DE69229272T2

DE69229272T2 - Topischer fibrinogenkomplex

Info

Publication number: DE69229272T2
Application number: DE69229272T
Authority: DE
Inventors: Melaine Alpern; Stanley Enomoto; Cataline Garanchon; Shu Liu; Samia Mankarious; William Thomas; Daphne Tse
Original assignee: Baxter International Inc
Current assignee: Baxter International Inc
Priority date: 1991-09-05
Filing date: 1992-09-04
Publication date: 2000-02-03
Anticipated expiration: 2012-09-05
Also published as: CA2117058A1; JPH1121249A; AU2577992A; BR1100978A; JPH07501517A; DE69229272D1; WO1993005067A1; EP0602173A1; EP0602173B1; ATE180492T1; EP0602173A4; JP2887329B2; AU675051B2

Description

Die Anmeldung ist eine Continuation-in-part-Anmeldung von der US-Anmeldung mit der US-Serial No. 755 156, angemeldet am 5. September 1991.

Hintergrund der Erfindung

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Fibrinogen-Zusammensetzung und ein Verfahren zu ihrer Herstellung, wobei die Zusammensetzung als Wundverschluß in Verbindung mit Thrombin und Calcium verwendet werden kann.

Stand der Technik

Die Verwendung von Fibrinogen zur topischen Hämostase wurde bereits seit dem frühen 20 Jahrhundert untersucht, als Fibrinogenpflaster in der Neurochirurgie verwendet wurden. Später wurden Mischungen aus Plasma und Thrombin bei der Hauttransplantation und bei intrakavitären Injektionen bei der Therapie von Tuberkulose verwendet. Diese frühen Versuche wiesen jedoch zwei große Nachteile auf: da die Quelle für Fibrinogen Plasma war, war die Konzentration an Fibrinogen gering, was zu einem Fibrinfilm unzureichender Festigkeit führte; und es war nicht möglich, den normalen physiologischen Prozeß der Fibrinolyse zu inhibieren, so daß der Fibrinfilm relativ rasch abgebaut wurde.
Frühere Versuche zur Entwicklung eines wirksamen Fibrin-Klebers wurden auch durch die Tatsache behindert, daß die meisten dieser Zubereitungen hohe Gehalte an Plasminogen enthalten, so daß diese Zusammensetzungen zusätzlich ein antifibrinolytisches Mittel enthalten mußten, um einen frühzeitigen Abbau des Fibrinverschlusses zu verhindern. Weil antifibrinolytische Mittel typischerweise von einer nicht menschlichen Quelle abgeleitet sind, ist die Möglichkeit, daß ein Patient eine Reaktion gegen solche Fremdproteinen zeigt, beträchtlich, insbesondere dann, wenn diese Mittel mehrmals angewendet werden.
Obwohl Rose et al. (US 4 627 879) die Herstellung eines Fibrinklebers beschreiben, der nicht notwendigerweise ein antifibrinolytisches Additiv erfordert, wird durch die darin beschriebene Zusammensetzung nicht ein weiterer großer Nachteil dieser früheren Fibrinkleber-Zusammensetzungen angesprochen, nämlich die mögliche Gegenwart infektiöser Mittel, wie z. B. Hepatitis B oder HIV, im Plasma. Die Rose-Arbeit macht es deshalb erforderlich, daß die darin beschriebenen Zusammensetzungen von einem einzigen Spender abgeleitet sind, um die Übertragung infektiöser Mittel, die mit gepooltem Plasma verbunden sein könnten, zu vermeiden.
Es besteht deshalb ein beträchtliches Bedürfnis für einen Fibrinkleber, der aus gepooltem Plasma abgeleitet werden kann und der frei ist von anti-fibrinolytischen Verbindungen, tierischen Proteinen und infektiösen Mitteln, wie z. B. Viren. Durch das Angeben solcher Zusammensetzungen entspricht die vorliegende Erfindung diesen Bedürfnissen.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung basiert auf der Feststellung, daß gepooltes Plasma, auch wenn es im wesentlichen an Faktor VIII verarmt ist, verarbeitet werden kann zur Herstellung einer Fibrinogen-Zusammensetzung, die mit Trombin und Calcium reagiert, um einen Fibrinkleber auszubilden, der zur Förderung der Hämostase verwendet werden kann.
Spezifischer ausgedrückt, es wird durch die Erfindung eine Fibrinogenzusammensetzung angegeben, die, zusätzlich dazu, daß sie im wesentlichen frei ist von Faktor VIII und Plasminogen, nicht die Verwendung eines anti-fibrinolytischen Mittels erfordert, und die behandelt worden ist, um die Anwesenheit von infektiösen Mitteln, wie z. B. Lipid-umhüllten Viren, zu eliminieren. Ein weiterer Vorteil der Zusammensetzung ist es, daß im wesentlichen alle in der Zusammensetzung vorhandenen Proteine menschlich sind, d. h. durch eine menschliche DNA-Sequenz kodiert werden.
Die erfindungsgemäße Zusammensetzung bietet durch ihre vorübergehende in vivo-Präsenz eine Matrix, die während eines Zeitraums vorhanden ist, der ausreicht, um eine medizinische Wirkung zu erzielen, ist beim Abbau im wesentlichen frei von Wirt-Toxizität, und ergibt mechanische Festigkeit, um die Hämostase zu fördern.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 ist eine schematische Darstellung der Herstellung eines topischen Fibrinogenkomplexes (Topical Fibrinogen Complex).
Fig. 2 zeigt die Wirkung der Calciumionen-Konzentration auf die Fibrin-Polymerbildung. Fibrinogen (90 mg/ml) und Thrombin (500 E/ml) wurden gemischt und 10 Minuten inkubieren gelassen. Spur A: MG (Molekulargewicht)-Marker; Spur B: Kontroll- Fibrinogen; Spur C: 0 mM Ca&spplus;&spplus;; Spur D: 1 mM Ca&spplus;&spplus;; Spur E: 3 mM Ca&spplus;&spplus;; Spur F: 6 mM Ca&spplus;&spplus;; Spur G: 10 mM Ca&spplus;&spplus;; Spur H: 20 mM Ca&spplus;&spplus;; Spur I: 30 mM Ca&spplus;&spplus;; Spur J: MG-Marker.
Fig. 3 zeigt die Wirkung der Calciumionen-Konzentration auf die Fibrin-Polymerbildung. Fibrinogen (130 mg/ml) und Thrombin (500 E/ml) wurden gemischt und 10 Minuten inkubieren gelassen. Spur A: MG-Marker; Spur B: Kontroll-Fibrinogen; Spur C: 0 mM Ca&spplus;&spplus;; Spur D: 1 mM Ca&spplus;&spplus;; Spur E: 3 mM Ca&spplus;&spplus;; Spur F: 6 mM Ca&spplus;&spplus;; Spur G: 10 mM Ca&spplus;&spplus;; Spur H: 20 mM Ca Spur I: 30 mM Ca&spplus;&spplus;; Spur J: MG-Marker.
Fig. 4 zeigt die Rate der Fibrin-Polymerisation. Fibrinogen (130 mg/ml) und Thrombin (500 E/ml) wurden in Gegenwart von Calciumionen (40 mM CaCl&sub2;) gemischt. Spur A: MG-Marker; Spur B: 0 Min.; Spur C: 1 Min. Spur D: 3 Min.; Spur E: 5 Min.; Spur F: 10 Min.; Spur G: 30 Min.; Spur H: 60 Min.; Spur I: 2 Stunden; Spur J: 4 Stunden; Spur K: 8 Stunden; Spur L: 24 Stunden; Spur M: Fibrinogen- und Thrombinkontrolle; Spur N: MG-Marker.

