DK169306B1 - Middel til fjernelse eller inaktivering af uønskede komponenter i blod eller andre ekstracellulære legemsvæsker samt fremgangsmåde til fremstilling af dextran-O-carbonyl-benzo-18-crown-6 og af dextran-hydroxyethylbenzo-18-crown-6 - Google Patents

Description

i DK 169306 B1

Opfindelsen angår et middel til fjernelse eller inaktivering af uønskede komponenter, herunder virus, i menneskers eller dyrs blod eller fra andre ekstracellu-lære legemsvæsker, hvilket middel er ejendommeligt ved, 5 at det indeholder en kronetherforbindelse, som er i stand til at binde den pågældende komponent, hvilken kronetherforbindelse er substitueret på et polysaccha-rid.

Opfindelsen angår også fremgangsmåde til frem-10 stilling af dextran-0-carbonylbenzo-l8-crown-6 og af dextran-0-hydroxyethylbenzo-l8-crown-6.

Udtrykket "kronetherforbindelse" benyttés· i· nær1 ' værende beskrivelse og krav i udtrykkets bredeste betydning, dvs. som omfattende ikke alene coronandfor-15 bindeiser, men også podandforbindelser og cryptandfor-bindelser.

En beskrivelse af coronand-, podand- og cryp-tandforbindelser er givet af E. Weber i Merck-Schuchardts publikation: "Phase Transfer Catalysts", 20 samt i den deri refererede litteratur.

En yderligere beskrivelse af disse forbindelsestyper findes i følgende artikler, alle med titlen: "Progress in Crown Ether Chemistry": F. Vdgtle, E.

Weber og U. Elben, Kontakte 2, (1980), side 36 f.f., E.

25 Weber og F. VSgtle, Kontakte 1 (1981), side 24 f.f., E. Weber, Kontakte 1 (1982), side 24 ff. og Kontakte 1 (1983), side 38 ff. samt Kontakte 1 (1984), side‘26'ff.

/

De først fremstillede kronetherforbindelser var af typen l8-crown-6, dvs. omfattende følgende ring: 2 DK 169306 B1 c. ; 10 men siden er der fremstillet tilsvarende forbindelser med et både' større og et mindre antal heteroatomer. Udtrykket "coronander" omfatter også forbindelser af 15 den pågældende art, hvori oxygenatomerne helt eller delvis er erstattet med svovl, nitrogen eller phosphor-atomer. Udtrykket omfatter endvidere sådanne forbindelser, hvori ringen er substitueret eller kondenseret med grupper af vidt forskellig sammensætning og struk-20 tur.

Udtrykket cryptander bruges om tilsvarende forbindelser, som har bi- eller polycykliske ringsystemer, ligeledes med vilkårlige heteroatomer, medens podandforbindelser er åbenkædede coronand/cryptand-25 analoge.

Det har været foreslået at forbeholde udtrykket "kronether" for coronandforbindelser, hvori alle heteroatomer er oxygen, men i nærværende beskrivelse og krav anvendes udtrykket kronether, som anført, i den 30 almindeligt anvendte brede betydning, d.v.s. som omfattende alle coronand-, podand- og cryptandforbindeiser.

Talrige anvendelsesmuligheder har været foreslået for kronetherforbindelser.

35 De fleste af disse anvendelsesmuligheder har væ ret baseret på den kendsgerning, at forbindelserne, alt 3 DK 169306 B1 efter den enkelte forbindelses særegenheder, såsom dimensioner af ringe og kaviteter, er i stand til, ofte med stor selektivitet, at binde ikke alene kationer, men også anioner og ikke-ladede organiske molekyler.

5 Mange af disse anvendelsesforslag har vedrørt forbindelsernes udnyttelse ved kemiske synteser, hvor de i visse tilfælde kan bringes til at udøve en katalytisk virkning. I forbindelse med anvendelser af denne art har det, med henblik på at nedsætte forbruget af rela-10 tivt kostbare kronetherforbindelser, været foreslået at immobilisere kronetherforbindelserne ved binding til polymerharpikser, specielt polystyren.

Talrige andre anvendelsesmuligheder af teknisk art har også været foreslået.

15 Derudover har det været anført, at benzokron- ethere, såsom benzo-15-crown-5-derivater og dibenzo-30-crown-10 har anticoccocidal virkning ved vævskulturforsøg (George R. Brown og Allan J. Foubister: J. Med. Chem. 1983, 26, 590-592). Imidlertid var der ingen in 20 vivo virkning, hvis forbindelserne blev administreret til fjerkræ gennem foderet.

Også i US patentskrift nr. 3 997 565 anføres, at visse kronethere in vitro udviser antiviral virkning, hvorfor forbindelserne foreslås anvendt bl.a. som des-25 infektionsmidler. En therapeutisk anvendelse nævnes ikke i patentskriftet.

E. Weber angiver i den første af de ovenfor citerede artikler, at de antibakterielle og antivirale egenskaber, som besiddes af visse af kronetherforbin-30 delserne, skyldes deres evne til at kompleksbinde metaller, men det anføres samme sted, at virkelig anvendelse indenfor de fysiologiske-farmakologiske områder endnu ikke kommer i betragtning.

