔자 바이러스 제4형 HN, 파라인플루엔자 바이러스 제4형 F로 이루어진 그룹 중에서 선택된다. 여전히 다른 양태에서, 특정의 파라인플루엔자 바이러스에 대한 HN 및 F 당단백질 둘다는 결합되어 있고, 파라인플루엔자 바이러스 제1형 F 당단백질 유전자 및 파라인플루엔자 바이러스 제1형 HN 당단백질 유전자; 파라인플루엔자 바이러스 제2형 F 당단 백질 유전자 및 파라인플루엔자 바이러스 제2형 HN 당단백질 유전자; 파라인플루엔자 바이러스 제3형 F 당단백질 유전자 및 파라인플루엔자 바이러스 제3형 HN 당단백질 유전자; 및 파라인플루엔자 바이러스 제4형 F 당단백질 유전자 및 파라인플루엔자 바이러스 제4형 HN 당단백질 유전자로 이루어진 그룹 중에서 선택된다. 다른 양태에서, 파라믹소바이러스는 호흡기 합포체 바이러스이며 당당백질은 호흡기 합포체 바이러스 부착(G) 당단백질 및/또는 호흡기 합포체바이러스 융합(F) 당단백질이다. 본 발명의 하나의 양태에서, 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 레플리콘 입자는 BHK 배양된 세포의 단층을 감염시키는데 사용되는 경우 세포병변 효과를 유발한다. 다른 양태에서, 레플리콘 입자로 감염된 세포로부터의 상청액은 감염되지 않는 세포 단층으로 이전되는 경우 레플리콘 입자의 부재하에서 세포병변 효과를 유발한다. 본 발명의 특정 양태에서, 세포병변 효과는 합포체 형성, 단층 파열 및 아폽토시스로 이루어진 그룹 중에서 선택된다.
하나의 양태에서, 본 발명은 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 레플리카제, 파라인플루엔자 바이러스 제3형 F 당단백질, 및 파라인플루엔자 바이러스 제3형 HN 당단백질을 암호화하는 분리된 재조합 핵산 분자를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 레플리카제, 파라인플루엔자 바이러스 제3형 F 당단백질, 및 서열번호 4의 핵산 서열을 갖는 파라인플루엔자 바이러스 제3형 HN 당단백질을 암호화하는 분리된 재조합 핵산 분자를 제공한다. 다른 양태에서, 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 레플리카제, 파라인플루엔자 바이러스 제3형 F 당단백질 및 파라인플루엔자 바이러스 제3형 HN 당단백질은 서열번호 1의 핵산에 의해 암 호화된다. 특정 양태에서, 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 레플리카제, 파라인플루엔자 바이러스 제3형 F 당단백질 및 파라인플루엔자 바이러스 제3형 HN 당단백질은 서열번호 2, 서열번호 3 및 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함한다. 다른 양태에서, 면역원성 조성물은 또한 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 보조제를 포함한다.
하나의 양태에서, 본 발명은 면역학적 유효량의 (a) 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 레플리카제 유전자, 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 레플리카제 단백질, 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 E1 당단백질, 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 E2 당단백질 및 하나 이상의 파라믹소바이러스 당단백질 유전자를 포함하는 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 레플리콘 입자(VRP)의 집단을 포함하는 면역원성 조성물; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 면역 반응을 유발하기에 충분한 양으로 포유동물 피험체에게 투여함을 포함하여, 파라믹소바이러스에 의한 호흡기도의 감염에 대해 포유동물 피험체를 면역화시키는 방법을 제공한다. 특정의 양태에서, 파라믹소바이러스는 파라인플루엔자 바이러스 제3형이고, 당단백질은 파라인플루엔자 바이러스 제3형 헤마글루티닌-뉴라미니다제(HN) 당단백질 또는 파라인플루엔자 바이러스 제3형 융합(F) 당단백질이다. 다른 양태에서, 당단백질은 파라인플루엔자 바이러스 제3형 F 당단백질 및 HN 당단백질 둘다를 포함한다. 다른 양태에서, 레플리콘 입자로 감염된 세포로부터의 상청액은 감염되지 않은 세포 단층으로 이전되는 경우 레플리콘 입자의 부재하에 세포병변 효과를 유발한다. 특정 양태에서, BHK 배양된 세포에서 세포병변 효과는 합포체 형성, 단층 파열 또는 아폽토시스이다. 특정의 양태에서, 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 레플리콘 입자(VRP)의 집단은 검출가능한 복제 적격 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스를 함유하지 않는다. 다른 양태에서, 파라믹소바이러스는 호흡기 합포체 바이러스이며 당단백질은 호흡기 합포체 바이러스 부착(G) 당단백질 또는 호흡기 합포체 바이러스 융합(F) 당단백질이다. 다른 양태에서, 당단백질은 호흡기 합포체 바이러스 G 당단백질 및 F 당단백질 둘다를 포함한다. 특정 양태에서, 감염은 하부 호흡기도내에서 발생한다. 다른 양태에서, 감염은 상부 호흡기도내에서 발생한다.
본 발명은 또한 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 레플리카제 유전자, 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 레플리카제 단백질, 파라인플루엔자 바이러스 제3형 F 당단백질 유전자, 파라인플루엔자 바이러스 제3형 F 당단백질, 파라인플루엔자 바이러스 제3형 HN 당단백질 유전자 및 파라인플루엔자 바이러스 제3형 HN 당단백질을 포함하는 자가-증식하는 수포의 집단을 포함하는 면역원성 조성물을 제공한다. 특정 양태에서, 수포는 융합성(fusogenic)이다. 다른 양태에서, 자가-증식하는 수포는 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 레플리카제 유전자, 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 레플리카제 단백질, 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 E1 당단백질, 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 E2 당단백질, 파라인플루엔자 바이러스 F 당단백질 유전자 및 파라인플루엔자 바이러스 HN 당단백질 유전자를 포함하는, 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 레플리콘 입자(VRP)의 집단으로 감염된 세포 상청액으로부터 수득된다. 다른 양태에서, 자가-증식하는 수포는 BHK 배양된 세포의 단층을 감염시키는데 사용되는 경우 세포병변 효과를 유발한다. 더욱 특히, 자가-증식하는 수포로 감염된 세포로부터 의 상청액은, 단일감염된 세포 단층에 이전되는 경우 레플리콘 입자의 부재하에서 세포병변 효과를 유발한다. 본 발명의 특정 양태에서, 수포는 BHK 배양된 세포에서 다음 세포병변 효과 중 하나 이상을 유발한다: 합포체 형성, 단층 파열 및 아폽토시스. 다른 양태에서, 수포 집단은 검출가능한 복제 적격 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스를 함유하지 않는다. 특정 양태에서, 자가-증식하는 수포는 포유동물 숙주에서 보호성 면역 반응을 유발한다. 특정 양태에서, 보호성 면역 반응은 포유동물 숙주에서 파라인플루엔자 바이러스 제3형에 의해 감염된 하부 호흡기도의 감염을 예방한다. 다른 양태에서, 보호성 면역 반응은 포유동물 숙주에서 파라인플루엔자 바이러스 제3형에 의한 상부 호흡기도내 감염을 예방하고 이러한 감염의 중증도를 경감시킨다.
본 발명의 양태는 파라믹소바이러스에 의한 감염에 대해 포유동물 피험체를 면역화시키는 방법을 제공한다. 예를 들어, 한가지 이러한 방법은 (a) 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 레플리카제 유전자, 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 레플리카제 단백질, 하나 이상의 파라믹소바이러스 당단백질 유전자 및 하나 이상의 파라믹소바이러스 당단백질, (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 자가-증식하는 수포의 집단을 포함하는 면역원성 조성물의 면역학적 유효량을 피험체에게 투여하는 방법을 포함하며, 당해 면역원성 조성물은 면역 반응을 유발하기에 충분한 양으로 투여된다. 특정 양태에서, 자가 증식하는 수포는 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 레플리카제 유전자, 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 레플리카제 단백질, 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 E1 당단백질, 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 E2 당단백질 및 하나 이 상의 파라믹소바이러스 당단백질 유전자를 포함하는, 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 레플리콘 입자(VRP)의 집단으로 감염된 세포의 상청액으로 부터 입수한다. 특정의 양태에서, 파라믹소바이러스는 파라인플루엔자 바이러스 제1형, 파라인플루엔자 바이러스 제2형, 파라인플루엔자 바이러스 제3형, 파라인플루엔자 바이러스 제4형 및 호흡기 합포체 바이러스로 이루어진 그룹 중에서 선택된다. 다른 양태에서, 파라믹소바이러스 당단백질은 파라인플루엔자 바이러스 제1형 HN, 파라인플루엔자 바이러스 제1형 F, 파라인플루엔자 바이러스 제2형 HN, 파라인플루엔자 바이러스 제2형 F, 파라인플루엔자 바이러스 제3형 HN, 파라인플루엔자 바이러스 제3형 F, 파라인플루엔자 바이러스 제4형 HN, 파라인플루엔자 바이러스 제4형 F로 이루어진 그룹 중에서 선택된다. 특정 양태에서, 특정 파라인플루엔자 바이러스에 대한 HN 및 F 당단백질 둘다는 결합되어 있고 파라인플루엔자 바이러스 제1형 F 당단백질 유전자 및 파라인플루엔자 바이러스 제1형 HN 당단백질 유전자; 파라인플루엔자 바이러스 제2형 F 당단백질 유전자 및 파라인플루엔자 바이러스 제2형 HN 당단백질 유전자; 파라인플루엔자 바이러스 제3형 F 당단백질 유전자 및 파라인플루엔자 바이러스 제3형 HN 당단백질 유전자; 및 파라인플루엔자 바이러스 제4형 F 당단백질 유전자 및 파라인플루엔자 바이러스 제4형 HN 당단백질 유전자로 이루어진 그룹 중에서 선택된다. 다른 양태에서, 파라믹소바이러스는 호흡기 합포체 바이러스이며 당단백질은 호흡기 합포체 바이러스 부착(G) 당단백질 및/또는 호흡기 합포체 바이러스 융합(F) 당단백질이다. 다른 양태에서, 수포는 융합성이다. 본 발명의 하나의 양태에서, 수포는 BHK 배양된 세포의 단층을 감염시키는데 사용되는 경우 세포병변 효 과를 유발한다. 다른 양태에서, 수포로 감염된 세포로부터의 상청액은 감염되지 않는 세포 단층으로 이전되는 경우, 레플리콘 입자의 부재하에서 세포병변 효과를 유발한다. 본 발명의 특정 양태에서, 세포병변 효과는 합포체 형성, 단층 파열 및 아폽토시스로 이루어진 그룹 중에서 선택된다.
대안적 양태에서, 자가 증식하는 융합 수포를 포함하는 면역원성 조성물은 또한 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 다른 양태에서, 자가 증식하는 융합 수포를 포함하는 면역원성 조성물을 또한 보조제를 포함한다.
본 발명은 또한 면역학적 유효량의 (a) 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 레플리카제 유전자, 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 레플리카제 단백질, 파라인플루엔자 바이러스 F 당단백질 유전자, 파라인플루엔자 바이러스 F 당단백질, 파라인플루엔자 바이러스 HN 당단백질 유전자 및 파라인플루엔자 바이러스 HN 당단백질을 포함하는 자가-증식하는 수포의 집단을 포함하는 면역원성 조성물; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 면역 반응을 유발하기에 충분한 양으로 포유동물 피험체에게 투여함을 포함하여, 파라믹소바이러스에 의한 호흡기도의 감염에 대해 포유동물 피험체를 면역화시키는 방법을 제공한다. 하나의 양태에서, 자가-증식하는 수포는 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 레플리카제 유전자, 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 레플리카제 단백질, 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 E1 당단백질, 베네뷰엘라 말 뇌염 바이러스 E2 당단백질, 파라인플루엔자 바이러스 F 당단백질 유전자, 파라인플루엔자 바이러스 HN 당단백질 유전자를 포함하는 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 레플리콘 입자(VRP)의 집단으로 감염된 세포의 상청액으로부터 입수한다. 특정 양태에서, 당해 집단은 검출가능한 복제 적격 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스를 함유하지 않으며 자가 증식하는 수포로 감염된 세포로부터의 상청액은, 감염되지 않은 세포 단층으로 이전되는 경우, 레플리콘 입자의 부재하에서 세포병변 효과를 유발한다. 다른 양태에서, 파라인플루엔자 바이러스는 파라인플루엔자 바이러스 제1형, 파라인플루엔자 바이러스 제2형, 파라인플루엔자 바이러스 제3형 및 파라인플루엔자 바이러스 제4형으로 이루어진 그룹 중에서 선택된다. 다른 양태에서, HN 당단백질은 파라인플루엔자 바이러스 제3형 헤마글루티닌-뉴라미니다제(HN) 당단백질이고 F 당단백질은 파라인플루엔자 바이러스 제3형 융합(F) 당단백질이다. 특정 양태에서, 당단백질은 파라인플루엔자 바이러스 제3형 F 당단백질 및 HN 당단백질 둘다를 포함한다.
하나의 양태에서, 본 발명은 면역학적 유효량의 (a) 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 레플리카제 유전자, 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 레플리카제 단백질, 파라인플루엔자 제3형 F 당단백질 유전자, 파라인플루엔자 바이러스 제3형 F 당단백질, 파라인플루엔자 바이러스 제3형 HN 당단백질 유전자 및 파라인플루엔자 바이러스 제3형 HN 당단백질을 포함하는 자가 증식하는 수포의 집단을 포함하는 면역원성 조성물; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 면역 반응을 유발하기에 충분한 양으로 포유동물 피험체에게 투여함을 포함하여, 파라인플루엔자 바이러스 제3형에 의한 감염에 대해 포유동물 피험체를 면역화시키는 방법을 제공한다. 다른 양태에서, 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 레플리카제 단백질, 파라인플루엔자 바이러스 제3형 F 당단백질 및 파라인플루엔자 바이러스 제3형 HN 당단백질은 서열번호 2, 서 열번호 3 및 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는다. 특정 양태에서, 자가-증식하는 수포는 면역 반응을 유발하기에 충분한 양의 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 레플리카제 유전자, 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 레플리카제 단백질, 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 E1 당단백질, 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 E2 당단백질, 파라인플루엔자 제3형 F 당단백질 유전자, 파라인플루엔자 바이러스 제3형 HN 당단백질 유전자를 포함하는 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 레플리콘 입자(VRP)의 집단으로 감염된 세포의 상청액으로부터 수득된다. 다른 양태에서, 상기 집단은 검출가능한 복제 적격 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스를 함유하지 않는다. 특정 양태에서, 자가 증식하는 수포로 감염된 세포로부터의 상청액은 감염되지 않은 세포 단층에 이전되는 경우 레플리콘 입자의 부재하에서 세포병변 효과를 유발한다.
도 1은 VEE 레플리카제 유전자, PIV3 F 유전자 및 PIV3 HN 유전자를 나타내는 VRP-F/HN 레플리콘 플라스미드를 묘사한 것이다.
알파바이러스는 생체내 및 생체외 사용을 위해 포유동물 및 곤충 세포 유전자 전달 시스템으로서 유전적으로 조작되어 왔다. 알파바이러스 게놈은 2개의 영역인, 5' 비구조 단백질(NSP) 유전자에 이어 구조 유전자의 전사를 조절하는 아게놈성 프로모터로 나눠어진 단일의 포지티브-센스 RNA로 이루어진다. NSP 유전자는, 바이러스 코어가 세포질내로 방출된 직후 해독된다. NSP 복합체는 완전한 길이의 항게놈 및 게놈을 합성하기 위한 레플리카제로서, 및 구조 유전자를 암호화하는 아게놈성 전사체를 합성하는 트랜스크립타제로서 작용한다. 예시적인 알파바이러스는 베네쥬엘라 말 뇌염(VEE) 바이러스, 신드비스 바이러스 및 세밀리키 포레스트 바이러스(Semiliki Forest virus)를 포함한다.
알파바이러스의 복제는 구조 유전자와는 독립적이며; 따라서, 이들은 제거될 수 있고 외래 유전자가 이들의 위치로 도입될 수 있다. 이러한 재조합 RNA의 세포내로의 도입은 외래 유전자 산물의 1회 복제 및 발현을 초래한다. 그 자체로서, 이들 게놈은 "자살" 벡터 또는 "레플리콘"으로 불린다. 알파바이러스 벡터를 사용하여 외래 유전자를 전달하는 것의 두가지 주요 장점은 1) 높은 수준의 발현이 달성된다는 것, 및 2) 면역 시스템을 변경시키고 강인한 면역 반응을 유발하는 "위험(danger)" 신호를 초래하는, 감염된 세포의 아폽토시스(또는 프로그램된 세포 사멸)이다.
레플리콘 벡터는 cDNA로서 진핵세포 pol II 프로모터계 플라스미드 전달 비히클내로 혼입되거나, 달리는 감염성 바이러스유사 레플리콘 입자내로 패키지된 나상(naked) RNA의 형태로 사용될 수 있다. 레플리콘 벡터의 효과적인 전달로 활발한 외래 유전자 발현 및 프로그램된 세포 사멸이 초래된다. 모든 예에서, 벡터는, 생 바이러스와는 달리, 단지 1회의 복제만을 수행하며 세포로부터 세포로의 확산이 중지된다.
레플리콘 시스템은, 전문이 본원에 참고자료로서 인용된, 엔. 엘. 데이비스(N. L. Davis) 등에게 허여된 "베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 및 이의 약독화된 돌연변이체"란 명칭의 미국 특허 제5,185,440호; 알. 이. 존스톤(R.E.Johnston) 등에 허여된 "베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스에서 약독화된 돌연변이체"란 명칭의 미국 특허 제5,505,947호; 알. 이. 존스톤 등에 허여된 "알파바이러스 RNF 레플리콘 시스템"이란 명칭의 미국 특허 제6,156,558호; 및 알. 이. 존스톤 등에게 허여된 "알파바이러스 RNA 레플리콘 시스템"이란 명칭의 미국 특허 제6,531,135호에 상세히 기술되어 있다.
본 발명은 레플리콘 발현 벡터로 전달하기 위한 신규 방법을 기술하고 있다. 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스(VEE) 레플리콘 벡터는 파라믹소바이러스, 파라인플루엔자 바이러스 제3형(PIV3)의 헤마글루티닌(HN) 및 융합(F) 단백질을 동시 발현하도록 유전적으로 조작되었다. VEE 레플리콘 입자(VRP)의 특성화동안, 레플리콘에 대해 알려진 것과는 달리, 당해 시스템이 조직 배양물에서 VRP-F/HN 레플리콘 감염시 감염성 입자를 생성하는 것이 밝혀졌다. 이러한 감염성 입자는 1) PIV3 HN, F 및 VEE NSP 복합체를 발현하며, 2) 자가-증식할 수 있고, 3) 표면상에 HN 및 F 단백질을 함유하며, 4) 반복된 동결-해동 주기 전반에 걸쳐 안정하고, 5) 0.2㎛ 필터를 통해 여과가능한 이들의 크기 및 입자에 있어 이종이며, 6) 고도로 면역원성이고, 7) 시리안 햄스터(Syrian Hamster) 모델에서 PIV3 감염에 대해 효과적인 면역원성 조성물로서 사용될 수 있다. 본 발명은 하기에 상세히 기술한다.
당해 연구의 과정에서, PIV3 HN 및 F 유전자는 레플리콘 벡터내로 클로닝되었다. 수득되는 벡터(VRP-F/HN)는 고도로 면역원성이고 비강내 또는 근육내 경로에 의해 1x104 감염 단위(IU)의 낮은 투여량에서 PIV3 감염으로부터 햄스터를 보호하였다. VRP 패키징동안 HN 및 F의 공발현은 거대한 합포체를 형성하였고, 결과적으로 당해 특정 VRP의 역가가 패키징 반응당 1x105 VRP 이상에 이르지 못한 것으로 관측되었는데, 이 값은 다른 VRP 벡터보다 104-5 역가값 낮은 값이다.
감염성 또는 "자가 증식하는" 수포는 VRP-F/HN으로 세포를 감염시킴에 의해, 또는 세포를 VEE-F/HN 레플리콘 벡터 RNA 단독으로 형질감염시킴에 의해 생성시킬 수 있다. "감염성 수포" 또는 "자가 증식하는 수포"는 PIV3 HN 및 F 유전자 또는 다른 일부 바이러스 융합 단백질 또는 단백질들을 표면상에 지니거나 자가 증식할 수 있는 외막 융합 수포 또는 융합 입자를 말한다. 용어 "감염성 수포", "자가 증식하는 수포", 수포 및 "융합 입자"는 때때로 상호교환적으로 사용될 것이다. 수포는, 면역원성 조성물로서 투여되는 경우, 104 합포체 형성 단위(SFU)의 낮은 투여량에서 PIV3 감염에 대해 시리안 햄스터의 상부 및 하부 호흡기도를 보호할 수 있다. 이러한 전임상 연구는, 감염성 입자가 PIV3에 대한 면역원성 조성물로서 사용될 수 있음을 입증하였다.
본 발명은 몇가지 즉각적 용도를 갖는다. 첫째로, PIV3의 HN 및 F 유전자를 동시에 발현시키기 위한 VEE 레플리콘 입자의 용도이다. 둘째로 표면상에 PIV 또는 다른 융합 단백질/당단백질을 갖는 자가 증식하는 수포를 생성하기 위한 VEE 레플리콘 입자의 용도이다. 셋째로, 면역원으로서 융합성의 자가 증식하는 수포의 용도이다.
