DE69325981T2

DE69325981T2 - Pullulanase, Mikroorganismen die sie produzieren, Verfahren zur Herstellung und ihre Anwendung

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Publication number: DE69325981T2
Application number: DE69325981T
Authority: DE
Inventors: Antoine Amory; Philippe Deweer
Original assignee: Genencor International Inc
Current assignee: Danisco US Inc
Priority date: 1992-12-28
Filing date: 1993-12-20
Publication date: 2000-02-03
Anticipated expiration: 2013-12-21
Also published as: US5817498A; FI935900A0; KR100319442B1; JPH06217770A; AU6483198A; ATE183236T1; EP0605040A1; ES2137222T3; US5736375A; US5731174A; KR940014776A; US5721127A; US5721128A; MX9400123A; DE69325981D1; CN1090325A; FI935900A; FI116531B; DK0605040T3; AU686574B2

Description

Die Erfindung betrifft eine neue Pullulanase. Die Erfindung betrifft auch einen neuen Mikroorganismenstamm, welcher diese Pullulanase produziert, und die Verfahren zur Herstellung dieser Pullulanase. Die Erfindung betrifft auch die Verwendungen und die Zusammensetzungen, welche sie enthalten. Die Erfindung betrifft auch ein DNA-Molekül, welches das Gen dieser Pullulanase enthält, und einen Expressionsvektor, welcher dieses DNA-Molekül enthält, der geeignet ist, die Pullulanase in den Bacillus- bzw. Bakterienstämmen zu exprimieren.
Amidon, dessen wesentliche Bestandteile Amylose und Amylopektin sind, kann durch ein enzymatisches Verfahren, das in zwei Stufen durchgeführt wird, zu Einfachzuckern umgewandelt werden: eine Stufe der Verflüssigung von Amidon und eine Stufe der Verzuckerung des verflüssigten Amidons. Um einen erhöhten Umwandlungsgrad von Amidon zu erreichen, wurde bereits vorgeschlagen, während der Verzuckerung des verflüssigten Amidons ein Enzym zuzusetzen, welches die glucosidischen α-1,6-Bindungen hydrolysiert, wie beispielsweise eine Pullulanase.
Im europäischen Patent 0 063 909 wird ein zerlegendes Enzym beschrieben, d. h. das fähig ist, die glucosidischen α-1,6- Bindungen in Amylopektin zu hydrolysieren, das eine Pullulanaseaktivität zeigt und eine optimale Aktivität bei einem pH-Wert von 4 bis 5 bei 60ºC besitzt. Dieses Enzym stammt von einem Stamm von Bacillus acidopullulyticus.
Eine ähnliche Pullulanase, die von einem Bacillus-Stamm abgeleitet ist, wird ebenfalls beschrieben (J. Jpn. Soc. Starch Sci., 1983, Bd. 30, Nr. 2, S. 200-211). Diese Pullu lanase zeigt eine optimale Aktivität bei einem pH-Wert von 5,0 und einer Temperatur von 60ºC. Indessen ist sie bei einem pH-Wert unter 4,2 bei einer Temperatur von 60ºC inaktiv.
Darüber hinaus hat man in dem US-Patent 5,055,403 eine Pullulanase vorgeschlagen, welche eine enzymatische Aktivität in saurem Milieu aufweist und von einem Stamm Bacillus naganoensis abgeleitet ist. Dieses Enzym zeigt eine maximale Aktivität bei einem pH-Wert von etwa 5, gemessen bei 60ºC, und eine maximale Aktivität bei einer Temperatur von etwa 62,5ºC, gemessen bei einem pH-Wert von 4, 5.
Des weiteren ist auch die Klonierung einer Neopullulanase von Bacillus stearothermophilus in Bacillus subtilis bekannt (Journal of bacteriology, 1988, Bd. 170, Nr. 4, S. 1554-1559). Jedoch hydrolysiert diese Neopullulanase Amidon nur teilweise.
Obwohl bei einem sauren pH-Wert und einer Temperatur von etwa 60ºC aktiv und von da ab während der Verzuckerung von verflüssigtem Amidon verwendbar, zeigen die Pullulanasen des Standes der Technik den Nachteil, daß sie unter solchen Temperatur- und pH-Bedingungen wenig stabil sind, ihre Halbwertszeit bei einer Temperatur von 60ºC und einem pH- Wert von etwa 4, 5 in Abwesenheit von Substrat einige Zehn Minuten nicht überschreitet.
Dementsprechend besteht tatsächlich ein Bedürfnis für eine Pullulanase, welche während der Verzuckerung von verflüssigtem Amidon verwendbar ist und in einem großen Temperatur- und pH-Wertbereich stabil ist und insbesondere bei einer Temperatur von etwa 60ºC und einem pH-Wert von etwa 4,5.
Die vorliegende Erfindung hat zum Ziel, eine neue Pullulanase zur Verfügung zu stellen, welche bei saurem pH-Wert aktiv ist, eine Thermostabilität bei saurem pH-Wert zeigt, die sehr viel größer ist als diejenige von Pullulanasen des Standes der Technik, und eine Halbwertszeit von mehreren Stunden unter den vorerwähnten Bedingungen zeigt.
Die vorliegende Erfindung hat auch zum Ziel, einen Stamm und insbesondere einen Bacillus-Stamm zu identifizieren, zu isolieren und zur Verfügung zu stellen, welcher auf natürliche Weise die Pullulanase produziert.
Die vorliegende Erfindung hat auch zum Ziel, eine für die genannte Pullulanase codierende Nucleotidsequenz zu isolieren und zur Verfügung zu stellen.
Die vorliegende Erfindung hat auch zum Ziel, einen Expressionsvektor und einen chromosomalen Integrationsvektor zur Verfügung zu stellen, welche die für die genannte Pullulanase codierende Nucleotidsequenz enthalten, herzustellen und zur Verfügung zu stellen.
Die vorliegende Erfindung hat auch zum Ziel, den mit dem Expressionsvektor oder dem Integrationsvektor, welche die für die genannte Pullulanase codierende Nucleotidsequenz des Bacillus-Stammes enthalten, transformierten Wirt- Bacillus herzustellen und zur Verfügung zu stellen.
Demnach betrifft die Erfindung eine Pullulanase, welche durch einen Bacillus, insbesondere durch einen aeroben und nicht-thermophilen Mikroorganismus, wie Bacillus deramificans, produziert wird. Man verwendet vorzugsweise den Bacillus deramificans T89.117D oder ein Derivat oder einen Mutanten dieses Stammes.
Vorzugsweise ist die isolierte und gereinigte Pullulanase aus einem einzigen Polypeptid-Typ mit einem Molekulargewicht von etwa 100 (± 10) kDa gebildet.
Darüber hinaus ist die N-terminale Sequenz (SEQ ID Nr: 1> der Pullulanase in Richtung Amin-Carboxyl-Funktion und von links nach rechts die folgende:
Die Erfindung betrifft eine isolierte und gereinigte Pullulanase, welche die Aminosäuresequenz von 1 bis 928 Aminosäuren (SEQ ID Nr: 11) oder eine davon abgeleitete modifizierte Sequenz umfaßt. Diese Sequenz ist die vollständige Aminosäuresequenz der genannten Pullulanase, wie sie in der Fig. 4 (4a bis 4f) veranschaulicht ist.
Die für die Pullulanase codierende vollständige Sequenz von Nucleotiden (SEQ ID Nr: 10) sowie ihre Übersetzung in Aminosäuren ist in Fig. 4 angegeben.
In besonders bevorzugter Weise besitzt die Pullulanase einen isoelektrischen Punkt, welcher zwischen 4,1 und 4, 5 enthalten ist.
Die Pullulanase gemäß der Erfindung ist in einem großen Temperaturbereich thermostabil und aktiv. Die Pullulanase ist bei saurem pH-Wert aktiv.
Die Pullulanase kann die Hydrolyse von glucosidischen α- 1,6-Bindungen, welche sowohl in Amylopektin wie auch in Pullulan vorliegen, katalysieren. Es ist demnach ein eine Vernetzung abbauendes oder zerlegendes Enzym. Vorzugsweise ist die Pullulanase in der Lage, die glucosidischen Bindungen vom α-1,6-Typ in Amylopektin zu hydrolysieren.
Vorzugsweise baut die Pullulanase gemäß der Erfindung das Pullulan zu Maltotriose und das Amylopektin zu Amylose ab. Darüber hinaus hydrolysiert die Pullulanase der vorliegenden Erfindung das Amyloepektin unter Bildung von Oligosacchariden (Maltooligosaccharide). Während dieser Hydrolyse beobachtet man die Bildung von Oligosacchariden, welche aus etwa 13 Einheiten von Glucose gebildet sind (Polymerisationsgrad 13, dieses Molekül wird auch "A-Kette" genannt), danach die Bildung von Oligosacchariden, welche aus etwa 47 Einheiten Glucose gebildet sind (Polymerisationsgrad 47, dieses Molekül wird auch "B-Kette" genannt).
Die Definition von Oligosacchariden durch A- und B-Ketten wird unter Bezugnahme auf D. J. MANNERS ("Structural Analysis of Starch components by Debranching Enzymes" in "New Approaches to research on Cereal Carbohydrates", Amsterdam, 1985, S. 45-54) und B. E. ENEVOLDSEN ("Aspects of the fine structure of starch" in "New Approaches to research on Cereal Carbohydrates", Amsterdam, 1985, S. 55-60) vorgenommen.
Vorzugsweise hydrolysiert die Pullulanase der vorliegenden Erfindung das Amylopektin der Kartoffel. Diese Hydrolyse kann mit einer wäßrigen Suspension von Amylopektin in Gegenwart der Pullulanase unter den optimalen Aktivitätsbedingungen der Pullulanase durchgeführt werden, d. h. bei einer Temperatur von etwa 60ºC und einem pH-Wert von etwa 4,3.
Die Pullulanase der vorliegenden Erfindung katalysiert die Kondensationsreaktion von Maltose unter Bildung von Tetraholosiden (Oligosaccharide mit 4 Glucoseeinheiten).
Die Pullulanase der Erfindung hat eine Halbwertszeit von etwa 55 Stunden, gemessen bei einer Temperatur von etwa 60ºC, in einer auf einen pH-Wert von 4, 5 gepufferten Lösung und in Abwesenheit von Substrat.
Unter Halbwertszeit versteht man, daß die Pullulanase eine relative enzymatische Aktivität von wenigstens 50%, gemessen nach einer Inkubation von 55 Stunden bei einer Temperatur von etwa 60ºC in einer auf einen pH-Wert von etwa 4, 5 gepufferten Lösung in Abwesenheit von Substrat zeigt.
Die Pullulanase gemäß der Erfindung ist bei saurem pH-Wert thermostabil. Tatsächlich zeigt die Pullulanase gemäß der Erfindung eine relative enzymatische Aktivität von wenigstens 55%, gemessen nach einer Inkubation von 40 Stunden bei einer Temperatur von 60ºC, in einer auf einen pH-Wert von etwa 4, 5 gepufferten Lösung in Abwesenheit von Substrat. Sie zeigt eine relative enzymatische Aktivität von wenigstens 70%, gemessen nach einer Inkubation von 24 Stunden unter diesen gleichen Bedingungen.
Unter relativer enzymatischer Aktität versteht man das Verhältnis zwischen der enzymatischen Aktivität, welche im Verlauf eines Versuches, durchgeführt unter gegebenen pH-, Temperatur-, Substrat- und Zeitbedingungen, und der maximalen enzymatischen Aktivität während des gleichen Versuches, wobei die enzymatische Aktivität ausgehend von der Hydrolyse von Pullulan gemessen wird und wobei die maximale enzymatische Aktivität willkürlich auf den Wert von 100 festgelegt wird.
Die Pullulanase gemäß der Erfindung ist darüber hinaus in einem großen sauren pH-Bereich stabil.
Unter den nachfolgend beschriebenen Bedingungen ist sie bei einem pH-Wert von größer oder gleich 3 aktiv. Tatsächlich zeigt die Pullulanase eine relative enzymatische Aktivität von wenigstens 85%, gemessen nach einer Inkubation von 60 Minuten, bei einer Temperatur von etwa 60ºC, in Abwesenheit von Substrat und in einem pH-Bereich von größer oder gleich etwa 3,5.
Unter den nachfolgend beschriebenen Bedingungen ist sie bei einem pH-Wert von unter oder gleich 7 aktiv. Tatsächlich zeigt die Pullulanase eine relative enzymatische Aktivität von wenigstens 85%, gemessen nach einer Inkubation von 60 Minuten bei einer Temperatur von etwa 60ºC in Abwesenheit von Substrat und in einem pH-Bereich von unter oder gleich etwa 5,8.
Vorzugsweise zeigt sie eine relative enzymatische Aktivität von größer 90%, gemessen in einem pH-Bereich, der zwischen etwa 3,8 und etwa 5 unter diesen gleichen Bedingungen enthalten ist.
Die Pullulanase gemäß der Erfindung entwickelt eine optimale enzymatische Aktivität, gemessen bei einer Temperatur von etwa 60ºC, in einem pH-Bereich von über 4,0. Die Pullulanase gemäß der Erfindung entwickelt eine optimale enzymatische Aktivität, gemessen bei einer Temperatur von etwa 60ºC in einem pH-Bereich unter 4,8. Vorzugsweise entwickelt die Pullulanase eine optimale enzymatische Aktivität, gemessen bei einer Temperatur von etwa 60ºC, bei einem pH-Wert von etwa 4,3.
Die Pullulanase gemäß der Erfindung entwickelt darüber hinaus eine optimale enzymatische Aktivität, gemessen bei einem pH-Wert von etwa 4,3, in einem Temperaturbereich, welcher zwischen 55 und 65ºC enthalten ist und insbesondere bei 60ºC.
Die Pullulanase gemäß der vorliegenden Erfindung entwickelt eine enzymatische Aktivität von mehr als 80% der maximalen enzymatischen Aktivität (wobei die maximale enzymatische Aktivität bei einer Temperatur von 60ºC und einem pH-Wert von 4,3 gemessen wird) in einem pH-Bereich, welcher zwischen etwa 3,8 und etwa 4,9 enthalten ist, für eine Temperatur von etwa 60ºC.
Die Pullulanase der Erfindung besitzt darüber hinaus alle adäquaten Eigenschaften, welche mit den tatsächlichen industriellen Bedingungen der Verzuckerung von Amidon kompatibel sind. Diese Eigenschaften, sind ein Optimum des pH- Wertes von unter 5, ein Temperaturoptimum um 60ºC und eine gute Stabilität des Enzyms unter diesen Bedingungen des sauren pH-Wertes und der erhöhten Temperatur. Das saure Milieu wird durch gleichzeitige Verwendung von Glucoamylase und Pullulanase während der industriellen Verzuckerung von Amidon eingestellt. Tatsächlich wird die für die Verzuckerung von Amidon verwendete Glucoamylase im allgemeinen durch einen Pilz produziert und insbesondere durch einen Aspergillus-Stamm, wie Aspergillus niger, Aspergillus awamori oder Aspergillus foetidus. Die an die Verzuckerung von verflüssigtem Amidon in Gegenwart einer Glucoamylase angepaßten idealen Bedingungen sind eine Temperatur von etwa 60ºC und ein pH-Wert von etwa 4,0 bis 4, 5. Das ist insbesondere für Glucoamylase der Fall, welche unter den Marken DIAZYME® L-200 von SOLVEY ENZYMES (Elkhart, USA) und OPTIDEX® von SOLVEY ENZYMES (Hannover, Deutschland) verkauft werden. Darüber hinaus dauert die Verzuckerungsstufe mehrere Stunden, im allgemeinen 40 bis 60 Stunden, und es ist wesentlich, daß die verwendeten Enzyme während der gesamten Dauer dieser Stufe stabil, aktiv und wirksam sind, und diese Enzyme müssen demnach eine erhöhte Thermostabilität in saurem Milieu und eine so lang wie mögliche Halbwertszeit zeigen. Deshalb ist die Pullulanase der vorliegenden Erfindung wirksamer als die bekannten Pullulanasen.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung einer Pullulanase, das die Zucht eines aeroben (und nicht thermophilen) Bakteriums, das Pullulanase produzieren kann, in einem geeigneten Nährmedium, welches Quellen von Kohlenstoff und Stickstoff und Mineralsalze umfaßt, unter aerobiotischen Bedingungen und die Gewinnung der so erhaltenen Pullulanase umfaßt. Dieses Kultur- bzw. Zuchtme dium kann fest oder flüssig sein. Vorzugsweise ist das Zuchtmedium flüssig.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung einer Pullulanase, das die Zucht bzw. Kultur des Stammes Bacillus deramificans T 89.117D (LMG P-13056) oder ein Derivat dieses Stammes, das fähig ist, Pullulanase in einem geeigneten Nährmedium zu produzieren, welches Kohlenstoff- und Stickstoffquellen und Mineralsalze enthält, unter aerobiotischen Bedingungen, und die Gewinnung der so erhaltenen Pullulanase, umfaßt.
Die Zuchtbedingungen dieser Bakterien, wie Bestandteile des Kulturmediums, Kulturparameter, Temperatur, pH-Wert, Belüftung, Rühren, sind dem Fachmann gut bekannt. Die Kohlenstoffquellen des Kulturmediums werden gewöhnlich aus Amidon, teilweise hydrolysiertem Amidon, löslichem Amidon, Oligosacchariden, Glucose, Amylose, Amylopektin oder Mischungen von zwei oder mehreren davon ausgewählt. Die Kohlenstoffquellen des Kulturmediums werden vorzugsweise unter teilweise hydrolysiertem Amidon, Pullulan, Glucose oder Mischungen davon ausgewählt. Gute Ergebnisse wurden mit Glucose und teilweise hydrolysiertem Amidon erhalten. Die Stickstoffquellen des Kulturmediums werden im allgemeinen aus Hefeextrakt, Sojamehl, Baumwollkornmehl, Fischmehl, Gelatine, Kartoffelmehl oder Mischungen von zwei oder mehreren davon ausgewählt. Die Stickstoffquellen des Kulturmediums werden vorzugsweise aus Hefeextrakt, Sojamehl und Mischungen davon ausgewählt. Gute Ergebnisse wurden mit Hefeextrakt erhalten. Die Mineralsalze des Kulturmediums werden im allgemeinen für die Anionen unter Chlorid, Carbonat, Phosphat, Sulfat und für die Kationen unter Kalium, Natrium, Ammonium, Magnesium, Calcium oder einer Mischung von zwei oder mehreren davon ausgewählt. Gute Ergebnisse wurden mit einer Mischung der folgenden Salze erhalten: KH&sub2;PO&sub4;, K&sub2;HPO&sub4;.3H&sub2;O, (NH&sub4;)2SO&sub4;, MgCl&sub2;.6H&sub2;O und CaCl&sub2;.2H&sub2;O.
Die Kultur wird im allgemeinen auf eine Temperatur zwischen 20 und 45ºC, vorzugsweise zwischen 25 und 40ºC, gebracht.
Die Zucht wird im allgemeinen auf einen pH-Wert zwischen 3,5 und 6 und vorzugsweise zwischen 4 und 6 eingestellt.
Die Zucht wird unter aerobiotischen Bedingungen in Gegenwart von Luft oder Sauerstoff und unter Rühren gebracht.
Diese Gewinnungstechnik von Pullulanase-Produkt sind dem Fachmann gut bekannt. Gewöhnlicherweise verwendet man das Zentrifugieren, die Ultrafiltration, das Verdampfen, das Ausfällen, das Filtrieren, das Mikrofiltrieren, die Kristallisation oder eine Kombination der einen oder anderen dieser Techniken, wie ein Zentrifugieren mit nachfolgender Ultrafiltration.
Die Pullulanase kann dann, falls nötig, gereinigt werden. Die Reinigungsverfahren von Enzymen sind dem Fachmann bekannt, wie insbesondere das Ausfällen mit Hilfe eines Salzes, wie Ammoniumsulfat, oder eines Lösungsmittels, wie hauptsächlich Aceton.
