DE3784592T2

DE3784592T2 - Stabile, biologisch-aktive, fluorchemische emulsionen.

Info

Publication number: DE3784592T2
Application number: DE8787306123T
Authority: DE
Inventors: Dean S Milbrath
Original assignee: Minnesota Mining and Manufacturing Co
Current assignee: 3M Co
Priority date: 1986-08-07
Filing date: 1987-07-10
Publication date: 1993-09-23
Anticipated expiration: 2007-07-11
Also published as: AU590097B2; EP0257758A3; JPS6354932A; ES2044933T3; EP0257758A2; DE3784592D1; AU7554187A; EP0257758B1; US5401634A; CA1304681C

Description

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft perhalogenierte, fluorchemische Emulsionen, die auf ihrer Tröpfchenoberfläche einen Vertreter eines spezifischen Bindungspaares tragen, Die neuartigen Emulsionen der vorliegenden Erfindung sind als diagnostisches Trägermaterial und als Träger für biochemische Reaktionen verwendbar.

Ausgangssituation der Erfindung

Trägersubstanzen für Antigen/Antikörper-Assays und biochemische Reaktionen sind normalerweise Latexkügelchen, Papier, fixierte rote Blutkörperchen und unlösliche Polymere, wie beispielsweise Dextran und Polystyrol. Bei diesen Assays und biochemischen Reaktionen ist mindestens ein Vertreter eines spezifischen Bindungspaares (nachfolgend bezeichnet als "spezifische Bindungsspezies") auf einem Träger immobilisiert und wird danach chemischen Reaktionen, physikalischen Manipulationen oder beidem in einer Weise ausgesetzt, die schließlich zu ihrer Bindung (vorübergehend oder permanent) des anderen Vertreters des spezifischen Bindungspaares an der spezifischen Bindungsspezies führt. Diese Kupplung der zwei Vertreter des spezifischen Bindungspaares ist zum qualitativen oder quantitativen Nachweis der Anwesenheit einer der Spezies in einer Probe verwendbar, wie beispielsweise in einem kompetitiven Assay, einem Immunoassay, einem Protein-Bindungsassay. In ähnlicher Weise kann die Bindung der zwei Vertreter des spezifischen Bindungspaares verwendet werden, um den Vorteil der Eigenschaften zu nutzen, die einer der Spezies eigen sind, z. B. eine enzymatische Eigenschaft.
Ein ständiges Problem im Aufbau von Assays und Reaktionssystemen ist die Schwierigkeit des Immobilisierens der spezifischen Bindungsspezies auf der Trägersubstanz, so daß sie den Waschflüssigkeiten widersteht und unter den zu erwartenden chemischen Bedingungen auf der Trägersubstanz verbleibt. Ein weiteres Problem ist das Denaturieren des spezifischen Bindungspaares, d. h. das vorzeitige Umkehren der Bindung der zwei Spezies, so daß der gebundene Vertreter von dem immobilisierten Vertreter dissoziiert oder der immobilisierte Vertreter und der gebundene Vertreter von der Trägersubstanz dissoziieren. Ein weiteres ständiges Problem ist das Reaktionsvermögen der Trägersubstanz unter den für die Anwendung zu erwartenden Bedingungen, die in einer Testprobe zur nicht spezifischen Bindung von Bestandteilen führen.
Zur Verwendung als Trägersubstanzen in Immunreaktionsassays wurden Mikrokapseln vorgeschlagen. Die GB-A-2 079 937 und GB-A-2 079 936 (beide veröffentlicht am 27. Januar 1982) beschreiben beide die Herstellung von Mikrokapseln mit vernetzten Wandungssubstanzen, die eine ölige Kernsubstanz einschließen. Mit Hilfe eines Vernetzungsmittels sind funktionale Gruppen mit Stellen zum Binden eines Antigens oder Antikörpers an der Wandung angebracht.
Zur Verwendung als Austauschstoffe in vivo für Erythrocyten wurden Fluorkohlenstoff-Emulsionen vorgeschlagen. Einige Fluorkohlenstoff-Emulsionen scheinen gute Sauerstofftransporteigenschaften aufzuweisen und sind anscheinend nicht toxisch und werden sicher metabolisiert. Andere fluorchemische Emulsionen haben sich an Labortieren als toxisch oder nichtmetabolisiert gezeigt und wurden eliminiert. Geyer beschreibt verschiedene Emulsionen in Kapitel I von "The Design of Artificial Blood Substitutes", Drug Design, Bd. VII, Academic Press, N.Y. (1976) und in "Whole Animal Perfusion with Fluorocarbon Dispensors" Federation Proceedings, Bd. 29, Nr. 5, S. 1758 (1970). Als Emulgiermittel wurden Serumalbumin, Phospholipide (einschließlich Lecithin) und Tenside, wie beispielsweise Pluronic-F68® (Wyandotte Chemical Corp., Wyandotte, Mich.), verwendet.
Zur Verwendung als Blutersatzstoff hat Sloviter in der US-P-4 423 007 Emulsionen von Perfluorverbindungen vorgeschlagen, die mit einem nichtantigenen Lipid überzogen sind, vorzugsweise Eiphospholipid oder Lecithin in wäßrigem Medium. In der US-P-4 397 870 berichtet er, daß die Dauer der wirksamen Tröpfenkonzentrationen im Blutstrom aufgrund der offensichtlichen Entfernung der Lecithinbeschichtung und der Exponierung der Perfluor-Tröpfchenoberfläche im Blutstrom kurz ist. Eine Infusion des Patienten, der zuvor eine Infusion einer Emulsion von beschichteten Tröpfchen erhalten hat, wird mit der gleichen Substanz empfohlen, die zur Beschichtung der Tröpfchen der Perfluorverbindung verwendet wurde.
Von Sloviter wird in "Erythrocyte Substitute for Perfusion of Brain" Nature Bd. 216, November 1967, 458, ebenfalls vorgeschlagen, eine Perfluorverbindung in einer simulierten Blutplasmaverbindung von 8 % Rinderserumalbumin in Bicarbonat-Pufferlösung nach Krebs-Ringer zu dispergieren. Nachdem sich die Emulsion gebildet und abgesetzt hat, wurde alles lösliche Protein ausgewaschen. Das sedimentierte Material wurde analysiert und ein Gehalt von etwa 5 % Protein festgestellt.
Auf dem Gebiet der Blutersatzstoffe waren die Japaner ebenfalls aktiv. Die US-P-4 252 827 betrifft Emulsionen von Fluorkohlenwasserstoffverbindungen, die ausreichend stabil sind, um für längere Zeitdauer ohne Änderung der Tröpfchengröße erhalten zu bleiben, und können mit Plasmastreckmitteln, wie beispielsweise Dextran und Hydroxyethylstärke, gemischt werden. Es wird eine Emulsion in einem organischen Medium mit einer Perfluorkohlenstoffverbindung mit 9 bis 11 Kohlenstoffatomen, einem Perfluor-tert-amin mit 9 bis 11 Kohlenstoffatomen, einem Tensid mit einem Molekulargewicht von etwa 2.000 bis 20.000, einem Phospholipid und mindestens einer Fettsäure beschrieben.
Der Einfluß von Emulsionen mit perfluororganischen Verbindungen auf Serumproteine und Phospholipide wurde von V.V. Obraztsuv et al. in "Binding of Proteins and Phospholipid by Emulsion of Perfluoro Organic Compounds" Ftoruglerodrye Gazoperrnosyaschchie Sridy [531 FA5] 1984 147-52 (Russ.) beschrieben. Der von diesen Autoren gegebene Bericht ist nicht eindeutig. Sie haben anscheinend die Menge des Proteins und der Phospholipide analysiert, die aus der Lösung lediglich unter Gleichgewichtsbedingungen entfernt wurde. Es wurde über keine Experimente mit dem Versuch berichtet, das adsorbierte Protein und Phospholipid von den Emulsionströpfchen abzuwaschen. Sie erklären: "Der irreversible und denaturierte Charakter der Bindung der Proteine durch die hydrophobe Oberfläche führt zu der Frage, in welchem Maß sich die Konzentration der Proteine im Blut als Folge der übermäßigen Substitution des Bluts durch PFOC- Emulsion verringern könnte."

