DK153883B - Analogifremgangsmaade til fremstilling af antibiotiske salte af trimethylammoniumderivater af polyenmacrolider indeholdende en alifatisk aminogruppe - Google Patents

Description

i

DK 153883 B

Polyeumacrolidantibiotika anvendes almindeligt i terapien af svampeinfektioner hos mennesket og hos dyr og til forebyggelse eller fjernelse af svampeforureninger af forskellige materialer.

5 Der kendes allerede nogle derivater af polyenmacrolider, der udviser nogle egenskaber, som er mere ønskelige end stamantibiotikaene, kendt er komplekset af amphotericin B med natriumdeoxycholat, H-acylderivaterne af polyenmacrolider (amerikansk patent nr. 3.244.570, 1966), hydrochlori-10 derne af methylestere af polyenmacrolider (W. Mechlihski, O.P. Schaffner, J. Intibiot. 25, 256, 1964), kondensationsproduktet af formaldehyd med candidin (Prance Per., Bhone-Poulene 41.272) eller reaktionsproduktet af polyenmacrolider med polysaccharider oxygeneret efter behandling med 15 perjodat (belgisk patent nr. 620.619) og I-glycosylderiva-terne af polyenmacrolider (belgisk patent nr. 787.531).

De ovennævnte derivater udviser imidlertid nogle andre uønskede egenskaber, f.eks. udviser M-acylpolyenmacroli-derne betydeligt lavere antifungal virkning, og saltene 20 af methylesterne af disse antibiotika er ret ustabile.

Endvidere kendes fra USSR patentskrift nr. 618111 og tysk offentliggørelsesskrift nr. 2706156 trimethylammoniumderivater af polyenmacrolider. Disse forbindelser har imidlertid en usub-stitueret carboxylgruppe og er uopløselige i vand ligesom stam-25 antibiotikaene, hvilket er til forskel fra de i den foreliggende ansøgning omhandlede forbindelser, der har en forestret carboxylgruppe og er kationer, som danner salte med anioner. Forestringen af carboxylgruppen har endvidere den fordel at nedsætte stoffernes giftvirkning.

30 Opfindelsen angår en analogifremgangsmåde til fremstilling af antibiotiske uorganiske salte af trimethylammoniumderivater af polyenmacrolider indeholdende en aminogruppe især de uorganiske salte af methylestere af disse derivater med den almene formel I • ' 1 » 2

DK 153883 B

R-N (CH3)3 > χ- j COOCH3 -i.

hvor R er resten af polyenmarcrolidet, som er forbundet med en methyleret carboxylgruppe og er bundet til aminogruppen, og X-5 er anionen af saltet, eller med den almene formel II

|Vn(CH3)3J+ Χ" hvor R er resten af polyenmacrolidet bundet til aminogruppen, og x” har den ovennævnte betydning, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at polyenmacrolidet i et organisk opløsningsmiddel eller en blanding af opløsningsmidler behandles med i dimethylsulfat i nærværelse af et neutraliseringsmiddel ved stuetemperatur under stadig omrøring, indtil fuldendelse af reaktionen/ og det fremkomne produkt udfældes ved tilsætning 15 af ethylether og opløses i butanol, den organiske opløsning vaskes med vand, koncentreres under reduceret tryk, og det således dannede methylsulfat om ønsket omdannes til et andet uorganisk salt på i og for sig kendt måde.

20

Produktet af den almene formel I, d.v.s. methylsulfat af ΪΓ,ΪΓ,Ι-trimethylpolyenmacrolidmetliylester, eller af den almene formel II, d.v.s. methylsulfat af polyenmaerolid, udfældes ved tilsætning af ethylether.

25 Som polyenmacrolider kan anvendes: nystatin, polifungin, amphotericin B, candicidin, pimaricin, trichomycin, levo-rin, rimocidin, candidin, aureofacin, perimycin, mycohep-tin.

Som organiske opløsningsmidler blev anvendt: dimethylacet= 30 amid, dimethylformamid, dimethylsulfoxid og alifatiske alkoholer med en kædelængde på 0^-0^.

Som neutraliseringsmiddel blev anvendt natriumbicarbonat,

DK 153883 B

3 I polyenmacroliderne indeholdende en aromatisk aminogrup-pe er denne gruppe substitueret med en eller to methyl-grupper. Bisse antibiotika er repræsenteret ved levorin, candicidin, trichomycin, aureofacin, perimycin.

