Nothing Special   »   [go: up one dir, main page]

EA027236B1 - Иммуногенные композиции и способы применения таких композиций для индукции гуморального и клеточного иммунного ответа - Google Patents

Иммуногенные композиции и способы применения таких композиций для индукции гуморального и клеточного иммунного ответа Download PDF

Info

Publication number
EA027236B1
EA027236B1 EA201391496A EA201391496A EA027236B1 EA 027236 B1 EA027236 B1 EA 027236B1 EA 201391496 A EA201391496 A EA 201391496A EA 201391496 A EA201391496 A EA 201391496A EA 027236 B1 EA027236 B1 EA 027236B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
immunogen
antigen
immunogenic composition
specific
vector
Prior art date
Application number
EA201391496A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201391496A1 (ru
Inventor
Томас У. Дубенски
Скотт Х. Роббинс
Original Assignee
Иммьюн Дизайн Корп.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Иммьюн Дизайн Корп. filed Critical Иммьюн Дизайн Корп.
Publication of EA201391496A1 publication Critical patent/EA201391496A1/ru
Publication of EA027236B1 publication Critical patent/EA027236B1/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/245—Herpetoviridae, e.g. herpes simplex virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/001102—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K39/001103—Receptors for growth factors
    • A61K39/001104—Epidermal growth factor receptors [EGFR]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/001102—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K39/001103—Receptors for growth factors
    • A61K39/001108—Platelet-derived growth factor receptors [PDGFR]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/001102—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K39/001103—Receptors for growth factors
    • A61K39/001109—Vascular endothelial growth factor receptors [VEGFR]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/001102—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K39/001103—Receptors for growth factors
    • A61K39/00111—Hepatocyte growth factor receptor [HGFR or c-met]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/001148—Regulators of development
    • A61K39/001149—Cell cycle regulated proteins, e.g. cyclin, CDC, CDK or INK-CCR
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/001148—Regulators of development
    • A61K39/00115—Apoptosis related proteins, e.g. survivin or livin
    • A61K39/001151—Apoptosis related proteins, e.g. survivin or livin p53
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/001152—Transcription factors, e.g. SOX or c-MYC
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/001152—Transcription factors, e.g. SOX or c-MYC
    • A61K39/001153—Wilms tumor 1 [WT1]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/001154—Enzymes
    • A61K39/001156—Tyrosinase and tyrosinase related proteinases [TRP-1 or TRP-2]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/001154—Enzymes
    • A61K39/001158—Proteinases
    • A61K39/001161—Caspases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/001154—Enzymes
    • A61K39/001162—Kinases, e.g. Raf or Src
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/001154—Enzymes
    • A61K39/001164—GTPases, e.g. Ras or Rho
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/001166—Adhesion molecules, e.g. NRCAM, EpCAM or cadherins
    • A61K39/001168—Mesothelin [MSLN]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/001169—Tumor associated carbohydrates
    • A61K39/00117—Mucins, e.g. MUC-1
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/001169—Tumor associated carbohydrates
    • A61K39/001171—Gangliosides, e.g. GM2, GD2 or GD3
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/001169—Tumor associated carbohydrates
    • A61K39/001172—Sialyl-Thomson-nouvelle antigen [sTn]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/00118—Cancer antigens from embryonic or fetal origin
    • A61K39/001182—Carcinoembryonic antigen [CEA]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/001184—Cancer testis antigens, e.g. SSX, BAGE, GAGE or SAGE
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/001184—Cancer testis antigens, e.g. SSX, BAGE, GAGE or SAGE
    • A61K39/001186—MAGE
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/001184—Cancer testis antigens, e.g. SSX, BAGE, GAGE or SAGE
    • A61K39/001189—PRAME
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/00119—Melanoma antigens
    • A61K39/001191—Melan-A/MART
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/00119—Melanoma antigens
    • A61K39/001192—Glycoprotein 100 [Gp100]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/001193—Prostate associated antigens e.g. Prostate stem cell antigen [PSCA]; Prostate carcinoma tumor antigen [PCTA]; PAP or PSGR
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/001193—Prostate associated antigens e.g. Prostate stem cell antigen [PSCA]; Prostate carcinoma tumor antigen [PCTA]; PAP or PSGR
    • A61K39/001194—Prostate specific antigen [PSA]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/001193—Prostate associated antigens e.g. Prostate stem cell antigen [PSCA]; Prostate carcinoma tumor antigen [PCTA]; PAP or PSGR
    • A61K39/001195—Prostate specific membrane antigen [PSMA]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/10—Antimycotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A61P31/22—Antivirals for DNA viruses for herpes viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55566—Emulsions, e.g. Freund's adjuvant, MF59
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55572—Lipopolysaccharides; Lipid A; Monophosphoryl lipid A
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/70—Multivalent vaccine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16611—Simplexvirus, e.g. human herpesvirus 1, 2
    • C12N2710/16634—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
    • C12N2740/15034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/16043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2810/00—Vectors comprising a targeting moiety
    • C12N2810/50—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein
    • C12N2810/60—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from viruses
    • C12N2810/609—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from viruses positive strand RNA viruses
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Pregnancy & Childbirth (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)

Abstract

Изобретение относится к композициям и способам улучшения стратегии двойной иммунизации, вызывающей у пациента иммунный ответ, который включает в себя гуморальный иммунный ответ и клеточный иммунный ответ как CD4, так и CD8 Т-лимфоцитов иммунной реакции, тем самым обеспечивая полный адаптивный иммунный ответ одного или более антигенов. Таким образом, описанные способы полезны для лечения или предотвращения (т.е. снижения вероятности или риска возникновения) различных заболеваний, расстройств и состояний, таких как рак и инфекционные заболевания, для которых индукция как гуморального иммунного ответа, так и клеточного иммунного ответа является желательной и полезной.

