DE69028513T2

DE69028513T2 - Träger zur bindung von antiphospholipid-antikörpern, diese antikörper verwendender immunotest und kit dafür

Info

Publication number: DE69028513T2
Application number: DE69028513T
Authority: DE
Inventors: Yoshiko Choshi-Shi Chiba 288 Igarashi; Eiji Choshi-Shi Chiba 288 Matsuura; Hisato Choshi-Shi2Chiba 288 Nagae
Original assignee: Yamasa Shoyu KK
Current assignee: Yamasa Shoyu KK
Priority date: 1989-10-19
Filing date: 1990-10-19
Publication date: 1997-02-06
Anticipated expiration: 2010-10-20
Also published as: EP0450099B1; CA2044142A1; US5506110A; ATE142789T1; NZ237535A; EP0450099A1; AU6532190A; DE69028513D1; WO1991006006A1; EP0450099A4; AU640699B2

Description

Hintergrund der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Immunoassay-Verfahren, in welchem ein Träger zum Binden der Antiphospholipid- Antikörper eingesetzt wird, und eine Ausstattung (kit ) für dessen Durchführung, bei welchem Verfahren ein Protein oder ein Serum, Plasma oder eine Fraktion davon, welche das Protein enthält, welches aus einem menschlichen Serum oder Plasma erhalten worden ist, eingesetzt wird. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung die Bestimmung von Autoantikörpern, welche vor allem bei Patienten mit dem Antiphospholipidsyndrom auftreten.

Stand der Technik

Ein lebender Körper reagiert auf exogene Fremdstoffe, wie pathogene Viren, Bakterien, Pilze, Parasiten usw., die in den Körper eingedrungen sind, mit einer Immunreaktion, welche dazu dient, die Fremdstoffe auszuschalten. Dieses Phänomen wird im allgemeinen in die folgenden beiden Gruppen unterschieden: Humoralimmunität, bei welcher Antikörper beteiligt sind und Zellimmunität, bei welcher immunkompetente Zellen direkt beteiligt sind, wobei die Fremdstoffe ausgeschaltet werden. Bei Krankheiten, die man allgemein als Autoimmunkrankheiten bezeichnet, arbeitet jedoch der Erkennungsmechanismus in bezug auf Fremdstoff oder körpereigenes Material nicht einwandfrei, vielmehr richtet sich die humorale oder zelluläre Immunreaktion gegen die eigenen Zellen oder Gewebe. Ein repräsentativer klinischer Fall, in welchem mit Eigenkomponenten reagierende Antikörper (Autoantikörper) vorkommen, ist der systemische Lupus erythematodes (SLE). Es ist bekannt, daß im Blut von SLE- Patienten Anti-Einzelstrang-DNA-Antikörper (Anti-ssDNA), Anti-Doppelstrang-DNA-Antikörper (Anti-ds-DNA), Anti-Sm-Antikörper, Anti-Cardiolipinantikörper usw. vorkommen. Auch rheumatoide Faktoren hat man bei Patienten mit rheumatoider Arthritis (RA) festgestellt; Anti-SS-A-Antikörper, Anti-SS- B-Antikörper und Anti-Mitochondrien-Antikörper werden bei Patienten mit dem Sjörgenschen Syndrom (Sjs) festgestellt; Anti-scl-Antikörper und Anti-Einzelstrang-DNA-Antikörper liegen bei progressiver systemischer Sklerose (PSS) vor; Anti-RNP-Antikörper liegen bei Patienten mit Bindegewebsmischkrankheiten (mixed connective tissue diseases , MCTD) vor. Zur Zeit bestehen viele Unklarheiten in bezug auf die Beziehung zwischen dem Auftreten dieser Antikörper und ihrer Bedeutung beim Verlauf der Krankheiten. Die Bestimmung dieser Antikörper ist aber eine wichtige Maßnahme für die Diagnose von Krankheiten und für die Kenntnis bezüglich der Änderung ihrer Prognose.
Um diese verschiedenen Autoantikörper zu entdecken, wurden der Immundiffusionstest, die Gegenimmunelektrophorese, der Blutkörperchenagglutinationstest, das Radioimmunoassay (RIA), das Enzymimmunoassay (EIA) und der Latexagglutinationstest usw. in Abhängigkeit von den Antigenbesonderheiten der Antikörper und von den biochemischen und physikalisch-chemischen Eigenschaften der Antigene entwickelt.
Ein Verfahren zur Bestimmung der genannten Anticardiolipin- Antikörper ist die Immunausfällung, die in den späten vierziger Jahren erstmals zur Diagnose (Reihenuntersuchung - mass screening) von Syphilis entwickelt wurde. Bei der Diagnose unter Anwendung dieses Verfahrens bestand jedoch das Problem, daß Seren von Patienten mit systemischem Lupus erythematodes (SLE) oder mit einer der Autoimmunokrankheiten sich als biologisch scheinpositiv (biological false-positive (BFP)) herausstellten, und außerdem ist das Verfahren sehr unempfindlich. In den letzten Jahren hat man im Blut von jungen Frauen mit Lupus-ähnlichen Syndromen, welche in Arterien und Venen Thrombosen, eine Fehlgeburt oder Thrombopenie hatten, eine hohe Konzentration an Anticardiolipin-Antikörpern gefunden. Der klinischen Bedeutung der Bestimmung von Anticardiolipin-Antikörpern bei der Diagnose dieser Krankheiten wurde daher große Aufmerksamkeit geschenkt.
In dieser Situation hegte man große Erwartungen in bezug auf hochempfindliche und genaue Methoden anstelle der herkömmlichen Analysen, wie z.B. die unspezifische Bestimmung von Lupus anticoagulans oder die Bestimmung von Anticardiolipin-Antikörpern durch Immunausfällung und Blutkörperchen- Agglutination, bei welchen sehr häufig biologisch scheinpositive Ergebnisse erhalten werden (Proctor, R.R. & Rapaport, S.L., Am.J.Clin.Pathol.,36, 212 (1961), Exner, T. et al., British J.Haematol., 40, 143 (1978); Margolios, A., Medicine. 40, 145 (1961)). Im Jahre 1983 wurde von der Firma Harns et al das RIA zur Bestimmung von Anticardiolipin-Antikörpern entwickelt (Harns, E.N., et al., Lancet, 1211-1214 (1983)). Dann folgte die Entwicklung von EIA mittels der kompetitiven Methode (d.h. ein Sandwich-Verfahren) unter Verwendung eines Antikörpers, der mit einem Enzym markiert ist, wie alkalische Phosphatase. Die Bestimmung der im System enthaltenen Anticardiolipinantikörper mittels EIA ist sowohl quantitativ als auch einfach, und scheint sich für Diagnose und Verlaufsbeobachtung von Kollagenerkrankungen, wie SLE usw. zu eignen. Außerdem wird dieses Verfahren auch für die Analyse in bezug auf die Spezifität von Anticardiolipinantikörpern auf dem Gebiet der medizinischen Grundlagenforschung eingesetzt. Kürzlich kam man zu der Erkenntnis, daß auf dem Gebiet der Kollagenerkrankungen vor allem die immer wieder auftretenden Fehlgeburten durch Thrombosen aufgrund der Bildung von Antiphospholipid-Antikörpern, wie Anticardiolipin-Antikörpern usw. ausgelöst werden (Antiphospholipidsyndrom). Die Bestimmung von Anticardiolipinantikörpern wurde somit auch auf dem Gebiet der Geburtshilfe und der Gynäkologie erwartet.
Verschiedene Unterklassen von Anticardiolipin-Antikörpern (d.h. IgG, IgM, IgA, usw.) werden bei Patienten mit Kollagenerkrankungen und Infektionskrankheiten beobachtet, aber IgG oder IgM treten häufig bei SLE-Patienten auf.
Ferner liegen bei dsDNA, ssDNA, Cardiolipin, Phosphatidylserin, Phosphatidylinosit usw., welche spezifische Antigene für die entsprechenden Antikörper zu sein scheinen, die in Seren von Patienten mit dem Antiphospholipidsyndrom festgestellt worden sind, ähnliche Molekülstrukturen an der restriktiven polaren Stelle vor, welche sich in der Nähe des Phosphodiester-Molekülteils befindet. Es werden laufend Diskussionen darüber geführt, ob diese Antikörper identisch sind oder nicht.
Wie oben erwähnt wurden RIA und EIA für die Bestimmung von Anticardiolipin-Antikörpern als Analyse-Systeme für die Diagnose von Antiphospholipidsyndromen einschließlich SLE, sich wiederholender Fehlgeburten usw., entwickelt. Diese Analyse-Verfahren sind jedoch immer noch mit den folgenden Problemen verbunden.
Das heißt, wenn Seren von Patienten mit SLE usw. analysiert werden sollen, ist das Verfahren unter Verwendung eines an ein Antigen gebundenen festen Trägers manchmal bei der quantitativen Bestimmung von zu Cardiolipin spezifischen Antikörpern aufgrund der unspezifischen Adsorption mit Schwierigkeiten verbunden, es sei denn, daß ein geeignetes Blockiermittel eingesetzt wird. Wenn herkömmlicherweise das Serum eines Rinderfötus (Fetal bovine serum, FBS) als Blockiermittel eingesetzt wird, ist es nicht möglich, von SLE herrührende Anticardiolipin-Antikörper und Anti-Cardiolipin-Antikörper exogenen Ursprungs (d.h. durch Infektionskrankheiten usw. hervorgerufen) differenziert quantitativ zu bestimmen. Bis jetzt wurde kein für diesen Zweck geeignetes Blockiermittel gefunden,

