EA011355B1

EA011355B1 - Обнаружение окисляющих липиды абзимов в образцах

Info

Publication number: EA011355B1
Application number: EA200701811A
Authority: EA
Inventors: Иван Петаев
Original assignee: Кембридж Тераностикс Лимитед
Priority date: 2005-02-25
Filing date: 2006-02-24
Publication date: 2009-02-27
Also published as: EP1859276A1; EA200701811A1; US20080248505A1; GB0503940D0; JP2008532007A; CN101147064A; WO2006090164A1; US20130095505A1; EP1859276B1; ATE537447T1

Abstract

Настоящее изобретение основано на обнаружении того факта, что окисляющие липиды абзимы повреждают антигены Chlamydia в образце, при этом степень повреждения позволяет судить об уровне или активности абзимов в указанном образце. Окисляющие липиды абзимы можно измерить или обнаружить, например, путем подавления или прекращения обусловленного абзимами окисления липидов в образце и определения связывания антител с антигеном Chlamydia в указанном образце относительно контрольных образцов. Указанные способы можно применять при оценке сердечно-сосудистых заболеваний.

Description

Настоящее изобретение относится к способу обнаружения окисляющих липиды абзимов в образцах крови или сыворотки крови. Такой способ может быть полезен, например, при оценке состояния сердечно-сосудистой системы у пациента.

Окисление липидов является одним из основных процессов, который приводит к превращению циркулирующих в крови липопротеинов в сильные атерогенные факторы [Οοΐο Υ. (1982) кирга, На111^е11 В., апб 1.М.С. СиИспбдс. (1989) кирга, δοϊιιιΐΐζ Ό., апб Нагпкоп Ό.Ο. (2000) кирга]. Основной причиной окисления липидов являются каталитические антитела, также известные как «абзимы» (см. \УО 03/017992, \УО 03/019196 и \УО 03/019198). Абзимы являются ключевым патогенным фактором при развитии атеросклероза и важным диагностическим маркером для заболеваний, связанных с атеросклерозом, и также представляют собой мишень для терапевтического воздействия.

Современные способы анализа абзимов основаны на измерении окисления липидов абзимами. Величину окисления липидов определяют, например, по уровню содержания продукта окисления липидов малондиальдегида (МДА). Уровни МДА легко можно измерить спектрофотометрическим способом, поскольку при взаимодействии малондиальдегида с тиобарбитуровой кислотой образуется окрашенный продукт [Огарег, Н.Н. е! а1. Ргее К.аб1е. Βίο1. Меб. (1993), 15, 353].

Однако способы анализа абзимов на основе окисления липидов являются медленными, поскольку образование продуктов окисления липидов требует, как правило, от 8 до 12 ч. Способы анализа окисления липидов также требуют использования токсичных реагентов, таких как трихлоруксусная кислота, и больших объемов сыворотки крови пациента (обычно 2-3 мл).

Автор настоящего изобретения обнаружил, что абзимы повреждают антигены СЫатуб1а и это повреждение можно использовать для измерения активности абзимов в простых, быстрых способах анализа с применением обычных форматов иммунологического анализа.

Согласно одному аспекту настоящего изобретения предложен способ измерения уровней абзимов в пробе, согласно которому подавляют или вызывают прекращение активности опосредуемого абзимами окисления липидов в указанном образце и определяют связывание антител с антигеном СЫашуб1а в указанном образце.

Увеличение связывания в указанном образце по сравнению с необработанными контрольными образцами указывает на присутствие абзимов в указанном образце. Степень указанного увеличения представляет собой показатель уровня абзимов в образце. Отсутствие какого-либо увеличения связывания в указанном образце по сравнению с контрольными образцами указывает на отсутствие абзимов в образце.

Связывание антител в образцах, которые обработали с целью прекращения активности опосредуемого абзимами окисления липидов, и в контрольных образцах (например, необработанных образцах) можно определять одновременно или последовательно.

Согласно некоторым вариантам реализации изобретения исходный образец, отобранный у пациента, можно поделить на два или несколько отдельных образцов или аликвот, при этом по меньшей мере один из указанных (аликвот) обрабатывают с целью подавления или прекращения опосредуемого абзимами окисления липидов и по меньшей мере один из указанных образцов (аликвот) оставляют необработанным в качестве контрольного. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения у пациента можно отобрать два или более идентичных образца, по меньшей мере один из которых обрабатывают с целью подавления или прекращения опосредуемого абзимами окисления липидов и по меньшей мере один из которых оставляют необработанным в качестве контрольного.

Присутствие абзимов в сыворотке пациента может служить признаком того, что пациент имеет атеросклеротическое заболевание или может указывать на наличие у пациента предрасположенности к такому заболеванию или риска возникновения его в будущем. Количество, уровень содержания или активность абзимов может указывать на серьезность или степень риска указанного заболевания, т. е. увеличение количества и/или активности антитела указывает на возросшие серьезность или риск заболевания.

Согласно способу обследования пациента на предмет присутствия атеросклеротического заболевания подавляют или вызывают прекращение опосредуемого абзимами окисления липидов в образце, отобранном у пациента, и определяют связывание антител с антигеном СЫашуб1а в указанном образце.

Увеличение связывания в обработанном образце по сравнению с необработанным образцом указывает на уровень содержания абзимов в указанном образце. По уровню абзимов в указанном образце можно оценить присутствие, серьезность или предрасположенность пациента к атеросклеротическому заболеванию.

Указанные способы можно применять, например, при определении оптимального терапевтического лечения пациента. Например, пациенту, у которого обнаружены абзимы, направленные на липиды, что указывает на атеросклеротическое заболевание, можно назначить терапевтическое лечение для облегчения состояния или его симптоматики. Уровень или количество антилипидных абзимов может указывать на серьезность состояния и его можно использовать для определения того, является ли конкретный терапевтический курс подходящим.

Предпочтительно, чтобы указанный образец представлял собой образец, который содержит плазму или сыворотку крови пациента, например образец крови, сыворотки или плазмы крови. Способы получения, хранения и приготовления подходящих образцов, взятых у пациента, хорошо известны в медицинской практике. Тестируемый образец сыворотки крови можно получить, например, путем взятия крови у

- 1 011355 пациента и выделения сыворотки из отобранной крови. Подходящие способы выделения включают центрифугирование с целью отделения сыворотки и плазмы от клеточного материала.