Description

Изобретение в целом относится к способам усиления специфического иммунного ответа на иммуноген путем иммунизации субъекта с помощью по меньшей мере двух композиций для вызова гуморального и клеточного иммунного ответа на иммуноген.
Уровень техники
Иммунная система хозяина предоставляет средства для быстрого и специфического построения защитного ответа на патогенные микроорганизмы, а также для содействия в подавлении злокачественных опухолей. Иммунные ответы в целом описываются как включающие гуморальные ответы, в которых антитела, специфичные для антигенов, вырабатываются дифференцированными В-лимфоцитами, а также клеточно-опосредованные ответы, в которых различные типы Т-лимфоцитов устраняют антигены с помощью различных механизмов. Например, вспомогательные Т-клетки СЭ4 (также называемые СЭ4') способны распознавать специфические антигены и реагировать путем выпуска растворимых медиаторов, таких как цитокины, для привлечения дополнительных клеток иммунной системы к участию в иммунном ответе. Цитотоксичные Т-клетки СЭ8 (также называемые СЭ8') также способны распознавать специфические антигены и могут связываться с антиген-специфичными клетками или их частицами и уничтожать или повреждать их. В частности, клеточно-опосредованные иммунные ответы, включающие цитотоксичные Т-лимфоциты (ЦТЛ), могут быть важными для элиминации опухолевых клеток и клеток, инфицированных микроорганизмами, например вирусами, бактериями или паразитами.
Рак включает в себя широкий круг заболеваний и затрагивает приблизительно одного из четырех человек по всему миру. ЦТЛ ответ является ключевой особенностью эффективных вакцин против рака; эффективность Т-клеток СЭ4 также играет важную роль в активации продуктивных Т-клеток СЭ8 и тем самым обеспечивает клинический результат. Вакцина 81ри1еисе1-Т (ΡΚΟνΕΝΟΕ®), основанная на аутологичных дендритных клетках (ЦК), была недавно одобрена Управлением по контролю за качеством пищевых продуктов и лекарственных препаратов для лечения метастатического кастрационнорезистентного рака предстательной железы, хотя продолжительность жизни при таком способе лечения составляет в среднем 4,1 месяца, свидетельствуя о существенной необходимости в его усовершенствовании (см., например, Кайой-, е! а1., Νον Εη§1. 1. Мей. 363(5):411 (2010)). Вакцина Рток^ас® V, основанная на поксвирусном векторе, также показывает значительное увеличение продолжительности жизни в фазе II (см., например, Кайой; е! а1., I. С1ш. Опсо1. 28(7):1099 (2010)). Активные иммунные терапии, такие как §1ри1еисе1-Т и Рток^ас® V?, как правило, переносятся лучше, чем использование химиотерапевтических препаратов, которые включают текущий стандарт медицинской помощи при кастрационнорезистентном раке предстательной железы (см., например, Ре!гу1ак, е! а1., Ν. Εη§1. I. Мей. 351(15):1513 (2004); ЗуруеЧег, е! а1., I. Ехр. Мей. 202(5):673 (2005)). Эти клинические успехи показывают, что иммунный ответ может быть использован в лечении рака для обеспечения улучшения результатов лечения и продления срока жизни пациентов.
Что касается микробных инфекций, малярии, туберкулеза, ВИЧ-СПИДа и других вирусных инфекций, таких как Вирус простого герпеса (ВПГ) (основная причина генетальных язв во всем мире), то они продолжают вносить свой вклад в глобальные проблемы здоровья. Распространенность ВПГ-2 растет с угрожающей скоростью по всему миру (см., например, Согеу е! а1., I. Ассщи. 1ттипе ЭеПс. Зупйг. 35:435 (2004)). В США показатель общей распространенности ВПГ-2 превышает 20%, а в развивающихся странах этот показатель составляет от 30 до 50%. В дополнение к высоким показателям ВПГ-2 у взрослых, также увеличивается показатель заболеваемости неонатальной инфекцией ВПГ-2. Даже в случае лечения неонатального энцефалита показатель смертности от инфекции ВПГ-2 составляет >15%, а 30-50% выживших младенцев с ВПГ-2 страдают неврологическими заболеваниями. Одновременно с эпидемией ВПГ-2 приходит полное осознание того, что ВПГ-2 значительно увеличивает риск заражения приобретения и передачи ВИЧ-1. Данные из Африки показывают, что ВПГ-2 может увеличить риск передачи ВИЧинфекции в целых 7 раз и что половина новых случаев ВИЧ-инфицирования непосредственно приписывается инфекции ВПГ-2 (см., например, АЬи-Каййай е! а1., РЬо8 ΟΝΕ 3(5):е2230 (2008)). В целом, относительный риск приобретения ВИЧ увеличивается более чем в два раза у инфицированных ВПГ-2.
Увеличение распространенности ВПГ-2 у взрослой и детской популяции сохраняется, несмотря на широкое использование фармакологического воздействия. Противовирусные средства, вводимые в
- 1 027236 больших количествах в начале инфекции ВПГ, могут уменьшить его передачу, но это не предотвращает от появления латентной инфекции (см., например, Согеу е! а1., 8ех Ттаизт. Όίδ. 12:215 (1985)). В недавнем исследовании при непрерывном применении Валацикловира передача ВПГ понижается менее чем на 50%, несмотря на раннее вмешательство (см., например, Согеу е! а1., N. Еи§1. 1. Мей. 350:11 (2004)). Действие альтернативных противовирусных препаратов, таких как противомикробные средства, не доказано клинически. По этим причинам многие ведущие учреждения считают, что вакцинация необходима для уменьшения воздействия болезни ВПГ-2 на здоровье.
Существует потребность в таких вакцинах, в том числе улучшенных вакцинах против инфекционных болезнетворных микроорганизмов, таких как вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) и Вируса простого герпеса, малярии, устойчивых к антибиотикам бактерий, для которых вызываемый надежный гуморальный и/или клеточный ответ имеет важное значение для успешной профилактики и лечения инфекции. Кроме того, существует значительная потребность в повышении эффективности вакцины против рака.
Суть изобретения
Ниже приведены иммуногенные композиции, препараты из этих иммуногенных композиций способы применения препаратов и композиций для индукции иммунного ответа, специфического для одного или нескольких иммуногенов и смежных антигенов. В одном варианте осуществления, способ предназначен для иммунного ответа у субъекта, причем способ включает (а) введение субъекту по меньшей мере одной дозы первой иммуногенной композиции, содержащей, по меньшей мере, первый иммуноген, притом что по меньшей мере один иммуноген способен индуцировать иммунный ответ, специфичный для первого назначенного антигена; (Ь) введение субъекту по меньшей мере одной дозы второй иммуногенной композиции, содержащей рекомбинантный экспрессирующий вектор, содержащий нуклеотидную последовательность, которая кодирует первый иммуноген, тем самым индуцируя иммунный ответ, специфичный для первого назначенного антиген. В конкретном варианте осуществления (ί) первая иммуногенная композиция содержит адъювант; (и) вторая композиция дополнительно содержит адъювант или (ίίί) каждая первая композиция и вторая композиция дополнительно содержит адъювант. В конкретных вариантах осуществления вторую иммуногенную композицию вводят после первой иммуногенной композиции. В других определенных вариантах вторую иммуногенную композицию вводят перед введением первой иммуногенной композиции. В другом одном определенном варианте осуществления первую иммуногенную композицию и вторую иммуногенную композицию вводят совместно. В конкретных вариантах осуществления вводят по меньшей мере две дозы первой иммуногенной композиции или вводят по меньшей мере две дозы второй иммуногенной композиции. В других вариантах осуществления вводят (а) две дозы; (Ь) три дозы; (с) четыре дозы или (й) пять доз первой иммуногенной композиции. В другом варианте при вводе двух или более доз (а) каждую дозу первой иммуногенной композиции вводят перед введением второй иммуногенной композицией; (Ь) по меньшей мере одну дозу первой иммуногенной композиции вводят после введения второй иммуногенной композиции; (с) по меньшей мере одну дозу первой иммуногенной композиции вводят одновременно с введением второй иммуногенной композиции; (й) по меньшей мере одну дозу первой иммуногенной композиции вводят до введения второй иммуногенной композиции и каждую из оставшихся доз первой иммуногенной композиции вводят после введения второй иммуногенной композиции или (е) каждую дозу первой композиции вводят со второй композицией. В отношении каждого из этих способов и вариантов осуществления иммунный ответ, индуцированный первой иммуногенной композицией, содержит Т-клеточный иммунный ответ СИ4, специфический для первого определенного антигена, а в определенных вариантах реализации иммунного ответа, индуцированного первым иммуногеном, включает Т-клеточный иммунный ответ СИ8, специфичный для первого назначенного антигена, а в двух определенных вариантах реализации иммунный ответ, индуцированный первым иммуногеном, содержит Т-клеточный иммунный ответ СИ4 и Т-клеточный иммунный ответ СИ8, специфический для первого назначенного антигена.
В конкретных вариантах осуществления способов, описанных здесь и выше, первая иммуногенная композиция дополнительно содержит второй иммуноген, в котором второй иммуноген и рекомбинантный вектор экспрессии дополнительно содержат нуклеотидную последовательность, которая кодирует второй иммуноген, где второй иммуноген индуцирует иммунный ответ на конкретный второй обозначенный антиген. В некоторых конкретных вариантах осуществления первый обозначенный антиген и второй обозначенный антиген одинаковы. В других некоторых конкретных вариантах осуществления первый обозначенный антиген и второй обозначенный антиген различны. В некоторых других вариантах осуществления способов, описанных здесь и выше, рекомбинантный экспрессирующий вектор дополнительно содержит нуклеотидную последовательность, которая кодирует второй иммуноген, способный индуцировать иммунный ответ, специфичный для второго обозначенного антигена. В некоторых конкретных вариантах осуществления первый обозначенный антиген и второй обозначенный антиген одинаковы. В других некоторых вариантах осуществления первый обозначенный антиген и второй обозначенный антиген различны. В конкретных вариантах осуществления, в отношении таких способов, иммунный ответ, индуцированный первым иммуногеном, состоит из Т-клеточного ответа СИ4, специфичного для первого обозначенного антигена. В конкретных вариантах осуществления, в отношении таких
- 2 027236 методов, иммунный ответ, индуцированный вторым иммуногеном, включает Т-клеточный ответ СЭ8 на конкретный обозначенный второй антиген.
В конкретных вариантах осуществления способов, описанных здесь и выше, в которых одна или более иммуногенная композиция содержит адъювант, адъювант представляет собой нетоксический липидный А-связанный адъювант. В некоторых конкретных вариантах осуществления нетоксичным липидным А-связанным адъювантом является глюкопиранозил-липидный адъювант (СЬА); в более конкретных вариантах СЬА формулируется в стабильной эмульсии масло-в-воде.
В других конкретных вариантах осуществления способов, описанных здесь и выше, первый обозначенный антиген ассоциируется с (а) антигеном опухоли или (Ь) с инфекционным микроорганизмом, выбранным из вируса, бактерии, грибка или паразита. В более конкретном варианте осуществления первый обозначенный антиген представляет собой ассоциированный с опухолью антиген, выбранный из антигена почечно-клеточной карциномы, антигена рака простаты, антигена мезотелиомы, антигена рака поджелудочной железы, антигена меланомы, антигена рака молочной железы, антигена рака легких и антигена рака яичников. В еще более специфичных вариантах осуществления антиген рака предстательной железы является кислой фосфатазой ΝΚΧ3.1 простатоспецифического антигена или простатоспецифического антигена мембраны. В других конкретных вариантах осуществления первый обозначенный антиген выбран из вируса. В более конкретном варианте вирус является вирусом простого герпеса-2 (ВПГ-2). В некоторых конкретных вариантах осуществления первый обозначенный антиген является ВПГ-2 ИЬ19 полипептидом или ВПГ-2 §0 полипептидом.
В других конкретных вариантах осуществления способов, описанных здесь и выше, когда иммунный ответ индуцируется специфичным для первого обозначенного и второго обозначенного антигена, каждый из этих антигенов представляет собой ассоциированный с опухолью антиген. В более конкретных вариантах осуществления каждый из этих антигенов выбирается из антигена почечно-клеточной карциномы, антигена рака простаты, антигена мезотелиомы, антигена рака поджелудочной железы, антигена меланомы, антигена рака молочной железы, антигена рака легких и антигена рака яичников. Согласно еще более конкретным вариантам осуществления каждый из первого и второго обозначенных антигенов представляет собой антиген рака простаты, выбранный из простатической кислой фосфатазы ΝΚΧ3.1 простатоспецифического антигена или простатоспецифического антигена мембраны. В других конкретных вариантах осуществления каждый из первого и второго обозначенных антигенов представляет собой антиген из инфекционного микроорганизма, выбранного из вируса, бактерии, грибка и паразита. В более конкретном варианте организмом инфекционных заболеваний является вирус, который в более конкретных вариантах осуществления представляет собой вирус простого герпеса-2 (ВПГ-2). В некоторых вариантах по меньшей мере один из первого обозначенного антигена и второго обозначенного антигена представляет собой ВПГ-2 ИЬ19 полипептид, а другой - ВПГ-2 СО полипептид.
В других конкретных вариантах осуществления способов, описанных здесь и выше, рекомбинантный экспрессирующий вектор выбран из лентивирусного векторного генома, поксвирусного векторного генома, векторного генома вируса коровьей оспы, аденовирусного векторного генома, аденовируссвязанного векторного генома, герпес-вирусного векторного генома и альфа-вирусного векторного генома. В конкретном осуществлении рекомбинантный экспрессирующий вектор вводят в вектор частицы, которая в некоторых конкретных вариантах осуществления доставляет рекомбинантный экспрессирующий вектор в антиген-представляющие клетки. В конкретном варианте антиген-представляющая клетка является дендритной клеткой. В конкретных вариантах осуществления вектор частицы состоит из лентивирусного вектора частицы, которая состоит из генома лентивирусного вектора; поксвирусного вектора частицы, которая включает поксвирусный вектор генома; вектора частицы из вируса коровьей оспы, которая состоит из генома вектора вируса коровьей оспы; аденовирусного вектора частицы, которая состоит из генома вектора аденовирусов; связанного аденовирусного вектора частицы, которая включает связанные аденовирусные векторные геномы; частицы вектора вируса герпеса, которая состоит из генома вектора вируса герпеса; или альфа-вирусной векторной частицы, которая включает в себя альфавирусный векторный геном. В более конкретном варианте векторные частицы являются лентивирусными векторными частицами, которые состоят из генома лентивирусного вектора. В еще более конкретных вариантах осуществления лентивирусные векторные частицы дополнительно состоят из конверта, состоящего из Синдбис вируса Е2 гликопротеина, который состоит из аминокислотной последовательности, имеющей по меньшей мере одну аминокислотную замену по сравнению с 8ЕС ГО N0: 1, где остаток 160 8ЕС ГО N0: 1 либо отсутствует, либо имеет аминокислоту, отличную от глютаминовой кислоты, и где гликопротеин Е2 не является фрагментом слитого белка, который содержит Синдбис вируса Е3 белка. В других конкретных вариантах осуществления гликопротеин Е2 связывается с дендритными специфическими клетками конкретной внутриклеточной молекулы-3-связывающих не интегрином (ОС-8Ю№).
Также, кроме того, в одном варианте осуществления представлены препараты, которые в одном варианте осуществления включают (а) первую иммуногенную композицию, которая включает, по меньшей мере, первый иммуноген, способный индуцировать иммунный ответ, специфичный для первого обозначенного антигена; и (Ь) вторую иммуногенную композицию, которая состоит из рекомбинантного экспрессирующего вектора, который состоит из последовательности нуклеотидов, кодирующей первый
- 3 027236 иммуноген. В конкретном варианте специфический иммунный ответ, вызванный первым иммуногеном, состоит из Т-клеточного ответа СЭ4 для первого обозначенного антигена. В другом конкретном варианте специфический иммунный ответ, вызванный первым иммуногеном, состоит из Т-клеточного ответа СИ8 для первого обозначенного антигена. В других конкретных вариантах осуществления иммунный ответ, вызванный первым иммуногеном, состоит из Т-клеточного иммунного ответа СЭ4 и Т-клеточного иммунного ответа СЭ8. характерных для первого обозначенного антигена. В другом воплощении препаратов, описанные здесь и выше, эти препараты предоставляются для использования в стимулировании цитотоксического Т-клеточного ответа против опухолевых клеток (а) первого обозначенного антигена. В других конкретных вариантах осуществления препараты, описанные здесь и выше, предоставляются для использования в стимулировании ответа цитотоксических Т-лимфоцитов против инфекционных заболеваний микроорганизма, принимая первый обозначенный антиген. В других конкретных вариантах осуществления препараты, описанные здесь и выше, используются для сокращения вероятности возникновения или рецидива опухоли, содержащей множество опухолевых клеток, несущих ассоциированный с опухолью антиген. В другом воплощении эти препараты используются для предотвращении или лечения инфекции, вызванной инфекционными микроорганизмами.
Приведены дополнительные варианты осуществления препаратов, в которых первая иммуногенная композиция дополнительно содержит второй иммуноген и в которых рекомбинантный экспрессирующий вектор дополнительно содержит нуклеотидную последовательность, которая кодирует второй иммуноген, в котором второй иммуноген индуцирует иммунный ответ, специфичный для второго обозначенного антигена. В одном конкретном варианте первый обозначенный антиген и второй обозначенный антиген одинаковые. В другом конкретном варианте первый обозначенный антиген и второй обозначенный антиген разные. В других, до сих пор конкретных вариантах осуществления препаратов, описанных выше и здесь, рекомбинантный экспрессирующий вектор состоит из последовательности нуклеотидов, которая кодирует второй иммуноген, способный индуцировать иммунный ответ, специфичный для второго обозначенного антигена. В некоторых конкретных вариантах осуществления первый обозначенный антиген и второй обозначенный антиген одинаковы, а в других конкретных вариантах осуществления первый обозначенный антиген и второй обозначенный антиген различаются. В этих вариантах иммунный ответ, вызванный первым иммуногеном, включает Т-клеточный ответ СЭ4 для первого обозначенного антигена. Кроме того, в отношении этих вариантов осуществления, препараты, иммунный ответ которых вызван вторым иммуногеном, состоит из Т-клеточного ответа СЭ8 для второго обозначенного антигена.
Что касается воплощения подготовки условий, указанных здесь и выше, (а) первая иммуногенная композиция дополнительно включает адъювант, (Ь) вторая иммуногенная композиция дополнительно включает адъювант или (с) первая иммуногенная композиция и вторая иммуногенная композиция дополнительно включают адъювант. В более конкретных вариантах осуществления нетоксичным липидным А-связанным адъювантом является глюкопиранозил-липидный адъювант (СЬА). В еще более конкретном варианте осуществления нетоксичным липидным А-связанным адъювантом является глюкопиранозил-липидный адъювант (СЬА), который в конкретных вариантах осуществления формулируется в стабильной эмульсии масло-в воде.
Что касается воплощения препаратов, приведенных здесь и выше, первым определенным антигеном является (а) опухоль-связующий антиген или (Ь) от инфекционных микроорганизмов, выбранных из вируса, бактерии, грибка и паразита. В конкретных вариантах осуществления первый определенный антиген является опухоль-ассоциированным антигеном, выбранным из антигена почечно-клеточной карциномы, антигена рака простаты, антигена мезотелиомы, антигена рака поджелудочной железы, антигена меланомы, антигена рака молочной железы, антигена рака легких и антигена рака яичников. В более конкретных вариантах осуществления антиген рака простаты является простатической кислой фосфатазой ΝΚΧ3.1 простатоспецифического антигена или простатоспецифического антигена мембраны. В других конкретных вариантах осуществления первый определенный антиген выбран из вируса. В более конкретном варианте вирус является вирусом простого герпеса-2 (ВПГ-2). Первый определенный антиген в еще одном конкретном варианте является Н8У-2 иЬ19 полипептидом или Н8У-2 §0 полипептидом.
В других вариантах осуществления препаратов, описанных здесь и выше, когда иммунный ответ, индуцированный препаратом, включает иммунный ответ, специфический для первого определенного антигена и второго определенного антигена, каждый первый определенный антиген и второй определенный антиген являются опухоль-ассоциированным антигеном. В более конкретном варианте и первый и второй определенные антигены выбираются из антигена почечно-клеточной карциномы, антигена рака простаты, антигена мезотелиомы, антигена рака поджелудочной железы, антигена меланомы, антигена рака молочной железы, антигена рака легких и антигена рака яичников. В еще одной более конкретном воплощении и первый и второй определенные антигены выбираются из антигена рака простаты, выбранного из простатической кислой фосфатазы ΝΚΧ3.1 простатоспецифического антигена и простатоспецифического антигена мембраны. В других конкретных вариантах и первый и второй определенные антигены являются антигенами из инфекционных микроорганизмов, выбранных из вируса, бактерии, грибка и паразита. В одном конкретном воплощении инфекционным заболеванием организма является вирус. В конкретном варианте осуществления вирусом является вирус простого герпеса-2 (ВПГ-2). В еще одном
- 4 027236 конкретном варианте по меньшей мере один из первого и второго определенного антигена выбран из
ВПГ-2 ИЬ19 полипептида, а другой - из первого и второго определенного антигена ВПГ-2 ΟΌ полипептида.
В других вариантах осуществления препаратов, описанных здесь и выше, рекомбинантный экспрессионный вектор выбирается из лентивирусного векторного генома, поксвирусного векторного генома, генома вируса коровьей оспы, аденовирусного векторного генома, аденовирус-связанных вирусных векторных геномов, герпес-вирусного векторного генома и альфа-вирусного векторного генома. В одном конкретном варианте рекомбинантный экспрессионный вектор включен в вектор частицы. В еще одном конкретном варианте частица вектора способна доставлять рекомбинантный экспрессионный вектор в антиген-представляющие клетки. В более конкретных вариантах осуществления антигенпредставляющими клетками являются дендритные клетки. В других конкретных вариантах осуществления векторные частицы являются лентивирусной векторной частицей, которая состоит из генома лентивирусного вектора; поксвирусной векторной частицы, которая включает поксвирусный вектор генома; геном вируса коровьей оспы, который состоит из геномного вектора вируса коровьей оспы; аденовирусной векторной частицы, которая состоит из генома вектор аденовируса; аденовирус-связанная вирусная векторная частица, которая включает аденовирус-связанный вирусный векторный геном; частицы вектора вируса герпеса, который состоит из генома вектора вируса герпеса; или альфа-вирусной векторной частицы, которая включает в себя альфа-вирусный вектор генома. В более конкретном воплощении вектор частицы является лентивирусным вектором частицы, который состоит из генома лентивирусного вектора. В еще более конкретных вариантах осуществления лентивирусные векторные частицы дополнительно состоят из конверта, состоящего из Синдбис вируса Е2 гликопротеина, который состоит из аминокислотной последовательности, имеющей по меньшей мере одну аминокислотную замену по сравнению с 8ЕО ГО N0: 1, где остаток 160 8Е0 ГО N0: 1 либо отсутствует, либо имеет аминокислоту, отличную от глютаминовой кислоты, и где гликопротеин Е2 не является фрагментом слитого белка, который содержит Синдбис вирус Е3 белка. В других конкретных вариантах осуществления гликопротеин Е2 связывается с дендритными специфическими клетками конкретной внутриклеточной молекулы-3связывающих не интегрином (Όϋ-δΙΟΝ).
В другом воплощении препаратов, описанных здесь и выше, предоставляются препараты для использования в стимулировании цитотоксического Т-клеточного ответа против опухолевых клеток, состоящие из (а) первого определенного антигена; (Ь) второго определенного антигена или (с) первого определенного антигена и второго определенного антигена. В других конкретных вариантах осуществления препараты, описанные здесь и выше, используются для стимулирования ответа цитотоксических Т-лимфоцитов против инфекционных заболеваний микроорганизма (а) первого определенного антигена, (Ь) второго определенного антигена или (с) первого определенного антигена и второго определенного антигена. В других конкретных вариантах осуществления препараты, описанные здесь и выше, используются для сокращения вероятности возникновения или рецидива опухоли, состоящей из множества опухолевых клеток, которые несут опухоль-ассоциированные антигены. В другом воплощении эти препараты используются для предотвращения или лечения инфекции, вызванной инфекционным микроорганизмом.
Используемый здесь термин изолированный означает, что материал удаляется из исходной среды (например, из природной среды, если он встречается в природе). Например, встречающаяся в природе нуклеиновая кислота или полипептид присутствуют в живом животном в не изолированном виде, но та же нуклеиновая кислота или полипептид отделены от некоторых или всех совместно существующих материалов в природной среде. Такая нуклеиновая кислота может быть частью вектора. Нуклеиновая кислота, которая может быть частью вектора, все еще может быть изолированной нуклеиновой кислотой, не являющаяся частью природной среды для нуклеиновых кислот. Изолированный полипептид, белок или фрагмент, может быть компонентом композиции и все еще быть изолированным, так как композиция не является частью природной среды для полипептида. Термин ген означает сегмент ДНК, участвующей в производстве полипептидной цепи; ген включает регионы до и после кодирования регионов лидирующий и завершающий, а также промежуточных последовательностей (интронов) между отдельными сегментами кодирования (экзонов). Аминокислоты могут передаваться здесь с помощью однобуквенного и трехбуквенного кода, которые входят в объем общих знаний в данной области техники и с которыми знаком специалист в данной области техники. Термин фьюжн полипептид может также использоваться здесь взаимозаменяемо с фьюжн белок, и, если специально не указано иное, эти два термина не предназначены для обозначения молекул, которые имеют различные свойства или характеристики.
Используемые в изобретении и в формуле формы единственного числа подразумевают и множественное число, если в контексте явно не указано иначе. Так, например, ссылка на антиген включает множество таких антигенов, и ссылка на клетка или клетки включает ссылку на одну или несколько клеток и их эквиваленты (например, множественность клеток), известных квалифицированным специалистам в данной области техники. Аналогичным образом, ссылка на соединение или композицию включает в себя множество таких соединений или композиций и относится к одному(ой) или более со- 5 027236 единениям или композициям соответственно, если в контексте явно не указано иначе. При описании этапов способа шаги выполняются в определенном порядке: первый шаг происходит (или выполняется) до (т.е. перед), второй шаг выполняется (или происходит) последующим за первым шагом. Термин приблизительно, ссылаясь на ряд или числовой диапазон, означает, что упоминаемый номер или числовой диапазон является приближенным в рамках экспериментальной изменчивости (или в пределах статистической погрешности эксперимента), и, таким образом, число или числовой диапазон может варьироваться от 1 до 15% от заявленного номера или числового диапазона. Термин включает (и связанные с ними такие термины, как включают, или включает, или включая) не является или намеревается исключить, что в других вариантах, например, вариант осуществления любой композиции вещества, композиции, способа, процесса или т.п., описанного здесь, может состоять из или по существу состоит из описанных функций.
Краткое описание фигур
Фиг. 1 изображает СГО4 иммунный ответ, специфичный для ВПГ-2 ЦЫ9 белка. Группы из пяти мышей были иммунизированы через первичную/бустерную иммунизацию (Й0 первичная/й21 бустерная) с 5 мкг рекомбинантного ВПГ-2 ИЬ19 белка в сочетании с 5 мкг гликопиранозил-липидного адъюванта (ОЬЛ), сформулированного в стабильной эмульсии масло-в-воде (ОЬЛ-СЭ), стабильной эмульсии маслов-воде (СЭ) или ΡΒδ (ни один). Лиенальный СГО4 Т-клеточный ответ был измерен после ех νίνο повторной стимуляции с ИЬ19 Т-клеточнымо эпитопом, содержащим пептид. Уровни ΙΝΤ-γ, ΙΝΤ-α и 1Ь-2 были определены внутриклеточным цитокиновым окрашиванием (ВЦО) с последующей функционально активной клеточной сывороткой (ФАКС). Процент положительных цитокиновых СГО4 Т-клеток изображен для каждой группы.
Фиг. 2 иллюстрирует иммунный ответ на ВПГ -2 ИЬ19 белок. Группы из пяти мышей были иммунизированы ΟΤΑ-δΕ-адъювантным тиЬ19 белком (тРто1еш + ОЬА/δΕ) либо с лентивирусным вектором (ΌΟ-ΝΙΕν) (Корпорация иммунных разработок, Сиэтл, США) кодирования полипептидом ВПГ-2, ИЬ19 (Ленти вектора). Титры антител были определены (справа), лиенальные ИЬ19 специфические СГО4 и С.ГО8 Т-клетки были проанализированы для производства ΙΝΤ-γ и ΙΝΤ-α Ιί','δ (слева). Число в штучной упаковке указывает на процент С.ГО4 и СГО8 клеток, которые являются ΙΝΤ-γ' и ΙΝΤ-α+.
Фиг. 3 изображает иммунный ответ индуцированной мыши первичной прививкой с ΌΟ-ΝΙΕν, кодированной овальбумином (Εν), и затем увеличивает за счет ΡΒδ, ОЬА/δΕ одиночку, рекомбинантного овальбумина, в сочетании с δΕ (гР + δΕ) или овальбумина ΟΕΑ-δΕ-адъювант (гР + ОЬА/δΕ). Лиенальные клетки были изолированы от животных через четыре дня после повышения иммунизации. Лиенальные специфичные СЭ8 Т-клетки овальбумина были проанализированы для производства ΙΝΤ-γ и ΙΝΤ-α в ΙΟδ. Номера в каждом квадранте представляют процент СЭ8 Т-клетки, которые представляют ΙΝΤ-γ' и ΤΝΤ-α+.
Фиг. 4А и 4В иллюстрируют иммунный ответ животных, иммунизированных рекомбинантным белком ВПГ-2 иЬ19, сформулированным с ОЬА-δΕ и иммунизированным ΌΟ-ΝΙΕν кодирования иЬ19. Группы из пяти мышей С57ВЬ/6 были иммунизированы с адъювантами ОЬА-δΕ тиЬ19 белка (гР + ОЬА/δΕ) или ΡΒδ с увеличением ОТА^Т-адъювантом тиЬ19 белка или ЭС-ΝΙΤν. содержащих полинуклеотид, кодированные иЬ19 (ЬУ). Лиенальные клетки были изолированы от животных через десять дней после повышения иммунизации. После ех νίνο стимуляции с одним 15-мерным пептидом содержащие эпитоп СГО4 или СГО8 иЬ19, лиенальные ИЫ9 специфические СГО4 и СГО8 Т-клетки были проанализированы для производства ΙΝΤ-γ и ΙΝΤ-α и 11-2 в Ιί',’δ.
Фиг. 4А (слева) изображает продукцию для одного мышиного представителя на группу. В правой части показан процент позитивных С.ГО8 цитокиновых Т-клеток, которые были простимулированы двумя различными эпитопами СГО8 ИЫ9.
Фиг. 4В представляет совместные измерения ^О в животных от каждой привитой группы. ОТА^В-адъювантный тиЬ19 белок представляет гР, ΒίΩ: ниже уровня обнаружения.
Фиг. 5А и 5В изображают иммунный ответ у животных, иммунизированных рекомбинантным белком, сформулированным с адъювантом, ОЬА/δΕ, и затем увеличение иммунного ответа рекомбинантным белком и лентивирусным вектором, кодирующим белок. Группы из пяти мышей С57ВЬ/6 были иммунизированы с ОТА^Н-адъювантным тиЬ19 белком (гР + ОЬА/δΕ) или ΡΒδ и увеличили с ОЬА-δΕадъювантным тиЬ19 белком (гР + ОЬА/δΕ) и ΌΑΝΙΕν, содержащих полинуклеотид, которые кодированы ИЬ19 (Εν). Лиенальные клетки были изолированы от животных через десять дней после повышенной иммунизации. После ех νίνο стимуляции с одним 15-мерным пептидом, содержащим СГО4 или С.ГО8 ИЬ19 эпитоп, лиенальные ИЬ19 определенные СГО4 и С.ГО8 Т-клетки, были проанализированы для ΙΝΤ-γ и ΙΝΤ-α и Ι1-2 в Ιί',’δ. Фиг. 5 (слева) изображает цитокиновую продукцию для одного мышиного представителя на группу. С правой стороны на фиг. 5А показан процент положительных С.ГО4 Т-клеток цитокина, которые были простимулированы одним из двух различных эпитопов СГО4 ИЬ19 и процент позитивных С.ГО8 Т-клеток цитокина, которые были простимулированы одним из двух различных эпитопов С.ГО8 ИЬ19.
Сыворотки были получены от животных в каждой группе через пять дней после иммунизации и че- 6 027236 рез десять дней после повышения были обнаружены специфические антитела 1дС.
Фиг. 5В представляет общие измерения 1дС у животных от каждой привитой группы. СЬА-δΕадъювантный гиЬ19 белок представляет гР. Слева направо, четыре набора данных представляют титр 1дС у животных, которые получили: (1) РВ§ (композиция грунтовки, 1°) следуют иммунизации с адъювантами СЬА-δΕ гиЬ19 белка и ПС-МЬУ кодирования ИЬ19 (гР + ЬУ) (увеличение композиции, 2°) (сыворотка, полученная через пять дней после повышения); (2) РВ§ (основная композиция, 1°) последующая иммунизации с гР + ЬУ (бустерная композиция, 2°) (сыворотка, полученная через десять дней после иммунизации); (3) ОЬЛ-§Е-адъювантным гЦЫ9 белком (гР) (основная композиция, 1°), а затем иммунизации с гР + ЬУ (бустерная композиция, 2°) (сыворотка, полученная через пять дней после иммунизации); (4) гР (основная композиция, 1°), а затем иммунизации с гР + ЬУ (бустерная композиция, 2°) (сыворотка,. полученная через десять дней после иммунизации).
Фиг. 6 иллюстрирует несколько схем образцовой иммунизации, которые могут быть использованы с помощью иммуногенной композиции, описанных здесь для стимулирования специфического ответа СЭ4 Т-клеток, определенного ответа СИ8 Т-клеток и специфического ответа антитела. Иммуноген: рекомбинантный или изолированный полипептид(ы), представляющий(е) интерес; вектор, кодирующий иммуноген: рекомбинантный экспрессирующий вектор, содержащий полинуклеотид, который кодирует полипептид(ы), представляющий(е) интерес.
Фиг. 7 показывает, что ИС-МЕУ создает надежный Сад-специфический СИ8 Т-клеточный ответ.
Фиг. 8 показывает, что СЬА необходим для надежного ТЫ СИ4 Т-клеточного ответа после иммунизации с рекомбинантным белком §гУ-Сад.
Фиг. 9 показывает, что ТЫ СИ4 и СИ8 Т-клеточные ответы, генерируемые гетерологичной вакцинацией, могут быть увеличены с г§1У Сад + СЬА-δΕ.
Фиг. 10 показывает, что ТЫ СИ8 и СИ4 Т-клеточные ответы, генерированные гетерологичной вакциной, могут быть бустерным г§1У-Сад + СЬА-δΕ.
Фиг. 11 показывает, что СИ8 Т-клеточный ответ, генерированный ИС-МЕУ, может быть бустерным с синтетическим долгим пептидом + СЬА-δΕ. Показаны аминокислоты 289-333 δ^-Сад (СРΚΕРΡ^δΥV^ΚΡΥΚδ^ΚАΕ^Т^ААVΚNVΜТ^Т^^I^NАNР^СΚ^; δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 42).
Подробное описание
Вакцинации против заболеваний и состояний, например инфекционных заболеваний, включали стратегии, которые включали иммунизацию с одной композицией (основной композицией) и впоследствии иммунизацию с различными композициями (бустерной композицией). Однако двойная вакцинационная стратегия на сегодняшний день адекватно не побудила как реакции СИ4 и СИ8 Т-клеток, так и гуморальный иммунитет, которые обеспечивают достаточную защиту от многих заболеваний и условий.
Представленные здесь композиции и способы для повышения двойной иммунизации, которые индуцируют иммунный ответ у пациента, который включает гуморальный иммунный ответ и клеточный иммунный ответ, СИ4 и СИ8 Т-лимфоцитные иммунные реакции, обеспечивают полный адаптогенный иммунный ответ на один или более антиген. Соответственно композиции, описанные здесь, могут быть разработаны и сформулированы как вакцины. Поэтому описанные способы полезны для лечения и предотвращения (т.е. уменьшение вероятности или риска или их повторения биологично, клинично, и/или статистично значимым образом) различных заболеваний, расстройств и условий, таких как рак и инфекционные заболевания, для которых индукция гуморального иммунного ответа и клеточного иммунного ответа улучшает клинические исходы или необходима для оптимальной выгоды.
Представлены две разные иммуногенные композиции, которые вводят одновременно или последовательно в любом порядке субъекту, который в этом нуждается. По меньшей мере одна из иммуногенных композиций индуцирует специфический гуморальный (т.е. реакции антитела) и/или специфический СИ4 Т-клеточный ответ (который может включать в себя память СИ4 Т-клеточного ответа) на иммуноген и по меньшей мере одна из иммуногенных композиций вызывает специфичный ответ СИ8 Т-клеток, которая может включать ответ цитотоксических Т-клеток (ЦТЛ), специфичных для иммуногена. В некоторых вариантах одна из двух иммуногенных композиций может быть более эффективной для стимулирования специфичного гуморального и/или специфичного СИ4 Т-клеточного ответа и другая из двух иммуногенных композиций может быть более эффективной для стимулирования специфического ответа СИ8 Т-клеток.
Одна иммуногенная композиция состоит по меньшей мере из одного иммуногена, который способен индуцировать иммунный ответ, специфичный для определенного антигена, который представляет интерес. Эта иммуногенная композиция дополнительно может состоять из адъюванта, что усиливает или дополнительно может потребоваться, для стимулирования иммунной реакции, специфичной для конкретного иммуногена и назначенного антигена. Вторая иммуногенная композиция состоит из рекомбинантного экспрессирующего вектора, состоящего из последовательности нуклеотидов, которая кодирует иммуноген. Рекомбинантный экспрессирующий вектор дополнительно включает по меньшей мере одну регулированную последовательность, оперативно связанную с последовательностью нуклеотидов, которая кодирует иммуноген, и, таким образом, рекомбинантный экспрессирующий вектор способен руководить выражением иммуноген. В некоторых конкретных вариантах осуществления рекомбинантный экс- 7 027236 дрессирующий вектор включает вектор частицы (например, частица вирусного вектора). Описываемый дополнительно иммуноген может быть иммуногенным фрагментом определенного антигена или может быть полноразмерным назначенным антигеном (или его иммуногенным вариантом) или слитым белком, который включает один или несколько иммуногенных фрагментов или включает полноразмерный определенный антиген (или их иммуногенные варианты).
Таким образом, любое использование термина иммуноген здесь относится ко всей группе полипептидов, которые являются (а) полноразмерным антигеном, (2) иммуногенным фрагментом антигена, (3) иммуногенным вариантом иммуногенных фрагментов, (4) химерным слитым белком, включающим части других полипептидов и (5) конъюгатами. Таким образом, иммуноген представляет полипептид, состоящий из любого из (I) первого определенного антигена, (II) его иммуногенного фрагмента или (III) его варианта, способного индуцировать иммунный ответ, специфичный для первого определенного антигена.
К примеру, такие иммуногенные варианты сохраняют по меньшей мере 90% идентичных аминокислот, по меньшей мере 10 смежных аминокислот антигена или по меньшей мере 85% идентичных аминокислот, по меньшей мере 15 смежных последовательных аминокислот с антигеном (например, оболочки белков или опухоль-ассоциированных антигенов). Как другой пример, такие иммуногенные фрагменты композиции имеют по меньшей мере 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 48 или 50 смежных аминокислот с антигеном. Другие примеры включают по меньшей мере 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичность по меньшей мере 50 смежных аминокислот с антигеном или по меньшей мере 100 смежных аминокислот с антигеном.
Следует понимать, что описанные здесь методы, когда делается ссылка на первую иммуногенную композицию, состоящую из иммуногена, и вторую иммуногенную композицию, состоящие из последовательности нуклеотидов, которая кодирует иммуноген, кодированные иммуногены полипептида второй иммуногенной композиции не должны иметь ту же последовательность аминокислот, как полипептид иммуногена первой иммуногенной композиции. Таким образом, способы и композиции, описываемые здесь, представляют, что первая иммуногенная композиция состоит по меньшей мере из одного, двух, трех или более мелких фрагментов антигена (например, оболочка белков или опухольассоциированных антигенов) и вторая иммуногенная композиция включает нуклеотидные последовательности, кодированные полноразмерным антигеном или больше его фрагментом, или наоборот. Например, первый полипептид - небольшой фрагмент иммуногенного антигена, около 50 аминокислот или меньше в длину - и второй полипептид полноразмерного антигена или больше фрагмента, около 50 аминокислот или более в длину, при необходимости по меньшей мере 80, 85, 90 или 95% идентичности с полноразмерным антигеном.
В других конкретных вариантах осуществления приведенный второй иммуноген включен в иммуногенную композицию. Второй иммуноген способен побудить иммунную реакцию к определенному антигену, который может быть такой же или отличается от определенного антигена, для которого первый иммуноген побуждает специфический иммунный ответ. В другом конкретном варианте первый иммуноген вызывает специфический иммунный ответ С.И4 Т-клеток и может также вызвать специфический ответ антитела, и второй иммуноген индуцирует, по меньшей мере, С.И8 Т-клетки иммунного ответа. В некоторых конкретных вариантах осуществления иммунизация предназначена для иммунизации со вторым иммуногеном только через выражение второго иммуногенного рекомбинантного экспрессирующего вектора. Соответственно, иммуногенная композиция, состоящая из первого иммуногена (и который дополнительно может включать адъювант), не хватает второго иммуногена, и рекомбинантный экспрессирующий вектор состоит из последовательности нуклеотидов, которая кодирует первый иммуноген и которая кодирует второй иммуноген.
Иммуногенные композиции и способы, описанные здесь, могут быть полезны для профилактики или лечения инфекционных болезней, особенно инфекционных заболеваний, для которых нет удовлетворительной вакцины или после заражения лечения не существует (например, вирусные инфекции, такие как ВИЧ и ВПГ-2 и паразитарные инфекции, таких как малярия). В других вариантах иммуногенные композиции и способы, описанные здесь, могут использоваться для лечения и/или снижение вероятности возникновения рака и злокачественной опухоли.
Ниже подробно описаны различные варианты осуществления иммуногенных композиций, препаратов, включающих иммуногенные композиции, так и способы использования препаратов и композиции.
- 8 027236
Иммуногенные композиции
Различные иммуногенные композиции, описанные здесь, что использованы в стратегии скоординированного иммунизации, полезны для стимулирования конкретного, адаптивного иммунного ответа. Одна иммуногенная композиция состоит по меньшей мере из одного иммуногена и дополнительно включает физиологически подходящий (т.е. фармацевтически приемлемый или подходящий) адъюванта. Иммуноген, включенный в первую иммуногенную композицию, обычно является изолированным иммуногеном, который может быть изолированы от своей природной среды или может образовываться рекомбинантно. Во-первых, для удобства ссылок, иммуноген иммуногенной композиции называется здесь изолированным рекомбинантным иммуногеном. Во-вторых, различные композиции состоят из рекомбинантного экспрессирующего вектора, который состоит из последовательности нуклеотидов, кодирующая иммуноген. Вторая иммуногенная композиция также может состоять из вспомогательного средства. Если первая композиция и вторая композиция включают адъювант, то адъюванты включены в каждую композицию, могут быть одинаковыми или разными.
Введение двух разных композиций субъекту индуцирует специфический иммунный ответ по меньшей мере один иммуноген из соответствующих антигенов представляющих интерес (также называется здесь определенный антиген). Специфический иммунный ответ включает в себя конкретный гуморальный иммунный ответ (т.е. специфический антительный ответ) и конкретный клеточный иммунный ответ (включая СИ4 Т-клеточный ответ и СИ8 Т-клеточный ответ), каждый ответ иммуногена есть специфичным для определенного антигена представляющего интерес. Иммуногенные препараты, упомянутых в настоящем документе, включает эти две иммуногенные композиции, которые могут быть переданы здесь для удобства как первая иммуногенная композиция и вторая иммуногенная композиция. Соответственно в одном воплощении, иммуногенная подготовка включает (а) по меньшей мере, одну иммуногенную композицию, которая включает по меньшей мере один изолированный рекомбинантный иммуноген способный вызывая иммунную реакцию, специфичную для определенного антигена; и (Ь) по меньшей мере, одну вторую иммуногенную композицию, которая включает рекомбинантного экспрессирующего вектора, содержащего иммуногенную нуклеотидную последовательность кодирующую по меньшей мере один иммуноген. Иммуногенные композиции препаратов могут назначаться одновременно или последовательно в любом порядке субъекту для индукции специфичного иммунного ответа на конкретный иммуноген и для соответствующего определенного антигена. Каждая из иммуногенных композиций, которые используются, описаны более подробно в настоящем документе.
Каждая иммуногенная композиция дополнительно может состоять по меньшей мере из одного физиологически (или фармацевтически) подходящего наполнителя. Любой физиологически или фармацевтически подходящий наполнитель или носитель (т.е. материала не токсичного, который не влияет на активность активного ингредиента) известны специалистам в данной области, для использования в фармацевтической композиции могут быть использованы в иммуногенных композициях, описанных здесь. Примерами наполнителей являются разбавители и наполнители, которые поддерживают стабильность и целостность белков. Наполнители для терапевтического использования, хорошо известны и описаны, например, в ВепипЦоп: ТЬе 8тепсе апб Ргасйсе оГ РЬагтасу (Оеииаго, 2Е’1 Еб. Маск РиЬ. Со., ЕаЛоп, РА (2005)) и описываются в настоящем документе более подробно.
Иммуноген может быть идентичен определенного антигена, т.е. иммуноген состоит из примерной полноразмерной аминокислотной последовательности определенного антигена, или может включать его вариант, который разделяет высокий процент идентичности с примерным полноразмерным определенным антигеном и который сохраняет функциональную характеристику определенного антигена, например, способность индуцировать специфический иммунный ответ. Кроме того, иммуноген может быть иммуногенным фрагментом определенного антигена. Иммуногеном, который является вариантом или фрагментом определенного антигена демонстрируют способность индуцировать иммунную реакцию (например, гуморальный ответ (т.е. В-клеточный ответ) или клеточный ответ (т.е. Т-клеточный ответ (включая ответ цитотоксических Т-лимфоцитов)) или как гуморальный и клеточный ответ у субъекта, клинически и/или биологически значительным образом. Места антигенов, что представляет интерес, и иммуногенные фрагменты, и их иммуногенные варианты определенных антигенов описаны здесь более подробно.
По отношению к иммуногенной композиции, которая включает по меньшей мере один изолированный рекомбинантный иммуноген, иммуноген может быть полипептидом или пептидом, который был получен рекомбинантно в клетке-хозяине и затем изолирован от клетки-хозяина или изолирован из клеточной культуры (т.е. удалены из исходной среды клетки-хозяина) в соответствии с методами, вошедшими в практику молекулярной биологии и искусства выделения белка. Когда иммуноген производится рекомбинантно согласно способам, описанным здесь и в уровне техники, с которыми знакомы квалифицированные специалисты, иммуноген можно назвать рекомбинантным иммуногеном. Кроме того, иммуногены могут быть выделены или удалены из природного источника, такого как, например, из вируса, бактерии, паразита, грибка или опухолевой клетки. Методы для выделения одного или нескольких иммуногенов и антигенов из природных источников, описаны в уровне техники, а также могут быть легко определены эмпирически квалифицированным специалистом с использованием методов и методик, ко- 9 027236 торые регулярно практикуются в уровне техники.
Как описано в данном описании, рекомбинантный экспрессирующий вектор, включенный во вторую иммуногенную композицию, состоит из последовательности нуклеотидов (также называется здесь полинуклеотидной последовательностью), которая кодирует по меньшей мере один иммуноген. Рекомбинантный экспрессирующий вектор дополнительно состоит по меньшей мере из одной регулированной последовательности, которая оперативно связана с кодирующей нуклеотидной последовательностью таким образом, что вектор способен управлять экспрессией иммуногена. Иммуноген, который кодируется, и рекомбинантный экспрессирующий вектор могут быть идентичными с определенным антигеном, т.е. иммуноген состоит из примерной полноразмерной аминокислотной последовательности определенного антигена или может включать его вариант, что имеет высокий процент идентичности с примерный полноразмерный определенным антигеном и что сохраняет функциональные характеристики определенного антигена, например возможность, индуцировать специфический иммунный ответ. Кроме того, кодированный иммуноген может быть фрагментом иммуногенного определенного антигена. Иммуногены, которые являются вариантами или фрагментами определенного антигена, демонстрируют возможность индуцировать иммунную реакцию (например, гуморальный ответ (т.е. В-клеточный ответ) или клеточный ответ (т.е. Т-клеточный ответ (включая ответ цитотоксических Т-лимфоцитов)) или гуморальный и клеточный ответ) или как гуморальный и клеточный ответ у субъекта, клинически и/или биологически значительным образом. Определенный интерес к иммуногенным фрагментам и иммуногенным вариантам, их назначение описаны более подробно здесь.
В некоторых вариантах рекомбинантный экспрессирующий вектор включен в вектор частицы (например, вирусный вектор частицы или клеточных частиц). Рекомбинантный экспрессирующий вектор или вектор частиц, состоящий из вектора, сконструирован таким образом, что позволяет частицам быть введенными (т.е. доставленными) в клетки-мишени. В некоторых вариантах клетка-мишень является антиген-представляющей клеткой. В более конкретных вариантах осуществления клетка-мишень представляет профессиональные антиген-представляющие клетки, такие как дендритные клетки. Иммуноген затем экспрессируют в клетку-мишень, и иммуноген или его фрагмент представлены на поверхности антиген-представляющих клеток и индуцируют иммунный ответ, специфический для иммуногена и тем самым для соответствующих определенных антигенов.
В других вариантах, иммуногенная композиция включает в себя по меньшей мере один изолированный рекомбинантный иммуноген (и который дополнительно может включаться адъювантно) дополнительно включает по меньшей мере один дополнительный иммуноген (т.е. по меньшей мере два, три, четыре, пять или более иммуногенов, которые могут быть трансформированы, как два, три, четыре, пять или более иммуногенов)). В некоторых вариантах иммуногенная композиция может включать два или более изолированные рекомбинантный иммуногенов (т.е. по меньшей мере два иммуногена), образуя многовалентную иммуногенность композиции. В случаях, когда два или более иммуногена сочетаются с адъювантом, иммуногенная композиция может включать каждый иммуноген, сформулированный отдельно с адъювантом, и затем адъювантные иммуногены объединяются для формирования иммуногенной композиция. Кроме того, два или более иммуногена могут формулироваться совместно с адъювантом. В некоторых конкретных вариантах каждый из дополнительных иммуногенов (например, второй, третий, иммуноген и т.д.) может индуцировать иммунный ответ специфический для другого определенного антигена как для первого иммуногена. В других конкретных вариантах каждый из дополнительных иммуногенов (например, второй, третий, иммуноген и т.д.) может индуцировать иммунный ответ для другого (например, второй, третий и т.д.) определенного антигена соответственно.
В некоторых альтернативных вариантах многовалентная иммуногенная композиция может включать лизат клетки, органеллы клетки или клетки супернатанта, которые включают по меньшей мере два иммуногена. Например, иммуногены, удаленные из природной среды, такие как иммуногены, полученные от микроорганизмов, могут быть частично изолированы от микроорганизма так, что два или более иммуногена присутствуют в иммуногенной композиции. Аналогичным образом, иммуногены, полученные из опухолевых клеток, могут быть частично изолированы от опухолевых клеток так, чтобы два или более опухоль-связанных антигена присутствовали в иммуногенной композиции.
В отношении иммуногенной композиции, состоящей из рекомбинантного экспрессирующего вектора, нуклеотидная последовательность может кодировать более чем один иммуноген, например по меньшей мере два, три, четыре, пять или более иммуногенов (т.е. два, три, четыре, пять или более иммуногенов). В некоторых конкретных вариантах каждый из дополнительных иммуногенов (например, второй, третий, иммуноген и т.д.) может вызвать такой же иммунный ответ на определенный антиген, как первый иммуноген. В других конкретных вариантах каждый из дополнительных иммуногенов (например, второй, третий иммуноген и т.д.) может вызвать иммунный ответ для другого (например, второй, третий и т.д.) определенного антигена соответственно.
В конкретных вариантах осуществления одна иммуногенная композиция (также называется первая иммуногенная композиция), которая включает по меньшей мере один изолированный рекомбинантный иммуноген (и композиция, которая дополнительно может включать адъювант), способна индуцировать
СИ4 Т-клеток ответ, который специфичен для иммуногена и тем самым специфичен для определенного
- 10 027236 антигена и может также стимулировать гуморальный ответ (т.е. конкретный отклик антитела или антиген-специфического антигена) на иммуноген и определенный антиген. Другая иммуногенная композиция (или вторая иммуногенная композиция) состоит из рекомбинантного экспрессирующего вектора, который включает в себя нуклеотидную последовательность, кодирующую иммуноген, способна индуцировать ί'.Ό8 Т-клеточный ответ для иммуногена и, таким образом, способна индуцировать конкретный СЭ8 Т-клеточный ответ на определенный антиген. Как описано более подробно ниже, иммуноген имеет один или более иммуногенных регионов, которые содержат эпитопы, которые способны индуцировать СЭ4 Т-клеточный ответ и ί'.Ό8 Т-клеточный ответ на специфический иммуноген.
В других конкретных вариантах осуществления иммуногенные препараты, которые предоставляются первой иммуногенной композицией, состоящей по меньшей мере из одного изолированного рекомбинантного иммуногена (так называемый для удобства первый иммуноген), дополнительно могут включать по меньшей мере один дополнительный изолированные рекомбинантный иммуноген. В других вариантах рекомбинантный экспрессирующий вектор включен в другие различные иммуногенные композиции, может кодировать первый иммуноген и кодировать по меньшей мере один дополнительный иммуноген. В еще других альтернативных вариантах первая иммуногенная композиция включает по меньшей мере два изолированных рекомбинантных иммуногена и вторая иммуногенная композиция включает экспрессирующий вектор, который содержит последовательности нуклеотидов, которые кодируют первый иммуноген и по меньшей мере один дополнительный иммуноген.
В некоторых вариантах, когда индукция иммунной реакции характерна для двух или более иммуногенов, желательно, чтобы по меньшей мере один иммуноген был способен индуцировать иммунный ответ, который включает, по меньшей мере, определенный гуморальный и/или СЭ4 Т-клеточный ответ, и по меньшей мере один дополнительный иммуноген способен индуцировать иммунный ответ, который включает, по меньшей мере, определенный СЭ8 Т-клеточный иммунный ответ. Соответственно, представленные здесь в одном варианте воплощения иммуногенная композиция включает (а) иммуногенную композицию (которая может называться первой иммуногенной композицией), которая состоит из первого изолированного/рекомбинантного иммуногена (композиция, которая также может включать дополнительное средство) и (Ь) вторую иммуногенную композицию, которая состоит из рекомбинантного экспрессирующего вектора, который кодирует и направляет экспрессию первого иммуногена и второго иммуногена, где, по меньшей мере, второй иммуноген способен индуцировать определенный СИ8 Т-клеточный ответ. В некоторых вариантах каждый по меньшей мере из двух иммуногенов имеет способность индуцировать иммунную реакцию к одному и тому же определенному антигену. Кроме того, каждый по меньшей мере из двух иммуногенов имеет возможность индуцировать иммунный ответ, специфичный для разных определенных антигенов (для удобства также называется первый и второй определенные антигены и т.д. соответственно).
Иммуногены и определенные антигены.
Иммуноген, который может быть изолированным и/или рекомбинантным иммуногеном, входящий в первую иммуногенную композицию и/или который кодируется рекомбинантным экспрессирующим вектором, содержащимся во второй иммуногенной композиции, используется в способах и в целях, описанных в данном описании, и включает любые иммуногены, которые необходимы для индукции специфического иммунного ответа. В некоторых вариантах иммуноген состоит из примерной полноразмерной аминокислотной последовательности определенного антигена, представляющего интерес, или иммуноген может быть фрагментом иммуногенного антигена, соответствующего определенному антигену. В других определенных вариантах осуществления иммуноген может включать вариант определенного антигена, который включает вариант, содержащий высокий процент идентичности с примерным полноразмерно определенным антигеном, и имеет, по существу, такой же уровень иммуногенности, как определенный антиген, состоящий из примерной аминокислотной последовательности (т.е. вариант сохраняет уровень иммуногенности к статистически, клинически или биологически значительной степени по сравнению с иммуногенностью антигена примерного или дикого типа). В частности, иммуногены, которые содержат иммуногенные фрагменты или являются вариантами определенного антигена, статистически, клинически или биологически значимым образом способны индуцировать гуморальный иммунный ответ (например, В-клеточный ответ в результате экспрессии специфических антител), или клеточный ответ (например, СЭ4 Т-клеточный ответ или СЭ8 Т-клеточный ответ, включая ответ, цитотоксических Т-лимфоцитов), или гуморальный и клеточный ответ у субъекта. Определенные антигены, представляющие интерес, и иммуногенные фрагменты и их иммуногенные варианты описаны более подробно в данном документе.
Как описано более подробно в данном документе, иммуноген включает по меньшей мере один иммуногенный регион или иммуногенный эпитоп, который способны индуцировать у субъекта иммунный ответ, специфичный для определенного антигена. В одном конкретном варианте иммуноген состоит из одного или нескольких иммуногенных регионов таким образом, что иммуноген способен индуцировать одну или несколько реакций антитела, СИ4 Т-клеточный ответ и СИ8 Т-клеточный ответ, таким образом, специфичный для соответствующих антигенов. Соответственно, иммуногенные области включают в себя по меньшей мере один эпитоп (т.е. один или несколько эпитопов), который вызывает одну или более из
- 11 027236 реакций антитела, СЭ4 Т-клеточный ответ и СЭ8 Т-клеточный ответ.
Клеточный иммунный ответ включает в себя ответ цитотоксических Т-лимфоцитов, такой ответ может уничтожить или повредить клетки (например, опухолевые клеток, бактериальные клеток, вирусные, паразитные или грибковые клетки) или инфекционные частицы (например, вирусные частицы), который продуцирует или экспрессирует иммуноген или соответствующий определенный антиген. Любой антиген, связанный с заболеванием или расстройством, для которого гуморальный иммунный ответ или клеточный иммунный ответ или оба ответа не являются благоприятными для иммунизации субъекта, может быть использован в качестве иммуногена.
Антигены, ассоциированные со многими заболеваниями и расстройствами, хорошо известны в уровне техники. Антиген, который представляет интерес (т.е. определенный антиген), может быть заранее ассоциирован с заболеванием или расстройством или может быть определен как антиген-связанный с заболеванием или расстройством любым способом, известным и использованным в данной области техники. Например, антиген, связанный с типом рака, из-за которого страдает пациент, может быть известен, например ассоциированный с опухолью антиген, или может быть определен из самой опухоли любым из различных способов, использованных в данной области техники. В некоторых вариантах определенный антиген является ассоциированным с опухолью антигеном (также называется здесь как опухолевый антиген), полученным от раковых клеток (т.е. опухолевых клеток), и один или несколько таких опухолевых антигенов могут быть полезны для иммунотерапевтического лечения раковых заболеваний. В качестве неограничивающего примера ассоциированный с опухолью антиген может быть получен от простаты, молочной железы, толстой кишки, легких, поджелудочной железы, почек, мезотелиомы, яичников или меланомы рака. Эти и дополнительные ассоциированные с опухолью антигены описаны здесь и в уровне техники.
В некоторых вариантах иммуноген включают полноразмерные белки, которые являются определенными антигенами и являются производными от опухоли или злокачественных новообразований. В других определенных вариантах осуществления иммуноген состоит из одного или нескольких иммуногенных фрагментов, которые содержат один или несколько эпитопов от таких белков. В других вариантах осуществления иммуноген состоит из слитого полипептида, который состоит из полноразмерного определенного антигена или включает один, два, три или более иммуногенных фрагмента определенного антигена, производного от опухолевых клеток. В других вариантах, когда иммуногенная композиция готовится для использования в стимулировании иммунного ответа против двух или более указанных антигенов, слитый полипептид может включать любую комбинацию полноразмерного антигена или одного или более его иммуногенных фрагментов для каждого из двух или больше определенных антигенов. Например, слитый полипептид может включать в себя один или более иммуногенных фрагментов, полученных из одного ассоциированного с опухолью антигена, и дополнительно может состоять из одного или нескольких иммуногенных фрагментов, полученных от второго, другого связанного с опухолью антигена. Слитые белки могут включать, в дополнение к иммуногенному полипептиду или пептиду, по меньшей мере один полипептид или пептид, который иногда называют белком-носителем в иммунологии, что усиливает иммунную реакцию к иммуногену, представляющему интерес.
Типичные ассоциированные с опухолью антигены или опухолевые клетки включают МАСЕ 1, 3 и МАСЕ 4 (или другие МАСЕ антигены, такие как описанные к Международной заявке на патент под номером АО 99/40188); РКАМЕ; ВАСЕ; КАСЕ, Ьаде (также известным в Нью-Йорке как ΝΥ Е§0 1); §АСЕ и НАСЕ (см., например, описанные к Международной заявке на патент под номером АО 99/53061) или САСЕ (КоЬЫик е! а1., Сигг. Ορίη. 1ттипо1. 8:628-36 (1996); Уаи беи Еуибе е! а1., Ιηΐ. I. С1ш. ЬаЬ. Кек. 27:81-86 (1997); Уаи беи Еуибе е! а1., Сигг. Ορίη. 1ттиио1. 9:648-93 (1997); Соггеа1е е! а1., I. Ν;·ι11. Саисег 1ик!. 89: 293 (1997)). Эти неограниченные примеры опухолевых антигенов, выражены в широком диапазоне типов опухолей, таких как меланома, рак легкого, саркома и карцинома мочевого пузыря. См., например, патент США № 6544518. Опухоль-ассоциированные антигены рака простаты включают, например, антиген простаты конкретной мембраны (АПКМ), простатоспецифический антиген (ПСА), кислые фосфаты предстательной железы, ΝΚΧ3.1 и шесть трансмембранных эпителиальных антигенов простаты (ШТЕАП) (НиЬей е! а1., Ргос. Νηΐ1. Асаб. δα. υδΛ. 96 14523-28, 1999); см., также например, КеЬет е! а1., Ргос. №1. Асаб. δ^.. υδΑ 95:1735-40, 1998; №1кои е! а1., Ргос. №!1. Асаб. δΦ. ^А, 96:3114-19 (1999); АО 98/12302; υ.δ. Ра!. №)8. 5955306; 5840871 аиб 5786148; см. также, например, описания к Международным заявкам на патенты под номерами АО 98/20117; АО 00/04149; АО 98/137418).
Другие связанные с опухолью антигены включают Р1и-1 (ί. Вю1. СЬет. 274:15633-45, 1999), НАδН-1, НакН-2, Спр!о (Аа1отог1 е! а1., Вюеккаук, 199, 21:61-70; патент США № 5654140) и Спрйи (патент США № 5981215). Кроме того, антиген опухоли может быть самостоятельным пептидным гормоном, таким как полноразмерный гонадотропный рилизинг гормон ((СиКН), см., например, описанные к Международной заявке на патент под номером АО 95/20600), короткий пептид, который состоит их 10 аминокислот, полезный в лечении многих видов рака.
Опухолевые антигены включают опухолевые антигены, производные от рака, которые характеризуются экспрессией ассоциированного с опухолью антигена, например, такого как экспрессия
- 12 027236
НЕК-2/пеи. Ассоциированный с опухолью антиген включает линиеспецифическую экспрессию опухолевого антигена, такого как меланоцит-стимулирующие меланома-специфические антигены МАКТ-1/Ме1ап-А, др100, §р75, тба-7, тирозиназы и тирозинсвязанные белки. Иллюстративный ассоциированный с опухолью антиген включает, но не ограничивается ими, опухоль-специфичные антигены, полученные из или содержащие один или больше из р53, Как, с-Мус, цитоплазматической серин/тирозинкиназы (см. А-КаГ, В-КаГ, и С-КаГ, циклинзависимые киназы), МАОЕ-А1, МАОЕ-А2, МАОЕ-А3, МАОЕ-А4, МАОЕ-А6, МАОЕ-А10, МАОЕ-А12, МАКТ-1, ВАСЕ, ИАМ-6, -10, ОАОЕ-1, -2, -8, ОАОЕ-3, -4, -5, -6, -7В, ИА88-А, МАКТ-1, МС1К, Ср100, Р§А, Р§М, тирозиназы, ТКР-1, ТКР-2, АКТ-4, САМЕЬ, СЕА, Сур-В, ЬТЕКТ, ЬТКТ, ίί'.Έ, МИС1, МИС2, фосфатидилинозитол 3-киназы (Р13Кк), ТКК рецепторов, РКАМЕ, Р15, КИ1, КИ2, §АКТ-1, §АКТ-3, антиген опухоли Вильмса (^Т1), АРР, са!ешп/т, Сакраке-8/т, СЕА, СИК-4/т, ЕЬР2М, ОпТ-У, О250, Н§Р70-2М, Н§Т-2, К1АА0205, МИМ-1, МИМ-2, МИМ-3, Муок1п/т, КАСЕ, §АКТ-2, ТКР-2/ЮТ2, 707-АР, Аппехш II, СИС27/т, ТР1/тЬет-аЫ, ВСК-АВЬ, регуляторный фактор интерферонов 4 (ТКР4), ЕТУ6/АМЬ, ЬПЕК/РИТ, Рт1/КАК, опухольассоциированный кальциевый сигнальный трансдуктор 1 (ТАС8ТИ1) ТАС§ТИ2, рецептор тирозинкиназы (см., например, Рецептор эпидермального фактора роста (РЭФР) (ЕОРК) (частично, ЕОРКуШ), рецептор фактора роста тромбоцитов (РИОРК), рецептор сосудисто-эндотелиального фактора роста (РСЭФР) (УЕОРК)), цитоплазматическую тирозинкиназу (см., например, кгс-семейство, кук-/АР70 семейство), интегрин-связанная киназа (ГБК), переносчики сигнала и активаторы транскрипции §ТАТ3, §ТАТ5, и §ТАТ6, гипоксия индуцированный фактор см., Н1Р-1 и Н1Р-2), ядерный фактор - каппа В (ΝΡ-кВ), Νοίαίιрецептор (см., Νοίαΐι 1-4), с-Ме!, мишень рапамицина в клетках млекопитающих (тТОК), ΧΥΝΕ внутреклеточные сигнал-регулируемые киназы (ЕККк), и их регуляторные субъединицы, РМ§А, РК-3, МИМ2, мезотелин, почечно-клеточный рак (светло-клеточный рак) - 5Т4, §М22-а1рЬа, недостаточность карбоангидразы I (СА1) и IX ((СА1Х) (также известная как О250), §ТЕАЭ, ТЕЬ/АМЫ, ΟΌ2, протеинкиназы 3, ЬТЕКТ, саркома транслокационной точки основы, ЕрЬА2, МШАР, ЕрСАМ, ЕКО (ТМРК§§2 ЕТ§ гибридные гены), ИА17, РАХ3, АЬК, андрогеновый рецептор, циклин В1, полисиаловая кислота, МУСИ, КЬоС, ОИ3, фукозил ОМ1, мезотелин, Р§СА, кЬе, РЬАС1, ОМ3, ВОШ§, Тп, ОЬоЬоН, ИУ-ВК-1, КОк5, §АКТ3, §Тп, РАХ5, ОУ-ТЕ81, спермиевые клетки 17, ЬСК, НМ^МАА, АКАР-4, §§Х2, ХАОЕ 1, В7Н3, легумаин, ТШ2, Раде4, МАЭ-СТ-1, РАР, МАЭ-СТ-2, для родственных антигенов 1 и идиотипов.
Иммуноген также включает опухолевый антиген, который включает эпитопную область или эпитопный белок, полученный из генетических мутированных генов или генов, транскрибирующихся на различных уровнях, в опухолевых клетках, по сравнению с нормальными клетками, такими как теломеразы, сурвивин, мезотелин, мутантные так, Ьсг/аЬ1 перестройки, Нег2/пеи, мутированный или дикий тип р53, цитохром Р450 1В1, и выражено ненормальной экспрессией последовательности интронов, такой как Ν-ацетилглюкозаминилтрансфераза-У; клонированной перестройки генов иммуноглобулинов, продуцированных уникальными идиотипами в меланоме и В-клеточных лимфоцитах; опухолевые антигены, которые включают эпитопные области или эпитопный белок, полученный из онковирусных процессов, таких как белок Е6 и Е7 папиломавируса; белок ЬМР2 вируса Эпштейн-Барр; немутированные онкофетальные белки с опухоль-отборной экспрессией, такой как канцероэмбриональный антиген и альфафетопротеин. См. также Вооп е! а1., Апп. Кеу. Iттипο1. 12:337-65 (1994); КепкуЩ е! а1., Сапсег Iттипο1. ПптипоФег. 50:3-15 (2001).
В других вариантах иммуногены получены от патогенного микроорганизма или от оппортунистического патогенного микроорганизма (также называемого здесь инфекционные болезни, вызванные микроорганизмами), такие как вирусные, грибковые, паразитарные и бактериальные иммуногены. В некоторых вариантах иммуногены, производные от такого микроорганизма, включают полноразмерные белки, которые являются выбранными определенными антигенами. В других определенных вариантах осуществления иммуноген состоит из одного или нескольких иммуногенных фрагментов, которые содержат один или несколько эпитопов от таких белков. В еще других определенных вариантах осуществления иммуноген состоит из слитого полипептида, который включает в себя один, два или более иммуногенных фрагментов белка, производных от микроорганизмов. В еще других вариантах осуществления иммуноген состоит из слитого полипептида, состоящего из полноразмерного определенного антигена или включающего в себя один, два, три или более иммуногенных фрагментов определенного антигена, производного от микроорганизма. В других вариантах, когда иммуногенная композиция готовится для использования в индукции иммунного ответа против двух или более указанных антигенов инфекционных заболеваний микроорганизма, слитый полипептид может включать любое сочетание полноразмерного антигена или один или несколько его иммуногенных фрагментов для каждого из двух или более определенных антигенов. Например, слитый полипептид может включать один или несколько иммуногенных фрагментов, полученных от одного микробного антигена (т.е. вирусного, бактериального, паразитарного или грибкового антигена), и дополнительно может включать один или более иммуногенных фрагментов, полученных от второго, другого микробного антигена (т.е. вторым антигеном являются различные вирусные, бактериальные, паразитарные или грибковые антигены). Слитые протеины могут включать, в дополнение к иммуногенному полипептиду или пептиду, по меньшей мере один полипептид или пептид, который иногда называют белком-носителем в иммунологии, что повышает иммунный ответ иммуноге- 13 027236 на, представляющего интерес.
Примерами патогенных организмов, чьи антигены рассматриваются как определенные антигены и иммуногены для использования в иммуногенных композициях, описанных здесь и что кодируются векторами и векторными частицами, описанные здесь, включают вирус иммунодефицита человека (ВИЧ), вирус простого герпеса (ВПГ), респираторно-синцитиальный вирус (РСВ), цитомегаловирусом (ЦМВ), вирус Эпштейна-Барр (ВЭБ), вирус гриппы А, В и С, вирус везикулярного стоматита (ВВС), вирус везикулярного стоматита (ВВС), видов стафилококков, включая метициллин устойчивый золотистый стафилококк (МУЗС) и видов 8!гер!ососси8, включая 8!гер!ососси8 рпеитотае. Как должно быть понятным квалифицированному специалисту, белки, производные от этих и других патогенных микроорганизмов для использования в качестве иммуногенов, как описано здесь, известны в данной области техники и аминокислотные последовательности таких белков (и их видов) и нуклеотидные последовательности, кодирующие белки, могут быть определены в публикациях и общедоступных базах данных, таких как ΟΕΝΒΑΝΚ, 8\\388-Рго1 и ТтЕМВЬ.
Антигены, полученные из вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), который может быть иммуногеном и использоваться здесь, включают любой из структурных белков ВИЧ (см., др120, др41, р17, р24), протеазы, обратной транскриптазы, или ВИЧ белки кодирующие 1а1. геу, пеГ, νίί, урт и ури. ВИЧ белки и их иммуногенные фрагменты хорошо известны специалистам в данной области техники и могут быть найденым в множестве общественных баз данных (см., например, У1йет-8йай! е! а1., ΑΙΌ8 23(11):1311-18 (2009); \Уа1кш8, Мет. Ιη8ΐ. О8\\а1йо Сти/. 103(2):119-29 (2008); Оао е! а1., Ехрег! Кеу. Уассше8 (4 8ирр1):8161-68 (2004)). (См., например, КПтзйа е! а1., 2003. I. Уио1. 77:12022-32; Ветпатй е! а1., Уйо1о§у 276:93-103 (2000); Вугпе8 е! а1., I. У1то1. 72: 7349-56 (1998); ЫеЬеттап е! а1., ΑΙΌ8 Ке8 Нит. Ке1тоу1ги8е8 13(5): 383-92 (1997); Мепепйе/.-Апт е! а1., Уиа11ттипо1. 11(4):167-181 (1998).
Антигены, полученные из вируса простого герпеса (см., например, Н8У1 и Н8У2), которые рассматриваются для использования в качестве иммуногенов описанных здесь иммуногенных композиций, кодируемые векторами или векторными частицами, включают описанные здесь, но не ограничиваются белками, экспрессирующимися с ВПГ опаздывающими генами. Группа опаздывающих генов преимущественно кодирует белки, которые образуют частицы вириона. Такие белки включают белки (ИЬ), которые образуются из пяти вирусных капсидов: иЬ6, ЦЫ8, иЬ35, иЬ38 и основных белков капсида иЬ19, иЬ45 и иЬ27, которые могут быть использованы в качестве иммуногенов, как описано выше (см., например, МсОеосй е! а1., Уни8 Ке8. 117:90-104 (2006); Мейеп1ейет е! а1., Сигг. Орш МютоЬю1. 9: 423-29 (2006)). Другие примеры ВПГ белков, рассмотренных для использования в качестве иммуногенов, включают 1СР27 (Н1, Н2), гликопротеин В (гВ) и гликопротеин Ό (τΌ) белка. Геном ВПГ включает по меньшей мере 74 гена, каждый из которых кодирует белок, который потенциально может быть использован в качестве иммуногена для индукции Т-клеточного иммунного ответа (включающего ЦТЛ ответ), В-клеточного ответа или оба ЦТЛ и В-клеточные ответы.
Защитный иммунный ответ против антигена ВПГ-2 у людей (см., например, Согеу е! а1., Оепйа1 Негре8, ш 8ехиа11у Ттап8тй1ей Э18еа8е8, Но1те8 е! а1., еЙ8. (МсОга^-НШ, Νον Уогк, 1999) 285-312) и на животных моделях (см., например, Рагг е! а1., 1. Уио1. 72:2677 (1998)) предполагают, что соответствующие ВПГ-2 вакцинные препараты являются желанными и доступными целями. За последние четыре десятилетия серии ВПГ человека, вакцины испытаны в инактивированном виде, целые препараты ВПГ и ВПГ субъединицы белков, сформулированные с адъювантом, были проведены в США и Европе. Несмотря на умеренную терапевтическую эффективность этих вакцин, которая наблюдалась в некоторых краткосрочных исследованиях, результаты исследований надлежащим образом регулированы с более длительным периодом и были в основном разочаровывающими (см., например, Ка_)сат е! а1., Ройа МютоЬю1. (Ргайа) 51:67 (2006)).
В Европе в 1960- и 1970-х гг. длительные клинические испытания были проведены с формальдегидинактивированным ВПГ (Ей ЬШу 4гда1) или инактивированным нагреванием ВПГ (БирЛоп Н !па1). Хотя улучшения в тяжести и частота рецидивов ВПГ были зарегистрированы, только небольшая часть из этих испытаний была плацебо-контролем и двойным-слепым. Кроме того, эти вакцины не предоставляли долгосрочные терапевтические эффекты. Исследования передачи по материнской линии ребенку ВПГ-2, проведенные в 1980-х гг., показали, что младенцы ВПГ-2 серопозитивных женщин обладают более низким риском передачи по сравнению с женщинами, которые в ближайшей перспективе приобретут ВПГ2, предполагая, что нейтрализирующие антитела (нАт) (пАЬ) против ВПГ -2 гликопротеинов τΌ и гВ могут обеспечить защиту (см., например, Кое11е е! а1., Сйп. МютоЬю1. Кеу. 16:96 (2003)). Предназначенные для создания нАт против ВПГ-2 гликопротеинов и испытанные на О1ахо-8тййКйпе и Сйиоп в США в 1990-х гг. была испытана рекомбинантная вакцина с одним τΌ или с гВ, сформулированные с тремя разными адъювантами: квасцы, МР-59 (масло-в-воде), и монофосфорил липид А (МФЛ). Эти вакцины вызвали или увеличили ВПГ-2 специфичных нАт в у серонегативных лиц и кросс-реактивные нАт в ВПГ-1 позитивных лиц (см., например, Витке, Кеу. 1пГес1. Όΐ8. 13 8ирр1 11:8906-8911 (1991)). Тем не менее, не смотря на достижении целевого уровня гуморальной антигенности, эти вакцины не показали эффективность у мужчин, и только переходную эффективность у женщин, предполагая, что анти-ВПГ нАт являются недостаточными, и что успешная вакцина против ВПГ, скорее всего, нужны для создания мощного
- 14 027236
Т-клеточного иммунитета (см., например, Согеу с! а1., 1ЛМЛ 282:331 (1999); 8!апЬсггу, с! а1., N. Еп§1. 1.
Мса. 347:1652(2002)).
Ранее проведенных испытаний вакцины против ВПГ указывает, что нАт может быть недостаточным для защиты людей от инфекции ВПГ-2, и данные свидетельствуют о том, что ВПГ-2-специфические Т-клетки играют важную роль в снижении приобретения вируса, передачи и повторной реактивации (см., например, Согеу с! а1., 1АМА (1999), см. выше). Например, лица с недостатками в функциональности Тклеток имеют, длительные, более тяжелые случаи инфекции ВПГ-2, а в продольных исследованиях биопсии, пораженных ВПГ-2, вирусы обратно коррелируют с проникновением СЭ8 Т-клеток (см., например, Кос11с с! а1., 1. С1ш. ЩускР 110:537 (2002); Кос11с с! а1., 1. С1ш. ШускР 101:1500 (1998), см. выше). Дополнительные ВПГ исследования показали, что: вспомогательные ответы Т-клетки 1 типа (ТЫ), были защитные в животных моделях (см., например, Кос11с, с! а1., 1. Iттиηо1. 166:4049 (2001); Ζΐιιι, с! а1., 1. Ехр. Мса. 204:595 (2007)), Дополнительные ВПГ исследования показали, что: вспомогательные ответы Тклетки 1 типа (ТЫ) были защитные в животных моделях (см., например Кос11с, с! а1., 1. Iттиηо1. 166:4049 (2001); ΖΕυ, с! а1., 1. Ехр. Мса. 204:595 (2007)), тяжесть и частота возобновлений ВПГ-2 была обратной с частотой корреляции ВПГ-специфических Т-клеток и инфильтрация конкретных ЦТЛ-ВПГ-2 в генитальных поражениях коррелирует с клиренсом вируса (см., например, Кос11с с! а1., 1. ШссТ Όίκ. 169:956 (1994); Кос11с с! а1., 1. С1ш. ЫускР 110:537 (2002); Кос11с с! а1., 1. С1ш. ЫускР (1998), см. выше). Эти результаты согласуются с данными исследования субъеденици вакцины, в которых замешаны ТЫ СЭ4 и СЭ8 Т-клеточный ответов в слизистой оболочке ВПГ-2 залоз (см., например, Рокауаа с! а1., №ιΡ Мса. 4:381 (1998)). Кроме того, ВПГ-2-специфические СЭ8 Т-клетки были обнаружены в течении длительного периода на кожно- эпидермальных соединениях после анализа генитального герпеса (см., например, СайатапсЫ с! а1., С1ит Уассшс Iттиηо1. 15:1638 (2008)).
Антигены производные от цитомегаловируса (ЦМВ), которые рассмотрены для использования в некоторых вариантах осуществления, а именно в иммуногенных композициях и способах, описанные здесь, включают ЦМВ структурные белки, вирусные антигены, экспрессированные в ходе непосредственно раннего и начального этапах репликации вируса, гликопротеинов I и III, капсидного белка, белка оболочки, нижнюю матрицу белка рр65 (рриЬ83), р52 (рриЬ44), ЕЕ1 и Ш2 (ИЬ123 и иЬ122), белковые продукты из кластера генов от иЕ128-иЬ150 (Куктап, с! а1., 1. УиоР 2006 1ап;80(2):710-22), гликопротеины оболочки В (гВ), гН, τΝ и рр150. Как должно быть понятно специалисту в данной области, ЦМВ белки для использования в качестве иммуногенов, описанные здесь, могут быть определены в общедоступных базах данных, таких как СспВапк, §№155-Рто! и ТтЕМВЬ (см., например, Всппскоу с! а1., М!. 8ша1 1. Мса. 71 (2): 86-93 (2004); ЬостепаотГ с! а1., 1. Шстп. Мса. 267(5):483-501 (2010); МагксЕа11 с! а1., Ри!игс МютоЬюР 4:731-42 (2009)).
Антигены, производные от вирус Эпштейна - Барр (ВЭБ), которые рассматриваются для использования в некоторых вариантах осуществления включают ВЭБ литические белки §р350 и др1 10, ВЭБ белки, продуцируемые, во время латентного цикла инфекции, включая Эпштейн-Барр ядерного антигена (ЕВ^)-1, ΕВNА-2, ЕВ^-ЗА, ЕВт 3В, ЕВт - 3С, ЕВ^-лидер белка (ΕΗΝΑ-Ι.Ρ) и скрытые мембранные белки (ЬМР)-1, БМР-2А и БМР-2В (см., например, Ьосксу с! а1., РтопР ВюксР 13:5916-27 (2008)).
Антигены производным от респираторно-синцитиального вируса (РСВ), которые рассматриваются для использования, в качестве иммуногенов, как описано здесь, включают любую из одиннадцати белков, кодируемых геном РСВ, или его иммуногенным фрагментом: N81, N82, N (нуклеокапсидным белком), М (матрицей белка) 8Н, С и Р (вирусными белками оболочки), М2 (второй матрицей белка), М2-1 (фактором эллонгации), М2-2 (регуляции транскрипции), РИК-полимеразой и фосфоропротеидом Р.
Антигены производные от вируса везикулярного стоматита (ВВС), которые рассматриваются для использования, в качестве иммуногенов включают любой из пяти основных белков, кодируемых геном ВВС и его иммуногенные фрагменты: большой белок (Ь), гликопротеин (С), нуклеопротеиды (Щ, фосфоропротеид (Р) и матрица белка (М) (см., например, Кюаст с! а1., 1. [ШсгГсгоп Су!окшс Кск. (2009) (9):499-509; КоЬсйк с! а1., Аау. Уиик Кск. (1999) 53:301-19).
Антигены, производный от вируса гриппа, которые рассматриваются для использования в некоторых вариантах осуществления включают гемагглютинин (НА), нейраминидазы ЩА), Нуклеопротеиды (№), матричные белки М1 и М2, N81, N82 (№Р), РА, РВ1, РВ1-Р2, иРВ2 (см. например, №!итс 437 (7062):1162-66).
Примеры иммуногенов, которые являются вирусными антигенами также включают, но не ограничиваются, аденовирусным полипептидом, альфа-вирусным полипептидом, калицивирусным полипептидом (например, антиген капсида калицивируса), коронавируным полипептидом, темперавирусным полипептидом, полипептидом вируса Эбола, энтеровирусным полипептидом, флававирусным полипептидом, полипептидом вируса гепатита (АЕ) (гепатит В ядра или поверхностный антиген, вирус гепатита С или Е2 Е1 гликопротеинов, ядро или неструктурные белки), полипептидом герпеса (как описано здесь и в том числе гликопротеин вируса герпеса или вируса ветряной оспы), полипептидом вируса инфекционного перитонита, полипептидом вируса лейкемии, полипептидом вируса Марбург, ортомиксовирусным полипептидом, полипептидом вируса папилломы, полипептидом вируса парагриппа (например, полипеп- 15 027236 тиды гемагглютинина и нейраминидазы), парамиксовирусным полипептидом, парвовирусным полипептидом, пестивирусным полипептидом, полипептидом пикорна вируса (например, полипептид капсида полиовируса), полипептидом вируса оспы (например, полипептид вируса коровьей оспы), полипептидом вируса бешенства (например, гликопротеин О вируса бешенства), реовирусным полипептидом, ретровирусным полипептидом и ротавирусным полипептидом.