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft eine stabile Emulsion mit einer wäßrigen, kontinuierlichen Phase und einer perhalogenierten, fluorchemischen diskontinuierlichen Tröpfchenphase. Es wird mindestens eine spezifische Bindungsspezies an der Oberfläche der perhalogenierten, fluorchemischen Tröpfchen ohne Verlust des spezifischen Bindungsvermögens immobilisiert. Die Verwendung des Ausdrucks "spezifische Bindungsspezies" bezieht sich hierin auf einen Vertreter eines spezifischen Bindungspaares. Die Emulsionen der vorliegenden Erfindung können mühelos hergestellt werden und sind über lange Zeitdauer überraschend stabil. Die Emulsionen widerstehen Waschungen ohne Verlust des spezifischen Bindungsvermögens.
Die relative Reaktionsunwilligkeit von perhalogenierten, fluorchemischen Substanzen gegenüber biologischen Molekülen im Vergleich zu konventionellen Trägersubstanzen macht sie ideal geeignet für die Verwendung unter einer großen Zahl von Bedingungen. Repräsentative Beispiele für spezifische Bindungsspezies, die auf perhalogenierten, fluorchemischen Tröpfchen immobilisiert werden können, umfassen einen Vertreter eines Antigen/Ankikörper-Paares, bei welchem das Antigen ein natürlich auf tretendes oder synthetisches Protein, Peptid, Polysaccharid, Lipid, Nucleinsäure, organisches Polymer, ein antigenes Fragment dieser Substanzen, ein infektiöses Agens, wie beispielsweise Bakterien oder Viren oder ein Teil ihrer Zellenoberfläche, ein Hapten, wie beispielsweise ein Medikament, Hormon, oder organisches Molekül sowie deren Kombinationen und Derivate ist, ein Molekül oder Segment von natürlich auftretender oder synthetischer DNA oder RNA, ein Enzym, wie beispielsweise alkalische Phosphatase, Peroxidase, oder beta-Galactosidase, Luciferase, Urease oder andere Enzyme, die aus Oxidoreduktasen, Transferasen, Hydrolyasen, Kinasen oder Lyasen ausgewählt werden, ein weiterer Reaktionskatalysator, ein Lektin, ein Zucker, ein Zelloberflächenmarker oder -rezeptor, und eine therapeutische Substanz, wie beispielsweise ein Medikament, Pflanzenextrakt, Hormon oder deren Metabolite, der andere Vertreter des spezifischen Bindungspaares für jeden der vorstehenden, und weitere Komponenten der Reaktionsschemen der spezifischen Bindung, wie beispielsweise Farbstoffe, Fluoreszenzmoleküle, oder Komponenten, die in den Reaktionsschemen der spezifischen Bindung zur Erzeugung von Farbstoff, Fluoreszenz, Phosphoreszenz, Chemilumineszenz oder anderer nachweisbarer Stoffe verwerten werden können.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft die Immobilisierung von Kombinationen verschiedener spezifischer Bindungsspezies auf den gleichen Emulsionströpfchen. Emulsionen mit einer Kombination spezifischer Bindungsspezies und anderer Komponenten ihrer Reaktionsschemen der spezifischen Bindung sind besonders in diagnostischen Systemen verwendbar. So kann der eine Vertreter eines Antigen/Antikörper-Bindungspaares und eine Substanz, die ein nachweisbares Erzeugnis ist oder zu dessen Bildung reagiert, wie beispielsweise ein Enzym, Farbstoff, Fluoreszenzmolekül oder chemilumineszentes Reagens, unabhängig auf Emulsionströpfchen immobilisiert werden. Die Immobilisierung mehrfacher spezifischer Bindungsspezies ermöglicht die Immobilisierung der separaten Komponenten einer Enzymkaskade, die zum Nachweis der Anwesenheit und der Menge einer Substanz verwendet werden kann. Beispielsweise kann Glucose mit den Enzymen der Glucoseoxidase und Peroxidase nachgewiesen werden, die mit dem gleichen Emulsionströpfchen verknüpft sind.
Die spezifische Bindungsspezies kann auf den perhalogenierten, fluorchemischen Tröpfchen durch direkte Adsorption an der Grenzfläche Tröpfen/Wasser immobilisiert werden. Wahlweise kann eine Primersubstanz verwendet werden. Eine "Primersubstanz" ist eine Substanz mit der Fähigkeit zur Kupplung spezifischer Bindungsspezies an ein perhalogeniertes, fluorchemisches Tröpfchen. Bevorzugt werden natürlich auftretende oder synthetische Polymere mit Amin, Carboxyl, Mercapto oder anderen funktionalen Gruppen, die zu einer spezifischen Reaktion mit Kupplungsmitteln fähig sind, sowie hoch geladene Polymere. Die spezifische Bindungsspezies kann dadurch immobilisiert werden, daß sie kovalent an einer Primersubstanz gebunden wird und das Paar an der Grenzfläche der diskontinuierlichen und der kontinuierlichen Phasen adsorbiert wird. Wahlweise kann die spezifische Bindungsspezies an einer Primersubstanz adsorbiert werden, wobei der resultierende Komplex an der Grenzfläche der kontinuierlichen und diskontinuierlichen Phasen adsorbiert wird. Das gleiche Ergebnis kann durch Bildung einer Emulsion mit einer wäßrigen kontinuierlichen Phase und einer perhalogenierten, fluorchemischen diskontinuierlichen Phase unter Verwendung einer Primersubstanz als ein Emulgiermittel erzielt werden. Sodann kann die biologisch aktive Hälfte an der Primersubstanz an der Grenzfläche der kontinuierlichen und diskontinuierlichen Phasen adsorbiert oder gepaart werden.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft die Einbeziehung eines "Farbstoffes" in das perhalogenierte, fluorchemische Tröpfchen. Die hierin bezeichneten "Farbstoffe" sind Spezies, die durch spektrophotometrische, fluorometrische oder kolorimetrische Mittel nachgewiesen werden können.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung betrifft die Gewährung einer in vitro-Emulsion mit einer kontinuierlichen Phase und einer perhalogenierten, fluorchemischen diskontinuierlichen Phase. Mindestens eine spezifische Bindungsspezies ist auf den perhalogenierten, fluorchemischen Tröpfchen immobilisiert. Die perhalogenierten, fluorchemischen Tröpfchen und die immobilisierten spezifischen Bindungsspezies werden mit einer wäßrigen Lösung in Kontakt gebracht, welche den spezifischen Bindungspartner der spezifischen Bindungsspezies enthält, und zwar für eine ausreichende Dauer, um die Bindung der spezifischen Bindungsspezies an ihren Partner zu ermöglichen. Das Verfahren wird vorzugsweise in der Diagnostik eingesetzt, wie beispielsweise Agglutinationsanalysen, Sandwich- oder reverse Inhibitions-Enzymimmunoassays oder Radioimmunoassays oder Proteinbindungsassays.