I ungarsk patentskrift nr. 187 360 omhandles en 35 fremgangsmåde til fremstilling af visse cyclodextrin-kronetherderivater. Det anføres, at hvis cyclodextrin- 4 DK 169306 B1 molekylet og kronethermolekylet knyttes sammen over en sidekæde, som indeholder amino- eller carbonylgrupper, vil det resulterende molekyle være i stand til at kompleksbinde saltlignende organiske forbindelser, da der 5 dannes en kompleksbinding både med kationen og den apolære gruppe i den organiske anion. Det hævdes, at denne kompleksdannelse kan udnyttes til at ændre de farma-kokinematiske egenskaber af organiske molekyler med ionbinding. Der er ingen antydning af, at cyclodex-10 trin-kronetherderivaterne som sådanne skulle være egnede som lægemidler, og intet synes at være anført om deres tålelighed i det menneskelige legeme.

I beskrivelsen til international patentansøgning PCT/GB88/00671 (offentliggørelsesnummer W089/01476) om-15 handles specielle kronether forbindelser, nemlig tetra-aza-forbindelser og metalkomplekser deraf såvel som deres anvendelse til diagnostiske formål eller til opnåelse af en cytotoksisk virkning, fortrinsvis efter kompleksdannelse med radioaktive atomer. Muligheden 20 af at sammenknytte disse tetra-aza-forbindelser med andre molekyler, så som proteiner, specielt antistoffer, peptider eller carbonhydrater, nævnes som en teoretisk, ikke-underbygget mulighed. Det anføres ikke, hvilke fordele der ville kunne forventes ved en sådan rent hy-25 potetisk beskrevet sammenknytning, bortset fra det tilfælde hvor denne sker til et antistof. Da den eneste terapeutiske virkning, der nævnes, er en cytotoksisk virkning, er det på basis af den nedenfor givne forklaring indlysende, at en tilknytning til carbonhydrater 30 kun kommer i betragtning i forbindelse med lavmolekylære carbonhydrater, idet et produkt som fås ved tilknytning til f.eks. polysaccharider, som følge af at sidstnævnte ikke kan trænge gennem cellevæggene, ikke vil have nogen cytotoksisk virkning i sig selv, eller i 35 hvert tilfælde kun en meget ringe cytotoksisk virkning.

DK 169306 Bl 5 Årsagen til at kronethere endnu ikke har fundet medicinsk og therapeutisk anvendelse er, at frie kronethere som sådanne er særdeles toksiske overfor pattedyr og mennesker.

5 Det har nu vist sig, at toksiciteten af kron ethere nedsættes drastisk, når disse kobles til et po-lysaccharid, samtidig med, at den i visse tilfælde meget specifikke evne til binding af kationer, anioner eller ikke-ladede molekyler bevares, 10 Det har endvidere vist sig, at der kan dannes meget stabile kronether-polysaccharid-kondensationspro-dukter, som kan indgives intravenøst, eller som ekstra-korporalt kan bringes i kontakt med en blodstrøm, uden risiko for at bundne kronetherforbindelser fraspaltes 15 som toksiske, frie kronetherforbindelser.

Nærværende opfindelse muliggør en medicinsk udnyttelse af kronetherforbindelsers store selektivitet med hensyn til de stoffer, der kan bindes deraf. Baseret på kendskab til molekylstørrelse og -struktur 20 såvel som andre egenskaber af det stof eller de stoffer, som i hvert enkelt tilfælde ønskes fjernet fra blodet eller andre ekstracellulære legemsvæsker, og eventuelt på basis af enkle forsøg, kan der udvælges eller syntetiseres en egnet kronether til binding af 25 specielt det pågældende stof eller de pågældende stoffer.

Midlet ifølge opfindelsen kommer således i betragtning til behandling af mennesker eller dyr, som er angrebet af f.eks. følgende: Rhinovirus 1A, 2, 14 el- 30 ler andre typer, polio-2, Coxsackie-A 21, Coccidia, influenza eller svineherpes. Endvidere til fjernelse af NH4+-ioner samt primære, sekundære og tertiære aminer og deraf afledede forbindelser fra legemsvæsker i forbindelse med organdefekter, hvor den naturlige elimine-35 ring deraf er nedsat. Midlet er endvidere egnet til ved forgiftningstilfælde at binde og fortrinsvis fjerne 6 DK 169306 B1 ioner af f.eks. følgende metaller: Pb, Ag, Hg, Au, Cd,

Cu, zn, Na og K samt radioaktiv Cs.

Det polysaccharid, som kronetherforbindelsen er substitueret på, kan være hydroxyethylstivelse, inulin 5 etc., men er fortrinsvis dextran.

En foretrukken udførelsesform for midlet ifølge opfindelsen er ejendommelig ved, at polysaccharidet er dextran med en molekylvægt Mw mellem 1.000 og 120.000.

Et sådant middel er vandopløseligt og kan administreres 10 intravenøst.

Ved normal nyrefunktion vil hovedparten af dex-tran-kronetherforbindelsen være udskilt i uændret form . efter et antal timer, medtagende komponenter som kronetherforbindelsen har opfanget under opholdet i den 15 ekstracellulfcre væske.

Opfindelsen består ikke af, og er ikke begrænset af nogen teori vedrørende den drastiske reduktion af kronetherforbindelsernes toksicitet ved kobling med po-lysaccharider, specielt dextran, men det antages, at en 20 væsentlig faktor er, at kronether-polysaccharid-forbin-delsen forbliver i legemets ekstracellulærvæske og ikke som de frie kronethere påvirker de partier af nerver eller organer, hvor specielt kronethernes ionbindende virkning ville medføre toksiske skader.

25 På denne basis vil det være indlysende, at de kronether-polysaccharidderivater, som anvendes i midlet ifølge opfindelsen, er af en anden type end de cytotoksiske stoffer, som nævnes i ovenfor omtalte internationale patentansøgning, da det må antages, at disse 30 stoffer skal passere ind i cellerne gennem cellevæggene fra den ekstracellulære væske for at være i stand til at udøve deres cytotoksiske virkning.

