DE69328120T2

DE69328120T2 - Prüfungsstreifen für immunoassays

Info

Publication number: DE69328120T2
Application number: DE69328120T
Authority: DE
Inventors: Sakari Kouvonen; Markus Sivonen; Helena Svens; Hannele Tikanoja; Antero Turunen
Original assignee: Medix Biochemica Oy AB
Current assignee: Medix Biochemica Oy AB
Priority date: 1992-12-29
Filing date: 1993-12-29
Publication date: 2000-09-21
Anticipated expiration: 2013-12-30
Also published as: FI92882B; PL304890A1; EP0677170A1; JPH08505224A; JP3448056B2; FI925922A0; AU5701594A; FI925922A; DE69328120D1; WO1994015215A1; US5712170A; US5965458A; EP0677170B1; FI92882C; PL172246B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft einen Teststreifen, der einen schnellen Immuntest bereitstellt, der keine anderen Reagenzien, Apparaturen oder Vorrichtungen erfordert. Der Test kann einfach durch Eintauchen eines bestimmten Bereichs des Teststreifens in eine flüssige Probe und durch Beobachten einer innerhalb eines kurzen Zeitraums als Ergebnis einer immunologischen Reaktion erfolgenden, sichtbaren Veränderung in dem Streifen durchgeführt werden. Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein vorteilhaftes industrielles Verfahren zur Herstellung des Teststreifens sowie seine Verwendung bei diagnostischen und umweltanalytischen Bestimmungen.
Immuntests basieren auf der Verwendung von Antikörpern. Antikörper umfassen biologisch bereitgestellte Reagenzien, die an einen gewünschten Analyten mit großer Spezifität binden. Immuntests wurden größtenteils für die klinische Medizin entwickelt, wobei ihre Sensitivität und Spezifität von großem Wert ist. Es bestehen jedoch gute Möglichkeiten für Immuntests, um durch die Bereitstellung von zuverlässigen Tests für den Nachweis von Schadstoffen in Luft, Wasser und Boden, für die Qualitätskontrolle von Nahrungsmitteln etc. auch in der Umweltanalyse nützlich zu sein.
Die Notwendigkeit zur Analyse verschiedener Umweltschadstoffe hat in letzter Zeit zugenommen. Es ist notwendig, die Menge an Schadstoffen festzustellen, um zu beurteilen, ob die fragliche Umwelt für Menschen oder Tiere möglicherweise gefährlich ist. Es ist zum Beispiel erforderlich zu analysieren, ob der Boden um Reparaturwerkstätten herum Reste von verschiedene Carcinogene enthaltendem Kraftstoff enthält; ob pathogene Bakterien in Trinkwasser vorhanden sind; ob carcinogene Reste von Pestiziden in Pflanzen vorhanden sind; ob die Zersetzung oder die Schleimbildung verhindernde Reste von Chemikalien in Abwässern der Holzindustrie vorhanden sind etc. Wenn festgestellt wurde, daß eine Umwelt verschmutzt ist, besteht auch die Notwendigkeit, den Reinigungsprozeß mittels Analyse zu überwachen. Außerdem können neue Verschmutzungen durch die Untersuchung der Dosierung von toxischen Chemikalien mittels Analyse verhindert werden. Auf mehreren Gebieten gibt es Gesetzgebung über Höchstkonzentrationen von möglicherweise schädlichen Verbindungen sowie verschiedene Empfehlungen, die ebenfalls zuverlässige Analyseverfahren erfordern.
Da die in der Umwelt zu untersuchenden Verbindungen so zahlreich sind, gibt es einen großen Unterschied hinsichtlich der derzeitigen Analyseverfahren. Bakterien werden durch mikrobiologische Züchtungs- und Identifizierungsverfahren nachgewiesen. Für andere Schadstoffe werden traditionelle Verfahren der analytischen Chemie angewendet. Viele carcinogene Verbindungen, zum Beispiel Pestizide, sind kleine, aromatische Ringe enthaltende Moleküle und diese sind für die gaschromatographische Analyse geeignet. Den Analysen gehen oft komplexe Extraktionsverfahren voraus. In einigen Fällen werden Bestimmungen vom Biotesttyp verwendet (zum Beispiel werden Algentoxine durch Untersuchen der Wirkung einer Probe auf Mäuse nachgewiesen).
Diese Analysen machen oft eine komplizierte Ausrüstung erforderlich und die meisten analytischen Verfahren sind zur Durchführung in großen Reihen schlecht geeignet. Dies erhöht die Kosten der Bestimmungen und verhindert das Testen so vieler Proben wie tatsächlich erforderlich sind. Nur sehr wenige Bestimmungen allgemeiner Art (wie der pH- Wert von Wasser oder einer Bodenprobe oder der Nachweis von bestimmten Schwermetallen) können an der Probenentnahmestelle unter Verwendung von schnellen Tests durchgeführt werden.
Als Beispiele für schnelle Tests, die seit langem in der klinischen Chemie verwendet werden, können Tests für pH-, Glucose- und Proteinbestimmungen im Urin erwähnt werden. Die Testeinrichtung umfaßt Streifen, die in eine Probe getaucht und gemäß Farbmodellen auf der Verpackung interpretiert werden. Die Farbveränderungen basieren üblicherweise auf pH-Indikatoren oder spezifischen Enzymreaktionen.
Die immunochemische Methodik wurde lange als zu teuer und zu kompliziert angesehen, um sie durchzuführen, und sie wurde nur für die anspruchsvollsten Bestimmungen angewendet. Während den letzten Jahren wurden jedoch schnelle immunochemische Tests für die Anforderungen der klinischen Chemie entwickelt. Diese Tests können durch eine ungeschulte Person in wenigen Minuten ohne eine spezielle Ausrüstung durchgeführt werden, wobei das Ergebnis optisch ablesbar ist. Diese Technik wurde insbesondere auf für den häuslichen Gebrauch geeignete Schwangerschaftstests angewendet.
Die üblichste technische Ausführungsform dieser Art eines schnellen Tests ist in der Patentveröffentlichung GB-2204398B offenbart, der diagnostische Test davon basiert auf zwei Antikörpern. Einer von ihnen ist an eine Nitrocellulosemembran in Form einer Linie befestigt. Der andere Antikörper ist auf der Oberfläche von gefärbten Latex- oder kolloiden Goldteilchen befestigt, die auf der gleichen Membran getrocknet wurden. Der Test wird durch Absorbieren einer flüssigen Probe in die Membran durchgeführt. Die Teilchen werden durch den Flüssigkeitsstrom freigesetzt und der zu bestimmende Analyt bindet an den Antikörper auf diesen Teilchen. Durch eine andere Molekülstelle bindet der Analyt auch an den anderen Antikörper, der in der Linie vorhanden ist, und es bildet sich eine sichtbare gefärbte Linie, um die Anwesenheit des Analyten anzuzeigen. Diese Art eines immunochromatographischen Testverfahrens, das auf einer Strömung auf einer Membran basiert, wird oft als "laterales Strömungsverfahren" bezeichnet.
Das vorstehende Verfahren kann auch in der halbquantitativen oder quantitativen Analyse angewendet werden. Falls das Analytenmolekül so klein ist, daß die gleichzeitige Bindung von zwei Antikörpern nicht möglich ist, kann ein kompetitives Prinzip angewendet werden, wobei nur ein Antikörper und ergänzend hierzu ein markierter Analyt verwendet wird. In diesem Fall wird die Anwesenheit des Analyten in der Probe zum Beispiel durch die Abwesenheit einer gefärbten Linie gezeigt.
Bei einem schnellen immunochemischen Test, der im US-Patent 5,141,850 offenbart ist, wird eine Probe in eine poröse Testmembran, die zwei Zonen mit beweglichen Antikörperreagenzien aufweist, absorbiert. Eines dieser Reagenzien ist mit einem ein Signal erzeugenden Marker markiert. Eine dritte unbewegliche Zone enthält einen Stoff, der fähig ist, den kein Signal erzeugenden Antikörper abzufangen. Falls die Probe das zu testende Antigen enthält, binden beide Antikörper an dieses Antigen und der Komplex wird wiederum an den unbeweglichen abfangenden Stoff gebunden, was eine Farbbildung hervorruft.
