JP2008532007A - サンプル中の脂質酸化性アブザイムの検出 - Google Patents

Abstract

本発明は、脂質酸化性アブザイムがサンプル中でクラミジア抗原に損傷を与え、その損傷度がサンプル中のアブザイムのレベルまたは活性の尺度を提供するという発見に関する。脂質酸化性アブザイムは、たとえば、サンプル中のアブザイム媒介脂質酸化活性を抑止するかまたは消失させることと、対照と比較してクラミジア抗原へのサンプル中の抗体の結合を測定することと、により測定可能または検出可能である。そのような方法は、心臓血管病状の評価に有用でありうる。

Description

本発明は、血液または血清サンプル中の脂質酸化性アブザイムの検出に関する。これは、たとえば、心臓血管病状に関して個体を評価するのに有用である。

脂質酸化は、循環リポタンパク質から高アテローム原性因子への変換を引き起こす主要な過程のうちの１つである［Goto Y. (1982) supra, Halliwell B., and J.M.C. Gutteridge, (1989) supra, Schultz D., and Harrison D.G. (2000) supra］。脂質酸化の主原因は、「アブザイム」として知られる触媒抗体である（WO03/017992、WO03/019196、およびWO03/019198を参照されたい）。アブザイムは、アテローム性動脈硬化症発症の主要な病原性因子であり、アテローム性動脈硬化症関連病状の重要な診断マーカーであるとともに治療的介入の標的でもある。

現在のアブザイムアッセイは、アブザイムによる脂質の酸化を測定することに基づく。脂質酸化の量は、たとえば、脂質酸化生成物マロンジアルデヒド（ＭＤＡ）のレベルから決定される。マロンジアルデヒドがチオバルビツール酸と反応したときに着色生成物を生じるので、ＭＤＡレベルは、適宜、分光測光法により測定可能である［Draper, H.H. et al Free Radic. Biol. Med. (1993) 15, 353］。

しかしながら、脂質酸化生成物の発色では一般に８〜１２時間が必要とされるので、脂質酸化に基づくアブザイムアッセイは時間がかかる。脂質酸化アッセイでは、トリクロロ酢酸のような毒性試薬および多量の患者血清（典型的には２〜３ｍｌ）を使用することも必要とされる。

本発明者は、アブザイムがクラミジア抗原に損傷を与え、この損傷が従来の免疫アッセイ方式を用いた簡単迅速アッセイによるアブザイム活性の測定に利用可能であることに気付いた。

本発明の１つの態様は、
サンプル中のアブザイム媒介脂質酸化活性を抑止するかまたは消失させることと、
クラミジア抗原へのサンプル中の抗体の結合を測定することと、
を含む、サンプル中のアブザイムレベルの測定方法を提供する。

未処理の対照に対するサンプル中の結合の増加は、サンプル中のアブザイムの存在の指標となる。増加の量は、サンプル中のアブザイムのレベルの指標となる。対照に対するサンプル中の結合の増加の不在は、サンプルに由来するアブザイムの不在の指標となる。

アブザイム媒介脂質酸化活性を消失させるように処理されたサンプル中および対照（すなわち未処理のサンプル）中の抗体の結合は、同時にまたは逐次的に測定可能である。

いくつかの実施形態では、個体から採取された初期サンプルを２つ以上の個別サンプルに分割するかまたは等分して、アブザイム媒介脂質酸化を抑止するかまたは消失させるようにそのうちの少なくとも１つを処理し、かつ対照としてそのうちの少なくとも１つを未処理の状態に保持するようにすることが可能である。他の実施形態では、２つ以上の同等なサンプルを個体から取得して、アブザイム媒介脂質酸化を消失させるようにそのうちの少なくとも１つを処理し、かつ対照としてそのうちの少なくとも１つを未処理の状態に保持するようにすることが可能である。

個体の血清中のアブザイムの存在は、個体がアテローム性動脈硬化性障害を有するかもしくは患っていることの指標となりうるか、または個体が今後そのような障害を患う罹患性もしくは危険性の指標となりうる。アブザイムの量、レベル、または活性は、障害の重症度または障害にかかる危険性レベルの指標となりうる。すなわち、抗体の量および／または活性の増加は、障害の重症度または障害にかかる危険性の増大の指標となる。

アテローム性動脈硬化性障害に関して個体を評価する方法は、
個体から得られたサンプル中のアブザイム媒介脂質酸化活性を抑止するかまたは消失させることと、
クラミジア抗原へのサンプル中の抗体の結合を測定することと、
を含みうる。

未処理のサンプルに対する処理サンプル中の結合の増加は、サンプル中のアブザイムのレベルの指標となる。アテローム性動脈硬化性障害の存在、重症度、または個体の罹患性は、サンプル中のアブザイムのレベルから評価可能である。

こうした方法は、たとえば、個体に最適な治療処置を決定するのに有用でありうる。たとえば、アテローム性動脈硬化性病状の指標となる抗脂質アブザイムを有する個体は、病状またはその症状を軽減するための治療処置に付すことが可能である。抗脂質アブザイムのレベルまたは量は、病状の重症度の指標となりうる。また、特定の治療コースが適切か否かを判定するために使用しうる。

サンプルは、好ましくは、個体に由来する血漿または血清を含むサンプル、たとえば、血液、血清、血漿サンプルである。個体に由来する好適なサンプルの取得方法、貯蔵方法、および調製方法は、医業において周知である。血清の試験サンプルは、たとえば、個体から血液を採取して、採取された血液から血清を単離することにより取得可能である。好適な採取法は、細胞物質から血清および血漿を分離する遠心分離を含む。

クラミジア抗原は、クラミジア菌体の任意の免疫原または免疫原性成分、すなわち、哺乳動物においてクラミジア菌体に対する免疫応答を惹起するかまたは惹起しうるクラミジア由来分子、たとえば、クラミジア菌体の表面上の分子またはそのような成分の模倣体もしくは機能的類似体でありうる。言い換えれば、クラミジア抗原は、クラミジア菌体に対して生成された抗体に特異的に結合しうるクラミジア菌体の成分である。本方法に使用するのに好適なクラミジア抗原としては、クラミジアの単離抗原、精製抗原、クローン化抗原、または合成抗原、そのような抗原のフラグメントまたはエピトープ、そのような抗原のグループ、クラミジア菌体ホモジネートの画分（複数可）、全クラミジア菌体、およびこれらのいずれかの組合せが挙げられる。