Ved den udførelsesform, hvor midlet er beregnet til at indgives intravenøst, er, som nævnt, dextran det 35 foretrukne polysaccharid, ikke alene fordi der i forbindelse med dets kendte anvendelse som plasmaerstat- 7 DK 169306 B1 ning findes et stort erfaringsmateriale om dets udskillelse gennem nyrene, viskositetsegenskaber etc., men også fordi mulighederne for tilvejebringelse af med kronethere substituerede produkter indtil nu er særligt 5 undersøgt for dextran.

De vandopløselige midler ifølge opfindelsen kan alternativt benyttes til ekstrakorporal behandling af en blodstrøm, idet der mellem denne og en opløsning af det vandopløselige middel ifølge opfindelsen er ind-10 skudt en membran, som under de benyttede betingelser muliggør fjernelse af den eller de uønskede komponenter fra blodstrømmen, uden at der passerer kronetherforbindelse over i blodet.

Ekstrakorporal behandling af en blodstrøm kan 15 også foretages med en vanduopløselig form for midlet ifølge opfindelsen, fortrinsvis et kronethersubstitue-ret, ved tværbinding vanduopløseliggjort dextran. Et sådant uopløseligt middel anbringes i kontakt med blodstrømmen og optager uønskede komponenter fra denne, 20 uden at de i sig selv toksiske kronetherforbindelser overgår i blodet.

I de tilfælde, hvor polysaccharidet udgøres af et dextran, har det vist sig hensigtsmæssigt, at dette er substitueret med kronetherforbindelse i en mængde op 25 til 25 vægt%, beregnet på den substituerede dextranfor-bindelse.

I midlet ifølge opfindelsen er, som nævnt, polysaccharidet substitueret med coronand-, podand- eller cryptandforbindelser, men en særlig interesse knytter 30 sig til polysaccharider, specielt dextraner, substitueret med coronandforbindelser, da det eksperimentelle arbejde med sådanne er længst fremskredet.

Et foretrukket middel ifølge opfindelsen omfatter i overensstemmelse dermed en coronandforbindelse, 35 substitueret på et polysaccharid, og er ejendommelig ved, at de substituerende coronandgrupper har den almene formel: DK 169306 B1 8 X z ril ·, Γ Y(-CH - CH - Y)ni - Q - A1 L Y(-JH - J« - Y>n2 j 10 X z . hvori Q står for en gruppe, som danner bro til polysac- charidet og som er en carbonhydridkæde, der kan tjene 15 som såkaldt spacergruppe og fortrinsvis har 1-20 car- bonatomer, en -C-O-gruppe eller en -CH-CH2-gruppe,

II I

O OH

hvori A1 og A2, som kan være ens eller forskellige, 20 hver betegner en gruppe med en af formlerne: / /V A/

- - f f [T

h2cNs /Vs /ΛΑ x,z x,z 30

I II III

35 9 DK 169306 B1 ./V A/

5 x/\. /A

χ'Ζ X/Z

A

10 Χ'Δ IV v n1 og n2 kan være ens eller forskellige og hver betegner et helt tal mellem 0 og 20, idet dog n1 og n2 ikke 15 samtidig kan betegne 0, og hvis A1 og A2 betegner IV eller V betegner n1 eller n2 mindst 2, symbolerne Y kan være ens eller forskellige og er valgt blandt -0-, -S-, -NH- og -PH-, symbolerne X og Z betegner hver hydrogen, eller et eller flere par af symbolerne X og Z betegner 20 hver sammen med C-atomer i coronandringen en eller to carbonhydridringe eller eventuelt sammen med Y en eller to heterocykliske ringe, fortrinsvis benzenringe eller pyridinringe.

Også coronandgrupper af den umiddelbart overfor 25 nævnte art, hvori et eller flere af symbolerne X og Z betegner en substituent, f.eks. som nævnt i beskrivelsen til US patent 3 997 565, kommer i betragtning.

Det har vist sig, at dextran, substitueret med 0-carbonylbenzo-18-crown-6-grupper med formlen: 10 DK 169306 B1 k 0£r° 10 kan fremstilles med stor substitutionsgrad, og at disse . siibstituerede dextranforbindelser ikke har væsentlig toksicitet f.eks. for mus. Endvidere kan de opløses i 15 vand i tilstrækkelig koncentration, uden at opløsningens viskocitet bliver for stor til intravenøs infusion.

Interesse knytter sig endvidere til polysaccha-rider, specielt dextran, substitueret med 0-hydroxy-20 ethylbenzo-18-crown-6-grupper med formlen: - c«,. o .

L An

0 0 OB

A O

30

Kronetheres evne til at binde ioner og uladede molekyler skyldes deres særlige molekylåre struktur.

35 Der henvises til de ovenfor refererede artikler af E. Weber og de dér givne referencer for en nærmere forkla- 11 DK 169306 B1 ring af disse forhold. Det er ikke alene ioner eller molekyler, som netop passer i kronethrenes ringe eller hulrum som bindes, også molekyler som har særlige partier, der modsvarer den pågældende kronether, kan bin-5 des, og der kan endvidere f.eks. dannes strukturer, hvor kronethergrupperne er orienterede lagvis, mellem hvilke lag større molekyler kan bindes.

