DE69133533T2

DE69133533T2 - Expression von Phytase in Pflanzen

Info

Publication number: DE69133533T2
Application number: DE69133533T
Authority: DE
Inventors: Jan Pen; Andreas Hoekema; Peter Christiaan Sijmons; Albert J.J. Van Ooyen; Krijn Rietveld; Teunis Cornelis Verwoerd
Original assignee: Koninklijke DSM NV; Syngenta Mogen BV
Current assignee: Koninklijke DSM NV; Syngenta Mogen BV
Priority date: 1990-03-23
Filing date: 1991-03-25
Publication date: 2006-11-23
Anticipated expiration: 2011-03-26
Also published as: EP0449375A2; EP0449375A3; ATE328093T1; HU215164B; ES2267092T3; KR100225087B1; RU2128228C1; US5770413A; AU632941B2; CA2056396A1; HU914086D0; HUT60780A; FI915477A0; JP3471795B2; AU7776691A; DE69133533D1; IL97646A; PT97111B; PT97111A; EP0449375B1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft die Produktion von Phytase in transgenen Pflanzen und die Verwendung der so produzierten Phytase in industriellen Prozessen.
Hintergrund der Erfindung
Phosphor ist ein wesentliches Element für das Wachstum sämtlicher Organismen. Bei der Nutzviehproduktion muss das Futter mit anorganischem Phosphor ergänzt werden, damit eine gute Wachstumsleistung monogastrischer Tiere (beispielsweise Schweine, Geflügel und Fisch) erzielt wird.
Kein Phosphat muss dagegen zum Futter von Wiederkäuern gegeben werden. Im Pansen vorhandene Mikroorganismen produzieren Enzyme, die die Umwandlung von Phytat (Myoinositolhexakisphosphat) zu Inositol und anorganischem Phosphat katalysieren.
Phytat tritt als Speicherphosphorquelle in fast allen Futtersubstanzen auf, die pflanzlichen Ursprungs sind (für einen Überblick siehe: Phytic acid, chemistry and applications, E. Graf (Hrsg.), Pilatus Press; Minneapolis, MN, USA (1986)). Phytat ist in 1 bis 3% sämtlicher Nüsse, Cerealien, Hülsenfrüchte, Ölsamen, Sporen und Pollen enthalten. Komplexe Salze der Phytinsäure werden als Phytin bezeichnet. Phytinsäure wird als antinutritiver Faktor angesehen, da es Chelate mit Mineralien bildet, wie Calcium, Zink, Magnesium, Eisen, und es kann ebenfalls mit Proteinen reagieren, wodurch die Bioverfügbarkeit der Proteine und von Mineralien, die für die Ernährung wichtig sind, gesenkt wird.
Phytatphosphor gelangt durch den Magendarmtrakt der monogastrischen Tiere und wird im Dung ausgeschieden. Das Phytat wird zwar in gewissem Maße im Kolon hydrolysiert, jedoch hat das so freigesetzte anorganische Phosphor keinen Nährwert, da der anorganische Phosphor nur im Dünndarm absorbiert wird.
Demzufolge wird keine bedeutende Menge des für die Ernährung wichtigen Phosphors von monogastrischen Tieren genutzt, obwohl es im Futter vorhanden ist.
Die Ausscheidung von Phytatphosphor im Dung hat weitere Konsequenzen. Die intensive Viehzucht hat während der vergangenen Jahrzehnte enorm zugenommen. Folglich nahm entsprechend die Menge des erzeugten Dungs zu und hat Umweltprobleme in verschiedenen Teilen der Welt hervorgerufen. Dies beruht zum Teil auf der Anreicherung von Phosphat aus dem Dung in Oberflächengewässern, die eutrophiert wurden.
Die von den Mikroorganismen produzierten Enzyme, die die Umwandlung von Phytat zu Inositol und anorganischem Phosphor katalysieren, sind gemeinhin als Phytasen bekannt. Phytaseproduzierende Mikroorganismen umfassen Bakterien, wie Bacillus subtilis (V.K. Paver und V.J. Jagannathan (1982) J. Bacteriol. 151, 1102) und Pseudomonas (D.J. Cosgrove (1970) Austral. J. Biol. Sci. 23, 1207); Hefen, wie Saccharomyces cerevisiae (N.R. Nayini und P. Markakis (1984) Lebensmittel Wissenschaft und Technologie 17, 24); und Pilze, wie Aspergillus terreus (K. Yamada, Y. Minoda und S. Yamamoto (1986) Agric. Biol. Chem. 32, 1275). Verschiedene andere Aspergillus-Arten produzieren bekanntlich Phytase, von denen die von Aspergillus ficuum produzierte Phytase Bestimmungen zufolge mit die höchsten Mengen spezifischer Aktivität aufweist, sowie bessere Thermostabilität als Phytasen, die von anderen Mikroorganismen produziert werden (van Gorcom et al. (1991) Europäische Patentanmeldung 89202436.5, Veröffentlichung Nr. 0 420 358, eingereicht am 27. September 1989).
Phytasen sind ebenfalls endogen in vielen Pflanzenarten vorhanden (siehe Loewus, F.A. (1990) In: Plant Biology Bd. 9: "Inositol metabolism in Plants" (Hrsg. D.J. Morré, W.F. Boss, F.A. Loewus)13). Gellatly, K.S. und Lefebvre, D.D. ((1990) Plant Physiology (Anhang), 93, Abstract 562) erwähnen die Isolation und die Charakterisierung eines Phytase-cDNA- Klons, der von Kartoffelknollen erhalten wurde. Gibson, D.M. et al., und Christen A.A. et al. ((1988) J. Cell Biochem., 12C Abstracts L407 bzw. L402) erwähnen die Synthese der endogenen Phytase während der Keimbildung von Sojasamen. Die Pflanzenphytasen werden jedoch normal in Mengen produziert, die für ihre Anwendung in industriellen Verfahren an sich unzureichend ist.
Das Konzept der Zugabe von mikrobieller Phytase zu den Futtermitteln monogastrischer Tiere wurde zuvor beschrieben (Ware, J.H., Bluff, L. und Shieh, T.R. (1967) US-Patent Nr. 3297548; Nelson, T.S., Shieh, T.R., Wodzinski, R.J. und Ware, J.H. (1971) J. Nutrition 101, 1289). Bisher ließ sich dieses Konzept nicht kommerziell anwenden, und zwar aufgrund der hohen Kosten der Produktion der mikrobiellen Enzyme (Y.W. Han (1989) Animal Feed Sci. und Technol. 24, 345). Aus ökonomischen Gründen wird immer noch anorganischer Phosphor zum Futter monogastrischer Tiere gegeben.
Phytasen haben ebenfalls andere industrielle Nutzen gefunden. Ein Beispiel für solche Nutzen ist ein industrielles Verfahren zur Produktion von Stärke aus Getreide, wie Mais und Weizen. Abfallprodukte, die beispielsweise Maisglutenfutter aus einem solchen Nass-Schrotverfahren umfassen, werden als Tierfutter verkauft. Während des Einweichverfahrens kann Phytase ergänzt werden. Die Bedingungen (T ≈ 50°C und pH-Wert = 5,5) sind ideal für Pilzphytasen (siehe beispielsweise die europäische Patentanmeldung 0 321 004 von Alko Ltd.). Vorteilhafterweise enthalten Tierfutter, die von Abfallprodukten dieses Verfahrens hergeleitet werden, Phosphat anstelle von Phytat.
Man überlegt auch, dass Phytasen bei der Sojaverarbeitung verwendet werden können (siehe Finase^TM Enzyme von Alko, eine Produktinformationsbroschüre, veröffentlicht von Alko Ltd., Rajamäki, Finnland). Sojamehl enthält hohe Mengen des Antinährstofffaktors Phytat, das diese Proteinquelle zur Anwendung in Babynahrung und in Futter für Fische, Kälber und andere Nicht-Wiederkäuer ungeeignet macht. Ein enzymatisches Aufwerten dieser wertvollen Proteinquelle verbessert den Nähr- und den kommerziellen Wert dieses Materials.
Die Möglichkeit der Verwendung transgener Pflanzen als Produktionssystem für wertvolle Proteine wurde vorgeschlagen. Bisherige Beispiele sind die Produktion von Interferon in Tabak (Goodman, R.M., Knauf, V.C., Houck, C.M. und Comai, L., (1987) PCT/WO 87/00865), von Enkephalinen in Tabak, Brassica napus und Arabidopsis thaliana (Vandekerckhove, J., VanDamme, J. Van Lijsebettens, M., Botterman, J. DeBlock, M., DeClerq, A., Leemans, J., Van Montagu, M. und Krebbers, E. (1989) Bio/Technol. 7, 929), von Antikörpern in Tabak (Hiatt, A., Cafferkey, R. und Boedish, K. (1990) Nature 342, 76) und von Humanserumalbumin in Tabak und Kartoffel (Sijmons, P.C. Dekker, B.M.M., Schrammeijer, B., Verwoerd, T.C., van den Elzen, P.J.M. und Hoekema, A. (1990) Bio/Technol. 8, 217).
In der Praxis wurde die Transformation einer steigenden Anzahl von Pflanzeneinheiten, insbesondere dikotyler Arten (beispielsweise. Tabak, Kartoffel, Tomate, Petunia, Brassica) zu einem Routineverfahren für den Fachmann (Klee, H. Horsch, R. und Rogers, S. (1987) Annu. Rev. Plant Physiol. 38, 467; Gasser C.S. und Fraley, R.T. (1989) Science 244, 1293). Strategien für die Expression von Fremdgenen in Pflanzen wurden gut etabliert (Gasser und Fraley, siehe oben). Es wurden regulatorische Sequenzen aus Pflanzengenen identifiziert, die zur Konstruktion chimärer Gene verwendet werden, die in Pflanzen und Pflanzenzellen funktionell exprimiert werden können.
Für die Einbringung der Genkonstruktionen in Pflanzen sind mehrere Techniken verfügbar, wie die Transformation mit Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes. Mit dieser Strategie wurde eine Reihe von Pflanzengeweben ausgenutzt, wobei die Auswahl stark von der Pflanzenart und seiner Zugänglichkeit in Gewebekulturen abhängt. Erfolgreiche Beispiele sind die Transformation von Protoplasten, Mikrosporen oder Pollen, und von Explantaten, wie Blättern, Stängeln, Wurzeln, Hypokotylen und Kotylen. Zudem werden Verfahren zur direkten DNA-Einführung in Protoplasten und Pflanzenzellen oder Geweben verwendet, wie Mikroinjektion, Elektroporation, Teilchenbeschuss und direkte DNA-Aufnahme (Gasser und Fraley, siehe oben).