Антиген СЫатуб1а может представлять собой любой иммуноген или иммуногенный компонент клетки СЫатуб1а, т.е. молекулу СЫатуб1а, которая вызывает или способна вызвать у млекопитающего иммунный ответ по отношению к клетке СЫатуб1а, например, молекулу поверхности клетки СЫатуФа, или миметический или функциональный аналог такого компонента. Другими словами, антиген СЫатуФа представляет собой компонент клетки СЫатуФа, который способен специфичным образом связываться с антителами, восстающими против клетки СЫатуФа. Антигены СЫатуб1а, подходящие для применения в настоящем изобретении, включают изолированные, очищенные, клонированные или синтезированные антигены СЫатуб1а, фрагменты или детерминанты таких антигенов, группы таких антигенов, фракцию (фракции) гомогенизата клетки СЫатуФа, целую клетку СЫатуФа, и любые их комбинации.

При применении настоящих способов в качестве антигенов СЫатуФа также можно использовать антиидиотипические антитела, которые имитируют активные детерминанты СЫатуФа, или фрагменты указанных антиидиотипических антител.

Подходящие способы получения антигенов СЫатуФа хорошо известны в данной области техники. Например, антигены СЫатуФа можно выделить и/или очистить такими способами как ВЭЖХ.

Согласно некоторым предпочтительным вариантам реализации настоящего изобретения, антиген СЫатуФа может находиться на поверхности клетки СЫатуФа и способы, описанные в настоящем описании, могут включать определение связывания антител с клеткой СЫатуФа в обработанном и необработанном образце.

Клетка СЫатуФа может представлять собой клетку, относящуюся к видам, принадлежащим группе СЫатуб1а рзШасг Группа СЫатуб1а ρδίΙΙηοί включает СЫатуб1а ρδίΙΙηοί и СЫатуб1а рпеитошае. Согласно некоторым вариантам реализации, клетка СЫатуФа может представлять собой клетку СЫатуФа р81йас1 овцы. Подходящие препараты живой овечьей СЫатуб1а ρδίΙΙηοί в лиофилизированной форме являются коммерчески доступными (1п1егте1).

Связывание антител в образце с антигеном СЫатуФа можно обнаружить с помощью любого подходящего средства или способа анализа. Одной возможностью является маркирование отдельными репортерными молекулами. Например, репортерной молекулой можно пометить вторичное антитело, которое связывается с антителами в образце, или клетку СЫатуФа или антиген. Репортерные молекулы могут прямо или косвенно генерировать обнаруживаемые, предпочтительно измеряемые, сигналы. При необходимости, связывание репортерных молекул может быть прямым или косвенным, ковалентным, например, через пептидную связь или нековалентным. Связывание посредством пептидной связи может являться результатом экспрессии рекомбинантного гена, кодирующего связывающую молекулу (например, антитело) и репортерную молекулу.

Репортерные молекулы включают флюорохромы, такие как флюоресцеин, родамин, фикоэритрин и Техаз Веб, пигментообразующие красители, такие как диаминобензидин, макромолекулярные коллоидные частицы или корпускулярный материал, например латексные гранулы, которые являются окрашенными, магнитными или парамагнитными, и биологически или химически активные реагенты, которые могут прямо или косвенно давать обнаруживаемые сигналы, визуально наблюдаемые, обнаруживаемые с помощью электронного оборудования или фиксируемые иным способом.

Биологически или химически активные реагенты включают ферменты, которые катализируют реакции, выявляющие или изменяющие цвет или вызывающие изменения электрических свойств. Молекулы реагентов могут возбуждаться таким образом, что электронные переходы между энергетическими уровнями приводят к характеристическому спектральному поглощению или излучению. Они могут включать химические объекты, используемые при соединении с биосенсорами. Можно применять биотин/авидин или биотин/стрептавидин и системы обнаружения на основе щелочной фосфатазы. Другие примеры включают пероксидазу хрена и хемилюминесценцию. Любой указанный способ можно применять для определения связывания антитела с антигеном СЫатуб1а.

Сигналы, генерируемые отдельными конъюгатами антитело-репортерная молекула, можно применять для количественного получения абсолютных или относительных данных о связывании соответствующего антитела в образцах (обычных и тестируемых).

Способы, предлагаемые в настоящем изобретении, можно применять в любом удобном формате. Иммунологические способы анализа хорошо известны в данной области, и существует много подходящих форматов, которые можно использовать при реализации способов настоящего изобретения, например способ твердофазного иммуноферментного анализа (ТИФА), вестерн-блоттинга, микроиммунофлюоресценции (МИФ), В1асоге®, (В1асоге, Упсала, Швеция), иммунопреципитации или иммунотурбидиметрии, агглютинации, например агглютинации на основе эритроцитов, латекса или других полимеров, иммуногистохимии, иммуноэлектрофореза, аффинной хроматографии, основанной на антителах, и ΙΌΕΙΑ® (Воо18-Се111есй) и других диагностических систем, усиливающих окисление-восстановление.

В некоторых предпочтительных вариантах реализации настоящего изобретения можно использовать формат «сэндвич» анализа. Например, в «сэндвич» анализе можно применять иммобилизованное «захваты

- 2 011355 вающее» антитело, которое связывает антитела против СЫатуФа в указанном образце и меченый антиген СЫатуФа или клетку, который позволяет обнаружить присутствие антител против СЫатуФа, которые связаны с указанным иммобилизованным антителом. В качестве альтернативы в «сэндвич» анализе можно применять иммобилизованные антиген или клетку СЫатуФа или меченное антитело, которое обнаруживает присутствие антител к СЫатуФа, связанных с антигеном. Иммобилизованное антитело, антиген СЫатуФа или клетку СЫатуФа можно иммобилизовать, например, путем прикрепления к нерастворимой подложке или твердой поверхности. Подложка может быть в корпускулярной или твердой форме и может включать пластинку, пробирку, гранулы, шарик, фильтр или мембрану. Способы фиксирования антител на нерастворимых подложках известны специалистам в данной области. Неиммобилизованный компонент анализируемого образца (т.е. компонент, который находится в растворе в свободном состоянии), например антитело, антиген СЫатуФа или клетка СЫатуФа, может содержать детектируемую метку, как описано выше. Например, антитело можно пометить флуорофором, таким как РГГС или родамин, радиоизотопом или неизотопной меткой, такой как биотин или дигоксигенин; компоненты, содержащие биотин можно обнаружить, используя «реагенты обнаружения», такие как например, авидин, конъюгированный с любой подходящей меткой, например флуорохромом.

Способ определения связывания не является отличительной особенностью настоящего изобретения и специалисты в данной области могут выбрать подходящий способ в соответствии с их предпочтением и общими знаниями.

Для прекращения опосредуемого абзимами окисления липидов образец можно обработать, используя любую физическую или химическую обработку, которая уничтожит или существенно уменьшит активность абзимов, но не окажет воздействия или существенного воздействия на связывание абзимов с антигенами СЫатуФа.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения для инактивации опосредуемого абзимами окисления липидов образец можно обработать физическими способами.