Ved valg af kronethere med passende ringstørrelser og for podanders vedkommende passende kædelængder, 10 samt ved substituering og fusionering til ændring af ringenes og kædernes effektive dimensioner og stivhed, er det for fagmanden muligt at syntetisere kronethere, som er meget specifikke til en given opgave. Det kan eksempelvis nævnes, at polysaccharider, hvorpå er sub-15 stitueret benzo-18-crown-6, er effektive til fjernelse eller inaktivering af polio-2 og Coxsackie-A2l virus, medens polysaccharider med benzo-15-crown-5 kan benyttes til fjernelse eller inaktivering af NH4+.

Den omstændighed, at kronetherne i midlet iføl-20 ge opfindelsen er substitueret på et polysaccharid, kan i visse tilfælde medføre, at kronethernes bindings- eller absorptionsevne af steriske grunde svækkes noget. Denne svækkelse kan imidlertid imødegås ved at anvende spacergrupper Q af en vis længde, som skaber en af-25 stand mellem kronetherstrukturen og polysaccharidets skelet.

Kronetherne kan knyttes til polysacchariderne under anvendelse af substitutionsmetoder, som bygger på i sig selv kendte kemiske reaktioner.

30 Man har, til opnåelse af kronetherforbindeiser, som kan reagere med OH-grupper i polysaccharidet, således i 4'-stillingen i benzo-18-crown-6 indført f. eks. følgende grupper: 35 DK 169306 B1 12 -COCl, -COOH, -CH2Br, -CH2C1, -CH3, -CH=CH2, -CH—CH9, -C-CHq, -CH-CH9-Br, -CH-CHo, \ / 2 II 3 f 2 I 3

5 cr O OH OH

En række kronetherforbindelser er kommercielt tilgængelige eller kan fremstilles efter fremgangsmåder, angivet i den ovenfor refererede litteratur.

10 Opfindelsen angår også fremgangsmåde til frem stilling af dextran-0-carbonylbenzo-18-crown-6, der er ejendommelig ved det i krav 9's kendetegnende del angivne .

Opfindelsen angår endvidere en fremgangsmåde til 15 fremstilling af dextran-hydroxyethylbenzo-18-crown-6, der er ejendommelig ved det i krav 10's kendetegnende del angivne.

Blandt kronetherforbindelser, der må anses for interessante i forbindelse med nærværende opfindelse, 20 kan foruden de ovennævnte specielt anføres benzo-19-crown-6 samt benzo-15-crown-5, der f.eks. er egnet til fremstilling af produkter, som kan benyttes til fjernelse af NH4+ fra blodet, og benzo-12-crown-4.

Omsætningen mellem den med en reaktionsdygtig 25 gruppe forsynede kronetherforbindelse og polysacchari-det udføres fortrinsvis i et opløsningsmiddel, som omfatter pyridin og/eller dimethylformamid.

Til belysning af fremstillingsmåder for kron-ether-polysaccharidforbindelser til anvendelse i midlet 30 ifølge opfindelsen anføres følgende eksempler, som beskriver synteser og analyser udført på Forsøgsanlæg Risø, Roskilde, Danmark. De anførte eksempler er ikke resultat af nogen optimering af de pågældende fremgangsmåder.

35 DK 169306 B1 13

Eksempel 1

Fremstilling af dextran-0-carbonylbenzo-l8-crown-6.

5 4'-chlorcarbonylbenzo-18-crown-6 fremstilles ef ter Bourgain, Wong, Hui og Smid, J. Am. Chem. Soc. 97:12 (1975) 3462-67. Udbyttet er kvantitativt.

36 g dextran (T40 d.v.s. dextran med gennemsnitlig molekylvægt ca. 40 000) svarende til 0,22 mol mono-10 mer (glucose) opslæmmes i 250 ml pyridin. Under omrøring på oliebad ved 65-70°C tilsættes 22,1 g 4-chlor-carbonylbenzo-i8-crown-6, svarende til 0,06 mol, opløst . i 75 ml pyridin. Reaktionsblandingen afkøles og fældes med acetone. Den udfældede sirup opløses i vand og 15 fældes atter med acetone. Fældningsproduktet genopløses i vand og dialyseres i et døgn. Det dialyserede produkt frysétørres. Udbytte 34 g, svarende til 61% af det teoretiske udbytte.

Produktet analyseres ved massespektroskopi, NMR 20 og HPLC.

Indhold af kemisk bundet kronetherforbindelse i produktet: 17,4%, indhold af fri kronetherforbindelse i produktet 0,3%.

Ved en lignende fremgangsmåde blev opnået et 25 produkt med et indhold af dextranbundet kronetherforbindelse på ca. 8%.

Eksempel 2 30 Fremstilling af dextran-hydroxyethylbenzo-l8-crown-6 4' -(2"-brom-1"-hydroxyethyl)-benzo-18-crown-6 fremstilles ud fra 4'-vinylbenzo-l8-crown-6 ved om sætning med N-bromacetamid i dioxan. Udbytte af det rå 35 stof 90%.

Der fremstilles tre opløsninger: 14 DK 169306 B1 I: 5 g dextran (T20) svarende til 0,03 mol monomer (glucose) opløses i ca. 10 ml vand.

II: 3,5 g 4'-(2',-brom-l"-hydroxyethyl)-benzo-l8- crown-6, svarende til 0,008 mol, opløses i 10 ml 5 vand.

III: 4,3 g natriumhydroxid, svarende til 0,011 mol, opløses i 10 ml vand.