Die Pullulanase kann auch durch Zerstäuben oder Lyophilisieren getrocknet werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Identifizierung und das Zurverfügungstellen eines neuen aeroben, isolierten Bakteriums, das Pullulanase produziert. Im allgemeinen gehört es zur Familie der Bacillaceae. Vorzugsweise gehört es zur Gattung Bacillus. In bevorzugter Weise ist der Bacillus der Stamm Bacillus deramificans T 89.117D oder ein Derivat oder Muntant dieses Stammes.
Unter Derivat oder Mutant dieses Stammes versteht man alle natürlich oder künstlich modifizierten Bakterien. Die Derivate dieses Stammes können durch bekannte Modifikations techniken erhalten werden, wie Ultraviolettstrahlen, Röntgenstrahlen, mutagene Mittel oder Gentechnik.
Der Stamm Bacillus deramificans T 89.117D wurde bei der BELGIAN COORDINATED COLLECTIONS OF MICROORGANISMS (LMG culture collection, Universite de Gand, Laboratoire de Microbiologie - K. L. Ledeganckstraat 35, B-9000 Gand, Belgien) in Übereinstimmung mit dem Budapester Vertrag unter der Nummer LMG P-13056 am 9. Dezember 1992 hinterlegt. Die Erfindung betrifft demnach eine isolierte und gereinigte Kultur von Bacillus deramificans T 89.117D und eine davon abgeleitete oder mutierte Kultur.
Der Stamm der vorliegenden Erfindung wurde durch seine biochemischen Eigenschaften identifiziert: grampositives Bakterium, aerob, Stäbchenform, Endosporen bildend. Die Erfindung betrifft auch das Isolieren und Zurverfügungstellen eines DNA-Moleküles, das eine für die Pullulanase von Bacillus deramificans T 89.117D (LMG P-13056) oder einer davon abgeleiteten modifizierten Sequenz codierende Nucleotidsequenz umfaßt. Vorzugsweise umfaßt dieses DNA-Molekül das gesamte Gen der Pullulanase von Bacillus deramificans T 89.117D. Unter das gesamte Gen von Pullulanase versteht man wenigstens den (oder die) Transkriptionspromotor(en), die (oder die) Signalsequenz(en), die für die reife Pullulanase codierende Nucleotidsequenz und den (die) Transkriptionsterminator (en).
Das DNA-Molekül gemäß der Erfindung umfaßt mindestens die Nucleotidsequenz (SEQ ID Nr: 10), welche für die reife Pullulanase von Bacillus deramificans T 89.117D (LMG P-13056) und ihre Signalsequenz (Vorsequenz) (SEQ ID Nr: 13) codiert. Vorzugsweise umfaßt das DNA-Molekül das gesamte Gen von Pullulanase von Bacillus deramificans T 89.117D. Gute Ergebnisse wurden mit einem DNA-Molekül erhalten, das die Nucleotidsequenz (SEQ ID Nr: 8) umfaßt. Die Nucleotidsequenz (SEQ ID Nr: 8) besteht in Richtung Amin-/Carboxylgruppe und von links nach rechts aus der Nucleotidsequenz (SEQ ID Nr: 14), der Nucleotidsequenz (SEQ ID Nr: 13), der Nucleotidsequenz (SEQ ID Nr: 10) und der Nucleotidsequenz (SEQ ID Nr: 15).
Die Pullulanase der Erfindung wird in Form eines Vorläufers synthetisiert, welcher eine zusätzliche Sequenz von 29 Aminosäuren enthält (SEQ ID Nr: 12).
Die Erfindung betrifft auch eine modifizierte Pullulanase, d. h. ein Enzym, dessen Aminosäuresequenz von der des Wildenzyms durch wenigstens eine Aminosäure verschieden ist. Diese Modifikation kann durch klassische Mutagenesetechniken an der DNA erhalten werden, wie einer Bestrahlung durch Ultraviolettlicht, Behandeln mit chemischen Produkten, wie Natriumnitrit oder o-Methylhydroxylamin, oder durch gentechnische Verfahren, wie beispielsweise einer gesteuerten oder willkürlichen Mutagenese.
Die Erfindung betrifft auch eine mutierte Pullulanase, erhalten durch Modifikation der Nucleotidsequenz des Genes, das für die oben definierte Pullulanase codiert. Die Verfahren zum Erhalten solcher mutierter Pullulanasen sind dem Fachmann bekannt und sind insbesondere in Molecular Cloning - a laboratory manual - SAMBROOK, FRITSCH, MANIATIS - Zweite Auflage, 1989, Kapitel 15, beschrieben.
Die Erfindung betrifft auch das Herstellen und Zurverfügungstellen eines Expressionsvektors, welcher das DNA-Molekül enthält, das die Nucleotidsequenz umfaßt, welche für die Pullulanase von Bacillus deramificans T 89.117D umfaßt. Vorzugsweise umfaßt das DNA-Molekül das Strukturgen, welches für die reife Pullulanase von Bacillus deramificans T 89.117D codiert. In besonders bevorzugter Weise ist dieser Vektor der Vektor pUBDEBRA1. Gute Resultate wurden auch mit dem Vektor pUBCDEBRA11 erhalten.
Unter Expressionsvektor versteht man jede DNA-Sequenz, welche ein Replikon und weitere DNA-Regionen (Nucleotidsequenzen) umfaßt und unabhängig vom Wirt als vollständige genetische Expressionseinheit funktionell ist.
Unter vollständiger genetischer Expressionseinheit versteht man das Strukturgen und den oder die Bereich(e) des Promotors und den oder die Bereich(e) der Regulation, welche(r) für die Transkription und die Übersetzung erforderlich sind. Unter Strukturgen versteht man die codierende Sequenz, welche für die RNA-Transkription verwendet wird und die Synthese des Proteins durch den Wirt erlaubt.
Der bevorzugte Expressionsvektor ist der Vektor pUBDEBR1. Dieser Vektor enthält das Gen, welches für die Pullulanase des Stammes Bacillus deramificans T 89.117D gemäß der Erfindung codiert. Dieser Vektor kann in einen geeigneten Wirt eingeführt werden. Im allgemeinen ist dieser Wirt ein Bacillus-Stamm. Vorzugsweise ist dieser Wirt ein Stamm von Bacillus licheniformis. In besonders bevorzugter Weise ist dieser Wirt ein Stamm von Bacillus licheniformis SE2. Ausgezeichnete Ergebnisse wurden mit diesem Vektor erhalten, wenn er in den Stamm von Bacillus licheniformis SE2 delapl, welcher als Wirt verwendet wird, eingeführt wird.
Die Erfindung betrifft auch die Herstellung und das Zurverfügungstellen eines chromosomalen Integrationsvektors, welcher das DNA-Molekül enthält, welche die Nucleotidsequenz umfaßt, die für die Pullulanase von Bacillus deramificans T 89.117D codiert. Vorzugsweise umfaßt das DNA-Molekül das Strukturgen, das für die reife Pullulanase von Bacillus deramificans T 89.117D codiert. In besonders bevorzugter Weise ist dieser chromosomale Integrationsvektor der Vektor pUBCDEBRA11DNSI.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch rekombinante Stämme, in welche das für die Pullulanase codierende Gen durch gentechnische Verfahren eingeführt ist. Das Gen kann über ein Plasmid durch einen Expressionsvektor eingeführt oder in das Wirt-Chromosom in einer oder mehreren Kopien durch einen chromosomale Integrationsvektor integriert sein.
Die Erfindung betrifft auch Mikroorganismenstämme, welche verscheiden vom Ausgangsproduktionsorganismus sind, in welche die Nucleotide, die für die Pullulanase codieren, durch Transformation eingeführt sind, entweder in einer Form, welche in die chromosomale DNA integriert ist oder in autoreplikativer Form (Plasmid).
Die Erfindung betrifft den transformierten Stamm von Bacillus licheniformis, welcher das oben beschriebene DNA- Molekül enthält. Die Erfindung betrifft den transformierten Stamm von Bacillus licheniformis, welcher den Expressionsvektor oder den chromosomalen Integrationsvektor enthält, welcher dieses DNA-Molekül umfaßt. Vorzugsweise betrifft die Erfindung den transformierten Stamm von Bacillus licheniformis, welcher den Expressionsvektor pUBDEBR1 oder den chromosomalen Integrationsvektor pUBCDEBRAlIDNSI umfaßt.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung einer Pullulanase aus einem rekombinanten Organismus, wobei das Verfahren die Isolierung eines DNA-Fragmentes, das für die Pullulanase codiert, die Insertion dieses DNA-Fragmentes in einen geeigneten Vektor, die Einführung dieses Vektors in einen geeigneten Wirt oder die Einführung dieses DNA-Fragmentes in das Chromosom eines geeigneten Wirtes, das Züchten bzw. Kultivieren dieses Wirtes, die Expression der Pullulanase und die Gewinnung der Pullulanase umfaßt. Der geeignete Wirt wird im allgemeinen aus der Gruppe ausgewählt, die aus den Mikroorganismen Escherichia coli, Bacillus oder Aspergillus ausgewählt ist. Gewöhnlich wird der Wirt unter den Bacillus-Mikroorganismen ausgewählt. Vor zugsweise wird der Wirt aus den Mikroorganismen der Gattung Bacillus (aerob) ausgewählt. In besonders bevorzugter Weise wird der Wirt unter den Mikroorganismen Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus alcalophilus, Bacillus pumilus, Bacillus lentus, Bacillus amyloliquefaciens oder Bacillus deramificans T 89.117D (LMG P-13056) ausgewählt.
Gute Resultate wurden erhalten, wenn der Wirt für die Expression der Pullulanase gemäß der vorliegenden Erfindung ein rekombinanter Stamm ist, der von Bacillus licheniformis abgeleitet ist und vorzugsweise der Stamm Bacillus licheniformis SE2 delapl.
Der Stamm Becillus licheniformis SE2 wurde am 21. Juni 1993 bei der BELGIAN COORDINATED COLLECTIONS OF MICROORGANISMS (LMG culture collectin, Gand, Belgien) in Übereinstimmung mit dem Budapester Vertrag unter der Nummer LMG P-14034 hinterlegt.
Der so von Bacillus lichiniformis SE2 erhaltene, transformierte Stamm SE2 delapl unterscheidet sich vom Mutterstamm nur dadurch, daß er in seinem Chromosom nicht die DNA-Sequenz enthält, welche für die reife Protease codiert.
Die Erfindung betrifft auch eine Pullulanase, welche auf heterologe Weise durch einen Mikroorganismus der Gattung Bacillus hergestellt ist, welcher ein Gen enthält, das für eine alkalische Protease codiert, wenn er sich im Wildzustand befindet. Vorzugsweise ist dieser Mikroorganismus ein Stamm von Bacillus licheniformis, welcher das DNA-Molekül umfaßt, das die Nucleotidsequenz umfaßt, welche für die Pullulanase von Bacillus deramificans T 89.117D codiert. In bevorzugter Weise wurde das Gen, das für die alkalische Protease codiert, von diesem Bacillustamm deletiert. Dieser Stamm ist vorzugsweise der Stamm von Bacillus licheniformis SE2 delapl.
Unter auf heterologe Weise hergestellt versteht man eine Herstellung, welche nicht durch den natürlichen Mikroorganismus bewirkt wird, das heißt, den Mikroorganismus, welcher im Wildzustand das Gen enthält, welches für die Pullulanase codiert.
Die Pullulanase gemäß der Erfindung besitzt vielfache Absatzgebiete in verschiedenen Industriezweigen, wie beispielsweise der Nahrungsmittelindustrie, der pharmazeutischen Industrie oder der chemischen Industrie.
Die Pullulanase kann insbesondere bei der Bäckerei als "Anti-Staling" verwendet werden, d. h. als Zusatz, um ein Altbackenwerden von Brot während seiner Konservierung zu vermeiden, oder im Brauereiwesen, während der Herstellung von Bieren mit niedrigem Kaloriengehalt.
Die Pullulanase kann auch während der Herstellung von kalorienarmen Lebensmitteln verwendet werden, in welchen Amylose als Ersatz für Fette verwendet wird.
Die Pullulanase kann auch zur Hydrolyse von Amylopektin und zur Bildung von Oligosacchariden, ausgehend von diesem Amylopektin, verwendet werden.
Die Pullulanase kann auch zur Bildung von Tetraholosiden, ausgehend von Maltose, verwendet werden.
Die Pullulanase kann auch zur Kondensierung von Mono- oder Oligosacchariden unter Bildung von Bindungen vom α-1,6-Typ verwendet werden.
Die Pullulanase kann beispielsweise zum Klären von Fruchtsäften verwendet werden.
Die Pullulanase kann zur Verflüssigung von Amidon verwendet werden.
Für Anwendungen im Lebensmittelbereich kann die Pullulanase an einem Träger immobilisiert sein. Die Immobilisierungsverfahren von Enzymen sind dem Fachmann gut bekannt.
Die Pullulanase gemäß der Erfindung eignet sich insbesondere gut für die Behandlung von Amidon und Pullulan.
Die Erfindung betrifft die Verwendung von Pullulanase zur Verzuckerung von verflüssigtem Amidon.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Verwendung der Pullulanase während eines Verfahrens zum Abbau von Amidon oder von teilweise hydrolysiertem Amidon, das eine Stufe der Verzuckerung von Amidon oder teilweise hydrolysiertem Amidon in Gegenwart einer Pullulanase umfaßt. Im allgemeinen wird dieses Verfahren in Gegenwart eines oder mehrerer weiterer Enzyme durchgeführt, wie Glucoamylase, α- Amylase, β-Amylase, α-Glucosidase oder anderen verzuckernden Enzymen.
Unter den gegebenen biochemischen Eigenschaften erlaubt die Pullulanase der vorliegenden Erfindung, die Verzuckerungsstufe unter stark sauren Bedingungen durchzuführen, d. h. bis wenigstens zu einem pH-Wert von 3,9. Dieser pH-Wert ist saurer als jener, welcher für die bekannten Pullulanasen akzeptabel ist.
Unter den gegebenen biochemischen Eigenschaften erlaubt die Pullulanase der vorliegenden Erfindung; die Verzuckerungsstufe bei relativ hohen Temperaturen durchzuführen, d. h. bis zu wenigstens einer Temperatur von 65ºC.
Die Zugabe der Pullulanase der vorliegenden Erfindung zum Verzuckerungsmedium ermöglicht es, den Glucosegehalt in der erhaltenen Endzusammensetzung zu erhöhen und demnach die Ausbeute der Umsetzung zu erhöhen.
Des weiteren erlaubt die Zugabe der Pullulanase der vorliegenden Erfindung zum Verzuckerungsmedium eine Erniedrigung der Verzuckerungsdauer.
Die Pullulanase der vorliegenden Erfindung erlaubt es, einen erhöhten Umwandlungsgrad von Amidon zu erhalten.
Darüber hinaus ist es während der Verzuckerungsstufe möglich, einen großen Teil (wenigstens 60%) der Glucoamylase, welche normalerweise eingesetzt wird, durch die Pullulanase der vorliegenden Erfindung zu ersetzen, und das ohne die Ausbeute an Glucose zu beeinflussen. Dieser Ersatz ist besonders vorteilhaft, tatsächlich ermöglicht er es, die Menge an gewöhnlich erhaltenen Nebenprodukten deutlich zu reduzieren. Liegt die Glucoamylase in geringem Verhältnis vor, ist sie unfähig, die Synthese von Oligosacchariden (mit α-1,6-Bindungen) ausgehend von Glucose zu katalysieren; unter den normalen Bedingungen katalysiert die Glucoamylase diese inverse Reaktion der Synthese von Oligosacchariden, wenn erhöhte Konzentrationen von Dextrose im Verzuckerungsmedium erhalten werden, was den Umwandlungsgrad von Amidon beschränkt.
Darüber hinaus erlaubt es die Pullulanase der vorliegenden Erfindung, ein konzentriertes Verzuckerungsmedium einzusetzen, d. h. ein Medium mit einem erhöhten Gehalt an verflüssigtem Amidon. Das ist aus wirtschaftlichen Gründen vorteilhaft, tatsächlich erlaubt es, die anfänglichen Verdampfungen zu verringern.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch enzymatische Zusammensetzungen, welche die Pullulanase gemäß der Erfindung umfassen.
Die Zusammensetzungen, welche die Pullulanase der vorliegenden Erfindung umfassen, können in fester oder flüssiger Form verwendet werden.
Die Pullulanase wird gemäß den vorgesehenen Anwendungsbereichen formuliert. Stabilisatoren und Konservierungsmittel können ebenfalls den enzymatischen Zusammensetzungen zugefügt werden, welche die Pullulanase gemäß der vorliegenden Erfindung umfassen. Beispielsweise kann man die Pullulanase durch Zugabe von Propylenglycol, Ethylenglycol, Glycerin, Amidon, Pullulan, eines Zuckers, wie Glucose oder Sorbitol, eines Salzes, wie Natriumchlorid, Calciumchlorid, Kaliumsorbat oder Natriumbenzoat oder einer Mischung von zwei oder mehreren dieser Produkte stabilisieren. Gute Ergebnisse wurden mit Propylenglycol erhalten. Gute Ergebnisse wurden mit einer Mischung von Amidon, Natriumbenzoat und Kaliumsorbat erhalten.
Die enzymatischen Zusammensetzungen gemäß der Erfindung können auch, zusätzlich zu Pullulanase eines oder mehrere weitere Enzyme umfassen. Solche Enzyme sind insbesondere Kohlehydrat-Hydrolasen, wie beispielsweise die Glucoamylasen, α-Amylase, β-Amylase, α-Glucosidase, Isoamylase, Cyclomaltodextrin-Glucotransferase, β-Glucanase, Glucose- Isomerase, verzuckernde Enzyme, Enzyme, welche glucosidische Bindungen brechen oder Mischungen von zwei oder mehreren davon.
Die vorliegende Erfindung betrifft vorzugsweise eine enzymatische Zusammensetzung, welche eine Glucoamylase und eine Pullulanase umfaßt.
Die Fig. 1 zeigt die Restriktionskarte von Plasmid pUBDEBR1.
Die Fig. 2 zeigt die Restriktionskarte von Plamid LD1.
Die Fig. 3 zeigt die Restriktionskarte von Plasmid pUBCDEBR11DNSI.
Die Fig. 4 (Fig. 4a bis 4f) zeigt die Nucleotidsequenz (SEQ ID Nr: 10), welche für die reife Pullulanase codiert, sowie ihre Übersetzung in Aminosäuren (SEQ ID Nr: 11).
Die Fig. 5 (Fig. 5a bis 5g) zeigt die Nucleotidsequenz (SEQ ID Nr: 8) des DNA-Fragments von der BamHI-Stelle an bis zur PstI-Stelle des Plasmids pUBCDEBRAlI sowie die Übersetzung in Aminosäuren (SEQ ID Nr: 9) der Signalsequenzen und der Elternpullulanase. Die Nucleotide, welche nicht mit Bestimmtheit festgestellt wurden, wurden durch das Symbol N dargestellt.
Die Bedeutung der Symbole und Abkürzungen, welche in den Figuren verwendet wird, ist in der folgenden Tabelle zusammengefaßt.
Symbol Abkürzung Bedeutung
ORIEC Ursprung der Replikation in E. coli
REP für die Replikation erforderliches Protein
ORI+ Ursprung der Replikation von brin +
ORI- Ursprung der Replikation von brin -
KMR die Resistenz auf Kanamycin einbringendes Gen
BLMR die Resistenz auf Bleomycin einbringendes Gen
AMPR die Resistenz auf Ampicillin einbringendes Gen
PP Pre-pro-Sequenz
BLIAPR Sequenz, codierend für die alkalische Protease von B. licheniformis
5'BLIAPR Sequenz in 5'-Stellung, oberhalb der für die alkalische Protease von B. licheniformis codierenden Sequenz
3'BLIAPR Sequenz in 3'-Stellung, unterhalb der für die alkalische Protease von B. licheniformis codierenden Sequenz
BDEPUL Sequenz, codierend für die Pullulanase von B. deramificans
Die vorliegende Erfindung wird durch die folgenden Beispiele veranschaulicht.