Например, образец можно нагреть. Образец можно нагреть с соответствии с любым температурным режимом, который инактивирует активность окисления липидов, но не воздействует на свойства связывания специфичных антител.

Подходящий температурный режим может включать нагревание указанного образца по меньшей мере до 37, по меньшей мере до 56 или по меньшей мере до 70°С. Образец можно нагревать в течение времени, достаточного для инактивации или инактивации в значительной степени опосредуемого абзимами окисления липидов без воздействия на связывание абзимов с антигеном. Например, образцы можно нагревать в течение по меньшей мере 1, по меньшей мере 5, по меньшей мере 15, по меньшей мере 45, по меньшей мере 60 мин, по меньшей мере 8, по меньшей мере 12 или по меньшей мере 24 ч.

Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения указанный образец можно нагревать до 70°С в течение по меньшей мере 1, по меньшей мере 2, по меньшей мере 3, по меньшей мере 5 или по меньшей мере 10 мин; нагревать до 56°С в течение по меньшей мере 15, по меньшей мере 20, по меньшей мере 30, по меньшей мере 45 или по меньшей мере 60 мин или нагревать до 37°С в течение по меньшей мере 8, по меньшей мере 12, по меньшей мере 24 или по меньшей мере 48 ч.

Для инактивации активности окисления липидов можно применять другие способы физической обработки, не воздействующие на свойства связывания специфичных антител.

Образцы можно подвергнуть периодически повторяющимся циклам замораживания-оттаивания, например двум или нескольким циклам замораживания, с последующим оттаиванием.

Образцы можно подвергнуть длительному хранению, например по меньшей мере 4 дня при 0-4°С, по меньшей мере 2 или по меньшей мере 3 месяца при -10°С или по меньшей мере 4 или по меньшей мере 6 месяцев при -20°С.

Образцы можно подвергнуть ультразвуку высокой эенргии, микроволновому, УФ- или гаммаизлучению или любым другим электромагнитным волнам.

Приемлемость использования в способах согласно настоящему изобретению того или иного способа или режима обработки можно определить путем измерения окисления липидов и активности связывания (антигенов) СЫашуФа в образце после обработки, как описано в данной заявке. Подходящая обработка или режим для применения в способах согласно настоящему изобретению инактивирует опосредуемое окисление липидов, но не оказывает воздействие на свойства связывания антител против СЫатуФа.

Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения для инактивации опосредуемого абзимами окисления липидов указанный образец можно обработать химическими способами. Например, образец можно обработать одним или несколькими реагентами, инактивирующим абзимы.

Инактивирующие реагенты могут включать антиоксиданты с низким рН (т.е. ингибирующие реакции окисления при рН 5,5), акцепторы гидроксильных радикалов, «ловушки электронов», такие как краун-эфиры и стероиды, «поглотители электронов» (своеобразные «подушки») такие как полимеры на основе поливинила, «стоки электронов», такие как убихиноны и О₈, комплексоны меди и кальция.

Подходящие инактивирующие реагенты могут включать аскорбиновую кислоту, ацетилсалициловую кислоту, азид натрия, катехины, в том числе катехингаллат, диметилсульфоксид, азитромицин, ге

- 3 011355 моглобин, телитромицин (Кетек) или их любые производные, аналоги и соли.

Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения, инактивирующий реагент может представлять собой бактериальную клетку, например клетку пробиотической бактерии, например лактобактерии, или продукт такой клетки.

Эффективность обработки с целью инактивации абзимов можно определить путем определения активности окисления липидов абзимами образца, например 1дС, взятого из атеромы пациента, до и после указанной обработки. Можно применять любой традиционный способ определения окисления липидов. В данной области известно много способов определения окисления липидов и их можно применять для определения уменьшения или прекращения активности окисления липидов в образце. Подходящие способы описаны, например, в СВС НаибЬоок οί Мебюбк !ог Охудеи Ваб1са1 Векеагсй, СВС Ргекк, Воса Ва!ои, Е1ог1ба (1985), Охудеи Вабюак ίη Вю1одюа1 8у81етк. МеШобк ίη Еп7ушо1оду, ν. 186, Асабешк Ргекк, Ьоибои (1990); Охудеи Ваб1са1к ίη Вю1одюа1 8у81етк. МеШобк ίη Ен/ушо^ду, ν. 234, Асабешю Ргекк, 8аи О1едо, №\ν Уогк, Вок!ои, Ьоибои (1994); и Егее Вабюак. А ргасбса1 арргоасй. 1ВЬ Ргекк, ОхРогб, №\ν Уогк, Токуо (1996). В предпочтительных вариантах реализации настоящего изобретения окисление измеряют путем определения образования (т.е. присутствия или количества) продукта окисления липидов, который может включать такие альдегиды, как малондиальдегид (МДА), (липидные) пероксиды, диеновые конъюгаты или углеводородные газы.

Образец, взятый у пациента, можно обработать для подавления или уменьшения активности комплемента. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения образец можно обработать ингибитором комплемента. Ингибиторы активности комплемента хорошо известны в данной области и включают, например, такие хелатирующие Са²⁺ агенты, как ЕСТА или этилендиаминтетраускусная кислота (ЕИТА), ингибиторы тимидинкиназы, в том числе, катехины, например, эпигаллокатехингаллат (ЭГКГ), полисахариды, например, зимозан, пептидильные молекулы, например, СО46, СО55, СО59, пекселизумаб, экулизумаб, компстатин, яд кобры, антитела против С1с.| и других компонент или промежуточных веществ активации комплемента, и фрагменты этих антител, и соединения, которые имитируют функции и свойства активации комплемента.

Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения образец можно обработать с помощью процедуры или режима, который подавляет активность комплемента. Подходящие процедуры включают нагревание образца, например, до 56°С в течение 30 мин, или до 70°С в течение 2-5 мин, или другой температурный режим, который инактивируют систему комплемента. Можно также применять другие физические процедуры, такие как ультразвуковой шок, облучение и/или обработку лазером.

Способы определения активности абзимов, которые описаны в настоящей заявке, можно также применять для скрининга (отбора) соединений, которые подавляют активность абзимов. Такие соединения можно использовать при лечении атеросклеротических заболеваний.

Согласно другому аспекту настоящего изобретения предложен способ скрининга ингибитора абзимов, согласно которому определяют связывание антител в указанном образце с антигеном Сй1ашуб1а, обрабатывают образец тестируемым соединением и определяют связывание антител в обработанном образце с антигеном Сй1ашуб1а.

Увеличение связывания с антигеном Сй1ашуб1а после вышеуказанной обработки свидетельствует, что данное соединение представляет собой ингибитор абзимов.

