Nothing Special   »   [go: up one dir, main page]

EA008619B1 - Применение неограниченных соматических стволовых клеток (ussc) для получения лекарственного средства - Google Patents

Применение неограниченных соматических стволовых клеток (ussc) для получения лекарственного средства Download PDF

Info

Publication number
EA008619B1
EA008619B1 EA200300536A EA200300536A EA008619B1 EA 008619 B1 EA008619 B1 EA 008619B1 EA 200300536 A EA200300536 A EA 200300536A EA 200300536 A EA200300536 A EA 200300536A EA 008619 B1 EA008619 B1 EA 008619B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
cells
artificial sequence
stem cells
disease
gene
Prior art date
Application number
EA200300536A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200300536A1 (ru
Inventor
Петер Вернет
Original Assignee
Коурион Терапьютикс Аг
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Коурион Терапьютикс Аг filed Critical Коурион Терапьютикс Аг
Publication of EA200300536A1 publication Critical patent/EA200300536A1/ru
Publication of EA008619B1 publication Critical patent/EA008619B1/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/48—Reproductive organs
    • A61K35/54—Ovaries; Ova; Ovules; Embryos; Foetal cells; Germ cells
    • A61K35/545—Embryonic stem cells; Pluripotent stem cells; Induced pluripotent stem cells; Uncharacterised stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/48—Reproductive organs
    • A61K35/50—Placenta; Placental stem cells; Amniotic fluid; Amnion; Amniotic stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/48—Reproductive organs
    • A61K35/51—Umbilical cord; Umbilical cord blood; Umbilical stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P41/00—Drugs used in surgical methods, e.g. surgery adjuvants for preventing adhesion or for vitreum substitution
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0607—Non-embryonic pluripotent stem cells, e.g. MASC

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Pregnancy & Childbirth (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Surgery (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Endocrinology (AREA)

Abstract

Раскрыто применение неограниченных соматических стволовых клеток, которые могут быть амплифицированы in vitro до больших количеств, достаточных для применений в медицине, такой как регенеративная терапия. Описаны протоколы инициации и поддержания, а также размножения ex vivo таких стволовых клеток из пуповинной крови. Более конкретно, раскрыто применение стволовых клеток по изобретению для получения лекарственного средства для лечения сосудистого заболевания, заболевания сердечной мышцы или гладкой мышцы, заболевания печени, заболевания поджелудочной железы, в частности диабета типа I, заболевания нервной ткани, в частности болезни Паркинсона, или гематологического заболевания.

