DE69220739T2

DE69220739T2 - Quantitativer Nachweis vom Lipid

Info

Publication number: DE69220739T2
Application number: DE69220739T
Authority: DE
Inventors: Masahiro Kawaguchi; Tsuyoshi Nomoto; Junji Ohyama; Yasuko Tomida; Nobuko Yamamoto
Original assignee: Canon Inc
Current assignee: Canon Inc
Priority date: 1991-09-09
Filing date: 1992-09-08
Publication date: 1998-01-15
Anticipated expiration: 2012-09-09
Also published as: ATE155249T1; DE69220739D1; EP0767384B1; EP0767384A2; EP0531933B1; EP0767384A3; DE69233452D1; US5491093A; DE69233452T2; EP0531933A2; DE69233570T2; EP1022567B1; EP1022567A1; US5770452A; ATE284035T1; DE69233570D1; ATE312353T1; EP0531933A3

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Gebiet der Erfindung

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum quantitativen Nachweis bzw. der quantitativen Bestimmung von Lipid.

In Beziehung stehender Stand der Technik

Lipide sind Baubestandteile von Zellen oder Organismen. Unter den Lipiden ist Phospholipid ein Hauptlipid beim Aufbau verschiedener Membranen in den Zellen, wie der Plasmamembran, der Kernmembran, der Membran des endoplasmatischen Retikulums, der Mitochondrienmembran, der Membran des Golgi- Körpers, der Lysosommembran und ähnliches. Das Phospholipid ist ein amphiphiles Molekül, daß sowohl eine polare Gruppe als auch eine hydrophobe Gruppe in dem Molekül aufweist. Wenn Phospholipid in Wasser suspendiert wird, werden die polaren Gruppen durch Wassermoleküle hydratisiert und die hydrophoben Gruppen werden aus der wäßrigen Umgebung ausgeschlossen und es kommt zu einer Ansammlung bzw. Anhäufung hydrophober Gruppen der Lipide. Konsequenterweise werden Mizellen, Lipiddoppelschichten mit einer bimolekularen Membranstruktur oder hexagonale II-Strukturen gebildet: der Zustand der Anhäufung hängt von dem Gleichgewicht zwischen dem Volumen der hydratisierten hydrophilen Gruppen und der hydrophoben Gruppen ab. Unter diesen Strukturen stellt die Lipiddoppelstruktur die Grundstruktur der Biomembranen dar. Die Doppelschicht aus Phospholipid bildet ein geschlossenes Bläschen (Liposom), das in der Lage ist ein Membranprotein oder ähnliches als Bestandteil einzubauen und eine wäßrige Phase einzuschließen. Deshalb wird die Phospholipiddoppelstruktur häufig als Modell für eine Biomembran für eine Substanzpermeation, Informationsübertragung und dergleichen verwendet. Ferner ist das Liposom für die Verwendung als medizinische Kapsel vielversprechend, da das Liposom in der Lage ist eine wasserlösliche Substanz in seiner inneren wäßrigen Phase auf zubewahren.
Viele Verfahren für die quantitative Bestimmung von Phospholipid sind bekannt, einschließlich eines Verfahrens der Naßverbrennung (Hoeflmayr, J. und Fried, R; Med. und Ern 7 9-10 (1966)) und eines Cholinoxidase-Phenol-Verfahrens (Takayama, M., Itoh, S., Nagasaki, T. und Tanimizu, I., Clin. Chim. Acta 79 93-98 (1977)). In dem Naßverbrennungsverf ahren wird das Phospholipid durch die Zugabe von Schwefelsäure und einem Permanganatsalz zu einer Probe, dem Erwärmen der Mischung in einem siedenden Wasserbad, um den Phosphorsäurebestandteil freizusetzen, der Zugabe von Ammoniummolybdat und einem Reduktionsmittel, und der Messung der durch das dabei gebildete Molybdänblau hervorgerufenen Lichtabsorbanz ermittelt. In dem Cholinoxidase-Phenol-Verfahren wird das Phospholipid durch die Umsetzung von Phospholipidase D mit dem Phospholipid in einer Probe, um den Cholinbestandteil freizusetzen, ferner der Umsetzung von Cholinoxidase mit dem resultierenden Cholin, um Betain und Wasserstoffperoxid zu bilden, und der Messung der Lichtabsorbanz des Produkts einer quantitativen Kondensationsoxidation des Phenols mit 4-Aminoantipyrin, die durch das Wasserstoffperoxid in Gegenwart von Peroxidase veranlaßt wird, ermittelt.
Das vorstehend erwähnte Naßverbrennungsverfahren weist den Nachteil auf, daß bei seiner Durchführung die sequentielle Zugabe der verschiedenen Reagenzien sehr beschwerlich ist, und die Gefahr besteht, daß es aufgrund des Erwärmens in Gegenwart von Schwefelsäure in einem siedenden Wasserbad zu einem Stoßen beim Siedeverzug und einem Meßfehler kommt. Das Cholinoxidase-Phenol-Verfahren weist den Nachteil auf, daß das Enzym instabil ist, die Reagentien in einer kalten und dunklen Umgebung aufbewahrt werden müssen, und daß die im Laufe der Zeit erhaltenen Meßdaten eine unzureichende Reproduzierbarkeit aufweisen.
Im allgemeinen wird die quantitative spektochemische Absorptionsanylase, in der die Absorbanz bei einer für das Objekt der Analyse in der Probe charakteristischen Wellenlänge gemessen wird, bei der quantitativen Bestimmung einer Substanz weithin praktisch angewandt, da die direkte Messung der Absorbanz einfach ist, die Notwendigkeit, das Objekt der Analyse mit einer anderen Substanz umzusetzen, entfällt, und somit eine spätere Verwendung der Probe für einen anderen Zweck ermäglicht wird.
