Nothing Special   »   [go: up one dir, main page]

EA006232B1 - Стрептококковые антигены - Google Patents

Стрептококковые антигены Download PDF

Info

Publication number
EA006232B1
EA006232B1 EA200201280A EA200201280A EA006232B1 EA 006232 B1 EA006232 B1 EA 006232B1 EA 200201280 A EA200201280 A EA 200201280A EA 200201280 A EA200201280 A EA 200201280A EA 006232 B1 EA006232 B1 EA 006232B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
polypeptide
vun
polynucleotide
amino acid
polypeptides
Prior art date
Application number
EA200201280A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200201280A1 (ru
Inventor
Джози Хамел
Катерина Оуиллет
Натали Чарлэнд
Денис Мартин
Бернард Бродеур
Original Assignee
Ай Ди Биомедикал Корпорейшн
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ай Ди Биомедикал Корпорейшн filed Critical Ай Ди Биомедикал Корпорейшн
Publication of EA200201280A1 publication Critical patent/EA200201280A1/ru
Publication of EA006232B1 publication Critical patent/EA006232B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/315—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Streptococcus (G), e.g. Enterococci
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/16—Otologicals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Раскрываются стрептококковые полипептиды и кодирующие их полинуклеотиды. Указанные полипептиды могут быть пригодны в качестве компонентов вакцины для профилактики или терапии стрептококковой инфекции у животных. Раскрываются также рекомбинантные способы продуцирования белковых антигенов и диагностические методы выявления стрептококковой бактериальной инфекции.