Description

Настоящее изобретение относится к соматической стволовой клетке, лекарственному средству, включающему стволовую клетку по изобретению, и к применению соматической стволовой клетки по изобретению для получения лекарственного средства.
Хотя стволовые клетки постоянно самозамещаются, они, в основном, характеризуются медленным циклом. Обычно полагают, что данные клетки дают начало временной размножающейся клеточной популяции с ограниченной способностью к самовозобновлению для увеличения числа дифференцированных клеток. До настоящего времени существовала проблема локализации стволовых клеток в организме взрослого человека, и поэтому применяется некоторое количество суррогатных маркеров (например, тесты образования колоний для гемопоэтического ростка), описанных в существующей литературе.
Некоторые патенты США, например патенты США 5486359; 5591625; 5736396; 5811094; 5827740; 5837539; 5908782; 5908784; 5942225; 5965436; 6010696; 6022540; 6087113; 5858390; 5804446; 5846796; 5654186; 6054121; 5827735; 5906934, имеют отношение к мезенхимальным стволовым клеткам (М8С), которые могут дифференцироваться в некоторые клетки-предшественники, например в мышечные клетки-предшественники (прогениторные клетки), клетки-предшественники соединительной ткани или овальные клетки. Мышечные клетки-предшественники далее дифференцируются в сердечные, скелетные, а также гладкомышечные клетки, в то время как клетки-предшественники соединительной ткани могут дифференцироваться в костные, хрящевые, а также жировые клетки. Овальные клетки могут дифференцироваться в клетки печени или поджелудочной железы (Стошре с1 а1., 2001).
Наличие в пуповинной крови негемопоэтических стволовых клеток пока является предметом дискуссии (Мауап е1 а1., 2000, МагексЫ е1 а1., 2001). Заявка на патент Германии ΌΕ 198 03 267 А1 является первым источником, в котором описаны предшественники остеобластов и образование кости из пуповинной крови человека.
Однако применение данных мезенхимальных клеток-предшественников предшествующего уровня техники часто ограничено, поскольку они слишком далеко зашли по пути развития, чтобы представлять собой инструмент, который может использоваться для образования органов или тканей. Другими словами, кажется, что они уже слишком детерминированы и специализированы для того, чтобы дать функциональный регенерирующийся орган или ткань.
Поэтому целью данного изобретения является предоставление стволовой клетки, которая способна дифференцироваться в разные клетки-предшественники, такие как мезенхимальные клетки, нервные клетки, клетки крови или эндотелиальные клетки.
Другой целью изобретения является предоставление стволовой клетки, которая не имеет недостатков эмбриональных стволовых клеток.
Было обнаружено, что впервые идентифицированная соматическая стволовая клетка способна удовлетворять сформулированным выше целям. Соматическая стволовая клетка по изобретению получена из пуповинной крови человека, крови плаценты и/или крови новорожденного ребенка, причем указанная соматическая клетка отличается от мезенхимальных стволовых клеток или клеток-предшественников, стволовых клеток или клеток-предшественников гемопоэтического ростка, нервных стволовых клеток или клеток-предшественников или эндотелиальных стволовых клеток или печеночных клетокпредшественников, но способна дифференцироваться в них. Данные клетки представляют собой предшественники гемопоэтического ростка, мезенхимальные стволовые клетки, а также нервные стволовые клетки. Данные уникальные многофункциональные возможности и технология культивирования данных неограниченных соматических стволовых клеток (И88С), полученных из пуповинной крови (СВ), будь то такие соматические стволовые клетки или клетки, детерминированные по различным протоколам дифференцировки, дают возможность для точной характеристики, стандартизации и применения в целях продукции и проведения терапии стволовыми клетками в рамках регенеративной медицины.
На фиг. 1 показана микрофотография первичной культуры И88С с клетками, высеянными с низкой плотностью.
На фиг. 2 показана микрофотография сливающейся культуры И88С.
На фиг. 3 показан ЕАС8-анализ антигена СБ45 по ходу культивирования ίη νίίτο.
На фиг. 4 показан ЕАС8-анализ эмбрионального маркера 88ЕА4.
На фиг. 5 показан ЕАС8-анализ НЬА класса I (А, В, С), НЬА ΌΚ и СБ14.
На фиг. 6 показана кинетика ЕАС8 поверхностного маркера СБ34.
На фиг. 7 показана микрофотография клеток И88С после нейрональной индукции.
На фиг. 8 показано, что И88С по изобретению экспрессируют маркер нервного ствола нестин путем иммунного окрашивания антителами против нестина.
На фиг. 9 показаны И88С, генерирующие клетки нейронального ростка.
На фиг. 10 показаны И88С, генерирующие клетки глиального ростка.
На фиг. 11 показано образование минерализованного узелка после остеогенной индукции и после окрашивания ализарином красным (В).
На фиг. 12 показано окрашивание А1с1ап В1ие сферической культуры, происходящей из И88С.
На фиг. 13 показано окрашивание коллагена II (зеленое) в культурах И88С после хондрогенной дифференцировки.
На фиг. 14 показана адипогенная дифференцировка культур И88С, продемонстрированная окраши
- 1 008619 ванием Θίΐ Кей.
На фиг. 15 показаны микрофотографии культур И88С до и после миогенной дифференцировки.
На фиг. 16 показан иммуноцитохимический анализ медленно действующего миозина после обработки азацитидином.
На фиг. 17 показан фенотип овальных клеток, происходящих от И88С.
На фиг. 18 показаны выживание и интеграция культур И88С после инъекции в паренхиму печени мыши 8СГО.
Соматические стволовые клетки по изобретению могут быть выделены и очищены различными способами, включающими стадии выделения в градиенте плотности, культуры прилипающих клеток и субкультуры с применением факторов роста, как описано в примере 1. После установления слияния клеточного слоя процессы выделения полученных клеток по изобретению контролировали традиционными морфологическими методоми (фибробластоидная морфология), а для фенотипического анализа использовали антитела против поверхностных антигенов СЭ13 (положительный), СЭ14 (отрицательный), СО45 (отрицательный) и СО29 (положительный; см. пример 2).
Соматическая стволовая клетка по изобретению не взаимодействует с маркерами, специфичными для гемопоэтического ростка, такими как СО45, и, следовательно, отличается от гемопоэтических стволовых клеток, которые также могут выделяться из пуповинной крови. СО 14 представляет собой еще один поверхностный антиген, который не может быть детектирован на И88С. Кроме того, стволовая клетка по данному изобретению характеризуется набором антигенов, которые присутствуют на клеточной поверхности, таких как СО13, СО29, СО44 и СО49е. Препараты И88С дополнительно характеризуются наличием транскриптов мРНК некоторых рецепторных молекул, таких как рецептор эпидермального фактора роста (ЕСР-К), альфа-рецептор фактора роста, полученного из тромбоцитов (РОСЕ-КЛ), рецептор инсулиноподобного фактора роста (1СР-К). Данные клетки также обычно экспрессируют транскрипционные факторы, такие как ΥΒ1 (транскрипционный фактор Υ-бокса 1), Кипх1 (связанный с карликовостью транскрипционный фактор 1) и АМЬ1С (транскрипционный фактор острой миелоидной лейкемии 1), что определено путем КТ-РСК. Однако препараты И88С обычно не содержат транскрипты хондрогенного транскрипционного фактора Сай-1 и маркеров нервной ткани, таких как нейрофиламенты, синаптофизин, тирозингидроксилаза (ТН) и глиальный фибриллярный кислый белок (СРАР).
Таблица 1
Анализ транскрипционных профилей И88С путем КТ-РСК
Название Результат РСК Й53С Результат РСК (другая ткань) '
РОСГК-альфа + + (кость взрослого)
1СГК + + (кость взрослого)
Нейрофиламент - + (печень взрослого)
СО105 + + (мононуклеарные клетки из СВ)
СГАР + (фетальный головной мозг)
Синаптофизин + (фетальный головной мозг)
Тирозингидролаза + (фетальный головной мозг)
ΥΒ1 + + (фетальный головной мозг)
Κυηχΐ + + (кость взрослого)
АМЪХс + + (кость взрослого)
ВМРК II + + (хрящ взрослого)
Коллаген I типа + + (кость взрослого)
СагС-1 + (мононуклеарные клетки из СВ)
Хондроадгерин - + (кость взрослого)
СО49е + + (кость взрослого)
- 2 008619
Результаты КТ-РСК. получали с предсказанными олигонуклеотидными праймерами и с мРНК из И88С, и, в качестве положительного контроля, с мРНК из других тканей, таких как кость, хрящ, головной мозг или мононуклеарные клетки пуповинной крови.
Экспрессию РНК препаратов И88С и выделенных из костного мозга М8С (Сар1ап, 1991) непосредственно сравнивали путем использования количественных микроматриц АГГутс1пх СепеСЫр™.
Транскрипт гена фибулина-2 (номер генного банка Х82494) детектировали на высоком уровне экспрессии в И88С, но не детектировали в М8С. Продукция фибулина-2 была ранее продемонстрирована в фибробластах (Рап е! а1., 1993). При анализе путем нозерн-блоттинга мРНК из различных тканей человека были выявлены обильные транскрипты массой 4,5 тыс.н.п. в сердце, плаценте и тканях яичника (Ζ1ιηη§ е! а1., 1994). Данный белок был локализован на уровне световой микроскопии в человеческих эмбрионах 4-10 недель гестации с использованием поликлональных антител.
Фибулин-2 вначале детектировали в нейроэпителии, спинальных ганглиях и периферических нервах (Мюкде е! а1., 1996).
В модели на крысах миофибробласты печени крысы (тМР) локализованы совместно с фибулином-2. Данные клетки были локализованы в портальной области, в стенках центральных вен и лишь рассеянно в паренхиме. На ранних стадиях фиброза тМР детектировали внутри развивающихся рубцов. На развернутых стадиях фиброза гМР составляли большинство клеток, локализованных внутри шрама (Кшйе1 е! а1., 1999). У других экспериментальных животных мышиный белок фибулин-2 экспрессируется в течение эпителиально-мезенхимальной трансформации в матриксе эндокардиального валика в течение развития сердца эмбриона. Фибулин-2 также синтезируется гладкомышечными клетками-предшественниками развивающихся сосудов аортальной дуги и коронарными эндотелиальными клетками, которые берут начало от клеток нервного гребня и эпикардиальных клеток, соответственно (Ткиба е! а1., 2001).
Транскрипты гена гиалуронансинтазы (Ό84424), гена фибромодулина (И05291) и транскрипт ЮТТ8 (\νϋ3846) не детектировались в И88С, но имели место на высоком уровне в М8С. Путем анализа нозерн-блоттингом было показано, что гиалуронансинтаза повсеместно экспрессирована в тканях человека (1!апо апб К1та!а, 1996). Продукт данного фермента, гиалуронан, выполняет разнообразные функции, включая заполнение пространства, смазку суставов и предоставления матрикса, сквозь который могут мигрировать клетки (На11 е! а1., 1995). Фибромодулин является представителем семейства малых интерстициальных протеогликанов. Данный белок характеризуется широким тканевым распределением с наивысшим обилием, наблюдаемым в суставном хряще, сухожилиях и связках (8х1го1оу1ск е! а1., 1994). Транскрипт ШРЬ8 был клонирован из фетальной печени человека.
Ген СЭ24 (Ь33930) экспрессируется на очень низком уровне в И88С по сравнению с его уровнем экспрессии в М8С. СЭ24 экспрессирован во многих клетках В-ростка и на зрелых гранулоцитах (Уап бег 8сйоо! е! а1., 1989).
Соматические клетки по данному изобретению отличаются от М8С, что основывается на тканевом источнике, из которого они выделены. Кроме того, И88С характеризуются отсутствием экспрессии человеческого лейкоцитарного антигена I класса (НЬА I класса). В отличие от соматических стволовых клеток по данному изобретению, ранее описанные М8С, выделенные из костного мозга и мышечной ткани, экспрессируют на своей клеточной поверхности антиген НЬА I класса на очень высоком уровне. Клетка по данному изобретению также экспрессирует стадиоспецифический ранний антиген 4 (88ЕА4) (см. фиг. 4).
Обычно соматическая стволовая клетка по изобретению характеризуется фибробластоидной формой клетки и пролиферирует по типу прилипания.
В предпочтительном осуществлении настоящего изобретения соматическая стволовая клетка по изобретению (И88С) представлена во множестве или в смесях, включающих в себя предшественники других соматических стволовых клеток, например гемопоэтического ростка, предпочтительно экспрессирующих АС133 и СЭ34. мезенхимальные соматические стволовые клетки-предшественники, нейрональные соматические стволовые клетки-предшественники или их комбинации. Данное осуществление обладает преимуществом, поскольку оно обладает высоким регенеративным потенциалом, основанным на способности дифференцироваться в другие соматические стволовые клетки или на наличии таких стволовых клеток в предпочтительном осуществлении настоящего изобретения. Предпочтительно мезенхимальные соматические стволовые клетки-предшественники или нейрональные соматические стволовые клетки-предшественники продуцируются путем дифференцировки из стволовой клетки по изобретению.
По изобретению предоставляется лекарственное средство (регенеративное терапевтическое средство), включающее в себя соматические стволовые клетки по изобретению, а также множество или смеси соматических стволовых клеток по изобретению. Данное лекарственное средство может, кроме того, содержать носители или добавочные вещества, которые являются приемлемыми в медицинском и фармакологическом смысле. Настоящее изобретение также относится к способу применения И88С или множества или смесей стволовых клеток по изобретению при генной терапии, пересадке органов, тестировании фармацевтического средства, выращивании кровеносных сосудов ш уйто, терапии сосудистых, костных заболеваний, при заболеваниях печени, поджелудочной железы и нервных заболеваниях.
- 3 008619
Например, ИББС по настоящему изобретению могут применяться местно на участке, где это необходимо, например, с биоматериалами или без них.
В зависимости от вида заболевания подходящим является местное и/или системное введение ИББС. ИББС могут применяться непосредственно или вместе с фармацевтически приемлемыми носителями или адъювантами. Может быть благоприятным добавление дополнительных веществ, которые способствуют излечению заболеваний. Например, в ортопедических применениях вместе с ИББС могут быть добавлены вещества, которые улучшают регенерацию кости.
В основном, способы, известные для применения МБС, могут аналогичным образом использоваться для применения ИББС. Более того, применение стволовых клеток описано, например, В.Е. Б1гаиег с1 а1. 1йгакогопаге, йишаие аиЮ1оде 81аттхс111гап5р1ап1а1юп хиг МуокагбгедепегаОоп паск Нсг/шГагкГ. Бйск теб ХУосйсщсйг 2001; 126: 932-938, ОиаПо В., е1 а1. Верай оГ Ьагде Вопе БеГесй χνίΐΐι 111е Изе оГ Лйо1одои5 Вопе Маггои Б!гота1 Се1к, N. Епд1. 1. Меб. 2001; 344: 385-386; Уасай1 С.А., ВпеГ Верой: Вер1асетей оГ ап Ауйзеб Рка1апх ийй Ткзие-Епдшеегеб Вопе, N. Епд1. 1. Меб. 2001; 344: 1511-1514, Мау 17, 2001; Ней/ У.В., Тйзие Е^шее^^ Гог Весои8ΐшсί^ои оГ 111е ТкитЬ, N. Епд1. 1. Меб. 2001; 344: 1547-1548; ВпйЬегд М., ТгеаИпей оГ Беер Саййаде БеГесй ш 1йе Кпее ийй ЛиЮ1одои8 Сйоиб^осуΐе Т^аи8р1айаύои,
N. Епд1. 1. Меб. 1994; 331: 889-895, Ос!. 6, 1994; Егееб С.В., Тгап5р1айаОоп оГ ЕтЬтуойс Боратше №игоп8 Гог Беусге Рагктзоп'з Пйеазе, N. Епд1. 1. Меб. 2001; 344: 710-719; БЫп'ока Т., Тгап8р1айа1юп оГ а ТйзиеЕпдшеегеб Рйтопагу Айегу, N. Епд1. 1. Меб. 2001; 344: 532-533. Бйарбо А.М.1., 181еГ Тгап5р1айабоп ш Беуеп Рабейз ийй Туре 1 Б1аЬе1с5 МеШйз Изшд а О1исосогбсо1б-Егее Iттиио8ирр^е88^νе Вед^теи, N. Епд1. 1. Меб. 2000; 343: 230-238. Данные ссылки включены в качестве ссылки.
Стволовые клетки по изобретению далее описаны более подробно.
Стволовые клетки по изобретению представляют собой прилипающие клетки с фибробластоидной клеточной формой и двумя или тремя ядрышками (см. фиг. 1), полученные после обработки трипсином и ЕБТА, и при пересеве в подходящие условия культивирования (пример 1) они быстро размножались до сомкнутого состояния с вытянутой в длину морфологией (фиг. 2). На фиг. 1 показана микрофотография первичной культуры ИБСС. Клетки, высеянные с низкой плотностью, демонстрировали фибробластоидную морфологию ИББС. Данные клетки могут легко выращиваться в течение более чем 14 культуральных пассажей. На фиг. 2 показана микрофотография сливающейся культуры ИББС. Почти слитый клеточный слой ИББС характеризуется параллельной ориентацией клеток.
Фенотип поверхностных маркеров первичного слоя прилипающих клеток, а также всех их производных в последующих пассажах является негативным в плане маркера СБ45 и остается таковым. На фиг. 3 показан ЕАСБ-анализ на предмет антигена СБ45 в течение цикла культивирования ш уйго. СБ45, характеристический для гемопоэтических клеток маркерный антиген, почти не детектируется в ИББС из позднейших пассажей (фиг. 3 на 48, 54, 82 сутки).
После культивирования ш уйго с использованием способа А (пример 1) препараты ИББС становятся позитивными в плане стадиоспецифического раннего антигена 4 (ББЕА4) и характеризуются гомогенной экспрессией данного эмбрионального маркера. На фиг. 4 показан ЕАСБ-анализ эмбрионального маркера ББЕА4. Клетки, выращенные по способу А (пример 1), характеризуются сильной экспрессией стадиоспецифического раннего антигена 4 (ББЕА4). В то же время культуры ИББС являются негативными в плане экспрессии поверхностного антигена НЬА I класса (фиг. 5А), экспрессии антигена НЬА-БВ (фиг. 5В), а также являются СБ14-негативными (фиг. 5С). На фиг. 5 показан ЕАСБ-анализ на предмет НЬА I класса (А, В, С), НЬА-БВ и СБ14. Культуры ИББС по изобретению после размножения ш уйго являются негативными в плане антигенов НЬА I класса (секция А). Данные клетки также являются негативными в плане поверхностных антигенов НЬА-БВ (секция В) и СБ14 (секция С), характерных для антигенпредставляющих клеток (НЬА-БВ) и моноцитов (СБ 14).
На фиг. 6 показана кинетика ЕАСБ для поверхностного маркера СБ34. ИББС выращивали в Н5100/РЕ1 в течение 10 пассажей. В течение данного периода культивирования наблюдали значительное повышение экспрессии антигена СБ34. Касательно маркера гемопоэтической стволовой клетки СБ34, на фиг. 6 показано, что в пассаже 3 до 54 суток не смогли выявить СБ34-позитивные клетки. Наоборот, в седьмом пассаже на 82 сутки появляется новая СБ34-позитивная субпопуляция. С другой стороны, если такие СБ34- или/и Е1К1-позитивные предшественники культивировали со средой, кондиционированной цитокинами, специфичными для гемопоэтической дифференцироваки, развивались типичные смешанные или гемопоэтические колонии предшественников эритроцитов и лейкоцитов (СЕИ-ОМ и ВЕИ-Е), сравнимые с таковыми для СБ45+ гемопоэтических клеток-предшественников (пример 9).