Beispiel 1

Isolierung und Charakterisierung des Stammes von Bacillus deramificans

Der Stamm von Bacillus deramificans T 89.117D wurde vom Sol über einem gelierten Nährmedium isoliert und auf seine Kapazität zum Abbau eines gefärbten Derivates von Pullulan, das unter dem Namen AZCL-Pullulan bekannt ist und durch die Gesellschaft MEGAZYME verkauft wird, selektioniert.
Dieser Stamm wurde bei 37ºC in dem Wachstumsmedium MYE gezüchtet, dessen Zusammensetzung die folgende ist:
KH&sub2;PO&sub3; 33 mM; K&sub2;HPO&sub4;·3H&sub2;O 6 mM; (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; 45 mM; MgCl&sub2;·6H&sub2;O 1 mM, CaCl&sub2;·2H&sub2;O l mM; Hefeextrakt 0,5% (Gewicht/Volumen); Glucose 0,5% (Gewicht/Volumen). Der pH-Wert des Mediums wird auf pH 4,5 mit H&sub3;PO&sub4; eingestellt.
Das gelierte Medium (MYE/Agar) enthält 2% (Gewicht/Volumen) Agar.
Der Stamm der vorliegenden Erfindung wurde durch seine biochemischen Eigenschaften identifiziert: Grampositive Bakterie, aerob, Stäbchenform, Endosporen bildebd. Es gehört damit zur Gattung Bacillus.
Die vegetativen Zellen dieses Stammes weisen in Kultur über dem MYE-Medium bei 37ºC eine Form von Bakterien mit einer Größe von 0,7 · 3,0-3,5 um auf. Die Mobilität der vegetativen Zellen ist gering.
Nach einem dreitätigen Wachstum bei 37ºC über dem MYE-Medium zeigt die mikroskopische Beobachtung die Anwesenheit von leicht deformierten (sub)terminalen Sporenkapseln in elliptischer Form.
Der Katalasetest ist schwach positiv in Gegenwart von 10% Wasserstoffperoxid. Der Oxidasetest ist positiv in Gegenwart von 1% Tetramethyl-1,4-phenylendiammoniumdichlorid.
Dieser Stamm ist aerob, d. h. er entwickelt sich unter aerobiotischen Bedingungen. Er entwickelt sich nicht unter anaeroben Bedingungen, d. h. unter einer Atmosphäre von 84% (v/v) N2, 8% (v/v) CO&sub2;, 8% (v/v) H&sub2; bei 37ºC, im Gegensatz dazu entwickelt er sich unter mikroanaerobiotischen Bedingungen, d. h. unter einer Atmosphäre von 82,5% (v/v) N2, 6% (v/v) O&sub2;, 7,5% (v/v) H&sub2;, 4% (v/v) CO&sub2; bei 37ºC. Die Abkürzung % (v/v) stellt einen in Volumen pro Volumen ausgedrückten Prozentsatz dar.
Dieser Stamm ist nicht thermophil. Er zeigt eine normale Entwicklung nach Inkubation in MYE-Medium bei 20ºC, 30ºC, 37ºC und 45ºC, im Gegensatz dazu entwickelt er sich nicht bei 50ºC und 55ºC.·Er zeigt eine normale Entwicklung nach Inkubation in mit dem Phosphatpuffer auf folgende ph-Werte: 4,0, 4,5, 5,0 und 5,5 gepuffertem MYE-Medium, im Gegensatz dazu entwickelt er sich nicht bei pH 7,0. Er zeigt eine normale Entwicklung nach Inkubation in MYE-Medium in Gegenwart von NaCl bei Konzentrationen von 2,0% (p/v) und 3,5% (p/v), zeigt eine schwache Entwicklung in Gegenwart von 5,0% (p/v) NaCl und entwickelt sich nicht in Gegenwart von 7,0% (p/v) NaCl. Die Abkürzung % (p/v) stellt einen Prozentsatz, ausgedrückt in Gewicht pro Volumen dar.
Dieser Stamm hydrolysiert Casein nicht: tatsächlich kann keine Lysezone nach mehr als 2 Wochen Inkubation bei 37ºC beobachtet werden. Er zersetzt Tyrosin schwach, produziert kein Acetoin aus Pyruvat und reduziert Nitrat nicht zu Nitrit oder N&sub2;.
Der Stamm von Bacillus deramificans T 89.117D gemäß der Erfindung ist taxonomisch vom Stamm vom Bacillus acidopullulyticus verschieden, welcher in dem europäischen Patent 0 063 909 beschrieben ist, und dem Stamm von Bacillus naganoensis, welcher in dem US-Patent 5,055,403 beschrieben ist. Der Stamm von Bacillus deramificans T 89.117D zeigt ein Wachstum bei einem pH-Wert, welcher zwischen 4,7 und 5, 5 enthalten ist, zeigt kein Wachstum bei einem pH-Wert von 7,0, entwickelt sich in Gegenwart von 3,5% (p/v) NaCl, zersetzt Tyrosin und reduziert Nitrat nicht zu Nitrit.
Der Stamm von Bacillus deramificans T 89.117D wurde bei der BELGIAN COORDINATED COLLECTIONS OF MICROORGANISMS (LMG culture collection) unter der Nummer LMG P-13056 hinterlegt.