Offenbarung der Erfindung

Die Erfinder haben im vorliegenden Fall intensive Forschungen betrieben, um geeignete Träger zum Binden von Antiphopholipid-Antikörpern zu entwickeln, welche selektiv mit Antiphospholipid-Antikörpern, die vor allem beim Antiphospholipidsyndrom vorliegen, verbunden werden können, und um ein Verfahren zur Bestimmung von Anticardiolipin-Antikörpern mit hoher Genauigkeit und Empfindlichkeit zu entwickeln, welches sich für die praktische Anwendung bei der spezifischen Diagnose des Antiphospholipidsyndroms eignet. Als Ergebnis davon konnten die genannten Probleme wie folgt beseitigt werden, und man gelangte zu vorliegender Erfindung.
Die charakteristischen Merkmale der vorliegenden Erfindung sind:
Ein Immunoassay-Verfahren, welches umfaßt:
eine erste Stufe der Antigen-Antikörper-Reaktion, welche das Kontaktieren eines Trägers zum Binden eines Antiphospholipid-Antikörpers mit einer Probelösung zwecks Bildung eines Imunkomplexes zwischen dem Antiphospholipid- Antikörper in der genannten Probelösung und einem Phospholipid auf dem Träger umfaßt;
eine zweite Stufe der Antigen-Antikörper-Reaktion, welche das Umsetzen des Immunkomplexes mit einem markierten Anti- Immunglobulinantikörper umfaßt;
eine Stufe des Abtrennens einer Phase, die den Sandwich-Immunkomplex enthält; und
eine Stufe des Nachweises eines Markierungsmittels in der Phase, wobei der Träger zum Binden eines Antiphospholipid- Antikörpers durch Behandeln eines Trägers mit einem daran gebundenen Phospholipid wie folgt hergestellt worden ist;
Behandeln mit einem oberflächenaktiven Mittel;
Behandeln mit einem gereinigten Serumalbumin mit einem reduzierten Lipidgehalt; und
Behandeln mit einem Protein oder Serum, Plasma oder einer Fraktion davon, welche das Protein enthält, welches Protein aus menschlichem Serum oder Plasma erhalten worden ist und eine Funktion dahingehend hat, daß das Binden eines spezifisch beim Antiphospholipidsyndrom vorliegenden Antikörpers mit dem Phospholipid verstärkt wird, und eine Hemmwirkung in bezug auf das Verbinden der aufgrund von Infektionskrankheiten vorliegenden Antiphospholipid-Antikörper mit dem Phospholipid aufweist, und die folgenden physikochemischen Eigenschaften hat:
a) sein Molekulargewicht beträgt ca. 50 000 ± 2000, bestimmt durch SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese, und sein isoelektrischer Punkt liegt bei ca. 6,60 ± 0,4; und
b) das Protein kann sich an das Phospholipid binden; und
c) die Sequenz von 7 Aminosäuren des N-Terminus des Proteins ist wie folgt:
NH&sub2;-Gly-Arg-Thr-X-Pro-Lys-Pro,
wobei X vermutlich Cys oder His ist.
Ferner ist das vorstehend erwähnte oberflächenaktive Mittel vorzugsweise ein anionisches oberflächenaktives Mittel, und der genannte Träger ist in der Reaktionslösung nicht löslich.
Vorzugsweise weist das erwähnte Phospholipid eine elektronenspendende funktionelle Gruppe an der Stelle auf, die sich benachbart zu der Phosphodiesterbindung befindet. Vorzugsweise ist das genannte Phospholipid ein Cardiolipin. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das genannte Phospholipid ein Glycerophospholipid, dargestellt durch die allgemeine Formel (I):
in welcher R¹ und R² unabhängig voneinander eine Acylgruppe mit einer Alkylgruppe oder Alkenylgruppe in der Kohlenstoffkette derselben, eine Alkylgruppe oder eine Alkenylgruppe darstellen; R³ ein Wasserstoffatom oder eine Gruppe -(CH&sub2;)-n-CHR&sup4;-R&sup5; ist; in welcher R&sup4; ein Wasserstoffatom, eine Hydroxygruppe, eine Carboxylgruppe, eine Formylgruppe, eine Mercaptogruppe oder ein Halogenatom ist; und R&sup5; eine Aminogruppe , eine Hydroxyalkylgruppe oder ein Substituent, dargestellt durch die allgemeine Formel (II),bedeutet:
in welcher R¹ und R² die oben erwähnte Bedeutung haben; bzw R&sup4; und R&sup5; miteinander kombiniert sein können, wobei ein Zucker- oder ein Zucker-Alkohol-Rest gebildet wird; und n 0 oder eine ganze Zahl von 1 bis 3 bedeutet.
Ferner betrifft die vorliegende Erfindung eine Ausstattung zum Durchführen des beschriebenen Immunoassay-Verfahrens.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner ein Immunoassay- Verfahren, welches umfaßt:
eine erste Stufe einer Antigen-Antikörperreaktion, welche das Kontaktieren eines Trägers zum Binden eines Antiphospholipid-Antikörpers mit einer Probelösung unter Bildung eines Immunkomplexes zwischen dem Antiphospholipid-Antikörper in der genannten Probelösung und dem Phospholipid auf dem Träger umfaßt;
eine zweite Stufe der Antigen-Antikörperreaktion, welche das Umsetzen des Immunkomplexes mit einem markierten Antiimmunglobulin-Antikörper unter Bildung eines Sandwich-Immunkomplexes, der aus dem Immunkomplex und dem markierten Antiimmunglobulin-Antikörper besteht, umfaßt;
eine Stufe des Abtrennens einer Phase, welche den Sandwichimmunkomplex enthält; und
eine Stufe des Nachweises eines Markierungsmittels in der Phase,
wobei der Träger zum Binden eines Antiphospholipid-Antikörpers durch Behandlung eines Trägers mit einem daran gebundenen Phospholipid mit einem oberflächenaktiven Mittel hergestellt worden ist; und die Antigen-Antikörperreaktion in der ersten Stufe in Gegenwart eines Proteins, eines Serums, Plasmas oder einer Fraktion davon, enthaltend das Protein, durchgeführt wird, welches Protein aus einem menschlichen Serum oder Plasma erhalten worden ist, eine Funktion des Verstärkens der Bindung eines spezifisch beim Antiphospholipidsyndrom vorliegenden Antikörpers mit Phospholipid und eine Hemmwirkung in bezug auf das Binden der Antiphospholipid-Antikörper aufweist, die aufgrund von Infektionskrankheiten vorliegen, und die folgenden physikochemischen Eigenschaften hat:
a) sein Molekulargewicht beträgt ca. 50 000 ± 2000, bestimmt durch SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese, und sein isoelektrischer Punkt liegt bei ca. 6,60 ± 0,4; und
b) das Protein kann sich an das Phospholipid binden; und
c) die Sequenz von 7 Aminosäuren des N-Terminus des Proteins ist wie folgt:
NH&sub2;-Gly-Arg-Thr-X-Pro-Lys-Pro,
wobei X vermutlich Cys oder His ist.
Vorzugsweise ist der Träger zum Binden eines Antiphospholipid-Antikörpers beim beschriebenen Immunoassayverfahren erhalten worden durch Behandeln eines Trägers mit einem daran gebundenen Phospholipid mit :
einem oberflächenaktiven Mittel;
einem gereinigten Serumalbumin mit verringertem Lipidgehalt und
einem Protein oder einem Serum, einem Plasma oder einer Fraktion davon, enthaltend das Protein, welches Protein aus einem menschlichen Serum oder Plasma erhalten worden ist, eine Funktion der verstärkung des Bindens eines spezifisch beim Antiphospholipidsyndrom vorliegenden Antikörpers mit Phospholipid und eine Hemmwirkung in bezug auf das Binden der Antiphospholipid-Antikörper an das Phospholipid aufweist, die aufgrund von Infektionskrankheiten gebildet worden sind, und die folgenden physikochemischen Eigenschaften hat:
a) sein Molekulargewicht beträgt ca. 50 000 + 2000, bestimmt durch SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese und sein isoelektrischer Punkt liegt bei ca. 6,60 + 0,4; und
b) das Protein kann sich an das Phospholipid binden; und
c) die Sequenz von 7 Aminosäuren des N-Terminus des Proteins ist wie folgt:
NH&sub2;-Gly-Arg-Thr-X-Pro-Lys-Pro,
wobei X vermutlich Cys oder His ist.
Ferner ist das erwähnte oberflächenaktive Mittel vorzugsweise ein anionisches oberflächenaktives Mittel und der erwähnte Träger ist in der Reaktionslösung unlöslich.
Vorzugsweise weist das erwähnte Phospholipid eine elektronenspendende funktionelle Gruppe an der Stelle auf, die sich benachbart zu der Phosphodiesterbindung befindet. Vorzugsweise ist das genannte Phospholipid ein Cardiolipin. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das genannte Phospholipid ein Glycerophospholipid, dargestellt durch die allgemeine Formel (I), wie vorstehend angegeben.
Ferner betrifft die vorliegende Erfindung eine Ausstattung zur Durchführung des beschriebenen Immunoassay-Verfahrens.
Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem ein Verfahren zum unterscheidenden Nachweis eines Antiphospholipid-Antikörpers, abstammend vom Antiphospholipidsyndrom und eines Antiphospholipid-Antikörpers, abstammend von Infektionskrankheiten, welches die folgenden Verfahrensstufen umfaßt:
(1) Kontaktieren eines mit einem Phospholipid verbundenen Trägers zum Binden eines Antiphospholipid-Antikörpers mit einer Probelösung,
wobei ein erster Imunkomplex gebildet wird, und
(2) Umsetzen des ersten Imunkomplexes mit einem markierten Anti-Immunglobulinantikörper unter Bildung eines Sandwichimmunkomplexes, der aus dem ersten Immunkomplex und dem markierten Anti-Immunglobulinantikörper besteht, und
(3) Abtrennen der den Sandwichimmunkomplex enthaltenden Phase von der Phase, die die nicht an den Träger gebundene Substanz enthält, und
(4) Nachweis eines Markierungsmittels in einer dieser beiden Phasen;
wobei der an das Phospholipid gebundene Träger zum Binden eines Antiphospholipid-Antikörpers sowohl in Gegenwart als auch in Abwesenheit eines Proteins, oder eines Serums, Plasmas oder einer Fraktion davon, enthaltend das Protein, mit der Probelösung kontaktiert wird, welches Protein aus menschlichem Serum oder Plasma erhalten worden ist und eine Funktion dahingehend hat, daß die Bindung eines Antikörpers, der spezifisch beim Antiphospholipidsyndrom vorliegt, mit dem Phospholipid verstärkt wird, und das ferner eine Hemmwirkung in bezug auf das Binden der Antiphospholipid- Antikörper, die aufgrund von Infektionskrankheiten vorliegen, an das Phospholipid umfaßt, und das die folgenden physikalisch-chemischen