Proteine können in Pflanzen mit einer Vielzahl von Expressionssystemen produziert werden. Die Verwendung eines konstitutiven Promotors wie des ³⁵S-Promotors des Blumenkohl-Mosaikvirus (CaMV) (Guilley, H., Dudley, R.K., Jonard, G. Balazs, E., und Richards, K.E. (1982) Cell 30, 763) führt zur Anreicherung des exprimierten Proteins in allen Organen der transgenen Pflanze. Alternativ können Promotoren aus Genen verwendet werden, die Proteine kodieren, die auf sehr gewebespezifische und stadienspezifische Weise exprimiert werden (Higgins, T.J.V., (1984) Annu. Rev. Plant Physiol. 35, 191; Shotwell, M.A. und Larkins, B. A. (1989) In: The Biochemistry of Plants Bd. 15 (Academic Press, San Diego; Stumpf, P.K. und Conn, E.E. Hrsg.), 297, d.h. die Gene werden nur während der gewünschten Entwicklungsstufe im Zielgewebe exprimiert.
Es wird angenommen, dass ein ökonomisches Verfahren zur Herstellung von Phytase u.a. für die Tierfutterindustrie von Nutzen ist. Ein Verfahren zur Herstellung einer ökonomischeren Phytase ist die Verwendung von DNA-Rekombinationstechniken zur Herstellung transgener Pflanzen oder Pflanzenorgane, die Phytase exprimieren können, die dann wiederum als solche zu Tierfutter oder Futtermittel zum direkten Verbrauch durch das Tier gegeben werden können. Alternativ kann die Phytase, die in diesen transgenen Pflanzen oder Pflanzenorganen exprimiert wird, extrahiert werden und wenn gewünscht zur gewünschten Anwendung gereinigt werden.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt die Expression mikrobieller Phytase in transgenen Pflanzen oder Pflanzenorganen und Verfahren zur Herstellung dieser Pflanzen bereit. Dies wird über die Einbringung eines aus einer mikrobiellen Quelle erhaltenen Expressionskonstrukts, das ein Protein mit Phytaseaktivität kodiert, in die Pflanze erzielt.
Die erfindungsgemäß bereitgestellten DNA-Expressionskonstrukte zur Transformation von Pflanzen stehen unter der Kontrolle von regulatorischen Sequenzen, die die Expression von Phytase steuern können. Diese regulatorischen Sequenzen können ebenfalls Sequenzen beinhalten, die die Transkription in Pflanzen je nach der Verwendung der Pflanze oder deren Teile konstitutiv oder stadien- und gewebespezifisch steuern können.
Die transgenen Pflanzen und Pflanzenorgane, die erfindungsgemäß bereitgestellt werden, können für eine Vielzahl von industriellen Verfahren angewendet werden, und zwar entweder direkt, beispielsweise in Tierfutter oder Futtermitteln oder alternativ kann die exprimierte Phytase extrahiert und wenn gewünscht vor der Anwendung gereinigt werden.
Kurze Beschreibung der Figuren
1. Strategie zur Klonierung der Phytase-cDNA.
2. Nukleotidsequenz des translatierten Bereichs des Phytase-cDNA-Fragmentes und der abgeleiteten Aminosäuresequenz des Phytaseproteins; der Start des reifen Phytaseproteins ist als Position +1 angezeigt.
3. Binärer Vektor pMOG23.
4. Oligonukleotid-Duplices, die bei der Klonierung verwendet werden.
5. Plasmid pMOG29. Plasmid-pUC18, das eine Expressionscassette zur konstitutiven Expression in Pflanzen und eine Sequenz enthält, die ein Tabak-Signalpeptid kodiert.
6. Die Wirkungen der Zugabe von gemahlenen Samen, die Phytase enthalten, auf die Freisetzung von anorganischem Phosphor aus Phytat.
7. Dosisantwort-Beziehung von Aspergillus-Phytase in einem In-vitro-Verdauungsmodell.
8. Dosisantwort-Beziehung von Aspergillus-Phytase und Phytase, die in Tabaksamen enthalten ist, in einem In-vitro-Verdauungsmodell.
Eingehende Beschreibung der Erfindung
Erfindungsgemäß werden transgene Pflanzen oder Pflanzenorgane erhalten, in denen mikrobielle Phytase produziert wird. Dies wird erzielt über die Einbringung eines Expressionskonstruktes, das eine aus einer mikrobiellen Quelle erhaltene DNA-Sequenz umfasst, die ein Protein mit Phytaseaktivität kodiert.
DNA-Expressionskonstrukte werden erfindungsgemäß zur stabilen Transformation von Pflanzen mit einem aus einer mikrobiellen Quelle erhaltenen Gen, das eine Phytase kodiert, bereitgestellt. Diese Konstrukte umfassen eine Phytase, die funktionsfähig an regulatorische Sequenzen gebunden ist, die die Expression von Phytase steuern können. Diese regulatorischen Sequenzen können auch Sequenzen umfassen, die die Transkription in Pflanzen steuern können, und zwar entweder konstitutiv oder stadien- und/oder gewebespezifisch, je nach der Verwendung der Pflanze oder deren Teile.
Die erfindungsgemäß bereitgestellten Expressionskonstrukte können in einen Vektor, vorzugsweise ein Plasmid, eingeführt werden, das bei der bakterien-vermittelten Transformation des ausgewählten Pflanzenwirts verwendet wird. Das Expressionskonstrukt wird dann vorzugsweise in das Genom des Pflanzenwirts integriert.
Im erfindungsgemäßen Zusammenhang umfasst der Begriff Phytase eine Familie von Enzymen, die Reaktionen katalysieren, die die Freisetzung von anorganischem Phosphor aus verschiedenen Myoinositolphosphaten beinhalten. Dies umfasst sämtliche Proteine, die Phytaseaktivität aufweisen.
Die Phytase kodierende DNA-Sequenz kann aus einer Vielzahl von mikrobiellen Quellen erhalten werden, wie aus dem filamentösen Pilz Aspergillus. Am stärksten bevorzugte DNA-Sequenzen werden erhalten aus Aspergillus ficuum, Aspergillus niger, Aspergillus awamori und Aspergillus nidulans.
Die Klonierung eines Gens oder einer cDNA, die ein Phytaseprotein kodiert, kann mit verschiedenen Verfahren erzielt werden. Ein Verfahren ist durch Reinigung des Phytaseproteins, die anschließende Bestimmung der N-terminalen und einiger interner Aminosäuresequenzen und das Screening einer genomischen oder cDNA-Bank des Organismus, der die Phytase produziert, unter Verwendung von Oligonukleotidsonden, die auf den Aminosäuresequenz basieren.
Ist zumindest eine Partialsequenz des Gens bekannt, kann diese Information zur Klonierung der entsprechenden cDNA verwendet werden, beispielsweise Polymerasekettenreaktion (PCR) (PCR-Technology: Principles and Applications for DNA Amplifications (1989) H.A. Ehrlich, Hrsg. Stockton Press, New York).
Der Fachmann ist sich darüber bewusst, dass das vorstehend beschriebene klonierte Phytasegen in heterologen Hybridisierungsexperimenten verwendet werden kann, die auf die Isolation von Phytasekodierenden Genen aus anderen Mikroorganismen gerichtet sind.
Bei einem anderen Aspekt kann das vorstehend beschriebene klonierte Phytasegen als Ausgangsmaterialien zur Konstruktion von Phytasen der "zweiten Generation" verwendet werden. Phytasen der "zweiten Generation" sind Phytasen, die durch Mutagenesetechniken verändert wurden (beispielsweise stellengerichtete Mutagenese), die Eigenschaften haben, welche von denen der Wildtyp-Phytasen abweichen, oder rekombinante Phytasen, wie beispielsweise diejenigen, die durch die vorliegende Erfindung produziert werden. Die Temperatur oder das pH-Wert-Optimum, die spezifische Aktivität oder die Substrataffinität, können so verändert werden, dass sie sich besser zur Anwendung in einem definierten Verfahren eignen.
Die Isolation der cDNA, die die Phytase kodiert, ermöglicht die Konstruktion von Expressionskonstrukten, die die Produktion von Phytase im selektierten Pflanzenwirt über die Anwendung von DNA-Rekombinationstechniken, wie dem Austausch regulatorischer Elemente, wie beispielsweise Promotoren, sekretorischer Signale oder deren Kombinationen, steuern können.
Phytase kann konstitutiv in den transgenen Pflanzen, während sämtlicher Entwicklungsstadien produziert werden. Je nach der Verwendung der Pflanze oder Pflanzenorgane können die Enzyme in einer stadienspezifischer Weise exprimiert werden, beispielsweise während der Knollenbildung oder Fruchtentwicklung. Auch können die Enzyme je nach Verwendung gewebespezifisch exprimiert werden, beispielsweise in Pflanzenorganen, wie Früchten, Knollen, Blättern oder Samen.