С другой стороны, если мононуклеарные клетки пуповинной крови, лишенные СБ14, культивировали в среде с высоким содержанием глюкозы, они проявляли типичные характеристики нервных стволовых клеток. На фиг. 7 показана микрофотография клеток ИББС после нейронной индукции. ИББС по изобретению, культивированные в модифицированной по Дульбекко среде Игла (БМЕМ) с глюкозой, демонстрировали астроцитоподобную морфологию. На фиг. 7 показан пример таких культивируемых клеток, характеризующихся глиальной морфологией, полученных через 13 суток в культуре (пример 6). После стимуляции размножения с РЕ1 ИББС экспрессируют маркер нервных стволовых клеток нестин. Первое наблюдение показало, что окрашивание на нестин слабее выражено после того, как стимулирова
- 4 008619 ли средствами нейронной индукции, такими как ретиноевая кислота (КА), основной фактор роста фибробластов ЬРСР и фактор роста нервов β (Ν6Ρ-β) (МсКау, 1997).
На фиг. 8 подробно показаны И88С по изобретению, экспрессирующие маркер нервной стволовой клетки нестин. (А) И88С инкубировали в среде Η5100/ΡΕΙ в течение 7 суток и подвергали стандартному иммуногистохимическому анализу с антителами против нестина. (В) Клетки инкубировали в течение 7 суток в среде Η5100/ΡΕΙ с последующей индукцией КА, ЬРСР и Ν6Ρ в Н5100 в течение 9 суток. Заметьте, что окрашивание нестина снижено по сравнению с клетками, выращиваемыми в условиях (А).
При дальнейшем анализе данных клеток также выявлена экспрессия белков, характерных для нервных клеток, таких как γ-аминомасляная кислота (САВА, фиг. 9В), тирозингидроксилаза (фиг. 9В), синаптофизин (фиг. 9Ό), нейрофиламент (фиг. 9Ρ), или типичных глиальных антигенов, таких как галактоцереброзид (Са1С, фиг. 10В) и глиальный фибриллярный кислый белок (СРАР, фиг. 10Ό). На фиг. 9 показаны И88С по изобретению, генерирующие клетки нервного ростка. И88С по изобретению выращивали на Η5100/ΡΕΙ в течение 7 суток и выдерживали в течение 27 суток на Н5100, содержащем КА, ЬРСР и ΝΟΡ. После стандартных протоколов фиксации применяли нейронные специфические антитела. (А, С, Ό) Фазово-контрастные фотографии, (В, Ό, Р) флуоресцентные фотографии тех же препаратов, что в А, С, Ό. ДНК-краситель ЭЛР1 (голубой) применяют для окраски ядра клеток. (В) Фотография двойной флуоресценции с использованием антител против САВА (красные) и антител против тирозингидрокислазы (ТН, зеленые). (Ό) Окрашивание антителами против синаптофизина (зеленые). (Р) Показано специфическое для нейронов окрашивание антителами против нейрофиламентов (красный). Применяли коктейль антител против разных субтипов нейрофиламентов. На фиг. 10 показаны И88С по изобретению, генерирующие клетки глиального ростка. Клетки подвергали тем же культуральным условиям, что показаны для фиг. 9. ЭАР1 является голубым. (А, С) Представление фазово-контрастных фотографий. (В) Те же клетки, что видны на (А), которые подвергались окрашиванию антителами против Са1С (красные). (Ό) Те же клетки, что на (С), окрашенные антителами против глиального фибриллярного кислого белка (СРАР, красные).
Если, однако, описанные выше универсальные стволовые клетки берут из любого из пассажей разведения и индуцируют в условиях культивирования с содержанием ЭАС (дексаметазон, аскорбиновая кислота, β-глицеролфосфат) или в среде, содержащей фибронектин, индуцируется дифференцировка по остеогенному пути (пример 3). Как показано в табл. 2, специфичные для кости маркерные гены (щелочная фосфатаза, остеокальцин, коллаген II типа) легко индуцируются и детектируются путем КТ-РСК.
Таблица 2
Анализ путем КТ-РСК во время остеогенной дифференцировки И88С
контроль 7 сутки 14 сутки
β-актин (пол. контроль) + + +
Щелочная фосфатаза - +
Коллаген II типа - + +
Остеокальцин 4* + -
Все три маркерных гена остеогенной дифференцировки характеризуются повышенной экспрессией мРНК на 7 сутки индукции ЭАС. β-актин служит положительным контролем.
На фиг. 11 показано формирование минерализованных узелков после остеогенной индукции и после окрашивания ализарином красным (В). Остеогенную дифференцировку почти сливающихся слоев И88С индуцировали путем добавления дексаметазона, аскорбиновой кислоты и β-глицеролфосфата к культуральной среде Н5100. На 10 сутки стимуляции появились характерные костные узелки (11А).
Минеральное замещение таких узелков может демонстрироваться за счет окрашивания ализарином красным (11В). При данных условиях остеогенной индукции клетки по изобретению претерпевают полную остеогенную дифференцировку, что продемонстрировано накоплением в отдельных узелках минерализованной кости (фиг. 11А), которая может окрашиваться ализарином красным (фиг. 11В). Альтернативно, накопление гидроксиапатита в клеточной культуре может выявляться через 6 дней путем окрашивания по νοη Ко88а.
Из данных результатов ясно, что кровь пуповины содержит не выявленную до этого очень раннюю стволовую клетку, которая подлежит размножению до больших количеств. Кроме того, данная клетка может индуцироваться таким образом, что она дифференцируется в М8С и из них в остеобласты, как уже продемонстрировано на фиг. 11 А. После окончательной индукции ЭАС может быть получена дальнейшая дифференцировка до минерализованных костных узелков, как показано на фиг. 11В, посредством окрашивания ализарином красным.
Клетки по данному изобретению обладают даже большей многосторонностью, что демонстрирует
- 5 008619 ся хондрогенной дифференцировкой после культивирования в ΌΜΕΜ с высоким содержанием глюкозы, содержащей дексаметазон, пролин, пируват натрия, добавки ГТ8+, и Τ0Ρ-β1 (1ойп81оие с1 а1., 1998). На 0 и 14 сутки данных экспериментов по дифференцировке клетки собирали и анализировали путем К.Т-РСК. (табл. 3, пример 4).
Таблица 3
Анализ путем КТ-РСК во время хондрогенной дифференцировки И88С
Контроль 14 сутки
β-актин (пол. контроль) + +
Сагр-1 - +
Коллаген II типа (не подвергнутый сплайсингу) +
Хондроадгерин - +
На 14 сутки хондрогенной стимуляции зкспрессировались три характеристических маркерных гена текущего хондрогенеза.
Результаты данных исследований ясно демонстрируют наличие положительной регуляции С.'аг1-1. специфического хондрогенного транскрипционного фактора, через 14 дней после хондрогенной стимуляции. Более того, также положительно регулировались мРНК-транскрипты двух типичных хрящевых внеклеточных белков (коллаген ГГ типа и хондроадгерин). Более того, клетки по данному изобретению явственно продуцировали внеклеточные молекулы протеогликана, типичные для хондроцитарной дифференцировки, что продемонстрировано путем окрашивания А1с1ап В1ие. На фиг. 12 показано окрашивание А1с1аи В1ие происходящей от И88С осадочной культуры. И88С выращивали в седиментационной культуре в среде хондрогенной дифференцировки. Через 6 суток в индукционной среде посредством окрашивания А1с1ап В1ие не было выявлено значимого количества протеогликанов (РС), используемых в качестве характеристических маркеров хондрогенной дифференцировки (секция А). Наоборот, РС легко детектировались при выявлении посредством голубой/зеленой окраски (секция В).
Более того, присутствие специфичного для хряща коллагена ГГ типа могло быть продемонстрировано на белковом уровне. Фиг. 13: окрашивание коллаген ГГ типа (зеленое) культур И88С после хондрогенной дифференцировки.
И88С культивировали в среде хондрогенной дифференцировки. Экспрессию белка внеклеточного матрикса коллагена ГГ типа на 14 сутки демонстрировали путем флуоресцентной микроскопии с использованием первичного антитела против коллагена ГГ типа и меченного РГТС антимышиного вторичного антитела (фиг. 13В).
Дальнейшая многосторонность неограниченной стволовой клетки показана здесь ранее путем дифференцировки таковой в жировые клетки в культуре, размноженной по РЕГ-протоколу с высокими концентрациями дексаметазона (пример 5).
На фиг. 14 показаны жировые клетки, которые могут специфично окрашиваться 011 Кеб (81дша). Адипоциты характеризуются высоким содержанием внутриклеточных везикул и специфичным красным окрашиванием 011 Кеб.
Более того, И88С при культивировании в течение 24 ч в Н5100 с 10 мкМ 5'-азацитидина и впоследствии с 100 нг/мл ЬРОР демонстрируют ясные признаки мышечной дифференцировки. Изменение клеточной морфологии сопровождается экспрессией миозина длительного действия (фиг. 15 и 16).
Кроме того, возникновение и пролиферация типичных овальных клеток регулярно наблюдается в поздних пассажах (фиг. 17) при субклонировании индуцированных РЕГ И88С из СЭ34+-субпопуляции, что было показано на фиг. 6 (пример 8). Данные клетки в вариабельной степени зкспрессируют фермент дипептидилпептидазу ГУ, и это означает, что данные овальные клетки могут далее дифференцироваться в клетки печени.
Размноженные ΐη νίίτο И88С выживают и персистируют после инъекции в регенерирующие печени мышей 8СГО с 50% частичной гепатэктомией, а также в печенях без гепатэктомии, в то время как полученные из пуповинной крови мононуклеарные клетки невозможно детектировать даже при трансплантации в 25 раз большего количества клеток. На фиг. 18 показано выживание и интеграция культур И88С после инъекции в паренхиму печени мышей 8СГО. Фиг. 18А: красная флуоресценция через 7 суток после трансплантации означает выживание и интеграцию человеческих И88С по изобретению, меченных РКН26, в ткани мышиной печени (без гепатэктомии). После введения выделенных из пуповинной крови мононуклеарных клеток (МЫС), наоборот, не наблюдается какой-либо красной флуоресценции, которая бы указывала на интеграцию человеческих МЫС. Фиг. 18В: криосекция ткани мышиной печени, соответствующая А: светопропускающая микрофотография ткани мышиной печени с интегрированными чело
- 6 008619 веческими И88С.
Поскольку предшественник для клеток печени и клеток β-островков поджелудочной железы является одним и тем же, такие выделенные из СВ овальные клетки также могут дифференцироваться в продуцирующие инсулин клетки β-островка, что делает их подходящим инструментом для клеточной терапии пациентов с диабетом или пациентов с потерей клеток печени.
В дополнение к данным очевидным клиническим способам применения любые, хорошо охарактеризованные и размноженные в стандартизованных условиях компоненты, представляющие собой стволовые клетки, и их потомки могут использоваться для мониторинга и определения видов действия и молекулярных, а также клеточных эффектов вновь разработанных фармакологических средств и, таким образом, замещать также некоторые эксперименты, основанные на животных.
Таким образом, эти хорошо стандартизованные стволовые клетки и дифференцированные клетки, полученные из культур пуповинной крови человека, описанные здесь, могут применяться в качестве реагентов для теста ценности в фармацевтической промышленности и промышленности биологически совместимых материалов.
Препараты И88С, полученные при подходящих условиях культивирования, приводили к образованию множественных колоний различных гемопоэтических ростков, обеспечивая подтверждение того, что данные клетки могут давать начало гемопоэзу.
В составленной надлежащим образом культуральной среде с определенными концентрациями УЕСР, Р11 3Ь, 8ССР (фактор роста стволовых клеток) и на метилцеллюлозе такие клетки приводили к образованию смешанных колоний с клетками, которые также были позитивными в плане маркеров РЬК1+ и АС133+, Т1е1 и Т1е2. После дальнейшей дифференцировки развивался профиль маркеров, характерный для эндотелиальных клеток, негативный по АС133, СЭ31+, СО54+, У\УР+. УЕ-катерин+.
Здесь заявляется очевидная полезность таких эндотелиальных клеток при выращивании аутологических и аллогенных кровеносных сосудов ίη νίίτο для лечения сосудистых заболеваний.
В то же время ясно, что все эти сгенерированные ίη νίίτο и однородно размноженные предшественники и соответствующие им дифференцированные клетки на клональном уровне будут служить особо значимым инструментом для определения роли специфических генов и их продуктов в клеточной биологии и всех последующих медицинских применениях, основанных на способах лечения, опосредованных клетками и молекулами.
Лишь малых количеств клеток данных уникальных клеточных типов достаточно для того, чтобы генерировать большие количества растущих, прилегающих к поверхности И88С по изобретению и более дифференцированных мезенхимальных стволовых клеток для продукции применяемых в медицине регенеративных клеточных типов.
Одним из абсолютно новых аспектов данной области знания является тот факт, что такие предшественники могут асимметрично развиваться с образованием двух или более различно дифференцирующихся клеточных типов. Это выявляет новый биологический принцип регуляции совместными компонентами при функционально ориентированной регенерации клеток, который имеет место даже ίη νίίτο.
Результатом данного изобретения является то, что по данному принципу следует конструировать основанные на стволовой клетке терапевтические средства, которые должны состоять не только из одного клонального клеточного типа. Данное изобретение далее описывается следующими неограничивающими примерами.
Пример 1. Сбор пуповинной крови (СВ).
Сбор пуповинной крови в акушерских отделениях проводили с информированного согласия матери. После рождения ребенка, пока плацента еще оставалась в матке, пуповину дважды зажимали и рассекали в 7-10 см от пупка. После дезинфекции пуповины пунктировали пупочную вену и собирали СВ в резервуары для сбора, содержащие цитрат-фосфат декстрозы (СРЭ) в качестве антикоагулянта.
Выделение из пуповинной крови мононуклеарных клеток
Пуповинную кровь осторожно загружали на раствор Ρίοο11 (плотность 1,077 г/см3). Проводили центрифугирование в градиенте плотности (450 г, комнатная температура, 25 мин). Мононуклеарные клетки (МЫС) собирали из интерфазы и дважды промывали в фосфатно-солевом буфере, рН 7,3 (РВ8).
Получение прилипающих слоев фибробластоидной морфологии.
Мононуклеарные клетки высевали с плотностью примерно 5х103 клеток/см3 в культуральные флаконы Т25 (Νπηοίοη) [А.), В.), С.)]. Для инициации роста прилипающих клеточных слоев применяли четыре разных способа культивирования.
A. ) Полученные из СВ МЫС вначале культивировали в среде МуеЦсиЙ Н5100 (81ешСе11 Тесйηο1οд^е8, Ванкувер/Канада), содержащей 10-7 М дексаметазона.
B. ) Полученные из СВ МЫС вначале культивировали в среде Ме5енси11 (81ешСе11 ТесЬм^^ек, Ванкувер/Канада), содержащей 10-7 М дексаметазона.
C. ) Полученные из СВ МЫС вначале культивировали в среде ЭМЕМ с низким содержанием глюкозы (Βίο ^Ыйакег) с 30% РС8, содержащей 10-7 М дексаметазона.
Ό.) Полученные из СВ МЫС высевали с плотностью 5х106/мл в 10 мл среды МуеЦсиН Н5100
- 7 008619 (8!етСе11 ТесИпо1од1ез. Ванкувер/Канада) в культуральные флаконы объемом 50 мл (Νιιποίοη) без дексаметазона.
Все культуры инкубировали при 37°С в 5% СО2 в полностью увлажненной атмосфере и подпитывали раз в неделю путем удаления полной среды с неприлипшими клетками и добавлением 10 мл свежей среды. Через некоторое время прилипающие веретеновидные клетки удаляли обработкой 0,05% трипсином и
0.53 мМ ΕΌΤΆ в течение 2 мин. смывали средой. содержащей 50% сыворотку. собирали путем центрифугирования при 780 д и анализировали путем проточной цитометрии или ВТ-РСВ. Через 2-3 недели прилипающие клетки фибробластоидной морфологии появляются примерно в 30% всех клеточных культур.
Условия культивирования для размножения И88С по изобретению
И88С по изобретению могут размножаться в среде Н5100. содержащей 10 нг/мл ЮЕ I (инсулиноподобный фактор роста-1). 10 нг/мл РОСЕ-ВВ (полученный из тромбоцитов фактор роста-ВВ) и 10 нг/мл рек. человеческого ЕСЕ (рекомбинантный человеческий эпидермальный фактор роста) (среда ΡΕΙ). с плотностью. изменяющейся от 1х104 до 1х105 клеток/мл (способ размножения А). Альтернативно. препараты И88С могут быть размножены в исходной ростовой среде А. В и С.
Пример 2. Иммунофенотипирование клеток путем цитофлуориметрии.
Для определения иммунофенотипа И88С клетки окрашивали конъюгированным с Е1ТС антителом против СО45 (Вес!оп ΩίοΚιηδοη. СоиИет). конъюгированным с РЕ антителом против С014 (РИатМшдеп. Сои1!ег). антителом против 88ЕА-4 (МС-813-70). меченным козьим Е (аЬ')2-фрагментом против мышиных 1дС+1дМ (Н+Ь)-Е1ТС (Сои11ет). анти-СО 10-РЕ (САЕЬА. РИатМшдеп). антителом против НЬА I класса (СоиИет). меченным козьим Е(аЬ')2-фрагментом против мышиных 1дС+1дМ (Н+Ь)-Е1ТС. анти-СО13-РЕ (Вес!оп Оюкшзоп. Сои11ет); анти-СО29 (Сои11ет). анти-СО44 (СоиИет). анти-СО49е (СоиИет). анти-СО90 (СоиИет). анти-НЬА II класса-Е1ТС (СоиИет). Клетки анализировали с использованием ЕР1С8 ХЬ (СоиИет) или ЕАС8-анализатора (Вес!оп Оюкшзоп).
Пример 3. Демонстрация потенциала И88С в плане остеогенной дифференцировки.
И88С. полученные. как описано в примере 1. культивировали в стандартной среде до достижения ими 70% конфлюентности. Остеогенную дифференцировку данных клеток индуцировали добавлением 10-7 М дексаметазона. 50 мкг/мл аскорбиновой кислоты и 10 мМ β-глицеролфосфата (Вгибег е! а1.. 1994. 1а1з^а1 е! а1.. 1997). На 10 сутки стимуляции клетки характеризовались накоплениями фосфата кальция. результатом которых было образование костных узелков. Минерализованные костные узелки детектировали путем окрашивания ализарином красным следующим образом: прилипшие клетки в культуре дважды отмывали РВ8. рН 7.3. и окрашивали 5 мл 0.1% раствора ализарина красного в течение 1 ч при комнатной температуре и затем 0.1% уксусной кислотой и абсолютным этанолом. а также РВ8. Окрашивание кальция ализарином красным и окрашивание кальция по уоп Козза демонстрировало потенциал данных клеток в плане минерализации (81апГогб е! а1.. 1995. ВипдЬу е! а1.. 1993). Остеогенную дифференцировку также демонстрировали путем ВТ-РСВ с использованием специфических для дифференцировки кости маркеров остеокальцина (ОС). остеопонтина (ОР). специфической для кости щелочной фосфатазы (АР). костного сиалопротеина (В8Р). альфа-рецептора. полученного из тромбоцитов фактора роста (РОСЕ-Ва). рецептора эпидермального фактора роста (ЕСЕВ) и коллагена I типа.
Пример 4. Демонстрация потенциала И88С в плане хондрогенной дифференцировки.
Для хондрогенной дифференцировки 2х105 прилипших стволовых клеток помещали в седиментационную культуру в полипропиленовые пробирки объемом 15 мл. В качестве среды для клеточной культуры применяли ОМЕМ с высокой концентрацией глюкозы. содержащую дексаметазон. пролин. пируват натрия. добавку ГТ8+ и ТСЕ-в1 (1оИпз!опе е! а1.. 1998. Уоо е! а1.. 1998). На 7. 14 и 21 сутки фракции клеток анализировали путем ВТ-РСВ на предмет специфичных для хряща продуктов генов. кодирующих Сай-1. коллаген II типа и хондроадгерин. В дополнение. И88С применяли в седиментационных культурах. Через 2 недели секции Ое\уах фиксировали в 4% параформальдегиде в течение 15 мин при комнатной температуре и промывали этанолом. Секции окрашивали в 1% А1с1ап В1ие/3% уксусной кислоте. рН