Eigenschaften hat:
a) sein Molekulargewicht beträgt ca. 50 000 ± 2000, bestimmt durch SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese, und sein isoelektrischer Punkt liegt bei ca. 6,60 ± 0,4; und
b) das Protein kann sich an das Phospholipid binden; und
c) die Sequenz von 7 Aminosäuren des N-Terminus des Proteins ist wie folgt:
NH&sub2;-Gly-Arg-Thr-X-Pro-Lys-Pro,
wobei X vermutlich Cys oder His ist.
Der Antiphospholipid-Antikörper, der vom Antiphospholidsyndrom stammt, und der Antiphospholipid-Antikörper, der von Infektionskrankheiten stammt, lassen sich so unterscheidbar nachweisen.
Vorzugsweise ist der Träger zum Binden eines Antiphospholipid-Antikörpers beim oben beschriebenen Verfahren durch Behandeln eines Trägers mit einem daran gebundenen Phospholipid wie folgt erhalten werden:
Behandeln mit einem oberflächenaktiven Mittel; und/oder mit einem gereinigten Serumalbumin mit verringertem Lipidgehalt; und gegebenenfalls auch mit
einem Protein oder Serum, einem Plasma oder einer Fraktion davon, enthaltend das Protein, welches Protein aus einem menschlichen Serum oder Plasma erhalten worden ist, eine Funktion der Verstärkung des Bindens eines spezifisch beim Antiphospholipidsyndrom vorliegenden Antikörpers mit Phospholipid und eine Hemmwirkung in bezug auf das Binden der Antiphospholipid-Antikörper, die aufgrund von Infektionskrankheiten vorliegen, an das Phospholipid aufweist und die folgenden physikalisch-chemischen Eigenschaften hat:
a) sein Molekulargewicht beträgt ca. 50 000 ± 2000, bestimmt durch SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese und sein isoelektrischer Punkt liegt bei ca. 6,60 ± 0,4; und
b) das Protein kann sich an das Phospholipid binden; und
c) die Sequenz von 7 Aminosäuren des N-Terminus des Proteins ist wie folgt:
NH&sub2;-Gly-Arg-Thr-X-Pro-Lys-Pro,
wobei X vermutlich Cys oder His ist.
Vorzugsweise ist das genannte Phospholipid im beschriebenen Verfahren ein Glycerophospholipid, dargestellt durch die Formel (I)
in welcher R¹ und R² jeweils unabhängig voneinander eine Acylgruppe mit einer Alkylgruppe oder einer Alkenylgruppe in der Kohlenstoffkette davon, eine Alkylgruppe oder eine Alkenylgruppe sind; R³ ein Wasserstoffatom oder eine Gruppe -(CH&sub2;)n-CHR&sup4;-R&sup5; ist, wobei R&sup4; ein Wasserstoffatom, eine Hydroxygruppe, eine Carboxylgruppe, eine Formylgruppe, eine Mercaptogruppe oder ein Halogenatom ist; und R&sup5; eine Aminogruppe, eine Hydroxyalkylgruppe oder einen Substituenten bedeutet, dargestellt durch allgemeine Formel (II):
in welcher R¹ und R² die gleiche Bedeutung haben wie oben beschrieben; oder R&sup4; und R&sup5; miteinander kombiniert sein können, wobei ein Zucker- oder Zucker-Alkohol-Rest gebildet werden; und n 0 oder eine ganze Zahl von 1 bis 3 ist.
Ferner ist das erwähnte oberflächenaktive Mittel vorzugsweise ein anionisches oberflächenaktives Mittel, und der erwähnte Träger ist in der Reaktionslösung unlöslich.
Vorzugsweise weist das erwähnte Phospholipid eine elektronenspendende funktionelle Gruppe an der Stelle auf, die sich benachbart zur Phosphodiesterbindung befindet. Vorzugsweise ist das genannte Phospholipid ein Cardiolipin.
Ferner betrifft die vorliegende Erfindung eine Ausstattung zur Durchführung des beschriebenen Imunoassay-Verfahrens.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig.1(A), (B) und (C) stellt die Extinktion (450 nm) dar, gemessen im Bezugsbeispiel mittels des Verfahrens des Stands der Technik, gemessen in einem Versuch, der die Wirkung der vorliegenden Erfindung zeigt und gemessen bei einem Beispiel, das das Verfahren nach vorliegender Erfindung zum Inhalt hat, als Index für den Antiphospholipid-Antikörper-Titer in As-Serum, herstammend vom Antiphospholipid- Syndrom, und in Ya-Serum, herstammend von Infektionskrankheiten.
Fig.2 zeigt die Extinktion (450 nm), gemessen als Index des Antikörper-Titers in As-Serum und in Ya-Serum, unter Verwendung eines Trägers zum Binden des Antiphospholipid-Antikörpers, hergestellt durch Verfahren, die nicht dem Verfahren des Beispiels in Fig.1 (C) entsprechen.
Fig.3 zeigt die Beziehung zwischen der Konzentration (Verdünnungsgrad) der menschlichen Seren von gesunden Probanden und der Extinktion (450 nm) als Index des Antikörper-Titers.
Fig.4 zeigt die Beziehung zwischen dem Gelfiltrationsmuster von menschlichen Seren von gesunden Menschen und der Extinktion (450 nm) als Index des Antikörper-Titers in As- Serum und in Ya-Serum, bestimmt beim Durchführen der ersten Reaktion bei jeder Zugabe jeweils einer Teilmenge der Fraktion.
Fig.5 zeigt die Beziehung zwischen dem Gelfiltrationsmuster von menschlichen Seren von gesunden Menschen mittels HPLC und die Extinktion (450nm) als Index des Antikörper-Titers in As-Serum beim Durchführen der ersten Reaktion bei jeder Zugabe jeweils einer Teilmenge der Fraktion.
Fig.6 zeigt ein Auftrennmuster von Seren von gesunden Menschen mittels der Protein-A-Sepharose-Säule.
Fig.7 zeigt Eluierungsprofile des menschlichen Serums von gesunden Menschen mittels der DEAE-Cellulose-Säulenchromatographie, dargestellt durch die Extinktion bei 280 nm und bei 450 nm ( im ELISA-Test) als Index des Antikörper-Titers in As-Serum.
Fig.8 zeigt die Beziehung beim Fraktionieren der Seren von gesunden Menschen mittels Ammoniumsulfat und der Extinktion (450 nm) als Index des Antikörper-Titers in As-Serum.
Fig.9 zeigt die Ergebnisse, die durch Bestimmen des Antikörper-Titers (Einheit/ml; nachstehend abgekürzt als U) in Seren von gesunden Menschen und Seren von Patienten mit dem Antiphospholipid-Syndrom erhalten worden sind.
Fig.10 zeigt den Zusammenhang zwischen den Antikörper-Titer (U) von Seren von Patienten mit (einer) Autoimmunkrankheit(en), bestimmt durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung und durch ein bekanntes Verfahren.
Fig.11 zeigt die Linearität bei der Verdünnung von Seren von Patienten mit SLE, bestimmt nach dem Verfahren der vorliegenden Erfindung.
Fig.12 zeigt die Ergebnisse mit Seren von Patienten mit (einer) Autoimmunkrankheit(en) und Patienten mit Infektionskrankheiten (tuberkulöse Meningitis, Syphilis), die durch Bestimmen der Extinktion (450 nm) als Index des Antikörper-Titers in Gegenwart (Halbschattendarstellung) und in Abwesenheit (weiß auf schwarz) von menschlichem Serum nach dem Verfahren der vorliegenden Erfindung erhalten worden sind.
Fig.13 zeigt die Extinktion (450nm) bei der Reaktion mit dem As-Serum unter Verwendung einer Puffersubstanz, enthaltend HEPES, als erste Reaktionslösung, auf welcher Basis eine Eichkurve von Antikörper-Titern hergestellt wurde.
Fig.14 zeigt ein Chromatogramm von Seren von gesunden Menschen mittels Ionenaustauschchromatographie an einer DEAE- Cellulose(DE-52)-Säule.
Fig.15 zeigt ein chromatogramm, erhalten durch Unterwerfen derjenigen Fraktion, welche Anticardiolipin-Cofaktoraktivität zeigte und erhalten worden war durch Ionenaustauschchromatographie, dargestellt in Fig. 14, einer Säulenchromatographie, unter Verwendung einer Protein-A- Sepharose -Säule.
Fig.16 zeigt ein Chromatogramm, erhalten durch Unterwerfen derjenigen Fraktion, welche Anticardiolipin-Cofaktoraktivität zeigte und erhalten worden war durch Ionenaustauschchromatographie, dargestellt in Fig.15, einer Affinitäts-Säulenchromatographie mittels einer anti-menschlichen IgG-Antikörper-konjugierten Sepharose CL-4B-Säule.
Fig.17 zeigt die Ergebnisse, die durch Unterwerfen des Anticardiolipincofaktors einer SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese erhalten worden sind.
Fig.18 zeigt ein Chromatogramm von HPLC, erhalten durch Unterwerfen des Anticardiolipincofaktors, der mit Liposom gereinigt worden war.
Fig.19 zeigt die Ergebnisse, die beim Durchführen einer ISODALT-Elektrophorese mittels der Anticardiolipincofaktor- Aktivität enthaltenden Fraktion, die mittels der Affinitäts-Säulenchromatographie mittels der in Fig.16 dargestellten, mit anti-menschlichem IgG-Antikörper konjugierten Sepharose Cl-4B-Säule erhalten worden ist.
Fig.20 ist eine graphische Darstellung, welche die Bindungsfähigkeit des konzentrationsabhängigen biotinylierten Anticardiolipincofaktors an die Cardiolipinfestphasenplatte zeigt.
Fig.21 ist eine graphische Darstellung, welche die spezifischen Bindungseigenschaften des Anticardiolipincofaktors zu Phospholipiden darstellt.
Fig.22 ist eine graphische Darstellung, welche die Abhängigkeit des Anticardiolipincofaktors vom Binden des Anti- Cardiolipinantikörpers (As-Antikörper) an die feste Phase zeigt.
Fig.23 ist eine graphische Darstellung, welche die Artspezifität des Anticardiolipincofaktors im Nachweissystem des Anti-Cardiolipinantikörpers darstellt.
Fig.24 ist ein Chromatogramm des Serums von gesunden Menschen mittels der DEAE-Cellulose-Säulenchromatographie.
Fig.25 zeigt ein Chromatogramm des Serums von gesunden Menschen mittels der Heparin-Sepharose -Säulenchromatographie.
Fig.26 zeigt ein chromatogramm des Serums von gesunden Menschen mittels der Cardiolipin-Polyacrylamidgelsäulenchromatographie.
Fig.27 zeigt den Einfluß von gereinigtem Rinder-Serumalbumin auf das Immunoassay-Verfahren der vorliegenden Erfin-
TEXT FEHLT