Detaillierte Beschreibung

Die Emulsionen der vorliegenden Erfindung können aus einer großen Zahl von Substanzen hergestellt werden.
Es kann eine Vielzahl perhalogenierter, fluorchemischer Flüssigkeiten verwendet werden. Geeignete perhalogenierte, fluorchemische Flüssigkeiten umfassen geradkettige und verzweigtkettige sowie cyclische Perfluorkohlenwasserstoffe, geradkettige und verzweigtkettige sowie cyclische Perfluortert-amine, geradkettige und verzweigtkettige sowie cyclische Perfluorether und -thioether, Chlorfluorkohlenwasserstoffe und polymere Perfluorether u. dgl. Obgleich bis zu 50 % mit Wasserstoff substituierte Verbindungen verwendet werden können, werden perhalogenierte Verbindungen bevorzugt. Besonders bevorzugt sind perfluorierte Verbindungen. Für erfindungsgemäß verwendbare perhalogenierte, fluorchemische Verbindungen sind beispielsweise kommerziell verfügbare Substanzen, wie z. B. die perhalogenierten, fluorchemischen Feststoffe mit den Warenzeichen Kel-F® und Fluorinerte® (3M, St. Paul, Minnesota), Freone® und Series E (Dupont, Wilmington, Delaware) und Fombline® (Montedison, Italien).
Obgleich zur Herstellung einer erfindungsgemäßen perhalogenierten, fluorchemischen Emulsion jede perhalogenierte, fluorchemische Flüssigkeit verwendet werden kann, d. h. einen bei etwa 20 ºC und Luftdruck flüssige Substanz, werden für zahlreiche Zwecke Emulsionen mit länger währender Stabilität bevorzugt. Um derartige Emulsionen zu erhalten, werden perhalogenierte, fluorchemische Flüssigkeiten mit Siedepunkten oberhalb von 30 ºC bevorzugt. Bevorzugte perhalogenierte, fluorchemische Flüssigkeiten haben Siedepunkte oberhalb von 50 ºC und besonders bevorzugte perhalogenierte, fluorchemische Flüssigkeiten Siedepunkte von oberhalb etwa 100 ºC.
Geeignete perhalogenierte, fluorchemische Flüssigkeiten umfassen Perfluordecalin, Perfluor-n-pentan, Perfluormorpholin, Perfluortriamylamin, Perfluordimethylcyclohexan, Perfluordicyclohexylether, Perfluor-n-butyltetrahydrofuran, Perfluor-n-octylbromid, Perfluortri-n-butylamin und Verbindungen, die diesen Verbindungen strukturell ähnlich sind und zu mindestens 50 % halogeniert (umfassend mindestens einige Fluorsubstituenten) oder mindestens zu 50 % perfluoriert sind.
Zur Erleichterung der Bildung der Emulsionen können Emulgiermittel verwendet werden, wie beispielsweise Tenside. Normalerweise wurden Tenside in wäßriger Phase verwendet, um die Bildung der Emulsionen der perhalogenierten, fluorchemischen Flüssigkeiten zu erleichtern. Eine der Primersubstanzen, wie beispielsweise Albumine, Polysaccharide und Phospholipide, kann als ein Emulgiermittel verwendet werden. Weitere bekannte Tenside, wie beispielsweise Pluronic F-68®, ein Blockcopolymer von -O(CH&sub2;)&sub2;-O-(CH&sub2;)&sub2;-O- und O-(CH&sub2;)&sub3;-O- (CH&sub2;)&sub3;-O-, können verwendet werden.
Einige Beispiele für geeignete Tenside sind anionische Substanzen, wie sie beispielsweise mit den folgenden Handelsbezeichnungen vertrieben werden:
HamposylTM L30 (W.R. Grace Co., Nashua, NH),
Natriumdodecylsulfat,
Aerosol 413 (American Cyanamid Co., Wayne, NJ),
Aerosol 200 (American Cyanamid Co.),
LipoproteolTM LCO (Rhodia Inc., Maimnoth, NJ),
StandapolTM SH 135 (Henkel Corp., Teaneck, NJ),
FizulTM 10-127 (Finetex Inc., Elmwood Park, NJ), und
CyclopolTM SBFA 30 (Cyclo Chemicales Corp., Miami, FL);
amphotere Substanzen, wie sie beispielsweise unter den folgenden Handelsbezeichnungen vertrieben werden:
DeriphatTM 170 (Henkel, Corp.),
LonzaineTM JS (Lonza, Inc.),
MiranolTM C2M-SF (Miranol Chemical Co., Inc.,
Dayton, NJ),
AmphotergeTM W2 (Lonza, Inc.) und
AmphotergeTM 2WAS (Lonza, Inc.);
nichtionische Substanzen, wie sie beispielsweise unter den folgenden Handelsbezeichnungen vertrieben werden:
PluronicTM F-68 (BASF, Wyandotte, Wyandotte, MI),
PluronicTM F-127 (BASF Wyandotte),
Br&ijlig;TM 35 (ICI Americas; Wilmington, DE),
TritonTM X-100 (Rohm und Haas Co., Philadelphia, PA
Br&ijlig;TM 52 (ICI Americas),
SpanTM 20 (ICI Americas),
GenerolTM 122 ES (Henkel Corp.),
TritonTM N-42 (Rohm und Haas Co.),
TritonTM N-101 (Rohm und Haas, Co.),
TritonTM X-405 (Rohm und Haas, Co.),
TweenTM 80 (ICI Americas),
TweenTM 85 (ICI Americas) und
Br&ijlig;TM 56 (ICI Americas).
Diese Tenside werden allein oder in Kombination mit Mengen von 0,10 bis 5,0 Gew.% verwendet, um das Stabilisieren der Emulsionen zu unterstützen.
Fluorierte Tenside, die in der zu emulgierenden perhalogenierten, fluorchemischen Flüssigkeit löslich sind, können ebenfalls verwendet werden. Geeignete fluorchemische Tenside umfassen perfluorierte Alkansäuren, wie beispielsweise Perfluorhexan- und Perfluoroctansäuren und deren Amidoaminderivate, wie beispielsweise C&sub7;F&sub1;&sub5;CONH(CH&sub2;) &sub4;N(CH&sub3;)&sub2; und 1,1-Dihydroperfluoralkohole, z. B. 1,1-Dihydroperfluor-noctanol. Diese Tenside waren im allgemeinen in Mengen von 0,01 bis 5,0 Gew.% und vorzugsweise in Mengen von 0,1 bis 1,0 Gew.% verwendet.
Weitere geeignete fluorchemische Tenside umfassen perfluorierte Alkoholphosphatester und deren Salze, perfluorierte Sulfonamid-Alkoholphosphatester und deren Salze, perfluorierte, quaternäre Ammoniumsalze von Alkylsulfonamidalkylen, N,N-(Carboxyl-substituiertes niederes Alkyl) perfluorierte Alkylsulfonamide, sowie deren Mischungen. Der hierin verwendete Begriff "perfluoriert" bedeutet, daß das Tensid mindestens eine perfluorierte Alkylgruppe enthält.
Geeignete perfluorierte Alkoholphosphatester umfassen die freien Säuren der Diethanolaminsalze von Mono- und Bis (1H, 1H, 2H, 2H-perfluoralkyl)phosphaten. Die Phosphatsalze, die unter dem Handelsnamen "Zonyl RP" (E.I. Dupont de Nemours and Co., Wilmington, Del.), verfügbar sind, werden nach dem bekannten Verfahren in die entsprechenden freien Säuren überführt. Geeignete perfluorierte Sulfonamidalkohol- Phosphatester werden in der US-P-3 094 547 beschrieben und haben die allgemeine Formel:
Darin sind R Wasserstoff oder eine Alkylgruppe mit 1 bis etwa 12 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise von 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, R' eine Alkylenbrücke mit 2 bis 12 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise 2 bis 8 Kohlenstoffatomen, Rf perfluoraliphatisches CnF2n+1 oder perfluorcycloaliphatisches CnF2n-1 (n ist darin eine ganze Zahl von 1 bis 18, vorzugsweise von 6 bis 12), und m eine ganze Zahl von 1 bis 3. Obgleich jeder der Mono-, Di- und Triester verwendbar ist, sind die Diester, kommerziell am ehesten verfügbar. Geeignete perfluorierte Sulfonamidalkohol- Phosphatester und deren Salze umfassen:
Perfluor-n-octyl-N-ethylsulfonamidoethylphosphat,
Bis(perfluor-n-octyl-N-ethylsulfonamidoethyhl)phospaht,
das Ammoniumsalze von
Bis(perfluor-n-octyl-N-ethylsulfonamidoethyl)phosphat,
Bis(perfluorhecyl-N-ethylsulfonamidoethyl)phospaht und
Bis(perfluorhexyl-N-ethylsulfonamidoethyl)phosphat.
Die bevorzugten Zusammensetzungen verwenden Pluronic F- 68® als das wäßrige Tensid in Phosphat gepufferter Salzlösung und Perfluoramidoamine und Perfluordihydroalkohole als die fluorchemischen Tenside.
Die perhalogenierte, fluorchemische Emulsion kann mit oder ohne eine Primersubstanz hergestellt werden. Geeignete Primersubstanzen umfassen Proteine, wie beispielsweise Albumine (z. B. Rinderserumalbumin und Ovalbumin, Casein, ganze Seren, wie beispielsweise normales Humanserum, Fibrinogen, Collagene, synthetische Poly(aminosäuren), z .B. Poly(lysin-phenylalanin) und Polylysin. Primersubstanzen mit hohem Gehalt an Lysin erzeugen Emulsionströpfchen, die in Kupplungsreaktionen hoch aktiv sind. Die Verwendung von Copolymeren als Primersubstanzen, die ein Verhältnis von Lysin zu einer hydrophoben Aminosäure, wie beispielsweise Alanin oder Phenylalanin, von 1:1 haben, führen zu einer sehr hohen Konzentration von Aminogruppen, die für Kupplungsreaktionen verfügbar sind. Diese lysinhydrophoben Aminosäure-Copolymere werden fest von den hydrophoben Rückständen adsorbiert, die in Wechselwirkung mit der fluorchemischen flüssigen Phase stehen. In einigen Fällen kann jedoch die alleinige Verwendung des Copolymers als eine Primersubstanz zur Vernetzung der Emulsionströpfchen während der Kupplungsreaktionen mit spezifischen Bindungsspezies führen. Eine Mischung von Rinderserumalbumin und Copolymer überwindet das Vernetzungsproblem, wobei jedoch auch die Menge der spezifischen Bindungsspezies, die gekuppelt werden kann, reduziert wird. Andere geeignete Primersubstanzen umfassen natürlich auftretende oder synthetische Polymere, die hoch geladen sind, wie beispielsweise geladene Polysaccharide, z. B. Heparin, Dextransulfat, DIMA (ein Dimethylamin-Adduct eines expoxidierten Polybutadiens, wie es in der US-P-4 210 722 offenbart wurde), Protaminsulfat und Nucleinsäuren.
Die erfindungsgemäßen Emulsionen können in zahlreichen Verfahren hergestellt werden. Ein Verfahren ist die Beschallung einer Mischung einer perhalogenierten, fluorchemischen Flüssigkeit und einer wäßrigen Lösung, die eine geeignete Primersubstanz oder spezifische Bindungsspezies enthält. Im allgemeinen enthalten diese Mischungen ein Tensid. Das Kühlen der zu emulgierenden Mischung, das Herabsetzen der Konzentration des Tensids auf ein Minimum und das Puffern mit einem salzhaltigen Puffer maximieren sowohl das Haltevermögen der spezifischen Bindungseigenschaften als auch die Kupplungsfähigkeit der Primersubstanz. Diese Verfahren führen zu hervorragenden Emulsionen mit hoher Aktivität pro Einheit der absorbierten Primersubstanz oder spezifischen Bindungsspezies.