Opløsningen I opvarmes til 60°C og tilsættes en 10 trediedel af opløsningen II og en trediedel af opløsningen III. Der omrøres ved 60°C i 15 minutter, hvorpå der atter tilsættes en trediedel af hver af de oprindelige opløsninger II og III, og efter yderligere 15 minutter tilsættes den resterende trediedel af hver af de 15 to opløsninger. Temperaturen hæves til 70°C, og reaktionsblandingen omrøres i yderligere ca. to timer. Reaktionsblandingen afkøles til stuetemperatur og fældes med acetone. Den fældede sirup opløses i vand og fældes atter med acetone. Siruppen genopløses i vand, 20 gøres sur med 2 N HC1 til pH 4,5 og fældes derpå med alkohol. Det udfældede produkt genopløses i vand, dialyseres i et døgn og frysetørres.

Udbytte 3,5 g, svarende til 45% af det teoretiske udbytte. Stoffet underkastes HPLC. Indhold af 25 dextranbundet kronetherforbindelse 1,45%, indhold af fri kronetherforbindelse 0,12%. Renhed 96,5%.

Afprøvning af midlet 30 Toksicitet og eliminering T40-dextran-0-carbonylbenzo-l8-crown-6 blev efter den i Eksempel 1 beskrevne metode fremstillet med to forskellige substitutionsgrader. Det ene produkt 35 (A) havde en substitutionsgrad på 8%. Indholdet af fri kronetherforbindelse i dette produkt blev ikke bestemt.

15 DK 169306 B1

Det andet produkt (B) havde en substitutionsgrad på 15% og et indhold af ikke-kemisk bundet kronetherforbindel-se på 0,3%.

Produktet A blev i en koncentration på 1% indgi-5 vet intravenøst til mus, som hver modtog en dosis på 0,4 ml, svarende til 32 x 10”4 g kronether. Musene viste ingen sygdomstegn. Urinen blev opsamlet og underkastet uv analyse, som viste at dextran-O-carbonylbenzo- 18-crown-6-forbindelsen var udskilt praktisk taget 10 fuldstændigt efter 3-5 timers forløb.

Produktet B blev prøvet på lignende måde, men i en koncentration på 10%. Dosis var også her 0,4 ml - svarende til 6,0 x 10“ 3 g kronetherforbindelse. Indholdet af fri kronetherforbindelse i dosis udgjorde 1,2 15 x 10-4 g. Flere dyr blev efter denne indgivelse nedstemte og stritpelsede i ca. 30 minutter, men viste derefter ingen symptomer.

Der blev yderligere udført to rækker sammenligningsforsøg med kronethermonomeren.

20 I det første forsøg blev benzo-l8-crown-6 i vandig opløsning i en koncentration på 0,8% indgivet i en dosis på 0,4 ml pr dyr, svarende til 32 x 10-4 g kronether. Dyrene døde straks, inden injektionen var afsluttet.

25 I det andet forsøg blev der anvendt en koncen tration, ligeledes af benzo-18-crown-6, på 0,08%. Dosis var også her 0,4 ml, svarende til 3,2 x 10-4 g kronether. I dette tilfælde fremkom der stærke kramper hos dyrene, som varede i ca. 15 minutter, men dyrene over-30 levede.

Den reaktion, som blev konstateret ved indgivelse af produktet (B), skyldes formodentlig indholdet af fri kronether i produktet og vil kunne undgås ved en mere vidtgående rensning af dette.

35 Ved indgivelse af 3,2 x 10“4 g benzo-18-crown-6 i ren form fås der således tydeligt kraftigere reaktion DK 169306 B1 16 end ved det ovenfor beskrevne forsøg med produktet (B), hvor en mængde på 1,2 x 10-4 g af den samme forbindelse i fri tilstand blev tilført som urenhed, hvilket bestyrker ovenstående antagelse, at den iagttagne reak-5 tion med produktet (B) ikke skyldes den dextranbundne kronether, men den mængde, som foreligger som urenhed i ikke-kemisk bundet form.

Modvirkning af virusinfektion: 10 Disse afprøvninger blev foretaget af Statens veterinære Institut for Virusforskning, Lindholm, Danmark.

Test 1 15 Denne test blev udført under anvendelse af mund- og klovsygevirus, Type A, på små mus (3-4 dage gamle).

Ud fra en virussuspension blev fremstillet to identiske fortyndingsserier (Serie 1 og Serie 2) omfattende fortyndinger fra 10-1 til 10"8. Før inokulering af muse-20 ne blev hver fortyndingsprøve blandet med et lige så stort volumen af en af følgende væsker: 1. Phosphatstødpude (viruskontrol) - serie 1 2. 5% vandig opløsning af dextran-kronetherforbindelse, fremstil- 25 let ifølge eksempel 1 ovenfor og med 17,4% bundet kronether - serie 2 Hver blanding blev inokuleret intraperitonealt i 8 mus. Dosis 0,2 ml/mus. Testen blev gentaget to gange under anvendelse af to forskellige viruspræpara-30 ter (1/486) x 10”4 og (1/63) x 10“4 svarende til henholdsvis 1 og 8 muse-patogene enheder (forsøg henholdsvis A og B).

Følgende resultater blev opnået (virustitre): 35 17 DK 169306 B1

Forsøg A Forsøg B

1. Viruskontrol 7,5 6,5 2. Virus + dextran-kronether 7,0 5,0 5 Titeren, som afspejler indholdet af aktiv virus i blandingen, er udtrykt som den negative logarithme af den virusfortynding, som svarer til en 50%'s mortalitet af de inokkulerede mus. Metodens pålidelighed er sædvanligvis ca. ± 0,5. Dette medfører, at en forskel 10 mellem titrene skal være mere end 1 for at være signifikant. Derfor er forskellen mellem viruskontrollen (1) og virus + dextran-kronether (2) i forsøg A ikke • signifikant, hvorimod forsøg B viser, at dextran-kron-etherforbindelsen hæmmer virusaktiviteten.