Beste Ausführungsform zur Durchführung der Erfindung

Im folgenden wird die Erfindung im einzelnen beschrieben.

1. Phospholipid

Das Phospholipid in der vorliegenden Erfindung kann ein Phospholipid mit einer elektronenspendenden funktionellen Gruppe an der Stelle, die sich benachbart zu seiner Phosphodiesterbindung befindet, sein. Besonders bevorzugt sind Glycerophospholipide, dargestellt durch die Formel (I):
in welcher R¹ und R² unabhängig voneinander eine Acylgruppe mit einer Alkylgruppe oder eine Alkenylgruppe in der Kohlenstoffkette davon, eine Alkylgruppe oder eine Alkenylgruppe bedeuten; R³ ein Wasserstoffatom oder eine Gruppe - (CH&sub2;)n-CHR&sup4;-R&sup5; ist; wobei R&sup4; ein Wasserstoffatom, eine Hydroxygruppe, eine Carboxylgruppe, eine Formylgruppe, eine Mercaptogruppe oder ein Halogenatom ist;und R&sup5; eine Aminogruppe, eine Hydroxyalkylgruppe oder einen Substituenten bedeutet, dargestellt durch die allgemeine Formel (II):
in welcher R¹ und R² die gleiche Bedeutung haben, wie oben beschrieben; oder R&sup4; und R&sup5; miteinander kombiniert sein können, wobei ein Zucker- oder ein Zucker-Alkoholrest gebildet wird; und n 0 oder eine ganze Zahl von 1 bis 3 ist. Die Glycerophospholipide weisen eine negative Ladung auf, und spezifische Beispiele umfassen Cardiolipin, Phosphatidylserin, Phosphatidylinosit, Phosphatidylglycerin und Phosphatidsäure.
U.a. ist Cardiolipin bevorzugt. Im allgemeinen wird Cardiolipin aus dem Herzen von Säugetieren, wie z.B. Rindern usw., oder aus einem Mikroorganismus, wie Escherichia coli usw., hergestellt, wobei das aus dem Herzen von Säugetieren hergestellte Cardiolipin bevorzugt ist.
Das Cardiolipin ist nicht auf seine ursprüngliche Zusammensetzung aus Fettsäure,auf seinen Reinigungsgrad usw. beschränkt. Das Cardiolipin kann in Form eines Salzes oder in freier Form vorliegen. Das Lösungsmittel, in welchem das Cardiolipin zwecks Bindung an einen Träger gelöst wird, muß auch kein bestimmtes Lösungsmittel sein, aber der Reinigungsgrad soll vorzugsweise vergleichbar dem oder höher als der des Reagenz sein.

2. Trägersubstanz

Als Trägersubstanz kann in vorliegender Erfindung jede Substanz ohne Einschränkung eingesetzt werden, vorausgesetzt, daß sie dazu in der Lage ist, Phospholipid zu binden, und die Immunreaktion (Antigen-Antikörper-Reaktion) bei ihrer Durchführung nicht behindert. Trägt man einer leichten BF- Abtrennung Rechnung (d.h. die Trennung des markierten Immunkomplexes und eines freien markierten Materials voneinander), dann ist es bevorzugt, daß die Trägersubstanz (Festphase) in der Reaktionslösung nicht löslich ist.
Als Materialien für die in der Reaktionslösung nicht lösliche Trägersubstanz können synthetische organische Polymere, z.B. Poly(vinylchlorid), Polystyrol, Styrol-divinylbenzolcopolymer, Styrol-Maleinsäureanhydrid-Copolymer, Nylon, Poly(vinylalkohol), Polyacrylamid, Polyacrylnitril, Polypropylen, Poly(methylmethacrylat) usw; Polysaccharide, wie Dextranderivate (Sephadex usw), Agarosegel (Sepharose , Biogel usw), Cellulose (Papierscheiben, Filterpapier usw.) u.ä.; anorganische Polymere, wie Glas, Silicagel, Silicon usw. eingesetzt werden.
In diese Materialien können funktionelle Gruppen eingeführt werden, wie eine Aminogruppe, eine Aminoalkylgruppe, eine Carboxylgruppe, eine Acylgruppe, eine Hydroxygruppe usw. Als Materialien für die Trägersubstanz werden vorzugsweise solche eingesetzt, die sich schlecht an ein Protein binden lassen. Solche Materialien sind z.B. intaktes Polystyrol, intaktes Poly(vinylchlorid) usw.
Die Trägersubstanz, die in der Reaktionslösung unlöslich ist, kann plattenförmig (Mikrotiterplatte, Scheibe usw) teilchenförmig (Perlen usw.) rohrförmig (Teströhrchen usw.), faserförmig, membranartig sein, in feinen Teilchen (Latexteilchen, usw.) vorliegen, oder kapselförmig, bläschenförmig oder liposomenartig (Mehrschicht- oder Einzelschichtlipidmembran) usw. sein. Abhängig von der Meßmethode kann der Träger in geeigneter Form gewählt werden.