Description

Настоящее изобретение касается антигенов, эпитопов и антител, специфических для этих эпитопов, в частности, полипептидных антигенов стрептококковой патогенной пневмонии, которые могут быть полезными для профилактики, диагностики или лечения стрептококковой инфекции.
Предпосылки изобретения
8. риеитошае представляет собой важный возбудитель заболевания людей, особенно детей, пожилых людей и лиц с нарушениями иммунитета. Эти бактерии часто выделяют у пациентов с инвазивными заболеваниями, типа бактериемической/септической пневмонии и менингита, которые во всем мире характеризуются высокой заболеваемостью и смертностью. Пневмококковые инфекции даже при соответствующей антибиотикотерапии по-прежнему являются причиной многих смертей. Несмотря на то, что появление противомикробных лекарственных средств снизило общую смертность от пневмококковых заболеваний, главной проблемой в мире в настоящее время стало существование резистентных пневмококковых организмов. Эффективные пневмококковые вакцины могут оказать значительное влияние на заболеваемость и смертность, вызванные 8. риеитошае. Такие вакцины должны также быть пригодны, чтобы предотвратить развитие среднего отита у детей раннего и младшего возраста.
Обычно усилия по созданию пневмококковой вакцины концентрировались на выработке иммунной реакции на капсульный пневмококковый полисахарид. Более 80 пневмококковых капсульных серотипов было проидентифицировано по принципу антигенных различий. Доступная в настоящее время пневмококковая вакцина, которая содержит 23 капсульных полисахарида, наиболее часто являющихся причиной заболевания, обладает существенными недостатками. Они касаются, в первую очередь, низкой иммуногенности некоторых капсульных полисахаридов, разнообразия серотипов и отличиями в распределении серотипов по времени, географическим зонам и возрастным группам. В частности, неспособность вакцин, существующих в настоящее время, а также разрабатываемых капсульных сопряженных вакцин защитить детей младшего возраста от всех серотипов, стимулировала разработку других компонентов 8. риеитошае. Хотя иммуногенность капсульных полисахаридов можно повысить, но главным ограничением для вакцин на основе полисахаридов будет по-прежнему представлять собой специфичность серотипа. Применение антигенно-консервативного иммуногенного антигена пневмококкового белка или в чистом виде, или в сочетании с другими дополнительными компонентами, предполагает возможность создания пневмококковой вакцины на основе белка.
Патент РСТ XVО 98/18930, опубликованный 7 мая 1998 г. и озаглавленный «Антигены и вакцины стрептококковой пневмонии», описывает определенные полипептиды, и заявляется, что они обладают антигенностью. Однако никаких сведений относительно биологической активности этих полипептидов не сообщается. Аналогично не называется никакая консервативная последовательность, являющаяся необходимым биотипом для стандартных вариантов вакцин.
Патент νθ 00/39299 описывает полипептиды, а также полинуклеотиды, кодирующие эти полипептиды. В этом патенте показано, что полипептиды, обозначенные как ВУН-3 и ВУН-11, в эксперименте обеспечивают защиту от смертельной инфекции пневмококков.
Следовательно, сохраняется неудовлетворенная потребность стрептококковых антигенов, которые могут быть полезны в качестве компонентов для профилактики, диагностики и/или терапии стрептококковой инфекции.
Краткое изложение настоящего изобретения
Изолированный полинуклеотид, включающий полинуклеотид, выбранный из (а) полинуклеотида, кодирующего полипептид, обладающий по крайней мере 70% идентичностью со вторым полипептидом, выбранным из таблицы А, В, Ό, Е или Н;
(б) полинуклеотида, кодирующего полипептид, обладающий по крайней мере 95% идентичностью со вторым полипептидом, выбранным из таблицы А, В, Ό, Е или Н;
(в) полинуклеотида, кодирующего полипептид, обладающий последовательностью аминокислот, выбранной из таблицы А, В, Ό, Е или Н; или их фрагментов, аналогов или производных;
(г) полинуклеотида, кодирующего полипептид, выбранный из таблицы А, В, Ό, Е или Н;
(д) полинуклеотида, кодирующего полипептид, способный вырабатывать антитела, обладающие специфическим связыванием с полипептидом, имеющим последовательность, выбранную из таблицы А, В, Ό, Е или Н;
(е) полинуклеотида, кодирующего несущий эпитоп участок полипептида, выбранного из таблицы А, В, Ό, Е или Н; а также (ж) полинуклеотида, комплементарного полинуклеотиду из пп.(а), (б), (в), (г), (д) или (е).
Другими аспектами обеспечиваются новые полипептиды, кодируемые полинуклеотидами по настоящему изобретению; фармацевтические составы или вакцины; векторы, содержащие полинуклеотиды по настоящему изобретению и реально связанные с областью контролируемой экспрессии, а также клетки-хозяина, в которые проведена трансфекция указанными векторами; и способы получения полипептидов, включая культивирование указанных клеток-хозяина в условиях, пригодных для экспрессии.
- 1 006232
Краткое описание рисунков
На фиг. 1 приведена ДНК-последовательность гена 8Р64 ΒΥΗ-3: ЗЕЦ ГО N0:1.
На фиг. 2 приведена ДНК-последовательность, содержащая полностью последовательность гена 8Р64 ВУН-3, начиная с 1777 нуклеотида до 4896 нуклеотида; 8Е0 ГО N0:2.
На фиг. 3 приведена ДНК-последовательность гена 8Р64 ΒΥΗ-11; 8ЕЦ ГО N0:3.
На фиг. 4 приведена ДНК-последовательность, содержащая полностью последовательность гена 8Р64 ΒΥΗ-11, начиная с 45 нуклеотида до 2567 нуклеотида; 8ЕЦ ГО N0:4.
На фиг. 5 приведена ДНК-последовательность, содержащая полностью последовательность гена 8Р64 ΒΥΗ-11-2, начиная с 114 нуклеотида до 2630 нуклеотида; 8ЕЦ ГО N0:5.
На фиг. 6 приведена последовательность аминокислот полипептида 8Р64 ΒΥΗ-3; 8ЕЦ ГО N0:6.
На фиг. 7 приведена последовательность аминокислот полипептида 8Р64 ΒΥΗ-11; 8ЕЦ ГО N0:7.
На фиг. 8 приведена последовательность аминокислот полипептида 8Р64 ΒΥΗ-11-2; 8ЕЦ ГО N0:8.
На фиг. 9 приведена ДНК-последовательность гена 8Р63 ΒΥΗ-3; 8ЕЦ ГО N0:9.
На фиг. 10 приведена последовательность аминокислот полипептида 8Р63 ΒΥΗ-3 ; 8ЕЦ ГО N0:10.
На фиг. 11 приведена последовательность аминокислот полипептида 404.9;5>ЕО ГО N0:11.
На фиг. 12 приведена последовательность аминокислот полипептида 7011.7;5>ЕО ГО N0:12.
На фиг. 13 приведена последовательность аминокислот полипептида 7011.9;5>ЕО ГО N0:13.
На фиг. 14 приведена последовательность аминокислот полипептида 403.4;5>ЕО ГО N0:14.
На фиг. 15 приведена последовательность аминокислот полипептида 8Е3.1;8ЕО ГО N0:15.
На фиг. 16 приведена последовательность аминокислот полипептида 102.2;5>ЕО ГО N0:16.
На фиг. 17 приведена последовательность аминокислот полипептида 10С12.7;8ЕО ГО N0:17.
На фиг. 18 приведена последовательность аминокислот полипептида 14Е6.3;8ЕО ГО N0:18.
На фиг. 19 приведена последовательность аминокислот полипептида Β 12Э8.2;8ЕО ГО N0:19.
На фиг. 20 приведена последовательность аминокислот полипептида 7Е4.1;8ЕО ГО N0:20.
На фиг. 21 приведена последовательность аминокислот полипептида 10Э7.5;8ЕО ГО N0:21.
На фиг. 22 приведена последовательность аминокислот полипептида 1009.3, полипептида 10А2.2 и полипептида Β11Β8.1; 8Е0 ГО N0:22.
На фиг. 23 приведена последовательность аминокислот полипептида 11Β8.4;8ΕΟ ГО N0:23.
На фиг. 24 приведена последовательность аминокислот целевого эпитопа моноклонального антитела Η11Β-11Β8; 8Ер ГО 163.
На фиг. 25 схематически изображен ген ΒΥΗ-3, а также приведено расположение последовательностей гена, кодирующих полипептиды по всей их длине и укороченные полипептиды. Соотношение фрагментов ДНК дано относительно друг друга.
На фиг. 26 схематическое изображен ген ΒΥΗ-11, а также приведено расположение последовательностей гена, кодирующих полипептиды по всей их длине и укороченные полипептиды. Соотношение фрагментов ДНК дано относительно друг друга.
На фиг. 27 схематически изображен ген ΒΥΗ-11-2, а также приведено расположение последовательностей гена, кодирующих полипептиды по всей их длине и укороченные полипептиды. Соотношение фрагментов ДНК дано относительно друг друга.
На фиг. 28 схематически изображен белок ΒΥΗ-3, а также приведено расположение внутреннего и поверхностных эпитопов, распознаваемых определенными моноклональными антителами.
На фиг. 29 схематически изображен белок ΒΥΗ-11-2, а также приведено расположение защитных поверхностных эпитопов, распознаваемых определенными моноклональными антителами.
Фиг. 30 представляет карту плазмиды РиЯУ22.Н15>. Капк -резистентная канамицину кодирующая область; с 1857 термочувствительный репрессивный ген бактериофага λ с 1857; λ рЬ -промотор транскрипции бактериофага λ; Н15-1ад обозначает кодирующую область 6-гистидин; терминатор - терминатор транскрипции Т1; ори -оригинал репликации со1Е1.
На фиг. 31 представлено сравнение последовательностей аминокислот белков ΒΥΗ-3Μ (8р64)и ΒΥΗ-3 (8р63), проведенное с использованием программы С1из1а1 программное обеспечение ΜасΥес1от по секвенированию (версия 6.5.3). Внизу находится обобщающая линия, на которой значками * и . соответственно обозначены идентичные и похожие остатки аминокислот.
На фиг. 32 представлено сравнение последовательностей аминокислот белков ΒΥΗ-3, ΒΥΗ-11 и ΒΥΗ-11-2, проведенное с использованием программы С1из1а1 программное обеспечение МасУссЮг по секвенированию (версия 6.5.3). Внизу находится обобщающая линия, на которой значками * и . соответственно обозначены идентичные и похожие остатки аминокислот.
На фиг. 33 приведена ДНК последовательность гена №\43 (8Е0 ГО N0 257).
На фиг. 34 приведена логически установленная последовательность аминокислот полипептида \Е\\'4.3 (8ЕС ГО N0 258).
Подробное описание настоящего изобретения
Было установлено, что участки полипептидов ΒΥΗ-3 и ΒΥΗ-11 являются внутренними. В штаммах, типа инкапсулированного з.рпеишоша, вызывающих заболевания, другие участки, не содержались. Было
- 2 006232 бы желательно располагать таким полипептидом, который содержал бы участок, не являющийся внутренним. Если значительные участки полипептида являются внутренними, то эти участки не подвержены действию бактерий. Однако в рекомбинантном полипептиде эти участки могут быть в высокой степени иммуногенными и не будут создавать защиту от инфекций. Было бы также желательно иметь в распоряжении полипептид, включающий такой участок, который содержится в большинстве штаммов.
Настоящее изобретение касается полипептидов, в которых, в целях получения специфической иммунной реакции, ненужные участки уничтожены и/или модифицированы.
В соответствии с настоящим изобретением обеспечиваются также полипептиды или полинуклеотиды, кодируемые такими полипептидами, содержащими защищенные домены.
Удивительно, что когда ненужные участки полипептидов уничтожаются или модифицируются, то эти полипептиды обладают требуемыми биологическими свойствами. Это удивительно с точки зрения того факта, что в описании патента РСТ \УО 98/18930 некоторые из этих участков описаны как участки, несущие эпитоп. В других публикациях (типа РСТ \УО 00/37105) утверждалась важность участков, идентифицированных как триада гистидина и области витка, свернутые в кольцо. Настоящим изобретением установлено, что варианты полипептидов ВУН-3 и ВУН-11, в которых были уничтожены и/или модифицированы определенные участки, а также химеры этих полипептидов, обладают биологическими свойствами, и вызывают специфическую иммунную реакцию.
Согласно одному аспекту настоящее изобретение обеспечивает изолированный полипептид, обладающий по крайней мере 70% идентичностью со вторым полипептидом, содержащим последовательность, раскрываемую в настоящем описании, его таблицах и рисунках.
В соответствии с одним аспектом настоящего изобретения обеспечивается изолированный полинуклеотид, включающий полинуклеотид, выбранный из (а) полинуклеотида, кодирующего полипептид, обладающий по крайней мере 70% идентичностью со вторым полипептидом, выбранным из таблицы В, Е или Н;
(б) полинуклеотида, кодирующего полипептид, обладающий по крайней мере 95% идентичностью со вторым полипептидом, выбранным из таблицы В, Е или Н;
(в) полинуклеотида, кодирующего полипептид, обладающий последовательностью аминокислот, выбранной из таблицы В, Е или Н; или их фрагментов, аналогов или производных;
(г) полинуклеотида, кодирующего полипептид, выбранный из табл. В, Е или Н;
(д) полинуклеотида, кодирующего полипептид, способный производить антитела, обладающие специфическим связыванием с полипептидом, имеющим последовательность, выбранную из таблицы В, Е или Н;
(е) полинуклеотида, кодирующего несущий эпитоп участок полипептида, выбранного из таблицы В, Е или Н; а также (ж) полинуклеотида, комплементарного полинуклеотиду из пп.(а), (б), (в), (г), (д) или (е).
Согласно одному аспекту настоящее изобретение обеспечивает изолированный полинуклеотид, кодирующий полипептид, обладающий по крайней мере 70% идентичностью со вторым полипептидом, содержащим последовательность, выбранную из табл. А, В, Ό, Е, О или Н, или их аналогов или производных.
Согласно одному аспекту настоящее изобретение обеспечивает изолированный полинуклеотид, кодирующий полипептид, обладающий по крайней мере 95% идентичностью со вторым полипептидом, содержащим последовательность, выбранную из табл. А, В, Ό, Е, О или Н, их аналогов или производных.
Согласно одному аспекту настоящее изобретение касается полипептидов, характеризующихся последовательностью аминокислот, выбранной из табл. А, В, Ό, Е, О или Н, или их аналогов или производных.
Согласно одному аспекту настоящее изобретение обеспечивает изолированный полинуклеотид, кодирующий полипептид, обладающий по крайней мере 70% идентичностью со вторым полипептидом, содержащим последовательность, выбранную из табл. А, В, Ό, Е, О или Н.
Согласно одному аспекту настоящее изобретение обеспечивает изолированный полинуклеотид, кодирующий полипептид, обладающий по крайней мере 95% идентичностью со вторым полипептидом, содержащим последовательность, выбранную из табл. А, В, Ό, Е, О или Н.
Согласно одному аспекту настоящее изобретение касается полипептидов, характеризующихся последовательностью аминокислот, выбранной из табл. А, В, Ό, Е, О или Н.
Согласно одному аспекту настоящее изобретение обеспечивает изолированный полинуклеотид, кодирующий полипептид, обладающий по крайней мере 70% идентичностью со вторым полипептидом, содержащим последовательность, выбранную из табл. В, Е или Н, или их аналогов или производных.
Согласно одному аспекту настоящее изобретение обеспечивает изолированный полинуклеотид, кодирующий полипептид, обладающий по крайней мере 95% идентичностью со вторым полипептидом, содержащим последовательность, выбранную из табл. В, Е или Н, или их аналогов или производных.
Согласно одному аспекту настоящее изобретение касается полипептидов, характеризующихся последовательностью аминокислот, выбранной из табл. В, Е или Н, или их аналогов или производных.
Согласно одному аспекту настоящее изобретение обеспечивает изолированный полинуклеотид, ко
- 3 006232 дирующий полипептид, обладающий по крайней мере 70% идентичностью со вторым полипептидом, содержащим последовательность, выбранную из табл. В, Е или Н.
Согласно одному аспекту настоящее изобретение обеспечивает изолированный полинуклеотид, кодирующий полипептид, обладающий по крайней мере 95% идентичностью со вторым полипептидом, содержащим последовательность, выбранную из табл. В, Е или Н.
Согласно одному аспекту настоящее изобретение касается полипептидов, характеризующихся последовательностью аминокислот, выбранной из табл. В, Е или Н.
В соответствии с настоящим изобретением все нуклеотиды, кодирующие полипептиды и химерные полипептиды, входят в границы настоящего изобретения.
По другому варианту настоящего изобретения полипептиды или химерные полипептиды в соответствии с настоящим изобретением являются антигенными.
По другому варианту настоящего изобретения полипептиды или химерные полипептиды в соответствии с настоящим изобретением являются иммуногенными.
По еще одному варианту настоящего изобретения полипептиды или химерные полипептиды в соответствии с настоящим изобретением способны вызывать у субъекта иммунную реакцию.
По другому варианту настоящее изобретение касается также полипептидов, которые способны мобилизовать антитела, обладающие специфическим связыванием с определенными выше полипептидами или химерными полипептидами по настоящему изобретению.
В еще одном варианте фрагменты полипептидов по настоящему изобретению должны содержать один или более несущих эпитоп участков, которые проидентифицированы в табл. С и Р. Этот участок должен включать по крайней мере 15 заменимых аминокислот полипептида из табл. С и Р. Этот участок должен включать по крайней мере 20 заменимых аминокислот полипептида из табл. С и Р.
В другом варианте настоящего изобретения создающий несущий эпитоп участок полипептида из таблицы Л(ВУН-З) содержит по крайней мере один полипептид, приведенный в табл. С.
В другом варианте настоящего изобретения создающий несущий эпитоп участок полипептида из таблицы Β(ΒνΝ-11) содержит по крайней мере один полипептид, приведенный в табл. Р.
Антитело, обладающее «специфическим связыванием», представляет собой антитело, которое в некоторой пробе (типа биологической пробы) распознает и связывает выбранные полипептиды, но в значительной степени не распознает и не связывает другие молекулы. Специфическое связывание можно измерить с помощью твердофазного иммуноферментного анализа (ТФИФА) в котором выбранный полипептид используется в качестве антигена.
Если не приведено другого определения, то все используемые здесь технические и научные термины имеют то же самое значение, которое обычно понимается людьми, квалифицированными в области, к которой относится настоящее изобретение. Все публикации, описания патентов, патенты и другие упомянутые здесь ссылки даны по всей полноте. В случае конфликта следует сделать проверку настоящего описания, включая содержащиеся в нем определения. Кроме того, материалы, способы и примеры являются иллюстративными и не предназначены для ограничения настоящего изобретения.
В соответствии с настоящим изобретением термин «защита» в проведенных биологических исследованиях определяется значительным ростом кривой выживаемости, коэффициента или периода выживаемости. Для того, чтобы вычислить значение вероятности Р и определить, является ли разница между двумя группами существенной со статистической точки зрения, может быть полезным применение статистического анализа с использованием логарифмического рангового критерия (для сравнения кривых выживаемости) и точного критерия Фишера (для сравнения коэффициентов выживаемости и количества дней вплоть до смерти). Величины Р, составляющие 0,05 считаются несущественными.
Используемые здесь термины «фрагменты», «производные», или «аналоги» полипептидов по настоящему изобретению включает такие полипептиды, в которых один аминокислотный остаток или большее их количество заменены консервативным или неконсервативным аминокислотным остатком (предпочтительно консервативным),и такие полипептиды, которые могут быть природными или неприродными. По одному варианту производные и аналоги полипептидов по настоящему изобретению должны обладать приблизительно 70% идентичностью с последовательностями, приведенными на рисунках или их фрагментами. Это означает, что 70% этих остатков одинаковы. По другому варианту полипептиды должны обладать более чем 75% гомологией. По еще одному варианту полипептиды должны обладать более чем 80% гомологией. По другому варианту полипептиды должны обладать более чем 85% гомологией. По другому варианту полипептиды должны обладать более чем 90% гомологией. По еще одному варианту полипептиды должны обладать более чем 95% гомологией. По другому варианту полипептиды должны обладать более чем 99% гомологией. В еще одном варианте производные и аналоги полипептидов по настоящему изобретению должны содержать меньше, чем приблизительно 20 замененных, модифицированных аминокислотных остатков или аминокислотных остатков, претерпевших делецию, а более предпочтительно, чтобы их количество было меньше 10. Предпочтительными заменами являются такие замены, которые в данной технологии известны как консервативные, а именно, замененные остатки наделены физическими или химическими свойствами (типа гидрофобности, размера, заряда) функциональных групп.
- 4 006232
Квалифицированные люди должны понимать, что аналоги или производные белков или полипептидов по настоящему изобретению также должны найти применение в контексте настоящего изобретения, а именно в качестве антигенного иммуногенного материала. Таким образом, белки или полипептиды, содержащие одно или более дополнений, делеций, замен и т.п.входят в настоящее изобретение. Помимо этого может быть возможной замена одной аминокислоты другой аминокислотой того же «типа». Например, замена одной гидрофобной аминокислоты другой гидрофобной аминокислотой.
Для сравнения последовательности аминокислот можно использовать программу, типа программы С1и81а1. Эта программа сравнивает последовательности аминокислот и находит оптимальное выравнивание, внедряя, в качестве уместных, пробелы в любую последовательность. Для оптимального выравнивания можно подсчитать идентичность аминокислот или их схожесть (идентичность плюс консервативность типа аминокислоты). Программа типа ВЬЛБТх должна выровнять самый длинный фрагмент секвенирования сходных последовательностей и установить величину нужного соответствия. Таким образом можно провести сравнение, при котором обнаруживаются несколько схожих областей, каждая из которых имеет разное положение. Настоящее изобретение рассматривает оба типа исследования идентичности.
При альтернативном подходе аналогами или производными могут являться слитые белки, которые включают компоненты, более легко подвергающиеся очистке, например эффективным нанесением метки на целевой белок или полипептид. Может быть необходимым удаление этой «метки», или может быть так, что сам слитый белок сохраняет антигенность, достаточную для его полезности.
В дополнительном аспекте настоящего изобретения обеспечиваются антигенные/иммуногенные фрагменты белков или полипептидов по настоящему изобретению, или их аналогов или фрагментов.
Для того, чтобы сохранить свои антигенные/иммуногенные свойства, фрагменты по настоящему изобретению должны включать один такой эпитопный участок (или большее их количество), или они должны быть в достаточной степени похожи на такие участки. Таким образом, согласно настоящему изобретению для фрагментов возможна нерелевантная степень идентичности, поскольку эти фрагменты могут иметь 100% идентичность с определенной частью белка или полипептида, его аналога или производного. Вновь существенным результатом является то, чтобы конкретный фрагмент сохранял антигенные/иммуногенные свойства.
Таким образом для аналогов, производных и фрагментов существенно то, чтобы они по крайней мере обладали степенью антигенности/иммуногенности того белка или полипептида, производным которого являются.
В соответствии с настоящим изобретением в полипептиды по настоящему изобретению входят и полипептиды, и химерные полипептиды.
Входят также и полипептиды, слитые с другими соединениями, меняющими биологические или фармакологические свойства полипептидов, а именно с полиэтиленгликолем - для увеличения периода полупревращения, с лидерной или секреторной последовательностью аминокислот - для облегчения процесса очистки, препро- и пропоследовательностями, а также с (поли)сахаридами.
Более того, в тех ситуациях, когда обнаруживается, что области аминокислот полиморфны, то для более эффективного копирования различных эпитопов разных стрептококковых штаммов желательным может быть изменение одной конкретной аминокислоты или большего их количества.