В некоторых вариантах бактериальные антигены могут быть выбраны как определенные антигены и бактериальные антигены, или их иммуногенные фрагменты или варианты, которые могут быть использованы как иммуноген. В некоторых вариантах бактериальный антиген, представляющий интереса, может быть секретируемым полипептидом. В других определенных вариантах осуществления бактериальные антигены, которые могут быть использованы как иммуногены для стимулирования иммунной реакции, включают антигены, которые имеют часть или части полипептида, выставленные на внешней клеточной поверхности бактерий. Части иммуногенов полипептид, выставленные на клеточной поверхности доступны для иммунных клеток и/или антител в хозяине, могут быть полезными для иммуногенов кодируемых рекомбинантными экспрессирующими векторами и включены в иммуногенную композицию, состоящую из иммуногена, (который может дополнительно включать адъювант) описанные в данном документе.
Антигены, получаемые из видов стафилококков, включая метициллин резистентный золотистый стафилококк (МСЗС), которые предусмотрены для использования в качестве иммуногенов включают в себя регуляторы вирулентности, такие как Адг система, Заг и 8ае, Аг1 система, 8аг гомология (Ко!, МдгА, 8аг8, ЗагК, 8агТ, ЗатИ, 8агУ, 8агХ, Зай и ТсаК), 8гг система и ТКАР. Другие белки З!арйу1ососси8, которые могут служить в качестве иммуногенов, включают С1р белки, НйА, М8гК, аконитазу, СсрА, ЗугА, Мза. СГуА и СЕВ (см., например, З!арйу1ососси8: Мо1еси1аг Оеиейсз, 2008 С.Ш51ег Асайетю Рге88, Ей. ЛоЙ1 Ьшй8ау). Геномов для двух видов золотистого стафилококка (N315 и Ми50) были упорядочены и доступны для широкой общественности, например на РАТК1С (РАТК1С: Тйе УВ1 Ра1йоЗу81ет8 Ке8оигсе 1и1едгайои СеШег, Зпуйег е! а1., №ю1ею Ас1й8 Ке8. (2007) 35: 401-406). Как будет понятно специалисту в данной области, белки З!арйу1ососси8 для использования в качестве иммуногенов также могут быть определены в других публичных базах данных, таких как ОепВапк, З\У188-РгоЕ и ТгЕМВЬ.
Антигены производные от З1тер!ососси8 рпеитотае, которые рассматриваются для использования, в качестве иммуногенов в некоторых вариантах, описанных здесь, включают в себя пневмолизин, Р8рА, клон-связанный белок А (СЬрА), NаηА, №-1пВ, ЗрпНЬ, РауА, йу1А, Рй!, и белок илин (КгдА; КгдВ; КгдС). Иммуногенные белки З!гер!ососси8 рпеитотае также известны в уровне техники и рассматриваются для использования в качестве иммуногена (см., например, 2у8к е! а1., 1пГес!. 1ттип. 2000 68(6):3740-43). Полная последовательность генома вирулентного штамма З1тер!ососси8 рпеитотае была секвенированна (см., например, Тейейп Н, е! а1., Заепсе (2001), 293(5529):498-506) и, как должно быть понятно специалистам белки З. рпеитотае использованные для композиций, описанных здесь, могут также быть определены в других публичных базах данных, таких ОепВапк, З\У188-Рго1, и ТгЕМВЬ. Белки, представляющие интерес для иммуногенов, описанных здесь, включают факторы вирулентности и прогнозированные белки могут подвергается воздействию на поверхности пневмококка (см., например, Тейейп е! а1., 8ирга; Рго1е! е! а1., ВМС МюгоЬюй (2010), йй 12;10:190; Юдйеп, е! а1., Сгй. Кеу. Вюсйет. Мо1. Вю1. (2003), 38(2):143-68; йейк^, МюгоЬюй Мо1. Вю1. Кеу. (2001), 65(2):187-207).
Примеры бактериальных антигенов, которые могут быть использованы как иммуногены, включают, но не ограничиваются, Асйпотусе8 полипептидами, ВасШи8 полипептидами, бактериальными полипептидами, Вогйе!е11а полипептидами, Вайоиейа полипептидами, Воггейа полипептидами (например, В. ЬигдйогГеп О8рА), Вгисе11а полипептидами, Сатру1оЬас!ег полипептидами, Сарпосу!орйада полипептидами, Сй1атуй1а полипептидами, СотупеЬасКгшт полипептидами, Сох1е11а полипептидами, ОегтаЮрйЕ 1и8 полипептидами, Еп1егососси8 полипептидами, ЕйтйсЫа полипептидами, Е8сйегюЫа полипептидами, Ρ^аис^8е11а полипептидами, Ри8оЬас!етшт полипептидами, НаетоЬайопейа полипептидами, НаеторйЛи8 полипептидами (см., Н. тЛиеп/ае типа Ь белки внешней мембраны), НейсоЬас!ет полипептидами, К1еЬ81е11а полипептидами, полипептидами Ь-форменных бактерий, Рер!о8р1га полипептидами, Ы8!ет1а полипептидами, МусоЬас!ег1а полипептидами, Мусор1а8та полипептидами, №188епа полипептидами, №опскей81а полипептидами, ШсагШа полипептидами, Ра8!еиге11а полипептидами, Рер!ососси8 полипептидами, Рер!о8йер!ососси8 полипептидами, Рпеитососси8 полипептидами (см., З. рпеитотае полипептид) (см. описанные здесь), Рго!еи8 полипептидами, Р8еийотоиа8 полипептидами, Кюкей81а полипептидами, Косйайтаеа полипептидами, За1топе11а полипептидами, ЗЫдейа полипептидами, З1арйу1ососси8 полипептидами, полипептидами стрептококка группы А (см., З. руодепе8 М белок), полипептидами стрептококкуса группы В (З. ада1асйае), Тгеропета полипептидами, и Уег8Йиа полипептидами (например, Υ. ре8Й8 Р1 и V антигены).
Примеры простейших грибковых антигенов, которые могут быть использованы как иммуногены включают, но не ограничиваются, АЬ81й1а полипептиды, Астетошит полипептиды, АИегпапа полипептиды, А8регдШи8 полипептиды, Ва81йюЬо1и8 полипептиды, В1ро1ат18 полипептиды, В1а8!отусе8 полипептиды, СапШйа полипептиды, Сосс1йю1йе8 полипептиды, СотйюЬо1и8 полипептиды, Сгур!ососси8 полипептиды, Ситуа1ат1а полипептиды, Ер^йе^торйу!ои полипептиды, ЕхорЫа1а полипептиды, Оеойтсйит
- 16 027236 полипептиды, НМоркжта полипептиды, Макиге11а полипептиды, Ма1акке/1а полипептиды, Мюгокрогит полипептиды, МопШека полипептиды, Могкегека полипептиды, Мисог полипептиды, РаесПотусек полипептиды, РетсШшт полипептиды, РШа1етотит полипептиды, РШа1оркога полипептиды, РгоЮШеса полипептиды, РкеикаПекскепа полипептиды, Ркеикотюгокоскшт полипептиды, РуШшт полипептиды, КктокропШит полипептиды, ΡΗί/орик полипептиды, §со1есоЬак1Шит полипептиды, 8рогоШп\ полипептиды, 81етркукит полипептиды, ТпскоркуЮп полипептиды, Тпскокрогоп полипептиды и Ху1окурка полипептиды.
Примеры антигенов простейших, которые могут быть использованы как иммуногены, включают, но не ограничиваются, ВаЬек1а полипептиды, ВакткШшп полипептиды, ВекпоШа полипептиды, СгурккропШит полипептиды, Еипепа полипептиды, ЕпсеркаШо/ооп полипептиды, ЕйатоеЬа полипептиды, С1агШа полипептиды, НаттоиШа полипептиды, НераЮ/ооп полипептиды, 1кокрога полипептиды, Ьекктата полипептиды, МюгокропШа полипептиды, Шокрога полипептиды, Шкета полипептиды, Реиΐаΐ^^скотоиак полипептиды, Р1актоШит полипептиды. Примеры антигенов гельминтных паразитов, которые могут быть использованы как иммуногены, включают, но не ограничиваются, АсапШоскеПопета полипептиды, Ае1игок1гопду1ик полипептиды, Апсу1окЮта полипептиды, Апдюк1гопду1ик полипептиды, Аксапк полипептиды, Вгид1а полипептиды, ВипокЮтит полипептиды, СарП1апа полипептиды, СкаЬегйа полипептиды, Соорепа полипептиды, Сгепокота полипептиды, Э|с1уосаи1ик полипептиды, ОюсЮркуте полипептиды, О1ре1а1опета полипептиды, О|рку11оЬо1кг1ит полипептиды, О1р1уШит полипептиды, ОкоГПапа полипептиды, ЭгасипсиШк полипептиды, ЕШегоЬшк полипептиды, РПагоШек полипептиды, Наетопскик полипептиды, ЬадоскПаксапк полипептиды, Ьоа полипептиды, Машо^ка полипептиды, Миекегшк полипептиды, ШпоркуеШк полипептиды, ШсаЮг полипептиды, ШтаШШгик полипептиды, ОекоркадокЮпшт полипептиды, Опскосегса полипептиды, ОркШогсШк полипептиды, Ок1ейад1а полипептиды, РагаГЛапа полипептиды, Рагадоттик полипептиды, Рагаксапк полипептиды, Ркука1ор1ега полипептиды, Рго1ок1гопду1ик полипептиды, 8е1апа полипептиды, §р1госегса полипептиды, 8риоте1га полипептиды, 81еркапоП1апа полипептиды, §ΐ^оиду1о^άек полипептиды, ШгопдуШк полипептиды, Тке1а/к1 полипептиды, То\аксапк полипептиды, Тохосага полипептиды, ТпскШека полипептиды, Тпскок1гопду1ик полипептиды, Тпскипк полипептиды, ипсшапа полипептиды, и ХУискегепа полипептиды (например, Р. Га1арагит циркумспоразоид (РГС8Р)), спорозоид поверхности белка 2 (РГ58Р2), карбоксильный конец антигена печени 1 (РГР8А1 с-1егт). экспортирующийся белок 1 (РГЕ\р-1), РпеитосукИк полипептиды, §агсосуккк полипептиды, 8с1ик1окота полипептиды, ТкеПепа полипептиды, То\ор1акта полипептиды и Тгурапокота полипептиды.
Примеры антигенов эктопаразитов включают, но не ограничиваются, полипептиды (включая защитные антигены, а также аллергены) от блох; клещей, включая жесткие клещи и мягкие клещи; мух, таких как мошки, комары, москиты, черные мухи, слепни, мухи рога, слепней, мух цеце, настоящих мух, мух вызывающих миазы и укусов комаров; муравьев; пауков, вшей; клещей; и клопов, например, постельные клопы и триатомиды.
Индукция иммунного ответа, включая гуморальный ответ (т.е. В-клеточный ответ) или клеточный ответ (включая цитотоксические Т-лимфоциты (ЦТЛ) ответ) или оба, может также способствовать фагоцитозу или уничтожению дополнительных организмов, таких как Ркеикотопак аегидтока, МусоЬасЮгтт ШЬегси1ок1к, М. Ьергае и Ык1епа тпосика ЦТЛ иммунный ответ способствует уничтожению Р. аегидтока, М. ШЬегси1ок1к, М. 1ергае и Ь. тпосик) (см., например, Оукктап е1 а1., Р Вютек. ВюЮскпок (2010: 249482); риЬкккек оп-Ппе Еипе 23, 2010). Соответственно, иммуногены предназначены для описанных здесь иммуногенных композиций, и они могут быть закодированными рекомбинантным вектором экспрессии и векторной частицей, которая включает векторы, также могут быть получены от этих бактерий. Аминокислотные последовательности многочисленных полипептидов, кодирующиеся бактериальным геномом любым из видов бактерий и выражений бактерий, могут быть легко идентифицированы специалистом в данной области и в общедоступных базах данных белковых последовательностей. (См., например, 8Юусг е1 а1., ШШге, 406:959 (2000)).
Иммуноген, раскрытый здесь, может быть получен из грибков или паразитов. Примеры паразитов, которые вызывают иммунный ответ, в том числе ЦТЛ иммунного ответа, включают §сШк1окота тапкот, ЕшатеоЬа к1кЮ1у11са, То\ор1акта допки, и Р1актоШит Га1арагит (см., например, Оукктап, см. выше). Таким образом, антигенный белок, выделенный или полученный из паразита, может быть полезным в качестве иммуногена для индукции иммунного ответа против соответствующего паразита, иммуногены также могут быть полученными от полученных грибов, в том числе без ограничений СгурЮсоссик пеоГогтапк и СапЛШа а1Ысапк (см, например, Оукктап, см. выше).
Полипептиды, которые включают по меньшей мере один иммуногенный фрагмент иммуногенного полипептида (например, любой связанный с опухолью антиген или микробный антиген, описанные здесь и/или в уровне техники) могут быть использованы в качестве иммуногенов кодируемых рекомбинантными векторами экспрессии, описанными здесь. Иммуногенный фрагмент состоит по меньшей мере из одного эпитопа Т-клеток или по меньшей мере одного эпитопа В-клеток. Иммуногенный фрагмент может состоять по меньшей мере из 6, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 или более идентичных аминокислот иммуногенного полипептида.
- 17 027236
Иммуногенный фрагмент может включать любое количество смежных аминокислот с вышеупомянутым иммуногенным полипептидом, таким образом, чтобы, например, иммуногенный фрагмент находится между около 6-10, 10-15, 15-20, 20-30, 30-40, 40-50, 50-60, 60-70, 70-80, 80-90, 90-100 или более смежных аминокислот иммуногенного полипептида. Иммуногенные фрагменты могут включать достаточное количество смежных аминокислот, которые образуют линейный эпитоп и/или может включать достаточное количество смежных аминокислот, которые позволяют сложить фрагмент в похожую (или достаточно аналогичную) трехмерную конформацию как полноразмерный полипептид, производный фрагмент представитель нелинейного эпитопа или эпитопов (именуемых в уровне техники как конформационные эпитопы). Количественный анализ оценки иммуногенного фрагмента изгиба в конформации сопоставимы для полнометражных полипептидов, включает, например, белок, способный реагировать с моно- и поликлональными антителами, которые являются специфическими для родной или разложенными на эпитопе, сохраняют другие лиганд-связующие функции и чувствительность или сопротивления полипептидного фрагмента для растворения протеаз (см., например, ЗатЬгоок е! а1., Мо1еси1аг С1отид: А ЬаЬота!огу Мапиа1, 3й ей., Со1й 8рйид НагЬог ЬаЬота!огу Ргезз, ΝΥ (2001)). Соответственно, в качестве примера трехмерной конформации фрагмента полипептида, достаточно схожего с полноразмерным полипептидом, при возможности связываться и уровня связывания антитела, который специфически связывается с полноразмерным полипептидом, является, по существу, аналогичным для фрагмента полноразмерного полипептида (т.е. был сохранен уровень связывания к статистически клинической, и/или биологической достаточной степени по сравнению с иммуногенным образцом или диким типом полноразмерного антигена).
Определенный, имеющий третичную структуру полипептид, или иммуногенный фрагмент, представляющий интерес, может осуществляться рутинной методологией для определения того, сохраняет ли иммуногенность фрагмент пространственного расположения аминокислот, которые содержатся в полнометражном полипептиде. См., например, Вгай1еу е! а1., Заепсе. 309:1868-71 (2005); §сйие1ег-Ригтаи е! а1., 8с1епсе, 310:638 (2005); Э1е1/ е! а1., Ргос. №й Асай. 8с1. И8А, 103:1244 (2006); Иойзои е! а1., №!ите, 450:176 (2007); Οίηη е! а1., №!ите, 450:259 (2007). Также доступны в уровне техники программные средства, например, РЗОКТ или РЗОКТ II, и Зрзсаи (^зсоизш Зециеисе Аиа1уз1з Раскаде, Сеиейсз Сотри!ег Сгоир), которые являются полезными для прогнозирования трансмембранных сегментов и мембраной топологии полипептидов, которые, как известно или как предполагается, проходят через клеточную мембрану (см., например, ΝΆιί е! а1., Тгеийз Вюсйет. §ск 24:34-36 (1999)).
Отдельно или в сочетании с методами, описанными выше, и с учетом примерной аминокислотной последовательности определенного антигена, представляющего интерес, специалист в данной области может определить потенциальные эпитопы антигена полипептида (см., например, 1ате8ои аий \Уо1Г, Сотри!. Арр1. Вюзск 4:181-86 (1988)). В качестве другого примера Хопп и Вудс Вудс описывают гидрофильный метод, который основан на эмпирической демонстрации тесной взаимосвязи между гидрофильностью полипептидных областей и их антигенностью (см., например, Норр, Рер!. Кез. 6:183-90 (1993); НоГтаии е! а1., Вютей. Вюсйип. Ас!а 46:855-66 (1987)). Компьютерные программы доступны также для выявления эпитопов В-клеток или Т-клеток. ВАЗ1С программа под названием ЕРГРЬОТ предсказывает антигенность сайтов в белке В-клеток от их основных структур путем расчета и профилей построения гибкости, гидрофильности и антигенности с помощью 13 различных масштабов (см., например, Меиеийе/ е! а1., Сотри!. Арр1. Вюзск 6:101-105 (1990)). См. также, например, Уаи РедешпоПек Ме!йойз: а сотраиюи !о Ме!йойз т Еи/ушо^ду, 9: 465-472 (1996); РеПециег е! а1., Ерйоре ртейюйоиз Ггот !йе рптагу зйис!иге оГ рго!ешз, 1и Рерййе аийдеиз: а ртасйса1 арргоасй (ей. С.В. ^1зйот), р. 7-25; ОхГогй Итуетзйу Ргезз, ОхГогй (1994); Уаи РедешпоПек Мо1еси1аг Фззесйои оГ рто!еш аийдеиз 1и §!гис!иге оГ аийдеиз (ей. М.Н.У. Уаи Редеиц-юНеЦ Уо1. 1, р. 1-27. СКС Ргезз, Воса Ка!ои (1992).
Т-клеточный эпитоп определенного антигена, который используется, как иммуноген также может быть определенным с использованием программ поиска пептидных мотивов на основе алгоритмов, разработанных Каттеизее, е! а1. (1ттииодеиейсз 50: 213-219 (1999)); Рагкег, е! а1. (см. выше), или с использованием методов раскрытых ИоуКйшоуа и Е1о\уег в 1ттиио1. Се11 Вю1. 80(3):270-9 (2002); В1у!йе е! а1., ВюшГогтайсз 18:434-439 (2002); Сиаи е! а1., Аррйей ВюшГогтайсз 2:63-66 (2003); Е1о\уег е! а1., Аррйей ВюшГогтайсз 1:167-176 (2002); Ма1йоз, ВюшГогтайсз 17: 942-48 (2001); 8сй1г1е е! а1., I. 1ттиио1. Ме!й. 257:1-16 (2001).
Области эпитопа определенных микробных антигенов или определенных опухолевых антигенов, которые могут быть использованы в качестве иммуногенов в композициях и способах, описанных здесь, также описаны в уровне техники. См., например, ЬатЬ е! а1., Кеу. 1иГес!. Э|з. Маг - Арг: §ирр1 2:з443-447 (1989); ЬатЬ е! а1., ЕМВО I. 6:1245-49 (1987); ЬатЬ е! а1., Ьерг. Кеу. 8ирр1 2:131-37 (1986); Мейга е! а1., Ргос. Ν;·ιΐ1. Асай. §ск И8А, 83:7013-27 (1986); НогзГа11 е! а1., 1ттиио1. Тойау 12:211-13 (1991); Ко!йЬагй е! а1., Сигг. Тор. МютоЬюк 1ттиио1. 155:143-52 (1990); §тдй е! а1., ВюшГогтайсз 17:1236-37 (2001); ЭеСгоо! е! а1., Уассте 19:4385-95 (2001); ИейаНа е! а1., I. 1ттиио1. 163:1725-29 (1999); Сосй1оушз е! а1., I. 1ттиио1. 165:4731- 41 (2000); Соизодио е! а1., В1оой 101:1039-44 (2003); КоЬейз е! а1., ΛΙΌδ Кез. Нит. Кейоуи. 12:593-610 (1996); Куок е! а1., Тгеийз 1ттиио1. 22:583-88 (2001); №уак е! а1., I. 1ттиио1. 166:6665-70 (2001).
- 18 027236
Дополнительные методы для выявления областей эпитопов включают в себя способы, описанные в
НоГГтеМег е1 а1., МеГйобк 29:270-281 (2003); Маескег е1 а1., 1. 1ттипо1. МеГйобк 255:27-40 (2001). Анализы для выявления эпитопов описаны и хорошо известны квалифицированным специалистам и включают, например, описанные распространенные правила в иммунологии, см., Сойдап е1 а1. (Ебк), 1о1т \УПеу &
8оп5, \ем Уогк, ΝΥ (1991).
Определение иммуногенной области и/или эпитопа определенного антигена, представляющего интерес, можно также легко определить эмпирическими методами известными специалистам в уровне техники и/или компьютерными анализами и компьютерным моделированием, с использованием методов и приемов, которые регулярно практикуются специалистами в данной области. Эмпирические методы включают, в качестве, например, синтез фрагмента полипептида, содержащий определенной длины смежные аминокислоты белков, или генерации фрагментов путем использования одного или нескольких протеаз и затем определение иммуногенности фрагментов с помощью одного из многочисленных анализов связывания или методов иммуноферментного анализа регулярно использующихся в данной области. Примером способа для определения антител (их поликлональных, моноклональных или антигенсвязывающихся фрагментов) специфически связывающихся с фрагментом включает, но не ограничивается, ЕЫ8А, радиоиммунологический анализ, иммуноблотинг, анализ конкурентного связывания, анализ сортировки активированных флуоресцированием клеток (РАС8) и поверхностного плазменного резонанса.
Последовательности эпитопов Т-клеток и В-клеток могут быть получены из общественных баз данных. Например, пептидную базу данных, которая включает Т-клетки определенных опухолевых антигенов можно найти в Интернете в базе данных пептидов, организованной организации Иммунитет рака (см. сапсепттипПу(ООТ)огд/рерПбеба1аЬа5е/Тсе11ерПоре5.1ит). которая периодически обновляется. Другая имеющаяся база данных, при поддержке Национального института аллергии и инфекционных заболеваний, предоставляет инструменты для поиска эпитопов В-клеток и Т-клеток и обеспечивает инструменты анализа эпитопов (см., 1ттипе Ерборе Эа1аЬа5е и Апа1у818 Кекоигсе а1 пптипоерПоре(бо1)огд).
В некоторых случаях, когда антиген-специфические Т-клеточные линии или клоны, доступны, например опухоль лимфоциты (Т1Ь), вирусные или бактериальные цитотоксические Т-лимфоциты (СТЬ), эти клетки могут использоваться в качестве скрининга на наличие соответствующих эпитопов, используя приготовленные специфические антигенные клетки-мишени. Такие мишени могут быть подготовлены с использованием случайных или выбранных синтетических пептидных библиотек, которые будут использоваться для лизиса ЦТЛ клеток-мишеней. Другой подход к идентификации соответствующих эпитопов Т-клеточных линий или их доступных клонов заключается в использовании меток рекомбинантных ДНК. Гены или кДНК библиотеки с ЦТЛ-восприимчивыми метками сначала подготавливаются и трансфицируются в нечувствительных клетках-мишенях. Это позволяет идентифицировать и клонировать гены, кодирующие белки предшественники пептида, содержащего эпитоп ЦТЛ. Второй шаг в этом процессе необходим для подготовки усеченного гена от соответствующего клонированного гена, для того, чтобы сузить область, которая кодирует по меньшей мере один эпитоп ЦТЛ. Этот шаг является необязательным, если ген не является слишком большим. Третий шаг заключается в подготовке синтетических пептидов, к примеру, примерно 10-20 аминокислотных остатков, перекрытие 5-10 остатков, которые используются для информативных целей показателей ЦТЛ. Когда пептид или пептиды, как показано, содержали соответствующие эпитопы, и при желании, меньшие пептиды могут быть приготовлены для определения минимального размера пептида, содержащего эпитоп. Эти эпитопы, как правило, но не обязательно, содержат 9-10 остатков для эпитопов ЦТЛ и до 20 или 30 остатков для хелперных Т-лимфоцитов (ХТЛ) эпитопов.
Кроме того, эпитопы могут быть определенными прямой элюцией пептидов, которые нековалентно специфически связанные с молекулой главного комплекса гистосовместимости (МНС), с последующим секвенированием аминокислотных элюированных пептидов (см., например, ЕпдеШагб е1 а1., Сапсег 1. 2000 Мау;6 §ирр1 3:δ272-80). Кратко, элюированные пептиды отделены с помощью метода очистки, такого как НРЬС, и отдельные фракции тестировали на их способности повышать чувствительность целевых показателей для ЦТЛ, лизиса или индукции пролиферации цитокинов НТЬ. Когда доля была обнаружена в качестве содержащего пептида, она дополнительно очищалась и предавалась анализу последовательности. Пептидная последовательность также может определяться с помощью тандемной массспектрометрии. Синтетические пептиды затем подготавливались и тестировались с ЦТЛ или НТЬ, чтобы подтвердить, что последовательности и пептиды были определены правильно.
Эпитопы могут быть также определены с использованием компьютерного анализа, такого как программа Ткбек (см., например, КоГйЬагб апб Тау1ог, ЕМВО 1. 7:93-100, 1988; Эеау|п е1 а1., Мо1. 1ттипо1. 33:145-155, 1996), которая ищет пептидные мотивы, которые имеют потенциал для получения Т1 ответов на СТЬ пептиды с мотивами для связывания мышиных и человеческих МНС класса I или класса II могут быть определены в соответствии с В1МА8 (Рагкег е1 а1., 1. 1ттипо1. 152:163, 1994) и другие прогнозирующие анализы связывания пептида с НЬА. Кратко, белковые последовательности, например, из микробных компонентов или антигенов, или компонентов клеток опухоли или опухолевые антигены, проверяются на наличие МНС-связывающих мотивов. Эти связывающие мотивы, которые существуют для
- 19 027236 каждого МНС аллеля, являются консервативными аминокислотными остатками, как правило, в позициях 2 (или 3) и 9 (или 10) для МНС класса I связанных пептидов, которые, как правило, состоят из 9-10 остатков. Затем получают синтетические пептиды, которые содержат такие последовательности с учетом МНС связанных мотивов, и впоследствии такие пептиды проверяются на их способность связаться с молекулой МНС. Анализ МНС связанного ответа может осуществляться либо с использованием клеток, которые экспрессируют большое количество пустых (незанятых) молекул МНС (клеточный анализ связывания), или с использованием очищенной молекулы МНС. И, наконец, МНС связанные пептиды затем проверяются на их способность стимулировать ЦТЛ ответ у исходных лиц ίη νίνο, используя лимфоциты человека, либо в естественных условиях, с использованием НЬА-трансгенных животных. ЦТЛ тестируются с помощью пептид-сенсибилизированных клеток-мишеней, а также целей, которые естественным образом обрабатывают антиген, таких как вирусные инфицированные клетки или опухолевых клетки. Для дальнейшего подтверждения иммуногенности, пептид может тестироваться с использованием НЬА А2 модели трансгенных мышей и/или любого множества анализов ίη νίίτο стимуляции.
В некоторых вариантах иммуноген включает полипептид определенного вида антигена, который имеет одну или более аминокислотных замен, вставок или делеций в аминокислотной последовательности, которая известна и доступна в уровне техники для соответствующих иммуногенов. Консервативная(ые) замена аминокислот хорошо известна и может происходить естественно в полипептиде или может быть введенной, когда полипептид сконструирован методом рекомбинантного производства. Аминокислотные замены, делеции и вставки могут быть введены в полипептид, с помощью хорошо известных и вошедших в практику методов мутагенеза (см., например, ЗатЬгоок с1 а1. Мо1еси1аг С1отпд: А ЬаЬогаЮгу Мапиа1, 3гб еб., Со1б Зртшд НагЬог БаЬогаЮгу Рте88, ΝΥ 2001)). Олигонуклеотид-направленный на конкретные участки (или конкретные сегменты) мутагенез может быть использован для обеспечения измененного полинуклеотида, который имеет определенные кодоны, измененные согласно заменам, делециям или вставкам. Делетированные или усеченные варианты определенных антигенов, которые могут быть использованы как иммуногены, также могут быть сконструированными с помощью удобного сайта рестрикции, прилегающего к желаемому месту удаления. После ограничения выступы могут быть заполнены и повторно легированы ДНК. Кроме того, методы случайного мутагенеза, такого как аланин сканирующий мутагенез, мутагенез подверженный ошибкам и олигонуклеотид-направленный мутагенез может использоваться для подготовки иммуногенных полипептидных вариантов (см., например, ЗатЬгоок е1 а1., см. выше). Виды (или варианты) из определенного антигена (или его полипептидного фрагмента) включают иммуногенный полипептид, который имеет по меньшей мере 85, 90, 95 или 99% идентичность к аминокислотным последовательностям любой образцовой аминокислотной последовательности, известной в уровне техники.
Эти варианты иммуногенных полипептидов сохраняют биологическую активность или функции соответствующих определенных антигенов. В частности, иммуногены, которые являются вариантами определенного антигена, статистически, клинически, или биологически значимыми образами, сохраняют способность индуцировать иммунную реакцию (например, гуморальный ответ (т.е. В-клеточный ответ), клеточный ответ (т.е. Т-клеточный ответ (включая ответы цитотоксических Т-лимфоцитов)), или гуморальный и клеточный ответ у субъекта. Учитывая множество молекулярно-биологических способов и методов, экспрессии белка и его выделение, регулярно использующиеся в уровне техники для внедрения мутаций в полипептид, подготовки полипептидных фрагментов, изоляции фрагментов и вариантов, а также анализа иммуногенных полипептидных вариантов и фрагментов, имеющих желаемую биологическую активность, можно сделать легко и без ненужных экспериментов.
Различные критерии, известные специалистам в данной области техники, чтобы указать, является ли аминокислота, которая замещена в определенном положении в консервативном (или аналогичном) пептиде или полипептиде. Например, аналогичные аминокислотные или консервативные аминокислотные замены, при каких, аминокислотный остаток, замененный на аминокислотный остаток, имеющий сходную боковую цепь. Похожие аминокислоты могут быть включены в следующие категории: аминокислоты с основными боковыми цепями (например, лизин, аргинин, гистидин); аминокислоты с кислыми боковыми цепями (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота); аминокислоты с незаряженными полярными боковыми цепями (например, глицин, аспарагин, глютамин, серин, треонин, тирозин, аспарагин, гистидина); аминокислоты с неполярными боковыми цепями (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан); аминокислоты с разветвленными бетабоковыми цепями (например, треонин, валин и изолейцин) и аминокислоты с ароматическими боковыми цепями (например, тирозин, фенилаланин, триптофан). Пролин, который считается более трудно классифицированым, разделяет свойства аминокислот, которые имеют алифатические боковые цепи (например, лейцин, валин, изолейцин и аланин). При определенных обстоятельствах замена глутамина, глутаминовой кислоты или аспарагина аспарагиновой кислотой может быть рассмотрена аналогичная замена в глутамине и аспарагине амидной производной, глутаминовой кислотой и аспарагиновой кислотой соответственно. Как известно в уровне техники, сходство между двумя полипептидами определяется путем сравнения аминокислотных последовательностей и консервативных аминокислотных замен полипептида с последовательностью второго полипептида (например, ΟΕΝΕ^ΟΡΚδ, АЛдп, ВЬАЗТ метод или други- 20 027236 ми методами, описанными здесь и практикующимися в данной области).
Как описано здесь, анализы для иммуногенных фрагментов, для оценки соответствующих конформационных вариантов, сопоставимые с невариантными полипептидами или их фрагментами включают, например, белок, специфично реагирующий с моно- и поликлональными антителами, которые являются специфическими для нативного или развернутого эпитопа, сохраняющего лиганд-связывающие функции и чувствительность или устойчивость мутантного белка переваривания протеаз (см. §атЬгоок е! а1. выше). Такие варианты могут быть идентифицированными, характеризированными или в соответствии с методами, описанными здесь, или методами, известными в уровне техники, которые регулярно практикуются специалистами в данной области.
Изолированный/рекомбинантный иммуноген, включенный в иммуногенные композиции, описанные здесь, может быть полученным, и получен в соответствии с различными способами и способами, которые обычно практикуются в области молекулярной и/или известных в данной области методами очистки. Конструирование экспрессирующего вектора, который используется для рекомбинантного получения иммуногена, представляющего интерес, осуществляется с использованием любым из многочисленных в молекулярной биологии инженерных методов, известных в данной области, включая, без ограничений, стандартные методы расщепления рестрикционных эндонуклеаз, лигирования, трансформирования, плазмидной трансформации и секвенирования ДНК, например, как описано в §атЬгоок е! а1. (1989 апб 2001 ебШопк; Мо1еси1аг С1отпд: А ЬаЬога!огу Мапиа1, Со1б 8ргшд НагЬог ЬаЬогаФгу Рге88, ΝΥ) и Аи8иЬе1 е! а1. (Сиггеп! Рго!осок т Мо1еси1аг Вю1оду (2003)). Чтобы получить эффективную транскрипцию, трансляцию, полинуклеотидной последовательности в каждой рекомбинантной экспрессирующей конструкции, включена по меньшей мере одна соответствующая последовательность, управляющая экспрессией (также называется регулировательной последовательностью), такие как лидерные последовательности и особенно промоторы, функционально связанные с нуклеотидной последовательностью, которая кодирует иммуноген.
Клетка-хозяин, сконструирована с помощью генной инженерии с рекомбинантным вектором экспрессии, продуцирующим иммуноген(ы), или их фрагменты или варианты, получены с помощью рекомбинантных методик. Каждый из этих пептидов и слитых пептидов, описанных здесь, могут быть экспрессированы в клетках млекопитающих, дрожжах, бактериях, насекомых или других клетках под контролем соответствующего промотора. Бесклеточные системы трансляции могут также быть использованы для производства таких белков РНК, полученных из ДНК конструкций. Соответствующие векторы клонирования и экспрессии для использования в прокариотических и эукариотических хозяевах описаны, например, 8атЬгоок е! а1., Мо1еси1аг С1отпд: А ЬаЬога!огу Мапиа1, ТЫгб Ебйоп, Со1б 8ргшд НагЬог, №\\ Уогк (2001).
Как правило, рекомбинантные векторы экспрессии пригодны для производства иммуногенов, представляющих интерес, включающие в себя начало репликации, селективные маркеры, позволяющие преобразование клетки-хозяина, например ген резистентности к ампициллину из Е. сой и 8. Сегеуыае, ТРР1 ген и промотор, полученный от сильно экспрессирующего гена для прямой транскрипции, последовательность которого приведена. Промоторы, могут быть полученными от оперонов кодирующих гликолитические ферменты, такие как 3-фосфоглицерат киназы (ФГК), α-фактор, кислоты или белки теплового шока, среди других. Гетерологичные структурные последовательности собраны в соответствующей фазе инициации и терминации последовательности.
Дополнительно, гетерогенные последовательности могут быть вставлены в рамку считывания с нуклеотидной последовательностью, которая кодирует иммуноген, чтобы обеспечить пептид или полипептид, который предает желательные характеристики, например, упрощает очистку экспрессированного рекомбинантного продукта. Такие пептиды включают в себя идентификацию полигистидиновой метки (его метки) или РЬАО® метки-эпитопа (ΌΥΚΌΌΌΌΚ, 8ЕЦ ГО N0:35), бета-галактозидазы, щелочной фосфотазы, О8Т, или ХРКЕ88™ метки-эпитопа (ΌΕΥΌΌΌΌΚ, 8ЕЦ ГО N0:41; 1пуйгодеп Ы1с ТесЬпо1оДех СагЦЬаб, СА) и похожиях похожих к ним (см., например, и.8. Ра1еп1 №. 5011912; Норр е! а1., (В|о/ТесЬпо1оду 6:1204 (1988)). Сходные последовательности могут быть встроенными в векторы, такие как, например, гексагистидиновые метки, представленные в ρΒΛΌ/Ηίδ (ЧпуПгодеп). Кроме того, сходные последовательности могут быть либо синтетическими, либо встроенными в праймеры, используемые для рекомбинантного конструирования нуклеотида, кодирующего последовательность (например, с использованием ПЦР).
Клетка-хозяин, содержит рекомбинантный вектор экспрессии, может быть генетически сконструированной (трансдуцированной, трансформированной, или трансфицированной), с экспрессирующей конструкцией (например, вектор клонирования, шатл-вектор, или экспрессионный вектор) или конструкты могут быть в форме плазмиды, вирусной частицы, фага и т.д. Созданные клетки-хозяева может культивироваться в обычных питательных средах, модифицированных соответствующим образом для активации промоторов, отбора трансформантов или амплификации кодирующих нуклеотидных последовательностей. Предпочтительно клетка-хозяин может быть адаптирована к устойчивости распространения в культуре с получением клеточной линии в соответствии с установленными методами получения поли- 21 027236 пептидов. В некоторых вариантах клеточные линии являются бессмертными клеточными линиями, которые относятся к клеточным линиям, которые могут быть неоднократно (по меньшей мере десять раз, оставаясь жизнеспособными) пассированными в культуре, после лог-фазы роста.
Полезные бактерии, экспрессирующие конструкт, изготовлены путем вставки в вектор экспрессии структурной последовательности ДНК, кодирующей иммуноген вместе с подходящими инициаторами транскрипции и сигнала терминации в рабочей фазе с функциональным промотором. Конструкт может включать один или больше фенотипически селективных маркеров и начало репликации для обеспечения, поддержания векторной конструкции, и желательно обеспечивают усиление в пределах клетки. Подходящие прокариотические хозяева для трансформации включает Е. сой, ВасШик киЬййк, 8а1топе11а (урйФшпит и различные виды в пределах родов Ркеиботопак, 8!тер!отусек и §!арйу1ососсик, хотя другие также могут быть использованными в выборе. Любые другие плазмиды или векторы могут быть использованными, если они являются воспроизводимыми и жизнеспособными в клетке-хозяине. Так, например, последовательности нуклеотидов, кодирующие иммуноген или определенный антиген, представляющий интерес, могут быть включены в любую из различных рекомбинантных конструкций, создаваемых для экспрессии полипептида. Такие векторы и конструкции включают хромосомные, нехромосомные и синтетические последовательности ДНК, например бактериальные плазмиды; фаговые ДНК; бакуловирусы; дрожжевые плазмиды; векторы, производные от комбинации плазмидов и фагов ДНК; вирусов ДНК, например вирус коровьей оспы, аденовирусы, вирус оспы домашней птицы и вирус псевдобешенства. Однако любой вектор может использоваться для приготовления рекомбинантных конструкций до тех пор, пока он воспроизводимый и жизнеспособный в хозяине.
Соответствующие последовательности ДНК могут быть встроены в вектор различными способами. В общем, последовательности ДНК вставляются в соответствующие сайты репликации способами, известными в данной области. Стандартные методы клонирования, изоляции ДНК, усиления и очистки для ферментативных реакций с участием ДНК лигаз, ДНК-полимераз, эндонуклеаз рестрикции и т.п., а также различные способы разделения являются известными и широко применяются специалистами в данной области. Многочисленные стандартные методы описаны, например, в АикиЬе1 е! а1. (Ситгеп! Рго!осо1к ίη Мо1еси1аг Вю1оду (Огеепе РиЬ1. Аккос. 1пс. & 1ойп \УПеу & §опк, 1пс., 2003)); ЗатЬгоок е! а1. (Мо1еси1аг С1отпд: А йаЬогаЮгу Мапиа1, 3гб Еб., (Со1б 8ргтд НагЬог ЬаЬогаФгу 2001)); Машайк е! а1. (Мо1еси1аг С1отпд, (Со1б 8ргтд НагЬог ЙаЬогаЮгу 1982)) и в других местах.
Последовательность ДНК, кодирующая иммуногенный полипептид в векторе экспрессии, функционально связана по меньшей мере с одной соответствующей контролирующей последовательностью, (например, промотором или регулируемым промотором) для прямого синтеза мРНК. Характерными примерами таких последовательностей, контролирующих экспрессию ЬТР или §У40 промотора, Е. сой 1ас или !гр, белока, фага лямбда РЬ, и других промоторов известных для контроля экспрессии генов в прокариотических или эукариотических клетках или их вирусах. Промоторные области могут быть выбранными из любого желаемого гена с использованием САТ (хлорамфеникол трансферазы) векторы или другие векторы с селективными маркерами. Особые бактериальные промоторы включают 1аб, ΕκΖ, Т3, Т5, Т7, др!, лямбда РР, РЬ и 1гр. Эукариотические промоторы включают СМУ немедленные и ранние, Н8У тимидинкиназы, ранние и поздние 8У40, ЬТРк с ретровирусами, и мишинный металлотионин-1. Выбор соответствующего вектора, промотора и препаратов полученных некоторыми экспрессионными конструктами включают по меньшей мере один промотор или регулированный промотор, функционально связанный с нуклеотидной последовательностью, которая кодирует по меньшей мере один иммуноген, находящийся в пределах обычных знаний данного уровня техники.
Конструкция и выбор индуцибельного, регулированного промотора, регулируемого и/или жестко регулируемого промотора известна в уровне техники и будет зависеть от конкретной клетки-хозяина и их свободной экспрессирующей системы (см., например, Е.сой оперон арабинозы (РЬаб ог Рага), как описано в Ои/тап е! а1., 1. Вас!етю1оду 177:4121-30 (1995); §тйй е! а1., 1. Вю1. Сйет. 253:6931-33 (1978); Н1гкй е! а1., Се11 11:545-50 (1977); РЕТ экспрессирующая система (см. патент на изобретение под № υ.δ. 4.952,496) доступный с 8!та!адепе (Ьа 1о11а, СА); !е!-регулированные экспрессионные системы (Ооккеп е! а1., Ргос. ЫаИ. Асаб. δοί. И8А, 89:5547-51 (1992); Ооккеп е! а1., 8с1епсе 268:1766-69 (1995)); рЬР-ТРЕ2 акцепторный вектор (ΒΌ Вюкиепсек С1оп!есй, Ра1о А1!о, СА) предназначен для использования с ΕΈΟΝТЕСН'к Сгеа!ог™ С1отпд Кйк); см., например, 8аиет, Ме!йобк 14:381-92 (1998); РитТО, ί. Матт. О1апб Вю1. №ор1ак. 2:373 (1997)); см., напрмиер, Саксю, АгйЕ. Огдапк 25:529 (2001)).
Иммуноген, кодирующий последовательность нуклеиновой кислоты, может клонироваться в бакуловирусном векторе, который затем рекомбинируют с бакуловирусами для создания рекомбинантных бакуловирусных экспрессирующих конструкций, которые используется для заражения, например, δί9 клетки-хозяина (см., например, ВасШоуиик Ехртеккюп Рго!осо1к, Ме!йобк ш Мо1еси1аг Вю1оду, Уо1. 39, Рюйатбкоп, Еб. (Нитап Ргекк 1995); Рттса-^оттк, Ехртеккюп оЕ РгоЮигк ш 1пкес! Се11к Икшд Васи1оу1та1 Уес!огк, 8ес!юп II, Сйар!ег 16 ш §йой Рго!осо1к ш Мо1еси1аг Вю1оду, 2пб Еб., АикиЬе1 е! а1., ебк., (1ойп \Убеу & 8опк 1992)).
Методы, которые могут быть использованы для изоляции и очистки рекомбинантных иммуногенов, например, могут включать получение супернатантов из подходящего хозяина/векторной системы, кото- 22 027236 рые секвенируют рекомбинантный иммуноген в культуральную среду с последующей концентрацией культуральной среды с использованием коммерчески доступного фильтра. После концентрации концентрат может применяться к одной подходящей матричной очистке или серии матричных очисток, таких как матрицы сродства или рекомбинантные полипептиды. Эти способы очистки, также могут быть использованы при выделении иммуногенов, антигенов или определения из природной среды пептидов.
Методы для крупномасштабного производства одного или нескольких изолированных рекомбинантных иммуногенов, описанных здесь, включают партии клеточных культур, которые контролируются и управляются для поддержания в соответствующих культурах. Очистка иммуногена может выполняться согласно способам, описанным здесь и известным в уровне техники, которые согласуются с законами и руководящими принципами отечественных и зарубежных регулирующих органов.
Адъюванты и адъювантные композиции.
Как описано здесь, иммуногенные композиции дополнительно могут включать по меньшей мере один адъювант, который предназначен для повышения (или улучшения, расширения) иммунного ответа для иммуногена и его соответствующего определенного антигена (т.е. увеличивается уровень специфического иммунного ответа на иммуноген и определенного антигена в статистически, биологически или клинически значительным образом по сравнению с уровнем конкретных иммунных ответов при отсутствии введения адъюванта). В некоторых вариантах иммуногенная композиция включает по меньшей мере один иммуноген, который может быть изолирован рекомбинантно, и/или по меньшей мере один адъювант.
В других определенных вариантах осуществления иммуногенная композиция, состоящая из рекомбинантного экспрессирующего вектора, который кодирует по меньшей мере один иммуноген и способен управлять экспрессией иммуногена, дополнительно включает вспомогательное средство. В других определенных вариантах осуществления иммуногенная композиция, которая включает в себя по меньшей мере один иммуноген и иммуногенные композиции, состоящие из рекомбинантных экспрессирующих векторов, дополнительно содержите адъювант. В еще других вариантах осуществления вместо объединения адъюванта с иммуногенной композицией, содержащей рекомбинантный вектор экспрессии или введение адъюванта одновременно с этой иммуногенной композицией, адъюванта в более позднее время и может быть введенным другим путем и/или другими, чем иммуногенная композиция, состоящая из вектора. Когда адъювант после введения иммуногенной композиции, состоящей из рекомбинантного вектора экспрессии и адъювант, осуществляется в 18, 24, 36, 72 ч или 1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7 дней (1 неделя) после приема иммуногенной композиции. Способы и методы для определения уровня иммунного ответа обсуждаются более подробно ниже и обычно практикуются в данной области.
Примеры адъювантов, которые могут быть включены в иммуногенную композицию, используются, в методах, описанных здесь, но не обязательно ограничиваются ими. Адъюванты, которые могут быть использованы в этих методах, включают адъюванты, полезные для повышения гуморального иммунного ответа, клеточного ответа или гуморального и клеточного ответа одновременно, специфический для иммуногена(ов) и соответствующего определенного антигена(ов). Клеточный иммунный ответ состоит из СБ4 Т-клеточного ответа (который может включать в себя память СБ4 Т-клеточного ответа) и СБ8 Т-клеточный ответ для иммуногена и его соответствующего определенного антигена. Клеточный ответ может также включать цитотоксический Т-клеточный ответ (ответ ЦТЛ) на иммуноген (или клетку, или частицу, или иммуноген(ы) экспрессии). Желаемый адъювант дополняет ответ на иммуноген, не вызывая конформационные изменения в иммуногене, что может отрицательно сказаться на качестве формы ответа. Подходящие адъюванты включают соли алюминия, такие как квасцы (калий-алюминий-сульфат), или другие включающие алюминий адъюванты; нетоксичные липиды, А-связанные адъюванты, такие как способы без ограничения, например, нетоксичный монофосфорил липид А (см., например, Тота1 е! а1., I. Бю1. Кекропке Мой. 6:99-107 (1987); Реткшд е! а1., Тгепйк М1сгоЬю1. 10:832-837 (2002)); ОЬА описанных здесь; 3 де-О-ацилат монофосфорил липид А (МРЬ) (см., например, Ит!ей Кшдйот Ра!еп! АррЬсаЬоп №. ОБ 2220211); адъювант, такой как 0821 и 0ш1А который содержит тритерпеновые гликозиды или сапониновые изоляты с коры дерева Ош11а)а каропапа МоЬпа, растущего в Южной Америке (см., например, КепкП е! а1., ш Vасс^ηе Бек^п: ТЬе 8иЬиш! апй Ай)иуап1 АрргоасЬ (ейк. Роуе11 апй №утап, Р1епит Ргекк, ΝΥ, 1995); и.8. Ра!еп! №. 5057540). Другие подходящие адъюванты включают эмульсии масло-вводе (например, сквален или арахисовое масло), при необходимости в сочетании с иммунными стимуляторами, такими как монофосфатные липиды (см., например, 8!ои!е е! а1., Ν. Επ^Ι I. Мей. 336, 86-91 (1997)). Еще один подходящий адъювант-СрО (см., например, КПптап, 1п!. Кеу. 1ттипо1. 25(3-4):135-54 (2006); и.8. Ра!еп! №. 7402572; Ειπ^^η]·! Ра!еп! №. 772619).
Как описано здесь, подходящими адъювантами являются соли алюминия, например гидроксид алюминия, фосфат алюминия или сульфат алюминия. Такие адъюванты могут использоваться с или без других конкретных иммуностимулированных агентов, таких как МРЬ или 3-ЭМР, 0821, полимерных или мономерных аминокислот, например полиглутаминовой или полилизиновой кислоты. Другой класс подходящих адъювантов является эмульсией масло-в-воде (также называемой здесь стабильной эмульсией масло-в-воде). Такие адъюванты могут использоваться при необходимости с другими конкретными иммуностимулирующими агентами, такими как мерамилпептид (например, Ν-ацетилмурамин-Ь- 23 027236 треонил-О-изоглутамин (1йг-МОР), Ν-ацетилнормурамин-Ь-аланин-Э-изоглутамин (пог-МОР), М-ацетилмурамин-Ь-аланин-О-изоглутамин-Ь-аланин-2-(1'-2'-дипальмитоил-8п-глицеро-3гидроксифофорилокси)этиламин (МТР-РЕ), М-ацетилглуксаминил-М-ацетилмурамин-Е-А1-О-изоглю-ЬА1а-дипальмитоксипропиламид (ЭТР-ЭРР) ТЬегатбе™), или другими компонентами бактериальной клеточной стенки. Типы масло-в-воде включают (1) МР59 (νθ 90/14837), содержащая 5% δ^иа1еηе, 0,5% Т\\ееп 80 и 0,5% δρап 85 (необязательно содержащая различные количества МТР-РЕ), сформулированная в виде субмикронных частиц с использованием микрофлюидозатора, такого как модель 110Υ, микрофлюидизатора (Мюгойшбюз, №\\1оп Ма88.); (2) δАΡ, содержащий 10% δ^иа1аηе, 0,4% Т\\ееп 80, 5% плуроник-блокированный полимер Ь121 и (Нг-МЭР либо другие микрофлюидизаторы в субмикронной эмульсии или встряхиваемые для получения эмульсии с частицами большого размера, и (3) КгЫ адъювантная система (ΚΛδ) (Κώί 1ттипосНет, Нашгйоп, МТ), содержащая 2% 8циа1епе, 0,2% Т\\ееп 80 и один или больше компонентов клеточной стенки, выбранный из группы, состоящей из монофосфориллипида А (МРЬ), димиколата трегалозы (ТОМ), и каркаса клеточной стенки (ί'.'\νδ). предпочтительно МРЕ+Ονδ (ЭеЮх™). Кроме того, как описано выше, подходящие дополнительные вещества включают сапониновые адъюванты, такие как δΐ^ши1оη™ (Ρδ21, Ацш1а, Vо^се8ΐе^, Ма88.) или частицы, генерированные ими, такие как ШСОМз (иммуностимулирующий комплекс) и ШСОМАТКЕХ. Другие адъюванты включают полный адъювант Фрейнда (СЕА) (который подходит для нечеловеческого использования, но не подходит для использования человеку) и неполный адъювант Фрейнда (1ЕА). Другие вспомогательные вещества включают в себя цитокины, такие как интерлейкины (1Ь-1, 1Ь-2 и 1Ь-12), колониестимулирующий фактор макрофагов (М-С+Е) и фактор некроза опухоли (ΊΝΡ).
Как описано здесь, вспомогательное вещество может быть связанным токсичным липидом А (или производным липида А) адъювантом. В конкретном варианте осуществления адъювант выбран на основе его способности действовать как агонист То11-подобного рецептора (ТЬК). В качестве примера, не токсичного липида А-подобного адъюванта, который действует как агонист ТЬК4 и который может быть использован в композициях, описанных здесь, определен как ΩδΕΕ. ΩδΕ-Р имеет особенности, так как он содержит дисахаридную группу (Όδ), образованную путем соединения вместе двух моносахаридных групп, выбранных из глюкозы и аминогрупп, замещающих глюкозу, где дисахарид химически связан с обеими фосфатными группами (Р) и множеством липидных групп (Ь). Более конкретно, дисахарид может быть представлен в виде образованного из двух моносахаридных звеньев, каждое из которых имеет шесть атомов углерода. В дисахариде один моносахарид образует восстанавливающий конец, а другой моносахарид образует невосстанавливающий конец. Для удобства атом углерода восстанавливающего конца будет обозначен как расположенный в положениях 1, 2, 3, 4, 5 и 6, и соответствующие атомы моносахарида, формирующие невосстанавливающие концы, будут обозначаться как расположенные в положениях 1', 2', 3', 4', 5' и 6', после обычных углеродов нумерационной номенклатуры. В ΩδΕ-Р атом углерода в положении 1 невосстанавливающим концом соединен либо через эфир (-Ο-), либо аминогруппу (-ΝΗ-) с углеродом в положении 6' восстановительного конца. Фосфатная группа будет связана с дисахаридом, предпочтительно через углерод 4' невосстанавливающегося конца. Каждый из липидных групп будет объединен либо через амидную (-МН-С(О)-), либо эфирую (-О-С(О)-) связь с дисахаридом, где карбонильная группа присоединяется к липидной группе. Дисахарид имеет 7 позиций, которые могут быть связаны с группой амида или сложным эфиром, а именно в положениях 2', 3', и 6' невосстанавливающегося конца, и позициях 1, 2, 3 и 4 восстановительного конца.
Липидная группа имеет по меньшей мере шесть углеродов, предпочтительно по меньшей мере 8 углеродов и более предпочтительно по меньшей мере 10 углеродов, где в каждом случае группа липидов имеет не более чем 24 атома углерода, не более чем 22 атома углерода или не более 20 атомов углеродов. В одном воплощении группы липидов, взятые вместе, обеспечивают 60-100 углеродов, желательно 70-90 углеродов. Липидная группа может состоять исключительно из атомов углерода и водорода, т.е. он может быть углеводородной группой липидов, или он может содержать одну гидроксильную группу, т.е. это может быть группа липидов гидроксил-замещенных или может содержать группу эфиров, которая в свою очередь, присоединяется к углеводородным липидам или группе гидроксил-замещенных липидов через карбонильные (-С(О)-)-эфирные группы, т.е. эфир замещенных липидов. Группа углеводородных липидов может быть насыщенной или ненасыщенной, где группа липидных ненасыщенных углеводородов будет иметь одну двойную связь между смежными углеродными атомами.
ΩδΕΓ состоит из 3, или 4, или 5, или 6, или 7 липидных групп. В одном аспекте ΩδΕ-Р состоит из 3-7 липидных групп, в то время как в другом аспекте ΩδΕΓ состоит из 4-6 липидов. В одном аспекте липидная группа самостоятельно выбрана из углеродных липидов, гидроксил-замещенных липидов и эфирзамещенных липидов. В одном аспекте 1, 4' и 6' позиции заменяют гидроксил. В одном аспекте каждая моносахаридная единица, глюкозамин.,^δ^Р может быть в форме свободной кислоты или в форме соли, например соли аммония.
В некоторых вариантах липиды на ΩδΕΓ описаны следующими позициями: позиция 3' замещается -О-(СО)-СН2-СН(Ка)(-О-С(О)-КЬ); позиция 2' замещается -МН-(СО)-СН2-СН(Ка)(-О-С(О)-КЬ); позиция 3 замещается -О-(СО)-СН2-СН(ОН)(Ка); позиция 2 замещается -МН-(СО)-СН2-СН(ОН)(Ка); где каждый Ка
- 24 027236 и КЬ выбран из децила, ундецила, додецила, тридецила, тетрадецила, где каждый из этих терминов относится к насыщенной углеродной группе. В одном воплощении Ка является ундецилом, КЬ - тридецилом, где этот адъювант описан, например, в заявке на патент США под номером 2008/0131466 СЬА. Соединения, где Ка является ундецилом КЬ и является тридецилом, могут быть использованы в стехеометрически определенной форме, как известно, например, из Ауаик Ро1аг Ыр1б ак РНАО™ адъювант.
В некоторых вариантах ΩδΕΓ представляет собой смесь, естественно полученную из соединений, также известных как 3Э-МРЕ 30-МРЬ адъювант получают в промышленном масштабе в фармацевтической форме, компанией С1аxоδт^!ЬК1^ие Сотраиу в качестве адъюванта МРЬ™. 3О-МРЬ был широко описан в научной и патентной литературе, см. например, Уассше Оекфи: !Ье киЬиш! аиб аб.)иуаи! арргоасЬ, Роуе11 М.Р. и №утаи, М.1. ебк., СЬар!ег 21 МоиорЬокрЬогу1 Пр1б А ак ашб^аи!: рак! ехрепеисек аиб иеу бЬес!юик Ьу ШпсЬ, ТТ. и Муегк, К.К., Р1еиит Ргекк, №у Υо^к (1995) и υ.δ. Ра!еи! №. 4912094.
В другом аспекте адъювант ^δ^Р может быть описан как состоящий из (I) диглюкозамина, связанного с невосстанавливающимся клоном глюкозамина через простую эфирную связь между гексозамином в положении 1 невосстанавливающимся концом глюкозамина и гексозамина в положении 6 конца глюкозамина; (II) О-фосфорильной группы, присоединенной к гексозамину в положении 4 невосстанавливающимся концом глюкозамина; и (III) до шести жирных ацильных цепей; где одна из жирных ацильных цепей прикрепляется к 3-гидрокси ^восстанавливающимся концом глюкозамина через эфирную связь, где одна из жирных ацильных цепей прикрепляется к 2-амино невосстанавливающемуся концу глюкозамина через эфирную связь и состоит из тетрадеканоильной цепи, связанной с алканоильной цепью более чем 12 атомов углерода через эфирную связь, и котором одна из жирных ацильных цепей прикрепляется к 3-гидрокси невосстанавливающимся концом глюкозамина через эфирную связь и состоит из тетрадеканоильной цепи связанной с алканоильной цепью более чем 12 атомами углерода через эфирную связь. См., например, патентую заявку на изобретение США под номером 2008/0131466.
В другом аспекте адъювантом может быть синтетический дисахарид, имеющий шесть групп липидов, см., например, патентую заявку на изобретение США под номером 2010/0310602.
В другом аспекте адъювант ^δ^Р описывается химической формулой (I) и упоминается как глюкопиранозил липид А (СЬА):
в которой фрагменты А1 и А2 независимо выбирают из группы, включающей водород, фосфат и фосфатные соли натрия и калия, являющийся примерными противоионами для фосфатной соли;
фрагменты К1, К2, К3, К4, К5 и К6 независимо выбирают из группы гидрокарбила, содержат от 3 до 23 атомов углерода, представленных С3-С23.
Для большей ясности будет объяснено, что, когда фрагмент независимо выбранный из указанной группы, имеющей несколько элементов, следует понимать, что элементы выбраны для первой части ни в коем случае не влияет или не ограничивает выбор элемента, выбранного для второй части углеродного атома, к которому К1, К3, К5 и К6, соединенные асимметрически, и, следовательно, могут существовать в К- или δ химической конфигурации. В одном варианте осуществления все эти атомы углерода в К химической конфигурации, в то время как в другом варианте все эти атомы углерода в δ химической конфигурации. Гидрокарбил относится к химическому фрагменту, образованному исключительно из углерода и водорода, где расположение атомов углерода может быть линейной или разветвленной цепью, нециклической или циклической, а также связь между соседними атомами углерода может быть полностью одинарной связью, т.е. чтобы обеспечить насыщенный углеводородный остаток, или может быть двойной или тройной связью, присутствующей между любыми двумя соседними атомами углерода, т.е. обеспечить ненасыщенный углеводород, и количество атомов углерода в углеводородной группе композиция включает от 3 и 24 атомов углерода. Гидрокарбил может быть алкилом, где представители прямой алкильной цепи включают метил, этил, н-пропил, н-бутил, н-пентил, н-гексил и т.п., в том числе ундецил, додецил, тридецил, тетрадецил, пентадецил, гексадеццл, гептадецил, октадецил и т.п., в то время как разветвленные алкилы включают изопропил, втор-бутил, изобутил, трет-бутил, изопентил и т.п. Представитель насыщенных циклических углеводородов включает циклопропил, циклобутил, циклопентил, цикло- 25 027236 гексил и т.п., в то время как ненасыщенные циклические углеводороды включают циклопентенил и циклогексенил и т.п. Ненасыщенные углеводороды содержат по меньшей мере одну двойную или тройную связь между соседними атомами углерода (именуемые алкенил и алкинил соответственно, если гидрокарбил не является циклическим, и циклоалкен и циклоалкинил соответственно, если гидрокарбил, по меньшей мере, частично циклические представители прямой и разветвленной цепи включают алкенильный этиленил, пропиленил, 1-бутенил, 2-бутенил, изобутиленил, 1-пентенил, 2-пентенил, 3-метил-Ьбутенил, 2-метил-2-бутенил, 2,3-диметил-2-бутенил и т.п., тогда как представители прямой и разветвленной цепей алкинилов включают ацетиленил, пропинил, 1-бутинил, 2-бутинил, 1-пентинил, 2-пентинил, 3-метил-Ь-бутинил и т.п. Адъюванты формулы (Ι) могут быть получены синтетическими способами, известными в данной области, например синтетическими методами, раскрытыми в международной публикации РСТ АО 2009/035528, которая включена в настоящее описание посредством ссылки, а также в публикациях, указанных в АО 2009/035528, каждые из этих публикаций также включены в настоящее описание посредством ссылки. Некоторые из адъювантов также могут быть получены коммерческим путем.
Адъюванты ΩδΤ-Р могут быть получены синтетическими способами, известными в данной области, например, способами синтеза, описанными в международной публикации РСТ АО 2009/035528, которая включена в настоящее описание посредством ссылки, а также в публикациях, указанных в АО 2009/035528, где каждая из этих публикаций также включена в настоящее описание посредством ссылки. Химически синтезированный ^δ^Ρ адъювант, например адъювант формулы (Ι), может быть получен, по существу, в однородной форме, которая относится к препарату, который по меньшей мере на 80, по меньшей мере 85, по меньшей мере 90, по меньшей мере 95 или по меньшей мере 96, 97, 98 или 99% идентична по отношению к молекуле ΩδΡΕ, присутствующей, например, в соединениях формулы (Ι). Определение степени чистоты данного адъювантного препарата может быть легко осуществлено для тех, кто знаком с соответствующими аналитическими методиками химии, такими как с помощью газовой хроматографии, жидкостной хроматографии, масс-спектроскопии и/или ЯМР. ^δ^Ρ вспомогательные вещества, полученные из природных источников, как правило, не легко сделать в химически чистом виде, и, следовательно, синтезированные вспомогательные вещества являются предпочтительными адъювантами для применения в композициях и способах, описанных здесь. Как обсуждалось ранее, некоторые адъюванты могут быть получены коммерческим путем. Одним из таких является адъювант ΩδΤ-Р под номером 699 800, как указано в каталоге АуапИ Ро1аг Μρίάδ, А1аЬа51ет АЬ, см. Ε1 в сочетании с Ε10, см. выше.
В различных вариантах осуществления вспомогательное вещество имеет химическую структуру формулы (Ι), но фрагменты А1, А2, К1, К2, К3, К4, К5 и К6 выбраны из подмножества вариантов, ранее предусмотренных на эти фрагменты, где эти подмножества указаны ниже как Ε1, Ε2 и т.д.
Ε1: А1 фосфат или фосфатная соль и А2 водород.
Ε2
Ε3
Е4
Е5
Е6
Е7
Е8
Е9
К1,
К1,
К1,
К1,
К1,
К1,
К1,
К1,
К3, К5 и К6 алкил и К2 и К4
С5-С23-гидрокарбил.
С7 -С19-гидрокарбил.
С9-С17 -гидрокарбил.
С11 -С!5-гидрокарбил.
С11-С17 -гидрокарбил.
С9-С15-гидрокарбил.
С12-С20-гидрокарбил.
Сц-алкил и К2 и К4, С^-гидрокарбил.
Ε10: К1, К3, К5 и К6 ундецил и К2 и К4 тридецил.
В некоторых вариантах осуществления каждый из Ε2-Ε10 в сочетании с вариантом Ε1, и/или углеводородной группой Ε2 до Е9 представляют собой алкильные группы, предпочтительно линейные алкильные группы. ΩδΤ-Р адъювант, например, адъюванты формулы (Ι) могут быть введены в фармацевтическую композицию, необязательно с совместным адъювантом, каждый, как описано ниже. В этой связи делается ссылка на публикацию патента США 2008/0131466, которая обеспечивает композиции, такие как водная композиция (АР) и стабильная композиция эмульсии (δΕ) для ОЬА адъюванта, в котором эти композиции могут быть использованы для любого из адъювантов формулы (Ι). В некоторых конкретных вариантах осуществления иммуногенная композиция содержит ОЬА, в которой ОЬА адъювант (см. формулу (Ι)) формулируется в стабильной эмульсии масло-в-воде (δΕ) (ОЬА/δΕ или ОЬА-δΕ), а затем в сочетании по меньшей мере с одним иммуногеном.
Дополнительно, как описано более подробно ниже и в данном описании, два или более различных адъюванта могут быть использованы одновременно, например, в качестве не ограничивающего примера, соли алюминия с ΩδίΕ адъювантом соли алюминия, с Οδ21, ΩδΤ-Р адъювантом с Οδ21 и МРЬ или ОЬА вместе. Кроме того, неполный адъювант Фрейнда может быть использован (см., например, СЬаид е1 а1., Аймапсей Эгид ЭеВуегу Ре\ае\У5 32, 173-186 (1998)) необязательно в сочетании с любой солью алюминия, с Οδ21 и МРЬ и все их композиции.
В некоторых вариантах ΩδίΕ адъювант, например адъювант формулы (Ι), может быть составлен в фармацевтическую композицию (или адъювантную композицию) необязательно с совместным адъюванК3, К5 и К6 К3, К5 и К6 К3, К5 и К6 К3, К5 и К6 К3, К5 и К6 К3, К5 и К6 К3, К5 и К6
С3-С21
С5-С17·
С7-С15·
С9-С13·
С9-С15·
С7-С13·
С11-С0· алкил и К2 и К4 алкил и К2 и К4 алкил и К2 и К4 алкил и К2 и К4 алкил и К2 и К4 алкил и К2 и К4
- 26 027236 том, каждый, как описано ниже, или любым другим адъювантом, описанным здесь или доступным в данной области. В этой связи делается ссылка на публикацию патента США 2008/0131466, которая обеспечивает композиции, такие как водная композиция (АР) и стабильная эмульсионная композиция (8Е) для ОЬА адъюванта, где адъювантная композиция может быть использована в отношении любого из адъювантов формулы (Ι).
Как предлагается здесь, Э8БР адъювант, такой как адъювант формулы (I), может быть использован в комбинации со вторым адъювантом, называемым здесь в качестве совместного адъюванта (соадъюванта). Через три примерных варианта осуществления со-адъювант может быть системой доставки, или он может быть иммуностимулятором, или он может быть композицией, которая функционирует как система доставки и иммуностимулятор (см., например, О'Надап е! а1., Рйагт. Ке8. 21(9):1519-30 (2004)). Со-адъювантом может быть иммуностимулятор, который работает через элемент То11-подобного рецептора семейства биомолекул. Например, со-адъюванты могут быть выбраны для его основного способа действия как ТЬК4 агонист, или ТЬК8 агонист, или ТЬК9 агонист. Альтернативно или в дополнение, соадъювант может быть выбран для его свойства носителя, например, со-адъювантом могут быть эмульсии, липосомы, микрочастицы или квасцы.
В одном варианте осуществления со-адъювант представляет собой алюминиевые квасцы, где этот термин относится к алюминиевой соли, такой как фосфат алюминия (А1РО4) и гидроксид алюминия (А1(ОН)3). Когда квасцы используются в качестве со-адъювантов, квасцы могут присутствовать в дозе иммуногенной композиции (или препарата, содержащего иммуногенную композицию) в количестве приблизительно от 100 до 1,000 мкг, от 200 до 800 мкг, от 300 до 700 мкг, от 400 до 600 мкг. Адъюванты формулы (Ι) обычно присутствуют в количестве, меньшем, чем количество квасцов, и в различных конкретных вариантах осуществления адъювант формулы (Ι) в расчете на вес присутствует в количестве 0?1-1%, или 1-5%, или 1-10%, или 1-100% по отношению к массе квасцов.
В одном конкретном варианте осуществления адъювант представляет собой эмульсию, имеющую адъювантные свойства, достаточные для использования в вакцине или иммуногенной композиции. Такие эмульсии включают масло-в-воде. Неполный адъювант Фрейнда (ΙΡΑ) является одним из таких адъювантов. Другим подходящим масло-в-воде является МР-59™ адъювант, который содержит сквален, моноолеат полиоксиэтиленсорбитана (также известный как Туееп™ 80 сурфактант) и сорбитантриолеат. Сквален является естественным органическим соединением, первоначально получен из печени акулы, хотя также доступен из растительных источников (в основном растительные масла), включая семена амаранта, рисовые отруби, пшеничные зародыши и оливки. Другими подходящими вспомогательными веществами являются Моп!апЛе™ адъюванты (8еррю 1пс., РайГте1й N1), в том числе Моп!атйе™ Ι8Α 50У, адъюванты, которые основаны на минеральных маслах; Моп!атйе™ Ι8Α 206; и Мойатйе™ 1М8 1312. В то время как минеральное масло может присутствовать в со-адъюванта, в одном варианте масличными компонентами иммуногенной композиции, описанной здесь, являются все метаболизированные масла.
Примеры иммуностимуляторов, которые могут быть использованы в композициях, способах, описанных здесь, в качестве со-адъюванта включают в себя МРЬ™; МОР и производные; олигонуклеотиды; двухцепочечные РНК; альтернативные патоген-связанные молекулярные модели (РАМР8); сапонины; низкомолекулярные иммунные усилители (8М1Р8); цитокины и хемокины.
В одном варианте осуществления со-адъювант МРЬ™ является адъювантом, который коммерчески доступен от компании О1ахо8тййКйпе (первоначально разработанный К1Ы 1ттипосйет Ке8еагсй, 1пс НатШоп, МТ). См., например, Ийгсй апй Муег8, Сйар!ег 21 Ггот Уассше Ое81дп: Тйе 8иЬит! апй Айщуап! Арргоасй, Роуе11 апй №\утап, ей8. Р1епит Рге88, №ν Уогк (1995). Относятся к адъювантам МРЬ™, а также подходят в качестве со-адъювантов для использования в композициях и способах, описанных здесь, являются А802™ адъювант, А804™ адъювант. А802™ адъювант представляет собой эмульсию масло-в-воде, которая содержит как адъювант Р8-21™ (сапонин-вместимые адъюванты обсуждались здесь и в уровне техники). А804™ адъювант содержит адъювант МРЬ ™ и квасцы. МРЬ™ адъювант, получают из липополисахарида (ЛПС) из 8а1топе11а т1ппе8о!а К595 обработкой ЛПС слабым кислотным и основным гидролизом с последующей очисткой модифицированных ЛПС.
В другом варианте осуществления изобретения со-адъювант представляет собой сапонин, такой как соль, полученная из коры дерева Ош11а)а Ош11а)а вида мыльнянка, или модифицированного сапонина (см., например, патенты США № 5057540; 5273965; 5352449; 5443829 и 5560398). Продающийся адъювантный продукт Р8-21™, Ап!1§етс8, 1пс. Ьехш§!оп, МА является примером сапонинсодержащих со-адъювантов, которые можно использовать с адъювантом формулы (Ι). Альтернативными соадъювантами, связанными с сапонином, являются 18СОМ 18СОМ™ из семейства адъювантов, первоначально разработанный 18со!ес (8уейеп) и обычно формирован из сапонинов, полученных из Ош11а)а или синтетических аналогов, холестерина и фосфолипидов, все формируется в сотовую структуру.
В еще одном варианте со-адъювант представляет собой цитокин, который функционирует в качестве со-адъюванта (см., например, Ып е! а1., Сйп. 1пГес!. Όΐ8. 21(6):1439-49 (1995); Тау1ог, 1пГес!. 1ттип. 63(9):3241-44 (1995) и ЕдИте/, Сйар. 14 ш Уассше Ай)иуап!8 апй Эейуегу 8у8!ет8, 1ойп \УПеу & 8оп8,
- 27 027236
Шс. (2007)). В различных вариантах осуществления цитокин может быть, например, гранулоцитарномакрофагальным колониестимулирующим фактором (ОМ-С§Р) (см., например, СЬапде е! а1., Нета!о1оду 9(3):207-15 (2004); ЭгапоГГ, Iттипο1. Кеу. 188:147-54 (2002) и и.§. Ра!еп! 5679356), или интерфероном, таким как интерферон типа I (например, интерферон-α (ШАа) или интерферон-β (ΓΕΝ-β)), или интерферон типа II (например, интерферон-γ (ΣΗΝ-γ) (см., например, ВоеЬт е! а1., Апп. Кеу. Iттипο1. 15:749-95 (1997); и ТЬеоП1орон1ок е! а1., Апп. Кеу. Iттипο1. 23:307-36 (2005)); интерлейкином, включающим, в частности, интерлейкин-1а (ГБ-1 а), интерлейкин-1 β (ТЪ-1 β), интерлейкин-2 (Ш-2) (см., например, №1коп, I. Iттипο1. 172(7):3983-88 (2004); интерлейкин-4 (Ш-4), интерлейкин-7 (Ш-7), интерлейкин-12 (Ш-12) (см., например, РоШеЦе е! а1., Сапсег Iттипο1. Шнпипобюг. 52(3):133-44 (2003) и ТппсЫеп, ΝηΙ. Кеу. Тттипо1. 3(2):133-46 (2003)); интерлейкин-15 (Ш-15), интерлейкин-18 (Ш-18); эмбриональный лиганд печени тирозинкиназы 3 (Р1!3Ь) или фактор некроза опухоли а (ТОТа). Адъювант О§ЬР, такой как адъювант формулы (I), может быть совместно сформулирован с цитокином до сочетания с вакцинным антигеном или антигенами, Э§ЬР адъювант (например, адъювант формулы (I)) и цитокин совместно с адъювантом могут быть сформулированы отдельно, а затем объединены).
В некоторых вариантах осуществления иммуногенная композиция, которая включает иммуноген (который может быть выделенным и/или рекомбинантным), и адъювант сформулированы вместе. В других определенных вариантах осуществления, когда иммуногенная композиция содержит два или более иммуногена, адъюванты могут быть приготовлены с каждым иммуногеном по отдельности или два или более иммуногена могут быть приготовлены вместе с адъювантом, что и образует единую иммуногенную композицию. Когда два или более иммуногена предназначены для введения субъекту и когда каждый иммуноген отдельно сформулирован с адъювантом, каждая композиция может затем быть объединенной в одну иммуногенную композицию.
В других определенных вариантах осуществления иммуногенная композиция содержит иммуноген или композиция содержит рекомбинантный экспрессирующий вектор, который кодирует иммуноген или векторные частицы, содержащие вектор, упаковываются и поставляются в отдельных ампулах, чем те, что содержат адъювант. Каждая из иммуногенных композиций может быть объединенной с фармацевтически приемлемым адъювантом (т.е. физиологически подходящим или приемлемым) эксципиентом(ами), которые более подробно описаны в данном документе. Соответствующие этикетки обычно упаковывают с каждой композиции с указанием предполагаемого терапевтического применения. Выбор адъюванта и/или наполнителя зависит от стабильности иммуногена, рекомбинантного вектора экспрессии и/или векторной частицы, пути введения, режим дозирования и эффективность адъюванта для вида прививки. Для введения человеку фармацевтически приемлемым вспомогательным веществом является то, которое был одобрено или утверждено для введения человеку, с помощью соответствующих регулирующих органов. Например, как описано выше и известно в данной области, полный адъювант Фрейнда не подходит для введения человеку.
Адъювантами, полезными для использования в иммуногенной композиции и способах, описанных здесь, являются физиологически или фармацевтически приемлемые адъюванты для субъекта, которому вводится адъювант. Адъювантные композиции содержат по меньшей мере один адъювант (например, один или более адъювантов) и необязательно по меньшей мере один физиологически или фармацевтически приемлемый (или приемлемый) наполнитель. Любой физиологически или фармацевтически приемлемый наполнитель или носитель (т.е. нетоксичный материал, который не влияет на активность активного ингредиента), известный специалистам в данной области для использования в фармацевтических композициях, может быть использован в качестве адъювантной композиции, описанной в данном документе. Типичные наполнители включают разбавители и носители, которые поддерживают стабильные и целостные компонент(ы) из адъюванта. Вспомогательные вещества для терапевтического применения хорошо известны и описаны, например, в КетШд!оп: ТЬе §с1епсе апб РтасЬсе оГ РЬаттасу (Оеппаго, 21к! Еб. Маск РиЬ. Со., Еак!оп, РА (2005)) и описаны более подробно в данном документе.
Рекомбинантный вектор экспрессии.
В одном варианте рекомбинантные векторы экспрессии при условии, что содержат полинуклеотидную последовательность, кодирующую по меньшей мере один иммуноген, который индуцирует иммунный ответ на иммуноген и с соответствующим определенным антигеном. Чтобы получить эффективную транскрипцию и трансляцию иммуногена, кодирование полинуклеотидных последовательностей в каждом векторе включает по меньшей мере одну соответствующую последовательность, контролирующую экспрессию (также называемые последовательности, регулирующие экспрессию или функции) (например, промотор, энхансер, лидер), которая описана более подробно здесь, которая функционально связана с последовательностью, кодирующую полинуклеотид(ы). Эти рекомбинантные векторы экспрессии, таким образом, направлены для экспрессии иммуногена или направленной совместной экспрессии по меньшей мере двух иммуногенов в любой подходящей клетке-хозяине, который был преобразован, трансдуцирован или трансфицирован рекомбинантным вектором экспрессии или частицей, содержащей вектор экспрессии рекомбинантного вектора.
- 28 027236
Рекомбинантные экспрессионные векторы, описанные здесь, могут кодировать один или несколько иммуногенов (т.е. по меньшей мере один, по меньшей мере два, по меньшей мере три иммуногена и т.д.), которые описаны здесь более подробно. В конкретных вариантах осуществления по меньшей мере один, два, или три, или более иммуногенов из инфекционного микроорганизма (например, вирусов, бактерий, грибков или паразитов) могут кодироваться рекомбинантным вектором экспрессии. Иммуногены и определенные антигены, полученные из микроорганизмов инфекционного заболевания, описаны здесь более подробно. В качестве примера иммуноген может быть ВПГ-2 белком, таким как ЦЫ9 или §0 (или иммуногенным вариантом), или может быть иммуногенным фрагментом или областью ВПГ-2 белка. В другом конкретном варианте осуществления рекомбинантный экспрессирующий вектор, описанный здесь, может кодировать по меньшей мере один, два, три или более ассоциированных с опухолью антигенов, или иммуногенов или их вариантов или фрагментов. Эти ассоциированные с опухолью антигены описаны более подробно в данном документе и могут быть, например, ассоциированными с опухолью антигеном из почечной антиген-клеточной карциномы, антигеном рака предстательной железы (например, кислой фосфатазой предстательной железы, специфическим антигеном предстательной железы, ΝΚΧ3.1, и простатоспецифическим мембранным антигеном), антигеном мезотелиомы, антигеном рака поджелудочной железы, антигеном меланомы, антигеном рака молочной железы, антигеном колоректального рака, антигеном рака легкого, антигеном рака яичника или любого рака или опухоль-ассоциированного антигена, описанного здесь и в данной области.
Рекомбинантные векторы экспрессии могут быть использованы для экспрессии одного или более иммуногенов, описанных здесь. В конкретных вариантах осуществления рекомбинантный вектор экспрессии поступает в соответствующую клетку (например, антиген-представляющие клетки, т.е. ячейку, которая отображает пептид/МНС на поверхности клетки, такие как дендритные клетки) или ткани (например, лимфоидная ткань), которая будет вызывать желаемый иммунный ответ (т.е. специфический гуморальный ответ (т.е. В-клеточный ответ) и/или индукцию конкретного лекарственного клеточного иммунного ответа, который может включать иммуноген-специфический СЭ4 и/или СЭ8' Т-клеточный ответ, который СЭ8 Т-клеточный ответ может включать цитотоксический Т-клеточный (ЦТЛ ответ). Рекомбинантные экспрессирующие векторы могут также включать в себя, например, лимфоидные ткани конкретных транскрипционных регуляторных элементов (ТКЕ), таких как лимфоциты, Т-лимфоциты, или дендритные клетки конкретных ТКЕ. Конкретная лимфоидная ткань ТКЕ известна в данной области (см., например, ТЕотрвоп е1 а1., Мо1. Се11. Вю1. 12, 1043-53 (1992); Тобб е1 а1., ί. Ехр. Меб. 177, 1663-74 (1993); Ретх е1 а1., ί. Ехр. Меб. 178:1483-96 (1993)).
В одном конкретном варианте осуществления рекомбинантный экспрессирующий вектор является плазмидной ДНК или космидной ДНК. Плазмидные ДНК или космидные ДНК, содержащие один или более полинуклеотидов, кодирующих иммуноген, как описано в данном документе, легко сконструированы с использованием стандартных методик, хорошо известных в данной области. Векторный геном может обычно создается в форме плазмиды, которая может быть затем трансфицированной в оболочки клеточных линий или линейной продуцирующихся клеток. Плазмида обычно содержит последовательности, полезные для репликации плазмиды в бактериях. Такие плазмиды хорошо известны в данной области. Кроме того, векторы, которые включают прокариотическое начало репликации, могут также включать ген, экспрессии который дает детектируемый или селектируемый маркер, такой как лекарственная устойчивость. Типичными бактериальными продуктами лекарственной устойчивости являются те, которые придают устойчивость к ампициллину или тетрациклину. Для анализа подтверждения правильности нуклеотидных последовательностей, включенных в плазмиду, плазмида может реплицироваться в Е.соЕ, очищаться и анализироваться с помощью рестрикционного гидролиза эндонуклеазой и/или ее нуклеотидной последовательностью, определенной обычными методами.
В других конкретных вариантах осуществления рекомбинантный экспрессирующий вектор является вирусным вектором. Примеры рекомбинантных вирусных экспрессирующих векторов включают лентивирусный векторный геном, поксвирусной векторный геном, векторный геном вируса коровьей оспы, геном аденовирусного вектора, вирусный вектор, связанный с аденовирусным геном, векторным геном вируса герпеса и вирусный геном альфа вектора. Вирусные векторы могут быть живыми, ослабленными, репликационными или условно репликационными недостаточными и, как правило, не являющиеся патогенными (дефектными), репликациями компетентного вирусного вектора.
Так, например, в конкретном варианте осуществления, когда вирусный вектор представляет собой геном вируса оспы, полинуклеотид, кодирующий иммуноген, представляющий интерес, может быть вставлен в несущественные сайты вектора вируса коровьей оспы. Такие несущественные сайты, описаны, например, в Регкив е1 а1., Уио1оду 152:285 (1986); НгиЬу е1 а1., Ргос. Ν;·ιΐ1. Асаб. 8с1. ИЗА, 80:3411 (1983); Уеи е1 а1., ί. Упо1. 46:530 (1983). Подходящие промоторы для использования с вирусными вакцинами включают, но не ограничивается, Р7.5 (см., например, СосЬгап е1 а1., ί. Упо1. 54:30 (1985); Р11 (см., ВейЬо1е1, е1 а1., Ргос. Ν;·ιΐ1. Асаб. δα. ИЗА, 82:2096 (1985)); и САЕ-1 (см., например, Ра1е1 е1 а1., Ргос. Ν;·ιΐ1. Асаб. δα. ИЗА, 85:9431 (1988)). Сильно ослабленные штаммы коровьей оспы более приемлемы для использования в организме человека и включают ЫЧег, №ГУАС, который содержит специфические делеции генома (см., например, Сиегга е1 а1., ί. Упо1. 80:985-98 (2006); ТайадЬа е1 а1., АГОЗ КевеагсЬ и Ни- 29 027236 таи Ке!гоу1гикек 8:1445-47 (1992)), или МУА (см., например, СЬегаб1 е! а1., I. Сеи. Уио1. 86:2925-36 (2005); Мауг е! а1., Шескои 3:6-14 (1975)). См., например, Ни е! а1. (I. Уио1. 75:10300-308 (2001), описывающий использование Υπόη-ΠΙ^ при заболевании вирусом в качестве вектора для лечения рака); υ.δ.
Ра!еи! №к. 5698530 и 6,998,252. См., например, υ.δ. Ра!еи! №. 5443964. См., например, υ.δ. Ра!еи! №к.
7247615 и 7368116.
Несколько аденовирусных векторных систем и способов введения в векторы были описаны (см., например, Моки е! а1., I. Уко1. 72:8358-61 (1998); №гит1 е! а1., Ат I. Кекри. Се11 Мо1. Вю1. 19:936-41 (1998); Метает е! а1., Ргос. №ί1. Асаб. δοΐ. υδΑ 101:6188-93 (2004); υ.δ. Ра!еи! №к. 6143290; 6596535; 6855317; 6936257; 7125717; 7378087; 7550296).
Ретровирусные геномные векторы могут опираться на вирус мышиного лейкоза (МиЬУ), вирус лейкемии обезьяны гиббона (оцинкованный), экотропный ретровирус, вирус иммунодефицита обезьяны АРУ), вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) и их комбинации (см., например, ВисЬксЬег е! а1., I. Упо1. 66:2731-39 (1992); ПИапп е! а1., I. Уио1. 66:1635-40 (1992); БоштегёеП е! а1., Уио1о§у 176:58-59 (1990); Аккои е! а1., I. Учо1. 63:2374-78 (1989); МШет е! а1., I. Учо1. 65:2220-24 (1991); МШет е! а1., Мо1. Се11 Вю1. 10:4239 (1990); Ко1Ьегд, ШН Кек. 4:43 1992; Согиейа е! а1., Нит. Сеие ТЬег. 2:215 (1991)).
В более конкретном варианте рекомбинантный экспрессирующий вирусный вектор опирается на лентивирусный векторный геном. Геном, может быть получен из любого из большого количества подходящих, на основе доступных геномов лентивирусных векторов, в том числе те, которые определены для человеческого применения генной терапии (см., например, РГеГег е! а1., Аиии. Кеу. Сеиотюк Нит. Сеие!. 2:177-211 (2001)). Подходящие лентивирусные геномные векторы включают те, которые основаны на вирус иммунодефицита человека (ВИЧ-1), ВИЧ-2, вирус иммунодефицита кошек (ПУ), вирус инфекционной анемии лошадей, вирус иммунодефицита обезьян (8ГУ), маеди/висны вирусы. Желательной характеристикой лентивирусов является то, что они могут заразить клетки с делением и без деления, хотя клетки-мишени не должны быть деленными клетками или быть стимулированными к делению. Как правило, геномы и гликопротеины оболочки будут основываться на различных вирусах, так что в результате вирусные векторные частицы - псевдотипы. Особенности безопасности введения векторного генома включают самостоятельно инактивирующийся ЬТК и не встраивающийся в геном. Примерные векторы содержат сигнал упаковки ^δ^, Кеу-реактивный элемент (РРЭ), сплайсинг донор, акцептор сплайсинга, центральный поли-пурин-кишечного тракта (СРРТ) и АРКЕ элемент. В некоторых примерных вариантах осуществления вирусный геномный вектор содержит последовательность генома лентивирусов, таких как ВИЧ-1 геном или геном δΗ. Вирусная геномная конструкция может включать в себя последовательность от 5' и 3' ЬТКк из лентивирусов, в частности может включать в себя К и υ5 последовательности из 5'ЬТКЬТК из лентивирусов инактивированных или самостоятельно инактиванных 3'ЬТК из лентивирусов. ЬТК-последовательности могут быть ЬТК-последовательностями из любого лентивируса из любого вида. Например, они могут быть ЬТК-последовательностями из ШУ, δΗ, ЫУ или ЕНУ. Как правило, последовательности ЬТК, ШУ и ЬТК последовательности.
Вектор генома может содержать инактивированный или самостоятельно инактиванный 3'ЬТК (см., например, 2иГГетеу е! а1., I. Уио1. 72: 9873, 1998; М1уокЫ е! а1., I. Уко1. 72:8150, 1998; оба из которых включены как полноразмерные. Самостоятельно инактивированный вектор обычно имеет делеционно усиленные и промоторные последовательности от 3' длинного концевого повтора (ЬТК), который копируется в 5' ЬТК по всей длине вектора интеграции. В одном случае υ3 элемент 3'ЬТК содержит делецию последовательности энхансера ТАТА Ьох, δρ1 и ΝΡ-каппа В сайта. В результате самоинактивации 3'ЬТК, про вирус, который генерируется после входа, и обратная транскрипция будет включать инактивированный 5 ЬТК. Обоснованием является повышение безопасности путем снижения риска мобилизации векторного генома и влияние ЬТК на близлежащие клеточные промоторы. Самостоятельно инактивированный 3'ЬТК может быть построен любым способом, известным в данной области.
По желанию, υ3 последовательности из лентивирусов 5'ЬТК могут быть заменены последовательностями промотора в вирусной конструкции, такой как гетерологичная последовательность промотора. Последовательности энхансера могут быть также включены. Любая энхансер/промотор комбинация, которая увеличивает экспрессию вирусного генома РНК в клеточной линии, может быть использована. В одном примере используется последовательность энхансера/промотора СМУ (см., например, патенты США № 5385839 и 5168062).
В некоторых вариантах риск инсерционного мутагенеза сведен к минимуму путем построения интеграции дефектов лентивирусного векторного генома. Различные подходы могут осуществляться для получения неинтегрирующего векторного генома. Эти подходы влекут за собой инженерную мутацию (и) фермента гена как компонента интегразы, так что он кодирует белок неактивной интегразы. Векторный геном сам по себе может быть изменен, чтобы предотвратить интеграцию, например, мутации или удаления одного или обоих участков присоединения, или сделать ЬТК-проксимальным 3' ЬТКпроксимальным полипурин (РРТ) нефункциональным, путем делеции или модификации. Кроме того, негенетические подходы, которые могут использоваться, к ним относятся фармакологические агенты, которые ингибируют одну или более функций интегразы. Подходы не являются взаимоисключающими, т.е. более чем один из них может быть использован одновременно. Например, обе интегразы привязан- 30 027236 ные к сайтам могут быть нефункциональными или интеграза РРТ сайта может быть нефункциональной или вложенные в сайты РРТ может оказаться нерабочими, или все из них могут быть нефункциональными.