Andere einfache immunochemische Testvorrichtungen werden u. a. in den folgenden Patentveröffentlichungen beschrieben: WO86/04683; worin ein enzymimmunologisches Prinzip angewendet wird und somit verschiedene Reagenzien erforderlich sind.; GB- 1 589 234 A und EP-0 225 054 A1, worin eine enzymimmunologische Reaktion nach der Probenzugabe durch Eintauchen eines Endes eines Streifens in eine Entwicklungslösung gestartet wird; EP-0 186 799 B1, wobei der Aufbau überlappende Streifen umfaßt, die Reagenzien enthalten, die sich in der Probenflüssigkeit auflösen; EP-0 421 294 A2, das die Verwendung eines Seleniumkolloids bei dem lateralen Strömungsprinzip beschreibt und Test- und Kontrollantikörper aufweist, die als eine "Plus"-Figur auf die Membran aufgetragen sind; EP-0 149 168 B1, wobei die Reaktion in einem Glaskapillarröhrchen in Schichten einer chromatographischen Trägersubstanz stattfindet.
Die vorstehend erwähnten Literaturstellen gemäß dem Stand der Technik beschreiben die Verwendung von immunochemischen Tests in der Diagnostik. Die EP-Patentveröffentlichung 0 520 202 A2 beschreibt andererseits einen immunochemischen Test, der insbesondere für die Analyse von Umweltschadstoffen gedacht ist. Der zu testende Analyt wandert in einer Reaktionsschicht, die einen Marker-Antikörper-Komplex enthält, wobei der Analyt fähig ist, diesen Marker zu verdrängen und statt dessen an die Membran zu binden. Der abgelöste Marker wandert durch die Reaktionsschicht in eine andere Schicht, die transparent ist, und die Konzentration kann direkt optisch nachgewiesen werden.
Eine schneller diagnostischer Test wird im US-Patent 5,104,811 beschrieben, der ein absorbierendes Kissen befestigt an einer streifenähnlichen Trägerschicht und mindestens eine immunochemische Reaktionsschicht befestigt in kurzem Abstand zu diesem Kissen einschließt. Die Wanderung von Flüssigkeit von dem Kissen zu der Reaktionsschicht wird entweder in einer faserigen Transferschicht oder in einem kapillaren Zwischenraum zwischen der Reaktionsschicht und der Trägerschicht durchgeführt, wobei der Zwischenraum an seinen Seiten geschlossen ist.
Da die Verwendung von Tests weltweit zunimmt, besteht ein wachsender Bedarf für die Entwicklung von Tests, die so einfach sind, daß sie nicht nur unter gut ausgerüsteten Laborbedingungen, sondern auch nahezu überall sonst, zum Beispiel zu Hause, unter Fabrik- oder Feldbedingungen, selbst ohne elektrischen Strom oder sauberes Wasser durchgeführt werden können. Es sollte auch für eine ungeschulte Person möglich sein, den Test durchzuführen. Die Testdurchführung sollte schnell, sensitiv und zuverlässig sein. Der Testaufbau sollte einfach genug sein, um die Herstellung ohne komplizierte Verfahren zu ermöglichen. Der Teststreifen sollte jedoch auch stark genug sein, um umweltbedingte Feldbedingungen zu überstehen.
Die vorliegende Erfindung stellt einen Teststreifen mit einer Struktur bereit, die im Hinblick auf die Herstellung einfach und vorteilhaft ist. Der Test kann einfach durch Eintauchen des Teststreifens in eine Probe und Beobachten des Ergebnisses durchgeführt werden. Trotz der streifenähnlichen Form der Testvorrichtung finden die essentiellen Reaktionen in einem schützten, raumähnlichen Zwischenraum statt. Die Schichtstruktur des Teststreifens ermöglicht auch ein vorteilhaftes industrielles Herstellungs- und Verpackungsverfahren.
Der erfindungsgemäße Teststreifen wird in der folgenden Beschreibung und in den die Erfindung veranschaulichenden Figuren ausführlicher beschrieben. Die spezifischen Merkmale der Erfindung werden in den beigefügten Patentansprüchen definiert.
So ist der Gegenstand der vorliegenden Erfindung ein Teststreifen für einen schnellen Immuntest, enthaltend spezifische immunochemische Reagenzzonen, wobei der Teststreifen eine Trägerschicht aufweist und daran befestigt ein Aufnahmekissen an einem Ende und in einem Abstand dazu ein weiteres Endkissen. Eine Testmembran wird zwischen den Kissen vorgesehen. Diese Membran soll in flüssigen Kontakt mit einer Probe gebracht werden, entweder direkt oder mit Hilfe der Aufnahmekissen an einem Aufnahmeende. Die Membran befindet sich parallel zu der Trägerschicht in einem Abstand dazu. Der Teststreifen ist dadurch gekennzeichnet, daß sich zwischen der Trägerschicht und der Membran ein Luftzwischenraum befindet, der an seinen Seiten offen ist. Der Raum dient als ein geschützter Reaktionsraum für die in der Membran stattfindende immunologische Reaktion.
Der Teststreifen weist vorzugsweise zwei stützende Deckschichten oder Trägerschichten auf, eine auf jeder Seite. Eine dieser Trägerschichten ist vorteilhafterweise zumindest teilweise transparent, auf diese Weise wird ermöglicht, daß die Farbbildung auf der Testmembran sichtbar ist.
Die Kissen zwischen der Trägerschicht und der Testmembran sind vorteilhafterweise absorbierende Kissen und insbesondere ist das absorbierende Kissen an dem Aufnahmeende über die Testmembran hinaus verlängert, so daß eine flüssige Probe veranlaßt werden kann, mit Hilfe des absorbierenden Kissens in die Testmembran zu fließen. Da dieses Kissen aus einem porösen Material hergestellt ist, wirkt es als ein Filter, das feste Verunreinigungen zurückhält, die möglicherweise in nicht-homogenen Proben vorhanden sind. Ein kontinuierlicher Flüssigkeitsstrom durch die Reaktionszonen in dem Teststreifen kann durch die Verwendung eines absorbierenden Materials als Kissen auch am Aufnahmeende sichergestellt werden.
Die Testmembran trägt vorzugsweise eine Testzone, die ein unbewegliches Reagenz und eine eine Kontrollsubstanz enthaltende Kontrollzone enthält. Eine Markerzone, enthaltend einen beweglichen Marker, wird auf der Testmembran oder in dem absorbierenden Kissen am Aufnahmeende aufgetragen, wodurch dem Marker ermöglicht wird, getragen von dem Flüssigkeitsstrom in die Testzone zu wandern. Der Streifen kann auch ein bewegliches, jedoch unmarkiertes Reagenz enthalten. In diesem Fall enthält die Testzone einen Stoff, der fähig ist, das Reagenz abzufangen. Es kann mehr als eine Testmembran in dem gleichen Streifen vorhanden sein, um verschiedene Analyte zu testen, oder die gleiche Membran kann mehr als eine Zone enthalten, die jeweils verschiedene Reagenzien enthalten. Der Streifen kann auch mehrere unterschiedliche Konzentrationen des gleichen Reagenz oder Markers enthalten, um unterschiedliche Analytenkonzentrationen halbquantitativ zu bestimmen.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein kontinuierliches industrielles Herstellungsverfahren, das ein besonders vorteilhaftes Verfahren zur Herstellung eines Teststreifens bereitstellt. Bei dem erfindungsgemäßen Herstellungsverfahren werden eine oder mehrere Markerverbindungen und/oder Testsubstanzen, die für die immunochemische Reaktion spezifisch sind, als Reagenzzonen entlang der gesamten Länge des Testmembranmaterials verteilt. Die Zonen sind getrennt und in Längsrichtung kontinuierlich. Vorteilhafterweise ist eine weitere schmale Zone, enthaltend eine Kontrollsubstanz, auf dem Membranmaterial neben der die Testsubstanz enthaltenden Zone verteilt. Die verteilten Zonen werden danach getrocknet. Zumindest zwei Stränge von Kissenmaterial werden in Abstand voneinander auf einem unterschiedlichen langen Unterlagsträgermaterial befestigt. Einer der Kissenmaterialstränge kann ein oder mehrere immunochemische Reagenzien enthalten, die vorher darauf getrocknet wurden. Die Länge der Testmembran, die wie vorstehend beschrieben hergestellt wurde, wird auf den Kissenmaterialsträngen befestigt, so daß die Reagenzzonen dem Zwischenraum zwischen den Kissen gegenüberliegen. Transparentes Trägerdeckmaterial mit zumindest der Größe des Unterlagsträgermaterials wird auf der Testmembran und den Kissensträngen befestigt, auf diese Weise wird ein langer geschichteter Teststreifenzuschnitt bereitgestellt, der in Teststreifen einer gewünschten Größe geschnitten werden kann.