3. Träger zum Binden der Antiphospholipid-Antikörper

Der Träger zum Binden der Antiphospholipid-Antikörper in vorliegender Erfindung umfaßt das genannte Phospholipid, an welches die oben beschriebene Trägersubstanz gebunden ist. Zum Binden des Phospholipids an die Trägersubstanz können bekannte Techniken angewendet werden, wie z.B. die physikalische Adsorption, die lonenbindung, die kovalente Bindung, das Einschließen usw. (siehe z.B."KOTEIKA KOSO (Immobilized Enzyme)", herausgegeben von Ichiro Chibata, veröffentlicht am 20.März 1975 von Kodansha Publishing Co.). Von diesen Methoden ist die physikalische Adsorption wegen ihrer Einfachheit bevorzugt. Das Binden des Phospholipids an die Trägersubstanz kann direkt oder durch Einführen einer weiteren Substanz zwischen die beiden Substanzen durchgeführt werden.
Zum Binden des Phospholipids an die Trägersubstanz mittels physikalischer Adsorption wird im allgemeinen eine Lösung des Phospholipids in einem organischen Lösungsmittel (wie Methanol, Ethanol, Chloroform usw., das dazu in der Lage ist, das Phospholipid zu lösen) mit der Trägersubstanz während eines geeigneten Zeitraums kontaktiert, und das organische Lösungsmittel in der Lösung wird dann bis zum Trockenzustand entfernt. Das Entfernen des Lösungsmittels durch Trocknen kann mittels bekannter Techniken erfolgen, z.B. mittels Lufttrocknen unter vermindertem Druck, mittels Luftströmung usw. Das Phospholipid kann auch durch Abtrocknen des organischen Lösungsmittels aus der Lösung des Phospholipids an die Trägersubstanz gebunden werden, wobei das Phospholipid an der Oberfläche einer anderen Substanz als der Trägersubstanz adsorbiert wird, das adsorbierte Phospholipid in einer Pufferlösung (z.B. phosphat-gepufferte Natrium-, Kalium- oder Natrium-Kalium- Salzlösung) usw. suspendiert und diese Suspension mit der Trägersubstanz während eines geeigneten Zeitraums (z.B. mehrmals 10 Minuten bis zu mehreren Stunden) bei solchen Temperaturen (z.B. 0 bis 50ºC) kontaktiert wird, daß die Reaktion nicht behindert wird und anschließend das Lösungsmittel mittels Absaugen, Dekantieren, Zentrifugieren usw. und, falls notwendig und erwünscht, durch Trocknen (Trocknen unter vermindertem Druck, Lufttrocknen usw. )entfernt wird.
Der in vorliegender Erfindung eingesetzte Träger zum Binden der Antiphospholipid-Antikörper wird vorzugsweise mit einem oberflächenaktiven Mittel allein, mit einer Kombination aus einem gereinigten Serumalbumin und einem oberflächenaktiven Mittel oder mit allen drei Substanzen, nämlich einem oberflächenaktiven Mittel, einem gereinigten Serumalbumin und einem Serum oder Plasma oder mit einer Fraktion davon, oder mit einem Protein aus der Fraktion behandelt (anschließend werden diese Materialien teilweise nur als "Behandlungsmaterialien" bezeichnet). Die Antigen-Antikörper-Reaktion zum Bilden des ersten Immunkomplexes aus dem an den Träger zwecks Bindung der Antiphospholipid-Antikörper gebunden Phospholipid und dem Antiphospholipid-Antikörper in einer Probelösung wird in Gegenwart eines Serums oder Plasmas in hoher Konzentration in der Reaktionslösung, oder in Gegenwart der Fraktion oder des Proteins, das aus dem Serum oder Plasma in vorliegender Erfindung erhalten worden ist, durchgeführt, wie später beschrieben, und zwar in einer Konzentration, die derjenigen vom Serum oder Plasma in der Reaktionslösung entspricht. In diesem Fall ist es nicht unbedingt erforderlich, den oben beschriebene Träger zum Binden der Antiphospholipid-Antikörper der vorliegenden Erfindung einzusetzen. Im vorliegenden Text bedeutet der Begriff "Behandlung" den Vorgang, in welchem diese Behandlungsmaterialien physikalisch oder chemisch an den Träger für die Bindung der Antiphospholipid-Antikörper gebunden werden, indem man diese Materialien auf den Träger wirken läßt. Im einzelnen kann eine solche Behandlung durchgeführt werden, indem nach dem Binden des Phospholipids an die Trägersubstanz der an das Phospholipid gebundene Träger mit den entsprechenden Lösungen, welche die Behandlungsmaterialien enthalten, nacheinander (unabhängig von der Reihenfolge) oder mit der Lösung, welche 2 oder 3 dieser Materialien enthält, während eines geeigneten Zeitraums (z.B. mehrmals 10 Minuten oder mehrere Stunden) bei solchen Temperaturbedingungen (z.B. 0 bis 50ºC), daß die Reaktion nicht gestört wird, kontaktiert wird. Bei der Behandlung ist die Wahl des Lösungsmittels, in welchem diese Behandlungsmaterialien gelöst werden, nicht besonders eingeschränkt, vielmehr können allgemein Pufferlösungen usw. eingesetzt werden (z.B. phosphat-gepufferte Natrium-, Kalium- oder Natrium-Kalium-Salzlösungen ). Eine solche Behandlung kann auch in Gegenwart von Zuckern (Oligosacchariden, wie Sucrose usw., Polysacchariden, wie Dextrin, Cyclodextrin, Dextran usw.; Monosacchariden u.ä.) o.ä.,der (die) zu den Behandlungslösung(en ) zugegeben wird (werden), durchgeführt werden.
Durch Einsatz des so behandelten Trägers zum Binden der Antiphospholipid-Antikörper kann das Binden des Trägers an die Antiphospholipid-Antikörper, die aus Infektionskrankheiten herstammen, zum Zeitpunkt der ersten Antigen-Antikörperreaktion (Primärreaktion) verhindert werden. Durch diese Behandlung lassen sich auch Zusatzwirkungen erzielen, z.B. das Verhindern nicht-spezifischer Adsorption ( Verhindem des Findens von Antiphospholipid-Antikörpern oder nicht markiertem Antikörper an der nicht-bindenden Stelle des Phospholipids auf der Trägersubstanz), potenzierte Bindefähigkeit der Antiphospholipid-Antikörper, die vor allem beim Antiphospholipid-Syndrom vorliegen, an das Phospholipid auf der Trägersubstanz, Stabilisierung des Phospholipids auf der Trägersubstanz usw.
Das gereinigte Serumalbumin , das bei vorliegender Erfindung eingesetzt wird, betrifft das Serumalbumin, das durch Reinigen von Tierseren, wie Rinder-, Pferde-, Hunde-, Katzen-, Ziegen-, Schaf-, Schweine-, Affen-, Kaninchen-, Ratten-, Mäuseseren oder von menschlichen Seren usw. erhalten worden ist,es weist einen höheren Reinheitsgrad auf als die Fraktion V (erhalten mittels der Cohn'schen Niedertemperaturethanol-Fraktionierung, mittels der Hitzeschockmethode, mittels Aussalzen usw.), der sich für den Zweck der vorliegenden Erfindung eignet. Das bedeutet, daß spezifische Beispiele des gereinigten Serumalbumins, die vorzugsweise eingesetzt werden, das gereinigte Serumalbumin, das durch Unterwerfen der Fraktion V einer Behandlung mit Aktivkohle, Chromatographie (Ionenaustauschchromatographie usw.) oder Kristallisation erhalten worden ist, und Serumalbumin mit einem Reinheitsgrad umfassen, der gleich dem der gereinigten Fraktion V ist, das aber mittels anderer Methoden als der erwähnten gereinigt worden ist und vorzugsweise einen verminderten Lipidgehalt aufweist.
Das Serum, Plasma, seine Fraktion oder das Protein in der Fraktion (nachstehend zusammengefaßt als "Blutkomponenten der vorliegenden Erfindung") umfaßt Serum oder Plasma als solches, hergestellt mittels bekannter Techniken aus Tierblut, ferner die Fraktion , die durch Fraktionieren von Serum oder Plasma erhalten wird bzw das Protein, welches durch weiteres Reinigen der Fraktion erhalten wird. Es ist vorzugsweise tierischen Ursprungs, wobei das Tier zu der gleichen Art gehört, wie jenes, von dem die zu untersuchende Probelösung stammt, aber es kann auch von einem artverwandten Tier sein. Die Blutkomponenten der vorliegenden Erfindung sind im Prinzip die gleichen wie diejenigen, die in der Primärreaktion zugeführt worden sind, welche später beschrieben wird
Nach dem Stand der Technik wurden an ein Phospholipid gebundene Träger mit einem Serum von Rinderföten, von einem neugeborenen Kalb, mit Rinderserumalbumin, einem oberflächenaktiven Mittel usw. behandelt. Nach diesen bekannten Verfahren war es jedoch nicht möglich, das Verbinden der Antiphospholipid-Antikörper von Infektionskrankheiten mit dem Träger zum Binden der Antiphospholipid-Antikörper zu verhindern. Außerdem ist das Rinderserumalbumin, das herkömmlicherweise eingesetzt wird, eine Fraktion V, die mittels der Cohn'schen Niedertemperatur-Ethanolfraktionierung usw. erhalten worden ist, die keinen hohen Reinheitsgrad aufweist.
Die oberflächenaktiven Mittel, die in vorliegender Erfindung eingesetzt werden, umfassen nicht-ionische, amphotere, anionische und kationische oberflächenaktive Mittel. Davon werden nichtionische oberflächenaktive Mittel bevorzugt. Spezifische Beispiele für das nichtionische oberflächenaktive Mittel sind Polyoxyethylenglykolsorbitanalkylester (z.B. das oberflächenaktive Mittel der Tween-Reihe usw.), Acylsorbitane (z.B. das oberflächenaktive Mittel der Span-Serie, der Arlace -Serie usw.), Polyoxyethylenglykolalkylphenyläther (z.B. das oberflächenaktive Mittel der Triton -Serie usw.) Sucrosefettsäureester usw.
Der Träger zum Binden der Antiphospholipid-Antikörper der vorliegenden Erfindung kann nicht nur für Immunoassayverfahren eingesetzt werden, sondern auch für verschiedene Techniken der selektiven Adsorption und des Entfernens oder Isolierens und der Reinigung der Antiphospholipid-Antikörper. Beispielsweise kann der Träger bei einer Plasmaphoresetherapie als selektives Adsorptionsmittel für die Antiphospholipid-Antikörper eingesetzt werden (siehe z.B. die japanische Offenlegungsschrift Nr. 1-68273). Der Träger der vorliegenden Erfindung kann auch als Adsorptionsmittel für Affinitätschromatographie zum Isolieren und Reinigen der Antiphospholipid-Antikörper eingesetzt werden.
Wird die Reaktion in der nachstehend beschriebenen Primärreaktion in Gegenwart von Blutkomponenten der vorliegenden Erfindung durchgeführt, dann können auch bekannte Träger zum Binden der Antiphospholipid-Antikörper anstelle des mit diesen Behandlungsmaterialien behandelten Trägers eingesetzt werden.