Интеграза участвует в расщеплении тупых концов вирусной двухцепочечной ДНК и соединения концом к 5'- в две нити хромосомного сайта мишени. Интеграза имеет три функциональных домена: Ν-концевой домен, который содержит цинк-связывающий мотив (ННСС); центральный ядерный домен, который содержит каталитическое ядро и консервативный мотив ОЭ35Е (Ό64, Ό116, Е152 в Н1У-1); и Сконцевой домен, который имеет ДНК свойства. Точечные мутации вводят в интегразы достаточно, чтобы нарушить нормальные функцию. Многие мутации интегразы были построены и охарактеризованны (см., например, РЫ1ро!! апб ТЬгакЬег, Нитап Оепе ТЬегару 18:483, 2007; Аро1ота, ТЬе818 зиЬтЫеб !о Ишуегейу Со11еде Ьопбоп, Аргй 2009, р, 82-97; Епдейпап е! а1., 1. У1го1. 69: 2729, 1995; №§Ытда1е е! а1., Мо1. ТЬегару, 13:1121, 2006). Последовательность, кодирующая белок интегразы, представляющая неактивный белок, может быть удалена или мутирована, предпочтительно без существенного ухудшения активности обратной транскриптазы или ядерного таргетинга, тем самым только предотвращая интеграцию провируса в геном клетки-мишени. Приемлемые мутации интегразы могут уменьшить катализ, перенос цепи, привязки к АТТ сайтам связывания для размещения хромосомной ДНК, и другие функции. Например, в одной аспарагиновой кислоте замещение аспарагина в положении остатка 35 ВИЧ-интегразы или 81У интегразы полностью устраняет вирусные интеграции ДНК. Удаленная интеграза, как правило, будет ограничиваться С-концевым доменом. Удаление кодирующей последовательности остатков 235-288 в результате полезны для нефункциональности интегразы (см., например, Епде1тап е! а1., 1. У1го1. 69:2729, 1995). В качестве дополнительных примеров, мутации могут быть получены, например, Азр64 (номера данных остатков для ВИЧ-1, соответствующие номерам остатков интегразы от других ретровирусов, лентивирусов или могут быть легко определены специалистами) (например, Э64Е, Э64У), Азр116 (например, Ό116Ν), Азп120 (например,М20К), О1и152, О1п148 (например, Ц148А), Ьу8156, Ьу8159, Тгр235 например, ХУ235Е), Ьу8264 (например, Κ264Κ), Ьу8266 (например, Κ266Κ), Ьу8273 (например, Κ273Κ). Другие мутации могут быть изготовлены и испытаны для интеграции экспрессии трансгена и любых других желательных параметров. Анализы для этих функций хорошо известны. Мутации могут быть получены с помощью любых из разнообразных методов, включая сайт-направленный мутагенез и химический синтез нуклеиновый кислот. Может быть сделана одна мутация или более чем одна из этих мутаций может присутствовать в интегразе. Например, интеграза может иметь мутации двух аминокислот, трех аминокислот, четырех аминокислоты, и так далее.
В качестве альтернативы или в сочетании с использованием интегразы мутант(ы), имеющие вложенные сайты (АТТ) в И3, И5, также может быть мутированным. Интегразы связываются с этими сайтами, и 3'-концевой динуклеотид расщепляется на обоих концах векторного генома. Динуклеотид СА расположен на конце встраиваемого в 3' конца; СА требуется для обработки, мутации интегрированных упакованных нуклеотидов в хромосому хозяина. СА динуклеотид сертификации является наиболее критическим для нуклеотидов интеграции, и мутации в обоих концах генома даст лучшие результаты (см., например, Βιό\υπ е! а1., 1. У1го1. 73:9011 (1999)). Другими примерами, СА на каждом конце изменяется на ТО. Другими примерами, СА на каждом конце изменяется на ТО на одном конце и ОТ на другом конце. Другими примерами, СА удаляется на каждом конце.
Интеграция также может быть запрещена в результате мутации или делеции полипуринового тракта (РРТ) (см., например, ^02009/076524), расположенного проксимально ЬТК 3' ЬТК. РРТ является полипуриновой последовательностью, состоящей примерно из 15 нуклеотидов, которые могут служить в качестве праймера, сайта связывания для синтеза плюс-цепи ДНК. В этом случае мутациями или делециями РРТ является обратным процессом транскрипции. Не желая быть проведенной конкретным механизмом, за счет мутации или удаления РРТ, производство линейной ДНК радикально снижается, а, по существу, производство только 1-ЬТК круговой ДНК. Интеграция требует векторный геном линейной двухцепочечной ДНК и интеграцию, по существу, устранную без него. Как указано в данном описании, РРТ можно сделать нефункциональным в результате мутации или удаления. Как правило, всего приблизительно 15 нт РРТ делетированы, хотя в некоторых вариантах осуществления могут быть сделаны более короткие делеции 14 нт, 13, нт, 12 нт, 11 нт, 10 нт, 9 нт, 8 нт, 7 нт, 6 нт, 5 нт, 4 нт, 3 нт и 2 нт. Когда мутации сделаны, сделаны типичные множественные мутации, особенно на 5' неполном РРТ (см., например, МсХУППапъ е! а1., 1. У1го1. 77:11150, 2003), хотя все еще уменьшают транскрипцию единичные и двойнные мутации первых четырех основ. Мутации, осуществленные на 3' конце РРТ 'РРТ, как правило, имеют более сильное воздействие (см., например, Ро\\е11 е! а1., 1. Уио1. 70:5288, 1996).
Эти различные подходы, используют неинтегрирующийся векторный геном по отдельности или в комбинации. Использование более одного подхода могут быть использованы для создания отказоустойчивых векторов через избыточные механизмы. Таким образом, РРТ мутации или делеции могут быть объединены с АТТ сайтами мутации или делеции или мутации интегразы или РРТ мутации или делеции могут быть объединены с обеими АТТ сайтами мутации или делеции и мутации интегразы. Аналогично, АТТ сайты мутации или делеции и мутации интегразы могут быть объединены друг с другом или с РРТ мутации или делеции.
- 31 027236
Как здесь описано, лентивирусные векторные конструкции содержат промотор для экспрессии в клетках млекопитающих. Промоторы, которые обсуждаются более подробно в данном описании, включают, например, человеческий промотор убиквитина С (ИЫС), ранний промотор цитомегаловируса (СМУ) и промоторы вируса саркомы Рауса (К8У). И3 область может содержать РРТ (полипуриновый тракт) непосредственно перед последовательностью. В некоторых конкретных вариантах осуществления любой по меньшей мере из трех различных И3 областей (в 3'-конце) может быть включен в лентивирусный вектор (см. 8Е0 ГО N0: 21-23). Конструкты содержат делеции в И3 области. δΙΝ конструкция имеет удаление около 130 нуклеотидов в И3 (см., например, М1уокЫ, еГ а1. 1. Упо1. 72: 8150, 1998; Υυ еГ а1., Ргос. №Г1. Асаб. δα. И8А, 83: 3194, 1986), который удаляет ТАТА Ьох, таким образом отменяя активность ЬТК промотра. Делеции в конструкции 703 и 704 увеличивают экспрессию лентивирусных векторов (см., например, Вауег еГ а1., Мо1. Тйегару 16:1968, 2008). Кроме того, конструкция 704 содержит делецию 3'РРТ, которая уменьшает интеграцию вектора (см., например, \УО 2009/076524). См. также патент США № 12/842609 и международную заявку на патент \УО 2011/011584 (международную заявку на патент РСТ/и§10/042870), каждый из которых включен в качестве ссылки в полном объеме.
Последовательности, регулирующие экспрессию.
Как описано в данном описании, рекомбинантный вектор экспрессии содержит по меньшей мере одну последовательность, регулирующую экспрессию. В некоторых вариантах осуществления рекомбинантный вектор экспрессии содержит вирусный геномный вектор экспрессии, по меньшей мере один иммуноген, желательно, в частности, клетки-мишени. Как правило, например, лентивирусный вектор содержит полинуклеотидную последовательностями, кодирующую иммуноген, расположенный между 5'-ЬТК и 3'-последовательности ЬТК. Кроме того, кодирование нуклеотидной последовательности(тей) предпочтительно функционально связано в функциональной связи с другими генетическими или регуляторными последовательностями или функциями, например, регулирующие транскрипцию последовательности, включающие промоторы или энхансеры, которые регулируют экспрессию иммуногена определенным образом. В некоторых случаях полезно регулирующими транскрипцию последовательностями являются, последовательности, которые строго регулируются по отношению к активности как во времени, так и в пространстве. Контролирующие экспрессию элементы, которые могут быть использованы для регуляции экспрессии кодируемых полипептидов, известны в данной области техники и включают, но не ограничиваются ими, индуцируемые промоторы, конститутивные промоторы, сигналы секреции, энхансеры и другие регуляторные последовательности.
Полинуклеотид, кодирующий иммуноген и любую другую экспрессирующую последовательность, обычно находится в функциональной связи с внутренними промоторами/энхансерами регуляторных последовательностей. Что касается лентивирусных векторных конструкций, внутренним промотор/энхансером является тот, который расположен между 5'-ЬТК и 3'-ЬТК-последовательности в вирусный вектор и функционально связан с кодирующим интересующим полинуклеотидом. Внутренний промотор/энхансер может быть любым промотором, энхансером или промотор/энхансер, сочетание которых известны, увеличивают экспрессию гена, с которыми она находится в функциональной связи. Функциональная зависимость и функционально связанный означает, помимо прочего, что последовательности в правильном местоположении и ориентации по отношению к промотору и/или усиление таким образом, что последовательность должна быть выражена, когда промотор и/или энхансер приводят в контакт с соответствующими молекулами.
Выбор внутреннего промотора/энхансера проводится на основе желаемой экспрессии иммуногена и специфических свойств известных промоторов/энхансеров.
Таким образом, внутренний промотор может быть конститутивно активным. Неограничивающие примеры конститутивных промоторов, которые могут быть использованы, включают промотор убиквитина (см., например, патент США 5510474; \УО 98/32869); СМУ (см., например, ТНоткеп еГ а1., Ргос. №Г1. Асаб. δα. И8А, 81:659, 1984; υ.δ. РаГепГ №. 5168062); бета-актина (Оиптпд еГ а1. 1989 Ргос. №б. Асаб. δα. υδΛ, 84:4831-4835); и рдк (см., например, Абга еГ а1. 1987 Оепе 60:65-74; 8шдег-8ат еГ а1. 1984 Оепе 32:409-417; и ОоЬкоп еГ а1. 1982 №с1ею Аабк Кек. 10:2635-2637).
Кроме того, промотор может быть тканеспецифическим промотором. В некоторых вариантах осуществления промотор представляет собой специфический к клетке-мишени промотор. Например, промотор может быть выбранным из любого продукта, экспрессирующего дендритные клетки, в том числе СЭ11с, СШ0А ТЬКк, ПС-δΙΟΝ, ВВСА-3, ВЕС-205, ВС1К2, рецептор мананазы, ВесГш-1, С1ес9А, МНС класса II. Кроме того, промоторы могут быть выбраны для обеспечения индуцируемой экспрессии иммуногена. Количество систем для индуцируемой экспрессии, известны в данной области техники, в том числе чувствительные к тетрациклину системы, 1ас оператор-репрессорной системы, а также промоторы, реагирующие на различные экологические или физиологические изменения, в том числе тепловой шок, ионы металлов, таких как металлотионеиновый промотор, интерфероны, гипоксии, стероиды, такие как прогестерон или глюкокортикоидный рецепторный промотор радиации, такой как промотор УЕОР. Сочетание промоторов может быть также использовано для получения желаемой экспрессии каждой иммуногенной последовательности, кодирующие полинуклеотид. Специалисту в данной области выбор промотора должен быть очевидным на основе желаемой паттерн экспрессии полинуклеотидных последова- 32 027236 тельностей в организме или клетке-мишени, представляющих интерес.
Рекомбинантный вектор экспрессии, в том числе вирусный геномный вектор, может содержать по меньшей мере одну РНК-полимеразу II или III, реагирующую промотором. Этот промотор может быть функционально связан с этим полинуклеотидом представляющей интерес последовательностью, а также может быть связан с концом последовательности. Кроме того, более чем одна РНК-полимераза II или III может быть включена в промотор. РНК-полимеразные II и III промоторы хорошо известны специалистам в данной области техники. Подходящий диапазон РНК-полимеразных III промоторов можно найти, например, в Раи1е и \У1Ше, №с1ею Ашйк Кек., №1. 28, р. 1283-1298 (2000). РНК-полимеразный II или III промотор включают также любой синтетический или генно сконструированный ДНК фрагмент, который может направить РНК-полимеразы II или III, приведенные ниже, РНК кодирующие последовательности. Кроме того, РНК-полимеразный II или III (Ро1 II или III) промотор или промоторы используются как часть вирусного геномного вектора могут быть индуцируемыми. Любой подходящий индуцибельный Ро1 II или III промотор может быть использован с методами, описанными в данном документе. Особенно подходящие Ро1 II или III промоторы включают промоторы, тетрациклина, представлены в ОЬкауа и Така, Нитап Оепе ТЬегару, 11:577-585 (2000) и в Меккпег е! а1., №с1ею Ашйк Кек., 29:1672-1682(2001).
Внутренний усилитель может также присутствовать в рекомбинантном векторе экспрессии, в том числе вирусном геномном векторе, для увеличения экспрессии полинуклеотидных последовательностей, представляющих интерес. Например, СМV энхансер (см., например, ВокЬаЛ е! а1., Се11 41:521, 1985) может быть использован во многих усилителях в вирусных генах, таких как НА СМV, и геномы млекопитающих были идентифицированы и охарактеризованы (см., например, публично доступных базах данных, таких как ОепВапк). Усилитель может быть использован в сочетании с гетерологичным промотором. Специалист в данной области техники сможет выбрать соответствующий усилитель на основе желаемой экспрессии.
При ориентации доставки рекомбинантного вектора экспрессии, в том числе вирусного геномного вектора, в частности клетки-мишени, геномный вектор обычно содержит промотор, который распознается клеткой-мишенью и который функционально связан с последовательностью представляющей интерес, вирусными компонентами (когда вектор представляет собой вирусный вектор), а также другими последовательностями, описанными здесь. Промотор представляет собой элемент, контролирующий экспрессию образованную последовательностью нуклеиновой кислоты, которая позволяет связывание РНКполимеразы и происходящую транскрипцию. Промоторы могут быть индуцируемыми, конститутивными, временно активными или тканеспецифическими. Индуцирующие активность промоторы индуцированы наличием или отсутствием биотических или абиотических факторов. Индуцируемые промоторы могут быть полезными инструментами в области генной инженерии, так как экспрессия генов, с которыми они функционально связаны, может быть включена или выключена на определенных стадиях развития организма, его производства, или в конкретной ткани. Индуцируемые промоторы могут быть сгруппированы как химически регулируемые промоторы и физически регулируемые промоторы. Типичные химически регулируемые промоторы включают алкоголь регулируемые промоторы (например, алкогольдегидрогеназы I (АЬСА) промоторного гена), тетрациклин-регулируемые промоторы, стероидрегулируемые промоторы (например, крысиный глюкокортикоидный рецептор (ОК) на основе промотора человеческого рецептора эстрогена (ΕΚ) на основе промотора мотылькового экдизонного рецептора в основе промотора, и промоторы на основе стероидов/ретиноидов/рецепторов щитовидной железы семянников), металл-регулируемых промоторов (например, металлотионеина ген-основаного промотора) и связанные с патогенезом промоторов (например, АгаЫйорык и т;и/е патоген-связанных (РК) промоторов на основе белков) и др. Типичные физически регулируемые промоторы включают, но не ограничиваются ими, промоторы с регулируемой температурой (например, промоторы теплового шока), и промоторы свет-регулируемые (например, промотор сои 88И). Другие типичные промоторы описаны в другом месте, например в патентах и опубликованных патентных заявках, которые могут быть найдены при поиске по базах данных патентов и товарных знаков США.
Специалист в данной области техники сможет выбрать соответствующий промотор на основе конкретных условий. Много различных промоторов, которые хорошо известны в данной области техники, как и способы функционального связывания промотора полинуклеотидной последовательности, подлежащей экспрессии. Обе нативные последовательности промотора и многие гетерологичные промоторы могут быть использованы для направления экспрессии в клетки укладки и клетки-мишени. Гетерологичные промоторы обычно используется, потому что они обычно обеспечивают повышенную транскрипцию и более высокие выходы целевого белка по сравнению с нативным промотором.
Промотор может быть получен, например, из геномов вирусов, таких как вирус папиломы, вирус оспы кур, аденовирус, вирус бычьей папилломы, вируса саркомы птиц, цитомегаловирус, ретровирус, вирус гепатита В, и 8ίιηί;πι Щгик 40 (8ν40). Промотор может быть получен, например из, млекопитающих, гетерологичного промотора, например, промотор актина или иммуноглобулина, промотор теплового шока, промотор или промоторы, обычно связанные с нативной последовательностью при условии, что такие промоторы совместимы с клеткой-мишенью. В одном варианте осуществления промотор представляет собой естественный вирусный промотор в вирусной системе экспрессии. В некоторых вариан- 33 027236 тах осуществления промотор представляет собой дендритный клеткоспецифический промотор. Дендритный клеткоспецифический промотор может быть, например, СИ11с промотором.
Транскрипция может быть увеличена путем вставки последовательности энхансера в вектор(ы). Усилители, как правило, цис-действующие элементы ДНК, обычно примерно от 10 до 300 пар оснований в длину, которые действуют на промотор, увеличивая его транскрипцию. Многие последовательности энхансера в настоящее время известны из генов млекопитающих (глобина, эластазы, альбумина, альфафетопротена и инсулина) и эукариотических клеточных вирусов. Примеры включают энхансер 8У40 на поздней стороне источника репликации (100-270 пар оснований), энхансер раннего промотора цитомегаловируса, энхансер полиомы на поздней стороне источника репликации, аденовирусы и усилители. Усилитель может быть соединен с вектором в положении 5' или 3' антиген-специфической последовательности полинуклеотида, но предпочтительно расположен на участке 5' промотора.
Экспрессирующие векторы также могут содержать последовательности, необходимые для терминации транскрипции и для стабилизации мРНК. Эти последовательности часто встречаются в 5'- и иногда 3'-нетранслируемых областях эукариотических или вирусных ДНК или кДНК и хорошо известны в данной области.
Рекомбинантный вектор экспрессии в том числе включает вирусный генный вектор, который также может содержать дополнительные генетические элементы. Типы элементов, которые могут быть включены в конструкции, не ограничены каким-либо образом и могут быть выбраны для достижения конкретного результата. Например, сигнал, который облегчает ядерный ввод рекомбинантного экспрессирующего вектора или гена вируса в клетку-мишень, также может быть включенным. Примером такого сигнала НГУ-1 является клапан сигнала. Могут быть включены дополнительные регуляторные последовательности, которые облегчают характеристики сайта провирусной интеграции в клетки-мишени. В конструкцию может быть включена, например, янтарная последовательность супрессорной тРНК. Инсулятор последовательности, например, из куриного β-глобина также может быть включен в конструкцию вирусного генома. Этот элемент уменьшает шанс затихания провируса, интегрированного в клеткумишень, за счет метилирования и гетерохроматирования. Кроме того, инсулятор может экранировать внутренние энхансеры, промоторы и экзогенные полинуклеотидные последовательности с положительным или отрицательным позиционным эффектом от окружающих ДНК на сайт интеграции в хромосому. Кроме того, рекомбинантная конструкция, в том числе геномный вектор, может содержать один или более генетических элементов, предназначенных для усиления экспрессии интересующего гена. В конструкцию может быть помещен, например, реактивный элемент (^КЕ) вируса гепатита сурка (см., например, ΖиГГс^су с! а1. 1999. 1. У1то1. 74:3668-81; Исд1оп с! а1., 2000. Нит. Сспс ТЕсг. 11:179-90).
Когда рекомбинантный экспрессирующий вектор является вирусным генным вектором, вирусный геномный вектор, как правило, построен в форме плазмиды, которая может быть трансфицирована в упаковке или в виде продуцирующей клеточной линии для производства конструкции вирусного генного вектора. Плазмида обычно содержит последовательности, полезные для репликации плазмиды в бактериях. Такие плазмиды хорошо известны в данной области. Кроме того, векторы, которые включают прокариотическое начало репликации, могут также включать ген, экспрессия которого дает детектируемый или селектируемый маркер, такой как маркер лекарственной устойчивости. Типичными бактериальными продуктами лекарственной устойчивости являются те, которые придают устойчивость к ампициллину или тетрациклину.
В определенных конфигурациях рекомбинантные экспрессирующие векторы содержат полинуклеотидные последовательности, которые кодируют дендритные клетки (ИС), созревание/стимулирование факторов. Примерами стимулирующих молекул могут быть СМ-С8Р, ^-2, [И-4, [И-6, ^-7, ^-15, ^-21, ^-23, ЮТа, В7.1, В7.2, 4-1ВВ, СЭ40 лиганд (СО40Ь), лекарство-индуцибельный СЭ40 (ίί.Ό40) и т.п. Эти полинуклеотиды, как правило, находятся под контролем одного или более регуляторных элементов, которые направляют экспрессию кодирующих последовательностей в дендритных клетках. В некоторых других конкретных вариантах осуществления рекомбинантный вектор экспрессии включает нуклеотидную последовательность, которая кодирует как иммуноген и СМ-С8Р. Созревание дендритных клеток способствует их успешной вакцинации (см., например, ВапсЕсгсаи с! а1., №·ιΙ. Ксу. Iттиηо1. 5:296-306 (2005); 8сЕи1сг с! а1., Сигг. Орт. Iттиηо1. 15:138-147 (2003); Р^аог с! а1., N3!. Мса. 10:475-480 (2004). Созревание может превратить ДК клетки, активно участвующие в захвате антигена, в клетки специализированые для Т-клеточной основы. Например, взаимодействие СЭ40, СИ40Ь на СИ4-Т-хелперных является критическим для созревания сигнала постоянного тока, при мощной активации СИ8+ Т-клеток. Такие стимулирующие молекулы также упоминаются как созревание фактора или факторов, стимулирующих созревание. Иммунные контрольно-пропускные пункты представляют значительные препятствия для активации функционального клеточного иммунитета при раке, и антагонистические антитела, специфичное ингибирующие лиганды на Т-клетки, в том числе СТЬА4 и запрограммированной смертности1 (РИ-1), являются примерами целевых агентов, оценивающихся в клиниках.
Важным механизмом толерантности при хронических инфекциях и раке являются функциональные антиген-специфические Т-клетки истощения, которые экспрессируют высокие уровни РИ-1. Как потен- 34 027236 циал терапевтической иммунизации было показано, возможность значительно улучшить путем комбинации с иммунным пропускным пунктом, в качестве не ограничивающего примера, специалистами в данной области может быть оценено, что альтернативный подход ингибирования иммунных пропускных пунктов заключается в ингибировании экспрессии запрограммированной смертности (РО) лигандов один и два (РП-Ь1/Ь2). Одним из способов реализации ингибирования экспрессии молекул РНК, таких какие описаны здесь, которые подавляют экспрессию РП-Ь1/Ь2 в ДК трансдуцированных вирусным векторным геномом, например геномным вектором лентивирусов, кодирующим одну или более соответствующих молекул. Созревание ДК или экспрессия отдельных элементов, таких как иммунные пропускные пункты, например РЭ-1 лиганды, может быть охарактеризовано с помощью анализа проточной цитометрии, повышающей регуляцию поверхностного маркера, такого как МНС ΙΙ, а также путем повышения экспрессии хемокина и цитокина, например, путем выполнения способов и методов, описанных здесь.
Последовательности, кодирующие детектируемый продукт, обычно белок, могут быть включены для обеспечения идентификации клеток, которые экспрессируют желаемый иммуноген. Например, флуоресцент, такой как зеленый флуоресцентный белок (ОГР), включен в рекомбинантную экспрессионную конструкцию вместе с полинуклеотидной последовательностью, представляющую интерес (например, кодирование по меньшей мере одного иммуногена). В других случаях белок может быть обнаружен путем использования антитела или белка, который может быть ферментом, который действует на подложке для получения детектируемого продукта, или может быть белковым продуктом, что дает возможность выбора трансфицирования или трансдуцирования клетки-мишени, например, придает устойчивость к лекарственному средству, например устойчивость к гигромицину. Типичные гены селекции кодируют белки, которые придают устойчивость к антибиотикам или другим токсинам, подходят для использования в эукариотических клетках, например неомицина, метотрексата бластицитидин, среди других известных в данной области, или дополнительно ауксотрофные дефициты, или снабжают необходимыми питательными веществами из средств, известных в уровне техники. Селектируемый маркер может дополнительно присутствовать на отдельной плазмиде и введен котрансфекцией.
В отношении векторных частиц, описанных здесь, может быть использована одна или более мультицистронная единица, включающая две или больше нуклеотидные последовательности, кодирующие иммуноген, и последовательности, кодирующие оболочку молекулы, как описано здесь, один или больше факторов созревания ОС, необходимых для нужной векторной частицы в клетке. Использование мультицистронных векторов уменьшает общее число необходимых молекул нуклеиновой кислоты и дает возможность избежать возможных трудностей, связанных с координацией экспрессии из нескольких векторных генов. В мультицистронных векторах различные элементы должны быть выражены функционально связанными с одним или несколькими промоторами (и другие элементы регуляции экспрессии в случае необходимости). В некоторых конфигурациях мультицистронный вектор содержит последовательность, кодирующую по меньшей мере один иммуноген (например, один или более), представляющие интерес, последовательности, кодирующие репортерный продукт, и последовательность, кодирующая один или более компонентов вектора частицы. В некоторых вариантах осуществления, в которых рекомбинантная конструкция содержит полинуклеотид, который кодирует иммуноген, конструкция необязательно кодирует фактор ОС созревания. В некоторых других вариантах мультицистронный вектор содержит последовательности полинуклеотидов, которые кодируют каждый из иммуногенов, коэффициент ОС созревания и, необязательно, вирусные компоненты при экспрессии вектора, являющиеся вирусным вектором экспрессии. В других вариантах мультицистронные векторы являются векторами прямой экспрессии и кодируют по меньшей мере два или более.
Каждый компонент для экспрессии в мультицистронном экспрессивном векторе может быть разделены, например, с помощью внутреннего входа рибосом (ΙΡΕδ) элемента или вирусного элемента 2А, чтобы позволить отдельные экспрессии различных белков из того же промотора. ΙΡΕδ элементы и 2А элементы известны в данной области (см., например, патент США 4937190; йе Ьейре е1 а1. 2004. ТгаГПс 5: 616-626). В одном варианте осуществления олигонуклеотид есть последовательность фуринового сайта расщепления (КАКК) (см., например, ?ап§ е1 а1. 2005 Вю1ес1т 23: 584-590), связанного с 2Аподобной последовательностью с вирусом ящура (ΤΜΌν); вируса А ринита лошадей (ΕКΑV) и тетравироидного вируса (ТаХ) (см., например, δζутсζак е1 а1. 2004 №к Вю1ес1то1. 22: 589-594), использующегося для разделения генетических элементов в мультицистронном векторе. Эффективность конкретного мультицистронного вектора может быть легко протестирована на обнаружение экспрессии каждого из генов с использованием стандартных методик.
В конкретном примере вирусного генома вектор содержит цитомегаловирус (СМУ), энхансерную/промоторную последовательности, К и И5 последовательности из ΗΙν 5'-ЬТК; последовательности оболочки (ψ), ΗΙν-1 клапан сигнал; внутренний усилитель; внутренний промотор гена; реактивный элемент вируса гепатита сурка; последовательность янтарного супрессора тРНК; И3 элемент с делецией последовательности его энхансера; куриного Р-глобина инсулятора, и К и И5 последовательности ΗΙν-3' ЬТК. В некоторых примерах, векторный геном включает лентивирус интактный 5 'ЬТК и самостоятельно инактивированный 3' ЬТК (см., например, руакита е1 а1. У1то1о§у 15:120, 1999).
- 35 027236
Конструкт векторного генома может быть осуществлен с использованием любых подходящих методов генной инженерии, известных в данной области, включая, без ограничений, стандартные методы: рестрикция эндонуклеаз пищеварения, легирование, трансформацию плазмидой, очистку и секвенирование ДНК, например, как описано в §атЬгоок е! а1. (1989 апб 2001 ебЫопк; Мо1еси1аг С1отп§: А ЬаЬога!огу Мапиа1, Со1б 8ргтд НагЬог ЬаЬога!огу Ргекк, ΝΥ); СоГПп е! а1. (Ре!гоу1гикек. Со1б 8ргтд НагЬог ЬаЬога!огу Ргекк, Ν.Υ. (1997)) и РNА УЬикек: А РгасЬса1 АрргоасЬ (А1ап I. Сапп, Еб., ОхГогб Итуегкйу Ргекк, (2000), каждая из указанных выше, включена здесь в качестве ссылки в полном объеме.
Векторные конструкты для кратковременной экспрессии также могут быть использованы в клетках млекопитающих. Переходная экспрессия включает использование вектора экспрессии, который способен эффективно реплицироваться в клетке-хозяине таким образом, что клетка-хозяин накапливает количество копий вектора экспрессии и производит высокий уровень синтеза полипептида, кодируемого иммуногенспецифическим полинуклеотидом в векторе экспрессии. См. §атЬгоок е! а1., кирга, р. 16.17-16.22, 1989. Другие векторы и способы, подходящие для адаптации к экспрессии полипептидов, хорошо известны в данной области техники, могут быть легко адаптированы к конкретным условиям.
При использовании представленных здесь учений и знаний в данной области техники квалифицированному специалисту будет понятно, что эффективность конкретной системы экспрессии может быть проверена путем трансфекции клеточной оболочки с вектором, содержащим полинуклеотидную последовательность, кодирующую репортерный белок, и измерения экспрессии с использованием подходящего способа, например путем измерения флуоресценции зеленого флуоресцентного белка. Другие подходящие репортерные гены хорошо известны в данной области.
Рекомбинантный вектор экспрессии, который содержит полинуклеотидную последовательность, которая кодирует иммуноген, может быть использована для производства иммуногена. Рекомбинантный вектор экспрессии включает по меньшей мере одну последовательность, регулирующую экспрессию, такую как промотор или энхансер, которая функционально связана с полинуклеотидом, кодирующим иммуноген. Каждый из векторов экспрессии может быть использован для трансформации, трансдукции или трансфекции подходящей клетки-хозяина для рекомбинантного получения соответствующего иммуногена. Подходящие клетки-хозяева для получения иммуногена включает прокариотические, дрожжевые и клетки высших эукариот (например, СНО и СО8). Иммуноген может быть выделенным из соответствующей клетки-хозяина или из культуры клеток-хозяина с использованием любых различных изоляционных методов (например, фильтрации, диафильтрации, хроматографии (включая аффинную хроматографию, высокоэффективную жидкостную хроматографию) и препаративного электрофореза) известных и обычно практикующихся в уровне техники. В некоторых вариантах осуществления описанные в данном описании изолированные иммуногены затем могут быть приготовлены с фармацевтически приемлемым наполнителем, чтобы обеспечить иммуногенность композиции.
Конкретные способы получения рекомбинантных полипептидов, как правило, хорошо известны и обычно используются. Например, способы молекулярной биологии описаны в §атЬгоок е! а1. (Мо1еси1аг С1отпд, А ЬаЬога!огу Мапиа1, 2пб еб., Со1б 8ргтд НагЬог ЬаЬога!огу, Νον Υо^к, 1989; см., §атЬгоок е! а1., 3гб еб., Со1б 8ргт§ НагЬог ЬаЬога!огу, №ν Υо^к, (2001)). Секвенирование ДНК может быть выполнено, как описано в §апдег е! а1. (Ргос. №И. Асаб. 8ск И8А, 74:5463 (1977) и Атегкйат 1п!ета!юпа1 рю справочнике секвенирования, в том числе улучшение методики секвенирования.
Векторные частицы.
В другом варианте осуществления обеспечиваются векторные частицы. Векторные частицы содержат любой из рекомбинантных экспрессионных векторов, описанных здесь, которые включают полинуклеотидную последовательность, кодирующую по меньшей мере один иммуноген. В некоторых других вариантах осуществления векторная частица содержит рекомбинантные системы экспрессии, которые содержит один рекомбинантный вектор экспрессии (также называемый первым рекомбинантный вектором экспрессии), содержащий полинуклеотидную последовательность, кодирующую по меньшей мере один иммуноген, который индуцирует иммунный ответ. Кроме того, здесь приведены способы доставки полинуклеотида, кодирующего по меньшей мере один иммуноген (как описано здесь) к клетке-мишени. В конкретных вариантах осуществления клетка-мишень представляет иммунные клетки, что являются антиген-представляющими клетками, а в более конкретных вариантах осуществления и как описано здесь, клетка-мишень представляет собой дендритные клетки. Такие способы включают контактирование (т.е. разрешенное взаимодействие) клетки-мишени с транспортным средством, которое обеспечивает полинуклеотид. Как описано здесь, рекомбинантный вектор экспрессии может быть мультицистронным, кодирующим и направляющим экспрессию по меньшей мере двух иммуногенов. В конкретных вариантах осуществления, описанных здесь подробно, способы доставки полинуклеотида включают контактирование клетки путем введения субъекту векторной частицы, которая содержит рекомбинантный вектор экспрессии, содержащий полинуклеотидную последовательность, которая кодирует иммуноген. Векторные частицы, рекомбинантные векторы экспрессии, полинуклеотиды и иммуногены, обсуждаются более подробно в данном документе.
В некоторых вариантах осуществления векторная частица представляет собой частицу вирусного вектора и в других определенных вариантах реализации векторные частицы, полученные из бактерий,
- 36 027236 таких как, например, ЫЧепа шопосуЮдепеу δа1шопе11а 8рр., МусоЬас1егшш Ьоуй, ΕδсНе^^сН^а сой, δΐ^е11а 8рр., и Υе^8^п^а 8рр. (см., например, Ра1ег5оп, δеш^п. 1шшипо1 (2010), 22:183; Ьоеззпег, Ε.^Π Орш. Вю1. ТНег. (2004), 4:157; Оаи6е1, Εxре^ι Кеу. Уассшез (2007), 6:97). Примеры векторных вирусных частиц включают частицы вектора лентивируса, который содержит лентивирусный векторный геном; частицы поксвирусного вектора, которые содержат геном, поксвирусного вектора; частиц вектора вируса коровьей оспы, которая содержит векторный геном вируса коровьей оспы; частиц аденовирусного вектора, который содержит геном аденовирусного вектора; аденовирус-связанных частиц вирусного вектора, который содержит аденовирус-связанный геном вирусного вектора, векторные частицы вируса герпеса, которые содержат векторный геном вируса герпеса (например, вирус простого герпеса Ι или ΙΙ), или частицы вектора альфа-вируса, которые содержат альфа вирусный векторый геном.
В более конкретном варианте осуществления векторные частицы являются лентивирусными частицами, которые содержат векторный геном лентивирусов (который подробно описан выше). Способы и композиции, приведенные здесь, для нацеливания клеток и ориентации дендритных клеток (ДК), в частности с использованием лентивирусных векторных частиц (которые также могут быть названными вирионом лентивирусных частиц) для подачи последовательности, которая кодирует по меньшей мере один иммуноген для РС. Лентивирусные векторные частицы содержат в варианте гликопротеин оболочки, полученный из вируса Синдбис Ε2 и рекомбинантную экспрессионную конструкцию, которая содержит геном, который включает последовательность, представляющую интерес, и, необязательно, другие компоненты. Гликопротеиновый экспозиционный вариант показывает уменьшенное связывание гепаринсульфата по сравнению с гликопротеином из НК, соответствующего штамма вируса Синдбис. Гликопротеин оболочки облегчает инфицированные дендритных клеток лентивирусными векторными частицами. Облегчает инфицирование, как использовано здесь, так же, облегчение трансдукции и относится к роли гликопротеина оболочки, действующего отдельно или в сочетании с другими молекулами, в развитии или усилении опосредованного рецептором ввода псевдотипа ретровируса или лентивирусных частиц в клетки-мишени.
В целом, лентивирусные векторные частицы получают путем клеточной линии, которая содержит один или более плазмидных векторов и/или интегрированных элементов, которые вместе кодируют компоненты, необходимые для получения функциональных векторных частиц. Эти лентивирусные векторные частицы, как правило, не реплицируются, т.е. они способны только на один раунд инфекции. Чаще всего множественные плазмидные векторы или отдельные кассеты экспрессии стабильно интегрированы в хромосому клетки-мишени и используются для разделения различных генетических компонентов, которые генерируют лентивирусные векторные частицы, также могут быть использованы единичные плазмидные векторы, имеющие все лентивирусные компоненты. В одном иллюстративном примере упаковывающиеся клеточные линии трансфицируют одной или более плазмидами, содержащими вирусный геномный вектор, включая ЬТК, цис-действующие последовательности оболочки, а также последовательности, представляющие интерес (т.е. по меньшей мере, нуклеотидную последовательность, кодирующую один иммуноген), по меньшей мере одна плазмида кодирует ферментативный вирус и его структурные компоненты (например, копии и полы) и по меньшей мере одна плазмида кодирует гликопротеин оболочки АгЬоуН'ив. Вирусные частицы протекают через клеточную мембрану и включаются в ядро, которое включает, как правило, геномы, содержащие две РНК-последовательности, представляющие интерес, и гликопротеин оболочки АгЬоуН'ив, предопределенный дендритными клетками. В некоторых вариантах осуществления гликопротеином АгЬоупиз является гликопротеин Ε2 вируса Синдбис, спроектированный, чтобы снизить связывание сульфата гепарина по сравнению с Ε2 от НК эталонного штамма. Он обычно включает по меньшей мере одну аминокислотную замену по сравнению с гликопротеиновой последовательностью НК Ε2. Кроме того, гликопротеины Ε2 могут быть сконструированы для увеличения специфичной ориентации к дендритным клеткам.
Не желая быть привязанными к теории, связывание вирусной частицы на поверхности клеток, как полагают, вызывает эндоцитоз, в результате чего вирус встраивается в эндосомы, вызывая слияние мембран, а также позволяет ядру вируса, выйти в цитозоль. В некоторых вариантах осуществления, использующих интеграцию лентивирусных векторных частиц, после обратной транскрипции и миграции продукта в ядро геном вируса интегрирует в геном клетки-мишени, присоединяя последовательности, представляющие интерес, геному клетки-мишени. Чтобы уменьшить вероятность инсерционного мутагенеза и содействовать временной экспрессии определенного иммуногена (ов), возможно использование вариантов использования без встраивания лентивирусных векторных частиц (т.е. тех, которые не интегрируются в геном клетки-мишени), а вместо этого с различением последовательностей, представляющих интерес, от эписомы. В любом случае зараженные ДК затем экспрессируют последовательности, представляющие интерес (например, иммуноген и необязательно стимулирующие молекулы). Иммуноген может быть обработан дендритными клетками и представлен Т- и В-клетками, которые генерируют антигенспецифический иммунный ответ. Конкретный путь, описанный выше, не требуется при условии, что дендритные клетки способны стимулировать антиген-специфический иммунный ответ.
Вирусные частицы могут быть введены субъекту в виде иммуногенной композиции, описанной здесь, чтобы обеспечить профилактический или терапевтический эффект. После инфицирования денд- 37 027236 ритных клеток и экспрессии иммуногенного продукта генерируется иммунный ответ продуктов.
Дендритные клетки (ДК), необходимые вспомогательные клетки для инициирования и управления иммунным ответом. ДК может развиваться по двум путям: один путь не зависит от моноцитов, а второй путь является производным от моноцитов (Мо-ЭС8). Моноциты крови, на культуре с ОМ-СЗР и 1Ь-4 приобретают морфологию дендритов и вполне определенный потенциал инициации адаптивного иммунного ответа (см., например, Вепйег е! а1., 1. 1ттипо1. Ме!йой8 196(2):121 (1996); За11и8!о е! а1., 1. Ехр. Мей. 179(4), 1109 (1994), в том числе ш У1уо в человеке (см., например, Эйойаркат, е! а1., 1. Сйп. 1пуе81 104(2), 173 (1999); Зсйи1ег-Тйитег, е! а1., 1. 1ттипо1. 165(6):3492 (2000)). Более эффективный иммуногенный конкретный Т-клеточный ответ может быть достигнут при использовании вакцинной векторной частицы, в частности лентивирусной системы векторных частиц, которые эффективно обеспечивают иммуногены непосредственно к Мо-ЭС-ам ίιτ У1уо, в естественных условиях, без необходимости, исключая ех У1уо культуральные манипуляции. Человеческие Мо-ЭС-ам экспрессируют высокие уровни двух С-типов рецепторов лектина, рецепторов мананазы (ММК) и ЭС-специфичных молекул межклеточной адгезии-3, захватывающих не интегрин (ЭС-ЗЮЦ). Как описано более подробно в данном описании, выраженные иммуногены могут быть направлены на Мо-ЭС с использованием рекомбинантного лентивирусного вектора, спроектированного мишенью ЭС-ЗГОИ
ЭС-ЗЮ^связанная оболочка, ЗVОти, состоящая из сконструированного гликопротеина вируса Синдбис ^ΙΝ), которая селективно связывается ЭС-ЗГСН была изменена, как описано (см. данное описание и к патентной заявке США № 12/842,609; Международной патентной заявке \УО 2011/011584). Лентивирусный вектор индуцирует высокофункциональный СЭ8 Т-клеточный иммунный ответ после однократной иммунизации у мышей (см., например, Эак е! а1., Ргос. №й1. Асай. Зск и.З.А (2009); Υаид, е! а1., №1. Вю1есйпо1. 26(3), 326 (2008)). Этот прототип был значительно прогрессирован двумя основными модификациями. Лентивирусный вектор, описанный здесь, содержит гликопротеин оболочки (называющийся ЗШуат1) на основе родного 8ΙΝ арбовируса известной кожной инфекции ЭС через ^С-ЗIОN рецептор (см., например, Оа^ег, е! а1., 1. νΰΌ1. 74(24), 11849 (2000); Кйт8!та, е! а1., 1. νΐΓθ1. 77(22), 12022 (2003)) который модифицирован для предотвращения связывания с вездесущими рецепторами гепаринсульфата (см., например, Кйт8!та е! а1., 1. νίΐΌ1. 72(9), 7357 (1998)). З1Жаг1 оболочка дает повышение как производительности в естественных условиях, так и функциональности по сравнению с родительскими ЗVОти оболочками. Вектор также избыточно некомпетентно интегрирован, через комбинацию мутированной интегзазы (роЮ64'У), что делает его не функциональным (см., например, Аро1ота, е! а1., Мо1. Тйег. 15(11), 1947 (2007)), и векторная основа удалена из И3 области ЬТК (до а!!) и 3'ЬТК полипуринового тракта (РРТ). Таким образом, в дополнение к неработающим интегразам, композиция, основанная на векторе, предотвращает транскрипцию по всей длине векторного генома (самоинактивирующиеся мутации), в результате одной ЬТК обратной транскрипции эписомной круговой двухцепочечной ДНК в инфицированной ЭС, которые не являются шаблонными для хромосомных интеграций (см., например, Вауег, е! а1., Мо1. Тйег. 16(12):1968 (2008); Вгескро! е! а1., 1. νΰΌ1. (2010); Ма е! а1., Мо1. Тйег. 10(1):139 (2004)). Примерно 75% от родительского генома НА была удалена из ЭС-ΝΙΡν, включая все регуляторные и вспомогательные белки, за исключением Кеу. После одной инъекции ЭС-ΝΙΕν индуцируется высокий уровень антиген-специфичного СЭ8 Т-клеточного ответа на опухоль. Сила лентивирусного вектора зависит по меньшей мере в части от привлечения ТЬК3 и ТЬК7 рецептора распознавания паттернов (см., например, Ве18поп е! а1., 1. νΐΓθ1. (2009); Вгескро! е! а1., см. выше).
Оболочка вирусного вектора.
Передающийся членистоногими вирус (арбовирус) является вирусом, передающимся к хозяину, которым может быть человек, конь или птица, инфицированные от зараженного арбовирусным вектором членистоногого, такого как комар. Арбовирусы, в свою очередь, делятся на подгруппы семейств вирусов, включая и альфа-вирусы, такие как флававирусы, которые имеют гликопротеин из генома одноцепочечной РНК положительной полярности, содержащейся в оболочке. Например, вирус лихорадки Денге, вирус желтой лихорадки и вирус Западного Нила принадлежащие семейству флавивирусов, и вирус Синдбис, вирус леса Семлики и вирус Венесуэльского конского энцефалита, являющиеся членами семейства альфа-вирусов (см., например, ^апд е! а1., 1. νίΐΌ1. 66, 4992 (1992)). Оболочка вируса Синдбис включает два трансмембранных гликопротеина (см., например, Микйораййуау е! а1. №Ииге Кеу. МютоЬюк 3, 13 (2005)): Е1, который считается ответственным за слияние, и Е2, который считается ответственным за связывание клеток. Гликопротеин оболочки вируса Синдбис является известным псевдотипом других ретровирусов, в том числе онкоретровирусов и лентивирусов.
Как показано в данном описании, гликопротеин оболочки арбовируса может быть использован для псевдотипирования геномного вектора на основе лентивируса. Псевдотип лентивируса - это лентивирус, имеющий один или больше гликопротеинов оболочки, кодирующий отдельный геном лентивирусов. Гликопротеин оболочки может быть модифицированным, мутантным или сконструированным, как описано здесь.
Оболочка вируса Синдбис и другие альфа-вирусы включают в липидный бислой мембраны вирусной частицы и обычно включают в себя множество копий двух гликопротеинов, Е1, Е2. Каждый гликопротеин имеет трансмембранный регион; Е2 имеет около 33 остатков цитоплазматических доменов, в то
- 38 027236 время как цитоплазматический хвост Е1 очень короткий (около 2 остатков). Оба Е1 и Е2 имеют пальмитиновую кислоту или подобные трансмембранные регионы. Е2 сначала синтезируется в виде белкапредшественника, который расщепляется пурином или другими Са2+-протеиназами серина в Е2 и небольшим гликопротеином, называемым Е3. Расположенный между последовательностями, кодирующими Е2 и Е1, представляющие собой последовательности, кодирующие белок, называемый 6К. Е3 и 6К являются сигнальными последовательностями, которые служат, чтобы перемещать в мембране Е2 и Е1 гликопротеины соответственно. В геноме вируса Синдбис кодирующая область оболочки вируса Синдбис включает в себя белковые последовательности, кодирующие Е3, Е2, 6К и Е1. Используемый здесь термин оболочка из арбовирусов включает по меньшей мере Е2, и может также включать Е1, 6К и Е3. Примерная последовательность гликопротеина оболочки вируса Синдбис, штамм НК, представлена в ЗЕО ГО NО:17. В некоторых конкретных вариантах осуществления гликопротеины Е3/Е2 альтернативные, где Е3 последовательность соответствует остаткам 1-65 из ЗЕО ГО NО: 20 или ее варианта и где остатки 62-65 являются КЗКК (ЗЕО ГО NО: 27), с возможностью быть включенным в псевдотип вирусной оболочки. Последовательности гликопротеинов оболочки для других арбовирусов можно найти в общедоступных базах данных, таких как СеиВаик. Например, последовательность, кодирующая гликопротеин вируса Денге, может быть найденной под номером СО252677.1 (в частности, СеиВаик), а также в базе данных изменения вируса на NСВI (приложение СеиВаик и вирусные базы без изменения включены в качестве ссылки для последовательностей гликопротеинов оболочки) и примерную последовательность гликопротеина оболочки, кодирующую Венесуэльский конский энцефалит в приложении №_040824.1 (в качестве ссылки для последовательностей гликопротеинов оболочки).
Хотя клеточный рецептор(ы) на дендритных клетках для альфа-вирусов и вируса Синдбис, в частности, не был окончательно определенным на сегодняшний день, одним рецептором, обозначенным ЭС-δΙΟΝ (см., например, Кйтз!га е! а1., I. Уио1. 77:12022, 2003). Термины присоединение, связывание, ориентация и т.п. используются взаимозаменяемо и не предназначены, чтобы указать механизм взаимодействия между гликопротеином вирусной оболочки вируса Синдбис вируса и клеточным компонентом. ЭС-δΙΟΝ (дендритные клетки, специфические 1САМ-3 (внутриклеточные молекулы адгезии 3)захватывающие нонинтегрин; также известны как СГО209) С-тип лектин-подобных рецепторов, способных к быстрому связыванию и эндоцитозу материала (см., например, Сеу!еиЬеек е! а1. Аиии. Кеу. 1ттиио1. 22:33-54, 2004). Е2 вирус-мишени, кажется, попадает в дендритные клетки через ЭС-ЗЮК как показано здесь, клетки, экспрессирующие ΏΟ-δΙΟΝ, преобразованные вирусными векторными частицами с Е2 псевдотипом вируса Синдбис, лучше (по меньшей мере в 2 раза, по меньшей мере в 3 раза, по меньшей мере в 4 раза, по меньшей мере в 5 раз, по меньшей мере в 6 раз, по меньшей мере в 7 раз, по меньшей мере в 8 раз, по меньшей мере в 9 раз или, по меньшей мере в 10 раз лучше), чем изогенные клетки, которые не экспрессируют ЭС-δΙΟΝ. Механизм того, как гликопротеин Е2, облегченный вирусными инфекциями, по-видимому, включает ПС-δΙΟΝ, возможно путем прямого связывания для ОС-δΙΟΝ или приводит к изменению конформации или некоторых других механизмов. Независимо от фактического механизма, нацеленного на Е2, является предпочтительным для клеток, экспрессирующих ПС-δΙΟΝ, а именно дендритных клеток.
Синдбис вирус также связывается с клетками через гепаринсульфат (см., например, Кйтз!га е! а1., I. У1го1. 72:7357, 1998; Вигтез е! а1., I. Уио1. 72: 7349, 1998). Поскольку гепаринсульфат и другие гликозаминогликаны поверхности клетки находятся на поверхности большинства типов клеток, желательно уменьшить взаимодействие между гепаринсульфатом и гликопротеинами оболочки вируса Синдбис. Это может быть достигнуто путем уменьшения связывания оболочки вируса Синдбис в гепарин сульфат или увеличения связывания, например, увеличение авидности, из оболочки вируса Синдбис в дендритные клетки или их обоих. В результате неспецифического связывания с другими молекулами, которое может быть выражено другими типами клеток и которое может произойти, даже если оболочка является специфической для ОС-δΙΟΝ, уменьшается и улучшается специфичность, может служить для избежания нежелательных побочных эффектов, таких как побочные эффекты, которые могут уменьшить желаемый иммунный ответ, или побочные эффекты, связанные, в частности, с трансдукцией клеток других типов. Альтернативно или в дополнение к преимуществам относительно конкретной трансдукции клеток, экспрессирующих ОС-δΙΟΝ, вирусные частицы псевдотипа гликопротеина Е2 с оболочки вируса Синдбис могут предложить другие преимущества по сравнению с гликопротеином вирусных частиц псевдотипа, такого как УЗУ-С. Примеры такого преимущества включают снижение опосредованного комплиментом лизиса и/или пониженной ориентацией нервной клетки, оба из которых, как полагается, чтобы связать с введением УЗУ-С псевдотипизированных вирусных частиц.
В различных примерах векторные частицы лентивируса специфически связываются с клетками, экспрессирующими ^С-ЗIСN и сокращающими или отменяющими привязку к гепаринсульфату. Таким образом, гликопротеин Е2 оболочки вируса Синдбис может быть модифицированным для предпочтительно направленных дендритных клеток вируса, которые экспрессируют ^С-ЗIСN по сравнению с другими типами клеток. На основе информации, полученной от структурных исследований и молекулярного моделирования среди других исследований, вариантные последовательности оболочки белков, особенно гликопротеины Е2 и Е1, разработаны и генерируются так, чтобы гликопротеины поддержали свои функ- 39 027236 ции как белки оболочки, но имели желаемую специфичность связывания, авидность или уровень связывания. Последовательность кандидатов вариантов может быть созданной для каждого гликопротеина и анализироваться с использованием методов, описанных ниже, или другими методами, известными в данной области, для определения гликопротеинов оболочки с наиболее желательными характеристиками.
Некоторые последовательности Е2 варианта вируса Синдбис имеют по меньшей мере одну измененную аминокислоту в положении остатка 160, по сравнению с §ЕО ГО ΝΟ: 1. Делецию или замену на аминокислоту, отличную от глутаминовой кислоты. Изменение является наиболее часто замещающимся по меньшей мере одной аминокислотой, но, альтернативно, может быть добавлена или удалена одна или более аминокислот. Предпочтительно любые дополнительные аминокислоты немногочисленны и не содержат антигенный эпитоп (например, последовательность гемагглютинин !ад), которая может скомпрометировать безопасность. При наличии двух или более изменений они оба могут быть того же типа (например, замещение) или различных типов (например, замена и удаление). Множественные изменения могут быть рассеянными или расположенными рядом в последовательности белка.
В порядке примера, варианты последовательности содержат по меньшей мере одну измененную аминокислоту в положении примерно от 50 до примерно 180 остатков §ЕО ГО ΝΟ: 1. В пределах этой области являются аминокислоты, которые участвуют с привязкой к гепаринсульфату. При снижении положительного заряда Е2 электростатическое взаимодействие с гепаринсульфатом может быть уменьшено, что приводит к снижению связывания гепаринсульфата. Кандидат положительно заряженных аминокислот в этой области включает лизин в остатках 63, 70, 76, 84, 97, 104, 129, 131, 133, 139, 148, 149, 159 и аргинин в остатках 65, 92, 128, 137, 157, 170, 172 (см., например, Веаг е! а1., Уио1оду, 347:183-190, 2006) (см., §ЕО ГО ΝΟ:1). По меньшей мере, некоторые из этих аминокислот непосредственно вовлечены в связывание с Е2 гепаринсульфата. Чистый положительный заряд может быть уменьшен путем удаления лизина или аргинина или замены лизина или аргинина на нейтральную или отрицательно заряженную аминокислоту. Например, один или более из этих остатков лизина и аргинина может быть заменен глутаминовой или аспарагиновой кислотой. Некоторые варианты имеют по меньшей мере одну замену лизина в положении 70, 76 или 159. Примеры аминокислотных последовательностей гликопротеина Е2 изложены в §ЕО ГО ΝΟ: 3-16. В тех случаях, где Е2 выражается в виде полипротеина с Е3, лизин расположен рядом с природным Е3/Е2 сайтом постоянного расщепления, т.е. последовательности узнавания и сайт расщепления не изменяются. С другой стороны, сайт расщепления родной последовательности эндопептидазы заменен на последовательность узнавания другой эндопептидазы.
Некоторые варианты Е2 также изменяются таким образом, что оказывает положительное влияние на связывание с дендритными клетками. Изменения глутаминовой кислоты найдены в остатке 160 в эталонной последовательности НК, могут улучшить связывание с дендритными клетками (см., например, Оагбпег е! а1., I. Уио1. 74, 11849, 2000). Изменения, например делеция остатка 160 или замена остатка 160, находятся в определенных вариантах. В конкретных вариантах осуществляют замену незаряженной аминокислоты на О1и, в других вариантах, некислую аминокислоту заменяют О1и. Как правило, заменяется О1и 160 на одну из небольших или алифатических аминокислот, в том числе глицин, аланин, валин, лейцин или изолейцин.
Другие варианты включают два или более аминокислотных изменения. Как правило, в этих вариантах одно из изменений является О1и 160, а остальные модификации изменения одного или более лизина или аргинина в области, охватывающей остаток примерно до 50, примерно до 180 из §ЕО ГО ΝΟ: 1. Некоторые из вариантов включают изменение О1и 160 на некислые остатки или делеции одного или более изменений лизина 70, лизина 76 или лизина 159 с не основной аминокислотой. Некоторые конкретные варианты включают изменения О1и160 на О1у, Ьук 70 на О1и и Ьук 159 на О1и; О1и 160 на О1у, Ьук 70, 76 и 159 на О1и; делецию О1и 160 и Ьук 70 и 159 на О1и и делецию О1и 160 и Ьук 70, 76 и 159 на О1и (см., например, §ЕО ГО ΝΟ: 3-16).
В некоторых вариантах белок Е2 сначала выражается в виде полипротеина в слиянии, по меньшей мере, с Е3 или в слиянии с лидерной последовательностью. Независимо от того, лидерная последовательность Е3 или иная последовательность, Е2 в вирусной оболочке должен быть свободным от Е3 или другой лидерной последовательности. Другими словами, Е2, предпочтительно не Е3/Е2 слитый белок (например, Е3/Е2 слитый белок называют §УОти). В некоторых вариантах осуществления Е2 выражается как часть Е3-Е2-6К-Е1 полипротеина. Вирус Синдбис естественно синтезирует Е2 как часть полипротеина и связывание для Е3/Е2, Е2/6К, и 6К/Е1 имеет признанную последовательность и расщепленный эндопептид. Как правило, переход Е3/Е2 расщепляется фурино- или фурино-сериновой эндопептидазой между остатками 65 и 66. Фурин имеет специфичность для парных остатков аргинина, которые разделены двумя аминокислотами. Для поддержания Е3/Е2 расщепления фуриновые остатки 62-66 (К§КК§; §ЕО ГО ΝΟ: 26) должны поддерживать два остатка аргинина с двумя аминокислотными разделениями кислоты и остатка серина. Кроме того, различные последовательности расщепления могут быть использованы вместо Е3/Е2 расщепления последовательности фурина или любой другой последовательности расщепления. Распознавание и сайт расщепления могут быть включены для эндопептидазы, в том числе, без ограничения, аспарагиновой эндопептидазы (например, катепсина Ό, химозин, ВИЧ-протеазы), цистеиновой эндопептидазы (бромелин, папаин, калпаин), металоэндопептидазы (например, коллагеназа,
- 40 027236 термолизин), сериновой эндопептидазы (например, химотрипсин, фактор 1Ха, фактор X, тромбин, трипсин), стрептокиназы. Распознавание и сайти расщепления последовательности для ферментов хорошо известны в данной области.
Аминокислоты в Е2, кроме уже упомянутых выше, также могут быть изменены. Как правило, вариант последовательности Е2 будет иметь по меньшей мере 80%-ную идентичность аминокислот к эталонной последовательности Е2 или она может иметь по меньшей мере 82%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 87%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 92,% по меньшей мере 95% или по меньшей мере 98% идентичную последовательность. Варианты гликопротеина должны обладать биологической функциональностью, такой как способность, облегчать инфекции дендритных клеток, имеющие оболочки вирусной частицы содержащие Е2. Эксперименты выявили области оболочки гликопротеинов, которые, как представляется, играют важную роль в различных аспектах сборки вирусных векторов, привязанности к поверхности клеток и инфекциям. При принятии варианта, следующая информация может быть использована в качестве руководства.
Цитоплазматический хвост Е2 - составляет примерно 408 до 415 остатков - это важно для сборки вируса (см., например, УеЧ е1 а1. ί. У1го1. 80: 4458-4468, 2006; включены в полном объеме). Другие области участвуют в формировании вторичной структуры (приблизительно 33-53 остатков), а также участвуют в транспорте и стабильность белка (примерно 86-119 остатков) (см., например, №уага1тага)а11 е1 а1., ί. Уио1. 363:124-147, 2007; включены в полном объеме). Вариант может сохранить гидрофобный характер области, который охватывает мембраны, примерно 370-380 остатков. Вариант может сохранять один или оба Ν-связанных сайтов гликозилирования остатков И1Т (остатки 196-198) и НМТ (остатки 318-320) и может сохранять один или более узлов, пальмитоилированных (С-396, С416 и С417) (см., например, З1гаи55 е1 а1., МюгоЬю1. Кеу. 58, 491-562, 1994; рр. 499-509 включенные в полном объеме). С другой стороны, во многих регионах Е2 могут быть изменения без вредных событий. Например, вставки транспозонов в разные места по-прежнему привели в Е2 жизнеспособный вирус (см., например, №уага1тага_)аЬ, см. выше).
В некоторых вариантах пептидные метки могут быть включены в белки Е3, 6Κ или Е1. Для некоторых целей 1ад может быть включен в Е2, но 1ад не желателен для использования в продуктах для введения пациенту, такому как человек. Тад пептид имеет короткую последовательность (например, 5-30 аминокислот могут быть использованы для облегчения обнаружения экспрессирующей оболочки и ее присутствия в вирусных частицах). Для обнаружения целей последовательности маркеров обычно будут обнаруживать антитела или химические вещества. Другое применение для облегчения очистки вирусных частиц. Субстрат, содержит партнера для 1ад, для поглощения вируса. Элюированный вирус может быть достигнут путем обработки фрагментом, который смещает 1ад из партнера по связыванию, или когда последовательность 1ад в связи с расщеплением последовательности обработки с помощью соответствующей эндопептидазы будет позволять удобному высвобождению вируса (см., например, О1аСЕИ® са1а1од, Еас1ог Ха РгоЮаве ЗуЧет). Удаление пептидной метки обычно желательно в целях безопасности использования вирусных частиц на животных предметах. Если 1ад не удаляется, может произойти иммунный ответ на 1ад.
Подходящие 1ад включают, без ограничения, РЬАС (ΌΎΚΌΌΌΌΚ) (ЗЕЦ ΙΌ ΝΟ: 35) (патент США № 4703004, включенный в полном объеме), для которых коммерчески доступны антитела, хитинсвязывающие белки, белки, связывающие мальтозу, глутатион-З-трансферазу, поли-(Шв) (патент США № 4569794, включенный в полном объеме), тиоредоксин, НА (гемаглютенин)-1ад меток, среди других. Поли-(Шв) может быть адсорбирован на питательную среду, содержащую связанные ионы металлов, таких как никель или кобальт, и элюирован при низком рН среды.
Векторные частицы могут быть оценены для определения специфичности гликопротеинов оболочки, включенных в вирус, заражающий дендритные клетки. Например, смешанная популяция клеток костного мозга может быть получена от субъекта и культивирована ίη νίΙΐΌ. Кроме того, изогенные линии клеток, которые экспрессируют или не экспрессируют ЭС-ЗГОИ, могут быть получены и использованы. Рекомбинантный вирус можно вводить в смешанную популяцию клеток костного мозга или изогенные линии клеток, и экспрессия гена-репортера, включенного в вирус, может проводиться в культуре клеток. Некоторые варианты осуществления могут использовать анализ лимитирующего разведения, в котором смешанная популяция клеток разделена на отдельные части, которые затем инкубируются отдельно при уменьшении количества вируса (например, в 2, в 5, 10 раз меньше вируса в каждой части). В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере 50, или по меньшей мере приблизительно 60, 70, 80 или 90%, или по меньшей мере около 95% инфицированных клеток в смешанной популяции клеток являются дендритными клетками, которые экспрессируют ЭС-ЗГОИ. В некоторых вариантах осуществления соотношение количества инфицированных дендритных клеток и инфицированных недендритных клеток (или не ЭС-ЗЮИ экспрессирующих клеток) составляет по меньшей мере 2:1, по меньшей мере около 3:1, по меньшей мере около 4:1, по меньшей мере около 5:1, по меньшей мере около 6:1, по меньшей мере около 7:1, по меньшей мере около 8:1, по меньшей мере около 9:1, по меньшей мере около 10:1, по меньшей мере около 20:1, по меньшей мере около 30:1, по меньшей мере около 40:1, по меньшей мере около 50:1, по меньшей мере около 100:1, по меньшей мере около 200:1, по меньшей мере около 500:1, по меньшей
- 41 027236 мере около 1000:1, по меньшей мере около 5000:1, по меньшей мере около 10 000:1 или более. Для ограничения разведения большей селективностью, как правило, рассматривается на более высоком разведении (т.е. меньших количествах) входных вирусов.
Активность псевдотипных вирусных частиц может быть определена с помощью любого из разнообразных методов. Например, предпочтительным способом для измерения эффективности инфекции (ΐυ, инфекционных единиц) является введение вирусных частиц в клетки и измерение экспрессии продукта, кодирующегося в векторном геноме. Любой продукт, который может быть проанализирован, может быть использован. Одним из удобных типов продукта является флуоресцентный белок, такой как зеленый флуоресцентный белок (ОРР). Другие продукты, которые могут быть использованы, включают белки, экспрессирующиеся на поверхности клеток (например, обнаружение связанных антител), ферменты и т.п. Если продукт представляет собой антиген и дендритные клетки, инфекционность/активность может быть оценена путем определения иммунного ответа. Кроме того, можно констатировать побочные эффекты у млекопитающих. Возможность определения специально направленных дендритных клеток также может быть проверенной непосредственно, например, в клеточной культуре, как описано ниже.
Векторные частицы, которые включают в себя вирусные частицы, описанные здесь, могут быть также получены и испытаны на их селективность и/или их способность облегчать проникновение через мембраны клетки-мишени. Вирусные частицы, которые имеют оболочку с немодифицированным гликопротеином, могут быть использованы в качестве контроля для сравнения. Вкратце, клетки, экспрессирующие рецептор для оболочки гликопротеина, инфицированы вирусом с помощью стандартного анализа инфекции. После заданного времени, например после 48 ч, инфицированные клетки могут быть собраны и процент клеток, зараженных вирусом, может быть определен с помощью, например, проточной цитометрии. Избирательность может быть засчитанной, вычисляя процент клеток, инфицированных вирусом. Аналогичным образом, эффективные варианты оболочки гликопротеина на вирусный титр могут быть определены количественно путем деления процента клеток, инфицированных вирусом, содержащий вариант оболочки на процент клеток, инфицированных вирусом, содержащий соответствующий дикий тип (немодифицированного) гликопротеина оболочки. Особенно подходящий вариант будет иметь наилучшее сочетание селективности и инфекционных титров. После того как выбран вариант вирусных анализов, концентрации могут быть выполнены, чтобы подтвердить, что эти вирусы могут быть сконцентрированы без ущерба для активности. Вирусные супернатанты собирали и концентрировали с помощью ультрацентрифугирования. Титры вирусов могут быть определены путем ограниченного разведения вирусным маточным раствором инфекционных клеток, экспрессирующих рецептор для гликопротеина оболочки, и измерения экспрессии продукта экспрессирующих вирусов, как описано выше.
Вступление лентивирусной векторной частицы в клетку-мишень - другой тип оценки деятельности. В1аМ-Ург (бета-лактамазы Ург) слитый белок был использован для оценки проникновения вируса ВИЧ1; слияние В1аМ и гликопротеина оболочки вируса Синдбис, такого как Е1 или Е2/Е1 функционального белка, может быть использовано для оценки эффективности белка оболочки в обеспечении синтеза и проникновения в клетку-мишень. Вирусные частицы могут быть получены, например, путем кратковременной трансфекции оболочки клетки с одним или более векторов, содержащих вирусные элементы, В1аМ-Ург, и вариант оболочки, представляющей интерес (и аффинность молекулы, если необходимо). Полученные вирусы могут быть использованы для инфицирования клеток, экспрессирования целевой молекулы (или подобные молекулы) и специфического связывания в отсутствие или в присутствии свободного ингибитора связывания (например, антителом). Клетки затем могут быть промытыми СО2-независимой средой и нагруженными с ССР2 красителем (Аигога Вю8с1епсе8, 8ап О1едо, СА). После инкубации при комнатной температуре для завершения реакции расщепления клетки могут быть зафиксированы путем параформальдегидратации и проанализированы с помощью проточной цитометрии и микроскопии. Присутствие голубой клетки указывает на проникновение вирусов в цитоплазму; уменьшение уровня голубых клеток можно было бы ожидать при добавлении блокирующих антител (см., например, Сауго18 е! а1., Ν;·ιΙ. Вю!есйпо1. 20:1151-54,2002).
Для исследования зависимости проникновения от низкого рН, а также определения гликопротеинов оболочки с желаемой рН зависимостью, ΝΉ4Ο или другое соединение, которые изменяют рН, могут быть добавлены в инфекцию ΝΉ4Ο (нейтрализирует кислотные остатки эндосомы), исчезновение голубых клеток показывает, что проникновение вирусов зависит от низкого рН. Кроме того, чтобы подтвердить, что активность зависит от рН, лизосомотропные агенты, такие как хлорид аммония, хлорохин, контамицин, бафиломицин А1, момензин нигерицина и т.д., могут быть добавлены в инкубационный буфер. Эти агенты увеличивают рН в эндосомных отсеках (см., например, Эго8е е! а1., 1. Ехр. Вю1. 200, 1-8, 1997). Ингибиторный эффект этих агентов будет выявлять роль рН для слияния вируса и его записи. Различная для кинетики запись между вирусами отображается на различных фузогенных молекулах, которые могут быть сравнены и наиболее подходят для конкретного применения.
Запись ПЦР-анализов может быть использована для контроля обратной транскрипции и измерения кинетики синтеза вирусной ДНК, как указание на кинетику проникновения вируса. Так, например, вирусные частицы, содержащие определенную молекулу оболочки белка, инкубируют с клеткамимишенями, такими как клетки 293Т, ДК или любые другие клетки, которые были сконструированы для
- 42 027236 экспрессии или которые в природе экспрессируют соответствующий партнер по связыванию (рецептор) для сгибания белковой молекулы. Либо в это же время, либо через некоторое протяженное время (чтобы позволить инфекции развиваться) удаляют несвязанные вирусы и аликвоты клеток анализируют на присутствие вирусных нуклеиновых кислотах. ДНК экстрагировали из этих аликвот и подвергали амплификационному анализу, обычно полуколичественному анализу связанными ЬТК-специфическими праймерами. Появление ЬТК-специфических продуктов ДНК указывает на успех проникновения вируса.
После вирусной инфекции вектором с вирусной частицей иммуноген экспрессируется дендритными клетками-мишенями. Если присоединенные ех νί\Ό, нацеленные дендритные клетки затем передаются обратно к пациенту, например, путем инъекции, где они взаимодействуют с иммунными клетками, которые способны генерировать иммунный ответ против желаемого антигена. В предпочтительных вариантах осуществления рекомбинантный вирус вводится в организм пациента, где он преобразовывает целевые дендритные клетки. Дендритные клетки затем экспрессируют конкретный антиген, связанный с заболеванием или расстройством, которое лечат, и пациент может установить эффективную иммунную реакцию против заболевания или нарушения.
Вирусный векторный геном может содержать полинуклеотидную последовательность, кодирующую более чем один иммуноген, и после трансдукции нацеленных дендритных клеток генерирует иммунный ответ на иммуноген, каждый из которых доставлен в клетки. В некоторых вариантах осуществления иммуногены связаны с одним заболеванием или расстройством. В других вариантах осуществления иммуногены связаны с множественными заболеваниями или расстройствами.
В некоторых векторных частицах, факторы созревания БС, которые активируют и/или стимулируют созревание, поставляются в сочетании с иммуноген-кодирующей последовательностью, представляющей интерес. В некоторых альтернативных вариантах осуществления ДК активируются доставкой факторов БС созревания до, одновременно с, или после доставки векторных частиц. Факторы созревания ДК могут быть представлены отдельно от регуляции векторных частиц.
Как здесь описано, один или более иммуномодулятор или фактор БС созревания могут быть закодированы одной или несколькими последовательностями, которые содержатся в векторной частице и экспрессируется после входа частицы или заражения дендритных клеток. Последовательности, кодирующие факторы иммунной модуляции, также могут быть включены в отдельный вектор, который трансфицируется совместно векторными частицами, кодирующими один или более иммуногенов в оболочке клеточной линии.
Способы, описанные здесь, могут использоваться для адаптивной иммунотерапии у субъекта. Как описано выше, желательно идентифицировать иммуноген, против которого направлен иммунный ответ. Полинуклеотид, кодирующий нужный иммуноген(ы) получается и упаковывается в векторных частицах. Целевые дендритные клетки, полученные от пациента и трансдуцированные векторными частицами, содержат полинуклеотид, который кодирует желаемый иммуноген. Дендритные клетки затем передаются обратно пациенту.
Векторные частицы (например, вирусные векторные частицы, описанные в данном описании) могут быть введены в живой организм, в котором частицы заражают ДК и доставляют иммуноген, кодирующий нуклеотид, представляющий интерес. Количество вирусных частиц, по меньшей мере 3X106 инфекционных единиц (Ш) и может быть по меньшей мере 1X107 Щ, по меньшей мере 3X107 Щ, по меньшей мере 1X108 Щ, по меньшей мере 3X108 Щ, по меньшей мере 1X109 Щ или по меньшей мере 3X109 Щ. В определенных интервалах ДК из лимфоидных органов реципиента может быть использован для измерения экспрессии, например, путем наблюдения маркеров экспрессии, например, ОРР или люциферазы при совместной экспрессии полинуклеотидной последовательности, присутствующей в рекомбинантном векторе экспрессии, включенной в векторные частицы. Методика мониторинга нуклеиновых кислот и измерения обратной транскриптазной (КТ) активности также может быть использована для анализа биологического распределения векторных частиц, когда векторные частицы представляют собой лентивирусные векторные частицы. Т-клетки из мононуклеарных клеток периферической крови, лимфатических узлов, селезенки или злокачественной или целенаправленно инфицированной векторными частицами патогенной ткани (в том числе лентивирусной векторной частицы), обрабатываемые получателем, могут зависеть от величины и длительность ответа на антигенную стимуляцию. Ткань клеток, отличных доменов, таких как эпителиальные клетки и лимфоидные клетки, может быть проанализирована на специфичность в естественных условиях доставки генов.
Иммунный ответ.
Как описано здесь, способы обеспечены для индукции иммунного ответа на иммуноген. Клетки иммунной системы, которые вовлечены в иммунный ответ, представлены, как правило, в виде иммунных клеток и включают лимфоциты и нелимфоидные клетки, такие как вспомогательные клетки. Лимфоциты являются клетками, которые специфически распознают и реагируют на чужеродные антигены, а вспомогательные клетки - те, которые не являются специфичными для определенных антигенов, но участвуют в распознавании и активации фазы иммунного ответа. Например, мононуклеарные фагоциты (макрофаги), другие лейкоциты (например, гранулоциты, в том числе нейтрофилы, эозинофилы, базофилы) и дендритные клетки действуют в качестве вспомогательных клеток в индукции иммунного ответа. Активация
- 43 027236 лимфоцитов на чужеродный антиген приводит к индукции или извлечению многочисленных эффекторных механизмов, которые функционируют для устранения антигена. Вспомогательные клетки, такие как мононуклеарные фагоциты, которые влияют или связаны с эффекторными механизмами, также называют эффекторными клетками.
Основные классы лимфоцитов включают В-лимфоциты (В-клетки), Т-лимфоциты (Т-клетки) и натуральные киллерные (ΝΚ), которые являются большими гранулированными лимфоцитами. В-клетки способны продуцировать антитела. Т-лимфоциты подразделяются на Т-хелперы (ί'.Ό4' (также называемые здесь и в уровне техники как ί'.Ό4)) и цитолитические или цитотоксические Т-клетки (СЭ8' (также называемые здесь и в уровне техники как СЭ8)). Вспомогательные клетки секретируют цитокины, которые способствуют пролиферации и дифференцировке Т-клеток и других клеток, включая В-клетки и макрофаги, и пополняют и активируют воспалительные лейкоциты. Другая подгруппа Т-клеток, называемых регуляторными Т-клетками или супрессорными Т-клетками, активно подавляет активацию иммунной системы и предотвращает патологические самостоятельные реактивные, т.е. аутоиммунные заболевания.
Описанные здесь способы для индукции иммунного ответа могут быть использованы для индукции клеточного иммунного ответа с использованием различных типов Т-клеток (например, Т-лимфоцитов). В клеточном ответе различные типы Т-лимфоцитов действуют для устранения антигена множественными механизмами. Например, Т-хелперные клетки, которые способны распознавать антигены, могут реагировать, выпуская растворимые медиаторы, такие как цитокины, задействующие дополнительные клетки иммунной системы для участия в иммунном ответе. Кроме того, цитотоксические Т-клетки способны специфически распознавать антигены и могут реагировать путем связывания и уничтожения или повреждения клеток или частиц, которые несут антиген. Описанные здесь способы для индукции иммунного ответа могут также индуцировать гуморальный ответ, который также называется В-клеточным ответом. Гуморальный ответ включает продукцию антител, которые специфически связываются с антигеном (или иммуногеном). Антитела производятся дифференцированными лимфоцитами, известными как плазматические клетки.
То, как иммунный ответ индуцируется и тип иммунного ответа, индуцированного в клетке-хозяине или предмете, может быть определен любым из большего количества известных методов иммунологии, описанных здесь, и с которыми специалисты в данной области техники хорошо знакомы. Как описано здесь, методы и приемы для определения наличия и уровня иммунного ответа включают, например, резонансный перенос энергии флуоресценции, поляризацию флуоресценции, с разрешением во времени, резонансный перенос энергии флуоресценции, сцинтилляционные анализы, анализы с использованием репортерных генов, флуоресценция закаленного субстратом фермента, хромогенного субстратного фермента и электрохемилюминесценции, иммунологических методов (например, иммуноферментный анализ (ЕЬКА), радиоиммуноанализ, иммуноблоттинг, иммуногистохимия и т.п.), поверхностный плазменный резонанс, на основе клеток, таких как те, которые используют репортерные гены, и функциональных анализов (например, анализы, которые определяют иммунную функцию и иммунный ответ).
Такие анализы включают, но не должны быть ограниченными ш νί\Ό или ш νίΙΐΌ определением наличия и уровня растворимого антитела, растворимого медиатора, такого как цитокин (например, ΓΡΝ-γ, ^-2, ^-4, [Б-10, ^-12, !Б-6, [Б-23, ΊΝΡ-α, и ТОР-β), лимфокины, хемокины, гормоны, факторы роста и т.п., а также другие растворимые небольшие пептиды, углеводы, нуклеотидные и/или липидные медиаторы. Иммунологические методы также включают в себя определение клеточных изменений состояния активации, анализируя измененные функциональные или структурные свойства клетки иммунной системы, например пролиферации клеток, изменение подвижности специализированной индукции, такая как специфическая экспрессия гена или цитолитическое поведение; созревание клеток, таких как созревание дендритных клеток в ответ на стимул; изменение отношения между ответом Т11 и Т12 ответом; клеточную дифференциацию клетками иммунной системы, в том числе по изменению профиля экспрессии поверхностных антигенов или начала апоптоза (запрограммированной гибели клеток). Процедуры для выполнения этих и подобных анализов можно найти, например, в ЬеГкоу1Гк ДттипоЕду МеГйобк Мапиа1: Т1е Сотргейеи81уе δои^сеЬоок о£ ТесНпкщек, 1998). См. также СиггепГ РгоГосок ш ПптипоКду; ХУеи, НапбЬоок о£ Ехрептейа1 Пптипо^ду, В1аск\уе11 δ№ι·ιΙίΓία ВокЮп, МА (1986); М|кке11 апб δΐί^ίί (ебк.) δе1есГеб МеШобк ш Се11и1аг Пптипо^ду, Ргеетап РиЬНкЫпд, δап Ргапаксо, СА (1979); Огееп апб Кееб, δ№ι^, 281:1309 (1998) и приведенные в них ссылки).
Определение присутствия и/или уровня антител, которые специфически связывают иммуноген и соответствующий определенный антиген, представляющие интерес, может быть сделано с использованием любого из нескольких иммунологических анализов обычно практикующихся в данной области техники, включая, но не ограничиваясь, анализ ЕЬКА, иммунопреципитацию, иммуноблотинг, противотоки иммуноэлектрофореза, радиоиммуноанализы, дот-блот анализы, ингибирование или конкурентные анализы и т.п. (см., например, патенты США № 4376110 и 4486530; Наг1о\у еГ а1., АпиЬоб1ек: А ЬаЬогаГогу Мапиа1, Со1б διοτίι-ι^ НагЬог ЬаЬогаГогу (1988)). Иммунологические анализы также могут быть выполнены для определения класса и изотипа антитела, которое специфически связывается с иммуногеном. Антите- 44 027236 ла (поликлональные и/или моноклональные или их антиген-связывающие фрагменты), которые специфически связываются с иммуногеном и которые могут быть использованы в качестве контроля в иммунологических анализах обнаружения антитело-специфических иммунных ответов у иммунизированных субъектов, обычно могут быть получены любым из различных методов, известных специалистам в данной области техники. См., например, Наг1о\у е! а1., Λи!^Ьоб^е8: А ЬаЬога!огу Мапиа1, Со1б 8рппд НагЬог ЬаЬога!огу (1988); Ре!ег8оп, ГОАК 1. 46:314-19 (2005); (КоЬ1ег е! а1., №!иге, 256:495-97 (1976); КоЬ1ег е! а1., Еиг. 1. 1ттипо1. 6:511-19 (1975); СоПдап е! а1. (еб8.), Сиггеп! Рго!осо18 т 1ттипо1оду, 1:2.5.1-2.6.7 ЦоЬп \УПеу & 8оп8 1991); и.8. Ра!еп! Νϋ8. 4902614, 4543439 и 4411993; Мопос1опа1 АпйЬоб1е8, НуЬпбота8: А №υ ЭппегЩоп ш Вю1одюа1 Апа1у8е8, Р1епит Рге88, Кеппе!! е! а1. (еб8.) (1980); АпйЬоб1е8: А ЬаЬога!огу Мапиа1, Наг1о\у апб Ьапе (еб8.), Со1б 8рппд НагЬог ЬаЬога!огу Рге88 (1988); см. также, например, Вгапб е! а1., Р1ап!а Меб. 70:986-92 (2004); Ра8С1иа1пй е! а1., Ргос. №!1. Асаб. 8ск И8А, 101:257-59 (2004). Иммуногены, или их иммуногенные фрагменты, или клетки, или частицы иммуногена или его иммуногенные фрагменты могут быть использованы для иммунизации животного для производства поликлональных антител или моноклональных антител.
Уровни цитокинов могут быть определенными в соответствии с описанными здесь способами, практикующимися в данной области техники, включая, например, ЕЫ8А, ЕЫ8Р0Т, внутриклеточное окрашивание цитокинов, и проточную цитометрию и их комбинации (например, внутриклеточное окрашивание цитокинов и проточной цитометрии). Иммунные пролиферационные клетки и клональная экспансия в результате антиген-специфического выявления или стимуляции иммунного ответа могут быть определены путем выделения лимфоцитов, например клетки селезенки или клетки из лимфатических узлов, стимулирующиеся клетками с антигеном, и измерение продукции цитокинов, пролиферации клеток и/или выживаемости клеток, например, путем включения меченного тритием тимидина или нерадиоактивных анализов, таких как анализ МТТ и т.п. Эффективные иммуногены, описанные здесь, от баланса между ТЬ1 иммунного ответа и ТЬ2 иммунного ответа могут быть рассмотрены, например, путем определения уровня цитокинов ТЬ1, такого как ΙΡΝ-, 1Ь-12, 1Ь-2, ΊΝΡ-β, и типа 2 цитокинов, такого как 1Ь-4, 1Ь-5, 1Ь-9, 1Ь-10 и 1Ь-13.
Уровень СТЬ иммунного ответа и уровень памяти СЭ4 Т-клеточного ответа могут быть определены с помощью любого из многочисленных иммунологических методов, описанных здесь, и обычно практикуется в данной области. Уровень СТЬ иммунного ответа может быть определен перед введением любого одного из композиции, вектора или вектора частицы, описанных выше, а затем использоваться для сравнения с уровнем СТЬ иммунного ответа при соответствующем моменте времени после одного или нескольких введенных композиций, векторов или векторных частиц, которые обеспечивают память СЭ4 Т -клетки. Цитотоксичные анализы для определения СТЬ-активности могут быть осуществлены с использованием любого из нескольких способов и методов обычно практикующихся в данной области (см., например, Неикай е! а1., Су!о!охю Т-ЬутрЬосу!е8 т Рипбатеп!а1 1ттипо1оду, Раи1 (еб.) (2003 Прртсой \УППат8 & ХУПкйъ, РЫ1абе1рЫа, РА), раде8 1127-50 и приведенные в них ссылки).