Die vorliegende Erfindung betrifft auf die Verwendung des Teststreifen für einen schneller Immuntest in der Diagnostik und der Umweltanalyse.
Das Folgende stellt eine ausführlichere Beschreibung der Erfindung unter Bezugnahme auf die beigefügten Figuren dar, wobei:
Fig. 1 ein perspektivische Ansicht einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Teststreifens ist;
Fig. 1A eine in Einzelheiten aufgeteilte Darstellung der einzelnen Teile der Ausführungsform gemäß Fig. 1 ist;
Fig. 2 eine in dem erfindungsgemäßen Teststreifen zu verwendende Testmembran und die Zonen gemäß einer seiner Ausführungsformen zeigt; und
Fig. 3 einen schematischen Querschnitt einer anderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Teststreifens zeigt.
Die Fig. 1 und 1A zeigen eine bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Teststreifens. Die Rückseite des Teststreifens, allgemein durch die Hinweisnummer 10 angegeben, wird von einer aus Kunststoff oder irgendeinem anderen geeigneten steifen Material hergestellten Trägerschicht 1 gebildet. Beide Enden der Trägerschicht 1 sind mit den verhältnismäßig dünnen Kissen 3 und 5 versehen. Diese Kissen sind vorzugsweise aus einem Material hergestellt, das eine hohe Aufnahmefähigkeit aufweist und chemisch inert ist. Das Kissen 3 am Aufnahmeende kann mit verschiedenen Stoffen behandelt werden, um sein Aufnahmevermögen und die Geschwindigkeit des Flüssigkeitsstroms darin zu erhöhen. Eine Zone 7 in dem absorbierenden Kissen 3 enthält ein getrocknetes markiertes Reagenz. Die Testmembran 2, wo die nachzuweisende eigentliche Reaktion stattfindet, wird auf und zwischen den absorbierenden Kissen 3 und 5 befestigt.
Die absorbierenden Kissen 3 und 5 sind durch einen Zwischenraum 4 getrennt, der lang genug ist, so daß er sich über den Reaktionsbereich in der Testmembran 2, d. h. den Bereich, der die Reaktionszone oder -zonen enthält, erstreckt. Die Zonen im Zwischenraum 4 umfassen mindestens eine spezifische Antikörperlinie 8 sowie eine oder beliebige Kontrolllinien 9. Wenn der Teststreifen 10 hergestellt wird, wird die Membran 2 auf den Kissen 3 und 5 in einer solchen Weise befestigt, daß die ausgesetzte reaktive Testseite der Membran 2 dem Zwischenraum 4 gegenüberliegt. Der Kontaktbereich zwischen der Membran 2 und den Kissen 3 bzw. 5 muß groß genug sein, um einen Flüssigkeitsstrom zu erzeugen und aufrechtzuerhalten.
Die obige Anordnung führt zu einer Struktur, bei der die Reaktionsfläche in der Testmembran 2 nicht in Kontakt mit einem Material ist. Statt dessen ist ein Zwischenraum 4 zwischen der Membran 2 und der Trägerschicht 1 vorhanden, wobei der Zwischenraum als ein kleiner, an beiden Seiten offener Raum beschrieben werden kann, wo der Flüssigkeitsstrom auf der Membran 2 ungestört ist. Die absorbierenden Kissen 3 und 5 sind vorteilhafterweise etwa 0,5-3 mm dick, so daß der Zwischenraum 4 klein ist. Da der Zwischenraum 4 klein ist, behält die Atmosphäre in dem Reaktionsraum ihre Feuchtigkeit bei und der Fluß der Flüssigkeit wird durch eine durch Luftströmung verursachte Austrocknung nicht gestört.
Eine andere Trägerschicht, nämlich eine Deckschicht 6, ist vorteilhafterweise auf der Membran 2 und den Kissen 3 und 5 befestigt. Diese Deckschicht 6 kann eine transparente Schicht sein, die vorzugsweise die gleiche Größe wie der Teststreifen 10 hat und zum Beispiel aus durchsichtigem Kunststoff wie PVC, PE oder PC hergestellt ist. Diese Deckschicht schützt die Membran 2 und die Kissen 3 und 5, verhindert die Verdunstung von Flüssigkeiten und verstärkt die Struktur. Da die Deckschicht 6 transparent ist, ist das Testergebnis trotzdem sichtbar. Die Deckschicht kann in einer geeigneten Weise lackiert sein oder sie kann mit einem Klebestreifen oder Klebestreifen versehen sein (nicht gezeigt), die die Interpretation des Tests durch Abdecken der anderen Teile des Streifens außer dem Bereich, wo die Testlinien gebildet werden, erleichtern. Die Deckschicht 6 kann auch aus einem nicht-transparenten Material mit einer hineingeschnittenen Öffnung oder Öffnungen hergestellt sein, um zu ermöglichen, daß das Testergebnis sichtbar ist. In einer anderen Ausführungsform ist die Trägerschicht 1 transparent und die Reaktion kann durch den Zwischenraum 4 beobachtet werden.
Fig. 2 zeigt eine andere Ausführungsform der Reagenzzonen, wobei alle Zonen auf die Testmembran 1 aufgebracht wurden. Die Hinweisnummer 7 weist auf eine Zone hin, wobei als Marker verwendete Teilchen auf einer Schicht einer getrockneten Zuckerlösung getrocknet wurden; die Zonen 8' und 8" enthalten Antikörper, die für zwei verschiedene Analyte spezifisch sind; und die Zone 9 weist einen daran befestigten Kontrollantikörper auf.
Der Test basiert auf dem lateralen Strömungsprinzip. Folglich findet die Reaktion auf der Membran 2 statt, wobei chemische Eigenschaften davon so gewählt sind, daß ermöglicht wird, Antikörper und andere bei der Reaktion erforderlichen Stoffe daran zu befestigten. Die Membran sollte in einer Weise porös sein, die geeignet ist, um einen Flüssigkeitsstrom darin zu erzeugen und zu ermöglichen, daß die zum Nachweis erforderlichen Stoffe (z. B. Latex-, kolloidale Metall- oder andere Teilchen sowie lösliche Moleküle) durch den Strom getragen werden. Ein geeignetes Material für die Testmembran 2 ist Nitrocellulose. Die Membran kann in einer anderen Ausführungsform aus Nylon oder irgendeinem anderen geeigneten Material hergestellt sein.
Falls die Testmembran 2 sehr dünn ist, ist es vorteilhaft, sie selbst an einen Träger zu befestigen (in den Figuren nicht gezeigt). Dies erleichtert ihre Behandlung während der Beschichtungsverfahren, die dem Testzusammenbau vorausgehen. Falls der Nachweis der Reaktion von der den Membranträger aufweisenden Seite sichtbar sein soll, sollte der Träger transparent sein.
Die Anzahl und Position der Zonen auf der Testmembran 2 kann in Abhängigkeit von dem zu testenden Analyten variieren. Die gleiche Membran kann mehrere Reagenzien zum Nachweis verschiedener Analyte in der gleichen Probe oder entsprechenderweise zum Nachweis unterschiedlicher Konzentrationen des gleichen Analyten enthalten. Der Streifen kann auch mehrere Testmembranen einschließen. In einem solchen Fall muß ein ununterbrochener Fluß zwischen ihnen erfolgen, der zum Beispiel durch Befestigen der Membranen zumindest teilweise aufeinander oder durch Anordnen einer porösen verbindenden Membran zwischen ihnen erreicht werden kann.
Unter Verwendung eines erfindungsgemäßen Teststreifens ist es möglich, einen Test, zum Beispiel einen Schwangerschaftstest, einen Listeria-Test von Nahrungsmitteln oder einen Atrazintest in Wasser, durch Einbringen des Aufnahmeendes von Streifen 10 bis zu einem bestimmten Niveau in die Probe oder einen Extrakt der Ausgangsprobe durchzuführen. Die Flüssigkeit wird in das Kissen 3 an dem Aufnahmeende absorbiert, von wo sie weiter zur Testmembran 2 wandert. Die Kontrolllinie 9 wird sichtbar, sobald der Flüssigkeitsstrom die Linie erreicht hat. Wenn der Test auf einem immunometrischen Prinzip basiert, ist der Test positiv, wenn eine andere spezifische Testlinie ebenfalls angefärbt wird.
