DE69128238T2

DE69128238T2 - Nachweis von thrombopenies

Info

Publication number: DE69128238T2
Application number: DE69128238T
Authority: DE
Inventors: Jean Amiral
Original assignee: Diagnostica Stago SAS
Current assignee: Diagnostica Stago SAS
Priority date: 1990-08-09
Filing date: 1991-08-09
Publication date: 1998-06-25
Anticipated expiration: 2011-08-10
Also published as: FR2665769A1; EP0495971A1; EP0495971B1; ATE160448T1; DE69128238D1; ES2110998T3; JP2821951B2; FR2665769B1; JPH05502103A; WO1992002823A1

Description

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren unter Verwendung einer speziellen antigenen Substanz zur Bestimmung von Thrombopenien (auch als Thrombocytopenien bezeichnet), die durch Heparin induziert sind.

Stand der Technik

Man weiß insbesondere aus dem Artikel von M.C. Berndt et al., Blood Reviews 1, S. 111-118 (1987), daß Thrombopenien durch zahlreiche Medikamente induziert werden können und daß sie am häufigsten durch Chinin/Chinidin und insbesondere Heparin hervorgerufen werden.
Es ist bekannt, daß Heparin als Antikoagulans Krankenhauspatienten verabreicht wird, um jedes Risiko eines venösen oder arteriellen Thrombus zu vermeiden. Aus der Statistik ist bekannt, daß (i) mindestens 50 % der Krankenhauspatienten Heparin durch Injektion erhalten, und daß (ii) 1 bis 5 % der Patienten unter einer Heparintherapie Thrombopenien bekommen, die sich besonders schwer zwischen dem 5. und 15. Tag dei Heparintherapie entwickeln können. Bezüglich dieses Effekts wird auf die Artikel von
- J.G. Kelton et al., Blood 72 (Nr. 2), S. 925-930 (1988);
- B.H. Chong et al., British Journal of Haematology 49, S. 531-540 (1981);
- B.H. Chong, Blood Reviews 2, S. 108-114 (1986);
- D. Sheridan et al., Blood 67 (Nr. 1), S. 27-30 (1986);
- Y. Gruel, Sang Thrombose Vaisseaux, 1 (Nr. 4), S. 233-236 (1989);
- M. Samama et al., Journal des Maladies Vasculaires 7, S. 237-242 (1982); und
- J. Conrad et al., mit dem Titel "Les Thrombopénies l'heparine", veröffentlicht in dem Werk "Progrès en Hématologie 4, Les Plaquettes Sanguines", S. 107-118, Doin-Verlag, Paris (1983),
verwiesen.
Bei Patienten, die von einer Heparintherapie profitieren und Thrombopenien entwickeln, sind zwei Formen bekannt:
- die sog. leichten oder gemäßigten Thrombopenien, die asymptomatisch sind, und
- die sog. schweren Thrombopenien, die häufig von arteriellen oder venösen thromboembolischen Komplikationen als Ergebnis des Auftretens von Antikörpern gegen Plättchen in Gegenwart von Heparin begleitet sind.
Dieses Auftreten von Antikörpern ist insbesondere in dem Artikel von D.M. Lynch et al., Blood 66 (Nr. 5), S. 1176-1181 (1985) und in den vorstehend genannten Artikeln von M.C. Berndt et al., J.G. Kelton et al., B.H. Chong et al., B.H. Chong, D. Sheridan et al., und J. Conard et al. beschrieben (vgl. insbesondere den Mechanismus der durch Heparin induzierten Thrombopenien, der in Tabelle III, S. 115 des Artikels von J. Conard et al. dargelegt ist).
Das Problem der Prophylaxe von thrombopenischen Zwischenfällen ist noch nicht gelöst. Es besteht daher ein Bedarf nach einem Verfahren zur raschen und zuverlässigen Bestimmung, das die Abschätzung des Risikos der Entwicklung von Thrombopenien erlaubt, um ausreichend schnell die Verabreichung des induzierenden Medikaments (oder des induzierenden Arzneistoffs) zu stoppen.
Gegenwärtig umfassen die Verfahren, die zur Diagnose von. Thrombopenien verwendet werden, die Folgenden:
(1) die Suche nach der Abwesenheit einer Ätiologie, die sich von Thrombopenien unterscheidet (Infektionen, andere Therapien etc. ...), was zeitaufwendig und beschwerlich ist,
(2) die Zählung von Blutplättchen vor, während und nach der Behandlung, was zeitaufwendig und wenig spezifisch ist, oder
(3) biologische Tests (nachstehend aufgeführt), mit denen nach dem Auftreten von Antikörpern gegen die Plättchen in Gegenwart des induzierenden Medikaments oder des induzierenden Arzneistoffs geforscht wird.
Es wurde festgestellt, daß die am häufigsten verwendeten biologischen Untersuchungen Plättchenaggregationstests sind, bei denen eine Spezialapparatur benötigt wird und bei denen zeitaufwendige und in bestimmten Fällen wenig empfindliche Arbeitsvorschriften verwendet werden.
Die anderen Methoden gemäß dem vorstehenden Punkt (3), die beschrieben wurden (vgl. insbesondere die Artikel von J.G. Kelton et al., B.H. Chong et al., B.H. Chong, D. Sheridan et al. und Y. Gruel), verwenden die Untersuchung der Bindung von Serum-IgG an die Plättchen, die Freisetzung von mit ¹&sup4;C radioaktiv markiertem Serotonin bei zwei verschiedenen Heparinkonzentrationen, die Verfügbarkeit des Plättchenfaktors 3, die Komplementbindung, die Hemmung der Komplementlyse und die Agglutination von sensibilisierten Erythrocyten (insbesondere vom Schaf). Es wurde gefunden, daß diese biologischen Testverfahren entweder wenig empfindlich oder wenig zuverlässig sind, oder, wenn sie empfindlich sind, zeitaufwendig in der Durchführung sind.
Das gleiche folgt aus der Lehre des Artikels von D.M. Lynch et al., der vorstehend genannt wurde, und aus der EP-A-0 165 681.
Gemäß dem Artikel von D.M. Lynch et al. wird vorgeschlagen, auf ELISA-Platten, die (i) an der Wand fixierte menschliche Plättchen, (ii) Serum eines Patienten mit einer Thrombopenie im Zusammenhang mit Heparin und (iii) Heparin enthalten, die Anwesenheit von Ig, das an Plättchen binden kann und von Heparin abhängig ist [d.h. "heparin-dependent serum platelet-bindable immunoglobulin" (S-PBIg)], mit einem anti(Ig)-Antikörper, der an Peroxidase gebunden ist, nachzuweisen. Bei dieser Technik werden die Plättchen mit dem Patientenserum behandelt.
Gemäß der EP-A-0 165 681 wird ein Verfahren zum Nachweis einer Thrombopenie als Folge eines induzierenden Arzneistoffs (hier Qn/Qnd) vorgeschlagen, gemäß dem man Blutplättchen mit dem Serum oder dem Plasma eines thrombopeniegefährdeten Patienten und dem induzierenden Arzneistoff behandelt, bei 21 bis 24ºC 15 bis 25 min inkubiert, die inkubierten Plättchen mit einer den induzierenden Arzneistoff enthaltenden Lösung wäscht, die so erhaltenen Plättchen (suspendiert) mit einem festen Träger mit einem spezifisch bindenden Protein in Kontakt bringt und inkubiert, die nicht-gebundenen Plättchen abgießt und die gebundenen Plättchen mit einem Enzym und seinem Substrat quantitativ bestimmt.
Außerdem ist aus M.B. Zucker et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, S.7571- 7574 (1989) und aus EP-A-0 378 364 (Publikationsdatum: 18. Juli 1990) die Struktur von pF4 und der Erhalt von rekombinantem pF4 auf gentechnischem Weg bekannt.