본 발명의 하나의 양태에서, HN 및 F 유전자의 동시-발현은 시리안 햄스터 모델에서 PIV3에 대해 면역을 생성하는데 있어 유전자 단독, 또는 개개의 발현후 배합 [HN + F]시 발현보다 더욱 효과적인 것으로 밝혀졌다. 이론에 얽메이는 것이 아니라, 당해 벡터의 면역원성은 F/HN 복합체의 발현 수준 및/또는 더욱 긴 반감기의 증진된 수준과 관련될 수 있다. 달리는, 감염된 세포로부터 방출된 융합성 입자 또는 수포는 발현 수명 및/또는 감염되는 세포의 수를 증가시킬 수 있다.
본 발명의 다른 양태에서, 표면상에 HN 및 F 단백질을 함유하는 융합성 입자 또는 수포는 또한 시리안 햄스터 모델에서 PIV3 감염에 대해 효과적인 면역원성 조성물이었다. 당해 시스템이 대량 생산에 적합하도록 하는, 대략 10 내지 100개의 수포가 시험관내 감염된 세포당 생산된다. 수포는 동결-해동 주기 전반에 걸쳐 안정하였다. 자가-증식하는 수포는 세포를 VRP-F/HN 또는 수포로 감염시키거나, 또는 VEE 레플리콘-F/HN RNA의 전기영동에 의해 생성될 수 있다.
본 발명의 하나의 특정 양태는 이종 병원체에 대해 보호를 부여할 수 있는 추가의 1개 또는 2개의 유전자를 포함한다. 융합성 입자가 자가 증식한다는 사실은 시험관내 생성된 면역원성 조성물 이상의 잇점을 제공한다. 예를 들어, 다른 바이러스(풍진, SV5 또는 HIV)로부터의 다른 융합성 단백질은 또한 PIV3 HN 및 F 대신에 사용될 수 있으므로 면역원성 조성물의 레퍼토리를 향상시킬 수 있다.
베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스(VEEV)로부터 기원한 레플리콘은 면역원성 조성물을 설계하기 위한 대체 벡터 시스템을 나타낸다. VEE 레플리콘은 각종의 동물 세포 유형을 감염시킬 수 있는 것으로 밝혀졌다. VEE 레플리콘은 바이러스 및 세균 항원의 항원 전달에 사용되어 왔으며[참조: Davis N. L., et al., J. Virology 70(6): 3781-3787 (1996); Lee J. S., et al., J. Infect. Dis., 185 (8): 1192-6 (2002)], 수지상 세포에 표적화함으로써 강력한 체액성 및 세포 매개된 면역을 성공적으로 유발한다[참조: MacDonald G. H., et al. J. Virology, 74(2): 914-922 (2000)].
VEE 레플리콘은 모 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스의 특정 특성을 이용한다. 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스(VEE)는 토가비리다애(Togaviridae)의 알파바이러스 속의 구성원이다. 바이러스 게놈은 5' 말단에서 메틸화된 캡(cap)으로 및 3' 말단에서 가변 길이의 폴리(A) 트랙으로 변형된 일본쇄의, 포지티브-센스 RNA이다. 단일의 바이러스 캡시드 단백질(c)을 함유하는 구조 서브유닛은 8면체 뉴클레오캡시드내 RNA 게놈과 연합된다. 비리온내에서, 캡시드는 각각 2개의 당단백질, E1 및 E2의 이종이량체 복합체로 이루어진, 전이막 단백질 스파이크의 규칙적인 배열로 덮힌 지질 외피로 둘러싸여 있다[참조: Pedersen, C. E. and Eddy, G. A. , J. Mol. Biol. 168 : 1-15 (1974)]. VEE 게놈의 구성 및 VEE 유전자 발현의 전체적인 방법은 원형 알파바이러스, 신드비스 바이러스 및 셈리키 포레스트 바이러스(Semliki Forest virus)의 것에 필적한다[참조: Schlesinger, S. and Schlesinger, M. J., The Togaviridae and Flaviviridae. Plenum Publishing Corp. , New York (1986)]. 예를 들어, VEE의 트리니다드 당나귀(Trinidad Donkey) 혈통의 부분 게놈 서열의 세부사항은, VEE 구조 단백질이 바이러스 게놈의 3' 1/3에 상응하는 25S 아게놈성 mRNA로부터 폴리단백질의 형태로 해독됨을 나타낸다[참조: Kinney et al., Virology 152: 400 (1986)]. 단백분해 과정은 성숙한 비리온에서 발견된 단백질을 생성한다. 알파바이러스 비구조 단백질 유전자는 NSP1, NSP2, NSP3 및 NSP4의 순서로 게놈의 5' 2/3에 위치한다. 당해 단백질은 다단백질 전구체로서 초기에 발현된 후 이들의 성숙한 형태로 단백분해적으로 프로세싱된다. 성숙한 비구조 단백질은 게놈 RNA의 복제 및 26S 아게놈성 mRNA의 합성에 요구된다.
VEE 게놈은 포지티브 센스 일본쇄 RNA 분자로 이루어진다. 이는 5'-캡 구조와 3'-폴리 A 구조를 지닌 약 11kb의 길이이다. 복제는 추가의 바이러스 게놈의 합성 및 아게놈성 mRNA의 전사에 주형으로서 사용되는, (-)-쇄 RNA 중간체를 통해 프로세싱된다. 유전자 전달을 위한 벡터로 사용되는 경우, 바이러스 RNA 복제에 중요하지 않은 바이러스 구조 단백질을 암호화하는 게놈의 3' 1/3은 결실되고 관심있는 항원을 암호화하는 유전자로 대체된다. 이러한 레플리콘의 패키징은 VEE 구조 단백질을 암호화하는 불완전한 헬퍼 RNA을 동시감염시킴에 의해 달성된다. 수득되는 레플리콘 입자는 관심대상 항원을 암호화하는 유전자를 포함하나, 더 이상 감염성 바이러스 입자를 생성하지 않는다. 그러나, 레플리콘은 다량의 이종 유전자 생성물을 직접 발현시킬 수 있으므로, 항원을 전달하기 위한 효과적인 도구로서 제공된다.
VEE 레플리콘이 파라믹소비리다애 과 바이러스에 대한 면역원성 조성물의 설계시 벡터로 사용될 수 있는지를 평가하기 위해, PIV3 바이러스를 파라믹소바이러스에 대한 면역원성 조성물에서 연구자용 실험 바이러스로서 광범위하에 사용되므로 선택하였다. PIV 및 RSV 소단위 백신의 개발은 개개 바이러스 단백질 자체의 항원성 및 면역원성의 완전한 이해 부족으로 인해 저지되어왔다. 예를 들어, PIV3 게놈은 다음의 비-구조 내부 단백질을 암호화하는 6개의 개방 판독 프레임(ORF)을 함유한다: 뉴클레오캡시드(NP), 매트릭스(M), 당단백질(P), 거대한 폴리머라제(L) 단백질 및 2개의 표면 당단백질, 헤마글루티닌 뉴로아미니다제(HN) 및 융합(F). ORF는 또한 RNA 편집 및 또한 해독 개시 각각으로 인해 발현되는 2개의 다른 단백질 C 및 V를 암호화한다. 제3 단백질 D도 가능하게 발현되지만, 당해 단백질의 작용은 현재 측정되지 않는다. 지금까지, PIV3 감염에 대한 보호시 이들 내부 단백질의 역활에 대해 매우 적은 정보만이 유용하다. PIV3의 NP와 약 85%의 동일성을 공유하는, PIV1의 핵단백질(NP)은 우세한 MHC 부류 I 결합 펩타이드를 암호화하며 매우 강력한 MHC 부류 I-제한된 반응을 유발하고 PIV1 감염으로부터 마우스를 보호할 수 있음이 밝혀졌다. 또한, HN 및 F는 HN에 대해 6개 이상의 중화 부위 및 F 단백질에 대해 8개의 중화 부위를 함유하는 2개의 주요 중화 항원이다.
HN은 내부 적혈구응집 및 뉴로아미다제 활성을 지닌 제II형 당단백질이다. HN은 세포에 대한 바이러스 부착을 매개하며 융합 과정을 촉진한다. 이는 시알산을 제거하여 바이러스 입자를 방출하고 응집을 방지한다. F 단백질은 제I형 당단백질이며 바이러스 침투 및 합포체 형성에 중요하다. Fo의 단백분해 분열은 소단위 F1 및 F2에 결합된 2개의 이황화물 결합을 생성하며 융합 활성에 필수적이다. 바이러스 표면상에서 HN 및 F의 동시 존재는 중요한 생물학적 결과를 지니는 것으로 여겨지며, 이는 F의 시험관내 융합 활성이 HN 단백질의 존재를 필요로 하기 때문이다. PIV3 소단위를 함유하는 면역원성 조성물에서 전임상 연구로 예방 항원으로서 HN 및 F를 사용하는 중요성에 있어서의 데이타가 수득되었다.
일반적으로, 파라인플루엔자 바이러스(PIV) 및 호흡기 합포체 바이러스(RS V)와 같은 파라믹소바이러스에 대한 면역원성 조성물의 설계는 하부 호흡기도(LRT)에서의 감염 예방에 대해 지시된다. 예를 들어, 보조제-보조의 정제되거나 벡터-발현된 PIV3 HN 단백질은 동물 모델에서 LRT에 대해 보호를 제공하는 반면, 정제되거나 벡터 발현된 F 단백질은 부분적 보호만을 제공하거나 보호를 제공하지 않는다. 재조합 HN 및 F의 배합 또는 키메라 단백질 F/HN을 사용한 시도는 LRT 감염에 대한 보호를 나타낸다. 연구들을 본원에 기술한 바와 같이 개시하여 HN 및 F 단백질을 동시 발현한 VRP를 작제하였다. 효과적인 VEE 계 PIV 소단위 면역원성 조성물이 이의 강력한 효능에 크게 기여할 수 있는 신규 특징과 함께 본원에 기술되어 있다.
본원에 사용된 것으로서, 용어 "감염성 수포", 또는 "자가 증식하는 수포" 또는 "수포"는 표면상에 PIV3 HN 및 F 유전자(또는 일부의 기타 바이러스 융합 단백질 또는 단백질들)을 가지며, 자가 증식할 수 있는 외막 융합 소포(fusogenic vesicle)를 말한다. 용어 "감염성 수포", "자가 증식하는 수포", 수포, 및 "융합 입자(fusogenic particle)"는 때때로 상호교환적으로 사용될 것이다. 자가 증식은 수포 표면에 융합 단백질을 통해 단백질이 기원하는 것이다. 그러나, 수포는 또한 레플리콘 RNA를 함유함으로써, 신규 세포와 융합시 당해 레플리콘 RNA가 전사되어 융합 단백질 또는 단백질들이 세포 표면에 발현되고 당해 과정이 다시 개시된다. 본 발명의 자가 증식하는 수포는 PIV3에 대해 면역원성 조성물로서 효과적인 것으로 밝혀졌다. 당해 시스템이 대량 생산에 적합하도록 하는 대략 10 내지 100개의 자가 증식하는 수포가 시험관내에서 감염 세포당 생성되었다. 자가 증식하는 수포는 동결-해동 주기를 통해 안정하였다. 자가 증식하는 수포는 VRP-F/HN 또는 융합 입자로 세포를 감염시키거나, 또는 VEE 레플리콘-F/HN RNA의 전기영동에 의해 생성되었다. 감염성 수포가 자가 증식한다는 사실은 시험관내 생성된 소단위 단백질에 잇점을 제공한다.
용어 "알파바이러스"는 당해 분야에서 자체의 통상의 의미를 가지며 동부 말 뇌염 바이러스(EEE), 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스(VEE), 서부 말 뇌염 바이러스(WEE), 신드비스 바이러스, 사우쓰 아프리카 아르보바이러스 86번, 셈리키, 포레스트 바이러스 등과 같은 각종의 알파바이러스를 포함한다[참조: 본원에 전문이 참조로 인용된, Field's Virology, 4th Edition, Chapter 30 : Alphaviruses pp. 917-962 by Griffin, D. E. , Publisher: Lippincott Williams & Wilkins, New York (2001)]. 본 발명에서 사용하기 위한 바람직한 알파바이러스 RNA 전사체는 VEE, 신드비스 바이러스 및 셈리키 포레스트 바이러스를 포함한다.
본 발명의 방법에 사용된 알파바이러스-허용성 세포는, 바이러스 RNA 전사체로 감염되는 경우, 바이러스 입자를 생성할 수 있는 세포이다. 알파바이러스는 광범위한 숙주 범위를 지닌다. 적합한 포유동물 숙주 세포는 베로 세포, 새끼 햄스터 신장(BHK) 세포, 닭 배아 섬유모(CEF) 세포 및 레수스 원숭이 신장 세포(LLC-MK2)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
VRP는 BHK-21 계열로부터의 세포에서 증식되었다. 당해 경우, BHK 세포는 CCL-10 클론으로부터 기원함으로써 쉐임(shame) 표현형 특성을 지니지 않을 수 있는 다른 BHK 클로날 집단으로부터 이들을 구별시켰다. 본원에 정의된 것으로서, 당해 세포는 BHK21 또는 단순히 BHK 세포로 언급될 수 있다.
본원에 사용된 것으로서 용어 "비구조적 단백질" 또는 "NSP"는 레플리콘의 폴리머라제 작용을 말한다. 예를 들어, 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스(VEE)에서, 폴리머라제 작용은 단일의 다단백질로서 해독된 NSP1, NSP2, NSP3 및 NSP4 단백질에 의해 제공된다. 비구조 단백질 유전자는 자가 복제를 위한 레플리콘 RNA의 일부로서 필요하다.
본원에 사용된 것으로서 어구 "구조 단백질" 또는 "알파바이러스 구조 단백질은 RNA 레플리콘의 복제에 필요하며 캡시드 단백질인 E1 당단백질 및 E2 당단백질을 포함하는 암호화된 단백질을 말한다. 본원에 기술된 것으로서, 알파바이러스의 구조 단백질은 하나 이상의 헬퍼 RNA(즉, 제1의 헬퍼 RNA 및 제2의 헬퍼 RNA)상에서 암호화된다. 또한, 하나 이상의 구조 단백질은 레플리콘 RNA로서 동일한 RNA분자상에서 암호화될 수 있는데, 단, 하나 이상의 구조 단백질을 암호화하는 영역이 레플리콘 RNA로부터 제거됨으로써, 레플리콘 및 수득되는 알파바이러스 입자는 복제-결함성이다. 본원에 사용된 것으로서, 용어 "결실된" 또는 "결실"은 표준 용도에 따라 분절이 작동불가능하거나 작용성이지 않도록 하기에 충분한 특정 절편의 일부를 결실시키거나 특정 핵산 절편 전체를 결실시키는 것을 의미한다[참조: 테민(Temin) 등에 허여된 미국 특허 제4,650,764호]. 본원에 사용된 것으로서, 용어 "복제-결함성"은, 레플리콘 RNA가 헬퍼 RNA의 부재하에 숙주 세포내에서 새로운 바이러스 입자를 형성할 수 없음을 의미한다. 레플리콘 RNA는, 레플리콘 RNA가 이로부터 결실되는 필요한 구조 단백질중 적어도 하나인, 복제에 필요한 알파바이러스 구조 단백질 모두를 암호화하지 않을 만큼 복제-결함성이다.
감염성의, 복제-결함성 알파바이러스 입자 발현용 헬퍼 세포는 위에서 기술한 바와 같은 RNA 세트를 포함한다. RNA 세트는 제1의 헬퍼 RNA 및 제2의 헬퍼 RNA를 포함한다. 제1의 헬퍼 RNA는 하나 이상의 알파바이러스 구조 단백질을 암호화하는 RNA를 포함하나 모든 알파바이러스 구조 단백질을 암호화하지 않는다. 달리 말해서, 제1 헬퍼 RNA는 하나 이상의 알파바이러스 구조 단백질을 암호화지 않는데, 즉 하나 이상의 비-암호화된 알파바이러스 구조 단백질이 제1의 헬퍼 RNA로부터 결실된다. 하나의 양태에서, 제1의 헬퍼 RNA는 알파바이러스 E1 당단백질을 암호화하는 RNA를 포함하고, 알파바이러스 E2 당단백질 및 알파바이러스 캡시드 단백질은 당해 제1의 헬퍼 RNA로부터 결실된다. 다른 양태에서, 제1의 헬퍼 RNA는 알파바이러스 E2 당단백질을 암호화하는 RNA를 포함하고, 알파바이러스 E1 당단백질과 알파바이러스 캡시드 단백질은 당해 제1의 헬퍼 RNA로부터 결실된다. 제3의 양태에서, 제1의 헬퍼 RNA는 알파바이러스 E1 당단백질 및 알파바이러스 E2 당단백질을 암호화하는 RNA를 포함하고, 알파바이러스 캡시드 단백질은 당해 제1의 헬퍼 RNA로부터 결실된다.
제2의 헬퍼 RNA는 제1의 헬퍼 RNA에 의해 암호화된 하나 이상의 구조 단백질과는 상이한 하나 이상의 알파바이러스 구조 단백질을 암호화하는 RNA를 포함한다. 즉, 제2의 헬퍼 RNA는 제1의 헬퍼 RNA에 의해 암호화된 하나 이상의 구조 단백질에 의해 암호화되지 않은 하나 이상의 알파바이러스 구조 단백질을 암호화한다. 제2의 헬퍼 RNA는 제1의 헬퍼 RNA에 의해 암호화된 하나 이상의 알파바이러스 구조 단백질을 암호화하지 않음으로써, 제1 및 제2 헬퍼 RNA는 이중체 구조 단백질을 암호화하지 않는다. 제2의 헬퍼 RNA는 제1의 헬퍼 RNA에 의해 암호화된 것과 상이한 구조 단백질을 암호화한다. 제1의 헬퍼 RNA가 단지 알파바이러스 E1 당단백질만을 암호화하는 RNA를 포함하는 양태에서, 제2의 헬퍼 RNA는 제1의 헬퍼 RNA로부터 결실된 알파바이러스 캡시드 단백질 및 알파바이러스 E2 당단백질중 하나 또는 둘다를 암호화하는 RNA를 포함할 수 있다. 제1의 헬퍼 RNA가 단지 알파바이러스 E2 당단백질만을 암호화하는 RNA를 포함하는 양태에서, 제2의 헬퍼 RNA는 제1의 헬퍼 RNA로부터 결실되는 알파바이러스 캡시드 단백질 및 알파바이러스 E1 당단백질중 하나 또는 둘다를 암호화하는 RNA를 포함할 수 있다. 제1의 헬퍼 RNA가 알파바이러스 E2 당단백질 및 알파바이러스 E1 당단백질 둘다를 암호화하는 RNA를 포함하는 양태에서, 제2의 헬퍼 RNA는 제1의 헬퍼 RNA로부터 결실된 알파바이러스 캡시드 단백질을 암호화하는 RNA를 포함할 수 있다.
하나의 양태에서, 패키징 분절 또는 "캡시드화 서열"은 적어도 제1의 헬퍼 RNA로부터 결실된다. 다른 양태에서, 패키징 분절은 제1의 헬퍼 RNA 및 제2의 헬퍼 RNA 둘다로부터 결실된다.
패키징 분절이 제1의 헬퍼 RNA 및 제2의 헬퍼 RNA 둘다로부터 결실되는 하나의 양태에서, 바람직하게는 헬퍼 세포는 제1의 헬퍼 RNA 및 제2의 헬퍼 RNA 외에 레플리콘 RNA를 함유한다. 레플리콘 RNA는 패키징 분절 및 삽입된 이종 RNA를 암호화한다. 삽입된 이종 RNA는 바이러스 융합 단백질, 또는 융합 활성을 생성하는데 필요한 단백질, 또는 융합 활성을 매개할 수 있는 펩타이드를 암호화하는 RNA일 수 있다. 통상적으로, 삽입된 이종 RNA는 숙주, 알파바이러스-허용성 세포 또는 자가 증식하는 수포의 융합 파트너에 의해 바람직하게 발현되며, 세포내에서 단백질 또는 펩타이드를 발현하는데 필수적인 프로모터 및 조절 분절을 포함하는 단백질 또는 펩타이드를 암호화한다. 적합하게 삽입된 이종 RNA의 예는 파라인플루엔자 제1형, 파라인플루엔자 제2형, 파라인플루엔자 제3형, 파라인플루엔자 제4형, 호흡기 합포체 바이러스, 사람 면역결핍성 바이러스, 수포성 구내염 바이러스 및 인플루엔자 바이러스를 포함하나, 이에 한정되지 않는 각종 바이러스로부터 기원한 바이러스 RNA를 포함한다.
삽입된 이종 RNA를 제공하는데 사용될 수 있는 적합한 바이러스 RNA의 예는 인플루엔자 제1형 내지 제4형의 HN 및 F 유전자, 특히 파라인플루엔자 제3형의 HN 및 F 유전자, 인플루엔자 헤마글루티닌 유전자, 인플루엔자 뉴라미니다제 유전자, 렌티바이러스 당단백질 외피 유전자, HIV 외피 gp160 유전자 및 HIV 매트릭스 캡시드 융합 유전자를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 다른 양태에서, 삽입된 이종 RNA는 호흡기 합포체 바이러스 융합(F) 당단백질, 호흡기 합포체 바이러스 부착(G) 당단백질 또는 호흡기 합포체 바이러스 F 및 G 단백질 둘다를 암호화한다.
