CN102776150A - 一种诱导脐带间充质干细胞分化为内皮细胞的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属生物医学领域，涉及芍药苷诱导脐带间充质干细胞分化为内皮细胞的方法及用途。本发明中，所述的芍药苷具有式（Ⅰ）的结构；所述方法的诱导分化步骤为：将脐带间充质干细胞分别在含有β-巯基乙醇1-100μmol/L和维甲酸1-100μmol/L5%DMEM的培养基中诱导24小时，然后转入含有芍药苷的内皮细胞条件培养基，每隔两天半量换液，诱导10-14天，获得脐带间充质干细胞来源内皮细胞。本发明中，所述的芍药苷的用途和方法可促进脐带间充质干细胞分化，并提高分获效率，可用于缺血性血管疾病的细胞移植治疗；所获得的内皮细胞可进一步制备成细胞制剂，用于缺血性血管疾病的治疗、及血管组织工程的种子细胞应用。

Description

一种诱导脐带间充质干细胞分化为内皮细胞的方法

技术领域

本发明属生物医学领域，涉及诱导干细胞分化为内皮细胞的方法，具体涉及诱导脐带间充质干细胞分化为内皮细胞的方法，尤其涉及芍药苷诱导脐带间充质干细胞分化为内皮细胞的方法及用途。

背景技术

据报道，细胞移植治疗从细胞水平入手，促进缺血部位新生血管形成，改善血液供应，是目前治疗缺血性血管疾病的新策略。随着研究者对各种干细胞生物学特性认识的不断深入以及分离纯化手段的不断改进，使采用干细胞等治疗性血管生成方法在缺血部位重新建立有效的侧支循环逐渐成为可能；因此，研究者对通过干细胞移植增加血管生成治疗严重的下肢缺血产生了浓厚的兴趣。

目前，将干细胞用于治疗缺血性疾病已经成为了基础和临床研究的热点之一；有关临床前期的研究已经显示出干细胞移植治疗令人鼓舞的成果，但是仍存在许多问题亟需解决，如：细胞来源、免疫反应及伦理学争议等。有研究发现，临床治疗下肢缺血时，取得满意的患肢再灌注，需要移植异源性干细胞2x10⁴/g体重；通过体外培养扩增，100ml健康成人志愿者的外周静脉血通常约可产生5.0x10⁶个内皮干细胞，按上述研究结果预算，用于治疗一条严重缺血的肢体，至少需要12升外周静脉血才能获得足够数量的内皮干细胞，这无疑是极难实现的，因此，对上述疾患的治疗，干细胞的来源问题亟需解决。

有研究表明，脐带间充质干细胞是除骨髓、外周血之外又一极具有潜力的干细胞来源，在组织工程、细胞移植、基因治疗等领域的应用前景广阔。脐带作为干细胞移植的另一种干细胞来源，与骨髓和外周血造血干细胞相比有如下显著优点:（1）富含可在体内长期植入的干、祖细胞；在作体外集落形成试验时，细胞产生的集落形成单位比成人骨髓来源的HSC的更大； （2）干细胞的端粒酶的长度较成年细胞更长；（3）移植后移植物抗宿主病发生率低；（4）在体外的长期培养中仍可以扩增。目前，随着干细胞技术的迅速发展，由多能干细胞向内皮细胞诱导分化已经有了较为完善的技术，但仍存在分化效率低等缺陷。

发明内容

本发明的目的是提供一种涉及诱导干细胞分化为内皮细胞的方法，具体涉及诱导脐带间充质干细胞分化为内皮细胞的方法，尤其涉及芍药苷诱导脐带间充质干细胞分化为内皮细胞的方法。

本发明的进一步目的是提供所述的方法在制备内皮细胞制剂中的用途。

本发明中，所述的脐带间充质干细胞来源于离体的胎儿脐带，获得的脐带充质干细胞经分离、扩增和诱导分化过程制得脐带间充质干细胞来源内皮细胞。

本发明的诱导脐带间充质干细胞分化为内皮细胞的方法中，将脐带间充质干细胞分别在含有β-巯基乙醇和维甲酸5%DMEM的培养基中诱导后，转入含有芍药苷的内皮细胞条件培养基，获得所需的内皮细胞。该方法利用芍药苷诱导脐带间充质干细胞分化为内皮细胞，能有效解决内皮细胞移植治疗中因细胞分化效率低、细胞分化周期长等缺陷造成的难题。