15

Test 2 40 marsvin blev inokuleret samtidigt under anvendelse af mund- og klovsygevirus, type A, Holland. Inokuleringen blev foretaget ved at injicere en virus-20 suspension intrakutant i een planta. Hvert marsvin modtog ca. 500 infektive marsvine-enheder.

De inokulerede marsvin blev opdelt i to grupper på hver 20 dyr. I tre på hinanden følgende dage, startende på inokuleringsdagen, blev den ene af disse 25 grupper behandlet med fysiologisk saltvand, medens den anden gruppe blev behandlet med en 5 vægt%'s opløsning af dextran-kronetherforbindelse, fremstillet ifølge Eksempel 1 og indeholdende 17,4 vægt% kronether.

Hvert dyr modtog to subkutane injektioner dag-30 lig. Hver injektion var på 1 ml.

Dyrene blev undersøgt hver 3., 4. og 5. dag efter inokulering, og udviklingen af sygdommen blev vurderet på basis af antallet af blærer på de tre plantae, hvor der ikke var foretaget inokulering. En antiviral 35 virkning viste sig som en formindskelse af antallet af blærer.

18 DK 169306 B1 Følgende resultater blev opnået:

Antallet af blærer som procent af det maksimale antal: 5 3. dag 4. dag 5. dag

Fysiologisk saltvand 25 66 100

Dextran-kronether 15 43 86

Af ovenstående resultater fremgår, at der blev 10 opnået en reduktion af antallet af blærer ved injektion af dextran-kronetherforbindelsen. Baseret på kendskab til hastigheden af den renale eliminering af dextran-. kronetherforbindelsen er det mest sandysnligt, at en endnu mere udtalt antiviral virkning, ville være blevet 15 påvist, hvis behandlingen var blevet fortsat ud over den tredie dag.

Test 3 40 marsvin blev samtidig inokuleret med mund-20 og klovsygevirus type C, Turup. Inokuleringen blev udført ved at injicere en virussuspension intrakutant i een planta. · Hvert marsvin modtog ca. 500 infektive marsvine-enheder.

De inokulerede marsvin blev opdelt i to grupper 25 på hver 20. Den ene gruppe blev behandlet med fysiologisk saltvand, den anden blev behandlet med en 3,75 vægt%'s opløsning af dextran-kronetherforbindelse i fysiologisk saltvand. Dextran-kronetherforbindelsen var den, som fremstilles i Eksempel 1 med 17,4 vægt% bundet 30 kronether.

Behandlingen blev foretaget efter følgende skema: På selve inokuleringsdagen, såvel som på den 1., 2. og 3. dag efter inokuleringen, blev hvert mar-35 svin injiceret under anvendelse af % ml væske intracor-dialt og 2 x 2 ml subkutant. Injektionerne blev fore- 19 DK 169306 B1 taget kl. 9, kl. 12 og 15. Dyrene blev undersøgt dagligt og udviklingen af sygdommen blev vurderet på basis af dannelsen af blærer på de plantae, hvor der ikke var sket nogen inokulering.

5 Følgende resultater blev opnået:

Antal blærer på forskellige dage efter inokulering, angivet som % af det maksimalt talte antal: 3. dag 5. dag 6. dag 10 Fysiologisk saltvand 0 8 100

Dextran-kronether (3,75%) 0 2 90

Ovenstående resultater viser, at dextran-kron-etherforbindelsen udøvede en antiviral virkning samtli-15 ge tre dage,, hvor sygdommens udvikling blev vurderet.

Også i forbindelsen med denne test gælder det, at det synes mest sandsynligt, at hvis behandlingen var blevet fortsat i mere end de første tre dage, ville der være fundet et væsentligt mindre antal blærer, og mu-20 ligvis være fremkommet en fuldstændig helbredelse på den 4. og 6*. dag hos den gruppe, som modtog dextran-kronetherforbindelsen.

Kompleksdannende evne 25 (a) Ved diffusionsforsøg i en dialyseopstilling, hvor et dextran-benzo-18-crown-6-produkt, som det i Eksempel 1 fremstillede, befandt sig i vandig, alkoholholdig opløsning, har det vist sig, at den for den frie 30 kronether karakteristiske evne til at kompleksbinde metaller, såsom natriumioner, er bevaret i det på dextran substituerede kronetherprodukt. 1

Ved et andet diffusionsforsøg blev anvendt et 35 kronethersubstitueret dextranprodukt syntetiseret som i

Eksempel 2.

20 DK 169306 B1 2,5 g kronetherdextran blev opløst i 50 ml vand indeholdende 10 yg Cs134/ml og herefter overført i en dialyseslange med poreradius ca. 1,5 nm. Dialyseslange med indhold blev anbragt i et måleglas indeholdende 150 5 ml vand med 10 yg cs134/ml. Til dialyseslangens indhold blev sat 2 ml vand indeholdende 10 yg Cs134/ml plus en spormængde Cs137 (ca. 20 000 Bq). Efter henstand i 12 timer blev udtaget prøver fra henholdsvis dialyseslange og udvendig væske og på basis af radioak-10 tivitetsmålinger blev Cs-koncentrationerne bestemt og forholdet mellem koncentrationerne beregnet.