5 Bet er blevet vist, at reaktionsbetingelserne, der anvendes ifølge opfindelsen, er tilstrækkeligt milde til at forhindre nedbrydning af antibiotikaene. Behandling af poly= enmacrolidet med dimethylsulfat under betingelser kendt fra litteraturen skulle bevirke åbning af macrolidringen, fjer-10 nelse af sukkerdelen og nedbrydning af polyen chromoforen, resulterende i tab af den biologiske virkning.

Be antimikrobielle og hemolytiske virkninger in vitro af BMS polyenmacrolider og stamantibiotikaene er vist i tabel 1.

15 Strukturen af de fremkomne derivater er blevet dokumenteret ved hjælp af spektroskopiske metoder. Som eksempel er vist fremgangs nåden anvendt til identifikation af candici= dinderivatet, nærmere betegnet BMS candicidin, fremkommet ved behandling af antibiotikumet med dimethylsulfat under 20 de foreslåede alkyleringsbetingelser. Sur hydrolyse af candicidin selv giver sukkerdelen mycosamin, hvorimod BMS candicidin gav F, F,F-tr ime thy lmy c o s amin. Strukturen af stoffet fremgik af massespektret (baseionerne og samtidigt molekylionerne ved m(e 206) og af det protonmagnetiske re-25 sonansspektrum) signal ved 6=5,68 karakteristisk for me= thylgrupperne bundet til nitrogenatomet med intensitet tre gange større end signalet ved 6=1,68 karakteristisk for protonerne i 0-6 methylgruppen i aminosukkeret.

Tilstedeværelsen af esterbindingen i molekylet i derivatet 50 vises af det intensive absorptionsbånd ved λ = 1750 οπΤ^ i IR spektret og samtidig mangel på absorption ved Λ*1590 cm”^, som er karakteristisk for stamantibiotikumet. Ben elektroniske absorption af candicidin og dets BMS derivat 4

DK 153883 B

er lidt forskellige i intensiteterne af absorptionsmaksima, hvorimod deres beliggenhed og strukturen af spektret er identiske. Dette gav bevis for, at strukturen af polyenchromoforen forblev uændret ved alkyleringsmetoden.

5 HMR-spektret af per-O-trimethylsilyl-DMS-candicidin viste bånd ved 6=5,65 og 3,03 karakteristiske for henholdsvis methoxy og h-methylprotoner. Behandling af alkaliske vandige opløsninger af candicidin frigjorde p-aminoacetophe-non, medens DMS-candicidin frigjorde F-dimethyl, F-methyl 10 og usubstitueret p-aminoacetophenon i molforholdet 3:5:2.

Fordelene ved derivaterne fremstillet ifølge opfindelsen er deres fuldstændige vandopløselighed sammen med den høje antifun-gale virkning og forbedrede selektive toksicitet sammenlignet med de naturlige antibiotika.

15 De uorganiske salte af trimethylammoniumderivater af poly= enmacrolider, især methylesterne af uorganiske salte af trimethylammoniumderivater af disse antibiotika, og fremgangsmåden ifølge opfindelsen til deres fremstilling belyses nærmere af følgende eksempler.

20 Eksempel 1 2 g polyfungin (E^ = 800 ved 304 nm) opløses i 10 ml dimethylformamid, og 10 ml methanol, 2 g natriumbicarbonat og 1 ml dimethylsulfat blev tilsat portionsvis, og reaktionsblandingen blev omrørt i 10 timer ved 25°C. Uopløst 25 natriumbicarbonat blev centrifugeret, methanolen inddampet under formindsket tryk, og derivatet blev fældet med ethyl= ether. Produktet blev opløst i 50 ml vand, mættet med butanol, og butanollaget blev vasket to gange med 20 ml vand og koncentreret under formindsket tryk til et rumfang på 30 15 ml. Udfældning med ethylether efterfulgt af vask to gange med ethylether og hexan gav 1,6 g af saltene af F,F, F-trimethylpolyfunginmethylester, som viste = 700 ved

10M

DK 153883 B

5 304 nm. Det opnåede udbytte er 80$ af det teoretiske. Eksempel 2 2 g nystatin (E^om = 860 med 304 nm) blev opløst i 50 ml methanol, 2 g natriumbicarbonat blev tilsat, og 2 ml di= 5 methylsulfat tilsat portionsvis. Reaktionsblandingen blev omrørt i 4 timer ved 25°C og yderligere oparbejdet, som beskrevet i eksempel 1. Saltet af K,R,R-trimethylnystatin= methylester fremkom i et udbytte på 1,3 g (75$ af det teoretiske), og produktet udviste = 760 ved 304 nm.