Beispiel 2

Herstellung von Pullulanase

Der Stamm Bacillus deramificans T 89.117D wird in einem flüssigen Medium (MYA) gezüchtet, dessen Zusammensetzung identisch mit dem MYE-Medium ist, mit Ausnahme des Gehaltes an Hefeextrakt und durch Amidon ersetzte Glucose, d. h.
Hefeextrakt 2,5% (p/v)
Amidon von Kartoffel 2,5% (p/v)
Die Kultur bzw. Zucht wird unter Rühren mit einer wirksamen Belüftung bei einer Temperatur von 37ºC durchgeführt.
Nach 68 Stunden Kultivieren trennt man die Pullulanase ab und die zelluläre Biomasse durch Zentrifugieren (5000 Umdrehungen pro Minute, während 30 Minuten, BECKMAN JA-10). Die durch den Stamm Bacillus deramificans T 89.117D erzeugte Pullulanase ist extrazellulär.
Dann konzentriert man die Pullulanase durch Ultrafiltration (Membran AMICON S10 Y10), um eine wäßrige, konzentrierte Lösung von Pullulanase zu erhalten.
Man mißt die enzymatische Aktivität der erhaltenen Lösung.
Eine enzymatische Einheit der Pullulanase (PUN) wird als die Menge Enzym definiert, welche bei einem pH-Wert von 4, 5 und einer Temperatur von 60ºC und in Gegenwart von Pullulan die Freisetzung von reduzierenden Zuckern im Verhältnis von 1 uM Äquivalent Glucose pro Minute katalysiert.
Die Messung der enzymatischen Aktivität von Pullulanase wird gemäß der folgenden Vorschrift durchgeführt. 1 ml einer Pullulanlösung von 1% in einem Acetatpuffer von 50 mM bei pH 4, 5 wird bei 60ºC während 10 Minuten inkubiert. 0,1 ml einer Pullulanaselösung, welche einer Aktivität entspricht, die zwischen 0,2 und 1 PUN/ml enthalten ist, wird zugefügt. Die Reaktion wird nach 15 Minuten durch Zugabe von 0,4 ml NaOH von 0,5 M gestoppt. Die Dosierung von freigesetztem Reduktionszucker erfolgt nach der Methode von SOMOGYI-NELSON [J. Biol. Chem., 153 (1944), S. 375-380; J. Biol. Chem., 160 (1945), S. 61-68] und wie in den weiteren Beispielen dieser Anmeldung.
Ein zweites Verfahren wird verwendet, um die Dosierung der Pullulanase durchzuführen. Die enzymatische Reaktion in Gegenwart von Pullulan wird gemäß den Versuchsbedingungen durchgeführt, wird dann durch Zugabe von Schwefelsäure angehalten (0,1 N). Die Produkte der Pullulan-Hydrolyse werden dann einer HPLC-Chromatographie (HPX-87H-Säule von BIO-RAD; die mobile Phase besteht aus 10 mM H&sub2;SO&sub4;) unterworfen, um die verschiedenen Bestandteile zu trennen. Die Menge von gebildeter Maltotriose wird durch Messung der Oberfläche des erhaltenen Peaks bestimmt.
Die Abbauaktivität, d. h. die Hydrolyse von glycosidischen α-1,6-Bindungen, welche in Amylopektin vorhanden sind, kann durch Erhöhung der hervorgerufenen Blaufärbung in Gegenwart von Iod durch Freisetzung von Amylase aus Amylopektin quantifiziert werden.
Die Messung der abbauenden enzymatischen Aktivität wird gemäß der folgenden Vorschrift durchgeführt. 0,4 ml einer 1%igen Amylopektinlösung, welche einen 50 mM Acetatpuffer bei pH 4,5 enthält, wird bei 60ºC 10 Minuten inkubiert. Die Reaktion wird durch Zugabe von 0,2 ml Pullulanase eingeleitet und nach 30 Minuten durch Zugabe von 0,4 ml 0,3 M HCl angehalten. 0,8 ml einer Iodlösung von 0,025% (v/v) wird dann zu 0,2 ml dieser Reaktionsmischung zugegeben und die optische Dichte wird bei 565 nm gemessen.
Um die Pullulanase zu reinigen, diafiltriert man die konzentrierte wäßrige Lösung von Pullulanase durch 6 · 500 ml einer wäßrigen Lösung von 9 g/l NaCl und man stellt den pH- Wert der so erhaltenen wäßrigen Lösung auf pH 3,5 durch Zugabe von 25%iger (v/v) 1-Ici bei Raumtemperatur ein. Die Diafiltration besteht im Mischen der Pullulanaselösung mit der NaCl-Lösung und dann dem Ultrafiltrieren der erhaltenen Lösung.
Der erhaltene Niederschlag wird durch Zentrifugieren (5000 Umdrehungen pro Minute während 30 Minuten, BECKMAN JA-10) entfernt, man gewinnt den Zentrifugationsüberstand. Der pH- Wert dieses Überstandes wird auf pH 6,0 durch Zugabe von 5 M NaOH eingestellt. Der erhaltene Niederschlag wird durch Zentrifugieren entfernt.
Man gewinnt den Überstand der Zentrifugierung, den man auf 55ºC während 15 Minuten erhitzt.
Der gebildete Niederschlag wird erneut durch Zentrifugieren (5000 Umdrehungen pro Minute während 30 Minuten, BECKMAN JA-10) entfernt. Man gewinnt den Überstand der Zentrifugierung.
Diesem Überstand fügt man Aceton in einer Endkonzentration von 60% (v/v) zu. Die gebildete Suspension wird während zwei Stunden auf 4ºC gebracht. Der bei 4ºC gebildete Niederschlag wird in einem MES-Puffer (2-(N-Morpholin)ethansulfonsäure) von 20 mM, CaCl&sub2; l mM (pH 6,0) in Lösung gebracht. Diese Pullulanaselösung wird als A-Lösung bezeichnet.
Man konzentriert erneut diese A-Lösung durch Ionenaustauschchromatographie, um sie zu reinigen. Eine Säule von etwa 20 ml innerem Volumen, welche unter der Marke S- SEPHAROSE HP H&sub1; LOAD 16/10 verkauft wird, wird im Voraus durch einen Puffer aus CH&sub3;COONa von 50 mM, 100 mM NaCl (pH 4,0) mit einem Durchsatz von 5 ml/min äquilibriert. Die A- Lösung wird 10mal in dem Acetatpuffer verdünnt und 15 ml dieser verdünnten Lösung werden auf die Säule aufgebracht. Eine isokratische Phase wird durch Eluieren von 80 ml Acetatpuffer (100 mM NaCl) mit nachfolgendem Eluieren durch 200 ml Acetatpüffer von 50 mM (pH = 4,0) mit einem linearen NaCl-Gradienten (100-500 mM) sichergestellt.
Die Pullulanase-Aktivität wird in jeder Fraktion gemessen. Die aktivsten Fraktionen werden zu einer Lösung gesammelt, die mit B bezeichnet wird (wobei 12 ml 0,025 mg/ml Proteine mit einer Pullulanase-Aktivität von 0,7 PUN/ml enthalten).
Ausgehend von dieser B-Lösung führt man eine Präzipitierung durch Aceton bei einer Endkonzentration von 80% (v/v) durch. Der erhaltene Niederschlag wird in einem Volumen von 0,6 ml 20 mM MES-Puffer, 1 mM CaCl&sub2; (pH 6,0) gelöst.
Diese Pullulanase-Lösung wird C-Lösung bezeichnet.
Die C-Lösung hat einen Proteingehalt von 0,4 mg/ml, eine enzymatische Aktivität von 12 PUN/ml und eine spezifische Aktivität von 30 PUN/mg.
Die Ergebnisse sind in der Tabelle 1 zusammengefaßt. TABELLE 1
Die Tabelle 1 zeigt, daß diese Reinigungsstufe die spezifische Pullulanaseaktivität der enzymatischen Lösung um einen Faktor 10 erhöht hat.
Die Abbauaktivität, d. h. die Aktivität der Hydrolyse von α- 1,6-Bindungen in Amylopektin, der Pullulanase wurde ebenfalls wie oben beschrieben durch Einfärben mit Iod nach Hydrolyse von Amylopektin gemessen. Die Ergebnisse zeigen, daß die Abbauaktivität ebenfalls erhöht wurde.

Beispiel 3

Bestimmung des Molekulargewichtes

Man bringt die C-Lösung, welche man im Beispiel 2 erhalten hat, mittels Trichloressigsäure (10% (v/v) Endkonzentration) zum Ausfällen. Der erhaltene Niederschlag wird in einem Puffer, bestehend aus 10 mM TRIS/HCl (pH = 8,0), 1 mM EDTA, 2,5% (w/v) SDS (Natriumdodecylsulfat), 5% (v/v) (3- Mercaptoethanol und 0,01% (p/v) Bromphenolblau, erneut aufgenommen.
4 ul des in dem Puffer wiederaufgenommenen Präzipitates werden auf ein Polyacrylamid-Gel aufgetragen. Das verwendete Gelsystem ist das System PHASTSYSTEM von PHARMACIA LKB BIOTECHNOLOGY, mit Gelen, welche einen Polyacrylamid-Gradienten von 10-15% (v/v) in Gegenwart von SDS enthalten. Die Elektrophoresebedingungen sind die vom Lieferanten vorgeschriebenen. Ein Anfärben des Geles mit Coomassie-Blau läßt ein Polypeptid eines Molargewichtes von etwa 105 KDalton erscheinen, das der Hauptbestandteil der C-Lösung ist.
Das wird durch die Bewertung bestätigt, welche ausgehend von der Aminosäuresequenz der reifen Form der Pullulanase (ohne die Signalsequenz) durchgeführt wird, wie in Beispiel 4 beschrieben ist, man folgert durch Berechnung ein Molekulargewicht von 102 KDalton.

Beispiel 4

1. Bestimmung der N-terminalen Sequenz

Ausgehend von dem in Beispiel 3 beschriebenen Gel identifiziert man die N-terminale Sequenz der Pullulanase gemäß der Technik, welche von Bauw et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, S. 4806-4810 (1987) beschrieben ist.
Diese Sequenz (SEQ ID Nr: 1), die so bestimmt ist, ist die folgende in Richtung Amin-/Carboxylgruppe und von links nach rechts:
Asp Gly Asn Thr Thr Thr Ile Ile Val His Tyr Phe Cys Pro Ala Gly Asp Tyr Gln Pro

2. Bestimmung der Aminosäuresequenz der Pullulanase

Die Nucleotidsequenz (SEQ ID Nr: 8) des BamHI-PstI-Fragmentes von etwa 4,5 Kb des Plasmides pUBCDEBR11, welches das für die Pullulanase codierende Gen enthält, wie in Beispiel 21 erhalten, wurde durch die Methode des Kettenabschlusses unter Verwendung von Dideoxynucleotiden von SANGER et al. (1977), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, S. 5463-5467 bestimmt.
Die synthetischen Oligonucleotide, welche für den Start der Verlängerungsreaktionen durch die T7-DNA-Polymerase verwendet werden, wurden durch die Methode von BEAUCAGE et al., Tetrahedron Letters 22, S. 1859-1882 (1981), synthetisiert. Die Sequenzierung wurde gemäß der Vorschrift, die durch den Lieferanten des Sequenzierungskits (PHARMACIA) angegeben ist, durchgeführt, indem man eine Denaturierung des DNA- Doppelstranges durch Behandeln mit NaOH ausführt.
Die Sequenzierungsstrategie ist von SAMBROOK, 1989, 5. 13.15 und 13.17 beschrieben. Die Polyacrylamidgele für die Sequenzierung wurden gemäß der durch SAMBROOK 1989, S. 13.45-13.58 beschriebenen Technik durchgeführt.
Die Nucleotidsequenz (SEQ ID Nr: 8) des DNA-Fragmentes von der BamHI-Stelle bis zur PstI-Stelle von pUBCDEBR11 sowie die Übersetzung in Aminosäuren (SEQ ID Nr: 9) der Signalsequenzen und reifen Sequenzen der Pullulanase wurden identifiziert (Fig. 5). Die Nucleotide, welche nicht mit Sicherheit bestimmt wurden, wurden durch das Symbol N dargestellt.
Die Analyse dieser Sequenz zeigt die Anwesenheit einer offenen Lesephase, welche für die Pullulanase codiert. Man identifiziert die Sequenz von Nucleotiden, welche für die reife Pullulanase codiert (SEQ ID Nr: 10). Man bestimmt so die Sequenz an Aminosäuren der reifen Pullulanase (SEQ ID Nr: 11) durch Übersetzen dieser offenen Lesephase. Die Fig. 4 zeigt die Nucleotidsequenz, welche für die reife Pullulanase codiert sowie ihre Übersetzung in Aminosäuren.
Es wird bestätigt, daß die N-terminale Sequenz, welche experimentell ausgehend von dem oben beschriebenen Protein bestimmt wurde, jener entspricht, welche ausgehend von der DNA-Sequenz übersetzt wurde.
Das zeigt, daß die Pullulanase in Form eines Vorläufers synthetisiert wurde, welcher eine zusätzliche Sequenz von 29 Aminosäuren (Vorsequenz) enthält. Diese Sequenz von 29 Aminosäuren wird identifiziert (SEQ ID Nr: 12), sowie die entsprechende Nucleotidsequenz (SEQ ID Nr: 13). Diese zusätzliche Sequenz zeigt die typischen Eigenschaften einer Sekretionssignalsequenz, welche während dem Exportieren des Enzyms zum Äußeren der Zelle eliminiert wird (Freudl, (1992), Journal of Biotechnology, 23, S. 231-240).
Diese Sequenz von 29 Aminosüuren ist die folgende:

Beispiel 5

Verteilung von Aminosäuren

Die Verteilung von Aminosäuren der reifen Pullulanase, welche ausgehend von der Aminosäuresequenz der Pullulanase (Beispiel 4) bestimmt wird, ist in der Tabelle 2 zusammengefaßt. TABELLE 2

Beispiel 6

Bestimmung des isoelektrischen Punktes

Man führt an der C-Lösung, wie sie im Beispiel 2 erhalten wurde, eine IEF-Elektrophorese (iso electro focusing) in einem pH-Gradienten zwischen 4,0 bis 6,5 durch.
Man bringt ein 0,12 Pullulanase-Einheiten entsprechendes Volumen dreifach auf ein Gel auf. Nach Migration wird ein Drittel mit Coomassie-Blau angefärbt.
Die zwei weiteren Teile des Geles werden durch Agargele (1 Gew.-% /Volumen), die mit 100 mM CH&sub3;COONa, 1 mM CaCl&sub2;, 1 mM MgCl&sub2; (pH 4,5) gepuffert sind, welche jeweils 0,1% (p/v) AZCL-Pullulan oder 1% (p/v) Amylopektin enthalten, zurückgewonnen. Die Gesamtheit (Acrylamidgel-Agargel), die so erhalten wurde, wird dann bei 60ºC in feuchtigkeitsgesättigter Atmosphäre während 16 Stunden inkubiert. Das wiedergewonnene Gel des Überstandes von Amylopektin wird dann bei Raumtemperatur in einer Lösung inkubiert, welche 3 mM I&sub2;, 50 mM KI enthält, um die Abbauaktivität durch Auftreten der Blaufärbung zu zeigen. Das Aufdecken mit Iod des Amylopektingels zeigt einen dunklen blauen Hof, Zeichen einer Abbauaktivität, an einem isoelektrischen Punkt, welcher zwischen etwa 4,1 und etwa 4,5 für das Enzym der vorliegenden Erfindung enthalten ist. Das Aufdecken der Pullulanase-Aktivität zeigt das gleiche Ergebnis.
Das beweist, daß die Pullulanase der vorliegenden Erfindung eine Pullulanase-Aktivität und eine Abbauaktivität zeigt.
Das beweist, daß die Pullulanase der vorliegenden Erfindung die Bindungen vom α-1,6-Typ ebensogut bei Pullulan wie bei Amylopektin hydrolysieren kann. Das beweist eine schwache Spezifität der Pullulanase der vorliegenden Erfindung, gegenüber ihrem Substrat.
Das wird durch die Bewertung bestätigt, welche ausgehend von der Aminosäuresequenz der reifen Form der Pullulanase (ohne die Signalsequenz) durchgeführt wird, wie in Beispiel 4 beschrieben ist, man bestimmt durch Berechnen einen isoelektrischen Punkt von 4,5.