活性クラミジアエピトープを模倣する抗イディオタイプ抗体またはこうした抗イディオタイプ抗体のフラグメントもまた、本方法においてクラミジア抗原として使用するのに好適でありうる。

クラミジア抗原の好適な調製方法は、当技術分野で周知である。たとえば、ＨＰＬＣのような技術によりクラミジア抗原の単離および／または精製を行うことが可能である。

いくつかの好ましい実施形態では、クラミジア抗原は、クラミジア菌体の表面上に存在しうる。また、本明細書に記載の方法は、クラミジア菌体への処理サンプル中および未処理のサンプル中の抗体の結合を測定することを含みうる。

クラミジア菌体は、クラミジア・シッタシ（Chlamydia psittaci）群に属する種に由来する菌体でありうる。クラミジア・シッタシ（Chlamydia psittaci）群は、クラミジア・シッタシ（Chlamydia psittaci）およびクラミジア・ニューモニエ（Chlamydia pneumoniae）を包含する。いくつかの実施形態では、クラミジア菌体は、ヒツジクラミジア・シッタシ（Chlamydia psittaci）菌体でありうる。凍結乾燥形態の生存ヒツジクラミジア・シッタシ（Chlamydia psittaci）の好適な製剤が、市販されている（Intervet）。

クラミジア抗原へのサンプル中の抗体の結合は、任意の適切な手段またはアッセイ方式により測定可能である。個別のレポーター分子でタグ付けすることは、実施可能な一手段である。たとえば、サンプル中の抗体に結合する第２の抗体またはクラミジア菌体もしくはクラミジア抗原をレポーター分子でタグ付けすることが可能である。レポーター分子は、検出可能な（好ましくは測定可能な）シグナルを直接的もしくは間接的に発生する。必要な場合、レポーター分子の結合は、直接的であっても間接的であってもよく、共有結合（たとえばペプチド結合）であっても非共有結合であってもよい。ペプチド結合による結合は、結合性分子（たとえば抗体）とレポーター分子とをコードする遺伝子融合体の組換え発現の結果として存在しうる。

レポーターとしては、蛍光色素（たとえば、フルオレセイン、ローダミン、フィコエリトリン、およびテキサス・レッド（Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ））、色素原性染料（たとえば、ジアミノベンジジン）、高分子コロイド粒子または微粒子状材料（たとえば、検出可能なシグナルの目視観測、電子的検出、または他の方法による記録を直接的もしくは間接的に行いうる着色した作用剤、磁性もしくは常磁性の作用剤、および生物学的もしくは化学的に活性な作用剤であるラテックスビーズ）が挙げられる。

生物学的もしくは化学的に活性な作用剤としては、発色反応もしくは変色反応または電気的性質の変化を引き起こす反応を触媒する酵素が挙げられる。作用剤は、エネルギー状態間の電子遷移により特徴的な分光吸収または分光放射を生じるような分子的に励起可能なものであってもよい。それらは、バイオセンサーと組み合わせて使用される化学物質を含みうる。ビオチン／アビジンまたはビオチン／ストレプトアビジン検出システムおよびアルカリホスファターゼ検出システムが利用可能である。さらなる例としては、ホースラディッシュペルオキシダーゼおよび化学発光が挙げられる。任意のそのような方法を使用してクラミジア抗原への抗体の結合を測定することが可能である。

個別の抗体−レポーターコンジュゲートにより生成されるシグナルを用いてサンプル（正常サンプルおよび試験サンプル）における適合する抗体結合の定量可能な絶対的もしくは相対的なデータを誘導することが可能である。

本発明に係る方法は、任意の便利な方式で実施可能である。免疫学的アッセイは当技術分野で周知であり、多くの好適な方式が利用可能であり、そうした方式を利用して本方法を実施することが可能である。たとえば、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロッティング、マイクロ免疫蛍光（ＭＩＦ）、ビアコア（Ｂｉａｃｏｒｅ）（登録商標）（Biacore, Upsala, Sweden）、免疫沈降または免疫比濁、凝集（たとえば、赤血球、ラテックス、または他のポリマーに基づく凝集）、免疫組織化学、免疫電気泳動、抗体に基づくアフィニティークロマトグラフィーおよびＩＤＥＩＡ（登録商標）（Boots-Celltech）、ならびに他の酸化還元増幅診断システムが利用可能である。

いくつかの好ましい実施形態では、サンドイッチアッセイ方式が利用可能である。たとえば、サンドイッチアッセイでは、サンプル中の抗クラミジア抗体に結合する捕捉抗体と捕捉抗体に結合された抗クラミジア抗体の存在を検出する標識化されたクラミジア抗原またはクラミジア菌体とが利用可能である。他の選択肢として、サンドイッチアッセイでは、捕捉クラミジア抗原または捕捉クラミジア抗原細胞と抗原に結合された抗クラミジア抗体の存在を検出する標識化抗体とが利用可能である。捕捉抗体、クラミジア抗原、またはクラミジア菌体は、不溶性担体または固体表面に結合させることにより固定可能である。担体は、微粒子形態または固体形態でありうる。また、プレート、試験管、ビーズ、ボール、フィルター、または膜を包含しうる。不溶性担体に抗体を固定する方法は、当業者に公知である。アッセイの非固定化成分（すなわち、溶液中に遊離している成分）、たとえば、抗体、クラミジア抗原、またはクラミジア菌体は、以上に記載したような検出可能な標識を含みうる。たとえば、ＦＩＴＣやローダミンのような発蛍光団、放射性同位体、またはビオチンやジゴキシゲニンのような非同位体標識試薬で抗体を標識することが可能であり、蛍光色素のような任意の望ましい標識にコンジュゲートされたアビジンのような「検出試薬」を用いてビオチン含有成分を検出することが可能である。