Detaillierte Beschreibung bevorzugter Ausführungsformen

Von den Erfindern wurden Zusammensetzungen zur Herstellung eines Fibrinklebers bereitgestellt, die eine beträchtliche Verbesserung gegenüber Zusammensetzungen des Standes der Technik, die ebenfalls diese Wirkung erzielen sollen, darstellen. Diese Zusammensetzungen, die als Topical Fibrinogen Complex (topischer Fibrinogenkomplex) (TFC) bezeichnet werden, sind vorteilhaft, weil es mit ihnen möglich ist, in Abwesenheit nicht menschlicher Proteine und möglicher viraler Pathogene eine in situ-Langlebigkeit zu erzielen, um die Hämostase zu induzieren.
Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen können hergestellt werden, indem man ausgeht von irgendeiner von Blut abgeleiteten Fraktion, die an Fibrinogen nicht wesentlich verarmt wurde. Bevorzugte Blutfraktionen zur Herstellung der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen sind Plasma, Kryopräzipitat, und an Faktor VIII-verarmtes Kältepräzipitat. Im allgemeinen umfaßt das Verfahren die Bildung eines Kryopräzipitats mit einem hohem Gehalt an Faktor VIII (F VIII) und Fibrinogen. Dieser Stufe folgt die Ausbildung eines Kältepräzipitats, das wieder eine hohe Konzentration an Fibrinogen und sehr geringe Gehalte an F VIII aufweist. Der Zusatz einer Calciumionenquelle während des Ausbildens des Kältepräzipitats erhöht die Ausfällung von Fibrinogen sowie von Fibronectin, so daß die Konzentration dieser Substanzen im Kältepräzipitat erhöht wird. Zur Aufkonzentrierung des Fibrinogens in der Zusammensetzung kann auch ein Zusatz von Polyethylenglykol (PEG) verwendet werden.
Typischerweise geht das erfindungsgemäße Verfahren aus von Behältern mit gefrorenem Plasma. Wie im Beispiel 1 beschrieben, wird das Kryopräzipitat aus dem gefrorenen Plasma gesammelt und danach in einer kontrollierten Umgebung aufgetaut.
Vor der Bildung des Kältepräzipitats wird die Blutfraktion behandelt, um ein Kryopräzipitat zu bilden. Dieses Kryopräzipitat kann gebildet werden durch Gefrieren der Blutfraktion (z. B. von Plasma), und wird dann auf eine Temperatur erwärmt, die ca. + 6ºC nicht übersteigt. Das Kryopräzipitat wird in destilliertem Wasser bei ca. 20ºC bis 35ºC gelöst. In einer Konzentration von ca. 1 um bis ca. 1000 um wird Calciumchlorid zugegeben. Vorzugsweise wird das Calciumchlorid in dieser Stufe bei einer Konzentration von ca. 40 um zugegeben, und der pH-Wert auf 6,8 ± 0,3 eingestellt, um die Ausfällung von Fibrinogen zu erhöhen.
Das gelöste Kryopräzipitat wird dann auf 10ºC ± 2ºC unter Mischen abgekühlt, wobei sich ein Präzipitat, als Kältepräzipitat bekannt, bildet. Das Präzipitat wird aus der Lösung durch Zentrifugieren, z. B. mit 5600 g bis 7200 g entfernt. Das Präzipitat kann bei -60ºC, oder, wenn gewünscht, darunter gelagert werden. In der bevorzugten Ausführungsform wird die anfängliche Fraktionierung zum Erhalt des topischen Fibrinogenkomplexes erreicht, indem man zuerst eine Kryopräzipitation durchführt und dann ein Kältepräzipitat ausbildet.
Das resultierende Präzipitat, das reich ist an Fibrinogen, wird unter Mischen in einem Puffer gelöst, und der pH-Wert wird auf 7,2 ± 0,1 eingestellt. Vorzugsweise wird das Kältepräzipitat in Gegenwart eines Proteaseinhibitors resuspendiert, wie z. B. PPACK (D-Phe-L-pro-Larg-Chlormethylketon), Heparin-Cofaktor II, oder Hirudin, um Thrombin, das vorhanden sein könnte, zu inhibieren. Der am meisten bevorzugte Thrombininhibitor ist PPACK bei einer Konzentration von ca. 0,75 uM bis ca. 1,75 pH. Der Thrombininhibitor wird bei der PEG- Fällung und den Verfahrensstufen der DEAE-Säule entfernt. Für einen Fachmann auf diesem Gebiet sind andere Protease-Thrombininhibitoren und ihre wirksamen Konzentrationen bekannt.
Die Suspension des Kältepräzipitats wird dann in eine Pufferlösung übertragen, die ein Salz, wie z. B. Tricalciumphosphat, enthält. Das Calciumphosphat entfernt aus der an Fibrinogen reichen Lösung Prothrombin. Dies minimiert die Wahrscheinlichkeit einer Prothrombinumwandlung zu Thrombin, die, wenn eine solche Reaktion auftreten würde, zur Umwandlung von Fibrinogen in Fibrin führen könnte. Das Calciumsulfat wird dann aus dem Verfahren durch Zentrifugieren und/oder Filtration entfernt.
Weitere Methoden zur Entfernung von Prothrombin werden von Murano (Prothrombin and Other Vitamin K Proteins, Band II, Seegers and Walz, Herausgeber, CRC Press, Inc. Boca Raton, FL, 1986); Heystek et al. (Vox Sang. 25, 113, 1973); Banowcliffe et al. (Vox Sang 25, 426, 1973); Chandra et al. (Vox Sang 41, 257, 1981); und Chanas et al. (US 4465623) beschrieben, wobei auf diese Arbeiten summarisch Bezug genommen wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird das gelöste Kältepräzipitat auf ca. 23 bis 27ºC erwärmt und mit Lysin-Sepharose 4B in Kontakt gebracht. Die Fibrinogen-reiche Fraktion, die im wesentlichen nicht an die Lysin-Sepharose 4B bindet, wird vom Affinitätsabsorbens abgetrennt. Das gelöste Prothrombin-freie Kältepräzipitat wird mit Lysin in Kontakt gebracht, das an einer festen Matrix, wie z. B. Sepharose, gebunden ist, um eine Adsorption des restlichen Plasminogens im Kältepräzipitat zu ermöglichen.
Die Entfernung von Plasminogen ist wichtig, weil es ein profibrinolytisches Zymogen ist, das Fibrinogen und Fibrinmoleküle spalten kann. Das Material, das nicht an die Lysinmatrix gebunden ist, wird dann aufkonzentriert, vorzugsweise durch Zugabe von Polyethylenglykol (PEG). Polyethylenglykol (3000- 8000 MG) wird dann bis zu einer Endkonzentration von ca. 3% bis ca. 7%, und vorzugsweise von ca. 4% (Gew/Gew) zugegeben. Der PEG-Niederschlag wird gelöst und vor der Klärung durch Filtration der pH-Wert auf 8,6 + 0,1 eingestellt.
Wenn PEG für die Konzentrationsstufe verwendet wird, sollte der Molekulargewichtsbereich des PEG ein solcher sein, der im Menschen nicht toxisch wirkt. Bei einer alternativen Ausführungsform der Erfindung ist es auch möglich, die Stufe der PEG-Ausfällung vor der Adsorption durch die Lysin-Matrix durchzuführen.
Nach der Filtration wird die Zusammensetzung mit einer virusinaktivierend-wirksamen Menge eines Mittels, wie z. B. eines Detergens, behandelt, das typischerweise wirkt, indem es die Lipidhülle solcher Viren, wie z. B. Hepatitis B, HIV und HTLV, zerstört. Der Ausdruck "virusinaktivierend-wirksame Menge" bedeutet, daß die Konzentration des zur Zusammensetzung zugegebenen Detergens ausreicht, um im wesentlichen alle Virionen, die vorhanden sein könnten, zu inaktivieren. Selbstverständlich sollte die Konzentration des Detergens die Fähigkeit der Zusammensetzung zur ausreichenden Ausbildung des Fibrinklebers nicht wesentlich inhibieren. Detergentien, die brauchbar sind, können ausgewählt werden aus anerkannten Gruppen, wie z. B. anionischen, kationischen und nichtionischen Detergentien.
Beispiele umfassen sulfatierte Alkohole und Natrium-Salze, wie sulfatiertes oxyethyliertes Alkylphenol (Triton W-30 und Triton X-100), Natriumdodecylbenzolsulfonat (Nacconol NR), Natrium 2-sulfoethyloleat (Igepon A), Natriumcholat, Natriumdeoxycholat, Natriumdodecylsulfonat, Dodecyldimethylbenzylammoniumchlorid (Triton K-60), oxyethylierte Amine (Ethomeen), N-Dodecylaminoethansulfonsäure, Ethylenoxid/Propylenoxid-Kondensate (Pluronic-Copolymere), polyoxyethylierte Derivate von Estern (Tween 80 und Polysorbat 80), Polyoxyethylen-Fettalkoholether (Brij 35), Nonidet P-40 und Lubrox PX. In der bevorzugten Ausführungsform, in der die Proteinkonzentration 0,6% beträgt, werden Triton X- 100 (Endkonzentration 1,0%) und Polysorbat 80 (Endkonzentration 0,3%) mit einem organischen Lösungsmittel, wie z. B. Tri (n-butyl)-phosphat (TNBP) (Endkonzentration 0,3%), kombiniert, um Viren zu inaktivieren.
Zusätzlich können auch chaotrope Mittel verwendet werden, um Viren zu inaktivieren, unter der Voraussetzung, daß die Ver wendung dieser Mittel zu keinem signifikanten Verlust der Fibrinogenwirkung führt.
Die Konzentration des bei der Durchführung der bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung verwendeten organischen Lösungsmittels und Detergens kann, abhängig von der zu behandelnden Zusammensetzung und vom ausgewählten Lösungsmittel oder Detergens, variieren. Die Alkylphosphate werden in Konzentrationen von ca. 0,10 mg/ml der zu behandelnden Mischung bis zu 1,0 mg/ml verwendet, und zwar vorzugsweise zwischen ca. 0,1 mg/ml bis ca. 10 mg/ml. Die verwendete Menge an Detergens oder Netzmittel ist nicht kritisch, da es dazu dient, den Kontakt zwischen dem organischen Lösungsmittel und dem Virus zu verbessern.