하나의 양태에서, 레플리콘 RNA, 제1의 헬퍼 RNA 및 제2의 헬퍼 RNA는 별개의 분자로 제공됨으로써 제1 분자, 즉, 레플리콘 RNA는 패키징 분절을 암호화하는 RNA 및 융합 활성을 암호화하는 삽입된 이종 RNA를 포함하며, 제2의 분자, 즉, 제1의 헬퍼 RNA는 요구되는 하나 이상, 그러나 전부는 아닌 알파바이러스 구조 단백질을 암호화하는 RNA를 포함하고, 제3의 분자, 즉, 제2의 헬퍼 RNA는 하나 이상, 그러나 전부는 아닌 요구되는 알파바이러스 구조 단백질을 암호화하는 RNA를 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 다른 양태에서, 헬퍼 세포는 (a) 알파바이러스 패키징 서열을 암호화하는 RNA 및 융합 활성을 암호화하는 삽입된 이종 RNA를 포함하는 레플리콘 RNA, (b) 알파바이러스 E1 당단백질 및 알파바이러스 E2 당단백질을 암호화하는 RNA를 포함하는 제1의 헬퍼 RNA, 및 (c) 알파바이러스 캡시드 단백질을 암호화하는 RNA를 포함하는 제2의 헬퍼 RNA를 포함하는 RNA의 세트를 포함함으로써, 알파바이러스 E1 당단백질, 알파바이러스 E2 당단백질 및 캡시드 단백질은 숙주 세포내에서 알파바이러스 레플리콘 입자내로 함께 조립된다.
다른 양태에서, 레플리콘 RNA 및 제1의 헬퍼 RNA는 별개의 분자상에 있으며, 레플리콘 RNA 및 제2의 헬퍼 RNA는 단일 분자상에 함께 있음으로써, 제1의 분자, 즉, 제1의 헬퍼 RNA는 하나 이상, 그러나 전부는 아닌 필요한 알파바이러스 구조 단백질을 암호화하는 RNA를 포함하고, 제2의 분자, 즉, 레플리콘 RNA와 제2의 헬퍼 RNA는 패키징 분절, 삽입된 이종 DNA 및 캡시드 단백질을 암호화하는 RNA를 포함한다. 따라서, 캡시드 단백질은 제2의 헬퍼 RNA에 의해 암호화되나, 제2의 헬퍼 RNA는 레플리콘 RNA와 함께 제2의 분자상에 위치한다. 예를 들어, 본 발명의 하나의 양태에서, 헬퍼 세포는 (a) 알파바이러스 패키징 서열, 삽입된 이종 RNA 및 알파바이러스 캡시드 단백질을 암호화하는 RNA를 포함하는 레플리콘 RNA, 및 (b) 알파바이러스 E1 당단백질, 알파바이러스 E2 당단백질 및 캡시드 단백질이 숙주 세포내 알파바이러스 입자내로 함께 조립되도록 알파바이러스 E1 당단백질 및 알파바이러스 E2 당단백질을 암호화하는 RNA를 포함하는 제1의 헬퍼 RNA를 포함하는 RNA의 세트를 포함한다.
본원에 사용된 것으로서, 용어 "세포병변 효과"(CPE)는 바이러스 감염에 의해 개개의 배양된 세포 또는 세포들내에서 유도된 알려진 형태학적 변화를 말한다. 일반적으로, CPE는 광학 현미경하에서 용이하게 관찰된다. CPE는 다음 세포 현상을 포함하나, 이에 한정되지 않는다: 합포체 형성, 단층 파열, 라운딩(rounding), 수축, 증가된 굴절반사, 융합, 응집, 부착 상실 또는 용해. 이들 현상들은 특정 바이러스, 세포 유형 및 조건에 따라 단독으로 또는 함께 발생할 수 있다.
본 발명의 면역학적 조성물은 보조제를 함유할 수 있다. 보조제는 면역원 또는 항원과 함께 투여되는 경우 면역 반응을 증진시키는 물질이다. 다수의 사이토킨 또는 림포카인이 면역 조절 활성을 지닌 것으로 밝혀졌으므로 인터류킨, 1-α, 1-β, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 12(참조: 미국 특허 제5,723,127호), 13, 14, 15, 16, 17 및 18(및 이의 돌연변이체형), 인터페론-α, β 및 γ, 과립구-대식구 콜로니 자극 인자(참조: 미국 특허 제5,078,996호), 대식구 콜로니 자극 인자, 과립구 콜로니 자극 인자, GSF, 및 종양 괴사 인자 α 및 β를 포함하나, 이에 한정되지 않는 보조제로서 사용될 수 있다. 본 발명에 유용한 여전히 다른 보조제는 MCP-1, MIP-1α, MIP-1β 및 RANTES를 포함하나 이에 한정되지 않는 케모킨을 포한한다. 셀렉틴, 예를 들면, L-셀렉틴, P-셀렉틴 및 E-셀렉틴과 같은 부착 분자도 보조제로서 유용할 수 있다. 여전히 다른 유용한 보조제는 뮤신-유사 분자(mucin-like molecule), 예를 들면, CD34, GlyCAM-1 및 MadCAM-1, LFA-1, VLA-1, Mac-1 및 p150.95와 같은 인테그린 과의 구성원, PECAM, ICAM(예: ICAM-1, ICAM-2 및 ICAM-3), CD2 및 LFA-3과 같은 면역글로불린 슈퍼패밀리(superfamily) 구성원, CD40 및 CD40L과 같은 공-자극 분자, 혈관 성장 인자, 신경 성장 인자, 섬유모세포 성장 인자, 상피 성장 인자, B7.2, PDGF, BL-1, 및 혈관 내피 성자 인자, Fas, TNF 수용체, Flt, Apo-1, p55, WSL-1, DR3, TRAMP, Apo-3, AIR, LARD, NGRF, DR4, DR5, KILLER, TRAIL-R2, TRICK2 및 DR6를 포함하는 수용체 분자를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 여전히 다른 보조제 분자는 카스파제(ICE)를 포함한다[참조: 본원에 참조로 인용된 국제 특허 공보 제WO98/17799호 및 제WO99/43839호].
면역 반응을 증진시키는데 사용된 적합한 보조제는 본원에 참조로 인용된 미국 특허 제4,912,094호에 기술된 MPLTM(3-O-데아실화된 모노포스포릴화 지질 A; 메사츄세츠주 해밀톤 소재의 Corixa 제조원)을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 보조제로서 사용하기에 또한 적합한 것은 합성 지질 A 유사체 또는 아미노알킬 글루코사민 포스페이트 화합물(AGP), 또는 이의 유도체 또는 유사체[이는 메사츄세츠주 해밀톤 소재의 Corixa로부터 시판되며 본원에 참조로 인용된 미국 특허 제6,113,918호에 기술되어 있다]이다. 이러한 AGP중 하나는 또한 529(이전에는 RC529로도 공지됨)로 공지된 2-[(R)-3-T-테트라데카노일옥시테트라데카노일아미노]에틸 2-데옥시-4-O-포스포노-3-O-[(R)-3-테트라데카노일옥시테트라데카노일]-2-[(R)-3-테트라데카노일옥시테트라데카노일-아미노]-b-D-글루코피라노사이드이다. 당해 529 보조제는 수성형 또는 안정한 에멀젼으로 제형화된다.
또한 다른 보조제는 광유 및 수 에멀젼, 수산화알루미늄, 인산알루미늄 등과 같은 알루미늄 염(alum), 암피겐, 아브리딘, L121/스쿠알렌, D-락타이드-폴리락타이드/글리코사이드, 플루로닉 폴리올, 뮤라밀 디펩타이드, 자살 보르데텔라, 사포닌[예: 본원에 참조로 인용된 미국 특허 제5,057,540호에 기술된 StimulonTM QS-21(메사츄세츠주 프라밍햄 소재의 Antigenics 제조원)] 및 ISCOMS(면역자극 복합체), 마이코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis), 세균 리포폴리사카라이드, 합성 폴리뉴클레오타이드[예: CpG 모티프를 함유하는 올리고뉴클레오타이드(본원에 참조로 인용된 미국 특허 제6,207,646호], 백일해 독소(PT), 또는 이. 콜라이 열-불안정성 독소(LT), 특히 LT-K63, LT-R72, PT-K9/G129(참조: 본원에 참조로 인용된 국제 특허 공보 제WO93/13302호 및 제WO92/19265호)와 같은 이로부터 생성된 입자를 포함한다.
또한 보조제로서 유용한 것은 공개된 국제 특허원 제WO00/18434호에 기술된 것(여기서, 29번 아미노산 위치에서 글루탐산은 아스파르트산 이외의 다른 아미노산, 바람직하게는 히스티딘으로 치환된다)을 포함하는, 콜레라 독소 및 이의 돌연변이체이다. 유사한 CT 독소 또는 돌연변이체가 공개된 국제 특허원 제WO02/098368호(여기서, 16번 아미노산 위치에서 이소루이신은 단독으로 또는 68번 아미노산 위치에서 세린의 다른 아미노산으로의 치환과 함께 다른 아미노산으로 치환되고/되거나 72번 아미노산 위치에서 발린은 다른 아미노산으로 치환된다)에 기술되어 있다. 다른 CT 독소는 공개된 국제 특허원 제WO02/098369호(여기서, 25번 아미노산 위치의 아르기닌은 다른 아미노산으로 치환되고/되거나 아미노산이 49번 아미노산 위치에 삽입되고/되거나 2개의 아미노산이 35번 및 36번 아미노산 위치에 삽입되어 있다)에 기술되어 있다.
본 발명은 하기 실시예로 기술한다. 그러나, 명세서내 어디에서도 이들 또는 다른 실시예의 용도는 단지 나열하기 위함이며 본 발명의 영역 및 의미 또는 어떠한 예시된 용어를 한정하는 것은 아니다. 유사하게, 본 발명은 본원에 기술된 특정 양태에 한정되지 않는다. 또한, 본 발명의 많은 변형 및 변화는 본 명세서를 읽은 당해 분야의 숙련가에게 명백할 수 있으며 본 발명의 취지 및 영역을 벗어남이 없이 이루어질 수 있다.
실시예 1
PIV 단백질을 발현하는 VRP의 플라스미드 작제
본 발명은 파라인플루엔자 바이러스의 모델로서 사람 PIV-3을 사용한다. 사람 PIV3 바이러스 스톡(워싱톤 47885/57 균주)을 앞서 기술한 바와 같이 제조하였다[참조: Stokes, A. et al. Virus Research 25: 91-103 (1992)]. 바이러스 스톡을 폴리에틸렌글리콜(PEG) 침전으로 정제하였다. RNA를 트리졸-LS(Life Technologies 제조원)으로 추출하고 티탄 원 튜브(Titan One Tube) RT-PCT 시스템 (Roche 제조원)을 사용하여 역전사 PCR에 대한 주형으로 사용하였다. 프라이머를 사용하여 5' 코작 컨센수스 서열을 포함하는 N, P, M, C, HN 및 F의 전체 개방 판독 프레임(ORF)에 걸쳐있는 단편을 증폭시켰다. 수득되는 단편을 다음 제한 엔도뉴클레아제로 분해하였다: F의 경우 ClaI 및 HindIII, HN의 경우 EcoRI 및 BamHI, NP의 경우 PstI 및 EcoRI, P 및 C의 경우 AccI 및 XbaI, 및 M의 경우 HindIII 및 XbaI. 수득되는 단편을 셔틀 플라스미드인 pKSR1내로 클로닝시켰다. 후속적으로, 셔틀 플라스미드로부터의 ApaI-ORF-NotI 카세트를 VEEV 26S 아게놈성 프로모터로부터 하부로 및 이의 조절하에 pVR200내로 아클로닝시켜 레플리콘 발현 플라스미드pVR(NP), pVR(P), pVR(M), pVR(C), pVR(F) 및 pVR(HN)을 생성시켰다.
2개의 PIV 유전자를 함유하는 레플리콘을 생성시키기 위해, 제2의 ApaI-ORF(HN)-NotI 카세트를 F 유전자의 하부 스트림으로 pVR(F) 플라스미드내로 아클로닝시켜 2개의 외인성 유전자를 함유한 레플리콘 플라스미드 pVR-F/HN를 생성시켰다(참조: 도 1). 또한, VEE 캡시드 단백질(pV3014delta520-7505delta8495-11229) 또는 표면 당단맥질 gp E1/E2(pV3014delta520-7505delta7565-8386)을 발현할 수 있는 2개의 헬퍼 플라스미드를 레플리콘 패키징에 사용하였다[참조: 본원에 이의 전문이 참조로 인용된 Pushko et al. Virology 239: 389-401 (1997)]. 수득되는 플라스미드를 염료 종결인자 주기 서열분석 및 377 ABI DNA 서열분석기(캘리포니아주 포스터 시티 소재의 Applied Biosystems 제조원)를 사용하여 서열분석하였다.
실시예 2
VRP 생산
당해 실시예는 실시예 1에서 작제한 플라스미드로부터의 RNA를 BHK21 세포내로 전기천공(electroporating)시킴으로써 PIV3의 항원 각각을 발현하는 VRP를 생성시키는 방법을 기술하고 있다. 원래의 VEE 플라스미드 pVR100, 및 2개의 헬퍼 플라스미드 pHC(캡시드) 및 pHC(gp E1/E2)를 업자[AlphaVax (Durham, NC)]로부터 입수하였다[참조: 전문이 본원에 참조로 인용된 Pushko et al. Virology 239: 389-401 (1997)]. PIV3 당단백질 유전자의 RT-PCR 단편을 개별적으로 pVR200 또는 pVR100(HN 및 F 둘다)내로 클로닝하였다. 이후에 생성된 플라스미드를 시험관내 전사시켜 RNA를 생성시켰다. RNA를 BHK21 세포내로 후속적으로 전기천공시켜 NP, M, P, C, F 및/또는 HN 유전자(VRP-NP, -M, -P, -C, -HN, -F, -F/HN) 각각을 암호화한 VRP를 생성시켰다.
개개의 PIV를 수득하고 이들을 적합한 벡터내로 클로닝한 후, 캡핑된 RNA 전사체를 시험관내에서 NotI 선형화된 플라스미드 주형 및 mMessage MACHINE T7 RNA 폴리머라제 키트(텍사스주 오스틴 소재의 Ambion 제조원)을 사용하여 시험관내에서 제조하였다. 반응은 제조업자의 지침에 따라 수행하였다. 레플리콘 입자를 생성하는 세포를 플라스미드 pVR(NP), pVR(M), pVR(P), pVR(C), pVR(HN), pVR(F), pVR(HN) 및 pVR(F), 또는 pVR-F/HN로부터 50㎍의 각각의 RNA와 함께 헬퍼 플라스미드로부터의 50㎍의 RNA를 BHK21 세포내로 전기천공시켜 생성하였다[참조: 전문이 본원에 참조로 인용된 Pushko et al. Virology 239: 389-401 (1997)]. 이후에 처리된 BHK 세포를 37℃에서 5% CO2와 함께 T-175 플라스크속에서 배양하였다. 배지 는 고 글루코즈, 10% 태 송아지 혈청 및 1% 나트륨 피루베이트가 들어있는 이글스의 둘베코 변형 배지[Dulbecco's Modification of Eagle's Medium (DMEM)]로 구성되었다. 다음 배양 상청액을 전기천공후 48시간 동안 수거하고 3,200rpm에서 원심분리하여 청명하게 하였다. VRP를 PBS속에 재현탁시키고 역가를 BHK21 세포를 감염시키고 적절한 PIV3 특이적 항체로 면역염색시킴에 의해 측정하였다.
실시예 3
VRP 및 PIV의 바이러스 역가
PIV 단백질 및 당단백질을 발현하는 VEE 레플리콘(VRP)을 면역조직화학 방법으로 역가측정하였다. VRP는 BHK-21 계통에서 증식시켰다. 이 경우에, BHK 세포는 CCL-10 클론으로부터 기원함으로써 쉐임 표현형 특성을 공유하지 않을 수 있는 다른 BHK 클론 집단과 차별화시켰다. 본원에 기술된 것으로서, 세포는 BHK21 또는 단순히 BHK 세포로 언급될 수 있다. BHK21 단층을 일련의 희석된 VEE 레플리콘: VRP- NP; VRP-P; VRP-M; VRP-C; VRP-HN; VRP-F; VRP-F/HN 및 VRP-GFP로 감염시키고 37℃에서 16 내지 20시간 동안 항온처리하였다. 이후에 단층을 1:1 아세톤/메탄올을 사용하여 5분 동안 고정시키고 세균으로부터 발현된 토끼 항-VEE NSP1 단백질, 폴리클로날 Ab r835 또는 말 항-PIV3 혈청으로 염색시켰다. 이후에 플라크를 cyTM3 접합된 염소 항-토끼 항체(제조원: Jackson ImmunoResearch, 펜실베니아주 웨스트 그로브 소재) 또는 서양고추냉이 퍼옥시다제(HOURP) 접합된 항-말 Ab(미들랜드주 매릴랜드 소재의 Kirkegaard & Perry 제조원) 및 아미노에틸카르바졸(AEC) 퍼옥시다제 기질 키트(뉴욕주 파밍데일소재의 Enzo Life Sciences 제조원)로 검출하였다. 플라크의 수를 현미경하에 계수하고 VEE 레플리콘에 대해 ml당 감염성 단위(iu/ml) 또는 VRP-F/HN 레플리콘 감염으로부터 생성된 제2의 감염성 입자에 대해 ml당 합포체 형성 단위(sfu/ml)로 보고하였다.
PIV3 Wash47885/57 바이러스 스톡 또는 조직 균질물의 역가를 기술한 바와 같이 변형된 헴흡수 검정(Hemadsorption assay; HAD) 프로토콜로 측정하였다[참조: Durbin et al., Virology 235: 323-332 (1997); Durbin et al., Vaccine 16: 1234-1330 (1998)]. 요약하면, 10배씩 일련 희석된 샘플들 37℃에서 LLC-MK2 단층의 96-웰 플레이트속에서 역가측정하였다. 상청액을 배양물속에서 6 내지 7일 후에 수집하고 0.5% 기니아 피그 적혈구를 사용하여 HA 검정하였다. 샘플 ml당 평균 Log10TCID50을 계산하였다.
실시예 4
동물 면역화 및 챌린지
비-면역 햄스터를 특정의 PIV 단백질을 발현하는 VRP 레플리콘으로 면역화시키면 후속적인 PIV 감염으로부터의 보호 면역성이 유발된다. PIV3에 대해 음성혈청인 5 내지 8주된 골든 시리안 햄스터를 PIV-3 단백질인 PIV3의 NP, P, M, C 또는 대조군으로서 GFP를 발현한 VEE 레플리콘: VRP-NP; VRP-P; VRP-M; VRP-C를 사용하여 비강내(i.n.) 또는 근육내(i.m.)로 면역화시켰다. 투여량은 표 1에 나타낸다. 동물을 동일한 투여량으로 초기 면역화한 후 3주 및 5중동안 부스트하였다(참조: 표 1). 7주 후 햄스터를 1x106의 LogTCID50의 PIV3(Wash47885/57 바이러스 균주)로 챌린지하였다. 챌린지한 후 4일째에, 비강 코선반 및 폐 조직을 수집하여 균질화시켰다[참조: Durbin et al., Virology 235: 323-332 (1997); Durbin et al., Vaccine 16: 1234-1330 (1998)]. 이들 균질물에서의 PIV3 복제를 상기 실시예 3에서 기술된 바와 같은 HAD 검정으로 분석하였다. 모든 골든 시리안 햄스터 및BALB/c 마우스는 업자(참조: 매릴랜드주 윌밍톤 소재의 Charles River laboratory)에서 입수하였고 현재의 NIH "실험 동물의 보호 및 사용 가이드" 및 연방 및 주 법률 및 와이어쓰 리서치 바이오리소스(Wyeth Research's BioResources)에 의해 유지된 현재의 작업 과정에 따라 사육하였다.
본 발명의 하나의 양태에서, 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 레플리콘 입자는 BHK 배양된 세포의 단층을 감염시키는데 사용되는 경우 세포병변 효과를 유발한다. 다른 양태에서, 레플리콘 입자로 감염된 세포로부터의 상청액은 감염되지 않은 세포 단층으로 이전되는 경우 레플리콘 입자의 부재하에서 세포병변 효과를 유발한다. 본 발명의 다른 양태에서, 세포병변 효과는 합포체 형성, 단층 파열 및 아폽토시스로 이루어진 그룹 중에서 선택된다.
Figure 112005070929264-PCT00001
동물에서 PIV3 감염에 대한 보호를 제공하는 PIV3의 내부 단백질의 능력은, 햄스터가 PIV3 복제 및 VEE 감염을 지지하는 가장 작은 동물 모델이므로, 실험 모델로서 햄스터를 사용하여 시험하였다[참조: Durbin et al., Vaccine 16: 1234-1330 (1999)]. 표 1은 면역화 및 챌린지후 LRT 및 URT에서 수득한 바이러스 역가를 나타낸다. i.n. 또는 i.m.으로 제공된 1x106 내지 1x107 i.u 범위의 투여량에서 NP, P, M 또는 C를 발현한 VRP 모두는 VRP-GFP 및 PBS 그룹과 비교하여 명백한 보호를 나타내지 않았다(참조: 표 1). 약독화된 생 PIV3 바이러스인 cp45만이 PIV3 감염으로부터 햄스터를 보호할 수 있었다. 따라서, 내부 단백질 NP, P, M 및 C는 PIV3에 대한 면역원성 조성물중에 혼입시키기 위한 후보물로서의 효능을 지니지 않거나 매우 최소의 효능을 지녔다.
이어서, 보호를 제공하는 VRP-발현된 HN 및/또는 F의 능력을 조사하였다. 햄스터를 동일한 스케쥴에 따라 표 2에 나타낸 투여량에서 면역화시켰다. 표 2에 나타낸 결과는, VRP-F/HN 면역화된 동물만이 URT에서 거의 완벽하게 보호됨을 나타낸다. VRP-HN 단독으로 면역화된 햄스터는, URT에서 바이러스 역가가 거의 100배 감소되었다. VRP-F/HN보다는 VRP-HN+VRP-F i.n.으로 햄스터를 면역화시키는 것은 URT에서 단지 10배만 바이러스 복제를 감소시켰다. 또한, VRP-F 면역화는 어떠한 혈청 중화 역가를 유발하지 않았고, URT에서 보호하지 않았으며 LRT에서 바이러스 복제를 단지 10배만 감소시켰다(참조: 표 2. 실시예 1). 따라서, i.n. 면역화에 의해, VRP-F/HN을 포함하는 면역원성 조성물은 중화 역가의 현저한 수준을 유발하고 LRT에서 PIV3 감염에 대해 완전히 보호하며 LRT에서 PIV3 감염의 중증도를 감소시켰다.