結合の測定形式は、本発明の特徴ではなく、当業者であれば、好みや一般的知識に従って好適な形式を選択することが可能である。

アブザイム活性を消失させるかまたは実質的に減少させるがクラミジア抗原へのアブザイムの結合にまったく影響を及ぼさないかまたは実質的にまったく影響を及ぼさない任意の都合のよい物理的もしくは化学的な処理を用いて、アブザイム媒介脂質酸化を抑止するようにサンプルを処理することが可能である。

いくつかの実施形態では、アブザイム媒介脂質酸化を不活性化するようにサンプルを物理的に処理することが可能である。

たとえば、サンプルを加熱することが可能である。脂質酸化活性を不活性化するが特異的抗体の結合性に影響を及ぼさない任意の温度レジメンに従ってサンプルを加熱することが可能である。

好適な温度レジメンは、少なくとも３７℃、少なくとも５６℃、または少なくとも７０℃にサンプルを加熱することを含みうる。抗原へのアブザイムの結合に影響を及ぼすことなくアブザイム媒介脂質酸化を不活性化するかまたは実質的に不活性化するのに十分な時間にわたりサンプルを加熱することが可能である。たとえば、少なくとも１分間、少なくとも５分間、少なくとも１５分間、少なくとも４５分間、少なくとも６０分間、少なくとも８時間、少なくとも１２時間、または少なくとも２４時間にわたりサンプルを加熱することが可能である。

いくつかの実施形態では、少なくとも１分間、少なくとも２分間、少なくとも３分間、少なくとも５分間、または少なくとも１０分間にわたりサンプルを７０℃に加熱することが可能であるか、少なくとも１５分間、少なくとも２０分間、少なくとも３０分間、少なくとも４５分間、または少なくとも６０分間にわたりサンプルを５６℃に加熱することが可能であるか、または、少なくとも８時間、少なくとも１２時間、少なくとも２４時間、または少なくとも４８時間にわたりサンプルを３７℃に加熱することが可能である。

他の物理的処理を用いて特異的抗体の結合性に影響を及ぼすことなく脂質酸化活性を不活性化させることが可能である。

サンプルを反復凍結−解凍サイクル（たとえば、２回以上の凍結後解凍のサイクル）に付すことが可能である。

サンプルを長期保存（たとえば、０℃〜４℃で少なくとも４日間、−１０℃で少なくとも２ヶ月間もしくは少なくとも３ヶ月間、または−２０℃で少なくとも４ヶ月間もしくは少なくとも６ヶ月間）に付すことが可能である。

サンプルを高エネルギー超音波、マイクロ波、ＵＶ、γ線、または任意の他の電磁波に付すことが可能である。

本方法に使用される処理またはレジメンの適合性は、本明細書に記載されるように、処理後のサンプルの脂質酸化およびクラミジア結合活性を測定することにより決定可能である。本方法に使用するのに好適な処理またはレジメンは、アブザイム媒介脂質酸化を不活性化するが抗クラミジア抗体の結合性に影響を及ぼさない。

他の実施形態では、アブザイム媒介脂質酸化を不活性化するようにサンプルを化学的に処理することが可能である。たとえば、１種以上のアブザイム不活性化剤でサンプルを処理することが可能である。

不活性化剤としては、低ｐＨ抗酸化剤（すなわち、ｐＨ５．５で酸化反応を阻害する）、ヒドロキシルラジカルスカベンジャー、「電子捕捉剤」（たとえばクラウンエーテルおよびステロイド）、「電子クッション」（たとえばポリビニル系ポリマー）、「電子シンク」（たとえばユビキノンおよびＱ_８）、銅キレート化剤、ならびにカルシウムキレート化剤が挙げられる。

好適な不活性化剤としては、アスコルビン酸、アセチルサリチル酸、アジ化ナトリウム、カテキン（カテキンガレートを包含する）、ＤＭＳＯ、アジスロマイシン、ヘモグロビン、テリスロマイシンケテック、またはこれらのいずれかの誘導体、類似体、および塩が挙げられうる。

他の実施形態では、不活性化剤は、菌体（たとえば、乳酸桿菌のようなプロバイオティック細菌に由来する菌体）またはそのような菌体の産物でありうる。

アブザイム不活性化処理の有効性は、アブザイム（たとえば、処理前および処理後の患者のアテロームから得られるＩｇＧ）のサンプルの脂質酸化活性を測定することにより決定可能である。脂質酸化を測定する任意の便利な方法を使用することが可能である。脂質酸化を測定する多くの方法が当技術分野で公知であり、サンプル中の脂質酸化活性の減少または抑止を測定するために使用可能である。好適な方法は、たとえば、CRC Handbook of Methods for Oxygen Radical Research, CRC Press, Boca Raton, Florida (1985)、Oxygen Radicals in Biological Systems. Methods in Enzymology, v. 186, Academic Press, London (1990)、Oxygen Radicals in Biological Systems. Methods in Enzymology, v. 234, Academic Press, San Diego, New York, Boston, London (1994)、およびFree Radicals. A practical approach. IRL Press, Oxford, New York, Tokyo (1996)に記載されている。好ましい実施形態では、マロンジアルデヒド（ＭＤＡ）のようなアルデヒド、（脂質）ペルオキシド、共役ジエン、または炭化水素ガスを含みうる脂質酸化生成物の生成（すなわち存在または量）を測定することにより、酸化を測定することが可能である。

補体活性を阻害するかまたは減少させるように個体由来サンプルを処理することが可能である。いくつかの実施形態では、サンプルを補体阻害剤で処理することが可能である。補体活性阻害剤は当技術分野で周知であり、例としては、Ｃａ^２＋キレート化剤（たとえばＥＧＴＡまたはＥＤＴＡ）、チミジンキナーゼ阻害剤（エピガロカテキンガレート（ＥＧＣＧ）のようなカテキンを包含する）、ポリサッカリド（たとえばザイモサン）、ペプチジル分子（たとえば、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ペキセリズマブ、エクリズマブ、コンプスタチン、コブラ毒）、Ｃ１ｑおよび補体カスケードの他の成分または中間体に対する抗体およびこうした抗体のフラグメント、ならびに補体カスケードの機能および性質を模倣する化合物が挙げられる。