Für die meisten nicht ionischen Materialien, die verwendet werden können, kann das Netzmittel variieren von ca. 0,001% bis 10%, und vorzugsweise von ca. 0,01% bis ca. 2%, der wässerigen Mischung, wobei dies abhängig ist von der Menge an dem in der behandelten wässerigen Mischung vorhandenen fettigen Material. Die Mengen an Lösungsmittel und Detergens werden auch abhängig voneinander variieren.
Der Stand der Technik, wie z. B. das US-Patent 4 540 573, beschreibt die Zugabe von organischen Lösungsmitteln und Detergentien zu konzentrierten Proteinlösungen, um die Lipid-umhüllten Viren zu zerstören und zu inaktivieren, während die Struktur und Aktivität des Proteins aufrechterhalten wird.
Es wurde gezeigt, daß organische Lösungsmittel, die entweder Tween 80 oder Triton X-100 enthalten, wirksame Reagentien sind zur Abtötung von in konzentrierten Lösungen von Proteinen vorhandenen Viren, ohne daß sie die Aktivität der Proteine nachteilig beeinträchtigen. Die Verwendung solcher Lösungsmittel/Detergentien-Mischungen wurde jedoch üblicher weise vermieden, weil die nachfolgende Entfernung der Detergentienmischung aus dem konzentrierten Protein sich als schwierig herausgestellt hat. Deshalb wurden häufiger andere Detergentien, wie z. B. Natriumcholat oder Natriumdeoxycholat, verwendet.
Diese Detergentien können aus der Zusammensetzung durch Gelausschlußchromatographie, z. B. unter Verwendung von Sephadex G-25, entfernt werden. Bei der Auswahl eines bestimmten Detergens, oder einer Mischung aus Detergentien, ist es auf alle Fälle wichtig, die Verwendung solcher Detergentien zu vermeiden, die Fibrinogen auf eine solche Weise denaturieren könnten, daß seine Fähigkeit zur Mitwirkung bei der Gerinnselbildung verhindert wird.
In der bevorzugten Ausführungsform ist DEAE, Diethylaminoethylcellulose (DE 52), die zum Entfernen des Lösungsmittels- Detergens aus der Fibrinogenzusammensetzung verwendeten Matrix. Das Fibrinogen bindet an die DE 52-Cellulose, und nach sorgfältigem Waschen zur Entfernung von ungebundenem Material und Detergens wird es mit 0,3M NaCl eluiert. Andere Ionenaustauschmaterialien, die zur Entfernung des Lösungsmittels/Detergens verwendet werden können, umfassen praktisch jede der handelsüblich erhältlichen Anionenaustauscher-Matrices, einschließlich von Cellulosen und Agarosen, wie z. B. polysulfatierte Agarosen, insbesondere, aber nicht darauf beschränkt, QAE (quaternäres Amin)-Derivate, Ecteola (Epichlorhydrintriethanolamin), TEAE (Triethylaminoethyl)-Derivate, und AE (Aminoethyl)-Matrices. Die spezifischen Parameter zum Binden und Eluieren aus diesen verschiedenen Ionenaustauschmaterialien sind für einen Fachmann auf diesem Gebiet bekannt, oder können ohne unangemessen große experimentelle Arbeit leicht festgestellt werden.
Nach Elution aus dem Ionenaustauscherharz wird die Fibrinogenzusammensetzung durch Zugabe von Exzipientien, wie z. B. menschlichem Serumalbumin (HSA) und Polysorbat-80, zur Steigerung der Löslichkeit weiter ausgebildet. Der Zusatz von HSA, Hydroxyethylstärke, Dextran, oder Kombinationen davon, erhöht die Stabilität des Endproduktes. Vorzugsweise werden HSA und Polysorbat-80 mit einer Konzentration von 80 mg bzw. 15 mg, pro g Protein im Eluat, zugegeben.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird die erfindungsgemäße Fibrinogenzusammensetzung vor dem Erreichen der Endkonzentration durch Ultrafiltration, Lyophilisation oder eine andere übliche Methode behandelt, um die Löslichkeit des Endproduktes bei der Rekonstitution vor der therapeutischen Verwendung zu erhöhen. Nach der Behandlung wird der Ansatz auf ca. 20% bis ca. 50% des ursprünglichen Eluatvolumens aufkonzentriert und dann auf das Eluatvolumen vor der Konzentration verdünnt. Vor der sterilen Aufarbeitung und Lyophilisation wird der Ansatz dann auf eine Endproteinkonzentration von 4 ± 1 g % (Gew/Vol) aufkonzentriert.
Bei der bevorzugten Ausführungsform wird die Konzentrierung erreicht durch Ultrafiltration unter Verwendung einer Membran mit einer Molekulargewichtsausschlußgrenze, die groß genug ist zur Entfernung von NaCl, aber klein genug ist, um Proteinmoleküle zurückzuhalten. Diese Filtration wird insbesondere durchgeführt unter Verwendung einer Membran mit einer Molekulargewicht-Ausschlußgrenze von 30000. Wenn die erfindungsgemäße TFC-Zusammensetzung lyophilisiert wird, ist das Volumen vor der Lyophilisation im allgemeinen größer als das Volumen, auf das das Lyophilisat zur Zeit der Verwendung resuspendiert wird.
Wenn die Zusammensetzung deshalb vorzugsweise, wie vorstehend beschrieben, unter Anwendung einer Ultrafiltration herge stellt wird, beträgt das der Lyophilisierung folgende rekonstituierte Volumen ca. 33% des Volumens vor der Lyophilisation. Auf alle Fälle sollte die NaCl-Konzentration im rekonstituierten Lyophilisat vorzugsweise ca. 0,1 bis 0,2 M betragen.
Wenn dies gewünscht wird, können die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen durch Zugabe von nicht-proteinhaltigen sowie proteinhaltigen Arzneimitteln modifiziert werden. Der Ausdruck "nicht-proteinhaltige Arzneimittel" umfaßt Verbindungen, bei denen es sich um klassische Arzneimittel handelt, wie z. B. Mitomycin C, Daunorubicin, und Vinblastin, sowie Antibiotika.
Die eiweißhaltigen Arzneimittel, die zu den erfindungsgemäßen Fibrinogenzusammensetzungen zugegeben werden können, umfassen Immunomodulatoren und andere Modifikationsmittel der biologischen Reaktion. Der Ausdruck "Modifikationsmittel der biologischen Reaktion soll Substanzen umfassen, die an der Modifikation einer biologischen Reaktion, wie z. B. der Immunantwort oder dem Gewebewachstum und -heilung, auf eine Weise beteiligt sind, die einen bestimmten gewünschten therapeutischen Effekt vergrößert, z. B. die Cytolyse von Bakterienzellen oder das Wachstum von Epidermiszellen.
Beispiele für Reaktions-Modifikationsmittel umfassen Verbindungen wie z. B. Lymphokine. Beispiele von Lymphokinen umfassen Tumor-Nekrose-Faktor, Interleukine, Lymphotoxin, Makrophagen-aktivierende Faktoren, Migration-Inhibitionsfaktor, Kolonie-stimulierenden Faktor, und die Interferone.
Zusätzlich können in die erfindungsgemäßen Fibrinogenzusammensetzungen auch Peptid- oder Polysaccharid-Fragmente eingearbeitet werden, die aus diesen proteinhaltigen Arzneimitteln erhalten wurden, oder unabhängig hergestellt wurden. Für einen Fachmann auf diesem Gebiet sind auch andere Substanzen, die als proteinhaltige oder nicht-proteinhaltige Arzneimittel wirken können, bekannt oder leicht ermittelbar.
Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen können auch modifiziert werden, um ein diagnostisches Mittel, wie z. B. ein strahlenundurchlässiges Mittel, einzubauen. Die Gegenwart solcher Mittel erlaubt es dem Arzt, den Fortschritt der Wundheilung, der intern, z. B. an der Leber, Gallenblase, dem Harntrakt, den Bronchien, Lungen, dem Herz, den Blutgefäßen und dem Knochenmarkkanal, auftritt, zu verfolgen. Solche Verbindungen umfassen Bariumsulfat sowie verschiedene organische Verbindungen, die Jod enthalten. Beispiele dieser letzteren Verbindungen umfassen Jocetaminsäure, Jodipamid, Jodoxamat, Meglumin, Jopansäure, sowie Diatrizoat-Derivate, wie z. B. Diatrizoat-Natrium. Von einem Fachmann auf diesem Gebiet können auch andere Kontrastmittel, die in den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen verwendet werden können, leicht ermittelt werden.
Die Konzentration des Arzneimittels oder diagnostischen Mittels in der Zusammensetzung variiert mit der Natur der Verbindung, seiner physiologischen Rolle und dem gewünschten therapeutischen oder diagnostischen Effekt. Der Ausdruck "therapeutisch wirksame Menge bedeutet, daß das therapeutische Mittel in einer Konzentration vorhanden ist, die ausreicht, um die Toxizität zu minimieren, aber den gewünschten Effekt zeigt. Die Konzentration für ein für einen zytolytischen therapeutischen Effekt verwendetes Antibiotikum wird z. B. sicher verschieden sein von der Konzentration eines Immunantwort-Modulators, bei dem der therapeutische Effekt darin besteht, die Vermehrung von Immunzellen an der Stelle der Anwendung des Fibrinogenkomplexes zu stimulieren.
Der Ausdruck "diagnostisch wirksame Menge" bezeichnet die Konzentration an diagnostischen Mittel, mit der der Fibrinkleber unter gleichzeitiger Minimierung einer potentiellen Toxizität überwacht werden kann. Für einen Fachmann auf diesem Gebiet ist für einen bestimmten Fall die gewünschte Konzentration einer bestimmten Verbindung leicht bestimmbar.
In der obigen Beschreibung wurde die vorliegende Erfindung allgemein beschrieben. Unter Bezugnahme auf die nachfolgenden spezifischen Beispiele läßt sich die Erfindung besser verstehen, wobei die Beispiele nur zum Zweck der Veranschaulichung angegeben werden, und, wenn nicht anders angegeben, keinesfalls beschränkend sind.