Помимо этого, для того, чтобы обеспечить стабильность и, в целях сцепления или связывания с подложкой или другой молекулой, увеличить гидрофобность, полипептиды по настоящему изобретению можно модифицировать ΝΗ2 -концевым ацилированием (например, ацилированием, амидирование тиогликолевой кислотой, концевым карбоксиамидированием, к примеру аммиаком или метиламином).
Рассматриваются также гетеро- и гомополипептидные мультимеры полипептидных фрагментов, аналогов и производных. Эти полимерные формы включают, например, один или более полипептидов, сшитых сшивающим линкером (таким, как авидин/биотин, глютеральдегид или диметисуперимидат). В такие полимерные формы включены также полипептиды, которые содержат две или более последовательно соединенные последовательности или обращенные и следующие друг за другом последовательности, продуцированные мультицистронными мРНК, полученными генной инженерией.
Предпочтительно, чтобы фрагмент, аналог или производное полипептида по настоящему изобретению содержал по крайней мере одну антигенную область, а именно по крайней мере один эпитоп.
Для того, чтобы осуществить получение антигенных полимеров (а именно, синтетических мультимеров) можно использовать полипептиды с бис-галоацетильными группами, нитроарилгалогенидами или т.п.группами, в которых указанные реагенты являются специфическими для тиогрупп. Поэтому связь двух меркаптогрупп различных полипептидов может представлять собой одинарную химическую связь, или она может быть образована связывающей группой, содержащей по крайней мере 2 атома углерода, обычно по крайней мере 4, но не более 16 атомов углерода (обычно не более чем приблизительно 14 атомов углерода).
В частном варианте полипептидные фрагменты, аналоги и производные по настоящему изобретению не содержат метиониновый (Мет) остаток как стартовый. Предпочтительно, чтобы полипептиды не содержали лидерной или секреторной последовательности (сигнальной последовательности). Сигналь- 5 006232 ный участок полипептида по настоящему изобретению можно определить, используя утвержденные методику молекулярной биологии. В общих чертах для того, чтобы установить первичный остаток зрелого белка, а следовательно и последовательность зрелого полипептида, из стрептококковой культуры можно выделить представляющий интерес полипептид, а затем его секвенировать.
Согласно другому аспекту настоящего изобретения обеспечиваются составы вакцин, которые содержат один или более стрептококковых полипептидов по настоящему изобретению в смеси с фармацевтически приемлемым носителем, разбавителем или адъювантом. Подходящие адъюванты включают масла, а именно полный или неполный адъювант Фрейнда; соли, а именно А1К(8О4)2, АШа(8О4)2, Α1ΝΗ4(8Ο4)2; кремнезем, каолин, углеродные полинуклеотиды, а именно поли-1С и поли-АИ. Предпочтительные адъюванты включают ΟιιίΙΑ и АШубгодеЕ Вакцины по настоящему изобретению можно вводить парентеральной инъекцией, быстрой инфузией, назофарингеальным всасыванием, дермоабсорбцией, трансбуккально или перорально. В фармацевтически приемлемые носители входит также столбнячный анатоксин.
Термин «вакцина» подразумевает также включение антител. В соответствии с настоящим изобретением в целях лечения или профилактики стрептококковой инфекции и/или заболеваний и симптомов, опосредованных стрептококковой инфекцией, обеспечивается применением одного или более антител, обладающих специфическим связыванием с полипептидами по настоящему изобретению.
Составы вакцин по настоящему изобретению используются для лечения или профилактики стрептококковой инфекции и/или заболеваний и симптомов, опосредованных стрептококковой инфекцией таким образом, как это описано в руководстве по клинической микробиологии (Р. В. Миггау (Еб, ίη еЫеЕ), Е. Е Вагоп, М. А. Р£а11ег, Е. С.Тепоуег апб В. Η. Уо1кеп. Мапиа1 о£ С11шса1 М1сгоЬю1оду, А8М Ргекц ^акЫпдЕоп, Ό. С δίχΐΐι ебйюп, 1995, 1482 р), ссылка на которое дана здесь полностью. В одном варианте составы вакцины по настоящему изобретению используют для лечения или профилактики менингита, среднего отита, бактериемии или пневмонии. В одном варианте составы вакцины по настоящему изобретению используют для лечения и профилактики стрептококковой инфекции и/или заболеваний и симптомов, опосредованных стрептококковой инфекцией, в частности 8. рпеитошае, группой А стрептококков (руодепеЦ, группой В стрептококков (СВ8 или ада1асйае), бшдаПсбае, иЬебц посагб1а, а также золотистым стафилококком. В другом варианте указанная стрептококковая инфекция представляет собой 8. рпеитошае.
В частном варианте вакцины вводят субъектам, имеющим фактор риска стрептококковой инфекции, таким, как дети, люди старшего возраста и лица с нарушением иммунитета.
Согласно использованию в настоящем описании термин «субъекты» включает млекопитающих. В другом варианте таким млекопитающим является человек.
Составы вакцины предпочтительно представляют собой стандартную дозировку, составляющую приблизительно от 0,001 до 100 мкг/кг (антиген/масса тела), более предпочтительно от 0,01 до 10 мкг/кг, а наиболее предпочтительно от 0,1 до 1 мкг/кг. Эту дозировку вводят от 1 до 3 раз с интервалом между иммунизациями, равным приблизительно от 1 до 6 недель.
Составы вакцины предпочтительно представляют собой стандартную дозировку, составляющую приблизительно от 0,01 мкг до 10 мг, более предпочтительно от 1 мкг до 1 мг, а наиболее предпочтительно от 10 до «фрагмент антитела» обозначается антитело или фрагмент антитела, продуцированные с помощью молекулярной биологии. Указанное антитело или фрагменты антитела могут быть поликлональными, или, предпочтительно, моноклональными. Антитело может быть специфическим для нескольких эпитопов, связанных с полипептидами стрептококковой пневмонии, но предпочтительно, чтобы оно было специфическим для одного эпитопа.
Далее приводятся таблицы, суммирующие последовательности, раскрытые в настоящем описании.
- 6 006232
Таблица А, В и С , варианты и эпитоп ВУН-3Таблица А
Семейство Последовательности полипептидов, 8Е<) ПЭ N0
ВУН-З
Νβ^ν21 аа 396-1039 из 8Е<Э ГО. 6
Νβνν25 аа 233-1039- из 8ЕЦ ГО. 6
Νβ\ν40 аа 408-1039 из ВЕС? ГО. 6
Таблица В
Семейство Последовательности полипептидов, 8Ε0ΙΟΝΟ
ВУН-З
ΝΕν/1-тиЦ*· 235
ЫЕУГ35А 236
ΝΕν/42 237
ЫБЗУ49 238
ΝΕ1Λ150 239
ΝΕ1Υ51 240
ΝΕ1Υ52 241
ΝΕ1Υ53 242
ΝΕ3Υ54 243
ΝΕλ¥55 244
ΝΕΫ/56 245
ЫЕ1У56-тш2** 245
ЫЕ\У56-ти13*‘ 245
ΝΕ4ί57 246
ΝΕ1Ϋ63 247
ΝΕ1¥64 248
МЕШ5 249
ΝΕ0/66 250
ΝΕΟ/76 251
ΝΈ\νΐΟ5 252
ΝΕΨ106 253
ΝΕ\νΐΟ7 254
** молчащая мутация, т.е. указанный полипептид тот же самый, что Νεν/1 или Νε\ν 56
Таблица С - Эпитопы ВУН-З
7011.7 12
7011.9 13
Β12Ρ8.2 19
7Ε4.1 20
14Ε6.3 18
4Ρ3.4 14
10С12.7 17
8ЕЗЛ 15
102.2 16
Таблица Р, Е и Г, варианты и эпитоп ВУН-11Таблипа Р
Семейство Последовательности полипептидов, 8ΕΟΙΡΝΟ
ВУН-З
Νβλν19 аа 497-838 из 8к|. ГО 8
Νε\ν24 аа 227-838 из Хед. Ю 8
Таблипа Е-
Семейство Последовательности полипептидов, 8Ε() ΕΡ ΝΟ
ВУН-З
Νβν/43 258
КЕ\У60 293
ΝΕΨ61 294
ΝΕΧΥ62 295
ΝΕ\ν80 296
>1Е\У81 297
ΝΕΛΥ82 298
ΝΕ\ν83 299
ΝΕ\¥84 300
ΝΕ9/85 301
ΝΕΨ88Ρ1 302
ΝΕ\ν88Ρ2 303
ΝΕ\ν88 304
Таблипа Г- эпитопы ВУН-11
10137.5 21
1009.3 22
Β11Β8.1 22
10Α2.2 22
11Β8.4 23
3Α4.1 24
- 7 006232
Таблицы С и Н, химеры
Таблица О
Семейство Последовательности полипептидов, 8Е(? ПЭ ΝΟ
Химеры ВУН-11 и ВУН-З
Νετν17 Μ*-ΝΕν/5-6*Ρ* -ΝΕ4¥1
Νετν20 Μ*-ΝΕν/1 -Ο*Ρ*-ΝΈ\ν5
Νε\ν26 Μ*-ΝΕ\νΐΟ-<3*Ρ*-ΝΕ\ν25
Νβ\ν27 Μ*-ΝΕν/19-6*Ρ*-ΝΕ\ν25
Νβτν28 Μ*-ΝΕ\νΐ0-Ο*Ρ’»-ΝΕ\νΐ
Νβ\ν29 Μ*-ΝΕ\ν5-Ο*Ρ*-ΝΕΨ25
Νε\ν30 Μ* -ΝΕΨ4-Ο*Ρ*-ΝΕ\ν25
Νβ\ν31 Μ*-ΝΕν/4-6*Ρ*-ΝΕ\νΐ
ΝΕλΥ32 Μ*-Ν1·19-<3*Ρ*-ΝΕ\νΐ
* необязательные аминокислоты
ТаблицаН
Семейство Последовательности полипептидов, 8Εφ Ш ΝΟ
Химеры ВУН-11 и ВУН-З
УР 89 305
УР 90 306
УР91 307
УР92 308
УР93 309
УР94 310
УР 108 311
УР109 312
УР 110 313
νρ 111 314
УР112 315
УР113 316
УР114 317
УР115 318
УР116 319
УР117 320
УР119 321
УР120 322
УР121 323
УР122 324
УР123 325
УР124 326
которые сшивают в целях получения полного полипептида (блочное сшивание).
Стандартные способы получения и расшифровки полинуклеотидов и полипептидов описаны в приведенных ниже работах: 8атЬгоок е! а1., (1989) Мо1еси1аг с1ошпд: А ЬаЬога1огу Мапиа1, 2'1 сб. Со1б 8рппд НагЬог, N. Υ.; Сиггеп! Рго!осо1к ίη Мо1еси1аг Вю1оду, (1999) Ебйеб Ьу Аи8иЬе1 Р. М. е! а1., 1окп Жйеу & 8опк, 1пс., Ν.Υ.; РСК С1оп1пд РгоЮсоР. Рюш Мо1еси1аг С1оп1пд 1о Сепейс Епдтееппд, Ебйеб Ьу ЖЫ1е В. А., Нитапа Ргекк, ТоЮ\га. №\\-1ег5еу. 1997, 490 радек; Рго!еш РипЕсабоп, Рппар1е апб РгасЕсек, 8сорек К.К., 8рппдег-Уег1ад, №\ν Υо^к, 3пб Ебйюп, 1993, 380 радек; Сиггеп! РгоЮсоР ш 1ттипо1оду, Ебйеб Ьу СоНдап 1. Е. е! а1., 1окп Жйеу & 8опз 1пс., №\ν Υо^к, ссылки на которые здесь приводятся.
Для продуцирования рекомбинантов осуществляют трансфекцию клетки-хозяина векторами, кодирующими указанный полипептид, а затем проводят культивирование в питательной среде, модифицированной так, как это необходимо для активации промоторов, отбора трансформантов или для амплификации генов. Подходящими векторами являются вектора, жизнеспособные в выбранной клетке-хозяине и способные к репликации в ней; они включают последовательности хромосомных, нехромосомных и синтетических ДНК, например бактериальные плазмиды, ДНК фагов, бакуловирусов, плазмиды дрожжей, векторы, полученные из объединений плазмид и ДНК фагов. Используя рестрикционные ферменты, последовательность полипептидов можно внедрить в вектор на определенное место так, чтобы она была реально сцеплена с содержащей промотор областью контролируемой экспрессии, сайтом связывания рибосомы (согласованная область или последовательность Шайн-Далгарно), а также (необязательно) с оператором (контролирующий элемент). В соответствии с установленными принципами молекулярной биологии (8атЬгоок е! а1., (1989) Мо1еси1аг с1ошпд: А ЬаЬога1огу Мапиа1, 2пб еб, Со1б 8рппд НагЬог, Ν.Υ.; Сиггеп! Рго!осо1к т Мо1еси1аг Вю1оду, (1999) Ебйеб Ьу АикиЬе1 Р. М. е! а1., 1о1т Жйеу & 8опк, 1пс., Ν.Υ.) можно подобрать отдельные компоненты области контролируемой экспрессии, пригодные для данной клетки-хозяина и вектора. Подходящие промоторы включают (однако ими не ограничены): промотор
- 8 006232
БТВ или 8У40, 1ас, 1ас или 1гр промоторы Ε.οοίί, а также Рь промотор λ-фага. Векторы должны предпочтительно содержать исходные селективные маркеры (а именно ген, резистентный ампициллину) или их репликацию. Пригодные бактериальные вектора включают: рЕТ, рЦЕ70. рЦЕ60. рЦЕ-9. рЬк, рЭ10 рйадсхспрГ р51Х 174, рЫнеаспр! 8К, рЬккк, рДН8А. рДН16а. рЫН18А, рДН46А. р1гс99а. рКК223-3, рКК233-3, рЭР540. рШТ5. а также вектора эукариот : рВ1иеВас111, р^БДЕО. р8У2САТ, рО644, рХТ1, р86, р8УК3, рВРУ, рМ86 апй р8УБ. Клетки-хозяина могут представлять собой бактерии, а именно: Е.Со11, ВасШик киЬШщ, 81гер1отусе5; грибы: АкрегдШик шдег, АкрегдШик шйийщ; дрожжи, а именно 8ассйаготусек или эукариоты, а именно СНО, СО8.
При экспрессии полипептида в культуре полученные клетки обычно собирают центрифугированием, а затем разрушают физическим или химическим способом (если прошедший экспрессию полипептид не выделяют в среду). Получившийся в результате этого неочищенный экстракт оставляют для выделения нужного полипептида. Очистку полипептида от культуральной среды или лизата можно провести по общепринятой технологии в зависимости от свойств самого полипептида. Для этого используют осаждение сульфатом аммония или этанолом, экстракцию кислотой, анионную или катионную обменную хроматографию, фосфоцеллюлозную хроматографию, гидрофобную хроматографию, гидроксиапатитовую хроматографию и лектиновую хроматографию. Окончательную очистку можно провести с помощью жидкостной хроматографии высокого разрешения (ВЭЖХ).
Полипептид можно подвергнуть экспрессии с лидерной или секретирующей последовательностью или без нее. В первом случае указанную лидерную последовательность можно удалить посттрансляционной обработкой (см. патенты США 4,431,739; 4,425,437 и 4,338,397, на которые здесь сделана ссылка), или (после очистки прошедшего экспрессию полипептида), используя химические способы удаления.
Согласно другому аспекту стрептококковые полипептиды по настоящему изобретению можно использовать как диагностический тест на стрептококковую инфекцию, в частности, на инфекцию 8. рпеитошае. Для того, чтобы выявить, например, стрептококковый организм в биологическом образце, возможно применение нескольких диагностических способов. Возможно выполнение следующей методики:
(а) получение от пациента биологического образца;
(б) инкубирование антитела или его фрагмента, реагирующего со стрептококковым полипептидом по настоящему изобретению, с биологическим образцом в целях образования смеси; а также (в) выявление в указанной смеси специфически связанного антитела или связанного фрагмента, что указывает на присутствие стрептококков.
Или же, способ выявления антитела, специфичного для стрептококкового антигена в биологическом образце, содержащем указанное антитело, или предположительно содержащем его, можно провести следующим образом:
(а) получение от пациента биологического образца;
(б) инкубирование одного или более стрептококковых полипептидов по настоящему изобретению или их фрагментов с биологическим образцом в целях образования смеси; а также (в) выявление в указанной смеси специфически связанного антитела или связанного фрагмента, что указывает на присутствие стрептококков.
Квалифицированный в этой технологии человек поймет, что этот диагностический тест может иметь разнообразные формы, они включают иммунологический тест типа твердофазного иммуноферментного анализа (ТФИФА), радиоиммунологический тест, или латексный анализ, и, в основном, предназначены для определения являются ли присутствующие в организме антитела специфическими для указанного полипептида.
Последовательности ДНК, кодирующие полипептиды по настоящему изобретению, можно также использовать чтобы сконструировать ДНК-зонды, применяемые для обнаружения стрептококков в биологическом образце, предположительно содержащем такие бактерии. Способ выявления согласно настоящему изобретению включает (а) получение от пациента биологического образца;
(б) инкубирование одного или более ДНК-зондов, обладающих последовательностью ДНК, кодирующей полипептиды по настоящему изобретению или их фрагменты, с биологическим образцом в целях образования смеси; а также (в) выявление в указанной смеси специфически связанного ДНК-зонда, что указывает на присутствие стрептококков.
ДНК-зонды по настоящему изобретению можно также использовать для выявления в образце циркулирующих стрептококков, а именно нуклеиновых кислот 8.рпеитошае. В качестве способа диагностики стрептококковых инфекций можно использовать, например цепную реакции полимеразы (ПЦР).
Такие зонды можно синтезировать, используя стандартную технологию, и можно провести их иммобилизацию на твердой фазе, или на них можно нанести выявляемую метку. Предпочтительным ДНКзондом для такого применения может служить олигомер, последовательность которого комплементарна по крайней мере 6 соседним нуклеотидам стрептококковых полипептидов по настоящему изобретению.
Другой диагностический способ выявления стрептококков у пациента включает (а) нанесение выявляемой метки на антитело, взаимодействующее с полипептидом по настоящему
- 9 006232 изобретению или с его фрагментом;
(б) введение пациенту указанного меченного антитела или меченного фрагмента; а также (в) выявление у указанного пациента специфически связанного антитела или связанного фрагмента, что указывает на присутствие стрептококков.
Следующим аспектом настоящего изобретения является применение стрептококковых полипептидов по настоящему изобретению в качестве иммуногенов при продуцировании специфических антител в целях диагностики, и, в частности, лечения стрептококковых инфекций. Подходящие антитела можно определить стандартными методами скриннинга, например, измеряя на опытной модели способность конкретного антитела к пассивной защите от стрептококковой инфекции. Одним примером модели на животных является описанная ниже модель на мыши. Указанным антителом может быть антитело целиком или его антигенсвязывающий фрагмент, и оно может относиться к любому иммунологическому классу. Такое антитело или его фрагмент может антителом животного, в частности, млекопитающего, а более конкретно - мыши, крысы или человека. Это может быть природное антитело или его фрагмент, или, если это необходимо, рекомбинантное антитело или фрагмент антитела. Термином «рекомбинатное антитело» или «фрагмент антитела» обозначается антитело или фрагмент антитела, продуцированные с помощью молекулярной биологии. Указанное антитело или фрагменты антитела могут быть поликлональными, или, предпочтительно, моноклональными. Антитело может быть специфическим для нескольких эпитопов, связанных с полипептидами стрептококковой пневмонии, но предпочтительно, чтобы оно было специфическим для одного эпитопа.
Другим аспектом настоящего изобретения является использование для пассивной иммунизации антител, специфических к стрептококковым полипептидам по настоящему изобретению. Можно использовать антитела, описанные в настоящем изобретении. Подходящие антитела можно определить стандартными методами скриннинга, например, измеряя на опытной модели способность конкретного антитела к пассивной защите от стрептококковой инфекции. Одним примером модели на животных является описанная ниже модель на мыши. Указанным антителом может быть антитело целиком или его антигенсвязывающий фрагмент, и оно может принадлежать любому иммунологическому классу. Такое антитело или его фрагмент может антителом животного, в частности, млекопитающего, а более конкретно - мыши, крысы или человека. Это может быть природное антитело или его фрагмент, или, если это необходимо, рекомбинантное антитело или фрагмент антитела. Термином «рекомбинатное антитело» или «фрагмент антитела» обозначается антитело или фрагмент антитела, продуцированные с помощью молекулярной биологии. Указанное антитело или фрагменты антитела могут быть поликлональными, или, предпочтительно, моноклональными. Антитело может быть специфическим для нескольких эпитопов, связанных с полипептидами стрептококковой пневмонии, но предпочтительно, чтобы оно было специфическим для одного эпитопа.
Далее приводятся таблицы, суммирующие последовательности, раскрытые в настоящем описании.
- 10 006232
Таблицы А, В и С, варианты и эпитоп ВУН-3Таблица А
Семейство Последовательности полипептидов, 5Е<3 ГО N0
ВУН-З
Νβι*21 аа 396-1039 из 8ЕС? ГО. 6
Νε\ν 25 аа 233-1039 из 8Ер ГО. 6
Νβ\ν 40 аа 408-1039 из 8Е(? ГО. 6
Таблица В
Семейство Последовательности полипептидов, 8Εφ ГО ΝΟ
ВУН-З
ΝΕλνΐ-тиН** 235
ΝΕ\¥35Α 236
ΝΕλ¥42 237
ΝΕ\ν49 238
ΝΕΨ50 239
ΝΕ\ν51 240
ΝΕ4/52 241
ΝΕΜ/53 242
ΝΕΧΪ54 243
ΝΕ3Υ55 244
ΝΕ3Υ56 245
ΝΕ\ν56-τηιιί2** 245
ΝΕ\ν56-τηιι[3** 245
ΝΕ3Υ57 246
ΝΕΧΥ63 247
ΝΕ7/64 248
ΝΕ3Υ65 249
ΝΕ\ν66 250
ΝΕ\ν76 251
ΝΕ3Υ105 252
ΝΕ\νΐΟ6 253
ΝΕλνΐΟ7 254
молчащая мутация, т.е. указанный полипептид тот же самый, что Νε\ν1 или Νβνν 56
- 11 006232
Таблица С - Эпитопы ВУН-З
7011.7 12
7011.9 13
В 1208.2 19
7Р4.1 20
14Р6.3 18
403.4 14
10С12.7 17
8Е3.1 15
102.2 16
Таблица Р, Е и Г, варианты и эпитоп ВУН-11Таблииа Р
Семейство Последовательности полипептидов, 8Е(} Ю ΝΟ
ВУН-З
Νβ\ν19 аа 497-838 из 5ец. ГО 8
Νβιν24 аа 227-838 из 8ец. ГО 8
Таблица Е-
Семейство Последовательности полипептидов, 8Εζ> ГО ΝΟ
ВУН-З
Νο\ν 43 258
ΝΕν/60 293
ΝΕ5Υ61 294
ΝΕ5¥62 295
ΝΕίνδΟ 296
ΝΕ\ν81 297
ΝΕν/82 298
ΝΕν/83 299
- 12 006232
ΝΕ\Μ84 300
ΝΕΨ85 301
ΝΕ5Υ88Ο1 302
ΝΕ\Μ88ϋ2 303
ΝΕΨ88 304
Таблица Г- эпитопы ВУН-11
1007.5 21
10С9.3 22
Β11Β8.1 22
10Α2.2 22
11Ь8.4 23
3Α4.1 24
Таблицы СнН, химеры
Таблица С
Семейство Последовательности полипептидов, 8Ερ Ю ΝΟ
Химеры ВУН-11 и ВУН-З
Νβ«Ί7 Μ*-ΝΕ\ν5-Ο*Ρ* -ΝΕ\Υ1
Νβν20 Μ*-ΝΕ\νΐ-Ο·Ρ*-ΝΕ\ν5
Νενν26 Μ ‘-ΝΕ V1 Ο-С *Ρ*-ΝΕ\ν25
Νβλν27 Μ*-ΝΕ\¥19-ΰ*Ρ*-ΝΕλ¥25
Νε»28 Μ*-ΝΕΆ'10-Ο*Ρ*-ΝΈΛ'1
Νβν29 Μ*-ΝΕ\ν5-6·Ρ·-ΝΕν25
Νβ«30 Μ* -ΝΕν/4-6*Ρ*-ΝΕ\ν25
Νε\ν31 Μ*-ΝΕΐν4-Ο*Ρ*-ΝΕ\νΐ
ΝΕ3Μ32 Μ*-ΝΕ19-Ο*Ρ*-ΝΕΐνΐ
* необязательные аминокислоты
ТаблицтН
Семейство Последовательности полипептидов, ЗЕр Π) N0
Химеры ВУН-11и ВУН-З
УР 89 305
УР 90 306
УР91 307
УР92 308
УР 93 309
УР 94 310
УР108 311
УР109 312
νρ 110 313
νρ 111 314
УР112 315
УР113 316
УР114 317
УР115 318
УР116 319
νΡ117 320
УР119 321
УР120 322
νΡ121 323
УР122 324
УР123 325
УР124 326
- 13 006232
Пример 1. В этом примере описаны использованные штаммы бактерий, плазмиды, праймеры цепной реакции полимеразы (ПЦР), рекомбинантные белки, а также гибридома, продуцирующая антитела.
Клинические изоляты 3. рпеитошае 3Р64 (серогруппа 6) и 8Р63 (серогруппа 9) были предоставлены Ьу 1йе ЬаЬога1о1те бе 1а 3айе РиЬйцие би ЦисЬес. 8ат1е-Аппе-бе-Ве11еуие; штамм Их1 - неинкапсулированное производное типа 2 штамма Ό39, а также типа 3 штамма \УБ2 были получены от Эау|б Е. Вгйек Ггот Ишуегайу оГ А1аЬата, В1гт1пдйат; а тип 3 клинического изолята Р4241 был предоставлен Сейте бе Кесйегсйе еп 1пГес1ю1още би Сейте Нокрйайег бе ГИшуегайе Ьауа1, 3а1йе-Еоу. В настоящем исследовании использовались штаммы Е. сой: ЭН3а (С1Ьсо ВИЙ, СаййекЬигд, ΜΌ), ΑΌ494 (λΌΕ3) (Иоуадеп, Маб1коп, XVI) и ВЬ21 (λ1ϋΕ3) (Ыоуадеп); а также вектор р3Ь301 суперлинкера плазмиды (1пуйтодеп, Зап П1едо, СА); вектор рСМУ-СН (предоставлен Ότ. 31ерйеп А. 1ойпк1оп, Иерайтей Гог Вюсйетййу, ипуегайу оГ Техак, Эайак, Техак); рЕТ32 и рЕТ21 (Ыоуадеп), а также вектора экспрессии риИУ22.Н13 (рис. 30). Этот вектор риВУ22.Н13 содержит кассету бактериофага λ с1857, термочувствительного репрессивного гена, из которого была произведена делеция функционального промотора РЕ. Дезактивация репрессора с1857 путем увеличения температуры от 30-37°С до 37-42°С вызывает индукцию гена под контролем промотора λΡΕ. Праймеры ПЦР, используемые для получения рекомбинантных плазмид, у 5'-конца содержат сайт рестрикции эндонуклеазы, что позволяет направленное клонирование амплифицированного продукта в гидролизованный вектор плазмиды. Использованные олигонуклеотидные праймеры ПЦР приведены ниже в табл. 1. Расположение последовательностей гена, кодирующих генные продукты ВУН-3, ВУН-11 и ВУН-11-2, показаны на рис. 25, 26 и 27 соответственно.
Таблица 1. Перечень олигонуклеотидных праймеров ЦПР
Праймер 8Е<3 ΙΟ ΝΟ Последовательность 5' -3’ Положение нуклеотида Сайты рестрикции
ОСКК 479 25 садЪадаЪсЪдЪдссЪаЪдсасЪ ааас 8Е(}ГО 1. 61-78 8Еф ГО 9: 1-18 В81П
ОСКК 480 26 даЬсЬсЕадасЬасСдсбаЬСсс ЬЬасдсЕаЬд δΕζ) ГО 2: 4909-4887 8Еф ГО 9; 2528-2519 ХЬа1
ОСКК 497 27 абсасЬсдадсаббассСддаСа аЬссЬдС 8ЕС_)ГО 1: 1525-1506 Х1ю!
ОСКК 498 28 сЬдсЬаадсббаЬдааадаббба дае δΕφΙϋ 1: 1534-1548 ΗίικΠΪΙ
Праймер 5Εζ) ГО ΝΟ Последовательность 5' -3' Положение нуклеотида Сайты рестрикции
ОСКК 499 29 даЬасЬсдадсЬдсЬаъъссЬСа с 8Е<3 ГО 2: 4906-4893 ХЬо1
НАМ1 172 30 дааЬсЬсдадЕЕаадсЕдсЬдсЕ ааСЪс 5Е<3 ΙΟ 1: 675-661 ХЬо1
НАШ 247 31 дасдсесдадсдсЕаЬдаааеса даЪаааСЕс 5ЕО ГО 1: 3117-3096 ХЬо1
НАМ1 248 32 дасдсбсдадддсаСХассЬдда ЪааЕссЬдЕЬсаЕд 8ЕфГО 1: 1527-1501 ХЬо1
НАШ. 249 33 садбадаЕсЕсЕЕсаЕсаЬЬЕаб Ъдаааададд 8Е0 ГО 2: 1749-1771 Вё1П
НАШ 278 34 ЕЕаЬЬЕсЫхсабабддасЕЬда садаададсаааееаад 8Е<ЗГО1: 1414-1437 ΝάβΙ
НАМ1 279 35 сдссаадсЬЬсдсбаЪдаааЬса даЕаааЬЕс 8Е15ГО1: · 3117-3096 ΗίηάΙΙΙ
НАШ 280 36 сдссаадсЕЬЬЕссасааЬаЕаа дЬсдаЕЕдаЕЕ 5Εζ) ГО 1: 2400-2377 ΗίηάΙΠ
- 14 006232
НАМД 281 37 ЬСаСЬЬсЬСссаЕаЪддаадЪас сСаСсССддааааадаа 5Е<2 ГО 1: 2398-2421 ΝάβΙ
НАМД 300 38 СЬаЬССсССссаСаСддСдссЕа Ъдсас Сааассадс 5Е0101:62- 82 ΝάβΙ
нам; 313 39 аЬаадааСдсддссдсСЪесаса аЬасаадссдаЪЪдасс $Εζ) ГО 1: 2400-2377 ΝοΙΙ
оскк '487' ' 40 садСадаСс ЬдСдс ССаСдаасе аддессдс ЗЕ<> 1О 3: 58- 79 . ' ' ' ' В8Ш
оскк 488 41 даСсаадсССдсСдсСассСЬСа сЬСасСсСс 8Е9Ю4: 2577-2556 ΗίηάΙΠ
НАШ 171 42 седадаЪаЬссдЬЬаЬсдеСсаа асе 8Εζ) ГО 3: 1060-1075 ЕсоКУ
ΗΑΜΙ 251 43 сСдсаадсССССаааддддааЬа аЬасд 8Е<2 ГОЗ: 1059-1045 ΗίηόΙΙΙ
НАШ 264 44 садСадаСсСдсадаадссССсс СаСсЪд 8Еф ГО 3: 682-700 вёш
ΗΑΜΣ 282 45 ЬсдссаадсССсдЕСаСсдЬСса аассаЪЪддд 8ЕОГОЗ: 1060-1081 ΗίηόΙΙΙ
НАШ 283 46 аСаадааЬдсддссдссЪЬасСс СссеССааСааадссааЬадСЬ 8Е<)ГОЗ: 2520-2492 ΝοίΙ
НАШ 284 47 саЬдссаСддасаСЬда ЬадСсЬ сСЬдааасадс ЗЕЦ ГО 3: 856- 880 ΝοοΙ
НАМЗ 285 48 сдссаадсЬЬс ЬСасСсЬссЬЬС ааСааадссааСад 8ЕОГОЗ: 2520-2494 ΗϊηΗΙΙΙ