Wenn hohe Konzentrationen einer Primersubstanz oder spezifische Bindungsspezies angestrebt werden, die auf perhalogenierten, fluorchemischen Tröpfchen beschichtet sind, muß die Mischung während der Beschallung erhitzt werden, eine verhältnismäßig niedrige Ionenstärke haben, und die wäßrige Lösung sollte einen mittleren bis niedrigen pH- Wert aufweisen. Eine zu geringe Ionenstärke, zu geringer pH- Wert und zu starke Erhitzung kann in einigen Fällen eine gewisse Beeinträchtigung oder den Verlust aller spezifischen Bindungseigenschaften der spezifischen Bindungsspezies oder des Kupplungsvermögens der Primersubstanz bewirken. Eine sorgfältige Kontrolle und Einstellung der Bedingungen der Emulsionsbildung wird die Eigenschaften der Primersubstanz oder der spezifischen Bindungsspezies optimieren, während hohe Konzentrationen der Beschichtung erhalten werden. Die Einstellung der Ionenstärke, des pH-Wertes und der Temperatur haben sich bei Rinderserumalbumin als Primersubstanz als besonders wertvoll erwiesen.
Die Qualität der erhaltenen Emulsionen kann nach konventionellen Verfahren ausgewertet werden, wie beispielsweise die visuelle Beobachtung, Nephelometrie, Teilchengrößenmessung nach Coulter oder spektrometrische Messung. Wenn in den Bestandteilen der Emulsion geeignete Indikatoren enthalten sind, wie beispielsweise Farbstoffe oder fluoreszente und chemilumineszente Marker, können die Tröpfchen der Emulsion mit Hilfe der Eigenschaften dieser Substanzen beobachtet werden. Die verwendbaren Emulsionen können einen großen Bereich der mittleren Durchmesser des Tröpfchens haben, z. B. von 0,01 um bis zu 500 um. Die Tröpfchengrößen können durch Modifikationen der Verfahren der Emulsionsbildung und der chemischen Komponenten kontrolliert und eingestellt werden.
Obgleich die Herstellung von Emulsionen durch Beschallung zulässig ist, wird ein gewisses Maß der Streuung der Tröpfchengrößenverteilung bei den Tröpfchen beobachtet. Bei einem anderen Verfahren zur Herstellung der Emulsionen werden bei hohem Druck strahlen der Mischungen, welche die wäßrige Lösung, eine Primersubstanz oder die spezifische Bindungsspezies, die perhalogenierte Fluorkohlenwasserstoffflüssigkeit und (gegebenenfalls) ein Tensid so gelenkt, daß sie aufeinandertreffen um Emulsionen mit schmaler Tröpfchengrößenverteilung und kleiner Tröpfchengröße zu erzeugen. Zur Herstellung der bevorzugten Emulsionen wird die MicrofluidizerTM-Vorrichtung (Microfluidics, Newton, Mass.) verwendet. Die Vorrichtung ist ebenfalls verwendbar, um Emulsionen zu verarbeiten, die durch Beschallung oder andere konventionelle Verfahren hergestellt wurden. Die Zuführung eines Stroms von Tröpfchen durch die MicrofluidizerTM-Vorrichtung liefert Emulsionen, die eine schmale Tröpfchengrößenverteilung und kleine Tröpfchengröße haben.
Die spezifische Bindungsspezies kann auf der Oberfläche des perhalogenierten, fluorchemischen Tröpfchens durch direkte Adsorption oder durch chemische Kupplung immobilisiert werden. Beispiele von spezifischen Bindungsspezies, die durch direkte Adsorption immobilisiert werden können, umfassen Antikörper, Protein A und Enzyme. Zur Herstellung einer derartigen Emulsion kann die spezifische Bindungsspezies vor der Bildung der Emulsion in der wäßrigen Phase suspendiert oder aufgelöst werden. Wahlweise kann die spezifische Bindungsspezies nach der Bildung der Emulsion zugesetzt und durch Rühren bei Raumtemperatur (25 ºC) in einem Puffer mit einem pH-Wert von 7,0 (normalerweise Phosphat gepufferte Salzlösung) für 12 bis 18 Stunden bebrütet werden.
Wenn die spezifische Bindungsspezies mit einer Primersubstanz gekuppelt werden soll, können konventionelle Kupplungsverfahren verwendet werden. Die spezifische Bindungsspezies kann kovalent an der Primersubstanz mit Hilfe von Kupplungsmitteln unter Anwendung von bekannten Verfahren gebunden werden. Eine Art des Kupplungsmittels verwendet ein Carbodiimid, wie beispielsweise 1-Ethyl-3-(3- N,N-dimethylaminopropyl)carbodiimid-hydrochlorid oder 1- Cyclohexyl-3-(2-morpholinoethyl)carbodiimidmethyl-p-toluolsulfonat. Weitere geeignete Kupplungsmittel umfassen Aldehyd-Kupplungsmittel, die entweder einen ethylenischungesättigten Charakter aufweisen, wie beispielsweise Acrolein, Methacrolein oder 2-Butenal, oder eine Vielzahl von Aldehydgruppen haben, wie beispielsweise Glutaraldehyd, Propandiol oder Butandiol. Weitere Kupplungsmittel umfassen: 2-Iminothiolan-hydrochlorid, bifunktionale N-Hydroxysuccinimidester, beispielsweise Disuccinimidylsuberat, Disuccinimidyltartrat, Bis[2-(succinimidooxycarbonyloxy)ethyl]sulfon, Disuccinimidylpropionat, Ethylenglycolbis- (succinimidylsuccinat); hetero-bifunktionale Reagentien, wie beispielsweise N-(5-azido-2-nitrobenzoyloxy)succinimid, p- Azidophenylbromid, p-Azidophenylglyoxal, 4-Fluor-3-nitrophenylazid, N-Hydroxysuccinimidyl-4-azidobenzoat, m-Maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimidester, Methyl-4-azidophenylglyoxal, 4-Fluor-3-nitrophenylazid, N-Hydroxysuccinimidyl-4- azidobenzoat-hydrochlorid, p-Nitrophenyl-2-diazo-3,3,3,trifluorpropionat, N-Succinimidyl-6-(4'-azido-2'-nitrophenylamino) hexanoat, Succinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)-cyclohexan-1-carboxylat, Succinimidyl-4-(p-maleimidophenyl)butyrat, N-Succinimidyl(4-azidophenyldithio)propionat, N- succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionat, N-(4-azidophenylthio)phthalamid; homobifunktionale Reagentien, wie beispielsweise 1,5-Difluor-2,4-dinitrobenzol, 4,4'-Difluor- 3,3'-dinitrodiphenylsulfon, 4,4'-Diisothiocyano-2,2'-disulfonsäurestilben, p-Phenylendiisothiocyanat, Carbonyl-bis(L- methionin-p-nitrophenylester), 4,4'-Dithiobisphenylazid, Erythrit-biscarbonat und bifunktionale Imidoester, wie beispielsweise Dimethyladipimidat-hydrochlorid, Dimethylsuberimidat und Dimethyl-3,3'-dithiobispropionimidathydrochlorid. Das kovalente Binden einer spezifischen Bindungsspezies an der Primersubstanz kann mit den vorstehend genannten Reagentien nach konventionellen bekannten Reaktionen durchgeführt werden, beispielsweise in den wäßrigen Lösungen bei einem neutralen pH-Wert und Temperaturen unterhalb von 25 ºC für die Dauer einer Stunde bis über Nacht.
Bei einigen Anwendungen sind die erfindungsgemäßen Emulsionen besser verwendbar, wenn die perhalogenierten, fluorchemischen Tröpfchen einen Farbstoff enthalten, der durch spektrophotometrische, fluorometrische oder kolorimetrische Mittel nachgewiesen werden kann. Beispielsweise können die Agglutinationsendpunkte leichter mit dem bloßen Auge festgestellt werden, wenn die fluorchemischen Tröpfchen gefärbt sind. Geeignete Farbstoffe, die für diesen Zweck verwendbar sind, sind in fluorierten Flüssigkeiten ausreichend lösliche Farbstoffe, um die Flüssigkeit zu färben. Die bevorzugten Farbstoffe sind löslich in perfluorierten Flüssigkeiten. Derartige Farbstoffe besitzen normalerweise eine oder mehrere löslichmachende Gruppen, wie beispielsweise halogenierte Seitenketten oder vorzugsweise eine perfluorierte Seitenkette, z. B. eine Perfluoralkyl- oder Perfluoralkylether- Seitenkette oder eine perfluorierte cyclische Gruppe. Einige Beispiele geeigneter Farbstoffe sind die perfluoralkylierten Phthalein-, Phthalocyanin-, Rhodanin- und Chinophthalin-Farbstoffe, wie sie in der US-P- 3 281 426 beschrieben wurden. In diesem Patent beschriebene repräsentative Farbstoffe sind Thioindigo (rosa), Pyranthron (orange), Violanthron (dunkelblau), Isoviolanthron (violett) und Tiers' Blau, ein durch Perfluoralkylgruppen substituiertes Phthalocyanin:
Ein zu einer Perfluoralkyl-Gruppe analoges, substituiertes Methylrot ist:
Weitere geeignete Farbstoffe sind Perfluoralkyl-betadiketonlanthanid- Komplexe, wie beispielsweise
Darin sind Rf und R¹f Perfluoralkyl oder Perfluoraryl u. dgl.
Die löslichen Farbstoffe können in der perhalogenierten, fluorchemischen Flüssigkeit durch einfaches Mischen und wahlweise unter Erhitzen aufgelöst werden, um vor der Emulsionsbildung emulgiert zu werden. Wahlweise können die Zugabe des löslichen Farbstoffs und die Emulsionsbildung gleichzeitig durchgeführt werden, indem standardverfahren der Emulsionsbildung angewendet werden, wie beispielsweise Beschallung und mechanische Emulsionsbildung, wie sie unter Anwendung einer Motor betriebenen französischen Presse, Modell FA-078 (erhältlich bei SLM Instruments, Inc., Urbana, Illinois) erhalten werden. Farbstoffe können den Emulsionen nach der Bildung der Emulsionen zugesetzt werden, obgleich diese Operation schwieriger sein kann, da die Primersubstanz oder die spezifischen Bindungsspezies als eine Barriere wirken können.
Kombinationen verschiedener Farbstoffe in separaten Tröpfchen bieten die Möglichkeit zur Herstellung von Emulsionen jeder beliebigen Farbe. Die selektive Entfernung von Tröpfchen einer Farbe infolge einer Antikörper/Antigeneiner Aggregationsreaktion würde beispielsweise eine Änderung der sichtbaren Farbe der Emulsion bewirken. Auch würden gefärbte Tröpfchen, die infolge einer Antigen/Antikörper-Reaktion an einem Meßstab haften, wurden auf einem Meßstab eine Farbe erzeugen. Bei beiden dieser Vorgehensweisen besteht die Möglichkeit zur Schaffung eines leicht zu interpretierenden qualitativen Endpunktes für eine Zahl von Immunoassays.
Ebenfalls können Vorstufen von Farbstoffen verwendet werden. Beispielsweise können sich farbbildende Mittel mit der Oberfläche der Tröpfchen verbinden, so daß sie zu einer entsprechenden Substanz zur Bildung von Farbstoffen gekuppelt werden können (eine Art Farbkupplungsverfahren). Dieses könnte durch Anwendung eines Diazosalzes erzielt werden, das zur Herstellung des vorstehend beschriebenen Perfluoralkyl-Methylrot-Materials verwendet wird.
Weitere Aspekte der Erfindung, einschließlich das Verfahren zur Verwendung der Emulsionen, werden anhand der folgenden, nicht einschränkenden Beispiele offensichtlich.