4. Antiphospholipid-Syndrom

Das Immunoassay-Verfahren, bei welchem der Träger zum Binden der Antiphospholipid-Antikörper der vorliegenden Erfindung eingesetzt wird, kann zum Zweck der Diagnose des Antiphospholipid-Syndroms Anwendung finden. Der Ausdruck "Antiphospholipid-Syndrom" betrifft von den Autoimmunkrankheiten (systemischer Lupus erythematodes (SLE), sich wiederholende Fehlgeburten usw.) Krankheiten, bei welchen sich Antiphospholipid-Antikörper in den Körperflüssigkeiten der Patienten befinden. Eine solche Krankheit unterscheidet sich von Infektionskrankheiten, wie tuberkulöse Meningitis, Syphilis usw., bei welchen die Antiphospholipid-Antikörper ebenfalls in Körperflüssigkeiten auftreten.
Das Immunoassay-Verfahren der vorliegenden Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß die für das Antiphospholipid- Syndrom spezifischen Antikörper von den Antiphospholipid- Antikörpern, die aufgrund von Infektionskrankheiten vorliegen, unterschieden und differenziert bestimmt werden können.

5. Immunoassay-verfahren

Das Immunoassay-Verfahren der vorliegenden Erfindung zielt auf das Bestimmen der Antiphospholipid-Antikörper ab. Solange das Verfahren die Antigen-Antikörper-Reaktion unter Einsatz des Trägers zum Binden der beschriebenen Antiphospholipid-Antikörper und/oder die Durchführung der Primärreaktion in Gegenwart der Blutkomponenten der vorliegenden Erfindung umfaßt, gehört das Verfahren zum Bereich der vorliegenden Erfindung, unabhängig davon, welche Vorgehensweisen, welche Markierungsmethode, welche markierten Substanzen, welche Träger, welche BF-Trennmethode usw. eingesetzt wurden. Techniken , die sich für den Zweck der vorliegenden Erfindung eignen, können aus herkömmlichen für das Immunoassayverfahren bekannten Techniken ausgewählt werden.
Dabei sind folgende Techniken bekannt.
Bei einer Unterteilung bezüglich der Reaktionsart der Antigen-Antikörperreaktion, sind die kompetitive Reaktionsart und die nicht-kompetitive Reaktionsart (Immunometrische Analyse) bekannt. Bei vorliegender Erfindung wird die nicht-kompetitive Reaktionsart bevorzugt.
Bei Unterteilung bezüglich der Nachweismethode gibt es die Nicht-Markierungsmethode (Nephelometrie usw.), bei welcher die Ergebnisse der Antigen-Antikörper-Reaktion direkt festgestellt werden, und das Markierungsverfahren zum Nachweis unter Verwendung von einigen Markierungsmitteln. Beide Verfahren können bei vorliegender Erfindung Anwendung finden. Bei Berücksichtigung der Empfindlichkeit usw. wird das Markierungsverfahren besonders bevorzugt. Das beim Markierungsverfahren eingesetzte Markierungsmittel wird anschließend beschrieben.
Bekannt sind das heterogene Verfahren, bei welchem eine BF- Trennung erforderlich ist, und das homogene Verfahren, bei welchen keine BF-Trennung erforderlich ist. Beide Verfahren sind für vorliegende Erfindung geeignet.
Bei Unterteilung in bezug auf die Reaktionsphase sind die Flüssigphasenmethode, bei welcher die Gesamtreaktion in der flüssigen Phase durchgeführt wird, und die Festphasenmethode, bei welcher ein Teilnehmer an der Immunreaktion in der Festphase immobilisiert und anschließend die Reaktion durchgeführt wird, bekannt. Bei vorliegender Erfindung entspricht der Fall, wo die in der Reaktionslösung lösliche Substanz als Trägersubstanz eingesetzt wird, der Flüssigphasenmethode und der Fall, wo die in der Reaktionslösung unlösliche Substanz als Träger eingesetzt wird, entspricht der Festphasenmethode.
Die Beziehung zwischen dem bekannten Immunoassay-Verfahren und der vorliegenden Erfindung wurde bereits dargestellt; allgemeine Techniken sind in den folgenden Veröffentlichungen beschrieben:
(1) "Radioimmunoassay, zweite Serie", herausgegeben von Hiroshi Irie (veröffentlicht am 1.Mai 1979 von Kodansha Publishing Co.Ltd.)
(2) "Enzyme immunoassay", herausgegeben von Eiji Ishikawa et al (zweite Ausgabe), (veröffentlicht am 15.Dezember 1982 von der Igaku Shoin Foundation)
(3) Clinical Pathology , Special Extra Issue No.53 "Immunoassay for clinical examination - Technique and its application (veröffentlicht im Jahre 1983 von Publishing Association of Clinical Pathology)
(4) "Dictionary of Biotechnology" (veröffentlicht am 9. Oktober 1986, von CMC Co.Ltd.)
(5) "Methods in Enzymology", Bd. 70 (Immunochemical Techniques (Teil A))
(6) "Methods in Enzymology", Bd.73 (Immunochemical techniques (Teil B))
7) "Methods in Enzymology", Bd.74 (Immunochemical techniques (Teil C))
8) "Methods in Enzymology", Bd.84 (Immunochemical techniques (Teil D: Selected Imunoassay))
9) "Methods in Enzymology", Bd.92 (Immunochemical techniques (Teil E:Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods))
((5) bis (9) wurde von Academic Press Co.Ltd. veröffentlicht).
Anschließend wird das Immunoassayverfahren der vorliegende Erfindung konkret beschrieben.

5.1 Probelösung

Eine Probelösung, in welcher das Vorhandensein des Antiphospholipid-Antikörpers oder dessen Konzentration mittels des Immunoassayverfahrens der vorliegenden Erfindung zu bestimmen ist (nachstehend manchmal kurz "Verfahren der vorliegenden Erfindung" genannt) ist eine Körperflüssigkeit eines Tiers oder eines Menschen. Der Ausdruck "Körperflüssigkeit" betrifft Blut, Serum, Bauchwasser, Lymphflüssigkeit, Gelenkschmiere oder eine Fraktion, die daraus erhalten worden ist, oder andere flüssige Komponenten aus einem lebenden Organismus.
Die Probelösung kann auch mit einem Verdünnungsmittel bis zu einer geeigneten Antikörperkonzentration verdünnt sein. Bevorzugte Beispiele eines solchen Verdünnungsmittels umfassen phosphat-gepufferte Salzlösung (PBS) von Natrium, Kalium oder Natrium-Kalium; Good'sche Pufferlösungen (z.B. Pufferlösungen, enthaltend Puffermittel, wie N-2-Hydroxyethylpiperazin-N'-2-ethansulfonsäure (HEPES), N- Tris(hydroxymethyl)methyl-2-aminoethanbulfonsäure (TES), 3- (N-Morpholino )propansulfonsäure (MOPS) usw), glycin-gepufferte Salzlösung, veronal-gepufferte Salzlösung, tris-gepufferte Salzlösung usw.