Образец предпочтительно представляет собой образец, содержащий абзимы. Подходящий образец можно взять у пациента, имеющего атеросклеротическое заболевание, и он может представлять собой, например, образец сыворотки крови или образец из атеромы или органа, поврежденного атеросклерозом. Образец может быть обогащен 1дС, например, за счет связывания с белком А, как описано ниже. Присутствие абзимов в указанном образце можно подтвердить, используя способы анализа на окисление липидов, известные в данной области.

Ингибитор абзимов, идентифицированный указаным способом, можно применять для лечения атеросклеротического заболевания, в том числе, сердечно-сосудистого заболевания, например атеросклероза, ишемического (коронарного) заболевания сердца, инфаркта миокарда, аневризмы, атероматозного периферийного сосудистого заболевания, аортоподвздошного заболевания, хронической и критической ишемии нижних конечностей, внутренней ишемии, заболевания почечной артерии, цереброваскулярного заболевания, инсульта, атеросклеротической ретинопатии, тромбоза и аберрантного свертывания крови, и гипертонии. Указанными заболеваниями могут страдать человек или животное.

Подходящее тестируемое соединение может представлять собой низкомолекулярное соединение, пептид, молекулу антитела или другую молекулу, воздействие которых на активность абзимов требуется исследовать. Подходящие тестируемые соединения можно выбрать из библиотек соединений и синтезированных соединений, например, с помощью комбинационной химии, как описано ниже. Особенно подходящие тестируемые соединения включают хелаторы металлов, например хелатирующие медь или кальций соединения, антиоксиданты, в частности антиоксиданты с низким рН (т.е. соединения, которые подавляют реакции окисления при рН 5.5), акцепторы гидроксильных радикалов, «ловушки электронов», такие как краун-эфиры и стероиды, «электронные поглотители (сикйюик)», такие как полимеры на основе поливинила, и «стоки электронов (бгашк)», такие как убихиноны и О₈. Подходящие тестируемые соединения могут включать аналоги,

- 4 011355 соли и производные азида натрия, катехинов, в том числе, катехингаллата, диметилсульфоксида, азитромицина, гемоглобина, телитромицина, которые были идентифицированы как ингибиторы абзимов с помощью способов настоящего изобретения, а также фракции, экстракты и производные бактериальных клеток, в частности культур пробиотических бактерий, таких как лактобактерии (1ас1оЬасШ1).

Технология комбинаторных библиотек (8с1и.111х. 18 (1996), Вю1сс1то1. Ргод. 12:729-743) обеспечивает эффективный способ тестирования потенциально огромного числа различных веществ на способность модулировать активность абзимов. До или одновременно со скринингом, описанном выше, тестируемые соединения можно исследовать на способность связывать абзимы. Указанную процедуру можно использовать в качестве способа грубого отбора перед тестированием соединения на фактическую способность модулировать активность абзимов.

Количество тестируемого соединения, которое может быть добавлено в тестовую систему согласно настоящему изобретению, будет определено опытным путем и с расхождением, зависящим от вида применяемого соединения. Как правило, можно применять концентрации предполагаемого ингибиторного соединения от примерно 0,01 до 100 нМ, например от 0,1 до 10 нМ.

Соединения, которые можно применять, могут представлять собой природные или синтетические химические соединения, применяемые в программах скрининга лекарственных препаратов. Можно использовать экстракты растений, которые содержат некоторые охарактеризованные или неохарактеризованные компоненты, или экстракты, фрагменты или компоненты пробиотических бактерий, таких как лактобактерии.

Выбор других потенциальных соединений-ингибиторов может быть основан на моделировании 3-мерной структуры абзима и/или липидного антигена, который он связывает, и использовании рационального дизайна лекарственного препарата с целью получения потенциальных соединений-ингибиторов с определенной молекулярной формой, размерами и характеристиками заряда.

Способ скрининга, описанный в настоящей заявке, может также включать определение активности абзимов по окислению липидов в присутствии тестируемого соединения.

Активность окисления липидов, в том числе активность перокисления, можно установить путем определения окисления липида-хозяина (т.е. липида из образца), липида из чужеродного антигена, такого как клетка СЫатуФа, или липида из другого источника, который, например, можно добавить как часть способа анализа. Можно измерить накопление продуктов или побочных продуктов окисления, таких как совместно окисленные парные молекулы репортера, или измерить исчезновение или потребление субстратов, таких как немодифицированные липиды или сопутствующих субстратов, таких как кислород. В данной области известно много способов определения перокисления липидов, подходящие для применения в соответствии с настоящим изобретением. Подходящие способы, например, описаны в СКС НаибЬоок о! МеШобз Гот Охудеи Каб1са1 Кезеатсй, СКС Ргезз, Воса Ка1ои, Е1опба (1985), Охудеи Кабка1з ίη Вю1одка1 8уз1етз. МеШобз ίη Еихутокду, ν. 186, Асабетк Ргезз, Ьоибои (1990); Охудеи Кабка1з ίη Вю1одка1 8уз1етз. МеШобз 1и Еихутокду, ν. 234, Асабетк Ргезз, 8аи Экдо, №\ν Уотк, Возки, Ьоибои (1994); и Етее Кабка1з. А ртасйса1 арртоасй. 1КЬ Ргезз, ОхГогб, Ыете Уотк, Токуо (1996).

Согласно предпочтительным вариантам реализации настоящего изобретения, окисление определяют путем определения образования (т.е. присутствия или количества) продуктов окисления липидов, в том числе, альдегидов, например малондиальдегида (МДА), (липидных) пероксидов, диеновых конъюгатов или углеводородных газов. Продукты окисления липидов можно определять любым подходящим способом. Например, продукты перокисления липидов можно определить, используя ВЭЖХ (Вто^и, К.К., и Ке11у, Е.1 1и: Егее Кабкак. А ртас!ка1 арртоасй. 1КЬ Ргезз, ОхГогб, Ыете Уотк, Токуо (1996), 119131), УФ-спектроскопию (Кткт, М. ОпаШНайте аиа1узк оГ 4-йубгоху-2-иоиеиа1. 1Ь1б., 133-145), или газовую хроматографию - масс-спектрометрию (Моттов, Ι.Ό., аиб КоЬетк, ЬЭ. Е₂-1зоргоз1аиез: р^озΐад1аηб^и11ке ртобиск оГ Пр1б ретох1байои. 1Ь1б. 147-157). Образование малондиальдегида (МДА) можно установить, например, по реакции с 2-тиобарбитуровой кислотой (предпочтительно при 1 мМ) путем измерения оптической плотности при соответствующей длине волны, например, 525 нм.

Агент, идентифицированный при использовании одного или нескольких способов первичного отбора (например, в бесклеточной системе) как обладающий способностью ингибировать активность абзимов, можно исследовать далее, используя один или несколько способов вторичного отбора. Вторичный отбор может включать тестирование на активность абзимов в сосудистой системе или на биологическую функцию абзимов, например, в экспериментальной модели на животных. Подходящие биологические функции, которые можно определить при вторичном отборе, включают уменьшение размеров или количества атеросклеротических повреждений, или уменьшение других симптомов или эффектов атеросклеротического заболевания, например кровяного давления.