Transgene Pflanze, wie sie im Zusammenhang der vorliegenden Erfindung definiert sind, umfassen Pflanzen (sowie Teile und Zellen der Pflanzen) und ihre Nachkommen, die mit DNA-Rekombinationstechniken modifiziert wurden, so dass ihre Phytaseproduktion in der gewünschten Pflanze oder dem gewünschten Pflanzenorgan verursacht oder erhöht wird.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung steht der Ausdruck "eine erhöhte Phytasemenge" speziell für eine statistisch signifikante Menge Pflanzengewebe, die im Durchschnitt eine statistisch größere Menge Phytase enthält als die durchschnittliche Menge Phytaseenzym, die man in einer gleichen Menge eines nicht-modifizierten Pflanzengewebes findet.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung umfassen auszuwählende Pflanzen Feldfrüchte, die essbare Blüten bilden, sind aber nicht eingeschränkt auf; Blumenkohl (Brassica oleracea), Artischocke (Cynara scolymus), Früchte, wie Apfel (Malus, bspw. domesticus), Banane (Musa, bspw. acuminata), Beeren (wie die Johannisbeere, Ribes, bspw. rubrum), Kirschen (wie die Süßkirsche, Prunus, bspw. avium), Gurke (Cucumis, bspw. sativus), Weintraube (Vitis, bspw. vinifera), Zitrone (Citrus limon), Melone (Cucumis melo), Nüsse (wie die Walnuss, Juglans, bspw. regia; Erdnuss, Arachis hypogeae), Orange (Citrus, bspw. maxima), Pfirsich (Prunus, bspw. persica), Birne (Pyra, bspw. communis), Pflaume (Prunus, bspw. domestica), Erdbeere (Fragaria, bspw. moschata), Tomate (Lycopersicon, bspw. esculentum), Blätter, wie Luzerne (Medicago, bspw. sativa), Kohl (bspw. Brassica o1eracea), Endivie (Cichoreum, bspw. endivia), Lauch (Allium, bspw. porrum), Salat (Lactuca, bspw. sativa), Spinat (Spinacia bspw. oleraceae), Tabak (Nicotiana, bspw. tabacum), Wurzeln, wie Pfeilwurz (Maranta, bspw. arundinacea), Rübe (Beta, bspw. vulgaris), Karotte (Daucus, bspw. carota), Maniok (Manihot, bspw. esculenta), Weißrübe (Brassica, bspw. rapa), Rettich (Raphanus, bspw. sativus), Yams (Dioscorea, bspw. esculenta), Süßkartoffel (Ipomoea batatas) und Samen, wie Bohne (Phaseolus, bspw. vulgaris), Erbse (Pisum, bspw. sativum), Sojabohne (Glycine, bspw. max), Weizen (Triticum, bspw. aestivum), Gerste (Hordeum, bspw. vulgare), Mais (Zea, bspw. mays), Reis (Oryza, bspw. sativa), Raps (Brassica napus), Hirse (Panicum L.), Sonnenblume (Helianthus annus), Hafer (Avena sativa), Knollen, wie Kohlrabi (Brassica, bspw. oleraceae), Kartoffel (Solanum, bspw. tuberosum) und dergleichen.
Die Auswahl der Pflanzenart wird hauptsächlich von der beabsichtigten Verwendung der Pflanze oder ihrer Teile und der Zugänglichkeit der Pflanzenart gegenüber Transformation bestimmt.
Es sind mehrere Techniken zur Einbringung des Expressionskonstruktes, das die phytasekodierende DNA-Sequenz enthält, in die Zielpflanzen verfügbar. Solche Techniken umfassen, sind aber nicht eingeschränkt auf die Transformation der Protoplasten mit dem Calcium/Polyethylenglycol-Verfahren, Elektroporation und Mikroinjektion oder Beschuss (beschichteten) Teilchen (Potrykus, I. (1990) Bio/Technol. 8, 535).
Neben diesen sogenannten direkten DNA-Transformationsverfahren sind Transformationssysteme weithin erhältlich, die Vektoren umfassen, wie virale Vektoren (beispielsweise aus dem Blumenkohlmosaikvirus (CaMV) und bakterielle Vektoren (beispielsweise aus der Gattung Agrobacterium) (Potrykus, siehe oben). Nach der Selektion und/oder dem Screening können die transformierten Protoplasten, Zellen oder Pflanzenteile zu ganzen Pflanzen regeneriert werden, wobei Verfahren des Standes der Technik verwendet werden (Horsch, R.B. Fry, J.E. Hoffmann, N.L. Eichholtz, D., Rogers, S.G. & Fraley, R.T. (1985) Science 227, 1229). Die Auswahl der Transformations- und/oder Regenerationstechniken ist für diese Erfindung nicht entscheidend.
Für dikotyle Pflanzen verwendet eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung das Prinzip des binären Vektorsystems (Hoekema, A., Hirsch, P.R., Hooykaas, P.J.J. und Schilperoort, R.A. (1983) Nature 303, 179; Schilperoort, R.A., Hoekema, A. und Hooykaas, P.J.K. (1984) europäische Patentanmeldung Nr. 0 120 516), wobei Agrobacterium-Stämme verwendet werden, die ein Vir-Plasmid mit den Virulenzgegenen und ein kompatibles Plasmid enthalten, die das zu überführende Genkonstrukt enthalten. Dieser Vektor kann in E. coli und in Agrobacterium repliziert werden und ist von dem binären Vektor Bin19 (Bevan, M. (1984) Nucl. Acids Res. 12, 8711) hergeleitet, der in Einzelheiten verändert ist, die erfindungsgemäß nicht relevant sind. Die binären Vektoren, wie sie in diesem Beispiel verwendet werden, enthalten linke und rechte Grenzsequenzen der T-DNA, ein identisches NPTII-Gen, das die Kanamycinresistenz kodiert (Bevan, siehe oben) und eine mehrfache Klonierungsstelle zum Einklonieren der erforderlichen Genkonstrukte.
Die Transformation und Regeneration monokotyler Feldfrüchte ist kein Standard-Verfahren. Jüngerer wissenschaftlicher Fortschritt zeigt, dass Monokotyledonen gegenüber einer Transformation zugänglich sind, und dass fertile transgene Pflanzen aus transformierten Zellen regneriert werden können. Die Entwicklung von reproduzierbaren Gewebekultursystemen für diese Feldfrüchte, zusammen mit den leistungsfähigen Verfahren zum Einbringen von genetischem Material in die Pflanzenzellen hat die Transformation erleichtert. Die Verfahren der Wahl für die Transformation von Monokotyledonen sind derzeit Mikroprojektil-Beschuss von Explantaten oder Suspensionszellen, und direkte DNA-Aufnahme oder Elektroporation von Protoplasten. Transgene Reispflanzen wurden beispielsweise erfolgreich erhalten mit dem bakteriellen hph-Gen, das die Hygromycin-Resistenz kodiert, als Selektionsmarker. Dieses Gen wurde durch Elektroporation eingebracht (Shimamoto, K., Terada, R., Izawa, T. und Fujimoto, H. (1989) Nature 338, 274). Transgene Maispflanzen wurden erhalten durch Einbringen des Streptomyces hygroscopius-bar-Gens, das die Phosphoinothricinacetyltransferase (ein Enzym, das das Herbizid Phosphoinothrizin inaktiviert) kodiert, in embryogene Zellen einer Maissuspensionskultur durch Mikropartikelbeschuss (Gordon-Kamm, W.J. Spencer, T.M., Mangano, M.L., Adams, T.R., Daines, R.J. Start, W.G., O'Brien, J.V., Chambers, S.A., Adams Jr., W.R., Willets, N.G., Rice, T.B., Mackey, C.J., Krueger, R.W., Kausch, A.P. und Lemaux, P.G. (1990) The Plant Cell 2, 603). Die Einbringung von genetischem Material in Aleuronprotoplasten anderer monokotyler Feldfrüchte, wie Weizen und Gerste, wurde beschrieben (Lee, B., Murdoch, K., Topping, J., Kreis, M. und Jones, M.G..K. (1989) Plant Mol. Biol. 13, 21). Weizenpflanzenpflanzen wurden aus der embryogenen Suspensionskultur durch Selektieren nur der gealterten kompakten und knotenförmigen embryogen Kallusgewebe für die Etablierung der embryogenen Supensionskulturen regeneriert (Vasil, V., Redway, F. und Vasil, I.K. (1990) Bio/Technol. 8, 429). Die Kombination mit den Transformationssystemen für diese Feldfrüchte ermöglicht die Anwendung der vorliegenden Erfindung auf Monokotyledone. Diese Verfahren können ebenfalls für die Transformation und Regeneration der Dikotyledonen angewendet werden.
Die Expression des Phytasekonstruktes beinhaltet solche Einzelheiten, wie die Transkription des Gens durch Pflanzenpolymerasen, Translation von mRNA, usw. die dem Fachmann auf dem Gebiet der DNA-Rekombinationstechniken geläufig sind. Es werden nur Einzelheiten nachstehend erläutert, die für das korrekte Verständnis dieser Erfindung relevant sind.
Regulatorische Sequenzen, die bekannt sind oder die Befunden zufolge die Expression der Phytase verursachen, können erfindungsgemäß verwendet werden. Die Auswahl der verwendeten regulatorischen Sequenzen hängt vom der Zielfrucht und/oder dem Zielorgan von Interesse ab. Diese regulatorischen Sequenzen können von Pflanzen oder Pflanzenviren erhalten werden oder können chemisch synthetisiert werden. Diese regulatorischen Sequenzen sind Promotoren, die bei der Steuerung der Transkription in Pflanzen je nach der Verwendung der Pflanze oder von deren Teilen entweder konstitutiv oder stadien- und/oder gewebespezifisch aktiv sind. Diese Promotoren umfassen, sind aber nicht eingeschränkt auf Promotoren, die konstitutive Expression aufweisen, wie der 35S-Promotor des Blumenkohl-Mosaikvirus (CaMV) (Guilley et al., (1982) Cell 30, 763), diejenigen für blattspezifische Expression, wie der Promotor für das Gen der kleinen Untereinheit der Ribulosebisphosphatcarboxylase (Coruzzi et al., (1984) EMBO J. 3, 1671), diejenigen für eine wurzelspezifische Expression, wie der Promotor aus dem Glutaminsynthasegen (Tingey et al., (1987) EMBO J., 6, 3565), diejenigen für samenspezifische Expression, wie der Cruciferin A-Promotor aus Brassica napus (Ryan et. al., (1989) Nucl. Acids Res. 17, 3584), diejenigen für knollenspezifische Expression, wie der Klasse-I-Patatin-Promotor aus Kartoffel (Rocha-Sosa et al., (1989) EMBO J. 8, 23; Wenzler et al., (1989) Plant Mol. Biol. 12, 41) oder diejenigen für fruchtspezifische Expression, wie der Polygalacturonase (PG)-Promotor aus Tomato (Bird et al., (1988) Plant Mol. Biol. 11, 651).
Andere regulatorische Sequenzen, wie die Terminatorsequenzen, und die Polyadenylierungssignale, umfassen eine beliebige Sequenz, die als solche in Pflanzen wirkt, deren Auswahl innerhalb des Könnens des Fachmanns liegt. Ein Beispiel für eine solche Sequenz ist der 3'-flankierende Bereich des Nopalinsynthasegens (nos) von Agrobacterium tumefaciens (Bevan, M., siehe oben).
Die regulatorischen Sequenzen können ebenfalls Enhancer-Sequenzen umfassen, wie sie in dem 355-Promotor von CaMV gefunden werden, und mRNA-stabilisierende Sequenzen, wie die Leadersequenz des Luzerne-Mosaik-Virus (AlMV) RNA4 (Brederode, F.T., Koper-Zwarthoff, E.C. & Bol, J.F. (1980) Nucl. Acids Res. 8, 2213) oder eine beliebige andere Sequenz, die auf ähnliche Weise funktioniert.