Beispiel 1

Um die Bildung von perhalogenierten, fluorchemischen Emulsionen standardgemäß zu vergleichen, wurde jede der in Tabelle 1 aufgeführten fluorchemischen Flüssigkeiten durch Beschallung für 5 Minuten in einer in einem Eisbad gekühlten Rosettenzelle emulgiert. Jede fluorchemische Flüssigkeit (100 Mikroliter) wurde bei einer Konzentration von 1 Vol.% in 10 Milliliter wäßriger Salzlösung, auf pH 7 Phosphat gepuffert und mit einem Gehalt von 0,5 Gew.% Pluronic F-68® als Tensid dispergiert.
Diese Lösungen wurden nach einem Tag und nochmals nach 7 Tagen in bezug auf Tröpfchengröße ausgewertet, indem die Menge der Sedimentation aufgezeichnet wurde. Die Tröpfchengröße wurde auf qualitativer Grundlage unter einer 400fachen Vergrößerung mit Dunkelfeldbeleuchtung nach 1 und 7 Tagen bestimmt.
Die niedrigsiedenden Perfluorkohlenwasserstoffe FC-78 und FC-88 sowie die Chlorfluorkohlenwasserstoffe Freon 113 und Kel-F1 bildeten Emulsionen mit geringerer Qualität als die übrigen Substanzen. Die Anwesenheit von Stickstoff oder Sauerstoffin den fluorierten Verbindungen schien bei dieser Gruppe von Substanzen zu einer erhöhten Stabilität der Emulsion und verringerten Größe der Tröpfchen zu führen. Tabelle 1 Perfluorierte Flüssigkeit
1. Decalin (PP-5: DuPont)
2. n-Pentan (FC-88: 3M)
3. Morpholin (FC-78: 3M)
4. Tri-n-amylamin (FC-70: 3M)
5. Dimethylcyclohexan (FC-82: 3M)
6. Polyether E-2 (DuPont)
7. Polyether E-5 (DuPont)
8. Kel F-1 (3M) (C1- (CF&sub2;-CC1F)&sub2;-C1)
9. Fomblin LS (Montedison)
10. Freon 113 (Dupont) (Cl&sub3;CCF&sub3;)
11. Dicyclohexylether (DCE)
12. Octylbromid (OB)
13. Tri-n-butylamin (Fc-43: 3M)
14. C-8 cyclischer Ether (FC-75: 3M)
15. C-8 Mischung (FC-77: 3M)

Beispiel 2

Ein fluorchemisches Co-Tensid, bestehend aus Perfluor-noctansäure oder Perfluoramidoamin, C&sub7;F&sub1;&sub5;C(O)NH(CH&sub2;)&sub4;N(CH&sub3;)&sub2; wurde in jeder der fluorchemischen Flüssigkeiten nach Tabelle I aufgelöst, bevor die Emulsion nach Beispiel 1 zubereitet wurde. Die Perfluorsäure enthaltenden Fluorchemikalien wurden in dem in Beispiel 1 beschriebenen Tensid-Puffer mit 0,05 bis 0,1 % Rinderserumalbumin (BSA)-Lösung und die Perfluoramidoamin enthaltenden fluorchemischen Substanzen in einer 0,05%igen DIMA-Lösung emulgiert. Diese Emulsionen wurden ebenfalls in bezug auf Tröpfchengröße und Sedimentation entsprechend der Beschreibung in Beispiel 1 ausgewertet. Jede der in Tabelle 1 aufgeführten fluorchemischen Substanzen wurde erfolgreich zu einer Emulsion mit diesem Fluorkohlenstoff und Polymer-Co-Tensiden dispergiert. Diese Emulsionen schienen stabiler zu sein, wobei ihre Tröpfchengröße im allgemeinen kleiner war als die der Emulsionen, die ohne Co-Tenside nach Beispiel 1 zubereitet wurden.

Beispiel 3

Die nach Beispiel 2 zubereiteten Emulsionen wurden in bezug auf die Menge der dispergierten fluorchemischen Substanz, die Menge des an der Oberfläche der Tröpfchen gebundenen BSA oder DIMA und die Größe der erzeugten Tröpfchen analysiert. Vor dieser Analyse wurden die Emulsionen durch Zusatz einer gesättigten Lösung von Ammoniumsulfat im Volumenverhältnis 1:1, durch Zentrifugieren des Niederschlags und erneut es Suspendieren des Niederschlags in frischer Puffer-Tensidlösung vom freien Protein abgetrennt. Diesem folgte ein Zentrifugieren bei 30.000 g für 15 Minuten und erneutes Suspendieren in frischer Puffer-Tensidlösung für 2 weitere Male.
Der Gehalt an fluorchemischen Substanzen dieser Emulsionen wurde mit Hilfe der gaschromatographischen Analyse an einer Füllkörpersäule OV-101 mit 1,83 m · 3,2 mm (6 feet · 0,125 inch) bestimmt. Der Gehalt an fluorchemischer Substanz wurde durch Vergleich mit einer Standardkurve ermittelt, die durch Injektion bekannter Mengen von FC-43 erhalten wurde. Da der Flammenionisationsdetektor (FID) auf die verschiedenen emulgierten fluorchemischen Substanzen etwas unterschiedlich anspricht, variierte dementsprechend auch der berechnete Gehalt der fluorchemischen Substanzen.
Die Menge von BSA und DIMA auf der Oberfläche der Emulsionströpfchen wurde nach der Bradford-Methode unter Verwendung von Coomassie-Blue G-250 und einer Standardkurve bestimmt, die anhand bekannter Mengen BSA und DIMA erhalten wurde.
Die Größe der Emulsionströpfchen wurde durch mikroskopische Auswertung (400fach unter Dunkelfeldbeleuchtung) untersucht und einer numerischen Punktbewertung einen Tag und 7 Tage nach der Zubereitung zugeordnet. Eine numerische Punktbewertung wurde durch Zuordnung eines Werts von 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 zu den Tröpfchen der Emulsion festgelegt, deren Größe auf etwa 200, 330, 460, 800, 1.200 bzw. mehr als 2.500 Nanometer bewertet wurde, indem mit klassierten Polystyrol-Latex-Kugeln (Sigma Chemical) verglichen wurde. Unter Verwendung eines repräsentativen mikroskopischen Bereichs jeder Probe wurde die Zahl der Tröpfchen eines bestimmten Größenbereichs mit ihrem Größenwert multipliziert. Die endgültige Punktbewertung einer Emulsion war die Summe dieser Größenwerte dividiert durch die Gesamtzahl der Tröpfchen. Wenn es den Anschein hatte, daß bei einer Emulsionsprobe eine größere Zahl von Tröpfchen zu Klumpen aggregiert war, wurden die Emulsionen als aggregiert bezeichnet und nicht weiter bewertet.
Die durch die mikroskopische Untersuchung dieser Emulsionen erhaltenen analytischen Ergebnisse und zugeordneten Punktbewertungen sind in Tabelle 2 wiedergegeben. Diese Daten zeigen, daß auf der Oberfläche der Tröpfchen nach der Emulsionsbildung erhebliche Mengen von BSA oder DIMA vorhanden sind und daß sie durch wiederholtes Waschen mit frischem Puffer-Tensid nicht entfernt werden. Die Menge der an der fluorchemischen Substanz gebundenen BSA oder DIMA (Milligramm pro Milliliter der fluorchemischen Emulsion) ist in den Dispersionen FC-43, FC-75, E-2, E-5 und DCE am größten, bei denen es sich um fluorchemische Substanzen mit Heteroatomen (Stickstoff oder Sauerstoff) handelt. Darüber hinaus ist bei allen Zusammensetzungen mehr BSA gebunden als DIMA.
Die Teilchengrößendaten zeigen, daß die mit BSA formulierten Emulsionen eine Neigung haben, zu Klumpen von Tröpfchen zu aggregieren, während dies bei Emulsionen DIMA nicht der Fall ist. Darüber hinaus zeigt die Änderung der numerischen Punktbewertung bei einigen der Emulsionen über die Dauer von 7 Tagen hinaus, daß sich diese Zubereitungen für die spezielle Zusammensetzung dynamisch einer stabileren Größenverteilung annähern. Tabelle 2 Zum auantitativen Vergleich zubereitete Fluorkohlenstoff- Emulsion Fluorkohlenstoff Emulgiermittel mikrosk. Unters. Tage Proteingehalt Gehalt an Fluorkohlenstoff BSA-Säure DIMA-Amidoamin Agg . . . aggregierte Tröpfchen

Beispiel 4

Es wurden Emulsionen mit einer Reihe von wäßrigen Tensiden durch Beschallung der Mischungen zubereitet, die 1 Vol.% FC-43 mit 0,5 Gew.% entweder Perfluoroctansäure oder Perfluoramidoamin entsprechend Beispiel 2 enthielten und Phosphat gepufferte Salzlösung mit 0,5 Gew.% Emerset® 2400, Triton X-100®, Tween® 40, Pluronic® P-85, Pluronic® F-38 (nichtionische Tenside), Laurinsäure, Triton X-200®, Emersoll 6434 (anionische Tenside), Miranol® C2M-SF (ein amphoteres Tensid) oder C&sub1;&sub0;F&sub2;&sub1;S(O)&sub2;NH-(CH&sub2;)&sub3;-N(CH&sub3;)&sub3;Cl (ein kationisches fluorchemisches Tensid) bei pH 6,5 bis 8,5. Vor der Beschallung wurde BSA (0,5 % der Endkonzentration) zu den Mischungen der Perfluorsäure und DIMA (0,5 der Endkonzentration) zu den Mischungen des Perfluoramidoamins zugesetzt.
Die Emulsionen wurden an den Tagen 1, 4 und 7 nach der Zubereitung in bezug auf die Sedimentation und die Größe der Emulsionströpfchen entsprechend den Angaben in den Beispielen 1, 2 und 3 ausgewertet. Diejenigen, die mit nichtionischen und amphoteren wäßrigen Tensiden zubereitet wurden, waren denjenigen überlegen, die mit anionischen oder kationischen Tensiden zubereitet worden waren.