Способы, предлагаемые в настоящем изобретении, могут включать идентификацию тестируемых соединений в качестве реагентов, которые ингибируют активность абзима.

Примеры соединений, идентифицированных как ингибиторы абзима с применением способов настоящего изобретения, включают аскорбиновую кислоту, ацетилсалициловую кислоту, азид натрия, (+) катехингаллат, ДМСО, гемоглобин, телитромицин-кетек, клетки лактобактерий и другие реагенты, перечисленные в табл. 3.

- 5 011355

Идентифицированное соединение можно выделить или очистить и/или синтезировать или получить промышленным способом.

При желании, соединение, идентифицированное в качестве ингибитора абзимов, как описано в настоящей заявке, можно модифицировать с целью оптимизации активности или обеспечения других полезных при введении пациенту характеристик, таких как увеличенный период полувыведения или уменьшенные побочные эффекты. Способы и стратегии модификации образцов соединений хорошо известны в данной области.

Ингибитор абзимов, идентифицированный как описано в настоящем документе, можно приготовить в виде композиции, например медикамента, фармацевтической композиции или лекарства, с фармацевтически приемлемым наполнителем, как описано ниже. Такие композиции можно вводить пациенту.

Настоящее изобретение охватывает соединение, идентифицированное способом анализа, описанным выше, в качестве ингибитора абзимов, фармацевтическую или ветеринарную композицию, медикамент, лекарство или другую композицию, содержащую такое соединение, способ, включающий введение такой композиции пациенту, например, для лечения (которое может включать профилактическое лечение) атеросклеротических заболеваний, применение таких соединений при промышленном производстве композиций для введения, например для лечения атеросклеротического заболевания, и способ производства фармацевтической или ветеринарной композиции, включающий смешивание указанного соединения с фармацевтически приемлемым наполнителем, связующим веществом или носителем и, возможно, другими ингредиентами.

Независимо от того, является ли это соединение полипептидом, пептидом, молекулой нуклеиновой кислоты, низкомолекулярной молекулой или другим фармацевтически применимым соединением, которое можно назначать пациенту, введение предпочтительно осуществлять в «профилактически эффективном количестве» или «терапевтически эффективном количестве» (в зависимости от обстоятельств, хотя профилактика может считаться терапией), которое является достаточным для принесения пользы пациенту. Фактическое вводимое количество, норма и режим введения будут зависеть от природы и серьезности заболевания, которое лечат. Назначение лечения, например решение о дозировке и т.д., находится в пределах компетенции лечащего врача и других практикующих докторов.

Состав можно вводить отдельно или в комбинации с другими курсами лечения, одновременно или последовательно, в зависимости от заболевания, которое лечат.

Фармацевтические композиции, приготовленные согласно настоящему изобретению и для применения в соответствии с настоящим изобретением, могут содержать, помимо активного ингредиента, фармацевтически приемлемый наполнитель, носитель, буфер, стабилизатор или другие компоненты, хорошо известные специалистам в данной области. Такие материалы должны быть нетоксичными и не должны препятствовать эффективному действию активного ингредиента. Точная природа носителя или другого материала будет зависеть от способа введения, который может быть пероральным, или с помощью инъекции, например, кожной, подкожной или внутривенной.

Фармацевтические композиции для перорального введения могут быть в форме таблетки, капсулы, порошка или в жидкой форме. Таблетка может включать твердый носитель, например желатин или адъювант. Жидкие фармацевтические композиции, как правило, содержат такие жидкие носители, как вода, вазелин, животные и растительные масла, минеральное масло или синтетическое масло. В жидкие композиции могут быть включены физиологический раствор, раствор декстрозы или другого сахарида или гликоли, такие как этиленгликоль, пропиленгликоль или полиэтиленгликоль.

Для внутривенной, кожной или подкожной инъекции или инъекции в место поражения активный ингредиент может находиться в форме приемлемого для введения парентеральным способом водного раствора, который не содержит пирогенов и имеет подходящие рН, изотоничность и стабильность. Специалисты, достаточно опытные в данной области, легко могут приготовить подходящие растворы, используя, например, изотонический наполнитель, такой как физиологический раствор для инъекций, инъекционный раствор Рингера или лактированный инъекционный раствор Рингера. При необходимости, могут быть включены консерванты, стабилизаторы, буферные агенты, антиоксиданты и/или другие добавки.

Специалисты в данной области могут варьировать точный формат способов анализа, предлагаемых в настоящем изобретении, используя стандартные навыки и знания.

Различные другие аспекты и варианты реализации данного изобретения будут очевидны специалистам в данной области на основе настоящего описания. Все документы, упомянутые в описании этого настоящего изобретения, полностью включены в него посредством ссылок.

Изобретение охватывает каждую и любую комбинацию и часть комбинации признаков, которые описаны выше.

Некоторые аспекты и варианты реализации настоящего изобретения будут далее проиллюстрированы с помощью примеров и со ссылкой на рисунки и таблицы, описанные ниже.

На фигуре показано сравнение анализа окисления липидов и повреждения антигена СЫашуФа в отношении измерения активности абзимов, специфичных к СЫашуФа.

В табл. 1 показано сравнение измерения активности абзимов против СЫашуФа. как через их способность окислять липиды сыворотки крови, так и через их способность повреждать антиген СЫашуФа.

- 6 011355 иммуноферментный твердофазный анализ.

В табл. 2 показано сравнение измерения активности абзимов, специфичных к СЫатуФа, как через их способность окислять липиды сыворотки, так и через их способность повреждать антиген СЫатуФа. способ диагностики с помощью консерванта мертиолят-йод-формалин.

В табл. 3 показано влияние различных факторов на способность абзимов вызывать перокисление липидов и повреждать антиген (антигены) СЫатуФа риеитошае.

Примеры

Материалы и способы.

Приготовление образцов.

Антитела экстрагировали из запущенных атеросклеротических повреждений человеческой аорты, извлеченной из двух пациентов мужского пола 53 и 64 лет во время операции шунтирования брюшного аортального стеноза в Центре сердечно-сосудистой хирургии Медицинского университета Ростова-наДону, Российская Федерация. После извлечения образцы немедленно помещали в 30% вес./об., раствор №С1 и хранили до исследования при 0-4°С в течение 1 месяца. В контрольных экспериментах было показано, что во время этого периода, активности таких ферментов как трипсин, каталаза, супероксиддисмутаза, глютатионпероксидаза, креатинкиназа и лактатдегидрогеназа, а также уровень фрагментации иммуноглобулина (1дС) и степень перокисления липидов существенно не изменялись.