Beispiel 7

Aktivitätsprofil als Funktion des pH-wertes und der Temperatur für die durch den natürlichen Stamm produzierte Pullulanase (Bacillus deramificans)

Man mißt die enzymatische Aktivität der Pullulanase bei verschiedenen Temperaturen (55, 60 und 65ºC) und bei verschiedenen pH-Werten (von 3,25 bis 7) in 50 mM Citrat-Phosphat-Puffer durch die Messung von freigesetzten Reduktionszuckern. Man setzt die C-Lösung der Pullulanase, wie sie in Beispiel 2 erhalten wurde, verdünnt auf etwa 1 PUIT/ml ein.
Die Ergebnisse sind in der Tabelle 3 zusammengefaßt.
Im Verlauf dieses Versuches wurde die maximale enzymatische Aktivität durch Messen der freigesetzten Reduktionszucker für Proben, welche auf einen pH-Wert von etwa 4,3 und auf eine Temperatur von etwa 60ºC eingestellt waren, während 15 Minuten gemessen. Per Definition hat man diesen Proben eine relative enzymatische Aktivität von 100% zugeordnet.
Dieses Beispiel zeigt, daß die Pullulanase gemäß der vorliegenden Erfindung eine optimale enzymatische Aktivität, gemessen bei einer Temperatur von etwa 60ºC in einem pH-Bereich, der zwischen 4,0 und 4,8 enthalten ist, zeigt.
Dieses Beispiel zeigt auch, daß die Pullulanase gemäß der Erfindung eine optimale enzymatische Aktivität, gemessen bei einem pH-Wert von etwa 4,3 in einem Temperaturbereich, der zwischen 55 und 65ºC enthalten ist, zeigt.
Des weiteren zeigt dieses Beispiel, daß die Pullulanase gemäß der Erfindung eine enzymatische Aktivität von mehr als 80% der maximalen enzymatischen Aktivität in einem pH-Bereich, der zwischen etwa 3,8 und etwa 4,9 enthalten ist, zeigt. TABELLE 3

Beispiel 8

Stabilität gegenüber dem pH-Wert der Pullulanase, welche durch den natürlichen Stamm erzeugt ist (Bacillus deramificans)

Man verdünnt die A-Lösung der Pullulanase, wie sie in Beispiel 2 erhalten wurde, so, daß sie eine enzymatische Aktivität von etwa 0,7 PUN/ml entwickelt, in verschiedenen Citrat-Phosphat-Puffern von 100 mM bei pH-Werten, welche zwischen pH 3,0 und 7,0 variieren. Man inkubiert die verschiedenen verdünnten Lösungen, welche die Pullulanase enthalten, während 60 Minuten bei 60ºC.
Dann mißt man die enzymatische Aktivität dieser verschiedenen Lösungen nach Inkubieren während 60 Minuten bei einem pH-Wert von 4,2 bei 60ºC in Gegenwart von 1,6% (Gewicht/Volumen) Pullulan. Die Menge an gebildeter Maltotriose wird durch HPLC-Chromatographie (wie in Beispiel 2 beschrieben ist) gemessen. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 4 zusammengefaßt.
Während dieses Versuches wurde die maximale enzymatische Aktivität für Proben gemessen, welche auf einen pH-Wert von etwa 4,5 und eine Temperatur von etwa 60ºC eingestellt waren. Per Definition hat man so diesen Proben eine relative enzymatische Aktivität von 100% zugeordnet.
Dieses Beispiel zeigt, daß die Pullulanase gemäß der Erfindung in einem großen sauren pH-Bereich stabil ist, tatsächlich zeigt sie eine relative enzymatische Aktivität von wenigstens 85%, gemessen nach einer Inkubation von 60 Minuten bei einer Temperatur von etwa 60ºC in Abwesenheit von Substrat und in einem pH-Bereich, der zwischen etwa 3,5 und etwa 5,8 enthalten ist. Dieses Beispiel zeigt auch, daß sie eine relative enzymatische Aktivität von über 90% zeigt, gemessen in einem pH-Bereich, der zwischen etwa 3,8 und etwa 5 enthalten ist, unter diesen gleichen Bedingungen, und daß sie nur inaktiv bei einem pH-Wert unter oder gleich 3 oder über oder gleich 7 ist.

TABELLE 4

pH relative Aktivität, %
3 0
3,5 90
4 98
4, 5 100
5 96
5,5 92
6 89
6,5 75
7 0

Beispiel 9

Bestimmung der Halbwertszeit der Pullulanase, welche durch den natürlichen Stamm (Bacillus deramificans) erzeugt ist

Man verdünnt die C-Lösung der Pullulanase, wie sie in Beispiel 2 erhalten wurde so, daß sie eine enzymatische Akti vität von etwa 0,7 PUN/ml in einem Natriumacetatpuffer von 100 mM bei einem pH-Wert von 4, 5 entwickelt. Man inkubiert die verdünnte Lösung, welche die Pullulanase enthält, bei 60ºC und Proben werden zu verschiedenen Zeiten entnommen.
Eine Messung der enzymatischen Aktivität durch die Reduktionszucker-Methode (SOMOGYI-Verfahren, oben beschrieben) wird dann durchgeführt.
Im Verlauf dieses Versuches wurde die maximale enzymatische Aktivität für die Probe zur Zeit 0 gemessen. Per Definition hat man dieser Probe eine relative enzymatische Aktivität von 100% zugeordnet.
Die Ergebnisse sind in der Tabelle 5 zusammengefaßt.

TABELLE 5

Zeit, Stunden relative Aktivität, %
0 100
16 76
24 74
40 57
48 54
64 47
Dieses Beispiel zeigt, daß die Pullulanase bei saurem pH- Wert thermostabil ist.
Dieses Beispiel zeigt, daß die Halbwertszeit von Pullulanase etwa 55 Stunden unter diesen Bedingungen beträgt. Tatsächlich zeigt die Pullulanase eine relative enzymatische Aktivität von wenigstens 50%, gemessen nach einer Inkubation von 55 Stunden bei einer Temperatur von etwa 60ºC in einer auf einen pH-Wert von etwa 4, 5 gepufferten Lösung und in Abwesenheit von Substrat.
Dieses Beispiel zeigt des weiteren, daß die Pullulanase gemäß der Erfindung eine relative enzymatische Aktivität von wenigstens 55% zeigt, gemessen nach einer Inkubation von 40 Stunden, bei einer Temperatur von etwa 60ºC, in einer auf einen pH-Wert von etwa 4,5 gepufferten Lösung und in Abwesenheit von Substrat. Dieses Beispiel zeigt auch, daß sie eine relative enzymatische Aktivität von wenigstens 70%, gemessen nach einer Inkubation von 24 Stunden unter den gleichen Bedingungen zeigt.

Beispiel 10 und Beispiel 11R (Vergleich)

Verzuckerung

Man bereitet ein Verzuckerungsmedium, indem man eine Suspension in Wasser von Mais-Amidon bei einer Konzentration von 35 Gew.-% (Gewicht/Gewicht) Trockenmasse Amidon und Calciumchlorid bei einer Konzentration von 0,02% (Gewicht/Volumen) herstellt.
Man verflüssigt diese Mais-Amidon-Suspension in Gegenwart von α-Amylase, bezogen unter der Marke TAKATHERN L-340 von SOLVAY ENZYMES, bei 105ºC, während 5 Minuten bei einem pH- Wert von 6,0.
Man kühlt das so erhaltene verflüssigte Amidon rasch auf eine Temperatur von 95ºC ab und setzt die Hydrolyse während 120 Minuten bei 95ºC unter Rühren fort. In diesem Stadium ist der Hydrolysegrad zwischen 10 und 12 DE enthalten (DE stellt die "Dextrose-Äquivalente"-Einheit dar, d. h. die Reduktionsendzahl, ausgedrückt in Glucoseäquivalenten).
Das so erhaltene verflüssigte Amidon wird auf eine Endkonzentration von 32 g Trockengewicht pro 100 g Verzuckerungsmedium verdünnt.
Man kühlt das erhaltene Verzuckerungsmedium auf eine Temperatur von 60ºC ab.
Man stellt den pH-Wert dieses Verzuckerungsmediums auf verschiedene Werte mit Essigsäure von 3,9 bis 4,8 ein, und man hält ihn während der Verzuckerung konstant.
Man fügt dem Verzuckerungsmedium eine Menge Glucoamylase zu, welche 0,176 DU/g.ds. entspricht (enzymatische Einheit Glucoamylase pro Gramm Trockenmasse des Verzuckerungsmediums), die verwendete Glucoamylase wird unter der Marke DIAZYME L-200 von SOLVAY ENZYMES verkauft.
Für das Beispiel 10 der Erfindung fügt man dem Verzuckerungsmedium auch eine Menge Pullulanase zu, welche 0,075 PUN/g.ds. entspricht, in Form einer konzentrierten wäßrigen Lösung von Pullulanase (A-Lösung), wie sie in Beispiel 2 beschrieben ist.
Das Vergleichsbeispiel 11R wird, wie oben in Beispiel 10 beschrieben ist, durchgeführt, jedoch ohne Zugabe von Pullulanase.
Nach 48 Stunden stellt man die Verzuckerung ein und man analysiert die erhaltenen Produkte durch Chromatographie (wie in Beispiel 2 beschrieben).
Die Ergebnisse sind in der Tabelle 6 zusammengefaßt.
Dieses Beispiel zeigt, daß die Pullulanase der Erfindung bei der Verzuckerung wirksam ist. Die Pullulanase der Erfindung besitzt demnach alle geeigneten Eigenschaften, die mit den tatsächlichen industriellen Bedingungen der Verzuckerung von Amidon kompatibel sind.
Dieses Beispiel zeigt, daß der Umwandlungsgrad von Amidon in Gegenwart der Pullulanase der Erfindung bei verschiede nen pH-Werten, und das bis zu sehr sauren pH-Werten, d. h. wenigstens 3,9, überlegen ist. TABELLE 6
DP2 stellt die Oligosaccharide dar, welche zwei Glucoseeinheiten enthalten (Glucosedimer), DP3 die Oligosaccharide, welche drei Glucoseeinheiten enthalten (Glucosetrimer) DP3 die Oligosaccharide, welche mehr als drei Glucoseeinheiten enthalten.

Beispiel 12 und Beispiel 13R (Vergleich)

Verzuckerung

Man wiederholt das Beispiel 10, jedoch indem man den pH- Wert des Verzuckerungsmediums auf einen pH-Wert von 4,2 festsetzt.
Man fügt dem Verzuckerungsmedium eine Menge von Glucoamylase zu, welche 0,17 DU/g.ds. entspricht (enzymatische Einheit pro g Trockenmasse des Verzuckerungsmediums), die verwendete Glucoamylase wird unter der Marke DIAZYME L-200 von SOLVAY ENZYMES verkauft.
Für Beispiel 12 gemäß der Erfindung fügt man dem Verzuckerungsmedium auch verschiedene Mengen Pullulanase bei, welche jeweils 0,0325 PUNT/g.ds., 0,050 PUN/g.ds., 0,075 PUN/g.ds. und 0,10 PUN/g.ds. entsprechen (enzymatische Einheit Pullulanase pro Gramm Trockenmasse des Verzuckerungsmediums) in Form der konzentrierten wäßrigen Lösung von Pullulanase (Lösung A), wie sie in Beispiel 2 beschrieben ist.
Das Vergleichsbeispiel 13R wird wie oben für Beispiel 12 beschrieben durchgeführt, jedoch ohne Zugabe von Pullulanase. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 7 zusammengefaßt.
Dieses Beispiel zeigt, daß die Menge Pullulanase, welche man einsetzen muß, um eine Erhöhung des Prozentsatzes erzeugter Glucose zu beobachten, unter 0,0325 PUN/g.ds. liegt. TABELLE 7