2.5 (81дта) в течение 5 мин и промывали в дистиллированной воде. Они ясно демонстрировали позитивное окрашивание на специфические протеогликаны. что было показано путем окрашивания А1с1ап В1ие (фиг. 12) (СИао. С. е! а1.. 1993). После периода хондрогенной индукции продолжительностью 14 суток клетки фиксировали по стандартному протоколу и анализировали путем флуоресцентной микроскопии (ВозепЬаит е! а1.. 1998). демонстрируя наличие специфического для коллагена II типа внеклеточного матрикса (фиг. 13В).
Пример 5. Демонстрация потенциала И88С в плане адипогенной дифференцировки.
И88С культивировали в Н5100. содержащей 10-6 М дексаметазона. 50 мкг/мл аскорбиновой кислоты и 10 мМ β-глицеролфосфата. что приводило к дифференцировке части И88С в адипоциты. что было продемонстрировано окрашиванием 011 Веб (В11шге/-2асапаз е! а1.. 1992).
Пример 6. Демонстрация потенциала И88С в плане нейрогенной дифференцировки.
Выделение клеток и условия культивирования глиальных клеток
Мононуклеарные клетки пуповинной крови. полученные. как описано здесь. истощали для получения СО14+ клеток посредством системы выделения за счет СО14/магнитного активированного сортиро
- 8 008619 вания клеток (МАС8), в которой использованы колонки для разделения У8+, по инструкции производителя (М1бепу1 В101ес, Вегд1§сб С1абЬасб). Истощенные по СЭ14 мононуклеарные клетки культивировали с плотностью 2х106/мл в 10 мл среды с высоким содержанием глюкозы (МЕМ по Дульбекко с 4500 г/л глюкозы) в культуральных флаконах Т25 (М.1пс1оп) и инкубировали при 37°С в 5% СО2 в полностью увлажненной атмосфере. Через 10-15 суток в культуре детектировали клетки глиальной формы.
Дифференцировка в нервные клетки
А) Клетки размножали в течение 7 суток или только в среде Н5100, или в присутствии 40 пг/мл РИСЕВ, 10 пг/мл ЕСЕ, 10 пг/мл 1СЕ-1. Клетки обрабатывали трипсином и высевали с плотностью примерно 3,5х103 клеток/см2 в 24-луночные культуральные чашки на наклейки, покрытые поли-Э-лизином (РИЬ) и ламинином (РЭМат). Впоследствии инициировали нейрональную дифференцировку добавлением индуцирующих агентов, таких как полностью транс-ретиноевая кислота (10-5 М), ЬЕСЕ (20 нг/мл) и ΝΟΕ-β (50 нг/мл).
Флуоресцентная микроскопия
После периода инкубации (27 суток) клетки фиксировали по стандартному протоколу (КокепЬаит е1 а1., 1998) и окрашивали антителами против специфических для нервных клеток антигенов. Образцы анализировали с использованием флуоресцентной и светопропускающей микроскопии.
Пример 7. Демонстрация потенциала в плане дифференцировки по миоцитарному ростку.
1х104 И88С культивировали в среде Н5100 (81етСе11 Тесбпо1о§у), дополненной 10 нг/мл ΡΌΟΕΒΒ, 10 нг/мл ЕСЕ, 10 нг/мл 1СЕ при 37°С, 5% СО2, пока они не достигали примерно 70% конфлюентности. После этого клетки инкубировали с 10 мкМ 5'-азацитидина (81дта) в течение 24 ч, дважды промывали РВ8 и культивировали в среде Н5100, дополненной 100 нг/мл ЬЕСЕ (81дта). Через 1 неделю инкубации в среде для дифференцировки изменялась морфология клеток (фиг. 15). Через 10 суток клетки трипсинизировали и переносили в стеклянные камеры, покрытые фибронектином, для окрашивания.
Иммуногистохимия
Клетки фиксировали 5% формальдегидом/РВ8 в течение 15 мин и промывали дважды в РВ8, рН 7,3. С использованием стандартного протокола инкубировали клетки со специфическим первичным антителом против скелетного миозина (медленного) (клон ΝΘΟ7.5.4Ό. 1:400) (показано зеленым) и первичным антителом против СЭ13 (показано красным) или моноклональным первичным антителом против скелетного миозина (клон МУ-32, 1:4000). Окрашивание было положительным для И88С, культивированных при указанных выше условиях культивирования (фиг. 16).
Пример 8.
Человеческие клетки И88С, а также полученные из пуповинной крови мононуклеарные клетки (МNС) метили посредством РКН26 КЕИ ЕбюгексеШ Се11 Ыикег Кб (81дта, РКН26 СЬ). 2х105 И88С и 5х106 МNС вводили инъекцией в паренхиму печени мышей 8СГО с 50% гепатэктомией и без нее. Через 7 суток после трансплантации достигалась полная регенерация печени подвергнутых гепатэктомии животных. Ткань печени анализировали путем флуоресцентной микроскопии криосекций на предмет наличия меченных красным клеток человека (фиг. 18).
Пример 9. Демонстрация потенциала И88С в плане дифференцировки по гемопоэтическому ростку.
Три различных препарата И88С (И88СКСВ55 в среде ИМЕМ, содержащей 30% ЕС8, И88СКСВ12 в среде Н5100, содержащей дексаметазон, И88СКСВ13 в среде МекепСиб, содержащей дексаметазон, и И88ССК12 в среде Н5100, содержащей РЕ1), растущих в подходящей среде размножения в течение длительных периодов (пассажи от 5 до 8), высевали в объеме 250 мкл (2х104-2х105 клеток) клеточной суспензии в трех параллелях на 24-луночные планшеты в специальную гемопоэтическую среду культивирования (Ме1босиб 4434). Колонии размером более 50 клеток подсчитывали и классифицировали как происходящие из гранулоцитарных/макрофагальных (СЕИ-СМ), ранних эритроидных (ВЕИ-Е) или мультипотентных (СЕИ-СЕММ) клеток-предшественников по установленным критериям. Образование колоний в различных культурах было очевидным, начиная с 1 недели наблюдения, и продолжалось до 3 недель в условиях дифференцировки. Препараты И88С образовывали множественные колонии различных ростков, что обеспечивало доказательство того, что данные клетки могут давать начало гемопоэзу.
Пример 10. Молекулярные способы анализа неограниченных соматических стволовых клеток и продуктов их последующей дифференцировки.
РСК-праймеры для амплификации специфических последовательностей кДНК из остеокальцина, остеопонтина, костного сиалопротеина, щелочной фосфатазы, РИСЕКа и рецептора ЕСЕ выбирали из различных соответствующих экзонов так, чтобы была возможность различить их по размеру соответственно генерированных фрагментов ДНК.
Путем клонирования в вектор рСКЬ1 (1пубгодеи/США) и последующей трансформации штамма Е. соб ТОР 10Е получали соответственные специфичные клоны кДНК и характеризовали их путем циклического определения последовательности на автоматическом секвенаторе (Аррбеб Вюкуйетк).
Реакции КТ-РСК проводили по двухстадийной процедуре. 200 нг общей РНК клеток вначале подвергали обратной транскрипции с использованием 10 ед. обратной транскриптазы АМУ (Рготеда, Маппбе1т), 15 пмоль 3'-геноспецифических праймеров, 1 мМ б№ТР и буфера от поставщика (Рготеда, Маипбе1т) в объеме 20 мкл в течение 1 ч при 50°С. Реакцию РСК. проводили с использованием 2 мкл кДНК, 1 ед.
- 9 008619
ДНК-полимеразы Но181агТас.|. буфера и 0-раствора (01адеп. Нйбеп), 1,5 мМ 6ΝΤΡ и 20 пмоль 3'- и 5'геноспецифического праймера. Реакцию РСК проводили с использованием инициирующей стадии в течение 15 мин при 95°С, 37 циклов по 94°С в течение 30 с, 56°С в течение 30 с, 68°С в течение 1 мин и конечной стадии полимеризации в течение 5 мин при 68°С.
Таблица 4
РСК-праймеры для амплификации специфичных последовательностей кДНК
Наименование последовательность 5'-праймера последовательность 3' -праймера Н.П.
ΡϋΟΡΚ альфа асад£ддадайасдааСдТд сасагсад1дд1да!с(:сад 251
1СЕЯ сдад£ддадаааРс1дсдд дассадддсд(адйд(ад 272
Е6РК СдссасаассадСдСдсС ссасаСаайасддддасас 205
Нейрофиламент айсдсдсдсадсйдаад ссРддСаддаддсааРдРс 265
6ЕАР сСсСссс1дд<ЛсдааСдс ссТсЛдаСаасСддссд 871
Синаптофизин сс!дсадаасаад1ассдад ссйдсбдсссаСадСсдс 516
Тирозингидроксилаза са ссйсд сдсадШ±сд сТдСссадса сд!сд аедд 387
ΥΒ1 ддЬдаддаддсадсаааСд! адддйддаа1асРд1дд1с 279
Нипх1 дсаадйдаддадсддсд дассдасааассСдаадСс 296
АМ1_1с сад1дсйса!дададаа1дс дассдасааассСдаадй 453
Сай-1 ддадасдсТддасааГдад д д1ад сфсадйхйддс 560
СР1О5 сЛдссасТддасасадд а1дд сад ййдГддЬдйд 411
Коллаген 1 типа д д асасааРдда йдсаадд аассасСдсСссасСсСдд 441
Коллаген 11 типа Шсссадд1:саадаСддТс сйсадсассСдРсТсасса 377
Остеокальцин адгссадсаааддидсадс ддссдСадаадсдссда1 231
Щелочная фосфатаза дсйсадаадЛсаасасса сдйдСсГд адЬа сса д Бсс 454
Бета-актин дадаааа!сйдсассасас сТсддСдаддаЩСТсас 340
В таблице показаны последовательности 5'- и 3'-праймеров исследуемых генов и ожидаемая длина фрагментов РСК в н.п.
Ссылки
Вгибег, 8., Ешк, Ό.Ι., апб Сар1ап, Α.Ι. (1994). Ме8епсйута1 Чет се118 ίη Ьопе Гогтабоп, Ьопе герай. апб 8ке1е1а1 гедепегабоп Шегару. ί. Се11 Вюсбет. 56: 284.
Сар1ап, Α.Ι., Ме8епсбута1 Чет се118. (1991) 1. Оббор. Кеч 9: 641-50.
Оготре, М. апб Ешедо1б, М.1. Ыуег Чет се118. р. 455-497 Ггот 81ет Се11 Вю1оду, Со1б 8рппд НагЬог ЬаЬога1огу Рге88, 2001.
Оготре, М. апб Ешедо1б, М.1. Ыуег Чет се118. р. 455-497 Ггот 81ет Се11 Вю1оду, Со1б 8рппд НагЬог ЬаЬога1огу Рге88, 2001.
На11, С.Ь., Уапд, В., Уапд, X., 2бапд, 8., Тиг1еу, М., 8атие1, 8., Ьапде, Ь.А., \Уапд. С., Сигреп, Ο.Ό., 8ауат, К.С., ОгеепЬегд, А.Н., Тиг1еу, Е.А. Оуегехрге88юп оГ 1Не буа1игопап гесерЮг КНАММ 18 ЦащГогттд апб 18 а18о гес.|тгеб Гог Н-га8 бап8Гогтабоп. Се11 82: 19-26, 1995.
бапо. Ι.Ν., К1та1а, К. Ехрге88юп с1ошпд апб то1еси1аг сбагас1епха1юп оГ НА8 рго1ет. а еикагуобс
- 10 008619 буа1игопап куп!баке. 1. ΒίοΙ. Сбет. 271: 9875-9878, 1996.
1а1ктеа1, Ν,, Наупектеог!б, 8.Е., Сар1ап, А.1., Вгибег, 8.Р. Ок!еодешс бШегепбабоп о! рипйеб, сибигеехрапбеб битап текепсбута1 к!ет се11к т убго. 1. Се11 Вюсбет. 1997 ЕеЬ.; 64(2): 295-312.
1обпк!опе, В., Неппд, Т.М., Сар1ап, Α.Ι., 6о1бЬегд, У.М., Уоо, 1.И. 1п убго сбопбгодепекй о! Ьопе тагготе-бепуеб текепсбута1 ргодепбог се11к. Ехр. Се11 Век. 1998 1ап. 10; 238(1): 265-72.
Кпб!е1, Т., КоЬо1б, Ό., Рйсадба, Е., 8абе, В., НеиЬаиег, К., Меббе, М., Т1тр1, В., Ватабоп, 6. Ьосаб/абоп о! буег туоДЬгоЬ1ак!к апб берабс к!е11а!е се11к ш погта1 апб бйеакеб га! буегк: бйбпс! го1ек о! (туо-)йЬгоЬ1ак! киЬрори1абопк ш берабс бккие герай. Н1к!осбет. Се11 Вю1. 1999 Коу,; 112(5): 387-401.
Κγ6ζι6, М.В. апб 8атуе!тск, N. Рапсгеабс 81ет Се11к, р. 499-513 !гот 81ет Се11 Вю1оду, Со1б 8рппд НагЬог ЬаЬога!огу Ргекк, 2001.
МагексЫ, К., В1акт, Е., Р1ас1Ье11о, ^., Адбеба, М., Мабоп, Е., Еадюб, Е. Наета!о1одюа 2001 Ос!.; 86(10): 1099-100. 1ко1абоп о! битап текепсбута1 к!ет се11к: Ьопе тагготе уегкик итЬШса1 согб Ь1ооб.
Рап, Т.-С., 8акак1, Т., 2бапд, В.-Ζ., Еакк1ег, В., Т1тр1, В., Сби, М.-Ь. 8бис!иге апб ехргеккюп о! йЬибп2, а поуе1 ехбасе11и1аг табтх рго!еш тебб ти1бр1е Е6Е-бке гереа!к апб сопкепкик тоб!к !ог са1сшт Ьтбтд.
1. Се11 Вю1. 123: 1269-1277, 1993.
Ватбга^асапак, 1.6., Сак!^ο-Мипοζ1ебο, Е., Кшг-Натсисб, ^. Н1к!осбет1к!гу 1992 1и1.; 97(6): 493-7. Циайбабоп о! аб1роке сопуегкюп апб бгд1усепбек Ьу к!шшпд тбасу!ор1актю бр1бк тебб Об геб О.
ВокепЬаит, С., Китее, I., Маи!пег, У.Е., Ебеббсб, В.Е., Ми11ег, Н.^., Напетапп, С.О. (1998). Епбапсеб рго1бегабоп апб ро!аккшт сопбис!апсе о! 8сбтеапп се11к 1ко1а!еб !гот ΝΕ2 ксбтеаппотак сап Ье гебисеб Ьу цшшбте. №игоЬю1. 5, 55-64.
ВипдЬу, 1., Каккет, М., Епккеп, Е.Е., Оапксбег, 6. Н1к!осбет. 1. 1993 1ип.; 25(6): 446-51. Тбе уоп Кокка геасбоп !ог са1сшт берокбк: кбуег 1ас!а!е к!шшпд тсгеакек кептбубу апб гебисек Ьаскдгоипб.
8!ап!огб, С.М., 1асоЬкоп, Р.А., Еапек, ЕЮ., ЬетЬке, Ь.А., М1бига, Р.1. 1. Вю1, Сбет. 1995 Арг. 21; 270(16): 9420-8. Вар1б1у !огттд араббс ттега1 ш ап ок!еоЬ1акбс се11 бпе (ИМВ 106-01 В8Р).
8барбо, А.М.1., Ьакеу, 1.В.Т., Вуап, Е.А., КогЬи!!, 6.8., То!б, Е., ^агпоск, 6.6, Кпе!етап, КМ,, Варбе, В.У. N. Епд1. 1. Меб. 2000 1и1. 27; (343): 230-238. 1к1е! Тгапкр1ап!абоп ш 8еуеп Рабеп!к тебб Туре 1 Э|аЬе1ек Ме1б!ик Иктд а 61исосогбсо1б-Егее 1ттипокирргекк1уе Вещтеп.
8ζ!^ο1ον^ск, В., Сбеп, Χ.-Ν., бгоуег, 1., Воидб1еу, Р.1., КогепЬегд, 1.В. ^οса1^ζа!^οп о! !бе битап йЬготобибп депе (ЕМОЭ) !о сбготокоте 1ц32 апб сотр1ебоп о! !бе сЭХА кециепсе. бепотюк 23: 715-717, 1994.
Ткиба, Т., ^апд, Н., Т1тр1, В., Сби, М.Ь. Е1Ьибп-2 ехргеккюп тагкк !гапк!огтеб текепсбута1 се11к т беуе1ортд сагб1ас уа1уек, аогбс агсб уекке1к, апб согопагу уекке1к. Оеу. Пуп. 2001 8ер.; 222(1): 89-100.
Уап бег 8сбоо!, С.Е., Ни^ζ^пда, Т.^.б, 6абб, 8.К., Ма_)б1с, О., ^цтапк, В., Кпарр, ^., Уоп бет Воте, А.Е.6. 1бепбйсабоп о! !бгее поуе1 Р1-бпкеб рго!етк оп дгапи1осу!ек. 1п: Кпарр, ^., Эогкеп, В., 6бкк, ^.В., В1еЬег, Е.Р., 8сбт1б!, В.Е., 8!еш, Н., Уоп бет Воте, А.Е.6.К. Ьеикосу!е Туртд IV: ^ббе Се11 ПбГегепбабоп Апбдепк. ОхТогб: ОхТогб Ишу. Ргекк (риЬ.) 1989. Рр. 887-891.
Уоо, 1.И., Ваг!бе1, Т.8., КкЫтига, К., 8о1сбада, Ь., Сар1ап, А.1., 6о1бЬегд, У.М., 1обпк!опе, В. Тбе сбопбгодешс ро!епба1 о! битап Ьопе-тагготе-бепуеб текепсбута1 ргодепбог се11к. 1. Вопе 1от! 8игд. Ат. 1998 Пес.; 80(12): 1745-57.
Ζ^-ιπ^, В.-Ζ., Рап, Т.-С., Ζбапд, Ζ.-Υ., Ма!!е1, М.-6., Т1тр1, В., Сби, М.-Ь. Е1Ьибп-2 (ЕВ6К2): битап сЭХА кециепсе, тВКА ехргеккюп, апб тарртд о! !бе депе оп битап апб тоике сбготокотек. бепотюк 22: 425-430, 1994.
Сокращения
ПА6 - среда остеогенной дифференцировки, содержащая дексаметазон, аскорбиновую кислоту и βглицеролфосфат
НЬА - человеческий лейкоцитарный антиген
М8С - мезенхимальная стволовая клетка
РЕ1 - среда, содержащая РП6Е-ВВ, Е6Е и Ι6Ε
88ЕА4 - стадиоспецифический ранний антиген 4
И88С - неограниченная соматическая стволовая клетка
Р6 - протеогликаны
- 11 008619
Список последовательностей <110> ΚΟϋΚΙΟΝ ΤΗΕΕΑΡΕϋΤΙΟΕ СтЬН <120> неограниченные соматические стволовые клетки (и38С), полученные из пуповинной крови человека <130> 012770но МЕ/ВМ <140> РСТ/ЕР 01/ 12768 <141> 2001-11-03 <160> 34 <170> РаЕепЕ1п Уег. 2.1 <210> 1 <211> 21 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: 5’-праймер для гена ΡϋΟΕΕί-альфа <400> 1 ' асадЕддада ЕЕасдааЕдЕ д 21 <210> 2 <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: 3’-праймер для гена ΡϋΟΕΚ альфа <400> 2 сасагсадЕд дЕдаЕсЕсад <210> 3 <211> 19 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220> , <223> Описание искусственной последовательности: 5’праймер для гена ΙΕΓΚ <400> 3 сдадЕддада ааЕсЕдсдд 19 <210> 4 <211> 19 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: З'-праймер для гена югк.
<400> 4 дассадддсд ЕадЕЕдЕад 19
- 12 008619 <210> 5 <211> 18 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: 5'-праймер для гена ЕСЕК <400> 5
1дссасаасс ад1:д1:дс1: 18 <210> 6 <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> описание искусственной последовательности: З’-праймер для гена БОЕВ <400> 6 ссасаЬааМ: асддддасас 20 <210> 7 <211> 19 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: 5'-праймер для гена нейрофиламента <400> 7 аР^сдсдсдс адсРбдаад 19 <210> 8 <211> 19 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: 3'-праймер для гена нейрофиламента <400> 8 ссЕддкадда ддсаакдРс 19 <210> 9 <211> 19 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: 5'-праймер для гена ΘΕΑΡ <400> 9 с1:ссссс1:дд сСсдааСдс 19 <210> 10
- 13 008619 <211> 19 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: 3'-праймер для гена СТАР <400> 10 ссБссЪдаБа аскддссд 16 <210> 11 <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220> ’ <223> Описание искусственной последовательности: 5'-праймер для гена синаптофизина <400> 11 сс£дсадаас аадБассдад 20 <210> 12 <211> 19 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: 3’-праймер для гена синаптофизина <400> 12 ссЕЕдсСдсс саГадксдс 19 <210> 13 <211> 19 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: 5'-праймер для гена тирозингидроксилазы, <400> 13 сассЕЬсдсд садБ^сСсд19 <210> 14 <211> 19 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: З’-праймер для гена тирозингидроксилазы <400> 14 сЕдиссадса сд^сдаСдд 19 <210> 15 <211> 20 <212> ДНК
- 14 008619 <213> искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: 5’-праймер для гена ΥΒ1 <400> 15 дд£даддадд садсаааЁдС 20 <210> 16 ' <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: 3'-праймер для гена ΥΒ1 <400> 16 адддЪкддаа ЪасЬд^дд'Ьс 20 <210> 17 <211> 18 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: 5'-праймер для гена гивх1 <400> 17 дсаадсгдад дадсддсд 18 <210> 18 <211> 19 <212> днк <213> искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: 3'-праймер для гена гипх1 <400> 18 .
дассдасааа сс£даад£с 19 <210> 19 <211> 21 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: 5’-праймер для гена АМЫс <400> 19 садЬдсССса Сдададаасд с 21 <210> 20 <211> 19 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность
- 15 008619 <220>
<223> Описание искусственной последовательности: 3’-праймер для гена АМЫс <400> 20 дассдасааа ссРдаадбс 19 <210> 21 <211> 19 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: 5'-праймер для гена сагБ-1 <400> 21 ддадасдсбд дасааСдад 19 <210 22 <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: 3’-праймер для гена сагЕ-1 <400> 22 ддСадссдгс адСссббддс 20 <210 23 <211> 18 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220 <223> Описание искусственной последовательности: 5’-праймер для гена С0105 <400> 23 ссбдссас^д дасасадд 18 <210> 24 <211> 20 <212> ДНК <21з> Искусственная последовательность <220 <223> Описание искусственной последовательности: 3'-праймер для гена СОЮЗ -·.· <400> 24 абддсадсЪс Сд-бддбдРСд 20 <210 25 <211> 20 <212> ДНК <2Ю Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: 5'-праймер
- 16 008619 для гена коллагена I типа <400> 25 ддасасаа^д даИ£дсаадд 20 <210> 26 .
<211> 19 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: 3'-праймер для гена коллагена I типа <400> 26 аассаскдсг ссасЪсЬдд 19 <210> 27 <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <22 0>
<223> Описание искусственной последовательности: 5’-праймер для гена коллагена II типа <400> 27
СЪЕсссаддй саадаСддИс 20 <210> 28 <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: 3'-праймер для гена коллагена II типа <40 0 28 сГЕсадсасс 1дксксасса 20 <210> 29 <211> 19 , <212>
<213> ДНК
Искусственная последовательность <220> ' <223> описание искусственной последовательности: 5'-праймер для гена остеокальцина <400> 29 адСссадсаа аддЪдсадс 19 <210> 30 <211> 18 <212> ДНК .
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> описание искусственной последовательности: З’-праймер для гена остеокальцина
- 17 008619 <400> 30 ддссдРадаа дсдссдаЕ 18 <210> 31 <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: 5’-праймер для гена щелочной фосфатазы <400> 31 дсССсадаад с^саасасса 20 <210> 32 <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: 3'-праймер для гена щелочной фосфатазы <400> 32 сдРЕдЕсЕда дсассад1:сс 20 <210> 33 <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: 5’-праймер для гена бета-актина <400> 33 дадааааксЪ Сдсассасас 20 <210> 34 <211> 18 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: 3’-праймер для гена бета-актина <400> 34 1 с^сддБдадд акскЬса!: 18