Фрагменты аорты (приблизительно 200-400 мг влажного веса) разрезали на части, приблизительно по 10 мг каждая, помещали в 5,0 мл фосфатно-буферизированного соляного раствора (ФБСР) с 1% неионным детергентом 1дера1 СА-630 и гомогенизировали с помощью механического гомогенизатора (И11га-Тштах) при полной мощности с 15 мм зондом три раза по 3 с с 20-секундными интервалами для охлаждения. После гомогенизации нерастворимые компоненты отделяли центрифугированием при 5000 д в течение 10 мин и надосадочную жидкость использовали для анализа.

Надосадочную жидкость обрабатывали белком А, прикрепленным к поперечно сшитой 4% гранулированной агарозе при 37°С в течение 30 мин. Затем иммуноглобулиновую фракцию, прикрепленную к гранулам, центрифугировали при 5000 д в течение 10 мин и надосадочную жидкость декантировали. Для того чтобы удалить любые липопротеиды, прикрепленные к осажденным иммуноглобулинам, образцы повторно суспендировали с 10% 1дера1 СА-630. Затем их центрифугировали при 5000 д в течение 10 мин и надосадочную жидкость декантировали.

Для удаления детергента выполняли три дополнительных промывания в избытке фосфатного буфера с центрифугированием в том же режиме. Удаление липопротеина из иммуноглобулиновой фракции подтверждалось отсутствием холестерина в этой фракции.

Инактивация абзимов.

Для инактивации физическими способами один и тот же образец абзимов разделяли на две аликвоты. Одну аликвоту нагревали на водяной бане в течение 30 мин при 56°С. Другую аликвоту не обрабатывали. После обработки первой аликвоты оба образца исследовали одинаковым способом.

Для инактивации химическими способами разбавленный раствор делили на две порции. В одну порцию добавляли ингибитор абзимов. Использовали следующие ингибиторы абзимов: ДМСО 0,1-10%; азид натрия 10^-5-10^-3 М; катехины 10^-6-10^-3 М; кетек 10^-6-10^-3 М; культуру лактобактерий 1 мкМ-1 мМ; аскорбиновую кислоту 10^-4-10^-3 М; ацетилсалициловую кислоту 10^-4-10^-3 М.

Образец сыворотки крови разделяли на две аликвоты и одну аликвоту разбавляли раствором, содержащим ингибитор абзимов, вторую аликвоту разбавляли контрольным раствором. Затем аликвоты исследовали одинаковым способом.

Исследование абзимов с применением иммуноферментного твердофазного анализа (ИФТА).

ИФТА исследования выполняли с использованием материалов и реагентов Мебае, которые применяли в соответствии с инструкциями производителей.

Вкратце, образцы сыворотки крови, взятые у пациентов, обрабатывали, как указано выше. 50 мкл разбавителя для образцов отбирали пипеткой в лунку А1 микротитровального планшета в качестве пустой пробы, а в другие лунки отбирали пипеткой 50 мкл образца для негативного контроля, позитивного контроля и разбавленных образцов от пациентов. Лунки на микропланшете инкубировали во влажной камере в течение 60 мин (±5 мин) при 37°С (±1°С) и затем три раза промывали промывочным буферным раствором 200 мкл на лунку. Затем в каждую лунку добавляли 50 мкл конъюгата и лунки снова инкубировали во влажной камере в течение 60 мин (±5 мин) при 37°С (±1°С) и затем промывали. В каждую лунку добавляли 50 мкл ТМВ-субстрата и лунки на микропланшете инкубировали во влажной камере в течение 30 мин (±2 мин) при 37°С (±1°С). Реакцию останавливали путем добавления в каждую лунку 100 мкл стоп-раствора.

В пределах 15 мин после добавления стоп-раствора снимали фотометрические показания при 450 нм (начало отсчета 620-650 нм).

Для расчета результатов значение оптической плотности пустой пробы (лунка А1) вычитали из всех других значений оптической плотности. Предпочтительно, значение оптической плотности (ОП) пустой пробы было <0,150, среднее значение ОП образца негативного контроля было <0,100 и значение ОП

- 7 011355 пробы позитивного контроля было >0,800. Отсечка = среднее значение ОП пробы негативного контроля + 0,380. Серая зона = отсечка ±10%.

Микроиммунофлюоресценция (МИФ) на лизированных СЫатуФа

Готовили микроскопические препараты с антигенами СЫатуФа басйотаШ, С. ΡδίΙΙαοί и С. Рпеитошае, используя очищенные элементарные тельца этих бактерий. Сыворотки разбавляли до титра 1:1024 в забуференном фосфатом физрастворе (ФБСР) и инкубировали в течение 30 мин при 37°С. После промывания в ФБСР, к пробам добавляли конъюгаты против 1§С. 1дА, 1дМ человека. После 30 мин инкубации при 37°С и промывания ФБСР препарат на предметном стекле накрывали покровным стеклом с гистологической средой.

Для исследования предметных стекол использовали флуоресцентный микроскоп. Положительная реакция отображается появлением звездного неба: флуоресцентных зеленых сигналов на немного красном фоне.

Все образцы оценивали два независимых эксперта.

Анализ результатов ИФТА и МИФ

Если разница сигнала между обработанным и необработанным образцами составляла менее 10% (или не наблюдали увеличения в титрах при МИФ анализе), делали вывод, что активность абзимов была отрицательной.

Если разница сигнала между обработанным и необработанным образцом составляла между 10 и 15% (или наблюдалось увеличение в одном титре при МИФ анализе), делали вывод, что активность абзимов была неясной или находилась в «серой» зоне.

Если разница сигнала между обработанным и необработанным образцом составляла более 15% (или наблюдали увеличение в двух или нескольких титрах при МИФ анализе), делали вывод, что активность абзимов была положительной.

Электронная микроскопия на лизированных СЫатуФа.

Клетки бактерий фиксировали в течение 1 ч в 2,5% растворе глутаральдегида, приготовленном в 0,2 М какодиловом буфере с рН 7,2, а затем в хромово-осмиевом растворе в течение еще 1 ч.

После этого пробы обезвоживали при градиентном увеличении этанола и абсолютного ацетона и заливали Еропа1е 12Т14 - Ата1бйе 502. Приготавливали ультратонкие препараты, используя ИНтаси! Ве1с11ей - 1инд, окрашенный 1% водным раствором уранилацетата и цитрата свинца.

Препараты исследовали и фотографировали, используя электронный микроскоп 1ЕМ 100С х (с увеличением в) 5300-53000 раз.