Beispiel 14

Konstruktion des Plasmides pUBDEBRA1

Das Plasmid pUBDEBR1 (Fig. 1) enthält das Gen, das für die Pullulanase des Stammes Bacillus deramificans T 89.117D unter der Kontrolle seines geeigneten Transkriptionspromotors, der in den Vektor pUB131 eingeführt ist, codiert. Die Konstruktion des Plasmides pUBDEBR1 wird nachfolgend beschrieben.
Die chromosomale DNA wird ausgehend von einer Kultur des Stammes Bacillus deramificans T 89.117D (identifiziert unter der Nummer LMG P-13056) extrahiert und gereinigt.
Dafür wird eine Kultur von 200 ml dieses Bakteriums in flüssigem MYE (Beispiel 1) Medium realisiert.
Wenn diese Kultur bzw. Zucht ausgeführt ist und sich in stationärer Phase befindet, wird sie bei 5000 Umdrehungen pro Minute 10 Minuten zentrifugiert (BECKMAN JA-10-Rotor). Der Bodenstand dieses so erhaltenen Zentrifugats wird in 9 ml Tris-HCl-Puffer (Tris(hydroxymethyl)aminomethan, angesäuert mit HCl) von 0,1 M bei einem pH-Wert von 8, EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure) von 0,1 M, NaCl von 0,15 M, welche 18 mg Lysozym enthält, aufgenommen, die so erhaltene Suspension wird 15 Minuten bei 37ºC inkubiert.
Das so erhaltene Lysat wird dann mit 200 ul einer RNAse- Lösung von 10 mg/ml während 20 Minuten bei 50ºC behandelt. Ein ml einer SDS-Lösung (Natriumdodecylsulfat) von 10% wird dann dem Lysat zugegeben. Dann inkubiert man das Lysat während 30 Minuten bei 70ºC.
Dann wird das Lysat auf etwa 45ºC abgekühlt und man fügt dann 0,5 ml einer Proteinase K-Lösung von 20 mg/ml (vor Zugabe zubereitet) zu.
Das Lysat wird bei 45ºC unter Rühren von Hand bis zum Erhalten einer transparenten Lösung inkubiert.
Ausgehend von dieser transparenten Lösung führt man mehrere Extraktionen mit Phenol unter den Bedingungen und gemäß den Verfahren, welche in Molecular Cloning - a laboratory manual - SAMBROOK, FRITSCH, MANIATIS - 2. Ausgabe, 1989, S. E.3 bis zum Erhalten einer geeigneten Schnittstelle, wie sie dort beschrieben ist, durch.
Die DNA wird mit 20 ml Ethanol gefällt. Der Niederschlag wird durch Zentrifugieren bei 5000 Umdrehungen pro Minute während 5 Minuten gewonnen, dann in Suspension in 2 ml TE- Puffer bei pH 8,0 gebracht (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA bei pH 8,0).
Die so erhaltene DNA wird dann teilweise durch das Restriktionsenzym Sau3AI gespalten. Die Restriktionsbedingungen bei diesem Beispiel und in allen weiteren Beispielen dieser Anmeldung, sind jene, welche durch SAMBROOK et al. (S. 5.28-5.32) beschrieben sind, mit Ausnahme, daß diese Restriktionsbedingungen um den Faktor 10 erhöht sind, um eine Menge DNA zu erhalten, welche ausreichend für die nachfolgende Reinigungsstufe ist.
Das Verhältnis zwischen der eingesetzten DNA-Menge und der Enzymmenge wird eingestellt, um ein Maximum von Fragmenten der Größe zu erhalten, welche zwischen 5 und 10 kpb (kpb: 103 Basenpaare) enthalten ist.
Die Sammlung der so erhaltenen Fragmente wird dann einer Elektrophorese auf Agarosegel (0,8%) wie durch SAMBROOK et al. (S. 6.01-6.19) beschrieben, unterworfen und die Fragmente einer Größe, welche zwischen 5 und 10 kpb enthalten ist, werden isoliert und durch das GENE-CLEAN- Verfahren gereinigt. Sie werden dann mit dem Plasmid pBR322 ligiert, welches von BIOLABS [CLONTECH LABORATORIES (USA), Katalognr. 6210&supmin;¹] verkauft wird, an der BämHI-Stelle geschnitten und wie durch SAMBROOK et al. (S. 1.60-1.61) beschrieben, dephosphoryliert. Das gleiche Verfahren wird bei den weiteren Beispielen verwendet.
Das so erhaltene Ligat wird in Zellen von E. coli MC1061 [CLONTECH LABORATORIES, Katalognr. C-1070-1] durch Elektroporation (SAMBROOK et al., S. 1.75-1.81) transformiert; die transformierten Stämme werden auf Petri-Schalen selektioniert, welche das gelierte LB-Medium (Luria- Bertani) und 100 ug/ml Ampicillin enthalten, nach einem Wachsen bei 37ºC während etwa 18 Stunden. Das LB-Medium ist durch SAMBROOK et al. (S. A.4) beschrieben. Dieses Medium enthält 10 g/l Trypton, 5 g/l Hefeextrakt und 10 g/l Natriumchlorid.
Die erhaltenen Kolonien werden dann auf zwei Schalen gleichen Mediums vermehrt.
Eine der zwei Schalen wird in einem Gelmedium aufgenommen, das 1% (p/v) Agar, 100 mM Natriumacetat (pH 4,5) und 0,1% (p/v) AZCL-Pullulan enthält. Nach Inkubieren bei 60ºC während 18 Stunden wird die Kolonie, welche eine sehr bedeutende Hydrolysezone von AZCL-Pullulan zeigt, gekennzeichnet, und die entsprechende Kolonie wird auf weiteren Replikationsschalen isoliert.
Man erhält so einen Stamm, von dem man das Plasmid extrahiert, das pBRDEBRA3 bezeichnet ist. Das Fragment EcoRI- BamHI von etwa 4,6 Kpb des Plasmides bBRDEBRA3 wird durch doppelte Verdauung des Plasmides pBRDEBRA3 mit BamHI und EcoRI und dann einer Reinigung durch Elektrophorese auf Agarosegel (0,8% w/v) erhalten. Dieses Fragment wird dann mit dem Vektor pUBI31 gebunden (beschrieben in dem europäischen Patent 0 415 296), der vorher einer doppelten Verdauung mit BamHI und EcoRI an der BamHI- und EcoRI-Seite unterworfen wurde, indem man den Stamm Bacillus subtilis PSL1 als Wirt verwendet.
Der Stamm Bacillus subtilis PSL1 kann durch die B. G. S. C.- Sammlung unter der Nummer 1A510 erhalten werden (BACILLUS GENETIC STOCK CENTER, Ohio State University, Vereinigte Staaten).
Das Plasmid pUBDEBR1, das so erhalten wurde, wird ausgehend von transformierten PSL1-Zellen durch die Technik der alkalischen Lyse (SAMBROOK et al., S. 1.25-1.28) erhalten. Die gleiche Technik wird in den weiteren Beispielen verwendet.
Alle Stämme von transformiertem Bacillus subtilis sind geeignet, das Gen von Pullulanase zu exprimieren und die Pullulanase zu sekretieren.
Die transformierten PSL1-Stämme, welche das Plasmid pUBDEBRA1 enthalten, werden erneut auf einer Petrischale aufgetragen, welche das LB-Medium mit 25 ug/ml Kanamycin enthält.
Die erhaltenen Kolonien werden aus einem Überstand von Agarose (1% Gewicht/Volumen) gewonnen, welcher das AZCL-Pullulan (0,1% Gewicht/Volumen) und Natriumacetat (100 mM, pH 4,5) enthält. Nach einer Inkubierung bei 60ºC während 18 Stunden beobachtet man, daß die gesamten Kolonien des transformierten Stammes von einem Hofder Hydrolyse von AZCL-Pullulan umgeben sind.

Beispiel 15

Herstellung des Stammes Bacillus licheniformis SE2 delapl. Identifizierung des endständigen Teiles des Genes der alkalischen Protease des Wirtstammes von Bacillus licheniformis SE2.

Dieses Beispiel betrifft die Identifizierung des endständigen Teiles des Genes der alkalischen Protease des Wirtstammes von Bacillus licheniformis, um das Deletierungplasmid zum Deletieren des genannten Bacillus licheniformis SE2-Genes herzustellen.

1. Extraktion chromsomaler DNA ausgehend von B. licheniformis SE2

Um das Gen der alkalischen Protease der chromosomalen DNA von Bacillus licheniformis 5E2 zu isolieren, extrahiert man zunächst chromosomale DNA gemäß der Methode, welche in Beispiel 14 für das Extrahieren chromosomaler DNA beschrieben ist, mit Ausnahme, daß das Kulturmedium aus LB-Medium besteht und man es reinigt.

2. Identifizierung des C-terminalen Teiles des Genes der alkalischen Protease

Die extrahierte chromosomale DNA wird einer Analyse durch Restriktion unterworfen, einer Analyse, welche in Molecular Cloning - SAMBROOK et al. (S. 1.85) und Molecular Cloning, a laboratory Manual, MANIATIS et al., 1982, Cold Spring Harbor Laboratory, S. 374-379 beschrieben ist. Die ausgehend von dieser Verdauung erhaltenen DNA-Fragmente werden nach ihrer Größe auf einem Agarosegel von 0,8% (Gewicht/Volumen) separiert.
Das Agarosegel wird dann einer Analyse durch die SOUTHERN BLOT-Technik unterworfen (einer Technik, welche von SAMBROOK et al., S. 9.31, beschrieben ist), um die Fragmente zu identifizieren, welche die Nucleotidsequenzen des C-terminalen Teiles des Genes der alkalischen Protease enthalten.
Die konstruierte Sonde, welche für die Hybridisierungen verwendet wird, ist ein synthetisches Oligonucleotid, das dem C-terminalen Teil des Genes der alkalischen Protease entspricht. Die für die Konstruktion des synthetischen Oligonucleotides verwendete Technik ist in BEAUCAGE, S. L. et al. (1981), Tetrahedron Letters, 22 : 1859-1882 beschrieben und wird unter Verwendung von β-Cyanoethylphosphoramidit in einer BIOSEARCH CYCLONE SYNTHESIZER-Apparatur durchgeführt durchgeführt. Die Sequenz des synthetischen Oligonucleotides, welche konstruiert wurde, ist die folgende (SEQ ID Nr: 2):
5' - GGCGGAGCAAGCTTTGTGG - 3'
Diese Ergebnisse zeigen, daß das C-terminale Ende des Genes der alkalischen Protease auf einem PstI-Fragment von etwa 2,7 kpb lokalisiert ist.
Die Hybridisierung mit den DNA-Sonden wird gemäß der Technik durchgeführt, welche in Molecular Cloning - SAMBROOK et al. - S. 9.52-9.55 beschrieben ist. Die gleiche Technik wird in den weiteren Beispielen verwendet.
Die Herstellung der extrahierten, chromosomalen DNA, welche vom Stamm Bacillus lichiniformis SE2 abstammt, wird dann mit dem PstI-Enzym digeriert, und die erhaltenen Fragmente werden gemäß ihrer Größe durch Agarosegel-Elektrophorese (0,8%) separiert.
Die erhaltenen PstI-Fragmente von etwa 2,7 kpb werden auf Gelen extrahiert und durch die "GENE CLEAN"-Technik gereinigt, indem man Glaskugeln einsetzt, welche durch die Société BIO101 (USA) vertrieben werden.
Die PstI-Fragmente von 2,7 kpb werden dann mit dem Plasmid pUCl8 (CLONTECH Laboratories, Nr: 6110-1) liegiert bzw. gebunden(SAMBROOK et al., S. 1.68-1.69), das in-situ mit der Pstl-Stelle digeriert und dephosphoryliert wurde. Das erhaltene Ligat wurde dann in Zellen von Escherichia coli MC1061 durch die CaCl&sub2;-Technik transformiert (SAMBROOK et al., S. 1.82-1.84). Die Technik, welche die Dephosphorylierung der DNA-Fragmente oder die Linearisierung der Vektoren erlaubt, ist von SAMBROOK et al. (S. 1.60-1.61) beschrieben. Die Ligationstechnik wird auch von SAMBROOK et al. (S. 1.68-1.69) beschrieben.
Die transformierten Stämme werden in Petrischalen selektioniert, welche das gelierte LB-Medium enthalten und mit 100 ug/ml Ampicillin überschichtetsind. Die von E. coli MC1061 so erhaltenen, transformierten Stämme werden dann durch Hybridisierung mit markierten synthetischen Oligonucleotiden selektioniert, unter Verwendung der Cterminalen Sonde, welche in dem SOUTHERN-Versuch verwendet wird, und das Plasmid pKCl wird isoliert.
Das synthetische Oligonucleotid wird durch Phosphorylierung mit ATP [y-32P] unter Verwendung von T4-Polynucleotid- Kinase des Phagen T4 unter Befolgung der Technik, welche von SAMBROOK et al. -(S. 11,31-11.33) beschrieben wird, markiert.

3. Identifizierung des N-terminalen Teiles des Genes der alkalischen Protease

Die extrahierte chromosomale DNA wird einer Analyse durch Restriktion unterworfen. Die durch diese Verdauung erhaltenen DNA-Fragmente werden gemäß ihrer Größe auf einem Agarosegel von 0,8% getrennt.
Das Agarosegel wird dann einer SOUTHERN-BLOT-Analyse unterworfen, um die Fragmente zu identifizieren, welche die Nucleotidsequenzen des N-terminalen Teiles des Genes der alkalischen Protease enthalten.
Die Sonde, welche für die Hybridisierung verwendet wird, ist ein synthetisches Oligonucleotid, das dem N-terminalen Teil des Genes der alkalischen Protease entspricht. Die synthetische Oligonucleotidsequenz, welche konstruiert wurde, ist die folgende (SEQ ID Nr: 3):
5' - ATGGCTCCTGGCGCAGGC - 3'
Diese Ergebnisse zeigen, daß der N-terminale Teil des Genes der alkalischen Protease auf dem Fragment Pstl von etwa 5,5 kpb lokalisiert ist und auch auf einem Fragment BclI-PstI von etwa 2 kpb. Dieses Fragment enthält nicht die Restriktionsstellen XbaI, ClaI, Hpal und SphI.
Das extrahierte, chromosomale DNA-Präparat, das vom Stamm Bacillus licheniformis SE 2 abstammt, wird dann mit PstI- Enzym digeriert, und die erhaltenen Fragmente werden nach ihrer Größe durch Elektrophorese auf Agarosegel (0,8%) separiert.
Die erhaltenen Fragmente von etwa 5,5 kpb werden von den Gelen extrahiert und durch die genannte "GENE CLEAN"-Technik gereinigt.
Die PstI-Fragmente von 5, 5 kpb, welche so erhalten wurden, werden dann einer Verdauungsreihe mit BclI, XbaI, ClaI, HpaI und SphI unterworfen. Die so erzeugten DNA-Fragmente werden mit dem Plasmid pMK4 (wie von SULLIVAN et al. beschrieben (1984), Gene 29 : 21-26) ligiert, welche vorab durch BamHI und PstI linearisiert worden sind. Das Plasmid pMK4 kann bei der B. G. S. C. (Bacillus Genetic Stock Center (Ohio State University), Columbus, Ohio, USA) unter der Nummer 1E29 erhalten werden.
Die so erhaltenen Ligate werden dann in Zellen von Escherichia coli MC1061 durch die CaCl&sub2;-Technik transformiert.
Die transformierten Stämme werden auf Petrischalen selektioniert, welche das gelierte LB-Medium enthalten, unter Zusatz von 100 ug/ml Ampicillin. Die so erhaltenen, von E. coli MC1061 abstammenden, transformierten Stämme, werden dann durch Hybridisierung mit markiertem, synthetischem Oligonucleotid selektioniert, indem man die N-terminale Sonde in dem SOUTHERN-Versuch verwendet, und das Plasmid pKP1 wird isoliert.

Beispiel 16

Sequenz der alkalischen Protease

Man bestimmt die Sequenzen der Fragmente, welche in die Plasmide pKP1 und pKC1, ausgehend von der Pstl-Stelle bis zur SacI-Stelle, eingeführt werden, gemäß der Technik, welche durch SAMBROOK et al. (S. 13.15 und 13.17 und Fig. 13.3B) beschrieben ist.