Figure 112005070929264-PCT00002
일반적으로, 근육내 면역화는 PIV3에 대해 보호 면역을 유발하는데 있어서 비강내 면역화에 비해 거의 효과가 없다. 예를 들어, VRP-HN 및 VRP-HN+VRP-F를 사용하여 근육내(i.m.) 면역화시킨 동물은 LRT에서 후속적인 챌린지 감염으로부터 완전히 보호하는, 이들 레플리콘을 사용한 비강내 면역화와 비교하여, LTR에서 대략 3log10(참조: 표 2, 실시예 1)까지의 감소된 바이러스 역가를 나타내었다.
다시, i.m. 및 i.n. 면역화에 대해 LRT에서 후속적인 챌린지 감염으로부터 완전한 보호에 따라서 VRP-F/HN을 사용하여 가장 효과적인 면역원성을 수득하였다(참조: 표 2, 실시예 2). VRP-F/HN이외에 다른 VRP를 사용한 i.m. 면역화에 의해 완전한 보호가 달성된 실시예는 없었다(참조: 표 2).
당해 데이타는, 감소된 바이러스 역가 및 감소된 감염 중증도의 형태의 보호 범위가 i.m. 면역화를 통해 URT에서 가능함을 나타내었다. 구체적으로는, VRP-HN, VRP-F, VRP-HN + VRP-F를 사용한 근육내 면역화는 PBS 대조군과 비교하여 약 10배 내지 약 100배의 범위까지 바이러스 역가를 감소시켰다(참조: 표 2, 실시예 1 및 2). VRP-F/HN는 i.n. 면역화보다 덜 효율적이라고 해도, i.m.으로 제공시 LRT 감염에 대해 보호하기 위한 가장 우수한 후보물질이었다.
실시예 4
PIV에 대한 체액 반응
A. PIV3 특이적인 B 세포 ELISPOT
마우스의 림프절에서 PIV3 특이적인 Ig를 분비하는 세포를 B 세포 ELISPOT 검정으로 측정하였다. 요약하면, 면역화된 마우스의 림프절로부터의 단일 세포 현탁액을 5% CO2중 37℃에서 밤새 세제 파괴시킨 PIV3 바이러스 100ng으로 피복시킨 96-웰 임뮬론(Immulon) II 플레이트(메사츄세츠주 베드포드 소재의 Milipore 제조원)상에서 항온처리하였다. 이후에 세포를 세척하고 플레이트에 결합된 PIV3-특이적인 총 Ig 또는 IgA를 알칼린 포스파타제 접합체 염소 항-마우스 IgM + IgG + IgA의 혼합물 또는 IgA 단독 각각으로 검출하였다. 이후에 스폿을 알칼린 포스파타제 기질 키트(Bio-Rad 제조원)를 사용하여 전개시키고 올림푸스 해부 현미경(미네소타주 미네아폴리스 소재의 Leeds Precision Instruments, Inc. 제조원)하에 계수함으로써 정량화하였다. 결과를 1x106 세포당 스폿 형성 세포(SFC)의 수로 보고한다.
B. 바이러스 중화 검정
PIV3 바이러스 입자를 중화시키는 햄스터 혈청의 능력은 헴응집 억제 검정(HI)으로 측정하였다. 요약하면, 열 불활성화시킨 혈청을 37℃에서 18 내지 20시간동안 수용체 파괴 효소(RDE)(일본, 도쿄소재의 Denka Seiken Co. Ltd. 제조원)로 처리하여 4℃에서 1시간 동안 0.4% 기니아 피그 RBC(gpRBC)와 함께 항온처리함으로써 비-특이적 아글루티닌의 추가의 제거전에 비-특이적 억제제를 제거하였다. 0.5% gpRBC를 응집시키기 위한 PIV3 바이러스의 4HA 단위를 억제시키기 위해 일련 희석 처리된 혈청의 종점을 측정하였다.
VRP-F/HN의 입증된 보호 효능은 이의 보호 효과의 조사를 유도하였다. 호흡기 병원체로부터의 보호는 일반적으로 점막 면역성의 유발과 관련되어 있다. 따라서, 폐 또는 비강에서 고갈된, 종격 림프절(MLN) 및 경부 림프절(CLN)에서 IgA를 생성하는 세포의 유발을 평가하였다. 이 경우에 마우스 모델을 사용였는데, 그 이유는 햄스터에 대한 적절한 보호 시약이 입수가능하지 않았기 때문이다. BALB/c 마우스를 햄스터에 대한 것과 동일한 면역화 스케쥴에 따라 VRP-HN 또는 VRP-F/HN(i.n.)로 면역화시켰다. 개개의 CLN을 수집하고 MLN을 혼주시켰다. 단일 세포 현탁액을 LN으로부터 제조하고 총 Ig 분비 세포 또는 IgA 분비 세포를 B 세포 ELISPOT 기술로 평가하였다.
VRP-F/HN을 사용한 면역화로 다른 VRP를 사용한 면역화와 비교하여 보다 높은 수준의 항원 특이적 IgA를 유발하였다. 예를 들어, VRP-HN을 사용한 면역화는 CLN에서 약 800 SFC/1x106 세포의 PIV3-특이적 Ig 분비 세포를 유발하였다. 이들 Ig를 분비하는 세포의 대략 10%를 제외한 나머지는 PIV-3 특이적 IgA 분비 세포(100 SFC/1x106 세포)이었다. 대조적으로, VRP-F/HN 면역화는 CLN에서 약 400 SFC/1x106 세포의 PIV3-특이적 Ig-SFC를 유발하였다. 중요하게는, 다수의 항원 특이적 IgA SFC가 VRP-HN(약 250 SFC/1x106 세포)를 사용한 것 보다 퍼센트 기준으로 훨씬 더 높았다. 이 경우에, VRP-F/HN 면역화 그룹에서 Ig 분비 세포의 60% 이상이 IgA이었다. 따라서, VRP-F/HN은 바람직하게는 URT에서 항원 특이적 IgA 생산을 유발하며 이는 우수한 보호 효능과 상관관계가 있다(참조: 표 2).
MLN에서, PIV3-특이적 총 Ig 분비 세포 또는 IgA 분비 세포의 양은 VRP-HN 및 VRP-F/HN 면역화 둘다와 유사하며, 이는, 면역화 둘다가 햄스터의 LRT에서 바이러스 복제를 완전히 제거한다는 사실과 일치한다(참조: 표 2).
바이러스 챌린지 후에 보호 면역성에서의 중화 항체의 역활을 시험하였다. 혈청 샘플을 PIV3 챌린지 2일 전에 수집하고 PIV3 중화 역가를 측정하였다. 표 2는, 중화 역가가 PBS 대조군 그룹에서 측정되지 않았으며 LRT 및 URT에서 바이러스 복제가 각각 5.8±0.4 및 5.2±0.2의 수준이하였음을 나타낸다. 모든 시험 그룹중에서, VRP-HN, VRP-F/HN, 또는 VRP-HN 및 VRP-F의 배합(VRP-HN+VRP-F) 면역화가 현저한 수준의 HI 역가를 유발하였으며, cP45 면역화된 그룹의 것(데이타는 나타내지 않음)과 비교하여, 각각 6.3, 7.1 및 7.5의 수준에 이르고 LRT에 있어 완전한 보호를 나타내었다.
실시예 5
PIV 보호용 최소 투여량
효과적인 보호에 필요한 VRP-F/HN의 최소 투여량을 측정하였다. i.n.으로 제공하는 경우 2x104 iu의 투여량에서 VRP-F/HN는 감염으로부터 LRT를 여전히 보호할 수 있으며 바이러스 복제를 100 배까지 저하시킴으로써 URT 감염에 대해 부분 보호하였다(참조: 표 3, 실험 1). 또한, 제3의 주사는 불필요한 것으로 여겨지며 1x104 i.u. 투여량의 2회 주사로 LRT 감염을 예방하는데 충분하였다. VRP-F/HN 1x104 iu의 1회 투여량은 충분하지 않았다(참조: 표 3, 실험 2). 따라서, 햄스터 모델에서, VRP-F/HN는 하부 및 상부 호흡기도에서 PIV3 복제의 확립을 예방하는데 가장 효과적인 섭생이었다. LRT 감염을 근절하는데 효과적인 것으로서 VRP-F/HN에 대한 용량은 1x104 iu에서 2회의 면역화로 낮을 수 있다.
당해 데이타는, VRP-F/HN의 1x104 iu의 2회 투여량을 사용한 면역화가 바이러스 복제를 LRT에서 검출불가능한 수준으로 감소시키는데 충분하며 바이러스 복제 수준을 URT에서 약 100배 감소시켰음을 나타내었다(참조: 표 3). 이는 PIV 및 RSV 관련 현상과 같은 특정의 질병 합병증을 예방할 수 있는 아단위 조성물을 제조하기 위한 방법을 제시하므로, 현저히 달성된다. 당해 데이타는, HN 및 F가 PIV 아단위 백신 설계에 요구되는 2개의 주요 항원임을 나타낸다.
Figure 112005070929264-PCT00003
실시예 6
VRP-F/HN 감염으로부터 세포병변 효과
A. 아폽토시스
VRP-HN, VRP-F 또는 VRP-HN+VRP-F과 비교하는 경우 면역원성 조성물로서 VRP-F/HN의 강력한 효능은 작용 메카니즘을 시험하도록 하였다. VRP-F/HN 감염은 배양물에서 다른 VRP 감염과 비교하여 유일한 CPE를 초래하는 것으로 관측되었다. 배양물속에서 증식되는 경우 아폽토시스을 가져오는 이들 VRP의 능력을 시험하였다. BHK21 단층을 VRP-F/HN 또는 VRP-HN로 MOI=0.5에서 감염시키거나, 감염시키지 않았다(대조군)(참조: 표 4). 단층 형태를 감염 24, 48 및 72시간 후에 100x로 확대하여 상 대조 현미경으로 측정하였다(참조: 표 4). CPE 데이타로부터 BHK 단층이 가벼운 CPE(+)를 나타내면서 붕괴되었는지, 또는 단층 세포가 심각하게 파괴되었는지, 및 막 수포가 형성되거나(++) 단층이 완전히 전멸하여 상청액속에 수포와 조직파편(+++)이 남았는지를 특성화하였다(참조: 표 4).
표 4에 나타낸 바와 같이, BHK 세포를 VRP-F/HN로 감염시킨 경우, 24시간 후에, BHK 단층은 VRP-HN 또는 다른 VRP 감염(데이타는 나타내지 않음)과 비교하여 붕괴되었다. 48시간 후, VRP-F/HN을 사용한 감염은 단층 파열을 유발하였고, 명백한 합포체 및 막 수포가 형성되었다. 72시간 후, 단층이 완전히 전멸하여 상청액속에 수포와 조직파편이 남은 반면, VRP-HN으로 감염된 그룹은 완전한 아폽토시스 현상으로 인하여 세포들이 둥글게 모인 완전한 단층을 나타내었다(참조: 표 4).
레플리콘 감염된 세포에서 CPE의 수준
CPE
그룹 24시간 48시간 72시간
비감염됨 - - -
VRP-F/HN + ++ +++
VRP-HN - - -
B. 플라크 형태
앞서의 연구는, F 단백질의 융합 특성이 HN 단백질의 존재를 필요로함을 나타내는 반면[참조: Ebata, S. N. et al. Virology 183: 437-441 (1991)], 이들 자체에 의해 HN 또는 F는 합포체 형성을 유발하지 않았다. VRP-F/HN 감염에 의한 유일한 CPE가 합포체 형성에 기인하였다는 가능성은 다음에서 시험하였다.
세포의 BHK21 단층을 상이한 VRP, 예를 들면 , VRP-HN, VRP-F, VRP-HN+VRP-F 또는 VRP-F/HN로 15 내지 18 시간 동안 감염시킨 후 단층을 고정시키고 항-PIV3 폴리클로날 Ab로 염색시킨 후 서양 고추냉이 퍼옥시다제 접합된 항-말 Ab를 제2 Ab로서 및 아미노에틸카르바졸 퍼옥시다제를 기질로서 염색시키거나 토끼 항-VEE NSP1 폴리클로날 Ab r835 및 cyTM3 접합된 염소 항-토끼 항체로 염색시켰다. 사진을 광시야 현미경 또는 100x 확대한 형광 현미경하에 찍었다.
예측한 바와 같이, VRP-HN 또는 VRP-F 자체는 개개의 VRP 감염에 의해 형성된 선명한 HN- 또는 F-발현 플라크를 나타내었다. 그러나, VRP-F/HN 감염된 그룹에서 "플라크"는 더욱 큰 크기를 가졌으며 용이하게 가시화되었다. 이들 보다 큰 "플라크"는, 합포체 형성을 나타내는데, 이는, 다핵화된 세포가 이들 "플라크"내에서 명백하게 관측되었기 때문이다.[합포체 형성을 기초로 하는 적정은 후에 감염 단위(iu) 대신에 합포체 형성 단위(sfu)로 명명하였는데, 이는, 이것이 단일의 레플리콘 및 다수의 세포에 기초하였기 때문이다]. 세포를 VRP-HN 및 VRP-F로 동시에 공감염시키는 경우, 합포체 형태를 나타낸 보다 적은 "플라크"(1% 미만)가 존재하였다. 그러나, 플라크는 VRP-HN 또는 VRP-F 감염 단독으로 형성된 것과 유사하였다. 플라크를 항-VEE NSP1 Ab로 염색하는 경우 동일한 플라크 프로파일이 관측되었다. 합포체 형성은 또한 VRP-F/HN로부터 HN 및 F 단백질의 동시-발현을 확인하였다. 실제로 VRP-F/HN 감염은 2개의 상이한 CPE 과정, 아폽토시스 및 합포체 형성을 가져왔다고 결론지을 수 있다.
실시예 7
HN 및 F의 공발현은 감염성 입자를 생산하였다
VRP-F/HN 유발된 CPE는 매우 "접촉전염성"인데, 이는 세포의 단층("단층")이 매우 낮은 감염 다중성(MOI)(<0.001, 데이타는 나타내지 않음)으로 파괴될 수 있기 때문임을 알 수 있다. 따라서, 제 2의 레플리콘 또는 감염성 입자의 일부 형태가 유일한 CPE로부터 생성되었다는 것은 놀라운 일이다. 제 2의 레플리콘 또는 감염성 입자는 자가 증식성이고 막 관련 HN 및 F 당단백질 유발된 융합 과정을 사용함으로써 다른 세포를 감염시키는 것으로 여겨졌다.
비-레플리콘 감염성 인자가 생산되었는지를 평가하기 위하여 BHK 단층을 0.5의 MOI에서 VRP-F/HN 또는 기타 VRP로 30분 동안 감염시켰다. 이후에 단층을 3회 세척하여 나머지 VRP를 제거하고, 신선한 배지를 새로 보충하고 48시간 동안 항온처리하였다. 다음, 단층을 말 항-PIV3 혈청으로 염색하여 HN 및 F 발현에 대해 평가하거나, VEE의 토끼 항-NSP1으로 염색하여 레플리콘 NSP1 단백질의 존재를 측정하였다. 48시간의 기간 말기에, 세포로부터의 상청액의 분취량을 단층으로부터 제거하여 30분 동안 신선한 BHK 단층을 "감염"시키는데 사용하였다. 30분 후 세포를 세척하고 신선한 배지로 재보충시키고 48시간 동안 항온처리하였다. 이후 단층을 CPE에 대해 평가하고 HN 및 F 발현에 대해 말 항-PIV3 혈청으로 또는 VEE의 토끼 항-NSP1으로 염색하여 레플리콘 단백질의 존재를 측정하였다. 당해 공정을 제 1의 이전(제1 이전), 다른 이전(제2 이전) 및 이전(제3 이전)을 통해 수행하였다. 모든 세포를 HN 및 F 발현에 대해 항-PIV3로 또는 VEE NSP1 발현에 대해 항-VEE NSP1으로 염색하였다. 항 PIV 항체에 대해 광 영역하에 100x 확대하여 사진을 찍거나 항 VEE NSP1 항체에 대해 형광 현미경으로 사진을 찍었다. 면역염색에 의해 발현 정도를 (-) 또는 (+) 내지 (+++++)로 나타내었다. 결과를 표 5에 나타낸다.
Figure 112005070929264-PCT00004
VRP 레플리콘을 사용한 1회 감염에서, 플라크는 다음 레플리콘: VRP-HN, VRP-F 및 VRP-HN + VRP-F로 감염시킨 세포주에서 48시간 후 가시적이었다(참조: 표 5). 당해 감염 주기에서, 헬퍼 플라스미드로부터 기원한 VEE 당단백질은 세포 도입을 용이하게 하였다.
초기 레플리콘 감염에서 CPE를 고려할 때, VRP-HN + VRP-F 감염된 세포는 HN 및 F의 기회적 공발현으로 인하여 경우에 따른 합포체 형성을 나타내었다. 대조적으로, 48시간 후 VRP-F/HN 감염은 세포 단층의 파괴 및 명백한 합포체를 유발하였다(참조: 표 5). 이들 그룹 모두는 또한 VEE NSP1 단백질을 발현하였으며, 이는 작용적 레플리콘 활성을 나타낸다(참조: 표 5).
제 2 주기의 감염에서, 상기 상청액을 새로운 단층으로 이전시키는 경우, VRP-HN 및 VRP-F 처리된 그룹에서 새로운 감염 활성이 없었다(참조: 표 5). 유사하게 PIV3 HN 및 F의 추가의 발현은 없었고, 어떠한 VEE NSP1 생산도 없었다(참조: 표 5). 당해 그룹에서, VEE 헬퍼 단백질의 투입의 부재는 본 발명 이전에 예측되는 것으로서 감염 과정에 치명적인 것으로 입증되었다.
그러나, 놀랍게도, 감염성 입자는 헬퍼 플라스미드상에서 VEE 단백질의 부재하에 VRP-F/HN 처리된 세포의 상청액에서 생산되었다. 예를 들어, 본 발명자들은, 다량의 PIV3 당단백질 HN 및 F가 VRP-F/HN 처리된 세포로부터의 상청액을 감염되지 않은 세포 단층으로 이전시킨 후 생성됨을 발견하였다(참조: 표 5). 당해 과정의 이러한 단계에서, 감염 과정은 세포 기원한 수포 표면에서 PIV HN 및 F 단백질의 표면 발현된 융합 활성에 기인한 것으로 고려되었다.
또한, NSP1 단백질은 이전이후에 VRP-F/HN 처리된 그룹에서 생산되었으며, 이는, VRP-F/HN 감염된 세포 상청액에서 강력한 감염 활성을 나타낸다(참조; 표 5). VEE 표면 당단백질 발현은 항-VEE 폴리클로날 혈청을 사용한 염색을 사용하여 검출할 수 없으며, 이는, 강력한 재조합 현상으로 인해 VEE 바이러스 생성이 없음을 나타낸다. 따라서, 감염제는 NSP1, NSP2, NSP3, NSP4, 및 PIV3 HN 및 F 유전자를 포함하는 VEE 레플리카제를 수반하는 원레의 VEE 레플리콘 RNA로 구성되며, 본 발명자는, 본원에서 이러한 동일한 단백질이 발현됨을 나타낸다.
후속적인 이전에 있어서의 감염 활성은 PIV3 HN 및 F의 동시 발현에 기인하는 것으로 여겨졌다. VRP-HN+VRP-F 그룹에서는 제한된 양의 PIV3 당단백질 HN 및 F 항원 염색이 존재하였고 NSP1 발현은 검출되지 않았다. 이러한 이유는, 합포체 유발 활성을 지닌 일부 레플리콘이 초기 VRP 감염으로부터 수반되기 때문일 수 있다(참조: 표 5). 이에 대한 지지로, 이러한 잔류 활성이 제 2의 이전으로 수행될 수 없으며 추가의 PIV3 항원이 검출되지 않았다는 것이 밝혀졌다(참조: 표 5).
VRP-HN+VRP-F 처리된 세포를 사용하여 관측된 감염 활성의 결여와는 대조적으로, VRP-F/HN 감염의 제 1의 이전을 제공받은 세포의 상청액은, 감염되지 않은 세포에 적용시, 합포체 형성, 단층 파열, PIV3 HN & F 항원 염색 및 VEE NSP1 항원 염색을 포함하는 다른 주기의 "감염성" 현상을 유발한다. 또한, 이러한 감염 활성의 결과로서 검출가능한 VEE 표면 당단백질 발현은 없으며, 또한 VEE 바이러스 오염도 없었다.
추가 주기의 "감염" 현상은, VRP-F/HN 감염된 세포로부터의 상청액을 추가의 BHK 단층으로 이전시키는 경우에 생성되었다(참조: 표 5). BHK 단층을 또한 항-VEE 폴리클로날 혈청으로 염색하며 VEE 표면 단백질 발현은 나타나지 않았고, 이는 VEE 바이러스가 생성되지 않았음을 나타낸다.
상기 관측은, 또한 "감염성" 단백질이 VRP-F/HN 감염된 세포로부터 생성된 융합 활성을 초래하며 이러한 활성이 지속적으로 이전될 수 있다는 가설을 입증하였다.