Beispiel 5

Es wurden Emulsionen mit 10 Vol.% FC-43 mit 0,5 bis 1,0 Gew.% C&sub7;F&sub1;&sub5;CO&sub2;H in Phospaht gepufferter Salzlösung bei pH 7 mit entweder 0,05 Gew.% Tween 20 oder 0,1 Gew.% C&sub7;F&sub1;&sub5;CO&sub2;H als ein Tensid zubereitet. Die resultierenden Emulsionen wurden unter Anwendung der im Beispiel 3 beschriebenen Verfahren des Zentrifugierens und der erneuten Suspension gewaschen. Zu einer Teilmenge von 0,5 ml dieser Emulsionen wurden alkalische Phosphatase (Sigma Typ VIIT) oder Protein A (Sigma Chemical Company) zugesetzt und für 0,5 bis 18 Stunden bebrütet. Die Emulsionen wurden sodann nach den vorstehend genannten Verfahren wiederum gewaschen und die Aktivität der alkalischen Phosphatase mit einem farbstoffbildenden Substrat, p-Nitrophenylphosphat, oder bei der Aktivität von Protein A durch Agglutination mit Immunoglobulin G (IgG) bestimmt. Diese Analysen verliefen in bezug auf die spezifischen Bindungsspezies positiv und demonstrierten, daß derartige Substanzen von dem Emulsionströpfchen adsorbiert werden können und ihre Aktivität bewahren.

Beispiel 6

Es wurden Emulsionen nach Beispiel 4 durch Zusatz von 0,5 Gew.% eines Perfluorether-Polymers mit endständigen funktionalen Estergruppen CH&sub3;O&sub2;CCF&sub2;O-(CF&sub2;CF&sub2;O)&sub7;(CF&sub2;O)&sub1;&sub4;- CF&sub2;CO&sub2;CH&sub3; (die CF&sub2;O- und CF&sub2;CF&sub2;O-Einheiten waren wahllos angeordnet) in dem FC-43 anstelle der Perfluorsäure zubereitet. Es wurde wie in Beispiel 5 alkalische Phosphatase zugesetzt und festgestellt, daß sie an den Emulsionströpfchen adsorbiert wurde.

Beispiel 7

Es wurden mit 1 bis 5 Vol.% FC-43 mit 0,1 bis 0,5 Gew.% von jeweils C&sub7;F&sub1;&sub5;C(O)NH-(CH&sub2;)&sub4;-N(CH&sub3;)&sub3; und C&sub7;F&sub1;&sub5;CH&sub2;OH in Lösungen einer Reihe von Proteinen, synthetischen Polyaminosäuren und Polysacchariden zubereitet, wie sie in Tabelle 3 aufgeführt sind. Die Emulsionen wurden durch Beschallung der FC-43-Mischung, Zusatz eines gleichen Volumens von Phosphat gepufferter Salzlösung mit 2 Gew.% Pluronic® F-68 bei pH 7 und dreifaches Waschen durch Zentrifugieren bei 30.000 g für 15 Minuten und durch erneutes Suspendieren in frischer Tensid-Puffer-Lösung, die kein BSA enthielt, zubereitet.
Die resultierenden Emulsionen wurden unter Anwendung der nachstehend aufgeführten Verfahren A, C, E oder F mit alkalischer Phosphatase (Sigma Typ VIIT) gekuppelt. Mit dem jeweiligen Material wurde die Aktivität der alkalischen Phosphatase an den Emulsionströpfchen wiederhergestellt und gezeigt, daß sowohl das Material an der Tröpfchenoberfläche adsorbiert wurde als auch daß es für die Immobilisierung der Enzym-Antikörper oder -antigene verfügbar war. Die auf diese Weise zubereiteten Substanzen sind geeignet, einzeln oder gemeinsam die Anwesenheit und die Konzentration eines Antigens oder Antikörpers in einer Probe zu bestimmen. Die mit Fibrinogen und Ovalbumin zubereiteten Emulsionen neigen während der Bearbeitungsschritte zum Aggregieren, während die anderen Substanzen eher akzeptable Emulsionen lieferten. Tabelle 3 Zur Zubereitung von fluorchemischen Emulsions/Biomolekülkombinationen verwendete Substanzen Biomolekül in wäßriger Lösung Konzentration Rinderserumalbumin Casein Gelatine Collagen Ovalbumin normales, menschliches Serum Fibrinogen Protaminsulfat Poly(lysin) Poly(phenylalanin-lysin) Poly(alanin-lysin) Heparin Dextransulfat

Beispiel 8

Es wurde eine Emulsion wie in Beispiel 7 mit BSA in der wäßrigen Phase zubereitet und wie in Beispiel 7 gewaschen. Zu einer Teilmenge dieser Emulsion wurde der Antikörper, Anti-BSA, zugesetzt, wobei beim Mischen eine Aggregation der Emulsion auftrat, die durch Änderungen (Zunahmen) der optischen Dichte der Emulsion beobachtet wurde. Unter Anwendung dieser Methode wurde die Anwesenheit des Antikörpers festgestellt und unter Anwendung der an einem Spektrophotometer auf genommenen Standardkurven halbquantitativ gemessen. Mit diesem Ergebnis wurde nachgewiesen, daß BSA sehr fest auf der Oberfläche des Emulsionströpfchens gebunden und als Antigen wirksam war.

Beispiel 9

Es wurde eine Teilmenge der in Beispiel 8 zubereiteten und gewaschenen Emulsion gemischt mit einer mit Fluorescein gekennzeichneten, Anti-BSA erzeugenden Aggregation von Emulsionströpfchen. Diese Klumpen waren bei Betrachtung in einem Fluoreszenzmikroskop, was darauf hinwies, daß der Antikörper die Emulsionströpfchen zum Vernetzen und Aggregieren brachte. Dieses Ergebnis bestätigt auch, daß BSA sehr fest auf der Tröpfchenoberfläche gebunden und als Antigen wirksam ist.

Beispiel 10

Es wurden Emulsionen mit 1 Vol.% FC-43 mit 0,1 Gew.% von jeweils C&sub7;F&sub1;&sub5;CH&sub2;OH und C&sub7;F&sub1;&sub5;C(O)NH-(CH&sub2;)&sub4;N(CH&sub3;)&sub2; oder C&sub7;F&sub1;&sub5;C(O)NH-C&sub6;H&sub4;N(CH&sub3;)&sub2; in einer Lösung von 0,5 Gew.% Poly(phenylalanin-lysin) bei pH 0 durch Beschallung für 5 Minuten in einer Rosettenzelle zubereitet. Nach der Beschallung wurden die Emulsionen mit einem gleichen Volumen von Phosphat gepufferter Salzlösung mit 2,0 Gew.% Pluronic F-68® und 0,2 Gew.% Triethanolamin stabilisiert. Die Dispersionen wurden nach dem Verfahren von Beispiel 7 gewaschen, bevor sie nach einem der nachstehend beschriebenen Verfahren mit der spezifischen Bindungsspezies gekuppelt wurden.
Substanzen, die erfolgreich an Emulsionen gekuppelt wurden, sowie die dafür verwendeten Verfahren sind in Tabelle 4 wiedergegeben. Die Substanzen wurden allein oder in Kombinationen gekuppelt, was zu separaten spezifischen Bindungsaktivitäten führte, die auf den gleichen Emulsionströpfchen intakt wieder hergestellt wurden. Die Materialien wurden bei den folgenden kommerziellen Quellen erhalten: Glucoseoxidase (Sigma Typ V), Meerrettichperoxidase (Sigma Typ VI), alkalische Phosphatase (Sigma Typ VIIT), Beta-Galactosidase (Sigma Grade VIII), Weizenkeimagglutinin (Triticum vulgaris lectin, Sigma), PHA (Phaseolus vulgaris lectin, Sigma), Protein A (Sigma), Kaninchen/Anti-Ziege-IgG (Cappel Laboratories and American Qualex), Maus/Anti-hCG (Hybritech, Monoclonal) I Kaninchen/Anti-HRP (Sigma), Ziege-IgG (Cappel Laboratories), hCG (Sigrna), Luminol (Sigma) und DL-Thyroxin (Sigma).
Die gekuppelten Emulsionen wurden in bezug auf die nach den bekannten Verfahren immobilisierten Substanzen ausgewertet, z. B. Enzyme durch die vom Lieferanten vorgegebenen Analyseverfahren, Antikörper mit ihren Antigenen in Agglutinationsreaktionen, Lektine durch Agglutination roter Blutkörperchen, Protein A durch Bindung der IgG's und deren Reaktion mit Antigen und Luminol durch Reaktion mit Peroxid und Peroxidase. Wenn Kombinationen der Substanzen mit Emulsionen gekuppelt wurden, wurden separate Analysen für die jeweilige Komponente durchgeführt. Tabelle 4 An fluorchemische Emulsionen gekuppelte Substanzen Substanz Methode Glucoseoxidase Meerrettichperoxidase alkalische Phosphatase Beta-Galactosidase Weizenkeimagglutinin Phaseolus vulgaris lectin (PHA) Anti-Meerrettichperoxidase Ziegen-Immunglobulin G Anti-Ziege-IgG Thyroxin Luminol menschliches Choriongonadotropin Anti-hCG Protein A

Methode A

Carbodiimid-Methode 1

Zu 2 ml einer Emulsion (1 bis 2 Vol.%) bei pH 7,0 in Phospaht gepufferter Salzlösung mit 2 % Pluronic F-68® und 0,2 % Triethanolamin, wurden 0,05 bis 1,0 mg der zu kuppelnden Substanz in wäßriger Lösung (0,1 bis 10 mg/ml) zugesetzt, gefolgt von 100 bis 500 Mikroliter eines Carbodiimid-Reagens (im allgemeinen 1-[3-(N,N-dimethylamin)propyl]-3-ethylcarbodiimid bei 2 mg/ml in Wasser). Die Mischung wurde bei Raumtemperatur für 1 bis 2 Stunden gemischt und 0,5 ml von jeweils 1,0 m Glycin und 10 % Ethanolamin zugesetzt und für weitere 2 Stunden gemischt. Die gekuppelte Emulsion wurde 12.900 g für 30 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das Emulsionspellet in frischem Tensid-Puffer erneut suspendiert. Die Schritte des Zentrifugierens und erneuten Suspendierens wurden 2 weitere Male wiederholt. Die resultierende Emulsion sodann einsatzbereit.