具体而言，本发明的诱导脐带间充质干细胞分化为内皮细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）无菌条件下获得离体脐带，经含有双抗的PBS清洗，切碎，再经胶原酶和胰酶分别消化，收集单细胞悬液，裂解红细胞，然后接种培养；

（2）在含有20%胎牛血清、1-50ng/mlbFGF的间充质干细胞培养基中培养，隔天换液，3-4天传代后得到胎脐带充质干细胞；

（3）上述制得的脐带间充质干细胞在含有β-巯基乙醇1-100μmol/L培养基中诱导24小时后，在1-100μmol/L 5%DMEM的培养基中诱导24小时；

（4）将上述诱导后的脐带间充质干细胞，转入含有芍药苷的内皮细胞条件培养基，每隔两天半量换液，诱导10-14天，获得脐带间充质干细胞来源内皮细胞；

所述的内皮细胞条件培养基中，含有芍药苷1-100μmol/L、ECGF100μmol/L、VEGF 50-100ng/ml、bFGF 10-100ng/ml 5%DMEM的培养基。

本发明的一个实施例中，所述的含有芍药苷的内皮细胞条件培养基为：芍药苷0.25mg/L-50mg/L、ECGF1-100ng/ml、VEGF 50-100ng/ml、bFGF 10-100ng/ml 5%DMEM的培养基。

本发明中，所述的芍药苷为芍药及川赤芍根中提取的单体化合物，是白芍及赤芍的主要有效成分，其分子式：C23H28O11,分子量：480.45，具有式（Ⅰ）的结构：

       （Ⅰ）              ；

所述的芍药苷可由市售或本领域技术人员按常规技术方法制备获得；

通常所述的赤芍和白芍是中医临床常用药：赤芍主要应用于治疗心脑血管疾病，白芍主要应用于治疗一些免疫性疾病及妇科疾病；所述的芍药苷在代谢方面，可调脂降糖；在免疫方面，可抑制炎症发生，对类风湿性关节炎有治疗作用。

本发明中，所述的芍药苷用于制备培养基，具有促进脐间充质干细胞向内皮细胞分化的作用，能提高分化效率、缩短分化时间。

本发明中，进行了脐带间充质干细胞培养过程中的形态变化观察，结果显示，细胞贴壁长至3天后，梭形细胞出现；细胞贴壁生长7天后，有克隆团形成；P3代细胞，细胞形态非常均一，细胞均瘦长，呈梭形，类成纤维样。

本发明中，采用流式细胞技术分析所获得的脐带间充质干细胞的表面重要的标志物，结果显示，所获得的细胞为胎盘来源的具有间充质特征的细胞。

本发明中，经双荧光鉴定诱导分化的内皮细胞，结果显示，其中，DIL-LDL染色阳性呈红色FITC-UEA-1染色阳性呈绿色，双染色阳性细胞分化为内皮细胞。

本发明中，所述的芍药苷诱导分化的内皮细胞可用于缺血性血管疾病的细胞移植治疗及血管组织工程；

或，制成内皮细胞制剂，用于制备治疗缺血性血管疾病的药物或用于其它原因引起的血管损伤的组织修复；

所述药物主要用于缺血性血管疾病的细胞移植治疗，所述的缺血性血管疾病包括缺血性心血管疾病、缺血性脑血管疾病及缺血性下肢血管疾病。

为了便于理解，以下将通过具体的附图和实施例对本发明的诱导脐带间充质干细胞分化为内皮细胞的方法及用途进行详细地描述。需要特别指出的是，这些描述仅仅是示例性的描述，并不构成对本发明范围的限制。依据本说明书的论述，本发明的许多变化、改变对所属领域技术人员来说都是显而易见的。