Die Phytase sollte in einer Umgebung exprimiert werden, die die Stabilität des exprimierten Proteins ermöglicht. Die Auswahl der zellulären Kompartimente, wie des Cytosols, endoplasmatischen Reticulums, der Vakuole, des Proteinkörpers oder des periplasmatischen Raums, können je nach den biophysikalischen Parametern der Phytase erfindungsgemäß verwendet werden, um eine solch stabile Umgebung zu erzeugen. Diese Parameter umfassen, sind aber nicht eingeschränkt auf pH-Wert-Optimum, Empfindlichkeit gegenüber Proteasen oder Empfindlichkeit gegenüber der Molarität des bevorzugten Kompartimentes.
Zur Erzielung der Expression im Cytoplasma der Zelle, sollte das exprimierte Enzym kein sekretorisches Signalpeptid oder eine andere Zielsequenz aufweisen. Zur Expression in Chloroplasten und Mitochondrien sollte das exprimierte Enzym eine spezifische sogenannte Transitpeptid zum Import in diese Organellen aufweisen. Die Targetingsequenzen, die zu diesem Zweck an dem interessierenden Enzym gebunden sein können, sind bekannt (Smeekens et al., (1990) T.I.B.S. 15, S. 73; van den Broeck et al., (1985) Nature 313, 358; Schreier et al., (1985) EMBO J. 4, 25). Soll die Aktivität des Enzyms in den Vakuolen gewünscht sein, muss ein sekretorisches Signalpeptid sowie eine spezifische Targetingsequenz vorhanden sein, die das Enzym zu diesen Vakuolen führt (Tague et al., (1988) Plant Phys. 86, 506). Das gleiche gilt für die Proteinkörper in Samen. Die DNA-Sequenz, die das interessierende Enzym kodiert, sollte derart modifiziert sein, dass das Enzym es eine Wirkung an der gewünschten Stelle in der Zelle ausübt.
Zur Erzielung der extrazellulären Expression der Phytase nutzt das erfindungsgemäße Expressionskonstrukt eine sekretorische Signalsequenz. Es sind zwar Signalsequenzen bevorzugt, die zur Pflanzenwirtsspezies homolog (nativ) sind, jedoch können heterologe Signalsequenzen, beispielsweise diejenigen, die von anderen Pflanzenarten abstammen oder von mikrobiellem Ursprung sind, genauso verwendet werden. Diese Signalsequenzen sind dem Fachmann bekannt. geeignete Signalsequenzen, die im erfindungsgemäßen Zusammenhang verwendet werden können, sind in Walter, P. und Blobel, G. (1986) Biochem. Soc. Symp., 47, 183; Von Heijne, G. (1986) J. Mol. Biol. 189, 239 und Sijmons, P.C., Dekker, B.M.M, Schrammeijer, B., Verwoerd, T.C., van der Elzen, P.J.M. und Hoekema, A. (1990) Bio/Technol., 8, 217 offenbart.
Sämtliche Teile der relevanten DNA-Konstrukte (Promotoren, regulatorische, sekretorische, stabilisierende, Ziel- oder Terminationssequenzen) der vorliegenden Erfindung können modifiziert werden, wenn gewünscht, so dass ihre Kontrolleigenschaften mit dem Fachmann bekannten Verfahren beeinflusst wird.
Es wird hervorgehoben, dass erfindungsgemäß erhaltene Phytase enthaltende Pflanzen, verwendet werden können, damit Pflanzen oder Pflanzenorgane erhalten werden, die höhere Phytasemengen aufweisen. Es kann beispielsweise möglich sein, solche Pflanzen oder Pflanzenorgane durch die Verwendung von somoklonalen Variationstechniken oder durch Kreuzzüchtungstechniken zu erhalten. Diese Techniken sind dem Fachmann bekannt.
Bei einer erfindungsgemäßen Ausführungsform wird eine doppelsträngige cDNA, die Phytase kodiert, aus mRNA hergestellt, die aus Aspergillus ficuum isoliert wird. Das DNA-Konstrukt wird unter die Steuerung der regulatorischen Sequenzen des Gens, das das 125-Speicherprotein Cruciferin aus Brassica napus kodiert, gestellt. Das Konstrukt wird hernach in einen binären Vektor, wie pMOG23 (in E. coli K 12. Stamm DH5α, hinterlegt am Centraal Bureau voor Schimmelcultures, Baarn, Niederlande am 29. Januar, 1990 unter der Zugangsnummer CBS 102.90 hinterlegt) subkloniert. Dieser Vektor wird in Agrobacterium tumefaciens eingeführt, das ein entschärftes Ti-Plasmid enthält. Bakterielle Zellen, die dieses Konstrukt enthalten, werden mit Geweben aus Tabak- oder Brassica-Pflanzen cokultiviert, und transformierte Pflanzenzellen werden durch Nährmedien selektiert, die Antibiotika enthalten, und zur Regeneration in differenzierte Pflanzen auf solchen Medien induziert. Die resultierenden Pflanzen erzeugen Samen, die das DNA-Konstrukt enthalten und exprimieren.
Bei einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird das Phytase-kodierende DNA-Konstrukt unter die Kontrolle regulatorischer Sequenzen aus dem 35S-Promotor des Blumenkohlmosaikvirus (CaMV) gestellt.
Das Konstrukt wird anschließend in einen binären Vektor subkloniert. Dieser Vektor wird dann in Agrobacterium tumefaciens eingebracht, der ein entschärftes Ti-Plasmid enthält. Bakterienzellen, die dieses Konstrukt enthalten, werden mit Geweben aus Tabak- oder Brassica-Pflanzen cokultiviert, und die transformierten Pflanzenzellen werden durch Nährmedien selektiert, die Antibiotika enthalten, und zur Regeneration in differenzierte Pflanzen auf solchen Medien induziert. Die resultierenden Pflanzen enthalten und exprimieren das DNA-Konstrukt konstitutiv.
Die Phytaseaktivität kann über eine Reihe von Assays gemessen werden, deren Auswahl erfindungsgemäß nicht entscheidend ist. Die Phytaseenzymaktivität des transgenen Pflanzengewebes kann beispielsweise mit einem ELISA-Test, Western-Blotting oder direkten Enzym-Tests mittels Kolorimetrietechniken oder nativen Gelassays gemessen werden.
Die Pflanze oder das Pflanzenorgan, die Phytase enthält, wie sie erfindungsgemäß produziert wird, kann dann in einer Vielzahl industrieller Verfahren verwendet werden, die die Wirkung einer Phytase erfordern.
Die Pflanzen oder Pflanzenorgane, die die erfindungsgemäß produzierte Phytase enthalten, kann in industriellen Verfahren verwendet werden, die die Wirkung einer Phytase erfordern. Beispiele für solche Anwendungen sind in den Futterzusätzen für Nicht-Wiederkäuer, bei der Soja-Verarbeitung oder bei der Herstellung von Inositol oder Inositol-Phosphaten aus Phytat. Andere industrielle Verfahren mit Phytat enthaltenden Substraten, gibt es in der Stärkeindustrie und den Fermentationsindustrien, wie in der Brauindustrie. Die Chelatbildung der Metallionen durch Phytat kann bewirken, dass diese Mineralien für die Produktions-Mikroorganismen nicht verfügbar sind. Die enzymatische Hydrolyse von Phytat verhindert diese Probleme.
In Pflanzen produzierte Phytase kann ebenfalls in einem Verfahren zum Einweichen von Mais- oder Sorghum-Kernen verwendet werden. Das Pflanzengewebe kann vor der Zugabe zu Einweichmais gemahlen werden. Phytase, die aus dem Pflanzengewebe freigesetzt wird, kann auf Phytin wirken, das in vielen Maispräparaten vorhanden ist. Der Abbau von Phytin in Einweichmais ist für den zusätzlichen kommerziellen Wert von Maisquellwasser vorteilhaft, das als Tierfutter oder als Nährstoff bei mikrobiellen Fermentationen verwendet wird. Der Abbau von Phytin kann darüber hinaus Probleme verhindern, die die Anreicherung von Ablagerungen in Filtern, Rohren, Reaktorgefäßen usw. während der Konzentrierung, dem Transport und der Aufbewahrung von Maisquellwasser betreffen (Vaara, T. et al., (1989) europäische Patentanmeldung 0 321 004). Die Wirkung der Phytase kann ebenfalls das Einweichverfahren und die an der Maisnassschroten beteiligten Trennverfahren beschleunigen.
Die Pflanzen oder Pflanzenorgane können direkt verwendet werden, d.h. ohne weitere Verarbeitung, oder können zuerst über herkömmliche Maßnahmen verarbeitet werden, wie Mahlen auf die gewünschte Konsistenz vor der Anwendung.
Alternativ kann die Phytase aus der Pflanze oder dem Pflanzenorgan extrahiert werden und wenn gewünscht vor der Verwendung mittels herkömmlicher Extraktionsverfahren und Reinigungstechniken gereinigt werden.
Die Produktion von Phytasen in Pflanzen, die mit der angestrebten Anwendung kompatibel sind, bieten Komfort und reduzieren die Produktionskosten verglichen mit denen der mikrobiellen Phytasen, um deren ökonomische Anwendung zu ermöglichen, beispielsweise in Tierfutter, das schließlich zu einen Preis/In-vivo-Leistungsverhältnis führt, das mit anorganischem Phosphat konkurriert. Als weiterer Vorteil wird der Phosphorgehalt von Dung erheblich gesenkt.
Man beachte, dass die Anwendung von Phytasen, die bei einem Preis erhältlich sind, der mit anorganischem Phosphat konkurrieren kann, die Freiheitsgrade für die Mischfutterindustrie erhöht, so dass ein qualitativ hochwertiges Futter erzeugt wird. Wird beispielsweise Futter mit Phytase ergänzt, kann die Zugabe von anorganischem Phosphat entfallen, und der Anteil verschiedener Materialien, die Phytat enthalten, kann erhöht werden.
Die folgenden Beispiele werden bereitgestellt, damit der Fachmann eine vollständige Offenbarung und Beschreibung darüber erhält, wie man die Erfindung produziert und nutzt, und sie sollen den Schutzbereich der Erfindung, die die Erfinder als ihre ansehen, keinesfalls einschränken. Die verwendeten Zahlen wurden möglichst genau angegeben (beispielsweise Mengen, Temperatur, pH-Wert usw.), aber einige experimentelle Fehler und Abweichungen sollten berücksichtigt werden. Wenn nicht anders angegeben, ist die Temperatur in °Celsius und der Druck ist Atmosphärendruck oder fast Atmosphärendruck.