НАШ 286 49 сдасаадсССаасаСддЬсдсСа дсдССасс 5Е<2 ГО 3: 2139-2119 5Е(Э ГО 5: 2210-2190 ΗίηάΙΙΙ
НАШ 287 50 саЬассаСдддссЕССаСдаддс асеСаад 5Е9 ГО 3: 2014-2034 ΝςοΙ
НАМ! 288 51 сдасаадсССаадСаааСс Ь Сс а дссЪсСсСсад 5Е(} ГО 3: 2376-2353 ΗίηάΙΠ
Праймер ЗЕрГО ΝΟ Последовательность 5' -3' Положение нуклеотида Сайты рестрикции
- 15 006232
НАМ1 289 52 даЕассаЕддсЕадсдассаЕдЕ Есааадаа 5Е<2 ГО 3: 2125-2146 Νοοί
НАШ 290 53 сдссаадсЕЕаЕсаЕссасЕаас 6 ЕдасЕ Е ЕаЕсас ЗЕО ЮЗ: 1533-1508 ΗΐηάΙΠ
НАШ 291 54 саЕассаЕддаЕаЕЕсЕЕдссЕЕ сЕЕадсЕссд ЗЕО ГО 3: 1531-1554 ΝοοΙ
НАШ 301 ’ 55 саЕдссаЕддЕдсЕЕаЕдаасЕа ддЕЕ'Едс ’ ЗЕО ГО 3: 59-79. ΝοοΙ
НАМ1 302 56 сдссаадсЕЕЕадсдЕЕассааа ассаЕЕаЕс ЗЕО 10 3: 2128-2107 ΗϊικΠΙΙ
НАШ 160 57 дЕаЕЕадаЕсЕдЕЕссЕаЕдаас ЕЕддЕсдЕсасса ЗЕО ГО 5: 172-196 Вё1П
НАМ1 186 58 сдс с Ес Еадас Е ас ЕдЕаЕадда дссдд ЗЕО ГО 5; 2613-2630 ХЬа1
НАШ 292 59 с а ЕдссаЕддааааса Е Е Е саад ссЕЕЕЕасдЕд ЗЕО ГО 5: 925-948 ΝοοΙ
НАМ1 293 60 сдасаадс Е Ес ЕдЕаЕаддадсс ддЕЕдасЕЕЕс ЗЕО Ю 5: 2627-2604 ΗΐηάΙΠ
НАШ 294 61 саЬдссаЪддЬЬсдЬаааааЬаа ддсадассаад ЗЕО ГО 5: 2209-2232 ΝοοΙ
НАМ! 297 62 саЕдс са Еддаадсс ЕаЕЕддаа Едддаад ЗЕО ГО 5: 793-812 ΝοοΙ
НАМ! 352 63 саЕдссаЕддаадссЕаЕЕддаа Едддаадс ЗЕО ГО 5: 793-813 ΝοοΙ
НАМ! 353 64 сдссаадсЕЕдЕаддЕааЕЕЕдс дсаЕЕЕдд ЗЕО ГО 5: 1673-1653 ΗίηάΙΙΙ
НАШ 354 65 сдссаадсЕЕсЕдЕаЕаддадсс ддЕЕдас ЗЕО ГО 5: 2627-2608 ΗίηόΙΙΙ
НАШ 355 66 саЕдссаЕддаЕаЕЕсЕЕдссЕЕ сЕЕадсЕсс ЗЕО ГО 5: 1603-1624 ΝοοΙ
НАШ 404 67 ЕЕаЕЕЕсЕЕссаЕаЕдсаЕддЕд аЕсаЕЕЕссаЕЕаса ЗЕО ΙΟ1: 1186-1207 ΝάβΙ
НАШ 464 68 да ЕдсаЕаЬдааЕаЕдсаассда дЕсадЕЕаадс ЗЕО ГО к 697-720 ΝάβΙ
- 16 006232
НАМ1 465 69 дабдсбсдададсабсааабссд бабссабс 8Е<2 ГО 1: 1338-1318 ХЬо!
НАМ1 466 70 дабдсабабддабсабббссабб асаббсса 8Е0 ГО 1: 1192-1212 Νάεΐ
НАМ1 467 71 дас аадс 6 бддсаб бассбддаб аабссбд 8ЕЦГО 1: 1527-1507 ΗίηΐΙΙΠ
НАМ1 352 . 72 са бдсса бддаадс с ба ббддаа бдддаадс 5Εζ> ГО 5: 793- 813 Мео!
НАМ1 470 73 абаадаабдсддссдссдсбабд ааабсадабаааббс 5ЕЦ1О 1: 3096-3117 ΝοίΙ
НАМ1 471 168 абабдддссссбдбабаддадсс ддббдасбббс 8ЕЦ ГО 5: 2626-2604 Ара I
НАМЛ 472 169 абабдддсссаабабдсаассда дбсадббаадс 8ЕЦ ГО 1: 720-697 Ара I
Праймер 8ЕЦЮ N0 Последовательность 5’ -3' Положение нуклеотида Сайты рестрикции
НАМ! 350 170 Абабдддсссаасабддбсдсба дсдббасс 8Е<2 ГО 3: 2139-2119 Ара I
НАМ1 351, 171 бс ссдддсссдасб бдас адаад адсаааббаад 8Εζ) ГО 1: 1414-1437 Ара!
НАМД 358 172 с а бдсс а бдддасб бдас адаад адсаааббаад 8Εζ) ГО 1: 1415-1437 Хсо1
НАШ 359 173 бсссдддссссдсбабдааабса дабаааббс 8Ες> ГО 1: 3116-3096 Ара 1
НАМ1 403 174 абабдддсссдасаббдабадбс бс ббдааасадс 8ЕС) ГО 3. 856-880 Ара 1
ΗΑΝϋ 361 175 сдссаадсббаасабддбсдсба дсдббасс 8ЕОГОЗ: 2139-2119 ΗιηάΠΙ
НАШ 483 176 абабдддссссббасбсбссббб аабааадссаабад 8Εζ> ГО 3: 2520-2494 Ара!
Приведенные здесь и далее в тексте описания, а также на рисунках символы а, с, д и ΐ обозначают аденозин, цитозин, гуанозин и тимидин соответственно (примеч. переводчика).
Методики молекулярной биологии были осуществлены стандартным образом. См., например, руководство 8атЬтоок, 1.. РгЩск Е. Р., ΜαηίαΙίδ. Т., Мо1еси1аг с1ошид. А 1аЬота1оту тапиа1 νοί. 1-2-3 (кесоиб ебИюи) Со1б 8ргтд НагЬоиг 1аЬога1огу Рге88, 1989, №\ν Уогк, которое включено здесь в виде ссылки. Амплифицированные продукты ПЦР гидролизовали рестрикционной эндонуклеазой и провели их сшивание или с линеаризованной плазмидой р8Ь301, рСМУ-СН, рЕТ, или с вектором экспрессии риКА22.Н18, гидролизованным аналогично, или гидролизованным ферментом, продуцирующим совместимые «липкие» концы. Рекомбинант р8Ь8О1 и рекомбинантные плазмиды ρί'.'Μν-6Η гидролизовали рестрикционными ферментами для того, чтобы осуществить «рамочное» клонирование в вектор экспрессии рЕТ. При использовании векторов рЕТ клоны вначале стабилизировали в Е.со11 ΌΗ5α, это проводилось до введения в Е.со11 ВЬ21(ХОЕ3) или ΑΌ494 (λΌΕ3) в целях экспрессии молекул ΒνΗ-3, ΒνΗ-11 или ΒνΗ-11-2 по всей их длине или укороченных молекул. Каждый из полученных в результате конструктов плазмид был подтвержден секвенированием нуклеотидов. Рекомбинантые белки обозначены как Ν-концевые слитые с тиоредоксином и Н18-1ад (рЕТ32 система экспрессии) белки; как С-концевые слитые с Н18-1ад (сис
- 17 006232 тема экспрессии рЕТ21) белки; или как Ν-концевые слитые с Нщ-1ад (система экспрессии риКУ22.Н18)белки. Полученные экспрессией рекомбинантные белки очистили от супернатантных фракций, образовавшихся после центрифугирования обработанных ультразвуком ГРЮ- (системы рЕТ) или термообработанных (риКУ22.Н18) индуцированных Е. сой; для очистки использовались хелатная металлическая Ηίκ-Βίηά смола (ОШдсп. Οι;·ιΙκ\\όγ11ι. СА). Генные продукты, полученные из 8. рпеитопае 8Р64, приведены ниже в табл. 2. Фрагменты гена, кодирующего белок ВУН-3-8р63 (аминокислотные остатки с 21 по 840 из последовательности 80 ΙΌ N0: 10), были получены из 8. рпеитопае 8Р63, используя 0СИИ479-0СИИ480 совокупности праймеров ЦПР, а также вектор клонирования р8Ь301.
Рекомбинант р8Ь301-ВУН-38р63 гидролизовали для «рамочного» клонирования в вектор рЕТ32 в целях экспрессии молекулы ВУН-3-8р63.
Таблица 2. Перечень укороченных ВУН-3, ВУН-11, ВУН-11-2. а также химерных генных продуктов, полученных из 8. рпеитошае 8Р64
Совокупности праймеров ПЦР Обозначение белков Идентификация Кодируемые аминокислоты (5Е(2 ГО Моб) Вектор клонирования
ОСКК.479-ОСКК480 ВУН-ЗМ ВУН-3 »7055 21-1039 р81.301
ОСКВ.479-ОСВК497 ВУН-ЗАО Ν'-концевой ВУН-3 »/055 21-509 р5Ь301
НАШ248-НАМ124.9 Ь-ВУН-ЗАО Ν'-концевой ΒΥΗ-3 1-509 рВТ-21(+)
ОСКК498-ООВК499 ВУН-ЗВ С'-комцевой ВУН-3 512-1039 р8Е301
ОСКВ479-НАМЛ 72 ВУН-ЗС Ν'-концевой ВУН-3 4/055 21-225 рЕТ-32с(+)
ОСКП487-ОСКВ488 ВУН-11М ВУН-11 №/θ55 20-840 рСМУ-СН
НАМ1251-ОСМ1487 ВУН-11 А Ν’-концевой ВУН-11 νν/055 20-353 рЕТ-32с(+)
НАМИ 71-ОСКК488 ВУН- С'-конисвой ВУН-11 354-840 рЕТ-32 а(+)
НАМ3264-ОСКК488 ВУН- С'-концевой ВУН-11 228-840 рЕТ-32 а(+)
НАШ278-НАМЭ279 ΝΕ3Υ1 С’-концевой ВУН-3 472-1039 рЕТ-21Ь(+)
НАМ1278-НАМ1280 ΝΕ3¥2 С'-концевой ВУН-3 472-800 рЕТ-21Ь(+)
НАМЭ281-НАМ1279 ΝΕ9/3 С'-концевой ВУН-3 800-1039 рЕТ-21Ь(+)
ΗΑΜΙ284-ΗΑΜ3285 ΝΕ9/4 С'-концевой ВУН-11 286-840 рЕТ-210(+)
НАЮ284-НАШ286 ΝΕ1Μ8 ВУН-11 286-713 рЕТ-21<К+)
НАМД287-НАМ3288 ΝΕΥ/6 ВУН-11 672-792 рЕТ-210(+)
НАМ3285-НАМ1289 ΝΕΧΥ7 С'-концевой ВУН-11 709-840 рЕТ-210(+)
НАМП84-НАМ3290 ΝΕ4/8 ВУН-11 286-511 рЕТ-210(+)
НАШ286-НАМ3291 ΝΕν/9 ВУН-11 511-713 рЕТ-210(+)
НАМЛ60-НАМЛ 86 ВУН- ВУН-11-2 »/о 20-838 р81.301
НАМГ292:НАЮ293 ΝΕ\¥10 ВУН-11-2 271-838 рЕТ-2 !0(+)
ΗΑΜ1293-ΙΙΑΜ1294 ΝΕΨΙ1 ВУН-11-2 699-838 - рЕТ-210(+) '
НАШ282-НАМ1283 ΝΕ\913 С'-концевой ВУН-11 354-840 рЕТ-21Ь(+)
НАМ1286-НАМ1297 ΝΈ7/14 ВУН-11-2 227-699 рЕТ-210(+)
НАМ1300-НАМ1313 МЕЗУ 15 Ч’-концевой ВУН-3 21-800 рЕТ-21Ь(+)
ΗΑΝ0301-ΗΑΜΙ302 ΝΕίνΐό Ч'-концевой ВУН-11 №/О55 20-709 рЕТ-210(+)
- 18 006232
Совокупности праймеров ПЦР Обозначение белков Идентификация Кодируемые аминокислоты (8Е0 ΙϋΝοό) Вектор клонирования
НАМ1352-НАШ353 ΝΕλν 18 ВУН-11-2 227-520 ρΕΤ21ά(+)
внутренний
НАМВ54-НАШ355 ΝΕ\νΐ9 С'-концевой ВУН-11-2 . - 497-838 ρΕΤ2Η(+)
ΗΑΝϋ404-ΗΑΜΙ279 ΝΕλΫ21 С'-концевой 396-1039 рЕТ21Ь(~)
ВУН-З
НА1Ш464-НАШ465 ΝΕ\ν22 ВУН-З 233-446 рЕТ-21а(-1-)
внутренний
ΗΑΜ1466-ΗΑΜ3467 ΝΕ\Ϋ23 ВУН-З 398-509 рЕТ-21Ь(+)
внутренний
ΗΑΜΪ352-ΗΑΜΙ293 ΝΕλν24 С’-концевой ВУН 227-838 рЕТ-21ά(+)
11-2
НАМ3464-НАМ1470 ΝΕ\ν25 С'-концевой 233-1039 рЕТ-21Ь(+)
ВУН-З
НАМ1278-НАМД279 ΝΕλνΐ 2 химера* М-ΝΕλν 1 -КЬ рЕТ21Ь(+)
(ΝΕλν 1) НАМ3282- НАМД283 (ΝΕλν 13) -ΝΕλν 13
НАШ284-НАМВ50 ΝΕλν 17 химера* Μ- ΝΕλν 5 -ΟΡ рЕТ214(+)
(ΝΕλν 5) НАМВ51НАМ6279 (ΝΕλΥ 1) -ΝΕλνΐ
НАМВ58-НАШ359 ΝΕ\Υ20 химера* Μ- ΝΕλν 1 -ΟΡ рЕТ21б(+)
(ΝΕλν 1)ΗΑΜ3403ΗΑΜΒ61(ΝΕ\ν5) -ΝΕλν 5
ΗΑΜΙ292-ΗΑΜΙ471 ΝΕν/26 химера * Μ- ΝΕλν 10- рЕТ214(+)
(ΝΕλΥ 10) ΟΡ -ΝΕλν25
НАШ472-
ΒΑΜ1470(ΝΕλν25)
НАМД355-НАМ1471 ΝΕλν27 химера * . Μ-ΝΕλν 19- рЕТ214(+)
(ΝΕλν 19) ΟΡ -ΝΕ\ν25
ΗΑΝΟ472- 1
ΗΑΜ3470(ΝΕ\ν25)
НАМД292-НАШ471 ΝΕλ¥28 химера * Μ-ΝΕλν 10- рЕТ214(+)
(ΝΕλν 10)НАШ351 -ΗΑΜ1279(ΝΕλνΐ) ΟΡ -ΝΕλνΐ
ΗΑΜ3284-ΗΑΜ3350 ΝΕλν29 химера * Μ- ΝΕλν 5 -ΟΡ рЕТ214(+)
(ΝΕλν 5) -ΝΕλν25
НАМД472-
ΗΑΜΪ470(ΝΕ\ν25)
ΗΑΜΙ284-ΗΑΜ1483 ΝΕλ¥30 химера * Μ- ΝΕλν 4 -ΟΡ рЕТ214(+)
(ΝΕλν 4) ·ΝΕλν25
ΗΑΜ3472-
ΗΑΜ3470(ΝΕ\ν25)
ΗΑΜ.1284-ΗΑΜΙ483 ΝΈλ¥31 химера * Μ- ΝΕλν 4 -ΟΡ рЕТ214(+)
(ΝΕλν 4) -ΝΕλνΐ
НАМД351-
ΗΑΜΙ279(ΝΕ\νΐ)
Совокупности праймеров ПЦР Обозначение белков Идентификация Кодируемые аминокислоты (8Е0 ΙΟΝοό) Вектор клонирования
НАМД355НАШ471 ΝΕλν32 Μ- ΝΕλν 19- ρΕΤ21ά(+)
(ΝΕλν 19) ОР ·ΝΕ\νΐ
ΗΑΜ3351-
ΗΑΜΙ279(ΝΕ\νί) .
νν/ο 5$: без сигнальной последовательности. Анализ последовательностей белков ВУН-З, ВУН11 и ВУН-11-2 предполагает наличие мнимых гидрофобных лидерных последовательностей.
* закодированные для химер аминокислоты обозначены как генные продукты, были добавлены дополнительные заменимые аминокислоты М представляет собой метионин, К-лизин, Ь -лейцин, О -глицин, а Р - пролин.
- 19 006232
Секретирующие моноклональные антитела гибридомы получали слиянием клеток селезенки иммунизированных мышей и несекретирующих ИСРРТ-неполных клеток миеломы мыши 8Р2/0, используя методы Рахеказ Эе 81-Ого111 апй 8сйе1йеддег (1. 1ттипо1 Ме11ю4з 35 : 1-21, 1980) с модификациями (1. Ηате1 е! а1. 1. Мей. М1сгоЫо1 23 : 163-170, 1987). Женские особи ΒΑΕΒ/с мышей (Сйаг1ез Ктуег, 81Сопз1ап1, ОиеЬес, Сапайа) иммунизировали или ΒΥΗ-3Μ (слитый белок тиоредоксин-Η^з·Тад-ΒΥΗ3М/система рЕТ32), ΒΥΗ-11Μ (слитый белок тиоредоксин-Η^8·Тад-ΒΥΗ-11М/система рЕТ32), ΒΥΗ-112М (слитый белок тиоредоксин-Η^з·Тад-ΒΥΗ-11-2М/система рЕТ32), ΒΥΗ-11Β (слитый белок тиоредоксин-Η^з·Тад-ΒΥΗ-11Β/система рЕТ32), ΒΥΗ-3Μ (слитый белок тиоредоксин-Η^з·Тад-ΒΥΗ-3М/система 13^’722413), или НЕ\1 генными продуктами штамма 8. рпеитопае 8Р64 (слитый белок ИЕ^НШз-Тад-/ система рЕТ21). Это проводится для выработки моноклональных антител серий Н3-, Н11-, Н112-, Η11Β-, Η3Υ- и ИЮ- соответственно. Сначала супернатанты культур подвергли скриннингу с помощью твердофазного иммуноферментного метода по описанной ранее методике Щате1 е! а1.); использовались пластины, покрытые препаратами из очищенных рекомбинантных белков ΒΥΗ-3, ΒΥΗ-11 и/или ΒΥΗ-11-2, или из суспензий клеток термообработанных клеток 8. рпеитошае. Отобранные для дальнейшего изучения гибридомы, секретирующие моноклональные антитела, представлены в табл. 3 и 4 из приведенного ниже примера 2. Класс и подкласс моноклональных иммуноглобулинов определяли твердофазным иммуноферментным анализом, используя для этого коммерчески доступные реагенты (8ои1йегп Β^оΐесЬпо1оду Аззоаа1ез, Β^^т^пдйат, ЛЬ).
Далее описывается клонирование и экспрессия химерного гена (генов), кодирующих химерные полипептиды, а также защита, выявленная после вакцинации указанными химерными полипептидами.
Фрагменты генов ΒΥΗ-3 и ΒΥΗ-11, соответствующие 3'-концу этих генов, амплифицировали с помощью ПЦР, используя для этого пары олигонуклеотидов, сконструированных таким образом, чтобы амплифицировать те фрагменты генов, которые должны содержаться в указанных химерных генах. Используемые праймеры содержали сайт рестрикции эндонуклеазы у 5'-конца, что допускает направленное «рамочное» клонирование амплифицированного продукта в прошедшие гидролиз вектора плазмид (таблицы 1 и 2). Амплифицированные с помощью ПЦР продукты гидролизовали рестрикционной эндонуклеазой и осуществили сшивание с линеаризованной плазмидой рЕТ21 или вектором р8Ь301. Полученные в результате конструкты плазмид были подтверждены секвенированием нуклеотидов. Рекомбинантные плазмиды рЕТ21, содержащие продукт ПЦР, линеаризовали гидролизом рестрикционными ферментами с целью «рамочного» клонирования второго фрагмента ДНК и получения химерного гена, кодирующего химерную молекулу пневмококкового белка. Рекомбинантные плазмиды р8Ь301, содержащие продукт ПЦР, подвергли гидролизу рестрикционными ферментами для получения включений в ДНК. Полученные в результате включенные фрагменты ДНК очистили, а включения, соответствующие данному химерному гену, сшили с вектором рЕТ21 в целях получения химерного гена. Рекомбинантные химерные полипептиды, приведенные в табл. 2, представляли собой С-концевые слияния с ШзЭад. Полученные экспрессией рекомбинантные белки очистили от супернатантных фракций, образовавшихся после центрифугирования обработанных ультразвуком 1Р1О-(системы рЕТ) или термообработанных индуцированных Е. сой; для очистки использовалась хелатная металлическая Шз-Ешй смола (О1Адеп, С’11а1з\\'ог111, СА).
Группу из 8 женских особей ΒΑΕΒ/с мышей (Сйат1ез Ктуег) подкожно иммунизировали, вводя 25 мкг очищенного слитого Шзйад белка любого сродства (проидентифицированного в присутствии 15-20 мкг адъюванта Οι.ιί1Α), введение проводили дважды с 3-недельным интервалом. Спустя 10-14 дней после последней иммунизации было осуществлено пробное заражение мышей, его проводили, вводя внутривенно 10Е5-10Е6 колониеобразующих единиц (КОЕ) 8.рпеитошае 3 типа, штамм \И2. Полипептиды и фрагменты оказались способными вызывать защитную иммунную реакцию.
Таблица 2 А
Эксперимент Иммуноген Живые : умершие Дни до постинфекционной смерти
1. Отсутствует 0:8 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
ΝΕ\ν 1 2:6 1,2,2,2,2,2, >14,>14
ΝΕ\ν 13 1 :7 1, 1,3, 3,4, 5,5, >14
ΝΕ\ν 12 6:2 3, 11, 6Х>14
ВУНЗМ 1 :7 3,3, 3,3,3,3,3, >14
2. Отсутствует 0:8 1,1, 1, ί, 1, 1,1,1
ΝΕ\ν 17 7: 1 4, 7Х>14
- 20 006232
Пример 2. В этом примере описана идентификация пептидного домена, содержащего целевые эпитопы. Идентификацию проводили, используя моноклональные антитела и описанные в примере 1 рекомбинантные укороченные белки.
Гибридомы исследовали твердофазным иммуноферментным методом на наличие в них укороченных генных продуктов ВУН-3, ВУН-11, или ВУН-11-2, это делалось для того, чтобы описать эпитопы, распознаваемые указанными моноклональными антителами. Укороченные генные продукты получали из штамма 8. риеитошае 8Р64, за исключением ВУН-3-8р63, полученного из штамма 8. риеитошае 8Р63. Реакционноспособность каждого антитела испытывалась на полных (неукороченных) рекомбинантных белках ВУН-3, ВУН-11 или ВУН-11-2, которые использовали в качестве позитивного контроля. В некоторых случаях реакционную способность моноклональных антител оценивали вестерн-иммуноблоттингом, который проводили после отделения генного продукта с помощью 8Э8-РЛСЕ и переноса на нитроцеллюлозную бумагу. Выявленная в результате этого реакционная способность приведена далее в табл. 3 и 4.
Логически установленные расположения эпитопов показаны на рис. 28 и 29. Как видно из данных табл. 3, моноклональные антитела, реагирующие с ВУН-3, можно разделить на две группы: моноклональные антитела, реагирующие с ВУН-3А и моноклональные антитела, реагирующие с ВУН-3В, за исключением моноклональных антител Н11-76-11 и Н3У-15А10, которые реагируют как с молекулами ВУН-3А, так и с молекулами ВУН-3В. Моноклональные антитела, реагирующие с ВУН-3А, можно разделить на 2 подгруппы в зависимости от их способности реагировать с рекомбинантным белком ВУН3С, или отсутствию такой способности. Моноклональные антитела, реагирующие с белком ВУН-3 С, распознают эпитопы, которыми совместно владеют как белок ВУН-3, так и белок ВУН-11. Из данных таблицы 4 видно, что моноклональные антитела, обладающие перекрестной реакционной способностью с ВУН-3, и с ВУН-11, способны взаимодействовать также с рекомбинантными белками ВУН-11 А и ВУН-11-2М. Моноклональные антитела, реагирующие с ВУН-3В, можно разделить на 3 подгруппы с учетом их способности взаимодействовать с рекомбинантыми белками ΝΕν1, ΝΕν2 и ΝΕν3. Некоторые моноклональные антитела способны реагировать только с белком ΝΕν1, в то время как другие антитела обладают реакционной способностью в отношении любого из рекомбинантных белков ΝΕν1 и ΧΕΑ2. или ΝΕν1 и ΝΕ№3.
Моноклональные антитела Н11-7611 взаимодействуют с эпитопами, занимающими более одной позиции в ВУН-3. Реакционная способность Н11-7611 с молекулами ВУН-3АО, ВУН-3В, ВУН-3С, ВУН-11А и ВУН-11-2М предполагает, что эпитоп Н11-7611 может содержать последовательность НХХНХН. Эта последовательность повторяется соответственно 6 и 5 раз в последовательностях белков ВУН-3 и ВУН-11/ВУН-11-2. Отсутствие реакционной способности моноклональных антител Н11-7611 с молекулой ΝΕν10 предполагает, что эпитоп содержит последовательность Н6ОНХН. Многопозиционное картирование эпитопа Н3У-15А10 на ВУН-3 предполагает, что моноклональное антитело взаимодействует с двумя неперекрывающимися фрагментами ВУН-3.
Интересно, что моноклональные антитела Н3-762, Н3У-9С6 и Н3У-16А7 не взаимодействовали с ВУН-3 8р63; это допускает возможность расположения их соответствующих эпитопов на фрагменте 177 аминокислоты, находящемся между 244 и 420 аминокислотами в молекуле ВУН-3 штамма 8.риеитошае 8Р64 (рис. 31).
Как видно из данных табл. 4, моноклональные антитела, которые обладают реакционной способностью относительно ВУН-11- и/или ВУН-11-2, и не распознают молекулы ВУН-3, можно разделить на 3 подгруппы с учетом их способности взаимодействовать с рекомбинантыми белками ВУН-11 А и ΝΕν10. Некоторые моноклональные антитела способны реагировать только с белком ВУН-11 А или ΝΕν10, в то время как другие антитела обладают реакционной способностью в отношении и рекомбинантного белка ВУН-11А и ΝΕν10.
Пример 3. В этом примере описано создание библиотек генов ВУН-3 и ВУН-11-2 в целях картирования эпитопов.
Библиотеки генов ВУН-3 и ВУН-11-2 создавали с использованием рекомбинантных плазмид ДНК: рСМУ-6Н и Р8Ь301, которые содержат соответственно последовательность гена ВУН-3, охватывающую нуклеотиды с 1837 по 4909 (8Ε6 ГО ΝΟ:2) или последовательность гена ВУН-11-2, охватывающую нук
- 21 006232 леотиды с 172 по 2630 (8ЕЦ ГО N0:5); а также систему создания библиотеки Ыоуа1оре® и систему отбора (Ыоуадеп).
Таблица 3. Определенная методом ТФИФА реакционная способность ВУН-3-реактивных моноклональных антител (МКА) с 11 генными продуктами ВУН-3, а также с молекулой ВУН-11М
Исследованные генные продукты ’
МКА (изотип ВУН- зм ВУН- ЗАО ВУН- зв ВУН- зс ΝΕΑ 1 ΝΕΑ 2 ΝΕ\ν 3 ΝΕ\ν 21 ΝΕΑ .22 ΝΕΑ 23 ВУН- 3 5ρ63 ВУН- 11Μ
Н3-4Е9(1) + + - 4- - - - - - - + 4-
НЗ-4И4 (1) + + - + - - - - - - 4- +
Н3-9Н12(1) + + - + - - - - - + +
Н3-7О2(1) + + - + -
НЗ-10А1 (1) + + - - - - - + - + -
ИЗ-403 (1) 4- - + - + - + + - - +, -
Н11-6Е7 (1) 4- + - 4- - ΝΤ ΝΤ ΝΤ + +
Н11-10Н10(2а) + + - + - - - ΝΤ ΝΤ ΝΤ . 4- +
ΗΙ1-7011 <2Ь) + + + + + + ΝΤ ΝΤ ΝΤ + , +
НЗУ-4ЕЗ(1) 4- - + - + - - + - - +' -
НЗУ-2Р2(1) + - + - + + - + - - + -
НЗУ-7Р4(1) + + - + + - + - -
НЗУ-7НЗ (1) + - + - + - + + - - + -
Исследованные генные продукты
ΜΚΑ ВУН- ВУН- ВУН- ВУН- ΝΕΑ ΝΕ\ν ΝΕΑ ΝΕΑ ΝΕ\ν ΝΕ\¥ ВУН- ВУН-
(изотип 1^6) зм 3Αϋ ЗВ зс 1 2 3 21 22 23 3 5ρ63 11Μ
НЗУ-13В8 (1) + + 4- + + - 4-
НЗУ-9С2(1) + 4- - +/- - - - - + - +/- +/-
НЗУ-9С6(1) + + - - - - - - + - . -
НЗУ-16А7(1) + + + 4- -
НЗУ-15А10(1) + + + +/- + + 4- + + . 4- +/-
НЗУ-6ВЗ (1/2) + + ΝΤ ΝΤ + + + + ΝΤ
ΗΝ1-5Η3 (2Ь) + + ΝΤ + + - +
ΗΝ1-8Ε3 (2а) + - + ΝΤ + - - + - - : 4- -
НШ-14Р6(2а) + - + ΝΤ 4- - - + - - • 4- -
ΗΝ1-2Ο2(1) + — + ΝΤ 4- + - + - - 4- -
Исследованные генные продукты ·;
ΜΚΑ ВУН- ВУН- ВУН- ВУН- ΝΕΑ ΝΕΑ ΝΕΑ ΝΕΑ ΝΕΑ ΝΕ\ν ΒνΗ- ВУН-
(изотип ίβΟ) ЗМ ЗАИ ЗВ зс 1 2 3 21 22 23 3 8ρ63 ПМ
тЧ1-12О8(2а) 4- 4- ΝΤ 4- 4- 4- - - 4- -
ΗΝ1-14Β2(2β) 4- 4- ΝΤ 4- 4- + - - 4- -
ΗΝ1-162(2π) 4- 4- ΝΤ + + 4- - - .4-- —
ΗΝ1-10ϋ12(1) 4- 4- ΝΤ 4- 4- 4- - *« 4-. -
ΗΝ1-3Ε5(1) 4- 4- — - + 4- - + - 4- 4-* -
ΝΤ : не исследован ’ +/« : очень низкая реакционная способность, но выше фоновой, возможно неспецифическое связывание с МКА
- 22 006232
Таблица 4. Определенная методом ТФИФ реакционная способность ВУН-11- и/или В УН-11-2реактивных моноклональных антител (МКА) с 14 генными продуктами ВУН-11 и ВУН-11-2, а также с молекулой ВУН-3М _____________________________________________________
Исследованные генные продукты .
МКА (изотип ί«0) ВУН- 11М ВУН- 11А ВУН- 11В ВУН- 11С ΝΕΆ/ 5 ΝΕ\ν 6 ΝΕ\ν 7 ΝΕ\ν 8 ΝΕ\ν 9 ΝΕΨ 10 ΝΕ\ν 11 ΝΕ\ν 14 ΝΕ\ν 18 Ν£\ν 19 ВУН- 11-2- Μ ВУН- 3Μ
Н3-4Г9(1) 4- + + +
НЗ-4П4 (1) + + • + +
НЗ-9Н12 (1) + + 4- +
Н11-6Е7(1) + + - + +
Н11-10Н10 (2а) + - + -
Н11-7611 (2Ь) 4- + + +
Н11-1В12 (1) + 4- -
Н11-7В9 + + + -
Исследованные генные продукты
ΜΚΑ (изотип Ι8θ ВУН- 11Μ ВУН- 1 ΙΑ ВУН- 11Β ВУН- 11С ΝΕ\ν 5 ΝΕ\ν 6 ΝΕ\¥ 7 ΝΕ\ν 8 ΝΕΑν 9 ΝΕ\ν 10 ΝΕ\ν 11 ΝΕ\ν 14 ΝΕ\ν 18 ΝΕ\ν 19 ВУН- 11-2- Μ ВУН- 3Μ
(2а)
Η11-3Η5(1) + - + 4- + - - _* - 4- - + 4- 4· -
ΗΙ1-10Β8 (1) + - + + 4- - - - 4- - 4- + 4- -
Η11-1Α2 (1) + - + 4- 4- - - - 4- - 4- 4- - 4- -
Η112-3Α1 (1) + - 4- ΝΤ 4- - - 4- - 4- - 4- 4- - 4- -
Η112- 13С1 (1) + +/- + ΝΤ 4- - + - 4- - 4- 4- - 4- -
Η112- 10Η10 (1) + + - ΝΤ + - - 4- - 4- - + 4- - 4- -
Н112-Ю8 + + - ΝΤ 4- - 4- 4- - + 4- - 4- -
(2а)
Исследованные генные продукты
ΜΚΑ (изотип Ι8θ) ВУН- им ВУН- 11А ВУН- 11В ВУН- 116 ΝΕ\ν 5 ΝΕ\ν 6 ΝΕ^ 7 ΝΕ\ν 8 ΝΕΨ 9 ΝΕ\ν 10 ΝΕ\ν 11 ΝΕ\ν 14 ΝΕ\ν 18 ΝΕ\ν 19 ВУН- 11-2- Μ ВУН- 3Μ
Η112-1069 (2Ь) 4- 4- ΝΤ + * + + * + * + 4-
Η112-10Α2 (1) 4- 4- ΝΤ + • • 4-/- 4- 4- + + •
Η112-3Ε8 (2а) 4- 4- ΝΤ 4- +/- + + '+ +
Η112-1007 (2а) 4- 4- ΝΤ 4- • + + +
Η112-2Η7 (2а) 4- 4- ΝΤ 4-
Н112-6Н7 (1) 4- 4- ΝΤ ·’ +
Н112-ЗА4 - - - ΝΤ - - - - - 4- 4- - - 4- + •
- 23 006232 (2а)
Н112ΝΤ + + - -4-4-
Исследованные генные продукты
МКА (изотип ВУН- НМ ВУН- 1ΙΑ БУН- ИН ВУН- 11С ΝΕ\ν 5 ΝΕ\ν 6 ΝΕ\¥ 7 ΝΕ\ν 8 ΝΕ¥Τ 9 ΝΕ\ν 10 ΝΕ\ν Π ΝΕλ¥ 14 МЕДУ 18 ΝΕλν 19 ВУН- 11-2- Μ ΒνΗ- 3Μ
ЮС8(1)
Н112-14Н6 (П - - - ΝΤ - - - - - + + - - 4- + -
Н112-702 (1) - - ΝΤ - - - - - + - 4- 4- - 4- -
Н112- 13ΗΙ0 (2а) - - - ΝΤ - - - - - - - + 4- + -
Н112-7Е8 (2Ь) +/- - - ΝΤ - - - - - - - +/- - 4- -
Η112-7Η6 (0 + /- - - ΝΤ - - - - - +/- - - - . - 4- -
Н11В-5Г10 (О 4- - + + + - - + - + - + 4- 4- -
Н11В-15С2 О) + - + + 4- - - + - 4- - + 4- - + -
нив- + - + + 4- - - - + + - + - + + -
Исследованные генные продукты
МКА( изотип 18«) ВУН- 11М ВУН- 11А ВУН- 11В ВУН- 11С ΝΕ\ν 5 ΝΕ\ν 6 ΝΕ\¥ 7 ΝΕ\¥ 8 ΝΕν 9 ΝΕ\¥ 10 ΝΕ\ν 11 ΝΕ\ν 14 ΝΕ\ν 18 ΝΕ\¥ 19 ВУН- 11-2- Μ ВУН- 3Μ
1305-(2)
НПВ-11В8 (1) 4- - + 4- + - - - + 4- - + - 4- 4- —
Н11В-7Е11 (1) + - т + + - - - - 4- - + - - 4- -
Н11В-1С9 (1) + - + + + - - - - + - + - - 4- -
Н11В-5ЕЗ (2) + + + - + - - · - - -
Н11В-6Е8 (О + - + + - - + - - - ΤΜ ... - - - -
ΝΤ: не исследована +/-очень низкая реакционная способность, но выше фоновой , возможно неспецифическое связывание с МКА * : зафиксирован сильный сигнал при исследовании методом вестерн-иммуноблоттинга
Рекомбинантные плазмиды, содержащие фрагменты генов ВУН-3 или ВУН-11-2 очистили, используя для этого О1Адеп набор (С11аг15\\'ог111. СА), а затем подвергли гидролизу рестрикционными ферментами ВдШ и ХЬа1 соответственно. Полученные в результате Вд111-ХЬа1 фрагменты ДНК очистили, проведя экстракцию О1Ас.|шск гелем из О1Адеп набора, а затем для получения случайным образом расщепленной ДНК осуществили гидролиз ДНКазы I. Фрагменты ДНК из 50-200 базовых точек очистили, и обработали Т4 ДНК-полимеразой, чтобы «затупить» концы целевой ДНК. Затем добавили один 3'йА остаток и осуществили сшивание в вектор ρ8ΟΚΕΕΝ-Τ Щоуадеп); при этом действовали по методикам, предложенным производителемЩоуаФре® 8уйет, Поуадеп). Библиотеки клонов Е.со11, каждая из которых отображает небольшой пептид, полученный из генов ВУН-3 или ВУН-11-2, отсортировали стандартным способом, используя для этого моноклональные антитела как иммунологические зонды. Сортировка колоний моноклональными антителами, создающими очень высокий фон на «возвышенностях» колоний, не была успешной. Более того, в нескольких случаях не удалось выявить колоний, экспресси
- 24 006232 рующих эпитоп. Потерю реакционной способности можно вероятно объяснить небольшим количеством продуцированных рекомбинантных белков, или распознаванием конформационно-зависимых эпитопов, содержащих различные белковые домены. Секвенирование включений ДНК из положительных клонов определяет расположение сегмента, кодирующего целевой эпитоп. Эти данные приведены в таблице 5. Пептиды, кодируемые включениями ДНК в рекомбинантный вектор р8СΚΕΕN-Τ, можно очистить и использовать как иммуногены, это описано ниже в примере 6.