他の実施形態では、補体活性を阻害する手順またはレジメンを用いてサンプルを処理することが可能である。好適な手順は、サンプルを加熱すること（たとえば、３０分間にわたり５６℃にもしくは２〜５分間にわたり７０℃に加熱すること）または補体を不活性化する他の温度レジメンを含む。超音波ショック、照射、および／またはレーザー処理のような他の物理的手順を使用することも可能である。

本明細書に記載のアブザイム活性測定法は、アブザイム活性を阻害する化合物をスクリーニングするうえでも有用でありうる。そのような化合物は、アテローム性動脈硬化性病状の治療に有用でありうる。

本発明の他の態様は、
クラミジア抗原へのサンプル中の抗体の結合を測定することと、
サンプルを試験化合物で処理することと、
クラミジア抗原への処理サンプル中の抗体の結合を測定することと、
を含む、アブザイム阻害剤のスクリーニング方法を提供する。

該処理の後のクラミジア抗原への結合の増加は、化合物がアブザイム阻害剤であることの指標となる。

サンプルは、好ましくは、アブザイムを含むサンプルである。好適なサンプルは、アテローム性動脈硬化性障害を有する個体から取得可能であり、たとえば、血清サンプルまたはアテロームもしくはアテローム性動脈硬化性病巣に由来するサンプルでありうる。サンプルは、以下に記載されるように、たとえば、プロテインＡに結合させることにより、ＩｇＧに関して富化させることが可能である。サンプル中のアブザイムの存在は、当技術分野で公知の脂質酸化アッセイを用いて確認可能である。

こうした方法により同定されるアブザイム阻害剤は、アテローム性動脈硬化性障害（心臓血管障害を包含する）、たとえば、アテローム性動脈硬化症、虚血性（冠動脈性）心疾患、心筋虚血（狭心症）、心筋梗塞、動脈瘤疾患、アテローム性末梢血管疾患、大動脈腸骨動脈疾患、慢性重症下肢虚血、内臓虚血、腎動脈疾患、脳血管疾患、脳卒中、アテローム性動脈硬化性網膜症、血栓症、および異常血液凝固、ならびに高血圧症を治療するうえで有用でありうる。そのような病状は、医学的病状または獣医学的病状でありうる。

好適な試験化合物は、低分子化学物質、ペプチド、抗体分子、またはアブザイム活性に及ぼす影響が測定される可能性のある他の分子でありうる。好適な試験化合物は、以下に記載されるように、たとえば、コンビナトリアルケミストリーを用いて、化合物コレクションおよび設計化合物から選択可能である。特定の好適な試験化合物としては、金属キレート化剤（たとえば銅キレート化剤またはカルシウムキレート化剤）、抗酸化剤、特定的には低ｐＨ抗酸化剤（すなわち、ｐＨ５．５で酸化反応を阻害する化合物）、ヒドロキシルラジカルスカベンジャー、「電子捕捉剤」（たとえばクラウンエーテルまたはステロイド）、「電子クッション」（たとえばポリビニル系ポリマー）、ならびに「電子シンク」（たとえばユビキノンおよびＱ_８）が挙げられる。

好適な試験化合物としては、アジ化ナトリウム、カテキン（カテキンガレートを包含する）、ＤＭＳＯ、アジスロマイシン、ヘモグロビン、およびテリスロマイシン（これらは、本方法を用いてアブザイム阻害剤として同定されている）の類似体、塩、および誘導体、ならびに菌体の画分、抽出物、および誘導体、特定的には乳酸桿菌のようなプロバイオティック細菌の培養物が挙げられうる。

コンビナトリアルライブラリー技術（Schultz, JS (1996) Biotechnol. Prog. 12:729-743）は、アブザイムの活性をモジュレートする能力に関して莫大な数のさまざまな物質を試験可能な効率的方法を提供する。以上に記載したようにスクリーニングする前にまたはスクリーニングするとともに、アブザイムに結合する能力に関して試験化合物をスクリーニングすることが可能である。これは、アブザイム活性をモジュレートする実際の能力に関して化合物を試験する前に粗いスクリーニングとして使用可能である。

本発明に係るアッセイ系に添加されうる試験化合物の量は、使用される化合物のタイプにもよるが、通常、試行錯誤により決定されるであろう。典型的には約０．０１〜１００ｎＭ、たとえば０．１〜１０ｎＭの濃度の推定阻害化合物を使用することが可能である。

使用しうる化合物は、薬剤スクリーニングプログラムに使用される天然もしくは合成の化学化合物でありうる。いくつかの特徴付けられた成分もしくは特徴付けされていない成分を含有する植物の抽出物、または乳酸桿菌のようなプロバイオティック細菌の抽出物、画分、もしくは成分を使用することが可能である。

他の候補阻害化合物は、結合の対象となるアブザイムおよび／または脂質抗原の三次元構造のモデリングならびに特定の分子形状、サイズ、および電荷特性を有する潜在的阻害化合物を提供するラショナルドラッグデザインの使用に基づくものでありうる。

本明細書に記載のスクリーニング方法は、試験化合物の存在下でアブザイムの脂質酸化活性を測定することをさらに含みうる。

脂質酸化活性（脂質過酸化活性を包含する）は、宿主脂質（すなわち、サンプルに由来する脂質）、クラミジア菌体のような外来抗原に由来する脂質、または他の供給源に由来する脂質の酸化を測定することにより、決定可能であり、これは、たとえば、アッセイ方法の一部として追加可能である。酸化生成物もしくは副生成物（たとえば共酸化結合レポーター分子）の蓄積が測定可能であるか、または基質（たとえば非修飾脂質）もしくは共基質（たとえば酸素）の消失もしくは消費が測定可能である。脂質過酸化を測定する多くの方法が当技術分野で公知であり、本発明に従って使用するのに好適である。好適な方法は、たとえば、CRC Handbook of Methods for Oxygen Radical Research, CRC Press, Boca Raton, Florida (1985)、Oxygen Radicals in Biological Systems. Methods in Enzymology, v. 186, Academic Press, London (1990)、Oxygen Radicals in Biological Systems. Methods in Enzymology, v. 234, Academic Press, San Diego, New York, Boston, London (1994)、およびFree Radicals. A practical approach. IRL Press, Oxford, New York, Tokyo (1996)に記載されている。