Aufgabe der Erfindung

Erfindungsgemäß wird eine neue technische Lösung zur Bestimmung von durch einen induzierenden Arzneistoff (Z), der eine heparinartige Substanz (Hep) ist, induzierten Thrombopenien vorgeschlagen. Diese neue technische Lösung beruht auf dem Nachweis (i) mittels einer spezifischen antigenen Substanz (Ag), (ii) eines immunologischen Antikörpermaterials, das in dem Plasma des zu testenden Patienten vorhanden ist und aus der Gesamtheit der anti-(Y)-Antikörper ausgewählt ist (worin Y insbesondere Z oder Z-Ag- Komplexe ist), die insbesondere gegen den induzierenden Arzneistoff Z und seine Komplexe mit Ag gerichtet sind.
Unter Berucksichtigung der Ergebnisse der von der Anmelderin durchgeführten Arbeiten wurde gefunden, daß bei warmblütigen Tieren, insbesondere beim Menschen und bei Säugern, die Verabreichung eines thrombopenieinduzierenden Arzneistoffs anti-(Z)-, anti-(Z-Plättchen)-, anti-(Z-Ag)- und anti-(Z-Ag-Plättchen)-Antikörper produziert, was zu einer Aggregation oder einer Aktivierung von Blutplättchen führt, was die Thrombopenie hervorruft.
Die erfindungsgemäße neue technische Lösung zur Bestimmung von Thrombopenien verwendet eine spezielle antigene Substanz, die insbesondere durch Spaltung oder Lyse von Blutplättchen erhalten wurde und eine hohe Affinität gegenüber dem induzierenden Arzneistoff besitzt.
Diese neue technische Lösung bietet im Gegensatz zu aus dem Stand der Technik bekannten Lösungen den Vorteil, daß sie zuverlässig, sehr empfindlich und rasch durchführbar ist.
Das Ergebnis der Antigen-Antikörper-Reaktion kann gemäß einem an sich bekannten Verfahren nachgewiesen, in ein Signal umgewandelt oder amplifiziert werden (insbesondere durch Agglutination, EIA, RIA oder FIA).

Gegenstand der Erfindung

Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur Bestimmung von Thrombopenien, die durch eine heparinartige Substanz (Hep) als induzierenden Arzneistoff induziert sind, bereitgestellt, wobei das Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, daß es die folgenden Schritte umfaßt:
(1.) Reagierenlassen (a) einer antigenen Substanz (Ag oder Ag&sub1;), wobei die antigene Substanz Ag ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus
(A) dem Plättchenfaktor 4 (pF4),
(B) den Fraktionen, die pF4 enthalten,
(C) den Fraktionen, die mindestens ein Substanz enthalten, die zur gleichen Zeit wie pF4 eluiert wird,
(D) dem rekombinanten pF4 und seinen Varianten,
(E) den synthetischen Peptiden, die die Gesamtheit oder einen Teil der Aminosäuresequenzen von pF4 aufweisen,
(F) dem Proteoglycan,
(G) den Proteoglycan-pF4-Komplexen und
(H) ihren Gemischen,
und wobei die antigene Substanz Ag&sub1; ein Komplex Hep-Ag aus der heparinartigen Substanz Hep mit der antigenen Substanz Ag ist,
mit (b) dem Plasma eines Patienten, der möglicherweise ein Antikörpermaterial anti-(Hep-Ag) besitzt, das im Fall von hepariner Thrombopenie in dem Organismus nach Verabreichung des Hep erzeugt wurde und das Ag gemäß der folgenden Reaktion erkennt
Ag + anti-(Hep-Ag) T Ag-anti-(Hep-Ag) oder
(Hep-Ag) + anti-(Hep-Ag) T (Hep-Ag)-anti-(Hep-Ag);
anschließend
(2.) Nachweis des erzeugten Komplexes, der aus der Reaktion resultiert.
Erfindungsgemäß wird ein Testbesteck, eine Testreagenzienzusammenstellung oder ein Test-Kit zum Nachweis von Thrombopenien bereitgestellt, das mindestens eine Probe der vorstehend genannten antigenen Substanz oder einen seiner Komplexe und ggf. geeignete Verdünnungsmedien und/oder andere Reagenzien enthält.