Beispiel 1
Isolation von polyA⁺-RNA aus Aspergillus ficuum
Der A. ficuum-Stamm NRRL 3135 wird in einem Medium gezüchtet, das 22,72 g/l Maismehl (amylasebehandelt bei pH-Wert 7 bei 85°C während 15 min), 9,36 g/l Glucose, 2,9 g/l KNO₃, 0,142 g/l KCl, 0,142 g/l MgSO₄·7 H₂O und 56,8 mg/l FeSO₄·7 H₂O enthielt. Nach 6 Tagen wird das Mycel geerntet.
Trockenes Mycel (0,5 g) wird mit flüssigem Stickstoff eingefroren und gemahlen. Anschließend wird das Material mit einem Ultra Turrax (volle Geschwindigkeit, 1 min) bei 0°C in 3 M LiCl, 6 M Harnstoff homogenisiert und über Nacht bei 4°C gehalten, wie von Auffray und Rougeon (1980) Eur. J. Biochem. 107, 303 beschrieben. Gesamt-Zell-RNA wird nach der Zentrifugation bei 16000 × g erhalten, wonach zwei aufeinanderfolgende Extraktionen mit Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol (50:48:2) folgen. Die RNA wird mit Ethanol gefällt und in 1 ml 10 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,4), 0,5% SDS erneut gelöst. Für eine polyA⁺-Selektion wird die Gesamt-RNA-Probe 5 min bei 65°C erwärmt, auf 0,5 M NaCl eingestellt und anschließend auf einer Oligo(dT)-Cellulose-Säule aufgetragen. Nach mehreren Wäschen mit einer Lösung, die 10 mM Tris, pH-Wert 7,0, 1 mM EDTA, und 0,1 mM NaCl, enthielt, wird die poly A⁺-RNA durch Elution mit 10 mM Tris pH-Wert 7,0 und 1 mM EDTA gesammelt.
Beispiel 2
Präparation und Klonierung einer Phytase-kodierenden cDNA
Für die Erststrangsynthese der cDNA werden 5 μg Poly-A⁺-RNA, isoliert gemäß Beispiel 1, in 16,5 μl H₂O gelöst, und die folgenden Komponenten werden zugefügt: 2,5 μl RNasin (30 U/μl), 10 μl eines Puffers, der Tris-HCl, pH-Wert 7,6, 6 mM MgCl₂ und 40 mM KCl, 2 μl 1 M KCl, 5 μl 0,1 M DTT, 0,5 μl Oligo(dT)_12-18 (2,5 mg/ml), 5 μl 8 mM dNTP-Mix, 5 μl BSA (1 mg/ml) und 2,5 μl Moloney MLV reverse Transkriptase (200 U/μl) enthielt. Das Gemisch wird für 30 min bei 37°C inkubiert. und die Reaktion wird durch Zugabe von 10 μl 0,2 M EDTA und 50 μl H₂O gestoppt. Eine Extraktion erfolgt mittels 110 μl Chloroform, und nach der Zentrifugation für 5 min werden 5 M NH₄Ac und 440 ml absoluter Ethanol (–20°C) zum Überstand zugegeben. Die Fällung erfolgt in einer Trockeneis/Ethanol-Lösung für 30 min. Nach der Zentrifugation (10 min bei 0°C) wird das cDNA/mRNA-Pellet mit 70% eiskaltem Ethanol gewaschen. Das Pellet wird getrocknet und in 20 μl H₂O gewaschen.
Die Isolation der Phytase kodierenden cDNA erfolgt mit der Polymerasekettenreaktion (PCR) in zwei Fragmenten. Die beiden Fragmente werden vereinigt, wobei die BamHI-Stelle innerhalb des Gens zur Erzeugung einer Vollängen-cDNA verwendet wird. Die Strategie für die Klonierung der Phytase-cDNA ist in der 1 gezeigt.
Die partielle Sequenzierung des Phytasegens (Van Gorcom et al., siehe oben) ergibt die Anwesenheit einer BamHI-Stelle bei etwa 800 Basenpaaren vom Initiationscodon. Die Nukleotidsequenz um diese BamHI-Stelle, sowie die Nukleotidsequenz, die diesem Start-Codon vorausgeht, und die Nukleotidsequenz hinter dem Stopcodon des Phytasegens werden zum Entwurf eines Oligonukleotids für die PCR verwendet.
Die Polymerasekettenreaktion erfolgt gemäß dem Hersteller der Taq-Polymerase (Cetus) mittels 1,5 μl der Lösung, die das Reaktionsprodukt der Erststrangsynthese und jeweils 0,5 μg der Oligonukleotide enthält. Die Amplifikation erfolgt in einem DNA-Amplifikator von Perkin-Elmer/Cetus. Nach 25 Zyklen von 2 min bei 94°C, 2 min bei 55°C und 3 min bei 72°C wird das Reaktionsgemisch durch anschließende Phenol- und Chloroform-Extraktionen deproteiniert. Die DNA wird gefällt, erneut in einem Puffer gelöst, der 10 mM Tris, pH-Wert 7, und 0,1 mM EDTA enthält, und anschließend mit geeigneten Restriktionsenzymen gespalten.
Für die Amplifikation des Fragmentes, das den N-terminalen Teil des Proteins kodiert, werden die beiden folgenden Oligonukleotide verwendet:
Oligo 1: 5' GGGTAGAATTCAAAAATGGGCGTCTCTGCTGTTCTA 3'
Oligo 2: 5' AGTGACGAATTCGTGCTGGTGGAGATGGTGTCG 3'
Das amplifizierte Fragment wird mit EcoRI gespalten und in die EcoRI-Stelle von pTZ18R (vertrieben von Pharmacia) kloniert. Die Restriktionsstellenkartierung und Nukleotidsequenzierung zeigen die Authentizität des Fragmentes. Das resultierende Plasmid wird als pGB925 bezeichnet.
Für die Amplifikation des zweiten Fragmentes werden die folgenden Oligonukleotide verwendet:
Oligo 3: 5' GAGCAACCAGCTGAAGGRTCC 3'
Oligo 4: 5' AAACTGCAGGCGTTGAGTGTGATTGTTTARAGGG 3'
Das amplifizierte Fragment wird mit BamHI und PstI gespalten und anschließend in mit BamHI und PstI gespaltenen pTZ18R kloniert. Die Restriktionsstellenkartierung und die Nukleotidsequenzierung zeigen, dass das korrekte Fragment isoliert ist. Das resultierende Plasmid wird als pGB926 bezeichnet.
Zur Isolation einer Vollängen-cDNA wird pGB925 mit EcoRI und BamHI gespalten und das Fragment, das die Phytase kodierende DNA enthält, wird isoliert. Dieses Fragment wird in mit EcoRI und BamHI gespaltenes Plasmid pGB926 kloniert, so dass das Plasmid pGB927 erhalten wird. Das Plasmid pGB927 enthält eine Phytase kodierende Vollängen-cDNA, mit einer ungefähren Größe von 1,8 kbp. Die Sequenz des cDNA-Bereich, der das Phytaseprotein kodiert, und die abgeleitete Aminosäuresequenz des Phytaseproteins, sind in der 2 gezeigt.
Beispiel 3
Konstruktion des binären Vektors pMOG23
In diesem Beispiel wird die Konstruktion des binären Vektors pMOG23 (in dem E. coli K12-Stamm DH5α, der am 29. Januar 1990 am Centraal Bureau voor Schimmelcultures unter der Zugangsnummer CBS 102.90 hinterlegt wurde) beschrieben.
Der binäre Vektor pMOG23 (2) ist ein Derivat des Vektors Bin19 (Bevan, M. siehe oben). Zur Gewinnung von pMOG23 wird der Vektor Bin19 auf eine Weise geändert, die für die vorliegende Erfindung nicht essentiell ist, wobei Techniken verwendet werden, die dem Fachmann auf dem Gebiet der Molekularbiologie geläufig sind.
Zuerst werden die Positionen der linken Grenze (LB) und der rechten Grenze (RB) in Bezug auf das Neomycinphosphotransferase-Gen II (NPTII-Gen) geändert. Zweitens wird die Orientierung des NPTII-Gens umgekehrt, so dass die Transkription in der LB-Richtung erhalten wird. Schließlich wird der Polylinker von Bin19 durch einen Polylinker mit den folgenden Restriktionsenzymerkennungsstellen ersetzt: EcoRI, KpnI, SmaI, BamHI, XbaI, SacI, XhoI, und HindIII.
Beispiel 4
Klonierung der Phytase-cDNA von Aspergillus ficuum in einem Expressionskonstrukt für die konstitutive Expression in Pflanzen
Das Phytase-Gen von Aspergillus ficuum wird angepasst und in ein Expressionskonstrukt zur konstitutiven Expression stromabwärts des Blumenkohlmosaikvirus-35S-Promotors kloniert. Das Expressionskonstrukt enthält auch die kodierende Information für eine Signalpeptidsequenz pflanzlichen Ursprungs.
Die Phytase-cDNA wird in das Expressionskontrukt auf dem Plasmid pMOG29 (beschrieben unter a)) kloniert. Anschließend wird das gesamte Konstrukt in den binären Vektor pMOG23 eingebracht und in Agrobacterium tumefaciens-Stamm LBA4404 überführt.