好ましい実施形態では、マロンジアルデヒド（ＭＤＡ）のようなアルデヒド、（脂質）ペルオキシド、共役ジエン、または炭化水素ガスを含む脂質酸化生成物の生成（すなわち存在または量）を測定することにより、酸化を測定することが可能である。脂質酸化生成物は、任意の好適な方法により測定可能である。たとえば、ＨＰＬＣ（Brown, R.K., and Kelly, F.J In: Free Radicals. A practical approach. IRL Press, Oxford, New York, Tokyo (1996), 119-131）、ＵＶ分光（Kinter, M. Quantitative analysis of 4-hydroxy-2-nonenal. Ibid.,133-145）、またはガスクロマトグラフィー質量分析（Morrow, J.D., and Roberts, L.J. F2-Isoprostanes: prostaglandin-like products of lipid peroxidation. Ibid. 147-157）を用いて、脂質過酸化生成物を測定することが可能である。マロンジアルデヒド（ＭＤＡ）の生成は、たとえば、２−チオバルビツール酸（適宜１ｍＭ）との反応の後、適切な波長（たとえば５２５ｎｍ）で吸光度を測定することにより、測定可能である。

１種以上の一次スクリーニング（たとえば無細胞系でのスクリーニング）によりアブザイム活性を阻害する能力を有すると同定された作用剤を、１種以上の二次スクリーニングによりさらに評価することが可能である。二次スクリーニングは、血管系でアブザイム活性に関してまたは動物モデルなどでアブザイムの生物学的機能に関して試験することを含みうる。二次スクリーニングにより評価されうる好適な生物学的機能としては、アテローム性動脈硬化性病巣のサイズもしくは数の減少またはアテローム性動脈硬化性障害の他の症状もしくは影響（たとえば血圧）の減少が挙げられる。

本発明に係る方法は、アブザイム活性を阻害する作用剤として試験化合物を同定することを含みうる。

本方法を用いてアブザイム阻害剤として同定された化合物の例としては、アスコルビン酸、アセチルサリチル酸、アジ化ナトリウム、（＋）カテキンガレート、ＤＭＳ、ヘモグロビン、テリスロマイシン−ケテック、乳酸桿菌菌体、および表３に示される他の作用剤が挙げられる。

同定された化合物は、単離もしくは精製および／または合成もしくは製造が可能である。

場合により、本明細書に記載されるようにアブザイム阻害剤として同定された化合物は、活性が最適化されるようにまたは個体に投与したときに半減期の増大や副作用の減少のような他の有益な特性が提供されるように修飾可能である。リード化合物を修飾する技術およびストラテジーは、当技術分野で周知である。

本明細書に記載の同定されたアブザイム阻害剤は、以下に記載されるような製薬上許容される賦形剤を有する組成物（たとえば、医薬剤、医薬組成物、または薬剤）の形態に製剤化可能である。そのような組成物は、個体に投与可能である。

本発明は、以上に記載したアッセイ方法を用いてアブザイム阻害剤として同定された化合物と、そのような化合物を含む医薬組成物もしくは獣医薬組成物、医薬剤、薬剤、または他の組成物と、アテローム性動脈硬化性病状の治療（予防的治療を包含する）などのためにそのような組成物を患者に投与することを含む方法と、アテローム性動脈硬化性病状の治療などのために投与される組成物の製造におけるそのような化合物の使用と、そのような化合物を製薬上許容される賦形剤、媒体、または担体および場合により他の成分と混合することを含む、医薬組成物または獣医薬組成物の製造方法と、を包含する。

ポリペプチド、ペプチド、核酸分子、小分子、または個体に与えられる他の製薬上有用な化合物のいずれであるかにかかわらず、投与は、好ましくは、「予防上有効な量」または「治療上有効な量」（場合にもよるが、予防が治療とみなされることもある）（これは個体に有益であることが認められる程度に十分な量である）で行われる。実際の投与量ならびに投与の速度および継続期間は、治療される対象の性質および重症度に依存するであろう。治療の処方（たとえば、投与量などに関する決定）は、一般医および他の医師の責任の範囲内にある。

組成物は、治療される病状に応じて、単独で投与するかまたは他の治療と併用して同時にもしくは逐次的に投与することが可能である。

本発明に係る医薬組成物および本発明に従って使用される医薬組成物は、活性成分に加えて、製薬上許容される賦形剤、担体、緩衝剤、安定化剤、または当業者に周知である他の材料を含みうる。そのような材料は、無毒でなければならず、しかも活性成分の効力を妨害するものであってはならない。担体または他の材料の正確な性質は、投与経路に依存するであろう。投与経路は、経口経路、または皮膚注射、皮下注射、もしくは静脈内注射などの注射による経路でありうる。

経口投与に供される医薬組成物は、錠剤、カプセル剤、粉末剤、または液体製剤の形態をとりうる。錠剤は、ゼラチンのような固体担体または佐剤を含みうる。液体医薬組成物は、一般的には、水、石油、動物油または植物油、鉱油または合成油のような液体担体を含む。生理食塩水、デキストロース溶液もしくは他のサッカリド溶液、またはグリコール（たとえば、エチレングリコール、プロピレングリコール、もしくはポリエチレングリコール）を組み込むことも可能である。

静脈内注射、皮内注射、もしくは皮下注射、または罹患部位への注射に供される場合、活性成分は、発熱原を含まずしかも好適なｐＨ、等張性、および安定性を有する非経口的に許容しうる水溶液剤の形態をとるであろう。当業者であれば、たとえば、食塩注射液、リンゲル注射液、または乳酸加リンゲル注射液のような等張性媒体を用いて、好適な溶液剤を調製することが十分に可能である。所要により、保存剤、安定化剤、緩衝剤、抗酸化剤、および／または他の添加剤を組み込むことが可能である。

当業者であれば、通常の技能および知識を用いて、本発明に係るアッセイ方法の正確な方式に変更を加えることが可能である。

本開示に照らせば、本発明の種々のさらなる態様および実施形態は、当業者には自明であろう。本明細書に挙げた文献はすべて、それらの全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする。
本発明は、以上に記載した特徴のあらゆる組合せおよび部分的組合せを包含する。