Abkürzungen

Nachstehend werden zur Vereinfachung die folgenden Abkürzungen verwendet.
Ag bezeichnet die erfindungsgemäße antigene Substanz mit einer hohen Affinität zu dem induzierenden Arzneistoff Z, d.h. hier der heparinartigen Substanz (Hep);
Ag&sub1; bezeichnet den Komplex Hep-Ag;
anti-(Z) bezeichnet einen gegen den induzierenden Arzneistoff (Z) erzeugten Antikörper;
anti-(X) bezeichnet jeden gegen die Substanz X erzeugten Antikörper; ebenso bezeichnen anti-(Z), anti-(Ig), anti-(IgA), anti-(IgG) bzw. anti-(IgM) jeden Antikörper, der gegen den induzierenden Arzneistoff Z und die Immunglobuline Ig, IgA, IgG bzw. IgM erzeugt wurde;
EIA bezeichnet einen Enzymimmuntest (englisch: "enzyme immunoassay");
ELISA Abkürzung des englischen Ausdrucks "enzyme-linked immunosorbent assay", bezeichnet eine spezielle EIA-Technik;
F(ab) bezeichnet ein erstes Fragment eines Antikörpers, erhalten durch Spaltung des Antikörpers mit Papain;
F(ab')&sub2; bezeichnet ein zweites Fragment eines Antikörpers, erhalten durch Spaltung des Antikörpers mit Pepsin;
Fc bezeichnet jedes Fragment des Antikörpers, getrennt von dem F(ab)- Fragment durch Spaltung mit Papain oder getrennt von dem F(ab')&sub2;- Fragment durch Spaltung mit Pepsin; die Fc-Fragmente sind homolog, aber unterscheiden sich strukturell leicht, je nach dem, ob sie mit Papain oder Pepsin gespalten wurden (die Struktur und die Art der Gewinnung von F(ab), F(ab')' ¥ und Fc sind in der französischen Patentanmeldung Nr. 89 04 589, eingereicht am 7. April 1989 beschrieben);
FIA bezeichnet einen fluoroimmunologischen Test (im Englischen: "fluorescent immunoassay");
FR bezeichnet den Rheumatoidfaktor;
Hep bezeichnet eine heparinartige Substanz, d.h. Heparin, seine Derivate und Analogen (einschließlich der Komplexe mit Plättchen);
HRGP bezeichnet ein histidinreiches Glycoprotein (im Englischen: "histidine- rich glycoprotein");
Ig bezeichnet jedes Immunglobulin;
IgA bezeichnet jedes Immunglobulin A;
IgG bezeichnet jedes Immunglobulin G;
IgM bezeichnet jedes Immunglobulin M;
LA-pF4 bezeichnet einen Vorläufer von βTG (im Englischen: "low-affinity pF4");
OD bezeichnet die optische Dichte (gemessen insbesondere bei einer Wellenlänge von 492 nm);
OPD bezeichnet ortho-Phenylendiamin;
PBP bezeichnet den Vorläufer von LA-pF4, d.h. das basische Plättchenprotein (im Englischen: "platelet basic protein");
pF3 bezeichnet den Plättchenfaktor 3;
pF4 bezeichnet den Plättchenfaktor 4;
MG bezeichnet das Molekulargewicht;
POD bezeichnet die Peroxidase;
Qn/Qnd bezeichnet Chinin, Chinidin, ihre Gemische, Derivate oder entsprechenden Analogen;
R* bezeichnet ein Markierungsmittel;
RIA bezeichnet einen radioimmunologischen Test (im Englischen: "radio immunoassay");
RT bezeichnet die Umgebungstemperatur (15 bis 25ºC);
βTG bezeichnet β-Thromboglobulin und ist das Ergebnis des Abbaus oder der Teilspaltung von LA-pF4;
Y bezeichnet den induzierenden Arzneistoff Z, ihn enthaltende Produkte und seine Derivate und/oder Analoge;
Z bezeichnet den induzierenden Arzneistoff der Thrombopenien, d.h. hier Hep.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft die Bestimmung von Thrombopenien immunologischen Ursprungs.
Das antigene Material Ag besteht aus Plättchenfragmenten (einschließlich Wände), aus den Blutplättchen durch Spaltung oder Lyse freisetzbaren Intraplättchenfraktionen und ggf Plasma- oder Blutsubstanzen. Die antigene Substanz Ag&sub1;, die ein Hep-Ag-Komplex ist, umfaßt die Komplexe der Plättchenfragmente, der Intraplättchenfraktionen und der Plasma- oder Blutsubstanzen.
Unter dem Ausdruck "mit einer hohen Affinität zu dem induzierenden Arzneistoff Z", der auf die antigene Substanz angewendet wird, wird die Tatsache verstanden, daß die antigene Substanz Ag leicht mit dem induzierenden Arzneistoff Z, den Derivaten von Z, den Analogen von Z und den Z enthaltenden Produkten reagiert.
Im Hinblick auf die Affinität von Ag zu dem induzierenden Arzneistoff Z, den Derivaten von Z (insbesondere den Metaboliten), den Analogen von Z (insbesondere den Heparinoiden) und den Z enthaltenden Produkten wird die Gesamtheit der in der Definition von Ag&sub1;, ausgehend von Ag, umfaßten Komplexe erfaßt.
Insbesondere zur Bestimmung der häufigeren Thrombopenien, die durch Hep induziert werden, wird die Verwendung einer antigenen Substanz Ag oder Hep-Ag mit einer hohen Affinität zu Hep empfohlen, die mit einem Anti-Heparin-Antikörpermaterial reagieren soll, das in dem zu testenden Plasma enthalten ist und gegen Hep, die Hep- Plättchenkomplexe, die antigene Hep-Substanz und/oder die antigene Plättchen-Hep- Substanz gerichtet ist, wobei Hep Heparin, von Heparin abgeleitete Verbindungen, heparinanaloge Verbindungen oder ihre Gemische bezeichnet und wobei das Antikörpermaterial eine Aggregation oder Aktivierung der Blutplättchen, die die Thrombopenie hervorrufen, erzeugt.
Im Hinblick auf die vorstehend gegebenen Definitionen umfaßt der induzierende Arzneistoff Hep jedes Produkt, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus
- Heparin mit genau genommen einem mittleren MG von 6.000 bis 30.000 Dalton und einer spezifischen Drehung [α]D²&sup0; von ca. + 55º;
- die Heparinderivate, insbesondere metallische Heparinate (Ca²&spplus;, Li&spplus;, Na&spplus;, Mg²&spplus; etc. ...) und die Heparinfragmente;
- die Heparinanalogen, insbesondere die Heparinoide (Heparamin und dessen Salze, die Chondroitine und ihre Salze etc. ...) und die Heparine mit einem mittleren Molekulargewicht von weniger als 6.000 Dalton;
- Substanzen, die Heparin, seine Derivate und Analogen enthalten, insbesondere Komplexe von Heparin und seinen sog. Derivaten und Analogen; und