В настоящем описании связанный агент или антитело являются иммуноспецифическим, специфичным к или специфически связываемым иммуногенным, представляющим интерес, если антитело реагирует на детектируемый уровень с иммуногеном или его иммуногенным фрагментом, предпочтительно с константной аффинностью, Ка, большей или равной приблизительно 104 М-1 или большей или равной примерно 105 М-1, большей или равной приблизительно 106 М-1, большей или равной приблизительно 107 М-1 или большей или равной 108 М-1. Аффинность антитела с его антигеном также обычно выражается в виде константы диссоциации ΚΌ, и антитело специфически связывается с иммуногеном, представляющим интерес, если он связывается с ΚΌ, меньшей или равной 10-4 М, меньшей или равной примерно 10-5 М, меньшей или равной примерно 10-6 М, меньшей или равной 10-7 М, меньшей или равной 10-8 М.
Сродство связывания партнеров или антитела может быть легко определено с использованием обычных методов, например тех, которые описаны 8са!сЬагб е! а1. (Апп. Ν.Υ. Асаб. 8ск И8А, 51:660 (1949)), и с помощью поверхностного плазменного резонанса (8РК; В1Асоге™, Вю8еп8ог, Р18са1а\уау, ΝΤ). Для поверхностного плазменного резонанса молекулы-мишени иммобилизуют на твердой фазе и подвергают партнер по связыванию (или лиганд) в качестве подвижной фазы вдоль проточной ячейки. Если связывание лиганда с иммобилизованными мишенями происходит, местные показатели преломления меняются, что приводит к изменению угла 8РК, который может контролироваться в режиме реального времени путем обнаружения изменений интенсивности отраженного света. Скорость изменения сигнала 8РК может быть проанализирована, чтобы дать наблюдаемые константы скорости ассоциации и диссоциации фазы реакции связывания. Соотношение этих величин дает представление о константе равновесия (сродством) (см., например, \Уо1ГГе! а1., Сапсег Ке8. 53:2560-2565 (1993)).
Биологические образцы могут быть получены от субъекта для определения наличия и уровня иммунного ответа на иммуноген и/или соответствующих установленных антигенов у субъекта, который получает одну или более иммуногенные композиции, описанные здесь, такие как иммуногенные композиции, содержащие иммуноген, и иммуногенные композиции, содержащие рекомбинантный экспресси- 45 027236 рующий вектор, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую иммуноген, или которая получена как иммуногенная композиция, включающая одну или более композицию, содержащую адъювант в соответствии с описанными здесь способами. Биологический образец, используемый здесь, представляет собой пробы крови (из которых могут быть получены сыворотки или плазма), биопсию, жидкости организма (например, лаваж легких, асцит, стирок слизистой, синовиальная жидкость), костный мозг, лимфатические узлы тканевого эксплантата, органную культуру или любой другой препарат тканей или клеток субъекта или биологического источника. Биологические образцы могут быть также получены от объекта до получения любой иммуногенной композиции, биологический образец которой является полезным в качестве контроля для установления базовой линии (т.е. предварительной иммунизации) данных.
В отношении всех иммунных ответов и способов, описанных здесь, для определения иммунного ответа специалисту в данной области техники также будет легко оценить и понять, какие элементы управления являются надлежащими и включенными, когда практикуются эти методы. Концентрации компонентов реакции, типы буферов, температуры и периоды времени, достаточные для обеспечения взаимодействия компонентов реакции, могут быть определены и/или регулированы в соответствии с описанными здесь способами и которые известны специалистам в данной области техники.
Способы индукции иммунного ответа.
Методы приведены в данном описании, которые включают введение по меньшей мере двух различных иммуногенных композиций для индукции адаптивного антиген-специфического иммунного ответа против одного или нескольких антигенов. Двойная иммунизация субъекта иммуногенной композицией, как описано здесь, приводит к индукции гуморального иммунного ответа и клеточного иммунного ответа (включая СЭ4 Т-клеточный ответа и СЭ8 Т-клеточный ответ). Две иммуногенные композиции могут быть введенными одновременно или последовательно в любом порядке. Соответственно, представленные здесь способы индукции гуморального иммунного ответа и клеточного ответа, которые включают СЭ4 Т-клеточный ответ и СЭ8 Т-клеточный ответ (и которые могут включать цитотоксический Т-клеточный ответ), где каждый из иммунных ответов специфичный для иммуногена(ов) и, таким образом, специфичный для соответствующих определенных антигенов. Эти способы включают введение иммуногенной композиции, которая содержит по меньшей мере один иммуноген (который изолирован и/или выделен рекомбинантными способами), и введение второй иммуногенной композиции, содержащей рекомбинантный экспрессирующий вектор, который кодирует и управляет экспрессией иммуногена.
В одном варианте осуществления способы для индукции иммунного ответа, специфичные для одного или более указанных антигенов у субъекта путем введения иммуногенной композиции, которая содержит по меньшей мере один иммуноген, способный вызывать специфический иммунный ответ против определенного антигена (который для удобства может быть назван здесь первым определенным антигеном). Способы дополнительно включают одновременное введение или последовательное введение (т.е. до или после) другой (т.е. второй различной/гетерологичной) иммуногенной композиции, которая содержит рекомбинантный экспрессирующий вектор, содержащий нуклеотидную последовательность, которая кодирует иммуноген. Рекомбинантный вектор экспрессии содержит по меньшей мере одну регуляторную последовательность функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, которая кодирует иммуноген, и, таким образом, рекомбинантный вектор экспрессии, способный управлять экспрессией иммуногена.
В некоторых вариантах осуществления рекомбинантный экспрессирующий вектор вводили в соответствии с этими способами, для индукции иммунного ответа встраивали векторные частицы (например, частицы вирусного вектора или клеточные частицы). Рекомбинантный вектор экспрессии или векторные частицы, содержащие вектор, сконструированы таким образом, что позволяет частицам быть введенными (т.е. доставленными) в клетки-мишени. В некоторых вариантах осуществления клетка-мишень представляет антиген-представляющие клетки. В более конкретных вариантах осуществления клетка-мишень представляет профессиональные антиген-представляющие клетки, такие как дендритные клетки. Иммуноген (или его фрагмент) затем вводят в клетку-мишень, и иммуноген или его фрагмент, представленный на поверхности антиген-представляющих клеток, индуцирует иммунный ответ, специфичный для иммуногена и тем самым для соответствующего определенного антигена.
Иммуногенная композиция, которая содержит по меньшей мере один иммуноген (первая иммуногенная композиция) может дополнительно содержать по меньшей мере один адъювант, который фармацевтически или физиологически пригодный для введения субъекту, нуждающемуся в этом, которому вводят иммуногенную композицию. Иммуногенная композиция, которая содержит рекомбинантный вектор экспрессии (вторая иммуногенная композиция), могут также дополнительно содержать адъювант. Если первая композиция и вторая композиция содержат адъювант, адъюванты могут быть одинаковыми или разными. Иммуногены, соответствующие определенным антигенам, адъювантам и рекомбинантным экспрессирующимся векторам и векторным частицам, описаны здесь подробно.
В другом варианте осуществления иммуногенная композиция, содержащая по меньшей мере один иммуноген (который может дополнительно содержать адъювант), вводится вначале с последующим введением иммуногенной композиции, содержащей рекомбинантный вектор экспрессии одновременно с
- 46 027236 введением иммуногенной композиции, содержащей по меньшей мере один иммуноген (который может дополнительно содержать адъювант). Другими словами, иммуногенная композиция, содержащая по меньшей мере один иммуноген (который может дополнительно содержать адъювант), являющийся первым или основным в иммунизации, и иммуногенная композиция, которая включает рекомбинантный вектор экспрессии, а вторая доза иммуногенной композиции, содержащая по меньшей мере один иммуноген (который может дополнительно содержать адъювант) и одновременно экспрессироваться, как повышение композиции.
В других вариантах осуществления рассматриваются способы для индукции иммунного ответа, где иммуногенная композиция содержит по меньшей мере один иммуноген дополнительно содержит по меньшей мере один дополнительный иммуноген (или, по меньшей мере, второй иммуноген). В других вариантах осуществления способов, описанных здесь, рекомбинантный экспрессирующий вектор, который кодирует иммуноген и который включен во вторую иммуногенную композицию, также кодирует и направляет экспрессию по меньшей мере одного дополнительного иммуногена. В еще одном варианте осуществления иммуногенная композиция, которая содержит по меньшей мере один иммуноген, дополнительно содержит по меньшей мере один дополнительный иммуноген и рекомбинантный вектор экспрессии, включенный в другую (или вторую) иммуногенную композицию, кодирует и направляет экспрессию по меньшей мере одного дополнительного иммуногена. Иммуногены, включенные в каждую первую и вторую иммуногенные композиции, могут быть одинаковыми или разными. В конкретных вариантах осуществления по меньшей мере один дополнительный иммуноген, включенный в первую композицию, и кодирующий рекомбинантный вектор экспрессии, включенный во вторую иммуногенную композицию, являются одинаковыми. Как более подробно описано здесь, когда более чем один иммуноген входит в иммуногенную композицию или кодируют рекомбинантный вектор экспрессии, каждый иммуноген может вызывать специфический иммунный ответ на те же или различные указанные антигены.
Соответственно, в одном конкретном варианте осуществления обеспечены способы, в которых иммуногенная композиция, которая содержит по меньшей мере один иммуноген (и который может дополнительно содержать адъювант), дополнительно содержит по меньшей мере один дополнительный иммуноген (т.е. по меньшей мере два, по меньшей мере три, по меньшей мере четыре, по меньшей мере пять, по меньшей мере шесть или более иммуногенов, которые можно переформулировать в виде двух, трех, четырех, пяти, шести или более иммуногенов)). В некоторых вариантах осуществления иммуногенная композиция, которая содержит по меньшей мере два иммуногена (например, два, три, четыре, пять, шесть или более иммуногенов), образует поливалентную иммуногенную композицию. В случаях, когда два или более иммуногена в сочетании с адъювантом, иммуногенная композиция может включать каждый иммуноген, сформулированный отдельно с адъювантом, а затем объединение адъюванта и иммуногена с образованием иммуногенной композиции, которую вводят субъекту. Альтернативно, два или более иммуногена могут быть объединены с адъювантом и сформулированы вместе, чтобы сформировать иммуногенную композицию. В некоторых конкретных вариантах осуществления один или более из каждого дополнительного иммуногена (например, второго, третьего, четвертого, пятого, шестого иммуногенов и т.д.) может индуцировать иммунный ответ на определенный антиген в качестве первого иммуногена. В других конкретных вариантах осуществления каждый дополнительный иммуноген (например, второй, третий, четвертый, пятый иммуноген и т.д.) может индуцировать иммунный ответ, специфичный для различных указанных антигенов (например, второго, третьего, четвертого, пятого, шестого и т.д. определенных антигенов), соответственно.
Как описано выше, в некоторых вариантах осуществления обеспеченный способ, в котором рекомбинантный вектор экспрессии в иммуногенной композиции может быть мультицистронным и содержать нуклеотидную последовательность, которая кодирует по меньшей мере один дополнительный иммуноген (т.е. по меньшей мере два, по меньшей мере три, по меньшей мере не менее четырех, по меньшей мере пять, по меньшей мере шесть или более иммуногенов, которые можно сформулировать в виде двух, трех, четырех, пяти, шести или более иммуногенов). Рекомбинантный экспрессирующий вектор сконструирован так, чтобы включать в себя все соответствующие регуляторные последовательности в оболочке с соответствующей нуклеотидной последовательностью, которая кодирует каждый иммуноген, где каждый иммуноген экспрессируется в клетке, в которую вводят рекомбинантный экспрессирующий вектор. В некоторых конкретных вариантах осуществления один или более из каждого дополнительного иммуногена (например, второго, третьего, четвертого, пятого, шестого иммуногена и т.д.) может индуцировать иммунный ответ на определенный антиген в качестве первого иммуногена. В других конкретных вариантах осуществления каждый из дополнительных иммуногенов (например, второй, третий, четвертый, пятый, шестой иммуноген и т.д.) может индуцировать иммунный ответ, специфичный для различных указанных антигенов (например, второго, третьего, четвертого, пятого, шестой определенных антигенов и т.д.), соответственно.
В других конкретных вариантах осуществления предоставляются способы для индукции иммунного ответа, в которых первая иммуногенная композиция включает по меньшей мере один изолированный/рекомбинантный иммуноген (для удобства называемый первым иммуногеном) и может дополни- 47 027236 тельно содержать по меньшей мере один дополнительный изолированный/рекомбинантный иммуноген. В других вариантах осуществления способы включают введение второй иммуногенной композиции, содержащей рекомбинантный экспрессирующий вектор, который кодирует первый иммуноген и кодирует по меньшей мере один дополнительный иммуноген. В конкретном варианте осуществления первая иммуногенная композиция включает по меньшей мере два изолированных/рекомбинантных иммуногена и вторая иммуногенная композиция включает рекомбинантный вектор экспрессии, который содержит нуклеотидную последовательность, которая кодирует по меньшей мере два иммуногена.
Когда два или более иммуногена включены в иммуногенную композицию, содержащую изолированный/рекомбинантный иммуноген и/или кодирующий полинуклеотидную последовательность, присутствующую в рекомбинантном векторе экспрессии, каждый иммуноген может включать аминокислотные последовательности, которые включают два различных региона или иммуногенных эпитопов антигена, представляющих интерес. По меньшей мере один иммуноген может содержать по меньшей мере один В-клеточный эпитоп, или может содержать Т-клеточный эпитоп, или может содержать аминокислотные последовательности, которые включают в себя как В-клеточный эпитоп, так и Т-клеточный эпитоп. Во-вторых, различные иммуногены могут содержать аминокислотные последовательности, которые соответствуют различным В-клеточным и/или Т-клеточным эпитопам. Когда два или более иммуногена включены в иммуногенную композицию (или кодируемый рекомбинантный вектор экспрессии), по меньшей мере один иммуноген включает по меньшей мере одну область эпитопа Т-клетки. В более конкретных вариантах осуществления по меньшей мере одна область Т-клеточного эпитопа способна индуцировать СЭ8 Т-клеточный специфический иммунный ответ на иммуноген и соответствующий определенный антиген.
В некоторых вариантах осуществления, когда иммунный ответ индуцируется на конкретные два или более иммуногена, желательно, чтобы по меньшей мере один иммуноген был способным индуцировать иммунный ответ, который содержит, по меньшей мере, специфический гуморальный и/или СЭ4 Т-клеточный ответ и по меньшей мере один дополнительный иммуноген, способный индуцировать иммунный ответ, который содержит, по меньшей мере, специфический СЭ8 Т-клеточный иммунный ответ. Соответственно, представленные здесь в одном варианте осуществления способы включают введение субъекту, нуждающемуся в этом, (а) иммуногенной композиции (которая может быть названа первой иммуногенной композицией), которая содержит первый изолированный/рекомбинантный иммуноген (композиция может дополнительно содержать адъювант), и (Ь) второй иммуногенной композиции, содержащей рекомбинантный экспрессирующий вектор, который кодирует и направляет экспрессию первого иммуногена и второго иммуногена, где, по меньшей мере, второй иммуноген, способный индуцировать специфический СЭ8 Т-клеточный ответ. В некоторых вариантах осуществления каждый по меньшей мере из двух иммуногенов обладает способностью индуцировать иммунный ответ к тому же определенному антигену. Кроме того, каждый по меньшей мере из двух иммуногенов обладает способностью индуцировать иммунный ответ на конкретные различные указанные антигенны (для удобства, называемые также первый и второй определенные антигены и т.д. соответственно).
В конкретных вариантах осуществления способы, описанные в данном описании, две различные иммуногенные композиции последовательно вводят субъекту, нуждающемуся в этом. В одном конкретном варианте осуществления способ включает в себя введение иммуногенной композиции, содержащей по меньшей мере один изолированный/рекомбинантный иммуноген (который может дополнительно содержать адъювант) перед введением иммуногенной композиции, содержащей рекомбинантный вектор экспрессии. Говоря по-другому, в некоторых вариантах осуществления способ включает введение иммуногенной композиции, содержащей рекомбинантный вектор экспрессии после (т.е. после) введения иммуногенной композиции, содержащей изолированный/рекомбинантный иммуноген (композиция, которая может дополнительно содержать адъювант).
В других вариантах осуществления иммуногенная композиция, содержащая рекомбинантный экспрессирующий вектор, вводится в иммуногенную композицию, содержащую изолированный/рекомбинантный иммуноген (композиция может дополнительно содержать адъювант). Говоря подругому, в некоторых вариантах осуществления способ включает введение иммуногенной композиции, содержащей по меньшей мере один иммуноген (который может дополнительно содержать адъювант) после (т.е. после) введения иммуногенной композиции, содержащей рекомбинантный вектор экспрессии.
Индукция иммунного ответа с использованием двойного способа иммунизации и иммуногенной композиции, описанной здесь, могут быть выполнены с использованием различных схем иммунизации. Например, неисчерпывающее списки схем иммунизации представлены на фиг. 6. Эти и другие варианты осуществления способов индукции адаптивного антиген-специфического иммунного ответа, описаны более подробно в данном документе ниже. В конкретных вариантах осуществления способы включают введение иммуногенной композиции, содержащий изолированный/рекомбинантный иммуноген (для удобства называется первой иммуногенной композицией) и/или иммуногенной композиции, содержащей рекомбинантный вектор экспрессии (для удобства называемые второй иммуногенной композицией) более чем один раз субъекту.
- 48 027236
В конкретных вариантах осуществления иммуногенная композиция, содержащая иммуноген (который может дополнительно содержать адъювант), вводится по меньшей мере два, по меньшей мере три, по меньшей мере четыре, по меньшей мере пять или более раз (например, в два раза, в три раза, в четыре раза, в пять раз или более) объекту. Иначе говоря, в несколько приемов (например, 2, 3, 4, 5, 6 или более доз) первую иммуногенную композицию вводят пациенту. Когда первую иммуногенную композицию вводят несколько раз (например, в два раза (два раза), три раза, четыре раза, в пять раз или более), каждая иммуногенная композиция введенная первой может быть последовательной и каждое последовательное введение первой композиции до введения второй композиции. В других конкретных вариантах осуществления вторая композиция вводится через одну дозу первой композиции и до последующей дозы первой композиции. В качестве примера, когда первая композиция вводится два раза объекту, вторую композицию можно вводить после первого введения (т.е. первой дозы) первой иммуногенной композиции и до введения второго введения (т.е. второй дозы) иммуногенной композиции. В другом конкретном варианте осуществления, например, когда первую иммуногенную композицию вводят три раза (т.е. вводят три дозы), вторая композиция может быть введена после первой дозы и до второй дозы; после второй дозы и перед третьей дозой, или после того, как введены все три дозы первой иммуногенной композиции. В еще одном конкретном варианте осуществления, например, когда первую иммуногенную композицию вводят четыре раза (т.е. вводят четыре дозы), вторая композиция может быть введена после первой дозы и до второй дозы; после второй дозы и перед третьей дозой, после третьей дозы и до четвертой дозы или после всех четырех доз первой иммуногенной композиции. Специалист в данной области техники может легко понять, что при введении пяти или более доз первой иммуногенной композиции, вторая композиция может быть введенной после любой из нескольких доз первой иммуногенной композиции или после введения всех доз первой иммуногенной композиции. В альтернативных вариантах осуществления вторая иммуногенная композиция вводится один раз и вводится перед всеми введениями первой иммуногенной композиции.
В еще одном варианте осуществления, когда первая иммуногенная композиция вводится несколько раз (т.е. два или более раза), одна доза первой иммуногенной композиции может вводиться одновременно с введением второй иммуногенной композиции. В качестве примера, когда режим дозирования включает введение двух доз первой иммуногенной композиции, первая доза может быть введена до одновременного введения второй иммуногенной композиции и второй дозы первой иммуногенной композиции. В качестве дополнительного примера, когда режим дозирования включает введение трех или более доз первой иммуногенной композиции, по меньшей мере одна из трех доз вакцины вводится одновременно с введением второй иммуногенной композиции и дополнительная доза первой иммуногенной композиции может быть введенной до параллельного введения обеих композиций, после одновременного применения обеих композиций, или одна или несколько доз может вводиться до одновременного применения обеих композиций, а остальные дозы первой иммуногенной композиции можно вводить после одновременного применения, как композиции в зависимости от общего числа доз первой иммуногенной композиции предназначенной для введения в соответствии с конкретным режимом дозирования.
В некоторых конкретных вариантах осуществления первая иммуногенная композиция вводится два раза и вторая иммуногенная композиция вводится (а) после первого введения первой иммуногенной композиции и до второго введения первой иммуногенной композиции; (Ь) после второго введения первой иммуногенной композиции, (с) до первого введения первой иммуногенной композиции или (й) одновременно с первым или вторым введением первой иммуногенной композиции. В другом конкретном варианте осуществления первую иммуногенную композицию вводят в три раза, а вторую иммуногенную композицию вводят (а) после первого введения первой иммуногенной композиции и до второго введения первой иммуногенной композиции; (Ь) после второго введения первой иммуногенной композиции и до третьего введения первой композиции; (с) после третьего введения первой иммуногенной композиции; (й) до первого приема первой иммуногенной композиции или (е) одновременно с первой, второй или третьей введенной первой иммуногенной композицией. В еще одном конкретном варианте осуществления первую иммуногенную композицию вводят в четыре раза, а вторую иммуногенную композицию вводят (а) после первого введения первой иммуногенной композиции и до второго введения первой иммуногенной композиции; (Ь) после последующего второго введения первой иммуногенной композиции и до третьего введения первой композиции; (с) после третьего введения первой иммуногенной композиции и до четвертого введения первой иммуногенной композиции; (й) после четвёртого введения первой иммуногенной композиции; (е) до первого приема первой иммуногенной композиции или (Г) одновременно с первым, вторым, третьим или четвертым введениями первой иммуногенной композиции.
В других конкретных вариантах осуществления обеспечены способы, причем вторую композицию (т.е. иммуногенная композиция, содержащая рекомбинантный вектор экспрессии, кодирующий по меньшей мере один иммуноген) вводят два раза и первую иммуногенную композицию (например, иммуногенную композицию, содержащую по меньшей мере один изолированный/рекомбинантный иммуноген и которая может дополнительно содержать адъювант), вводят один раз, два раза, три раза, четыре раза, пять раз или более. Каждая из двух введенных (т.е. две дозы) вторых композиций и каждое введение первой иммуногенной композиции (т.е. первой, второй, третьей, четвертой или пятой дозировки) можно
- 49 027236 вводить последовательно в любом порядке. В других конкретных вариантах осуществления по меньшей мере одна из доз второй иммуногенной композиции вводится одновременно с дозой первой иммуногенной композиции.
Как здесь описано, в других вариантах осуществления иммуногенная композиция содержит изолированный/рекомбинантный иммуноген (где композиция может дополнительно содержать адъювант) и иммуногенную композицию, содержащую рекомбинантный вектор экспрессии, который содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую иммуноген, можно вводить одновременно по меньшей мере один раз. В одном таком варианте обеспечены способы, описанные в данном документе, которые включают введение (1) иммуногенной композиции, содержащей иммуноген (где композиция может дополнительно содержать адъювант), и последовательное введение в любом порядке, (2) второй дозы иммуногенной композиции, содержащей иммуноген одновременно с иммуногенной композицией, содержащей рекомбинантный вектор экспрессии, кодирующий иммуноген. В одном конкретном варианте осуществления иммуногенную композицию, содержащую иммуноген, вводят одновременно перед введением иммуногенной композиции, содержащей рекомбинантный вектор экспрессии, и иммуногенной композиции, содержащей иммуноген (т.е. вторая доза иммуногенной композиции, содержит иммуноген). В другом конкретном варианте осуществления иммуногенную композицию, содержащую иммуноген, вводят после одновременного введения иммуногенной композиции, содержащей рекомбинантный вектор экспрессии с иммуногенной композицией, содержащей иммуноген. В еще более конкретных вариантах осуществления каждая доза иммуногенной композиции, содержащая рекомбинантный/изолированный иммуноген (т.е. первая иммуногенная композиция), вводится одновременно с дозой иммуногенной композиции, содержащей рекомбинантный вектор экспрессии, кодирующий иммуноген (т.е. вторая иммуногенная композиция). В частности, методы приведены в данном описании, в котором первая доза первой иммуногенной композиции вводится одновременно с первой дозой второй иммуногенной композиции (также называемая основной иммунизацией), с последующим одновременным введением второй дозы первой иммуногенной композиции и второй дозы второй иммуногенной композиции (также называемой повышенной иммунизацией). В некоторых вариантах осуществления объект может быть иммунизирован третий раз с одновременным введением первой и второй иммуногенных композиций. Интервал времени между основной иммунизацией и повышенной иммунизацией обсуждается более подробно ниже, и его выбирают на основе результатов доклинических и/или клинических исследований.
В отношении описанных здесь способов, которые включают последовательное введение иммуногенной композиции, интервалы времени между введенными дозами могут быть легко определены специалистами в данной области, практикующими клинические испытания. Режим дозирования для человека также может быть составлен по результатам доклинических исследований и знаний в данной области. В некоторых вариантах осуществления временной интервал между введением доз иммуногенных композиций может быть по меньшей мере один, два, три, четыре, пять, шесть или семь дней, или один, два, три, четыре, пять, шесть, семь или восемь недель, или может быть по меньшей мере один, два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять или одиннадцать месяцев, или по меньшей мере один, два, три или четыре года. В качестве иллюстрации, когда иммуногенная композиция содержит рекомбинантный вектор экспрессии (для простоты обсуждения, называемый второй иммуногенной композицией), после введения по меньшей мере одной дозы иммуногенной композиции, содержащей иммуноген (для простоты обсуждения, называемый первой иммуногенной композицией), вторую иммуногенную композицию вводят после введения по меньшей мере одной дозы первой иммуногенной композиции по любому одному из временных интервалов, описанных здесь, или которые могут быть определены соответствующими доклиническими и клиническими исследованиями. В некоторых вариантах осуществления объект может быть иммунизирован три, четыре или пять раз с одной или более иммуногенной композицией. Интервал времени между третьей иммунизацией и второй иммунизацией может быть одинаковым или отличным от интервала времени между введением первой иммуногенной композицией и второй иммуногенной композицией. Интервалы времени, как описано здесь, между введениями из одинаковых или различных иммуногенных композиций относятся к любой из схем введения, описанных здесь (в том числе, например, схемы, показанной на фиг. 6).
Иммунный ответ, индуцированный введением иммуногенной композиции, в соответствии с методами, описанными выше, включает адаптивный иммунный ответ, который включает в себя гуморальный ответ и клеточный ответ (который включает в себя иммунный ответа СЭ4 и иммунный ответ СЭ8), специфичный для каждого иммуногена, присутствующего в каждой иммуногенной композиции и, следовательно, специфичного для определенного антигена соответствующего каждому иммуногену. Когда иммуногенная композиция содержит изолированный/рекомбинантный иммуноген (композиция может дополнительно содержать адъювант) и иммуногенную композицию, которая содержит рекомбинантный вектор экспрессии, который содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую иммуноген, вводят последовательно, по меньшей мере, композиция (или композиции), вводимая первой, которую можно также назвать основной композицией, способна индуцировать иммунный ответ, который включает в себя СЭ4 Т-клеточный ответ на конкретный иммуноген и соответствующий определенный антиген. Иммунный ответ, индуцированный основной композицией, может также содержать специфический иммунный
- 50 027236 ответ на иммуноген и соответствующий определенный антиген. Вводят вторую иммуногенную композицию(и) (можно также назвать основной иммуногенной композицией), которая индуцирует иммунный ответ, который включает СЭ8 Т-клеточный ответ на специфический иммуноген и определенный антиген. Введение повышенной композиции может также индуцировать или усилить антиген-специфические антитела и/или СЭ4 Т-клеточный специфический иммунный ответ. В некоторых конкретных вариантах и, как описано выше, введение иммуногенной композиции, содержащей рекомбинантный вектор экспрессии, который содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую иммуноген, способный индуцировать иммунный ответ, который включает в себя, по меньшей мере, индукцию СЭ8 Т-клеточного иммунного ответа на конкретный иммуноген и соответствующий определенный антиген.
Иммунный ответ, индуцированный первой введенной (т.е. первой дозой) иммуногенной композицией, описанной здесь, может содержать гуморальный иммунный ответ и иммунный СЭ4 Т-клеточный ответ для каждого конкретного иммуногена, включенного в иммуногенную композицию. Первое дозирование может включать введение иммуногенной композиции, содержащей изолированный/рекомбинантный иммуноген (который может дополнительно содержать адъювант), или иммуногенной композиции, содержащей рекомбинантный экспрессирующий вектор, который кодирует и управляет экспрессией иммуногена, или первое дозирование может включать совместное введение каждой из вышеуказанных иммуногенных композиций. Вторая иммунизация (т.е. повышенная иммунизация) включает введение одной или более из этих иммуногенных композиций и способна индуцировать иммунный ответ, который включены в специфический СЭ8 Т-клеточный иммунный ответ.
В конкретных вариантах осуществления иммуногенная композиция (также называемая первой иммуногенной композицией), которая включает в себя по меньшей мере один изолированный/рекомбинантный иммуноген (который может дополнительно содержать адъювант), способна индуцировать иммунный ответ, включенный в СЭ4 Т-клеточный ответ, специфичный для иммуногена и, таким образом, специфический для соответствующих определенных антигенов и который индуцирует иммунный ответ, также может содержать гуморальный ответ (т.е. специфический антительный ответ или антиген-специфические антитела) на иммуноген. Другая иммуногенная композиция (или вторая иммуногенная композиция), содержащая рекомбинантный вектор экспрессии, который содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую иммуноген, способен, по меньшей мере, вызывать СЭ8 Т-клеточный ответ на конкретный иммуноген и, следовательно, способен индуцировать СЭ8 Т-клеточный ответ на конкретный определенный антиген.
Соответственно, способ для индукции цитотоксического Т-клеточного ответа (СТЬ) включает введение субъекту, нуждающемуся в этом, иммуногенной композиции, содержащей по меньшей мере один изолированный/рекомбинантный иммуноген (композиция может дополнительно содержать адъювант), и последовательное и/или одновременное введение иммуногенной композиции, содержащей рекомбинантный вектор экспрессии, который содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую иммуноген. Эти способы могут быть выполнены в соответствии с любым из описанных здесь шагов введения двух иммуногенных композиций, в том числе нескольких режимов дозирования. СТЬ-ответ является специфическим для клеток или частиц, которые носят или представляют иммуноген и/или соответствующий определенным антигенам. В некоторых конкретных вариантах осуществления и в качестве примера, когда иммуноген представляет собой ассоциированный с опухолью антиген, СТЬ-ответ является специфическим для опухолевых клеток, экспрессирующих иммуноген и/или определенный антиген. Иммуноген и/или определенный антиген может присутствовать на поверхности опухолевых клеток и, следовательно, быть доступным для цитотоксических Т-клеток. Способы и композиции, описанные здесь подробно, следовательно, полезны для снижения вероятности возникновения или рецидива опухоли, которая содержит множество опухолевых клеток, которые несут или экспресс-ассоциированы с антигеном опухоли.
В других конкретных вариантах осуществления иммуноген и определенный антиген может быть выбранным из заболеваний, вызванных инфекционным микроорганизмом, таким как вирус, бактерия, паразит или грибок, а иммунный СТЬ-ответ является специфическим для вирусов, бактерий, паразитов, или грибков соответственно, что выражает или несет иммуноген и/или определенный антиген. Описанные здесь способы поэтому являются полезными для профилактики или лечения инфекций, заболеваний, вызванных соответствующими инфекционными организмами.
Кроме того, как описано выше, в некоторых вариантах осуществления эти способы индукции СТЬответа могут включать введение рекомбинантного вектора экспрессии, мультицистронного и содержащего нуклеотидную последовательность, которая кодирует по меньшей мере один дополнительный иммуноген (т.е. по меньшей мере два, по меньшей мере три, по меньшей мере четыре, по меньшей мере пять, по меньшей мере шесть или более иммуногенов, которые можно сформулировать в виде двух, трех, четырех, пяти, шести или более иммуногенов). В некоторых конкретных вариантах осуществления при экспрессии каждого из дополнительных иммуногенов (например, второго, третьего, четвертого, пятого, шестого иммуногена и т.д.), каждый может индуцировать иммунный ответ на определенный антиген в качестве первого иммуногена. В других конкретных вариантах осуществления каждый из дополнительных иммуногенов (например, второго, третьего, четвертого, пятого, шестого иммуногенов и т.д.) может индуцировать иммунный ответ, специфичный для различных указанных антигенов (например, второго,
- 51 027236 третьего, четвертого, пятого, шестого и т.д.) соответственно. В других определенных вариантах осуществления иммуногенная композиция, которая содержит по меньшей мере один изолированный/рекомбинантный иммуноген, может содержать по меньшей мере два изолированных/рекомбинантных иммуногена (например, два, три, четыре, пять, шесть или более иммуногенов) с образованием поливалентной иммуногенной композиции. В случаях, когда два или более иммуногена в сочетании с адъювантом - иммуногенная композиция может включать каждый иммуноген, сформулированный отдельно с адъювантом, а затем объединение иммуногенов с адъювантом с образованием иммуногенной композиции, которую вводят субъекту. Альтернативно, два или более иммуногена могут быть объединены с адъювантом и сформулированы вместе, чтобы сформировать иммуногенную композицию. В некоторых конкретных вариантах осуществления каждый дополнительный иммуноген (например, второй, третий, четвертый, пятый, шестой иммуноген и т.д.) может индуцировать иммунный ответ на определенный антиген в качестве первого иммуногена. В других конкретных вариантах осуществления каждый дополнительный иммуноген (например, второй, третий, четвертый, пятый иммуноген и т.д.) может индуцировать иммунный ответ, специфичный для различных указанных антигенов (например, второго, третьего, четвертого, пятого, шестого и т.д.) соответственно.
В более конкретных вариантах осуществления способы включают описанные здесь адъюванты, например нетоксичные липиды, связанные адъювантом, могут быть приготовлены с иммуногеном. В других конкретных вариантах адъювант, такой как нетоксичный липидный, связанный адъювант, может быть введен в сочетании с иммуногенной композиции, содержащей рекомбинантный вектор экспрессии, который содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую иммуноген. Согласно еще более конкретным вариантам осуществления, нетоксичные липидным А-связанным адъювантом являются СЬА. В еще более специфических воплощениях СЬА смешан с ЗЕ с образованием стабильной эмульсии масло-в-воде (СЬА/ЗЕ) для использования в способах и композициях, описанных здесь.
Когда адъювант входит в иммуногенную композицию, содержащую по меньшей мере один изолированный/рекомбинантный иммуноген, адъювант и иммуноген, как правило, в сочетании (например, сформулированные вместе, смешанные) до введения субъекту. В альтернативных вариантах осуществления иммуногенная композиция, содержащая по меньшей мере один иммуноген и адъювант, может вводиться раздельно, но одновременно к субъекту. Когда иммуногенная композиция содержит иммуноген и адъювант, то композицию вводят раздельно и одновременно, каждые из иммуногенных композиций и адъювантов могут быть введены в том же месте по тому же маршруту, или могут быть введены в том же месте по различным маршрутам, или могут быть введены субъекту в различные места одним и тем же или различными путями. В некоторых вариантах осуществления адъювант представляет собой нетоксичные липидные А-связанные адъюванты, такие как СЬА/ЗЕ.
Когда адъювант входит в иммуногенную композицию, содержащую рекомбинантный вектор экспрессии, адъювант может быть объединен (т.е. приготовлены вместе, смешанный с) с рекомбинантным вектором экспрессии (или векторной частицей, содержащей рекомбинантный вектор экспрессии), с образованием иммуногенной композиции. В других осуществлениях иммуногенные композиции содержат рекомбинантный вектор экспрессии (или векторную частицу, содержащую рекомбинантный вектор экспрессии), отдельные композиции, которые могут быть введены в том же месте по тому же маршруту, или могут быть введены в том же месте по различным маршрутам, или могут быть введены субъекту в различные места одним и тем же или различными путями. В некоторых вариантах осуществления адъювант представляет собой нетоксичный липидный А-связанный адъювант, такой как СЬА/ЗЕ.
В другом конкретном варианте способы осуществления иммунизации, описанные здесь для индукции специфического иммунного ответа, включают введение субъекту, нуждающемуся в этом, иммуногенной композиции, содержащей адъювант СЬА/ЗЕ и иммуноген, способный индуцировать иммунный ответ, специфичный для определенного антигена. Как описано здесь, СЬА цели ТЬК4. ТЬК4 являются уникальными среди семейства ТЬК, которые ниже имеют, оба, МуЭ88-конца ТК1Р-зависимых путей. В совокупности эти пути стимулируют созревание ДК, процессинга антигена/презентации Т-клеточной основы, а также продукцию цитокинов (например, 1Ь-12, ΙΡΝα/β и ТОТа) (см., например, 1уазак1 е! а1., №!. 1ттиио1. 5:987 (2004)).
В некоторых вариантах осуществления, как описано здесь, рекомбинантный экспрессирующий вектор вводят в векторные частицы, описанные здесь, способы включают введение иммуногенной композиции, содержащей векторную частицу, содержащую рекомбинантный экспрессирующий вектор, который кодирует и управляет экспрессией иммуногена. В более конкретных вариантах осуществления векторные частицы, частицы вирусного вектора, такие как лентивирусные векторные частицы. Как описано здесь, лентивирусные векторные частицы могут быть ПС-№ЬУ, самоинактивирующимся не встраивающимся лентивектором, который использует модифицированный гликопротеин оболочки вируса Синдбис для избирательного ввода в дендритные клетки (ДК). После вступления в вектор тока антигенные пептиды генерируются с помощью активной транскрипции и трансляции иммуногена, кодируемого вектором, вводятся в МНС класса Ι. Не желая быть связанными какой-либо конкретной теорией, использование ЭС-МЪУ генерирует надежный СЭ8 Т-клеточный ответ.
- 52 027236
В одном варианте осуществления иммуногенная композиция содержит рекомбинантный экспрессирующий вектор или векторную частицу, содержащую рекомбинантный экспрессирующий вектор, которую вводят непосредственно объекту. В других конкретных вариантах осуществления клетка-мишень(и) может быть изолированной от субъекта, которому может быть введена иммуногенная композиция, а векторные частицы вводят в бывшие естественные клетки-мишени. Затем клетки-мишени, содержащие векторные частицы, вводят в субъект.
Согласно еще более конкретным вариантам осуществления два метода иммунизации включают введение иммуногенной композиции, содержащей рекомбинантный/изолированный иммуноген(ы), представляющий интерес в сочетании с адъювантом ОЬА/§Е. Способы дополнительно включают введение второй иммуногенной композиции, содержащей ОС-МЬУ, который кодирует и экспрессирует иммуноген(ы). Иллюстративные, но не исчерпывающие иммунизационные схемы для использования этих иммуногенных композиций представлены в табл. 1.
Таблица 1
Схемы иммунизации
Первичная доза 1” Бустерная доза 2я Бустерная доза
иммуноген(ы) + ОЬА/5Е ЦС-МЬУ* Ни один
иммуноген(ы) + ОЬА/5Е ПС-ΝΠΛ· иммуноген(ы) + ОЬА/5Е
иммуноген(ы) + ОЬА/ЗЕ иммуноген(ы) + ОЬА/ЗЕ ОС-МЬУ
иммуноген(ы) + ОЬА/8Е иммуноген(ы) + ОЬА/ЗЕ и ПС-ΝΠΛ· Ни один
иммуноген(ы) + СЬА/5Е и ОС-МЬУ Ни один Ни один
иммуноген(ы) + ОЬА/ЗЕ и РСМЬУ иммуноген(ы) + ОЬА/ЗЕ и ОС-ΝΙίν Ни один
ϋϋ-ΝΙΕν иммуноген(ы) + ОЬА/ЗЕ Ни один
НС-ГЛЬУ иммуноген(ы) + ОЬА/5Е ОС-МЬУ
* БС-МЬУ содержит полинуклеотид, который кодирует иммуноген(ы).
Описанные здесь способы могут быть использованы для индукции иммунного ответа на конкретный любой из иммуногенов и соответствующих определенных антигенов. Как подробно описано в данном описании, определенный антиген, представляющий интерес, может быть ассоциирован с антигеном опухоли или антигеном из инфекционного микроорганизма (например, вируса, бактерии, грибка или паразита). В некоторых конкретных вариантах осуществления описанные здесь способы могут быть использованы для индукции иммунного ответа на конкретный ассоциированный с опухолью антиген, включая, но не ограничиваясь, почечные антигенные клетки карциномы, антиген рака предстательной железы, антиген мезотелиомы, антиген рака поджелудочной железы, антиген меланомы, антиген рака молочной железы, антиген рака легкого и антиген рака яичников. В более конкретных вариантах осуществления антиген, представляющий интерес, представляет собой антиген рака предстательной железы, например простатической кислой фосфатазой, простатоспецифического антигена, ΝΧΧ3.1 или просто специфического мембранного антигена.
В другом конкретном варианте осуществления используются композиции и способы для иммунизации субъекта против вирусов, таких как ВИЧ, СМУ, вирус гепатита, ЕВУ, К§У, У§У, воспаление или Н§У-2 или любой другой инфекционный вирус, описанных здесь или в данной области. Соответственно, описанные здесь способы могут быть использованы для индукции иммунного ответа на конкретный вирусный антиген. В более конкретных вариантах изобретения определенный антиген, представляющий интерес, является Н§У-2 белком, таким как §ϋ и ЦЫ9.
Двойные методы иммунизации настоящего изобретения могут быть использованы для индукции цитотоксического Т-лимфоцитного (СТЬ) ответа против клетки, частицы или микроорганизма, несущего или экспрессирующего по меньшей мере один определенный антиген, представляющий интерес. В конкретных вариантах осуществления методы приведены здесь для индукции иммунного СТЬ-ответа против опухолевых клеток, экспрессирующих по меньшей мере один определенный антиген, представляющий интерес. В конкретных вариантах осуществления определенный антиген (или его часть или части) присутствует на внешней поверхности клетки, опухолевой клетки и выставлен в внеклеточную среду. Описанные здесь способы могут быть использованы для снижения вероятности возникновения или рецидива (т.е. снижения вероятности возникновения или рецидива статистически, клинически или биологически значимым образом) опухоли (которая включает в себя множество опухолевых клеток), которая экспрессирует или секретирует ассоциированный с опухолью антиген, который является определенным антиге- 53 027236 ном, представляющим интерес.
В других конкретных вариантах описаны способы индукции СТЬ-ответа против микроорганизмов, таких как вирусы, паразиты, бактерии или грибковые клетки. Определенный антиген может быть микробным антигеном, который обычно выделяется из микроорганизмов или может быть микробными антигенами, которые присутствуют на поверхности клеток микроорганизма и, следовательно, имеют одну или более иммуногенных областей, которые подвергаются и доступны для распознавания и взаимодействия с молекулами и клетками иммунной системы субъекта. Таким образом, способы, описанные здесь, которые включают двойную иммунизацию субъекта, являются полезными для лечения и/или профилактики (т.е. снижения вероятности возникновения статистически, клинически или биологически значимым образом) микробной инфекции, которая стала бы усиливаться или происходить, если бы имело место, в отсутствие введения иммуногенной композиции, описанной в данном документе.
Как понятно специалисту в области медицины, термины лечить и лечение относится к лекарственной терапии заболевания, расстройства или состояния субъекта (например, пациента, хозяина, который может быть человеком или животным, кроме человека) (см., например, 8!ейтап'к Мейюа1 БкПопагу). В общем, подходящая доза и режим лечения обеспечивают иммуноген и, необязательно, адъювант, как описано здесь, в количестве, достаточном для терапевтической и/или профилактической выгоды. Терапевтические и/или профилактические выгоды в результате терапевтического и/или профилактического лечения или превентивного способа включают, например, улучшенный клинический результат, в котором объект вводят, чтобы предотвратить или замедлить (уменьшить) нежелательные физиологические изменения или расстройства или для предотвращения или замедления (уменьшения) расширения или тяжести таких заболеваний или нарушений. Выгодный или желаемый клинический результат от лечения субъекта включает, но не ограничиваются ими, снижение, уменьшение или ослабление симптомов, которые возникают в результате или связаны с заболеванием или расстройством, подлежащим лечению, уменьшает возникновение симптомов, улучшение качества жизни; больше безрецидивном положении (т.е. уменьшая вероятность или предрасположенность, что субъект будет представлять симптомы, на основе которых выполняется диагностика заболевания), уменьшение степени болезни; стабилизированного (т.е. не ухудшение) состояния заболевания; задержания или замедления прогрессирования заболевания, улучшение или временное облегчение болезненного состояния и ремиссии (частичной или полной), обнаружения и/или обнаружении или общей выживаемости. Лечение может также означать продление выживаемости, по сравнению с ожидаемой выживаемостью, если субъект не получает лечение. Субъекты, нуждающиеся в способах и композициях, описанных здесь, включают те, которые уже имеют заболевания или нарушения, а также субъекты склонны иметь риск развития заболевания или нарушения. Субъекты, нуждающиеся в профилактическом лечении, включают субъекты, у которых заболевание, состояние или расстройство должны быть предотвращены (т.е. уменьшение вероятности возникновения или рецидива заболевания, или расстройства). Клинический эффект обеспечивают композиции и препараты, содержащие композиции и способы, описанные здесь, могут быть оценены и проектировано выполненные ш У1!го анализы, доклинические исследования и клинические исследования у пациентов, которым введенные композиции предназначены для выгоды. Проектирование и выполнение соответствующих доклинических исследований и клинических исследований могут быть легко выполнены специалистами в данной области (областях) техники.
Изолированный/рекомбинантный иммуноген, рекомбинантный вектор экспрессии и/или векторные частицы могут быть введены субъекту с фармацевтически или физиологически приемлемым наполнителем или приемлемым носителем. Фармацевтически приемлемыми наполнителями являются биологически совместные транспортные средства, например физиологический солевой раствор, который описан более подробно в данном описании, который являются подходящим для введения человеку или другим нечеловеческим субъектам, в том числе млекопитающему, не являющемуся человеком.
В отношении введения рекомбинантного вектора экспрессии терапевтически эффективное количество представляет собой количество полинуклеотида, который способен производить медицинский желаемый результат (т.е. достаточное количество экспрессированного иммуногена, чтобы индуцировать или усиливать иммунный ответ на специфический иммуноген (гуморальный и/или клеточный ответ, включая цитотоксический Т-клеточный ответ) статистически, биологически и/или значительным образом) у человека или животного, кроме человека. Как хорошо известно в области медицины, доза для любого пациента зависит от множества факторов, включая размеры пациента, площадь поверхности тела, возраст, конкретное вводимое количество зависит и от пола, времени и пути введения, общего состояния здоровья, а также других препаратов, которые вводят одновременно. Доза будет меняться, но предпочтительная доза для введения векторной частицы, содержащая рекомбинантный вектор экспрессии, является достаточной для обеспечения примерно от 106 до 1012 копий полинуклеотидной молекулы вектора.
Фармацевтические композиции, в том числе и адъювантные иммуногенные композиции, описанные здесь, могут быть введены в порядке, соответствующем заболеванию или состоянию, подлежащему лечению (или предотвращению), как определено специалистами в данной области медицины. Соответствующая доза и соответствующая длительность, а также частота введения композиций будет зависеть от таких факторов, как состояние здоровья пациента, размеры пациента (например, вес, масса или область
- 54 027236 тела), тип и серьезность заболевания пациента, конкретной формы активного ингредиента и способов введения. В общем, подходящие дозы и схемы лечения обеспечивают композиции в количестве, достаточном для терапевтической и/или профилактической выгоды (такой, как описано здесь, в том числе улучшение клинических исходов, например, более частая полная или частичная ремиссия или больше без признаков заболевания и/или общая выживаемость, или уменьшение тяжести симптомов). Для профилактического применения доза должна быть достаточной для предотвращения, замедления наступления или уменьшения степени тяжести заболевания, связанного с заболеванием или расстройством. Профилактическое преимущество иммуногенной композиции, введенной в соответствии с методами, описанными здесь, может быть определена путем проведения доклинических (в том числе ш уйго и ш у1уо исследованиях на животных) и клинических исследованиях и анализов данных, полученных из них, на соответствующие статистические, биологические и клинические методы и приемы, все из которых могут легко быть осуществлены специалистом в данной области.
В целом, количество иммуногена, в том числе слитые полипептиды, как описано в данном описании, содержится в дозе или получают на месте посредством настоящего полинуклеотида, кодирующего в дозе от примерно 0,01 до примерно 1000 мкг на 1 кг хозяина. Использование минимальной дозы, достаточной, чтобы обеспечить эффективное лечение, как правило, предпочтительно. Пациенты могут обычно быть проверены для терапевтической или профилактической эффективности с помощью анализов, подходящих для состояния, которое лечат или предупреждают, что анализы будут знакомы специалистам в данной области техники и которые описаны здесь. При введении в жидкой форме подходящий размер дозы будет варьировать в зависимости от размера пациента, но обычно находится в пределах примерно от 1 до 500 мл (содержащий примерно от 0,01 до примерно 1000 мкг/кг) для 10-60 кг субъекта. Оптимальная доза обычно может быть определена с использованием экспериментальных моделей и/или клинических испытаний. Оптимальная доза может зависеть от массы тела, участка тела, веса или объема крови субъекта. Как описано здесь, соответствующая доза может также зависеть от (например, человека) состояния пациента, т.е. стадии заболевания, общего состояния здоровья, а также возраста, пола и веса и других факторов, знакомых специалисту в области медицины.
Фармацевтические композиции могут быть приготовлены для любого соответствующего способа введения, включая, например, местное, пероральное, энтеральное, носовое (например, интраназальное), ингаляции, интратекальное, ректальное, вагинальное, внутриглазное, субконъюнктивальное, подъязычное, внутрикожное, внутреннее, внутриопухольное, трансдермальное или парентеральное введения, включая подкожное, чрескожное, внутривенное, внутримышечное, внутригрудинное, интракавернозное, внутриотверственное или интрауретральное инъекцирование или инфузионное введение. Способы введения описаны здесь более подробно.
Для парентерального введения носитель предпочтительно содержит воду, физиологический раствор, спирт, жир, воск или буфер. Для перорального введения любой из вышеуказанных наполнителей или твердых наполнителей или носителей, таких как маннит, лактоза, крахмал, стеарат магния, сахарин натрия, тальк, целлюлоза, каолин, глицерин, крахмал, декстрин, альгинат натрия, карбоксиметилцеллюлоза, этилцеллюлоза, глюкоза, сахароза и/или карбонат магния, могут быть использованы.
Иммуногенная композиция, содержащая рекомбинантный/изолированный иммуноген, и иммуногенная композиция, содержащая рекомбинантную конструкцию вектора или векторные частицы, могут быть приготовлены для доставки любым способом, который обеспечивает эффективную дозу иммуногена. Такие методы введения включают пероральное введение или доставку путем инъекции и могу быть в виде жидкости. Жидкая фармацевтическая композиция может включать, например, один или более из следующих: стерильный разбавитель, такой как вода, для инъекций, солевой раствор, предпочтительно физиологический раствор, раствор Рингера, изотонический хлорид натрия, нелетучие масла, которые могут служить в качестве растворителя или суспендирующей среды, полиэтиленгликоля, глицерина, пропиленгликоля или другого растворителя; антибактериального агента, антиоксиданта, хелатирующего агента, буфера и агента для регулирования тоничности, такого как хлорид натрия или декстроза. Препарат для парентерального введения может быть заключен в ампулы, одноразовые шприцы или пузырьки, содержащие множество доз, изготовленных из стекла или пластика. Использование физиологического солевого раствора является предпочтительным, и инъекционные фармацевтические композиции предпочтительно стерильны.
Для получения фармацевтических композиций, содержащих молекулу нуклеиновой кислоты, такой как рекомбинантный экспрессирующий вектор, описанный здесь, молекула нуклеиновой кислоты может присутствовать в любой из множества систем доставки, известных специалистам в данной области, включая бактериальные и вирусные нуклеиновые кислоты экспрессированные в клеточные системы млекопитающих, такие как, например, векторные частицы и экспрессионные рекомбинантные конструкции, как представлено здесь. Методы, включающие полинуклеотиды (например, ДНК) в таких системах экспрессии, хорошо известны специалистам в данной области. В других определенных вариантах осуществления рекомбинантный экспрессирующий вектор, как правило, ДНК, также может быть голым, как описано, например, в и1тег е! а1., 8аепсе, 259:1745-49 (1993) и рассмотрено Сойеп, 8аепсе, 259:1691-92 (1993). Поглощение голой ДНК может быть увеличено путем нанесения ДНК на биоразлагаемые ша- 55 027236 рики, которые эффективно транспортируются в клетки.
Молекулы нуклеиновых кислот могут быть доставлены в клетки в соответствии с любым из нескольких способов, описанных в уровне техники (см., например, АкЕ!аг с! а1., Тгспак Сс11 Вю. 2:139 (1992); ИсЕусгу 8!га!сд1ск Гог АпЕкспкс ОЕдопис1соЕас ТЕсгарсиЕск, са. АкЕ1аг, 1995, Маигсг с! а1., Мо1. МстЬг. Вю1. 16:129-40 (1999); НоГ1апа апа Ниапд, НапаЬ. Ехр. РЕагтасо1. 137:165-92 (1999); Ьсс с! а1., АС8 8утр. 8сг. 752:184-92 (2000); и.8. Ра!сп! №. 6395713; Iη!с^ηаΕоηа1 Ра!сп! АррЕсаЕоп РиЬЕсаЕоп №. АО 94/02595); 8с1Ьо с! а1., Ь!. 1. Сапссг 87:853-59 (2000); 8с1Ьо с! а1., Титоиг Вю1. 23:103-12 (2002); и.8. Ра!сп! АррЕсаЕоп РиЬЕсаЕоп №к. 2001/0007666 и 2003/077829. Такие способы доставки известны специалистам в данной области техники, включают, но не ограничиваются только ими, инкапсулированные в липосомы ионофорезом или путем включения в другие транспортные средства, такие как биоразлагаемые полимеры, гидрогели, циклодекстрины (см., например, Соп/а1с/ с! а1., Вюсопщд. СЕст. 10:1068-74 (1999); Аапд с! а1., [ШсгпаПопЕ АррЕсаЕоп РиЬЕсаЕоп №к. АО 03/47518 апа АО 03/46185); поли(молочно-ко-гликолевая) кислота (РЬСА) и РЬСА микросферы (также полезны для доставки пептидов и полипептидов и других веществами) (см., например, патент США № 6447796; заявка на патент США, 2002/130430); биоразлагаемые нанокапсулы, микросферы и биоадгезивные или белковые векторы (заявка на патент АО 00/53722. В другом варианте осуществления молекулы нуклеиновых кислот могут быть также приготовлены в комплексе с полиэтиленимином и его производными, такими как полиэтиленимин, полиэтиленгликоль-№ацетилгалактозамин (РЕЕРЕС-САЬ) или полиэтилениминполиэтиленгликоль-три-№ацетилгалактозамин (РЕБРЕС-ЕгСАЬ) их производные (см., например, заявку на патент США 2003/0077829).
В конкретных вариантах описанных здесь способов субъект представляет собой человека или животное, кроме человека. Субъекты, нуждающиеся в описанном здесь лечении, могут проявлять симптомы или осложнения заболевания, расстройства или состояния, описанного здесь, или могут быть подвержены риску развития заболевания, расстройства или состояния. Животные, кроме человека, которых можно лечить, включают млекопитающих, например приматов, кроме человека (например, обезьяны, шимпанзе, гориллы и т.п.), грызунов (например, крысы, мыши, песчанки, хомяки, хорьки, кролики), зайцеобразных, свиней (например, свинья, миниатюрные свиньи), лошадей, собак, кошек, коров и других домашних, фермерских и животных из зоопарка.
Композиции, предложенные здесь, могут быть в различных формах, например в твердых, жидких, порошковых, водных или лиофилизированных формах. Примеры подходящих фармацевтических наполнителей и носителей для введения векторной частицы, в том числе вирусных векторных частиц и бактериальных векторных частиц, иммуногенные композиции и рекомбинантные векторы экспрессии известны в данной области. Такие наполнители, носители и/или добавки могут быть приготовлены обычными методами и могут быть введены субъекту в подходящей дозе. Стабилизирующие агенты, такие как липиды, ингибиторы нуклеаз, полимеры и хелатирующие агенты, которые могут быть включены в композиции, описанные здесь, могут способствовать сохранению композиций и компонентов композиции от деградации в организме.
Векторные частицы, в том числе вирусные векторные частицы и бактериальные векторные частицы, иммуногенные композиции, стимулирующие композиции и рекомбинантные экспрессирующие векторы, представленные здесь, могут быть упакованы в виде комплектов. Наборы могут, необязательно, включать один или более компонентов, таких как инструкции по применению, устройства и дополнительные реагенты и компоненты, такие как трубы, контейнеры и шприцы для практических методов. Примерные наборы могут дополнительно включать инструкции по применению устройств или реагентов для обнаружения векторной частицы, рекомбинантного вектора экспрессии или иммуногена у индивидуума и устройство для введения композиций или композиции пациенту.
Наборы, включающие полинуклеотиды, кодирующие иммуноген, также рассматриваются в данном документе. Такой набор может также включать по меньшей мере одну плазмиду, кодирующую оболочку вирусных компонентов, и вектор, кодирующий вариант гликопротеина Е2 вируса Синдбис. Некоторые комплекты будут содержать по меньшей мере одну плазмиду, кодирующую компоненты оболочки вируса, и вектор, кодирующий вариант гликопротеина Е2 вируса Синдбис, вектор, кодирующий по меньшей мере один фактор созревания ДК.
Наборы, включающие вирусный вектор, кодирующий последовательности, представляющие интерес (как правило, кодирующие антиген или иммуноген), и, возможно, полинуклеотидные последовательности, кодирующее фактор созревания ДК, также рассматриваются в данном документе. В некоторых наборах комплект включает по меньшей мере одну плазмиду, кодирующую компоненты оболочки вируса, и вектор, кодирующий вариант гликопротеина Е2 вируса Синдбис.
Набор может также содержать инструкцию. Инструкция обычно описывает способы введения, в том числе методы определения надлежащего состояния субъекта, надлежащее количество дозировки и правильного метода введения композиции. Инструкция может также включать руководство для мониторинга пациента в течение продолжительного времени обработки.
Комплекты, представленные здесь, также могут включать в себя устройства для введения каждой из иммуногенных композиций, описанных здесь, и/или для введения адъювантной композиции субъекту.
- 56 027236
Любое из различных устройств, известных в данной области для введения медицинских препаратов, иммуногенных композиций и вакцин, могут быть включены в наборы, представленные здесь. Примеры устройств включают, но не ограничиваются ими, иглы для подкожных инъекций, внутривенные иглы, катетеры без иглы инъекционного устройства, ингалятор выдачи жидкости, такой как пипетка. Как правило, устройство для введения композиции совместимо с активными компонентами набора. Например, инъекционное устройство без иглы, такое как устройство впрыска, под высоким давлением может быть включено в комплекты векторных частиц, полинуклеотидов и полипептидов, не поврежденных высоким давлением впрыска, но, как правило, не включенных в наборы, которые включают векторные частицы, полинуклеотиды, а также полипептиды, которые могут быть введенными под кожу под высоким давлением.
Варианты осуществления
В некоторых вариантах осуществления раскрытые несколько иммуногенных композиций вводят пациенту, нуждающемуся в этом. Следующие параметры изменяются в соответствии с различными аспектами: количеством доз иммуногенной композиции, пути введения иммуногенной композиции, сайты на предмет для введения иммуногенных композиций, концентрацию или количество активного ингредиента или ингредиентов иммуногенной композиции, количеством иммуногенов и/или адъювантов в иммуногенных композициях.
В дополнение к любому из вышеуказанных вариантов осуществления, описанных в данном описании, предусмотрены варианты осуществления, в том числе любым следующим способом или любой их комбинацией.
1. Способ индукции иммунного ответа у субъекта, причем способ включает:
(a) введение пациенту первой дозы первой иммуногенной композиции, содержащей:
(1) первый полипептид, включающий любой из (ί) первого определенного антигена, (ίί) его иммуногенного фрагмента или (ίίί) его варианта, способного индуцировать иммунный ответ, специфичный для первого определенного антигена, (2) адъювант агониста или нетоксичный липид А-связанного адъюванта;
(b) введение пациенту первой дозы второй иммуногенной композиции, содержащей векторные частицы, которые преимущественно обеспечивают рекомбинантный вектор экспрессии на антигенпредставляющих клетках, где указанный рекомбинантный вектор экспрессии содержит нуклеотидную последовательность, которая кодирует второй полипептид, содержащий любое из (ί) первого определенного антигена, (ίί), его иммуногенного фрагмента или (ίίί) его варианта, способного индуцировать иммунный ответ, специфичный для первого определенного антигена;
каждая доза в количествах, эффективных, чтобы индуцировать или усиливать иммунный ответ, специфичный для первого определенного антигена.
В варианте 1 осуществления первый полипептид может быть таким же или отличным от второго полипептида.
2. Вариант осуществления 1, который отличается тем, что любой из иммуногенных фрагментов сохраняет способность индуцировать иммунный ответ, специфичный для первого определенного антигена, и включает в себя, например, по меньшей мере 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 48 или 50 аминокислот, смежных с антигеном.
3. Вариант осуществления 1, который отличается тем, что любой из иммуногенных вариантов может, например, сохранять по меньшей мере 90% идентичности аминокислот, по меньшей мере 10 смежных аминокислот с антигеном или по меньшей мере 85% идентичности аминокислот в течение по меньшей мере 15 смежных аминокислот с антигеном. Другие примеры включают по меньшей мере 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичности по меньшей мере 50 смежных аминокислот с антигеном или по меньшей мере 100 смежных аминокислот с антигеном.
4. Вариант осуществления 1, который отличается тем, что первый полипептид представляет собой небольшой иммуногенный фрагмент антигена из 50 аминокислот или менее в длину и второй полипептид представляет собой полноразмерный антиген или большой фрагмент из 50 аминокислот или более в длину, возможно имеющий по меньшей мере 80, 85, 90% или 95% идентичности с полноразмерным антигеном.
В варианте 1 осуществления вторая иммуногенная композиция может быть введенной после, до, или одновременно с введением первой иммуногенной композицией.
5. Любой из предшествующих вариантов осуществления, который отличается тем, что вторая иммуногенная композиция, содержащая векторные частицы, вводится после введения первой иммуногенной композиции, содержащей иммуногенный полипептид.
6. Любой из предшествующих вариантов осуществления, дополнительно содержащий после введения первой дозы первой и второй иммуногенных композиций любой из: (а) введение третьей иммуногенной композиции, или (Ь) введение второй дозы первой иммуногенной композиции, или (с) введение второй дозы второй иммуногенной композиции.
- 57 027236
7. Любой из предшествующих вариантов осуществления, который отличается тем, что (а) интервал между первым и вторым введениями и/или (Ь) интервал между вторым и третьим введениями составляет 2-4 недель, до 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 26 или 28 дней, или составляет 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51 или 52 недель, или составляет 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 лет после предыдущей иммунизации.
8. Любой из предшествующих вариантах осуществления, который отличается тем, что вводят (а) две дозы; (Ь) три дозы; (с) четыре дозы или (й) пять доз первой иммуногенной композиции. Любая комбинация любых из вышеуказанных введений предполагает, например, что (а) каждую дозу первой иммуногенной композиции вводят перед введением второй иммуногенной композиции; (Ь) по меньшей мере одну дозу первой иммуногенной композиции вводят после введения второй иммуногенной композиции; (с) по меньшей мере одну дозу первой иммуногенной композиции вводят одновременно с введением при второй иммуногенной композиции; (й) по меньшей мере одну дозу первой иммуногенной композиции вводят перед введением второй иммуногенной композиции, и каждую из оставшихся доз первой иммуногенной композиции вводят после введения второй иммуногенной композиции; или (е) каждую дозу первой композиции вводят одновременно со второй композицией.
Режим ввода включает (а) первую иммуногенную композицию, содержащую полипептид, и (Ь) вторую иммуногенную композицию, содержащую вирусную векторную частицу, приводящую к превосходству иммунного ответа, содержащего сильный антиген-специфический СЭ4' Т-клеточный ответ, сильный гуморальный иммунный ответ и сильный антиген-специфический СЭ8' Т-клеточный ответ. После этого режима (с) третья иммуногенная композиция, содержащая полипептид, в результате дала даже более высокие результаты. Обе первичные реакции (т.е. простая реакция, наблюдаемая после иммунизации) и вторичная реакция (т.е. реакция, наблюдаемая после бустерной иммунизации) могут быть измерены с точки зрения максимальной реакции (например, высоты пика) и последующего ответа памяти (например, когда х ось времени и у ось в % число СИ4 или СИ8 Т-клеток от общего количества клеток). В качестве примера в соответствии с настоящим изобретением вторичный ответ (т.е. реакция, наблюдаемая после введения импульса) больше, чем простой ответ, по меньшей мере больше одного из максимального ответа или иммунного ответа, где больше чем означает по меньшей мере или до 10%, или 20%, или 30%, или 40%, или 50% больше, чем соответствующий отклик, полученный после основной иммунизации (первичный ответ). В качестве примера вторая иммунизация повышает СИ8 и СИ4 ответы по меньшей мере на 25%.
9. Любой из предшествующих вариантов, который отличается тем, что первая иммуногенная композиция дополнительно содержит еще один иммуноген, где указанный иммуноген может быть полипептидом, содержащим любой из (ί) второго обозначенного антигена, (ίί) его иммуногенного фрагмента или (ίίί) его варианта, способного индуцировать иммунный ответ на конкретные определенные вторые антигены.
10. Любой из предшествующих вариантов осуществления, который отличается тем, что рекомбинантный вектор экспрессии (вторая иммуногенная композиция) дополнительно содержит другую нуклеотидную последовательность, которая кодирует другой иммуноген, где указанный иммуноген может быть полипептидом, содержащим любой из (ί) второго обозначенного антигена, (ίί) его иммуногенного фрагмента или (ίίί) его варианта, способного индуцировать иммунный ответ на конкретный второй определенный антиген.
11. В любом из предыдущих вариантов осуществления первый и второй определенные антигены могут быть одинаковыми или различными. В этих вариантах иммунный ответ генерируется против первого и второго определенных антигенов, содержащих сильный антиген-специфический СЭ4' Т-клеточный ответ, сильный гуморальный иммунный ответ и сильный антиген-специфический СЭ8' Т-клеточный ответ. В качестве дополнительных примеров иммуногенные композиции, содержащие полипептид и вирусный вектор для индукции иммунного ответа, могут быть введены на третий определенного антиген или четвертый или пятый антиген.
12. Любой из предшествующих вариантов осуществления, который отличается тем, что антиген (первый, второй, третий, четвертый и/или пятый) является (а) ассоциированным с опухолью антигеном или (Ь) от инфекционного микроорганизма, выбранного из вируса, бактерии, грибки, и паразита. В различных примерах ассоциированный с опухолью антиген представляет собой антиген почечного рака, антиген рака предстательной железы, антиген мезотелиомы, антиген рака поджелудочной железы, антиген меланомы, антиген рака молочной железы, антиген рака легких или антиген рака яичников; необязательно, антиген рака простаты кислой фосфатазой предстательной железы, специфический антиген простаты, ΝΚΧ3.1 или простатический мембраноспецифический антиген. В различных примерах антиген представляет собой антиген вируса, необязательно, от вируса простого герпеса-2 (ВПГ-2). Антиген может представлять собой любой из антигенов, описанных здесь.
13. Первый и второй определенные антигены, например, могут быть различными антигенами из той же опухоли или того же вируса или другого микроорганизма. Альтернативно, первый и второй определенные антигены могут быть из разных видов рака или от различных вирусов или микроорганизмов.
- 58 027236
14. Любой из предшествующих вариантов осуществления, который отличается тем, что полипептид первой иммуногенной композиции может быть включенным в диапазон от около 0,01 до примерно 1000 мкг/кг массы тела субъекта. В различных вариантах осуществления иммуноген присутствует в диапазоне от примерно 0,1 до примерно 100 мкг/кг массы тела субъекта.
15. Любой из предшествующих вариантов осуществления, который отличается тем, что вводится эффективное количество композиции для индукции цитотоксических Т-лимфоцитов в отношении клетки, несущий антиген, например, против опухолевых клеток или против микроорганизма. В любом из предыдущих вариантов осуществления вводят эффективное количество композиции для снижения вероятности возникновения или рецидива опухоли, содержащей ассоциированный с опухолью антиген. В любом из предыдущих вариантов осуществления вводят эффективное количество композиции для снижения вероятности возникновения и тяжести заболевания, вызванного микроорганизмом. Такие методы могут предотвратить или лечить инфекции, вызванные инфекционным микроорганизмом.
16. Любой из предшествующих вариантов осуществления, который отличается тем, что ТЬР4 адъювант агониста или нетоксичный липидный А-связанный адъювант представляет собой монофосфориллипид, или 3-де-О-ацилированный монофосфориллипид А (МРЬ), или миметический липид, или ОЬА формулы I, как описано в целом выше, или ОЬА формулы (1а)
или его фармацевтически приемлемая соль, где Р1, Р3, Р5 и Р6 представляют собой Сц-С20-алкил;
Р2 и Р4 представляют собой С12-С20-алкил;
в более конкретном варианте ОЬА имеет формулу (1а), изложенную выше, в которой Р1, Р3, Р5 и Р6 представляют собой Сц-С14-алкил; Р2 и Р4 представляют собой С12-С15-алкил; в дальнейшем более конкретные варианты ОЬА имеют формулу (1а), изложенную выше, в которой Р1, Р3, Р5 и Р6 представляют собой Сц-алкил;и Р2 и Р4 представляют собой С^-алкил;
или ОЬА имеет структуру, выбранную из следующей химической формулы (1Ь)
или его фармацевтически приемлемая соль, где Ьь Ь2, Ь3, Ь4, Ь5 и Ь6 являются одинаковыми или различными и независимо выбранными из О, ΝΉ и (СН2);
Ь7, Ь8, Ь9 и Ь10 могут быть одинаковыми или различными и на любой случай могут быть либо отсутствующими, либо С(=О); представлять собой кислотную функциональную группу;
Υ2 и Υ3 могут быть одинаковыми или различными и каждый независимо выбран из ОН, §Н, а также кислотные функциональные группы;
Υ4 обозначает ОН или §Н;
Р1, Р3, Р5 и Р6 могут быть одинаковыми или различными и, каждый независимо, выбраны из группы С8-Св-алкил;
Р2 и Р4 могут быть одинаковыми или различными и, каждый независимо, выбраны из группы С6-Сц-алкил.
17. Любой из предшествующих вариантов осуществления, который отличается тем, что другой адъювант (в дополнение к ТЬР4 адъювантному агонисту или нетоксическому липидному А-связанному адъюванту первой иммуногенной композиции) входит в любую из иммуногенных композиций.
18. Любой из предшествующих вариантов осуществления, который отличается тем, что адъювант, предпочтительно ОЬА, сформулирован в стабильной эмульсии масло-в-воде. В примерах вариантов осуществления ОЬА присутствует в количестве 0,1-10 мкг/инъекцию, или в количестве 0,2-5 мкг/инъекцию, или в количестве 0,5-2.5 мкг/инъекцию, где инъекцию вводят человеку по меньшей
- 59 027236 мере на 50 кг массы тела.
19. Любой из предшествующих вариантов осуществления, который отличается тем, что векторные частицы, которые преимущественно обеспечивают рекомбинантный вектор экспрессии на антигенпредставляющие клетки, представляют собой клетку, частицу вирусного вектора или вирусоподобные частицы.
20. Любой из предшествующих вариантов осуществления, который отличается тем, что антигенпредставляющие клетки являются дендритными клетками, предпочтительно дендритными клетками, экспрессирующими ОС-ЗЮИ.
21. Любой из предшествующих вариантов осуществления, который отличается тем, что векторные частицы предпочтительно содержат лентивирусный векторный геном или, альтернативно, поксвирусный векторный геном, векторный геном вируса коровьей оспы, векторный геном аденовирусов, векторный геном, связанный с аденовирусом, векторный геном вируса герпеса и векторный генома альфа-вируса.
22. Любой из предшествующих вариантов осуществления, который отличается тем, что векторная частица является лентивирусной векторной частицей, которая включает в себя лентивирусный векторный геном; частицей поксвирусного вектора, которая содержит геном поксвирусного вектора, вектор вирусных частиц осповакцины, которая содержит векторный геном вируса коровьей оспы; частицей аденовирусного вектора, что включает в геном аденовирусный вектор, аденовирус, связанный частицы вирусного вектора, которые содержат аденовирус-связанный геном вирусного вектора, частицей герпесвирусного вектора, который включает векторный геном вируса герпеса, или альфа-частицы вирусного вектора, который содержит геном вектора альфа-вируса.
23. Любой из предшествующих вариантов осуществления, который отличается тем, что векторная частица содержит оболочки белка, которые преимущественно обеспечивают векторные частицы дендритных клеток, экспрессирующих ЭС-З1СИ, и, необязательно, оболочку, которая является вариантом арбовирусной оболочки, или альфа-вирусной оболочки, или оболочки вируса Синдбис.
24. Любой из предшествующих вариантов осуществления, который отличается тем, что векторные частицы являются частицами лентивирусного вектора, содержащие лентивирусный геном и содержащие (псевдотип с) гликопротеин из арбовирусов, который преимущественно обеспечивает векторные частицы дендритных клеток, экспрессирующих ЭС-З1СИ, предпочтительно гликопротеин из альфа-вирусов, необязательно, вируса Синдбис и, необязательно, гликопротеин Е2 вируса Синдбис, содержащего мутацию в положении 160. Альтернативно, векторная частица содержит геном альфа-вирусов и гликопротеин альфа-вирусов, который предпочтительно обеспечивает векторные частицы дендритных клеток, экспрессирующих ОС-ЗЮИ.
25. Любой из предшествующих вариантов осуществления, который отличается тем, что лентивирусная векторная частица содержит оболочку, содержащую вариант гликопротеина Е2 вируса Синдбис, имеющего по меньшей мере 70, 75, 80, 85, 90 или 95% аминокислотной идентичности к аминокислотной последовательности родного Е2 вируса Синдбис, и (а) содержит по меньшей мере одну мутацию, в которой аминокислота в положении остатка 160 либо отсутствует, либо имеет аминокислоту, отличную от глутаминовой кислоты, и (Ь) гликопротеин Е2 не является фрагментом слитого белка, который содержит белок Е3 вируса Синдбис.
26. Любой из предыдущих вариантов осуществления, который отличается тем, что векторные частицы преимущественно обеспечиваются рекомбинантными векторами экспрессии на дендритных клетках, необязательно векторные частицы инфицируют предпочтительно дендритные клетки, например, соотношение количества инфицированных дендритных клеток и инфицированных недендритных клеток (или не экспрессирующихся ЭС-ЗЮИ клеток) составляет по меньшей мере 2:1, по меньшей мере 3:1, по меньшей мере 4:1, по меньшей мере 5:1, по меньшей мере 6:1, по меныпей мере 7:1, по меньшей мере 8:1, по меньшей мере 9:1, по меньшей мере 10:1, по меньшей мере 20:1, по меньшей мере 30:1, по меньшей мере 40:1, по меньшей мере 50:1, по меньшей мере 100:1, по меньшей мере 200:1, по меньшей мере 500:1, по меньшей мере 1000:1, по меньшей мере 5000:1, по меньшей мере 10000:1 или больше.
27. Любой из предшествующих вариантов осуществления, который отличается тем, что две композиции вводят в разные места, при необходимости разными путями введения. Например, способ введения может быть парентеральным, энтеральным, пероральным, внутримышечным, внутрикожным, подкожным, внутри опухолевым, интранодальным, интраназальным, трансдермальным, ингаляционным, через слизистую оболочку или другое место.
28. Любой из предшествующих вариантов осуществления, который отличается тем, что вторая иммуногенная композиция содержит векторные частицы, которые вводятся подкожно или внутрикожно.
29. Любой из предшествующих вариантов 1, который отличается тем, что композиции, содержащие адъювант, вводят подкожно, или внутримышечно, или перорально.
В вариантах осуществления раскрытые в данном документе наборы содержат первую иммуногенную композицию, как описано в любом из предыдущих вариантов осуществления, а также необязательно содержат любой из признаков, описанных выше.
В других вариантах осуществления, описанных в данном документе, раскрыта первая иммуногенная композиция для использования в (или для использования в получении лекарственного средства для
- 60 027236 применения в) любом из предшествующих способов, причем указанная первая иммуногенная композиция содержит:
(1) первый полипептид, содержащий любой из (ί) первого определенного антигена, (ίί) его иммуногенного фрагмента или (ίίί) его варианта, способного индуцировать иммунный ответ, специфичный для первого определенного антигена; и (2) ТЬК4 агонистичного адъюванта или нетоксичного липидного А-связанного адъюванта, каждый состоящий из полипептида и адъюванта в количестве, эффективном для индукции или усиления иммунного ответа, специфичного для первого определенного антигена.