Последовательности пептидов, полученные в результате скриннинга библиотек генов ВУН-3 и ВУН-11-2 с антителами, согласуются с данными ТФИФА, касающимися реакционной способности в отношении укороченных генных продуктов. Как и ожидалось, последовательности аминокислот, полученные из Н11-7611, содержали последовательность Н6ЭНХН. Эти данные обеспечивают дополнительное доказательство расположению эпитопов, распознаваемых антителами. Интересно, что хотя антитела Н112-1069, Н112-10А2 и Н11В-11В8 и обладали реакционной способностью в отношении одной и той же последовательности пептидов (аминокислотные остатки с 594 до 679 на последовательности белка ВУН-11-2), клоны, соответствующие последовательности, охватывающей аминокислотные остатки с 658 до 679 были собраны только антителами Н11В-11В8, что выявляет размещение эпитопа Н11В-11В8 между аминокислотными остатками 658-679 (8Ε0 ΙΌ ΝΟ: 163). Антитела Н112-1069, Н112-10А2 и Н11В11В8 являются специфическими в отношении трех отдельных неперекрывающихся эпитопов, расположенных непосредственно на последовательности пептидов, соответствующей аминокислотным остаткам с 594 до 679 (8ΕΟ ГО ΝΟ:22).
Таблица 5. Последовательности пептидов, полученные из скриннинга библиотек генов ВУН-3
- 25 006232
МКА Обозначен ие клона / белка Положение нуклеотида Положение аминокислоты Последовательность аминокислот 8ЕС? Ю ΝΟ
ΗΝ1- Ι2ϋ8 В 1208,2 8Е(? Ю1: 1433-1767 8Е0 ГО 6: 512-589 ΜΚΠΕϋΚΚΙΒΕΚΙΑαΐΜΚ0ΥανΚΒΕ8ΙΗΝΚΕΚΝΑΙΙΥΡΗ0ϋ ΗΗΗΆΏΡΙϋΕΗΚ.Ρν<3ΙΟΗ5Η5ΝΎΕ1ΡΚΡΕΕ£τνΑΚΚΕΟΝ 19
НЗУ- 7Р4 7Р4.1 8Е<} ГО 1: 1633-1785 8Е0 ГО 6: 545-595 ΑΧ IΥΡΗΟΟΗΗΗΑΟΡ ЮЕНКРУОЮНЗНЗЫУЕЬРКРЕЕбУАК КЕЗДЮТТСЕ 20
Н112- 1007 10ϋ7.5 8ЕС> Ю 5 : 1685-1765 8Е<2 Ю 8 : 525-553 ιονΆκίΑακγττΕΒαγίρηρκπιτθϋΕαη 21
Η1Ι2- 1009 1009.3 5ЕО 10 5 : 1893-2150 8Е0 10 8: 594-679 ΏΗ0Ώ5<3ΝΤΕΑΚ6ΑΕΑΙΥΝΚνΚΑΑΚΚνΡΙ>ΏΚΜΡΥΝΒ0ΥΤνΕν ΚΝΟ3&ΙΙ₽ΗΥϋΗΥΗΝΙΚΡΕΝΡυΕΟΕΥΕΑΡΚαΥ3ΙιΕΏΐ4ΐΑΤν κγγν 22
Н112- 10А2 10А2.2 8Е0 ГО 5: 1893-2150 8Е(} ГО 8: 594-679 ϋΗ0Γ3<3ΝΤΕΑΚ<3ΑΕΑΙΥΝΚνΚΑΑΚΚνΡηθΚΜΡΪΝ10ΥΤνΕν КЫОЗЫТРНУПНтаЫХКРЕНГОЕаЬТЕАРКОТЗЬЕПЫДТУ ΚΥΥν 22
НИВ- 11В8 В11В8.1 8Е<? ГО 5 : 1893-2150 8Е<7 Ю 8: 594-679 ΏΗ0υ3σΝΤΕΑΚΟΑΕΑΙΥΝΚνΚΑΑΚΚνΡηϋΚΜΡΥΝΕ<2ΥΤνΕν ΚΝ05ΓΧΙ₽ΗΥΒΗΥΗΝΙΚΡΕΗΡΟΕσΓΥΕΑΡΚΟΥ5ΕΕΟΙχΚΑΤν κγγν 22
нив- 11В8 11В8.4 8Е0 10 5: 2085-2217 8Е0 ГО 8: 658-698 σΏΥΕΑΡΚαΥ8ΕΕηΕΙΛΤνΚΥΥνΕΗΡΝΕΚΡΗ3ϋΝ(3ΡβΝΑ3ηΗ 23
Н112- ЗА4 ЗА4.1 8Е0 ГО 5 : 2421-2626 8Е<} ГО 8: 769-837 УЕКЗУХКАКХАВАЕАЪЬЕКУТОРгХВДКАМЕТЬТЭЬКЗЗЬЬ ИЗТКЛ1ШТ13АЕУСЗЫ»АЬЬКЕЗО₽АР1 24
Приведенные в таблице (столбец 5) и далее в тексте описания, а также на рисунках символы обозначают следующие аминокислоты: Ааланин, ϋ-аспарагиновая кислота, Е-глутаминовая кислота, Р-фенилаланин, О глицин, I- изолейцин, Ь-лейцин, К-аспарагин, оглутамин, К-аргинин, 3-серин, ν-валин,И-триптофан,Υ-тирозин (Примеч. переводчика).
Пример 4. В этом примере описана иммунизация животных рекомбинантными белками в целях выработки антител, реакционноспособных в отношении ВУН-3, ВУН-11 и/или ВУН-11-2.
Была проведена подкожная иммунизация ΝΖν кроликов (СНаг1с5 Кгусг ЬаЬогаЮпсх 81-Соп51ап1, ОнсЬсс. Сапайа). Ее проводили несколькими сериями 50 мкг или 10 мкг очищенного рекомбинантного белка ВУН-3М, Ь-ВУН-ЗАО, ΝΕν1, ΝΕν13 или Ь-ВУН-11 в присутствии 80 мкг адъюванта Ои1А (Ссйаг1апс ЬаЬогаГОпсз Ий, НогпЬу, Сапайа). Дважды с трехнедельным интервалом кроликов подпитывали тем же антителом, образцы крови собирали перед каждой иммунизацией, а также с 6 по 28 день после последней иммунизации. Были разработаны образцы предъиммунной сыворотки, и сывороток после первой, второй и третьей инъекции. Иммунную реакцию кроликов оценивали методом твердофазного иммуноферментного анализа, используя рекомбинанты белка ВУН-3М (ВУН-3М-Н18-Тад) слитый белок/система рЕТ21) или белка ВУН-11М (ВУН-11М-Н18-Тад)слитый белок/система рЕТ21), или суспензии клеток 8. рпситошас К.х-1, ослабленных тепловым действием, в качестве антигенов с покрытием. Титр метода определяли как значение, соответствующее самому высокому разведению, при котором величина поглощения А410 была на 0,1 выше фона. Антитела, взаимодействующие с эпитопом ВУН-3 и/или с эпитопом ВУН-11, выявляли после такой иммунизации у всех животных; это показано в приведенной далее таблице 6. В предъиммунной сыворотке не содержались антитела, взаимодействующие с рекомбинантами или антигенами пневмококков. Иммунную реакцию на иммунизацию можно было выявить в сыворотке каждого кролика после однократной инъекции рекомбинантного антигена. Иммунная реакция после вторичной инъекции любым из тестируемых антигенов характеризовалась значительным ростом титра антитела. Интересно, что были получены хорошие титры антител, способных к реакции с клетками 8.рпситошас. причем после третьей иммунизации среднее значение титра составляло 52000. Это показывает, что нативные пневмококковые эпитопы прошли экспрессию на рекомбинантых генных продуктах Е.соП. Эти данные подтверждают возможность использования генных продуктов ВУН-3, ВУН-11 и/или ВУН-11-2, и антител, полученных на генных продуктах ВУН-3, ВУН-11 и/или ВУН-11-2, в качестве вакцин для предотвращения и лечения пневмококковых инфекций соответственно.
- 26 006232
Таблица 6
Титр ТФИФА для антигена с покрытием
Образец сыворотки
8, рпеитошае
Иммуноген
Предъиммунная
После 1-и иммунизации
После 2-м иммунизации
После 3-й иммунизации
Предъиммунная
После 1-и иммунизации
После 2-й иммунизации
После 3-Й иммунизации
Предъиммунная
После 1-й иммунизации
После 2-й иммунизации
После 3-и иммунизации
Предъиммунная
После 1-й иммунизации
После 2-й иммунизации
После 3-й иммунизации
Предъиммунная
После 1-й иммунизации
После 2-й иммунизации
После 3-я иммунизации
Предъиммунная
После 1-и иммунизации
После 2-и иммунизации
После 3-и иммунизации
- 27 006232
Пример 5. В этом примере описана защита животных в эксперименте от смертельной инфекции стрептококков путем введения им антител, созданных из генных продукте ВУН-3, ВУН-11 или ВУН-11-2.
Препараты антител с высоким титром были получены из асцитной жидкости мышей, инокулированных внутрибрюшинно клетками гибридомы, выделяющими антитела. Процедуру проводили по методу, описанному Вгобеиг с1 а1. (I. 1ттипо1 Мс11юЙ5 71:265-272,1984). У кроликов, иммунизированных ВУН-3М, собрали образцы сыворотки, это проводилось так, как описано в примере 4. Сыворотку кроликов, собранную после третьей иммунизации, а также асцитную жидкость, применяли для очистки антител осаждением, был использован насыщенный 45-50% сульфат аммония. Препараты антител растворили и подвергли диализу в отношении фосфатно-солевого буфера (ФСБ).
СВА/Ν (χιά) мышам (Ναΐίοηαΐ Сапсег 1п8!йи!е, Бгейепск. МА) внутрибрюшинно вводили или 0,1 мл очищенных антител кролика, или 0,2 мл асцитной жидкости; это осуществляли до проведения внутривенного контрольного заражения, осуществляемого приблизительно 200 КОЕ.
8. Рпеитошае. тип 3 штамма УИ2. Контрольные мыши получали стерильный ФСБ или антитела, очищенные от предъиммунной сыворотки кроликов или от сыворотки кроликов, иммунизированых антигеном, неродственным рекомбинантному белку Ν. тешпдйщ. Образцы инокулята 8. рпеитошае поместили на пластины с шоколадным агаром для того, чтобы определить количество колониеобразующих единиц и проверить дозу контрольного заражения. Мышей СВА/Ν выбрали из-за их высокой предрасположенности к инфекции 8. рпеитошае. Было установлено, что доза, приводящая к смерти 50% мышей СВА/Ν, инфицированных внутривенно УИ2, составляет <10 КОЕ. Смерти регистрировались с 24 ч интервалом в течение по крайней мере 7 дней.
Данные по защите мышей, которым делали инъекции антителом кролика в отношении ВУН-3, приведены далее в табл. 7. Из 10 мышей, получавших анти-ВУН-3 антитело, 9 выжили при дозе контрольного заражения; напротив, ни одна из 10 мышей, которым делали инъекцию контрольным антителом или фосфатно-солевым буфером, не выжила. Результаты, показывающие, что антитело, относящееся к молекуле ВУН-3-М, осуществляет пассивную защиту даже в том случае, когда введение было сделано после контрольного заражения, продемонстрировали способность анти-ВУН-3 антитела предотвращать смерть даже от уже установленной инфекции.
Таблица 7. Защитное действие антител кролика к гену ВУН-3-М у СВА/Ν мышей после проведения контрольного внутривенного заражения пневмококком \УЦ2
Препарат антитела Время введения антитела Живые: умершие Дни до постинфекционной смерти
Анти-ВУНЗМ За 1 ч до заражения 5:0 >14, >14, >14, >14, >14
Анти-Ν. теп1п§16<118 За 1 ч до заражения 0:5 2, 2, 2, 2, 2
Анти-ВУН-3 М 0,5 ч после заражения 4: 1 2, >14, >14, >14, >14
Отсутствует (ФСБ) За 1 ч до заражения 0:5 1,2, 2, 2,2
Мыши СВА/Ν были инфицированы 1000 КОЕ штамма УА12 5. рпеитошае до или после внутрибрюшинного введения им 0,1 мл антитела кроликов.
В других экспериментах мышам СВА/Ν вводили внутрибрюшинно 0,1 мл антитела, приготовленного из предъиммунной и иммунной сыворотки; введение проводили за 4 ч до интраназального контрольного заражения 280 КОЕ штамма 8. рпеитошае Р424, тип 3. Как видно из приведенной далее таблицы 8, все иммунизированные мыши выжили после контрольного заражения, в то время как ни одна из 9 мышей, получавших только антитело предъиммунной сыворотки или буфер, не осталась в живых к 6 дню после инфицирования. Гемокультуры 8. рпеитошае на 11 день после контрольного заражения были негативными у всех выживших мышей. Более того, у мышей, получавших моноклональные антитела Н1121069 или смесь Н112-1069 и Н11В-7Е11, специфические в отношении ВУН-11/ВУН-11-2, наблюдалась 100 % защита.
Таблица 8. Защитное действие пассивной передачи антитела кролика генному продукту ВУН-3-М или специфическим антителам анти-ВУН-11/ВУН-11-2 на мышей СВА/Ν, испытавших контрольное интраназальное заражение пневмококком Р4241
- 28 006232
Препарат антитела Живые: умершие Дни до постинфекционной смерти
Анта-ВУН-ЗМ 5:0 >11, >п, >11, >11, >11
Антитело из предъиммунной сыворотки 0:5 3, 3, 3,6,6
Н112-10С9 4:0 >11,>11,>11,>11
Н112-10С9+Н11В-7Е11 5:0 >11, >11, >11,>11, >11
Отсутствует (ФСБ) 0:4 3,3,3,3
Результаты табл. 7 и 8 отчетливо показывают, что иммунизация животных генным продуктом ΒΥΗ3 (типа ΒΥΗ-3Μ) создает защитные антитела, способные в эксперименте предотвратить бактериемическую и пневмонийную инфекции.
Данные по защите, полученные для мышей, которым делали инъекцию асцитной жидкостью, приведены далее в табл. 9. Введение 0,2 мл асцитной жидкости несколькими сериями предотвращает смерть от инфекции в эксперименте. Например, серии Ш12-3А4 + Η112-1009 и Η112-1002 + Η112-10Ό7 из 2 моноклональных антител создают полную защиту от инфекции в эксперименте. Эти данные показывают, что антитела, целевым объектом которых являются эпитопы ΒΥΗ-11 и/или ΒΥΗ-11-2, создают эффективную защиту. Моноклональные антитела Н112-3А4, Η112-1009, Η112-10Ό7, Н112-10А2, Н112-3Е8, Н112-10С5, Н11В-11В8, Η11Β-1502, Н11В-1С9, Н11В-7Е11, Η11Β-13Ό5 и Н11-10В8 находились по крайней мере в одной паре моноклональных антител, и оказалось, что они обладают защитными свойствами и реакционной способностью в отношении защитных эпитопов. В табл. 10 и на фиг. 29 приведены итоговые сведения о расположении на молекулах ΒΥΗ-11-2 эпитопов, обеспечивающих защиту. Все защитные моноклональные антитела Н112-3А4, Η112-1009, Η112-10Ό7, Н112-10А2, Н112-3Е8, Н11210С5, Н11В-11В8, Η11Β-1502, Н11В-1С9, Н11В-7Е11, Η11Β-13Ό5, а также Н11-10В8 обладали реакционной способностью в отношении белка ИЕ\10, которому в молекуле ΒΥΗ-11-2 соответствуют аминокислотные остатки с 271 до 838. Из 12 приведенных моноклональных антител 6 антител обладали специфичностью в отношении эпитопа, присутствующего в белке ИЕ\10, а 3 защитных моноклональных антитела распознавали ИЕ\14. Интересно, что моноклональные антитела Н112-3А4 и Н112-10С5 взаимодействовали с отдельными эпитопами, принадлежащими ΒΥΗ-11-2 и расположенными у карбоксильного конца между аминокислотными остатками с 769 до 837. Моноклональные антитела Η11-701, Н116Е7 и Η3-4Ρ9, реагирующие с эпитопами, охватывающими пневмококковые молекулы ΒΥΗ-3, ΒΥΗ-11 и ΒΥΗ-11-2, не могут осуществлять защиту, даже при их комбинации с защитными моноклональными антителами Η112-1009 или Н112-11В8. Эти моноклональные антитела распознают эпитопы, расположенные у аминного конца молекул ΒΥΗ-3, ΒΥΗ-11 и ΒΥΗ-11-2, содержащих первые 225, 228 и 226 аминокислотных остатка соответственно. Сравнение белковых последовательностей ΒΥΗ-3, ΒΥΗ-11 и ΒΥΗ11-2 выявило, что на аминном участке конца, содержащем эти 225-228 остатки, большое количество аминокислот сохраняется неизменными, их общая идентичность составляет 72,8% (рис. 32).
Данные табл. 9 и 10, приведенных далее, предполагают, что защита, выявляемая эпитопами ΒΥΗ-11 и ΒΥΗ-11-2, заключается в карбокси-концевом продукте, на белках которого ΒΥΗ-11 и ΒΥΗ-11-2 находятся аминокислоты с 229 до 840 и с 227 до 838 соответственно.
- 29 006232 эксперименте
Таблица 9. Пассивная иммунизация специфическими моноклональными антителами.
ВУН-11- и/или ВУН-11-2- способна защитить мышей от смертельной пневмококковой инфекции в
Эксперимент Моноклональное антитело Живые: умершие Дни до постинфекционной смерти
1 Н112 ЗА4 + Н112-1069 6:0 6Х>10
Н112-ЗА4 + Н112-1007 5:1 4, 5Х >10
Отсутствует 0:6 2,2,2, 2,2,6
2 Н112-10 А2 + Н112-ЮО7 5:1 3, 5Х >10
Н112-ЗЕ8+Н112-1069 6:0 6Х>10
Отсутствует 0:6 2, 2, 2,2, 2,2
3 Η112-10ϋ7 + Н11В-11В8 6:0 6Х>10
Н112-1069+ Н11В-1562 3:3 2, 6,6,ЗХ>10
Отсутствует 0:6 2,2,2,2,2,2
4 Н112-1069 + Н112-1007 5:0 5 X >11
Отсутствует 0:5 2,2,2,2,2
5 Н112-1069+ Н11-10В8 4:1 8,4Х>14
Н112-1069 + Н11В-7Е11 5:0 5Х>14
Отсутствует 0:3 1,2,2
6 Н112-1069 + Н11В-1С9 4:1 4,4Х>14
Отсутствует 0:3 2,2,2
7 Н112-ЮС5 + Н11В-13О5 5:0 5Х>14
Отсутствует 3:3 2,2,2
Мышам СВА/Ν была сделана внутрибрюшинная инъекция ОД мл асцитной жидкости за 4 ч до проведения внутривенного пробного заражения 8. рпеитошае
Таблица 10. Логически установленное расположение создающих защиту эпитопов на молекулахВУН-11-2
В совокупности все данные, приведенные в этом примере, доказывают возможность применения антител, относящихся к молекулам ВУН-З, ВУН-11 или ВУН-11-2, в качестве терапевтических средств для защиты, диагностики или лечения заболеваний, вызванных 5, рпеитошае.
- 30 006232
Пример 6. В этом примере описана локализация находящихся на поверхности доменов пептидов, при этом используются моноклональные антитела из примера 1.
8. рпеитошае тип 3, штамм ЖИ2 выращивали в бульоне Тобб Не\\'Щ (ТН) (Эбсо ЬаЬогаФпек, Эе!гоб М1), обогащенном 0,5% дрожжевым экстрактом (Эбсо ЬаЬогаФпек), процесс проводили при 37 °С в атмосфере 8% СО2 с получением ΘΌ600, составляющем 0,20 (приблизительно 108 КОЕ/мл). Затем отобрали аликвоту суспензии бактерий в 1мл образец, а клетки 8. рпеитошае подвергли гранулированию центрифугированием, и вновь суспендировали в гибридомной культуре супернатантов. Затем суспензии бактерий инокулировали в течение 2 ч при 4°С. Образцы дважды промывали блокирующим буфером (фосфатно-солевой буфер, содержащий 2% сывороточного бычьего альбумина)(БСА). Затем в блокирующий буфер добавили 1мл козлиного флуоросцеина (ФИТЦ) и слитого антимышиного иммуноглобулина 1дС + 1дМ и разбавили. После дополнительного инкубирования в течение 60 мин при комнатной температуре образцы дважды промывали в блокирующем буфере и закрепляли в течение 18-24 ч при 4°С, используя для этого 0,25% формальдегид в фосфатно-солевом буфере (ФСБ). Клетки промыли в ФСБ, и провели повторное суспендирование в 500 мкл ФСБ. Вплоть до анализа на проточном цитометре (Ер1ск® ХЬ; Весктап Сои1!ег, 1пс.) клетки сохраняли при 4 °С в темноте. В каждом образце было проанализировано 10 тысяч клеток, полученные результаты представлены как процент флуоресценции и индекс флуоресценции (Р1). Процент флуоресценции представляет собой количество клеток 8. Рпеитошае, меченных флуоросцеином, деленное на 100, а величина индекса флуоресценции - это среднее значение флуоресценции пневмококков, обработанных только конъюгатом, или конъюгатом в сочетании с контрольным неродственным моноклональным антителом. Величина Р1, равная 1, означает, что указанное моноклональное антитело не выявляется на поверхности бактерий, в то время как величина Р1, составляющая больше 2, считается положительной, если имеет метку по крайней мере 10% клеток пневмококков, и она показывает, что указанное антитело обладает реакционной способностью в отношении поверхности клеток эпитопов. Приведенная ниже табл. 11 суммирует данные, полученные для моноклональных антител, протестированных проточной цитометрией.
Проточный цитометрический анализ выявил, что моноклональные антитела, реагирующие с молекулами ВУН-3С и/или ВУН-11 А, не связываются с клетками поверхности. Наоборот (за исключением моноклональных антител Н3У-9С6 и Н3У-16А7), на поверхности пневмококков были выявлены моноклональные антитела, реагирующие с генными продуктами ΝΞ^Σ, ΝΗ^3, ΝΗ\ν22 или ΝΗ\ν23
ВУН-3. Эти данные показывают, что первые 225 аминокислотных остатка, расположенные на аминном конце ВУН-3, являются внутренними. Отсутствие связывания моноклональных антител Н3У-9С6 и Н3У16А7 предполагает, что части последовательности, соответствующие 177 аминокислотам, отсутствуют в молекуле ВУН-3 штамма 8. рпеипошае 8Р63 и они оказались недоступными для антител.
Результаты, полученные от ВУН-11- и/или ВУН-11-2- реактивных моноклональных антител, показали наличие хорошей корреляции между расположением на поверхности и защитой. Все моноклональные антитела, которые, согласно данным проточного цитометрического анализа, реагируют с внутренними эпитопами, не были защитными, в то время как все защитные моноклональные антитела, описанные в примере 5, дали положительный сигнал при проточной цитометрии. Несмотря на то, что для моноклональных антител Н11-7С11 величина Р1 составила 9,0, а % флуоресценции был равен 81,2, однако не было показано, что эти антитела обладают защитными свойствами. Для того, чтобы изучить подробнее возможность конкретного антитела и соответствующего ему эпитопа принять участие в создании противоинфекционного иммунитета, допустимо использование дополнительных анализов.
- 31 006232
Таблица 11. Результаты по связыванию МКА у поверхности 8. рпеишошае, полученные проточной цитометрией
МКА % флуоресценции ΡΙ Связывание Генные продукты, несущие эпитоп МКА
НЗ-4Р9 3.4 1.2 - ВУН-ЗС и ВУН-11А
НЗ-4И4 3.4 1.2 - ВУН-ЗС и ВУН-11А
НЗ-9Н12 2.5 1.1 - ВУН-ЗС и ВУН-11А
НЗ-702 66.2 6.3 + ΝΕλ¥ 22
НЗ-10А1 58.8 5.6 + ΝΕ\ν 23
НЗ^ЮЗ 33.2 3.5 + ΝΕ\ν3
нзхмгз 24.4 2.9 + ΝΕν/1
НЗУ-2Р2 15.6 2.4 + ИЕ5У2
НЗУ-7Р4 58.7 5.6 + ΝΕ\Ϋ2
НЗУ-7НЗ 68.8 6.9 + ΝΕ\Ϋ3
МКА % флуоресценции ΡΙ Связы- вание Генные продукты, несущие эпитоп МКА
НЗУ-13В8 75.0 7.7 + ΝΕ\¥3
НЗУ-9С2 66.4 6.2 + ΝΕ\ν 22
НЗУ-9С6 2.9 1.0 - ΝΕ\ν 22
НЗУ-16А7 6.6 1,7 - ΝΕλ¥ 23
НЗУ-15А10 58.7 5.7 + ΝΕ\ν 22 и ΝΕ\ν 23
ΗΝ1-5Η3 43.4 5.3 + ΝΕ\ν 1
ΗΝ1-8Ε3 57.4 6.6 + ΝΕ\ν 1
ΗΝ1-14Ρ6 57.8 6.7 + ΝΕ\ν 1
ΗΝ1-2Ο2 54.8 6.3 + ΝΕ\¥2
ΗΝ1-12Ο8 14.3 3.0 + ΝΕ\ν2
ΗΝ1-14Β2 11.5 2.7 + ΝΕΧΫ2
ΗΝ1-162 59.9 7.0 + ΝΕ\ν3
НЫ1-10С12 13.6 2.8 + ΝΕ\ν3
Н11-6Е7 4.9 1.2 - ВУН-ЗС и ВУН-1 ΙΑ
Н11-10Н10 6.5 1.6 - ВУН-ЗС и ВУН-1 ΙΑ
НН-7011 81.2 9.0 + ВУН-ЗС и ΝΕ\ν 2
Н11-1В12 3.1 1.2 - ВУН-11А
ΗΙ1-7Β9 2.4 1.1 - ВУН-11А
Н11-10В8 81.1 9.1 + ΝΕ\ν 18κΝΕ)¥8
Н11-1А2 84.4 10 + ΝΕ\νΐ8ΗΝΕ\ν8
Н11-ЗН5 84.0 9.8 + ΝΕ\νΐ8ΗΝΕ\¥8
Н112-13С11 49.3 5.9 + ΝΕ\ν 18 и ΝΕίν 8
Н112-10Н10 0.4 1.0 ВУН-ПАиИЕХУ 18
Н112-108 0.4 1.0 - ΒνΗ-11ΑΗΝΕ\ν 18
Н112-10С9 78.9 10.4 + ΝΕ\ν 19
ΗΪ12-10А2 75.5 9.6 + ΝΕ\ν 19
Н112-ЗЕ8 62.5 7.5 + ΝΕ\¥ 19
Н112-10ϋ7 64.5 7.7 + ΝΕ\ν 14
ΗΙ12-2Η7 0.7 1.1 - ВУН-11А
Н112-6Н7 0.3 1.0 - ВУН-11А
Н112-ЗА4 70.1 8.9 + ΝΕ\νΐ1
Н112-10С5 86.3 9.2 + ΝΕΨ/11η3Α4.1
Н112-14Н6 89.6 11 + ΝΕλνΐΙ
Н112-14Н6 0.8 1.4 ΝΕ\ν 11
Н112-762 4.7 2.0 - ΝΕ\ν 18
Н112-13Н10 0.5 1.0 ΝΕ\ν 18
Н112-7Е8 0.4 1.0 - ВУН-11-2М
Н112-7Н6 0.2 1.0 - ВУН-11-2М
Н11В-5Р10 3.1 1.1 - ΝΕ\¥ 18
НИВ-1562 60.2 5.7 + ΝΕ\νΐ8ΗΝΕ\ν8
Н11В-13П5 75.7 8.3 + ΝΕλ¥ 19
нив-ι 1В8 78.4 8.3 + ΝΕ\ν 19
Η11Β-7Ε1Ι 32.3 3.5 + ΝΕ\ν 14
Н11В-1С9 57.3 5.5 + ΝΕλ¥ 14
Н11В-5ЕЗ 1.8 1.0 - ΝΕ\ν 7
Н11В-6Е8 2.4 1.0 - ΝΕ\¥7
- 32 006232
Пример 7. В этом примере описана иммунизация животных эпитопами пептидов ΒVΗ-3ΒVΗ-11-2.
Рекомбинантый вектор р8СКЕЕ№Т (№уадеп, Майкоп, XVI), содержащий фрагмент ДНК (нуклеотиды с 2421 до 2626 из последовательности 8ЕО ГО N0:5), кодирующий МКА 3А-4 эпитопа (8Е0 ГО N0:24), электропорацией (Сепе Ри1§ег II, ΒΙ0-ΚΑΌ ЬаЬк, Мкыккаида, Сапайа) был превращен в Е.соБ Типег (лЭЕ3) рЬу§8 |ВЬ21 (Р'отрТ Μ8Β (ΎΒιηΒ) да1 йст 1ас ΥΙ рЬу§8 (С т*)] (№гадеп). В этом штамме экспрессия слитого белка контролируется промотором Т7, который распознается Т7 РНКполимеразой (присутствующей на профаге /,ЭЕ3, который сам контролируется 1ас-промотором, индуцируемым изопропил-З-Э-тиогалактопиранозидом (1РТС). Плазмида рЬу§8 снижает уровень экспрессии основных слитых белков кодированием Т7 лизоцима, который является природным ингибитором Т7 РНК-полимеразы.
Полученные трансформанты культивировали при 37°С и 250 об/мин на ΕΒ бульоне (пептон 10г/л, экстракт дрожжей 5г/л, №1С1 5г/л) с добавками 50 мкМ глюкозы, 100 мкг/мл карбенициллина и 34 мкг/мл хлорамфеникола. Процесс проводили до тех пор, пока поглощение при 600 нм не достигло величины 0,7. Избыточную экспрессия Т7 гена слитого белка Н18-Тад-3А4.1 индуцировали добавлением 1РТС до его конечной концентрации в 1мкМ, после чего провели инкубирование при 25°С и перемешивании при 250 об/мин в течение 3 ч. Клетки, полученные из 800 мл культуры, гранулировали при центрифугировании и заморозили при -70°С. Слитый белок очистили от фракции растворимых клеток аффинной хроматографией, основанной на связывании 6 гистидиновых остатков последовательности (Н18-Тад) с двухвалентными катионами (Νί2+), иммобилизованными на металлической хелатной смоле Νί-ΝΓΑ (01адеп, Μίδδίδкаида, Сапайа). Полученные гранулированные клетки «оттаяли» и их повторно суспендировали в буферированном растворе Трис-сахарозы (50мМ Трис, 25% вес/объем сахароза), а потом замораживали при -70°С в течение 15 мин. Затем клетки инкубировали на льду в присутствии лизоцима в количестве 2 мг/мл, это проводили прежде, чем подвергнуть их разрушению с помощью ультразвука. Лизат центрифугировали 30 мин при частоте 12000 об/мин, а для инкубирования в течение ночи при 4°С и частоте встряхивания 100 об/мин к супернатанту добавили хелатную смолу Νί-ΝΓΑ (01адеп). После того, как смолу промыли буфером, содержащим 20мМ Трис, 500 мМ №1С1 и 20 мМ имидазола (рН 7,9), слитый белок 3А4.1 элюировали тем же самым буфером с добавкой 250 мМ имидазола. Отделение солей и имидазола от фосфатно-солевого буфера провели диализом при 4°С. Концентрацию белка определяли с помощью специального анализатора белка (Регсе, Лоск&гй, 1Ь), и довели ее до 760 мкг/мл.
Для проверки того, создает ли иммунизация эпитопом пептидной последовательности защиту от заболеваний, иммунизировали группу из 6 женских особей СΒΑ/N (х1й) мышей (№16опа1 Сапсег 1п81Ии1е). Иммунизацию проводили, вводя им подкожно трижды с трехнедельным интервалом очищенный слитый белок Т7ген10 белок-Н18-Тад-3А4.1, или, для контроля один только адъювант 0ш1А в фосфатно-солевом буфере. Спустя 12-14 дней после третьей иммунизации провели пробное внутривенное заражение мышей штаммом 8. рпеитошае νυ2, или интраназальное заражение штаммом Р4241. Образцы инокулята 8.рпеитошае поместили на пластинки с шоколадным агаром, чтобы проверить количество КОЕ, а также дозу пробного заражения. Эта доза составляет приблизительно 300 КОЕ. Смерти регистрировали ежедневно в течение 14 дней и на 14 день после пробного заражения. Выживших мышей умерщвили и образцы их крови были исследованы на наличие организмов 8.рпеитошае. Белок 3А4.1 или другой анализируемый белок называют защитным, если количество мышей, выживших от инфекции или если среднее количество дней до смерти в группе 3А4.1 значительно больше, чем в контрольной группе с имитированной иммунизацией.
Пример 8. Этот пример иллюстрирует усиление реакции антител на пневмококки при использовании фрагментов ΒνΉ-3 и их вариантов.