Beispiel 1

Herstellung des topischen Fibrinkomplexes (Topical Fibrinogen Complex)

Der Topical Fibrinogen Complex (TFC) wurde hergestellt, indem zunächst ein Plasma-Kryopräzipitat hergestellt wurde. Das Kryopräzipitat wurde abhängig von der physikalischen Form des Plasmas nach zwei verschiedenen Verfahren hergestellt.
In einem Verfahren wurden verschlossene Kunststoffflaschen mit gefrorenem Plasma in einer kontrollierten Umgebung durch In-Kontakt-bringen mit einem Wärmeaustauschmedium, wie z. B. Luft oder Wasser, aufgetaut. Das Auftauen wurde durch Programmieren der Temperatur und des Durchflusses des Wärmeaustauschmediums so gesteuert, daß die maximale Temperatur des Plasmas + 6ºC nicht überstieg. Dann wurden die Behälter geöffnet und der Inhalt in einem mit einem Mantel versehenen Auftaubehälter aus rostfreiem Stahl gesammelt.
Im Auftaubehälter wurde das Plasma (während es gemischt wurde) schwach erwärmt, um das verbleibende Eis zu schmelzen. Das aufgetaute Plasma wurde dann direkt zu einer Zentrifuge oder in einen ummantelten Aufbewahrungsbehälter aus rostfreiem Stahl gepumpt, wo es bei 2,5ºC ± 3,5ºC gehalten wurde.
Zur Entfernung des Kryopräzipitats wurde das Plasma zentrifugiert. Das so hergestellte Kryopräzipitat kann bei oder unterhalb von -25ºC gelagert werden, oder aber sofort zum Antihämophilie-Faktor (Mensch) verarbeitet werden. Das Kryoarme Plasma wurde in einem ummantelten Reaktionsgefäß aus rostfreiem Stahl gesammelt.
Alternativ wurde das Kryopräzipitat hergestellt, indem man verschlossene Kunststoffbeutel mit gefrorenem Plasma mehrere Sekunden in ein Bad mit flüssigem Stickstoff gab. Die Beutel wurden aus dem Bad entfernt, und die bröckeligen zersprungenen Beutel wurden vom Plasma abgezogen. Das Plasma wurde dann in einen ummantelten Auftaubehälter aus rostfreiem Stahl gegeben. Alternativ wurden die verschlossenen Kunststoffbeutel mit gefrorenem Plasma so angeordnet, daß die Beutel so erwärmt wurden, daß das gefrorene Plasma sich vom Kunststoff ablösen konnte. Die Behälter wurden dann geöffnet, und der Inhalt wurde in einem ummantelten Auftaubehälter aus rostfreiem Stahl gesammelt. Im Auftaubehälter wurde das Plasma unter Mischen schwach erwärmt, um das verbleibende Eis zu schmelzen.
Das aufgetaute Plasma wurde direkt zu einer Zentrifuge oder einem Aufbewahrungsbehälter aus rostfreiem Stahl gepumpt, wo es bei 2,5ºC ± 3,5ºC gehalten wurde. Zur Entfernung des Kryopräzipitats wurde das Plasma zentrifugiert. Das so hergestellte Kryopräzipitat kann bei oder unterhalb von -25ºC gelagert werden, oder sofort zu Antihämophiliefaktor (Mensch) verarbeitet werden. Das Kryoarme Plasma wurde in einem ummantelten Reaktionsbehälter aus rostfreiem Stahl gesammelt.
Nach Herstellung des Kryopräzipitats wurde es in destilliertem Wasser bei 20ºC bis 35ºC gelöst. Dieser Teil des Protokolls ist schematich in Fig. 1 dargestellt. Zum Erhalt einer minimalen Calciumkonzentration von ca. 40 um wurde genügend Calciumchlorid zugegeben, und der pH-Wert auf 6,8 ± 0,3 eingestellt. Diese Lösung wurde unter Mischen auf 10ºC ± 2ºC gekühlt. Der sich bildende Niederschlag wurde durch Zentrifugation (5600 g - 7200 g) entfernt. Der Niederschlag wurde bei oder unterhalb von -60ºC gelagert oder direkt zur Topical Fibrinogen Complex (Mensch) verarbeitet.
Der Niederschlag wurde dann in Process Solution I in einem Verhältnis von 4 l Process Solution I pro kg Niederschlag suspendiert. Die Process Solution I umfaßt:
(a) 0,5 M Glycin, 0,5 M Natriumchlorid und 0,1 M Natriumcitrat (pH eingestellt auf 7,2 ± 0,1 mit NaOH);
(b) Proteaseinhibitor: 0,75-1,75 pH PPACK (D-phe-L-pro-L- arg-Chlormethylketon) oder ein Äquivalent davon, und 0,6 ± 0,1 E/ml Heparin. Die Temperatur wurde auf 24 bis 32ºC eingestellt und die Suspension ca. 1 Stunde lang gerührt.
Nach Suspendieren des Niederschlags in Process Solution I wurde die Suspension in einen Behälter überführt, der 200 l Process Solution II mit 10 bis 15ºC enthielt, und mindestens 30 Minuten lang gerührt. Process Solution II enthält: 7 ± 1 mM monobasisches Natriumphosphat-Monohydrat, 18 ± 2 mM dibasisches Natriumphosphat-Heptahydrat, 0,25% (Gew/Vol) tribasisches Calciumphosphat. Die Suspension wurde dann mindestens 30 Minuten lang absitzen gelassen. In dieser Stufe kann die Suspension zur Entfernung von etwas Niederschlag zentrifu giert werden (5600 g-7200 g). Die Suspension wurde dann durch Filtration geklärt, zuerst durch ein 0,45 um-Filter, dann durch ein 0,2 um-Filter.
Das Filtrat wurde auf 23 bis 27ºC erwärmt und auf eine Lysin-Sepharose 4B-Säule oder ein Äquivalent davon aufgebracht. Das Gel wurde in eine Chromatographiesäule eingefüllt, mit 10 Säulenvolumina 0,1 M Essigsäure und dann mit 3 Säulenvolumina destilliertem Wasser präpariert, und dann mit 5 Säulenvolumina Process Solution III (25 mM Phosphatpuffer: 7 ± 1 mM monobasisches Natriumphosphat-Monohydrat, 18 ± 2 mM dibasisches Natriumphosphat-Heptahydrat) äquilibriert.
Wenn gewünscht, kann die Säule nach Regenerierung mit 3 Säulenvolumina 1,0 M NaCl, und dann mit 3 Säulenvolumina destilliertem Wasser, dann 3 Säulenvolumina 0,1 N Essigsäure, und dann 3 Säulenvolumina destilliertem Wasser, wiederverwendet werden. Für eine Langzeitlagerung kann die Säule mit 3 Säulenvolumina 20% Ethanol in destilliertem Wasser gewaschen und dann gelagert werden. Das ungebundene Material wurde in einem Behälter gesammelt. Die Säule wurde mit mindestens 2 Gelvolumina Process Solution III gewaschen. Die ungebundenen Fraktionen wurden gesammelt.
Als nächstes wurde die Temperatur des Ansatzes, der die gesammelten ungebundenen Fraktionen enthielt, auf 14 ± 4ºC eingestellt. Polyethylenglykol 3350 wurde bis zu einer Endkonzentration von 4% (Gew/Gew) zugegeben. Die Suspension wurde mindestens 30 Minuten lang gemischt und der Niederschlag durch Zentrifugation (8700 g) bei 10 bis 18ºC entfernt. Der resultierende PEG-Niederschlag wurde im Process Solution IV (39 mM Triphosphat mit einem mit Phosphorsäure eingestellten pH-Wert von 8,6 ± 0,1) in einer Menge von ca. 15 l/kg Niederschlag gelöst.
Die Proteinkonzentration der Suspension wurde auf 0,6 ± 0,2 g% (Gew/Vol) eingestellt, dann wurde die Suspension durch Filtration (0,2 um) geklärt. Eine Mischung aus Triton X-100, Tri(n-butyl)phophat (TNBP) und Polysorbat-80 wurde zur Lösung bis zu einer Endkonzentration von 1,0% (Vol/Vol), 0,3% (Vol/Vol) bzw. 0,3% (Vol/Vol) zugegeben. Die Protein- Detergens-Lösung wurde 1 Stunde lang gemischt.
Die Ansatzlösung wurde dann auf eine Chromatographiesäule gebracht, die DE 52-Ionenaustausch-Celluloseharz oder ein Äquivalent davon enthielt. Das Harz wurde in eine Chromatographiesäule gefüllt und mit 3 Säulenvolumina 1,0 M NaCl, dann 3 Säulenvolumina 0,5 M HCl, dann 3 Säulenvolumina 0,9% Salzlösung, dann 3 Säulenvolumina 0,5 M NaOH, regeneriert und mit 3 Säulenvolumina 0,5M Triphosphatpuffer (pH eingestellt auf 8,6) und 3 Säulenvolumina Process Solution IV äquilibriert. Nach Regeneration kann die Säule wieder verwendet und in 0,1 M NaOH gelagert werden.
Die Ionenaustauschsäule wurde dann mit einem Minimum von 20 Säulenvolumina Process Solution V (0,02 M Histidin, 0,01 M NaCl, pH mit 6 N HCl auf 7,0 ± 0,1 eingestellt) gewaschen, bis das gesamte ungebundene Material und Detergens entfernt waren. Der Ansatz wurde mit Process Solution VI (0,02 M Histidin, 0,3 M NaCl, pH mit 6 N HCl auf 7,0 ± 0,1 eingestellt) eluiert.
Zum Ansatz wurde dann menschliches Serumalbumin (5% oder 25% menschliches Serumalbumin zur therapeutischen Verwendung) bis zu einer Konzentration von 80 mg Albumin pro g Protein versetzt. Bis zu einer Endkonzentration von 15 mg pro g Protein wurde Polysorbat-80 zugegeben.
Schließlich wurde der Ansatz auf ca. 25% des ursprünglichen Volumens durch Ultrafiltration unter Verwendung einer 30000 MG-Ausschlußmembran konzentriert, und dann mit Process Solution VII (0,02 M Histidin, pH auf 7,0 ± 0,1 eingestellt) auf sein Volumen vor der Konzentration verdünnt. Der Ansatz wurde wieder mittels Ultrafiltration konzentriert, um eine Endproteinkonzentration von 4 ± 1 g% (Gew/Vol) zu erzielen. Der Ansatz wurde sterilfiltriert (0,2 um), aseptisch in sterile Behälter gefüllt, unter aseptischen Bedingungen lyophilisiert und mit sterilen Verschlüssen verschlossen.