В других вариантах осуществления также раскрыта вторая иммуногенная композиция для использования в (или использования в получении лекарственного средства для применения) любом из предшествующих способов, причем вторая иммуногенная композиция содержит векторные частицы, которые преимущественно обеспечивают рекомбинантный вектор экспрессии на антиген-представляющих клетках, где указанный рекомбинантный вектор экспрессии содержит нуклеотидную последовательность, которая кодирует второй полипептид, содержащий любой из (ί) первого определенного антигена, (ίί) его иммуногенного фрагмента или (ίίί) его варианта, способного индуцировать иммунный ответ, специфичный для первого определенного антигена, причем указанная векторная частица вводится в количестве, эффективном для индукции или усиления иммунного ответа, специфичного для первого определенного антигена.
Другие варианты осуществления и применения будут очевидны специалистам в данной области техники в свете настоящего раскрытия. Следующие примеры приведены только в качестве иллюстрации различных вариантов осуществления и не должны толковаться как ограничивающие изобретения какимлибо образом.
Примеры
Пример 1.
Иммунный ответ на иммуноген: введение иммуногена и адъюванта.
В этом примере описан иммунный ответ, индуцированный на иммуноген в сочетании с адъювантом, который является агонистом То11-подобного рецептора 4 (ТЬК4).
Материалы: СЬА синтезируются в антиполярных липидах (А1аЬак1ег, АЬ) и сформулированы в 8Е согласно ШГесйонк ОЬеаке Кекеагск 1пк1йи1е (8еай1е, УА) (см. также, например, заявки на патент США 2008/0131466 и 2010/0310602). Н8У-2 рекомбинантный ИЬ19 белок экспрессируется в бакуловирусной экспрессионной системе (Рагадоп Вюкегисек, ВаШтоге, МО). Примерные, полноразмерные последовательности полипептида ИЬ19 представлены в 8ЕО ГО NО: 36 (см., например, СепВапк под номером № 044488.1). Аминокислотные последовательности пептидов, содержащие эпитопы ИЬ19, используемые в этих примерах, относятся к позициям аминокислот в этом полноразмерном ИЬ19 полипептиде.
Уход за животными: Мыши размещаются в специальном пространстве для животных в Фонде исследований на животных, в пределах Иммунного Научно-исследовательского института (ГОМ). Объекты соответствуют требованиям правил υδΟΛ, и животные получают защиту от Управления по охране лабораторных животных (ОЬАУ). ГОМ сертифицирована Ассоциацией по оценке ухода за лабораторными животными (ААРАС) и является активистом Институционального комитета по уходу и использованию (1АСиС), который включает в себя консалтинговые ветеринарии. Все протоколы животных рассматриваются и утверждаются ГОМАСиС. Эвтаназия животных выполняется, когда необходима, и контролируется введением ингаляций углекислого газа и/или цервикальной дислокации. Эти методы приведены в соответствии с рекомендациями Группы по эвтаназии Американской ветеринарной медицинской ассоциации.
Группы из пяти мышей, иммунизированных внутримышечно через первичную иммунизацию/бустерный режим иммунизации; мышей первоначально иммунизировали в день 0 (первичная иммунизация) и затем бустерно на 21 день (к0 первичная/к21 бустерная) с 5 мкг рекомбинантного Н8У-2 иЬ19 белка в комбинации с 5 мкг глюкопиранозила липида А (СЬА), сформулированного в стабильной эмульсии масло-в-воде (СЬА-8Е), одной стабильной эмульсии масло-в-воде (8Е) или РВ8. Животных умерщвляли, клетки селезенки, были выделенными из животных на четвертый день после повышения иммунизации. Селезеночный СО4 Т-клеточный ответ измеряли после е\ νί\Ό повторной стимуляции иЬ19 одним пептидным эпитопом (аминокислоты 997-1011, последовательность NΥΡδδIΚ^РУУ^НАΚ (8ЕС ГО NО: 37)) или эпитопом 2 (аминокислоты 1185-1199, последовательность СЕИАТРУАТОШУР (8ЕС ГО NО: 38) путем определения уровня ΙΡΝ-γ, ΪΝΡ-α и 1Ь-2 внутриклеточного окрашивания цитокинов (1С8) с последующей активацией флуоресцентной сортировки клеток (РАС8). Результаты представлены на фиг. 1. Проценты цитокин-положительных СО4 Т-клеток показаны для каждой группы.
Титры антител определяли с помощью иммуноферментного анализа (ЕЬ18А). Образцы крови получали от мышей и были подготовлены сыворотки. Серийные разведения образцов добавляли в
96-луночные планшеты с рекомбинантным иЬ19 белком. Наличие специфических анти-иЬ19 антител детектировали с мышиными определенного класса и конкретными изотипами специфических антител (анти -1дС, -1дС1, -1дС2а и -1дС2Ь), конъюгированных с пероксидазой хрена (НИР). Связанные НРР- 61 027236 конъюгаты были обнаружены стандартными анализами с использованием пероксидазы δι.^Β1ικ® ТМВ на микролуночных субстратах (КРЬ, Кпкедагй & Репу ЬаЬога1опе5, ОайкегеЬигд, МО). Реакции были определены количественно путем считывания пластины при 450 нм с использованием δρесΐ^аΜаx® Р1и5 и планшетного ридера (Мо1еси1аг Оеу1се5, Ιικ., δυηηγνπΕ, СА). Мышей иммунизировали рекомбинантным белком ИЬ19 в сочетании с ОЬА-δΕ, также генерируется значительное повышение специфического антительного ответа, чем у мышей, иммунизированных только одним рекомбинантным белком Ηδν-2 иЬ19 (в РВ8).
Пример 2.
Иммунный ответ на иммуноген в сочетании с адъювантом и при экспрессии вирусным рекомбинантным вектором.
В этом примере описан индуцированный иммунный ответ, когда мышей иммунизировали иммуногеном в сочетании с адъювантом или иммунизировали векторными частицами, содержащими рекомбинантный экспрессирующий вектор, который кодирует и экспрессирует иммуноген.
Лентивирусный вектор (ПС-МЬУ) является самостоятельным инактивированным интегрированным неполноценным лентивектором, который использует модифицированный гликопротеин оболочки вируса Синдбис для избирательного ввода домена (см., например, международную патентную заявку АО 2011/011584). Если коротко, то вектор был сделан избыточной интеграцией некомпетентно через комбинацию мутантной интегразы (ро1С64У), что делает его нефункциональным (Аро1ота е1 а1., Мо1. Т1ег. 15:1947 (2007)), и векторная основа удалена с И3 региона ЬТК (до ай) и 3' ЬТК полипуринового тракта (РРТ). Таким образом, в дополнение к неработоспособной интегразе, основной состав вектора предотвращает транскрипцию полноразмерного геномного вектора (самоинактивирующихся мутаций), в результате одной ЬТК обратной транскрипцией эписомальной двухцепочечной ДНК в инфицированных дендритных клетках, которые не являются шаблонными для хромосомной интеграции (Вауег е1 а1., Мо1. Ткег. 16:1968 (2008); Кайог е1 а1., Ргос. ЫаИ. Асай. 8с1. И8А 106:18786-791 (2009); ИриЬ 2009 Ой 20; Ма е1 а1., Мо1. Т1ег. 10:139 (2004)). 75% от родительского генома ВИЧ был удален из ЭС-ШЕУ, включая все регуляторные и вспомогательные белки, за исключением Кеу.
Группы из пяти мышей иммунизировали внутримышечно либо с О^Α-δΕ-адъювантом и гИЬ19 белком или подкожно с лентивирусным вектором (ОС-МЬУ) Дттипе Эе51дп Согрогайоп, δеаΐί1е, АА), кодирующим Ηδν-2 полипептид, ИЬ19 ИЬ19. Рекомбинантный ИЬ19 белок экспрессируется в бакуловирусной системе экспрессии (Рагадоп В|о5ег^'1се5, ВаШтоге, МО). Титры антител были определены и селезеночно иЬ19-специфические белки С.ГО4 и С.ГО8 Т-клетки были анализированы на производство ΙΤΝ-γ и ТХЬ-α Ιί','δ (см. подробности эксперимента в примере 1). Селезеночный СГО4 Т-клеточный ответ измеряли после ех угуо повторной стимуляции ИЬ19 пептидного эпитопа 2 (аминокислоты 1185-1199 (δΕΟ ΙΌ ЫО: 38) (см. пример 1)). Селезеночный С.ГО4 Т-клеточный ответ измеряли ех у1уо повторной стимуляцией с комбинацией ИЬ19 СГО8 пептидного эпитопа 1 (аминокислоты 1017-1031, последовательности ΕNΑ^ТΥΑ^ΜΑОΥРКΜ (δΕΟ ΙΌ МО:39) и ИЬ19 С.ГО8 пептидного эпитопа 2 (аминокислоты 10451059, последовательности ΗΡОРОРТVVК^^КРV (δΕΟ ΙΌ МО: 40)). Данные представлены на фиг. 2 (с левой стороны).
Титры антител сыворотки конечной точки определялись ферментсвязанным иммуноферментным анализом (Ε^IδΑ), как описано в примере 1. Образцы крови получали от мышей только перед умерщвлением. Определялись специфические титры антител (ЩО). Данные показаны на фиг. 2 (с правой стороны).
Пример 3.
Иммунный ответ на иммуноген (Овальбумин).
Введение двух иммуногенных композиций.
В этом примере описана индукция иммунного ответа, когда мышей иммунизировали первой векторной частицей, содержащей рекомбинантный экспрессирующий вектор, который кодирует и экспрессирует иммуноген, и затем впоследствии иммунизировали с иммуногеном в сочетании с адъювантом.
Группы мышей иммунизировали подкожно ЭС-МЕУ, кодированным овальбумином, и бустерно с РВ8, одним ОЬА/δΕ, рекомбинантным овальбумином в сочетании с δΕ (гР + δΕ) или ОЬА-δΕадъювантированным овальбумином (гР + ОЬА/δΕ) внутримышечно. Клетки селезенки выделены из животных через четыре дня после повышения иммунизации. Селезеночный овальбумин-специфический СГО8 Т-клеточный ответ анализировали на производство ΙΤΝ-γ и ТОТ1^ Κ','δ. Данные представлены на фиг. 3.
Пример 4.
Иммунный ответ на иммуноген (Ηδν-2 ИЬ19).
Введение двух иммуногенных композиций.
В этом примере описана индукция иммунного ответа, когда мышей иммунизировали иммуногенной композицией, содержащей векторные частицы, содержащие рекомбинантный вектор экспрессии, кодирующий и экспрессирующий иммуноген, иммунизировали иммуногенной композицией, содержащей иммуноген в сочетании с адъювантом, или иммунизировали последовательностями с каждой иммуногенной композицией.
- 62 027236
Мышей иммунизировали гиЬ19 белком + ОЬА^Е внутримышечно и подкожно с ОС-НГОУ, кодирующим ЖУ-2 полипептидом иЬ19. Группы из пяти мышей С57ВЬ/6 иммунизировали с ОЬА^Еадъювантированным гиЬ19 белком или РВδ и повторно иммунизировали ОЬА^Е-адъювантированным гиЬ19 белком или ЭС-МЬУ, содержащим полинуклеотид, который кодирует иЬ19. Клетки селезенки выделяли из животных на десятый день после повышения иммунизации. После стимуляции ех У1уо с одним 15-мерным пептидом, содержащим либо СГО4, либо СЭ8 иЬ19 эпитопы, селезеночный иЬ19специфический СЭ4 и СЭ8 Т-клеточный ответ анализировали на производство ΓΡΝ-γ, ТОТ^а и ГЬ-2 Κ.'δ. Точечные участки приведены на фиг. 4 для одного представителя мыши на группу. Числовые значения, указанные на правой стороне каждого точечного участка, представляют собой проценты СГО4 или СЭ8 Т-клеток, которые ШЫ^+ и Т№-а+.
На фиг. 4А (правая сторона) иллюстрируется процент цитокин-позитивных СЭ8 Т-клеток, каждая стимулирована двумя различными эпитопами СГО8 иЬ19 (иЬ19 СЭ8 пептидом эпитопа 1 (аминокислоты 1017-1031, δЕ^ ГО NО: 39) и иЬ19 СГО8 пептидом эпитопа 2 (аминокислоты 1045-1059, δЕ^ ГО NО: 40) (см. пример 2)). Эти данные были получены от СГО8 Т-клеток селезенки от животных в группе, иммунизированной с первым ОЬА^Е-адъювантированным гиЬ19 белком (первичная композиция) и с ОС-НГОУ кодирующим иЬ19 белком (бустерная композиция).
Средние точки титра антитела были определены иммуноферментным анализом ЕЬГОА, образцы крови получали от мышей через 10 дней после последней иммунизации и сыворотки были подготовлены. Образцы серийного разведения добавляли в 96-луночные планшеты иммуноанализа, покрытые иЬ19 рекомбинантным белком. Наличие конкретных анти-иЬ19 антител детектировали с мышиными антителами определенного класса и конкретным изотоп-специфическим антителом (антзШдО, 4дО1, 4дО2а и 4дО2Ь), конъюгированными с пероксидазой хрена (НКР). Связанные НКР-конъюгаты были обнаружены стандартным методом с использованием пероксидазы δи^еВ1ие® ТМВ микролуночного субстрата (КРЬ, Кпкедагб & Репу ЬаЬогаГопек, ОаПкегкЬигд, МО). Реакции определяли количественным путем считывания пластины при 450 нм использованием δресГ^аМаx® Р1ик планшета-ридера (Мо1еси1аг Эеуюек, Ьк., δиииуνа1е, СА). Титры антител оценивались по средней точке для каждого животного и представлены на фиг. 4В.
Неожиданно и желательно, СГО8 Т-клеточный ответ, порожденный одной ОС-НГОУ иммунизацией, был увеличен примерно в 5 раз у мышей, которые были инициированы с гиЬ19 + ОЬА^Е по сравнению с контролем. Лентивекторная не простая Т11 СГО4 Т-клетка как моноагент, однако, когда она была доставлена бустерно белок/ОЬА первично, на удивление была одинаково эффективна при повышении (в виде повышение рекомбинантных белков ОЬА) Т11 СГО4 Т-клеточного ответа.
Пример 5.
Иммунный ответ на иммуноген (ЖУ-2 иЬ19).
Введение двух иммуногенных композиций.
В этом примере описана индукция иммунного ответа, когда мышей иммунизируют одновременно с иммуногенной композиции, содержащей иммуноген в сочетании с адъювантом и с иммуногенной композицией, содержащей векторные частицы, содержащие рекомбинантный экспрессирующий вектор, который кодирует и экспрессирует иммуноген.
Группы из пяти мышей С57ВЬ/6 иммунизировали с ОЬА^Е-адъювантированным гиЬ19 белком или РВδ внутримышечно и бустерно с ОЬА^Е-адъювантированным гиЬ19 белком внутримышечно и ЭС-НГО-У содержащим полинуклеотид, кодирующий иЬ19 белок подкожно. Клетки селезенки выделены из животных на 10 день после повышения иммунизации. После стимуляции ех У1уо с одним 15-мерным пептидом, содержащим либо СГО4, либо СГО8 иЬ19 эпитоп, селезеночно-специфические иЬ19 СГО4 и СГО8 Т-клетки анализировали на производство ΕΡΝ-γ, ТЫР-а и ГО-2 IСδ. Данные представлены на фиг. 5. Данные показывают, что одновременная доставка гР+ОЬА^Е вакцин на основе лентивирусов эффективно генерируют как СГО4 и СГО8 антиген-специфические Т-клетки и в присутствии и в отсутствие ранее существовавших антиген-специфических С.ГО4 Т-клеточных пулов. Фиг. 5А (правая сторона) иллюстрирует проценты цитокинов СГО4 положительных Т-клеток, стимулированных каждым из двух различных эпитопов С.ГО4 иЬ19 (С.ГО4 пептидом эпитопа 1 и СГО4 пептидом эпитопа 2; см. пример 1), и процент цитокин-позитивных СГО8 Т-клеток, стимулированных каждой из двух различных эпитопов СГО8 иЬ19 (СГО8 пептидом эпитопа 1 и С.ГО8 пептидрм эпитопа 2, см. примеры 2 и 4).
Сыворотки, полученные из животных в каждой группе, через пять дней после бустерной иммунозации и через десять дней после бустерной иммунизации, специфические !дО антитела были обнаружены. Титры антител средней точки были определены, как описано в примере 4. Титры специфических !дО антител средней точки для каждого животного показаны на фиг. 5В.
- 63 027236
Пример 6.
Иммунологичный ответ, индуцированный введением иммуногенной композиции, содержащей первый иммуноген и адъювант, и введение векторной частицы, содержащей рекомбинантный вектор экспрессии для экспрессии первого иммуногена и второго иммуногена.
ЭС-МЬУ векторная конструкция: ЭС-МЬ-У вектор получен, как описано в примере 1. ЖУ-2 белки, дЭ и ИЫ9, кодируются в мультицистронном векторе, в котором два антигена разделяются самостоятельно пептидом расщепления 2А (см., например, δζушсζак е( а1., Ν;·ιΙ. Вю1есНпо1. 22:589 (2004); ТгкЬаз е( а1., ВМС. Вю1. 6:40 (2008); Υаηд е( а1., Сепе ТНег. 15:1411 (2008)). Рекомбинантный экспрессирующий вектор сконструирован так, чтобы выразить оба дО и ЦЬ19 в соответствии с методами молекулярной биологии и методами, обычно практикующимися в данной области техники. Для лентивирусной векторной конструкции см. международную заявку на патент VΟ 2011/011584.
ЖУ-2 рекомбинантные белки, ЦЫ9 и дЭ, экспрессируются в бакуловирусной экспрессионной системе (Рагадоп Вюзегуюез, ВаНгшоге, МО). Иммуногенные композиции приготовлены с дЭ, сформулированы с СЬА/δΕ, ИЬ19 сформулированы с СЬА/δΕ и дЭ и ИЬ19 сформулированы вместе с СЬА/δΕ.
Группы из пяти мышей иммунизируют, как указано в табл. 2. Первый бустер вводят через 28 дней после первичной иммунизации. Группы мышей, которые получают второй бустер, иммунизировали через 28 дней после первого бустера.
Таблица 2
Схема иммунизации
Первичная доза 1“ Бустерная доза 2“ Бустерная доза
гР + СЬА/5Е ПС-ΝΙΙ.ν
гР + СЬА/5Е ОС-МЬУ гР + СЬА/δΕ
гР + СЬА/δΕ гР + СЬА/δΕ ПС-МЬУ
гР + СЬА/δΕ гР + СЬА/δΕ и ΙΧ.-Ν 1ЬУ Ни один
гР + СЬА/δΕ и ЬС-ЕНЬУ Ни один Ни один
гР + ОЬА/5Е и ОС-ЧШУ гР + СЬА/δΕ и ПС-МЬУ Ни один
ОС-ΝΙίν гР + СЬА/δΕ Ни один
ЬСМЬУ гР + СЬА/δΕ ЬС-ЕЛЬУ
Иммунный ответ (антительный, СЭ4 Т-клеточный и СЭ8 Т-клеточный) анализируют на 4 день после последней иммунизации, за исключением мышей, которые получают только одну иммунизацию, когда иммунный ответ анализируют на 12 день. Образцы крови берут у каждой мыши, и селезенка удаляется из животных. Общее количество клеток будет определяться с помощью Сиауа ΕаδуСуΐе™ Р1и8 (МйИроге, ВШепса, МА). Общая частота СО 8 и СЭ4 Т-клеток и их фенотипичная память (центральная против эффекторной) в пределах каждого образца определяется методом проточной цитометрии. Κ,’δ также выполняется для анализа антиген-специфических Т-клеточных ответов и определения присутствия ΙΡΝ-γ, 1Ь-2 и ТМЕ -α, производящих Т-клетки после ех У1уо стимуляции спленоцитом с 15-мерными пептидами, содержащими известные Т-клеточные эпитопы, по существу, как описано в (Ьш е( а1., Шипе, 457(7225):87 (2009); δеάе^ е( а1., №Ь Кеу. 1шшипо1. 8:247 (2008)). Специфический ответ антитела дЭ определялся методом Ε^IδА.
Защита исследований.
Защита исследования: группы из десяти мышей иммунизировали первично (первичная иммунизация) (день 0) и бустерно 28 дней (день 28). Некоторые группы мышей получают второй бустер на 28 день после первого бустера (день 56). Иммуногенные композиции для каждой из первичной, первой и второй иммунизаций определяются по результатам, полученным из предыдущего исследования. Через четыре дня после второго бустера (60-й день) мышей заражали не менее 50 X ЬЭ50 ЖУ-2. Кровь собирали от каждого животного на каждый день прививки (т.е. 0, 28 и 56 дни). Вагинальные мазки берут через 1, 3 и 5 дней после заражения. На 14 день после контрольного заражения вагинальные тампоны взяты из выживших животных, а затем из животных собирали кровь и селезенку. Конечные точки включают выживание и снижение титра вируса (определяется в режиме реального времени ЖУ-2 ОМА РСК, чувствительного к 1-10 экз.). Антигенный специфический антительный ответ, СЭ4 Т-клеточный ответ и СЭ8 Тклеточный ответ для дЭ и ИЬ19 определяются, как описано выше.
- 64 027236
Пример 7.
Первичная/бустерная схемы индукции функций СБ8 Т-клеточного ответа к 8ГО-ОАО.
В этом примере описана индукция иммунного ответа, когда мышей иммунизировали первично (первичная иммунизация) с векторной частицей, содержащей рекомбинантный экспрессирующий вектор, который кодирует и экспрессирует иммуноген, а затем впоследствии иммунизировали (бустерно) с рекомбинантным вектором экспрессии, который кодирует и экспрессирует иммуноген.
Группы мышей С57ВЬ/6 (4 в группе) были привиты в диапазоне доз один раз по 25 раз с БС-№^, кодирующим 8ГО-Оад подкожно первично, или первичными/бустерными (й0/й28) режимами иммунизации. Селезеночно 8ГО-Оад-специфические СБ8 Т-клетки были проанализированы на 12 день после первичной или на 5 день после бустерной иммунизации для эпитопов конкретных функциональных реакций, измеряли производство ΡΕΝ-γ, ΪΝΡ-α и ГО-2 через внутриклеточное окрашивание цитокинов ^СЗ), анализировали после стимуляции ех νί\Ό с известными СБ8 Т-клеточными минимальными эпитопами пептида АЬ11 (аминокислоты 312-322 8ГО ОАО; АА'УКРЫ^МТрТЬ; 8Ε0 Ш ΝΟ: 43) или Κν9 (аминокислоты 76-84 ОАО; = Κ8Ι.Υ\Ίν(Ύ; 8ΕΟ ГО ΝΟ: 44).
Данные, представленные на фиг. 7, демонстрируют что первичную и первичную/бустерную схемы, где обе прививки включают вирусный вектор и генерируют дозозависимые надежные функциональные Оад-специфические СБ8 Т-клеточные ответы на оба доминирующих АЬ11 эпитопа и субдоминантные эпитопы Κν9. Первичный/бустерный режимы иммунизации к еще большему увеличению наблюдают реакции обоих эпитопов по меньшей мере приблизительно в 2 раза.
Пример 8. Введение иммуногена и адъюванта, индуцирующиго ТЬ1 СБ4 Т-клеточный ответ.
В этом примере описана индукция иммунного ответа, 8ГО иммуногена в сочетании с адъювантом (ОЬА).
С57ВЬ/6 (4 на группу) мыши были иммунизированы внутримышечно через первичные/бустерные режимы иммунизации (й0 первичный/й21 бустерный) с 5 мкг рекомбинантного 8ГО-Оад белка + 5 мкг О^А-8Ε, одного 8Ε, и РВ8. Селезеночный СБ4 Т-клеточный ответ был получены на 5-й день после повышения Ю8 для ΣΕΝ-γ, ΪΝΕ-α и ГО-2 после ех νί\Ό рестимуляции с 8ГО-Оад СБ4 Т-клеточным эпитопом содержащим пептид ББ13 (аминокислоты 299-311 8ГО-ОАО; ^КΕΥΚ8^КАΕ^Т^; 8Ε0 ГО ΝΟ: 45)
Результаты показаны на фиг. 8 и демонстрируют, что адъювант типа ОЬА требуется для надежного ТЬ1 СБ4 Т-клеточного ответа после иммунизации 8ГО-Оад рекомбинантным белком.
Пример 9.
Сравнение многократной вакцинации того же вектора с многократной гетерологичной вакинацией и порядок первичной/бустерной иммунизации.
Этот пример описывает индукцию иммунного ответа, гетерологичными, первичными, бустерными прививками с 8ГО-рекомбинантным белком Оад + О^А-8Ε и 0С-№^, экспрессирующий 8ГО-Оад.
С57ВЬ/6 (4 на группу) мыши были иммунизированы с г8ГО-Оад + О^А-8Ε внутримышечно и/или БС-ΝΡΕν экспрессирующие 8ГО-Оад подкожно в режим иммунизации, как указано. Антигенспецифические СБ4 и СБ8 Т-клетки анализировали на 25 день после бустерной дозы с использованием СБ8 Т-клеточного минимального эпитопа пептида АЬ11, Κν9 или СБ4 (ББ13) и анализировали для производства ΕΕΝ-γ, ΪΝΕ-α и ГО-2 Ю8. Результаты показаны на фиг. 9 и демонстрируют, что гетерологичная, первичная иммунизация/бустерная иммунизация/бустерные прививки с 8ГО-Оад рекомбинантным белком + О^А-8Ε и БС-Ш^ кодирующего 8ГО-Оад генерируют оба, СБ8 и СБ4, антигенспецифические Т-клеточные ответы.
Данные показывают, что три прививки с рекомбинантным белком вместе с адъювантом типа ОЬА привели к очень надежному СБ4 Т-клеточному ответу, но не надежному СБ8 Т-клеточному ответу. Аналогично, три прививки с лентивектором привели к очень надежному СБ8 Т-клеточному ответу, который был значительно смещен в сторону доминирующего АЬ11 эпитопа, без надежного СБ4 Т-клеточного ответа. В отличие от гетерологичной схемы неожиданно привели как сильный СБ8, так и сильный СБ4 Т-клеточные ответы. Значительные и сбалансированные СБ8 Т-клеточные ответы наблюдали для обоих доминантых и субдоминантых эпитопов. Кроме того, было неожиданным, что режим, где первая (основная) иммунизация состояла из белка с ОЬА и последующей иммунизацией (бустерной), состоящей из вирусного вектора, привела к улучшенному СБ8 Т-клеточного отвеа по сравнению с бустерным режимом, где, например, был использован вирусный вектор и белок. Следует отметить, что первичная иммунизация с белком и бустерная иммунизация с вирусным вектором привели к значительному увеличению СБ8 Т-клеточного ответа на субдоминантные эпитопы Κν9. Это было неожиданно, так как трудно изменить внутреннее строение вакцины при вызывании иммунодоминантности. Субдоминанта ответов против эпитопов может быть важной для разнообразных иммунных ответов и может привести к более высокой эффективности вакцины для всего населения.
- 65 027236
Пример 10.
Второе бустерное введение повышает оба Тй1 СЭ8 и СЭ4 Т-клеточные ответы, генерированные гетерологичной вакциной.
Этот пример описывает индукцию иммунного ответа бустерной гетерологичной вакциной с г81УОад и ОБА-8Е.
С57ВБ/6 (4 групп) мыши были иммунизированы г81У-Оад + ОБА-8Е внутреклеточно и бустерно с ЭС-№ЬУ, экспрессирующий 81У-Оад подкожно в режиме иммунизации, как показано на фиг. 10. Иммунизации были разделены на 21 день. Антиген-специфические СЭ4 и СЭ8 Т-клетки анализировали на 25 день после бустерной иммунизации с использованием СГО8 (АЬ11 или КУ9 или СЭ4 (ΌΌΙ 3) Т-клеточного пептидного эпитопа и анализировали на производство ΙΤΝ-γ, ТОТ^а и ББ-2 1С8.
Результаты, показанные на фиг. 10, демонстрируют, что Тй1 СЭ8 и СЭ4 Т-клеточные ответы, порожденные гетерологичными вакцинами, могут быть повышенными за счет третьей иммунизации (второй импульс) с белком и адъювантом ОЬА типа. Три дозы препаратов вакцины приводят к дальнейшему увеличению как СГО8, так и СЭ4 антиген-специфических Т-клеточных ответов по сравнению с соответствующими ответами после двух доз вакцинации.
Пример 11.
СГО8 Т-клеточный ответ, генерированный ЭС-МБУ, может быть введенным бустерно с синтетическим олигонуклеотидным пептидом с адъювантом.
В этом примере описана индукция иммунного ответа ЭС-МБУ, экспрессирующего 81У-Оад, введенного бустерно с синтетическим долгим пептидом (8БР) и ОБА-8Е.
С57ВБ/6 (4 в группе) мыши были привиты с помощью первичной иммунизации/бустерной иммунизации (й0 первичная/ й21 бустерная) с ЭС-МБУ, экспрессирующего 81У-Оад и/или 8БР, содержащей 81У-Оад аминокислоты 289-333 (8ЕО ГО NО: 42) (эпитоп АЬ11 выделен жирным шрифтом на фиг. 11), а также ОБА-8Е согласно схеме иммунизации, показаной на фиг. 11. Антиген-специфические СГО8 Т-клетки были проанализированы на 25 день после повышения с использованием СГО8 (АЬ11) Т-клеточного эпитопа пептида на производство ΙΤΝ-γ, ТОТ^а и ББ-2 1С8.
Результаты, представленные на фиг. 11, показывают, что способы по изобретению являются функциональными, когда различные иммуногенные варианты, используют в первой и второй иммунизациях, например полноразмерный иммуноген против фрагмента. После первой иммунизации (первичной) с лентивекторным вирусным вектором, содержащим полинуклеотид, кодирующий полноразмерный иммуноген, второй иммунизации (бустерной иммунизации) с небольшим 45-аминокислотным фрагментом иммуногена создавали повышенный СГО8 Т-клеточный ответ по сравнению с бустерной иммунизацией с таким же лентивектором.
Различные варианты осуществления, описанные выше, могут быть объединены, чтобы обеспечить дополнительные варианты. Все патенты США, заявки на патенты США, публикации заявок на патенты США, иностранные патенты, иностранные заявки на патенты и не патентные публикации, упомянутые в данном описании, включены здесь в качестве ссылки в полном объеме. Аспекты вариантов осуществления могут быть модифицированы, если необходимо применить концепции различных патентов, заявок и публикаций, чтобы обеспечить еще другие варианты.
Эти и другие изменения могут быть сделаны в других вариантах осуществления, в свете вышеприведенного подробного описания. В общем, в последующей формуле изобретения термины не следует рассматривать как ограничивающие претензии на конкретные варианты осуществления, раскрытые в данном описании и в формуле изобретения, но должны рассматриваться для включения всех возможных вариантов осуществления вместе с полным объемом эквивалентов, к которым такие требования имеют право. Соответственно, формула изобретения не ограничивает раскрытие.
- 66 027236
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ <110> Дубенский, и др.
<120> Иммуногенные композиции и способы применения таких композиций для индукции гуморального и клеточного иммунного ответа <130> 31943/46441А <150> 61/473,660 <151> 2011-04-03 <160> 45 <170> РаЬепЫп уегзгоп 3.5 <210> 1 <211> 423 <212> Белки <213> Вирус Синдбис <220>
<221> тгзс £еаЬиге <222> (160?..(160) <223> Хаа может быть аминокислотой любой природы <400> 1
Зег Уа1 Не Азр Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг Зег Рго Туг Ьеи С1у ТЬг Суз 15 10 15
Зег Туг Суз ΗΪ5 Ыз ТЬг Уа1 Рго Суз РЬе Зег Рго Уа1 Ьуз 11е С1и 20 25 30
С1п Уа1 Тгр Азр С1и А1а Аэр Азр Азп ТЬг 11е Агд 11е С1п ТЬг Зег 35 40 45
А1а Θΐη РЬе С1у Туг Азр 61η Зег С1у А1а А1а Зег А1а Азп Ьуг Туг 50 55 60
Агд Туг МеЬ Зег Ьеи Ьуз С1п Азр Н£з ТЬг Уа1 Ьуз С1и С1у ТЬг МеЬ 65 70 75 80
Азр Азр 11е Ьуз 11е Зег ТЬг Зег С1у Рго Суз Агд Агд Ьеи Зег Туг 85 90 95
Ьуз С1у Туг РЬе Ьеи Ьеи А1а Ьуг Суг Рго Рго С1у Агр Зег Уа1 ТЬг 100 105 110
Уа1 Зег 11е Уа1 Зег Зег Азп Зег А1а ТЬг Зег Суз ТЬг Ьеи А1а Агд 115 120 125
Ьуз 11е Ьуз Рго Ьуз РЬе Уа1 С1у Агд С1и Ьуз Туг Азр Ьеи Рго Рго 130 135 140
- 67 027236
- 68 027236
А1а Ьеи А1а Рго Азп 405 А1а Уа1 11е Рго ТНг 410 Зег Ьеи А1а Ьеи Ьеи 415 Суе
Сун Уа1 Агд Зег А1а Аеп 420 <210> 2 <211> 986 <212> Белки <213> Вирус Синдбис <400> 2 А1а
Меб 1 Зег А1а А1а Рго 5 Ьеи Уа1 ТНг А1а Меб 10 Суз Ьеи Ьеи 61 у Азп 15 Уа1
Зег РНе Рго Суз 20 Азр Агд Его Рго ТЬг 25 Суз Туг ТЬг Агд 61и 30 Рго Зег
Агд А1а Ьеи 35 Азр Не Ьеи С1и 61и 40 Азп Уа1 Азп Шз 61и 45 А1а Туг Азр
ТЬг Ьеи Ьеи 50 Азп А1а 11е Ьеи 55 Агд Суз 61у Зег Зег 60 61 у Зег Уа1 Не
Азр 65 Азр РНе ТЬг Ьеи ТЬг 70 Зег Рго Туг Ьеи С1у 75 ТЬг Суз Зег Туг Суз 90
ΗΪΞ Ηϊε ТНг Уа1 Рго 85 Суз РЬе Зег Рго Уа1 90 Ьуз 11е 61и 61 п Уа1 95 Тгр
Азр 61и А1а Азр 100 Азр Азп ТЬг 11е Агд 105 11е 61п ТЬг Зег А1а но 31п РЬе
61 у Туг Азр 115 61п Зег 61 у А1а А1а 120 Зег А1а Азп Ьуз Туг 125 Агд Туг МеЬ
Зег Ьеи Ьуз 130 О1п Меб Туг Рго 135 Туг Азр Уа1 Рго Азр 140 Туг А1а ТНг Уа1
Ьуз 145 61и 61у ТЬг Меб Азр 150 Азр 11е Ьун 11е Зег 155 ТЬг Зег 61у Рго Суз 160
Агд Агд Ьеи Зег Туг 165 Ьуз 61у Туг РЬе Ьеи 170 Ьеи А1а Ьуз Суз Рго 175 Рго
61у Азр Зег Уа1 180 ТЬг Уа1 Зег Не Уа1 185 Зег Зег Аеп Зег А1а 190 ТЬг Зег
Суз ТЬг Ьеи 195 А1а Агд Ьуз 11е Ьуз 200 Рго Ьуз РНе Уа1 61 у 205 Агд 61и Ьуз
- 69 027236
- 70 027236
Суз Ьеи ТЬг Рго Туг А1а Ьеи А1а Рго Азп А1а Уа1 Не Рго ТЬг Зег 465 470 475 480
Ьеи А1а Ьеи Ьеи Суз Суз Уа1 Агд Зег А1а Азп А1а С1и ТЬг РЬе ТЬг
485 490 495 (31и ТЬг МеЬ Зег Туг Ьеи Тгр Зег Азп Зег (31п Рго РЬе РЬе Тгр Уа1 500 505 510
С1п Ьеи Суз 11е Рго Ьеи А1а А1а РЬе 11е Уа1 Ьеи МеЬ Агд Суз Суз 515 520 525
Зег Суз Суз Ьеи Рго РЬе Ьеи Уа1 Уа1 А1а О1у А1а Туг Ьеи А1а Ьуз 530 535 540
Уа1 Азр А1а Туг С1и Ηίδ А1а ТЬг ТЬг Уа1 Рго Азп Уа1 Рго <31п 11е 545 550 555 560
Рго Туг Ьуз А1а Ьеи Уа1 С1и Агд А1а С1у Туг А1а Рго Ьеи Азп Ьеи 565 570 575 (31и 11е ТЬг Уа1 МеЬ Зег Зег (31 и Уа1 Ьеи Рго Зег ТЬг Азп (31п С31и 580 585 590
Туг 11е ТЬг Суз Ьуз РЬе ТЬг ТЬг Уа1 Уа1 Рго Зег Рго Ьуз 11е Ьуз 595 600 605
Суз Суз (31у Зег Ьеи (31 и Суз (31 п Рго А1а А1а ΗΪ3 А1а (31у Туг ТЬг 610 615 620
Суз Ьуз Уа1 РЬе (31у (31у Уа1 Туг Рго РЬе МеЬ Тгр (31у С1у А1а 61η 625 630 635 640
Суз РЬе Суз Азр Зег С1и Азп Зег С1п МеЬ Зег С1и А1а Туг Уа1 С1и 645 650 655
Ьеи Зег А1а Азр Суз А1а Зег Азр Шз А1а (31п А1а 11е Ьуз Уа1 Нтз 660 665 670
ТЬг А1а А1а МеЬ Ьуз Уа1 С1у Ьеи Агд 11е Уа1 Туг С1у Азп ТЬг ТЬг
675 680 685
Зег РЬе Ьеи Азр Уа1 Туг Уа1 Азп (31 у Уа1 ТЬг Рго (31у ТЬг Зег Ьуз 690 695 700
Азр Ьеи Ьуз Уа1 11е А1а С1у Рго 11е 705 710
Зег А1а Зег 715
РЬе
ТЬг
Рго
РЬе
720
- 71 027236
- 72 027236
Суз Зег МеС МеС Ьеи ТЬг Зег ТЬг Агд Агд 980 985 <210> 3 <211> 982 <212> Белки <213> Вирус Синдбис <400> 3
МеС 1 Зег А1а А1а Рго 5 Ьеи Уа1 ТЬг А1а МеС 10 Суз Ьеи Ьеи С1у Азп 15 Уа1
Зег РЬе Рго Суз Азр Агд Рго Рго ТЬг Суз Туг ТЬг Агд О1и Рго Зег
20 25 30
Агд А1а Ьеи Агр 11е Ьеи С1и С1и Агп Уа1 Азп Н1з С1и А1а Туг Агр
35 40 45
ТЬг Ьеи Ьеи Азп А1а 11е Ьеи Агд Суз С1у Зег Зег С1у Агд Зег Ьуз
50 55 60
Агд Зег Уа1 Пе Азр Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг Зег Рго Туг Ьеи С1у ТЬг
65 70 75 80
Суз Зег Туг Суз Нтз Нтз ТЬг Уа1 Рго Суз РЬе Зег Рго Уа1 Ьуз 11е
35 90 95
С1и С1п Уа1 Тгр Азр 61и А1а Азр Азр Азп ТЬг 11е Агд 11е С1п ТЬг
100 105 110
Зег А1а С1п РЬе С1у Туг Азр С1п Зег С1у А1а А1а Зег А1а Азп Ьуз
115 120 125
Туг Агд Туг МеС Зег Ьеи С1и 61η Азр Нтз ТЬг ЛМ1 Ьуз С1и С1у ТЬг
130 135 140
МеС Азр Азр 11е Ьуз 11е Зег ТЬг Зег С1у Рго Суз Агд Агд Ьеи Зег
145 150 155 160
Туг Ьуз С1у Туг РЬе Ьеи Ьеи А1а Ьуз Суз Рго Рго С1у Азр Зег Уа1
165 170 175
ТЬг Уа1 Зег 11е Л/а1 Зег Зег Азп Зег А1а ТЬг Зег Суз ТЬг Ьеи А1а
180 185 190
Агд Ьуз Не Ьуз Рго Ьуз РЬе Уа1 С1у Агд 01и Ьуз Туг Азр Ьеи Рго
195 200 205
- 73 027236
- 74 027236
Туг А1а Ьеи А1а Его Азп А1а Уа1 Не Рго ТЬг 5ег Ьеи А1а Ьеи Ьеи 465 470 475 460
Суз Суз Уа1 Агд Зег А1а Азп А1а С1и ТЬг РЬе ТЬг 61и ТЬг МеЬ Зег 485 490 495
Туг Ьеи Тгр Зег Азп Зег 61п Рго РЬе РЬе Тгр Уа1 61п Ьеи Суз 11е 500 505 510
Рго Ьеи 741а 741а РЬе Ые Уа1 Ьеи МеЬ Агд Суз Суз Зег Суз Суз Ьеи 515 520 525
Рго РЬе Ьеи Уа1 Уа1 А1а С1у А1а Туг Ьеи А1а Ьуз Уа1 Азр 741а Туг 530 535 540
С1и Шз А1а ТЬг ТЬг Уа1 Рго Азп Уа1 Рго С1п 11е Рго Туг Ьуз А1а
545 550 555 560
Ьеи Уа1 С1и Агд А1а С1у Туг А1а Рго Ьеи Азп Ьеи С1и 11е ТЬг Уа1 565 570 575
МеЬ Зег Зег С1и Уа1 Ьеи Рго Зег ТЬг Азп С1п С1и Туг 11е ТЬг Суз
580 585 590
Ьуз РЬе ТЬг ТЬг Уа1 Уа1 Рго Зег Рго Ьуз 11е Ьуз Суз Суз С1у Зег 595 600 605
Ьеи С1и Суз С1п Рго А1а А1а Шз А1а Азр Туг ТЬг Суз Ьуз Уа1 РЬе 610 615 620
С1у С1у Уа1 Туг Рго РЬе МеЬ Тгр С1у С1у А1а С1п Суз РЬе Суз Азр
625 630 635 640
Зег С1и Азп Зег 61п МеЬ Зег С1и А1а Туг 47а1 С1и Ьеи Зег 741а Азр 645 650 655
Суз А1а Зег Азр Н1з А1а С1п А1а 11е Ьуз Уа1 Н1з ТЬг А1а А1а МеЬ 660 665 670
Ьуз Уа1 <31у Ьеи Агд 11е Уа1 Туг С1у Азп ТЬг ТЬг Зег РЬе Ьеи Азр 675 680 685
Уа1 Туг Уа1 Азп 61у Уа1 ТЬг Рго С1у ТЬг Зег Ьуз Азр Ьеи Ьуз Уа1 690 695 700
11е 741а С1у Рго 11е Зег А1а Зег РЬе ТЬг 705 710
Рго РЬе Азр Н1з Ьуз 715
Уа1
720
- 75 027236
УаЬ Не Ηίε Агд СЬу Ьеи УаЬ Туг Αεη Туг Αερ РЬе Рго 31и Туг СЬу 725 730 735
АЬа МеС Ьуз Рго СЬу АЬа РЬе СЬу Азр 11е СЬп АЬа ТЬг Зег Ьеи ТЬг
740 745 750
Зег Ьуз Азр Ьеи 11е АЬа Зег ТЬг Αερ 11е Агд Ьеи Ьеи Ьуз Рго Зег 755 760 765
АЬа Ьуз Αεη УаЬ Ηίε УаЬ Рго Туг ТЬг СЬп АЬа Зег Зег СЬу РНе СЬи
770 775 730
МеС Тгр Ьуз Азп Азп Зег СЬу Агд Рго Ьеи СЬп СЬи ТЬг АЬа Рго РЬе 785 790 795 800
С1у Суз Ьуз 11е АЬа УаЬ Αεη Рго Ьеи Агд АЬа УаЬ Αερ Суз Зег Туг 805 810 815
СЬу Азп 11е Рго 11е Зег 11е Азр 11е Рго Азп А1а А1а РЬе 11е Агд
820 825 830
ТЬг Зег Азр АЬа Рго Ьеи Уа1 Зег ТЬг Уа1 Ьуз Суз СЬи УаЬ Зег СЬи 835 840 845
Суз ТЬг Туг Зег АЬа Азр РЬе СЬу СЬу МеЬ АЬа ТЬг Ьеи С1п Туг Уа1
850 855 860
Зег Азр Агд 61и СЬу СЬп Суз Рго УаЬ НЬз Зег Н1з Зег Зег ТНг АЬа 865 870 875 880
ТЬг Ьеи СЬп СЬи Зег ТЬг УаЬ НЬз УаЬ Ьеи СЬи Ьуз СЬу АЬа УаЬ ТЬг 835 890 895
УаЬ НЬз РЬе Зег ТЬг АЬа Зег Его СЬп АЬа Азп РЬе Не УаЬ Зег Ьеи
900 905 910
Суз СЬу Ьуз Ьуз ТЬг ТЬг Суз Αεη АЬа СЬи Суз Ьуз Рго Рго АЬа Азр 915 920 925
НЬз 11е УаЬ Зег ТЬг Его НЬз Ьуз Азп Азр СЬп СЬи РЬе СЬп АЬа АЬа
930 935 940
11е Зег Ьуз ТЬг Зег Тгр Зег Тгр Ьеи РЬе АЬа Ьеи РЬе СЬу СЬу АЬа 945 950 955 960
Зег Зег Ьеи Ьеи
11е
965
11е СЬу Ьеи МеС
11е РЬе АЬа 970
Суз
Зег МеС МеС
975
- 76 027236
Ьеи ТЬг Зег ТЬг 980 Агд Агд
<210> 4
<211> 1 582
<212> Белки
<213> ] Вирус Синдбис
<400> , 4
МеЬ Зег А1а А1а Рго Ьеи Уа1 ТЬг А1а МеЬ Суз Ьеи Ьеи 61 у Азп Уа1
1 5 10 15
Зег РЬе Рго Суе Азр Агд Рго Рго ТЬг Суз Туг ТЬг Агд 61и Рго Бег
20 25 30
Агд А1а Ьеи Азр 11е Ъеи С1и 61и Азп Уа1 Азп Ыз 61и А1а Туг Азр
35 40 45
ТЬг Ьеи Ьеи Азп А1а 11е Ьеи Агд Суз 61у Зег Зег 61у Агд Зег Ьуз
50 55 60
Агд Зег Уа1 Не Азр Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг Зег Рго Туг Ьеи 61 у ТЬг
65 70 75 80
Суа Зег Туг Суз Нив ΗΪ3 ТЬг Уа1 Рго Суз РЬе Зег Рго Уа1 Ьуз 11е
85 90 95
01 и 61 η Уа1 Тгр Азр СЬи А1а Азр Азр Азп ТЬг 11е Агд 11е 61п ТЬг
100 105 но
Зег А1а 61п Рпе О1у Туг Азр 61п Зег 61 у А1а А1а Зег А1а Азп Ьуз
115 120 125
Туг Агд Туг МеС Зег Ьеи 61и С1п Азр Шз ТЬг Уа1 61и 61и 61у ТЬг
130 135 140
МеЬ Авр Азр 11е Ьуз 11е Зег ТЬг Зег 61 у Рго Суз Агд Агд Ьеи Зег
145 150 155 160
Туг Ьуз 51у Туг РЬе Ъеи Ьеи А1а Ьуз Суз Рго Рго 61 у Азр Зег Уа1
165 170 175
ТЬг Уа1 Зег 11е Уа1 Зег Зег Азп Зег А1а ТЬг Зег Суз ТЬг Ьеи А1а
130 185 190
Агд Ьуз Не Ъу$ Рго Ьу$ РЬе Уа1 61у Агд 61и Ьуз Туг Азр Ьеи Рго
195 200 205
- 77 027236
- 78 027236
Туг А1а Ьеи А1а Рго Азп А1а Уа1 Не Рго ТЬг Зег Ьеи А1а Ьеи Ьеи 465 470 475 480
Суз Суз Уа1 Агд Зег А1а Азп А1а 01и ТЬг РЬе ТЬг 01и ТЬг МеЬ Зег 485 490 495
Туг Ьеи Тгр Зег Азп Зег С1п Рго РЬе РЬе Тгр Уа1 С1п Ьеи Суз 11е 500 505 510
Рго Ьеи А1а А1а РЬе 11е Уа1 Ьеи МеЬ Агд Суз Суз Зег Суз Суз Ьеи 515 520 525
Рго РЬе Ьеи Уа1 Уа1 А1а С1у А1а Туг Ьеи А1а Ьуз Уа1 Азр А1а Туг 530 535 540
С1и Н1з А1а ТЬг ТЬг Уа1 Рго Азп Уа1 Рго С1п 11е Рго Туг Ьуз А1а 545 550 555 560
Ьеи Уа1 С1и Агд А1а О1у Туг А1а Рго Ьеи Азп Ьеи О1и 11е ТЬг Уа1 565 570 575
МеЬ Зег Зег С1и Уа1 Ьеи Рго Зег ТЬг Азп С1п С1и Туг 11е ТЬг Суз 580 585 590
Ьуз РЬе ТЬг ТЬг Уа1 Уа1 Рго Зег Рго Ьуз 11е Ьуз Суз Суз С1у Зег 595 600 605
Ьеи С1и Суз С1п Рго А1а А1а Ηίδ А1а Азр Туг ТЬг Суз Ьуз Уа1 РЬе 610 615 620
С1у С1у Уа1 Туг Рго РЬе МеЬ Тгр С1у <31 у А1а <31 п Суз РЬе Суз Азр
625 630 635 640
Зег Й1и Азп Зег <31п МеЬ Зег С1и А1а Туг Уа1 О1и Ьеи Зег А1а Азр 645 650 655
Суз А1а Зег Азр Н1з А1а <31п А1а 11е Ьуз Уа1 ΗΪ3 ТЬг А1а А1а МеЬ 660 665 670
Ьуз Уа1 С1у Ьеи Агд 11е Уа! Туг <31у Азп ТЬг ТЬг Зег РЬе Ьеи Азр 675 680 685
Уа1 Туг Уа1 Азп С1у Уа1 ТЬг Рго (31 у ТЬг Зег Ьуз Азр Ьеи Ьуз Уа1 690 695 700
11е А1а С1у Рго 11е 705
Зег
710
А1а
Зег РЬе
ТЬг Рго РЬе 715
Азр
Нтз
Ьуз
Уа1
720
- 79 027236
- 80 027236
Ьеи ТЬг Зег ТЬг Агд Агд 980 <210> 5 <211> 980 <212> Белки <213> Вирус Синдбис <400> 5
МеЬ 1 Зег А1а А1а Рго 5 Ьеи Уа1 ТЬг А1а МеТ 10 Суз Ьеи Ьеи С1у Азп 15 Уа1
Зег РЬе Рго Суз Азр Агд Рго Рго ТЬг Суз Туг ТЬг Агд С1и Рго Зег
20 25 30
Агд А1а Ьеи Азр 11е Ьеи С1и С1и Азп Уа1 Азп ΗΪ3 С1и А1а Туг Азр
35 40 45
ТЬг Ьеи Ьеи Авп А1а 11е Ьеи Агд Суз С1у Зег Зег С1у Агд £ег Ьуг
50 55 60
Агд Зег Уа1 11е Азр Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг Зег Рго Туг Ьеи 61у ТЬг
65 70 75 80
Суз Зег Туг Суз ΗΪ3 ΗΪ5 ТЬг Уа1 Рго Суэ РЬе Зег Рго Уа1 Ьуг 11е
85 90 95
С1и 61п Уа1 Тгр Азр 51и А1а Азр Азр Азп ТЬг 11е Агд 11е С1п ТЬг
100 105 110
Зег А1а С1п РЬе С1у Туг Азр 01 η Зег 01 у А1а А1а Зег А1а Азп Ьуз
115 120 125
Туг Агд Туг МеТ Зег Ьеи С1и С1п Азр ΗΪ5 ТЬг Уа1 Ьуз С1и С1у ТЬг
130 135 140
МеТ Азр Азр 11е Ьуз 11е Зег ТЬг Зег 51у Рго Суз Агд Агд Ьеи Зег
145 150 155 160
Туг Ьуз С1у Туг РНе Ьеи Ьеи А1а Ьуз Суз Рго Рго С1у Азр 5ег Уа1
165 170 175
ТЬг Уа1 Зег 11е Уа1 Зег Зег Азп Зег А1а ТЬг Зег Суз ТЬг Ьеи А1а
180 185 190
Агд Ьуз Не Ьуз Рго Ьуз РЬе Уа1 61у Агд 61и Ьуз Туг Азр Ьеи Рго
195 200 205
Рго Уа1 ΗΪ3 С1у Ьуз Ьуз 11е Рго Суз ТЬг Уа1 Туг Азр Агд Ьеи ТЬг
210 215 220
- 81 027236
ТНг А1а С1у Туг Не ТНг МеС НЬз Агд Рго Агд Рго НЬз А1а Туг ТНг 225 230 235 240
Зег Туг Ьеи СЬи СЬи Зег Зег СЬу Ьув Уа1 Туг А1а Ьув Рго Рго Бег 245 250 255
С1у Ьуз Азп 11е ТНг Туг СЬи Суз Ьув Сув СЬу Азр Туг Ьуз ТЬг С1у
260 265 270
ТЬг Уа1 Зег ТНг Агд ТЬг 61и 11е ТЬг СЬу Сув ТЬг АЬа 11е Ьуз С1п 275 280 285
Суз Уа1 А1а Туг Ьув Зег Азр С1п ТНг Ьуз Тгр Уа1 РНе Азп Зег Рго 290 295 300
Азр Ьеи 11е Агд НЬз Азр Азр НЬз ТНг А1а С1п СЬу Ьуз Ьеи НЬз Ьеи 305 310 315 320
Рго РЬе Ьуз Ьеи Не Рго Зег ТЬг Суз МеС УаЬ Рго УаЬ АЬа НЬз АЬа 325 330 335
Рго Азп Уа1 11е НЬз СЬу РНе Ьуз НЬз 11е Зег Ьеи СЬп Ьеи Азр ТНг 340 345 350
Авр НЬз Ьеи ТНг Ьеи Ьеи ТНг ТНг Агд Агд Ьеи СЬу АЬа Азп Рго С1и 355 360 365
Рго ТЬг ТЬг 61и Тгр 11е Уа1 61у Ьуз ТНг Уа1 Агд Азп РЬе ТЬг УаЬ 370 375 380
Азр Агд Азр СЬу Ьеи СЬи Туг 11е Тгр СЬу Азп НЬз СЬи Рго Уа1 Агд 385 390 395 400
УаЬ Туг АЬа СЬп СЬи Зег АЬа Рго СЬу Азр Рго НЬв СЬу Тгр Рго НЬз 405 410 415
С1и 11е УаЬ СЬп НЬз Туг Туг НЬз Агд НЬз Рго УаЬ Туг ТЬг 11е Ьеи
420 425 430
АЬа Уа1 АЬа Зег АЬа ТЬг УаЬ АЬа МеС МеС 1Ье СЬу УаЬ ТЬг УаЬ АЬа 435 440 445
УаЬ Ьеи Суз АЬа Суз Ьуз АЬа Агд Агд СЬи Суз Ьеи ТНг Рго Туг А1а 450 455 460
Ьеи АЬа Рго Азп АЬа УаЬ 1Ье Рго ТНг 465 470
Зег Ьеи АЬа Ней Ьеи Суз Сув 475 480
- 82 027236
- 83 027236
Ьуз Рго СЬу АЬа РНе СЬу Азр Не СЬп АЬа ТЬг Зег Ьеи ТЬг Зег Ьуз 740 745 750
Αερ Ьеи 11е АЬа Зег ТЬг Αερ 11е Агд Ьеи Ьеи Ьуз Рго Зег АЬа Ьуз 755 750 755
Азп УаЬ НЬз Уа1 Рго Туг ТЬг СЬп АЬа Зег Зег СЬу РЬе СЬи МеЬ Тгр 770 775 780
Ьуз Αεη Αεη Зег СЬу Агд Рго Ьеи СЬп СЬи ТЬг АЬа Рго РЬе СЬу Суз
785 790 795 800
Ьуз Ые А1а 7аЬ Азп Рго Ьеи Агд АЬа УаЬ Азр Суз Зег Туг СЬу Азп 805 810 315
11е Рго 11е Зег 11е Азр Ые Рго Азп АЬа АЬа РЬе Ые Агд ТЬг Зег 820 825 830
Αερ АЬа Рго Ьеи Уа1 Зег ТЬг УаЬ Ьуз Суз СЬи Уа1 Зег СЬи Суг ТЬг 835 840 845
Туг Зег АЬа Азр РЬе СЬу СЬу МеЬ АЬа ТЬг Ьеи СЬп Туг УаЬ Зег Азр 850 855 850
Агд СЬи СЬу СЬп Суз Рго Уа1 Ηίε Зег НЬз Зег Зег ТЬг АЬа ТЬг Ьеи
865 870 875 880
СЬп СЬи Зег ТЬг 7а 1 НЬз УаЬ Ьеи СЬи Ьуз СЬу АЬа УаЬ ТЬг УаЬ НЬз 885 890 395
РЬе Зег ТЬг АЬа Зег Рго СЬп АЬа Азп РЬе Ые УаЬ Зег Ьеи Суз СЬу 900 905 910
Ьуз Ьуз ТЬг ТЬг Суз Азп АЬа СЬи Суз Ьуз Рго Рго АЬа Αερ НЬз 11е
915 920 925
УаЬ Зег ТЬг Рго НЬз Ьуз Азп Азр СЬп СЬи РЬе СЬп АЬа АЬа Ые Зег 930 935 940
Ьуз ТЬг Зег Тгр Зег Тгр Ьеи РЬе АЬа Ьеи РЬе СЬу СЬу АЬа Зег Зег 945 950 955 960
Ьеи Ьеи Ые Ые СЬу Ьеи МеЬ Ые РЬе АЬа Суз Зег МеЬ МеЬ Ьеи ТЬг 965 970 975
Зег ТЬг Агд Агд
980
- 84 027236 <210> 6 <211> 981 <212> Белки <213> Вирус Симдбис <400> 6
МеЬ 1 Зег А1а А1а Рго 5 Ьеи Уа1 ТЬг А1а МеЬ 10 Суа Ьеи Ьеи 01 у Азп 15 Уа1
Зег РЬе Рго Суз Азр Агд Рго Рго ТЬг Суз Туг ТЬг Агд 01и Рго Зег
20 25 30
Агд А1а Ьеи Азр Не Ьеи С1и 61и Азп Уа1 Азп Нтз С1и А1а Туг Аер
35 40 45
ТЬг Ьеи Ьеи Азп А1а 11е Ьеи Агд Суз С1у Зег Зег С1у Агд Зег Ьуа
50 55 60
Агд Зег Уа1 Не Азр Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг Зег Рго Туг Ьеи С1у ТЬг
65 70 75 ео
Суз Зег Туг Суз Н1з Н1з ТЬг Уа1 Рго Суз РЬе Зег Рго Уа1 Ьуз Ие
85 90 95
С1и С1п Уа1 Тгр Азр С1и А1а Азр Азр Азп ТЬг Не Агд Не С1п ТЬг
100 105 но
Зег А1а С1п РЬе б1у Туг Азр 61η Зег С1у А1а А1а Зег А1а Азп Ьуз
115 120 125
Туг Агд Туг МеЬ Зег Ьеи С1и С1п Азр Нтз ТЬг Уа1 С1и 01 и С1у ТЬг
130 135 140
МеЬ Азр Азр Не Ьуз Не Зег ТЬг Зег С1у Рго Суз Агд Агд Ьеи Зег
145 150 155 160
Туг Ьуз 01 у Туг РЬе Ьеи Ьеи А1а Ьуз Суз Рго Рго С1у Аер Зег Уа1
165 170 175
ТЬг Уа1 Зег Не Уа1 Зег Зег Азп Зег А1а ТЬг Зег Суз ТЬг Ьеи А1а
180 185 190
Агд Ьуз 11е Ьуз Рго Ьуз РЬе Уа1 С1у Агд С1и Ьуз Туг Аер Ьеи Рго
195 200 205
Рго Уа1 Нтз 61у Ьуз Ьуз Не Рго Суз ТЬг Уа1 Туг Азр Агд Ьеи <31и
210 215 220
- 85 027236
- 86 027236
- 87 027236
Мее Ьуе Рго С1у А1а РНе С1у Аер 11е С1п А1а ТНг Зег Ьеи ТНг Зег 740 745 750
Ьуз Азр Ьеи 11е А1а Зег ТЬг Азр 11е Агд Ьеи Ьеи Ьуз Рго Зег А1а 755 760 765
Ьуе Азп Уа1 ΗΪ3 Уа1 Рго Туг ТНг С1п А1а Зег Зег С1у РНе С1и Мее
770 775 780
Тгр Ьуз Азп Азп Зег С1у Агд Рго Ьеи С1п С1и ТНг А1а Рго РНе О1у 795 790 795 800
Суз Ьуз 11е А1а Уа1 Азп Рго Ьеи Агд А1а Уа1 Азр Суз Зег Туг С1у 805 810 815
Азп 11е Рго 11е Зег 11е Азр 11е Рго Азп А1а А1а РНе 11е Агд ТНг
820 825 830
Зег Азр А1а Рго Ьеи Уа1 Зег ТНг Уа1 Ьуз Суз С1и Уа1 Зег С1и Суз 835 940 945
ТНг Туг Зег А1а Аер РНе С1у С1у МеЪ А1а ТНг Ьеи С1п Туг Уа1 Зег 850 855 860
Азр Агд 01и 01у 01п Суз Рго Уа1 Нгз Зег Ηίβ Зег Зег ТНг А1а ТНг 865 970 975 890
Ьеи 61η С1и Зег ТЬг Уа1 Нгз Уа1 Ьеи С1и Ьуз С1у А1а Уа1 ТНг Уа1 885 890 895
Н1е РНе Зег ТНг А1а Зег Рго С1п А1а Аеп РНе 11е Уа1 Зег Ьеи Суз 900 905 910
С1у Ьуз Ьуз ТНг ТЬг Суз Азп А1а С1и Суз Ьуз Рго Рго А1а Азр Нгз 915 920 925
11е Уа1 Зег ТНг Рго Н1з Ьуз Аеп Аер С1п С1и РНе С1п А1а А1а 11е 930 935 940
Зег Ьуз ТНг Зег Тгр Зег Тгр Ьеи РЬе А1а Ьеи РНе б1у С1у А1а Зег 945 950 955 960
Зег Ьеи Ьеи 11е 11е С1у Ьеи МеН 11е РНе А1а Суз Зег МеН МеН Ьеи 965 970 975
- 88 027236
<210> 7 Уа1 ТЬг А1а Мер 10 Суз Ьеи Ьеи 61у Азп 15 Уа1
<211> <212> : <213> : <400> 982 Белки Вирус Синдбис
7 А1а А1а Рго 5 Ьеи
МеЬ 1 Зег
Зег РЬе Рго Суз Азр Агд Рго Рго ТЬг Суз Туг ТЬг Агд 61и Рго Зег
20 25 30
Агд А1а Ьеи Аер Не Ьеи 01 и 51 и Аеп Уа1 Азп ΗΪ3 С1и А1а Туг Азр
35 40 45
ТЬг Ьеи Ьеи Аеп А1а 11е Ьеи Агд Суз 61у Зег Зег С1у Агд Зег Ьуз
50 55 60
Агд Зег Уа1 11е Азр Аер РЬе ТЬг Ьеи ТЬг Зег Рго Туг Ьеи 61 у ТЬг
65 70 75 80
Суз Зег Туг Суз ΗΪ3 ΗΪ3 ТЬг Уа1 Рго Суз РЬе Зег Рго Уа1 Ьуз 11е
85 90 95
61и О1п Уа1 Тгр Азр С1и А1а Азр Аер Азп ТЬг 11е Агд 11е О1п ТЬг
100 105 но
Зег А1а С1п РЬе 51 у Туг Азр 61 п 5ег 61у А1а А1а Зег А1а Азп Ьуз
115 12 0 125
Туг Агд Туг Ме© Зег Ьеи Ьуз 61п Аер ΗΪ5 ТЬг Уа1 Ьуз 61и О1у ТЬг
130 135 140
МеЬ Аэр Агр 11е Ьуз 11е Зег ТЬг Зег 01у Рго Суз Агд Агд Ьеи Зег
145 150 155 160
Туг Ьуз 61у Туг РЬе Ьеи Ьеи А1а Ьуз Суз Рго Рго С1у Азр Зег Уа1
165 170 175
ТЬг Уа1 Зег 11е Уа1 Зег Зег Азп Зег А1а ТЬг Зег Суз ТЬг Ьеи А1а
180 185 190
Агд Ьуз Не Ьуз Рго Ьуе РЬе Уа1 01 у Агд 61 и Ьуз Туг Азр Ьеи Рго
195 200 205
Рго Уа1 Н15 С1у Ьуз Ьуе 11е Рго Суе ТЬг Уа1 Туг Аер Агд Ьеи 61и
210 215 220
- 89 027236
- 90 027236
- 91 027236
А1а МеЬ Ьуз Рго С1у А1а РЬе С1у Азр Не С1п А1а ТЬг Зег Ьеи ТЬг 740 745 750
Зег Ьуг Агр Ьеи 11е А1а Зег ТЬг Агр 11е Агд Ьеи Ьеи Ьу5 Рго Зег 755 760 765
А1а Ьуз Азп Уа1 Низ Уа1 Рго Туг ТЬг С1п А1а Зег Зег С1у РЬе С1и 770 775 780
МеЬ Тгр Ьуз Азп Азп Зег О1у Агд Рго Ьеи О1п С1и ТЬг А1а Рго РЬе 785 790 795 800
С1у Суз Ьуз 11е А1а Уа1 Азп Рго Ьеи Агд А1а Уа1 Азр Суз Зег Туг
805 810 815
С1у Азп 11е Рго 11е Зег 11е Азр 11е Рго Азп А1а А1а РЬе 11е Агд 020 025 030
ТЬг Зег Азр А1а Рго Ьеи Уа1 Зег ТЬг Уа1 Ьуз Суз С1и Уа1 Зег С1и 835 840 845
Суз ТЬг Туг Зег А1а Азр РЬе б1у О1у МеЬ А1а ТЬг Ьеи С1п Туг Уа1 050 055 060
Зег Азр Агд б1и О1у 61η Суз Рго Уа1 Низ Зег Низ Зег Зег ТЬг А1а 865 870 875 880
ТЬг Ьеи С1п С1и Зег ТЬг Уа1 Низ Уа1 Ьеи С1и Ьуз С1у А1а Уа1 ТЬг
885 890 895
Уа1 Низ РЬе Зег ТЬг А1а Зег Рго О1п А1а Азп РЬе 11е Уа1 Зег Ьеи 900 905 910
Суз С1у Ьуз Ьуз ТЬг ТЬг Суз Азп А1а С1и Суз Ьуз Рго Рго А1а Азр
915 920 925
Низ 11е Уа1 Зег ТЬг Рго Низ Ьуз Азп Азр С1п С1и РЬе С1п А1а А1а 930 935 940
11е Зег Ьуз ТЬг Зег Тгр Зег Тгр Ьеи РЬе А1а Ьеи РЬе 31у С1у А1а 945 950 955 960
Зег Зег Ьеи Ьеи 11е 11е С1у Ьеи МеЬ 11е РЬе А1а Суг Зег МеЬ МеЬ 965 970 975
Ьеи ТЬг Зег ТЬг Агд Агд
930 <210> 8
- 92 027236 <2Ы> 981 <212> Белки <213> Вирус Синдбис <400> 8
МеС 1 Зег АЬа АЬа Рго 5 Ьеи УаЬ ТЬг АЬа МеС 10 Суз Ьеи Ьеи СЬу Азп 15 УаЬ
Зег РЬе Рго Суз Азр Агд Рго Рго ТЬг Суз Туг ТЬг Агд СЬи Рго Зег
20 25 30
Агд АЬа Ьеи Агр 11е Ьеи СЬи СЬи Азп УаЬ Азп НЬз СЬи АЬа Туг Азр
35 40 45
ТЬг Ьеи Ьеи Азп АЬа 11е Ьеи Агд Суз СЬу Зег Зег СЬу Агд Зег Ьуз
50 55 60
Агд Зег Уа1 11е Азр Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг Зег Рго Туг Ьеи 61у ТЬг
65 70 75 80
Суз Зег Туг Суз НЬз ΗΪ5 ТЬг УаЬ Рго Суз РЬе Зег Рго УаЬ Ъу$ 11е
85 90 95
СЬи С1п Уа1 Тгр Азр б1и АЬа Азр Азр Азп ТЬг 11е Агд 11е С1п ТЬг
100 105 но
Зег АЬа Οίη РЬе СЬу Туг Азр СЬп Зег СЬу АЬа АЬа Зег АЬа Азп Ьуз
115 120 125
Туг Агд Туг МеС Зег Ьеи Ьуз СЬп Азр НЬз ТЬг УаЬ Ьуз СЬи б1у ТЬг
130 135 140
МеС Азр Аер 11е Ьуз 11е Зег ТЬг Зег СЬу Рго Суз Агд Агд Ъеи Зег
145 150 155 160
Туг Ьуз С1у Туг РЬе Ьеи Ьеи АЬа Ьуз Суз Рго Рго СЬу Азр Зег УаЬ
165 170 175
ТЬг УаЬ Зег 11е УаЬ Зег Зег Азп Зег АЬа ТЬг Зег Суз ТЬг Ъеи АЬа
180 185 190
Агд Ьуз Не Ьуз Рго Ьуе РЬе УаЬ СЬу Агд СЬи Ьуз Туг Азр Ъеи Рго
195 200 205
Рго УаЬ Н±Б СЬу Ьуз Ьуз Не Рго Суз ТЬг УаЬ Туг Азр Агд Ъеи СЬи
210 215 220
ТЬг ТНг А1а СЬу Туг 11е ТЬг МеС НЬз Агд Рго Агд Рго НЬз А1а Туг
225 230 235 240
- 93 027236
- 94 027236
Ъеи Тгр Зег Азп Зег 61п Рго РНе РНе Тгр Уа1 61п Ьеи Суз Не Рго 500 505 510
Ъеи А1а А1а РНе 11е Уа1 Ъеи Мер Агд Сун Сун Зег Сун Сун Ъеи Рго 515 520 525
РНе Ъеи Уа1 Уа1 А1а С1у А1а Туг Ъеи А1а Ьуе Уа1 Азр А1а Туг С1и
530 535 540
Н±в А1а ТНг ТНг Уа1 Рго Азп Уа1 Рго С1п Не Рго Туг Ьуз А1а Ъеи 545 550 555 560
Уа1 С1и Агд А1а С1у Туг А1а Рго Ъеи Азп Ъеи С1и 11е ТНг Уа1 Мер
565 570 575
Зег Зег С1и Уа1 Ъеи Рго Зег ТНг Азп С1п С1и Туг 11е ТНг Суз Ъуг 580 585 590
РНе ТНг ТНг Уа1 Уа1 Рго Зег Рго Ъун 11е Ъун Суз Суз С1 у Зег Ъеи 595 600 605
С1и Суз С1п Рго А1а А1а Н1з А1а Азр Туг ТНг Суз Ъуз Уа1 РНе С1у 610 615 620
С1у Уа1 Туг Рго РНе Мер Тгр С1у С1у А1а С1п Суз РНе Суз Анр Зег 625 630 635 640
С1и Азп Зег С1п Мер Зег С1и А1а Туг Уа1 С1и Ъеи Зег А1а Азр Суз 645 650 655
А1а Зег Азр Шз А1а С1п А1а 11е Ъуз Уа1 Шз ТНг А1а А1а Мер Ъуз 660 665 670
Уа1 31у Ъеи Агд Ые Уа1 Туг 61у Азп ТНг ТЬг Зег РНе Ъеи Азр Уа1 675 680 685
Туг Уа1 Азп С1у Уа1 ТНг Рго С1у ТНг Зег Ъуз Азр Ъеи Ъуз Уа1 11е
690 695 700
А1а 51у Рго 11е Зег А1а Зег РНе ТНг Рго РНе Азр Шз Ъуз Уа1 Уа1 705 710 715 720
11е Шз Агд 61у Ъеи Уа1 Туг Азп Туг Азр РНе Рго 61и Туг 61у А1а
725 730 735
Мер Ъуз Рго С1у А1а РНе 61у Азр 11е С1п А1а ТЬг Зег Ъеи ТЬг Зег 740 745 750
- 95 027236
Ьуз Азр Ьеи Не АЬа Зег ТЬг Азр 11е Агд Ьеи Ьеи Ьуз Рго Зег АЬа 755 760 765
Ьуз Азп УаЬ Низ УаЬ Рго Туг ТЬг СЬп АЬа Зег Зег 61у РЬе С1и МеЬ 770 775 780
Тгр Ьуз Азп Азп Зег СЬу Агд Рго Ьеи СЬп СЬи ТЬг АЬа Рго РЬе СЬу 785 790 795 800
Суз Ьуз 11е АЬа УаЬ Азп Рго Ьеи Агд АЬа УаЬ Азр Суз Зег Туг СЬу 805 810 815
Азп 11е Рго 11е Зег 11е Азр 11е Рго Азп АЬа АЬа РЬе 11е Агд ТЬг
820 825 830
Зег Азр АЬа Его Ьеи УаЬ Зег ТЬг Уа1 Ьуз Суз СЬи УаЬ Зег СЬи Суз 835 810 815
ТЬг Туг Зег АЬа Азр РЬе СЬу СЬу МеЬ АЬа ТЬг Ьеи СЬп Туг УаЬ Зег 850 855 860
Азр Агд СЬи СЬу СЬп Суз Рго УаЬ ΗΪ5 Зег ΗΪ5 Зег Зег ТЬг А1а ТЬг
865 870 875 880
Ьеи СЬп СЬи Зег ТЬг УаЬ НЬз УаЬ Ьеи СЬи Ьуз СЬу АЬа УаЬ ТЬг УаЬ 885 890 895
НЬз РЬе Зег ТЬг АЬа Зег Рго СЬп АЬа Азп РЬе 1Ье УаЬ Зег Ьеи Суз 900 905 910
СЬу Ьуз Ьуз ТЬг ТЬг Суз Азп АЬа СЬи Суз Ьуз Рго Его АЬа Азр НЬз 915 920 925
11е УаЬ Зег ТЬг Рго НЬз Ьуз Азп Азр СЬп СЬи РЬе СЬп АЬа АЬа Не 930 935 910
Зег Ьуз ТЬг Зег Тгр Зег Тгр Ьеи РЬе АЬа Ьеи РЬе СЬу СЬу АЬа Зег 945 950 955 960
Зег Ьеи Ьеи 11е 11е СЬу Ьеи МеЬ 11е РЬе АЬа Суз Зег МеЬ МеЬ Ьеи 965 970 975
ТЬг Зег ТЬг Агд Агд
980 <210> 9 <211> 982
- 96 027236 <212> Белки <213> Вирус Синдбис <400> 9
МеЬ 1 Зег АЬа АЬа Рго 5 Ьеи УаЬ ТЬг А1а МеЬ 10 Суз Ьеи Ьеи СЬу Азп 15 Уа1
Зег РЬе Рго Суз Азр Агд Рго Рго ТНг Суз Туг ТНг Агд СЬи Рго Зег
20 25 30
Агд АЬа Ьеи Азр Не Ьеи С1и С1и Азп УаЬ Азп НЬз СЬи АЬа Туг Азр
35 40 45
ТЬг Ьеи Ьеи Азп АЬа 11е Ьеи Агд Суз СЬу Зег Зег СЬу Агд Зег Ьуз
50 55 60
Агд Зег УаЬ 11е Азр Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг Зег Рго Туг Ьеи С1у ТЬг
65 70 75 80
Суй Зег Туг Суз Н1з Н1з ТЬг УаЬ Рго Суз РЬе Зег Рго УаЬ Ьуз Не
85 90 95
С1и СЬп УаЬ Тгр Азр С1и АЬа Азр Азр Азп ТЬг Не Агд 11е СЬп ТЬг
100 105 но
Зег АЬа еьп РЬе С1у Туг Азр С1п Зег СЬу А1а А1а Зег А1а Азп Ьуз
115 120 125
Туг Агд Туг МеЬ Зег Ьеи Ьуз С1п Азр НЬз ТЬг УаЬ СЬи СЬи СЬу ТЬг
130 135 140
МеЬ Азр Азр 11е Ьу£ 11е Зег ТЬг Зег СЬу Рго Суз Агд Агд Ьеи Зег
145 150 155 160
Туг Ьуз СЬу Туг РНе Ьеи Ьеи А1а Ьуз Суз Рго Рго СЬу Азр Зег УаЬ
165 170 175
ТЬг УаЬ Зег 11е ν*1 Зег Зег Азп Зег АЬа ТЬг Зег Суз ТЬг Ьеи АЬа
180 185 190
Агд Ьуй 11е Ьуз Рго Ьуз РЬе УаЬ С1у Агд СЬи Ьуз Туг Азр Ьеи Рго
195 200 205
Рго УаЬ НЬз СЬу ЬуЗ Ьуз 11е Рго Суз ТЬг УаЬ Туг Азр Агд Ьеи СЬи
210 215 220
С1у ТЬг ТЬг АЬа 01 у Туг Не ТЬг МеН НЬз Агд Рго Агд Рго НЬз АЬа
225 230 235 240
- 97 027236
Туг ТНг Зег Туг Ьеи С1и С1и Зег
245
Зег СЬу Ьуг Уа1 Туг АЬа Ьуз Рго
250 255
Рго Зег 61у Ьуг Азп Не ТНг Туг 2 60
СЬи Суз Ьуз Суз СЬу Азр Туг Ьуз 265 270
ТНг 61у ТНг Уа1 Зег ТНг Агд ТНг
275 280
СЬи 1Ье ТНг СЬу Суг ТНг АЬа 11е
285
Ьуз 61п Суз 7а1 АЬа Туг Ьуз Зег 290 295
Азр СЬп ТНг Ьуз Тгр УаЬ РЬе Азп 300
Зег Рго Азр Ьеи Не Агд НЬз Азр 305 310
Азр НЬз ТНг АЬа СЬп СЬу Ьуз Ьеи
315 320
НЬз Ьеи Рго РНе Ьуз Ьеи Не Рго
325
Зег ТНг Суг МеС УаЬ Рго УаЬ АЬа
330 335
НЬз АЬа Рго Азп Уа1 11е НЬз СЬу 340
РЬе Ьуз НЬз 11е Зег Ьеи СЬп Ьеи 345 350
Агр ТНг Агр НЬг Ьеи ТНг Ьеи Ьеи
355 360
ТЬг ТНг Агд Агд Ьеи 61у А1а Агп
365
Рго С31и Рго ТНг ТЬг 61и Тгр 11е 370 375
Уа1 61у Ьуз ТЬг Уа1 Агд Азп РЬе 380
ТЬг УаЬ Азр Агд Азр 6Ьу Ьеи ОЬи 385 390
Туг Не Тгр СЬу Азп НЬз СЬи Рго 395 400
Уа1 Агд УаЬ Туг АЬа СЬп 61и Зег
405
АЬа Рго СЬу Азр Рго НЬз СЬу Тгр
410 415
Рго НЬз '11 и 11е 7а1 6Ьп НЬз Туг 420
Туг Шз Агд НЬз Рго АЬ Туг ТЬг 425 430
11е Ьеи А1а Уа1 А1а Зег А1а ТЬг 435 440
УаЬ АЬа Мес Мес 11е СЬу Уа1 ТЬг
445
ЫаЬ А1а УаЬ Ьеи Суз АЬа Суз Ьуз 450 455
АЬа Агд Агд СЬи Суг Ьеи ТЬг Рго 460
Туг А1а Ьеи А1а Рго Азп АЬа УаЬ 465 470
11е Рго ТЬг Зег Ьеи АЬа Ьеи Ьеи 475 480
Суз Суз .11 Агд Зег АЬа Азп А1а 485
СЬи ТЬг РЬе ТЬг СЬи ТЬг МеС Зег 490 495
- 98 027236
Туг Ьеи Тгр Зег 500 Аэп Зег С1п Рго РЬе 505 РЬе Тгр Уа1 С1п Ьеи 510 Суэ 11е
Рго Ьеи А1а 515 А1а РЬе 11е Уа1 Ъеи 52 0 МеЬ Агд Суз Суз Зег 525 Суз Суз Ъеи
Рго РЬе 530 Ъеи Уа1 Уа1 А1а С1у 535 А1а Туг Ьеи А1а Ьуз 540 Уа1 Азр А1а Туг
С1и 54 5 ΗΪ5 А1а ТЬг ТЬг Уа1 550 Рго Анп Уа1 Рго 31п 555 11е Рго Туг Ъуз А1а 560
Ъеи Уа1 61и Агд А1а 565 С1у Туг А1а Рго Ьеи 570 Анп Ьеи С1и 11е ТЬг 575 Уа1
МеС Зег Зег 61 и 580 Уа1 Ьеи Рго Зег ТЬг 585 Азп 61 п 01и Туг 11е 590 ТЬг Суй
ЪуН РЬе ТЬг 595 ТЬг Уа1 Уа1 Рго Бег 600 Рго Ьуз 11е Ьуз Суз 605 Суз 61у Вег
Ъеи С1и 610 Суз 61 п Рго А1а А1а 615 ΗΪ3 А1а Азр Туг ТЬг 62 0 Суз Ьуз Уа1 РЬе
61у 625 С1у Уа1 Туг Рго РЬе 630 МеЬ Тгр С1у С1у А1а 635 С1п Суз РЬе Суз Азр 640
Вег О1и Азп Бег 61η 645 МеЬ Зег 61и А1а Туг 650 Уа1 С1и Ьеи Зег А1а 655 Азр
Суз А1а Зег Азр 660 ΗΪ3 А1а С1п А1а 11е 665 Ьуз Уа1 Н1з ТЬг А1а 670 А1а МеС
Ъу5 Уа1 61у 675 Ъеи Агд 11е Уа1 Туг 680 С1у Азп ТЬг ТЬг Зег 685 РЬе Ъеи Азр
Уа1 Туг 690 Уа1 Азп 01 у Уа1 ТЬг 695 Рго С1у ТЬг Зег Ьуз 700 Азр Ьеи Ъуз Уа1
Не 705 А1а 61у Рго 11е Зег 710 А1а Бег РЬе ТЬг Рго 715 РЬе Азр ΗΪΞ Ъуз Уа1 720
Уа1 11е Ηίϊ Агд С1у 725 Ьеи Уа1 Туг Αδη Туг 730 Анр РЬе Рго 61и Туг 735 61у
А1а МеЬ Ъуз Рго 740 С1у А1а РЬе 61у Аер 745 11е 61п А1а ТЬг Зег 750 Ъеи ТЬг
- 99 027236
Зег Ьуг Азр Ьеи Не А1а Зег ТЬг Агр 11е Агд Ьеи Ьеи Ьуг Рго Зег 755 760 765
А1а Ьуг Азп Уа1 Н1з Уа1 Рго Туг ТЬг С1ь А1а Зег Зег С1у РЬе С1и 770 775 780
МеЬ Тгр Ьуг Агп Αεη Зег С1у Агд Рго Ьеи 31п (31и ТЬг А1а Рго РЬе 785 790 795 800
С1у Суг Ьуг 11е А1а Уа1 Агп Рго Ьеи Агд А1а Уа1 Агр Суз Зег Туг 805 810 815
С1у Агп 11е Рго 11е Зег 11е Азр 11е Рго Азп А1а А1а РЬе 11е Агд 820 825 830
ТЬг Зег Азр А1а Рго Ьеи Уа1 Зег ТЬг Ул I Ьуз Суз О1и Уа1 Зег Й1и 835 840 845
Суз ТЬг Туг Зег А1а Азр РЬе С1у С1у МеС А1а ТЬг Ьеи е1п Туг Уа1 850 855 860
Зег Агр Агд 61и 61у 61п Суг Рго УаЬ Н1г Зег Н1з Зег Зег ТЬг А1а 865 870 875 880
ТЬг Ьеи '3 Гл С1и Зег ТЬг УаЬ Ηίε Уа1 Ьеи С1и Ьуг С1у А1а Уа1 ТЬг 885 890 895
Уа1 Н1з РЬе Зег ТЬг А1а Зег Рго С1п А1а Азп РЬе 11е Уа1 Зег Ьеи 900 905 910
Суг С1у Ьуз Ьуг ТЬг ТЬг Суг Азп А1а 61и Суг Ьуг Рго Рго А1а Агр 915 920 925
Н1з 11е Уа1 Зег ТЬг Рго Ыз Ьуг Азп Азр С1п С1и РЬе С1п А1а А1а 930 935 940
11е Зег Ьуз ТЬг Зег Тгр Зег Тгр Ьеи РЬе А1а Ьеи РЬе <31у <31у А1а 945 950 955 960
Зег Зег Ьеи Ьеи Ые Ые С1у Ьеи МеС 11е РЬе А1а Суг Зег МеС МеС 965 970 975
Ьеи ТЬг Зег ТНг Агд Агд 980 <210> 10 <211> 981 <212> Белки
- 100 027236
<213> Вирус Синдбис
<4оо> ; 10
МеС Зег АЬа А1а Рго Ьеи УаЬ ТЬг А1а МеС Суз Ьеи Ьеи С1у Азп УаЬ
1 5 10 15
Зег РЬе Рго Суз Азр Агд Рго Рго ТЬг Суз Туг ТЬг Агд С1и Рго Зег
20 25 30
Агд А1а Ьеи Азр 11е Ьеи С1и СЬи Азп Уа1 Азп Ηίε СЬи А1а Туг Азр
35 40 45
ТЬг Ьеи Ьеи Азп А1а 11е Ьеи Агд Суз СЬу Зег Зег СЬу Агд Зег Ьуз
50 55 60
Агд Зег Уа1 Не Азр Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг Зег Рго Туг Ьеи С1у ТЬг
65 70 75 80
Суз Зег Туг Суз ΗΪ3 ΗΪ5 ТЬг УаЬ Рго Суз РЬе Зег Рго Уа1 Ьуз Ые
85 90 95
01 и οι и Уа1 Тгр Азр С1и А1а Азр Азр Азп ТЬг 11е Агд 11е 01 п ТЬг
100 105 но
Зег А1а 01 η РЬе С1у Туг Азр С1п £ег СЬу А1а АЬа Зег А1а Азп Ьуз
115 120 125
Туг Агд Туг МеТ Зег Ьеи Ьуз СЬп Азр НЬз ТЬг УаЬ СЬи С1и СЬу ТЬг
130 135 140
МеС Азр Азр 11е Ьуз 11е Зег ТЬг Зег 61 у Рго Суз Агд Агд Ьеи Зег
145 150 155 160
Туг Ьуз С1у Туг РЬе Ьеи Ьеи АЬа Ьуз Суз Рго Рго СЬу Азр Зег Уа1
165 170 175
ТЬг Уа1 Зег 11е Уа1 Зег Зег Азп Зег АЬа ТЬг Зег Суз ТЬг Ьеи А1а
130 185 190
Агд Ьуз 11е Ьуз Рго Ьуз РЬе Уа1 С1у Агд С1и Ьуз Туг Азр Ьеи Рго
195 200 205
Рго Уа1 НЬз 61у Ьуз Ьуз 11е Рго Суз ТЬг Уа1 Туг Азр Агд Ьеи СЬи
210 215 220
ТЬг ТЬг АЬа б1у Туг 11е ТЬг МеС Нйз Агд Рго Агд Рго Нте АЬа Туг
225 230 235 240
- 101 027236
- 102 027236
- 103 027236
ЬуЗ Азр Ьеи 755 Пе АЬа Зег ТЬг Авр 760 11е Агд Ьеи Ьеи Ьуз 765 Рго Зег А1а
Ь/5 Азп Уа1 НЬз УаЬ Рго Туг ТЬг СЬп АЬа Зег Зег С1у РЬе СЬи МеЬ
770 775 780
Тгр Ьуз Азп Азп Зег С1у Агд Рго Ьеи СЬп СЬи ТЬг А1а Рго РЬе С1у
735 790 795 800
Суз Ьуз 11е АЬа УаЬ Авп Рго Ьеи Агд АЬа УаЬ Азр Сув Зег Туг С1у
805 810 315
Азп Пе Рго Пе Зег 11е Агр 11е Рго А5П АЬа АЬа РЬе Не Агд ТЬг
820 825 330
Зег Азр А1а Рго Ьеи Уа1 Зег ТЬг УаЬ Ьуз Суз СЬи Уа1 Зег СЬи Сув
835 840 845
ТЬг Туг Зег АЬа Агр РЬе СЬу С1у МеС АЬа ТЬг Ьеи 61п Туг УаЬ Зег
850 855 860
Азр Агд С1и СЬу СЬп Сув Рго Уа1 НЬз Зег НЬз Зег Бег ТЬг АЬа ТЬг
865 870 375 880
Ьеи СЬп 31и Зег ТЬг Уа1 НЬз Уа1 Ьеи СЬи Ьуз СЬу А1а Уа1 ТЬг Уа1
885 890 395
НЬз РЬе Зег ТЬг АЬа Зег Рго С1п АЬа А5П РЬе 1Ье Уа1 Зег Ьеи Суз
900 905 910
СЬу Ьуз Ьуз ТЬг ТЬг Суз Азп А1а СЬи Суз Ьуз Рго Рго АЬа Азр Н1в
915 920 925
Пе УаЬ Зег ТЬг Рго Ηίε Ьуз Авп Азр СЬп СЬи РЬе 61п АЬа АЬа 11е
930 935 940
Зег Ьуз ТЬг Зег Тгр Зег Тгр Ьеи РЬе АЬа Ьеи РЬе 61у СЬу АЬа Зег
945 950 955 960
Зег Ьеи Ьеи 11е 11е С1у Ьеи МеЬ 11е РЬе АЬа Суз Бег МеЬ МеЬ Ьеи
965 970 975
ТЬг Зег ТЬг Агд Агд
980
<210> 11
<211> ' 982
<212> 1 Белки
<213> : Вирус Синдбис
- 104 027236
- 105 027236
Рго Зег СЬу Ьуз Азп 11е ТЬг Туг С1и Суз Ьуз Суз СЬу Азр Туг Ьуз 260 265 270
ТНг СЬу ТНг УаЬ Зег ТЬг Агд ТЬг СЬи 11е ТЬг СЬу Суе ТНг АЬа 11е
275 280 285
Ьуз СЬп Суз УаЬ АЬа Туг Ьуз Зег Азр СЬп ТЬг Ьуз Тгр УаЬ РЬе Азп 290 295 300
Зег Рго Аер Ьеи 11е Агд НЬе Азр Азр НЬз ТЬг АЬа СЬп СЬу Ьуз Ьеи
305 310 315 320
НЬз Ьеи Рго РЬе Ьуз Ьеи 11е Рго Зег ТЬг Суз МеЬ Уа1 Рго УаЬ А1г 325 330 335
Нтз АЬа Рго Азп Уа1 11е НЬз СЬу РЬе Ьуз Нтз Не Зег Ьеи СЬп Ьеи 340 345 350
Аер ТНг Аер НЬз Ьеи ТЬг Ьеи Ьеи ТЬг ТЬг Агд Агд Ьеи СЬу АЬа Аеп 355 360 365
Рго СЬи Рго ТЬг ТЬг СЬи Тгр Не УаЬ СЬу Ьуз ТЬг УаЬ Агд Азп РЬе 370 375 380
ТНг УаЬ Аер Агд Аер СЬу Ьеи СЬи Туг 1Ье Тгр СЬу Аеп НЬе СЬи Рго
385 390 395 400
УаЬ Агд УаЬ Туг АЬа СЬп СЬи Зег АЬа Рго СЬу Азр Рго НЬз СЬу Тгр 405 410 415
Рго Нтз СЬи 1Ье УаЬ СЬп Нтз Туг Туг НЬз Агд Нтз Рго УаЬ Туг ТНг 420 425 430
11е Ьеи АЬа УаЬ АЬа Зег АЬа ТЬг УаЬ АЬа МеС МеС 1Ье СЬу УаЬ ТЬг
435 440 445
УаЬ АЬа УаЬ Ъеи Суз АЬа Суз Ъуз АЬа Агд Агд СЬи Суз Ьеи ТНг Рго 450 455 460
Туг АЬа Ьеи АЬа Рго Аеп АЬа Уа1 1Ье Рго ТЬг Зег Ьеи АЬа Ьеи Ьеи 465 470 475 480
Суз Суз УаЬ Агд Зег АЬа Азп АЬа СЬи ТЬг РЬе ТЬг СЬи ТЬг МеС Зег 485 490 495
Туг Ьеи Тгр Зег Азп Зег СЬп Рго РЬе РЬе Тгр УаЬ СЬп Ьеи Суе 11е 500 505 510
- 106 027236
Рго Ьеи А1а А1а РНе 11е Уа1 Ьеи Меб Агд Суз Суз Зег Суз Суз Ьеи 515 520 525
Рго РЬе Ьеи Уа1 Уа1 А1а С1у А1а Туг Ьеи А1а Ьуз Уа1 Азр А1а Туг 530 535 540
61и Шз А1а ТНг ТНг Уа1 Рго Азп Уа1 Рго 61п 11е Рго Туг Ьуз А1а 545 550 555 560
Ьеи Уа1 31и Агд А1а О1у Туг А1а Рго Ьеи Азп Ьеи 61и 11е ТЬг Уа1 565 570 575
Меб Зег Зег С1и Уа1 Ьеи Рго Зег ТНг Азп 61п С1и Туг 11е ТЬг Суз
580 585 590
Ьуз РНе ТНг ТНг Уа1 Уа1 Рго Зег Рго Ьуз 11е Ьуз Суз Суз 61у Зег 595 600 605
Ьеи 61и Суз С1п. Рго А1а А1а Шз А1а Азр Туг ТЬг Суз Ьуз Уа1 РЬе 610 615 620
С1у С1у Уа1 Туг Рго РНе Меб Тгр С1у С1у А1а С1п Суз РЬе Суз Азр
625 630 635 640
Зег '7 I и Азп Зег С1п Меб Зег С1и А1а Туг Уа1 С1и Ьеи Зег А1а Азр 645 650 655
Суз А1а Зег Азр Шз А1а 61п А1а 11е Ьуз Уа1 Шз ТНг А1а А1а Меб
660 665 670
Ьуз Уа1 С1у Ьеи Агд 11е Уа1 Туг С1у Азп ТНг ТНг Зег РЬе Ьеи Азр 675 680 685
Уа1 Туг Уа1 Азп С1у Уа1 ТНг Рго С1у ТНг Зег Ьуз Азр Ьеи Ьуз Уа1 690 695 700
11е А1а 51у Рго 11е Зег А1а Зег РНе ТНг Рго РНе Азр Шз Ьуз Уа1 705 710 715 720
Уа1 11е Шз Агд 61у Ьеи Уа1 Туг Азп Туг Азр РЬе Рго 31и Туг 71у 725 730 735
А1а Меб Ьуз Рго С1у А1а РНе 61у Азр 11е С1п А1а ТНг Зег Ьеи ТНг
740 745 750
Зег Ьуз Азр Ьеи 11е 755
А1а
Зег
ТНг Азр 7 60
11е Агд Ьеи Ьеи Ьуз Рго Зег 765
- 107 027236
<210> 12
<211> 981
<212> Белки
<213> Вирус Симдбис
<400> 12
- 108 027236
- 109 027236
- 110 027236
- 111 027236
Ъуз Азп 770 Уа1 НЬз УаЬ Рго Туг ТЬг 775 ОЬп АЬа Зег Зег 780 51у РЬе ОЬи МеЕ
Тгр Ьуз Азп Азп Зег 51 у Агд Рго Ьеи 61 п 51 и ТЬг А1а Рго РЬе 01 у
785 790 795 800
Суз Ьуз 11е А1а УаЬ Азп Рго Ьеи Агд АЬа УаЬ Азр Суз Зег Туг 61у
805 810 815
Азп 11е Его 11е Зег 11е Азр 11е Рго Азп А1а АЬа РЬе Не Агд ТЬг
820 825 830
Зег Агр А1а Рго Ьеи Уа1 Зег ТЬг Уа1 Ьуг Суз 51 и Уа1 Зег 61и Суз
835 840 845
ТЬг Туг Зег А1а Анр РЬе 51у ЗЬу МеЬ АЬа ТЬг Ьеи ОЬп Туг Уа1 Зег
850 855 860
Азр Агд 61и 61у 61 п Суз Рго Уа1 НЬз Зег НЬз Зег Зег ТЬг АЬа ТЬг
865 870 875 830
Ъеи Οίη 61и Зег ТЬг Уа1 НЬз Уа1 Ьеи 51и Ьуз 61у АЬа Уа1 ТЬг Уа1
885 890 895
Ηΐ5 РЬе Зег ТЬг А1а Зег Рго 01 п А1а Азп РЬе 11е Уа1 Зег Ьеи Суз
900 905 910
С1у Ьу5 Ьу5 ТЬг ТЬг Суз Агп А1а 51 и Суг Ьуз Рго Рго А1а Аэр Н1 з
915 920 925
11е Уа1 Зег ТЬг Рго НЬз Ьуз Азп Азр 61п ОЬи РЬе 61п А1а АЬа Не
930 935 940
Зег Ьуз ТЬг Зег Тгр Зег Тгр Ьеи РЬе А1а Ьеи РЬе 61 у С1у АЬа Зег
945 950 955 960
5ег Ьеи Ьеи 11е Не 51у Ьеи Мер Не РЬе АЬа Суз Зег МеЕ МеЬ Ъеи
965 970 975
ТЬг Зег ТЬг Агд Агд
980
<210> 13
<211> 982
<212> Белки
<213> Вирус Синдбис
<400> 13
- 112 027236
Меб Зег 741а 741а Рго Ьеи \7а1 ТНг А1а МеС Сун Ьеи Ьеи С1у Анп 47а1 15 10 15
Зег РНе Рго Сун Аар Агд Рго Рго ТНг Сун Туг ТНг Агд С1и Рго Зег 20 25 30
Агд А1а Ьеи Анр 11е Ьеи 61и С1и Ани 47а1 Ани Ηίε 61и А1а Туг Агр 35 40 45
ТНг Ьеи Ьеи Ани А1а 11е Ьеи Агд Суг 61у Зег бег 61у Агд Зег Ьун 50 55 60
Агд Зег 47а1 11е Анр Анр РЬе ТНг Ьеи ТНг Зег Рго Туг Ьеи С1 у ТЬг 65 70 75 30
Сун Зег Туг Суг Н1г Н1г ТНг Уа1 Рго Суг РНе Зег Рго Уа1 Ьун 11е 85 90 95
С1и С1п 47а1 Тгр Анр С1и А1а Авр Азр Азп ТНг 11е Агд 11е С31п ТНг 100 105 110
Зег А1а С1п РНе С1у Туг Анр 61п Зег 61у А1а А1а Зег А1а Анн Ьун
115 120 125
Туг Агд Туг МеС Зег Ьеи 61и 61п Анр Ηίε ТНг Уа1 Ьуг С1и С1у ТНг 130 135 140
МеС Азр Азр 11е Ьун 11е Зег ТНг Зег С1у Рго Сун Агд Агд Ьеи Зег 145 150 155 160
Туг Ьун С1у Туг РНе Ьеи Ьеи А1а Ьуг Суг Рго Рго 61у Агр Зег Уа1
165 170 175
ТНг Уа1 Зег 11е 47а1 Зег Зег Азп Зег А1а ТНг Зег Сун ТНг Ьеи 741а 180 185 190
Агд Ьун 11е Ьуг Рго Ьуг РНе 47а1 С1у Агд С1и Ьуг Туг Агр Ьеи Рго
195 200 205
Рго 4-'а1 Шн С1у Ьуг Ьуг 11е Рго Суг ТНг Уа1 Туг Анр Агд Ьеи Ьуг 210 215 220
С1у ТНг ТНг А1а С1у Туг 11е ТНг МеС Шн Агд Рго Агд Рго Н1з 741а 225 230 235 240
Туг ТЬг Зег Туг Ьеи С1и С1и Зег Зег С1у Ьун Уа1 Туг 741а Ьуз Рго 245 250 255
- 113 027236
- 114 027236
- 115 027236
А1а Ьуз 770 Азп Уа1 Ηίδ Уа1 Рго 775 Туг ТЬг 61п А1а Зег 750 Зег 61 у РЬе 61и
МеЬ Тгр Ьуз Азп Азп Зег С1у Агд Рго Ьеи СЬп С1и ТЬг А1а Рго РЬе
7Θ5 790 795 800
51 у Суз Ьуз 11е А1а Уа1 АЗП Рго Ьеи. Агд А1а Уа1 Азр Суз Зег Туг
805 810 815
61 у Аеп 11е Рго 11е Зег 11е Азр 11е Рго Азп А1а А1а РЬе 11е Агд
820 825 830
ТЬг Зег Азр А1а Рго Ьеи Уа1 Зег ТЬг Уа1 Ьуе Суз С1и Уа1 Зег 61и
835 840 845
Суз ТЬг Туг Зег А1а Азр РЬе С1у С1у МеЬ А1а ТЬг Ьеи С1п Туг Уа1
850 855 360
Зег Азр Агд 61и С1у 61п Суз Рго Уа1 ΗΪ3 Зег Н13 Зег Зег ТЬг А1а
865 870 875 880
ТЬг Ьеи 61п 61 и Зег ТЬг Уа1 Н±з Уа1 Ьеи С1и Ьуз С1у А1а Уа1 ТЬг
885 890 895
Уа1 НЬз РЬе Зег ТЬг А1а Зег Рго СЬп А1а Аеп РЬе 11е Уа1 Зег Ьеи
900 905 910
Суз С1у Ьуз Ьуз ТНг ТЬг Суз Аеп А1а 61 и Суе Ьуз Рго Рго А1а Азр
915 920 925
Шз 11е Уа1 Зег ТЬг Рго ΗΪ3 Ьуз Азп Азр СЬп С1и РЬе С1п А1а А1а
930 935 940
11е Зег Ьуз ТЬг Зег Тгр Зег Тгр Ьеи РЬе А1а Ьеи РЬе 61 у 61 у А1а
94 5 950 955 960
Зег Зег Ьеи Ьеи 11е 11е С1у Ьеи Ме© 11е РЬе А1а Суз Зег МеС МеС
965 970 975
Ьеи ТНг Зег ТЬг Агд Агд
980
<210> 14
<211> 981
<212> : Белки
<213> Вирус Синдбис
<400> 14
Ме© Зег А1а А1а Рго Ьеи Уа1 ТЬг А1а МеС Суе Ьеи Ьеи 61 у Азп Уа1
1 5 10 15
- 116 027236
Зег РНе Рго Суз Азр Агд Рго Рго 20
ТНг Суз Туг ТЬг Агд С1и Рго Зег
30
Агд А1а Ъеи Азр 11е Ъеи <31и 31и 35 40
Азп Уа1 Азп Шз <31и А1а Туг Азр 45
ТНг Ъеи Ъеи Азп А1а 11е Ъеи Агд
55
Суз С1у Зег Зег С1у Агд Зег Ъуз 60
Агд Зег Уа1 11е Азр Азр РЬе ТЬг 65 70
Ъеи ТЬг Зег Рго Туг Ъеи С1у ТНг 75 80
Суз Зег Туг Суз НЪз Шз ТНг Уа1
Рго Суз РНе Зег Рго Уа1 Ъуэ 11е 90 95
С1и С1п Уа1 Тгр Азр С1и А1а Азр 100
Азр Азп ТНг 11е Агд 11е С1п ТНг 105 110
Зег А1а С1п РЬе <31у Туг Азр 31п 115 120
Зег 31у А1а А1а Зег А1а Азп Ъуз 125
Туг Агд Туг Мер Зег Ъеи С1и С1п
130 135
Азр Шз ТНг Уа1 Ъуз С1и С1у ТНг 140
Мер Азр Азр 11е Ъуз 11е Зег ТЬг 145 150
Зег С1у Рго Суз Агд Агд Ъеи Зег 155 160
Туг Ъуз С1у Туг РНе Ъеи Ъеи А1а 165
Ъуз Суз Рго Рго С1у Азр Зег Уа1 170 175
ТНг Уа1 Зег 11е Уа1 Зег Зег Азп
180
Зег А1а ТНг Зег Суз ТНг Ъеи А1а 185 190
Агд Ъуз 11е Ъуз Рго Ъуз РНе Уа1 195 200
С1у Агд С1и Ъуз Туг Азр Ъеи Рго 205
Рго Уа1 Шз С1у Ъуз Ъуз Не Рго
210 215
Суз ТНг Уа1 Туг Азр Агд Ъеи Ъуз
220
ТЬг ТНг А1а 31у Туг 11е ТЬг Мер 225 230
Н1з Агд Рго Агд Рго Шз А1а Туг 235 240
ТНг Зег Туг Ъеи С1и С1и Зег Зег 245
С1у Ъуз Уа1 Туг А1а Ъуг Рго Рго
250 255
Зег С1у Ъуз Азп 11е ТЬг Туг С1и 260
Суз Ъуз Суз С1у Азр Туг Ъуз ТНг 265 270
- 117 027236
- 118 027236
- 119 027236
Тгр 785 Ьуз Азп Азп Зег СЬу 790 Агд Рго Ьеи СЬп СЬи 795 ТЬг АЬа Рго РНе СЬу 800
Суз Ьуз 1Ье А1а УаЬ Азп Рго Ьеи Агд АЬа УаЬ Азр Суз Зег Туг СЬу
805 810 815
Азп Пе Рго Пе Зег Ые Азр Ые Рго Азп АЬа АЬа РЬе 11е Агд ТЬг
820 825 830
Зег Азр АЬа Рго Ьеи УаЬ Зег ТЬг УаЬ Ьуз Суз СЬи УаЬ Зег СЬи Суз
835 840 845
ТЬг Туг Зег АЬа Азр РЬе СЬу СЬу МеС АЬа ТЬг Ьеи СЬп Туг УаЬ Зег
350 855 8 60
Азр Агд СЬи СЬу СЬп Суз Рго Уа1 НЬз Зег НЬз Зег Зег ТЬг АЬа ТЬг
865 870 875 880
Ьеи 61η СЬи Зег ТЬг УаЬ НЬз УаЬ Ьеи СЬи Ьуз СЬу АЬа УаЬ ТЬг УаЬ
885 890 895
НЬз РНе Зег ТНг АЬа Зег Рго СЬп АЬа Азп РЬе Ые Уа1 Зег Ьеи Суз
900 905 эьо
СЬу Ьуз Ьуз ТНг ТЬг Суз Азп АЬа СЬи Суз Ьуз Рго Рго АЬа Азр НЬз
915 920 925
11е Уа1 Зег ТНг Рго НЬз Ьуз Азп Азр СЬп СЬи РЬе СЬп АЬа АЬа 11е
930 935 940
Зег Ьуз ТЬг Зег Тгр Зег Тгр Ьеи РЬе АЬа Ьеи РЬе СЬу СЬу АЬа Зег
945 950 955 960
Зег Ьеи Ьеи Ые Ые СЬу Ьеи МеЬ Ые РЬе АЬа Суз Зег МеС МеС Ьеи
965 970 975
ТЬг Зег ТЬг Агд Агд
980
<210> 15
<211> 982
<212> ] Белки
<213> : Вирус Синдбис
<400> 15
МеН Зег А1а АЬа Рго Ьеи УаЬ ТЬг АЬа МеС Суз Ьеи Ьеи СЬу Азп УаЬ
1 5 ьо 15
- 120 027236
Вег РЬе Рго Суз Азр Агд Рго Рго ТЬг Суз Туг ТЬг Агд СЬи Рго Вег 20 25 30
Агд АЬа Ьеи Аер 11е Ьеи СЬи СЬи Аеп УаЬ Аеп НЬе СЬи АЬа Туг Азр 35 40 45
ТЬг Ьеи Ьеи Азп АЬа ЬЬе Ьеи Агд Суз СЬу Бег Бег СЬу Агд Вег Ьуз 50 55 60
Агд Вег УаЬ 11е Азр Азр РЬе ТЬг Ьеи ТНг Бег Рго Туг Ьеи СЬу ТЬг 65 70 75 80
Суе Вег Туг Суз НЬз НЬз ТЬг УаЬ Рго Суе РНе Бег Рго УаЬ Ьуе 1Ье 85 90 95
СЬи СЬп УаЬ Тгр Азр СЬи АЬа Азр Азр Азп ТЬг ЬЬе Агд ЬЬе СЬп ТЬг 100 105 110
Вег АЬа СЬп РЬе СЬу Туг Азр СЬп Бег СЬу АЬа АЬа Бег АЬа Аеп Ьуз 115 120 125
Туг Агд Туг Мер Бег Ьеи С1и СЬп Азр НЬз ТЬг УаЬ СЬи СЬи СЬу ТЬг 130 135 140
МеС Азр Аер 11е Ьуе 11е Бег ТЬг Бег С1у Рго Суе Агд Агд Ьеи Зег
145 150 155 160
Туг Ьуз СЬу Туг РЬе Ьеи Ьеи АЬа Ьуз Суе Рго Рго С1у Аер Зег Уа1 165 170 175
ТНг Уа1 Вег Не УаЬ Бег Бег Азп Бег АЬа ТНг Бег Суз ТНг Ьеи АЬа 180 185 190
Агд Ьуз 11е Ьуе Рго Ьуе РНе УаЬ СЬу Асд СЬи Ьуе Туг Аер Ьеи Его
195 200 205
Рго Уа1 НЬз СЬу Ьуз Ьуз Ые Рго Суз ТЬг УаЬ Туг Азр Агд Ьеи Ьуз 210 215 220
СЬу ТНс ТНс АЬа СЬу Туг Ые ТНс МеС НЬз Асд Рсо Асд Рго НЬз АЬа
225 230 235 240
Туе ТНс Вес Туе Ьеи СЬи СЬи Бег Бег СЬу Ьуз УаЬ Туе АЬа Ьуз Его 245 250 255
Рго Вес СЬу Ьуе Аеп 11е ТНс Туе СЬи Суз Ьуз Суз СЬу Аер Туе Ьуе 260 265 270
- 121 027236
- 122 027236
- 123 027236
МеС 735 Тгр Ьуг Азп Агп Зег 790 С1 у Агд Рго Ьеи С1п 795 С1и ТЬг А1а Рго РЬе 800
61у Суз Ьуг 11е А1а ν*ι Азп Рго Ьеи Агд А1а Уа1 Азр Суг Зег Туг
805 310 815
С1у Азп 11е Рго 11е Зег 11е Аар 11е Рго Агп А1а А1а РЬе 11е Агд
320 825 830
ТЬг Зег Агр А1а Рго Ьеи Уа1 Зег ТЬг Уа1 Ьуг Суг С1и Уа1 Зег 61и
835 340 345
Суз ТЬг Туг Зег А1а Азр РЬе С1у С1у МеС А1а ТЬг Ьеи С1п Туг Уа1
350 855 860
Зег Азр Агд С1и С1у С1п Суз Рго Уа1 ΗΪ3 Зег Шз Зег Зег ТЬг А1а
365 870 875 880
ТЬг Ьеи 21п С1и Зег ТЬг Уа1 ΗΪ3 Уа1 Ьеи С1и Ьуг С1у А1а Уа1 ТЬг
885 890 395
Уа1 ΗΪ3 РЬе Зег ТЬг А1а Зег Рго С1п А1а Азп РЬе 11е Уа1 Зег Ьеи
900 905 910
Суз С1у Ьуг Ьуз ТЬг ТЬг Суз Азп А1а С1и Суг Ьуг Рго Рго А1а Агр
915 920 925
Н±з 11е УаЬ Зег ТЬг Рго ΗΪΞ Ьу5 Азп Азр С1п С1и РЬе С1п А1а А1а
930 935 94 0
Не Зег Ьуз ТЬг Зег Тгр Зег Тгр Ьеи РЬе А1а Ьеи РЬе 61у С1у А1а
945 950 955 960
Зег Зег Ьеи Ьеи Ые 11е С1у Ьеи МеС 11е РЬе А1а Суз Зег МеС МеС
965 970 975
Ьеи ТЬг Зег ТЬг Агд Агд
980
<210> 16
<211> 981
<212> ] Белки
<213> : Вирус Синдбис
<400> 16
МеС Зег А1а А1а Рго Ьеи Уа1 ТЬг А1а МеЬ Суз Ьеи Ьеи С1у Азп УаЬ
1 5 10 15
- 124 027236
Зег РЬе Рго Суз Азр Агд Рго Рго 20
ТЬг Суз Туг ТЬг Агд СЬи Рго Зег 25 30
Агд АЬа Ьеи Азр 11е Ьеи СЬи СЬи 35 40
Азп УаЬ Азп НЬз СЬи АЬа Туг Азр 45
ТЬг Ьеи Ьеи Αεη АЬа 1Ье Ьеи Агд
55
Суз СЬу Зег Зег СЬу Агд Зег Ьуз 60
Агд Зег УаЬ 1Ье Азр Азр РЬе ТНг 65 70
Ьеи ТЬг Зег Рго Туг Ьеи СЬу ТЬг 75 80
Суз Зег Туг Суз НЬз НЬз ТЬг УаЬ Э5
Рго Суз РЬе Зег Рго УаЬ Ьуз 11е 90 95
СЬи СЬп УаЬ Тгр Азр СЬи АЬа Азр ЬОО
Азр Азп ТНг 11е Агд Не СЬп ТЬг 105 110
Зег АЬа СЬп РЬе СЬу Туг Азр СЬп 115 120
Зег СЬу АЬа АЬа Зег АЬа Азп Ьуз 125
Туг Агд Туг МеС Зег Ьеи СЬи СЬп 130 135
Азр НЬз ТНг УаЬ СЬи СЬи СЬу ТЬг 140
МеС Азр Азр 11е Ьуз 11е Зег ТНг 145 150
Зег СЬу Рго Суз Агд Агд Ьеи Зег 155 160
Туг Ьуз СЬу Туг РЬе Ьеи Ьеи АЬа 165
Ьуз Суз Рго Рго СЬу Азр Зег УаЬ 170 175
ТЬг УаЬ Зег 11е УаЬ Зег Зег Азп 180
Зег АЬа ТНг Зег Суз ТЬг Ьеи АЬа 185 190
Агд Ьуз Не Ьуз Рго Ьуз РЬе УаЬ 195 200
СЬу Агд СЬи Ьуз Туг Азр Ьеи Рго 205
Рго УаЬ НЬз СЬу Ьуз Ьуз 11е Рго 210 215
Суз ТЬг УаЬ Туг Азр Агд Ьеи Ьуз
220
ТЬг ТЬг АЬа СЬу Туг 11е ТЬг МеС 225 230
НЬз Агд Рго Агд Рго НЬэ АЬа Туг 235 240
ТЬг Зег Туг Ьеи СЬи СЬи Зег Зег 245
СЬу Ьуз УаЬ Туг АЬа Ьуз Рго Рго 250 255
Зег СЬу Ьуз Азп 11е ТЬг Туг СЬи 260
Суз Ьуз Суз СЬу Азр Туг Ьуз ТЬг 265 270
- 125 027236
С1у ТЬг Уа1 Зег ТЬг Агд ТЬг С1и 275 280
11е ТЬг С1у Суз ТЬг А1а 11е Ьуз 285
С1п Суз Уа1 А1а Туг Ьуз Зег Азр
290 295
С1п ТЬг Ьуз Тгр Уа1 РЬе Азп Зег
300
Рго Азр Ьеи 11е Агд Нтз Азр Азр 305 310
Нтз ТЬг А1а 31п <31у Ьуз Ьеи Нтз 315 320
Ьеи Рго РЬе Ьуз Ьеи 11е Рго Зег 325
ТЬг Суз МеЬ Уа1 Рго Уа1 А1а Нтз 330 335
А1а Рго Азп Уа1 11е ΗΪ3 С1у РЬе
340
Ьуз НЬз 11е Зег Ьеи С1п Ьеи Азр 345 350
ТЬг Азр Ηϊз Ьеи ТЬг Ьеи Ьеи ТЬг 355 360
ТЬг Агд Агд Ьеи <31у А1а Азп Рго 365
С1и Рго ТЬг ТЬг С1и Тгр 11е Уа1
370 375
С1у Ьуг ТЬг Уа1 Агд Азп РЬе ТЬг
380
Уа1 Азр Агд Азр С1у Ьеи С1и Туг 385 390
11е Тгр С1у Азп Нтз С1и Рго Уа1 395 400
Агд Уа1 Туг А1а С1п 31и Зег А1а 405
Рго С1у Азр Рго Нтз С1у Тгр Рго 410 415
Нтз С1и 11е Уа1 С1п ΗΪ3 Туг Туг
420
НЬз Агд ΗΪ5 Рго Уа1 Туг ТЬг 11е 425 430
Ьеи А1а УаЬ А1а Зег А1а ТЬг Уа1 435 440
А1а МеЬ МеЬ 11е <31у Уа1 ТЬг Уа1 445
А1а Уа1 Ьеи Суз А1а Суз Ьуз А1а 450 455
Агд Агд С1и Суз Ьеи ТЬг Рго Туг
460
А1а Ьеи А1а Рго Азп А1а Уа1 11е 465 470
Рго ТЬг Зег Ьеи А1а Ьеи Ьеи Суз 475 480
Суз Уа1 Агд Зег А1а Азп А1а С1и 485
ТЬг РЬе ТЬг С1и ТЬг МеЬ Зег Туг 490 495
Ьеи Тгр Зег Азп Зег С1п Рго РЬе 500
РЬе Тгр Уа1 С1п Ьеи Суз 11е Рго 505 510
Ьеи А1а А1а РЬе 11е Уа1 Ьеи МеЬ
515 520
Агд Суз Суз Зег Суз Суз Ьеи Рго 525
- 126 027236
- 127 027236
Тгр 785 Ьуз Азп Азп Зег СЬу 790 Агд Рго Ьеи СЬп С1и 795 ТНг АЬа Рго РНе С1у 800
Суй Ьуз Не АЬа УаЬ Аеп Рго Ьеи Агд АЬа Уа1 Азр Суз Зег Туг С1у
805 810 815
Азп Не Рго Не Зег Не Азр Не Рго Азп АЬа АЬа РНе 1Ье Агд ТНг
820 825 330
Зег Азр АЬа Рго Ьеи νβΐ Зег ТЬг 11а 1 Ьуз Суз СЬи Уа Ь Зег СЬи Суз
835 840 345
ТНг Туг Зег АЬа Азр РЬе СЬу СЬу Меб АЬа ТНг Ьеи СЬп Туг УаЬ Бег
850 855 860
Азр Агд С1и СЬу СЬп Суз Рго ЛГаЬ НЬз Бег Нтз Зег Зег ТНг АЬа ТНг
865 870 875 880
Ьеи СЬп С1и Зег ТЬг УаЬ Н1з УаЬ Ьеи СЬи Ьуз СЬу АЬа УаЬ ТНг УаЬ
885 890 895
НЬз РНе Зег ТЬг АЬа Бег Рго СЬп АЬа Азп РНе Не УаЬ Зег Ьеи Суз
900 905 910
СЬу Ьуз Ьуз ТЬг ТЬг Суз Азп АЬа СЬи Суз Ьуз Рго Рго АЬа Азр ΗΪ8
915 920 925
Не Зег ТЬг Рго Н1з Ьуз Аеп Аер СЬп С1и РНе СЬп АЬа АЬа Не
930 935 940
Зег Ьуз ТНг Зег Тгр Бег Тгр Ьеи РЬе АЬа Ьеи РНе СЬу СЬу АЬа Зег
945 950 955 960
Зег Ьеи Ьеи Не Не СЬу Ьеи Меб Не РЬе А1а Суз Зег МеЬ Меб Ьеи
965 970 975
ТНг Зег ТНг Агд Агд
980
<210> 17
<211> 982
<212> : Белки
<213> Вирус Синдбис
<400> 17
МеН Зег АЬа АЬа Рго Ьеи ν3ΐ ТЬг АЬа Меб Суз Ьеи Ьеи СЬу Азп Уа1
1 5 10 15
Зег РНе Рго Су5 Азр Агд Рго Рго ТЬг Суз Туг ТНг Агд СЬи Его Бег
20 25 30
- 128 027236
Агд А1а Ьеи Азр Не Ьеи С1и С1и Азп Уа1 Азп Είδ С1и А1а Туг Азр 35 40 45
ТНг Ьеи Ьеи Азп А1а 11е Ьеи Агд Суз СЬу Зег Зег С1у Агд Зег Ьуз 50 55 60
Агд Зег Уа1 Не Азр Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг Зег Рго Туг Ьеи 31у ТЬг 65 70 75 80
Суз Зег Туг Суз НЬз НЬг ТЬг Уа1 Его Суз РЬе Зег Рго Уа1 Ьуз Не 85 90 95
Пи С1п Уа1 Тгр Азр С1и А1а Азр Азр Азп ТЬг 11е Агд 11е С1п ТЬг 100 105 110
Зег А1а <31п РЬе СЬу Туг Азр СЬп Зег СЬу АЬа А1а Зег А1а Азп Ьуз
115 120 125
Туг Агд Туг МеС Зег Ьеи Ьуз СЬп Азр НЬз ТЬг Уа1 Ьуз СЬи С1у ТНг
130 135 140
МеЬ Азр Азр 11е Ьуз 11е Зег ТЬг Зег СЬу Рго Суз Агд Агд Ьеи Зег 145 150 155 160
Туг Ьуз СЬу Туг РЬе Ьеи Ьеи АЬа Ьуз Суз Рго Рго СЬу Азр Зег УаЬ 165 170 175
ТЬг УаЬ Зег 11е УаЬ Зег Зег Азп Зег АЬа ТЬг Зег Сун ТЬг Ьеи А1а 180 185 190
Агд Ьуз 11е Ьун Рго Ьун РЬе УаЬ СЬу Агд СЬи Ьун Туг Анр Ьеи Рго 195 200 205
Рго УаЬ НЬз СЬу Ьуз Ьуз 11е Рго Суз ТЬг Уа1 Туг Азр Агд Ьеи Ьуз
210 215 220
СЬи ТЬг ТЬг АЬа СЬу Туг 11е ТЬг МеС Н1з Агд Рго Агд Рго НЬз АЬа 225 230 235 240
Туг ТЬг Зег Туг Ьеи СЬи СЬи Зег Зег СЬу Ьуз УаЬ Туг А1а Ьуз Рго
245 250 255
Рго Зег СЬу Ьуз Азп 11е ТЬг Туг СЬи Суз Ьуз Суз СЬу Азр Туг Ьуз 260 265 270
ТНг СЬу ТНг УаЬ Зег ТЬг Агд ТЬг СЬи 11е ТЬг СЬу Суз ТНг А1а 11е
275 280 285
- 129 027236
- 130 027236
С1и Шз АЬа ТЬг ТЬг УаЬ Рго Азп УаЬ Рго СЬп Ые Рго Туг Ьуз АЬа 545 550 555 550
Ьеи УаЬ 61и Агд АЬа СЬу Туг АЬа Рго Ьеи Азп Ьеи 61и Ые ТЬг УаЬ 565 570 575
МеС Вег Вег СЬи УаЬ Ьеи Рго Вег ТЬг Азп СЬп СЬи Туг Ые ТЬг Суз 580 585 590
Ьуз РЬе ТЬг ТЬг УаЬ УаЬ Рго Зег Рго Ьуз 11е Ьуз Суз Суз СЬу Вег 595 600 605
Ьеи СЬи Суз СЬп Рго АЬа АЬа НЬз АЬа Азр Туг ТЬг Суз Ьуз УаЬ РЬе 610 615 620
СЬу СЬу УаЬ Туг Рго РЬе МеС Тгр СЬу СЬу АЬа СЬп Суз РЬе Суз Азр 625 630 635 640
Зег СЬи Азп Вег С1п МеС Зег С1и А1а Туг Уа1 С1и Ьеи Вес АЬа Азр
645 650 655
Суз АЬа Зег Азр НЬз АЬа СЬп АЬа Ые Ьуз УаЬ НЬз ТЬг АЬа АЬа МеС 660 665 670
Ьуз Уа1 СЬу Ьеи Агд 11е Уа1 Туг С1у Азп ТЬг ТЬг Зег РЬе Ьеи Азр 675 680 685
УаЬ Туг УаЬ Азп СЬу УаЬ ТЬг Рго СЬу ТЬг Вег Ьуз Азр Ьеи Ьуз УаЬ 690 695 700
Ые АЬа СЬу Рго 1Ье Вег АЬа Вег РЬе ТЬг Рго РЬе Азр НЬз Ьуз УаЬ 705 710 715 720
Уа1 11е НЬз Агд С1у Ьеи Уа1 Туг Азп Туг Азр РЬе Рго СЬи Туг СЬу 725 730 735
АЬа МеС Ьуз Рго СЬу АЬа РЬе СЬу Азр Ые СЬп АЬа ТЬг Вег Ьеи ТЬг 740 745 750
Зег Ьуз Агр Ьеи 11е А1а Зег ТЬг Азр 11е Агд Ьеи Ьеи Ьуз Рго Зег 755 760 765
АЬа Ьуз Азп УаЬ НЬз УаЬ Рго Туг ТЬг СЬп АЬа Вег Вег СЬу РЬе СЬи 770 775 780
МеС Тгр Ьуз Азп Азп Зег С1у Агд Рго Ьеи 785 790
С1п С1и ТЬг АЬа Рго 795
РЬе
800
- 131 027236
СЬу Суз Ьуз 11е АЬа УаЬ Азп Его Ьеи Агд АЬа УаЬ Азр Суг Зег Туг 805 810 815
СЬу Азп 11е Рго 11е Зег 11е Азр 11е Рго Азп АЬа АЬа РЬе Ые Агд 820 825 330
ТЬг Зег Азр АЬа Рго Ьеи Уа1 Зег ТЬг УаЬ Ьуз Суз СЬи УаЬ Зег СЬи 835 840 845
Суз ТЬг Туг Зег АЬа Азр РЬе СЬу СЬу МеЬ АЬа ТЬг Ьеи СЬп Туг УаЬ 850 855 860
Зег Азр Агд СЬи СЬу СЬп Суз Рго УаЬ НЬе Зег НЬе Зег Зег ТЬг АЬа 865 870 875 880
ТЬг Ьеи СЬп СЬи Зег ТЬг УаЬ НЬз УаЬ Ьеи СЬи Ьуз СЬу АЬа УаЬ ТЬг 885 890 895
УаЬ НЬе РЬе Зег ТНг АЬа Зег Рго СЬп АЬа Азп РЬе Ые УаЬ Зег Ьеи 900 905 910
Суз СЬу Ьуз Ьуз ТЬг ТЬг Суз Аэп АЬа СЬи Суз Ьуз Рго Рго АЬа Азр 915 920 925
НЬз 11е УаЬ Зег ТЬг Рго НЬз Ьуз Азп Азр СЬп СЬи РЬе СЬп АЬа АЬа 930 935 940
Ые Зег Ьуз ТЬг Зег Тгр Зег Тгр Ьеи РНе АЬа Ьеи РЬе СЬу СЬу АЬа 945 950 955 960
Зег Зег Ьеи Ьеи Ые Ые СЬу Ьеи МеЬ 11е РЬе АЬа Суз Зег Мер МеЬ 965 970 975
Ьеи ТЬг Зег ТЬг Агд Агд
980
<210> 18
<400> ООО 18
<210> 19
<400> 000 19
<2Ю> <211> <212> <213> 20 488 Белки Вирус Синдбис
- 132 027236 <400> 20
МеЬ Зег АЬа АЬа Рго Ьеи УаЬ ТНг 1 5
Зег РНе Рго Суз Азр Агд Рго Рго 20
АЬа МеЬ Суз Ьеи Ьеи СЬу Азп УаЬ 10 15
ТЬг Суз Туг ТНг Агд СЬи Рго Зег 25 30
Агд АЬа Ьеи Азр 11е Ьеи СЬи СЬи 35 40
Азп УаЬ Азп НЬз СЬи АЬа Туг Азр 45
ТНг Ьеи Ьеи Азп А1а 11е Ьеи Агд 50 55
Суз СЬу Зег Зег СЬу Агд Зег Ьуз 60
Агд Зег УаЬ 11е Азр Азр РНе ТНг 65 70
Ьеи ТНг Зег Рго Туг Ьеи СЬу ТНг 75 00
Суз Зег Туг Суз Низ НЬз ТНг УаЬ 85
Рго Суз РНе Зег Рго УаЬ Ьуз 1Ье 90 95
СЬи СЬп Уа1 Тгр Агр СЬи АЬа Азр 100
Агр Аэп ТНг 11е Агд 1Ье СЬп ТНг 105 Ь10
Зег АЬа СЬп РНе СЬу Туг Азр СЬп 115 120
Зег СЬу АЬа АЬа Зег АЬа Азп Ьуз 125
Туг Агд Туг МеЬ Зег Ьеи Ьуз СЬп 130 135
Азр ΗΪ3 ТНг УаЬ Ьуз СЬи СЬу ТНг 140
МеЬ Азр Азр ЬЬе Ьуз ЬЬе Зег ТНг 145 150
Зег СЬу Рго Суз Агд Агд Ьеи Зег 155 160
Туг Ьуз СЬу Туг РНе Ьеи Ьеи АЬа 165
Ьуз Суз Рго Рго СЬу Азр Зег УаЬ 170 175
ТНг Уа1 Зег 11е УаЬ Зег Зег Азп
180
Зег АЬа ТНг Зег Су5 ТНг Ьеи АЬа
185 Ь90
Агд Ьуз 11е Ьуз Рго Ьуз РНе УаЬ 195 200
СЬу Агд СЬи Ьуз Туг Азр Ьеи Рго 205
Рго Уа1 Ηΐδ СЬу Ьу5 Ьуз Не Рго
210 2Ь5
Суз ТНг УаЬ Туг Азр Агд Ьеи Ьуэ
220
СЬи ТНг ТНг АЬа СЬу Туг ЬЬе ТНг 225 230
МеЬ НЬз Агд Рго Агд Рго НЬз АЬа 235 240
Туг ТНг Зег Туг Ьеи СЬи С1и Зег 245
Зег СЬу Ьуз УаЬ Туг АЬа Ьуэ Рго 250 255
- 133 027236
Рго Зег СЬу Ьуз Азп ЬЬе ТЬг Туг СЬи Суз Ьуз Суз СЬу Азр Туг Ьуз 260 265 270
ТЬг СЬу ТЬг УаЬ Зег ТЬг Агд ТЬг СЬи Пе ТЬг СЬу Суз ТЬг АЬа 11е
275 280 285
Ьуз СЬп Суз УаЬ АЬа Туг Ьуз Зег Азр СЬп ТЬг Ьуз Тгр УаЬ РЬе Азп 290 295 300
Зег Рго Азр Ьеи 11е Агд НЬз Агр Агр НЬз ТЬг АЬа СЬп СЬу Ьуг Ьеи
305 ЗЬО 315 320
НЬз Ьеи Рго РЬе Ьуз Ьеи 1Ье Рго Зег ТЬг Суз МеЬ УаЬ Рго УаЬ АЬа 325 330 335
НЬз АЬа Рго Азп УаЬ ЬЬе НЬз СЬу РЬе Ьуз НЬз ЬЬе Зег Ьеи С1п Ьеи 340 345 350
Азр ТЬг Азр НЬз Ьеи ТЬг Ьеи Ьеи ТЬг ТЬг Агд Агд Ьеи СЬу АЬа Азп
355 360 365
Рго СЬи Рго ТЬг ТЬг СЬи Тгр 1Ье УаЬ СЬу Ьуз ТЬг УаЬ Агд Азп РЬе 370 375 380
ТЬг УаЬ Азр Агд Азр СЬу Ьеи СЬи Туг Пе Тгр СЬу Азп ΗΪ5 СЬи Рго
385 390 395 400
УаЬ Агд УаЬ Туг АЬа СЬп СЬи Зег АЬа Рго СЬу Азр Рго НЬз СЬу Тгр 405 410 415
Рго НЬз СЬи Пе УаЬ СЬп НЬз Туг Туг НЬз Агд НЬз Рго УаЬ Туг ТЬг 420 425 430
Пе Ьеи АЬа УаЬ АЬа Зег АЬа ТЬг УаЬ АЬа Ме1: Ме^ Пе СЬу УаЬ ТЬг 435 440 445
УаЬ АЬа УаЬ Ьеи Суз АЬа Суз Ьуз АЬа Агд Агд СЬи Суз Ьеи ТЬг Рго 450 455 460
Туг АЬа Ьеи АЬа Рго Азп АЬа УаЬ ЬЬе Рхо ТЬг Зег Ьеи АЬа Ьеи Ьеи
465 470 475 480
Суз Суз УаЬ Агд Зег АЬа Азп АЬа 435 <210> 21 <2Ь1> 683
- 134 027236 <212> ДНК <213> Вирус иммунодефицита человека тип 1 <400> 21
ссЪадааааа са^ддадсаа ίсасаадСад саа^асадса дс^ассааСд сСда^^дСдс 60
с£ддс£адаа дсасаададд аддаддаддС дддЪЕЪСсса дСсасассСс аддСассСМ: 120
аадассааНд асССасаадд садсСдСада НсНСадссас СНСНСаааад аааадддддд 180
асНддааддд сНааНСсасС сссаасдаад асаадаНаНс сНСдаНсСдС ддаНсНасса 240
сасасааддс НасСНсссНд аННддсадаа сСасасасса дддссаддда НсадаНаНсс 300
асъдасс^сл дда7дд£дс7 асаадс1:адС ассадТХдад саададаадд 1;адаадаадс 360
саа^даадда дадаасассс дс1:СдС1:аса ссс7д7дадс сСдсаСддда £дда£дассс 420
ддадададаа дНаСНададС ддаддНННда садссдссНа дсаНННсаНс асаНддсссд 480
ададсДдсаН ссддасНдНа сЬдддНсЬсЬ сСддНСадас садаНсЬдад ссЬдддадсН 540
сДсДддсДаа сНадддаасс сасНдсПНаа дссДсааДаа адсННдссНП дадНдсДНса 600
ад£ад7д7д1: дсссд7с7д7 7д1:д1;дас1;с Сдд7аас7ад адаСссс1;са дассс£М:7а 660
дЪсадЪд^дд ааааЪсЪсЬа дса 683
<210> 22 <211> 416 <212> ДНК <213> Вирус иммунодефицита человека тип 1 <400> 22
ссНадааааа саСддадсаа СсасаадНад сааСасадса дсСассааНд сНдаСНдНдс 60
сСддсСадаа дсасаададд аддаддаддН дддСНСНсса дНсасассНс аддИассНСН 120
аадассааСд ас^асаадд садс1;д1;ада £с£1:адссас М:1;1:1;аааад аааадддддд 180
асЪддааддд сСааС1:сас7 сссаасдаад асаадаСсСд с£££1:Сдсс1: д£ас7ддд7с 240
НсНсЕддСНа дассадаСсС дадссНддда дсНсНсЪддс ЪаасЪаддда асссасСдсН 300
НаадссНсаа ЬааадсЬСдс сННдадИдсН ЕсаадСадЕд НдИдсссдНс 'Ьд'Ь'Ьд'Ьд'Ьда 360
сДсДддНаас ПададаНссс ДсадасссНН ЬДадНсадИд ДддааааНсН сНадса 416
<210> 23 <211> 401 <212> ДНК <213> Вирус иммунодефицита человека тип 1 <400> 23 ссЪадааааа са^ддадсаа 7сасаад1:ад саа^асадса дс^ассааСд сСдаМ^дСдс 60 сСддсСадаа дсасаададд аддаддаддН дддСНСНсса дНсасассНс аддНассНСН 120 аадассааСд асНЪасаадд садсНдНада ВсВЪадссас НДНДНасНдд аадддсЪааС 180
СсасСсссаа сдаадасаад аСсСдс1:£1:£ СдссСдСас1; ддд^с^сЪсЪ дд^Садасса 240
- 135 027236
даНсНдадсс НдддадсНсН сНддсНаасН адддаассса сНдсЬНаадс сНсааНааад 300
сННдссННда дНдсННсаад НадНдНдНдс ссдНсНдННд НдНдасНсНд дНаасНадад 360
аНсссНсада сссННННадН садНдНддаа ааНсНсНадс а 401
<210> 24
<400> ООО 24
<210> 25
<400> ООО 25
<210> 26
<211> 5
<212> Белок
<213> Вирус Синдбис
<4 00> 26
Агд Зег Ьуз Агд Зег
5 <210> 27 <211> 4 <212> Белок <213> Вирус Синдбис <400> 27
Агд Зег Ьуз Агд 1
<210> 28
<400> ООО 28
<210> 29
<400> ООО 29
<210> 30
<400> ООО 30
<210> 31
<400> ООО 31
<210> 32
<400> ООО 32
- 136 027236 <21υ> 33 <400> 33
ООО <210> 34 <400> 34
ООО <210> 35 <211> 8 <212> Белок <213> искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность пептида-метки <400> 35
Азр Туг Ьуе Азр Азр Азр Азр Ьуз 1 5 <210> 36 <211> 1374 <212> Белок <213> Герпесвирус человека тип <400> 36
МеС А1а А1а Его А1а Агд Азр Рго
5
Рго С1у Туг Агд Туг А1а А1а А1а 10 15
11е Ьеи Рго ТНг 31у Зег 11е Ьеи 20
Зег ТЬг 11е 61и Уа1 А1а Зег Ηίδ
30
Агд Агд Ьеи РНе Агр РЬе РЬе А1а 35 40
А1а Уа1 Агд Зег Агр С1и Азп Зег 45
Ьеи Туг Азр Уа1 С1и РЬе Агр А1а 50 55
Ьеи Ьеи 51у Зег Туг Суг Азп ТНг 60
Ьеи Зег Ьеи Уа1 Агд РЬе Ьеи 31и 65 70
Ьеи <31у Ьеи Зег Уа1 А1а Сун Уа1 75 80
Суз ТНг Ьуг РЬе Рго Е1и Ьеи А1а
Туг МеС Агп С1и С1у Агд Уа1 С1п
95
РНе 61и Уа1 Н1н '31 η Рго Ьеи 11е 100
А1а Агд Анр С31у Рго Шн Рго Уа1 105 110
С1и 61п Рго Уа1 Шз Агп Туг МеС 115 120
ТНг Ьуз Уа1 11е Агр Агд Агд А1а 125
Ьеи Азп А1а А1а РЬе Зег Ьеи А1а 130 135
ТЬг Ни А1а 11е А1а Ьеи Ьеи ТНг 140
- 137 027236
- 138 027236
- 139 027236
- 140 027236
А1а Рго Азр А1а 61у А1а Азп ТЬг А1а Зег ТЬг А1а Азп МеЬ Агд 11е 915 920 925
РНе Аэр б1у А1а Ьеи Нгз А1а 61у Уа1 Ьеи Ьеи МеЬ А1а Рго 61η Н1з 930 935 940
Ьеи Азр Н1з ТЬг 11е 61п Азп 61у 61и Туг РЬе Туг Уа1 Ьеи Рго Уа1 945 950 955 960
Шз А1а Ьеи РЬе А1а 61у А1а Азр Н1з Уа1 А1а Азп А1а Рго Азп РЬе
965 970 975
Рго Рго А1а Ьеи Агд Азр Ьеи А1а Агд Азр Уа1 Рго Ьеи Уа1 Рго Рго 980 985 990
А1а Ьеи б1у А1а Азп Туг РЬе Зег Зег 11е Агд 61η Рго Уа1 Уа1 61η 995 1000 1005
Ηΐ3 А1а Агд б1и Зег А1а А1а б1у С1и Азп А1а Ьеи ТЬг Туг А1а 1010 1015 1020
Ьеи МеЬ А1а 61у Туг РЬе Ьуз МеЬ Зег Рго УаЬ А1а Ьеи Туг Нгз 1025 1030 1035
С1п Ьеи Ьуз ТЬг 61у Ьеи Нгз Рго 61у РЬе 61у РЬе ТЬг Уа1 Уа1
1040 1045 1050
Агд 61η Азр Агд РЬе Уа1 ТЬг С1и Азп Уа1 Ьеи РЬе Зег б1и Агд 1055 1060 1065
А1а Зег С1и А1а Туг РЬе Ьеи 61у 61п Ьеи С1п Уа1 А1а Агд Нгз 1070 1075 1080
С1и ТЬг 61у 61у 61у Уа1 Азп РЬе ТЬг Ьеи ТЬг 61п Рго Агд 61у
1085 1090 1095
Азп Уа1 Азр Ьеи бЬу Уа1 бЬу Туг ТЬг А1а УаЬ А1а А1а ТЬг С1у 1100 1105 1110
ТЬг Уа1 Агд Азп Рго Уа1 ТЬг Азр МеЬ 61у Азп Ьеи Рго 61п Азп 1115 1120 1125
РЬе Туг Ьеи 31у Агд С1у А1а Рго Рго Ьеи Ьеи Азр Азп А1а А1а 1130 1135 1140
А1а Уа1 Туг Ьеи Агд Азп А1а Уа1 Уа1 А1а б1у Азп Агд Ьеи б1у 1145 1150 1155
- 141 027236
Рго А1а 1160 61п Рго Ъеи Рго Уа1 1165 Рпе О1у Суз А1а С1п 1170 Уа1 Рго Агд
Агд А1а 61у Мер Азр Н1з 61у С1п Азр А1а Уа1 Суз С1и РЬе 11е
1175 1180 1185
А1а ТНг Рго Уа1 А1а ТНг Азр Не Азп Туг РЬе Агд Агд Рго Суз
1190 1195 1200
Азп Рго Агд 61у Агд А1а А1а С1у С1у Уа1 Туг А1а С1у Азр Ьуз
1205 1210 1215
61и 61 у Азр Уа1 11е А1а Ъеи МеЬ Туг Азр ΗΪ3 С1у С1п Зег Азр
1220 1225 1230
Рго А1а Агд Рго РНе А1а А1а ТЬг А1а Азп Рго Тгр А1а Зег 61п
1235 1240 1245
Агд РНе Зег Туг 61у Азр Ъеи Ьеи Туг Азп С1у А1а Туг Н1з Ьеи
1250 1255 1260
Азп 61 у А1а Зег Рго Уа1 Ъеи Зег Рго Суз РЬе Ьуз РЬе РЬе ТЬг
1265 1270 1275
А1а А1а Азр 11е ТНг А1а Ъуз Ηΐ3 Агд Суз Ьеи С1и Агд Ьеи 11е
1280 1285 1290
Уа1 61и ТНг 61 у Зег А1а Уа1 Зег ТЬг А1а ТЬг А1 а А1 а Зег Азр
1295 1300 1305
Уа1 61п РНе Ъуз Агд Рго Рго С1у Суз Агд С1и Ьеи Л7а1 С1и Азр
1310 1315 1320
Рго Суз С1у Ъеи РНе 61п 61и А1а Туг Рго 11е ТЬг Су5 А1а Зег
1325 1330 1335
Азр Рго А1а Ъеи Ъеи Агд Зег А1а Агд Азр С1у С1и А1а ΗΪΞ А1а
1340 1345 1350
Агд 61и ТЬг Шз РНе ТЬг 61п Туг Ьеи 11е Туг Азр А1а Зег Рго
1355 1360 1365
Ъеи Ъуз 61у Ъеи Зег Ъеи
1370 <210> 37 <211> 15
- 142 027236
<212> <213> <400> Αεη Туг 1 Белок Герпесвирус 37 : РНе Зег Зег 5 человека 11е Агд тип С1п 2
Рго Уа1 10 Уа1 61 η Ша А1а Агд 15
<210 зе
<211> 15
<212> Белок
<213> Герпесвирус человека тип 2
<400> 38
Суз С1и РНе Не А1а ТЬг Рго Уа1 АЬа ТЬг Аар 11е Аап Туг РЬе
1 5 10 15
<210 39
<211> 15
<212> Белок
<213> Герпесвирус человека тип 2
<400 39
С1п Азп А1а Ьеи ТЬг Туг А1а Ьеи МеС А1а СЬу Туг РЬе Ьуз МеС
1 5 10 15
<2Ю> 40
<211> 15
<212> Белок
<213> Герпесвирус человека тип 2
<400> 40
ΗΪ3 Рго 61у РЬе С1у РЬе ТЬг Уа1 Уа1 Агд С1п Азр Агд РЬе Уа1
1 5 10 15
<210> 41 <211> 8 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Последовательность пептида-метки <400> 41
Азр Ьеи Туг Азр Азр Азр Азр Ъуз
5 <210> 42 <211> 45 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический пептид
- 143 027236 <400> 42
С1у Рго Ъуз С1и Рго РЬе С1п Зег Туг Уа1 Азр Агд РЬе Туг Ьуз Зег 15 10 15
Ьеи Агд АЬа СЬи С1п ТЬг Азр АЬа АЬа Уа1 Ьуз Азп Тгр
МеЬ ТЬг С1п
ТЬг Ьеи Ьеи 11е С1п Азп АЬа Азп Рго Азр Суз Ьуз Ьеи <210 43 <211> 11 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический пептид <400> 43
АЬа АЬа Уа1 Ьуз Азп Тгр МеЬ ТЬг С1п ТЬг Ьеи 15 10 <210 44 <211> 9 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический пептид <400> 44
Ьуз Зег Ьеи Туг Азп ТЬг Уа1 Суэ Уа1 1 5 <210> 45 <211> 13 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический пептид <400> 45
Азр Агд РЬе Туг Ьуз Зег Ьеи Агд АЬа СЬи С1п ТЬг Азр 15 10