Følgende resultater blev opnået:

Dialyseslange udvendig C Dialyse-/C udven- 15 væske slange dig

Start 520 yg Cs 1500 yg Cs i

Efter 12 timer 658 yg Cs 1362 yg Cs 1,2 20 At forholdet mellem Cs koncentrationen i dia lyseslangen og koncentrationen i den udvendige væske forøges ved henstand viser, at kronetherforbindelsen ved substitutionen på dextran har bevaret sin evne til at binde Cs-ioner.

25

Eliminering af Cs137 fra blodbanen På forsøgsstation Risø, Helsefysisk Afdeling, Roskilde, Danmark blev udført forsøg til undersøgelse 30 af de omhandlede dextran-kronether produkters evne til at fjerne radioaktivt Cesium, Cs137, fra blod hos mus.

Der blev udført tre forsøg, hver med 5 mus.

Som stamopløsning til anvendelse som eller til fremstilling af injektionsvæske blev ved alle forsøgene 35 anvendt en vandig 0,9 %'s natriumchloridopløsning indeholdende Cs137 i en mængde svarende til 3000 Bq/ml.

DK 169306 B1 21

Musene var ved hvert forsøg anbragt i et bur med netbund, hvorunder fandtes en tragtlignende bund til opsamling af musenes urin. Ved hver urinopsamling blev denne bund skyllet med vand, og urin plus skyllevand 5 blev opsamlet og fortyndet med vand til 20 ml, før radioaktiviteten blev bestemt med Geigertæller.

Forsøg 1 10 Ved dette forsøg blev hver mus injiceret med 0,1 ml af stamopløsningen og modtog således 300 Bq Cs1^7. Tidspunktet for denne injektion, som nedenfor er betegnet tD, var 11:30.

Efter 1 time injiceres hver mus med 0,4 ml af en 15 6 vægt/ml-% vandig opløsning af det i Eksempel i fremstillede dextran-0-carbonylbenzo-l8-crown-6-produkt svarende til 24 mg af dette produkt pr. mus.

Urinopsamlingerne med påfølgende radioaktivi-tetsbestemmelse blev begyndt 1 time og 24 minutter, 20 svarende til 1,35 timer, efter tQ, og fortsattes som det fremgår af nedenstående skema.

47,81 timer efter tD foretoges en yderligere injektion med 0,5 ml af den 6%'s dextran-kronetheropløs-ning til hver mus, og urinopsamling med radioaktivi-25 tetsmåling fortsattes.

Resultaterne fremgår af nedenstående Tabel I

30 35 DK 169306 Bl 22

TABEL I

Tidspunkt/dato tid efter t0 Radioaktivitet (counts) _i timer_i urin + skyllevand 5 12:54 19.6.90 1,35 6978 16:20 19.6.90 4,83 3684 20:23 19.6.90 8,88 8280 7:34 20.6.90 20,07 17001 10 8:25 21.6.90 44,92 17368 11:17 21.6.90 47,78 2213

Yderligere dextran-kronetherinjektion, hvorefter ny t0 = 11:34 den 21.6.90.

15 15:58 21.6.90 4,63 3533 20:00 21.6.90 8,67 2937 9:37 22.6.90 22,28 6391 20 Resultaterne er i form af de akkumulerede værdi er for radioaktiviteten anført i nedenstående Tabel IV og er optaget på tegningen.

Forsøg 2 25

Ved dette forsøg anvendes som injektionsopløsning en blanding af 2 ml af den ovennævnte Cs137-hol-dige opløsning og 8 ml af den i Forsøg 1 benyttede dextran-kronetheropløsning.

30 Hver mus injiceredes med 0,5 ml af blandingen og modtog således 300 Bq Cs137 og 24 mg dextran-kronether. Urinopsamling og yderligere kronether-injektion (0,5 ml 6%'s opløsning) blev foretaget på lignende måde som ved Forsøg 1, som det fremgår af nedenstående Tabel II.

35 DK 169306 B1 23

TABEL II

Tidspunkt/dato tid efter tQ Radioaktivitet (counts) for urinopsamling i timer_i urin + skyllevand 5 12:56 19.6.90 0,87 4498 16:25 19.6.90 4,62 11634 20:27 19.6.90 8,65 8566 7:37 20.6.90 19,82 16805 10 8:27 21.6.90 44,65 12901 11:20 21.6.90 47,53 2728

Yderligere dextran-kronetherinjektion, hvorefter ny tQ = 11:40 den 21.6.90.

15 16:00 21.6.90 4,33 3659 20:04 21.6.90 8,40 3222 9:40 22.6.90 22,08 4966 20 Forsøg 3

Ved dette Sammenligningsforsøg anvendes som injektionsopløsning en blanding af 2 ml af den ovennævnte stamopløsning indeholdende 3000 Bq/ml Cs137 og 8 ml 25 vandig 0,9 vægt% NaCl-opløsning. Hver mus injiceredes med 0,5 ml af blandingen og modtog således 300 Bg Cs137.