Methode B

Carbodiimid-Methode 2

Die an der Emulsion zu kuppelnde Substanz wurde mit einer Lösung des Carbodiimid-Reagens (wie bei der Methode A) bei Raumtemperatur für 30 bis 60 Minuten aktiviert. Das Verhältnis von Carbodiimid-Reagens war allgemein ein 2- bis 5-facher molarer Überschuß. Eine Dialyse für 2 bis 6 Stunden bei Raumtemperatur mit 3 Pufferänderungen oder Diafiltration mit 10 Volumina des Filtrats waren normalerweise für die Entfernung des überschüssigen Reagens ausreichend. Diese aktivierte Lösung wurde sodann zu 2 ml der Emulsion zugemischt und die Mischung für 2 bis 6 Stunden bei Raumtemperatur gedreht. Wie in der Methode A wurden Glycin und Ethanolamin zugesetzt, um die aktivierten Gruppen abzudecken, wobei die gekuppelte Emulsion wie in Methode A beschrieben zu isolieren.

Methode C

Glutaraldehyd-Methode 1

Zu 2 ml einer Emulsion in Salzlösung mit Phosphat gepuffertem pH-Wert von 7,0 und 2% Pluronic F-68® und 0,2 % Triethanolamin wurde die an der Emulsion zu kuppelnde Substanz, 0,5 bis 1,0 mg, in wäßriger Lösung (0,1 bis 10 mg/ml) zusammen mit 100 bis 500 Mikroliter von 1 % Glutaraldehyd- Monomerlösung (Sigma Chemical Co., Grade I) zugesetzt. Die Mischung wurde sodann bei Raumtemperatur für 30 bis 60 Minuten gemischt. Die Reaktion wurde durch Zusatz von 500 Mikrolitern von 10%igem Ethanolamin angehalten und für 2 bis 18 Stunden gemischt. Sodann wurde Natriumborhydrid, 500 Mikroliter von 2 mg/ml in Wasser (frisch zubereitet), zugesetzt und die Mischung für weitere 30 Minuten gedreht. Die Reinigung durch Zentrifugieren und erneutes Suspendieren wurde wie in Methode A vorgeschrieben ausgeführt.

Methode D

Glutaraldehyd-Methode 2

Die Oberfläche von 2 ml einer Emulsion in Tensid-Puffer wurde durch Reaktion mit 250 Mikrolitern einer 1%igen Glutaraldehyd-Monomerlösung für 30 Minuten aktiviert und sodann gegen den Tensid-Puffer bei 4 ºC für 18 Stunden mit 3 Änderungen des Puffers dialysiert. Danach wurde eine wäßrige Lösung der an der Emulsion zu kuppelnden Substanz zugesetzt (0,05 bis 1,0 mg) und für 18 Stunden gedreht. Die Kupplungsreaktion wurde durch Zugabe von 500 Mikrolitern von 10%igem Ethanolamin angehalten und die Emulsion nach dem in der Methode A beschriebenen Vorgehen aufbereitet.

Methode E

Perjodat-Methode 1

Eine Lösung der zu kuppelnden Substanz wurde in 0,3 m Natriumbicarbonat auf etwa 5 mg/ml aufgelöst, pH 8,1, und sodann durch Reaktion mit einem Milliliter einer 0,6 m Natriumperjodatlösung für 5 Minuten aktiviert, gefolgt von der Zugabe von einem Milliliter 0,16 m Ethylenglycollösung für 30 Minuten. Die Reaktionsmischung wurde sodann ausgiebig gegen 0,01 m Natriumbicarbonat dialysiert. Danach wurde die aktivierte Substanz 100 bis 200 Mikroliter, zu zwei Millilitern der Emulsion gegeben, 100 Mikroliter von Natriumcyanoborhydrid (100 mg/ml) zugesetzt und die Mischung für 2 Stunden gedreht. Die nicht zur Reaktion gelangten aktivierten Gruppen wurden sodann durch Reaktion mit 100 Mikrolitern von 10%igem Ethanolamin für 1 Stunde abgedeckt, gefolgt von einer Reaktion mit 1 mg Natriumborhydrid für weitere 30 Minuten. Die gekuppelte Emulsion wurde sodann durch das in Methode A beschriebene Vorgehen des Zentrifugierens und erneuten Suspendierens aufbereitet.

Methode F

Perjodat-Methode 2

Zu 2 ml Emulsion in Tensid-Puffer und 0,05 bis 1,0 mg der zu kuppelnden Substanz wurden 200 Mikroliter 0,06 in Natriumperjodat bei pH 7 und 100 Mikroliter Natriumcyanoborhydrid (100 mg/ml) zugesetzt und die Mischung für 1 Stunde-gedreht. Das überschüssige Reagens wurde mit 200 Mikroliter 0,16 m Ethylenglycol und 200 Mikroliter 10%igem Ethanolamin für 1 Stunde zur Reaktion gebracht und die gekuppelte Emulsion entsprechend dem Vorgehen nach Methode A durch Zentrifugieren und erneutes Suspendieren gereinigt.

Methode G

Bifunktionelle Säure, Methode 1

Zu einer Mischung von 2 ml Emulsion in Tensid-Puffer und 0,05 bis 1,0 mg der an der Emulsion zu kuppelnden Substanz wurden 100 Mikroliter frisch zubereitete Bis(N- hydroxysuccinimidyl)terephthalatlösung (10 mg/ml) in N,N- Dimethylformamid zugesetzt und die Mischung für 18 Stunden gedreht. Sodann wurde etwaiges zurückgebliebenes Reagens mit 500 Mikroliter 1m Glycin und 500 Mikroliter 10%igem Ethanolamin für 2 Stunden zur Reaktion gebracht. Die gekuppelte Emulsion wurde sodann durch Zentrifugieren und erneut es Suspendieren in frischem Puffer entsprechend Methode A abgetrennt.

Methode H

Bifunktionelle Säure, Methode 2

Zu einer Mischung von 2 ml Emulsion in Tensid-Puffer wurden 0,05 bis 1,0 mg der an der Emulsion zu kuppelnden Substanz und eine Teilmenge von 100 Mikroliter einer Mischung von 10 mg einer bifunktionellen organischen Säure zugesetzt, die nicht zum Ringschluß kommen kann, wie beispielsweise Fumarsäure oder Terephthalsäure, und 100 Mikroliter einer Carbonyldiimidazollösung (10 mg/ml) in N,N- Dimethylformamid, die für 15 Minuten reagiert haben, wonach die Mischung für 2 Stunden gedreht wurde. Das überschüssige Reagens wurde mit 500 Mikroliter von je 1 m Glycin und 10%igem Ethanolamin 2 Stunden zur Reaktion gebracht. Die gekuppelte Emulsion wurde sodann entsprechend Methode A durch Zentrifugieren und erneutes Suspendieren in frischem Puffer isoliert.

Methode I

Cyanat-Methode

Zu einer Mischung von 2 ml der Emulsion in Tensid- Puffer und 0,05 bis 1,0 mg der an der Emulsion zu kuppelnden Substanz wurden 100 Mikroliter einer p-Nitrophenylcyanatlösung (10 mg/ml) in N,N-Dimethylformamid zugesetzt und die Reaktionsmischung für 30 Minuten bei Raumtemperatur gedreht. Mit fortschreitender Reaktion entwickelte sich eine gelbe Farbe durch das in der Reaktion entstehende p-Nitrophenol. Sodann wurde die Mischung durch Zentrifugieren und erneut es Suspendieren entsprechend dem Vorgehen nach Methode A gereinigt.

Beispiel 11

Es wurde entsprechend Beispiel 7 eine Emulsion zubereitet und nach Methode E (Perjodat-Methode I) wie vorstehend mit einer Mischung von Glucoseoxidase und Meerrettichperoxidase gekuppelt. Die resultierende Emulsion erzeugte bei Exponierung an Glucose und dem Substrat für Peroxidase eine zur Menge der vorliegenden Glucose proportionale Färbung. Durch Verwendung von o-Dianisidin (0,0021m) in 0,05m Natriumacetat-Puffer bei pH 5,1 und von Vergleichsglucoselösungen mit 50 bis 500 mg/dl Emulsion wurde die lineare Bezugskurve (auch genannt Sollkurve) des Absorptionsvermögens bei 500 Namometer in Abhängigkeit von der Glucosekonzentration aufgetragen, was ergab, daß die Emulsion für der Analyse der Glucosekonzentration verwendet werden kann.

Beispiel 12

Es wurde eine Lösung von 0,2 Gew.% Tiers' Blau, ein perfluoralkylierter Kupferphthalocyanin-Farbstoff, in FC-43 für die Zubereitung von Emulsionen mit 1 bis 10 Vol.% Perfluortri-n-butylamin in Phosphat gepufferter Salzlösung mit 0,5 Gew.% Pluronic F-68® und 2 mg/ml BSA verwendet. Die Dispersionen wurden durch Beschallung für 5 bis 10 Minuten in einer eisgekühlten Rosettenzelle erhalten. Die Emulsionen wurden sodann durch Zentrifugieren bei 30.000 g und erneutes Suspendieren in frischer Puffer-Tensid-Lösung ohne BSA dreimal gewaschen. Die resultierenden Zubereitungen waren stark gefärbt mit einer leichten Verschiebung des Absorptionsmaximums von 610 zu 612 Nanometer, - gemessen mit einem Beckmann- Spektrophonometer, Modell 35.