Fig. 3 zeigt eine alternative Ausführungsform des erfindungsgemäßen Teststreifens, wobei die Trägerschicht 1 die poröse Testmembran 2 trägt. In einem bestimmten Abstand zu dem Aufnahmeende der Membran befindet sich ein inertes Stützkissen 3. Ein anderes Stützkissen 5 ist am gegenüberliegenden Ende der Membran-Trägerschicht-Kombination befestigt, so daß ein Hohlraum zwischen den Kissen 3 und 5 verbleibt. Auf den Kissen 3 und S ist eine Deckschicht 6 befestigt, um die Kissen in einer Weise zu bedecken, die die Bildung eines Zwischenraums 4, der an seinen Seiten offen ist, zur Folge hat. Entweder sind die Trägerschicht 1 und/oder die Deckschicht 6 oder beide aus einem transparenten Material hergestellt.
In dieser Ausführungsform wirkt die Testmembran 2 gleichzeitig als ein Aufnahmekissen und die Flüssigkeit wird direkt in die Membran absorbiert. Der Vorteil dieser Lösung ist die Einfachheit der Struktur und die Tatsache, daß der Flüssigkeitsstrom nicht von der Strömungsverbindung zwischen dem Aufnahmekissen und der Testmembran abhängig ist. Die Deckschicht 6 und/oder das Kissen 3 können auch eine Ausdehnung haben, die der Trägerschicht 1 entspricht, in diesem Fall wird die Flüssigkeit in die Testmembran 2 über ihre exponierten Enden absorbiert.
Bei ihrer Verwendung ist es wichtig, das Eintauchen der Zonen der Testmembran in die Probenflüssigkeit zu vermeiden. Die Reaktionen können nur stattfinden, während die Flüssigkeitsfront längs der Membran voranschreitet. Folglich sollte dem Verbraucher die Eintauchtiefe angezeigt werden und am meisten bevorzugt ist ein das Eintauchniveau anzeigender Marker auf dem Teststreifen selbst markiert.
Ein Weg zur Durchführung des Tests ist das Eintauchen des Aufnahmeendes von Teststreifen 10 in eine Probe bis zu einer markierten Linie bis das absorbierende Kissen 3 an dem Aufnahmeende eine ausreichende Flüssigkeitsmenge absorbiert hat; unmittelbar danach kann der Teststreifen aus der Probe entfernt und beiseite gelegt werden, bis die Linien erschienen sind.
Um eine ungestörte Wanderung der Flüssigkeitsfront in der Testmembran sicherzustellen, ist es vorteilhaft, eine Membran zu verwenden, die mit geeigneten Stoffen, die die Flüssigkeitsaufnahme erleichtern (z. B. ein Detergens wie Tween 20, hergestellt von BioRad Laboratories, USA) und die eine geeignete elektrische Ladung im Verhältnis zu den wandernden Teilchen hervorrufen (z. B. puffernde Ionen), behandelt wurde. Eine unbehandelte Membran kann auch vor dem Verteilen der testspezifischen Zonen darauf durch Eintauchen der Membran in geeignete Lösungen und durch Trocknen der Membran danach behandelt werden.
Reagenzien wie die vorstehend erwähnten, die eine verbessernde Wirkung auf die Testfunktionen haben, können auch durch Trocknen derselben in dem absorbierende Kissen 3 oder in dem Aufnahmeende der Testmembran 2 zugegeben werden. Die Freisetzung der Markerteilchen von der Membran durch den Flüssigkeitsstrom kann durch das Trocknen eines geeigneten Gemisches wie einer Zuckerlösung unter der Teilchenzone erleichtert werden. Die Struktur der bevorzugten erfindungsgemäßen Teststreifen, wobei die absorbierenden Kissen und eine absorbierende Membran zwischen einer Deckschicht und einer Trägerschicht vorgesehen werden, so daß die absorbierenden Seiten offen sind, ermöglicht eine einfache Durchführung des Tests. Die Probe muß nicht in die Testanordnung pipettiert werden, da die Absorption ungehindert ist, wenn der Streifen in die Flüssigkeit getaucht wird. In dem durch den schmalen Zwischenraum 4 in dem Streifen gebildeten raumähnlichen Zwischenraum wird der Fluß vor Störungen und vor einer durch Lufttrocknung verursachten Austrocknung geschützt.
Es ist offensichtlich, daß die erfindungsgemäßen Teststreifen einer nach dem anderen unter Verwendung von vorgeschnittenen Teilen der richtigen Größe hergestellt werden können. Jedoch war es wegen der an ihren Seiten offenen Schichtstruktur des erfindungsgemäßen Teststreifens möglich, ein industrielles Herstellungsverfahren zu entwickeln, das schnell, automatisiert und wirtschaftlich ist. So kann die Testmembran mit ihren Reagenzzonen in einer speziellen Fertigungsstraße vorgefertigt werden und danach kann der Teststreifen in einer anderen Fertigungsstraße durch Laminieren der verschiedenen Komponenten des Streifens in einem langen Teststreifenband zusammengesetzt werden.
Die Testmembran wird vorzugsweise in einer Fertigungsstraße hergestellt, wobei eine Rolle von Testmembranmaterial abgewickelt, behandelt und wieder zu einer Testmembranrolle aufgewickelt wird. Die auf der Testmembran erforderlichen Reagenzien werden verteilt und als kontinuierliche Linien auf dem Membranmaterial getrocknet. Auf diese Weise wird die empfindliche Testmembran in so wenigen mechanischen Schritten wie möglich behandelt und wird vor einer Beschädigung geschützt. Die erfolgreiche und gleichmäßige Reagenzverteilung auf der Membran kann durch Überwachen der Breite der ein optisches Nachweisinstrument durchlaufenden Reagenzlinie einfach beobachtet und ermittelt werden. Eine gleichmäßige Reagenzverteilung ist für die zuverlässige Testdurchführung wichtig. Da das Herstellungsverfahren schnell ist, verbleibt die Testmembran nur während eines sehr kurzen Zeitraums unter dem Einfluß von unkontrollierten Störungsfaktoren, wie sie in Umgebungsluft vorhanden sein können.
Alle Materialien für den Zusammenbau des Teststreifens sind vorteilhafterweise gewählt, so daß sie in Form von Rollen zur Verfügung stehen. Die Fertigungsstraße des Teststreifens ist so angelegt, daß die verschiedenen Materialien einschließlich der Testmembran von Rollen in der richtigen Reihenfolge aufeinander geschichtet werden, zum Beispiel durch Verkleben.
In einem typischen Herstellungsverfahren wird Klebstoff, ein Klebeband oder ähnliches auf das Band der Trägerschicht aufgetragen bzw. befestigt, das von einer Rolle von Trägerschichtmaterial zugeführt wird. Danach werden die Kissenmaterialien von ihren Rollen auf vorherbestimmte Bereiche des Trägerschichtbandes in Abstand voneinander zugeführt, so daß zwischen ihnen ein Zwischenraum verbleibt. Insbesondere kann das Kissenmaterial, das das Kissen am Aufnahmeende bilden soll, mit Stoffen vorbehandelt werden, die den Flüssigkeitsstrom verbessern. Das Kissenmaterial kann auch mit einem testspezifischen Reagenz bereitgestellt werden. Das vorbehandelte Testmembranmaterial wird von seiner Rolle abgewickelt und in einer solchen Position auf und zwischen den Kissenmaterialsträngen befestigt. Die Membran kann auf einer Seite eine Schutzschicht aufweisen, in diesem Fall sollte die Seite mit den exponierten Reagenzien dem Zwischenraum gegenüberliegen. Ein transparentes Kunststoffband wird schließlich von einer Rolle von Deckschichtmaterial zugeführt und auf der Kombination von Membran und Kissen auf der Trägerschicht befestigt. Das Deckschichtmaterial ist an den Kissenmaterialsträngen und auch an dem Testmembranmaterial zumindest an seinen Enden befestigt. Schließlich wird das Laminat gleichmäßig gepreßt, um die Haftung sicherzustellen.
Da die Fertigungsstraße kontinuierlich funktioniert, kann die homogene Qualität eines jeden einzelnen Teststreifens leicht überwacht werden. Es ist zum Beispiel möglich zu überprüfen, daß mechanische Toleranzwerte erfüllt werden. Die Fertigungsstraße kann durch Veränderung der Reagenzien und/oder der Breite der zur Laminierung verwendeten Materialrollen leicht und schnell eingestellt werden, um die Anforderungen von verschiedenen Tests zu erfüllen.