次に、本発明の特定の態様および実施形態について、実施例を介してならびに以下に記載の図および表を参照しながら説明する。

図１は、脂質酸化アッセイと抗クラミジアアブザイムの活性を測定するクラミジア抗原損傷アッセイとの比較を示している。

表１は、血清脂質を酸化する能力を介する場合またはクラミジア抗原に損傷を与える能力を介する場合について抗クラミジアアブザイムの活性の測定（ＥＬＩＳＡアッセイ）の比較を示している。

表２は、血清脂質を酸化する能力を介する場合またはクラミジア抗原に損傷を与える能力を介する場合について抗クラミジアアブザイムの活性の測定（ＭＩＦアッセイ）の比較を示している。

表３は、脂質過酸化を引き起こすアブザイムの能力およびクラミジア・ニューモニエ（Chlamydia pneumoniae）抗原に損傷を与えるアブザイムの能力に及ぼすさまざまな因子の影響を示している。

材料および方法
サンプルの調製
The Centre of Cardio-Vascular Surgery of the Medical University of Rostov-na-Donu, Russian Federationにおいて腹部大動脈狭窄のバイパス手術中に５３歳および６４歳の２名の男性患者から摘出されたヒト大動脈の進行アテローム性動脈硬化性病巣から抗体を取り出した。回収後、これらのサンプルをただちにＮａＣｌの３０％ｗ／ｖ溶液に入れ、検査前１ヶ月間にわたり０〜４℃で貯蔵した。対照実験において、この期間中、トリプシン、カタラーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、グルタチオンペルオキシダーゼ、クレアチンキナーゼ、および乳酸デヒドロゲナーゼのような酵素の活性は、免疫グロブリン（ＩｇＧ）フラグメント化レベルおよび脂質過酸化度と共に、有意に変化することはないことが明らかにされた。

大動脈片（約２００〜４００ｍｇの湿潤重量）をそれぞれ約１０ｍｇの小片にカットし、１％の非イオン性界面活性剤イゲパル（Ｉｇｅｐａｌ）ＣＡ−６３０を有する５．０ｍｌのＰＢＳ中に入れ、そして２０秒間の冷却時間をはさんでそれぞれ３秒間かけて３回にわたり１５ｍｍプローブを用いて最大出力で機械的ホモジナイザー（ウルトラ−タラックス（Ｕｌｔｒａ−Ｔｕｒｒａｘ））によりホモジナイズした。ホモジナイズした後、１０分間かけて５０００ｇで遠心分離することにより不溶性成分を分離し、そして上清を分析に使用した。

架橋された４％のビーズ状アガロースに結合されたプロテインＡを用いて、上清を３７℃で３０分間処理した。次に、ビーズに結合された免疫グロブリン画分を５０００ｇで１０分間遠心沈降させ、そして上清をデカントした。沈降免疫グロブリンに結合されたいかなるリポタンパク質をも除去すべく、１０％のイゲパル（Ｉｇｅｐａｌ）ＣＡ−６３０を用いてサンプルを再懸濁させた。次に、それを５０００ｇで１０分間遠心分離し、そして上清をデカントした。

界面活性剤を除去すべく、同一のレジーム下で遠心分離を併用して、過剰のリン酸緩衝液中で３回の後続洗浄処理を行った。この画分中のコレステロールの不在により、免疫グロブリン画分からのリポタンパク質の除去を確認した。

アブザイムの不活性化
物理的不活性化を行うために、同一のアブザイムサンプルを２つのアリコートに分割した。一方のアリコートを水浴中５６℃で３０分間加熱した。他方のアリコートは処理しなかった。第１のアリコートを処理した後、両サンプルを同一の方式で試験した。

化学的不活性化を行うために、希釈溶液を２つの部分に分割した。一方の部分には、アブザイム阻害剤を添加した。次のアブザイム阻害剤を使用した。ＤＭＳＯ、０．１〜１０％；アジ化ナトリウム、１０^−５〜１０^−３Ｍ；カテキン、１０^−６〜１０^−３Ｍ；ケテック、１０^−６〜１０^−３Ｍ；乳酸桿菌培養物、１μＭ〜１ｍＭ；アスコルビン酸、１０^−４〜１０^−３Ｍ；アセチルサリチル酸、１０^−４〜１０^−３Ｍ。

血清サンプルを２つのアリコートに分割し、アブザイム阻害剤を含有する溶液で一方のアリコートを希釈し、対照溶液で第２のアリコートを希釈した。次に、アリコートを同一の方式で試験した。

ＥＬＩＳＡに基づくアブザイムアッセイ
Medac社製の材料および試薬を用いてＥＬＩＳＡアッセイを行った。製造業者の使用説明書に従ってそれらを使用した。

簡潔に述べると、患者に由来する血清サンプルを以上に記載したように処理した。５０μｌのサンプル希釈剤をブランクとしてマイクロタイターウェルＡ１にピペットで添加し、そして５０μｌの陰性対照、陽性対照、および希釈された患者のサンプルを他のマイクロタイターウェルにピペットで添加した。マイクロプレートウェルを加湿チャンバー内３７℃（±１℃）で６０分間（±５分間）インキュベートし、次に、１ウェルあたり２００μｌの洗浄緩衝液で３回洗浄した。次に、５０μｌのコンジュゲートを各ウェルに添加し、そしてマイクロプレートウェルを再び加湿チャンバー内３７℃（±１℃）で６０分間（±５分間）インキュベートし、その後、洗浄した。５０μｌのＴＭＢ基質を各ウェルに添加し、そしてマイクロプレートウェルを加湿チャンバー内３７℃（±１℃）で３０分間（±２分間）インキュベートした。各ウェルに１００μｌの停止液を添加することにより、反応を停止させた。