Beispiel 13

Es wurde eine Lösung von C&sub8;F&sub1;&sub7;SO&sub3;-C&sub6;H&sub4;N=NC&sub6;H&sub4;N(CH&sub3;)&sub2; in Perfluortri-n-butylamin zur Darstellung von Emulsionen von 1 bis 10 Vol.% Perfluortri-n-butylamin in Phosphat gepufferter Salzlösung mit 0,5 Gew.% Pluronic F-68® und 2 mg/ml BSA verwendet. Die Dispersionen wurden durch Beschallung für 5 bis 10 Minuten in einer eisgekühlten Rosettenzelle erhalten.
Die Emulsionen wurden sodann durch Zentrifugieren bei 30.000 g und erneutes Suspendieren in frischer Puffer-Tensid-Lösung ohne BSA dreimal gewaschen. Die gewaschenen Emulsionen hatten eine gelbe Farbe, die jedoch zu rot wechselte, wenn der pH-Wert der Lösung in den Bereich von 2 bis 4 überging. Die Färbung trat jedoch lediglich im Zusammenhang mit den Emulsionströpfchen auf, was durch Zentrifugieren der Emulsion bei 30.00 g zur vollständigen Entfernung der Farbe von dem Überstand gezeigt wurde.
Es wurden Anteile der vorstehend erwähnten roten Emulsionen mit unterschiedlichen Anteilen von 1:1 bis 1:5 (Volumenanteil) der blauen Emulsionen aus Beispiel 12 kombiniert, um verschiedene Schattierungen von purpur Emulsionen zu erhalten. Die Farbe der kombinierten Emulsionen könnte durch Änderung des pH-Werts der wäßrigen Lösungen von purpur bis grün verändert werden.

Beispiel 14

Es wurden zwei Milligramm Mäuse-Immunglobulin (Ig) (kommerziell verfügbar bei Cappel Laboratories, Cochranville, PA) aufgelöst in 0,15m wäßriger Natriumchloridlösung und Glutaraldehyd zugesetzt, um 1,25 Gew.% zu erhalten. Nach 2 Stunden bei Raumtemperatur wurde das aktivierte Ig an Bio-Gel P-2 (kommerziell verfügbar bei BioRad Laboratories, Richmond, CA) chromatographiert, um das überschüssige Glutaraldehyd zu entfernen. Ein Milligramm des aktivierten Ig wurde mit 1 ml einer BSA-Emulsion nach Beispiel 7 in Phosphat gepufferter Salzlösung mit einem pH- Wert von 9,0 vereinigt. Nachdem sich die Mischung über 24 Stunden abgesetzt hatte, wurde die Emulsion zur Entfernung von nichtgebundenem Ig gewaschen und das Immun- Reaktionsvermögen auf Anti-Rinderserumalbumin und Anti-Maus- Immunglobolin mit Hilfe der Kapillar-Immundiffusion entsprechend den Ausführungen im "Handbook of Experimental Immunology", D.M. Weir, Herausg., Bd. 1, S. 19.1 . . . 19.5, Blackwell Scientific Publications (1973) getestet. Die Ergebnisse der Auswertung sind in Tabelle 5 zusammengestellt. Wenn eine Lösung des Antikörpers mit seinem entsprechenden Antiserum gemischt wird, verbindet sich das Antigen mit dem Antikörper, wobei unter geeigneten Bedingungen die Reaktionsteilnehmer ausfällende oder ausflockende Aggregate bilden, die mit dem bloßen Auge leicht sichtbar sind. Tabelle 5 Verwendete Antikörper Tensid fluorchem. Emulsion ohne Rinderserumalbumin und Immunglobulin g Anti-Rinderserumalbumin Anti-Immunglobulin

Beispiel 15

Es wurde eine Probe der fluorchemischen Emulsion nach Beispiel 7 unter Anwendung der Methode nach Beispiel 14 mit Streptococcus A-Kohlehydrat konjugiert, das nach der im Stanford Medical Bulletin 11, 290 . . . 291 beschriebenen Methode hergestellt wurde. ES wurde die Fähigkeit freier Streptococcus A-Organismen zur Verzögerung der Aggregation der fluorchemischen Emulsion mit gebundener Streptococcus A- Kohlehydrat-Mischung in Gegenwart eines monoklonalen IgM- Antikörpers getestet. Eine Kombination der fluorchemischen Emulsion mit gebundenem Streptococcus A-Kohlehydrat, des Antikörpers und unterschiedlicher Konzentrationen von freien Streptococcus A-Organismen wurde für 30 Minuten bei etwa 20 ºC bebrütet und auf Aggregation untersucht. Die Aggregation wurde mit einer Skala von 0 bis 4+ bewertet, wobei 0 keine Verzögerung der Tröpfchenaggregation bedeutet und 4+ die vollständige Verzögerung der Tröpfchenaggregation. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 dargestellt. Sie zeigen, daß diese Methode in der Lage ist, Organismen mit einer Konzentration von 10&sup5; pro Milliliter festzustellen. Tabelle 6 Test-Nummer Konzentration der Organismen Bewertung der Verzögerung der Aggregation

Claims

1. Träger für eine spezifische Bindungsreaktion, umfassend eine Emulsion mit einer wäßrigen kontinuierlichen Phase und einer perhalogenierten, fluorchemischen diskontinuierlichen Tröpfchenphase, die wahlweise weiter substituiert ist mit bis zu 50% Wasserstoff-Substitution, wobei die perhalogenierten fluorchemischen Tröpfchen an ihrer Oberfläche mindestens eine spezifische Bindungsspezies haben, die Emulsion in der Lage ist, mit dem Bindungspartner der spezifische Bindungsspezies in Kontakt zu kommen und die spezifische Bindungsspezies nicht Rinderserumalbumin oder Lecithin ist.

2. Biologisch aktive Emulsion nach Anspruch 1, bei welcher die spezifische Bindungsspezies ausgewählt wird aus einer Gruppe, bestehend aus einem Vertreter eines Antigen/Antikörperpaars, bei welchem das Antigen ein natürlich auf tretendes oder synthetisches Protein ist, Peptid, Polysaccharid, Lipid, Nucleinsäure, organisches Polymer, Antigenfragment dieser Substanzen, ein infektiöses Agens, ein Hapten; Lektin; ein Segment der DNS oder RNS; Enzym; ein Zelloberflächenmarker, ein Zelloberfächenrezeptor; eine therapeutische Substanz; ein Metabolit einer therapeutischen Substanz; ein Endotoxin; ein spezifischer Bindungspartner eines der Vorstehenden sowie Kombinationen und Derivate eines der Vorstehenden.

3. Biologisch aktive Emulsion nach einem der vorstehenden Ansprüche, bei welcher die spezifischen Bindungsspezies an den perhalogenierten fluorchemischen Tröpfchen durch Adsorption an der Grenzfläche der kontinuierlichen Phase und der diskontinuierlichen Phase immobilisiert sind.

4. Biologisch aktive Emulsion nach einem der vorstehenden Ansprüche, bei welcher die perhalogenierte, fluorchemische diskontinuierliche Tröpfchenphase ferner eine Primersubstanz aufweist und die spezifische Bindungsspezies zur Primersubstanz an der Grenzfläche der kontinuierlichen Phase und der diskontinuierlichen Phase konjugiert ist.

5. Biologisch aktive Emulsion nach Anspruch 4, bei welcher die Primersubstanz ausgewählt wird aus einer Gruppe, bestehend aus natürlich auftretenden oder synthetischen Polymeren mit Amin, Carboxyl, Mercapto oder anderen funktionalen Gruppen, die zu spezifischen Reaktionen mit Kupplungsmitteln in der Lage sind, sowie natürlich auftretenden und synthetischen Polymeren, die höher geladen sind.

6. Biologisch aktive Emulsion nach Anspruch 4, bei welcher die Primersubstanz ausgewählt wird aus einer Gruppe, bestehend aus Albuminen, Casein, ganzen Seren, Fibrinogen, Collagene, sowie natürlich auftretenden und synthetischen Poly(aminosäuren) und geladenen Polysacchariden.

7. Biologisch aktive Emulsion nach einem der vorstehenden Ansprüche, bei welcher die perhalogenierte, fluorchemische diskontinuierliche Tröpfchenphase mit einer gefärbten Substanz gefärbt ist, die in der perhalogenierten, fluorchemischen Substanz löslich und in der wäßrigen kontinuierlichen Phase unlöslich ist.

8. Emulsion, umfassend eine wäßrige kontinuierliche Phase und eine perhalogenierte, fluorchemische diskontinuierliche Tröpfchenphase, die wahlweise weiter substituiert ist mit bis zu 50% Wasserstoff-Substitution, wobei die perhalogenierten fluorchemischen Tröpfchen einen Farbstoff aufweisen.

9. In vitro spezifisches Bindeverfahren, umfassend:

a. Schaffung einer Emulsion in vitro mit einer wäßrigen kontinuierlichen Phase, einer perhalogenierten, fluorchemischen diskontinuierlichen Tröpfchenphase, die wahlweise weiter substituiert ist mit bis zu 50% Wasserstoff-Substitution, sowie eine auf den perhalogenierten fluorchemischen Tröpfchen immobilisierte spezifischen Bindungsspezies; und

b. Inkontaktbringen der perhalogenierten fluorchemischen Tröpfchen und Immobilisieren spezifischer Bindungsspezies mit einer wäßrigen Lösung, welche die spezifischen Bindungspartner der spezifischen Bindungsspezies für eine ausreichende Dauer enthält, um ein Binden zu ermöglichen.