실시예 8
감염성 입자는 레플리콘이 아닌 수포였다
감염성 입자의 형태 특성을 전자 현미경을 사용하여 시험함으로써 이들의 특성을 추정하였다. 보다 근접한 시험으로, 감염성 입자가 VRP-F/HN 레플리콘이고, PIV3 HN 및 F를 동시 발현하는, 감염된 세포로부터 기원한 수포로서 감염제가 대신 확인되었음이 판정되었다.
VRP-F/HN 수포는, 이들을 PBS속에 1;20으로 우선 희석시켜 전자 현미경용으로 제조하였다. 전체 수포, 네가티브 균주, 면역금 표지를 문헌(참조: Slot and Geuze 1984)에 의해 개발된 변형법을 사용하여 수행하였다(참조: Immunolabeling for Electron Microscopy, by Slot and Geuze, Pollack and Varndell eds. Elsevier Science Publishers, BV, Amsterdam). 수포의 소적을 파라핀상에 두고 포름바-탄소-피복된 금 격자를 각각의 소적상에 엎어놓았다. 과량의 에멀젼을 제거하고 차단을 PBS 및 1% BSA(5ml)에 이어 1% 냉수어 젤라틴(10ml)을 함유하는 PBS를 사용하여 2단계로 달성하였다. 수포를 지닌 격자를 휴미드 챔버(humid chamber)속에서 PBS BSA속에 1:50으로 희석시킨 항-F mAb 클론 B-102 또는 항-HN mAb 클론 68/2위로 되돌렸다(1시간). 격자를 PBS BSA속에서 5 X 1ml로 세정하였다. 6nm 콜로이드성 금 비드(펜실베니아 더블유. 그로브 소재의 Jackson ImmunoResearch Labs 제조원)에 접합된 염소 항-마우스 IgG + M과 함께 항온처리하여 항원을 검출하였다. 세정은 PBS(4X1ml)속에서 수행하였다. 세포를 지닌 격자를 PBS(3ml)중 1% 글루타르알데하이드로 안정화시켰다. 각각의 샘플을 희석수(5X1ml)속에서 세정하였다. 최종적으로 수포를 지닌 격자를 1% PTA, pH 6.5를 사용하여 네가티브적으로 염색(30초) 하였다. 대조군 샘플을 주요 항체의 부재하에서 항온처리하였다. 시험은 80kV에서 작동하는 짜이스(Zeiss) 10C 투과 전자 현미경상에서 수행하였다.
상청액으로부터의 감염성 입자 샘플의 전자 현미경 연구는, 감염성 입자가 VRP-F/HN 레플리콘이 아님을 나타내었다. VEE 레플리콘은 크기가 VEE 바이러스에 근접하는 70nm 바이러스 입자이다[참조: Paredes et aL, J. Virol. 75: 9532 (2001)]. 네가티브 염색은 크기에 있어서 현저한 양의 이질성을 나타내었다. 대조적으로, VEE 레플리콘은 크기가 동질성인 것으로 알려져 있다.
감염성 입자는 PIV3 HN 및 F 당단백질의 표면 발현을 나타내었으며, 이는 감염성 입자와 같은 VRP-F/HN 레플리콘과 일지하지 않았다. 정제된 감염성 입자를 항-HN 모노클로날 항체 "클론 68/2" 및 항-F 모노클로날 항체 "클론 B-102"를 사용하여 면역금 표지에 적용시켰다. 결과는, 감염성 입자가 쥐 Ig 동형을 사용하여 염색한 대조군과 비교하여 항-HN 및 항-F로 우세하게 염색되었음을 나타내었다. 당해 결과는, 감염성 물질이 레플리콘에 기초하지 않는다는 것을 또한 입증하였는데, 이는, 오직 VEE 당단백질만이 레플리콘의 표면상에서 발현되기 때문이다. VEE 레플리콘의 패키징 특성에 따라서, PIV3-HN 및 F 당단백질은 레플리콘 입자에서 제외시킬 수 있다[참조: 본원에 전문이 참조로 인용된, Straus, J. H. & Strauss E. G., The Alphaviruses : Gene Expression, Replication and Evolution. Microbiological Reviews 58 (3): 491-562 (1994)].
실시예 9
HN 및 F에 의해 매개된 감염성 수포의 감염성
당해 감염성 수포의 세포내 도입을 매개하는 표면 단백질의 실체는 특정 단백질에 대한 항체가 감염성을 억제할 수 있는지를 산정함으로써 평가하였다. 우선, 감염성 수포 또는 GFP를 암호화하는 VEE 레플리콘을 항-PIV3 혈청인, 항-HN mAb; 항-F mAb; 항-HN mAb + 항-F mAb; 정상 혈청 및 동형 대조군 쥐 Ig와 함께 2시간 동안 예비항온처리하였다. 다음, BHK 단층을 이러한 예비항온처리된 감염성 수포 또는 VEE 레플리콘과 함께 1시간 동안 감염시켰다. 이후에 단층을 세척하고 성장 배지를 교체하였다. 수포에 의한 감염은 세포를 고정시키고 토끼 항-VEE NSP1 및 cyTM3 접합된 염소 항-토끼 항체와 함께 밤새 염색함으로써 측정하였다. VEE 레플리콘에 의한 감염은 녹색 형광성 단백질의 발현에 의해 5시간 배양한 후 가시화되었다. 100x로 확대시킨 형광 현미경하에서 사진을 찍었다. 감염 수준의 확인은 (+) 또는 (++)로서 표 6에 점수를 매겼다. 감염 근거가 없는 것은 (-)로 점수를 매겼다.
Figure 112005070929264-PCT00005
표 6에 나타낸 데이타는, 감염성 수포와 항-PIV3 폴리클로날 항혈청 또는 PIV3 HN에 대한 모노클로날 항체와의 예비 항온처리가 자가 증식하거나 새로운 세포를 감염시키는 수포의 능력을 차단시켰음을 나타내었다. 수포를 PIV3의 융합 단백질에 대한 단일의 모노클로날 항체와 함께 항온처리하는 경우, 감염성은 어느 정도 소멸되었으나, 전체적으로 억제되지 않았다. 수포와 VEE 단백질에 대한 모노클로날 항체의 예비-항온처리는 수포 감염성에 영향을 미치지 않았다.
후속적인 감염성에 있어서 항체 예비항온처리의 효과는, 레플리콘이 수포대신 사용되는 경우에 매우 상이하였다. 예를 들어, PIV3에 대한 폴리클로날 항혈청 또는 PIV3 당단백질 HN 및 F에 대한 모노클로날 항체 어느 것도 VRP-HN/P 감염성을 억제할 수 없었다(참조: 표 6). 대조적으로, VEE 표면 당단백질에 대한 모노클로날 항체와의 예비항온처리만이 VRP-F/HN 감염성을 억제할 수 있다.
몇가지 중요한 요지가 감염성의 항체 억제의 이러한 연구로부터 도출될 수 있다. 첫째로, 감염성 억제 결과는, HN 및 F 단백질이 자가 증식하는 수포의 표면상에 위치하였음을 나타내었다. 당해 결과는 또한 감염성인 것으로 여겨지는 자가 증식하는 활성이 자가 증식하는 수포의 표면에 위치하는 융합성 당단백질 PIV HN 및 F에 의해 유도됨을 나타내었다. 대조적으로, 이러한 결과는, 레플리콘이 세포를 감염시키는데 사용되는 경우 수용체에 결합하고 첫번째 주기의 감염을 유발하는, VEE 구조 단백질 E1 및 E2임을 확인하였다.
실시예 10
감염성 수포 대 레플리콘의 증폭
다음, 이러한 감염성의 자가 증식하는 수포가 바이러스와 같이 증폭될 수 있는지와 이러한 증폭을 원래의 레플리콘의 성장 특성과 비교하는 방법을 조사하였다. 이를 수행하기 위해, 우선 VRP-F/HN 레플리콘을 다음과 같이 증폭시켰다: (1) 아합치성 BHK 세포의 T-175 플라스크를 약 1x105 iu(sfu)의 VRP-F/HN로 1시간 동안 감염시켰다; (ii) 이후, 세포를 세척하고 신선한 배지를 교체하였다; (iii) 다음 합포체 형성 활성을 VRP-F/HN 적정을 위해 동일한 프로토콜을 사용하여 시간에 걸쳐 모니터하였다. 최초 16시간째에, 감염성 활성의 낮은 역가(약 300sfu)가 존재하였음이 밝혀졌다. 합포체는 적정 과정동안 형성되었으며, 이는 VRP-F/HN의 것과 유사한 형태를 나타내었다. 대략 40시간 후, 합포체 형성 활성은 거의 2500배로 현저히 증가하였고 다른 72 시간 동안 변하지 않았다. 따라서, 레플리콘 입자에 대한 파열 크기는 약 0.1로 계산되었다.
비교시, 레플리콘과 같이 증폭된 VRP-F/HN 감염된 세포로부터 생성된 "감염성 수포 입자"의 능력을 시험하였다. 다시 BHK 세포의 T-175 플라스크를 약 80% 합치성에서 사용하여, 이를 1시간 동안 VRP-F/HN 감염된 세포의 배양 상청액의 형태로 자가 증식하는 수포의 약 1 x 104 sfu로 감염시켰다. 이후에 세포를 세척하고 신선한 배지로 교체하고 합포체 형성 활성을 시간에 걸쳐 모니터하였다. 합포체 형성 활성으로서 측정한 자가 증식하는 수포의 증폭은 VRP-F/HN 레플리콘의 증폭보다 더욱 우수하였다. 자가 증식하는 수포에 대한 성장 곡선은 처음 16시간 동안 낮은 역가(~500sfu)을 나타내었으며 처음 40시간내에 560배까지 합포체 형성 활성이 크게 증가하였다. 후속적으로, 초기 감염후 약 112시간째에, 합포체 형성 활성의 역가는 대략 15,000 배로 증가하였다. 당해 데이타는, VRP-F/HN 감염이 또한 자가 증식할 수 있는 자가 증식하는 수포로 명명된 감염성 입자를 생성한다는 가정을 지지하였다. 이러한 제 2의 "감염성 수포" 입자는 단지 VRP-F/HN 감염으로부터 생성될 수 있으나, VRP-HN, VRP-F 또는 VRP-HN+VRP-F로부터의 생성될 수 없었다. 이러한 현상은 PIV3 감염에 대한 면역원성 조성물용 후보물질로서 VRP-F/HN의 효능 및 적절한 보호 면역성의 효과적인 개시를 또한 설명할 수 있다.
실시예 11
감염성 수포의 특성화
자가 증식하는 수포의 가능한 취약성을 동결-해동, 볼텍싱(vortexing), -80℃에서 7일간 동결, 2500rpm에서 20분 동안 원심분리 및 0.2㎛, 0.45㎛ 및 0.8㎛ 여과기를 통한 여과와 같은 통상의 물리학적 현상에 대한 반응을 시험하였다. 수포를 각각의 물리적 시험에 적용시키기 전 및 후에 적정하고 결과를 하기 표 7에 나타낸다.
당해 결과는, 수포의 물리적 감염성이 동결, 볼텍싱 및 원심분리와 같은 매일의 현상에 직면하는 경우에 활발해짐을 나타내었다. 흥미롭게도, 감염성은 볼텍싱에 의해 크게 증진되는데, 아마도 이는, 볼텍싱에 의해 파괴된 수포의 덩어리 또는 일부 끈적거림이 있기 때문이다. 감염성의 여과능은 수포의 덩어리화 경향이 있다는 개념을 지지한다.
수포 감염성의 취약성
물리적 처리 역가(sfu×10-4/ml)
처리하지 않음 3.06
동결-해동 2.79
2분 동안 볼텍싱 9.81
7일 동안 -80℃로 동결 2.30
2500rpm에서 20분 동안 원심분리: 상청액 2.75
2500rpm에서 20분 동안 원심분리: 펠렛 2.03
0.2㎛를 통해 여과 0.47
0.45㎛를 통해 여과 1.1
0.8㎛를 통해 여과 0.88
실시예 12
감염성 수포를 사용한 면역화
A. PIV3 감염으로부터 자가 증식하는 감염성 수포로 보호된 햄스터
표 8은, 시험으로부터의 결과를 나타내는데, 여기서, 햄스터는 VRP-F/HN 감염된 BHK 세포로부터의 상청액(수포) 또는 VRP-F/HN로 백신화하였다. VRP-F/HN은 1, 2 또는 3회 접종하였다(참조: 표 8). 수포를 1, 2 또는 3회 비강내 투여하였다. 투여량은 제 1 투여량의 2.8x104; 제 2 투여량의 2.6x103; 및 제 3 투여량의 1x105 sfu로서 표 8에 나타낸다. 동물을 모두 PIV3 바이러스의 1x106 LogTCID50로 초기 면역화 후 7주째에 챌린지시키고 호흡기도내 바이러스 복제를 분석하였다. 데이타는 평균 ± SEM (n=4-6)으로 기록하였다.
표 8의 결과는, VRP-F/HN 레플리콘으로 면역화시킨 햄스터가 VRP-F/HN으로 감염된 BHK 세포(수포)로 면역화시킨 햄스터(이는 단지 2회 투여량을 필요로 한다)와 비교하여 동일한 HI 역가를 유발하는데 3회 투여량이 요구됨을 입증하였다. 또한, 수포의 2회 투여량은 LRT 및 URT에서 바이러스를 제거하는데 충분한 반면, 2회 투여량의 VRP-F/HN 레플리콘으로 면역화시킨 햄스터는 단지 LRT에서만 바이러스가 제거되었다(참조: 표 8).
Figure 112005070929264-PCT00006
2회 투여량이 VRP-F/HN(수포)를 사용하여 동물을 보호하는데 최적 투여량인 것으로 여겨지므로, 최적 경로를 햄스터에서 총 보호에 대해 평가하였다. 연구의 당해 단계에서, 표 9에 나타낸 바와 같이, 햄스터를 동일한 농도의 HN 단백질(0.58ng)(VRP-HN- 또는 VRP-F/HN- 감염된 상청액) 및/또는 동일한 F 농도(0.21ng)(VRP-F- 또는 VRP-F/HN-감염된 상청액)을 함유하는 2회 투여량의 수포를 사용하여 비강내(IN) 또는 근육내(IM)로 면역화시켰다. 투여량당 7000 sfu와 동일한 감염성 수포 활성을 함유하는 VRP-F/HN으로 감염된 배양물로부터의 상청액을 제외하고는 모든 접종물이 0 sfu를 나타내었다(참조: 표 9). 이후, 동물을 최종 면역화 및 호흡기도내 바이러스 복제후 7주째에 PIV3 바이러스의 1x105 LogTCID50으로 비강내 챌린지시키고, 호흡기도내의 바이러스 복제 및 중화 역가를 분석하였다. 데이타는 평균 ± SEM(n=4-6)으로 보고하였다.
Figure 112005070929264-PCT00007
당해 결과는, 비강내 경로에 의해 제공된, VRP-F/HN 감염된 BHK 세포(수포)가 상부 및 하부 호흡기도 둘다에서 바이러스를 제거하지만, 근육내 경로로 제공되는 경우 하부 호흡기도(LRT)내에서만 제거함을 입증하였다. VRP-HN 또는 VRP-F 또는 VRP-HN +VRP-F를 함유하는 레플리콘으로 감염된 세포로부터의 상청액을 사용하여 면역화시킨 동물은 LRT 및 URT 로부터 바이러스를 제거하지 않았다.
평가
당해 분야의 숙련가들은 더 이상의 정규 시험없이도, 본원에 기술된 본 발명의 특정 양태에 대한 많은 등량체를 인지하거나 추정할 수 있을 것이다. 이러한 등가물은 하기 청구의 범위에 포함되는 것으로 의도된다.