Beispiel 2

TFC-in vitro-Untersuchungen

A. Untersuchung der Gerinnung

Es wurden Untersuchungen durchgeführt, um die Zusammensetzung der Fibrin Sealant (FS)-Komponenten, die eine rasche Gerinnung hervorrufen, zu bestimmen. Rasches Gerinnen wurde willkürlich mit 1 bis 2 Sekunden definiert. Kürzere Zeitperioden ergeben im allgemeinen eine Gerinnung innerhalb der Abgabevorrichtung, und längere Zeiten führen zu einer losen Mischung der Komponenten, die in schwer zu definierender Richtung fließt.
Bei der Durchführung dieser Experimente wurde eine reine Pyrex-Glasplatte in einer Lage -30ºC von der horizontalen Achse positioniert. Auf der Unterseite wurde eine 2"-Linie eingezeichnet, um die Fläche der FS-Applikation zu definieren.
Menschliches Fibrinogen wurde mit 50 bis 130 mg/ml Gesamtprotein mit Rinderthrombin (Armour Pharmaceutical Co.) mit 100 bis 1000 NIH E/ml, ohne Ca&spplus;&spplus;, getestet. Es wurde angenommen, daß die Fibrinogenkonzentration dem Wert der Gesamtproteine entsprach. Die Wirkung der Zugabe von [Ca&spplus;&spplus;] zur Bildung eines Fibrin Sealant (FS; TFC, Thrombin und Ca&spplus;&spplus;) wurde bei 10, 20, 40 und 60 mM untersucht.
Das Fibrin Sealant wurde unter Verwendung einer Experimental- Zweispritzen-Anordnung (Fenwal) entlang der vorstehend beschriebenen 2"-Linie, beginnend am oberen Ende und sich nach abwärts bewegend, abgegeben.
Die Tabelle 1 stellt die durch Testen des Fibrinogens bei 50 bis 130 mg/mg mit Thrombin mit 100 bis 1000 NIE E/ml in Abwesenheit von Calcium erhaltene Werte zusammen. Jeder Wertpunkt ist das Mittel aus vier Bestimmungen. Tabelle 1 Mittlere Gerinnungszeiten in Sekunden (+SD) Thrombin in NIH E/ml
* Nicht bestimmt - für eine Zeitmessung trat das Gerinnen zu rasch auf ("N" bedeutet den Mittelwert von 4 durchgeführten Messungen).
Wie Tabelle 1 zeigt, waren die Gerinnungszeiten bei der niedrigeren Thrombinkonzentration (z. B. 100 NIH E/ml) und niedrigem Proteingehalt (z. B. 50 mg/ml) lang. Es wurde auch beobachtet, daß die Mischung "laufend" war. Höhere Konzentrationen an Thrombin (z. B. 1000 NIH E/ml) zeigten im allgemeinen eine Gerinnung innerhalb der Abgabevorrichtung und wurden deshalb als ungeeignet betrachtet. Der Zusatz von CaCl&sub2; verbesserte das Aussehen des Gerinnsels und verkürzte im allgemeinen die Gerinnungszeit.
Tabelle 2 zeigt die Wirkung von [Ca&spplus;&spplus;] im Bereich von 0 bis 60 mM. Es wurde CaCl&sub2;-Lösung verwendet, um das Thrombin so zu rekonstituieren, daß der End-[Ca&spplus;&spplus;] in der 1 : 1-Mischung von FS die Hälfte des in der Tabelle angegebenen Wertes beträgt. Tabelle 2 Effekt von [Ca&spplus;&spplus;] auf die Gerinnungszeit Thrombin in NIH E/ml
* Nicht bestimmt - Für eine Zeitmessung trat die Gerinnung zu schnell auf.
[Protein] bedeutet die Konzentration des Gesamtproteins in mg/ml in der getesteten Formulierung.
Auf der Basis der obigen Ergebnisse wurde geschlossen, daß ein Proteinbereich von 90 bis 130 mg/ml und eine Thrombinkonzentration von 250 bis 500 NIH E/ml für weitere Untersuchungen geeignet sind. Es war auch ersichtlich, daß zugesetzte Calciumionen benötigt werden, um die Gerinnung zu erhöhen. Deshalb wurde in späteren Untersuchungen die Ca&spplus;&spplus;-Konzentration als Variable miteinbezogen.

B. Rate der Vernetzung

Diese Untersuchungen waren darauf gerichtet, die Rolle der Ca-Ionen und den Effekt von [Ca&spplus;&spplus;] auf das Ausmaß der Fibrinpolymerisation sowie die Rate der Vernetzung abhängig von der Zeit aufgrund der Fibrinpolymerisation zu bestimmen.
Die Fibrin-Vernetzungsreaktion wurde in einem System unter reduzierten Bedingungen, das SDS/PAGE verwendete, getestet. Die Trenngele bei 7,5% und die Stapelgele bei 3,75% wurden wie von Schwartz et al. (Journal of Clinical Investigation 50 (1971) 1506) beschrieben gegossen.
Thrombin (Amour Pharmaceutical) wurde mit oder ohne CaCl&sub2;-Lösung der gewünschten Molarität, d. h. 0, 2, 6, 12, 20, 40 oder 60 mM, rekonstituiert. Fibrinogen wurde mit Wasser rekonstituiert, rasch in einem 12 · 75 mm Reagensglas mit dem Thrombin gemischt, und für die Untersuchungen zum entsprechenden Zeitpunkt entnommen. Die Gerinnsel wurden mit 0,15 M NaCl gespült, dann in dem dreifachen Gerinnselvolumen 9M Harnstoff, der 3% SDS und 3% β-Mercaptoethanol enthielt, durch Kochen in einem Wasserbad bei 95 ± 5ºC gelöst. Die Lösungen des gelösten Gerinnsels wurden dann bei 5ºC bis zur Gelelektrophorese gelagert.
Der Effekt der CaCl&sub2;-Konzentration wurde mit Thrombin mit 500 NIH E/ml und Fibrinogen mit 90 mg/ml und 130 mg/ml nach 10 minütiger Gerinnungszeit getestet. Der Effekt der Ca&spplus;&spplus;- Konzentration auf die Rate des Verschwindens der γ-Bande unter Bildung des γ-γ-Dimers wird in den Fig. 2 und 3 gezeigt.
Wie in den Fig. 2 und 3 gezeigt, ist die Anwesenheit von Ca&spplus;&spplus; zur Vervollständigung der Fibrinpolymerisation notwendig. Weil Calciumionen im Bereich von 20 bis 60 mM vergleichbare Ergebnisse liefern, wurde zur Sicherstellung einer optimalen Polymerisation eine in der Mitte liegende Konzentration von 40 mM gewählt. Es besteht bei einer Messung zum untersuchten Zeitpunkt (10 Minuten) auch kein signifikanter Unterschied in der Fibrinpolymerisation zwischen den zwei Fibrinogenkonzentrationen (90 mg/ml und 130 mg/ml).
Vier Kombinationen aus Thrombin mit 250 NIH E/ml oder 500 NIH E/ml in 40 mM CaCl&sub2; und Fibrinogen mit 90 mg/ml oder 130 mg/ml wurden getestet, um den Effekt der Veränderung der Konzentrationen der Komponenten zu untersuchen. Die Proben wurden für die Gelelektrophorese nach einer Gerinnungszeit von 10 Minuten entnommen. Die Gelelektrophorese der vier Kombinationen von Thrombin (in 40 mM CaCl&sub2;) und Fibrinogen zeigten keine signifikanten Unterschiede beim untersuchten Zeitpunkt (10 Minuten).
Es wurde eine Zeitstudie durchgeführt, und 24 Stunden lang wurden Proben entnommen. Die Fig. 4 zeigt die Fibrinpolyme risationsreaktion im Verlauf der 24 Stunden-Periode. Die Bildung des γ-γ-Dimers tritt sehr rasch in Gegenwart von Ca&spplus;&spplus; (innerhalb einer Minute) auf, wie dies in Fig. 4 gezeigt wird. Das α-Polymer ist in diesem System bis zu einer Inkubationszeit von 10 Minuten nicht bestimmbar. Wenn das α-Polymer mit zunehmender Inkubationszeit (bis zu 24 Stunden) zunimmt, zeigt die α-Monomerbande eine entsprechende Abnahme in der Intensität.
Zusammenfassend wird festgestellt, daß die Zeitstudie demonstriert, daß die anfängliche Polymerisation (γ-γ-Dimer) fast sofort auftritt, wenn die Reaktionsteilnehmer gemischt werden, und sich die α-Polymeren langsamer bilden. Aus dieser Untersuchung kann geschlossen werden, daß die Gegenwart von Ca-Ionen zur Polymerisation notwendig ist, und daß die Ergebnisse mit denen vorher in der Literatur berichteten vergleichbar sind (T. Seelich, J. Head & Neck Pathol., 3 (1982) 65-69; M. Schwartz et al., J. Clinical Inv. 50 (1971) 1506- 1513).