- ihre Gemische.
Wie vorstehend angegeben, umfaßt das erfindungsgemäße Verfahren zur Bestimmung von durch einen induzierenden Arzneistoff (Z) induzierten Thrombopenien die Reaktion (A) einer antigenen Substanz Ag oder Ag&sub1; mit (B) einem anti-(Y)-Antikörpermaterial, wobei anti-(Y) ein gegen (a) Z, (b) die Derivate von Z, (c) die Analogen von Z, (d) Z, seine Derivate oder seine Analoge enthaltende Produkte oder (e) ihre Gemische gerichtet ist.
Bevorzugt ist das anti-(Y)-Antikörpermaterial ein anti-(Hep-Ag)-Antikörpermaterial; in der Praxis wird das zu testende Plasma des Patienten als Ausgangsmaterial für anti-(Y) verwendet, das im allgemeinen die anti-(Z)-und insbesondere die anti-(Z-Ag)- Antikörper enthält, d.h. genauer gesagt das Plasma eines Patienten, der möglicherweise ein anti-(Hep-Ag)-Antikörpermaterial enthält, das im Organismus nach Verabreichung von Hep im Falle einer heparinischen Thrombopenie erzeugt wird, und das Ag gemäß der Reaktion
Ag + anti-(Hep-Ag) T Ag-anti-(Hep-Ag) oder
(Hep-Ag) + anti-(Hep-Ag) T (Hep-Ag)-anti-(Hep-Ag)
erkennt.
Außerdem wurde festgestellt, daß, wenn man von einer antigenen Substanz Ag&sub1; (hier Hep-Ag) ausgeht, die Empfindlichkeit der Bestimmung verbessert wird, indem man dem Komplex eine geeignete Menge des induzierenden Arzneistoffs Hep beifügt.
Zur Bestimmung von durch Heparin induzierten Thrombopenien wird erfindungsgemäß ein Verfahren empfohlen, das die Reaktion eines Antigens (1), das für den Autoantikörper (2) spezifisch ist, der durch den induzierenden Arzneistoff nach dessen Verabreichung erzeugt wurde, mit dem Autoantikörper (2) umfaßt, wobei das Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, daß das Antigen (1) eine antigene Substanz Ag oder Hep-Ag ist.
Bei diesem Verfahren zur Bestimmung von durch Heparin induzierten Thrombopenien ist der Autoantikörper (2), wie vorstehend angegeben, der anti-(Hep-Ag)-Antikörper.
Zur Bestimmung von durch Heparin induzierten Thrombopenien wird die antigene Substanz Ag ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus
(A) dem Plättchenfaktor 4 (pF4),
(B) den Fraktionen, die pF4 enthalten,
(C) den Fraktionen, die mindestens ein Substanz enthalten, die zur gleichen Zeit wie pF4 eluiert wird,
(D) dem rekombinanten pF4 und seinen Varianten,
(E) den synthetischen Peptiden, die die Gesamtheit oder einen Teil der Aminosäuresequenzen von pF4 aufweisen (insbesondere die carboxylterminalen Peptide 1 - 13 oder 13-24),
(F) dem Proteoglycan,
(G) den Proteoglycan-pF4-Komplexen und
(H) ihren Gemischen.
Unter den Fraktionen, die pF4 enthalten, und die vorstehend als Mittel (B) in Betracht gezogen wurden, können insbesondere pF4-Polymere, die mehrere parallele Ketten des pF4-Monomeren enthalten, genannt werden.
Unter den Fraktionen, die mindestens eine Substanz, die gleichzeitig wie pF4 eluiert wird, enthalten, und die vorstehend als Mittel (C) in Betracht gezogen wurden, können insbesondere die Substanzen PBP, LA-pF4, βTG und ihre Gemische genannt werden.
Unter den Proteoglycan-pF4-Komplexen, die vorstehend als Mittel (G) in Betracht gezogen wurden, kann insbesondere der Komplex aus dem Proteoglycandimer genannt werden, in dem jeder Proteoglycanrest an vier pF4-Tetramerreste gebunden ist und der ein mittleres Molekulargewicht von 368.000 Dalton besitzt, wobei der Komplex auch als "native Form von pF4" bezeichnet wird und eine hohe Affinität zu Heparin besitzt. Der Komplex kann durch die folgende Formel dargestellt werden.
Die antigenen Substanzen Ag, die zur Bestimmung von durch Heparin induzierten Thrombopenien besonders bevorzugt sind, werden ausgewählt aus der Gesamtheit, bestehend aus
- dem pF4-Monomer mit einem mittleren Molekulargewicht von 8.000 Dalton,
- dem pF4-Polymer, insbesondere dem pF4-Tetramer, mit einem mittleren Molekulargewicht von 32.000 Dalton,
- dem Proteoglycan mit einem mittleren Molekulargewicht von 56.000 Dalton,
- den Proteoglycan-pF4-Komplexen, insbesondere dem Komplex aus dem Proteoglycandimer, in dem jeder Proteoglycanrest an vier pF4-Tetramerreste gebunden ist und der ein mittleres Molekulargewicht von 368.000 Dalton besitzt, und
- ihren Gemischen.
Gemäß einer besseren Ausführungsform der Erfindung werden bevorzugt die antigenen Substanzen Ag&sub1; verwendet, die Komplexe der vorstehend in Betracht gezogenen Substanzen Ag mit Hep sind.
Im Rahmen der Bestimmung von durch Heparin induzierten Thrombopenien umfaßt die Durchführung der vorstehend genannten Reaktion:
1. die Bildung und/oder Aktivierung der antigenen Substanz gemäß dem Mechanismus:
Ag + Hep -> Ag-Rep (2)
2. eine der entsprechenden Reaktionen:
Ag-Rep + anti-(Hep) -> Ag-Hep-anti-(Hep) (3)
Ag-Rep + anti-(Hep-Ag) -> Ag-Hep-anti-(Hep-Ag) (4)
Ag-Rep + anti-(Rep-Ag-Plättchen) -> Ag-Hep-anti-(Hep-Ag-Plättchen) (5)
wobei
Hep wie vorstehend definiert ist, und
Ag pF4, eines seiner Polymer, Proteoglycan, ein Proteoglycan-pF4-Komplex oder ihre Gemische ist.
Zum Erhalt der vorstehend in Betracht gezogenen Mittel (A) bis (H) werden Blutplättchen gespalten oder lysiert. Bevorzugt werden pF4, seine Polymere und die Proteoglycan-pF4-Komplexe aus lysierten Blutplättchen durch Fixierung an ein Heparin- Agarose-Gel und anschließende Elution des Gels bei einer Temperatur von 15 bis 25ºC mit einem wäßrigen Elutionsmittel mit einer Ionenstärke von größer oder gleich 0,60 bei einem pH-Wert von 6,5 bis 7,5 gewonnen.
Erfindungsgemäß wird die Bildung des Komplexes aus der Reaktion der antigenen Substanz mit dem Antikörpermaterial durch ein Verfahren, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus EIA-, RIA-, FIA- und Agglutinationsmethoden, nachgewiesen.