Beispiel 17

Konstruktion des Plasmides pLD1

Das Plasmid pLD1 (Fig. 2) wird zu dem Zweck konstruiert, den Stamm Bacillus licheniformis SE2 delapl herzustellen. Die Konstruktion des Plasmides pLD1 wird nachfolgend beschrieben.
Das Plasmid pKP1, wie es in Beispiel 15 erhalten wurde, ist in E. coli MC1061 instabil. Deshalb wurde das chromosomale DNA-Fragment, das den N-terminalen Teil des Genes der alkalischen Protease von B. lichiniformis 5E2 enthält, in den Vektor pACYC184 (BIOLABS, USA unter der Nummer 401-M) eingeführt. Diese Einführung wird durch Einführen des EcoRI- EcoRI-Fragmentes von 1849 bp des Plasmides pKP1 in die EcoRI-Stelle des Plasmides pACYC184 bewirkt einführt und das Ligat wird verwendet, um die Zellen von E. Coli MC1061 zu transformieren. Das Plasmid pKPN11 wird so erhalten.
Die transformierten Stämme werden auf Petrischalen selektioniert, welche das gelierte LB-Medium unter Zusatz von 12,5 ug/ml Tetracyclin enthalten. Die Orientierung des Fragmentes EcoRI-EcoRI von 1849 bp in dem Plasmid pKPN11 wird durch Restriktionsanalyse bestimmt (SAMBROOK et al. - S. 1.85 und MANIATIS et al. - S. 374-379).
Das Plasmid pKPN12 wird auf folgende Weise erhalten: man entfernt das Fragment Styl-Styl von 1671 pb des Plasmides pKPNll durch Verdauen mit StyI, mit nachfolgendem Ersatz dieses Fragmentes durch die folgende synthetische Doppelstrang-DNA, welche vorab hergestellt worden ist:
5' - CTTG CAGCTC GTTAAC AGATCT - 3' (SEQ ID Nr: 4)
3' - CTCGAG CAATTG TCTAGA GTTC - 5' (SEQ ID Nr: S) (StyI) SacI Hpal Balil (Styl)
Die Verdauung der Plasmide mit den Restriktionsenzymen wird gemäß der Technik durchgeführt, welche von SAMBROOK et al. - 1989 - Kapitel 5.28-5.32 beschrieben ist.
Das vorn Plasmid pUB131 abstammende DNA-Fragment, das für die Resistenz gegen Kanamycin und Bleomycin oder Phleomycin codiert, wurde wie folgt erhalten:
Das Fragment PstI-TaqI von 2666 bp, das die Gene trägt, welche für die Resistenz auf Kanamycin und Bleomycin oder Phleomycin codieren, wird durch Doppelverdauung durch PstI- TaqI des Plasmids pUB131 erhalten. Dieses Fragment wird in die Pstil-AccI-Stellen des Plasmides pBS- (STRATAGENE, USA, unter der Nummer 211202) eingeführt. Man erhält so das Plasmid pBSKMPM.
Während der Herstellung des Plasmides pBSKMPM taucht eine kleine Deletion in der Region der Bindung mit dem Plasmid pBS- auf, was den Verlust der SphI- und PstI-Stellen in dem Plasmid pBSKMPM herbeiführt: Das Plasmid pBSKMPM wird verwendet, um eine Einzelstrang-DNA zu erzeugen, welche eingesetzt wird, um eine gerichtete Mutagenese zu bewirken, damit die zwei synthetischen Nucleotide, deren Smal-Stellen nachfolgend identifiziert werden, eingeführt werden, eine ist aufwärts und die andere abwärts von den auf Kanamycin und Phleomycin resistenten Genen angeordnet.
Die Technik der gesteuerten Mutagenese ist von SAMBROOK et al. - S. 15.74-15.79 beschrieben. Sie verwendet das Mutagenese-Kit, das von BIO-RAD (Nr. 170-3576) verkauft wird.
Die synthetischen Oligonucleotidsequenzen, welche für die Mutagenese eingesetzt werden, sind die folgenden (nämlich die SEQ ID Nr: 6 und SEQ ID Nr: 7):
5' - CATCTAATCTTCAACACCCGGGCCCGTTTGTTGAAC - 3' SmaI
5' - CAAAATAAJAAAAGATACAACCCGGGTCTCTCGTATCTTTTAT - 3' SmaI
Das durch diese Mutagenese in Gegenwart der zwei Oligonucleotide erhaltene Plasmid ist das Plasmid pBSKMPM1. Dieses Plasmid enthält zwei Restriktionsstellen SmaI, welche die DNA-Fragmentisolierung erlauben, das die Gene enthält, welche für die Kanamycin- und Phleomycin-Resistenz codieren.
Das Fragment SmaI-SmaI von 1597 pb des Plasmids pBSKMPM1 wird dann in die SmaI-Stelle des Plasmides pKPN12 eingeführt, das Plasmid pKPN14 wird so erhalten.
Die gute Orientierung des in das Plasmid pKPN14 eingeführten Fragmentes wird bestätigt, indem man eine Selektion über die plasmidischen DNA-Präparate durch Restriktionsanalyse durchführt (SAMBROOK et al. - S. 1.85).
Das DNA-Fragment, das auf dem Plasmid pKC1 vorhanden ist und abwärts der N-terminalen Sequenz der alkalischen Protease lokalisiert ist, wird über das Fragment SacI-HindIII von 1,2 kpb des Plasmides pKCl (wie es in Beispiel 15 erhalten wurde) durch Verdauung zunächst mit HindIII isoliert.
Das von HindIII ausgehende 5'-Ende wird durch Behandeln mit dem Klenow-Fragment von DNA-Polymerase zum rechten Ende verschoben (SAMBROOK et al. - S. F.2-F.3). Die SacI- Restriktion wird dann durchgeführt, um das gewünschte Fragment SacI-HindIII am rechten Ende zu erzeugen. Dieses Fragment witd in die HpaI- und SacI-Stellen des Plasmides pKPN14 eingeführt, unter Erzeugen des Plasmides pLID1.
Alle diese Konstruktionen werden durch Transformieren des Stammes E. coli MC1061 in Gegenwart von Tetracyclin (12 ug/ml) durchgeführt, für die Selektion der transformierten Stämme.
Ein Plasmid, das zur Vermehrung in B. subtilis und in B. lichiniformis fähig ist, wird ausgehend vom Plasmid pLID1 konstruiert, indem die Replikations-Funktionen von E. coli ersetzt werden, welche durch das Fragment BglII-BglII von 3623 pb des Plasmids pLIDl getragen werden, durch das Fragment, welches die Replikationsfunktionen von Bacillus trägt, das Fragment BglII-BamHI von 2238 pb, isoliert ausgehend von Plasmid pUB131.
Dieser Ersatz von Replikationsfunktionen von E. coli durch jene von Bacillus wurden unter vorheriges Isolieren des Fragmentes BglII-BglII von 3,6 kpb ausgehend von Plasmid pLID1 durch Verdauen von Plasmid pLIDl mit BgIII und BamHI bewirkt. Eine zusätzliche BamHI-Verdauung wurde erforderlich, tatsächlich würde eine BglII-Verdauung alleine nur in Fragmenten identischer Größe resultieren, welche nicht durch Elektrophorese auf Agarosegel separiert werden könnten. Das Fragment BglII-BglII von 3,6 kpb wird dann in dem Stamm Bacillus subtilis 5E3 in dem Fragment BglII-BamHI von 2238 bp, welche vom Plasmid pUB131 isoliert worden sind, unter Erzeugung des Plasmides pLD1 (Fig. 2) kloniert.
Der Stamm von Bacillus subtilis 5E3 wurde am 21. Juni 1993 bei der BELGIAN COORDINATED COLLECTIONS OF MICROORGANISMS in Übereinstimmung mit dem Budapester Vertrag unter der Nummer LMG P-14035 hinterlegt.

Beispiel 18

Konstruktion des Bacillus licheniformis SE2 delapl

Die in der chromosomalen DNA des Stammes Bacillus licheniformis SE2 gewünschten Modifikationen werden durch Techniken erhalten, welche auf der homologen Rekombination basieren. Die Modifikationen werden durchgeführt, um den Stamm Bacillus licheniformis SE2 delapl zu erzeugen.
Das Plasmid PLD1 wird in B. licheniformis SE2 durch die Protoplastentechnik transformiert, welche in Molecular Biological Methods for Bacillus (S. 150-151) beschrieben sind und unter den definierten Bedingungen, mit Ausnahme der folgenden Modifikationen: das Lysozympulver wird zu 5 mg/ml in SMMP anstelle von 1 mg/ml, wie in der Stufe 7 des beschriebenen Verfahrens, zugegeben, das Inkubieren, um eine maximale Lyse mit dem Lysozym zu erhalten, beträgt 60 Minuten, die Regenerierung wird in dem DM3-Medium durchgeführt (beschrieben durch Molecular Biological Methods for Bacillus (Harwood et al., eds), John Wiley and Sons (1990) (S. 150-151), welches 200 ug/ml Kanamycin enthält.
Ein transformierter Stamm wird isoliert und die Restriktionskarte des in diesem Stamm eingeführten Plasmides pLD1 wird bestätigt.
Der transformierte Stamm wird in 50 ml eines LB-Mediums unter Zusatz von 2 g/l Glucose und 25 ug/ml Kanamycin während 18 Stunden bei 37ºC kultiviert.
Eine Kulturprobe (0,1 ml) wird abgenommen und dient zur Inokulierung eines Erlenmeyerkolbens, welcher 50 ml des gleichen LB-Mediums enthält. Die Kultur wird bei 37ºC während 18 Stunden inkubiert. Eine Probe dieser Kultur wird abgenommen und in einer Petri-Schale überprüft, welche das gelierte LB-Medium, ergänzt durch 25 ug/ml Kanamycin und 1% (Gewicht/Volumen) entrahmte Milch (DIFCO), enthält, um die Anwesenheit von Protease festzustellen.
Die Abwesenheit des Hydrolysehofes um die Kolonien, welche ein Wachstum in diesen Petrischalen darstellen, zeigt an, daß diese Kolonien keine alkalische Protease erzeugen können.
Die Kulturen und Tests werden bis zum Erhalten eines Stammes (apr-, Kmr) wiederholt, das heißt, der gleichzeitig nureine alkalische Protease (apr-) erzeugt und resistent auf Kanamycin (Kmr) ist.
Das Plasmid pLD1, das in diesem Stamm von Bacillus licheniformis 5E2 delapl vorhanden ist, wird dann durch Kultivieren in einem Wachstumsmedium bei 37ºC in Abwesenheit von Antibiotika entfernt.
Dieser Stamm wird in 50 ml LB-Medium, ergänzt durch 2 g/l Glucose während 18 Stunden bei 37ºC gezüchtet. Ein Volumen von 0,1 ml dieser Kultur wird abgenommen und dient zur Inokulierung eines weiteren Erlenmeyerkolbens, welcher ebenfalls 50 ml des gleichen Mediums enthält, die Zucht dauert 18 Stunden bei 37ºC. Eine Probe wird dann abgenommen und wird dann auf einer Petri-Schale mit LB-Medium ausgetragen. Die isolierten Kolonien werden dann auf einer zweiten Schale LB-Medium, ergänzt durch 25 ug/ml Kanamycin, ausgetragen. Ein kanamycinempfindlicher Stamm (Kms) wird isoliert. Man bestätigt seinen Phänotyp (apr-, Kms).
Die chromosomale DNA dieses Stammes wird dann isoliert und gereinigt und die Struktur der chromosomalen Deletion wird durch die SOUTHERN BLOT-Technik bestätigt. Die identifi zierten Deletionen sind, was ihre Position anbelangt, korrekt, da sie durch eine homologe Doppelrekombination in den Sequenzen stattgefunden hat, welche aufwärts (5') und abwärts (3') vom Gen der alkalischen Protease liegt.
Der erhaltene Stamm wird B. licheniformis 5E2 delapl genannt. Er produziert keine alkalische Protease.

Beispiel 19

Transformation des Bacillus licheniformis SE2 delap1 mit dem Expressionsvektor

Das Plasmid pUBDEBR1 (Fig. 1), das in Beispiel 14 beschrieben ist, wird von seinem Wirt extrahiert, isoliert und gereinigt (SAMBROOK et al., 1989, S. 1.25-1.28).
Man bereitet eine Kultur des Stammes B. licheniformis 5E2 delapl, wie er in Beispiel 18 beschrieben ist, dann transformiert man diesen Stamm mit dem Plasmid gemäß der Protoplastentechnik, welche von MANIATIS et al. (S. 150- 151) beschrieben ist.
Der transformierte Stamm wird auf einer Petri-Schale selektioniert, isoliert und durch Sieben bzw. Klassieren gereinigt.

Beispiel 20

Herstellung der Pullulanase durch B licheniformis 5E2 delapl (pUBDEBR1)

Der durch das Plasmid pUBDEBR1 transformierte Stamm B. licheniformis 5E2 delapl, wie er in Beispiel 19 erhalten wurde, wird während 17 Stunden bei 37ºC in einem Vorkulturmedium LB, ergänzt von 0,5% (p/v) Glucose und 20 ug/ml Kanamycin, kultiviert bzw. gezüchtet. Diese Vorkultur wird (5% v/v) in 50 ml M2-Medium, ergänzt durch 10 ug/ml Kanamycin, übertragen. Das M2-Medium enthält 30 g Sojamehl, 75 g lösliches Amidon, 2 g Natriumsulfat, 5 mg Magnesiumchlorid, 3 g NaH&sub2;PO&sub4;, 0,2 g KCl2·H&sub2;O und 1000 ml Wasser. Der pH-Wert des M2-Mediums wird auf 5,8 mit 10 N NaOH vor seinem Sterilisieren eingestellt. Die Kultur wird unter Rühren während 80 Stunden bei 37 W inkubiert. Nach 80 Stunden wird die Biomasse durch Zentrifugieren bei 5000 Umdrehungen pro Minute während 10 Minuten entfernt. Der Überstand der Zentrifugation wird aufbewahrt. Man mißt die enzymatische Aktivität von diesem Überstand und stellt eine Pullulanase-Aktivität fest.