Der nach der Laminierung hergestellte lange Teststreifenzuschnitt wird in Teststreifen einer gewünschten Breite am Ende der Teststreifen-Fertigungsstraße geschnitten. Die durch das Schneiden erhaltenen frischen Teilstücke garantieren, daß die Seiten der absorbierenden Kissen von homogener Qualität sind und folglich, daß eine Probe reproduzierbar und gleichmäßig absorbiert wird. Dies wiederum hat eine vorteilhafte Wirkung auf die Genauigkeit des Testergebnisses.
Die fertigen Teststreifen können dann in traditioneller Weise in Einzelpackungen (zum Beispiel Taschen von Kunststofflaminat mit einem Beutel von feuchtigkeitsbindendem Material) verpackt werden. Jedoch, da die Struktur der erfindungsgemäßen Teststreifen leicht und klein ist, können dieses Streifen auch vorteilhafterweise in zum Beispiel zylinderähnlichen Röhrchen wie Aluminiumröhrchen, die für Feuchtigkeit undurchlässig, widerstandsfähig und leicht zu handhaben sind, verpackt werden.
Der erfindungsgemäße Teststreifen kann zum Beispiel für Schwangerschaftstests verwendet werden. Der Test kann so angelegt sein, daß er direkt mit Urin oder Serum durchgeführt werden kann, und der zu bestimmende Analyt wäre von der Plazenta sezerniertes menschliches Choriongonadotropin (hCG).
Der Teststreifen kann jedoch auch für viele andere diagnostische Tests angepaßt werden, wo die Anwesenheit oder Abwesenheit irgendeiner bestimmten Verbindung in der Probe nachgewiesen wird, wobei die Verbindung mit einer Krankheit oder einem pathophysiologischen Zustand verbunden ist oder künstlich in den Körper eingeführt wird. Diese Art eines Tests ist besonders geeignet zur · Diagnose von durch Mikroben verursachte Infektionen.
Die Probe kann flüssig sein, wie Serum, wenn die Anwesenheit von Rheumafaktoren bei Rheuma gezeigt wird, oder Urin, wenn das Vorhandensein eines Albuminaustritts gezeigt wird, der durch geschädigte Nieren verursacht wird, oder Rückenmarksflüssigkeit, wenn die Anwesenheit von Meningitis verursachenden Bakterien gezeigt wird. Die Probe kann auch Schleim oder ein Feststoff sein, in diesen Fällen wird die zu testende Verbindung zuerst in einer geeigneten Flüssigkeit extrahiert. Ein Beispiel einer Adaptation wie dieser ist der Nachweis von Chlamydia-Antigenen in einer Probe, die von den Schleimhautmembranen in den Harnwegen eines Patienten genommen wurde. Entsprechend kann eine Probe von den Schleimhautmembranen im Rachen genommen werden, um zum Beispiel Streptococcus A nachzuweisen. Okkultes Blut in Exkrementen, das mit Darmkrebs verbunden ist, kann in einer Stuhlprobe unter Verwendung eines erfindungsgemäßen Teststreifens, um die Anwesenheit von menschlichem Hämoglobin in der Probe zu zeigen, nachgewiesen werden. Die Anwesenheit von Lungenentzündung verursachenden Pneumococcus- Bakterien kann in einer Sputumprobe nachgewiesen werden. Der Einriß der Fruchtblase kann durch Nachweis der Gegenwart eines als IGFBP-1 bezeichneten Proteins in einer vaginalen Sekretprobe nachgewiesen werden. Falls zwei unterschiedliche Markerkonzentrationen eines monoclonalen Antikörpers gegen IGFBP-1 in dem gleichen Test verwendet werden, ist es möglich, eine mit einer Anfälligkeit für die Niederkunft verbundene niedrige IGFBP-1- Konzentration oder eine durch einen Einriß der Fruchtblase verursachte hohe Konzentration nachzuweisen. Es ist auch möglich, die Anwesenheit von mit Infektionen verbundenen Antikörpern wie IgG-Klasse-Antikörpern gegen Helicobacter pylori in Serum zu zeigen. Es wurde festgestellt, daß diese Bakterien einen wichtigen ätiologischen Faktor bei einem Magengeschwür darstellen.
Der erfindungsgemäße Teststreifen kann auch für viele Umweltanalysetests angepaßt werden. Der vorliegende Teststreifen stellt mehrere Vorteile im Vergleich zu traditionellen Verfahren bereit. Der Test ist schnell, billig und einfach. Es gibt keine Art der Durchführung von Tests gemäß dem Stand der Technik von ähnlicher Sensitivität und Spezifität in nur wenigen Minuten. Die Testdurchführung selbst erfordert keine spezialisierte Ausrüstung und das Personal benötigt keine spezielle Schulung. Die Probenvorbehandlung ist erheblich einfacher als die, die für die meisten traditionellen Verfahren notwendig ist. Die Spezifität eines immunochemischen Verfahrens basiert auf der Spezifität von Antikörpern und deshalb ist kein besonderer Probenreinigungsschritt erforderlich. Es ist ausreichend, daß die Probe in eine flüssige Form überführt wird.
Es gibt Analyte, die für Bestimmungen unter Anwendung von traditionellen chromatographischen und anderen entsprechenden Verfahren nicht gut angepaßt sind, aber die für immunologische Verfahren gut geeignet sind (zum Beispiel alle Proteine). Deshalb bietet die vorliegende Erfindung eine Möglichkeit für völlig neue Tests.
Da die Tests billig und einfach durchzuführen sind, kann eine ausreichende Anzahl von Tests durchgeführt werden, zum Beispiel um ein verschmutztes Gebiet gründlich zu untersuchen und die Situation für einen ausreichenden Zeitraum zu überwachen. Eine ausreichend große Probenentnahme kann bei Nahrungsmitteln durchgeführt werden. Der Besitzer eines Gewächshauses kann die Fortschritte bei der Reinigung des Bodens von Pestiziden verfolgen (gegenwärtig gibt es keinen anderen Weg als für einen Zeitraum zu warten, der vermutlich lang genug ist). Auch Hersteller von Nahrungsmitteln im kleinen Maßstab können eine gute Überwachung der Nahrungsmittelreinheit erhalten.
Unter Verwendung des erfindungsgemäßen Teststreifens können Durchmusterungssysteme verschiedener Arten entwickelt werden. Ein schneller Test kann zum Beispiel entwickelt werden, um eine bestimmte Gruppe von Stoffen ("polyaromatische Kohlenwasserstoffe", Aflatoxine etc.) nachzuweisen, wobei die Proben dann weiter auf verschiedene Komponenten mit einem komplexeren Laborverfahren analysiert werden, falls ein positives Ergebnis in einem vor Ort durchgeführten Durchmusterungstest erhalten wurde. Eine schnelle Durchmusterung eines einzigen Analyten kann auch unter Verwendung eines qualitativen Tests (durch Zeigen, daß die Konzentration höher als eine annehmbare Grenze ist) durchgeführt werden und eine genauere Analyse kann dann unter Anwendung eines langsameren, aber empfindlicheren quantitativen Laborverfahrens ausgeführt werden, falls ein positives Durchmusterungsergebnis erhalten wurde.
Geeignete Umweltadaptationen des erfindungsgemäßen Teststreifens, die Wert sind erwähnt zu werden, sind zum Beispiel das Absuchen von Flächen mit verschmutztem Boden und Wasser, um ihre PCP- oder PCB-Konzentrationen herauszufinden oder aromatische oder chlorierte aliphatische Kohlenwasserstoffe nachzuweisen. In Industriegebieten können mögliche Freisetzungen von verschiedenen Chemikalien, wie zum Beispiel Ölverbindungen, Lösungsmittel und Pestizide, überwacht werden. Das Vorkommen von verschiedenen Toxinen, Antibiotika, Histamin, Mikroorganismen oder Pestiziden kann in Nahrungsmitteln untersucht werden. Carcinogene Verbindungen wie Benzopyren können in entweichendem Gas bestimmt werden. Toluol und verwandte, aromatische Ringstrukturen enthaltende Verbindungen, die als Marker für Erdöltreibstoff verwendet werden, können in kontaminierten Böden nachgewiesen werden.
Die folgenden Beispiele veranschaulichen die vorliegende Erfindung ohne sie jedoch in irgendeiner Weise zu begrenzen.