附图说明

图1显示了脐带间充质干细胞培养过程中的形态变化，其中，A：细胞贴壁长至3天后，梭形细胞出现；B：细胞贴壁生长7天后，有克隆团形成；C：P3代细胞，细胞形态非常均一，细胞均瘦长，呈梭形，类成纤维样。

图2是流式细胞技术鉴定脐带间充质干细胞的表面重要的标志物，其中，采用流式细胞技术分析本研究所获得的脐带间充质干细胞，结果显示：CD44，CD73，CD105，CD29等标志物表达分别为98.5%，97.8%，99.4%，97.2%；CD29和CD44是干细胞特异性的标志，提示细胞为胎盘来源的具有间充质特征的细胞。

图3是诱导分化为内皮细胞的DIL-LDL和FITC-UEA-1双荧光鉴定图，荧光显微镜检测贴壁细胞表面标志，其中，DIL-LDL染色阳性呈红色FITC-UEA-1染色阳性呈绿色，双染色阳性细胞分化为内皮细胞。

具体实施方式

实施例 1 制备含有芍药苷细胞培养基

按常规方法， 制备含有芍药苷的内皮细胞条件培养基，其中：

芍药苷0.25mg/L-50mg/L、ECGF1-100ng/ml、VEGF 50-100ng/ml、bFGF10-100ng/ml 5%DMEM。

所述的芍药苷其分子式：C23H28O11,分子量：480.45，具有式（Ⅰ）的结构：

       （Ⅰ）              。

 

实施例2 诱导脐带间充质干细胞分化为内皮细胞试验

（1）分离脐带间充质干细胞

无菌条件下取5cm左右的离体的脐带组织，用含有青霉素浓度为100U/ml链霉素为100μg/ml的PBS反复冲洗后，剪碎，加入0.1%胶原酶，于37℃消化1h，过100目筛网，收集细胞悬液，室温下以100Or/min离心10min，弃上清；剩余的组织加入含0.02%EDTA的0.05%胰酶中，于37℃消化1h，过100目筛网，收集细胞悬液，室温下以100Or/min离心10min，弃上清；收集细胞，用红细胞裂解液去除红细胞后，用含20%FBS和bFGF的间充质干细胞培养基重悬细胞，制成单细胞悬液；接种到培养瓶中，置于 37℃，5%CO2，95%湿度的培养箱中孵育,3d 后，第1 次换液,去除未贴壁的细胞，之后每48h更换培养液。

（2）间充质干细胞培养与冻存

待培养细胞接近汇流80-90%时，用0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化，以1：3的适中比例传代培养；取第三代细胞鉴定其表面重要标志物。

冻存采用缓慢冷冻。冻存液中各成分比例为DMEM：FBS：二甲基亚砜（DMSO）=4：5：1，细胞浓度为5×10⁵～1×10⁶·mL/1，细胞用棉花包裹后，经-20℃1h，-80℃过夜，最后置于液氮中长期保存。复苏则采用速融方法；将细胞在37℃水浴中迅速融化，用含20%FBS的LG-DMEM洗涤细胞，1000 r·min^-1，离心5min，将细胞接种于含20%FBS的DMEM中。

（3）流式细胞技术检测脐带间充质干细胞表面重要标志物

①0.25%胰酶-0.02%EDTA消化收集不同代次细胞，每例样本细胞数为2×10⁵个左右；

②细胞重悬于1ml 0.01M PBS中洗涤2次，1500r·min^-1，10min；

③弃去PBS，与一抗孵育液（一抗稀释度为1：100）常温下孵育30min；

④0.01M PBS洗涤2次后，分别与FITC－二抗（稀释度为1：50）4℃避光孵育30min；

⑤0.01M PBS洗涤2次后，弃去PBS，再加入300μl 0.01M PBS重悬细胞，用于FACS分析；如不能立即上机检测，可用4%多聚甲醛或70%酒精固定，4℃待测。