Claims (2)

1. Применение неограниченных соматических стволовых клеток (И88С) для получения лекарственного средства для лечения сосудистого заболевания, заболевания сердечной мышцы или гладкой мышцы, заболевания печени, заболевания поджелудочной железы, в частности диабета типа Г, заболевания нервной ткани, в частности болезни Паркинсона, или гематологического заболевания, где указанные И88С получены из пуповинной крови или плацентарной крови, причем указаные стволовые клетки обладают следующими свойствами:
(ί) негативны по отношению к поверхностным антигенам СЭ14 и СЭ45;
(ίί) позитивны по отношению к поверхностным антигенам СЭ13. СЭ29. СЭ44 и СЭ49е;
(ίίί) позитивны по экспрессии ΥΒ1, АМЬ-1, ΚυΝΧ-1 и фибулина-2; и
- 18 008619 (ίν) негативны по экспрессии гиалуронансинтазы, фибромодулина и 1 ΧΙ'Ί,δ.
2. Применение по п.1, где указанное лекарственное средство дополнительно содержит потомство указанных И88С, дифференцированных ίη νίΐτο.
EA200300536A 2000-11-03 2001-11-03 Применение неограниченных соматических стволовых клеток (ussc) для получения лекарственного средства EA008619B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US24516800P 2000-11-03 2000-11-03
PCT/EP2001/012768 WO2002036751A2 (en) 2000-11-03 2001-11-03 Human cord blood derived unrestricted somatic stem cells (ussc)