Beispiel 1

Schwangerschaftstest

Markerherstellung: Zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Teststreifens wurden blaue Latexteilchen mit einem monoclonalen Antikörper gegen hCG beschichtet. Die Größe der Teilchen betrug 200 nm. Der auf diese Weise hergestellte Nachweismarker wurde als eine 1%ige Suspension in einem Puffer gelagert.
Testmembranherstellung (Alternative 1): Das zur Herstellung einer Testmembran verwendete Material war Nitrocellulose, die an einer dünnen transparenten Kunststoffträgerschicht befestigt worden war. Die Membran war 30 mm lang. Eine Zuckerlösung wurde in einer Zone 9 mm von einem Ende der Membran getrocknet und danach wurde der vorstehend beschriebene Marker auf der trockenen Zuckerzone verteilt. Eine zweite schmale Zone wurde 18 mm von dem Ende der Membran verteilt, wobei die zweite Zone eine Lösung eines anderen monoclonalen Antikörpers gegen hCG in einem Puffer enthielt. Eine dritte schmale Zone wurde 2 mm von der zweiten Zone verteilt, wobei die dritte Zone Antikörper gegen Maus-Immunoglobulin enthielt.
Testmembranherstellung (Alternative 2): Das gleiche Material wie in Alternative 1 wurde verwendet, aber nur die zweiten und dritten Zonen wurden darauf verteilt. Der Latexmarker der ersten Zone wurde statt dessen in einem am Aufnahmeende des Teststreifens verwendeten absorbierenden Kissen getrocknet.
Zusammenbau des Teststreifens: Eine weiße Polyesterfolie wurde in Stücke einer Größe von 6 mm · 120 mm geschnitten, um Unterlagsschichten für den Teststreifen herzustellen. Das zur Herstellung der absorbierenden Kissen an beiden Enden des Teststreifens verwendete Material war Kunstseidefaser in etwa 1 mm dicken Schichten zwischen zwei Polyethylengeweben. Ein 30 mm-Stück von Kissenmaterial wurde an dem Aufnahmeende der Unterlagsschicht befestigt und entsprechend wurde ein 70 mm-Stück an dem entgegengesetzten Ende befestigt. Bei Alternative 2 war das Aufnahmekissen an einem Aufnahmeende mit dem markierten Reagenz vorgesehen worden. Die wie vorstehend beschrieben hergestellte Testmembran wurde auf den Kissen befestigt, so daß sie beide Kissen über eine Länge von etwa 5 mm an beiden Enden überlappte. Die beschichtete Nitrocelluloseseite war abwärts zu einem leeren raumähnlichen Zwischenraum, der zwischen den Kissen, der Trägerschicht und der Membran gebildet wurde, hin gerichtet. Eine bedeckende Unterlagsschicht von transparentem Polyester wurde in Stücke der Größe der Trägerschicht geschnitten. Die Deckschicht wurde an den Kissen und teilweise auch an der Membran entlang einige wenige Millimeter davon befestigt. Ein nichttransparentes Band wurde an beiden Enden der Deckschicht befestigt, so daß nur ein 10 mm breiter Raum an der Stelle unbedeckt blieb, wo die spezifische Linie und die Kontrolllinie gebildet wurden.
Einige Teststreifen wurden zusammengesetzt, so daß die Testmembran an die Unterlagsschicht in einer solchen Weise befestigt wurde, daß die reaktive Nitrocelluloseseite nach oben gerichtet war. Die Kissen wurden in Kontakt mit beiden Enden der Testmembran in einer der vorstehend beschriebenen entsprechenden Weise aufgebracht. Wieder wurde eine transparente Deckschicht darauf befestigt. Auf der Nitrocelluloseoberfläche wurde keine Verklebung durchgeführt. Der Unterschied des Ergebnisses im Vergleich zu dem vorstehend beschriebenen Zusammenbau war, daß der raumähnliche Zwischenraum über der Membran und nicht unter ihr gebildet wurde.

Durchführung des Schwangerschaftstests:

1. Das Aufnahmeende des Teststreifens wurde 20 mm tief in eine Probe getaucht.
2. Der Streifen wurde aus der Probe entfernt.
3. Nach 5 Minuten wurde die Anzahl der in dem Teststreifen erscheinenden blauen Linien aufgezeichnet und das Ergebnis wurde interpretiert.

Interpretation des Ergebnisses:

Es war eine solche Antikörpermenge in der spezifischen Linie aufgetragen worden, daß eine hCG-Konzentration von etwa 50 IE/l die niedrigste Konzentration ist, die bewirken kann, daß eine ausreichende Menge des Markers gebunden wird, so daß eine sichtbare Linie erscheint und der Test als positiv interpretiert werden kann. Der Antikörper gegen Maus- Immunoglobulin, der auf die Kontrolllinie aufgetragen worden war, bindet den vom Flüssigkeitsstrom getragenen Marker unspezifisch, da der Marker mit einem zur Klasse IgG gehörenden Maus-Antikörper beschichtet wurde. Die Lösungen wurden in solchen Verhältnissen zugegeben, daß, auch wenn die Konzentration von hCG hoch war, eine ausreichende Menge des Markers vorhanden ist, die nicht an die spezifische Linie bindet, so daß sich eine sichtbare Kontrolllinie bildet, die anzeigt, daß der Flüssigkeitsstrom in der richtigen Weise vorangeschritten war und der Test funktionierte. Das Erscheinen einer blauen Kontrolllinie zeigte, daß der Test in einer zuverlässigen Weise funktioniert hatte.
Die Ergebnisse einer Testreihe sind nachstehend in Tabelle 1 angegeben. Bekannte Mengen von hCG waren zu einer Probe gegeben worden, von der bekannt war, daß sie negativ ist. Tabelle 1
Die Teststreifen, wobei die Membran an der Unterlagsschicht befestigt wurde, ergaben ein identisches Ergebnis.