C. Reißfestigkeit

Die Reißfestigkeit des Fibrinklebers wurde untersucht, indem man am Gerinnsel eine Beanspruchung appliziert, bis ein Bruch des Materials beobachtet wird, und die im Zugbeanspruchungs- Belastungs-System erforderliche Kraft mißt. Zusätzlich wurde die Veränderung der Bruchbeanspruchung als Funktion einer Veränderung der in der Polymerisationsmischung zur Herstellung des Klebers verwendeten Komponenten untersucht.
Zur Untersuchung der Reißfestigkeit des Fibrinklebers wurde eine Form entworfen, die auf der von Nowotny et al. (Biomaterials 2 (1981) 55), mit der Ausnahme einer Modifikationen, entsprach. Die neu entworfene Form wurde aus einem transpa renten Kunststoff hergestellt, um eine visuelle Prüfung der Gerinnselbildung zu erleichtern. Die Gerinnung wurde zur leichteren Reinigung in Gerinnsel-Halterungen für den einmaligen Gebrauch durchgeführt.
Die Gerinnsel-Halterungen wurden erhalten, indem man Einweg- Vollpipetten aus Kunststoff (SAMCO, San Fernando Mfg. Co.) aufschnitt. Zwei kleine Stücke aus einem angefeuchten Schwamm wurden verwendet, um die Gerinnungsmischung an beiden Enden zu halten. Einweg-Gerinnselhalterungen mit den angebrachten Schwämmen wurden durch die Endhalterungen und in die Form eingeführt (die Endhalterungen waren in der Form enthalten). Ein Tensometer-Instrument (T10, Monsanto) wurde zur Messung und Aufzeichnung der Peak-Bruchbeanspruchung der Gerinnsel verwendet. Es wurden Adapter für die T10-Griffe hergestellt, um die Endhalterungen zu halten.
Die Gerinnsel wurden ausgebildet, indem man gleiche Volumina an Fibrinogen und Thrombin (mit oder ohne CaCl&sub2;) unter Verwendung einer Zweispritzen-Abgabevorrichtung (Fenwal) und einer 3 Inch 22 Gauge-Nadel injizierte. Vor dem Einbringen der Spritzen in ihrer Halterung wurden alle Blasen entfernt. Die Nadel wurde durch ein Schwamm-"Top", durch die Form und in den anderen Schwamm-"Boden" eingeführt. Ein unter der gesamten Form angebrachter Parafilm (American Can Co.) verhinderte eine Leckage von überschüssiger Mischung. Nach Ausfüllen der Form durch die Gerinnungsmischung wurde die Nadel entfernt.
Ca. 2 bis 5 Minuten vor dem Testen wurde das Gerinnsel aus der Form entfernt und in die T10-Griffe gegeben. Zur Testzeit wurde das Gerinnsel mit einer Rate von 100 mm/min gestreckt. Die Gauge-Länge wurde (etwas willkürlich) mit 6,0 cm festgesetzt, und der Querschnitt des Gerinnsels betrug 0,049 cm². T10 gibt die Beanspruchungswerte in kg/cm³ an. Tabelle 3 Effekt von CaCl&sub2; auf die Reißfestigkeit des Fibrinklebers Reißfestigkeit kg/cm²
* Fibrinogenlot #2830R129
Die Messungen der Reißfestigkeit (Peakbeanspruchung) wurden 10 Minuten nach Injektion der Gerinnungsmischung durchgeführt. Die Ergebnisse in Tabelle 3 zeigen den Effekt der Variation der CaCl&sub2;-Konzentration, wenn das Thrombin 250 NIH E/ml oder 500 NIH E/ml beträgt. Drei Konzentrationen an Fibrinogen (90, 110 und 130 mg/ml) wurden getestet. Jede Messung der Peakbeanspruchung war das Mittel aus N Bestimmungen. Pro Punkt wurde ein Minimum von 8 Ablesungen gemacht.
Wie die Tabelle 3 zeigt, wiesen die Gerinnsel in Abwesenheit von Ca&spplus;&spplus; die geringsten Peakbeanspruchungswerte für beide Thrombinkonzentrationen und bei allen Fibrinogengehalten auf. Der Zusatz von Ca-Ionen mit 10 bis 60 mM erhöhte die Reißfestigkeit für alle Thrombin/Fibrinogen-Konzentrationen. Im allgemeinen wurden höhere Werte bei der höheren Thrombinkonzentration, d. h. 500 NIH E/ml beobachtet, die auch etwas ähnliche Werte für [Ca&spplus;&spplus;] im Bereich von 20 bis 60 mM (Ca&spplus;&spplus;) ergaben. Die niedrigste Standardabweichungs (SD)-Werte wurden bei 40 mM CaCl&sub2; beobachtet.
Um diese Resultate zu bestätigen, wurde eine zweite Charge an menschlichem Fibrinogen getestet, und die Ergebnisse wurden bei 40 und 60 mM CaCl&sub2; und 500 NIH E/ml Thrombin verglichen. Die Ergebnisse der Tests der zweiten Fibrinogencharge zeigen im allgemeinen ähnliche Werte der Peakbeanspruchung, insbesondere bei den höheren Fibrinogenkonzentrationen von 110 und 130 mg/ml, und zeigten ebenfalls höhere Werte bei 90 mg/ml.
Zeituntersuchungen der Gerinnsel-Reißfestigkeit wurden während eines Zeitraums von 24 Stunden durchgeführt unter Verwendung von Fibrinogen bei 90 mg/ml und 130 mg/ml, und bei einer Thrombinkonzentration von 500 NIH E/ml, und CaCl&sub2; mit 40 mM. Während eines 24 Stunden-Zeitraums zeigte die Reißfestigkeit keine signifikante Verringerung des Werts. Weil die Vernetzung mit der Zeit fortschreitet, wurde eine allmähliche Erhöhung der Peakbeanspruchung erwartet.

D. Gerinnsellyse-Untersuchungen

Es wurde die Zeit bestimmt, während der das Fibringerinnsel fest bleibt, wenn es bei 37ºC unter sterilen feuchten Bedingungen mit und ohne Plasminogen-Aktivator inkubiert wird. Ebenfalls getestet wurde der Effekt der Zugabe von Proteaseinhibitor (Aprotinin) zur Reaktionsmischung auf die Gerinnsel-Langlebigkeit.
Unter Verwendung der folgenden Verdünnungsmittel wurde eine sterile menschliche Fibrinogenlösung hergestellt:
a) steriles Wasser (d. h. 0 KIU/ml Aprotinin);
b) Aprotininlösung mit 1000 KIU/ml;
c) Aprotininlösung mit 3000 KIU/ml;
um eine der drei Konzentrationen von 90, 110 oder 130 mg/ml Gesamtprotein zu erhalten.
Thrombin wurde hergestellt durch Rekonstituieren mit einer 40 mM CaCl&sub2;-Lösung, um entweder 250 oder 500 NIH E/ml herzustellen. Somit wurden 6 Kombinationen von Thrombin und Fibrinogen getestet. Urokinase (Abbott) wurde mit 5 E/ml in normaler Kochsalzlösung hergestellt.
Fibrin-Gerinnsel wurden ausgebildet, indem man gleiche Volumina an Fibrinogen (in H&sub2;O oder Aprotinin) und Thrombin (in CaCl&sub2;-Lösung) in einem zylindrischen Silicon-Röhrchen (5 mm Innendurchmesser) mischte. Die Mischung wurde unter Verwendung einer Zweispritzen-Verabreichungsvorrichtung (Fenwal) abgegeben. Die Abgabevorrichtungen und das Silicon-Röhrchen wurden im Autoklaven sterilisiert.
Unter Verwendung von Parafilm wurde ein Silicon-Röhrchen mit einer Länge von 10 cm an einem Ende verschlossen. Indem das Röhrchen in einem Winkel von ca. 10º zur Vertikalen gehalten wurde, wurde die Fenwal-Vorrichtung verwendet, um das Fibrinogen und Thrombin rasch in das Röhrchen zu injizieren, wobei die (22 g)-Nadelspitze gerade den Parafilm durchdringt. Nach Verfestigung des Gerinnsels während 20 Minuten wurde das 10 cm-Siliconröhrchen in Stücke von 3 cm Länge geschnitten, um ein Gerinnselvolumen von 590 ul zu erhalten. Jedes 3 cm-Segment wurde in Hälften geschnitten, und die zwei Hälften in ein Loch einer sterilen 24-Lochplatte (Corning) gegeben.
Segmente, bei denen Luftblasen festgestellt wurden, wurden verworfen. Das Gerinnsel wurde aus dem Röhrchen durch sanftes Quetschen des Röhrchen an einem Ende extrudiert. Es wurde mit 1 ml steriler Salzlösung gespült, und dann wurde 1 ml von entweder Urokinase oder Salzlösung dem Loch zugegeben und die Platte in einen sterilen feuchten 37ºC-Inkubator gegeben. Alle 24 Stunden wurden die Überstände jedes Loches zum Testen unter Verwendung des Fibrin(ogen)s Degradation Products Agglunation-Kits (Baxter Dade) entnommen.
Die Urokinase- und Salzlösungen wurden täglich durch frische Reagentien ersetzt, bevor die Platte wieder in den 37ºC- Inkubator zurückgegeben wurde. Alle Zubereitungen und Probenahmen der Überstände wurde unter sterilen Bedingungen vorgenommen. Die Gerinnsel wurden visuell untersucht und ihr Aussehen notiert. Nach 14 Tagen wurde das Experiment beendet. Die Gesamtzahl der getesteten Bedingungen betrug 36, und alle Bedingungen wurden zweifach durchgeführt.