（4）脐带间充质干细胞诱导分化为内皮细胞

取P3代脐带间充质干细胞，0.1%明胶包被孔板，按照2×103个/cm2细胞密度接种，无血清过夜培养；脐带间充质干细胞分别在含有β-巯基乙醇1-100μmol/L和维甲酸1-100μmol/L 5%DMEM的培养基中诱导24小时，然后转入含有芍药苷的内皮细胞条件培养基；

其中，所述的含有芍药苷的内皮细胞条件培养基为：芍药苷0.25mg/L-50mg/L、ECGF1-100ng/ml、VEGF 50-100ng/ml、bFGF10-100ng/ml 5%DMEM的培养基，每隔两天半量换液，诱导10-14天获得脐带间充质干细胞来源内皮细胞。

（5）脐带间充质细胞诱导分化为内皮细胞

脐带间充质干细胞经内皮诱导14d后，消化重铺细胞于96孔板中（8×10/孔），重铺36h后进行鉴定。贴壁细胞与Dil-acLDL(2.4μg/mL) 37℃孵育l小时以检测细胞对acLDL的摄取；用2%多聚甲醛固定细胞1Omin，然后用PBS浸洗3次，每次5min、将FITC标记的荆豆凝集素I(FITC-UEA-I，10μg/ml)加于上述标本于37℃下孵育lh，PBS浸洗3次，每次5min，通过激光共聚焦显微镜鉴定细胞对Di-acLDL(红色，激发波长543nm)的摄取，与FITC-UEA-I结合(绿色，激发波长477nm)双染色阳性细胞(呈黄色)。

试验结果证实，本发明所述的芍药苷诱导脐带间充质干细胞分化为内皮细胞的方法可明显促进脐带间充质干细胞分化，并提高分获效率；所分化的内皮细胞可用于缺血性血管疾病的细胞移植治疗；所获得的内皮细胞可进一步制备成细胞制剂，用于缺血性血管疾病的治疗、及血管组织工程的种子细胞应用。

Claims (8)

1.一种诱导脐带间充质干细胞分化为内皮细胞的方法，其特征在于，将脐带间充质干细胞分别在含有β-巯基乙醇和维甲酸5%DMEM的培养基中诱导后，转入含有芍药苷的内皮细胞条件培养基，获得所需的内皮细胞，包括以下步骤：

（1）无菌条件下获得离体脐带，经含有双抗的PBS清洗，切碎，再经胶原酶和胰酶分别消化，收集单细胞悬液，裂解红细胞，然后接种培养；

（2）在含有20%胎牛血清、1-50ng/mlbFGF的间充质干细胞培养基中培养，隔天换液，3-4天传代后得到胎脐带充质干细胞；

（3）上述制得的脐带间充质干细胞在含有β-巯基乙醇1-100μmol/L培养基中诱导24小时后，在1-100μmol/L 5%DMEM的培养基中诱导24小时；

（4）将上述诱导后的脐带间充质干细胞，转入含有芍药苷的内皮细胞条件培养基，每隔两天半量换液，诱导10-14天，获得脐带间充质干细胞来源内皮细胞。

2.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的内皮细胞条件培养基中，含有芍药苷1-100μmol/L、ECGF100μmol/L、VEGF 50-100ng/ml、bFGF 10-100ng/ml 5%DMEM。

3.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的芍药苷分子式为C23H28O11,分子量为480.45，具有式（Ⅰ）的结构：

        （Ⅰ）              。

4.芍药苷在制备内皮细胞条件培养基中的用途。

5.按权利要求4所述的用途，其特征在于，所述的内皮细胞条件培养基中，含有芍药苷1-100μmol/L、ECGF100μmol/L、VEGF 50-100ng/ml、bFGF 10-100ng/ml 5%DMEM。

6.权利要求1的方法所制得的内皮细胞在制备内皮细胞制剂中的用途。

7.按权利要求6所述的用途，其特征在于，所述的内皮细胞制剂在制备治疗缺血性血管疾病的药物或其它原因引起的血管损伤的组织修复药物中的用途。

8.按权利要求7所述的用途，其特征在于，所述的缺血性血管疾病选自缺血性心血管疾病、缺血性脑血管疾病或缺血性下肢血管疾病。

Images