Денатурирующий электрофорез в полиакриламидном геле (ДЭПГ)

Электрофорез в полиакриламидном геле выполняли с использованием различных коммерчески доступных систем, в соответствии с инструкциями производителей. Например, способ, описанный в ΌΡΟ 033/02; издание 1.0 Рто1еш е1ес1гор1югем5 ищнд ΝΟνΕΧ™ хуЧет (8Ό8-ΡΑ6Ε) использовали со следующими препаратами:

ΝιιΡΑΟΕ™ Βίδ-Ττίδ 4-12% готовые гели (1нуйтоден ΝΡ0321 партия #2063076) (15 лунка); ΝιιΡΑΟΕ™ Βίδ-Ττίδ 4-12% готовые гели (1нуйгоден ΝΡ0321 партия #2072272) (10 лунка); ΝιιΡΑΟΕ™ БЭ8 буфер для проб 4 х (1пуЦгодеп ΝΡ0007 партия #300277); ΝιιΡΑΟΕ™ восстановитель проб х 10 (1нуйгоден ΝΡ0004 партия #300505), ΝιιΡΑΟΕ™ ΜΟΡ8 8Ό8 буфер для электрофореза х 20 (1нуйтоден ΝΡ0001 партия #300704); 8ееВ1ие™ предварительно окрашенные маркеры (1нуйтоден БС5625 партия #§ее11214).

Определение перокисления липидов

Липидное перокисление оценивали по уровню концентрации МДА, которую измеряли спектрофотометрическими способами [Отарет, Н.Н. е! а1 Етее Ваб1с. Вю1. Меб. (1993), 15, 353]. Короче, уровень абзимов в образце определяли следующим образом: образцы сывороток разбавляли 1:1 0.05 М ацетатным буфером с рН 4,0 для получения конечного рН этих проб между 5,6-5,8. 990 мкл разбавленной сыворотки смешивали с 10 мкл живой овечьей вакцины СЫатуб1а (1п1егуе1). Пробы инкубировали всю ночь (12-16 ч) при 37°С. К каждому образцу добавляли 250 мкл 40% трихлоруксусной кислоты и 250 мкл 1мМ 2-тиобарбитуровой кислоты. Все образцы помещали в водяную баню и кипятили в течение 30 мин. Образцы охлаждали и центрифугировали при 3,000 д в течение 10 мин. Надосадочные жидкости собирали и измеряли их оптическую плотность при λ 525 нм для определения концентрации малондиальдегидов (МДА), которые являются продуктами перокисления липидов.

Результаты.

Воздействие абзимов на СЫатуб1а.

Обогащенную абзимами фракцию 1дО атеромы готовили, как описано выше. Воздействие обогащенной абзимами фракции 1дО атеромы на элементарные и ректикулоцитные тела СЫатуб1а риеитошае определяли способами МИФ и электронной спектроскопии.

С применением микроиммунофлюоресцентного анализа (МИФ) наблюдали, что обогащенная абзимами фракция лизирует клетки СЫатуб1а риеитошае. Электронная микроскопия показала, что обогащенная абзимами фракция лизировала как элементарные, так и ретикулярные тела СЫашуб1а риеитошае.

- 8 011355

Анализ обогащенной абзимами фракции 1дС атеромы.

Обогащенную абзимами фракцию 1дС атеромы анализировали способом ДЭПГ вместе с фракцией 1дС. очищенной от сыворотки.

Анализ способом электрофореза показал. что обогащенная абзимами фракция содержала только 1дС и не содержала никаких других определяемых белков.

Анализы абзимов.

Анализы ИФТА и МИФ. оценивающие повреждение антигена СЫатуФа. как описано выше. использовали для измерения активности абзимов. специфичных к СЫатуФа в образцах сыворотки крови пациентов. по сравнению с анализом окисления липидов. Результаты представлены в табл. 1 и 2. соответственно. и суммированы на фигуре.

Было отмечено. что результаты ИФТА (при Е_450нмх 1.000) и МИФ (АЬ Нет) анализов коррелируют с результатами анализов окисления липидов.

Ингибирование абзимов.

Несколько вариантов обработки исследовали на способность инактивировать абзимы способом ИФТА. как описано выше. и на способность ингибировать активность абзимов способом окисления липидов. Результаты представлены в табл. 3.

Было отмечено. что аскорбиновая кислота. ацетилсалициловая кислота. азид натрия. ЭДТК. ЕСТА. катехингаллат. ДМСО. гемоглобин. телитромицин-кетек и лактобактерии ингибируют активность абзимов.

Соединения. которые инактивируют абзимы. можно использовать в способах определения уровней абзимов или в способах терапии. например. для лечения атеросклеротических или сердечно-сосудистых заболеваний.

Таблица 1

Абзим—негативные сыворотки (п = 33), измерение активности, основанное на:	Абзим-положительные сыворотки (п = 33), измерение активности, основанное на:
перокислении	повреждении антигена	перокислении	повреждении
сыворотки, в	СЫатусНа рпеитогнае,	сыворотки, в	антигена СЫатусИа
мкМ МДА	в ИФТА Ε₄5ο™^χ 1,000	мкМ МДА	рпеитогнае, в ИФТА Е₄5_0птх 1,000
0	139	186	550
6	271	128	296
4	136	37	283
9	307	35	207
3	15	131	424
0	0	54	390
0	31	82	564
0	0	77	494
0	8	47	660
0	16	35	322
0	63	27.5	206
0	43	38	345
0	0	43.5	732
3	124	41	584
0	61	65	413
0	100	60	267
0	166	26	555
9	278	19	432
0	8	78.5	241
0	28	62	443
0	0	21	409
0	4	12	124
0	11	23	324
0	11	18	172
0	14	17	298
0	16	97.5	293
0	26	13	237
0	204	43	356
0	6	53	320
0	0	74	1158
10	99	68	376
0	0	24	376
0	0	17	238
1.310.025	58113.7	52.816.17 р < 0.001	388131.4 р< 0.001

- 9 011355

Таблица 2

Пациенты	Активность абзимов в терминах потери способности антитела повреждать антиген СЫатусНа рпеитоп/ае
МИФ титры до инактивации абзимов	МИФ титры после инактивации абзимов
Абзим (+) сыворотки, исследуемые путем анализа МДА, образующихся при окислении липидов
Р577	0	1/128
ОАО	0	1/64
ΥΙΟ	0	1/64
1УМ	0	1/64
ΙΜΚ	0-1/16	1/64
Р580	0	1/64
Р573	0	1/64
Р571	0	1/32
АРР	0	1/16-1/32
УАМ	0	1/16
Р572	0	0
Абзим (-) сыворотки, исследуемые путем анализа МДА, образующихся при окислении липидов
Р585	0	0
ΑΙ8	0	0
ОРМ	0	0
Р567	0	0
ΙΝΚ	0	0-1/16
ЗН	0	0-1/16
ΝΕΩ	0	0
ΰΟΝ	0	0-1/16
КАТ	0	0
ЛМ	0	0