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA200300536A1 EA200300536A1 (ru) 2003-12-25
EA008619B1 true EA008619B1 (ru) 2007-06-29

Family

ID=22925565

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200300536A EA008619B1 (ru) 2000-11-03 2001-11-03 Применение неограниченных соматических стволовых клеток (ussc) для получения лекарственного средства

Country Status (25)

Country Link
US (3) US7560280B2 (ru)
EP (1) EP1404815B1 (ru)
JP (2) JP4799804B2 (ru)
CN (1) CN100480375C (ru)
AT (1) ATE340255T1 (ru)
AU (2) AU2002229533B2 (ru)
BG (1) BG107770A (ru)
CA (1) CA2426987C (ru)
CY (1) CY1106287T1 (ru)
CZ (1) CZ20031165A3 (ru)
DE (1) DE60123293T2 (ru)
DK (1) DK1404815T3 (ru)
EA (1) EA008619B1 (ru)
EE (1) EE200300205A (ru)
ES (1) ES2272563T3 (ru)
HK (1) HK1071771A1 (ru)
HU (1) HUP0301600A3 (ru)
IL (2) IL155608A0 (ru)
MX (1) MXPA03003844A (ru)
NO (1) NO20031999L (ru)
PL (1) PL362293A1 (ru)
PT (1) PT1404815E (ru)
SK (1) SK5242003A3 (ru)
UA (1) UA81390C2 (ru)
WO (1) WO2002036751A2 (ru)