В целом результаты, полученные при изучении реактивных моноклональных антител с укороченными генными продуктами, колоний, экспрессирующих эпитоп, а также живых, неповрежденных пневмококков (представлены в примерах 2, 3 и 6) позволяют провести различие между находящимися на поверхности эпитопами и внутренними. Эпитопы, выявляемые моноклональными антителами как эффективно связанные с клетками пневмококков, отображены на участке, включающем аминокислотные остатки с 223 до 1039 из ΒVΗ-3, описанном 8ЕО ГО Ν0:6. Наличие защитных эпитопов на карбоксильной половине ΒVΗ-3 было подтверждено тем, что мыши, иммунизированные молекулами NΕV1, были защищены от смертельной инфекции штамма Р4241.
Сравнение последовательностей гена выявило, что в некоторых штаммах участок ΒVΗ-3, кодирующий аминокислоты с 244 до 420 и описанный 8ЕО ГО Ν0:6, отсутствует. Это предполагает, что указанная последовательность вакцины не пригодна для предотвращения заболевания, вызванного такими штаммами (8ЕО ГО Ν0:9 против 8ЕО ГО Ν0:1). Другие фрагменты ΒΧ'Ή-3 или их варианты были сконструированы для разработки универсальной высокоэффективной вакцины, которая должна быть нацелена на определенную иммунную реакцию в отношении расположенных на поверхности эпитопов. Фрагменты гена ΒΥΉΓ обозначенные №\\;1 (кодируют аминокислотные остатки с 472 до 1039 из 8ЕО ГО Ν0:6) и №ν40 (кодируют аминокислотные остатки с 408 до 1039 из 8ЕО ГО Ν0:6), амплифицировали из штамма 8. рпеитошае 8Р64, по ПЦР, используя пары олигонуклеотидов, сконструированных для ам
- 33 006232 плификации соответствующих генных фрагментов. Амплифицированные ПЦР продукты гидролизовали рестрикционной эндонуклеазой и сшили с линеаризованным вектором экспрессии плазмиды рЕТ21 (N0уадеп), аналогично гидролизованным. Для конструирования ΝΕ\ν40 использовали олигонуклеотидные праймеры ΗΑΜΙ489 (ссдааЪ6ссаеаедсааа6ЪдддсаассдасЪс;аде1) и ΗΑΜΙ279 (сдссаадссесдсьаьдаааесадаьаааьес; ΗίηάΙΙΙ). Вначале клоны были стабилизированы в Е.сой ϋΗ5α до того, как было проведено их введение в Ε.οοίί ВЬ21 (λΌΕ3) в целях экспрессии укороченных генных продуктов. Варианты ΝΕν1 и ΝΕν40 были получены мутагенезом, для чего использовали комплект для направленного мутагенеза (фшсксйапде 8йе-б1гес1еб Ми1адепе818, 81га1адепе), и были сконструированы олигонуклеотиды для участия в необходимой мутации. Наличие на С-концах полученных рекомбинантных молекул 6 остатков с гистидиновой меткой упростило очистку этих белков хроматографией на никеле. В приведенных ниже табл. 12 и 13 указаны последовательности праймеров, использованных в эксперименте по мутагенезу и варианты полученных генных продуктов соответственно. Эксперименты по мутагенезу с использованием серий 39, 40, 46, 47 или 48 праймеров, приведшие к неявным изменениям, проводились для усиления экспрессии целевых генов или их фрагментов, поскольку наблюдалось, что при экспрессии ген ВУН-3 и его фрагменты (более короткие продукты вторичной трансляции) подвергаются совместной экспрессии.
Таблица 12. Перечень серий олигонуклеотидных праймеров ПЦР, использованных для направленного мутагенеза на укороченных генах ВУН-3
Серия праймеров
НАМ1513
НАМ1514
ΗΑΜΙ5Ι5
НАМД516
НАМ1517
ΗΑΝΚ518
ΟΗΑΝ51
СНА1Ч52
СНА1Ч53
ΟΗΑΝ54
ΟΗΑΝ47
СНА1448
СНА1Ч55
ΟΙΑΝ56
ΟΗΑΝ57
СНАЫ58
НАМ1523
НАМ3524
НАМ3526
НАМД527
НАШ528
НАМ1529
НАМ3569
НА МИ 70
НАМИ71
НАМ1572
НАМИ73
Обозначение праймеров
179
180
181
182
183
184
185
186
187
188
189
190
191
192
193
194
195
196
197
198
199
200
201
202
203
НАМ1574
204
Последовательность праймеров 5' — 3 (ЗААТСАааТТТТСТСАТаАаТТССеаАСАССАСААТСАТТАТТТС
САААТААТСАТТСТССТСТССООААСТСАТСАСААААССТОАТТС
ОТСАТСАСТТССО<ЗА<ЗАСТССААТСАТТАТТТСТТСААСААСС
ССТТСТТ6АА6АААТААТ6АТТв0АСТСТСС6ОААСТСАТ6АС
АТСАОТТСОВАСАСТССААТТСТТАТТТСТТСААОААССАСТТО
СААОТССТТСТТСААОАААТААСААТТОаАОТСТССССААСТСАТ
ОССАТТАТТТАТССОТСТССАСАТСАССАТСАТаС дСАТаАТССТСАТСТССАОАССОАТАААТААТСОС
ССОТСТСКЗАОАТООССАТСАТОСАОАТССВ
СООАТСТССАТСАТббССАТСТССАвАССС
ССаСАСОбАСАТААССдТСАТССАСАТСССАТТО
СААТСбСАТСТВСАТСАСеСТТАТСТСССТССОа
СССТСТО6АОАТОССАСТСАТССА<ЗАТСС(ЗАТТ<3
СААТСвОАТСТОСАТОАОТОССАТСТССАОАСаС
ССбТСТООАОАТаВСАСТТСТаСАОАТСССАТТОАТС
САТСААТСадАТСТаСАСААОТОССАТСТССАаАССС
ССОСАТОбАвАТСесСАТСАТОСАОАТССО
СбОАТСТССАТСАТСОССАТСТССАТССОа вТСАТеАСТСАСОЗАСАСТССААТСАТТАТТТСТТСААаААОб
ССТТСТТСААСАААТААТСАТТСОАСТСТСССТОАСТСАТОАС
АТСАСТСАСа<ЗА<ЗАССАСААТТСТТАТТТСТТСААСААС<ЗАСТТО
СААвТССТТСТТСААСАААТААбААТТОТОСТСТССвТОАСТСАТ
ТАССТСАТТАТаАСТСТТАСТСТААСАТСАААТТТОАСТОСТТТа
САААССАСТСАААТТТОАТвТТАвАеТААвАОТСАТААТбАСМЗТА
ТАССТТСТТАТСАССАТТАСТСТААСАТСАААТТТОАСТССТТТС
АААССАСТСАКАТТТОАТ0ТТА<ЗА0ТААТСЭОТСАТААСААв6ТА
ААСаОТАОТТТААТСАТАССТТСТАААОАССАТТАССАТААСАТС
САТСТТАТССТААТСОТСТТТАСААСОТАТОАТТАААСТАСССТТ
- 34 006232
Серия праймеров
48.
Обозначение праймеров
НАМД575
НАМИ76
НАМД577
НАМ.1578
НАМ1579
ИАМ158О
НАМ1581
ΙΙΑΜ1582
НАМД536
ΗΑΜΙ537
ΗΑΝΗ55Ο
НАМД551
НАМД586
НАМД587
ΗΑΝΠ588
НАМЛ589
НАМЛ590
НАМД591
НАМ1592
ΗΑΜί593
НАМ7594
НАМ1595
НАЮ600
НАМ1601
НАШ604
ПАМ1605
НАМ1606
НА М.1607
НА МД 608
ΗΑΝΠ609
8Е<2 10
Νο
205
206
207
208
209
210
211
212
213
214
215
216
217
218
219
220
221
222
223
224
225
226
227
228
229
230
231
232
233
234
Последовательность праймеров 5' — 3
СОСТАаТТТААТСАТАССТСАТААССАСТСТТАССАТААСАТСААА тттоАтаттАтаатААСАатссттАтсАаатАтвАттАААСТАсса
ААСССТАаТТТААТСАТАССТСАССАТТАССАТААСАТСАААТТТС
САААТТТОАТСТТАТОаТААТаОТСАССТАТСАТТАААСТАССаТТ
ААСССТАСТТТААТСАТАССТТАССАТААСАТСАААТТТОАСТОа
ССАСТСАААТТТСАТСТТАТССТААСаТАТЯАТТАААСТАСССТТ
АССОСТАСТТТААТСУТАССТААСАТСАААТТТСАСТСОТТТСАС
СТСАААССАСТСАААТТТаАТОТТАЗОТАТаАТТАААСТАССаТТ
ССТАТСТААСТССАСАТАТААСССАТАСССАСТОО
ССАСТСССТАТСССТТАТАТСТССАСТТАСАТА5С
ССТСАААОТАТТОТССТАААТАААСАААААААТаСС
СССАТТТТГТТСТТТАТТТАССАСААТАСТТГСАСе
САТСААСААСАТССТТАСаОТТТССАТССТААСССТАТТАТСССТСААа
СТТСА(ЗС<ЗАТААТАССетТА<ЗСАТССАААСССТААССАТСТТСТТСТО
СААТСАОаТТТТОТСАТОАатеАССАСААТСАТТАТТТСТТС
СААСАААТААТ<ЭАТТ<ЗТ<ЗаТСАСТСАТ<ЗАСААААССТ<ЗАТТС
СААСАТаААТСАСаТТТТСТСАТаАСТААТСАТТАТТТСТТСААС
СТТОААОАААТААТСАТТАСТСАТвАСААААССТСАТТСАТСТТС
СААбАТСААТСАСВТТТТСТСАТСАЗТТАТТТСТТСААСААОСАС
СТССТТСТТ6ААЗАААТААСТСАТСАСААААССТСАТТСАТСТТС
ААААТСССАТТАТТТАТССССАССАТСАТССАОАТСССАТТС
СЛАТССаАТСТвСАТвАТСаТвСеСАТАААТЛЛТСвСАТТТТ
ААААТСССАТТАТТТАТСССЗ<ЗСАСЗАТСССАТТ<ЗАТ6ААСАТАААС
ОТТТАТОТТСАТСААТСОТАТСТОССОСАТАААТААТСССАТТТТ <ЗАТОСТААСС(ЗТАТААТСОСС<ЗААОАСвААТСА<3<ЗТТТТОТСАТ6
САТОАСАЛААССТаАТТСОТСТТСССССАТТАТАСОаТТАОСАТС
СаСССААаАССААТСС&ЭСТТТСТААТ<ЗА<ЗТСАСа<ЗА<ЗАСТСС <ЮАОТСТСС<ЗТ<ЗАСТСАТТАСААА<ЗСС<3<ЗАТТС<ЗТСТТС<Э<ЗС0
САтстСАтаААСАсаАТТАТСссаасААсессАААаААлталлАа
СТТТСАТТТСТТТСеСОТТСССОООАТААТССТСТТСАТСАСАТа
Таблица 13. Перечень укороченных вариантов продуктов гена ВУН-3, полученных из 8.рпеитошае 8Р64
Обозначение белка Ген/белок, 5Ε0ΙΟΝΟ Идентификация белка* Серия праймера 11ЦР (см.таблЛ2) Ген» использованный для мутагенеза
ΝΕΤνί-ηιιιΐΙ»* 255 ΝΕλνΐ 39 ΝΕ391
ΝΕ9935Α 256 ΝΕ\νΐ 550-8ОГЮТ8-555 14, 17, 20,22 ΝΕ391
ΝΕΨ42 257 ΝΕ\Ο40 55-5ΟΟ5Ν2-60 144-8СРСТ8-149 9, 10, 11,14, 17,20,22 ΝΕ3940
ΝΕΧΥ49 258 ΝΕ3940 55-8ΟΟΗΝΗ-60 9 ΝΕ9940
ΝΕ3¥50 259 ΝΕ1¥40 55-86Ο8ΝΗ-60 10 ΝΕ3049
ΝΕ3Υ51 260 ΝΕΨ40 55-8ΟΟΗΝΗ-60 144-8ΟΟΗΗΗ-149 14 ΝΕ3¥49
ΝΕ3¥52 261 ΝΕ\ν40 55-86Ο5ΝΗ-60 144-8СОСНН-149 10,17 ΝΕ3951
ΝΕ3¥53 262 ΝΕΨ40 55-Η6ΟΗΝΗ-60 144-8СОННН-149 14 ΝΕ994Ο
ΝΕ3Υ54 263 ΝΕ\940 55-8ΟΟΙ1ΝΗ-60 144-8СОСНН-149 17 ΝΕ\ν53
ΝΕν/55 264 ΝΕ\νΐ 550-НСОСНН-555 23 ΝΕΆΊ
ΝΕΝΥ56 265 ΝΕ\¥40 55-ΗΟϋ8ΝΗ-60 144-8ΟΟΗΗΗ-149 24 ΝΕ3¥53
ΝΕν56-ιηιιΐ2** 266 ΝΕ3Υ56 40 ΝΕ3¥56
ИЕА¥56-ти*3·* 267 ΝΕ3956 46,47,48 ΝΕ3Ϋ56
ΝΕν/57 268 ΝΕ3940 55-ΗΟΟΗΝ8-60 144-8ΟΟΗΗΗ-149 25 ΝΕν/53
ΝΕ3963 269 ΝΕΫ/40 55-ΗΟΟ5ΝΗ-60 144-НСОННН-149 24 ΝΕ9/40
ΝΕ\ν64 270 ΝΕ9740 55-ΗΟΟΗΝ8-60 144-ΗΟΟΗΗΗ-149 25 ΝΕ9/40
ΝΕ9/55 271 МЕУ/40 55-ΙΙΟΟ5ΝΙΙ-60 144-НСТСНН-149 23 ΝΕ3Υ63
- 35 006232
Обозначение белка Ген/белок, 8Ε<3 ΙΟ ΝΟ Идентификация белка* Серия праймера ПЦР (см. табл. 12) Ген, использованный для мутагенеза
ΝΕν/66 272 ΝΕ\ν40 55-ΗΟϋΗΝ§-60 144-Н6РСНН- 149 23 ЫЕЗУ64
ΝΕ\ν7 6 273 ΝΕ\¥40 55-ΗΟΒ11Ν8-60 144-8СЮСНН- 149 17 ΝΕ5Λ764
ΝΕ4Ί05 274 ΝΕ\ν40 55- -60 41,42,43 ΝΕ\ν40
ΝΡ.ΐνίΟή 275 Νενν40 144- -149 44,45 ΝΕ7940
ΝΕΐνΐΟ7 276 ΝΕ9/40 55- -60 144- -149 44.45 ΝΕ%405
•Подчеркнутые аминокислотные остатки представляют собой модификацию белковой последовательности.
Нуклсотидные/аминокислотные остатки уничтожены в конструктах ΝΕν/105, ΝΕ\¥106 и ΝΕ\Υ107.
** молчащая мутация, а именно полипептид такой же, как ΝΕ^Ι.
Группы из 7 или 8 женских особей ΒΑΣΒ/с мышей (Сйаг1ез К!уег),иммунизированных так, как это было описано ранее в примере 1, использовали в эксперименте для защиты от интраназального пробного заражения вирулентным штаммом 8.рпеитошае Р4241. За мышами наблюдали в течение 10-14 дней после заражения. Данные таблицы 15 четко показывают, что по эффекту защиты молекула НЕ\\35А эквивалента парентеральной НЕ\\1. Интересно, что высокое значение коэффициента выживаемости было получено в группах, иммунизированных №Е\40 и №Е\56, в которых из 8 животных выживало соответственно 7 и 8 особей. Аналогично НЕ\\25, содержащий аминокислотные остатки с 233 до 1039, защищает от смертельной инфекции 7 из 8 животных.
Таблица 14. Защита, опосредованная фрагментами ΒΥΗ-3 или его фрагментами, при экспериментальной пневмонии
Эксперимент Иммуноген Живые: умершие Дни до постинфекционной смерти
1 ζ)υί1 А 0: 8 4,4,4,4,4,4,4,4
ΝΈ\ν 1 5 :3 5, 1,7, >14, >14, >14, >14, >14
ΝΕίν 35А 5 :2 9, 10, >14, >14, >14, >14, >14
ΝΕ1Υ40 7 : 1 13, >14, >14, >14, >14, >14, >14, >14
ВУН-ЗМ 4 :4 1,8, 10,12, >14, >14, >14, >14
2 С}ш1 А 0: 8 3,3,4,4,4,4,4,4
ΝΕίν 52 4: 4 7,7,8,9, >10, >10, >10, >10
ЫЕ5У56 8: 0 8Х>10
ΝΕ9/ 40 7: 1 6, >10, >10, >10, >10, >10, >10, >10
3 Цш1 А 0: 8 3,3,4,4, 4, 4,4,4
ΝΕν/25 7 : 1 6, >13, >13, >13, >13, >13, >13, >13
Помимо этого, анализ связывания сыворотки антител вакцинированных животных, проведенный методом проточной цитометрии, выявил, что №Е\40 и №Е\56, меченные оставшимися в живых пневмококками, более эффективны, чем антитела от ΒΥΗ-3Μ (табл. 15).
Таблица 15. Связывание сывороточных антител мыши на поверхности 8. рпеитошае,тип 3 штамма \и2 по измерениям проточной цитометрией.
Антисыворопса Индекс флуоресценции
Эксперимент 1 Эксперимент 2 Эксперимент 3 Среднее значение ± среднеарифмети ческая ошибка
ВУН-ЗМ 9,2 11,4 14,5 11,7 = 1,5
ΝΕ\νΐ 11,5 10,1 ηά* 10,8 = 0,7
ΝΕ\ν35Α 14,3 12,9 ηύ 13,6 ±0,7
ΝΕ1Υ40 20,4 19,1 20,2 19,9 = 0,4
ΝΕ1Υ56 ηά 16,7 20,2 18,5=1,8
ΝΕ1¥52 ηά 16,6 19,3 18,0= 1,4
Только адъювант 1,9 1,6 1,2 1,6±0Д
* ηά: не определялось
- 36 006232
Результаты цитометрического анализа выражаются величиной индекса флуоресценции, где указанный индекс флуоресценции представляет собой среднюю величину флуоресценции пневмококков, обработанных исследуемой сывороткой, деленную на величину фоновой флуоресценции пневмококков, обработанных только конъюгатом флуоресцина. Во всех этих анализах методом проточной цитометрии использовалась сыворотка в разведении 1:50, а сыворотка мышей, иммунизированных фрагментом ВУН3С или одним только адъювантом 0ш1Л. дала результаты, аналогичные в отношении фоновой величины.
В целом данные по защите и связыванию пневмококковых антител показали, что вакцинация с использованием молекул ΝΕ\ν1 и ΝΕ\ν40 направляет иммунную реакцию к консервативным, защитным эпитопам, находящимся на поверхности.
Пример 9. В этом примере описано клонирование и экспрессия химерного гена ВУН-11-2, кодирующего химерные полипептиды, соответствующие консервативным, защитным эпитопам ВУН-11-2, находящимся на поверхности; они содержатся в большинстве (если не во всех ) штаммах 8. рпеитошае.
Фрагменты гена ВУН-11-2, соответствующие 4 областям гена, амплифицировали с помощью ЦПР, используя пары олигонуклеотидов, сконструированных для амплифицирования фрагментов из последовательности 8ЕЦ ΙΌ N0:5, охватывающей нуклеотиды с 1662 до 1742, с 1806 до 2153, и с 2484 до 2627 штамма 8. рпеитошае 8р64 гена ВУН-11-2.
У использованных праймеров НЛМ1490-491, НЛМ1492-493, НЛМ1494-495, НЛМ1496-354 имелись сайты рестрикционной эндонуклеазы у 5'-конца. Это позволяет направленное «рамочное» клонирование амплифицированного продукта в гидролизованный вектор плазмиды рЕТ21Ь(+) (табл. 16). Амплифицированные по ПЦР продукты гидролизовали рестрикционными эндонуклеазами и сшили с линеаризованным вектором плазмиды р8Ь301, гидролизованным аналогичным образом; это осуществлялось для всех продуктов за исключением амплифицированного ПЦР фрагмента, полученного с использованием пары праймеров НЛМ1490-491. Амплифицированный ПЦР продукт, полученный с помощью пары праймеров НЛМ1490-491, очистили от геля агарозы, используя для этого экстракцию 01Ас.|шск гелем из Ц1Адеп набора (Сйа18^ойй, СА) и сшили с вектором плазмиды р6ЕМ-Т без какого-либо предварительного гидролиза рестрикционной эндонуклеазой. Полученные в результате конструкты плазмид были подтверждены секвенированием нуклеотидов. Рекомбинантные плазмиды, содержащие каждый из четырех праймеров, гидролизовали рестрикционными эндонуклеазами, соответствующими 5'-концу каждой пары праймеров, использованных для ПЦР-амплифицирования. Полученные фрагменты очистили от агарозы так, как это было описано ранее, и все они были сшиты с линеаризованной плазмидой рЕТ21Ь(+), гидролизованной рестрикционными ферментами Дйе1 НшйШ для «рамочного» клонирования четырех различных участков гена ВУН11-2. Полученные клоны сначала стабилизировали в Е.со11 ЭН5а. это проводилось до введения в Е.соН ВБ21(/ГОЕ3) в целях экспрессии молекул химерного пневмококкового белка.
Полученная в результате последовательность гена ДЕ^43 (8ЕЦ ΙΌ N0 257) описана на рис.33.
Установленная логическим образом последовательность аминокислот белка ДЕ^43 (8ЕЦ ΙΌ N0 258) описана на рис.34.
Таблица 16. Перечень олигонуклеотидных праймеров ПЦР, использованных для конструирования НЕ\\43. УР438 и \Е\\'86
Праймер 5Е<2 10 N0 Последовательность 5* - 3' Положение нуклеотида Сайты рестрикции
ΗΑΜΙ490 259 ссдааЕЕссаСаЕдсаааЕ еассЕасасЕдаЕдаЬд 8Е<} ГО 5 :1662- 1683 ΝάεΙ
НАШ491 260 ддасЕадЕаЕсааадаЪаЪ аассдЕсЕЕс 8Е(} ГО 5 :1742- 1722 8ре1
НАМ1492 261 ддасЪадЬЬддаЕЬааааа адаЕадЕЕЕдЪсЬд 8Е<} 10 5:1806- 1830 8ре!
НАМ3493 262 ЕЕсссдсддЕЕсдасаЕад ЪасЪЬдасадЪсд 8Е<5 10 5:2153- 2131 8ас11
ΗΑΝΟ494 263 е Есс сдсддаасдсЕадЕд ассаЬдЕЕсд 8Εζ> 10 5:2193- 2212 8ас11
НАШ495 264 сддддЬассаддааЕЕЕса дссЕсаЕсЕдЕд 8Е0 ГО 5 :2414- 2393 ΚρηΙ
ΗΑΜΙ496 265 сссддЬассссЕадЕаЕЕа дас аааа ЕдсЕ аЕддад 5Е<2 ГО 5 :2484- 2510 ΚρηΙ
ΗΑΝΠ354 65 сдссаадсЕЕсЕдЕаЕадд адссддЕЕдас 5Еф 105:2627- 2608 ΗίηΟΠΙ
- 37 006232
НАШ 583 266 ддаЬсссдддаддЬаЬдаЬ ЬааасЬассд ЗЕ(? 10 5 :2039- 2021 5та1
НАШ 584 267 саЬдсссдддаасаЬсааа ЕССдадСддСХЬдас 5ЕС> 10 5 :2058- 2081 5та1
НАМ! 610 268 сеедаЬсдасаЪаедЬсдд саддсаадЪасасаасад 5ЕО 1О5:170Ь 1722 Ше!
Таблица 17. Перечень фрагментов укороченных генов ВУН-11-2 , полученных из 8. рпеитошае 8Р64, для конструирования №У43____________________________________
Серни праймеров ЦПР Обозначение фрагмента гена Соответствующие аминокислотные остатки на 8Е0 ГО N0: 8 Клонирующий вектор
НАШ490-НАШ491 ΝΕλ¥433 517-543 рСЕМ-Т
НАМЛ492-НАМ1493 ΝΕ\¥436 565-680 р5Ь301
НАМ5494-НАМЛ495 ΝΕΑ¥43ε 694-767 рЗЬЗО!
НАШ496-НАШ354 ΝΕ\ν43ά 791-838 р8Ь301
Таблица 18. Свойства генов №У86 и УР438, полученных из гена ΝΈν43
Серии праймеров ЦПР Обозначение гена/ белка Идентификация
НАШ610-НАШ354 УР438 ΝΕ\ν43 С'- конец соответствующий остаткам 15-272)
НАШ490-НАШ583 НАШ584-НАШ354 ΝΕ\ν86 ΝΕΥ/43 109-___РО___-114
Производные молекул ΝΈν43, обозначенные УР438 и ΝΈν86, были получены в результате амплификации гена и клонирования при использовании праймеров ПЦР, описанных в таблицах 16 и 18, а также вектора экспрессии плазмиды рЕТ21. Варианты ΝΈν43 были получены мутагенезом с помощью комплекта для направленного мутагенеза (ОшсксНапде 8йе-б1гес!еб Ми1адепек1к, 81га1адепе) и олигонуклеотидов, сконструированных для участия в соответствующей мутации. Наличие на С-концах полученных рекомбинантных молекул 6 остатков с гистидиновой меткой упростило очистку этих белков хроматографией на никеле. В приведенных ниже табл. 19 и 20 указаны последовательности праймеров, использованных в эксперименте по мутагенезу и варианты полученных генных продуктов №\\43 соответственно.
Таблица 19. Перечень серий олигонуклеотидных праймеров ПЦР, использованных для направленного мутагенеза гена Νεν43___________________________________________
Серии праймеров Обозначение праймеров 8Е0 ГО ΝΟ Последовательность праймеров 5* —> 3'
1 НАШ 497 НАШ 498 269 270 ААСОСТАОТТТААТСАТАССТТСТТАТСАССАТТАССАТААСАТС (ЗАТ<ЗТТАТ<3<ЗТААТ<ЗОТСАТАА<ЗЛА<3(ЗТАТаАТТАААСТАССОТТ
2 НАМ3499 НАШ500 271 272 ААТСАТАССТТСТТАТаАСТСТТАССАТААСАТСАААТТТСАОТО САСТСАААТТТСАТСТТАТСОТААСАСТСАТААОААООТАТОАТТ
3 НАШ501 НАМ3502 273 274 ТАССТТСТТАТбАСТСТТАСТСТААСАТСЛААТТТ<ЗА<ЭТ<3(ЗТТТ<3 САААССАСТСАААТТТОАТОТТАОАОТААОАСТСАТААОААССТА
26 НАШ53О НАШ531 275 276 ААТСАТАССТСАТТАТСАСТСТТАССАТААСАТСАААТТТОАаТО САСТСАААТТТОАТаТТАТО(ЗТАА<ЗАОТСАТААТСАО(ЗТАТ(ЗАТТ
27 НАШ532 НАШ533 277 278 ТАССТСАТТАТСАССАТТАСТСТААСАТСАААТТТОАбТООТТТО САААССАСТСАААТТТСАТСТТАСАСТААТООТСАТААТОА65ТА
Серии праймеров Обозначение праймеров 8Е<3 ГО ΝΟ Последовательность праймеров 5' —> 3'
29 НАШ569 НАШ570 279 280 ТАССТСАТТАТОАСТСТТАСТСТААСАТСАААТТТОАОТООТТТО САААССАСТСАААТТТСАТОТТАОАСТААаАОТСАТААТ<ЗАО<ЗТА
30 НАМД571 ΗΑΜΙ572 281 282 ТАССТТСТТАТОАССАТТАСТСТААСАТСАААТТТаАОТСОТТТС АААССАСТСАААТТТ6АТСТТАСАСТААТОСТСАТАА(ЭАА(ЗСТА
31 НАМ3573 НАМ3574 283 284 ААСССТАСТТТААТСАТАССТТСТАААОАССАТТАССАТААСАТС ОАТОТТАТббТААТббТСТТТАбААбОТАТбАТТАААСТАССОТТ
32 НАМ1575 НАМ1576 285 286 СбОТАОТТТААТСАТАССТСАТААСОАСТСТТАССАТААСАТСААА ТТКЗАТбТТАТООТААСАОТССТТАТбАООТАТбАТТАААСТАССб
33 НАМД577 НАМД578 287 288 ААСОСТАОТТТААТСАТАССТСАССАТТАССАТААСАТСАААТТТО САААТТТСАТОТТАТССЗТААТООТСАССТАТОАТТАААСТАСССТТ
34 НАМ1579 НАМД580 289 290 ААСООТАОТТТААТСАТАССТТАССАТААСАТСАААТТТСАОТбб ССАСТСАААТТТСАТСТТАТССТААСЮТАТСАТТАААСТАСССТТ
35 НАШ581 НАМД582 291 292 АСССОТАбТТТААТСАТАССТААСАТСАААТТТбАОТООТТТОАС аТСАААССАСТСАААТТТОАТСТТАОаТАТОАТТАААСТАСССТТ
- 38 006232
Таблица 20. Перечень вариантов генных продуктов, полученных из 3. рпеитошае 3Р64
Обозначение полипептида Последовательность полипептида 8Ε<2 ΙΟΝΟ Обозначение полипептида* Серии ПЦР праймеров (см. Табл. 22) Использованные для мутагенеза гены
ΝΕνν60 293 ХЕУ/43 Ι09-8ΥΟΗΥΗ-114 1 ΝΕ3Υ43
ΝΕ9Ζ6Ι 294 ΝΕ\ν43 109-ΗΥΟ8ΥΗ-114 26 ΝΕ3943
ΝΕ1Υ62 295 ΝΕΨ43 109-ΗΥΟΗΥ8-114 27 ΝΕ9/43
ΝΕ9980 296 ΝΕ\ν43 109-8ΥΟ5ΥΗ-114 2 ΝΕ\ν60
ΝΕ9/81 297 ΝΕ9943 109-5ΥΟ8Υ8-114 3 ΝΕ9980
ΝΕ9982 298 ΝΕ9743 109-ΗΥΟ8Υ5-114 29 ΝΕ3Υ61
ΝΕΎ83 299 ΝΕΨ43 109-8ΥΟΗΥ8-114 30 ΝΕ1Υ60
ΝΕ9984 300 ΝΕ3Υ43 109-8ΚΟΗΥΗ-114 31 ΝΕ3960
ΝΕ\¥85 301 ΝΕ9743 109-ΗΚ08ΥΗ-114 32 ΝΕ3Υ61
ΝΕ\ν88ϋ1 302 ΝΕ9/43 109-_ϋΗΥΗ-114 33 ΝΕΧ943
ΝΕ\ν88Ο2 303 N£3943 109- ΥΗ-114 34 ΝΕ9988Ρ1
ΝΕΎ88 304 ΝΕ3943 109- -114 35 ΝΕ3Υ88Ρ2
* Подчеркнутые остатки аминокислот представляют собой модификации последовательности белков. ТЪе ипЛегКпей атто абд гез1(1ие5 гергезет (Не тод1ЙсаНоп ίη рго<ет зедиепсе. В конструктах ΝΕ\ν88ϋ1, ΝΕν/88ϋ2 н ΝΕΨ88 нуклеотнды/аминокислотные остатки уничтожены.
Группы из 7 или 8 женских особей ВАЬВ/с мышей (Сйаг1ек К4уег),иммунизированных так, как это было описано ранее в примере 1, использовали в эксперименте для защиты от интраназального пробного заражения вирулентным штаммом 3.рпеитошае Р4241. Данные табл. 21 четко указывают, что ΝΕν19, ΝΕν43 и их варианты обеспечивают защиту от экспериментальной пневмонии.
Таблица 21. Защита, опосредованная фрагментами ΝΕν19 и ΝΕν43, а также их вариантами в случае экспериментальной пневмонии________________________________________
Эксперимент Иммуноген Живые: умершие Среднее количество дней в живом состоянии
1 ζ)ιιϊ1 А 0:8 4, 4, 4, 4, 4, 4г 4г 5
ΝΕ\ν 19 7: 1 5, 7Х>14
ΝΕ\ν 43 8 : 0 8Х>14
2 Οιιϊΐ А 0 : 8 4,4,4,4,4,5, 5, 5
ΝΕ\ν 43 7 : 1 8, 7Х>14
ΝΕλν 80 6 : 2 5,6,6Х>14
ΝΕ« 83 6 : 2 8,10,6Х >14
3 риИ А 0: 8 4,4,4,4,5, 5,5,5
ΝΈ\ν 43 7: 1 5,7Х>8
ΝΕλν 88Э1 5 :3 5,6,6, 6Х>8
ΝΕ3ν 88ϋ2 5: 3 6, 6, 6, 6 X >8
ΝΕ39 88 7: 1 6, 7Х>8
3 Ουΐΐ А 0: 8 4,4,4, 5,5,5, 5,6
ΝΕ3Υ6Ο 8: 0 8Х>8
ΝΕν/84 8: 0 8Х>8
ΝΕ¥/85 5: 3 5,7, 7, 5 X >8
ΝΕν/86 5: 3 5,6,6, 5 X >8
Пример 10. В этом примере описано клонирование и экспрессия химерных генов, кодирующих химерные белки, соответствующие карбоксиконцевому участку ВУН-3, или его слитые варианты, которое осуществляли или по карбоксильному или по аминному концу на ΝΕν43 или его варианты.
Химерные гены, содержащие укороченный вариант гена ВУН-3 и ген ΝΕν43 или вариант гена ΝΕν43, сконструировали по методике, описанной в примере 1. Полипептиды, кодируемые этими химерными генами, приведены в табл. 22. Фрагменты генов, которые следовало включить в химерный ген, амплифицировали с помощью ПЦР, используя пары олигонуклеотидов, сконструированных таким образом, чтобы праймеры ПЦР у 5'-конца содержали сайт рестрикции эндонуклеазы, что допускает направленное «рамочное» клонирование амплифицированного продукта в гидролизованные вектора плазмиды (табл. 23 и 24). Амплифицированные с помощью ПЦР продукты гидролизовали рестрикционной эндо
- 39 006232 нуклеазой и осуществили сшивание с линеаризованным вектором плазмиды р8Ь301. Полученные в результате конструкты плазмид были подтверждены секвенированием нуклеотидов. Рекомбинантные плазмиды р 8Ь301, содержащие продукт ПЦР, повторно подвергли гидролизу тем же рестрикционным ферментом для получения включений в ДНК. Полученные в результате включенные фрагменты ДНК очистили, а включения, соответствующие данному химерному гену, сшили с вектором риКУ22-Ыйе1 в целях получения химерного гена. Полученные экспрессией рекомбинантные белки очистили от супернатантных фракций, образовавшихся после центрифугирования обработанных ультразвукомтермоиндуцированных культур Е. сой; для очистки использовалась многостадийная хроматография.
Таблица 22. Перечень полипептидов, кодируемых химерными генами, содержащими укороченный вариант гена ВУН-3 и вариант гена ЯЕУ43 или гена ЯЕУ43________________________
Обозначение полипептида δΕΟΙϋΝΟ Идентификация
УР 89 327 Μ-Νε\νδ 6 -СР- Νε\ν43*
УР90 328 Μ-Νβν/43 -ΟΡ- Νβ\ν56
УР91 329 Μ-Νενν52 -ΟΡ- Νε»43
УР 92 330 Μ-Νβ\ν43 -ΟΡ- Νεν.'52
УР 93 331 Μ-Ν«\ν56 -ΟΡ- Νε\ν60
УР94 332 Μ-Νβ\ν60 -ΟΡ- Νβ*56
УР 108 333 Μ -Νβ\ν56 -ΟΡ- Νβν/88
УР109 334 Μ-Νβιν88 -ΟΡ- Νβιν56
νρ 110 335 Μ-Νεν,'60 -ΟΡ- Νβ\ν105
νρ 111 336 Μ-Νεν/όΟ -ΟΡ- Νενν107
УР112 337 Μ-Νβχνδδ -ΟΡ- Νβν105
УР113 338 Μ-Νε\ν88 -ΟΡ- Νον/107
УР114 339 Μ-Νς\ν80-ΟΡ-Νεν.105
УР115 340 Μ-Νεχν80-ΟΡ-Νβνν107
УР116 341 Μ-Νβ«83 -ΟΡ- Νβ\ν105
УР117 342 Μ-Νε\ν83 -ΟΡ- Νβ\ν107
УР119 343 Μ-Νβ\ν438- ΟΡ -Νο\ν105
УР120 344 Μ-Νβ\ν438- ΟΡ-Νβ*Ί07
УР121 345 Μ-Νβιν808- ΟΡ-Νβνν105
УР122 346 Μ-Νβ\ν805- ΟΡ-Νβνν107
УР123 347 Μ-Νον/885- ΟΡ -Νβ\ν105
УР124 348 Μ-Νβνν888- ΟΡ-Νενν107
Кодируемые аминокислоты химер изображены как генные продукты, добавлены дополнительные аминокислотные остатки. М -означает метионин, <3 -глицин, а Р -пролин.
Таблица 23. Перечень пар олигонуклеотидных праймеров ПЦР, сконструированных для получения химерных генов, кодирующих полипептиды, указанные в табл. 22.______________________
Серия праймера Обозначение праймера ПЦР Ген, используемый для амплификации ПЦР Соответствующее расположение фрагмента гена
49 НАМ1490-НАМ1471 ВариантИе^АЗ Ν- концевое
50 НАМ1564-НАМ1556 Вариант Νε\ν43 С-концевое
51 НАМД489-НАМ1359 Вариант Νειν40 Ν-концевое
52 НАМ1559-НАМ1557 Вариант Мсл40 С-концевое
53 НАМ 1610 -НАМ Э471 Вариант Νε\ν438 Ν-концевое
Таблица 24. Перечень олигонуклеотидных праймеров ПЦР, сконструированных для получения химерных генов, кодирующих полипептиды, указанные в табл. 22.
- 40 006232
Праймер 8ΕΟΠ3ΝΟ Последовательность 51 - 31 Сайт рестрикции
НАМД490 259 ссдааЬЬссаЬаЬдсаааСЬассЬа сасЬдасдаЬд ΝάεΙ
НАШ471 168 аЬаЬдддссссЬдЬаЬаддадссдд ЬЬдасЬЬЬс Ара!
ΗΑΜΙ564 327 аЪаСдддссссаааЬЬассЬасасЬ даСдаЬдадаЬЬсадд Ара1
НАШ556 328 аЬаадааЬдсддссдссЬасЬдЬаЪ аддадссддЬЬдасЪСЬс Νοί I
НАМ1489 329 ссдааЬЪссаСаЬдсаааЬЬдддса ассдасЬс ΝάοΙ
НАМЛ359 173 ЬсссдддссссдсЬаЬдаааЬсада ЬаааЬЬс Ара!
НАМЛ559 330 аЪаСдддссссаааЪЪдддсаассд асСс Ара!
НАМП54 65 сдссаадсЬЬсЬдЬаСаддадссдд ЬЬдас ΗίηάΙΙΙ
НАМЛ610 268 сЬЬдаЬсдасаЬаЬдЬЬддсаддса адьасасаасад ΝάεΙΙ
НАМЛ557 331 аЬаадааЬдсддссдсЬЬасдсЬаЬ даааЬсадабаааЬЬс N011
НАМ1279 35 сдссаадсЪЪсдсЪаЬдаааЪсада ЪаааЪЪс ΗίηύΙΙΙ
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Claims (31)