a) Konstruktion von Expressionsvektor pMOG29
Das Expressionskonstrukt von ROK1 (Baulcombe et al., (1986) Nature 321, 446) wird als ein EcoRI/HindIII-Fragment in pUC18 kloniert. Dieses Konstrukt enthält den Blumenkohlmosaikvirus(CaMV)-355-Promotor auf einem EcoRI/BamHI-Fragment und den Nopalinsynthase(nos)-Transkriptionsterminator auf einem BamHI/HindIII-Fragment. Das Promotorfragment besteht aus der Sequenz von –800 bis +1 des CaMV-35S-Promotors. Die enthaltene Position +1 ist die Transkriptionsinitiationsselle (Guilley et al., siehe oben). Die Sequenz stromaufwärts der NcoI-Stelle an der Position –512 ist deletiert, und diese Stelle ist zu einer EcoRI-Stelle geändert. Dies erfolgt durch Schneiden des in pUC18 vorhandenen Expressionskonstruktes mit NcoI, Auffüllen der einzelsträngigen Enden mit Klenow-Polymerase und Ligation eines EcoRI-Linkers. Das resultierende Plasmid wird mit EcoRI gespalten, was zur Deletion des EcoRI-Fragmentes führt, das die Sequenz des 35S-Promotors stromaufwärts der ursprünglichen NcoI-Stelle trägt. Das BamHI/HindIII-Fragment, das den nos-Terminator enthält, wird durch ein synthetisches DNA-Fragment (Oligonukleotid-Duplex A, 4), das die Leader-Sequenz von RNA4 des Luzerne-Mosaikvirus (AlMV) (Brederode et al., siehe oben) enthält, ersetzt. Dies erfolgt durch Spaltung mit BamHI, anschließende Spaltung mit HindIII und Ligation des synthetischen DNA-Fragmentes. Die BamHI-Stelle und drei stromaufwärts befindliche Nukleotide werden durch stellengerichtete Mutagenese deletiert. In dem resultierenden Plasmid wird das BamHI/HindIII-Fragment, das die nos-Terminatorsequenz enthält, wieder eingebracht. Das Gen, das die β-Glucuronidase kodiert (und die aus dem Plasmid pRAJ 275 stammt; Jefferson, R.A. (1987) Plant Mol. Biol. Reporter 5, 387), wurde als NcoI/BamHI-Fragment einligiert, was das Plasmid pMOG14 ergab. Aus der Literatur ist bekannt, dass die Duplikation der Sequenz zwischen –343 und –90 die Aktivität des 355-Promotors steigert (Kay, R. Chan., A., Dayly, M. & McPherson, J. (1987) Science 236, 1299). Zur Gewinnung eines Promotorfragmentes mit einer doppelten, sogenannten Enhancersequenz werden die folgenden Schritte, die dem Fachmann bekannt sind, durchgeführt. Von dem Plasmid pMOG14 wird das Enhancer-Fragment auf einem AccI/EcoRI-Fragment isoliert, und anschließend mit Klenow-Polymerase stumpfendig gemacht. Das erhaltene Fragment wird in mit EcoRI gespaltenes pMOG eingebracht, und so stumpfendig gemacht, dass die Grenze zwischen den stumpfendigen EcoRI- und AccI-Stellen eine neue EcoRI-Stelle ergibt. Das resultierende Plasmid (pMOG18) enthält den 35S-Promotor mit einer doppelten Enhancer-Sequenz, die Leader-Sequenz von RNA4 aus AlMV und den nos-Terminator in einem Expressionskonstrukt, das noch auf einem EcoRI/HindIII-Fragment zugegen ist. Schließlich wird das NcoI/BamHI-Fragment, das die β-Glucuronidase kodiert, durch das synthetische DNA-Fragment B (4) ersetzt, das von der PROB12-cDNA hergeleitet ist (Cornelissen, B.J.C., Hooft van Huijsduijnen, R.A.M. & Bol, J.F. (1986) Nature 321, 531). Dieses Fragment kodiert das PR-Protein, PR-S-Signalpeptidsequenz von Tabak Samsun NN. Eine SphI-Stelle wird in der Signalpeptid kodierenden DNA-Sequenz erzeugt, indem ein Nukleotid geändert wird. Diese Änderung ändert die Aminosäuresequenz des kodierten PR-S-Signalpeptids nicht. Das resultierende Plasmid wird als pMOG29 bezeichnet (5).
b) Klovierung des Phytasegens aus Aspergillus ficuum in dem binären Vektor
Oligonukleotid-Duplex C (4) wird in Plasmid pMOG29 kloniert, mit SphI und BamHI gespalten, so dass das Plasmid pMOG407 erhalten wird. Der Oligonukleotid-Duplex enthält die kodierende Information für die letzten 2 Aminosäuren des Signalpeptids von PR-S, gefolgt von den ersten 6 Aminosäuren der reifen Phytase.
Das Plasmid pGB927, das die Vollängen-Phytase-cDNA enthält, wird mit XhoI (partiell) und PstI gespalten. Das XhoI/PstI-Fragment, umfassend die DNA-Sequenzen, die die reife Phytase von Aminosäure 6 aufwärts kodieren, wird in das mit XhoI und PstI linearisierte Plasmid pMOG407 kloniert, was das Plasmid pMOG417 ergibt. Das gesamte Konstrukt, das das Chimäre Phytasegen enthält, wird als EcoRI/HindIII-Fragment in den mit EcoRI und HindIII linearisierten binären Vektor pMOG23 eingebracht. Das resultierende binäre Plasmid pMOG413 wird in einer triparenteralen Kreuzung mit dem E. coli K-12-Stamm RK2013 (der das Plasmid pRK2013 enthält) (Ditta, G., Stanfield, S., Corbin, D & Helinski, D.R. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 7347), in Agrobacterium tumefaciens-Stamm LBA4404 mobilisiert, der ein Plasmid mit den Virulenzgenen enthält, die für die DNA-Übertragung in die Pflanze notwendig sind.
Beispiel 5
Transiente Expression von chimärem Phytasegen in Tabak-Protoplasten
Protoplasten von Tabak werden mit Plasmid-DNA transformiert, die das Chimäre Phytasegen unter der Regulation des konstitutiven CaMV-35S-Promotors enthält. Nach 72 Std. werden die behandelten Protoplasten auf transiente Expression des eingebrachten Phytasegens untersucht.
Protoplasten werden aus keimfrei gezüchteten 1–2 Monate alten Tabakpflanzen (Nicotiana tabacum SR1) hergestellt. Das gesamte Verfahren ist von Rodenburg, K.W., DeGroot, M.J.A. Schilperoort, R.A. & Hooykaas, P.J.J. ((1989) Plant Mol. Biol. 13, 711) beschrieben. Für die Transformation wird eine Anzahl von 5 × 10⁵ Protoplasten mit 40 μg DNA des Plasmids pMOG417) elektroporiert. Nach der Elektroporation werden die Protoplasten in 3 ml K3G-Medium resuspendiert. Für den Phytaseaktivitätsassay werden die Protoplasten pelletiert, und 3 ml Überstand werden über Nacht gegen einen Überschuss Wasser dialysiert. Das Dialysat wird gefriergetrocknet und in 300 μl 25 mM Natriumacetat, pH-Wert 5,5, resuspendiert. Der Assay wird dann wie eingehend in Beispiel 10 beschrieben durchgeführt, mit der einzigen Ausnahme, dass statt 250 mM Glycin-HCl-Puffer, pH-Wert 2,5, ein 25 mM Natriumacetatpuffer, pH-Wert 5,5 verwendet wird.
In diesen Experimenten wird eine Phytaseeinheit (PTU) als 1 μmol Phosphat definiert, das aus 1,5 mM Natriumphytatlösung pro min bei 37°C bei pH-Wert 5,5 freigesetzt wird.
Bei unbehandelten Protoplasten wird keine erfassbare Aktivität gefunden. Protoplasten, die mit Plasmid pMOG417 elektroporiert wurden, zeigen eine Aktivität von 0,26 PTU pro mg Protein im Überstand.
Beispiel 6
Stabile Expression eines chimären Phytasegens in Tabakpflanzen unter der Kontrolle des CaMV-35S-Promotors
Tabak wird transformiert durch Cokultivierung von Pflanzengewebe mit Agrobakterium tumefaciens-Stamm LBA4404, der den binären Vektor pMOG413 mit dem chimären Phytasegen unter der Regulation des CaMV-35S-Promotors enthält. Die Transformation erfolgt durch Cokultivierung von Blattscheiben aus Tabak (Nicotiana tabacum SRI) gemäß Horsch et al., siehe oben. Transgene Pflanzen werden aus Sprossen regeneriert, die auf Selektionsmedium (100 mg/l Kanamycin) wachsen, und nach der Wurzelbildung auf Boden überführt. Junge Pflanzen werden auf NPTII-Aktivität (Kanamycin-Resistenz) untersucht, bis zur Reife gezüchtet, und zur Selbstbestäubung und zum Samenansatz gelassen.
Für die Phytaseaktivitätsassays der Blätter von transgenen Pflanzen wurde ein Segment von etwa 5 mm Durchmesser von einem jungen Blatt von jeder Pflanze entnommen, und in 300 μl 25 mM Natriumacetat-Puffer, pH-Wert 5,5, entnommen. Anschließend wurden die Phytaseassays durchgeführt, wie für die transienten Assays beschrieben. In 32 untersuchten unabhängig transformierten Tabakpflanzen wurde eine maximale Aktivität von 2 PTU/mg lösliches Gesamtprotein in den Extrakten beobachtet. Dies entspricht insgesamt 1,7% löslichem Gesamtprotein. In den Samen dieser transformierten Tabakpflanzen wurde eine maximale Phytaseexpressionsmenge von 0,4% des löslichen Gesamtsamenproteins beobachtet. Es konnte keine Phytaseaktivität in nicht-transformierten Pflanzen erfasst werden.
Zwei transgene Pflanzenlinien, 413.25 und 413.32, wurden auf der Basis ihrer hohen Expressionsspiegel der Phytase selektiert.
Beispiel 7
Klonierung der Phytase-cDNA aus Aspergillus ficuum in einem samenspezifischen Expressionskonstrukt
Ein Expressionskonstrukt wird derart konstruiert, dass eine samenspezifische Expression erhalten wird, wobei Sequenzen des 12S Speicherprotein-Gens Cruciferin aus Brassica napus verwendet werden (cruA; Ryan et al., siehe oben). Diese Sequenzen können durch solche aus ähnlichen samenspezifischen Genen ersetzt werden, so dass das gleiche Ziel wie in der erfindungsgemäßen Aufgabe erreicht wird.
Die Phytase-cDNA wird in das Expressionskonstrukt kloniert. Schließlich wird das gesamte Konstrukt in Agrobacterium tumefaciens eingebracht, das zur Transformation verwendet wird.
Für sämtliche E. coli-Transformationen in diesem Beispiel wird der E. coli-K12-Stamm DH5α verwendet.
a) Konstruktion des Expressionskonstrukts
Für die Konstruktion des Expressionskonstrukts zur samenspezifischen Expression wurden die Promotor- und Terminatorsequenzen aus dem Cruciferin A (cruA)-Gen von Brassica napus cv. Jet Neuf mittels PCR-Technologie mit isolierter genomischer DNA (Mettler, I.J. (1987) Plant Mol. Biol. Rep. 5, 346) als Matrize synthetisiert. Dieses Gen zeigt samenspezifische Expression, und seine kodierenden und flankierenden Sequenzen wurden bestimmt (Ryan et al., siehe oben).
Zwei Sätze Oligonukleotide werden synthetisiert. Einer zur Ermöglichung der Amplifikation des cruA 5'-flankierenden Bereichs und eines Teils der Signalpeptid kodierenden Sequenz als EcoRI/NcoI-Fragment:
5' GTTCGGAATTCGGGTTCCGG 3' und 5' AACTGTTGAGCTGTAGAGCC 3'.