Beispiel 2

Test zum Nachweis des Einrisses der Fruchtblase

Der Test zum Nachweis des Einrisses der Fruchtblase basierte auf dem Anzeigen der Anwesenheit von IGFBP-1 (Insulin-ähnliches Wachstumsfaktor-Bindungsprotein-1) in einer Probe von Vaginalsekret. Die Herstellung des Markers und der Testmembran und der Zusammenbau des Teststreifens wurden in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 durchgeführt, außer daß, da das zu bestimmende Protein IGFBP-1 war, die in dem Marker und in der spezifischen Linie verwendeten Antikörper monoclonale Antikörper gegen IGFBP-1 waren.
Probe: Eine Probe von Vaginalsekret wurde mit einem sterilen Dracontupfer genommen. Die Probe, die in den Tupfer absorbiert worden war, wurde in einem Verdünnungspuffer in einem vorbestimmten Verhältnis extrahiert.

Durchführung des Tests:

1. Das Aufnahmeende des Teststreifens wurde 20 mm tief in den Probenextrakt getaucht.
2. Der Streifen wurde aus der Probe entfernt.
3. Nach 5 Minuten wurde die Anzahl der in dem Teststreifen erscheinenden blauen Linien aufgezeichnet und das Ergebnis wurde interpretiert.
Die Ergebnisse einer Testreihe sind nachstehend in Tabelle 2 gezeigt. Amnionflüssigkeit war in einer Salzlösung verdünnt worden (die Konzentration von IGFBP-1 in der Amnionflüssigkeitsprobe war bekannt).
In der verwendeten Testverdünnung kann eine IGFBP-1-Konzentration von 200 ug/l als so hoch angesehen werden, daß sie in einer vaginalen Sekretprobe nur durch die Anwesenheit von Amnionflüssigkeit verursacht werden kann und kann so interpretiert werden, daß sie anzeigt, daß die Fruchtblase geplatzt ist.

Beispiel 3

Test zum Nachweis von verborgenem Blut in Exkrementen (zwei Analyte)

Dieser Test soll Blut in Exkrementen nachweisen, das nach einer Blutung im Darm bei Krebspatienten vorkommt. Der Test wurde basierend auf dem Nachweis der Anwesenheit von sowohl menschlichem Hämoglobin als auch menschlichem Albumin entwickelt. Hämoglobin ist ein spezifischerer Marker für Blut, da Albumin in Exkremente als Ergebnis eines Proteinaustritts übertreten kann, der nicht in Verbindung mit Krebs steht. Albumin wiederum ist in Exkrementen stabiler als Hämoglobin. Die Herstellung des Markers und der Testmembran und der Zusammenbau des Teststreifens wurde in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 durchgeführt, außer daß, da zwei Analyte nachgewiesen werden sollen, ein gemischter Marker hergestellt wurde, der mit einem Hämoglobin-Antikörper beschichtete Teilchen sowie mit einem Albumin-Antikörper beschichtete Teilchen enthielt. Entsprechend wurden auch zwei verschiedene spezifische Linien auf die Membran aufgetragen. Bei ihrem Auftrag wurde berücksichtigt, daß der Test so empfindlich wie möglich sein muß.
Probe: Eine kleine Probe von Exkrementen wurde in einer Pufferlösung suspendiert. Die Suspension, die so homogen wie möglich sein sollte, wurde gefiltert und das Filtrat wurde in ein Teströhrchen überführt.

Testdurchführung:

1. Das Aufnahmeende des Teststreifens wurde 20 mm tief in das Filtrat getaucht.
2. Der Streifen wurde aus der Probe entfernt.
3. Nach S Minuten wurde die Anzahl der in dem Teststreifen erscheinenden blauen Linien aufgezeichnet und das Ergebnis wurde interpretiert.
Eine Linie bedeutete, daß der Test negativ war, drei Linien bedeuteten, daß er positiv war. Falls nur zwei Linien erschienen, wird empfohlen, daß eine neue Probe genommen wird.

Beispiel 4

Test zum Nachweis von Toluol im Boden

Antikörperherstellung: Murine monoclonale Antikörper gegen Toluol werden unter Anwendung von dem Fachmann bekannten Verfahren entwickelt (vgl. zum Beispiel Stenman U.-H. et al., J. Immunol. Methods 4b (1981), 337-345). Die Natur des Antigens, das ein Hapten ist, macht erforderlich, daß Mäuse mit einem Antigenderivat mit einem größeren Molekulargewicht immunisiert werden. Deshalb wird Tolylessigsäure kovalent an Rinderserumalbumin (BSA) für Immunisierungen konjugiert (für die Konjugation und die Verwendung von Konjugaten bei der Immunisierung vgl.: Muller S., Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Bd. 19, Hrsg. Burdon R. H. und von Knippenberg P. H., Elsevier, Amsterdam 1988, 95-130 oder Hudson L. und Hay F. C., Practical Immunology, Blackwell, Oxford 1983, 1-23). Zur Antikörperdurchmusterung wird ein Radioimmuntest verwendet.
Der in dem Verfahren erforderliche radioaktive Marker wird wie folgt hergestellt: Tolylessigsäure wird an ein Trägerpeptid mit mindestens einem Tyrosinrest konjugiert (für die Konjugation vgl. vorstehend) und das Konjugat wird mit Iod unter Anwendung eines Chloramin T-Standardverfahrens radioaktiv markiert. Die erhaltenen, mit Toluol reaktiven monoclonalen Antikörper werden auf Kreuzreaktionen mit in Kraftstoffen vorkommenden verwandten Verbindungen getestet. In diesem Fall sind Kreuzreaktionen nicht schädlich, sondern wünschenswert, da die Antikörper in einem Test verwendet werden sollen, wo ein Marker einer Kraftstoffkontamination ein positives Ergebnis hervorrufen kann.
Teststreifenherstellung: Die Herstellung des Markers und der Testmembran und der Teststreifenzusammenbau werden wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt, außer daß die spezifische Linie in der Membran durch das Beschichten mit einem Antigen (Tolylessigsäure-Trägerpeptid-Konjugat) anstelle eines Sekundärantikörpers hergestellt wird. Der an die Markerteilchen gebundene Antikörper ist ein monoclonaler Anti-Toluol-Antikörper.
Probenherstellung: Ein Probenmaterial mit Standardgewicht wird mit einem bekannten Volumen Methanol extrahiert. Der Extrakt wird mit Verdünnungspuffer in einem vorbestimmten Verhältnis von Volumina (mindestens 1 : 5) verdünnt und als Probe in dem Test verwendet.

Testdurchführung:

1. Das Aufnahmeende des Teststreifens wird 20 mm tief in die Probenflüssigkeit getaucht.
2. Der Streifen wird aus der Flüssigkeit entfernt.
3. Nach 5 Minuten wird die Anzahl der in dem Teststreifen erscheinenden blauen Linien aufgezeichnet und das Ergebnis wird interpretiert.
Interpretation: Der Test basiert auf einem kompetitiven Prinzip. Das Antigen in der Probe konkurriert mit dem Antigen in der spezifischen Testlinie um die Bindungsstellen des Marker-Antikörpers. Die Menge des Antikörpers in dem Marker ist so eingestellt, daß auch eine sehr geringe Menge (entsprechend etwa 5 ppm oder mehr in der Ausgangsprobe) von Toluol oder einer Toluol-verwandten, in Erdöltreibstoff vorkommenden Verbindung die Bindungsstellen blockiert und sich keine blaue spezifische Linie auf dem Streifen bilden kann. Deshalb, falls zwei blaue Linien erschienen sind, kann der Test als negativ interpretiert werden. Falls nur eine blaue Linie (die Kontrolllinie) erschienen ist, ist der Test positiv und die Bodenprobe ist kontaminiert.