<110> WYETH HOLDINGS CORPORATION <120> Immunogenic compositions comprising Venezuelan Equine Encephalitis virus replicon vectors and paramyxovirus protein antigens <130> AM101287L1 <140> US 60/476,137 <141> 2003-06-05 <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 13453 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> This sequence is a chimeric sequence of Venezuelan equine encepha litis virus sequences and parainfluenza virus type 3 sequences. <400> 1 ggtcgactct agaggatccc taatacgact cactatagat gggcggcgca tgagagaagc 60 ccagaccaat tacctaccca aaatggagaa agttcacgtt gacatcgagg aagacagccc 120 attcctcaga gctttgcagc ggagcttccc gcagtttgag gtagaagcca agcaggtcac 180 tgataatgac catgctaatg ccagagcgtt ttcgcatctg gcttcaaaac tgatcgaaac 240 ggaggtggac ccatccgaca cgatccttga cattggaagt gcgcccgccc gcagaatgta 300 ttctaagcac aagtatcatt gtatctgtcc gatgagatgt gcggaagatc cggacagatt 360 gtataagtat gcaactaagc tgaagaaaaa ctgtaaggaa ataactgata aggaattgga 420 caagaaaatg aaggagctcg ccgccgtcat gagcgaccct gacctggaaa ctgagactat 480 gtgcctccac gacgacgagt cgtgtcgcta cgaagggcaa gtcgctgttt accaggatgt 540 atacgcggtt gacggaccga caagtctcta tcaccaagcc aataagggag ttagagtcgc 600 ctactggata ggctttgaca ccaccccttt tatgtttaag aacttggctg gagcatatcc 660 atcatactct accaactggg ccgacgaaac cgtgttaacg gctcgtaaca taggcctatg 720 cagctctgac gttatggagc ggtcacgtag agggatgtcc attcttagaa agaagtattt 780 gaaaccatcc aacaatgttc tattctctgt tggctcgacc atctaccacg agaagaggga 840 cttactgagg agctggcacc tgccgtctgt atttcactta cgtggcaagc aaaattacac 900 atgtcggtgt gagactatag ttagttgcga cgggtacgtc gttaaaagaa tagctatcag 960 tccaggcctg tatgggaagc cttcaggcta tgctgctacg atgcaccgcg agggattctt 1020 gtgctgcaaa gtgacagaca cattgaacgg ggagagggtc tcttttcccg tgtgcacgta 1080 tgtgccagct acattgtgtg accaaatgac tggcatactg gcaacagatg tcagtgcgga 1140 cgacgcgcaa aaactgctgg ttgggctcaa ccagcgtata gtcgtcaacg gtcgcaccca 1200 gagaaacacc aataccatga aaaattacct tttgcccgta gtggcccagg catttgctag 1260 gtgggcaaag gaatataagg aagatcaaga agatgaaagg ccactaggac tacgagatag 1320 acagttagtc atggggtgtt gttgggcttt tagaaggcac aagataacat ctatttataa 1380 gcgcccggat acccaaacca tcatcaaagt gaacagcgat ttccactcat tcgtgctgcc 1440 caggataggc agtaacacat tggagatcgg gctgagaaca agaatcagga aaatgttaga 1500 ggagcacaag gagccgtcac ctctcattac cgccgaggac gtacaagaag ctaagtgcgc 1560 agccgatgag gctaaggagg tgcgtgaagc cgaggagttg cgcgcagctc taccaccttt 1620 ggcagctgat gttgaggagc ccactctgga agccgatgtc gacttgatgt tacaagaggc 1680 tggggccggc tcagtggaga cacctcgtgg cttgataaag gttaccagct acgctggcga 1740 ggacaagatc ggctcttacg ctgtgctttc tccgcaggct gtactcaaga gtgaaaaatt 1800 atcttgcatc caccctctcg ctgaacaagt catagtgata acacactctg gccgaaaagg 1860 gcgttatgcc gtggaaccat accatggtaa agtagtggtg ccagagggac atgcaatacc 1920 cgtccaggac tttcaagctc tgagtgaaag tgccaccatt gtgtacaacg aacgtgagtt 1980 cgtaaacagg tacctgcacc atattgccac acatggagga gcgctgaaca ctgatgaaga 2040 atattacaaa actgtcaagc ccagcgagca cgacggcgaa tacctgtacg acatcgacag 2100 gaaacagtgc gtcaagaaag aactagtcac tgggctaggg ctcacaggcg agctggtgga 2160 tcctcccttc catgaattcg cctacgagag tctgagaaca cgaccagccg ctccttacca 2220 agtaccaacc ataggggtgt atggcgtgcc aggatcaggc aagtctggca tcattaaaag 2280 cgcagtcacc aaaaaagatc tagtggtgag cgccaagaaa gaaaactgtg cagaaattat 2340 aagggacgtc aagaaaatga aagggctgga cgtcaatgcc agaactgtgg actcagtgct 2400 cttgaatgga tgcaaacacc ccgtagagac cctgtatatt gacgaagctt ttgcttgtca 2460 tgcaggtact ctcagagcgc tcatagccat tataagacct aaaaaggcag tgctctgcgg 2520 ggatcccaaa cagtgcggtt tttttaacat gatgtgcctg aaagtgcatt ttaaccacga 2580 gatttgcaca caagtcttcc acaaaagcat ctctcgccgt tgcactaaat ctgtgacttc 2640 ggtcgtctca accttgtttt acgacaaaaa aatgagaacg acgaatccga aagagactaa 2700 gattgtgatt gacactaccg gcagtaccaa acctaagcag gacgatctca ttctcacttg 2760 tttcagaggg tgggtgaagc agttgcaaat agattacaaa ggcaacgaaa taatgacggc 2820 agctgcctct caagggctga cccgtaaagg tgtgtatgcc gttcggtaca aggtgaatga 2880 aaatcctctg tacgcaccca cctcagaaca tgtgaacgtc ctactgaccc gcacggagga 2940 ccgcatcgtg tggaaaacac tagccggcga cccatggata aaaacactga ctgccaagta 3000 ccctgggaat ttcactgcca cgatagagga gtggcaagca gagcatgatg ccatcatgag 3060 gcacatcttg gagagaccgg accctaccga cgtcttccag aataaggcaa acgtgtgttg 3120 ggccaaggct ttagtgccgg tgctgaagac cgctggcata gacatgacca ctgaacaatg 3180 gaacactgtg gattattttg aaacggacaa agctcactca gcagagatag tattgaacca 3240 actatgcgtg aggttctttg gactcgatct ggactccggt ctattttctg cacccactgt 3300 tccgttatcc attaggaata atcactggga taactccccg tcgcctaaca tgtacgggct 3360 gaataaagaa gtggtccgtc agctctctcg caggtaccca caactgcctc gggcagttgc 3420 cactggaaga gtctatgaca tgaacactgg tacactgcgc aattatgatc cgcgcataaa 3480 cctagtacct gtaaacagaa gactgcctca tgctttagtc ctccaccata atgaacaccc 3540 acagagtgac ttttcttcat tcgtcagcaa attgaagggc agaactgtcc tggtggtcgg 3600 ggaaaagttg tccgtcccag gcaaaatggt tgactggttg tcagaccggc ctgaggctac 3660 cttcagagct cggctggatt taggcatccc aggtgatgtg cccaaatatg acataatatt 3720 tgttaatgtg aggaccccat ataaatacca tcactatcag cagtgtgaag accatgccat 3780 taagcttagc atgttgacca agaaagcttg tctgcatctg aatcccggcg gaacctgtgt 3840 cagcataggt tatggttacg ctgacagggc cagcgaaagc atcattggtg ctatagcgcg 3900 gcagttcaag ttttcccggg tatgcaaacc gaaatcctca cttgaagaga cggaagttct 3960 gtttgtattc attgggtacg atcgcaaggc ccgtacgcac aatccttaca agctttcatc 4020 aaccttgacc aacatttata caggttccag actccacgaa gccggatgtg caccctcata 4080 tcatgtggtg cgaggggata ttgccacggc caccgaagga gtgattataa atgctgctaa 4140 cagcaaagga caacctggcg gaggggtgtg cggagcgctg tataagaaat tcccggaaag 4200 cttcgattta cagccgatcg aagtaggaaa agcgcgactg gtcaaaggtg cagctaaaca 4260 tatcattcat gccgtaggac caaacttcaa caaagtttcg gaggttgaag gtgacaaaca 4320 gttggcagag gcttatgagt ccatcgctaa gattgtcaac gataacaatt acaagtcagt 4380 agcgattcca ctgttgtcca ccggcatctt ttccgggaac aaagatcgac taacccaatc 4440 attgaaccat ttgctgacag ctttagacac cactgatgca gatgtagcca tatactgcag 4500 ggacaagaaa tgggaaatga ctctcaagga agcagtggct aggagagaag cagtggagga 4560 gatatgcata tccgacgact cttcagtgac agaacctgat gcagagctgg tgagggtgca 4620 tccgaagagt tctttggctg gaaggaaggg ctacagcaca agcgatggca aaactttctc 4680 atatttggaa gggaccaagt ttcaccaggc ggccaaggat atagcagaaa ttaatgccat 4740 gtggcccgtt gcaacggagg ccaatgagca ggtatgcatg tatatcctcg gagaaagcat 4800 gagcagtatt aggtcgaaat gccccgtcga agagtcggaa gcctccacac cacctagcac 4860 gctgccttgc ttgtgcatcc atgccatgac tccagaaaga gtacagcgcc taaaagcctc 4920 acgtccagaa caaattactg tgtgctcatc ctttccattg ccgaagtata gaatcactgg 4980 tgtgcagaag atccaatgct cccagcctat attgttctca ccgaaagtgc ctgcgtatat 5040 tcatccaagg aagtatctcg tggaaacacc accggtagac gagactccgg agccatcggc 5100 agagaaccaa tccacagagg ggacacctga acaaccacca cttataaccg aggatgagac 5160 caggactaga acgcctgagc cgatcatcat cgaagaggaa gaagaggata gcataagttt 5220 gctgtcagat ggcccgaccc accaggtgct gcaagtcgag gcagacattc acgggccgcc 5280 ctctgtatct agctcatcct ggtccattcc tcatgcatcc gactttgatg tggacagttt 5340 atccatactt gacaccctgg agggagctag cgtgaccagc ggggcaacgt cagccgagac 5400 taactcttac ttcgcaaaga gtatggagtt tctggcgcga ccggtgcctg cgcctcgaac 5460 agtattcagg aaccctccac atcccgctcc gcgcacaaga acaccgtcac ttgcacccag 5520 cagggcctgc tcgagaacca gcctagtttc caccccgcca ggcgtgaata gggtgatcac 5580 tagagaggag ctcgaggcgc ttaccccgtc acgcactcct agcaggtcgg tctcgagaac 5640 cagcctggtc tccaacccgc caggcgtaaa tagggtgatt acaagagagg agtttgaggc 5700 gttcgtagca caacaacaat gacggtttga tgcgggtgca tacatctttt cctccgacac 5760 cggtcaaggg catttacaac aaaaatcagt aaggcaaacg gtgctatccg aagtggtgtt 5820 ggagaggacc gaattggaga tttcgtatgc cccgcgcctc gaccaagaaa aagaagaatt 5880 actacgcaag aaattacagt taaatcccac acctgctaac agaagcagat accagtccag 5940 gaaggtggag aacatgaaag ccataacagc tagacgtatt ctgcaaggcc tagggcatta 6000 tttgaaggca gaaggaaaag tggagtgcta ccgaaccctg catcctgttc ctttgtattc 6060 atctagtgtg aaccgtgcct tctcaagccc caaggtcgca gtggaagcct gtaacgccat 6120 gttgaaagag aactttccga ctgtggcttc ttactgtatt attccagagt acgatgccta 6180 tttggacatg gttgacggag cttcatgctg cttagacact gccagttttt gccctgcaaa 6240 gctgcgcagc tttccaaaga aacactccta tttggaaccc acaatacgat cggcagtgcc 6300 ttcagcgatc cagaacacgc tccagaacgt cctggcagct gccacaaaaa gaaattgcaa 6360 tgtcacgcaa atgagagaat tgcccgtatt ggattcggcg gcctttaatg tggaatgctt 6420 caagaaatat gcgtgtaata atgaatattg ggaaacgttt aaagaaaacc ccatcaggct 6480 tactgaagaa aacgtggtaa attacattac caaattaaaa ggaccaaaag ctgctgctct 6540 ttttgcgaag acacataatt tgaatatgtt gcaggacata ccaatggaca ggtttgtaat 6600 ggacttaaag agagacgtga aagtgactcc aggaacaaaa catactgaag aacggcccaa 6660 ggtacaggtg atccaggctg ccgatccgct agcaacagcg tatctgtgcg gaatccaccg 6720 agagctggtt aggagattaa atgcggtcct gcttccgaac attcatacac tgtttgatat 6780 gtcggctgaa gactttgacg ctattatagc cgagcacttc cagcctgggg attgtgttct 6840 ggaaactgac atcgcgtcgt ttgataaaag tgaggacgac gccatggctc tgaccgcgtt 6900 aatgattctg gaagacttag gtgtggacgc agagctgttg acgctgattg aggcggcttt 6960 cggcgaaatt tcatcaatac atttgcccac taaaactaaa tttaaattcg gagccatgat 7020 gaaatctgga atgttcctca cactgtttgt gaacacagtc attaacattg taatcgcaag 7080 cagagtgttg agagaacggc taaccggatc accatgtgca gcattcattg gagatgacaa 7140 tatcgtgaaa ggagtcaaat cggacaaatt aatggcagac aggtgcgcca cctggttgaa 7200 tatggaagtc aagattatag atgctgtggt gggcgagaaa gcgccctatt tctgtggagg 7260 gtttattttg tgtgactccg tgaccggcac agcgtgccgt gtggcagacc ccctaaaaag 7320 gctgtttaag cttggcaaac ctctggcagc agacgatgaa catgatgatg acaggagaag 7380 ggcattgcat gaagagtcaa cacgctggaa ccgagtgggt attctttcag agctgtgcaa 7440 ggcagtagaa tcaaggtatg aaaccgtagg aacttccatc atagttatgg ccatgactac 7500 tctagctagc agtgttaaat cattcagcta cctgagaggg gcccctataa ctctctacgg 7560 ctaacctgaa tggactacga catagtcgtt tgatccagcc gccaccatgc caacctcaat 7620 actgctaatt attacaacca tgattatggc atctttctgc caaatagata tcacaaaact 7680 acagcatgta ggtgtattgg ttaacagtcc caaagggatg aagatatcac aaaactttga 7740 aacaagatat ctaattttga gcctcatacc aaaaatagaa gattctaact cttgtggtga 7800 ccaacagatc aagcaataca agaggttatt ggatagactg atcattcctt tatatgatgg 7860 attaagatta cagaaggatg tgatagtgtc caatcaagaa tccaatgaaa acactgaccc 7920 cagaacaaaa cgattctttg gaggggtaat tggaactatt gctctgggag tggcaacctc 7980 agcacaaatt acagcggcag ttgctctggt tgaagccaag caggcaagat cagacattga 8040 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gctgttcaat acaaataaag aaggaactct tgcattttac acaccaaatg atataacatt 8940 aaacaattct gttgcacttg atccaattga catatcaatc gagctcaata aggccaaatc 9000 agatctagaa gagtcaaaag aatggataag aaggtcaaat caaaaactag attccattgg 9060 aaattggcat caatctagca ccacaatcat aattgttttg ataatgataa ttatattgtt 9120 tataattaat gtaacgataa ttataattgc agttaagtat tacagaattc aaaagagaaa 9180 tcgagtggat caaaatgata aaccatatgt attaacaaac aaatgaaagc taaacttaat 9240 taaggcgcgc cccgcggtgt caaaaaccgc gtggacgtgg ttaacatccc tgctgggagg 9300 atcagccgta attattataa ttggcttggt gctggctact attgtggcca tgtacgtgct 9360 gaccaaccag aaacataatt gagaggggcc cctataactc tctacggcta acctgaatgg 9420 actacgacat cgataagctc ggaattcagc cgccaccatg gaatactgga agcacaccaa 9480 tcacgggaaa gatgctggta atgagctgga aacatccatg gctactcatg gcaacaagat 9540 caccaacaag ataacatata tattatggac aataatcctg gtgttattat caatagtctt 9600 catcatagtg ctaattaatt ccatcaaaag tgaaaaagcc catgaatcat tgctacaaga 9660 cgtaaacaat gagtttatgg aagttacaga aaagatccaa atggcatcgg ataatattaa 9720 tgatctaata cagtcaggag tgaatacaag gcttcttaca attcagagtc atgtccagaa 9780 ttatataccg atatcattga cacaacaaat gtcggatctt aggaaattca ttagtgaaat 9840 tacaattagg aatgataatc aagaagtgcc tccacaaaga ataacacatg atgtgggcat 9900 aaaaccttta aatccagatg atttttggag atgcacgtct ggtcttccat ctttaatgaa 9960 aactccaaaa ataaggttaa tgccggggcc gggattatta gctatgccaa cgactgttga 10020 tggctgtgtt agaactccgt ccttagttat aaatgatctg atttatgctt atacctcgaa 10080 tctaattact cgaggttgcc aggatatagg aaaatcatat caagtattac agatagggat 10140 aataactgta aactcagact tggtacctga cttaaatcct aggatctctc atactttcaa 10200 cataaatgac aatagaaagt catgttctct agcactccta aacacagatg tatatcaact 10260 gtgttcgact cccaaagttg atgaaagatc agattatgca tcatcaggca tagaagatat 10320 tgtacttgat atcgtcaatc atgatggttc aatctcaaca acaagattta agaacaataa 10380 tataagtttt gatcaaccat atgcggcatt atacccatct gttggaccag ggatatacta 10440 caaaggcaaa ataatatttc tcgggtatgg aggtcttgaa catccaataa atgagaatgc 10500 aatctgcaac acaactgggt gtcccgggaa aacgcagaga gactgcaatc aggcatctca 10560 tagtccttgg ttttcagaca gaaggatggt caactccatt attgttgttg acaagggctt 10620 aaactcaatt ccaaaactga aggtatggac gatatccatg agacaaaatt actgggggtc 10680 agaaggaagg ctacttctac taggtaacaa gatctatata tatacaagat ctacaagttg 10740 gcatagcaag ttacaattag gaataattga tattactgat tacagtgata taagaataaa 10800 atggacatgg cataatgtgc tatcaagacc aggaaacaat gaatgtccat ggggacattc 10860 atgcccagat ggatgtataa caggagtata tactgatgca tatccactca atcccacagg 10920 gagcattgtg tcatctgtca tattagactc gcaaaaatcg agagtaaacc cagtcataac 10980 ttactcaaca tcaactgaaa gggtaaacga gctggccatc cgaaacaaaa cactctcagc 11040 tggatataca acaacgagct gcattacaca ctataacaaa ggatattgtt ttcatatagt 11100 agaaataaat cataaaagct tagacacatt ccaacctatg ttgttcaaaa cagagattcc 11160 aaaaagctgc agttaaggat cctctagagt cgacctgcag ccaagcttat cgatacagca 11220 gcaattggca agctgcttac atagaactcg cggcgattgg catgccgctt taaaattttt 11280 attttatttt tcttttcttt tccgaatcgg attttgtttt taatatttca aaaaaaaaaa 11340 aaaaaaaaaa gggcggccgc cgagctcgaa ttcgtaatca tgtcatagct gtttcctgtg 11400 tgaaattgtt atccgctcac aattccacac aacatacgag ccggaagcat aaagtgtaaa 11460 gcctggggtg cctaatgagt gagctaactc acattaattg cgttgcgctc actgcccgct 11520 ttccagtcgg gaaacctgtc gtgccagtcg aggggaatta attcttgaag acgaaagggc 11580 caggtggcac ttttcgggga aatgtgcgcg gaacccctat ttgtttattt ttctaaatac 11640 attcaaatat gtatccgctc atgagacaat aaccctgata aatgcttcaa taatattgaa 11700 aaaggaagag tatgagtatt caacatttcc gtgtcgccct tattcccttt tttgcggcat 11760 tttgccttcc tgtttttgct cacccagaaa cgctggtgaa agtaaaagat gctgaagatc 11820 agttgggtgc acgcgtgggt tacatcgaac tggatctcaa cagcggtaag atccttgaga 11880 gttttcgccc cgaagaacgt tttccaatga tgagcacttt taaagttctg ctatgtggcg 11940 cggtattatc ccgtgttgac gccgggcaag agcaactcgg tcgccgcata cactattctc 12000 agaatgactt ggttgagtac tcaccagtca cagaaaagca tcttacggat ggcatgacag 12060 taagagaatt atgcagtgct gccataacca tgagtgataa cactgcggcc aacttacttc 12120 tgacaacgat cggaggaccg aaggagctaa ccgctttttt gcacaacatg ggggatcatg 12180 taactcgcct tgatcgttgg gaaccggagc tgaatgaagc cataccaaac gacgagcgtg 12240 acaccacgat gcctgtagca atggcaacaa cgttgcgcaa actattaact ggcgaactac 12300 ttactctagc ttcccggcaa caattaatag actggatgga ggcggataaa gttgcaggac 12360 cacttctgcg ctcggccctt ccggctggct ggtttattgc tgataaatct ggagccggtg 12420 agcgtgggtc tcgcggtatc attgcagcac tggggccaga tggtaagccc tcccgtatcg 12480 tagttatcta cacgacgggg agtcaggcaa ctatggatga acgaaataga cagatcgctg 12540 agataggtgc ctcactgatt aagcattggt aactgtcaga ccaagtttac tcatatatac 12600 tttagattga tttaaaactt catttttaat ttaaaaggat ctaggtgaag atcctttttg 12660 ataatctcat gaccaaaatc ccttaacgtg agttttcgtt ccactgagcg tcagaccccg 12720 tagaaaagat caaaggatct tcttgagatc ctttttttct gcgcgtaatc tgctgcttgc 12780 aaacaaaaaa accaccgcta ccagcggtgg tttgtttgcc ggatcaagag ctaccaactc 12840 tttttccgaa ggtaactggc ttcagcagag cgcagatacc aaatactgtc cttctagtgt 12900 agccgtagtt aggccaccac ttcaagaact ctgtagcacc gcctacatac ctcgctctgc 12960 taatcctgtt accagtggct gctgccagtg gcgataagtc gtgtcttacc gggttggact 13020 caagacgata gttaccggat aaggcgcagc ggtcgggctg aacggggggt tcgtgcacac 13080 agcccagctt ggagcgaacg acctacaccg aactgagata cctacagcgt gagctatgag 13140 aaagcgccac gcttcccgaa gggagaaagg cggacaggta tccggtaagc ggcagggtcg 13200 gaacaggaga gcgcacgagg gagcttccag ggggaaacgc ctggtatctt tatagtcctg 13260 tcgggtttcg ccacctctga cttgagcgtc gatttttgtg atgctcgtca ggggggcgga 13320 gcctatggaa aaacgccagc aacgcgctgg cgaaaggggg atgtgctgca aggcgattaa 13380 gttgggtaac gccagggttt tcccagtcac gacgttgtaa aacgacggcc agtgccaagc 13440 ttgcatgcct gca 13453 <210> 2 <211> 2492 <212> PRT <213> Venezuelan equine encephalitis virus non-structural proteins 1-4 <400> 2 Met Glu Lys Val His Val Asp Ile Glu Glu Asp Ser Pro Phe Leu Arg 1 5 10 15 Ala Leu Gln Arg Ser Phe Pro Gln Phe Glu Val Glu Ala Lys Gln Val 20 25 30 Thr Asp Asn Asp His Ala Asn Ala Arg Ala Phe Ser His Leu Ala Ser 35 40 45 Lys Leu Ile Glu Thr Glu Val Asp Pro Ser Asp Thr Ile Leu Asp Ile 50 55 60 Gly Ser Ala Pro Ala Arg Arg Met Tyr Ser Lys His Lys Tyr His Cys 65 70 75 80 Ile Cys Pro Met Arg Cys Ala Glu Asp Pro Asp Arg Leu Tyr Lys Tyr 85 90 95 Ala Thr Lys Leu Lys Lys Asn Cys Lys Glu Ile Thr Asp Lys Glu Leu 100 105 110 Asp Lys