Urinopsamling blev herefter foretaget som følger: 30 35 DK 169306 B1 24 TABEL III tQ = 12:00 den 19.6.90

Tidspunkt/dato tid efter tQ Radioaktivitet (counts) _i timer_i urin + skyllevand 5 13:18 19.6.90 1,30 11355 16:29 19.6.90 4,48 3612 20:32 19.6.90 8,53 2542 7:40 20.6.90 19,66 17414 10 8:30 21.6.90 44,50 14592 16:03 21.6.90 52,05 3324 20:06 21.6.90 56,10 2522 9:42 22.6.90 69,70 3455 15 I nedenstående Tabel IV er de ved Forsøg 1, 2 og 3 opnåede resultater akkumuleret:

TABEL IV

20 Forsøg l_Forsøg 2_Forsøg 3

Tid Counts,total Tid Counts,total Tid Counts,total 1,35 6978 0,87 4498 1,30 11355 25 4,83 10662 4,62 16132 4,48 14967 8,88 18942 8,65 24698 8,53 17509 20,07 35943 19,82 41503 19,66 34923 44,92 53311 44,65 54411 44,50 49515 47,78 55524 47,53 57139 52,05 52839 30 52,41 59057 51,86 60798 56,10 55361 56,45 61994 55,93 64020 69,70 58816 67,06 68385 69,53 68986

De i Tabel IV anførte akkumulerede resultater 35 25 DK 169306 B1 danner basis for de på tegningen viste kurver, som gengiver de akkumulerede counts fra radioaktivitesmålin-gerne som funktion af tiden.

Ud fra en forsigtig vurdering og sammenligning 5 af de ved forsøgene 1, 2 og 3 opnåede resultater kan det sluttes, at udskillelseshastigheden i de første 5-8 timer efter første injektion er signifikant forøget af administreringen af dextran-kronether-forbindelsen.

Ligeledes fremgår det, at der efter anden injek-10 tion fås en noget større udskillelseshastighed i ca. 8 timer, hvorefter udskillelseshastigheden klinger af til niveauet i Forsøg 3.

Det ses, at i de ca. 70 timer observationerne fandt sted, har musene i forsøg 1 og 2, der modtog dex-15 tran-kronether, udskitlt ca. 17% mere radioaktivt Cs end musene i sammenligningsforsøg 3.

Claims (10)

1. Middel til fjernelse eller inaktivering af uønskede komponenter, herunder virus, fra menneskers eller dyrs blod eller fra andre ekstracellulære legemsvæsker, kendetegnet ved, at det indeholder 5 eller består af en kronetherforbindelse, som er i stand til at binde den pågældende komponent, hvilken kron-etherforbindelse er substitueret på et polysaccharid.

2. Middel ifølge krav 1, kendetegnet ved, at polysaccharidet er dextran.

3. Vandopløseligt middel ifølge krav 1 eller 2, fortrinsvis til intravenøs administrering, kendetegnet ved, at polysaccharidet er dextran med molekylvægt Mw mellem 1 000 og 120 000, fortrinsvis 40 000-110 000.

4. Middel ifølge krav 1 eller 2 til ekstrakor- poral behandling af blod, kendetegnet ved, at kronetheren er substitueret på et ved tværbinding vanduopløseliggjort dextran.

5. Middel ifølge krav 2-4, kendeteg- 20. e t ved, at kronetherforbindelsen udgør op til 25 vægt% af den dermed substituerede dextranforbindelse.

6. Middel ifølge et vilkårligt af de foregående krav, kendetegnet ved, at kronetherforbindelsen er en coronandforbindelse, og at de substitue- 25 rende coronandgrupper har den almene formel: DK 169306 B1 X Z ^ I | Y(-CH - CH - Y)nl 5

0. A1 A2 Y(-CH - CH - Y)n2 II 10. z hvori Q står for en gruppe, som danner bro til polysac-charidet og som er en carbonhydridkæde, der kan tjene 15 som såkaldt spacergruppe, og fortrinsvis har 1-20 carbonatomer, en -c-O-gruppe eller en -CH-CH2-0-gruppe

0 OH hvori A1 og A2, som kan være ens eller forskellige, 20 hver betegner en gruppe med en af formlerne: „ Af ' AA jj X'Z x,z

30. II III 35 DK 169306 B1 Λ/ Λ/ /λ Μ χ,ζ I χ,ζ /ΛΛ Jv\ Χ,ζ χ,ζ ίο IV V η.1 og η2 kan være ens eller forskellige og betegner hver et helt tal mellem 0 og 20, idet dog n1 og n2 ikke samtidig kan betegne 0, og hvis A1 og A2 betegner IV 15 eller V betegner n1 eller n2 mindst 2, symbolerne Y kan være ens eller forskellige og er valgt blandt -0-, -S-, -N- og -P-, symbolerne X og z betegner hver hydrogen, Η; H , eller et eller flere par af symbolerne X og z betegner 20 hver sammen med C-atomer i coronandringen en eller to carbonhydridringe eller eventuelt sammen med Y, en eller to heterocykliske ringe, fortrinsvis benzenringe eller pyridinringe.

7. Middel ifølge krav 6, kendetegnet 25 ved, at det omfatter dextran, substitueret med 0-carbo-nylbenzo-l8-crown-6-grupper med formlen: 30 35 DK 169306 B1 (0 Xh- 10

8. Middel ifølge krav 6, kendetegnet ved, at det omfatter dextran, som er substitueret med 0-hydroxyethylbenzo-18-crown-6-grupper med formlen: 15 ro 0 o. . H \ YVj - CHj - 0 - 20. yKJ I

0. OH 25

9. Fremgangsmåde til fremstilling af dextran- 0-carbonylbenzo-18-crown-6 til anvendelse i midlet ifølge krav 7, kendetegnet ved, at dextran i pyridin/dimethylformamid omsættes med 4'-chlorcarbonyl- 30 benzo-18-crown-6.

10. Fremgangsmåde til fremstilling af dextran-hydroxyethylbenzo-18-crown-6 til anvendelse i midlet ifølge krav 8, kendetegnet ved, at dextran i vandigt basisk medium omsættes med 4'-(2"-brom-l"-hy- 35 droxyethyl)-18-crown-6.