Beispiel 5

Test zum Nachweis von Salmonella sp. in Nahrunsgmittel

Antikörperherstellung: Murine monoclonale Antikörper gegen Salmonella werden unter Anwendung von dem Fachmann bekannten Verfahren hergestellt (vgl. zum Beispiel Stenman U.-H. et al., J. Immunol. Methods 46 (1981), 337-345). Der Salmonella sp.-Zellwandextrakt wird als Antigen bei Immunisierungen verwendet. Zur Antikörperdurchmusterung wird ein ELISA-Verfahren angewendet, wobei Platten mit Mikrovertiefungen mit dem gleichen Zellwandextrakt beschichtet werden. An die antigenbeschichtete Oberfläche gebundene Antikörper werden mit Enzym (HRP, Meerrettichperoxidase)-markiertem Kaninchen-anti-Maus-Immunoglobulin nachgewiesen. Die Clone, für die festgestellt wurde, daß sie positiv sind, werden dann mit ELISA-Verfahren unter Verwendung von Zellwandextrakten einer anderen wichtigen pathogenen Salmonella-Art getestet. Eine breite Gruppenspezifität ist erwünscht. Die selektierten monoclonalen Antikörper werden auf Kreuzreaktionen getestet, um schädliche Reaktionen mit anderen Bakterien auszuschließen, von denen bekannt ist, daß sie in Nahrungsmitteln häufig sind.
Teststreifenherstellung: Die Herstellung des Markers und der Testmembran und der Teststreifenzusammenbau werden wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt.
Monoclonale Salmonella-Antikörper werden auf die Markerteilchen und die spezifische Linie auf der Testmembran aufgetragen.
Probenherstellung: Mit der Nahrungsmittelprobe wird eine Anreicherungskultur durchgeführt und Kulturmedium verdünnt mit für die Antigenexposition vorteilhaftem Testpuffer wird als Probe in dem Test verwendet. Wenn eine schwere Salmonella-Kontamination zu erwarten ist, kann der Test ohne Anreicherung durch Verdünnen der Ausgangsprobe, falls sie eine Flüssigkeit ist oder sie kann in flüssiger Form suspendiert werden, durchgeführt werden.

Testdurchführung:

1. Das Aufnahmeende des Teststreifens wird 20 mm tief in die Probenflüssigkeit getaucht.
2. Der Streifen wird aus der Probe entfernt.
3. Nach 5 Minuten wird die Anzahl der in dem Teststreifen erscheinenden blauen Linien aufgezeichnet und das Ergebnis wird interpretiert.
Interpretation: Falls eine blaue Linie in dem Streifen erschienen ist, ist das Ergebnis negativ. Falls zwei blaue Linien erschienen sind, ist der Test für Salmonella sp. positiv. Der Test kann 0,1-1 Million Bakterien/ml oder mehr nachweisen.
Vorstehend wurde die Erfindung unter Bezugnahme auf bestimmte Ausführungsformen in diagnostischen und Umwelttestverfahren erläutert. Es sollte deutlich sein, daß die Beispiele nur veranschaulichend sind und daß ein Fachmann in der Lage ist, die Erfindung innerhalb der durch die beigefügten Patentansprüche gesetzten Grenzen zu variieren.

Claims

1. Teststreifen für einen schnellen Immuntest, enthaltend spezifische immunochemische Reagenzzonen (7, 8, 9), wobei der Teststreifen (10) eine Trägerschicht (1) aufweist und daran befestigt ein Aufnahmekissen an einem Aufnahmeende (3) und in einem Abstand dazu ein weiteres Endkissen (5), wobei eine Testmembran (2) zwischen den Kissen (3, 5) vorgesehen ist, die in flüssigen Kontakt mit einer Probe gebracht werden soll, wobei die Membran (2) sich parallel zu der Trägerschicht (1) in einem Abstand dazu befindet, wobei der Teststreifen dadurch gekennzeichnet ist, daß sich zwischen der Trägerschicht (1) und der Membran (2) ein Luftzwischenraum (4) befindet, der an seinen Seiten offen ist.

2. Teststreifen nach Anspruch 1, wobei das Aufnahmekissen (3) und vorzugsweise auch das weitere Endkissen (5) aus einem absorbierenden Material bestehen.

3. Teststreifen nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Streifen zwei Trägerschichten aufweist, die einerseits eine Unterlagsschicht (1) und andererseits eine zumindest teilweise transparente Deckschicht (6) ausbilden, wobei die Kissen (3, 5) und die Testmembran (2) zwischen der Unterlagsschicht (1) und der Deckschicht (6) angeordnet sind, wobei sich zwischen den Kissen (3, 5), der Testmembran (2) und einer der Trägerschichten (1, 6) der an den Seiten offene Luftzwischenraum (4) befindet, der als ein geschützter Reaktionsraum dient.

4. Teststreifen nach einem der vorangehenden Ansprüche 1 bis 3, wobei die Testmembran (2) aus einem porösen Material besteht, wie Nitrocellulose, Nylon oder ähnliches, wobei die Testmembran (2) zumindest teilweise an einer der Trägerschichten (1, 6) befestigt ist.

5. Teststreifen nach einem der vorangehenden Ansprüche 1 bis 4, wobei das weitere Endkissen (3) oder die Membran (2) als Reagenzzone eine oder mehrere Markierungszonen (7) aufweist, die bewegliche gefärbte Teilchen enthalten, die mit einem immunochemischen Reagenz beschichtet sind, wie einem Antikörper zu dem zu testenden Analyt, und wobei die Membran (2) innerhalb des Bereiches, der dem Luftzwischenraum (4) entspricht, als weitere Reagenzzonen eine oder mehrere Testzonen (8, 8', 8") aufweist, die immunochemische Reagenzien enthalten, wie einen anderen Antikörper oder ein Konjugat des zu testenden Analyts, sowie eine Kontrollzone (9) zum Anzeigen der geeigneten Fließbedingungen.

6. Teststreifen nach Anspruch 5, wobei die Markierungszonen (7) unterschiedliche spezifische immunochemische Reagenzien für mehr als einen zu testenden Analyten und/oder unterschiedliche Konzentrationen von einem oder mehreren spezifischen immunochemischen Reagenzien enthalten.

7. Testreifen nach Anspruch 5 oder 6, wobei die Markierungszone (7) gefärbte Teilchen enthält, die mit Antikörpern beschichtet sind, umfassend

(a) monoclonalen hCG-Antikörper,

(b) monoclonalen IGFBP-1-Antikörper,

(c) sowohl Hämobglobin- als auch Albumin-Antikörper,

(d) monoclonales Anti-Toluol, oder

(e) monoclonale Salmonella-Antikörper,

und wobei die Testzone (8, 8', 8")

im Fall (a) einen anderen monoclonalen hCG-Antikörper,

im Fall (b) einen anderen monoclonalen IGFBP-1-Antikörper,

im Fall (c) einen anderen Hämoglobin- und einen anderen Albumin-Antikörper,

im Fall (d) ein Toluolkonjugat, und

im Fall (e) einen monoclonalen Salmonella-Antikörper enthält.

8. Verfahren zur Herstellung eines Teststreifens nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren folgende Schritte umfaßt

(a) der Länge nach Verteilen und Trocken getrennter kontinuierlicher Zonen einer oder mehrerer immunochemischer Reagenzien auf eine kontinuierliche Länge der Testmembran,

(b) Anheften mindestens zweier getrennter kontinuierlicher Stränge von Kissenmaterial in einem Abstand voneinander auf einer kontinuierlichen Länge Trägermaterial,

(c) Aufbringen der Länge der Testmembran, die in Schritt (a) hergestellt wurde, auf die Stränge des Kissenmaterials, so daß die Reagenzzonen an der Lücke ausgerichtet sind, die sich zwischen den Strängen des Kissenmaterials gebildet hat,

(d) Anheften einer kontinuierlichen Länge von transparentem Deckmaterial auf die Kissenstränge und die Länge der Membran, und

(e) Schneiden des erhaltenen Strangzuschnittes in Teststreifen einer gewünschten Größe.

9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei eine oder mehrere kontinuierliche Zonen von Markerreagenz auf die Länge der Membran oder auf einen der Stränge des Kissenmaterials aufgebracht und getrocknet werden.

10. Teststreifen nach einem der Ansprüche 1 bis 7 zur schnellen immunochemischen Umweltanalyse oder für einen schnellen diagnostischen Immuntest und enthaltend in den Reagenzzonen (7, 8, 9) auf den Teststreifen (10) spezifische immunochemische Reagenzien, die fähig sind zu einer immunochemischen Reaktion mit einem oder mehreren Umweltanalyten bzw. einem oder mehreren diagnostischen Analyten.