Zum Nachweis der vorstehend genannten Reaktion kann im speziellen Fall der Bestimmung von durch Heparin induzierten Thrombopenien, der Reaktionen (3) bis (5), ein sog. kompetitives EIA-Verfahren oder auch ein sog. Sandwich-EIA-Verfahren gemäß einem Mechanismus durchgeführt werden, bei dem die antigene Substanz (1) mit dem Antikörpermaterial (2) umgesetzt wird und anschließend der so gebildete Komplex mit dem markierten anti-(Ig)-Antikörper, insbesondere einem markierten anti-(IGA)-Antikörper, einem markierten anti-(IgG)-Antikörper oder einem markierten anti-(IgM)-Antikörper, umgesetzt wird.
Als Beispiel zur Bestimmung von durch Heparin induzierten Thrombopenien wird gemäß dem Sandwich-Verfahren das Produkt der Reaktionen (3) bis (5), d.h. Ag-Hep- anti-(Hep), Ag-Hep-anti-(Hep-Ag) oder Ag-Hep-anti-(Hep-Ag-Plättchen), mit einem Antikörper der Formel Anti(Ig)-R* umgesetzt, in der das Markierungsmittel R* ein durch ein geeignetes Substrat nachweisbares Enzym umfaßt; so kann R* POD sein, und das geeignete entsprechende Substrat kann OPD sein.
Als Beispiel zur Bestimmung von durch Hep induzierten Thrombopenien wird gemäß dem sog. kompetitiven Verfahren die erfindungsgemäße antigene Substanz Ag oder Ag&sub1; (vorteilhafterweise an einen geeigneten Träger gebunden) mit einem Gemisch aus dem anti-(Hep-Ag)-Antikörper aus dem zu untersuchenden Plasma und einem anti-(Hep-Ag)- R*-Antikörper umgesetzt, in dem das Markierungsmittel R* ein durch ein geeignetes Substrat nachweisbares Enzym umfaßt, wobei R* POD sein kann und das geeignete entsprechende Substrat OPD, wie vorstehend angegeben, sein kann.
Auch als Beispiel zur Bestimmung von durch Hep induzierten Thrombopenien kann ein Agglutinationsverfahren verwendet werden, gemäß dem die antigene Substanz Ag oder Ag&sub1;, die an einen geeigneten Träger gebunden ist (Latexteilchen, Liposomen, Liposomenfragmente, Bentonit, Kohle oder kolloidale Teilchen oder jedes andere inerte Teilchen, das in der Immunchemie bekannt ist) mit dem Plasma des kranken Patienten, das den anti-(Hep-Ag)-Antikörper enthält, umgesetzt wird. Die Agglutination kann photometrisch gemessen werden oder direkt auf dem Objektträger oder in dem Röhrchen abgelesen werden.
Als Variante kann der so erhaltene Antigen/Antikörperkomplex, in dem das Antigen an einen geeigneten Träger (bevorzugt eine Wand) gebunden ist, durch Umsetzung mit einem geeigneten markierten Antikörper (mit einem Enzym, einem fluorogenen Mittel, einem Radioisotop, einem gefärbten Latexteilchen oder kolbidalem Gold etc. ... markierter Antikörper) nachgewiesen werden.
Im Hinblick auf die Praktikabilität ist das Verdünnungsmedium, das zur Durchführung der Reaktion und deren Nachweis bei Messung der Anderung der optischen Dichte mit einem Photometer verwendet wird, ein wäßriges Medium, das für normales Plasma eine optische Dichte von kleiner oder gleich 0,2 und noch besser von kleiner oder gleich 0,1 besitzt. Bevorzugt wird eine derartige anfängliche optische Dichte mit einem Verdünnungsmedium des Plasmas erhalten, das ein Phosphatpuffer ist, der Ziegenserum enthält, wobei die verwendeten Bedingungen eine Verdünnung des Plasmas des normalen Individuums und des zu untersuchenden pathologischen Plasmas von 1/50 bis 1/100 (Vol./Vol.) und eine Menge an Ziegenserum von 5 bis 10 Vol.-%, bezogen auf das Verdünnungsmedium, sind. Anders ausgedrückt, zur Bestimmung mit einem photometrischen Verfahren wird ein Verdünnungsmedium für das zu untersuchende Plasma verwendet, das eine optische Dichte von kleiner oder gleich 0,2 und noch besser kleiner oder gleich 0,1 besitzt.
Mit klassischen Verdünnungsmedien wird unter den gleichen Bedingungen eine optische Dichte für das normale Plasma von größer oder gleich 0,6 erhalten, was nicht die korrekte Beurteilung der Erhöhung der Anderung der optischen Dichte bei der Analyse von pathologischen Plasmen erlaubt.
Die anti-(Ig)- und anti-(Hep-Ag)-Antikörper, die bei der Durchführung der Erfindung verwendet werden, können polyclonale oder monoclonale Antikörper sein. Wenn monoclonale Antikörper verwendet werden, können (sofern bei der Durchführung der Erfindung gewünscht, aber nicht unbedingt notwendig) ihre F(ab)- oder F(ab')2-Fragmente verwendet werden, um jede mögliche Wechselwirkung mit FR zu vermeiden, da FR gegenüber Fc-Fragmenten sehr empfindlich ist.
Die Erfindung betrifft ferner ein Testbesteck zum Nachweis von durch Heparin induzierten Thrombopenien, das dadurch gekennzeichnet ist, daß es enthält:
(1) mindestens eine Probe der antigenen Substanz Ag, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus:
- dem monomeren pF4 mit einem mittleren Molekulargewicht von 8.000 Dalton,
- dem polymeren pF4, insbesondere dem pF4-Tetramer, mit einem mittleren Molekulargewicht von 32.000 Dalton,
- dem Proteoglycan mit einem mittleren Molekulargewicht von 56.000 Dalton,
- dem Proteoglycan-pF4-Komplex, gebildet aus dem Proteoglycandimer, in dem jeder Proteoglycanrest an vier pF4-Tetramerreste gebunden ist, und wobei der Komplex ein mittleres Molekulargewicht von 368.000 Dalton hat,
oder mindestens eine Probe mit einem Hep-Ag-Komplex aus der antigenen Substanz Ag mit Hep,
(2) mindestens einen anti-(Ig)-Antikörper nach Anspruch 13 oder einen anti-(Ag)- Antikörper nach Anspruch 15 und gegebenenfalls Verdünnungsmittel und andere Reagenzien.
Weitere Vorteile und Eigenschaften der Erfindung werden aus den folgenden Ausführungsbeispielen besser verstanden werden. Die Gesamtheit dieser Bestandteile ist in keiner Weise beschränkend, sondern dient nur der Erläuterung.