10 Eksempel '5 1 g amphotericin B (E^cm = 1420 ved 383 nm) blev opløst i 20 ml dimethylformamid-methanol i forholdet 10:1, og 1 g natriumbicarbonat blev tilsat, og 1 ml dimethylsulfat inddryppet. Reaktionsblandingen blev omrøret ved 20°C i 15 24 timer og yderligere oparbejdet som i eksempel 1. Der fremkom 0,9 g af saltet af R,H,R-trimethylamphotericin B methylester, som udviser E^ = 900 ved 382 nm, hvilket er 90$ af det teoretiske udbytte. Det fremkomne stof blev renset ved hjælp af modstrømsfordeling i opløsningsmiddel-20 systemet: chloroform-methanol-vand (2:2:1). Der fremkom 0,3 g salt af N,R,R-trimethylamphotericinmethylester, som udviser E^cm = 1400 ved 382 nm.

Eksempel 4 1 g candidin (E^cm = 820 ved 383 nm) blev opløst i 20 ml 25 dimethylformamid-methanol i forholdet 10:1, og 1 g natriumbicarbonat blev tilsat og 1 ml dimethylsulfat tildryppet. Reaktionsblandingen blev omrørt ;i 15 timer ved 20°C og oparbejdet som i eksempel 1. Der fremkom 0,5 g af saltet E,I,R-trimethylcandidinmethylester, som udviser E^cm = 30 550 ved 382 nm, hvilket er 80$ af det teoretiske udbytte.

Produktet blev renset ved søjlekromatografi på silicagel,

DK 153883B

6 der først var mættet med vand i opløsningsmiddelsystemet chloroform-methanol-vand (20:10:1). Der. fremkom 0,2 g af derivatet af candidin, der viser = 850 ved 378 nm.

Eksempel 3 5 1 g trychomycin = 450 ved 378 nm) blev opløst i 20 ml dimethylformamid-methanol i forholdet 10:1. 1 g natri um! icarb onat blev tilsat, og 1 ml dimethylsulfat blev inddryppet. Reaktionsblandingen blev omrørt i 15 timer ved 20°C og yderligere oparbejdet som i eksempel 1. Der frem- 10 kom 0,6 g DMS-trychomycin, som udviser Εη = 560 ved 378 j. cm nm.

Eksempel 6 1 g pimaricin (E^cm = 960 ved 304 nm) blev opløst i 20 ml methanol. 1 g natriumbicarbonat blev tilsat, og 1 ml 15 dimethylsulfat blev inddryppet. Reaktionsblandingen blev omrørt i 15 timer ved 25°0 og oparbejdet som beskrevet i eksempel 1. Der fremkom 0,85 g af saltet af H,li,N—trime= thylammoniummethylester, som udviser . = 700 ved 304 nm, hvilket er 80$ af det teoretiske udbytte.

20 Eksempel 7 1 g levorin (E^cm = 800 ved 378 nm) blev opløst i 30 ml dimethylformamid-methanol i forholdet 10:1, og 1 g natriumbicarbonat blev tilsat og 1 ml dimethylsulfat inddryppet. Reaktionsblandingen blev omrørt i 15 timer ved 20°C og op-25 arbejdet som beskrevet i eksempel 1. Der fremkom 0,7 g DMS-levorin, som udviser E^ = 600 ved 304 nm, hvilket er 70$ af det teoretiske udbytte.

Eksempel 8 1 g rimocidin (E^cm = 600 ved 304 nm) blev opløst i 20 7

DK 153883B

ml dimethylformarnid-methanol i forholdet 10:1, og 1 g na-triumbicarbonat blev tilsat og 1 ml dimethylsulfat inddryppet. Reaktionsblandingen blev omrørt i 15 timer ved 20°C og oparbejdet som i eksempel 1. Der fremkom 0,8 g 5 af saltet H,E,R-trimethylrimocidi:miiethylester, som udviser E?= 560 ved 304 run, hvilket er 80$ af det teoretiske -L cm udbytte.

Eksempel 9 0,1 g perimycin (E^ = 650 ved 380 run) blev opløst i 2 _l cm 10 ml dimethylacetamid-methanol i forholdet 10:1, og 0,1 g natriumbicarbonat blev tilsat og 0,1 ml dimethylsulfat tildryppet. Reaktionsblandingen blev omrørt i 10 timer ved 20°0 og oparbejdet som i eksempel 1. Der fremkom 0,05 g DMS-perimycin, som udviste E^cm = ^0 ve<^ nm’ ^vil-15 ket er 50$ af det teoretiske udbytte.