Families Citing this family (102)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1100529B2 (en) * 1998-07-30 2010-08-25 The Government of the United States of America, as repres. by the Secretary of Health and Human Services, Nat. Inst. of Health Thymosin beta 4 promotes wound repair
US8609412B2 (en) * 1999-08-05 2013-12-17 Regents Of The University Of Minnesota Mapc generation of lung tissue
US7015037B1 (en) * 1999-08-05 2006-03-21 Regents Of The University Of Minnesota Multiponent adult stem cells and methods for isolation
WO2005056026A1 (en) 2003-12-04 2005-06-23 Regents Of The University Of Minnesota Compositions and methods for the treatment of lysosomal storage disorders
US10638734B2 (en) 2004-01-05 2020-05-05 Abt Holding Company Multipotent adult stem cells, sources thereof, methods of obtaining and maintaining same, methods of differentiation thereof, methods of use thereof and cells derived thereof
US8252280B1 (en) 1999-08-05 2012-08-28 Regents Of The University Of Minnesota MAPC generation of muscle
US7927587B2 (en) * 1999-08-05 2011-04-19 Regents Of The University Of Minnesota MAPC administration for the treatment of lysosomal storage disorders
US8075881B2 (en) * 1999-08-05 2011-12-13 Regents Of The University Of Minnesota Use of multipotent adult stem cells in treatment of myocardial infarction and congestive heart failure
EP1226233B1 (en) * 1999-08-05 2011-06-29 ABT Holding Company Multipotent adult stem cells and methods for isolation
CA2438501C (en) * 2001-02-14 2014-09-16 Leo T. Furcht Multipotent adult stem cells, sources thereof, methods of obtaining and maintaining same, methods of differentiation thereof, methods of use thereof and cells derived thereof
CN1547480A (zh) * 2001-08-29 2004-11-17 雷根内克斯生物制药有限公司 用胸腺素β4、类似物、同型物和其他衍生物在心肌事件发生前、过程中或刚发生后治疗或预防炎症、损伤和其他改变的方法
DE10144326B4 (de) * 2001-09-10 2005-09-22 Siemens Ag Verfahren und System zur Überwachung eines Reifenluftdrucks
DE10158680B4 (de) * 2001-11-30 2004-04-08 Universitätsklinikum Hamburg-Eppendorf Verfahren zur ex vivo-Expansion und -Differenzierung von multipotenten Stammzellen
CA2473749C (en) * 2002-01-23 2012-05-22 University Of Utah Research Foundation Pure populations of astrocyte restricted precursor cells and methods for isolation and use thereof
JP2005517441A (ja) * 2002-02-19 2005-06-16 メディポスト・カンパニー・リミテッド 臍帯血由来の間葉幹細胞・前駆細胞の分離培養方法及び間葉組織への分化誘導方法
JP2006509770A (ja) 2002-11-26 2006-03-23 アンソロジェネシス コーポレーション 細胞治療学、細胞治療単位、およびそれらを利用した治療法
WO2004050859A2 (en) 2002-11-27 2004-06-17 Regents Of The University Of Minnesota Homologous recombination in multipotent adult progenitor cells
US7470538B2 (en) * 2002-12-05 2008-12-30 Case Western Reserve University Cell-based therapies for ischemia
WO2004052177A2 (en) * 2002-12-05 2004-06-24 Case Western Reserve University Cell-based therapies for ischemia
JP3762975B2 (ja) * 2003-03-18 2006-04-05 学校法人慶應義塾 単球由来多能性細胞ｍｏｍｃ
US20040203142A1 (en) * 2003-04-14 2004-10-14 Reliance Life Sciences Pvt. Ltd. Growth of neural precursor cells using umbilical cord blood serum and a process for the preparation thereof for therapeutic purposes
JP4950661B2 (ja) 2003-06-27 2012-06-13 エチコン、インコーポレイテッド 分娩後由来細胞類を使用する、神経組織の再生および修復
US8790637B2 (en) 2003-06-27 2014-07-29 DePuy Synthes Products, LLC Repair and regeneration of ocular tissue using postpartum-derived cells
AU2003304250A1 (en) 2003-06-27 2005-01-13 Universite Laval Method of isolating cells from umbilical cord
WO2005032251A1 (en) * 2003-10-09 2005-04-14 I.M.T. Interface Multigrad Technology Ltd. Method for freezing, thawing and transplantation of viable cartilage
GB0329449D0 (en) * 2003-12-19 2004-01-28 Omnicyte Ltd Stem cells
JP2007520462A (ja) * 2003-12-19 2007-07-26 バイアセル インコーポレーティッド ヒト臍帯血由来多能性細胞の疾患の処置のための使用方法
EP1544290A1 (en) * 2003-12-19 2005-06-22 Yu-Show Fu A cell system for generating somatic cells
JP4777908B2 (ja) * 2004-02-02 2011-09-21 コア・ダイナミクス・リミテッド 生物学的材料ならびに生物学的材料の保存のための方法および溶液
WO2005073652A2 (en) * 2004-02-02 2005-08-11 I.M.T. Interface Multigrad Technology Ltd. Apparatus, system and method for lyophilization
EP1718735A1 (en) * 2004-02-11 2006-11-08 Aldagen, Inc. Stem cell populations and methods of use
EP1747265B1 (en) * 2004-04-23 2011-04-20 BioE LLC Multi-lineage progenitor cells
US7622108B2 (en) 2004-04-23 2009-11-24 Bioe, Inc. Multi-lineage progenitor cells
US20070298015A1 (en) * 2004-04-28 2007-12-27 Viacell, Inc. Treatment of Muscular Dystrophy with Mobilized Peripheral Blood Pluripotent Cells
JP2007536935A (ja) 2004-05-14 2007-12-20 ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニー 間葉幹細胞の無血清増殖のための細胞培養環境
EP1753472B1 (en) * 2004-06-07 2010-03-17 Core Dynamics Ltd Method for sterilization of biological preparations
EP1778007A1 (en) * 2004-08-12 2007-05-02 I.M.T. Interface Multigrad Technology Ltd. Method and apparatus for freezing or thawing of a biological material
US9056093B2 (en) 2005-01-07 2015-06-16 Wake Forest University Health Sciences Regeneration of pancreatic islets by amniotic fluid stem cell therapy
EP2428563A1 (en) * 2005-02-10 2012-03-14 Regents Of The University Of Minnesota Vascular/lymphatic endothelial cells
EP1850661A2 (en) * 2005-02-22 2007-11-07 Interface Multigrad Technology (IMT) Ltd. Preserved viable cartilage, method for its preservation, and system and devices used therefor
CN101575590B (zh) * 2005-02-28 2012-05-23 中国医学科学院血液学研究所泰达生命科学技术研究中心 人脐带间充质干细胞的制备方法
EP1874922A4 (en) * 2005-04-19 2009-10-28 Univ Johns Hopkins METHOD USING STROMA CELLS FROM UMBILICAL CORD BLOOD TO DEVELOP AND GRAFT NUCLEAR CELLS DERIVED FROM UMBILICAL CORD BLOOD
WO2006121454A2 (en) * 2005-05-05 2006-11-16 Regents Of The University Of Minnesota Use of mapc or progeny therefrom to populate lymphohematopoietic tissues
CN101218341A (zh) * 2005-05-05 2008-07-09 明尼苏达大学董事会 Nk细胞抑制作用用于促进定植的mhc-i阴性细胞持续存在的用途
EP2662439A1 (en) * 2005-05-27 2013-11-13 Viacord, LLC Treatment of ischemia using stem cells
US20080194024A1 (en) * 2005-07-29 2008-08-14 Mays Robert W Culture of Non-Embryonic Cells at High Cell Density
EP1909565A2 (en) 2005-08-03 2008-04-16 Interface Multigrad Technology (IMT) Ltd. Somatic cells for use in cell therapy
DE602005017812D1 (de) * 2005-08-26 2009-12-31 Seoul Nat Univ Ind Foundation Multipotente blutstammzellen aus der nabelschnur und zellbehandlungsmittel damit zur behandlung der ischämischen krankheit
EP1941032A2 (en) 2005-10-14 2008-07-09 Regents Of The University Of Minnesota Differentiation of non-embryonic stem cells to cells having a pancreatic phenotype
ES2642844T3 (es) 2005-12-16 2017-11-20 DePuy Synthes Products, Inc. Composiciones y métodos para inhibir una respuesta inmune adversa en el trasplante de histocompatibilidad que no coinciden
US9125906B2 (en) 2005-12-28 2015-09-08 DePuy Synthes Products, Inc. Treatment of peripheral vascular disease using umbilical cord tissue-derived cells
PL2471903T3 (pl) 2005-12-29 2018-09-28 Anthrogenesis Corporation Populacje komórek macierzystych łożyska
WO2007121443A2 (en) * 2006-04-17 2007-10-25 Bioe, Inc. Differentiation of multi-lineage progenitor cells to respiratory epithelial cells
US7875453B2 (en) * 2006-06-14 2011-01-25 Bioe Llc Differentiation of multi-lineage progenitor cells to hepatocytes
ES2524443T3 (es) * 2006-11-13 2014-12-09 DePuy Synthes Products, LLC Expansión in vitro de células postparto usando microportadores
WO2008085229A2 (en) * 2006-11-15 2008-07-17 Arteriocyte Inc. Cell-based therapies for treating liver disease
EP2087101A2 (en) * 2006-11-24 2009-08-12 Regents of the University of Minnesota Endodermal progenitor cells
AU2007326171B2 (en) 2006-11-30 2012-11-15 Medipost Co., Ltd. Use of a composition contaning human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cell for inducing differentiation and proliferation of neural precursor cells or neural stem cells to neural cells
US20090029463A1 (en) * 2007-07-25 2009-01-29 Bioe, Inc. Differentiation of Multi-Lineage Progenitor Cells to Chondrocytes
MX2010004914A (es) * 2007-10-31 2010-08-18 Cryo Cell Int Metodos para cocultivar celulas derivadas de sangre de cordon umbilical con celulas madre menstruales.
US20120156134A1 (en) 2007-12-20 2012-06-21 Shayne Squires Compositions and methods for detecting or eliminating senescent cells to diagnose or treat disease
CN101978047A (zh) 2008-01-18 2011-02-16 明尼苏达大学董事会 干细胞聚集体及制备和使用方法
US20090202978A1 (en) * 2008-02-13 2009-08-13 Ginadi Shaham Method and apparatus for freezing of a biological material
US20090233993A1 (en) * 2008-03-06 2009-09-17 Burnham Institute For Medical Research Compositions and methods for inhibiting gsk3 activity and uses thereof
CN101543644B (zh) * 2008-03-27 2012-07-25 中国人民解放军总医院 无支架工程软骨组织的构建方法及其产品
CA2724839A1 (en) * 2008-05-21 2009-11-26 Bioe Llc Differentiation of multi-lineage progenitor cells to pancreatic cells
JP2012500792A (ja) 2008-08-22 2012-01-12 アンスロジェネシス コーポレーション 胎盤細胞集団による骨欠損の治療のための方法および組成物
EP4032552B1 (en) 2008-08-26 2023-10-04 City of Hope Method and compositions for enhanced anti-tumor effector functioning of t cells
GB0818725D0 (en) 2008-10-13 2008-11-19 Habib Nagy A Pharmaceutical composition
EP2182055A1 (en) 2008-10-14 2010-05-05 Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf Human cord blood derived unrestricted somatic stem cells (USSC)
WO2010049752A1 (en) 2008-10-31 2010-05-06 Katholieke Universiteit Leuven Optimized methods for differentiation of cells into cells with hepatocyte and hepatocyte progenitor phenotypes, cells produced by the methods, and methods for using the cells
KR20100054711A (ko) 2008-11-14 2010-05-25 메디포스트(주) 간엽 줄기세포 또는 이의 배양액을 포함하는 신경질환의 예방 또는 치료용 조성물
US10179900B2 (en) 2008-12-19 2019-01-15 DePuy Synthes Products, Inc. Conditioned media and methods of making a conditioned media
AU2010276264B2 (en) 2009-07-21 2013-09-19 Abt Holding Company Use of stem cells to reduce leukocyte extravasation
EP2456853B1 (en) 2009-07-21 2020-10-28 ABT Holding Company Use of stem cells to reduce leukocyte extravasation
US9081008B2 (en) 2009-12-04 2015-07-14 James Sherley Detecting and counting tissue—specific stem cells and uses thereof
US8759098B2 (en) 2009-12-04 2014-06-24 Boston Biomedical Research Institute, Inc. Method for cloning pluripotent stem cells
WO2011106476A1 (en) * 2010-02-25 2011-09-01 Abt Holding Company Modulation of microglia activation
SG10201914001QA (en) 2010-02-25 2020-03-30 Abt Holding Co Modulation of macrophage activation
US20110206647A1 (en) * 2010-02-25 2011-08-25 Abt Holding Company Modulation of Angiogenesis
MX2012011543A (es) 2010-04-08 2013-05-06 Anthrogenesis Corp Tratamiento de sarcoidosis empleando celulas madre placentarias.
WO2011143415A1 (en) 2010-05-12 2011-11-17 Abt Holding Company Modulation of splenocytes in cell therapy
US9090878B2 (en) 2010-06-17 2015-07-28 Katholieke Universiteit Leuven Methods for differentiating cells into hepatic stellate cells and hepatic sinusoidal endothelial cells, cells produced by the methods, and methods for using the cells
WO2012027358A1 (en) 2010-08-23 2012-03-01 President And Fellows Of Harvard College Optogenetic probes for measuring membrane potential
CA2809245C (en) 2010-08-24 2020-07-14 Regents Of The University Of Minnesota Non-static suspension culture of cell aggregates
US9725689B2 (en) 2010-10-08 2017-08-08 Terumo Bct, Inc. Configurable methods and systems of growing and harvesting cells in a hollow fiber bioreactor system
AU2011352036A1 (en) 2010-12-31 2013-07-18 Anthrogenesis Corporation Enhancement of placental stem cell potency using modulatory RNA molecules
US20120258439A1 (en) * 2011-04-11 2012-10-11 Ali Bin M Abdullah Jaffar Protein-Free Culture Media Products
CN102776150A (zh) * 2011-05-13 2012-11-14 上海交通大学医学院附属第九人民医院 一种诱导脐带间充质干细胞分化为内皮细胞的方法
US9040035B2 (en) 2011-06-01 2015-05-26 Anthrogenesis Corporation Treatment of pain using placental stem cells
HUE047474T2 (hu) 2011-06-06 2020-04-28 ReGenesys BVBA Õssejtek expanziója üreges rostbioreaktorokban
GB201119335D0 (en) 2011-11-09 2011-12-21 Univ Leuven Kath Hepatitis virus infectable stem cells
SG11201508403XA (en) 2013-04-12 2015-11-27 Saverio Lafrancesca Improving organs for transplantation
EP2992088B1 (en) 2013-04-30 2019-08-21 Katholieke Universiteit Leuven Cell therapy for myelodysplastic syndromes
WO2015073913A1 (en) 2013-11-16 2015-05-21 Terumo Bct, Inc. Expanding cells in a bioreactor
EP2952578A1 (de) 2014-06-03 2015-12-09 Peter Wernet Epigenetische Reprogrammierung von fötalen Stammzellen
JP6657195B2 (ja) 2014-09-19 2020-03-04 シティ・オブ・ホープＣｉｔｙ ｏｆ Ｈｏｐｅ Ｌ１３Ｒα２を標的とする共刺激性キメラ抗原レセプターＴ細胞
TW201613622A (en) * 2014-10-14 2016-04-16 Bionet Corp Composition for skincare and pharmaceutical composition and preparation method thereof
AU2016387339B2 (en) 2016-01-21 2022-11-17 Abt Holding Company Stem cells for wound healing
CN106377547B (zh) * 2016-09-30 2019-05-31 孔五一 脐带血再生粒子的提取方法及其用途
CN113637633B (zh) * 2021-08-16 2023-11-03 浙江大学 一种促进间充质干细胞向成骨细胞分化的方法
CA3232099A1 (en) 2021-09-23 2023-03-30 Adam Ezra Cohen Genetically encoded voltage indicators and uses thereof