Beispiel 1

Erhalt von pF4

Das Ausgangsmaterial ist ein gefrorenes Plättchenlysat, das dreimal in Folge gewaschen und aufgetaut wird. Das so behandelte Lysat wird in Kontakt mit einer wäßrigen Lösung gebracht, die Ammoniumsulfat (60 % Gew./Vol.) enthält; es bildet sich ein Niederschlag. Der Überstand wird gewonnen und einer Dialyse unterworfen. Das Dialysat wird auf eine Heparin-Agarose-Gelsäule aufgebracht und anschließend bei RT mit einem wäßrigen Elutionsmittel (Salzgradient), das bei einem pH-Wert von 6,5 bis 7,5 eine Ionenstärke von größer oder gleich 0,6 besitzt, eluiert.
Die Elution mit einem Salzgradienten mittels eines automatischen Analysators/Separators ergibt ein Chromatogramm in dem System mit einer OD (auf der Ordinate) bei 280 nm/eluiertem Volumen, ausgedrückt in ml (auf der Abszisse), wobei
a das "Totvolumen" bezeichnet;
b einen ersten Peak bei 30 ml (Injektion des Salzgradienten) bezeichnet;
c eine erste Fraktion von 60 bis 90 ml, betreffend Glycoproteine und Thrombospondinspuren, die einen Maximal-Peak bei 70 ml besitzen, bezeichnet;
d eine zweite Fraktion von 90 bis 132 ml, betreffend hauptsächlich Thrombospondin, bezeichnet, die einen Maximal-Peak bei 100 ml (Thrombospondin + Glycoprotein) und einen Maximal-Peak bei 112 ml (Thrombospondin) besitzt;
e eine dritte Fraktion von 132 bis 180 ml bezeichnet, betreffend hauptsächlich βTG, mit einem Maximal-Peak bei 142 ml (Glycoprotein) und einem Maximal-Peak bei 170 ml (βTG), und
f eine vierte Fraktion bezeichnet, betreffend pF4.
Die Fraktionen der Peaks 70 (d.h. 70 ml), 100, 112, 142, 170 und pF4 wurden mit dem Überstand vor der Ablagerung und dem Totvolumen nach der Beschichtung ("coating") an den Wänden oder am Boden der Mikroküvetten gegen pathologische Plasmen von Patienten mit Thrombopenien, die nachgewiesenermaßen durch Heparin, Calciumheparinat oder Magnesiumheparinat induziert waren, und Plasmen von normalen Individuen getestet, wobei die Plasmen 1/50 bis 1/100 mit einem Verdünnungsmedium verdünnt sind (Phosphatpuffer unter Zusatz von 10 % Vol./Vol. Ziegenserum).
Ein Immunkonjugat, ein anti-(Ig)-Antikörper, markiert mit Peroxidase [insbesondere anti-(IGA)-POD, anti-(IGG)-POD und anti-(IGM)-POD], wurde zum Nachweis (EIA-Sandwich-Technik) verwendet und anschließend wurde die Farbentwicklung mit dem Paar OPD/H&sub2;O&sub2; durchgeführt.
Der Reaktivitätsvergleich von normalen Plasmen und pathologischen Plasmen zeigte, daß die pF4 enthaltende Fraktion bezüglich der Bindung des anti-(Y)- Autoantikörpers, der für die Thrombopenie verantwortlich ist, wirksamer war.

Beispiel 2

Bestimmung von durch Heparin induzierten Thrombopenien

Empfohlen wird das folgende Protokoll zur Bestimmung von durch Heparin und seine Metallsalze induzierten Thrombopenien.
Es wird direkt Plasma gemäß einer EIA-Sandwich-Technik verarbeitet. Die durch Hep (das hier Heparin und/oder seine Metallsalze bezeichnet) erzeugten Autoantikörper, die in dem Plasma enthalten sind, werden durch das Antigen aus Plättchen in Gegenwart von Heparin (pF4-Hep) gebunden und durch einen anti-(Human-Ig)-POD-Antikörper [insbesondere anti-(IgA)-POD, anti-(IgG)-POD oder anti-(IgM)-POD] nachgewiesen, woran sich die Farbentwicklung mit dem Paar OPD/H&sub2;O&sub2; anschließt.

Reagenzien

Das Testbesteck, der Testkit oder die Testreagenzien-Zusammenstellung zur Bestimmung umfaßt die folgenden Reagenzien:
- vorbeschichtete Platte ("precoated"): in 6 Blöcke ("ships") aufteilbare Platte zu jeweils 16 Vertiefungen, die mit dem pF4-Antigen in Gegenwart von Hep in einem Verhältnis von 2 bis 8 ug/ml (bevorzugt 5 ug/ml) pF4 zu 0,02 bis 1 IE/ml (bevorzugt 0,1 IE/ml) Hep beschichtet sind;
- markierter anti-(Ig): anti-(Human-IgA, G oder M) Ziegenimmunglobuline, gekoppelt an Peroxidase [d.h. anti-(IgA)-POD, anti-(IgG)-POD oder anti-(IgM)-POD];
- Verdünnungsmedium: Phosphatpuffer mit 10 % (Vol./Vol.) Ziegenserum;
- Waschlösung: wäßrige Lösung, die das grenztlächenaktives Mittel TWEENR20, 20fach konzentriert enthält (bei Gebrauch zu verdünnen);
- OPD-Substrat: 5 bis 10 Tabletten zuje 2 mg OPD; und
- ggf. Referenzproben, die zur Eichung standardisiert sind, und eine Quelle für H&sub2;O&sub2;.

Arbeitsvorschriften

- Die zu testenden Plasmen werden unabhängig davon, ob sie pathologisch oder normal sind, wie folgt gewonnen und behandelt: Entnahme des Plasmas in 0,109 M Trinatriumcitrat, 10-minütige Zentrifugation bei 3000 UpM und Gewinnung des Überstands - Die zu testende Plasmaprobe muß 1/50 bis 1/100 mit dem Verdünnungsmedium verdünnt werden.