Claims (44)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Способ индукции СИ8 Т-клеточного иммунного ответа у субъекта, причем способ включает:
    (a) введение субъекту по меньшей мере одной дозы первой иммуногенной композиции, содержащей лентивирусный вектор, включающий нуклеотидную последовательность, кодирующую первый иммуноген или его иммуногенный фрагмент, где указанный лентивирусный вектор вставлен в векторную частицу, где указанная векторная частица содержит лентивирусный векторный геном и альфа-вирусную оболочку; и (b) введение субъекту по меньшей мере одной дозы второй иммуногенной композиции, содержащей (ί) по меньшей мере, первый иммуноген или его иммуногенный фрагмент и (ίί) агонист ТЬК4, тем самым вызывая СИ8 Т-клеточный иммунный ответ, специфичный для первого иммуногена.
  2. 2. Способ по п.1, где первый иммуноген представляет собой первый полипептид и указанная нуклеотидная последовательность кодирует второй полипептид, который отличается от первого полипептида.
  3. 3. Способ по п.1, где (ί) первая иммуногенная композиция дополнительно содержит адъювант; (ίί) вторая композиция дополнительно содержит второй адъювант или (ίίί) каждая из первой композиции и второй композиции дополнительно содержит адъювант.
  4. 4. Способ по п.1 или 3, где вторая иммуногенная композиция вводится после введения первой иммуногенной композиции.
  5. 5. Способ по п.1 или 3, где вторая иммуногенная композиция вводится перед введением первой иммуногенной композиции.
  6. 6. Способ по п.1 или 3, где первая иммуногенная композиция и вторая иммуногенная композиция вводятся совместно.
  7. 7. Способ по любому из пп.1-5, где вводят по меньшей мере две дозы первой иммуногенной композиции или где вводят по меньшей мере две дозы второй иммуногенной композиции.
  8. 8. Способ по п.1 или 3, где вводят (а) две дозы; (Ь) три дозы; (с) четыре дозы или (й) пять доз первой иммуногенной композиции.
  9. 9. Способ по п.8, где (а) каждую дозу первой иммуногенной композиции вводят перед введением второй иммуногенной композиции; (Ь) по меньшей мере одну дозу первой иммуногенной композиции вводят после введения второй иммуногенной композиции; (с) по меньшей мере одну дозу иммуногенной композиции вводят одновременно с введением второй иммуногенной композиции; (й) по меньшей мере одну дозу первой иммуногенной композиции вводят до введения второй иммуногенной композиции и введение каждой из любых оставшихся доз первой иммуногенной композиции осуществляют после введения второй иммуногенной композиции или (е) каждая доза первой композиции вводится одновременно со второй композицией.
  10. 10. Способ по любому из пп.1-9, где иммунный ответ, вызванный указанным способом, включает СИ4 Т-клеточный иммунный ответ, специфичный для первого иммуногена.
  11. 11. Способ по любому из пп.1-10, где иммунный ответ, вызванный указанным способом, включает СИ8 Т-клеточный иммунный ответ, специфичный для первого иммуногена.
  12. 12. Способ по любому из пп.1-11, где вторая иммуногенная композиция дополнительно содержит второй иммуноген или его иммуногенный фрагмент и где лентивирусный вектор дополнительно включает нуклеотидную последовательность, кодирующую второй иммуноген или его иммуногенный фрагмент, где указанный способ вызывает иммунный ответ, специфичный для второго иммуногена.
  13. 13. Способ по п.12, где первый иммуноген и второй иммуноген являются одинаковыми.
  14. 14. Способ по п.12, где первый иммуноген и второй иммуноген являются различными.
  15. 15. Способ по любому из пп.12-14, где иммунный ответ, вызванный первым иммуногеном, включает СИ4 Т -клеточный ответ, специфичный для первого иммуногена.
  16. 16. Способ по любому из пп.12-15, где иммунный ответ, вызванный вторым иммуногеном, включает СИ4 Т -клеточный ответ, специфичный для второго иммуногена.
  17. 17. Способ по любому из пп.3-16, где адъюванты представляют собой нетоксичные липидные Асвязанные адъюванты.
  18. 18. Способ по п.17, где нетоксичный липидный А-связанный адъювант представляет собой гликопиранозильный липид А (СЬА).
  19. 19. Способ по п.18, где СЬА составлен в стабильной эмульсии масло-в-воде.
  20. 20. Способ по любому из пп.1-19, где первый иммуноген является (а) опухоль-специфичным антигеном или (Ь) происходит от инфекционного микроорганизма, выбранного из вируса, бактерии, грибка и паразита.
  21. 21. Способ по п.20, где первый иммуноген представляет собой опухоль-ассоциированный антиген, выбранный из антигена почечно-клеточной карциномы, антигена рака предстательной железы, антигена мезотелиомы, антигена рака поджелудочной железы, антигена меланомы, антигена рака молочной железы, антигена рака легкого и антигена рака яичника.
    - 145 027236
  22. 22. Способ по п.20, где каждый из первого иммуногена и второго иммуногена представляет собой антиген рака предстательной железы, выбранный из простатической кислой фосфатазы, простатоспецифического антигена, ΝΚΧ3.1, простатоспецифического мембранного антигена, РКАМЕ, ВАСЕ, КАСЕ, Ьаде (также известного как ΝΥ ЕЗО 1), ЗАСЕ, НАСЕ, САСЕ, Р1и-1, НАЗН-1, НАЗН-2, ΕτίρΙο. СпрЕи МАКТ-1/Ме1ап-А, др100, др75, тба-7, тирозиназы, связанного с тирозиназой белка, р53, Кае, с-Мус, АКа£, В-КаР и С-КаР, МАСЕ-А1, МАСЕ-А2, МАСЕ-А3, МАСЕ-А4, МАСЕ-А6, МАСЕ-А10, МАСЕ-А12, МАКТ-1, ВАСЕ, ПАМ-6, -10, САСЕ-1, САСЕ-2, САСЕ-3, САСЕ-4, САСЕ-5, САСЕ-6, САСЕ-7В, САСЕ-8, ЫА88-А, МАКТ-1, МС1К, Ср100, РЗМ, ТКР-1, ТКР-2, АКТ-4, САМЕЬ, СЕА, Сур-В, ЬТЕКТ, ЬТКТ, 1СЕ, МИС1, МИС2, РКАМЕ, Р15, КИ1, КИ2, ЗАКТ-1, 8АКТ-3, антигена опухоли Вильмса (№Т1), АРР, β-катенина/т, каспазы-8/т, СЕА, СИК-4/т, ЕЬР2М, СпТ-У, С250, НЗР70-2М, НЗТ-2, К1АА0205, МИМ-1, МИМ-2, МИМ-3, миозина/т, ЗАКТ-2, ТКР-2/ЮТ2, 707-АР, аннексина II, СИС27/т, ТРЕтЪсгаЫ, ВСК-АВЬ, регуляторного фактора интерферонов 4 (1КР4), ЕТУ6/АМЬ, ЬПЕК/РИТ, Рт1/КАК, опухоль-ассоциированного кальциевого сигнального трансдуктора 1 (ТАСЗТИ1), ТАСЗТИ2, рецептора эпидермального фактора роста (ЕСРК и ЕСРКуШ), рецептора фактора роста, полученного из тромбоцитов (РИСРК), рецептора сосудисто-эндотелиального фактора роста (УЕСРК), интегрин-связанной киназы (1ЬК), 8ТАТ3, ЗТАТ5, ЗТАТ6, Н1Р-1, Н1Р-2, ядерного фактора каппа В (ΝΡ-κΒ), ΝοΚίι 1-4, с-Ме1, мишеней рапамицина в клетках млекопитающих (тТОК), ΧΥΝΕ РМЗА, РК-3, МИМ2, мезотелина, почечноклеточного рака - 5Т4, ЗМ22-альфа, карбоангидраз I (СА1) и IX (СА1Х) (также известной как С250), ЗТЕАЭ, ТЕЬ/АМЫ, СИ2, протеиназы 3, ЬТЕКТ, точек перелома транслокации саркомы, ЕрЬА2, МЬIΑР, ЕрСАМ, ЕКС (ТМРК332 ЕТЗ слитый ген), КА17, РАХ3, АЬК, андрогенового рецептора, циклина В1, полисиаловой кислоты, МУС© КЬоС, СИ3, фукозил-СМ1, мезотелиана, РЗСА, вЬе, РЬАС1, СМ3, ВОШЗ, Тп, СЬоЪоН, ΝΥ-βΡ-1, КСв5, 8АКТ3, ЗТп, РАХ5, ОУ-ТЕ81, белка спермы 17, ЬСК, НМ^МАА, АКАР-4, 88X2, ХАСЕ 1, В7Н3, легумаина, ТШ2, Ра§е4, МАИ-СТ-1, РАР, МАИ-СТ-2 и Гов-связанного антигена 1.
  23. 23. Способ по п.21, где антиген рака предстательной железы представляет собой простатическую кислую фосфатазу, простатоспецифический антиген, ЫКХ3.1, или простатоспецифический мембранный антиген.
  24. 24. Способ по п.20, где первый иммуноген происходит из вируса.
  25. 25. Способ по п.24, где вирус представляет собой вирус простого герпеса-2 (Н8У-2).
  26. 26. Способ по п.25, где первый иммуноген представляет собой иЬ19-полипептид Н8У-2 или §ϋ полипептид Н8У-2.
  27. 27. Способ по любому из пп.12-19, где каждый из первого иммуногена и второго иммуногена представляет собой опухоль-ассоциированный антиген.
  28. 28. Способ по п.27, где каждый из первого иммуногена и второго иммуногена выбирается из антигена почечно-клеточной карциномы, антигена рака предстательной железы, антигена мезотелиомы, антигена рака поджелудочной железы, антигена меланомы, антигена рака молочной железы, антигена рака легкого и антигена рака яичника.
  29. 29. Способ по п.28, где каждый из первого иммуногена и второго иммуногена представляет собой антиген рака предстательной железы, выбранный из простатической кислой фосфатазы, простатоспецифического антигена, МКХ3.1, и простатоспецифического мембранного антигена.
  30. 30. Способ по любому из пп.12-19, где каждый из первого иммуногена и второго иммуногена представляет собой антиген, происходящий от инфекционного микроорганизма, выбранного из вируса, бактерии, грибка и паразита.
  31. 31. Способ по п.30, где инфекционный микроорганизм представляет собой вирус.
  32. 32. Способ по п.31, где вирус представляет собой вирус простого герпеса-2 (Н8У-2).
  33. 33. Способ по п.32, где по меньшей мере один из первого иммуногена и второго иммуногена представляет собой ИЬ19 полипептид Н8У-2 и другой из первого иммуногена и второго иммуногена представляет собой §ϋ полипептид Н8У-2.
  34. 34. Способ по п.1, где лентивирусные частицы доставляют указанную нуклеотидную последовательность к антиген-представляющей клетке.
  35. 35. Способ по п.34, где антиген-представляющая клетка представляет собой дендритную клетку, предпочтительно дендритную клетку, экспрессирующую ПС-ЗЮЫ.
  36. 36. Способ по п.1, где лентивирусная векторная частица состоит из генома лентивирусного вектора и альфа-вирусной оболочки и доставляет лентивирусную векторную частицу к дендритной клетке, экспрессирующей ИС-ЗГОК
  37. 37. Способ по п.36, где альфа-вирусная оболочка включает гликопротеин Е2 вируса Синдбис, включающий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну замену в сравнении с ЗЕС ГО Ν0: 1, где остаток 160 ЗЕЦ ГО Ν0: 1 либо отсутствует, либо представляет собой аминокислоту, отличную от глутаминовой кислоты, и где гликопротеин Е2 не слит с белком Е3 вируса Синдбис.
  38. 38. Способ по п.37, где гликопротеин Е2 связывает специфичную к дендритным клеткам молекулу
    - 146 027236 межклеточной адгезии-3, захватывающую не интегрин (ΏΟ-δΙΟΝ).
    где А1 и А2 независимо выбирают из группы, включающей водород, фосфат и фосфатные соли;
    К1, К2, К3, К4, К5 и К6 независимо выбирают из группы гидрокарбила, имеющего от 3 до 23 атомов углерода, представленных С3-С23.
  39. 40. Способ по п.39, где А1 представляет собой фосфат или фосфатную соль; А2 представляет собой водород; К1, К3, К5 и К6 представляют собой ундецил и К2 и К4 представляют собой тридецил.
  40. 41. Способ по п.40, где соединение составлено в стабильной эмульсии масло-в-воде.
  41. 42. Способ по п.39, где К1, К3, К5 и К6 представляют собой Сп-С20-алкил, а К2 и К4 представляют собой С)2-С20-гидрокарбил.
  42. 43. Способ по п.20, где первый иммуноген представляет собой МАОЕ3 или Еаде (ΝΥ ΕδΟ 1).
  43. 44. Способ по п.1, где первую иммуногенную композицию и вторую иммуногенную композицию вводят одновременно и вводят две дозы.
  44. 45. Способ индукции ΟΏ8 Т-клеточного иммунного ответа у субъекта, причем способ включает:
    (a) введение субъекту по меньшей мере одной дозы первой иммуногенной композиции, содержащей лентивирусный вектор, включающий нуклеотидную последовательность, кодирующую первый иммуноген или его иммуногенный фрагмент, где указанный лентивирусный вектор вставлен в векторную частицу, где указанная векторная частица содержит лентивирусный векторный геном и альфа-вирусную оболочку, и одновременное введение субъекту второй иммуногенной композиции, содержащей (ΐ) по меньшей мере, первый иммуноген или его иммуногенный фрагмент и (ΐΐ) агонист ТЕК4; и после этого (b) введение субъекту первой и второй иммуногенных композиций согласно (а), тем самым вызывая ΟΏ8 Т -клеточный иммунный ответ, специфичный для первого иммуногена.
EA201391496A 2011-04-08 2012-04-06 Иммуногенные композиции и способы применения таких композиций для индукции гуморального и клеточного иммунного ответа EA027236B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201161473660P 2011-04-08 2011-04-08
PCT/US2012/032550 WO2012141984A1 (en) 2011-04-08 2012-04-06 Immunogenic compositions and methods of using the compositions for inducing humoral and cellular immune responses