Dieses Analyseverfahren wurde jedoch bei der Bestimmung der Lipide nicht angewandt, da Lipide, wie das Phospholipid, die aus amphiphilen Molekülen bestehen, in einem wäßrigen Medium Aggregate in verschiedenen Zuständen bilden, die das Licht streuen und eine genaue Gehaltsbestimmung der Lipidkonzentration mittels der Lichtabsorbanz verhindern.
US-Patentschrift US-A-4 839 294 offenbart ein enzymfreies, Nachweisverfahren, das ohne Hydrolyse auskommt, das für die Bestimmung des Lipidgehalts einer lipidhaltigen Flüssigkeit nützlich ist, das die Bildung eines wasserunlöslichen Komplexes aus einem geladenen Farbstoff und einem gegensätzlich geladenem Detergenz, die Inkubation des Farbstoff-Detergenz- Komplexes in einer wäßrigen Dispersion einer lipidhaltigen Flüssigkeit, wobei der lipidhaltigen Flüssigkeit eine charakteristische Färbung verliehen wird, umfaßt.
Die Baubestandteile von Lebewesen, wie Lipide, Proteine, Nukleinsäuren, Zucker werden oft in einem coexistierenden Zustand verwendet. Deshalb ist die quantitative Bestimmung solcher coexistierender Substanzen ein wichtiger Arbeitsgang.
Die britische Patentschrift GB-A-2 043 244 offenbart ein Verfahren für die Bestimmung von zwei oder mehr Bestandteilen in einer flüssigen Probe. In diesem Verfahren werden Reagentien für verschiedene Bestandteile zu der Probe gegeben, wobei die Zusammensetzung der Reagenzien so ausgewählt wird, daß sich die einzelnen Bestandteile für unterschiedliche Bestimmungen nicht gegenseitig stören. Die Absorptionen der entsprechenden Reaktionsprodukte werden in der Probe bei zwei verschiedenen Wellenlängen gemessen.
Biomembranen weisen eine Struktur aus einer Doppelschichtmembran auf, die hauptsächlich aus Lipidmolekülen besteht, in der sich durch nicht-kovalente Bindungen Proteine ansammeln, wodurch sie als Barriere, zur Aufbewahrung des Mediums im Inneren, fungiert. Das Verhältnis von Lipid zu Protein in Biomembranen weist in Abhängigkeit von den entsprechenden Membranen starke Unterschiede auf. In Membranen von Mitochondrien ist zum Beispiel viermal so viel Protein wie Lipid enthalten. Andererseits ist in einigen Biomembranen Lipid in einer Menge enthalten, die dem Mehrfachen des Proteins entspricht. Dementsprechend ist das Verhältnis von Lipid zu Protein in der Biomembran in den entsprechenden Organen ein wichtiger Untersuchungsgegenstand.
Verschiedene Biomembranmodelle, in denen Lipid und Protein gemeinsam auftreten, werden weithin für Untersuchungen der Struktur und der Funktion von Biomembranen verwendet. Die Beispiele schließen ein: Proteoliposom, das geschlossene Bläschen aufweist, die aus einer künstlichen bimolekularen Lipidmembran bestehen, die darin Protein enthält; feine Teilchen aus Glasperlen oder einem Hochpolyiner, die auf der Oberfläche adsorbiertes Lipid oder Protein enthalten; eine planare Lipidmembran, die in einem kleinen Loch in einem Substrat gebildet ist, das aus Teflon oder ähnlichem hergestellt ist (eine schwarze Lipidmembran), oder ein planarer bimolekularer Film, der durch Durchstoßen oder Steckpipettieren (sticking or patch-pipeting) aufgebaut wurde und in dem Protein eingeschlossen ist; und Langmuir-Blodgett-Oberflächenf ilme (LB-Oberflächenfilme), in denen ein coexistierendes Lipid-Protein-System aus Schichten im molekularen Maßstab aufgebaut ist. In diesen künstlichen Filmen ist die Bestimmung des Lipids und Proteins auch für die Bewertung ihrer Funktion wichtig.
Wenn das optimale Verhältnis von Lipid zu Protein in natürlichen oder künstlich hergestellten Membranstrukturen durch eine quantitative Bestimmung erhalten werden kann, und eine Membran entsprechend dem erhaltenen Verhältnis wirkungsvoll synthetisiert werden kann, dann können verschiedene Membranstrukturen industriell mit geringen Kosten und ohne Verschwendung von wertvollem Protein synthetisiert werden.
Weitere Beispiele von Systemen aus coexistierendem Lipid und Protein schließen Liposom ein, d.h. ein geschlossenes Bläschen, das aus einer Phospholipidmembran besteht, in dem ein funktionelles Protein, wie ein wasserlösliches Enzym, eingeschlossen ist; und sie schließen Emulsionen ein, in denen Lipid und Protein in einem flüssigen Medium einfach gemischt sind.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Es ist eine Aufgabe der Erfindung ein stark vereinfachtes Verfahren für die Bestimmung von Lipid in einem wäßrigen Medium, insbesondere ein vereinfachtes Verfahren für die Bestimmung von amphiphilem Lipid, das sich unter wäßrigen Bedingungen ansammelt bzw. zusammenlagert, zur Verfügung zu stellen.
Erfindungsgemäß wird ein Verfahren für die quantitative Bestimmung von Lipid zur Verfügung gestellt, das die Herstellung einer flüssigen Probendispersion durch die Behandlung einer Probe, die Lipid enthält, mit einem grenzflächenaktiven Mittel in einem wäßrigen Medium, um eine Mizelle zu bilden, die aus dem Lipid und dem grenzflächenaktiven Mittel besteht, wobei das grenzflächenaktive Mittel im UV-Bereich keine Absorption zeigt; und die Messung der Lichtabsorbanz der flüssigen Probendispersion im ultravioletten Bereich umfaßt.

BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORM

Zunächst wird das Verfahren der Erfindung für die Bestimmung von Lipid nachstehend beschrieben.
In dem Verfahren der Erfindung zur Bestimmung von Lipid wird das Lipid mit einem grenzflächenaktiven Mittel behandelt, um eine Mizelle herzustellen, die aus Lipid und dem grenzflächenaktiven Mittel besteht, um eine quantitative Bestimmung zu ermöglichen. Zum Beispiel wird im Falle eines amphiphilen Lipids, wie eines Phospholipids, ein in einem wäßrigen Medium gebildetes Lipidaggregat mit einem grenzflächenaktiven Mittel behandelt, um eine Mizelle zu bilden, die aus dem Lipid und dem grenzflächenaktiven Mittel besteht. Die geeignete Behandlung mit einem grenzflächenaktiven Mittel besteht aus einer Ultraschallbehandlung oder einer Wärmebehandlung auf einem Wasserbad. Eine Minute einer Ultraschallbehandlung oder ein 10 minütiges Erwärmen oder länger auf einem Wasserbad bei 60 ºC ist ausreichend. Eine unbekannte Probe und eine Standardprobe sollten auf die gleiche Weise behandelt werden.
Durch solch eine Behandlung wird das Phospholipid mittels des grenzflächenaktiven Mittels in Übereinstimmung mit der Lipidkonzentration, ungeachtet der Form des Aggregats, wie eines Liposoms, einer planaren Membran und einer hexagonalen II-Struktur, in einen Mizellenzustand überführt.
In dem Verfahren der quantitativen Bestimmung von Lipid, mit einem grenzflächenaktiven Mittel, das in dem gemessenen UV-Bereich keine UV-Absorption zeigt, wird die UV-Absorption alleine von dem Lipid in dem Mizellenzustand aus dem Lipid und dem grenzflächenaktiven Mittel hervorgerufen und die Absorbanz hängt nur von der Konzentration des Lipids ab, weshalb die Lipidkonzentration durch Messung der UV-Absorbanz bestimmt wird. Jede Wellenlänge innerhalb eines Bereichs von 230 bis 290 nm kann für die Absorbanzmessung verwendet werden, wenn außer dem Lipid keine andere Substanz anwesend ist. Wenn jedoch das Vorhandensein einer anderen Substanz zu erwarten ist, muß eine Wellenlänge, bei der die coexistierende Substanz keine oder wenig Absorbanz zeigt, ausgewählt werden. Auf den Forschungsgebieten der Behandlung oder Nachahmung einer Biomembran ist die coexistierende Substanz in den meisten Fällen Protein. In diesem Fall wird die Wellenlänge bevorzugt bei ungefähr 240 nm ausgewählt, wodurch die maximale Absorption des Proteins bei 280 nm vermieden wird.
Jedes grenzflächenaktive Mittel kann verwendet werden, das in dem UV-Bereich keine Absorption zeigt. Beispiele für ein nützliches grenzflächenaktives Mittel schließen Octylglucosid (n-Octyl-ß-D-glucopyranosid), CHAPS (3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propansulfonat und HECAMEG (6-0-(N-Heptylcarbamoyl)-methyl-α-D-glucopyranosid) ein.
In dem vorstehenden Verfahren der Erfindung für die Bestimmung von Lipid wird das Lipid mit einem grenzflächenaktiven Mittel in einem wäßrigen Medium behandelt. Es ist jedoch nicht erforderlich, daß das zu bestimmende Lipid ursprünglich im Suspensionszustand in dem wäßrigen Medium vorliegt. Zum Beispiel wird, wenn die Probe fest ist, eine Ermittlung durch eine Behandlung der festen Probe mit einem vorgegebenen Volumen einer wäßrigen Lösung eines grenzflächenaktiven Mittels ermöglicht.