1. Изолированный полинуклеотид, включающий полинуклеотид, выбранный из (а) полинуклеотида, кодирующего полипептид, обладающий по крайней мере 95% идентичностью со вторым полипептидом, выбранным из таблицы В, Е или Н;
(б) полинуклеотида, кодирующего полипептид, обладающий последовательностью аминокислот, выбранной из таблицы В, Е или Н;
(в) полинуклеотида, кодирующего полипептид, способный вырабатывать антитела, обладающие специфическим связыванием с полипептидом, имеющим последовательность, выбранную из таблицы В, Е или Н;
(г) полинуклеотида, кодирующего несущий эпитоп участок полипептида, выбранного из таблицы В, Е или Н; а также (д) полинуклеотида, комплементарного полинуклеотиду из пп.(а), (б), (в) или (г).
2. Изолированный полинуклеотид по п.1, отличающийся тем, что указанный полинуклеотид представляет собой (а).
3. Изолированный полинуклеотид по п.1, отличающийся тем, что указанный полинуклеотид представляет собой (б).
4. Изолированный полинуклеотид по п.1, отличающийся тем, что указанный полинуклеотид представляет собой (в).
5. Изолированный полинуклеотид по п.1, отличающийся тем, что указанный полинуклеотид представляет собой (г).
6. Изолированный полинуклеотид по п.5, отличающийся тем, что указанный полинуклеотид выбирают из таблицы В.
7. Изолированный полинуклеотид по п.6, отличающийся тем, что указанный участок, несущий эпитоп, выбирают из таблицы С.
8. Изолированный полинуклеотид по п.5, отличающийся тем, что указанный полинуклеотид выбирают из таблицы Е.
9. Изолированный полинуклеотид по п.8, отличающийся тем, что указанный участок, несущий эпитоп, выбирают из таблицы Р.
10. Полинуклеотид по любому из пп.1-9, отличающийся тем, что указанный полинуклеотид представляет собой ДНК.
11. Полинуклеотид по любому из пп.1-9, отличающийся тем, что указанный полинуклеотид представляет собой РНК.
12. Вектор, содержащий полинуклеотид по п.10, отличающийся тем, что указанная ДНК реально
- 41 006232 связана с областью контролируемой экспрессии.
13. Клетка-хозяин, подверженная трансфекции вектором по п.12.
14. Процесс продуцирования полипептида, включающий культивирование клетки-хозяина по п.13 в условиях, пригодных для экспрессии указанного полипептида.
15. Химерный полипептид, включающий элемент, выбранный из (а) полипептида, обладающего по крайней мере 70% идентичностью со вторым полипептидом, имеющим последовательность аминокислот, выбранную из таблицы В, Е или Н;
(б) полипептида, обладающего по крайней мере 95% идентичностью со вторым полипептидом, имеющим последовательность аминокислот, выбранную из таблицы В, Е или Н;
(в) полипептида, обладающего последовательностью аминокислот, выбранной из таблицы В, Е или Н;
(г) полипептида, обладающего последовательностью аминокислот, выбранной из таблицы В, Е или Н;
(д) полипептида, способного вырабатывать антитела, обладающие специфическим связыванием со вторым полипептидом, имеющим последовательность, выбранную из таблицы В, Е или Н;
(е) несущего эпитоп участка полипептида, обладающего последовательностью аминокислот, выбранной из таблицы В, Е или Н;
(ж) полипептида из (а), (б), (в), (г), (д) или (е), в котором Ν-концевой метиониновый остаток претерпел делецию; или (з) полипептида из (а), (б), (в), (г), (д) или (е), в котором секреторная последовательность аминокислот претерпела делецию.
16. Полипептид по п.15, отличающийся тем, что указанный полипептид представляет собой (е).
17. Полипептид по п.16, отличающийся тем, что указанный полипептид выбирают из таблицы В.
18. Полипептид по п.17, отличающийся тем, что указанный участок, несущий эпитоп, выбирают из таблицы С.
19. Полипептид по п.16, отличающийся тем, что указанный полипептид выбирают из таблицы Е.
20. Полипептид по п.19, отличающийся тем, что указанный участок, несущий эпитоп, выбирают из таблицы Р.
21. Химерный полипептид, содержащий два или более полипептидов, выбранных из таблицы В, Е или Н, при условии, что эти полипептиды соединены для образования химерного полипептида.
22. Состав вакцины, содержащей полипептид по любому из пп.15-21, а также фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или адъювант.
23. Способ терапевтического или профилактического лечения менингита, среднего отита, бактериемической или пневмонийной инфекции у субъекта, восприимчивого к менингиту, среднему отиту, бактериемической или пневмонийной инфекции, включающий введение указанному субъекту терапевтического или профилактического количества состава по п.22.
24. Способ терапевтического или профилактического лечения стрептококковой бактериальной инфекции у субъекта, восприимчивого к стрептококковой бактериальной инфекции, включающий введение указанному субъекту терапевтического или профилактического количества состава по п.22.
25. Способ по п.23, отличающийся тем, что указанным субъектом является млекопитающее.
26. Способ по п.24, отличающийся тем, что указанным субъектом является млекопитающее.
27. Способ по п.23, отличающийся тем, что указанным субъектом является человек.
28. Способ по п.24, отличающийся тем, что указанным субъектом является человек.
29. Способ по п.24, отличающийся тем, что указанная бактериальная инфекция представляет собой Б.риеитошае группу А стрептококк (руодепек), группу В стрептококк (ОВБ или ада1асйае), бу8да1ас!1ае, иЬсп5. иосагФа, или золотистый стафилококк.
30. Способ по п.24, отличающийся тем, что указанная бактериальная инфекция представляет собой Б.риеитошае.
31. Применение состава вакцины по п.22 для профилактического или терапевтического лечения стрептококковой бактериальной инфекции у животного, восприимчивого к стрептококковой бактериальной инфекции или инфицированного ей, включающее введение указанному животному профилактического или терапевтического количества этого состава.
EA200201280A 2000-06-20 2001-06-19 Стрептококковые антигены EA006232B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US21268300P 2000-06-20 2000-06-20
PCT/CA2001/000908 WO2001098334A2 (en) 2000-06-20 2001-06-19 Streptococcus antigens