Lys Met Lys Glu Leu Ala Ala Val Met Ser Asp Pro Asp Leu 115 120 125 Glu Thr Glu Thr Met Cys Leu His Asp Asp Glu Ser Cys Arg Tyr Glu 130 135 140 Gly Gln Val Ala Val Tyr Gln Asp Val Tyr Ala Val Asp Gly Pro Thr 145 150 155 160 Ser Leu Tyr His Gln Ala Asn Lys Gly Val Arg Val Ala Tyr Trp Ile 165 170 175 Gly Phe Asp Thr Thr Pro Phe Met Phe Lys Asn Leu Ala Gly Ala Tyr 180 185 190 Pro Ser Tyr Ser Thr Asn Trp Ala Asp Glu Thr Val Leu Thr Ala Arg 195 200 205 Asn Ile Gly Leu Cys Ser Ser Asp Val Met Glu Arg Ser Arg Arg Gly 210 215 220 Met Ser Ile Leu Arg Lys Lys Tyr Leu Lys Pro Ser Asn Asn Val Leu 225 230 235 240 Phe Ser Val Gly Ser Thr Ile Tyr His Glu Lys Arg Asp Leu Leu Arg 245 250 255 Ser Trp His Leu Pro Ser Val Phe His Leu Arg Gly Lys Gln Asn Tyr 260 265 270 Thr Cys Arg Cys Glu Thr Ile Val Ser Cys Asp Gly Tyr Val Val Lys 275 280 285 Arg Ile Ala Ile Ser Pro Gly Leu Tyr Gly 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Arg Ala Ala Leu Pro Pro 500 505 510 Leu Ala Ala Asp Val Glu Glu Pro Thr Leu Glu Ala Asp Val Asp Leu 515 520 525 Met Leu Gln Glu Ala Gly Ala Gly Ser Val Glu Thr Pro Arg Gly Leu 530 535 540 Ile Lys Val Thr Ser Tyr Ala Gly Glu Asp Lys Ile Gly Ser Tyr Ala 545 550 555 560 Val Leu Ser Pro Gln Ala Val Leu Lys Ser Glu Lys Leu Ser Cys Ile 565 570 575 His Pro Leu Ala Glu Gln Val Ile Val Ile Thr His Ser Gly Arg Lys 580 585 590 Gly Arg Tyr Ala Val Glu Pro Tyr His Gly Lys Val Val Val Pro Glu 595 600 605 Gly His Ala Ile Pro Val Gln Asp Phe Gln Ala Leu Ser Glu Ser Ala 610 615 620 Thr Ile Val Tyr Asn Glu Arg Glu Phe Val Asn Arg Tyr Leu His His 625 630 635 640 Ile Ala Thr His Gly Gly Ala Leu Asn Thr Asp Glu Glu Tyr Tyr Lys 645 650 655 Thr Val Lys Pro Ser Glu His Asp Gly Glu Tyr Leu Tyr Asp Ile Asp 660 665 670 Arg Lys Gln Cys Val Lys Lys Glu Leu Val Thr Gly Leu Gly Leu Thr 675 680 685 Gly Glu Leu Val Asp Pro Pro Phe His Glu Phe Ala Tyr Glu Ser Leu 690 695 700 Arg Thr Arg Pro Ala Ala Pro Tyr Gln Val Pro 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Val Tyr Ala Val Arg 915 920 925 Tyr Lys Val Asn Glu Asn Pro Leu Tyr Ala Pro Thr Ser Glu His Val 930 935 940 Asn Val Leu Leu Thr Arg Thr Glu Asp Arg Ile Val Trp Lys Thr Leu 945 950 955 960 Ala Gly Asp Pro Trp Ile Lys Thr Leu Thr Ala Lys Tyr Pro Gly Asn 965 970 975 Phe Thr Ala Thr Ile Glu Glu Trp Gln Ala Glu His Asp Ala Ile Met 980 985 990 Arg His Ile Leu Glu Arg Pro Asp Pro Thr Asp Val Phe Gln Asn Lys 995 1000 1005 Ala Asn Val Cys Trp Ala Lys Ala Leu Val Pro Val Leu Lys Thr 1010 1015 1020 Ala Gly Ile Asp Met Thr Thr Glu Gln Trp Asn Thr Val Asp Tyr 1025 1030 1035 Phe Glu Thr Asp Lys Ala His Ser Ala Glu Ile Val Leu Asn Gln 1040 1045 1050 Leu Cys Val Arg Phe Phe Gly Leu Asp Leu Asp Ser Gly Leu Phe 1055 1060 1065 Ser Ala Pro Thr Val Pro Leu Ser Ile Arg Asn Asn His Trp Asp 1070 1075 1080 Asn Ser Pro Ser Pro Asn Met Tyr Gly Leu Asn Lys Glu Val Val 1085 1090 1095 Arg Gln Leu Ser Arg Arg Tyr Pro Gln Leu Pro Arg Ala Val Ala 1100 1105 1110 Thr Gly Arg Val Tyr Asp Met Asn Thr Gly Thr Leu Arg Asn Tyr 1115 1120 1125 Asp Pro Arg Ile Asn Leu Val Pro Val Asn Arg Arg Leu Pro His 1130 1135 1140 Ala Leu Val Leu His His Asn Glu His Pro Gln Ser Asp Phe Ser 1145 1150 1155 Ser Phe Val Ser Lys Leu Lys Gly Arg Thr Val Leu Val Val Gly 1160 1165 1170 Glu Lys Leu Ser Val Pro Gly Lys Met Val Asp Trp Leu Ser Asp 1175 1180 1185 Arg Pro Glu Ala Thr Phe Arg Ala Arg Leu Asp Leu Gly Ile Pro 1190 1195 1200 Gly Asp Val Pro Lys Tyr Asp Ile Ile Phe Val Asn Val Arg Thr 1205 1210 1215 Pro Tyr Lys Tyr His His Tyr Gln Gln Cys Glu Asp His Ala Ile 1220 1225 1230 Lys Leu Ser Met Leu Thr Lys Lys Ala Cys Leu His Leu Asn Pro 1235 1240 1245 Gly Gly Thr Cys Val Ser Ile Gly Tyr Gly Tyr Ala Asp Arg Ala 1250 1255 1260 Ser Glu Ser Ile Ile Gly Ala Ile Ala Arg Gln Phe Lys Phe Ser 1265 1270 1275 Arg Val Cys Lys Pro Lys Ser Ser Leu Glu Glu Thr Glu Val Leu 1280 1285 1290 Phe Val Phe Ile Gly Tyr Asp Arg Lys Ala Arg Thr His Asn Pro 1295 1300 1305 Tyr Lys Leu Ser Ser Thr Leu Thr Asn Ile Tyr Thr Gly Ser Arg 1310 1315 1320 Leu 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Ala Asp 1715 1720 1725 Ile His Gly Pro Pro Ser Val Ser Ser Ser Ser Trp Ser Ile Pro 1730 1735 1740 His Ala Ser Asp Phe Asp Val Asp Ser Leu Ser Ile Leu Asp Thr 1745 1750 1755 Leu Glu Gly Ala Ser Val Thr Ser Gly Ala Thr Ser Ala Glu Thr 1760 1765 1770 Asn Ser Tyr Phe Ala Lys Ser Met Glu Phe Leu Ala Arg Pro Val 1775 1780 1785 Pro Ala Pro Arg Thr Val Phe Arg Asn Pro Pro His Pro Ala Pro 1790 1795 1800 Arg Thr Arg Thr Pro Ser Leu Ala Pro Ser Arg Ala Cys Ser Arg 1805 1810 1815 Thr Ser Leu Val Ser Thr Pro Pro Gly Val Asn Arg Val Ile Thr 1820 1825 1830 Arg Glu Glu Leu Glu Ala Leu Thr Pro Ser Arg Thr Pro Ser Arg 1835 1840 1845 Ser Val Ser Arg Thr Ser Leu Val Ser Asn Pro Pro Gly Val Asn 1850 1855 1860 Arg Val Ile Thr Arg Glu Glu Phe Glu Ala Phe Val Ala Gln Gln 1865 1870 1875 Gln Arg Phe Asp Ala Gly Ala Tyr Ile Phe Ser Ser Asp Thr Gly 1880 1885 1890 Gln Gly His Leu Gln Gln Lys Ser Val Arg Gln Thr Val Leu Ser 1895 1900 1905 Glu Val Val Leu Glu Arg Thr Glu Leu Glu Ile Ser Tyr Ala Pro 1910 1915 1920 Arg Leu Asp Gln Glu Lys Glu Glu Leu Leu Arg Lys Lys Leu Gln 1925 1930 1935 Leu Asn Pro Thr Pro Ala Asn Arg Ser Arg Tyr Gln Ser Arg Lys 1940 1945 1950 Val Glu Asn Met Lys Ala Ile Thr Ala Arg Arg Ile Leu Gln Gly 1955 1960 1965 Leu Gly His Tyr Leu Lys Ala Glu Gly Lys Val Glu Cys Tyr Arg 1970 1975 1980 Thr Leu His Pro Val Pro Leu Tyr Ser Ser Ser Val Asn Arg Ala 1985 1990 1995 Phe Ser Ser Pro Lys Val Ala Val Glu Ala Cys Asn Ala Met Leu 2000 2005 2010 Lys Glu Asn Phe Pro Thr Val Ala Ser Tyr Cys Ile Ile Pro Glu 2015 2020 2025 Tyr Asp Ala Tyr Leu Asp Met Val Asp Gly Ala Ser Cys Cys Leu 2030 2035 2040 Asp Thr Ala Ser Phe Cys Pro Ala Lys Leu Arg Ser Phe Pro Lys 2045 2050 2055 Lys His Ser Tyr Leu Glu Pro Thr Ile Arg Ser Ala Val Pro Ser 2060 2065 2070 Ala Ile Gln Asn Thr Leu Gln Asn Val Leu Ala Ala Ala Thr Lys 2075 2080 2085 Arg Asn Cys Asn Val Thr Gln Met Arg Glu Leu Pro Val Leu Asp 2090 2095 2100 Ser Ala Ala Phe Asn Val Glu Cys Phe Lys Lys Tyr Ala Cys Asn 2105 2110 2115 Asn Glu Tyr Trp Glu Thr Phe Lys Glu Asn Pro Ile Arg Leu Thr 2120 2125 2130 Glu Glu Asn Val Val Asn Tyr Ile Thr Lys Leu Lys Gly Pro Lys 2135 2140 2145 Ala Ala Ala Leu Phe Ala Lys Thr His Asn Leu Asn Met Leu Gln 2150 2155 2160 Asp Ile Pro Met Asp Arg Phe Val Met Asp Leu Lys Arg Asp Val 2165 2170 2175 Lys Val Thr Pro Gly Thr Lys His Thr Glu Glu Arg Pro Lys Val 2180 2185 2190 Gln Val Ile Gln Ala Ala Asp Pro Leu Ala Thr Ala Tyr Leu Cys 2195 2200 2205 Gly Ile His Arg Glu Leu Val Arg Arg Leu Asn Ala Val Leu Leu 2210 2215 2220 Pro Asn Ile His Thr Leu Phe Asp Met Ser Ala Glu Asp Phe Asp 2225 2230 2235 Ala Ile Ile Ala Glu His Phe Gln Pro Gly Asp Cys Val Leu Glu 2240 2245 2250 Thr Asp Ile Ala Ser Phe Asp Lys Ser Glu Asp Asp Ala Met Ala 2255 2260 2265 Leu Thr Ala Leu Met Ile Leu Glu Asp Leu Gly Val Asp Ala Glu 2270 2275 2280 Leu Leu Thr Leu Ile Glu Ala Ala Phe Gly Glu Ile Ser Ser Ile 2285 2290 2295 His Leu Pro Thr Lys Thr Lys Phe Lys Phe Gly Ala Met Met Lys 2300 2305 2310 Ser Gly Met Phe Leu Thr Leu Phe Val Asn Thr Val Ile Asn Ile 2315 2320 2325 Val Ile Ala Ser Arg Val Leu Arg Glu Arg Leu Thr Gly Ser Pro 2330 2335 2340 Cys Ala Ala Phe Ile Gly Asp Asp Asn Ile Val Lys Gly Val Lys 2345 2350 2355 Ser Asp Lys Leu Met Ala Asp Arg Cys Ala Thr Trp Leu Asn Met 2360 2365 2370 Glu Val Lys Ile Ile Asp Ala Val Val Gly Glu Lys Ala Pro Tyr 2375 2380 2385 Phe Cys Gly Gly Phe Ile Leu Cys Asp Ser Val Thr Gly Thr Ala 2390 2395 2400 Cys Arg Val Ala Asp Pro Leu Lys Arg Leu Phe Lys Leu Gly Lys 2405 2410 2415 Pro Leu Ala Ala Asp Asp Glu His Asp Asp Asp Arg Arg Arg Ala 2420 2425 2430 Leu His Glu Glu Ser Thr Arg Trp Asn Arg Val Gly Ile Leu Ser 2435 2440 2445 Glu Leu Cys Lys Ala Val Glu Ser Arg Tyr Glu Thr Val Gly Thr 2450 2455 2460 Ser Ile Ile Val Met Ala Met Thr Thr Leu Ala Ser Ser Val Lys 2465 2470 2475 Ser Phe Ser Tyr Leu Arg Gly Ala Pro Ile Thr Leu Tyr Gly 2480 2485 2490 <210> 3 <211> 539 <212> PRT <213> parainfluenza virus type 3 Fusion (F) protein sequence <400> 3 Met Pro Thr Ser Ile Leu Leu Ile Ile Thr Thr Met Ile Met Ala Ser 1 5 10 15 Phe Cys Gln Ile Asp Ile Thr Lys Leu Gln His Val Gly Val Leu Val 20 25 30 Asn Ser Pro Lys Gly Met Lys Ile Ser Gln Asn Phe Glu Thr Arg Tyr 35 40 45 Leu Ile Leu Ser Leu Ile Pro Lys Ile Glu Asp Ser Asn Ser Cys Gly 50 55 60 Asp Gln Gln Ile Lys Gln Tyr Lys Arg Leu Leu Asp Arg Leu Ile Ile 65 70 75 80 Pro Leu Tyr Asp Gly Leu Arg Leu Gln Lys Asp Val Ile Val Ser Asn 85 90 95 Gln Glu Ser Asn Glu Asn Thr Asp Pro Arg Thr Lys Arg Phe Phe Gly 100 105 110 Gly Val Ile Gly Thr Ile Ala Leu Gly Val Ala Thr Ser Ala Gln Ile 115 120 125 Thr Ala Ala Val Ala Leu Val Glu Ala Lys Gln Ala Arg Ser Asp Ile 130 135 140 Glu Lys Leu Lys Glu Ala Ile Arg Asp Thr Asn Lys Ala Val Gln Ser 145 150 155 160 Val Gln Ser Ser Ile Gly Asn Leu Ile Val Ala Ile Lys Ser Val Gln 165 170 175 Asp Tyr Val Asn Lys Glu Ile Val Pro Ser Ile Ala Arg Leu Gly Cys 180 185 190 Glu Ala Ala Gly Leu Gln Leu Gly Ile Ala Leu Thr Gln His Tyr Ser 195 200 205 Glu Leu Thr Asn Ile Phe Gly Asp Asn Ile Gly Ser Leu Gln Glu Lys 210 215 220 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Asn Asp Leu Ile Gln Ser Gly Val Asn 85 90 95 Thr Arg Leu Leu Thr Ile Gln Ser His Val Gln Asn Tyr Ile Pro Ile 100 105 110 Ser Leu Thr Gln Gln Met Ser Asp Leu Arg Lys Phe Ile Ser Glu Ile 115 120 125 Thr Ile Arg Asn Asp Asn Gln Glu Val Pro Pro Gln Arg Ile Thr His 130 135 140 Asp Val Gly Ile Lys Pro Leu Asn Pro Asp Asp Phe Trp Arg Cys Thr 145 150 155 160 Ser Gly Leu Pro Ser Leu Met Lys Thr Pro Lys Ile Arg Leu Met Pro 165 170 175 Gly Pro Gly Leu Leu Ala Met Pro Thr Thr Val Asp Gly Cys Val Arg 180 185 190 Thr Pro Ser Leu Val Ile Asn Asp Leu Ile Tyr Ala Tyr Thr Ser Asn 195 200 205 Leu Ile Thr Arg Gly Cys Gln Asp Ile Gly Lys Ser Tyr Gln Val Leu 210 215 220 Gln Ile Gly Ile Ile Thr Val Asn Ser Asp Leu Val Pro Asp Leu Asn 225 230 235 240 Pro Arg Ile Ser His Thr Phe Asn Ile Asn Asp Asn Arg Lys Ser Cys 245 250 255 Ser Leu Ala Leu Leu Asn Thr Asp Val Tyr Gln Leu Cys Ser Thr Pro 260 265 270 Lys Val Asp Glu Arg Ser Asp Tyr Ala Ser Ser Gly Ile Glu Asp Ile 275 280 285 Val Leu Asp Ile Val Asn His Asp Gly Ser Ile Ser Thr Thr Arg Phe 290 295 300 Lys Asn Asn Asn Ile Ser Phe Asp Gln Pro Tyr Ala Ala Leu Tyr Pro 305 310 315 320 Ser Val Gly Pro Gly Ile Tyr Tyr Lys Gly Lys Ile Ile Phe Leu Gly 325 330 335 Tyr Gly Gly Leu Glu His Pro Ile Asn Glu Asn Ala Ile Cys Asn Thr 340 345 350 Thr Gly Cys Pro Gly Lys Thr Gln Arg Asp Cys Asn Gln Ala Ser His 355 360 365 Ser Pro Trp Phe Ser Asp Arg Arg Met Val Asn Ser Ile Ile Val Val 370 375 380 Asp Lys Gly Leu Asn Ser Ile Pro Lys Leu Lys Val Trp Thr Ile Ser 385 390 395 400 Met Arg Gln Asn Tyr Trp Gly Ser Glu Gly Arg Leu Leu Leu Leu Gly 405 410 415 Asn Lys Ile Tyr Ile Tyr Thr Arg Ser Thr Ser Trp His Ser Lys Leu 420 425 430 Gln Leu Gly Ile Ile Asp Ile Thr Asp Tyr Ser Asp Ile Arg Ile Lys 435 440 445 Trp Thr Trp His Asn Val Leu Ser Arg Pro Gly Asn Asn Glu Cys Pro 450 455 460 Trp Gly His Ser Cys Pro Asp Gly Cys Ile Thr Gly Val Tyr Thr Asp 465 470 475 480 Ala Tyr Pro Leu Asn Pro Thr Gly Ser Ile Val Ser Ser Val Ile Leu 485 490 495 Asp Ser Gln Lys Ser Arg Val Asn Pro Val Ile Thr Tyr Ser Thr Ser 500 505 510 Thr Glu Arg Val Asn Glu Leu Ala Ile Arg Asn Lys Thr Leu Ser Ala 515 520 525 Gly Tyr Thr Thr Thr Ser Cys Ile Thr His Tyr Asn Lys Gly Tyr Cys 530 535 540 Phe His Ile Val Glu Ile Asn His Lys Ser Leu Asp Thr Phe Gln Pro 545 550 555 560 Met Leu Phe Lys Thr Glu Ile Pro Lys Ser Cys Ser 565 570

Claims (66)

  1. 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 레플리카제, 파라인플루엔자 바이러스 제3형 F 당단백질 및 파라인플루엔자 바이러스 제3형 HN 당단백질을 암호화하는 분리된 재조합 핵산 분자.
  2. 서열번호 1에 나타낸 핵산 서열을 갖는, 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 레플리카제, 파라인플루엔자 바이러스 제3형 F 당단백질 및 파라인플루엔자 바이러스 제3형 HN 당단백질을 암호화하는 분리된 재조합 핵산 분자.
  3. 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 레플리카제 유전자, 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 레플리카제 단백질, 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 E1 당단백질, 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 E2 당단백질, 파라인플루엔자 바이러스 제3형 F 당단백질 유전자 및 파라인플루엔자 바이러스 제3형 HN 당단백질 유전자를 포함하는, 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 레플리콘 입자(VRP) 집단을 포함하는 면역원성 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 레플리콘 입자가 BHK 배양된 세포의 단층을 감염시키는데 사용되는 경우 세포병변 효과를 유발하는 면역원성 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 레플리콘 입자로 감염된 세포로부터의 상청액이, 감염되지 않은 세포 단층으로 이전되는 경우, 상기 레플리콘 입자의 부재하에 세포병변 효과를 유발하는 면역원성 조성물.
  6. 제4항에 있어서, BHK 배양된 세포에서의 세포병변 효과가 합포체 형성인 면역원성 조성물.
  7. 제4항에 있어서, BHK 배양된 세포에서의 세포병변 효과가 단층 파열인 면역원성 조성물.
  8. 제4항에 있어서, 집단이 검출가능한 복제 적격 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스를 함유하지 않는 면역원성 조성물.
  9. 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 레플리카제 유전자, 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 레플리카제 단백질, 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 E1 당단백질, 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 E2 당단백질, 파라인플루엔자 바이러스 제3형 F 당단백질 유전자, 파라인플루엔자 바이러스 제3형 HN 당단백질 유전자를 포함하는 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 레플리콘 입자(VRP)의 집단을 포함하는 면역원성 조성물로서, 당해 집단이 검출가능한 복제 적격 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스를 함유하지 않고; 당해 레플리콘 입자가 배양된 BHK 세포의 단층을 감염시키는데 사용되는 경우 세포병변 효과를 유발하며; 당해 레플리콘 입자로 감염된 세포로부터의 상청액이 감염되지 않은 세포 단층으로 이전되는 경우 상기 레플리콘 입자의 부재하에 세포병변 효과를 유발하는 면역원성 조성물.
  10. 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 레플리카제 유전자, 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 레플리카제 단백질, 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 E1 당단백질, 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 E2 당단백질, 파라인플루엔자 바이러스 제3형 F 당단백질 유전자, 파라인플루엔자 바이러스 제3형 HN 당단백질 유전자를 포함하는 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 레플리콘 입자(VRP)의 집단을 포함하는 면역원성 조성물로서, 당해 집단이 검출가능한 복제 적격 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스를 함유하지 않고; 당해레플리콘 입자가 배양된 BHK 세포의 단층을 감염시키는데 사용되는 경우 세포병변 효과를 유발하며; 당해 레플리콘 입자로 감염된 세포로부터의 상청액이 감염되지 않은 세포 단층으로 이전되는 경우 상기 레플리콘 입자의 부재하에 세포병변 효과를 유발하고; 당해 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 레플리콘 입자가 포유동물 숙주내에서 보호성 면역 반응을 유발하는 면역원성 조성물.
  11. 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 레플리카제 유전자, 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 레플리카제 단백질, 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 E1 당단백질, 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 E2 당단백질, 파라인플루엔자 바이러스 제3형 F 당단백질 유전자, 파라인플루엔자 바이러스 제3형 HN 당단백질 유전자를 포함하는 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 레플리콘 입자(VRP)의 집단을 포함하는 면역원성 조성물로서, 당해 레플리콘의 핵산 부위가 서열번호 1의 핵산 서열을 지니고; 당해 집단이 검출가능한 복제 적격 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스를 함유하지 않고; 당해 레플리콘 입자로 감염된 세포로부터의 상청액이, 감염되지 않은 세포 단층으로 이전되는 경우 상기 레플리콘 입자의 부재하에 세포병변 효과를 유발하는 면역원성 조성물.
  12. 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 레플리카제 유전자, 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 레플리카제 단백질, 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 E1 당단백질, 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 E2 당단백질, 파라인플루엔자 바이러스 제3형 F 당단백질 유전자, 파라인플루엔자 바이러스 제3형 HN 당단백질 유전자를 포함하는 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 레플리콘 입자(VRP)의 집단을 포함하는 면역원성 조성물로서, 당해 레플리콘의 핵산 부위가 서열번호 1의 핵산 서열을 포함하고; 당해 집단이 검출가능한 복제 적격 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스를 함유하지 않고; 당해 레플리콘 입자로 감염된 세포로부터의 상청액이, 감염되지 않은 세포 단층으로 이전되는 경우 상기 레플리콘 입자의 부재하에 세포병변 효과를 유발하고; 당해 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 레플리콘 입자가 포유동물 숙주내에서 보호성 면역 반응을 유발하는 면역원성 조성물.
  13. 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 레플리카제 유전자, 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 레플리카제 단백질, 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 E1 당단백질, 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 E2 당단백질, 파라인플루엔자 바이러스 제3형 F 당단백질 유전자, 파라인플루엔자 바이러스 제3형 HN 당단백질 유전자를 포함하는 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 레플리콘 입자(VRP)를 포함하는 면역원성 조성물로서, 당해 레플리콘의 핵산 부위가 서열번호 1의 핵산 서열을 포함하고; 당해 집단이 검출가능한 복제 적격 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스를 함유하지 않고; 당해 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 레플리콘 입자가 포유동물 숙주에서 보호성 면역 반응을 유발하며; 상기 레플리콘 입자가 배양된 BHK 세포의 단층을 감염시키는데 사용되는 경우 세포병변 효과를 유발하며; 당해 레플리콘 입자로 감염된 세포로부터의 상청액이 감염되지 않은 세포 단층으로 이전되는 경우 상기 레플리콘 입자의 부재하에 세포병변 효과를 유발하는 면역원성 조성물.