停止液の添加後１５分間以内に、４５０ｎｍ（参照波長６２０〜６５０ｎｍ）で光度の読取りを行った。

結果を算出するために、ブランク（ウェルＡ１）のＯＤ値をすべての他のＯＤ値から差し引いた。好ましくは、ブランクのＯＤ値は＜０．１５０であり、陰性対照の平均ＯＤ値は＜０．１００であり、そして陽性対照のＯＤ値は＞０．８００であった。カットオフ値＝陰性対照の平均ＯＤ値＋０．３８０。グレーゾーン＝カットオフ値±１０％
クラミジアの溶解に基づくマイクロ免疫蛍光（ＭＩＦ）
細菌の精製基本小体を適用することにより、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）、Ｃ．シッタシ（C. psittaci）、およびＣ．ニューモニエ（C. pneumoniae）の抗原を有するスライドを作製した。血清をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中に１：１０２４の力価に希釈し、３７℃で３０分間インキュベートした。ＰＢＳ中で洗浄した後、抗ヒトＩｇＧコンジュゲート、抗ヒトＩｇＡコンジュゲート、抗ヒトＩｇＭコンジュゲートをサンプルに添加した。３７℃で３０分間インキュベートしかつＰＢＳ中で洗浄した後、封入剤を用いてスライドをカバースリップでカバーした。

スライドの読取りを行うために、蛍光顕微鏡を使用した。陽性反応は、わずかに赤色のバックグラウンド上に蛍光の緑色スポットを生じる「星空」像により表される。
利害関係のない２名の専門家が、すべてのサンプルを評価した。

ＥＬＩＳＡおよびＭＩＦの結果の分析
処理サンプルと未処理のサンプルと間に１０％未満のシグナル差が存在する場合（またはＭＩＦにおいて力価の増加がみられない場合）、アブザイム活性は陰性であると結論付けた。

処理サンプルと未処理のサンプルと間に１０〜１５％のシグナル差が存在する場合（またはＭＩＦにおいて１力価の増加がみられる場合）、アブザイムの活性は不明瞭であるかまたは「グレー」ゾーン内に存在すると結論付けた。

処理サンプルと未処理のサンプルと間に１５％超のシグナル差が存在する場合（またはＭＩＦにおいて２力価以上の増加がみられる場合）、アブザイム活性は陽性であると結論付けた。

クラミジアの溶解に基づく電子顕微鏡観察
０．２Ｍカコジル酸緩衝液ｐＨ７．２を用いて作製されたグルタルアルデヒドの２．５％溶液中で１時間かけて菌体を固定し、その後、さらに１時間かけてクロム−オスミウム液中で固定した。

その後、エタノールおよび無水アセトンのグラジェント増加を行ってサンプルを脱水し、そしてエポネート（Ｅｐｏｎａｔｅ）１２Ｔ１４−アラルダイト（Ａｒａｌｄｉｔｅ）５０２中に包埋した。ウルトラカット（Ｕｌｔｒａｃｕｔ）ライヘルト・ユング（Reichert-Jung）を用いて超薄スライドを作製し、酢酸ウラニルおよびクエン酸鉛の１％水溶液により染色した。

（倍率）５３００〜５３０００倍の電子顕微鏡ＪＥＭ１００Сを用いて、スライドを検査し写真撮影した。

ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
種々の市販のシステムを用いて製造業者の使用説明書に従ってポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。たとえば、DPO 033/02; Issue 1.0 ”Protein electrophoresis using NOVEX^TM system (SDS-PAGE)”に記載の方法を次の試薬と共に使用した：ニューページ（ＮｕＰＡＧＥ）^ＴＭビス−トリス４〜１２％プレキャストゲル（Invitrogen NP0321 batch #2063076）（１５ウェル）；ニューページ（ＮｕＰＡＧＥ）^ＴＭビス−トリス４〜１２％プレキャストゲル（Invitrogen NP0321 batch #2072272）（１０ウェル）；ニューページ（ＮｕＰＡＧＥ）^ＴＭ ＬＤＳサンプル緩衝液４×（Invitrogen NP0007 batch #300277）；ニューページ（ＮｕＰＡＧＥ）^ＴＭサンプル還元剤×１０（Invitrogen NP0004 batch #300505）；ニューページ（ＮｕＰＡＧＥ）^ＴＭ ＭＯＰＳ ＳＤＳ泳動緩衝液×２０（Invitrogen NP0001 batch #300704）；シーブルー（ＳｅｅＢｌｕｅ）^ＴＭプレ染色マーカー（Invitrogen LC5625 batch #see11214）。

脂質過酸化の測定
分光光度法により測定されるＭＤＡ濃度のレベルとして脂質過酸化を評価した［Draper, H.H. et al Free Radic. Biol. Med. (1993) 15, 353］。簡潔に述べると、サンプル中のアブザイムのレベルを次のように測定した。すなわち、サンプルの最終ｐＨが５．６〜５．８になるように血清サンプルを０．０５Ｍ酢酸緩衝液ｐＨ４．０で１：１に希釈した。９９０ ｌの希釈された血清を１０μｌの市販のヒツジクラミジア生ワクチン（Intervet）と混合した。サンプルを３７℃で一晩（１２〜１６時間）インキュベートした。２５０μｌの４０％トリクロロ酢酸および２５０μｌの１ｍＭ ２−チオバルビツール酸を各サンプルに添加した。すべてのサンプルを水浴中に入れ、３０分間煮沸した。サンプルを冷却し、３，０００ｇで１０分間遠心分離した。上清を捕集し、その吸収をλ５２５ｎｍで測定することにより、脂質過酸化の生成物であるマロンジアルデヒド（ＭＤＡ）の濃度を決定した。

結果
クラミジアに及ぼすアブザイムの作用
アテロームＩｇＧのアブザイム富化画分を以上に記載したように調製した。クラミジア・ニューモニエ（Chlamydia pneumoniae）の基本小体および網様体（recticulocyte bodies）に及ぼすアテロームＩｇＧのアブザイム富化画分の作用を電子顕微鏡観察により調べた。

アブザイム富化画分は、マイクロ免疫蛍光アッセイ（ＭＩＦ）においてクラミジア・ニューモニエ（Chlamydia pneumoniae）菌体を溶解することが確認された。電子顕微鏡観察では、アブザイム富化画分は、クラミジア・ニューモニエ（Chlamydia pneumoniae）の基本小体および網様体の両方を溶解することが明らかにされた。

アテロームＩｇＧのアブザイム富化画分の分析
アテロームＩｇＧのアブザイム富化画分を血清から精製されたＩｇＧ画分と共にＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。