Eksempel 10 1 g aureofacin (E^ = 800 ved 379 nm) blev opløst i di= methylformamid-methanol i forholdet 10:1, og 1 g natrium= bicarbonat blev tilsat og 1 ml dimethylsulfat tildryppet.

20 Reaktionsblandingen blev omrørt i 20 timer ved 20°C og oparbejdet som i eksempel 1. Der fremkom 0,7 g DMS-aureo= facin, som viser = 760 ved 378 nm, hvilket er 65$ af det teoretiske udbytte.

Eksempel 11 25 0,1 g candicidin - 400 ved 378 nm) blev opløst i 5 ml dimethylformamid-methanol i forholdet 10:1, og 0,1 g natriumbicarbonat blev tilsat og 0,1 ml dimethylsulfat tildryppet. Reaktionsblandingen blev omrørt i 15 timer ved 20°C og oparbejdet som beskrevet i eksempel 1. Der 30 fremkom 0,04 g DMS-candicidin, som udviser Έ^° = 560 -L cm ved 378 nm, hvilket er 45$ af det teoretiske udbytte.

DK 153883 B

8

Eksempel 12 1 g mycoheptin (E^cm = 700 ved 383 nm) blev opløst i 20 ml dimethylformamid-methanol i forholdet 10:1, og 1 g na-triumbicarbonat blev tilsat og 1 ml dimethylsulfat tildryp-5 pet. Reaktionsblandingen blev omrørt i 15 timer ved 20°0 og oparbejdet som beskrevet i eksempel 1. Der fremkom 0,5 g af saltet af Ε,ΪΓ,Η-dimethyl-mycoheptinmethylester, som udviser E^ = 680 ved 380 nm, hvilket er 85$ af det teo-retiske udbytte.

10 fabel

Antifungale og hæmolytiske virkninger af polyenmacrolider og deres EMS derivater.

Antibiotikum ^50 ^50 (mcg/ml) (mcg/ml) pimaricin 1 100 15 DMS-pimaricin 1,7 400 . polifungin 0,08 20 DMS-polifungin 0,15 120 nystatin 0,1 50 DMS-nystatin 0,25 100 20 rimocidin 1,5 30 DMS-rimocidin 2,5 50 amphotericin B 0,03 5 BMS-amphotericin B 0,08 5 mycoheptin 0,05 15 25 BMS-mycoheptin 0,2 65 candidin 0,054 20 DMS-candidin 0,15 70 candicidin 0,005 2,5 DMS-candicidin 0,005 15 30 aureofacin 0,005 0,35 DMS-aureofacin 0,003 15 *

DK 153883 B

9 levorin 0,007 2,5 EMS-levorin 0,009 20 trychomycin 0,005 3 EMS-trychomycin 0,01 10 5 perimycin 0,002 5 MS-perimycin 0,003 12 I tabellen betyder DMS saltet af ir,F,]!I-trimethylesteren af antibiotikumet eller saltet af Η,Ε,Ν-trimethylantibio-tikum.

10 IC5o cLen koncentration af stoffet, som forårsager 50$ hæmning af væksten af Saccharomyces cerevisiae celler i flydende standardmedium bestemt spektrofotometrisk ved "X = 600 nm efter 24 timers inkubation ved 28°C.

EH^q betyder den koncentration af stoffet, som forårsager 15 50$ hæmoglobin bestemt spektrofotometrisk ved λ = 550 nm.

Claims (1)

1. DK 153883B ίο · ‘ ! - ·. v i O g Analogifremgangsmåde til fremstilling af antibiotiske uorganiske salte af trimethylammoniumderivater af polyenmacrolider indeholdende en aminogruppe, især de uorganiske salte af me-thylestere af disse derivater med den almene formel I 10 x" I COOCH3 hvor R er resten af polyenmacrolidet, som er forbundet med en methyleret carboxylgruppe og er bundet til aminogruppen, 15 og X er anionen af saltet, eller med den almene formel II £r-n(ch3)3 + X" hvor R er resten af polyenmacrolidet bundet til aminogruppen, 20 og X har den ovennævnte betydning, kendetegnet ved, at polyenmacrolidet i et organisk opløsningsmiddel eller en blanding af opløsningsmidler behandles med dimethylsulfat i nærværelse af et neutraliseringsmiddel ved stuetemperatur under stadig omrøring indtil fuldendelse af reaktionen, og 25 det fremkomne produkt udfældes ved tilsætning af ethylether og. opløses i butanol, den organiske opløsning vaskes med vand, koncentreres under reduceret tryk, og det således dannede methylsulfat om ønsket omdannes til et andet uorganisk salt på i og for sig kendt måde. 30 35 t