  14. 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 레플리카제 유전자, 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 레플리카제 단백질, 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 E1 당단백질, 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 E2 당단백질, 파라인플루엔자 바이러스 제3형 F 당단백질 유전자, 파라인플루엔자 바이러스 제3형 HN 당단백질 유전자를 포함하는 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 레플리콘 입자(VRP)의 집단을 포함하는 면역원성 조성물로서, 당해 집단이 검출가능한 복제 적격 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스를 함유하지 않고; 당해 레플리콘 입자로 감염된 세포로부터의 상청액이, 감염되지 않은 세포 단층으로 이전되는 경우, 당해 레플리콘 입자의 부재하에 세포병변 효과를 유발하고; 당해 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 레플리콘 입자가 포유동물 숙주내에서 보호성 면역 반 응을 유발하는 면역원성 조성물.
  15. 제14항에 있어서, 보호성 면역 반응이 포유동물 숙주에서 파라인플루엔자 바이러스 제3형에 의한 하부 호흡기도 감염을 예방하는 면역원성 조성물.
  16. 제14항에 있어서, 보호성 면역 반응이 포유동물 숙주에서 파라인플루엔자 바이러스 제3형에 의한 상부 호흡기도 감염의 중증도를 경감시키는 면역원성 조성물.
  17. 제14항에 있어서, 약제학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함하는 면역원성 조성물.
  18. 제14항에 있어서, 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 레플리카제, 파라인플루엔자 바이러스 제3형 F 당단백질 및 파라인플루엔자 바이러스 제3형 HN 당단백질이 서열번호 1의 핵산에 의해 암호화되는 면역원성 조성물.
  19. 제14항에 있어서, 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 레플리카제, 파라인플루엔자 바이러스 제3형 F 당단백질 및 파라인플루엔자 바이러스 제3형 HN 당단백질이 서열번호 2, 서열번호 3 및 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 면역원성 조성물.
  20. 제14항에 있어서, 보조제를 추가로 포함하는 면역원성 조성물.
  21. 면역학적 유효량의
    (a) 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 레플리카제 유전자, 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 레플리카제 단백질, 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 E1 당단백질, 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 E2 당단백질 및 하나 이상의 파라믹소바이러스 당단백질 유전자를 포함하는 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 레플리콘 입자(VRP)의 집단을 포함하는 면역원성 조성물(여기서, 당해 집단은 검출가능한 복제 적격 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스를 함유하지 않고; 당해 레플리콘 입자로 감염된 세포로부터의 상청액은 감염되지 않은 세포 단층으로 이전되는 경우 상기 레플리콘 입자의 부재하에서 세포병변 효과를 유발한다); 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 면역 반응을 유발하기에 충분한 양으로 포유동물 피험체에게 투여함을 포함하여, 파라믹소바이러스에 의한 호흡기도의 감염에 대해 포유동물 피험체를 면역화시키는 방법.
  22. 제21항에 있어서, 파라믹소바이러스가 파라인플루엔자 바이러스 제3형인 방법.
  23. 제22항에 있어서, 당단백질이 파라인플루엔자 바이러스 제3형 헤마글루티닌-뉴라미니다제(HN) 당단백질인 방법.
  24. 제22항에 있어서, 당단백질이 파라인플루엔자 바이러스 제3형 융합(F) 당단 백질인 방법.
  25. 제21항에 있어서, 당단백질이 파라인플루엔자 바이러스 제3형 F 당단백질 및 HN 당단백질 둘다를 포함하는 방법.
  26. 제21항에 있어서, 파라믹소바이러스가 호흡기 합포체 바이러스인 방법.
  27. 제21항에 있어서, 당단백질이 호흡기 합포체 바이러스 부착(G) 당단백질인 방법.
  28. 제21항에 있어서, 당단백질이 호흡기 합포체 바이러스 융합(F) 당단백질인 방법.
  29. 제21항에 있어서, 당단백질이 호흡기 합포체 바이러스 G 당단백질 및 F 당단백질 둘다를 포함하는 방법.
  30. 제21항에 있어서, 감염이 하부 호흡기도내에서 발생하는 방법.
  31. 제21항에 있어서, 감염이 상부 호흡기도내에서 발생하는 방법.
  32. 면역학적 유효량의
    (a) 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 레플리카제 유전자, 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 레플리카제 단백질, 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 E1 당단백질, 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 E2 당단백질, 파라인플루엔자 바이러스 제3형 F 당단백질 유전자, 파라인플루엔자 바이러스 제3형 HN 당단백질 유전자를 포함하는 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 레플리콘 입자(VRP)의 집단을 포함하는 면역원성 조성물(여기서, 당해 집단은 검출가능한 복제 적격 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스를 함유하지 않고; 당해 레플리콘 입자로 감염된 세포로부터의 상청액은, 감염되지 않은 세포 단층으로 이전시키는 경우, 상기 레플리콘 입자의 부재하에서 세포병변 효과를 유발한다); 및
    (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 면역 반응을 유발하기에 충분한 양으로 포유동물 피험체에게 투여함을 포함하여, 파라인플루엔자 바이러스 제3형에 의한 감염에 대해 상기 포유동물 피험체를 면역화시키는 방법.
  33. 제32항에 있어서, 감염이 하부 호흡기도내에서 발생하는 방법.
  34. 제32항에 있어서, 감염이 상부 호흡기도내에서 발생하는 방법.
  35. 제32항에 있어서, 면역원성 조성물이 2회 투여되는 방법.
  36. 제32항에 있어서, 면역원성 조성물이 3회 투여되는 방법.
  37. 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 레플리카제 유전자, 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 레플리카제 단백질, 파라인플루엔자 바이러스 제3형 F 당단백질 유전자, 파라인플루엔자 바이러스 제3형 F 당단백질, 파라인플루엔자 바이러스 제3형 HN 당단백질 유전자 및 파라인플루엔자 바이러스 제3형 HN 당단백질을 포함하는 자가 증식하는 수포의 집단을 포함하는 면역원성 조성물.
  38. 제37항에 있어서, 자가 증식하는 수포가 BHK 배양된 세포의 단층을 감염시키는데 사용되는 경우 세포병변 효과를 유발하는 면역원성 조성물.
  39. 제38항에 있어서, 자가 증식하는 수포로 감염된 세포로 부터의 상청액이, 감염되지 않은 세포 단층으로 이전되는 경우 상기 레플리콘 입자의 부재하에서 세포병변 효과를 유발하는 면역원성 조성물.
  40. 제38항에 있어서, BHK 배양된 세포내 세포병변 효과가 합포체 형성인 면역원성 조성물.
  41. 제38항에 있어서, BHK 배양된 세포내 세포병변 효과가 단층 파열인 면역원성 조성물.
  42. 제38항에 있어서, 집단이 검출가능한 복제 적격 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스를 함유하지 않는 면역원성 조성물.
  43. 제38항에 있어서, 자가 증식하는 수포가 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 레플리카제 유전자, 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 레플리카제 단백질, 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 E1 당단백질, 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 E2 당단백질, 파라인플루엔자 바이러스 제3형 F 당단백질 유전자, 파라인플루엔자 바이러스 제3형 HN 당단백질 유전자를 포함하는 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 레플리콘 입자(VRP)의 집단으로 감염된 세포의 상청액으로부터 입수되는 면역원성 조성물.
  44. 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 레플리카제 유전자, 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 레플리카제 단백질, 파라인플루엔자 바이러스 제3형 F 당단백질 유전자, 파라인플루엔자 바이러스 제3형 F 당단백질, 파라인플루엔자 바이러스 제3형 HN 당단백질 유전자 및 파라인플루엔자 바이러스 제3형 HN 당단백질을 포함하는 자가 증식하는 수포의 집단을 포함하고; 당해 자가 증식하는 수포가 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 레플리카제 유전자, 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 레플리카제 단백질, 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 E1 당단백질, 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 E2 당단백질, 파라인플루엔자 바이러스 F 당단백질 유전자 및 파라인플루엔자 바이러스 HN 당단백질 유전자를 포함하는 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 레플리콘 입자(VRP)의 집단 으로 감염된 세포의 상청액으로부터 입수되며; 당해 자가 증식하는 수포의 집단이 검출가능한 복제 적격 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스를 함유하지 않는 면역원성 조성물.
  45. 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 레플리카제 유전자, 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 레플리카제 단백질, 파라인플루엔자 바이러스 제3형 F 당단백질 유전자, 파라인플루엔자 바이러스 제3형 F 당단백질, 파라인플루엔자 바이러스 제3형 HN 당단백질 유전자 및 파라인플루엔자 바이러스 제3형 HN 당단백질을 포함하는 자가 증식하는 수포의 집단을 포함하고; 당해 자가 증식하는 수포가 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 레플리카제 유전자, 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 레플리카제 단백질, 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 E1 당단백질, 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 E2 당단백질, 파라인플루엔자 바이러스 F 당단백질 유전자 및 파라인플루엔자 바이러스 HN 당단백질 유전자를 포함하는 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 레플리콘 입자(VRP)의 집단으로 감염된 세포의 상청액으로부터 입수되며; 당해 자가 증식하는 수포의 집단이 검출가능한 복제 적격 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스를 함유하지 않고, 배양된 BHK 세포의 단층을 감염시키는데 사용되는 경우 세포병변 효과를 유발하는, 면역원성 조성물.
  46. 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 레플리카제 유전자, 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 레플리카제 단백질, 파라인플루엔자 바이러스 제3형 F 당단백질 유전자, 파라 인플루엔자 바이러스 제3형 F 당단백질, 파라인플루엔자 바이러스 제3형 HN 당단백질 유전자 및 파라인플루엔자 바이러스 제3형 HN 당단백질을 포함하는 자가 증식하는 수포의 집단을 포함하고; 당해 자가 증식하는 수포가 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 레플리카제 유전자, 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 레플리카제 단백질, 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 E1 당단백질, 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 E2 당단백질, 파라인플루엔자 바이러스 제3형 F 당단백질 유전자 및 파라인플루엔자 바이러스 제3형 HN 당단백질 유전자를 포함하는 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 레플리콘 입자(VRP)의 집단으로 감염된 세포의 상청액으로부터 입수되며; 당해 자가 증식하는 수포의 집단이 검출가능한 복제 적격 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스를 함유하지 않고, 배양된 BHK 세포의 단층을 감염시키는데 사용되는 경우 세포병변 효과를 유발하며; 당해 자가 증식하는 수포의 집단으로 감염된 세포로부터의 상청액이, 감염되지 않은 세포 단층으로 이전되는 경우, 상기 레플리콘 입자의 부재하에서 세포병변 효과를 유발하는, 면역원성 조성물.
  47. 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 레플리카제 유전자, 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 레플리카제 단백질, 파라인플루엔자 바이러스 제3형 F 당단백질 유전자, 파라인플루엔자 바이러스 제3형 F 당단백질, 파라인플루엔자 바이러스 제3형 HN 당단백질 유전자 및 파라인플루엔자 바이러스 제3형 HN 당단백질을 포함하는 자가 증식하는 수포의 집단을 포함하고; 당해 자가 증식하는 수포가 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 레플리카제 유전자, 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 레플리카제 단백질, 베네쥬 엘라 말 뇌염 바이러스 E1 당단백질, 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 E2 당단백질, 파라인플루엔자 바이러스 제3형 F 당단백질 유전자 및 파라인플루엔자 바이러스 제3형 HN 당단백질 유전자를 포함하는 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 레플리콘 입자(VRP)의 집단으로 감염된 세포의 상청액으로부터 입수되며; 당해 자가 증식하는 수포의 집단이 검출가능한 복제 적격 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스를 함유하지 않고, 배양된 BHK 세포의 단층을 감염시키는데 사용되는 경우 세포병변 효과를 유발하며; 당해 자가 증식하는 수포의 집단으로 감염된 세포로부터의 상청액이, 감염되지 않은 세포 단층으로 이전되는 경우, 상기 레플리콘 입자의 부재하에서 세포병변 효과를 유발하고; 당해 자가 증식하는 수포의 집단이 포유동물 숙주내에서 보호성 면역 반응을 유발하는, 면역원성 조성물.
  48. 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 레플리카제 유전자, 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 레플리카제 단백질, 파라인플루엔자 바이러스 제3형 F 당단백질 유전자, 파라인플루엔자 바이러스 제3형 F 당단백질, 파라인플루엔자 바이러스 제3형 HN 당단백질 유전자 및 파라인플루엔자 바이러스 제3형 HN 당단백질을 포함하는 자가 증식하는 수포의 집단을 포함하고; 당해 자가 증식하는 수포가 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 레플리카제 유전자, 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 레플리카제 단백질, 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 E1 당단백질, 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 E2 당단백질, 파라인플루엔자 바이러스 제3형 F 당단백질 유전자 및 파라인플루엔자 바이러스 제3형 HN 당단백질 유전자를 포함하는 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 레플리콘 입자 (VRP)의 집단으로 감염된 세포의 상청액으로부터 입수되며; 당해 자가 증식하는 수포의 집단이 검출가능한 복제 적격 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스를 함유하지 않고, 배양된 BHK 세포의 단층을 감염시키는데 사용되는 경우 세포병변 효과를 유발하며; 당해 자가 증식하는 수포의 집단으로 감염된 세포로부터의 상청액이, 감염되지 않은 세포 단층으로 이전되는 경우, 상기 레플리콘 입자의 부재하에서 세포병변 효과를 유발하고; 당해 자기 증식하는 수포가 포유동물 숙주내에서 보호성 면역 반응을 유발하는, 면역원성 조성물.
  49. 제48항에 있어서, 보호성 면역 반응이 포유동물 숙주에서 파라인플루엔자 바이러스 제3형에 의한 하부 호흡기도의 감염을 예방하는 면역원성 조성물.
  50. 제48항에 있어서, 보호성 면역 반응이 포유동물 숙주에서 파라인플루엔자 바이러스 제3형에 의한 상부 호흡기도의 감염의 중증도를 경감시키는 면역원성 조성물.
  51. 제48항에 있어서, 약제학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함하는 면역원성 조성물.
  52. 제48항에 있어서, 보조제를 추가로 포함하는 면역원성 조성물.
  53. 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 레플리카제 유전자, 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 레플리카제 단백질, 파라인플루엔자 바이러스 제3형 F 당단백질 유전자, 파라인플루엔자 바이러스 제3형 F 당단백질, 파라인플루엔자 바이러스 제3형 HN 당단백질 유전자 및 파라인플루엔자 바이러스 제3형 HN 당단백질을 포함하는 자가 증식하는 수포의 집단을 포함하는 면역원성 조성물로서, 여기서 상기 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 레플리카제 단백질, 파라인플루엔자 바이러스 제3형 F 당단백질 및 파라인플루엔자 바이러스 제3형 HN 당단백질이 서열번호 2, 서열번호 3 및 서열번호 4의 아미노산 서열을 지니며, 당해 자가 증식하는 수포가 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 레플리카제 유전자, 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 레플리카제 단백질, 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 E1 당단백질, 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 E2 당단백질, 파라인플루엔자 바이러스 제3형 F 당단백질 유전자 및 파라인플루엔자 바이러스 제3형 HN 당단백질 유전자를 포함하는 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 레플리콘 입자(VRP)의 집단으로 감염된 세포의 상청액으로부터 입수되며; 당해 자가 증식하는 수포의 집단이 검출가능한 복제 적격 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스를 함유하지 않고, 배양된 BHK 세포의 단층을 감염시키는데 사용되는 경우 세포병변 효과를 유발하며; 당해 자가 증식하는 수포의 집단으로 감염된 세포로부터의 상청액이 감염되지 않은 세포 단층으로 이전되는 경우 상기 레플리콘 입자의 부재하에서 세포병변 효과를 유발하고; 당해 자가 증식하는 수포가 포유동물 숙주내에서 보호성 면역 반응을 유발하는, 면역원성 조성물.
  54. 면역학적 유효량의
    (a) 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 레플리카제 유전자, 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 레플리카제 단백질, 파라인플루엔자 바이러스 F 당단백질 유전자, 파라인플루엔자 바이러스 F 당단백질, 파라인플루엔자 바이러스 HN 당단백질 유전자 및 파라인플루엔자 바이러스 HN 당단백질을 포함하는 자가 증식하는 수포의 집단을 포함하는 면역원성 조성물(여기서, 당해 자가 증식하는 수포는 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 레플리카제 유전자, 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 레플리카제 단백질, 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 E1 당단백질, 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 E2 당단백질, 파라인플루엔자 바이러스 F 당단백질 유전자, 파라인플루엔자 바이러스 HN 당단백질 유전자를 포함하는 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 레플리콘 입자(VRP)의 집단으로 감염된 세포의 상청액으로부터 수득되며; 당해 VRP의 집단이 검출가능한 복제 적격 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스를 함유하지 않고; 당해 자가 증식하는 수포로 감염된 세포로부터의 상청액은 감염되지 않은 세포 단층으로 이전시키는 경우 상기 레플리콘 입자의 부재하에서 세포병변 효과를 유발한다); 및
    (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 면역 반응을 유발하기에 충분한 양으로 포유동물 피험체에게 투여함을 포함하여, 파라믹소 바이러스에 의한 호흡기도 감염에 대해 상기 포유동물 피험체를 면역화시키는 방법.
  55. 제54항에 있어서, 파라인플루엔자 바이러스가 파라인플루엔자 바이러스 제1형, 파라인플루엔자 바이러스 제2형, 파라인플루엔자 바이러스 제3형 및 파라인플 루엔자 바이러스 제4형으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 방법.
  56. 제55항에 있어서, HN 당단백질이 파라인플루엔자 바이러스 제3형 헤마글루티닌-뉴라미니다제(HN) 당단백질인 방법.
  57. 제55항에 있어서, F 당단백질이 파라인플루엔자 바이러스 제3형 융합(F) 당단백질인 방법.
  58. 제54항에 있어서, 당단백질이 파라인플루엔자 바이러스 제3형 F 당단백질 및 HN 당단백질 둘다를 포함하는 방법.
  59. 제54항에 있어서, 감염이 하부 호흡기도내에서 발생하는 방법.
  60. 제54항에 있어서, 감염이 상부 호흡기도내에서 발생하는 방법.
  61. 면역학적 유효량의
    (a) 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 레플리카제 유전자, 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 레플리카제 단백질, 파라인플루엔자 바이러스 제3형 F 당단백질 유전자, 파라인플루엔자 바이러스 제3형 F 당단백질 유전자, 파라인플루엔자 바이러스 제3형 HN 당단백질 유전자 및 파라인플루엔자 바이러스 제3형 HN 당단백질을 포함하는 자가 증식하는 수포의 집단을 포함하는 면역원성 조성물(여기서, 당해 자가 증식하는 수포는 면역 반응을 유발하기에 충분한 양의 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 레플리카제 유전자, 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 레플리카제 단백질, 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 E1 당단백질, 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 E2 당단백질, 파라인플루엔자 바이러스 제3형 F 당단백질 유전자, 파라인플루엔자 바이러스 제3형 HN 당단백질 유전자를 포함하는 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 레플리콘 입자(VRP)의 집단으로 감염된 세포의 상청액으로부터 수득되며; 당해 집단은 검출가능한 복제 적격 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스를 함유하지 않고; 당해 자가 증식하는 수포로 감염된 세포로부터의 상청액은 감염되지 않은 세포 단층으로 이전시키는 경우 상기 레플리콘 입자의 부재하에서 세포병변 효과를 유발한다); 및
    (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 면역 반응을 유발하기에 충분한 양으로 포유동물 피험체에게 투여함을 포함하여, 파라인플루엔자 바이러스 제3형에 의한 감염에 대해 상기 포유동물 피험체를 면역화시키는 방법.
  62. 제61항에 있어서, 감염이 하부 호흡기도내에서 발생하는 방법.
  63. 제61항에 있어서, 감염이 상부 호흡기도내에서 발생하는 방법.
  64. 제61항에 있어서, 면역원성 조성물이 2회 투여되는 방법.
  65. 제61항에 있어서, 면역원성 조성물이 3회 투여되는 방법.
  66. 면역학적 유효량의
    (a) 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 레플리카제 유전자, 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 레플리카제 단백질, 파라인플루엔자 바이러스 제3형 F 당단백질 유전자, 파라인플루엔자 바이러스 제3형 F 당단백질, 파라인플루엔자 바이러스 제3형 HN 당단백질 유전자 및 파라인플루엔자 바이러스 제3형 HN 당단백질을 포함하는 자가 증식하는 수포의 집단을 포함하는 면역원성 조성물(여기서, 당해 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 레플리카제 단백질, 파라인플루엔자 바이러스 제3형 F 당단백질 및 파라인플루엔자 바이러스 제3형 HN 당단백질이 서열번호 2, 서열번호 3 및 서열번호 4의 아미노산 서열을 가지며; 당해 자가 증식하는 수포는 면역 반응을 유발하기에 충분한 양의 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 레플리카제 유전자, 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 레플리카제 단백질, 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 E1 당단백질, 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 E2 당단백질, 파라인플루엔자 바이러스 제3형 F 당단백질 유전자, 파라인플루엔자 바이러스 제3형 HN 당단백질 유전자를 포함하는 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스 레플리콘 입자(VRP)의 집단으로 감염된 세포의 상청액으로부터 수득되며; 당해 집단은 검출가능한 복제 적격 베네쥬엘라 말 뇌염 바이러스를 함유하지 않고; 당해 자가 증식하는 수포로 감염된 세포로부터의 상청액은 감염되지 않은 세포 단층으로 이전시키는 경우 상기 레플리콘 입자의 부재하에서 세포병변 효과를 유발한다); 및
    (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 면역 반응을 유발하기에 충분한 양으로 포유동물 피험체에게 투여함을 포함하여, 파라인플루엔자 바이러스 제3형에 의한 감염에 대해 상기 포유동물 피험체를 면역화시키는 방법.
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