Der andere zur Amplifikation der 3'-flankierenden Sequenz als BglII/HindIII-Fragment:
5' CTTAAGATCTTACCCAGTGA 3' und 5' CGGAGAAGCTTGCATCTCGT 3'.
Die Oligos werden so entworfen, dass sie geeignete Restriktionsstellen an ihren Enden enthalten, so dass ein direkter Zusammenbau des Expressionskonstruktes nach der Spaltung der Fragmente mit den Restriktionsenzymen ermöglicht wird.
Das 5'-Fragment des cruA-Gens, die 54 Nukleotide der Sequenz beinhalten, die das Signalpeptid kodieren, wird in den Vektor pMOG445 (Oligonukleotid-Duplex E (4), in Vektor pUC18 kloniert, mit SstI und EcoRI linearisiert) kloniert, mit EcoRI und NcoI gespalten, so dass der Vektor pMOG24 erhalten wird. Der synthetische Oligonukleotid-Duplex D (4), umfassend die letzten 5 kodierenen Triplets für die Signalsequenz von Brassica napus Cruciferin, die Sequenz, die die Aminosäuren 1 bis 6 der reifen Phytase kodiert, und eine Mehrfachklonierungsstelle, werden in Vektor pMOG24 kloniert, der mit NcoI und HindIII gespalten ist. Der resultierende Vektor wird als pMOG425 bezeichet. Das 3' cruA-PCR-Fragment wird als BglII/HindIII-Fragment in mit BglII und HindIII gespaltenes pMOG425 kloniert, so dass pMOG426 erhalten wird.
b) Klonierung des Phytasegens aus Aspergillus ficuum in den binären Vektor
Plasmid pGB927, das die kodierende Vollängen-Sequenz für Aspergillus ficuum Phytase enthält, wird mit XhoI (partiell) und mit PstI gespalten. Das XhoI/PstI-Fragment, das die DNA-Sequenzen umfasst, die die reife Phytase von Aminosäure 6 aufwärts kodiert, wird in mit XhoI und PstI gespaltenen Vektor pMOG426 kloniert. Aus dem resultierenden Vektor pMOG428 wird das gesamte Konstrukt, das das Chimäre Phytasegen enthält, als EcoRI/HindIII-Fragment in den mit EcoRI und HindII linearisierten binären Vektor pMOG23 eingeführt. Der resultierende binäre Vektor pMOG429 wird in einer triparenteralen Kreuzung mit dem E. coli K12-Stamm RK2013 (der das Plasmid pRK2013 enthält) (Ditta et al., siehe oben) in den Agrobacterium-Stamm LBA4404 (Hoekema et al., 1983, siehe oben) mobilisiert, der ein Plasmid mit den Virulenzgenen enthält, die für die T-DNA-Übertragung in die Pflanze notwendig sind.
Beispiel 8
Stabile samenspezifische Expression von Phytase in Tabaksamen unter der Kontrolle eines Cruciferin-Promotors
Der Agrobacterium-Stamm LBA4404, der den binären Vector pMOG429 mit der Phytase-cDNA unter der Kontrolle des Cruciferins-Promotors enthält, wird für Transformationsexperimente verwendet. Die Transformation von Tabak (Nicotiana tabacum SR1) erfolgt unter Cocultivierung der Blattscheiben gemäß dem Verfahren von Horsch et al., siehe oben. Transgene Pflanzen werden aus den Sprossen regneriert, die auf Selektionsmedium (100 mg/ml Kanamycin) wachsen. Junge Pflanzen werden auf NPTII-Aktivität (Kanmycinresistenz) untersucht, bis zur Reife gezüchtet und zur Selbstbestäubung und zum Samenansatz gelassen. Die Samen aus einzelnen Transformanten werden vereinigt, und ein Teil der Samenprobe wird auf die Anwesenheit von Phytase untersucht. Von Klonen mit den höchsten Expressionswerten, verglichen mit den nicht transformierten Kontrollsamen, werden die verbleibenden Samen auf Kanamycin (200 mg/l) gekeimt. Aus Daten bezüglich der resultierenden S2-Samen, werden Samen, die für NPTII (und somit auch für Phytase) homozygot sind, selektiert und zur Massenvermehrung von Pflanzen verwendet, die die höchsten Mengen Phytase produzieren können. Diese können dann für Spaltungsexperimente verwendet werden.
Zur Bestimmung der Phytaseaktivität, die in den transgenen Samen gefunden wird, werden etwa 50 mg Samen verwendet und mit einem Pistill in einem eiskalten Mörser in 1 ml 25 mM Natriumacetatpuffer pH-Wert 5,5 homogenisiert. Nach der Zentrifugation wird der Überstand wie für die transienten Assays beschrieben untersucht, In 55 unabhängig transformierten Tabakpflanzen, wurde eine maximale Phytaseexpressionsmenge von 0,15 des löslichen Gesamtsamenproteins beobachtet. Die Phytaseaktivität wurde nicht in Stängeln, Wurzeln und Blättern der transgenen Pflanzen beschrieben. Keine Phytaseaktivität konnte in untransformierten Pflanzen nachgewiesen werden.
Beispiel 9
Transformation von Raps
In diesem Beispiel wurde die Transformation von Raps durch Cokultivierung von Pflanzengewebe mit Agrobacterium tumefaciens, das einen binären Vektor mit dem chimären Phytasegen enthält, beschrieben. Transgene Pflanzen können auf Antibiotikaresistenz selektiert werden. Die transgenen Pflanzen können auf Phytaseaktivität untersucht werden. Hochexprimierer können sorgfältiger untersucht und in weiteren Experimenten verwendet werden.
Das gleiche Chimäre Phytasekonstrukt in einem binären Vektor (pMOG429) wird in Agrobacterium tumefaciens-Stamm LBR4404 auf ähnliche Weise, wie in Beispiel 7 beschrieben mobilisiert. Dieser Stamm kann zur Transformation von Raps (Brassica napus cv. Westar) verwenet werden. Dazu werden oberflächensterilisierte Stängelsegmente von 5- bis 6 Wochen alten Pflanzen unmittelbar vor dem Blühen entnommen, für 24 Std. auf MS-Medium (Fry et al., (1987) Plant Cell Reports 6, 321) mit 1 mg/l BAP vorkonditioniert und dann für 48 Std. mit 48 Std. Agrobacterium auf frischen Platten mit dem gleichen Medium cokultiviert. Transgene Pflänzchen wurden aus Sprossen regeneriert, die auf Selektionsmedium (500 mg/l Carbenicillin, 40 mg/l Paromycin) wachsen, und weiter wie in Beispiel 8 für Tabak analysiert.
Beispiel 10
Phytaseaktivitätsassay
Eine Menge transgenes Pflanzenmaterial wurde gemahlen, das insgesamt etwa 0,25 PTU enthält (PTU = Phytase-Einheiten. Eine Einheit der Phytaseaktivität ist definiert als diejenige Menge Enzym, die anorganischen Phosphor aus 1,5 mM Natriumphytat in einer Rate von 1 μmol/min bei 37°C und bei einem pH-Wert von 2,5 freisetzt). Alternativ kann diese Phytasemenge aus dem Pflanzenmaterial extrahiert werden.
Das gemahlene Pflanzenmaterial wurde in einem Gesamtvolumen von 50 ml eines 250 mM Glycine/HCl-Puffers, pH-Wert 2,5, mit 0,86 g Natriumphytat·11 H₂O-inkubiert. Aspergillus-Phytase exprimiert zwar bei einem pH-Wert-Optimum bei 2,5 sowie bei 5,5, jedoch wird der niedrigere pH-Wert zum Ausschließen von Pflanzenphytaseaktivität gewählt.
Das resultierende Gemisch wird für 15 und 60 min bei 37°C inkubiert. Die Umsetzung wird durch Zugabe von 5 ml aus dem Inkubat in 5 ml 10% TCA (Trichloressigsäure) gestoppt. Anschließend wurden 10 ml Indikatoreragenz (3,66 g FeSO₂·7H₂O in 50 ml Ammoniummolybdat-Lösung (2,5 g (NH₄) 6Mo₇O₂₄·4 H₂O und 8 ml konz. H₂SO₄, mit entmineralisiertem Wasser auf 250 ml verdünnt) zu der gestoppten Enzymlösung zugegeben. Die Intensität der blauen Farbe wird spektralphotometrisch bei 700 nm gemessen.
Der Gehalt an anorganischem Phosphat zum Zeitpunkt T = 0 dient als Leerwert.
Die Messungen zeigen die Menge an freigesetztem Phosphat an, in Bezug auf eine Phosphat-Kalibrierungskurve im Bereich von 0 bis 1 mM.
Beispiel 11
Inkubation von gemahlenem Nicotiana-tabacum-Pflanzenmaterial mit Futtermitteln
In einem üblichen Experiment wird 0,25 g Lösungsmittel-extrahiertes Sojamehl mit einer Menge von gemahlenem Nicotiana-tabacum-Pflanzenmaterial inkubiert, das etwa 0,25 PTU wie oben beschrieben enthielt, außer der Zugabe von Natriumphytat. In diesem Fall besteht das zugegebene Inkubationsmittel aus einem Gemisch von 410 ml Puffer und 90 ml entmineralisiertem Wasser.
Die Freisetzung von Phosphat aus Phytat in Lösungsmittel-extrahiertem Sojamehl ist in der 6 beschrieben. Ohne Zugabe von gemahlenem Pflanzenmaterial wird keine Aktivität beobachtet.
In einem fast identischen Experiment werden ähnliche Ergebnisse mit Maisglutenfutter als Substrat erhalten. Die Ergebnisse mit transgenen Samen sind in der 6 gezeigt.
Keine Aktivität wird bei Fehlen des gemahlenen Pflanzenmaterials beobachtet oder wenn gemahlenes Pflanzenmaterial zugegeben wird, das keine Phytaseaktivität enthält.
Beispiel 12
In-vitro-Untersuchung von transgenem Pflanzenmaterial mit Phytase unter Bedingungen, die den Verdauungstrakt von Geflügel simulieren
Zur Bestimmung der Effizienz von Phytase, die in transgenem Tabakpflanzenmaterial produziert wird, wird die Aktivität von Phytase aus Aspergillus in einem Modell bestimmt, das die Bedingungen simuliert, die man im Verdauungstrakt in Geflügel vorfindet.