Verfahren

1. "Coating"

Die Bindung der antigenen Substanz pF4-Hep wird in jeder Vertietung mit 5 ug/ml pF4 und 0,1 IE/ml Hep durchgeführt.

2. Zugabe des Antikörpers

Es werden 200 ul Verdünnungsmedium, das das zu testende Plasma enthält (in dem der für die durch Hep induzierte Thrombopenie verantwortliche Autoantikörper vorhanden ist) pro Vertiefung zugesetzt.

3. Inkubation/Waschung

Es wird 2 h bei RT inkubiert und dann dreimal in Folge mit der Waschlösung nach ihrer vorherigen Verdünnung gewaschen.

4. Zugabe des Immunkonjugats

In jede Vertiefung werden 200 ul mit Peroxidase markiertes Immunkonjugat gegeben.

5. Inkubation/Waschung

Das so erhaltene Reaktionsmedium wird 2 h bei RT inkubiert und dann dreimal in Folge mit der verdünnten Waschlösung gewaschen.

6. Farbbildung

Es werden in 200 ul des Paares OPD/H&sub2;O&sub2; pro Vertiefüng zugesetzt; es wird 3 min bei RT inkubiert; die Reaktion wird durch Zugabe von 50 ul 3 M H&sub2;SO&sub4; pro Vertiefung gestoppt; und der OD-Wert wird bei 492 nm abgelesen.

Beispiel 3

Korrelation

Klinische Tests wurden parallel gemäß dem Protokoll von Beispiel 2 durch Vergleich mit dem Stand der Technik durchgeführt, wobei die Agglutination der Blutplättchen durch Heparin verwendet wurde. Bei dieser Verfahrensweise wurde das Plasma jedes Krankenhauspatienten, der vermutlich eine durch Heparin induzierte Thrombopenie hatte, in zwei Teile, eine für jede Technik, getrennt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle I angegeben.
Diese Ergebnisse weisen nach, daß
(i) wenn der Plättchen-Aggregationstest auf Heparin zweifelhaft ist, die erfindungsgemäße Bestimmung es erlaubt, den Zweifel zu beseitigen: Thrombopenie für die Patienten Nr. 4 und 15, keine Thrombopenie für die Patienten Nr. 2 und 25;
(ii) die erfindungsgemäße Bestimmung die Vermeidung von Diagnosefehlern beim Aggregationstest für die Patienten Nr. 14 und 16 (die eindeutig keine durch Heparin induzierte Thrombopenie hatten) und die Patienten Nr. 17 und 22 erlaubt (die eindeutig eine durch Heparin induzierte Thrombopenie hatten); und (iii) eine gute Korrelation, für die für den Rest der anderen Patienten erhaltenen Ergebnisse besteht.
Diese klinischen Versuche belegen die Bedeutung der erfindungsgemäßen Bestimmung von Thrombopenien hinsichtlich der Geschwindigkeit und Zuverlässigkeit, verglichen mit der Plättchenaggregation gemäß dem Stand der Technik.

Beispiel 4

Andere klinische Tests

Eine zweite Reihe von klinischen Tests wurde gemäß dem Protokoll von Beispiel 2 an einem Teil von Plasmen von Patienten mit durch Heparin induzierter Thrombopenie, im Vergleich zu einem Teil von Plasmen von normalen Patienten durchgeführt. In dieser zweiten Testserie wurden die Plasmen von 21 Thrombopeniepatienten und 32 normalen Patienten mit einem pF4-Heparinkomplex als antigener Substanz in den folgenden Anteilen: 5 ug/ml pF4 und 0,1 IE/ml Calciumheparinat verwendet.
Die mit den Verdünnungen 1/50 und 1/100 der zu testenden Plasmen erhaltenen Ergebnisse zeigen die Bedeutung der Zugabe von 10 % Vol./Vol. Ziegenserum zu dem Verdünnungsmedium, damit immer einen OD-Wert von kleiner 0,1 für die normalen Plasmen vorliegt. Wenn der OD-Wert der 1/50 oder 1/100 verdünnten normalen Plasmen über 0,3, oder sogar bei 0,6 liegt, wird es schwierig, die OD-Werte der thrombopenischen Plasmen mit einem Photometer zu beurteilen. Tabelle I

Anmerkungen

(a) mit 1/50 verdünntem Plasma;
(b) mit 1/100 verdünntem Plasma;
(c) mit der folgenden Anmerkung:
A positives Ergebnis;
B zweifelhaftes Ergebnis;
C negatives Ergebnis;
(d) zu Unrecht als positiv bewertetes Ergebnis (Fehler infolge Schwangerschaft der Patientin);
(e) durchgeführt an Plasma eines gesunden Patienten, Mittelwert und Intervall.

Claims

1. Verfahren zum Nachweis von Thrombopenien, induziert durch eine heparinartige Substanz (Hep) als induzierender Arzneistoff, wobei das Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, daß es die folgenden Schritte umfaßt:

(1) Reagierenlassen (a) einer antigenen Substanz (Ag oder Ag&sub1;), wobei die antigene Substanz Ag ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus:

(A) dem Plättchenfaktor 4 (pF4);

(B) den Fraktionen, die pF4 enthalten;

(C) den Fraktionen, die mindestens eine Substanz enthalten, die zur gleichen Zeit wie pF4 eluiert wird;

(D) dem rekombinanten pF4 und seinen Varianten;

(E) den synthetischen Peptiden, die die Gesamtheit oder einen Teil der Aminosäuresequenz von pF4 aufweisen;

(F) dem Proteoglycan;

(G) den Proteoglycan-pF4-Komplexen; und

(H) ihren Gemischen;

und wobei die antigene Substanz Ag&sub1; ein Komplex Hep-Ag aus der heparinartigen Substanz Hep mit der antigenen Substanz Ag ist;

mit (b) dem Plasma eines Patienten, der möglicherweise ein Antikörpermaterial anti- (Hep-Ag) besitzt, das im Fall von hepariner Thrombopenie in dem Organismus nach Verabreichung des Hep erzeugt wurde und das Ag gemäß der folgenden Reaktion erkennt

Ag + anti- (Hep-Ag) T Ag-anti- (Hep-Ag), oder

(Hep-Ag) + anti-(Hep-Ag) T (Hep-Ag)-anti-(Hep-Ag);

und anschließend

(2) Nachweis des erzeugten Komplexes, der aus der Reaktion resultiert.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die heparinartige Substanz Hep ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus:

- Heparin mit einem mittleren Molekulargewicht von 6 000 - 30 000 Dalton und einer spezifischen Drehung [α]D²&sup0; von ca. +55º;

- den Derivaten und den Fragmenten dieses Heparins;

- den Analogen dieses Heparins;

- den Substanzen, die dieses Heparin, eines seiner Derivate oder eines seiner Analoge enthalten; und

- ihren Gemischen.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Derivate ausgewählt sind aus metallischen Heparinaten.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die metallischen Heparinate ausgewählt sind aus Calcium-, Magnesium-, Lithium- und Natrium-Heparinaten.

5. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Analogen ausgewählt sind aus den Heparinoiden.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Heparinaiden ausgewählt sind aus Heparamin und seinen Salzen, den Chondroitinen und ihren Salzen und den Heparinen mit einem mittleren Molekulargewicht von weniger als 6 000 Dalton.

7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die antigene Substanz Ag von pF4 gebildet wird oder pF4 enthält und gewonnen wurde ausgehend von lysierten Blutplättchen durch Fixierung auf einem Heparin-Agarose-Gel und anschließender Elution von dem Gel bei einer Temperatur von 15 bis 25ºC mittels eines wäßrigen Elutionsmittels, das bei einem pH-Wert von 6,5 bis 7,5 eine Ionenstärke von 0,6 oder mehr hat.

8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Substanz Ag, die bei der Elution nach Anspruch 7 zur gleichen Zeit wie pF4 eluiert wird, ausgewählt ist aus dem basischen Blutplättchen-Protein (PBP), dem pF4 mit geringer Affinität (LA-pF4), dem β-Thromboglobulin (β- TG) und deren Gemischen.

9. Verfahren nach Anspruch 1 zum Nachweis von durch Hep induzierten Thrombopenien, wobei das Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, daß die antigene Substanz Ag&sub1; ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus den Komplexen:

- des Plättchenfaktors 4 (pF4);

- der Fraktionen, die den pF4 enthalten;

- der Fraktionen, die mindestens eine Substanz enthalten, die zur gleichen Zeit wie pF4 eluiert wird;

- des Proteoglycans; und

- der Proteoglycan-pF4-Komplexe;

mit Hep wie oben definiert; und ihren Gemischen.

10. Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, daß die antigene Substanz ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus:

- dem pF4-Monomer, das ein mittleres Molekulargewicht von 8 000 Dalton hat;

- dem pF4-Polymer, insbesondere dem pF4-Tetramer, das ein mittleres Molekulargewicht von 32 000 Dalton hat;

- dem Proteoglycan, das ein mittleres Molekulargewicht von 56 000 Dalton hat;

- dem Proteoglycan-pF4-Komplex, bestehend aus dem Proteoglycan-Dimer, in dem jeder Proteoglycanrest an 4 pF4-Tetramerreste gebunden ist, wobei der Komplex ein mittleres Molekulargewicht von 368 000 Dalton hat;

- den Komplexen dieser Produkte mit Hep, wobei Hep wie oben angegeben definiert ist; und ihren Gemischen.

11. Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, daß die antigene Substanz Ag das pF4-Monomer mit einem mittleren Molekulargewicht von 8 000 Dalton ist.

12. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die aus der Reaktion der antigenen Substanz Ag oder Ag&sub1; mit dem Antikörpermaterial anti-(Hep-Ag) resultierende Erzeugung des Komplexes nachgewiesen wird mittels einer Methode ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Methoden EIA, RIA, FIA und Agglutination.

13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß es die Reaktion der antigenen Substanz mit dem Antikörpermaterial umfaßt, um einen antigene Substanz-Antikörper-Komplex zu erhalten, und anschließend die Reaktion des so gebildeten Komplexes mit einem markierten anti- (Ig)-Antikörper.

14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß der markierte anti-(Ig)-Antikörper ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus den mit Peroxidase markierten Antikörpern anti-(IgA), anti-(IgG) und anti-(IgM).

15. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß es die Reaktion der antigenen Substanz mit einem Gemisch umfaßt, das das Antikörpermaterial und einen markierten anti-(antigene Substanz)-Antikörper enthält.

16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 und 12 bis 15 zum Nachweis von durch Hep induzierten Thrombopenien mittels einer photometrischen Methode, dadurch gekennzeichnet, daß das zu testende Plasma verdünnt wird, und das zur Verdünnung verwendete Mittel derart ist, daß es, bei einem Plasma eines Normalpatienten bei einer Konzentration von 1/50 - 1/100 (Vol./Vol.) in diesem Mittel, eine optische Dichte von 0,2 oder weniger aufweist und vorzugsweise von 0,1 oder weniger.

17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß das Verdünnungsmittel für das Plasma ein Phosphatpuffer ist, der Ziegenserum enthält.

18. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß

Ag der pF4 ist; und

Hep Heparin mit einem mittleren Molekulargewicht von 6 000 - 30 000 Dalton und einer spezifischen Drehung [α]D²&sup0; von ca. +55º ist.

19. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die antigene Substanz Ag mit dem Antikörpermaterial anti-(Hep-Ag) in Gegenwart von Hep zur Reaktion gebracht wird.

20. Testbesteck zum Nachweis von durch Hep induzierten Thrombopenien, dadurch gekennzeichnet, daß es enthält:

(1) mindestens eine Probe der antigenen Substanz Ag ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus

- dem pF4-Monomer mit einem mittleren Molekulargewicht von 8 000 Dalton;

- dem pF4-Polymer, insbesondere dem pF4-Tetramer mit einem mittleren Molekulargewicht von 32 000 Dalton;

- dem Proteoglycan mit einem mittleren Molekulargewicht von 56 000 Dalton;

- dem Proteoglycan-pF4-Komplex gebildet aus dem Proteoglycan-Dimer, in dem jeder Proteoglycanrest gebunden ist an 4 pF4-Tetramerreste, und wobei der Komplex ein mittleres Molekulargewicht von 368 000 Dalton hat;

oder mindestens eine Probe mit einem Hep-Ag-Komplex der antigenen Substanz Ag mit Hep;

(2) mindestens einen anti-(Ig)-Antikörper nach Anspruch 13 oder einen anti-(Ag)-Antikörper nach Anspruch 15; und

gegebenenfalls Verdünnungsmittel und andere Reagenzien.