Tabelle 4

Gerinnsellyse-Zeiten

[+ Urokinase, kein Aprotinin]

Bedingung Zeit, nach der das Gerinnsel seine zylindrische Form verlor

130 mg/ml Fibrinogen + 500 E/ml Thrombin Tag 10
130 mg/ml Fibrinogen + 250 E/ml Thrombin Tag 8
110 mg/ml Fibrinogen + 250 E/ml Thrombin Tag 7
110 mg/ml Fibrinogen + 500 E/ml Thrombin Tag 11
90 mg/ml Fibrinogen + 500 E/ml Thrombin Tag 8
90 mg/ml Fibrinogen + 250 E/ml Thrombin Tag 8
Die Tabelle 4 stellt die Gerinnsellyse-Zeit (definiert als die Zeit, in der die Gerinnsel ihre zylindrische Form verlieren) in Gegenwart von Urokinase und ohne Aprotinin zusammen. Der beobachtete Bereich betrug 7 bis 11 Tage mit einem Mittel von 8,66 ± 1,5d. Die Messungen der Fibrin(ogen) Degradation Products (FDP) (Fibrinogen)-Abbauprodukte zeigten einen Aktivitätspeak, der im allgemeinen der Zeit entsprach, oder dieser bald nachfolgte, bei dem die Gerinnsel ihre wohl definierte Form verloren hatten.
Wenn Urokinase weggelassen wird und die Gerinnsel nur in normaler Salzlösung inkubiert werden, und zwar in Gegenwart oder Abwesenheit von Aprotinin, behielten die Gerinnsel ihre Integrität während der gesamten Beobachtungsperiode (d. h. 14 Tage) bei. FDP-Messungen bestätigten die Abwesenheit einer signifikanten Gerinnsellyse.
Diese Untersuchung zeigt, daß dann, wenn das Gerinnsel nicht durch irgendwelche Plasminogenaktivatoren in situ beeinflußt wird, erwartet werden kann, daß sie mindestens 14 Tage halten. Wenn Urokinase vorhanden ist, halten die Gerinnsel mindestens 7 Tage. Diese Zeitspannen können ausreichen, damit der Heilungsmechanismus seine natürliche Rolle erfüllen kann. Auf der Basis dieser Ergebnisse kann deshalb geschlossen werden, daß Spuren von Plasminogen in den Fibrinogenzubereitungen die Langlebigkeit des Gerinnsels nicht nachteilig beeinflussen, und daß die Zugabe eines Proteaseinhibitors, wie z. B. vom Aprotinin, nicht notwendig ist.

Beispiel 3

TFC-in vivo-Test

Um die optimale Konzentration an TFC zu bestimmen, wurden Untersuchungen unter Verwendung eines in vivo-Modells durchgeführt. Swiss Webster-Mäuse (20-25 g) wurden in 10 Gruppen von je 5 für das Testen verwendet. Nach dem verwendeten Protokoll wurde jedes Tier anästhesiert, gewogen, und ein kleines Hautstück vom Rücken des Tiers entfernt. Die Hautprobe wurde in eine Salzlösung getaucht und mit einer Gottlob-Vorrichtung verbunden. Gleiche Volumina an TFC und Thrombin mit verschiedenen Konzentrationen (Tabelle 2) wurden dann gleichzeitig auf die Wunde aufgetragen, und die Haut wieder auf das Tier gesetzt, und ca. 2 Minuten lang an der Stelle gehalten. Das anästhesierte Tier wurde mit dem Gesicht nach unten auf eine Plattform gestellt, die dann an einem Tensometer (Monsanto Company) positioniert wurde, und die Gottlob-Vorrichtung an den Greifern angebracht. Die Tensometer-Parameter wurden festgesetzt mit: (1) Fläche: 1,76 cm²; (2) Geschwindigkeit: 10,0 mm/min. (3) Gauge: 1,0 cm; (4) Belastungsbereich: 500,0%. Die Kraft, die erforderlich ist, um den Kolben (mit der Hautprobe) vom Rücken des Tieres zu trennen, wurde in g/cm² angegeben. Die Daten aus diesen Experimenten wurden unter Verwendung einer RS1/Discover- Software (BBN Software Corp., Cambridge, MA) statistisch ausgewertet. Die Analyse der Ergebnisse dieser Untersuchung zeigte, daß TFC mit 120 bis 130 mg/ml und Thrombin mit 250 E/ml maximale Adhäsionsreaktionen ergab.
Die Fähigkeit des Gerinnsels, am Gewebe in vivo zu haften, ist wichtig zur Aufrechterhaltung der Hämostase. In diesem Experiment trat im Bereich der getesteten Reagentien eine maximale Adhäsionsreaktion auf, was die in vitro-Ergebnisse des Beispiels 2 bestätigt.
Die vorhergehenden Beispiele und die Beschreibung sind zum besseren Verständnis der vorliegenden Erfindung angegeben, und sind deshalb nur beispielhaft, aber nicht beschränkend.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung einer Hämostase-fördernden Zusammensetzung, die von menschlichem Plasma oder Plasmafraktionen abgeleitet ist, wobei das menschliche Plasma oder die Plasmafraktionen Fibrinogen, Faktor VIII und Plasminogen umfassen, umfassend die Stufen:

(a) Bereitstellen einer kryopräzipitierten Plasma-Zubereitung aus dem menschlichen Plasma oder den Plasmafraktionen;

(b) Abtrennen des Kryopräzipitats von der kryopräzipitierten Plasma-Zubereitung;

(c) Ausbilden eines Kältepräzipitats durch Auflösen des Kryopräzipitats in einem Medium und Abkühlen des Mediums, wobei das Kältepräzipitat wesentlich weniger Faktor VIII aufweist als das Kryopräzipitat;

(d) Suspendieren des Kältepräzipitats der Stufe (c) in einem Salz-enthaltenden Puffer, um Prothrombinkomplexe aus dem Kryopräzitat zu entfernen;

(e) Behandeln des aus der Suspension in Stufe (d) erhaltenen Überstandes mittels Affinitätschromatographie an einer Lysin-gebundenen festen Matrix, um daran Plasminogen adsorbieren zu lassen;

(f) Sammeln der nicht mehr als Spuren Plasminogen enthaltenden Fraktion;

(g) In-Kontakt-bringen der Fraktion von Stufe (f) mit einer virusinaktivierend-wirksamen Menge eines antiviralen Mittels;

(h) Entfernen des antiviralen Mittels aus dem in Stufe (g) erhaltenen virusinaktivierten Material; und

(i) Gewinnen der Fibrinogen-enthaltenden Zusammensetzung.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Kryopräzipitat in Stufe (c) zuerst in Wasser mit einer Temperatur von ca. 20ºC bis ca. 35ºC gelöst wird und das Abkühlen bei einer Temperatur von 10ºC bis ± 5ºC durchgeführt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei zu dem gelösten Kryopräzipitat in Stufe (c) Calciumionen in einer Konzentration zugegeben werden, die ausreicht, um die Ausfällung von Fibrinogen zu erhöhen.

4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei die Calciumionen in Form eines Calciumsalzes vorliegen.

5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei das Calciumsalz CaCl&sub2; ist.

6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei CaCl&sub2; bis zu einer Endkonzentration von 0,001 mM bis 1 mM zugegeben wird.

7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei das CaCl&sub2; bis zu einer Endkonzentration von 0,040 mM zugefügt wird.

8. Verfahren nach Anspruch 1, das außerdem die Stufe (c') vor der Stufe (d) umfaßt, wobei die Stufe (c') die Behandlung des Kältepräzipitats mit einem Proteaseinhibitor bei einer Konzentration umfaßt, die ausreicht, um die Thrombinaktivität zu inhibieren.

9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei der Proteaseinhibitor ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus PPACK, Heparincofaktor II, Hirudin und Antithrombin III (AT III) besteht.

10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei die Konzentration an PPACK 0,75 uM bis 1,75 uM beträgt.

11. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die feste Matrix der Stufe (c) Agarose ist.