電気泳動分析から、アブザイム富化画分は、ＩｇＧだけを含有し、他の検出可能なタンパク質をなんら含有しないことが明らかにされた。

アブザイムアッセイ
以上に記載したようなクラミジア抗原損傷に関するＥＬＩＳＡアッセイおよびＭＩＦアッセイを用いて、脂質酸化アッセイと比較して患者血清サンプルの抗クラミジアアブザイム活性を測定した。結果は、それぞれ表１および２に示され、図１にまとめられている。

ＥＬＩＳＡ（Ｅ_{４５０ｎｍ}×１，０００単位）アッセイおよびＭＩＦ（抗体価）アッセイの結果は、脂質過酸化アッセイの結果と相関することが観測により確認された。

アブザイム阻害
アブザイムを不活性化する能力に関して上記のＥＬＩＳＡにより、またアブザイム活性を阻害する能力に関して脂質酸化アッセイにより、一連の処理剤を試験した。結果を表３に示す。

アスコルビン酸、アセチルサリチル酸、アジ化ナトリウム、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、カテキンガレート、ＤＭＳＯ、ヘモグロビン、テリスロマイシンケテック、および乳酸桿菌はすべて、アブザイム活性を阻害することが観測により確認された。

アブザイムを不活性化する化合物は、アブザイムレベルを測定する方法に有用でありうるか、または治療（たとえば、アテローム性動脈硬化性病状または心臓血管病状の治療）に有用でありうる。

図１は、脂質酸化アッセイと抗クラミジアアブザイムの活性を測定するクラミジア抗原損傷アッセイとの比較を示している。

Claims (32)

1. サンプル中のアブザイムレベルを測定する方法であって、
   該サンプル中のアブザイム媒介脂質酸化を消失させることと、
   クラミジア抗原への該サンプル中の抗体の結合を測定することと、
   を含み、
   対照に対する処理サンプル中の結合の増加がサンプル中のアブザイムの存在またはレベルの指標となる、
   上記方法。
2. 前記サンプルが、個体から得られた血液、血清、または血漿サンプルである、請求項１に記載の方法。
3. 前記サンプル中のアブザイムの存在がアテローム性動脈硬化性病状の指標となる、請求項２に記載の方法。
4. 前記サンプルが、アブザイム媒介脂質酸化を抑止するように物理的に処理される、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
5. 前記サンプルが加熱される、請求項４に記載の方法。
6. 前記サンプルが少なくとも５分間にわたり少なくとも３７℃に加熱される、請求項５に記載の方法。
7. 前記サンプルが少なくとも３０分間にわたり少なくとも５６℃に加熱される、請求項６に記載の方法。
8. 前記サンプルが２回以上の凍結解凍サイクルに付される、請求項４に記載の方法。
9. 前記サンプルが少なくとも４日間にわたり０℃〜４℃に保持される、請求項４に記載の方法。
10. 前記サンプルが、アブザイム媒介脂質酸化を抑止するように化学的に処理される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
11. 前記サンプルが１種以上の不活性化剤で処理される、請求項１０に記載の方法。
12. 前記不活性化剤が、ヒドロキシルラジカルスカベンジャー、低ｐＨ抗酸化剤、電子捕捉剤、電子クッション、または電子シンクである、請求項１１に記載の方法。
13. 前記不活性化剤がヒドロキシルラジカルスカベンジャーである、請求項１１に記載の方法。
14. 前記不活性化剤が、アセチルサリチル酸、アスコルビン酸、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、（＋）カテキンガレート、アジ化ナトリウム、ＤＭＳＯ、ヘモグロビン、テリスロマイシンケテック、およびそれらの類似体または誘導体よりなる群から選択される、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
15. 前記不活性化剤が菌体である、請求項１１に記載の方法。
16. 前記不活性化剤が乳酸桿菌菌体である、請求項１５に記載の方法。
17. 前記サンプル中のアブザイム媒介脂質酸化の量が前記処理の後で測定される、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
18. 前記クラミジア抗原がクラミジア菌体の表面上に存在するものである、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
19. 前記クラミジア抗原への抗体の結合が、第２の抗体を用いて測定される、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
20. 前記第２の抗体がＩｇＧに結合する、請求項１９に記載の方法。
21. 前記第２の抗体と前記クラミジア抗原またはクラミジア菌体とよりなる群の第１のメンバーが標識されている、請求項１９または請求項２０に記載の方法。
22. 前記第２の抗体と前記クラミジア抗原またはクラミジア菌体とよりなる群の第２のメンバーが固定されている、請求項２１に記載の方法。
23. アブザイム阻害剤をスクリーニングする方法であって、
    クラミジア抗原へのサンプル中の抗体の結合を測定することと、
    サンプルを試験化合物で処理することと、
    クラミジア抗原への処理サンプル中の抗体の結合を測定することと、
    を含み、
    未処理のサンプルに対する処理サンプルの結合の増加が、該化合物がアブザイム阻害剤であることの指標となる、
    上記方法。
24. 前記アブザイム阻害剤が、アテローム性動脈硬化性障害を治療するためのものである、請求項２３に記載の方法。
25. 前記サンプルが脂質酸化性抗クラミジアアブザイムを含む、請求項２３または請求項２４に記載の方法。
26. 前記サンプルが、アテローム性動脈硬化性障害を有する個体に由来する、請求項２５に記載の方法。
27. 前記サンプルが血清またはアテロームサンプルである、請求項２６に記載の方法。
28. 前記サンプルがＩｇＧ富化サンプルである、請求項２３〜２７のいずれか１項に記載の方法。
29. 前記不活性化剤が低ｐＨ抗酸化剤である、請求項２３〜２８のいずれか１項に記載の方法。
30. 前記不活性化剤がヒドロキシルラジカルスカベンジャーである、請求項２３〜２８のいずれか１項に記載の方法。
31. 前記試験化合物の存在下でアブザイムの脂質酸化活性を測定することを含む、請求項２３〜３０のいずれか１項に記載の方法。
32. 前記化合物をアブザイム阻害剤として同定することを含む、請求項２３〜３１のいずれか１項に記載の方法。

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