Für die Zusammensetzung des wäßrigen Mediums für den Aufbau des Reaktionssystems gibt es keine besondere Einschränkung, wenn die Ionenstärke und der pH-Wert innerhalb von Bereichen liegen, in denen das Lösungsvermögen des grenzflächenaktiven Mittels beibehalten wird. Die unbekannte Probe und die Standardprobe sollten bei dem gleichen pH-Wert und der gleichen Ionenstärke oder Salzkonzentration behandelt werden.
Die Erfindung wird nachstehend unter Bezugnahme auf Beispiele detaillierter beschrieben.

Beispiel 1

In einen auberginenförmigen Kolben wurden 0,5 ml einer Lösung aus 30 mg/ml Asolectin (Sojabohnenphosphatidylcholin, Typ IV-S; hergestellt von Sigma Co.) in Chloroform eingebracht. Das Lösungsmittel wurde unter Verwendung eines Rotationsverdampfers abgezogen und anschließend in einem Exsikkator im Vakuum vollständig entfernt, um einen dünnen Lipidfilm zu bilden. Dazu wurde 1,0 ml einer wäßrigen 10 mM (10 millimolaren) Kaliumchloridlösung gegeben und es erfolgte 5 Minuten lang eine Behandlung mit einem Wirbelmischer, um den dünnen Lipidfilm zu dispergieren. Dann wurde er mit einem Wasserbad-Ultraschalloszillator (Sonifier Typ B-15, unter Verwendung eines Becherschalltrichters (cup horn) von Branson Co.) 30 Minuten lang behandelt, um eine Liposomdispersion (15 mg/ml) zu erhalten.
Es wurde mittels der Anwendung eines Korn- bzw. Teilchengrößenanalysators auf Basis einer dynamischen Lichtstreuung (DLS-700, Otsuka Electronics Co. LTD.) gefunden, daß die so hergestellte flüssige Liposomdispersion eine Verteilung der Teilchengrößen im Bereich von 30 bis 260 nm (einen mittleren Teilchendurchmesser von 190 nm) aufwies.
Diese Liposomdispersion wurde mit wäßriger 10 mM Kaliumchloridlösung, die 1 Gewichts-% Octylglucosid (n-Octyl-ß-D- glucosid; hergestellt von Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) enthielt, so verdünnt, daß sie in verschiedenen Konzentrationen vorlag, und die verdünnte Dispersion wurde eine Minute lang mit einem Wasserbad-Ultraschalloszillator behandelt, um Phospholipidstandardlösungen in einem Konzentrationsbereich von 0 bis 1,5 mg/ml zu erhalten.
Die Phospholipid-Standardflüssigkeit wurde in eine Quarzzelle mit einem Lichtweg von 1 cm eingebracht, und die Absorbanz wurde mittels eines Spektrophotometers (UV-VIS-NIR Recording Spectrophotometer UV 3100, Shimadzu Corporation) 30 bei 240 nm gemessen. Die Absorbanzwerte wurden als Funktion der Phospholipidkonzentration unter Verwendung, als Bezugswert, der Absorbanz einer wäßrigen lomm Kaliumchloridlösung, die 1% Octylglucosid enthielt, aufgetragen. So wurde eine gerade Linie, die durch den Ursprung ging, erhalten. Aus dem Gradienten der Linie ergab sich die nachstehende Beziehung zwischen der Phospholipidkonzentration und der Absorbanz:
(Absorbanz) = 0,400 x (Phospholipidkonzentration, mg/ml)
Dementsprechend kann die Menge an Phospholipid in einer unbekannten Probe ermittelt werden, indem die unbekannte Probe auf die gleiche Weise wie vorstehend behandelt und die Absorbanz gemessen wird und eine Berechnung mittels der vorstehenden Gleichung erfolgt.