12. Verfahren nach Anspruch 1, das außerdem die Stufe (f') vor der Stufe (g) umfaßt, wobei die Stufe (f') die Behandlung der Fraktionen durch Zugabe von Polyethylenglykol (PEG) umfaßt.

13. Verfahren nach Anspruch 12, wobei das PEG ein Molekulargewicht von ca. 3000 Dalton bis ca. 8000 Dalton aufweist.

14. Verfahren nach Anspruch 13, wobei das PEG ein Molekulargewicht von ca. 3350 Dalton aufweist.

15. Verfahren nach Anspruch 12, wobei in Stufe (f') das PEG bis zu einer Endkonzentration von 3% bis 7% zugegeben wird.

16. Verfahren nach Anspruch 12, wobei in Stufe (f') das PEG bis zu einer Endkonzentration von 4% (Gew/Gew) zugegeben wird.

17. Verfahren nach Anspruch 1, wobei in Stufe (g) das antivirale Mittel ein Detergens ist.

18. Verfahren nach Anspruch 17, wobei das Detergens nicht-ionisch ist.

19. Verfahren nach Anspruch 18, wobei die Konzentration des Detergens 0,001% (V/V) bis 10% (V/V) beträgt.

20. Verfahren nach Anspruch 19, wobei die Konzentration des Detergens 0,01% (V/V) bis 2% (V/V) beträgt.

21. Verfahren nach Anspruch 17, wobei eine Mischung aus Detergentien verwendet wird.

22. Verfahren nach Anspruch 21, wobei die Mischung nicht-ionisch ist.

23. Verfahren nach Anspruch 22, wobei die Mischung ein sulfatiertes oxyethyliertes Alkylphenol und ein polyoxyethyliertetes Esterderivat umfaßt.

24. Verfahren nach Anspruch 23, wobei das sulfatierte oxyethylierte Alkylphenol Triton X-100 ist.

25. Verfahren nach Anspruch 23, wobei das polyoxyethylierte Esterderivat Polysorbat 80 ist.

26. Verfahren nach Anspruch 22, wobei die gesamte Endkonzentration der Detergentienmischung 1% (V/V) bis 2% (V/V) beträgt.

27. Verfahren nach Anspruch 22, wobei die gesamte Endkonzentration der Detergentienmischung 1% (V/V) bis 1,5% (V/V) beträgt.

28. Verfahren nach Anspruch 22, wobei die gesamte Endkonzentration der Detergentienmischung 1,2% (V/V) bis 1,4% (V/V) beträgt.

29. Verfahren nach Anspruch 24, wobei die Endkonzentration an Triton X-100 einen Wert von 0,8% (V/V) bis 1,2% (V/V) hat.

30. Verfahren nach Anspruch 25, wobei die Endkonzentration an Polysorbat 80 einen Wert von 0,2% (V/V) bis 0,4% (V/V) hat.

31. Verfahren nach Anspruch 1, wobei in Stufe (g) das antivirale Mittel ein organisches Lösungsmittel ist.

32. Verfahren nach Anspruch 31, wobei das organische Lösungsmittel ein Alkylphosphat ist.

33. Verfahren nach Anspruch 32, wobei das Alkylphosphat Tri-(n-butyl)-phosphat ist.

34. Verfahren nach Anspruch 33, wobei die Endkonzentration an Tri-(n-butyl)-phosphat 0,2% (V/V) bis 0,4% (V/V) beträgt.

35. Verfahren nach Anspruch 17 oder Anspruch 31, wobei das antivirale Mittel durch Adsorbieren von Fibrinogen an einem anionischen Austauscherharz und Wegwaschen des nicht an das Harz gebundenen antiviralen Mittels entfernt wird.

36. Verfahren nach Anspruch 35, wobei der Rest im anionischen Austauscherharz Diethylaminoethyl (DEAE) ist.

37. Verfahren nach Anspruch 36, wobei das DEAE an Cellulose gebunden ist.

38. Verfahren nach Anspruch 37, wobei die Anionenaustauscher-Matrix DE 52-Cellulose ist.

39. Verfahren nach Anspruch 35, wobei das an das Anionenaustauscherharz gebundene Material mit 0,25 M bis 0,40 M NaCl eluiert wird.

40. Verfahren nach Anspruch 1, das außerdem die folgenden Stufen umfaßt:

(j) Zugeben eines Stabilisators und/oder eines Solubilisators zu der in Stufe (i) erhaltenen Zusammensetzung;

(k) Aufkonzentrieren der Zusammensetzung der Stufe (j) auf ca. 20% bis ca. 50% ihres ursprünglichen Volumens;

(l) Verdünnen des Konzentrats der Stufe (k) auf sein Volumen vor der Aufkonzentrierung;

(m) Aufkonzentrieren der Zusammensetzung der Stufe (1) auf ca. 3 g% bis ca. 5 g% (Gew/Vol), und

(n) sterile Aufarbeitung der Zusammensetzung.

41. Verfahren nach Anspruch 40, wobei in Stufe (n) die Zusammensetzung zusätzlich lyophilisiert wird.

42. Verfahren nach Anspruch 40, wobei das Volumen der Zusammensetzung vor der Lyophilisierung etwa das dreifache des Volumens der Zusammensetzung nach dem Resuspendieren des Lyophilisats beträgt.

43. Verfahren nach Anspruch 42, wobei in dem resuspendierten Lyophilisat NaCl in einer Konzentration von 0,1 M bis 0,2 M vorhanden ist.

44. Verfahren nach Anspruch 40, wobei in Stufe (j) der Stabilisator menschliches Serumalbumin (HSA) ist.

45. Verfahren nach Anspruch 44, wobei das HSA in einer Menge von 70 mg bis 100 mg pro Gramm Protein im Eluat enthalten ist.

46. Verfahren nach Anspruch 40, wobei in Stufe (j) der Solubilisator ein polyoxyethyliertes Esterderivat ist.

47. Verfahren nach Anspruch 46, wobei das polyoxyethylierte Esterderivat Polysorbat 80 ist.

48. Verfahren nach Anspruch 47, wobei das Polysorbat 80 in einer Menge von ca. 10 mg bis ca. 20 mg pro Gramm Protein im Eluat enthalten ist.

49. Verfahren nach Anspruch 40, wobei in Stufe (k) und in Stufe (m) das Aufkonzentrieren durch Ultrafiltration erreicht wird.

50. Verfahren nach Anspruch 49, wobei die Ultrafiltration eine Membran mit einer 30000 Dalton-Molekulargewichts-Ausschlußgrenze verwendet.

51. Hämostase-fördernde Zusammensetzung, die von menschlichem Plasma oder Plasmafraktionen abgeleitet ist, wobei die Zusammensetzung:

(a) darin 75% bis 95% menschliches Fibrinogen enthält;

(b) darin 10 bis 40 Einheiten/ml von menschlichem F XIII enthält;

(c) virusinaktiv ist;

(d) im wesentlichen nicht-pyrogen ist;

(e) darin nicht mehr als Spuren von Plasminogen enthält;

(f) frei ist von Protein, das durch eine nichtmenschliche DNA-Sequenz kodiert wird;

(g) im wesentlichen frei ist von Thrombin; und

(h) keinen Fibrinolyse-Inhibitor enthält.

52. Zusammensetzung nach Anspruch 51, wobei die Zusammensetzung lyophilisiert ist.

53. Zusammensetzung nach Anspruch 51, wobei sie ferner einen Stabilisator aufweist.

54. Zusammensetzung nach Anspruch 53, wobei der Stabilisator HSA ist.

55. Zusammensetzung nach Anspruch 53, wobei das HSA in einer Konzentration von 0,5 g% bis 1,5 g% vorliegt.

56. Zusammensetzung nach Anspruch 51, wobei sie ferner einen Solubilisator umfaßt.

57. Zusammensetzung nach Anspruch 56, wobei der Solubilisator ein polyoxyethyliertes Esterderivat ist.

58. Zusammensetzung nach Anspruch 57, wobei das polyoxyethylierte Esterderivat Polysorbat 80 ist.

59. Zusammensetzung nach Anspruch 58, wobei das Polysorbat 80 in einer Menge von 0,1% bis 0,3% vorliegt.

60. Zusammensetzung nach Anspruch 51, die außerdem eine therapeutisch wirksame Menge eines Arzneimittels aufweist.

61. Zusammensetzung nach Anspruch 51, die außerdem eine diagnostisch wirksame Menge eines Diagnostikums umfaßt.

62. Verwendung einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 51 bis 61 zur Herstellung eines Fibrinklebers.

63. Fibrinkleber, der folgendes aufweist:

(i) eine Hämostase-fördernde Zusammensetzung, die von menschlichem Plasma oder Plasmafraktionen abgeleitet ist, wobei die Zusammensetzung:

(a) darin 75% bis 95% menschliches Fibrinogen enthält;

(b) darin 10 bis 40 Einheiten/ml von menschlichem F XIII enthält;

(c) virusinaktiv ist;

(d) im wesentlichen nicht-pyrogen ist;

(e) darin nicht mehr als Spuren von Plasminogen enthält;

(f) frei ist von Protein, das durch eine nichtmenschliche DNA-Seguenz kodiert wird;

(g) im wesentlichen frei ist von Thrombin; und

(h) keinen Fibrinolyse-Inhibitor enthält;

(ii) Thrombin; und

(iii) Calcium.