Family Cites Families (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3639949A1 (de) 1986-11-22 1988-06-09 Diagen Inst Molekularbio Verfahren zur trennung von langkettigen nukleinsaeuren
US5192553A (en) * 1987-11-12 1993-03-09 Biocyte Corporation Isolation and preservation of fetal and neonatal hematopoietic stem and progenitor cells of the blood and methods of therapeutic use
US5486359A (en) * 1990-11-16 1996-01-23 Osiris Therapeutics, Inc. Human mesenchymal stem cells
US5851832A (en) * 1991-07-08 1998-12-22 Neurospheres, Ltd. In vitro growth and proliferation of multipotent neural stem cells and their progeny
US5672346A (en) * 1992-07-27 1997-09-30 Indiana University Foundation Human stem cell compositions and methods
US6482231B1 (en) * 1995-11-20 2002-11-19 Giovanni Abatangelo Biological material for the repair of connective tissue defects comprising mesenchymal stem cells and hyaluronic acid derivative
US5842477A (en) * 1996-02-21 1998-12-01 Advanced Tissue Sciences, Inc. Method for repairing cartilage
WO1997039104A1 (en) * 1996-04-17 1997-10-23 Osiris Therapeutics, Inc. Cryopreservation and extensive subculturing of human mesenchymal stem cells
US5843633A (en) * 1996-04-26 1998-12-01 Amcell Corporation Characterization of a human hematopoietic progenitor cell antigen
JPH10295369A (ja) 1997-02-26 1998-11-10 Japan Tobacco Inc 造血幹細胞の製造方法
JPH10306027A (ja) 1997-03-07 1998-11-17 Otsuka Pharmaceut Co Ltd 免疫寛容誘導剤
US6387369B1 (en) * 1997-07-14 2002-05-14 Osiris Therapeutics, Inc. Cardiac muscle regeneration using mesenchymal stem cells
DE19833476B4 (de) 1998-07-24 2005-08-25 Huss, Ralf, Dr. Genetisch modifizierte CD34-Negative, adhärent wachsende hämatopoetische Stammzellen und deren Verwendung in der Gentherapie
CA2371017A1 (en) 1999-04-27 2000-11-02 Layton Bioscience, Inc. Cell therapy for chronic stroke
US20020142457A1 (en) * 1999-12-28 2002-10-03 Akihiro Umezawa Cell having the potentiality of differentiation into cardiomyocytes
JP2005517441A (ja) * 2002-02-19 2005-06-16 メディポスト・カンパニー・リミテッド 臍帯血由来の間葉幹細胞・前駆細胞の分離培養方法及び間葉組織への分化誘導方法
US20040197310A1 (en) * 2003-02-12 2004-10-07 Sanberg Paul R. Compositions and methods for using umbilical cord progenitor cells in the treatment of myocardial infarction

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ALFONSO Z.Z.C. & FRASER J.K: "Osteoblast precursor cells are found in the low-density fraction of umbilical cord blood", BLOOD, vol. 94, no. 10, Suppl. 1, Part 2, 15 November 1999 (1999-11-15), page 161b, XP002231452, Forty-first Annual Meeting of the American Society of Hematology; New Orleans, Louisiana, USA; 3-7 December 1999, ISSN: 0006-4971, Abstract 3897 *
ERICES A. ET AL.: "Mesenchymal progenitor cells in human umbilical cord blood", BRITISH JOURNAL OF HAEMATOLOGY, vol. 109, no. 1, April 2000 (2000-04), pages 235-242, XP002205332, ISSN: 0007-1048, the whole document *
GOODWIN H.S. ET AL.: "Multilineage differentiation activity by cells isolated from umbilical cord blood: expression of bone, fat, and neural markers", BIOLOGY OF BLOOD AND MARROW TRANSPLANTATION, vol. 7, no. 11, November 2001 (2001-11), pages 581-588, XP008012375, ISSN: 1083-8791, the whole document *
GUTIERREZ-RODRIGUEZ M. ET AL.: "Characterization of the adherent cells developed in Dexter-type long-term cultures from human umbilical cord blood", STEM CELLS, vol. 18, no. 1, January 2000 (2000-01), pages 46-52, XP002231492, ISSN: 1066-5099 *
SANCHEZ-RAMOS J.R. ET AL.: "Expression of neural markers in human umbilical cord blood", EXPERIMENTAL NEUROLOGY, vol. 171, no. 1, September 2001 (2001-09), pages 109-115, XP002226905, ISSN: 0014-4886 *
SIRCHIA G. & REBULLA P: "Placental/umbilical cord blood transplantation.", HAEMATOLOGICA, vol. 84, no. 8, August 1999 (1999-08), pages 738-747, XP002226904, ISSN: 0390-6078 *
WERNET P. ET AL.: "Detection of unrestricted multipotential stem cells in human cord blood", BLOOD, vol. 98, no. 11, Part 1, 16 November 2001 (2001-11-16), page 550a, XP002226906, 43rd Annual Meeting of the American Society of Hematology; Orlando, Florida, USA; 7-11 December 2001, ISSN: 0006-4971 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN1553951A (zh) 2004-12-08
DE60123293D1 (de) 2006-11-02
NO20031999L (no) 2003-07-02
PT1404815E (pt) 2006-12-29
EE200300205A (xx) 2003-08-15
CZ20031165A3 (cs) 2003-10-15
JP4799804B2 (ja) 2011-10-26
US7560280B2 (en) 2009-07-14
UA81390C2 (en) 2008-01-10
JP2008179642A (ja) 2008-08-07
BG107770A (bg) 2004-02-27
HK1071771A1 (en) 2005-07-29
CA2426987C (en) 2013-06-11
CA2426987A1 (en) 2002-05-10
JP4805960B2 (ja) 2011-11-02
WO2002036751A2 (en) 2002-05-10
EP1404815B1 (en) 2006-09-20
WO2002036751A3 (en) 2004-01-08
JP2004521617A (ja) 2004-07-22
US20050142118A1 (en) 2005-06-30
EP1404815A2 (en) 2004-04-07
PL362293A1 (en) 2004-10-18
AU2002229533B2 (en) 2007-07-26
HUP0301600A3 (en) 2005-12-28
ATE340255T1 (de) 2006-10-15
AU2953302A (en) 2002-05-15
IL155608A0 (en) 2003-11-23
IL155608A (en) 2009-08-03
NO20031999D0 (no) 2003-05-02
CY1106287T1 (el) 2011-10-12
EA200300536A1 (ru) 2003-12-25
MXPA03003844A (es) 2004-10-15
US7556801B2 (en) 2009-07-07
DE60123293T2 (de) 2007-05-10
HUP0301600A2 (hu) 2003-10-28
DK1404815T3 (da) 2007-01-08
SK5242003A3 (en) 2003-11-04
ES2272563T3 (es) 2007-05-01
US20090238803A1 (en) 2009-09-24
CN100480375C (zh) 2009-04-22
US20020164794A1 (en) 2002-11-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA008619B1 (ru) Применение неограниченных соматических стволовых клеток (ussc) для получения лекарственного средства
Mennan et al. A comprehensive characterisation of large-scale expanded human bone marrow and umbilical cord mesenchymal stem cells
Deasy et al. Long-term self-renewal of postnatal muscle-derived stem cells
Wong et al. Pericytes, mesenchymal stem cells and their contributions to tissue repair
Pittenger et al. Adult mesenchymal stem cells: potential for muscle and tendon regeneration and use in gene therapy
Raynaud et al. Comprehensive characterization of mesenchymal stem cells from human placenta and fetal membrane and their response to osteoactivin stimulation
EP3124600B1 (en) Method for generating a cell condensate for self-organisation
US20050014255A1 (en) Stem cells for clinical and commercial uses
CN109689858B (zh) 用于产生具有体内血管形成能力的中胚层和/或内皮集落形成细胞样细胞的方法
CN108350423A (zh) 用于获得人类褐色/米色脂肪细胞的方法
CN103458935A (zh) 使组织或器官再细胞化以提高其可移植性的方法
Fu et al. Comparative study of the biological characteristics of mesenchymal stem cells from bone marrow and peripheral blood of rats
Hong et al. Skeletal extracellular matrix supports cardiac differentiation of embryonic stem cells: a potential scaffold for engineered cardiac tissue
Tamaki et al. Synchronized reconstitution of muscle fibers, peripheral nerves and blood vessels by murine skeletal muscle-derived CD34−/45− cells
Cheng et al. Influence of human platelet lysate on extracellular matrix deposition and cellular characteristics in adipose-derived stem cell sheets
CN103459590A (zh) 可由机体的脐带或脂肪组织分离的多能干细胞
JP2017104091A (ja) 間葉系細胞の製造方法
BR112020004517A2 (pt) células tronco derivadas de porco neonato e processo para sua preparação
KR102097005B1 (ko) 전구세포 배양액 및 다층 그래핀 필름을 포함하는 줄기세포 분화 촉진용 조성물 및 이의 용도
Jiang et al. Harvesting and cryopreservation of lymphatic endothelial cells for lymphatic tissue engineering
Kryukov et al. Three-dimensional perfusion cultivation of human cardiac-derived progenitors facilitates their expansion while maintaining progenitor state
US12139725B2 (en) Composition for promoting stem cell differentiation, comprising progenitor cell culture solution and multilayer graphene film, and use thereof
Korovina et al. Multipotent mesenchymal stem cells derived from sheep bone marrow: isolation and cryopreservation
KR20170104917A (ko) 폴리-2-하이드록시에틸 메타아크릴레이트를 이용한 사이토카인의 발현능이 증가된 줄기세포의 제조방법
Manfiolli et al. Stem cells, organoids, and cellular therapy

Legal Events

Date Code Title Description
PD1A Registration of transfer to a eurasian application by order of succession in title
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM RU