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA200201280A1 EA200201280A1 (ru) 2003-06-26
EA006232B1 true EA006232B1 (ru) 2005-10-27

Family

ID=22792041

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200201280A EA006232B1 (ru) 2000-06-20 2001-06-19 Стрептококковые антигены

Country Status (18)

Country Link
EP (2) EP1303612A2 (ru)
JP (2) JP5051959B2 (ru)
KR (1) KR100927767B1 (ru)
CN (2) CN1449446A (ru)
AR (1) AR033980A1 (ru)
AU (2) AU2001270381B2 (ru)
CA (1) CA2413450C (ru)
CZ (1) CZ2003154A3 (ru)
EA (1) EA006232B1 (ru)
HU (1) HU228706B1 (ru)
IL (2) IL153558A0 (ru)
MX (1) MXPA03000103A (ru)
NO (1) NO331103B1 (ru)
NZ (1) NZ553554A (ru)
PL (1) PL214229B1 (ru)
TR (1) TR200704553T2 (ru)
UY (1) UY26783A1 (ru)
WO (1) WO2001098334A2 (ru)

Families Citing this family (64)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7128918B1 (en) 1998-12-23 2006-10-31 Id Biomedical Corporation Streptococcus antigens
US7074415B2 (en) 2000-06-20 2006-07-11 Id Biomedical Corporation Streptococcus antigens
US7262024B2 (en) 2001-12-20 2007-08-28 Id Biomedical Corporation Streptococcus antigens
TWI457133B (zh) 2005-12-13 2014-10-21 Glaxosmithkline Biolog Sa 新穎組合物
GB0607088D0 (en) 2006-04-07 2006-05-17 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine
EP3470080A1 (en) 2005-12-22 2019-04-17 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Vaccine comprising streptococcus pneumoniae capsular polysaccharide conjugates
NZ575272A (en) 2006-09-07 2012-02-24 Glaxosmithkline Biolog Sa Inactivated poliovirus type 1, diptheria toxoid, tetanus toxoid and killed whole-cell Bordetella pertussis vaccine
US20100074918A1 (en) 2007-05-02 2010-03-25 Jan Poolman Vaccine
KR20100045445A (ko) 2007-06-26 2010-05-03 글락소스미스클라인 바이오로지칼즈 에스.에이. 스트렙토코쿠스 뉴모니애 캡슐 다당류 컨쥬게이트를 포함하는 백신
BRPI0814127A2 (pt) * 2007-07-23 2015-02-03 Sanofi Pasteur Ltd Polipeptídeos imunegênicos e anticorpos monoclonais
SI2271360T1 (sl) 2008-04-16 2015-12-31 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Cepivo
CA2738245A1 (en) 2008-09-26 2010-04-01 Nanobio Corporation Nanoemulsion therapeutic compositions and methods of using the same
WO2010125480A1 (en) 2009-04-30 2010-11-04 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Pneumococcal vaccine and uses thereof
WO2010132833A1 (en) 2009-05-14 2010-11-18 The Regents Of The University Of Michigan Streptococcus vaccine compositions and methods of using the same
WO2010141312A2 (en) 2009-06-01 2010-12-09 Wake Forest University Health Sciences Flagellin fusion proteins and conjugates comprising pneumococcus antigens and methods of using the same
MX2012002639A (es) 2009-09-03 2012-03-14 Pfizer Vaccines Llc Vacuna de pcsk9.
GB201003920D0 (en) 2010-03-09 2010-04-21 Glaxosmithkline Biolog Sa Method of treatment
GB201003924D0 (en) 2010-03-09 2010-04-21 Glaxosmithkline Biolog Sa Immunogenic composition
KR101272351B1 (ko) * 2010-04-23 2013-06-07 이화여자대학교 산학협력단 새로운 카나마이신 화합물, 카나마이신 생산 스트렙토마이세스 속 미생물 및 카나마이신의 생산 방법
EP2680883B1 (en) 2011-03-02 2018-09-05 Pfizer Inc Pcsk9 vaccine
MX339058B (es) 2011-05-17 2016-05-09 Glaxosmithkline Biolog Sa Vacuna contra streptococcus pneumoniae.
WO2015095868A1 (en) 2013-12-20 2015-06-25 Wake Forest University Health Sciences Methods and compositions for increasing protective antibody levels induced by pneumococcal polysaccharide vaccines
EP3096783B1 (en) 2014-01-21 2021-07-07 Pfizer Inc. Streptococcus pneumoniae capsular polysaccharides and conjugates thereof
US11160855B2 (en) 2014-01-21 2021-11-02 Pfizer Inc. Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens and uses thereof
EP3096786B1 (en) 2014-01-21 2021-07-07 Pfizer Inc. Streptococcus pneumoniae capsular polysaccharides and conjugates thereof
PE20161095A1 (es) 2014-01-21 2016-10-26 Pfizer Composiciones inmunogenicas que comprenden antigenos de sacaridos capsulares conjugados y uso de los mismos
CA2939416A1 (en) 2014-02-14 2015-08-20 Pfizer Inc. Immunogenic glycoprotein conjugates
MX2017009308A (es) 2015-01-15 2017-11-08 Pfizer Composiciones inmunogenicas para usar en vacunas neumococicas.
KR20230058726A (ko) 2015-07-21 2023-05-03 화이자 인코포레이티드 접합된 캡슐형 사카라이드 항원을 포함하는 면역원성 조성물, 그를 포함하는 키트 및 그의 용도
GB201518684D0 (en) 2015-10-21 2015-12-02 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine
JP6884145B2 (ja) 2015-11-20 2021-06-09 ファイザー・インク 肺炎連鎖球菌ワクチンにおいて用いるための免疫原性組成物
PL3570879T3 (pl) 2017-01-20 2022-06-20 Pfizer Inc. Kompozycje immunogenne do zastosowania w szczepionkach przeciw pneumokokom
KR102650073B1 (ko) 2017-01-31 2024-03-20 머크 샤프 앤드 돔 엘엘씨 스트렙토코커스 뉴모니아 혈청형 19f 유래의 협막 다당류 단백질 접합체의 제조 방법
CN111093650B (zh) 2017-09-07 2024-03-01 默沙东有限责任公司 肺炎球菌多糖及其在免疫原性多糖-载体蛋白缀合物中的用途
TWI725359B (zh) 2017-12-06 2021-04-21 美商默沙東藥廠 包含肺炎鏈球菌多醣-蛋白結合物之組合物及其使用方法
US11260119B2 (en) 2018-08-24 2022-03-01 Pfizer Inc. Escherichia coli compositions and methods thereof
US20220016229A1 (en) 2018-12-12 2022-01-20 Pfizer Inc. Immunogenic Multiple Hetero-Antigen Polysaccharide-Protein Conjugates and uses thereof
BR112021011961A8 (pt) 2018-12-19 2023-02-07 Merck Sharp & Dohme Composições compreendendo conjugados de polissacarídeo-proteína de streptococcus pneumoniae e métodos de uso dos mesmos
JP7239509B6 (ja) 2019-02-22 2023-03-28 ファイザー・インク 細菌多糖類を精製するための方法
EP3952906A1 (en) 2019-04-10 2022-02-16 Pfizer Inc. Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens, kits comprising the same and uses thereof
CN114728050A (zh) 2019-07-31 2022-07-08 圣诺菲·帕斯图尔公司 多价肺炎球菌多糖-蛋白质缀合物组合物及其使用方法
MX2022005252A (es) 2019-11-01 2022-06-08 Pfizer Composiciones de escherichia coli y metodos de las mismas.
EP4107192A1 (en) 2020-02-21 2022-12-28 Pfizer Inc. Purification of saccharides
KR20220143910A (ko) 2020-02-23 2022-10-25 화이자 인코포레이티드 에스케리키아 콜라이 조성물 및 그의 방법
CA3199094A1 (en) 2020-10-22 2022-04-28 Pfizer Inc. Methods for purifying bacterial polysaccharides
MX2023004912A (es) 2020-10-27 2023-05-16 Pfizer Composiciones de escherichia coli y metodos de las mismas.
CN116744965A (zh) 2020-11-04 2023-09-12 辉瑞大药厂 用于肺炎球菌疫苗的免疫原性组合物
US20220202923A1 (en) 2020-12-23 2022-06-30 Pfizer Inc. E. coli fimh mutants and uses thereof
TW202245835A (zh) 2021-02-04 2022-12-01 美商默沙東有限責任公司 用於肺炎球菌結合物疫苗之奈米乳化液佐劑組合物
JP2024517780A (ja) 2021-05-03 2024-04-23 ファイザー・インク 細菌およびベータコロナウイルス感染症に対するワクチン接種
WO2022234416A1 (en) 2021-05-03 2022-11-10 Pfizer Inc. Vaccination against pneumoccocal and covid-19 infections
KR20230175284A (ko) 2021-05-28 2023-12-29 화이자 인코포레이티드 접합된 피막 사카라이드 항원을 포함하는 면역원성 조성물 및 그의 용도
EP4346893A2 (en) 2021-05-28 2024-04-10 Pfizer Inc. Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens and uses thereof
KR20240128715A (ko) 2022-01-13 2024-08-26 화이자 인코포레이티드 접합된 피막 사카라이드 항원을 포함하는 면역원성 조성물 및 그의 용도
WO2023161817A1 (en) 2022-02-25 2023-08-31 Pfizer Inc. Methods for incorporating azido groups in bacterial capsular polysaccharides
WO2023218322A1 (en) 2022-05-11 2023-11-16 Pfizer Inc. Process for producing of vaccine formulations with preservatives
WO2024084397A1 (en) 2022-10-19 2024-04-25 Pfizer Inc. Vaccination against pneumoccocal and covid-19 infections
WO2024110827A1 (en) 2022-11-21 2024-05-30 Pfizer Inc. Methods for preparing conjugated capsular saccharide antigens and uses thereof
US20240181028A1 (en) 2022-11-22 2024-06-06 Pfizer Inc. Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens and uses thereof
WO2024116096A1 (en) 2022-12-01 2024-06-06 Pfizer Inc. Pneumococcal conjugate vaccine formulations
WO2024166008A1 (en) 2023-02-10 2024-08-15 Pfizer Inc. Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens and uses thereof
WO2024201324A2 (en) 2023-03-30 2024-10-03 Pfizer Inc. Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens and uses thereof
WO2024214016A1 (en) 2023-04-14 2024-10-17 Pfizer Inc. Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens and uses thereof
WO2024224266A1 (en) 2023-04-24 2024-10-31 Pfizer Inc. Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens and uses thereof

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4431739A (en) 1979-11-05 1984-02-14 Genentech, Inc. Transformant bacterial culture capable of expressing heterologous protein
US4425437A (en) 1979-11-05 1984-01-10 Genentech, Inc. Microbial polypeptide expression vehicle
US4338397A (en) 1980-04-11 1982-07-06 President And Fellows Of Harvard College Mature protein synthesis
US5866135A (en) * 1994-04-21 1999-02-02 North American Vaccine, Inc. Group A streptococcal polysaccharide immunogenic compositions and methods
NZ309713A (en) * 1995-06-07 1999-11-29 Alberta Res Council Oligosaccharides of S pneumoniae serotype 8 and their use in a vaccine
AU6909098A (en) 1996-10-31 1998-05-22 Human Genome Sciences, Inc. Streptococcus pneumoniae polynucleotides and sequences
CA2305016A1 (en) * 1997-09-24 1999-04-01 Regents Of The University Of Minnesota Human complement c3-degrading proteinase from streptococcus pneumoniae
EP1100921B1 (en) * 1998-07-27 2007-05-02 Sanofi Pasteur Limited Streptococcus pneumoniae proteins and nucleic acid molecules
ATE446107T1 (de) * 1998-08-19 2009-11-15 Baxter Healthcare Sa Immunogenes beta-propionamido-gebundenes polysaccharid-protein konjugat geeignet als impfstoff und hergestellt bei verwendung von n- acryloyliertem polysaccharid
BR9914066A (pt) * 1998-09-24 2002-04-23 Univ Minnesota Polipeptìdio degradador de c3 de complemento humano de streptococcus pneumoniae
AU776828B2 (en) * 1998-12-21 2004-09-23 Medimmune, Llc Streptococcus pneumoniae proteins and immunogenic fragments for vaccines
EP1141306B1 (en) 1998-12-23 2008-05-07 ID Biomedical Corporation Streptococcus antigens

Also Published As

Publication number Publication date
EP2281891A2 (en) 2011-02-09
CA2413450C (en) 2014-02-18
HUP0301656A3 (en) 2004-10-28
WO2001098334A2 (en) 2001-12-27
IL153558A (en) 2011-07-31
PL214229B1 (pl) 2013-07-31
KR100927767B1 (ko) 2009-11-20
MXPA03000103A (es) 2003-06-19
CA2413450A1 (en) 2001-12-27
HUP0301656A2 (hu) 2003-08-28
JP2012187110A (ja) 2012-10-04
NZ553554A (en) 2008-11-28
EP2281891A3 (en) 2011-08-17
NO20026121D0 (no) 2002-12-19
AR033980A1 (es) 2004-01-21
JP5889103B2 (ja) 2016-03-22
AU2001270381B2 (en) 2007-05-24
NO331103B1 (no) 2011-10-10
JP2004501618A (ja) 2004-01-22
IL153558A0 (en) 2003-07-06
TR200704553T2 (tr) 2007-11-21
UY26783A1 (es) 2002-01-31
HU228706B1 (en) 2013-05-28
EA200201280A1 (ru) 2003-06-26
CN1449446A (zh) 2003-10-15
PL360413A1 (en) 2004-09-06
CN101260149B (zh) 2016-05-11
JP5051959B2 (ja) 2012-10-17
EP1303612A2 (en) 2003-04-23
CN101260149A (zh) 2008-09-10
WO2001098334A3 (en) 2002-09-06
AU7038101A (en) 2002-01-02
NO20026121L (no) 2003-02-13
KR20030013450A (ko) 2003-02-14
CZ2003154A3 (cs) 2003-06-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA006232B1 (ru) Стрептококковые антигены
Brodeur et al. Identification of group B streptococcal Sip protein, which elicits cross-protective immunity
US5871943A (en) Immunoassay comprising a truncated pneumococcal surface protein A (PspA)
EP0571538B1 (en) Structural gene of pneumococcal protein
US20030099673A1 (en) Membrane-associated immunogens of mycobacteria
EA007409B1 (ru) Антигенные полипептиды стрептококков, способы их получения и применения
US6426074B1 (en) Group B Streptococcus vaccine
EP1456231A2 (en) Streptococcus antigens
EA015561B1 (ru) НОВЫЙ ПОВЕРХНОСТНЫЙ БЕЛОК HAEMOPHILUS INFLUENZAE (БЕЛОК E; pE)
KR19990022742A (ko) 스트렙토코커스 속 유래의 hsp70 계열의 쇼크 단백질
AU682018B2 (en) Epitopic regions of pneumococcal surface protein A
AU693175B2 (en) Epitopic regions of pneumococcal surface protein A
US6737521B1 (en) Delivery and expression of a hybrid surface protein on the surface of gram positive bacteria
JPH09506247A (ja) ヘモフィリス属菌株トランスフェリン受容体遺伝子
AU2008204471B2 (en) Protective proteins of S. agalactiae, combinations thereof and methods of using the same
EP0669985A1 (en) Conjugate vaccine against group b streptococcus
AU674311B2 (en) Delivery and expression of a hybrid surface protein on the surface of gram positive bacteria
HUT64596A (en) Recombinant vaccine against swine pleuropneumonie
Kling et al. Characterization of two distinct opsonic and protective epitopes within the alpha C protein of the group B Streptococcus
KR20200135563A (ko) 박테리아 표면 수용체 단백질로부터 유래된 면역원성 조성물 및 백신
KR20080052693A (ko) 유전자, 단백질 및 그들의 용도
JPH10509865A (ja) 細菌膜上で発現される呼吸器多核体ウイルスプロテインｇ
EP1465659A2 (en) Use of a novel cell surface protease from group b streptococcus
KR100216390B1 (ko) 헤모필루스 외부막 단백질
AU667668C (en) Structural gene of pneumococcal protein

Legal Events

Date Code Title Description
PC1A Registration of transfer to a eurasian application by force of assignment
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): KZ

MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ KG MD TJ TM

MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): BY RU