5.2 Stufe der ersten Antigen-Antikörper-Reaktion (Primärreaktion)

In der vorliegenden Erfindung betrifft die "Stufe der ersten Antigen-Antikörper-Reaktion" eine Stufe des Kontaktierens des Trägers zum Binden des Antiphospholipid-Antikörpers mit einer Probelösung unter Bildung eines ersten Immunkomplexes aus dem Antiphospholipid-Antikörper in der Probelösung und dem Phospholipid auf dem Träger.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung ist dadurch gekennzeichnet , daß die Reaktion unter Einsatz eines Trägers zum Binden der Antiphospholipid-Antikörper , welcher mit den oben beschriebenen Behandlungsmaterialien behandelt worden ist, und/oder in Gegenwart von Serum oder Plasma eines Tiers der gleichen Art oder einer ähnlichen Art wie das, von welchem die Probelösung abgeleitet ist, oder in Gegenwart einer Fraktion davon oder des gereinigten Proteins in der Fraktion, in der Reaktionslösung in dieser Stufe durchgeführt wird.
Mittels solcher vorgehensweisen kann das unerwünschte Verbinden der aufgrund einer Infektionskrankheit vorliegenden Antiphospholipid-Antikörper mit dem Träger zum Binden der Antiphospholipid-Antikörper verhindert werden, so daß die für das Antiphospholipid-Syndrom spezifischen Antikörper spezifisch an den Träger gebunden werden können.
Diese Stufe kann durch Kontaktieren von Körperflüssigkeiten von Patienten mit dem Antiphospholipid-Syndrom oder eines Standardreagenz, das bekannte Konzentrationen der Antiphospholipid-Antikörper enthält, als Probelösung mit dem Träger zum Binden der Antiphospholipid-Antikörper während eines geeigneten Zeitraums (z.B. mehrere 10 Minuten bis mehrere Stunden) bei solchen Temperaturbedingungen, daß die Reaktion nicht verhindert wird (z.B. 0 bis 50ºC), durchgeführt werden.
In der Primärreaktion kann das oben beschriebene gereinigte Serumalbumin zugegeben werden und die Primärreaktion kann dann durchgeführt werden. In diesem Fall wird das gereinigte Serumalbumin in einer Konzentration von nicht mehr als 5%, vorzugsweise von nicht mehr als 1% eingesetzt.
Der Träger zum Binden des Antiphospholipid-Antikörpers, an welchem der erste Immunkomplex gebildet worden ist, wird im allgemeinen mittels geeigneter Trennmethoden von der Probelösung abgetrennt, nachdem die Stufe der Primärreaktion abgeschlossen ist. Die anwendbaren Trennmethoden variieren je nach Art der eingesetzten Trägersubstanz. Wenn die in der Reaktionslösung unlösliche Trägersubstanz eingesetzt wird, dann kann der Immunkomplex mittels bekannter Techniken, wie Absaugen, Dekantieren, Filtrieren, Zentrifugieren usw. isoliert werden. Nach dem Abtrennen kann der Träger zum Binden des Antiphospholipid-Antikörpers mit einer Pufferlösung gewaschen werden usw.
Die Stufe der Primärreaktion und die Stufe der Sekundärreaktion lassen sich auch gleichzeitig durchführen. Alternativ dazu kann die Stufe der Sekundärreaktion nach der Stufe der Primärreaktion durchgeführt werden, ohne die Probelösung abzutrennen.

5.3 Fraktion und Protein

Das "Serum oder Plasma, das von einem Tier der gleichen Art, wie das, von welchem die Probelösung abgeleitet worden ist, stammt", das in der Stufe der Primärreaktion eingesetzt wird, kann jedes Serum oder Plasma sein, so lange sein Ursprung der gleiche ist (einschließlich einer ähnlichen Art), wie der der in der zu untersuchenden Probelösung enthaltenen Antiphospholipid-Antikörper seiner Körperflüssigkeit. Es wird mittels bekannter Techniken erhalten. Wenn z.B. menschliche Körperflüssigkeit zu analysieren ist, wird das Serum oder Plasma eines Menschen eingesetzt. Serum oder Plasma von gesunden Menschen ist besonders bevorzugt. Die Fraktion davon wird aus Serum (d.h. menschlichem Serum usw.) oder Plasma (d.h. menschlichem Plasma usw.) mittels bekannter Techniken zum Trennen und Reinigen (Gelfiltration (Molekularsiebchromatographie) erhalten. Hierfür eignen sich Ionenaustauschchromatographie unter Verwendung der DEAE-Zellulose usw.; Affinitätschromatographie unter Verwendung der Protein-A-Sepharose , der Heparin-Sepharose , des Cardiolipin-Polyacrylamidgels usw.; Affinitätsadsorption mittels Liposom, bestehend aus Phospholipiden, wie Cardiolipin, usw.; Membrantrennung mittels Dialyse, Ultrafiltration ,usw.; Elektrophorese; Extraktion mit einem Lösungsmittel, usw.). Dies zeigt die Wirkung der Verstärkung der Bindefähigkeit des spezifisch beim Antiphospholipid- Syndrom vorliegenden Antikörpers an das Phospholipid, das mit dem Träger verbunden ist,durch Zugabe der Fraktion zur Reaktionslösung in der Stufe der Primärreaktion gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung.
Als Fraktion des beschriebenen Serums oder Plasmas gibt es z.B. die Fraktion, die durch Unterwerfen des menschlichen Serums oder Plasmas einer Gelfiltration unter Verwendung von z.B. der Ultrogel ACA-34-Säule ( hergestellt von LKB Co.), und durch Sammeln der Fraktion mit Verstärkungswirkung in bezug auf die Bindefähigkeit der spezifisch in Seren von Patienten mit dem Antiphospholipid-Syndrom vorhandenen Antikörper an das Phospholipid erhalten wird.
Ferner gibt es eine Fraktion mit den folgenden physikalisch-chemi schen Eigenschaften:
(1) Die Fraktion enthält unter Verwendung einer Cellulosemembran (eine) nicht-dialysierbare aktive Komponente(n) mit einem Molekulargewicht mit einer Bandbreite (cut off) von 6000 bis 8000;
(2) Die Fraktion enthält (eine) aktive Komponente(n) mit einem Molekulargewicht, das ähnlich dem oder geringfügig unter dem des Albumins liegt, wenn die Fraktionierung mittels Gelfiltration oder SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese stattgefunden hat;
(3) Die Fraktion enthält (eine) aktive Komponente(n), welche sich nicht mit Protein A (verbindet) verbinden.
(4) Die Fraktion enthält (eine) aktive Komponente(n), welche mittels Chromatographie unter Verwendung eines schwach basischen Anionenaustauschers mit einer Diethylaminoethylgruppe in ähnlicher Position wie die IgG-Fraktion eluiert wird; wenn die Fraktion um die IgG-Fraktion bei der Chromatographie unter Verwendung eines schwach basischen Anionenaustauschers mit einer Diethylaminogruppe eluiert worden ist, dann wird (werden) die aktive(n) Komponente(n) mittels DEAE-Cellulosesäulenchromatographie in ähnlicher Position eluiert wie IgG (genauer gesagt etwas später als IgG),und zwar mit Eluat, 0,014 M Natriumphosphatpuffer (pH 7,4), und (5) Die Fraktion enthält (eine) aktive Komponente(n), die mit zu 30 bis 60% gesättigtem Ammoniumsulfat ausgesalzt wird (werden).
Die Konzentration des genannten Serums , des Plasmas oder dessen Fraktion oder des daraus erhalten Proteins in der Fraktion in der beschriebenen Antigen-Antikörper-Reaktionslösung, ist nicht besonders eingeschränkt, vorausgesetzt, daß sie hoch genug ist und die Wirkungen der vorliegenden Erfindung -wie beschrieben- erzielt werden können. Vorzugsweise ist die Konzentration des Serums oder Plasmas in der Reaktionslösung um das 200-fache oder mehr verdünnt, vorzugsweise liegt sie in 40-facher Verdünnung oder mehr vor, wobei das Serum oder Plasma in herkömmlicher Weise aus Blut hergestellt worden ist; im Fall der nachstehend beschriebenen Fraktion und des nachstehend beschriebenen Proteins, ist die Konzentration höher als dem genannten Verdünnungsgrad von Serum oder Plasma entspricht.
Die Anwesenheit von Serum, Plasma, dessen Fraktion oder des Proteins in der Fraktion in hoher Konzentration in der primären Reaktionslösung führt einerseits zur Verstärkung der Bindungsfähigkeit der Antiphospholipid-Antikörper, die vor allem in Seren von Patienten mit dem Antiphospholipid-Syndrom vorliegen, an das Phospholipid und andererseits zur Verhinderung der unerwünschten Reaktion zwischen den Antiphospholipid-Antikörpern, die in Seren von Patienten mit Infektionskrankheiten ,wie tuberkulöser Meningitis, Syphilis usw., vorliegen, und dem Phospholipid.
Das Protein, das die aktive Komponente in der beschriebenen Fraktion ist, kann mittels der folgenden Verfahren isoliert und als homogenes Protein gereinigt werden.
Zunächst wird das Serum oder Plasma von gesunden Menschen einer Ionenaustausch-Säulenchromatographie unter Verwendung von z.B. DEAE-Cellulose usw. unterworfen, um die Fraktion mit der aktiven Komponente zu sammeln. Die Fraktionen, welche die Bindungsfähigkeit der spezifisch in Seren von Patienten mit dem Antiphospholipid-Syndrom vorliegenden Antiphospholipid-Antikörper an das Phospholipid verstärken, werden abgetrennt.
Daraufhin wird die so erhaltene Fraktion einer Protein-A- Sepharose -Säulenchromatographie unterworfen, um in der Fraktion enthaltenes menschliches IgG zu entfernen. Die Fraktion wird ferner einer Affinitäts-Säulenchromatographie unter Verwendung einer Harzsäule unterworfen, welche durch Konjugieren des anti-menschlichen IgG-Antikörpers an z.B. Sepharose -CL-4B-Harz (hergestellt von Pharmacia Fine Chemicals) erhalten worden ist, zwecks Entfernung menschlicher IgG-Unterklassen, die von Protein A nicht adsorbiert werden.
Jede nach jeder Säulenchromatographie erhaltene Fraktion kann,falls notwendig und erwünscht, einer Dialyse in herkömmlicher Weise unterzogen werden, oder auch durch Ultrafiltration in geeigneter Weise konzentriert werden oder mit gesättigtem Ammoniumsulfat ausgesalzen werden.
Anschließend wird die gereinigte Fraktion, von welcher menschliches IgG entfernt worden ist, mit Liposom kontaktiert, um die aktive(n) Komponente(n) an Liposom(en) zu adsorbieren, wodurch die aktive(n) Komponente(n) gereinigt wird (werden). Die (das) hier eingesetzte(n) Liposom(e) sind Liposome, die aus dem in Formel (I) dargestellten Phospholipid, wie Cardiolipin, Phosphatidylserin, Phosphatidylinosit, Phosphatidsäure usw. oder einem Liposom bestehen, das das Phospholipid als einen Bestandteil enthält.
Die Liposome können in herkömmlicher Weise hergestellt werden (Procedures for Immunological Experiment IX, Seiten 2989-2994, veröffentlicht am 4.Dezember 1980 von der Japanese Society of Immunology). Cardiolipinliposome können z.B. hergestellt werden, indem man eine Alkohollösung von Cardiolipin in einem birnenförmigen Kolben nimmt,diese unter vermindertem Druck bis zur Trockne verdampft, eine geeignete Pufferlösung zum Rückstand gibt und die Mischung mit einem Vortex-Mixer heftig rührt.
Die die aktive Komponente enthaltende Fraktion wird zu einer Pufferlösung, enthaltend Liposome, gegeben, um die aktive Komponente an den Liposomen zu adsorbieren. Daraufhin wird eine Suspension der Liposome, an welchen die aktive Komponente adsorbiert ist, einer Zentrifugation unterworfen. Aus dem resultierenden Überstand wird die gereinigte aktive Komponente gewonnen. Die aktive Komponente kann durch Unterwerfen einer Chromatograhie, wie HPCL usw. weiter gereinigt werden.
Die so erhaltene gereinigte aktive Komponente weist die folgenden physikalisch-chemischen Eigenschaften auf:
(1) Bei Bestimmung durch SDS-Polyacrylamidgelelectrophorese, beträgt das Molekulargewicht der Komponente 50000 ± 2000 und ihr isoelektrischer Punkt liegt bei 6,60 ± 0,4;
(2) Das Protein ist dazu in der Lage,sich an das Phospholipid zu binden.
Vor allem weist die aktive Komponente spezifische Bindungsfähigkeit in bezug auf das Phospholipid, wie Cardiolipin, mit einer negativen Ladung auf.
Ferner werden der spezifisch beim Antiphospholipid-Syndrom vorliegende Antikörper , z.B. der Anti-Cardiolipinantikörper bei Patienten mit Autoimmunkrankeiten, und das an den Träger gebundene Cardiolipin miteinander umgesetzt, wobei die Dosis in Abhängigkeit von der aktiven Komponente bestimmt wird.
(3) Die aktive Komponente hat eine Hemmwirkung auf die Bindung der Antiphospholipid-Antikörper an das Phospholipid, die aufgrund von Infektionskrankheiten vorliegen, wie aufgrund von tuberkulöser Meningitis, Syphilis usw.
Auf der Grundlage dieser Eigenschaften geht man davon aus, daß in dem Fall, wo die beschriebene aktive Komponente zu dem Reaktionssystem zugegeben wird, das an den Träger gebundenes Cardiolipin und den spezifisch beim Antiphospholipid-Syndrom vorhandenen Antikörper enthält, die aktive Komponente mit an den Träger gebundenem Cardiolipin unter Bildung eines Komplexes reagiert und der für das Antiphospholipid-Syndrom spezifische Antikörper sich mit dem Komplex verbindet.
Da die aktive Komponente die beschriebenen Eigenschaften (2) und (3) aufweist, kann das System bei Einsatz der aktiven Komponente(n) die Antikörper, die vom Antiphospholipid- Syndrom stammen, von den Antikörpern, die aufgrund von Infektionskrankheiten vorliegen, wie nachstehend beschrieben, unterscheiden. Auch wenn Serum oder Plasma oder dessen Fraktion in hoher Konzentration in der Reaktionslösung vorliegen, werden die gleichen beschriebenen Wirkungen erzielt.
Durch zusätzliches Zugeben des Proteins der aktiven Komponente, das nach vorliegender Erfindung in der ersten oben beschriebenen Antigen-Antikörper-Reaktion erhalten wird, kann der spezifisch in den Seren von Patienten mit dem Antiphospholipid-Syndrom vorliegende Antikörper in unterscheidender Weise erkannt werden.