Beispiel 2

Eine flüssige Liposomdispersion wurde auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 hergestellt. Die Dispersion wurde durch Eintauchen in flüssigen Stickstoff eingefroren, wurde durch Stehenlassen bei Raumtemperatur aufgetaut und dann eine Minute lang einer Ultraschallbehandlung unterzogen. Diese Einfrier- und Auftaubehandlung wurde sechsmal durchgeführt, wodurch eine flüssige Liposomdispersion mit einem relativ großen Teilchendurchmesser hergestellt werden konnte. Es wurde durch eine Messung, die auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 mittels eines Teilchengrößenanalysators auf Basis einer dynamischen Lichtstreuung durchgeführt wurde, gefunden, daß die Verteilung der Teichendurchmesser in einem Bereich von 130 bis 520 nm (mittlerer Teilchendurchmesser: 280 nm) lag.
Die so hergestellte Liposomdispersion wurde auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 mit wäßriger 10 mM Kaliumchlorid lösung verdünnt, die 1 Gewichts-% Octylglucosid enthielt, verdünnt, und die verdünnte Dispersion wurde auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 eine Minute lang mit einem Wasserbad-Ultraschalloszillator behandelt, um Phospholipidstandardlösungen in einem Konzentrationsbereich von 0 bis 1,5 mg/ml zu erhalten.
Die Absorbanz des Phospholipidstandards wurde bei 240 nm gemessen. Die Absorbanzwerte wurden als Funktion der Phospholipidkonzentration unter Verwendung, als Bezugswert, der Absorbanz einer wäßrigen 10 mM Kaliumchloridlösung, die 1% Octylglucosid enthielt, aufgetragen. So wurde eine gerade Linie, die durch den Ursprung ging, erhalten. Aus dem Gradienten der Linie ergab sich die nachstehende Beziehung zwischen der Phospholipidkonzentration und der Absorbanz:
(Absorbanz) 0,400 x (Phospholipidkonzentration, mg/ml)
Dementsprechend kann die Menge an Phospholipid in einer unbekannten Probe ermittelt werden, indem die unbekannte Probe auf die gleiche Weise wie vorstehend behandelt und die Absorbanz gemessen wird und eine Berechnung mittels der vorstehenden Gleichung erfolgt.
Die Erfindung vereinfacht in großem Ausmaß die Bestimmung von Phospholipid, die herkömmlicherweise mit großem Arbeitsaufwand verbunden ist. Insbesondere stellt die Erfindung ein extrem vereinfachtes Verfahren für die quantitative Lipidbestimmung in einer Probe eines Lipidaggregats dar, das bei der Untersuchung einer Biomembran, die Lipid enthält, und beim Nachweis der Zusammensetzung einer künstlich hergestellten, lipidhaltigen Membran angetroffen wird.

Claims

1. Verfahren für den quantitativen Nachweis von Lipid, das die nachstehenden Schritte umfaßt:

Herstellung einer flüssigen Probendispersion durch die Behandlung einer Lipid enthaltenden Probe mit einem grenzflächenaktiven Mittel in einem wäßrigen Medium, um eine aus dem Lipid und dem grenzflächenaktiven Mittel bestehende Mizelle zu bilden, wobei das grenzflächenaktive Mittel im UV-Bereich keine Absorption zeigt, und

Messen der Lichtabsorbanz der flüssigen Probendispersion im ultravioletten Bereich.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Absorption bei 240 nm gemessen wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Probe Liposom enthält.