- 10 011355

Таблица 3

Факторы, влияющие на активность абзимов	Подавление способности абзимов вызывать:
Перокисление липидов сыворотки, в МДА анализе	Повреждение антигена СМатуд/а рпеитогнае, в ИФТА
Физические процедуры
Периодическое замораживание-оттаивание	Позитивное	Позитивное
Нагревание при 56’С в течение 30 минут	Позитивное	Позитивное
Лекарства, реагенты или пищевые продукты
1. Ацетилсалициловая кислота	Позитивное	Позитивное
2. Аскорбиновая кислота	Позитивное	Позитивное
3. эдтк	Позитивное	Позитивное
4. ЕСТА	Нет данных	Позитивное
5. Цианид натрия	Негативное	Негативное
6. Азид натрия	Позитивное	Позитивное
7. (+) Катехингаллат	Позитивное	Позитивное
8. β-Каротин	Негативное	Негативное
9. (+) а-токоферол	Негативное	Негативное
10. (+) у-токоферол	Негативное	Негативное
11. Бензойная кислота	Негативное	Негативное
12. ДМСО	Позитивное	Позитивное
13. ϋ-миннитол	Негативное	Негативное
14. ΡΜδ	Негативное	Негативное
15. Гемоглобин	Позитивное	Позитивное
16. Телитромицин, кетек	Позитивное	Позитивное
17. Тетрациклин	Негативное	Негативное
18. Культура лактобактерий	Позитивное	Позитивное
19. Ликопен	Негативное	Негативное

*Реакция антитело-антиген блокируется при понижении рН после добавления этих кислотных соединений.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Способ измерения уровня абзимов в образце, согласно которому вызывают прекращение опосредуемого абзимами окисления липидов в указанном образце и определяют связывание антител с антигеном СЫатуФа в указанном образце, при этом увеличение связывания в обработанном образце по сравнению с контрольными образцами служит показателем присутствия или уровня абзимов в указанном образце.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанный образец представляет собой образец крови, сыворотки или плазмы крови пациента.
3. Способ по п.2, отличающийся тем, что присутствие абзимов в указанном образце указывает на атеросклеротическое заболевание.
4. Способ по любому из пп.1-3, отличающийся тем, что указанный образец подвергают физическому воздействию для подавления опосредуемого абзимами окисления липидов.
5. Способ по п.4, отличающийся тем, что указанный образец нагревают.
6. Способ по п.5, отличающийся тем, что указанный образец нагревают по меньшей мере до 37°С в течение по меньшей мере 5 мин.

- 11 011355
7. Способ по п.6, отличающийся тем, что указанный образец нагревают по меньшей мере до 56°С в течение по меньшей мере 30 мин.
8. Способ по п.4, отличающийся тем, что указанный образец подвергают двум или более циклам замерзания-оттаивания.
9. Способ по п.4, отличающийся тем, что указанный образец выдерживают при температуре от 0 до 4°С по меньшей мере в течение 4 дней.
10. Способ по любому из пп.1-3, отличающийся тем, что указанный образец подвергают химическому воздействию для подавления опосредуемого абзимами окисления липидов.
11. Способ по п.10, отличающийся тем, что указанный образец обрабатывают одним или более инактивирующим реагентом.
12. Способ по п.11, отличающийся тем, что указанный инактивирующий реагент представляет собой вещество, поглощающее гидроксильные радикалы, антиоксидант с низким рН, ловушку, замедлитель или поглотитель электронов.
13. Способ по п.11, отличающийся тем, что указанный инактивирующий реагент представляет собой вещество, поглощающее радикалы гидроксила.
14. Способ по любому из пп.11-13, отличающийся тем, указанный инактивирующий реагент выбирают из группы, включающей ацетилсалициловую кислоту, аскорбиновую кислоту, этилендиаминтетрауксусную кислоту, ЕСТА, (+) катехингаллат, азид натрия, диметилсульфоксид, гемоглобин, телитромицин (кетек) и их аналоги или производные.
15. Способ по п.11, отличающийся тем, что указанный инактивирующий реагент представляет собой бактериальную клетку.
16. Способ по п.15, отличающийся тем, что указанный инактивирующий реагент представляет собой клетку лактобактерии.
17. Способ по любому из пп.1-3, 5-9, 11-13 или 15, 16, отличающийся тем, что степень опосредуемого абзимами окисления липидов в указанном образце определяют после вышеуказанной обработки.
18. Способ по любому из пп.1-3, 5-9, 11-13 или 15, 16, отличающийся тем, что антиген СЫатуФа находится на поверхности клетки СЫатуФа.
19. Способ по любому из пп.1-3, 5-9, 11-13 или 15, 16, отличающийся тем, что связывание антитела с антигеном СЫашуФа определяют с использованием второго антитела.
20. Способ по п.19, отличающийся тем, что указанное второе антитело связывает 1дС.
21. Способ по п.19 или 20, отличающийся тем, что первый член группы, состоящей из (а) второго указанного антитела и (б) антигена или клетки СЫашуФа, метят.
22. Способ по п.21, отличающийся тем, что второй член группы, состоящей из (а) второго антитела и (б) антигена или клетки СЫашуФа, иммобилизуют.
23. Способ скрининга ингибитора абзима, согласно которому определяют связывание антител в образце с антигеном СЫатуФа, обрабатывают указанный образец тестируемым соединением и определяют связывание антител с антигеном СЫатуФа в обработанном образце, при этом увеличение связывания в обработанном образце по сравнению с необработанным образцом указывает на то, что соединение представляет собой ингибитор абзима.
24. Способ по п.23, отличающийся тем, что указанный ингибитор абзима предназначен для лечения атеросклеротического заболевания.
25. Способ по п.23 или 24, отличающийся тем, что указанный образец содержит окисляющие липиды абзимы, специфичные к СЫашуФа.
26. Способ по п.25, отличающийся тем, что указанный образец отбирают у пациента, имеющего атеросклеротическое заболевание.
27. Способ по п.26, отличающийся тем, что указанный образец представляет собой образец сыворотки крови или атеромы.
28. Способ по п.27, отличающийся тем, что указанный образец представляет собой образец, обогащенный 1дС.
29. Способ по п.28, отличающийся тем, что указанный инактивирующий реагент представляет собой антиоксидант с низким рН.
30. Способ по п.29, отличающийся тем, что инактивирующий реагент представляет собой вещество, поглощающее гидроксильные радикалы.
31. Способ по п.30, включающий определение активности абзимов в отношении окисления липидов в присутствии тестируемого соединения.
32. Способ по п.31, включающий идентификацию указанного соединения в качестве ингибитора абзима.