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201391496A1 EA201391496A1 (ru) 2014-03-31
EA027236B1 true EA027236B1 (ru) 2017-07-31

Family

ID=45952669

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201391496A EA027236B1 (ru) 2011-04-08 2012-04-06 Иммуногенные композиции и способы применения таких композиций для индукции гуморального и клеточного иммунного ответа

Country Status (14)

Country Link
US (2) US9044420B2 (ru)
EP (2) EP3632463A1 (ru)
JP (2) JP6054942B2 (ru)
CN (1) CN103596586A (ru)
AU (1) AU2012243039B2 (ru)
BR (1) BR112013025799A2 (ru)
CA (1) CA2832307A1 (ru)
EA (1) EA027236B1 (ru)
IL (1) IL228685A (ru)
MX (1) MX350795B (ru)
NZ (1) NZ616304A (ru)
SG (1) SG194083A1 (ru)
WO (1) WO2012141984A1 (ru)
ZA (1) ZA201307394B (ru)

Families Citing this family (80)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8460674B2 (en) 2009-02-07 2013-06-11 University Of Washington HSV-1 epitopes and methods for using same
EP2413950A4 (en) 2009-04-03 2013-05-01 Univ Washington ANTIGENIC HSV-2 PEPTIDE AND METHOD OF USE THEREOF
US9585920B2 (en) 2011-02-04 2017-03-07 Katherine Rose Kovarik Method and system for treating cancer cachexia
US9457077B2 (en) 2009-11-18 2016-10-04 Katherine Rose Kovarik Method and system for targeting the microbiome to promote health and treat allergic and inflammatory diseases
US11951139B2 (en) 2015-11-30 2024-04-09 Seed Health, Inc. Method and system for reducing the likelihood of osteoporosis
US11951140B2 (en) 2011-02-04 2024-04-09 Seed Health, Inc. Modulation of an individual's gut microbiome to address osteoporosis and bone disease
US11844720B2 (en) 2011-02-04 2023-12-19 Seed Health, Inc. Method and system to reduce the likelihood of dental caries and halitosis
US9730967B2 (en) 2011-02-04 2017-08-15 Katherine Rose Kovarik Method and system for treating cancer cachexia
US10314865B2 (en) 2011-02-04 2019-06-11 Katherine Rose Kovarik Method and system for treating cancer and other age-related diseases by extending the healthspan of a human
US11998479B2 (en) 2011-02-04 2024-06-04 Seed Health, Inc. Method and system for addressing adverse effects on the oral microbiome and restoring gingival health caused by sodium lauryl sulphate exposure
US10940169B2 (en) 2015-11-30 2021-03-09 Joseph E. Kovarik Method for reducing the likelihood of developing cancer in an individual human being
PL2850431T3 (pl) * 2012-05-16 2018-09-28 Immune Design Corp. Szczepionki przeciwko HSV-2
WO2014082729A1 (en) * 2012-11-28 2014-06-05 Biontech Ag Individualized vaccines for cancer
EP2964254B1 (en) * 2013-03-07 2019-09-18 University of Maryland, Baltimore Immunotherapeutic potential of modified lipooligosaccharides/lipid a
WO2014164699A1 (en) * 2013-03-11 2014-10-09 The Regents Of The University Of California Herpes virus vaccines and treatments
US9402888B2 (en) * 2013-03-14 2016-08-02 The Wistar Institute Of Anatomy And Biology Methods and compositions for treating cancer
EP2986628A4 (en) * 2013-04-15 2016-09-21 Univ Duke POLYVALENT HIV-1 IMMUNOGENIC
AU2014315275A1 (en) * 2013-09-05 2016-03-10 Immune Design Corp. Vaccine compositions for drug addiction
EP3925619A1 (en) * 2013-09-06 2021-12-22 New York University Method for inducing antitumor immunity using sindbis viral vectors and tumor associated antigens
US9149522B2 (en) 2013-09-25 2015-10-06 Sequoia Sciences, Inc. Compositions of vaccines and adjuvants and methods for the treatment of urinary tract infections
US9504743B2 (en) 2013-09-25 2016-11-29 Sequoia Sciences, Inc Compositions of vaccines and adjuvants and methods for the treatment of urinary tract infections
US20150086592A1 (en) 2013-09-25 2015-03-26 Sequoia Sciences, Inc Compositions of vaccines and adjuvants and methods for the treatment of urinary tract infections
US9149521B2 (en) 2013-09-25 2015-10-06 Sequoia Sciences, Inc. Compositions of vaccines and adjuvants and methods for the treatment of urinary tract infections
SG11201602625YA (en) * 2013-11-01 2016-05-30 Pfizer Vectors for expression of prostate-associated antigens
CA2930784C (en) 2013-11-22 2023-01-31 Cellectis Method for generating batches of allogeneic t cells with averaged potency
US11642382B2 (en) 2013-12-20 2023-05-09 Seed Health, Inc. Method for treating an individual suffering from bladder cancer
US12005085B2 (en) 2013-12-20 2024-06-11 Seed Health, Inc. Probiotic method and composition for maintaining a healthy vaginal microbiome
US11833177B2 (en) 2013-12-20 2023-12-05 Seed Health, Inc. Probiotic to enhance an individual's skin microbiome
US11998574B2 (en) 2013-12-20 2024-06-04 Seed Health, Inc. Method and system for modulating an individual's skin microbiome
US11213552B2 (en) 2015-11-30 2022-01-04 Joseph E. Kovarik Method for treating an individual suffering from a chronic infectious disease and cancer
US11529379B2 (en) 2013-12-20 2022-12-20 Seed Health, Inc. Method and system for reducing the likelihood of developing colorectal cancer in an individual human being
US11826388B2 (en) 2013-12-20 2023-11-28 Seed Health, Inc. Topical application of Lactobacillus crispatus to ameliorate barrier damage and inflammation
US11980643B2 (en) 2013-12-20 2024-05-14 Seed Health, Inc. Method and system to modify an individual's gut-brain axis to provide neurocognitive protection
US11839632B2 (en) 2013-12-20 2023-12-12 Seed Health, Inc. Topical application of CRISPR-modified bacteria to treat acne vulgaris
US11672835B2 (en) 2013-12-20 2023-06-13 Seed Health, Inc. Method for treating individuals having cancer and who are receiving cancer immunotherapy
US11969445B2 (en) 2013-12-20 2024-04-30 Seed Health, Inc. Probiotic composition and method for controlling excess weight, obesity, NAFLD and NASH
US11026982B2 (en) 2015-11-30 2021-06-08 Joseph E. Kovarik Method for reducing the likelihood of developing bladder or colorectal cancer in an individual human being
BR112016018521A2 (pt) * 2014-02-14 2017-10-17 Immune Design Corp composição, e, kit.
EP3129034A4 (en) * 2014-03-14 2017-11-22 Brian J. Czerniecki Methods for monitoring cd4+ t-helper type 1 response in cancer and immune restoration
MX2017000630A (es) 2014-07-15 2017-04-27 Immune Design Corp Regimenes de sensibilización-refuerzo con un adyuvante de agonista tlr4 y un vector lentiviral.
KR20170121301A (ko) 2015-03-18 2017-11-01 옴니사이트 변형된 알파 바이러스 표면 당 단백질 및 종양-관련 항원을 포함하는 융합 단백질 및 이의 방법
JP2018512165A (ja) * 2015-04-13 2018-05-17 アデュロ バイオテック，インコーポレイテッド 癌の治療のための免疫原性融合タンパク質
WO2016184822A1 (en) * 2015-05-15 2016-11-24 Curevac Ag Prime-boost regimens involving administration of at least one mrna construct
CN108026593A (zh) * 2015-05-18 2018-05-11 卡琳缪恩股份有限公司 区分hiv-1与慢病毒载体的方法
JP2018532386A (ja) 2015-09-09 2018-11-08 イミューン デザイン コーポレイション Ｎｙ−ｅｓｏ−１特異的ｔｃｒおよびそれらの使用方法
IL310729A (en) 2016-04-15 2024-04-01 Alpine Immune Sciences Inc Cd80 variant immunomodulatory proteins and uses thereof
IL262365B2 (en) 2016-04-15 2024-11-01 Alpine Immune Sciences Inc Immunomodulatory proteins ICOS ligand variants and uses thereof
US11834490B2 (en) 2016-07-28 2023-12-05 Alpine Immune Sciences, Inc. CD112 variant immunomodulatory proteins and uses thereof
CN110088127A (zh) 2016-07-28 2019-08-02 高山免疫科学股份有限公司 Cd155变体免疫调节蛋白及其用途
US11471488B2 (en) 2016-07-28 2022-10-18 Alpine Immune Sciences, Inc. CD155 variant immunomodulatory proteins and uses thereof
IL267643B2 (en) 2016-12-26 2023-12-01 Mogam Inst Biomedical Res Herpes zoster vaccine
WO2018148180A2 (en) 2017-02-07 2018-08-16 Immune Design Corp. Materials and methods for identifying and treating cancer patients
WO2018170256A1 (en) * 2017-03-15 2018-09-20 Modernatx, Inc. Herpes simplex virus vaccine
JP2020511144A (ja) 2017-03-16 2020-04-16 アルパイン イミューン サイエンシズ インコーポレイテッド Ｐｄ−ｌ２バリアント免疫調節タンパク質及びその使用
DK3596116T5 (da) 2017-03-16 2024-09-02 Alpine Immune Sciences Inc Variante immunmodulatoriske pd-l1-proteiner og anvendelser deraf
BR112019018747A2 (pt) 2017-03-16 2020-05-05 Alpine Immune Sciences Inc proteínas imunomoduladoras variantes de cd80 e usos das mesmas
US20200054737A1 (en) * 2017-04-26 2020-02-20 Modema TX, Inc. Herpes simplex virus vaccine
US11160860B2 (en) * 2017-04-26 2021-11-02 Merck Sharp & Dohme Corp. HSV antigenic peptides and HSV protein vaccines
BR112019025403A2 (pt) 2017-06-02 2020-08-18 Juno Therapeutics Inc artigos de fabricação e métodos para tratamento usando terapia celular adotiva
JP7311489B2 (ja) * 2017-07-28 2023-07-19 ヤンセン ファッシンズ アンド プリベンション ベーフェー 異種ｒｅｐＲＮＡ免疫化のための方法および組成物
EP3681534A1 (en) * 2017-09-13 2020-07-22 Sanofi Pasteur Human cytomegalovirus immunogenic composition
WO2019074983A1 (en) 2017-10-10 2019-04-18 Alpine Immune Sciences, Inc. CTLA-4 VARIANT IMMUNOMODULATORY PROTEINS AND USES THEREOF
SG11202003078VA (en) 2017-10-18 2020-05-28 Alpine Immune Sciences Inc Variant icos ligand immunomodulatory proteins and related compositions and methods
IL274409B2 (en) 2017-11-03 2023-11-01 Nouscom Ag Vaccine t cell enhancer
WO2019136179A1 (en) 2018-01-03 2019-07-11 Alpine Immune Sciences, Inc. Multi-domain immunomodulatory proteins and methods of use thereof
WO2019241758A1 (en) 2018-06-15 2019-12-19 Alpine Immune Sciences, Inc. Pd-1 variant immunomodulatory proteins and uses thereof
WO2020061376A2 (en) 2018-09-19 2020-03-26 Alpine Immune Sciences, Inc. Methods and uses of variant cd80 fusion proteins and related constructs
CN109369795B (zh) * 2018-11-14 2020-09-04 江南大学 一种调控巨噬细胞免疫功能活性的蛋白质及其应用
CA3120868A1 (en) 2018-11-30 2020-06-04 Alpine Immune Sciences, Inc. Cd86 variant immunomodulatory proteins and uses thereof
EP3938379A4 (en) 2019-03-15 2023-02-22 ModernaTX, Inc. Hiv rna vaccines
CN114302736A (zh) 2019-04-17 2022-04-08 高山免疫科学股份有限公司 变体icos配体(icosl)融合蛋白的方法和用途
IL297980A (en) 2020-05-08 2023-01-01 Alpine Immune Sciences Inc Immunomodulatory proteins that inhibit april and baff and methods of using them
US20230203122A1 (en) * 2020-05-14 2023-06-29 Nutcracker Therapeutics, Inc. Polynucleotides comprising an antigenic payload
CA3208643A1 (en) 2021-01-18 2022-07-21 Conserv Bioscience Limited Coronavirus immunogenic compositions, methods and uses thereof
US20240139341A1 (en) * 2021-03-08 2024-05-02 The Regents Of The University Of California LENTIVIRUS PROTECTION VIA Fc OVEREXPRESSION
PE20240641A1 (es) 2021-05-07 2024-04-04 Alpine Immune Sciences Inc Metodos de dosificacion y tratamiento con una proteina inmunomoduladora de fusion taci-fc
CN113648294B (zh) * 2021-08-26 2024-01-23 山东领海生物科技有限公司 β-双磺酰亚胺取代酮类化合物在治疗癌症中的应用
WO2023172883A1 (en) 2022-03-07 2023-09-14 Alpine Immune Sciences, Inc. Immunomodulatory proteins of variant cd80 polypeptides, cell therapies thereof and related methods and uses
WO2024077018A2 (en) 2022-10-04 2024-04-11 Alpine Immune Sciences, Inc. Methods and uses of taci-fc fusion immunomodulatory protein
WO2024105245A1 (en) * 2022-11-18 2024-05-23 Ceva Sante Animale Recombinant marek's disease virus and uses thereof

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006040334A1 (en) * 2004-10-14 2006-04-20 Crucell Holland B.V. Malaria prime/boost vaccines
WO2009071613A2 (en) * 2007-12-06 2009-06-11 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Vaccine
EP2272859A2 (en) * 1998-08-07 2011-01-12 University of Washington Immunological herpes simplex virus antigens and methods for use thereof

Family Cites Families (283)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3238190A (en) 1963-10-23 1966-03-01 Madaus & Co K G Fa Dr Aescin recovery
US3598122A (en) 1969-04-01 1971-08-10 Alza Corp Bandage for administering drugs
US3598123A (en) 1969-04-01 1971-08-10 Alza Corp Bandage for administering drugs
US4029762A (en) 1971-11-17 1977-06-14 Max-Planck-Gesellschaft Zur Forderung Der Wissenschaften E.V. Lipid A-preparation
US4286592A (en) 1980-02-04 1981-09-01 Alza Corporation Therapeutic system for administering drugs to the skin
US4314557A (en) 1980-05-19 1982-02-09 Alza Corporation Dissolution controlled active agent dispenser
US4486530A (en) 1980-08-04 1984-12-04 Hybritech Incorporated Immunometric assays using monoclonal antibodies
US4376110A (en) 1980-08-04 1983-03-08 Hybritech, Incorporated Immunometric assays using monoclonal antibodies
US4420558A (en) 1981-02-12 1983-12-13 Janssen Pharmaceutica N.V. Bright field light microscopic method of enumerating and characterizing subtypes of white blood cells and their precursors
US4379454A (en) 1981-02-17 1983-04-12 Alza Corporation Dosage for coadministering drug and percutaneous absorption enhancer
US4411993A (en) 1981-04-29 1983-10-25 Steven Gillis Hybridoma antibody which inhibits interleukin 2 activity
US4769330A (en) 1981-12-24 1988-09-06 Health Research, Incorporated Modified vaccinia virus and methods for making and using the same
US4420461A (en) 1982-05-26 1983-12-13 Ortho Diagnostic Systems Inc. Agglutination-inhibition test kit for detecting immune complexes
US7045313B1 (en) 1982-11-30 2006-05-16 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Recombinant vaccinia virus containing a chimeric gene having foreign DNA flanked by vaccinia regulatory DNA
US4543439A (en) 1982-12-13 1985-09-24 Massachusetts Institute Of Technology Production and use of monoclonal antibodies to phosphotyrosine-containing proteins
US4987237A (en) 1983-08-26 1991-01-22 Ribi Immunochem Research, Inc. Derivatives of monophosphoryl lipid A
US4743540A (en) 1983-09-27 1988-05-10 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Method for diagnosis of subclassifications of common varied immunodeficiency disease group
US5147785A (en) 1983-11-01 1992-09-15 Amtl Corporation Method and apparatus for measuring the degree of reaction between a foreign entity and white blood cells
US4614722A (en) 1983-11-01 1986-09-30 Pasula Mark J Method and apparatus for measuring the degree of reaction between antigens and leukocyte cellular antibodies
US4595654A (en) 1983-11-07 1986-06-17 Immunomedics Inc. Method for detecting immune complexes in serum
US4855238A (en) 1983-12-16 1989-08-08 Genentech, Inc. Recombinant gamma interferons having enhanced stability and methods therefor
US4703004A (en) 1984-01-24 1987-10-27 Immunex Corporation Synthesis of protein with an identification peptide
US4952496A (en) 1984-03-30 1990-08-28 Associated Universities, Inc. Cloning and expression of the gene for bacteriophage T7 RNA polymerase
US4629722A (en) 1984-07-12 1986-12-16 Ribi Immunochem Research, Inc. Method of inhibiting the onset of acute radiation syndrome
US4844894A (en) 1984-07-12 1989-07-04 Ribi Immunochem Research Inc. Method of inhibiting the onset of septicemia and endotoxemia
US5612041A (en) 1984-07-17 1997-03-18 Chiron Corporation Recombinant herpes simplex gD vaccine
US4568343A (en) 1984-10-09 1986-02-04 Alza Corporation Skin permeation enhancer compositions
US4902614A (en) 1984-12-03 1990-02-20 Teijin Limited Monoclonal antibody to human protein C
US4569794A (en) 1984-12-05 1986-02-11 Eli Lilly And Company Process for purifying proteins and compounds useful in such process
US4659659A (en) 1985-01-22 1987-04-21 Monsanto Company Diagnostic method for diseases having an arthritic component
US5168062A (en) 1985-01-30 1992-12-01 University Of Iowa Research Foundation Transfer vectors and microorganisms containing human cytomegalovirus immediate-early promoter-regulatory DNA sequence
GB8508845D0 (en) 1985-04-04 1985-05-09 Hoffmann La Roche Vaccinia dna
FI861417A0 (fi) 1985-04-15 1986-04-01 Endotronics Inc Hepatitis b ytantigen framstaelld med rekombinant-dna-teknik, vaccin, diagnostiskt medel och cellinjer samt foerfaranden foer framstaellning daerav.
US4746742A (en) 1985-11-28 1988-05-24 Toho Yakuhin Kogyo Kabushiki Kaisha Analogs of nonreducing monosaccharide moiety of lipid A
US5310651A (en) 1986-01-22 1994-05-10 Institut Pasteur DNA probes of human immunodeficiency virus type 2 (HIV-2), and methods employing these probes for dectecting the presence of HIV-2
US6514691B1 (en) 1986-01-22 2003-02-04 Institut Pasteur Peptides of human immunodeficiency virus type 2 (HIV-2), antibodies against peptides of HIV-2, and methods and kits for detecting HIV-2
US6544728B1 (en) 1986-01-22 2003-04-08 Institut Pasteur Methods and kits for diagnosing human immunodeficiency virus type 2 (HIV-2), proteins of HIV-2, and vaccinating agents for HIV-2
US6054565A (en) 1986-03-03 2000-04-25 Institut Pasteur Nucleic Acids of HIV-2, Diagnostic Test Kit and Method using Nucleic Acid Probes of HIV-2
US5169763A (en) 1986-04-08 1992-12-08 Transgene S.A., Institut Pasteur Viral vector coding glycoprotein of HIV-1
US4877611A (en) 1986-04-15 1989-10-31 Ribi Immunochem Research Inc. Vaccine containing tumor antigens and adjuvants
US5352449A (en) 1986-05-30 1994-10-04 Cambridge Biotech Corporation Vaccine comprising recombinant feline leukemia antigen and saponin adjuvant
US4767402A (en) 1986-07-08 1988-08-30 Massachusetts Institute Of Technology Ultrasound enhancement of transdermal drug delivery
US4948587A (en) 1986-07-08 1990-08-14 Massachusetts Institute Of Technology Ultrasound enhancement of transbuccal drug delivery
US5075109A (en) 1986-10-24 1991-12-24 Southern Research Institute Method of potentiating an immune response
US5011912A (en) 1986-12-19 1991-04-30 Immunex Corporation Hybridoma and monoclonal antibody for use in an immunoaffinity purification system
FR2672290B1 (fr) 1991-02-05 1995-04-21 Pasteur Institut Sequences peptidiques specifiques des stades hepatiques de p. falciparum porteuses d'epitopes capables de stimuler les lymphocytes t.
US5565209A (en) 1987-03-17 1996-10-15 Akzo Nobel N.V. Adjuvant mixture
US5057540A (en) 1987-05-29 1991-10-15 Cambridge Biotech Corporation Saponin adjuvant
CA1331443C (en) 1987-05-29 1994-08-16 Charlotte A. Kensil Saponin adjuvant
EP1088830A3 (en) 1987-06-22 2004-04-07 Medeva Holdings B.V. Hepatitis b surface antigen particles
US4780212A (en) 1987-07-31 1988-10-25 Massachusetts Institute Of Technology Ultrasound enchancement of membrane permeability
US4897268A (en) 1987-08-03 1990-01-30 Southern Research Institute Drug delivery system and method of making the same
US5443964A (en) 1987-08-10 1995-08-22 Duke University Poxvirus insertion/expression vector
WO1989001973A2 (en) 1987-09-02 1989-03-09 Applied Biotechnology, Inc. Recombinant pox virus for immunization against tumor-associated antigens
US4937190A (en) 1987-10-15 1990-06-26 Wisconsin Alumni Research Foundation Translation enhancer
EP0324455A3 (en) 1988-01-15 1991-03-27 Hans O. Ribi Novel polymeric immunological adjuvants
GB2232892B (en) 1988-02-23 1991-07-24 John Mark Tucker Occlusive body for administering a physiologically active substance
ES2060765T3 (es) 1988-05-17 1994-12-01 Lubrizol Genetics Inc Sistema promotor de ubiquitina en plantas.
US5278302A (en) 1988-05-26 1994-01-11 University Patents, Inc. Polynucleotide phosphorodithioates
US4912094B1 (en) 1988-06-29 1994-02-15 Ribi Immunochem Research Inc. Modified lipopolysaccharides and process of preparation
GB8819209D0 (en) 1988-08-12 1988-09-14 Research Corp Ltd Polypeptide & dna encoding same
US5231168A (en) 1988-09-16 1993-07-27 Statens Seruminstitut Malaria antigen
US4999403A (en) 1988-10-28 1991-03-12 Exxon Chemical Patents Inc. Graft polymers of functionalized ethylene-alpha-olefin copolymer with polypropylene, methods of preparation, and use in polypropylene compositions
EP0449856B1 (en) 1988-12-16 2001-09-12 De Staat Der Nederlanden Vertegenwoordigd Door De Minister Van Welzijn, Volksgezondheid En Cultuur Pneumolysin mutants and pneumococcal vaccines made therefrom
EP0832980B1 (en) 1989-01-23 2002-06-19 Chiron Corporation Recombinant therapies for infection and hyperproliferative disorders
DE69015222T2 (de) 1989-02-04 1995-05-04 Akzo Nv Tocole als Impfstoffadjuvans.
CA2017507C (en) 1989-05-25 1996-11-12 Gary Van Nest Adjuvant formulation comprising a submicron oil droplet emulsion
FR2649012B1 (fr) 1989-07-03 1991-10-25 Seppic Sa Emulsions multiphasiques injectables
FR2649013B1 (fr) 1989-07-03 1991-10-25 Seppic Sa Vaccins et vecteurs de principes actifs fluides contenant une huile metabolisable
EP0414374B1 (en) 1989-07-25 1997-10-08 Smithkline Biologicals S.A. Novel antigens and methods for their preparation
EP1001032A3 (en) 1989-08-18 2005-02-23 Chiron Corporation Recombinant retroviruses delivering vector constructs to target cells
US4981684A (en) 1989-10-24 1991-01-01 Coopers Animal Health Limited Formation of adjuvant complexes
US6120769A (en) 1989-11-03 2000-09-19 Immulogic Pharmaceutical Corporation Human T cell reactive feline protein (TRFP) isolated from house dust and uses therefor
US5298396A (en) 1989-11-15 1994-03-29 National Jewish Center For Immunology And Respiratory Medicine Method for identifying T cells disease involved in autoimmune disease
US5256643A (en) 1990-05-29 1993-10-26 The Government Of The United States Human cripto protein
US5124141A (en) 1990-06-14 1992-06-23 Flow Incorporated Method for diagnosing malaria
US5162990A (en) 1990-06-15 1992-11-10 The United States Of America As Represented By The United States Navy System and method for quantifying macrophage phagocytosis by computer image analysis
EP0468520A3 (en) 1990-07-27 1992-07-01 Mitsui Toatsu Chemicals, Inc. Immunostimulatory remedies containing palindromic dna sequences
US6410010B1 (en) 1992-10-13 2002-06-25 Board Of Regents, The University Of Texas System Recombinant P53 adenovirus compositions
US6277969B1 (en) 1991-03-18 2001-08-21 New York University Anti-TNF antibodies and peptides of human tumor necrosis factor
GB9105992D0 (en) 1991-03-21 1991-05-08 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
AU674492B2 (en) 1991-05-06 1997-01-02 United States of America, as represented by the Department of Health and Human Services, The Recombinant virus expressing carcinoembryonic antigen and methods of use thereof
ES2194839T3 (es) 1991-07-19 2003-12-01 Univ Queensland Vacuna de papilomavirus.
US5464387A (en) 1991-07-24 1995-11-07 Alza Corporation Transdermal delivery device
KR100198868B1 (ko) 1991-07-25 1999-06-15 케네쓰 제이. 울코트 세포독성 t 림프구 반응을 유도하는 조성물
US6197311B1 (en) 1991-07-25 2001-03-06 Idec Pharmaceuticals Corporation Induction of cytotoxic T-lymphocyte responses
AU660325B2 (en) 1991-10-11 1995-06-22 Eisai Co. Ltd. Anti-endotoxin compounds and related molecules and methods
US5530113A (en) 1991-10-11 1996-06-25 Eisai Co., Ltd. Anti-endotoxin compounds
SG48390A1 (en) 1991-11-16 1998-04-17 Smithkline Beecham Biolog Hybrid protein between cs from plasmodium and hbs ag
US6057427A (en) 1991-11-20 2000-05-02 Trustees Of Dartmouth College Antibody to cytokine response gene 2(CR2) polypeptide
ZA929870B (en) 1991-12-23 1993-08-18 Duphar Int Res Adjuvants
US5286718A (en) 1991-12-31 1994-02-15 Ribi Immunochem Research, Inc. Method and composition for ameliorating tissue damage due to ischemia and reperfusion
JPH05328975A (ja) 1992-06-02 1993-12-14 Takara Shuzo Co Ltd Ｅ１ａ−ｆ遺伝子
EP0650370A4 (en) 1992-06-08 1995-11-22 Univ California METHODS AND COMPOSITIONS TARGETED ON SPECIFIC TISSUES.
JPH09507741A (ja) 1992-06-10 1997-08-12 アメリカ合衆国 ヒト血清による不活性化に耐性のあるベクター粒子
PL170980B1 (pl) 1992-06-25 1997-02-28 Smithkline Beecham Biolog Szczepionka PL PL PL PL PL PL PL
EP0647140B1 (en) 1992-06-25 2007-12-12 Georgetown University Papillomavirus vaccines
US5273965A (en) 1992-07-02 1993-12-28 Cambridge Biotech Corporation Methods for enhancing drug delivery with modified saponins
TNSN93075A1 (fr) 1992-07-08 1994-03-17 Schering Corp Utilisation de gm-csf comme adjuvant pour vaccin
WO1994002595A1 (en) 1992-07-17 1994-02-03 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Method and reagent for treatment of animal diseases
US5786148A (en) 1996-11-05 1998-07-28 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Polynucleotides encoding a novel prostate-specific kallikrein
GB2269175A (en) 1992-07-31 1994-02-02 Imperial College Retroviral vectors
US5437951A (en) 1992-09-03 1995-08-01 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Self-assembling recombinant papillomavirus capsid proteins
US5411865A (en) 1993-01-15 1995-05-02 Iasys Corporation Method of detecting anti-leishmania parasite antibodies
DE05075369T1 (de) 1993-03-09 2006-11-16 The University Of Rochester Herstellung von menschlichem Papilloma-Virus-Capsid-Protein und virusähnlichen Teilchen
DK0812593T4 (da) 1993-03-23 2008-05-13 Smithkline Beecham Biolog Vaccinepræparater indeholdende 3-O-deacyleret monophosphoryllipid-A
US5532133A (en) 1993-06-02 1996-07-02 New York University Plasmodium vivax blood stage antigens, PvESP-1, antibodies, and diagnostic assays
US6106824A (en) 1993-08-13 2000-08-22 The Rockefeller University Expression of growth associated protein B-50/GAP-43 in vitro and in vivo
US5961970A (en) 1993-10-29 1999-10-05 Pharmos Corporation Submicron emulsions as vaccine adjuvants
EP0887866B1 (en) 1993-11-02 2004-04-07 Matsushita Electric Industrial Co., Ltd Semiconductor device comprising an aggregate of semiconductor micro-needles
US5458140A (en) 1993-11-15 1995-10-17 Non-Invasive Monitoring Company (Nimco) Enhancement of transdermal monitoring applications with ultrasound and chemical enhancers
US5885211A (en) 1993-11-15 1999-03-23 Spectrix, Inc. Microporation of human skin for monitoring the concentration of an analyte
US5814599A (en) 1995-08-04 1998-09-29 Massachusetts Insitiute Of Technology Transdermal delivery of encapsulated drugs
CZ290331B6 (cs) 1993-11-17 2002-07-17 Laboratoires Om S. A. Glukosaminové disacharidy, způsob jejich přípravy a farmaceutický prostředek
US5693531A (en) 1993-11-24 1997-12-02 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Vector systems for the generation of adeno-associated virus particles
DE9319879U1 (de) 1993-12-23 1994-03-17 Ems-Inventa AG, Zürich Sequentiell Coextrudierte Kühlflüssigkeitsleitung
GB9326253D0 (en) 1993-12-23 1994-02-23 Smithkline Beecham Biolog Vaccines
US5688506A (en) 1994-01-27 1997-11-18 Aphton Corp. Immunogens against gonadotropin releasing hormone
US5457041A (en) 1994-03-25 1995-10-10 Science Applications International Corporation Needle array and method of introducing biological substances into living cells using the needle array
WO1995026204A1 (en) 1994-03-25 1995-10-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Immune stimulation by phosphorothioate oligonucleotide analogs
US6447796B1 (en) 1994-05-16 2002-09-10 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army Sustained release hydrophobic bioactive PLGA microspheres
US5591139A (en) 1994-06-06 1997-01-07 The Regents Of The University Of California IC-processed microneedles
US6207646B1 (en) 1994-07-15 2001-03-27 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules
EP1167378B1 (en) 1994-07-15 2011-05-11 University of Iowa Research Foundation Immunomodulatory oligonucleotides
US7037712B2 (en) 1994-07-26 2006-05-02 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation DNA encoding ovine adenovirus (OAV287) and its use as a viral vector
GB9415319D0 (en) 1994-07-29 1994-09-21 Medical Res Council HSV viral vector
SE9403137D0 (sv) 1994-09-20 1994-09-20 Perstorp Ab Derivatives of carbohydrates and compositions containing them
JP4418965B2 (ja) 1994-09-23 2010-02-24 タップイミューン・インコーポレイテッド 内在性ペプチドを有するｍｈｃクラスｉ分子の発現を増強する方法
DE69519521T2 (de) 1994-10-03 2001-06-28 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary National Institute Of Health Zusammensetzung enthaltend ein antigen exprimierendes rekombinantes virus und ein immunstimulierendes molekül exprimierendes rekombinantes virus
WO1996011272A2 (de) 1994-10-07 1996-04-18 Medigene Gesellschaft Für Molekularbiologische Diagnostik, Theraphie Und Technologie Mbh Papillomavirusähnliche partikel, fusionsproteine sowie verfahren zu deren herstellung
AUPM873294A0 (en) 1994-10-12 1994-11-03 Csl Limited Saponin preparations and use thereof in iscoms
FR2727689A1 (fr) 1994-12-01 1996-06-07 Transgene Sa Nouveau procede de preparation d'un vecteur viral
US6096542A (en) 1995-02-08 2000-08-01 Takara Shuzo Co., Ltd. Cancer control
EP0812358A1 (en) 1995-02-24 1997-12-17 Cantab Pharmaceuticals Research Limited Polypeptides useful as immunotherapeutic agents and methods of polypeptide preparation
US5912166A (en) 1995-04-21 1999-06-15 Corixa Corporation Compounds and methods for diagnosis of leishmaniasis
US6846489B1 (en) 1995-04-25 2005-01-25 Smithkline Beecham Biologicals S.A. Vaccines containing a saponin and a sterol
UA56132C2 (ru) 1995-04-25 2003-05-15 Смітклайн Бічем Байолоджікалс С.А. Композиция вакцины (варианты), способ стабилизации qs21 по отношению к гидролизу (варианты), способ приготовления вакцины
US5718904A (en) 1995-06-02 1998-02-17 American Home Products Corporation Adjuvants for viral vaccines
US5843464A (en) 1995-06-02 1998-12-01 The Ohio State University Synthetic chimeric fimbrin peptides
US5993800A (en) 1995-06-05 1999-11-30 Bristol-Myers Squibb Company Methods for prolonging the expression of a heterologous gene of interest using soluble CTLA4 molecules and an antiCD40 ligand
US6417172B1 (en) 1995-06-05 2002-07-09 Eisai Co., Ltd. Prevention and treatment of pulmonary bacterial infection or symptomatic pulmonary exposure to endotoxin by inhalation of antiendotoxin drugs
US5981215A (en) 1995-06-06 1999-11-09 Human Genome Sciences, Inc. Human criptin growth factor
US6309847B1 (en) 1995-07-05 2001-10-30 Yeda Research And Development Co. Ltd. Method for detecting or monitoring the effectiveness of treatment of T cell mediated diseases
US6458366B1 (en) 1995-09-01 2002-10-01 Corixa Corporation Compounds and methods for diagnosis of tuberculosis
WO1997011708A1 (en) 1995-09-29 1997-04-03 Eisai Research Institute Method for treating alcoholic liver disease
US5666153A (en) 1995-10-03 1997-09-09 Virtual Shopping, Inc. Retractable teleconferencing apparatus
US5618275A (en) 1995-10-27 1997-04-08 Sonex International Corporation Ultrasonic method and apparatus for cosmetic and dermatological applications
US5846758A (en) 1995-11-30 1998-12-08 His Excellency Ghassan I. Shaker Method for diagnosing autoimmune diseases
US5843462A (en) 1995-11-30 1998-12-01 Regents Of The University Of Minnesota Diphtheria toxin epitopes
SE9600648D0 (sv) 1996-02-21 1996-02-21 Bror Morein Receptorbimdande enhet
US5656016A (en) 1996-03-18 1997-08-12 Abbott Laboratories Sonophoretic drug delivery system
DE69733651T2 (de) 1996-07-03 2006-05-18 Eisai Co., Ltd. Lipid a-analoge enthaltende injektionen und verfahren zu deren herstellung
EP0942972B1 (en) 1996-09-06 2002-12-04 The Regents Of The University Of California E25a PROTEIN, METHODS FOR PRODUCTION AND USE THEREOF
US5955306A (en) 1996-09-17 1999-09-21 Millenium Pharmaceuticals, Inc. Genes encoding proteins that interact with the tub protein
JP4111403B2 (ja) 1996-10-11 2008-07-02 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティー オブ カリフォルニア 免疫刺激ポリヌクレオチド／免疫調節分子複合体
US6797276B1 (en) 1996-11-14 2004-09-28 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army Use of penetration enhancers and barrier disruption agents to enhance the transcutaneous immune response
US7033598B2 (en) 1996-11-19 2006-04-25 Intrabrain International N.V. Methods and apparatus for enhanced and controlled delivery of a biologically active agent into the central nervous system of a mammal
DE19654221B4 (de) 1996-12-23 2005-11-24 Telefonaktiebolaget Lm Ericsson (Publ) Leitungsanschlußschaltkreis
US5840871A (en) 1997-01-29 1998-11-24 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Prostate-associated kallikrein
WO1998032869A1 (en) 1997-01-29 1998-07-30 Neurosearch A/S Expression vectors and methods for in vivo expression of therapeutic polypeptides
US6977073B1 (en) 1997-02-07 2005-12-20 Cem Cezayirli Method for stimulating an immune response
CA2281954A1 (en) 1997-02-25 1998-08-27 Corixa Corporation Compounds for immunodiagnosis of prostate cancer and methods for their use
US6541212B2 (en) 1997-03-10 2003-04-01 The Regents Of The University Of California Methods for detecting prostate stem cell antigen protein
CN1326564C (zh) 1997-04-01 2007-07-18 科里克萨有限公司 单磷酰基脂质a的水性免疫佐剂组合物
US6491919B2 (en) 1997-04-01 2002-12-10 Corixa Corporation Aqueous immunologic adjuvant compostions of monophosphoryl lipid A
US7037510B2 (en) 1997-04-18 2006-05-02 Statens Serum Institut Hybrids of M. tuberculosis antigens
US6555653B2 (en) 1997-05-20 2003-04-29 Corixa Corporation Compounds for diagnosis of tuberculosis and methods for their use
GB9711957D0 (en) * 1997-06-09 1997-08-06 Isis Innovation Methods and reagents for vaccination
GB9711990D0 (en) 1997-06-11 1997-08-06 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
US6358508B1 (en) 1997-06-11 2002-03-19 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies to human tumor necrosis factor receptor TR9
JP2001510031A (ja) 1997-07-21 2001-07-31 ノース・アメリカン・ヴァクシン・インコーポレーテッド ワクチンとしての修飾された免疫原ニューモリシン組成物
US6395713B1 (en) 1997-07-23 2002-05-28 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Compositions for the delivery of negatively charged molecules
GB9717953D0 (en) 1997-08-22 1997-10-29 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
AU1145699A (en) 1997-09-05 1999-03-22 Smithkline Beecham Biologicals (Sa) Oil in water emulsions containing saponins
GB9718901D0 (en) 1997-09-05 1997-11-12 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
US6749856B1 (en) 1997-09-11 2004-06-15 The United States Of America, As Represented By The Department Of Health And Human Services Mucosal cytotoxic T lymphocyte responses
US6368604B1 (en) 1997-09-26 2002-04-09 University Of Maryland Biotechnology Institute Non-pyrogenic derivatives of lipid A
US7459524B1 (en) 1997-10-02 2008-12-02 Emergent Product Development Gaithersburg Inc. Chlamydia protein, sequence and uses thereof
KR100735651B1 (ko) 1997-11-28 2007-07-06 세로노 제네틱스 인스티튜트 에스.에이. 클라미디아 트라코마티스 게놈 서열과 폴리펩티드, 이의단편 및 이의 용도, 특히, 감염의 진단, 예방 및 치료 용도
WO1999034831A1 (en) 1998-01-05 1999-07-15 University Of Washington Enhanced transport using membrane disruptive agents
US7012134B2 (en) 1998-01-26 2006-03-14 Human Genome Sciences, Inc. Dendritic enriched secreted lymphocyte activation molecule
DE19803453A1 (de) 1998-01-30 1999-08-12 Boehringer Ingelheim Int Vakzine
SI1584685T1 (sl) 1998-02-05 2011-07-29 Glaxosmithkline Biolog Sa S tumorjem povezani antigenski derivati iz MAGE druĹľine, uporabljeni za pripravo fuzijskih proteinov s T-pomoĹľnimi epitopi in sestavki za vakcinacijo
DE69919984T2 (de) 1998-02-12 2005-11-17 Wyeth Holdings Corp. Interleukin-12 und herpes simplex virusantigen enthaltende impfstoffe
US6596501B2 (en) 1998-02-23 2003-07-22 Fred Hutchinson Cancer Research Center Method of diagnosing autoimmune disease
FR2775601B1 (fr) 1998-03-03 2001-09-21 Merial Sas Vaccins vivants recombines et adjuves
PL343429A1 (en) 1998-03-09 2001-08-13 Smithkline Beecham Biolog Combined vaccine compositions
WO1999051748A2 (en) 1998-04-07 1999-10-14 Corixa Corporation Fusion proteins of mycobacterium tuberculosis antigens and their uses
GB2336310B (en) 1998-04-14 2003-09-10 Stowic Resources Ltd Method of manufacturing transdermal patches
WO1999053061A2 (en) 1998-04-15 1999-10-21 Ludwig Institute For Cancer Research Tumor associated nucleic acids and uses therefor
US6680175B2 (en) 1998-05-05 2004-01-20 Adherex Technologies, Inc. Methods for diagnosing and evaluating cancer
DE69937343T2 (de) 1998-05-07 2008-07-24 Corixa Corp., Seattle Adjuvanszusammensetzung und methoden zu deren verwendung
GB2337755B (en) 1998-05-29 2003-10-29 Secr Defence Virus vaccine
US6322532B1 (en) 1998-06-24 2001-11-27 3M Innovative Properties Company Sonophoresis method and apparatus
EP1097208A2 (en) 1998-07-14 2001-05-09 Corixa Corporation Compositions and methods for therapy and diagnosis of prostate cancer
JP3943334B2 (ja) 1998-09-01 2007-07-11 エーザイ・アール・アンド・ディー・マネジメント株式会社 リピッドａ類縁体含有注射剤の評価方法
US6692752B1 (en) 1999-09-08 2004-02-17 Smithkline Beecham Biologicals S.A. Methods of treating human females susceptible to HSV infection
US6375944B1 (en) 1998-09-25 2002-04-23 The Wistar Institute Of Anatomy And Biology Methods and compositions for enhancing the immunostimulatory effect of interleukin-12
AU5980899A (en) 1998-09-25 2000-04-17 Smithkline Beecham Biologicals (Sa) Novel compounds
US7001770B1 (en) 1998-10-15 2006-02-21 Canji, Inc. Calpain inhibitors and their applications
KR100629028B1 (ko) 1998-10-16 2006-09-26 글락소스미스클라인 바이오로지칼즈 에스.에이. 애쥬번트 시스템 및 백신
US6261573B1 (en) 1998-10-30 2001-07-17 Avant Immunotherapeutics, Inc. Immunoadjuvants
US6734172B2 (en) 1998-11-18 2004-05-11 Pacific Northwest Research Institute Surface receptor antigen vaccines
US6512102B1 (en) 1998-12-31 2003-01-28 Chiron Corporation Compositions and methods of diagnosis and treatment using casein kinase I
WO2000042994A2 (en) 1999-01-21 2000-07-27 North Shore-Long Island Jewish Research Institute Inhibition of bacterial dissemination
AU769539B2 (en) 1999-01-29 2004-01-29 Zoetis Services Llc Adjuvants for use in vaccines
US20030170249A1 (en) 1999-02-19 2003-09-11 Hakomori Sen-Itiroh Vaccines directed to cancer-associated carbohydrate antigens
US6770445B1 (en) 1999-02-26 2004-08-03 Pacific Northwest Research Institute Methods and compositions for diagnosing carcinomas
DE60040274D1 (de) 1999-03-10 2008-10-30 Phogen Ltd Verabreichung von nukleinsäuren und proteinen an zellen
US6599710B1 (en) 1999-03-10 2003-07-29 The General Hospital Corporation Treatment of autoimmune disease
GB9906177D0 (en) 1999-03-17 1999-05-12 Oxford Biomedica Ltd Anti-viral vectors
US6919210B1 (en) 1999-04-07 2005-07-19 Hiroshi Okamoto Method for identifying autoimmune disease, method for detecting anti-Reg protein autoantibody and diagnostics for autoimmune disease
DK1187629T3 (da) 1999-04-19 2005-01-17 Glaxosmithkline Biolog Sa Adjuvanssammensætning omfattende saponin og et immunostimulerende oligonucleotid
US6685699B1 (en) 1999-06-09 2004-02-03 Spectrx, Inc. Self-removing energy absorbing structure for thermal tissue ablation
DK1204739T3 (da) 1999-08-09 2008-10-20 Targeted Genetics Corp Forögelse af ekspression af en enkeltstrenget, heterolog nukleotidsekvens fra rekombinante, virale vektorer ved en sådan udformning af sekvensen at den danner intrastrengbasepar
AU6884200A (en) 1999-08-26 2001-03-19 Biovitrum Ab Novel response element
GB9921146D0 (en) 1999-09-07 1999-11-10 Smithkline Beecham Biolog Novel composition
US7084256B2 (en) 1999-09-24 2006-08-01 Large Scale Biology Corporation Self antigen vaccines for treating B cell lymphomas and other cancers
AU1013701A (en) 1999-10-22 2001-05-08 Aventis Pasteur Limited Modified gp100 and uses thereof
JP4162813B2 (ja) 1999-10-28 2008-10-08 久光製薬株式会社 イオントフォレーシス装置
US6218186B1 (en) 1999-11-12 2001-04-17 Trustees Of The University Of Pennsylvania HIV-MSCV hybrid viral vector for gene transfer
AU780577B2 (en) 1999-11-15 2005-04-07 Oncothyreon Inc. Synthetic Lipid-A analogs and uses thereof
US20020064801A1 (en) 1999-12-01 2002-05-30 Ryan Jeffrey R. Novel and practical serological assay for the clinical diagnosis of leishmaniasis
US6974588B1 (en) 1999-12-07 2005-12-13 Elan Pharma International Limited Transdermal patch for delivering volatile liquid drugs
US6587792B1 (en) 2000-01-11 2003-07-01 Richard A. Thomas Nuclear packing efficiency
GB0000891D0 (en) 2000-01-14 2000-03-08 Allergy Therapeutics Ltd Formulation
WO2001055362A2 (en) 2000-01-31 2001-08-02 The Governement Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Departement Of Health & Human Services, The National Institutes Of Health Hybrid adeno-retroviral vector for the transfection of cells
EP1122542A1 (en) 2000-02-01 2001-08-08 Anda Biologicals S.A. Method for the rapid detection of whole microorganisms on retaining membranes by use of chaotropic agents
AU2001241738A1 (en) 2000-02-25 2001-09-03 Corixa Corporation Compounds and methods for diagnosis and immunotherapy of tuberculosis
US6875610B2 (en) 2000-05-31 2005-04-05 Human Gene Therapy Research Institute Methods and compositions for efficient gene transfer using transcomplementary vectors
DE10041515A1 (de) 2000-08-24 2002-03-14 Gerold Schuler Verfahren zur Herstellung gebrauchsfertiger, Antigen-beladener oder -unbeladener, kryokonservierter reifer dendritischer Zellen
US6969704B1 (en) 2000-08-25 2005-11-29 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Methods for suppressing early growth response—1protein (Egr-1) to reduce vascular injury in a subject
US7060802B1 (en) 2000-09-18 2006-06-13 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Tumor-associated marker
EP1341546B1 (en) 2000-10-06 2011-09-21 The Symbio Herborn Group GmbH u.Co Kyberdrug as autovaccines with immune-regulating effects
ES2295229T3 (es) 2000-10-18 2008-04-16 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Vacunas contra canceres.
US20020130430A1 (en) 2000-12-29 2002-09-19 Castor Trevor Percival Methods for making polymer microspheres/nanospheres and encapsulating therapeutic proteins and other products
US6855322B2 (en) 2001-01-26 2005-02-15 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army Isolation and purification of P. falciparum merozoite protein-142 vaccine
US6893820B1 (en) 2001-01-31 2005-05-17 The Ohio State University Research Foundation Detection of methylated CpG rich sequences diagnostic for malignant cells
EP1423405A4 (en) 2001-03-26 2005-01-05 Us Army PROTEIN AMA-1 FROM PLASMODIUM FALCIPARUM AND USES THEREOF
US7029685B2 (en) 2001-03-26 2006-04-18 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army Plasmodium falciparum AMA-1 protein and uses thereof
US6933123B2 (en) 2001-04-05 2005-08-23 Yao Xiong Hu Peptides from the E2, E6, and E7 proteins of human papilloma viruses 16 and 18 for detecting and/or diagnosing cervical and other human papillomavirus associated cancers
US20030077829A1 (en) 2001-04-30 2003-04-24 Protiva Biotherapeutics Inc.. Lipid-based formulations
US6844192B2 (en) 2001-06-29 2005-01-18 Wake Forest University Adenovirus E4 protein variants for virus production
US7727974B2 (en) 2001-08-10 2010-06-01 Eisai R & D Management Co., Ltd. Methods of reducing the severity of mucositis
JP2005521380A (ja) * 2001-08-31 2005-07-21 カイロン コーポレイション 抗原性ｂ型ｈｉｖポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、そのポリペプチドおよびそれらの使用
WO2003021227A2 (en) 2001-09-05 2003-03-13 The Children's Hospital Of Philadelphia Methods and compositions useful for diagnosis, staging, and treatment of cancers and tumors
US20040161776A1 (en) 2001-10-23 2004-08-19 Maddon Paul J. PSMA formulations and uses thereof
US7060498B1 (en) 2001-11-28 2006-06-13 Genta Salus Llc Polycationic water soluble copolymer and method for transferring polyanionic macromolecules across biological barriers
US7141540B2 (en) 2001-11-30 2006-11-28 Genta Salus Llc Cyclodextrin grafted biocompatible amphilphilic polymer and methods of preparation and use thereof
AU2002352913B2 (en) 2001-11-30 2008-05-29 The Government Of The United States Of America, Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Peptide agonists of prostate-specific antigen, and uses therefor
US6752995B2 (en) 2002-04-15 2004-06-22 Board Of Regents, The University Of Texas System Nucleic acid and polypeptide sequences useful as adjuvants
US6908453B2 (en) 2002-01-15 2005-06-21 3M Innovative Properties Company Microneedle devices and methods of manufacture
US6676961B1 (en) 2002-03-06 2004-01-13 Automated Carrier Technologies, Inc. Transdermal patch assembly
WO2003094850A2 (en) 2002-05-09 2003-11-20 Biomira, Inc. Lipid a and other carbohydrate ligand analogs
US7018345B2 (en) 2002-12-06 2006-03-28 Hisamitsu Pharmaceutical Co., Inc. Iontophoresis system
US20060257416A1 (en) 2003-06-13 2006-11-16 Palmowski J M Materials and methods for improved vaccination
FR2862062B1 (fr) 2003-11-06 2005-12-23 Oreal Lipide a et composition topique, notamment cosmetique, le comprenant
EP1687033A4 (en) 2003-11-12 2008-06-11 Us Navy IMPROVEMENT OF VACCINE-INDUCED IMMUNE REACTIONS AND PROTECTION THROUGH HETEROLOGY REINFORCEMENT WITH ALPHAVIRUS REPLICON VACCINE
EP1543837A1 (en) 2003-12-15 2005-06-22 Ruhr-Universität Bochum Virus-like particle (VLP) as vaccine
US20060135906A1 (en) 2004-11-16 2006-06-22 Akihiko Matsumura Iontophoretic device and method for administering immune response-enhancing agents and compositions
EP1819823A2 (en) 2004-12-01 2007-08-22 Bayer Schering Pharma Aktiengesellschaft Generation of replication competent viruses for therapeutic use
AU2006252406B2 (en) 2005-06-01 2012-05-17 California Institute Of Technology Method of targeted gene delivery using viral vectors
ES2281252B1 (es) 2005-07-27 2009-02-16 Consejo Superior De Investigaciones Cientificas Vectores recombinantes basados en el virus modificado de ankara (mva) como vacunas preventivas y terapeuticas contra el sida.
US20090208531A1 (en) 2006-02-16 2009-08-20 National Institutes Of Health Office Of Technology Antiviral agents and vaccines against influenza
EP2048955B1 (en) 2006-07-21 2013-08-21 California Institute of Technology Targeted gene delivery for dendritic cell vaccination
US20090181078A1 (en) 2006-09-26 2009-07-16 Infectious Disease Research Institute Vaccine composition containing synthetic adjuvant
JP5443164B2 (ja) * 2006-09-26 2014-03-19 インフェクティアス ディジーズ リサーチ インスティチュート 合成アジュバントを含むワクチン組成物
WO2008099284A2 (en) 2007-01-12 2008-08-21 The University Of Western Ontario Hiv combination vaccine and prime boost method
EP2185192B1 (en) 2007-08-03 2018-10-31 Institut Pasteur Lentiviral gene transfer vectors and their medicinal applications
US8563523B2 (en) 2007-09-07 2013-10-22 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Synthetic lipid A derivative
WO2009076524A2 (en) 2007-12-11 2009-06-18 The University Of North Carolina At Chapel Hill Polypurine tract modified retroviral vectors
US20110142880A1 (en) 2008-03-28 2011-06-16 Franck Yann Lemiale Lentivirus-based immunogenic vectors
WO2010135747A1 (en) 2009-05-22 2010-11-25 Genocea Biosciences Inc. Vaccines against herpes simplex virus type 2: compositions and methods for eliciting an immune response
PT2437753T (pt) 2009-06-05 2016-11-23 Infectious Disease Res Inst Adjuvantes lipídicos de glucopiranosilo sintéticos e composições de vacina contendo os mesmos
WO2011011584A1 (en) 2009-07-24 2011-01-27 Immune Design Corp Lentiviral vectors pseudotyped with a sindbis virus envelope glycoprotein
EA201290897A1 (ru) 2010-03-11 2013-03-29 Иммьюн Дизайн Корп. Вакцины для пандемического гриппа
WO2012038832A2 (en) 2010-09-24 2012-03-29 Institut Pasteur Generation of replicating chimeric measles virus - retrovirus particles
US20130302368A1 (en) 2011-01-27 2013-11-14 Boro Dropulic Advanced Prime and Boost Vaccine
WO2012112691A1 (en) 2011-02-15 2012-08-23 Immune Design Corp. Methods for enhancing immunogen specific immune responses by vectored vaccines
US20120288515A1 (en) 2011-04-27 2012-11-15 Immune Design Corp. Synthetic long peptide (slp)-based vaccines
WO2012162428A1 (en) 2011-05-23 2012-11-29 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services Prime-boost vaccination for viral infection
IN2014DN05656A (ru) 2011-12-23 2015-04-03 Univ Western Ontario
US8323662B1 (en) 2012-03-30 2012-12-04 Immune Design Corp. Methods useful for generating highly mannosylated pseudotyped lentiviral vector particles comprising a Vpx protein

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2272859A2 (en) * 1998-08-07 2011-01-12 University of Washington Immunological herpes simplex virus antigens and methods for use thereof
WO2006040334A1 (en) * 2004-10-14 2006-04-20 Crucell Holland B.V. Malaria prime/boost vaccines
WO2009071613A2 (en) * 2007-12-06 2009-06-11 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Vaccine

Non-Patent Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A. RODRIGUEZ, GOUDSMIT J., COMPANJEN A., MINTARDJO R., GILLISSEN G., TAX D., SIJTSMA J., WEVERLING G. J., HOLTERMAN L., LANAR D. E: "Impact of Recombinant Adenovirus Serotype 35 Priming versus Boosting of a Plasmodium falciparum Protein: Characterization of T- and B-Cell Responses to Liver-Stage Antigen 1", INFECTION AND IMMUNITY, AMERICAN SOCIETY FOR MICROBIOLOGY., vol. 76, no. 4, 1 April 2008 (2008-04-01), pages 1709 - 1718, XP055030130, ISSN: 00199567, DOI: 10.1128/IAI.01614-07 *
CLAIRE L. HUTCHINGS, ASHLEY J. BIRKETT, ANNE C. MOORE, AND ADRIAN V. S. HILL: "Combination of protein and viral vaccines induces potent cellular and humoral immune responses and enhanced protection from murine malaria challenge", INFECTION AND IMMUNITY, AMERICAN SOCIETY FOR MICROBIOLOGY., vol. 75, no. 12, 1 December 2007 (2007-12-01), pages 5819 - 5826, XP009123837, ISSN: 0019-9567, DOI: 10.1128/IAI.00828-07 *
DOUGLAS, A.D. ; DE CASSAN, S.C. ; DICKS, M.D.J. ; GILBERT, S.C. ; HILL, A.V.S. ; DRAPER, S.J.: "Tailoring subunit vaccine immunogenicity: Maximizing antibody and T cell responses by using combinations of adenovirus, poxvirus and protein-adjuvant vaccines against Plasmodium falciparum MSP1", VACCINE, ELSEVIER, AMSTERDAM, NL, vol. 28, no. 44, 18 October 2010 (2010-10-18), AMSTERDAM, NL, pages 7167 - 7178, XP027410019, ISSN: 0264-410X *
HILL ADRIAN V S , REYES-SANDOVAL A, O'HARA G, ET AL: "Prime-boost vectored malaria vaccines: progress and prospects.", HUMAN VACCINES, LANDES BIOSCIENCE, GEORGETOWN, TX, US, vol. 6, no. 1, 1 January 2010 (2010-01-01), US, pages 78 - 83, XP002636116, ISSN: 1554-8600, DOI: 10.4161/hv.6.1.10116 *
LAURA E. JOHNSON ; THOMAS P. FRYE ; NACHIMUTHU CHINNASAMY ; DHANALAKSHMI CHINNASAMY ; DOUGLAS G. MCNEEL: "Plasmid DNA vaccine encoding prostatic acid phosphatase is effective in eliciting autologous antigen-specific CD8+ T cells", CANCER IMMUNOLOGY, IMMUNOTHERAPY, SPRINGER, BERLIN, DE, vol. 56, no. 6, 11 November 2006 (2006-11-11), Berlin, DE, pages 885 - 895, XP019514146, ISSN: 1432-0851, DOI: 10.1007/s00262-006-0241-8 *
RADOSEVIC K, RODRIGUEZ A, LEMCKERT A A C, VAN DER MEER M, GILLISSEN G, WARNAR C, VON EYBEN R, GRAZIA PAU M, GOUDSMIT J: "The Th1 immune response to Plasmodium falciparum circumsporozoite protein is boosted by adenovirus vectors 35 and 26 with a homologous insert", CLINICAL AND VACCINE IMMUNOLOGY, AMERICAN SOCIETY FOR MICROBIOLOGY, WASHINGTON, DC, US, vol. 17, no. 11, 1 November 2010 (2010-11-01), US, pages 1687 - 1694, XP009146745, ISSN: 1556-6811, DOI: 10.1128/CVI.00311-10 *
RADOSEVIC KATARINA; RODRIGUEZ ARIANE; LEMCKERT ANGELIQUE; GOUDSMIT JAAP: "Heterologous prime-boost vaccinations for poverty-related diseases: advantages and future prospects.", EXPERT REVIEW OF VACCINES, EXPERT REVIEWS LTD., GB, vol. 8, no. 5, 1 May 2009 (2009-05-01), GB, pages 577 - 592, XP008131688, ISSN: 1744-8395, DOI: 10.1586/erv.09.14 *
RHEA N. COLER, BERTHOLET SYLVIE, MOUTAFTSI MAGDALINI, GUDERIAN JEFF A., WINDISH HILLARIE PLESSNER, BALDWIN SUSAN L., LAUGHLIN ELSA: "Development and Characterization of Synthetic Glucopyranosyl Lipid Adjuvant System as a Vaccine Adjuvant (art. e16333)", PLOS ONE, vol. 6, no. 1, pages 1 - 12, XP055030261, DOI: 10.1371/journal.pone.0016333 *
RHEA N. COLER, BERTHOLET SYLVIE, MOUTAFTSI MAGDALINI, GUDERIAN JEFF A., WINDISH HILLARIE PLESSNER, BALDWIN SUSAN L., LAUGHLIN ELSA: "Development and Characterization of Synthetic Glucopyranosyl Lipid Adjuvant System as a Vaccine Adjuvant", PLOS ONE, vol. 6, no. 1, pages e16333, XP055030257, DOI: 10.1371/journal.pone.0016333 *
STEWART V ANN, ET AL: "Priming with an adenovirus 35-circumsporozoite protein (CS) vaccine followed by RTS,S/AS01B boosting significantly improves immunogenicity to Plasmodium falciparum CS compared to that with either malaria vaccine alone.", INFECTION AND IMMUNITY, AMERICAN SOCIETY FOR MICROBIOLOGY., vol. 75, no. 5, 1 May 2007 (2007-05-01), pages 2283 - 2290, XP002527574, ISSN: 0019-9567, DOI: 10.1128/IAI.01879-06 *
YUCHENG TANG, HAKAN AKBULUT, JONATHAN MAYNARD, LINE PETERSEN, XIANGMING FANG, WEI-WEI ZHANG, XIAOQIN XIA, JAMES KOZIOL, PHYLLIS-JE: "Vector Prime/Protein Boost Vaccine That Overcomes Defects Acquired during Aging and Cancer", J IMMUNOL, THE AMERICAN ASSOCIATION OF IMMUNOLOGISTS, INC., vol. 177, 1 January 2006 (2006-01-01), pages 5697 - 5707, XP055030252, DOI: 10.4049/jimmunol.177.8.5697 *

Also Published As

Publication number Publication date
EA201391496A1 (ru) 2014-03-31
JP6054942B2 (ja) 2016-12-27
IL228685A0 (en) 2013-12-31
US20150335733A1 (en) 2015-11-26
ZA201307394B (en) 2015-03-25
EP3632463A1 (en) 2020-04-08
CN103596586A (zh) 2014-02-19
JP2017071629A (ja) 2017-04-13
EP2694099A1 (en) 2014-02-12
WO2012141984A1 (en) 2012-10-18
AU2012243039B2 (en) 2017-07-13
NZ616304A (en) 2016-01-29
EP2694099B1 (en) 2019-10-16
MX350795B (es) 2017-09-19
US20120328655A1 (en) 2012-12-27
CA2832307A1 (en) 2012-10-18
MX2013011740A (es) 2014-03-27
BR112013025799A2 (pt) 2016-12-20
IL228685A (en) 2017-12-31
US9044420B2 (en) 2015-06-02
AU2012243039A1 (en) 2013-10-24
SG194083A1 (en) 2013-11-29
JP2014516355A (ja) 2014-07-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA027236B1 (ru) Иммуногенные композиции и способы применения таких композиций для индукции гуморального и клеточного иммунного ответа
US20230181725A1 (en) Cmv vaccines
JP6688535B2 (ja) ワクチン組成物
US20220347291A1 (en) Vaccine for use in the prophylaxis and/or treatment of a disease
JP2014510721A (ja) ベクターワクチンによる免疫原特異的免疫応答を強化するための方法
EP3877531A1 (en) Alphavirus neoantigen vectors and interferon inhibitors
Odegard et al. Virological and preclinical characterization of a dendritic cell targeting, integration-deficient lentiviral vector for cancer immunotherapy
Uhlig et al. Lentiviral protein transfer vectors are an efficient vaccine platform and induce a strong antigen-specific cytotoxic T cell response
Neukirch et al. Adenovirus based virus-like-vaccines targeting endogenous retroviruses can eliminate growing colorectal cancers in mice
JP2019162120A (ja) ポックスウィルス−プラスモジウム組換え体、こうした組換え体を含む組成物、該組換え体の使用、および該組換え体を作製し、および用いる方法。
JP2024505274A (ja) ワクチン接種中のｔ細胞プライミングの強化において使用されるウイルスコンストラクト
JP2023503858A (ja) ４－１ｂｂｌアジュバント添加した組み換え改変ワクシニアウイルスアンカラ（ｍｖａ）の医学的使用
Zajakina et al. Application of alphaviral vectors for immunomodulation in cancer therapy
Wong et al. An evaluation of enforced rapid proteasomal degradation as a means of enhancing vaccine-induced CTL responses
Palmowski et al. A single-chain H-2Db molecule presenting an influenza virus nucleoprotein epitope shows enhanced ability at stimulating CD8+ T cell responses in vivo
EA046518B1 (ru) Устройство для сбора тепловой и вибрационной энергии окружающей среды
WO2024218400A1 (en) Improved expression of surface-displayed antigens
Suttmann et al. Vaccination/Immunotherapy