Eine Standard-Geflügelfutterprobe wird zuerst bei 1 g/15 ml entmineralisiertem Wasser für 60 min bei 39°C zur Simulation der Bedingungen in den Feldfrüchten der Tiere inkubiert. Anschließend werden 5 ml einer Pepsinlösung (Merck: 5,28 g/l, pH-Wert 3,0 – eingestellt mit HCl) zugegeben, der pH-Wert mit HCl auf einen Wert von 3,0 eingestellt, und die Inkubation weitere 90 min bei der gleichen Temperatur fortgesetzt, zur Simulation der Bedingungen im Darm.
Während des Inkubationszeitraums wurden die Proben entnommen, um die Menge an Phosphat zu bestimmen, die aus dem im Futter vorhandenen Phytat freigesetzt wurde.
Die Wirkung der Pilzphytase geht aus der 7 hervor. Eine Steigerung der Phytasedosierung von 250 auf 1000 PTU/kg Futter führt zu einer erhöhten Freisetzung des Phosphates aus der Futterprobe.
Wird eine Probe von transgenem Tabakpflanzenmaterial, entweder Samen oder Blatt (die Linien 413.25 und 413.32; nach dem Mahlen in einem Mörser) anstelle der Pilzphytase zugefügt, wird eine ähnlich erhöhte Phosphatfreisetzung beobachtet (8). Kontroll-Tabakpflanzenmaterial, das keine Phytase enthielt, wurde ebenfalls getestet. Keine Phosphatfreisetzung wurde verglichen mit der Leerwertkontrolle beobachtet.
Ein Vergleich der Ergebnisse mit 50 g transgenem Samen/kg Futter mit denjenigen, die mit 500 und 750 PTU/kg Futter erhalten wurden, zeigt, dass 1 g Tabaksamen etwa gleich 12 PTU in diesem In-vitro-Geflügel-Verdauungsmodell ist. Ein Probenvergleich mit Blattmaterial zeigt, dass 1 g (Frischgewicht) Tabakblattmaterial etwa 25 PTU enthält.
Beispiel 13
Tieruntersuchung
Es wurden Versuche mit Broilern durchgeführt, um die Effizienz der in Pflanzensamen exprimierten Phytase sowie das Fehlen jeglicher negativer Wirkung der Samen von Tabak auf zootechnische Ergebnisse aufzuzeigen.
Es werden Phytase-exprimierende als auch Kontroll-Tabaksamen geerntet. Die Samen wurden in 100 g-Portionen mit einem Sieb (Retch-Mill ZM1) mit 500 μm Poren, geerntet, wobei die Samen unbedingt gekühlt gehalten wurden.
Ein Tag alte männliche Broilerküken (Hybro) werden in zwei Reihen Batteriekäfigen (0,45 m²) gehalten. Die Umgebungstemperatur beträgt während der ersten zwei Tage 32°C und wird in der ersten Woche um 4°C gesenkt. Nach jeder folgenden Woche wird die Temperatur um 2°C gesenkt. Die Broiler werden in einem 1-Std.-Licht- und 3-Std. Dunkel-Schema gezüchtet.
Die Vögel werden gegen die New-Castle-Erkrankung im Alter von 1 Tag mit dem Klon-30-Impfstoff geimpft. Während der Experimente erhalten die Broiler die experimentellen Futter alle als Brei und ad libitum. Wachstum und Futter/Zunahme-Verhältnisse werden während der experimentellen Perioden gemessen. Die apparente Verfügbarkeit von Gesamtphosphor wird in einem Dreitageszeitraum gemessen, wobei währenddessen der Futterverbrauch als Aufnahme von Trockensubstanz und Exkremente quantitativ erfasst wird.
Die apparente Verfügbarkeit von Phosphor ist definiert als Differenz zwischen der Aufnahme von Phosphor und Exkretion von Phosphor mit den Exkrementen.
Die folgenden Kontrollfutter ohne Zugabe von Phytase werden verwendet:
Es wird kein Qualitäts-Futterphosphat zu Futter 1 (Basisfutter) zugegeben. Die Futter 2 und 3 werden mit Calcium und Phosphor aus einem Gemisch aus wasserfreiem Dicalciumphosphat und Monoammoniumphosphat (Verhältnis 5:1) ergänzt. Sämtliche experimentellen Futter werden durch Zusätze zum Basisfutter erhalten (siehe Tabelle 1).
Das experimentelle Futter 4 enthält mikrobielle Phytase in einer Konzentration von 400 PTU/kg Futter, hergestellt wie von Van Gorcom et al., siehe oben, beschrieben.
Das experimentelle Futter 5 ist wie Futter 4, aber gemahlene Samen von nicht-transgenem Tabak werden zu dem Futtergemisch zur Erzielung eines endgültigen Verhältnisses von 3 kg/90 kg Futter zugegeben.
Das experimentelle Futter 6 ist ebenfalls wie Futter 4, jedoch wurden 3 kg gemahlene Samen von transgenem Tabak (Linie 413.25) zu einem Gemisch aus 90 kg Futter zugegeben, so dass eine Endkonzentration von 400 PTU/kg Futter erhalten wurde.
Das Experiment erfolgt mit 176 Broilern in 16 Batteriekäfigen (11 pro Batteriekäfig) bis zum Alter von 24 Tagen. Die Behandlungen (Futter) werden zweimal wiederholt und werden zufällig den Käfigen innerhalb jeder Reihe zugeordnet.
Die Verfügbarkeit von Phosphor wird im Alter von 21 bis 24 Tagen gemessen.
Die Ergebnisse in Bezug auf die Phosphorverfügbarkeit und das Wachstum der Tiere, denen die Futter 4, 5 und 6 zugeführt wurden, zeigen jeweils die positive Wirkung der Zugabe von Phytase (Tabelle 2). Ein Vergleich der Futter 4, 5 und 6 zeigt ebenfalls, dass die Aufnahme von Tabaksamen im Futter vergleichbar ist mit der Wirkung von mikrobieller Phytase im Margendarmtrakt von Stalltieren, wie Broilern, und zeigt keine negative Wirkung auf die zootechnischen Ergebnisse.
Die vorliegende Erfindung wurde zwar anhand ihrer spezifischen Ausführungsformen beschrieben, jedoch sollte es für den Fachmann selbstverständlich sein, dass verschiedene Änderungen vorgenommen werden können und Äquivalente ersetzt werden können, ohne dass man vom wahren Geist und Schutzbereich der Erfindung abweicht. Zudem können viele Modifikationen durchgeführt werden, um eine bestimmte Situation, Material, Pflanze, Samen, Verfahren, Verfahrensschritt oder -schritte, an die Aufgabe, den Geist und den Schutzbereich der Erfindung anzupassen. Sämtliche dieser Modifikationen sollen im Schutzbereich der hier beigefügten Ansprüche liegen. Tabelle 1. Zusammensetzung des Basisfutters in Experimenten mit Broilern

* Zugeführte Menge pro kg Futter: 12000 IU Vitamin A; 2000 IU Vitamin D₃; 5 IU Vitamin E; 1,5 mg Vitamin K₃; 1 mg Thiamin; 5 mg Riboflavin; 1 mg Pyridoxin; 30 mg Nikotinsäure, 7,5 mg D-Pantothensäure; 0,015 mg Vitamin B₁₂; 0,5 mg Folsäure; 350 mg Cholinchlorid; 75 mg Ethoxychin; 9,5 g CaCO₃; 2,5 g NaCl; 0,26 g FeSO₄; 0,24 g MnSO₄; 45 mg CuSO₄; 60 mg ZnSO₄; 105 mg KI-Gemisch.
** ( ) Analysiert für die Experimente 1 bzw. 2.

Claims

Rekombinantes Expressionskonstrukt, dadurch gekennzeichnet, dass das rekombinante Expressionskonstrukt eine aus einer mikrobiellen Quelle stammende Phytase-codierende Sequenz umfasst, die funktionsfähig an 5'- und 3'-regulatorische Sequenzen gebunden ist, die die Expression der Phytase in einer Pflanzenzelle steuern können.
Rekombinantes Expressionskonstrukt nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Phytasecodierende Sequenz aus einer Pilzquelle erhalten wird.
Rekombinantes Expressionskonstrukt nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Phytasecodierende Sequenz aus der Gattung Aspergillus erhalten wird.
Rekombinantes Expressionskonstukt nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die codierende Sequenz einer reifen Phytase funktionsfähig an eine Signalsequenz gebunden ist, die zum Phytaseprotein heterolog ist, wobei die Signalsequenz in einer Pflanzenzelle funktioniert.
Rekombinantes Expressionskonstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die 5'-regulatorische Sequenz ein konstitutiver Promotor ist.
Rekombinantes Expressionskonstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die 5'-regulatorische Sequenz ein gewebespezifischer Promotor ist.
Vektor, dadurch gekennzeichnet, dass der Vektor ein Expressionskonstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 6 umfasst.
Bakterienstamm, dadurch gekennzeichnet, dass der Stamm einen Vektor nach Anspruch 7 umfasst.
Transgene Pflanzenzelle, dadurch gekennzeichnet, dass die Pflanzenzelle ein Expressionskonstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 6 umfasst.
Transgene Pflanzenzelle oder transgenes Pflanzenorgan, dadurch gekennzeichnet, dass die Pflanzenzelle ein Expressionskonstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 6 enthält.
Verfahren zur Umwandlung von Phytat in Inositol und anorganisches Phosphat, dadurch gekennzeichnet, dass eine aus einer mikrobiellen Quelle stammende Phytase, die in der transgenen Pflanze oder einem transgenen Pflanzenorgan nach Anspruch 10 enthalten ist, auf ein Substrat aufgebracht wird, welches das Phytat enthält.
Futterzusammensetzung für Tiere, dadurch gekennzeichnet, dass die Futterzusammensetzung die transgene Pflanze oder das transgene Pflanzenorgan nach Anspruch 10 enthält.
Verfahren zur Förderung des Wachstums eines Tiers, dadurch gekennzeichnet, dass das Tier mit einem Futter ernährt wird, das eine Futterzusammensetzung nach Anspruch 12 in einer Menge enthält, die das Wachstum des Tiers, das die Futterzusammensetzung aufnimmt, fördert.
Verfahren zur Reduktion der Phytatmenge in Tierdung, dadurch gekennzeichnet, dass ein Tier mit einem Futter ernährt wird, das eine Futterzusammensetzung nach Anspruch 12 in einer Menge enthält, die das in dem Futter enthältene Phytat in Inositol und anorganisches Phosphat umwandeln kann.
Verwendung einer transgenen Pflanze oder eines transgenen Pflanzenorgans nach Anspruch 10 als Inhaltsstoff in Nahrung oder Futter.