Beispiel 21

Konstruktion von Bacillus licheniformis SE2 delap1 (pUBCDEBRA11DNSI) chromosomale Integration

Dieses Beispiel betrifft die Integration des für die Pullulanase codierenden Genes in das Chromosom des Stammes Bacillus licheniformis SE2 delapl.
Dazu wird das Fragment EcoRI-BamHI von 4,6 kb des Plasmides pBRDEBRA3 in die EcoRI- und BamHI-Stellen des Vektors pUBC131 durch Transformieren des Stammes E. coli MC1061 kloniert, wobei so das Plasmid pUBCDEBR11 erzeugt wird.
Der Integrationsvektor pUBCDEBRAlIDNSI (Fig. 3) wird dann konstruiert, indem das Fragment NsiI-NsiI von 886 bp des Plasmids pUBCDEBR11 deletiert wird. Das so erhaltene Plasmid hat die Möglichkeit verloren, sich in Bacillus zu replikieren, durch den Verlust des Fragmentes NsiI von 886 pb.
Um diese Konstruktion durchzuführen, wird das Plasmid pUBCDEBR11 durch das Restriktionsenzym NsiI geschnitten und das Fragment NsiI-NsiI von etwa 9,5 Kbp wird durch Elektrophorese auf Agarosegel gereinigt. Dieses Fragment wird dann einer Ligation unterworfen, um es zu rezyklisieren. Das Ligat wird in E. coli MC1061 transformiert und das Plasmid pUBCDEBRA11DNSI1 wird erhalten.
Um das Plasmid pUBCDEBRA11DNSI1 in den Stamm B. licheniformis 5E2 delapl zu integrieren, ist es erforderlich, daß das Plasmid ein DNA-Fragment trägt, das homolog mit der chromosomalen DNA ist. Man hat daher in die BamHI-Stelle des Integrationsvektors pUBCDEBRA1 1DNSI1 chromosomale Fragmente Sau3AI kloniert, welche von B. licheniformis abstammen.
Dazu wird die von dem Stamm Bacillus licheniformis 5E2 delapl extrahierte chromosomale DNA teilweise durch das Restriktionsenzym Sau3AI geschnitten. Die DNA-Fragmente der Größe, welche zwischen 1,5 und 3 kb enthalten sind, werden dann durch Agarosegel gereinigt und mit dem Plasmid pUBCDEBRAlIDNSI ligiert bzw. verbunden, das durch das BamHI-Restriktionsenzym geschnitten und dephosphoryliert ist. Das so erhaltene Ligat wird in MC1061-Zellen durch Elektroporation transformiert. Nach Selektion auf geliertem LB-Medium, das 100 ug/ml Ampicillin enthält, werden etwa 3000 Kolonien erhalten. Die Gesamtheit dieser Kolonien wird in LB-Medium suspendiert und eine Extraktion von Plasmiden wird durch die Technik der alkalischen Lyse durchgeführt (SAMBROOK et al., S. 1.25-1.28).
Das Präparat des so erhaltenen Plasmides wird dann durch Transformation durch die Protoplastentechnik in den Stamm von Bacillus licheniformis 5E2 delapl eingeführt. Die transformierten Zellen werden auf dem Regerierationsmedium DM3 (beschrieben in Molecular Biological Methos for Bacillus (Harwood, C. R. und Cutting, S. M., Eds) J. Wiley and sons, 1990, S. 150-151) selektioniert, für ihre Phleomycinresistenz (17 ug/ml), welche ihnen nur durch chromosomale Integration eines oben konstruierten Plasmides verliehen werden kann.
Die so erhaltenen Kolonien werden erneut auf geliertem LB- Medium, ergänzt durch 5 ug/ml Phleomycin und 0,06% AZCL- Pullulan, ausgetragen. Die Kolonie, welche den größten Hof der AZCL-Pullulan-Hydrolyse zeigt, wird dann isoliert und erneut auf geliertem LB-Medium ausgetragen.
Dann wird eine Extraktion des plasmidischen Inhaltes dieses Stammes durchgeführt. Das so erhaltene Präparat wird einer Analyse durch Agarose-Elektrophorese unterworfen, welche die Abwesenheit von Plasmid zeigt.
Die chromosomale DNA wird extrahiert und gereinigt, wie in Beispiel 14 beschrieben ist, und einer Analyse durch die SOUTHERN-Technik unterworfen, welche zeigt, daß das Plasmid pUBCDEBRAlIDNSI sich in die chromosomale DNA durch homologe Rekombination in einem Fragment Sau3AI von etwa 3 kb integriert hat.
Das zeigt, daß das für die Pullulanase von B. deramificans codierende Gen, sich in B. licheniformis in in dem Chromosom integrierten Zustand, exprimiert.

Beispiel 22

Verfahren zur Herstellung der Pululanase durch den Stamm Bacillus licheniformis SE2 delapl (pUBCDEBRA11DNSI)

Der Stamm B. licheniformis 5E2 delapl, welcher das Gen der Pullulanase in in der chromosomalen DNA integrierten Form enthält, wie er in Beispiel 21 erhalten wurde, wird während 17 Stunden bei 37ºC in einem Vorkulturmedium LB, ergänzt durch 0,5% (p/p) Glucose und 5 ug/ml Phleomycin, kultiviert. Ein Volumen von 10 ml dieser Vorkultur wird in 250 ml M2-Medium (beschrieben in Beispiel 20), ergänzt durch 5 ug/ml Phleomycin, in Fläschchen mit Klappverschluß inokuliert.
Nach 24 Stunden Inkubieren unter Rühren bei 37º wird die so erhaltene Gesamtheit der Kultur in einen Fermenter eingeführt, welcher 6,5 l M2-Medium enthält. Die Fermentierung wird 72 Stunden bei 37ºC durchgeführt. Der pH-Wert wird bei einem Wert unter 7,0 durch Zugabe von konzentrierter Phosphorsäure gehalten, der Luftdurchsatz wird bei 4 l/min gehalten, und das Rühren wird so eingestellt, daß man einen Gehalt an gelöstem Sauerstoff von über 30% (v/v) des Sättigungsgehaltes erhält.
Nach Zugabe von 50 ml eines Flockungsmittels auf Basis von Polyamin, verkauft unter der Marke OPTIFLOC FC 205, durch SOLVAY DEUTSCHLAND, zu der erhaltenen Kultur, wird die Biomasse durch Zentrifugieren (BECKMAN JA-10) bei 5000 Umdrehungen/Minute während 15 Minuten entfernt und der erhaltene Überstand wird auf einen pH-Wert von 4, 5 mit einer 1 M HCl- Lösung angesäuert. Die erhaltene Lösung wird erneut bei 8000 Umdrehungen/Minute während 15 Minuten zentrifugiert (BECKMAN JA-10).
Der Überstand wird dann durch Ultrafiltration auf ein Endvolumen von 1 l konzentriert, indem man eine Ultrafiltrationseinheit verwendet, welche mit einer Membran mit einer Grenzauflösung von 5000 Dalton ausgerüstet ist.
Dann fügt man dieser konzentrierten Lösung Aceton bis zu einer Endkonzentration von 60% (v/v) zu. Die gebildete Suspension wird bei 4ºC während 2 Stunden inkubiert, dann bei 8000 Umdrehungen/Minute während 15 Minuten zentrifugiert (BECKMAN JA-10). Der erhaltene Bodenstand der Zentrifugation wird in 100 ml einer wäßrigen Lösung suspendiert, welche 30% (p/v) Amidon der Marke MALTRIN® 250 (GRAIN PROCESSING CORPORATION), 0,3% (p/v) Natriumbenzoat und 0,15% (p/v) Kaliumsorbat bei einem pH-Wert von 4, 5 enthält. Das so erhaltene, durch den rekombinanten Stamm erzeugte, gereinigte Präparat der Pullulanase wird Lösung D genannt. Die Aktivität der Lösung D von Pullulanase, gemessen durch die Reduktionszucker-Methode, beträgt 150 PUN/ml.

Beispiel 23

Stabilität der durch den Stamm von Bacillus licheniformis 5E2 delapl (oUBCDEBRA11DNSI) erzeugten Pullulanase gegenüber Temperatur

Man verdünnt die Lösung D von Pullulanse, wie sie in Beispiel 22 erhalten wurde, so in einem Citrat-Phosphat-Puffer von 0,05 M bei einem pH-Wert von 4,75, daß sie eine enzymatische Aktivität entwickelt, welche zwischen 10 und 15 PUN/ml enthalten ist.
Man verteilt diese verdünnte Lösung, welche die Pullulanase enthält, auf neun Röhrchen zu je 5 ml verdünnter Lösung pro Röhrchen.
Man inkubiert diese verschiedenen, die verdünnte Lösung enthaltenden Röhrchen in Wasserbädern bei Temperaturen, welche zwischen 40 und 80ºC enthalten sind, während 75 Minuten.
Nach dieser Inkubation stellt man sie in ein Eisbad, um sie rasch abzukühlen.
Dann mißt man die enzymatische Aktivität der verschiedenen Lösungen (Meßbedingungen: Temperatur 60ºC, pH-Wert 4, 5, Inkubationsdauer 15 Minuten).
Im Verlauf dieses Versuches wurde die maximale enzymatische Aktivität für Proben gemessen, welche auf einen pH-Wert von etwa 4,75 und auf eine Temperatur von etwa 55ºC eingestellt waren. Per Definition hat man so dieser Probe eine relative enzymatische Aktivität von 100% zugeordnet.
Die Ergebnisse sind in der Tabelle 12 zusammengefaßt.

TABELLE 12

Temperatur relative enzymatische Aktivität, %
40 99
45 99
50 100
55 100
60 96
65 83
70 2
80 1
Dieses Beispiel zeigt, daß die Pullulanase gemäß der Erfindung eine relative enzymatische Aktivität von wenigstens 80%, gemessen nach einer Inkubation von 75 Minuten bei einem pH-Wert von 4,75 in Abwesenheit von Substrat und in einem Temperaturbereich unter oder gleich 65ºC zeigt.

Claims

1. Pullulanase, dadurch gekennzeichnet, daß ihre N-terminale Sequenz (SEQ ID Nr: 1) die folgende in Richtung der Amino-Carboxyl-Gruppe und von links nach rechts ist:

2. Pullulanase nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie durch den Stamm Bacillus deramificans erzeugt ist.

3. Pullulanase, dadurch gekennzeichnet, daß sie die Aminosäuresequenz von 1 bis 928 Aminosäuren enthält, wie sie in der Fig. 4 veranschaulicht ist (SEQ ID Nr: 11).

4. Pullulanase nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß sie in Form eines Vorläufers synthetisiert ist, welcher eine zusätzliche Sequenz von 29 Aminosäuren enthält (SEQ ID Nr: 12).

5. Pullulanase nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine optimale enzymatische Aktivität, gemessen bei einer Temperatur von etwa 60ºC bei einem pH-Wert von etwa 4, 3, entwickelt.

6. Pullulanase nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein Molekulargewicht von etwa 100 kDa aufweist.

7. Pullulanase nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß sie einen isoelektrischen Punkt aufweist, welcher zwischen 4, 1 und 4, 5 enthalten ist.

8. Pullulanase nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine enzymatische Aktivität von mehr als 80% der maximalen enzymatischen Aktivität in einem pH-Bereich, welcher zwischen etwa 3, 8 und etwa 4, 9 enthalten ist, für eine Temperatur von etwa 60ºC entwickelt, wobei die maximale enzymatische Aktivität bei einer Temperatur von 60ºC und einem pH-Wert von 4, 3 gemessen wird.

9. Pullulanase nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine relative enzymatische Aktivität von über 90%, gemessen bei einer Temperatur von etwa 60ºC in Abwesenheit von Substrat in einem pH-Bereich, welcher zwischen etwa 3, 8 und etwa 5 enthalten ist, zeigt.

10. Pullulanase nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß sie die glucosidischen α- 1,6-Bindungen in Amylopektin hydrolysiert.

11. Pullulanase nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß sie Pullulan zu Maltotriose abbaut.

12. Pullulanase nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß sie Amylopektin unter Bildung von Oligosacchariden hydrolysiert.

13. Pullulanase nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß sie die Kondensationsreaktion von Maltose unter Bildung von Tetrahalosiden katalysiert.

14. Pullulanase nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß sie ausgehend von dem Stamm Bacillus deramificans LMG P-13056 oder einem Derivat oder Mutanten dieses Stammes erhalten werden kann.

15. Pullulanase nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß sie auf heterologe Weise durch einen Mikroorganismus der Gattung Bacillus erzeugt wird, welcher ein für eine alkalische Protease codierendes Gen enthält, wenn er sich im Wildzustand befindet, wobei das für die alkalische Protease codierende Gen vom Mikroorganismus der Gattung Bacillus deletiert wurde.

16. Verfahren zur Erzeugung von Pullulanase nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß es die Kultivierung des Stammes Bacillus deramificans oder eines Derivates dieses Stammes, welche die Pullulanase in einem geeigneten Nährmedium erzeugen können, das Kohlenstoff- und Stickstoffquellen und Mineralsalze enthält, unter aerobiotischen Bedingungen, und die Gewinnung der so erhaltenen Pullulanase umfaßt.

17. Verfahren zur Herstellung einer Pullulanase nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß es die Isolierung eines DNA-Fragmentes, das für Pullulanase codiert, die Insertion dieses DNA-Fragmentes in einen geeigneten Vektor, das Einführen dieses Vektors in einen geeigneten Wirt oder das Einführen dieses DNA-Fragmentes in das Chromosom eines geeigneten Wirtes, das Züchten dieses Wirtes, die Expression der Pullulanase und die Gewinnung der Pullulanase umfaßt.

18. Verwendung einer Pullulanase nach einem der Ansprüche 1 bis 15 für die Verzuckerung von Amidon.

19. DNA-Molekül, umfassend die Nucleotidsequenz (SEQ ID Nr: 10), welche für Pullulanase nach einem der Ansprüche 1 bis 15 codiert.

20. DNA-Molekül nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß es das gesamte Gen (SEQ ID Nr: 8) der Pullulanase von Bacillus deramificans LMG P-13056 umfaßt.

21. Expressionsvektor, enthaltend das DNA-Molekül nach Anspruch 19.

22. Chromosomaler Integrationsvektor, enthaltend das DNA- Molekül nach Anspruch 19.

23. Expressionsvektor, gekennzeichnet durch die in Fig. 1 dargestellte Restriktionskarte.

24. Chromosomaler Integrationsvektor, gekennzeichnet durch die in Fig. 3 dargestellte Restriktionskarte.

25. Transformierter Stamm von Bacillus licheniformis, umfassend das DNA-Molekül nach Anspruch 19.

26. Transformierter Stamm von Bacillus licheniformis, umfassend den Expressionsvektor nach Anspruch 21 oder den chromosomalen Integrationsvektor nach Anspruch 22.

27. Transformierter Stamm von Bacillus licheniformis, umfassend den Expressionsvektor, der durch die in Fig. 1 veranschaulichte Restriktionskarte charakterisiert ist, oder den chromosomalen Integrationsvektor, der durch die in der Fig. 3 veranschaulichte Restriktionskarte gekennzeichnet ist.

28. Eine Kultur von Bacillus deramificans LMG P-13056.

29. Eine Kultur von Bacillus deramificans LMG P-13056 und eine davon abgeleitete oder mutierte Kultur, welche eine Pullulanase nach einem der Ansprüche 1 bis 13 erzeugen kann.

30. Enzymatische Zusammensetzung, umfassend eine Pullulanase nach einem der Ansprüche 1 bis 15.