5.4. Stufe der zweiten Antigen-Antikörper-Reaktion (Sekundärreaktion)

Die "Stufe der zweiten Antigen-Antikörper-Reaktion (Sekundärreaktion)" in vorliegender Erfindung betrifft eine Stufe des Umsetzens des ersten Immunkomplexes mit dem markierten Anti-Immunglobulin-Antikörper zwecks Bildung eines Sandwich-Imunkomplexes, der aus dem ersten Imunkomplex und dem markierten Anti-Immunglobulin-Antikörper besteht.
Der markierte Anti-Imunglobulin-Antikörper, der in dieser Stufe eingesetzt wird, ist ein Anti-Imunglobulin-Antikörper, der mit einem geeigneten Markierungsmittel entsprechend einer Nachweismethode, die nachstehend beschrieben wird, markiert ist.
Der im vorliegenden Fall verwendete Anti-Immunglobulin-Antikörper kann jeder Antikörper sein, der dazu in der Lage ist, den zu analysierenden Antiphospholipid-Antikörper oder dessen Fragment zu binden, und es besteht keine Einschränkung in bezug auf seine Herkunft oder das Verfahren zu seiner Herstellung.
Verschiedene Unterklassen (d.h. IgG, IgM, IgA usw.) der Antiphospholipid-Antikörper sind in Körperflüssigkeiten beobachtet worden. Daher kann der geeignete Anti-Immunglobulin- Antikörper (d.h. der Anti-IgG-Antikörper, Anti-IgM-Antikörper, Anti-IgA-Antikörper usw.) je nach Anwendungszweck gewählt werden. Ist der zu analysierende Antiphospholipid-Antikörper menschlichen Ursprungs, dann wird selbstverständlich ein anti-menschlicher Immunglobulin-Antikörper eingesetzt.
Ein solcher Anti-Immunglobulin-Antikörper kann in herkömmlicher Weise hergestellt werden. Er kann durch ein Verfahren erhalten werden, welches das Verabreichen von Immunglobulin, das von einem Tier der gleichen Art erhalten worden ist, wie das, von welchem der zu untersuchende Antiphospholipid-Antikörper stammt, an ein Tier zwecks Immunisierung des Tiers und das Isolieren und Reinigen des Anti-Immunglobulin-Antikörpers aus dem Serum des Tiers umfaßt. Er kann auch durch ein Verfahren erhalten werden, welches dazu dient, Antikörper bildende Zellen ( wie z.B. Milzzellen, Lymphknotenzellen, periphere Blutlymphozyten usw.) des Tiers in herkömmlicher Weise, wie z.B. mittels des Hybridomverfahrens, des Transformationsverfahrens (mit dem EB- Virus usw.) o.ä. (siehe z.B. Eur.J.Immunol.,6,511 (1976) dazu zu bringen, sich semipermanent zu vermehren, und das Züchten der Zellen in vitro oder in vivo und das Reinigen des Antikörpers von dem Kulturmedium umfaßt. Diese Anti-Immunglobulin-Antikörper sind im Handel erhältlich, und solche Antikörper, welche für jeden Fachmann leicht zugänglich sind, lassen sich beim Verfahren der vorliegenden Erfindung einsetzen.
Außerdem kann das Antikörpermolekül auch als solches als Anti-Immunglobulin-Antikörper eingesetzt werden, oder es kann mittels Proteinase (z.B. Papain, Pepsin, usw.) in Antikörper-Fragmente (F(ab')2, Fab', usw. )aufgespalten und dann in vorliegender Erfindung eingesetzt werden.
Es besteht keine Einschränkung in bezug auf das zur Markierung des Anti-Immunglobulin-Antikörpers eingesetzte Markierungsmittel, vorausgesetzt, daß das Markierungsmittel in der Nachweisstufe richtig funktioniert. Der Anti-Immunglobulin-Antikörper kann z.B. mit einem herkömmlichen Markierungsmittel, wie mit Radioisotopen (¹²&sup5;I,¹³¹I,³H, ¹&sup4;C usw.), Enzymen (Peroxidase, β-Galactosidase, alkalische Phosphatase, Glucoseoxidase, Glutamatoxidase, Glucose-6- phosphat-dehydrogenase, Lysozym, Glucoamylase, Acetylcholinesterase, Maleatdehydrogenase usw.), wobei solche von einem Ligand-Rezeptor-Paar in einem lebenden Körper vorliegen (Biotin, Avidin, Streptoavidin usw.), Coenzymen, Cofaktoren (FAD, FMN, ATP usw.), fluoreszierenden Substanzen (Fluoresceinisothiocyanat (FITC), Europium, Phycoerythrin , usw.), lumineszierenden Substanzen (Luminolderivaten usw.), Markierungsmitteln für Elektronenspinresonanz (ESR) (Piperidin-1-N-oxylverbindungen, Pyrrolidin-1-N-oxyl-Verbindungen usw.), Liposomen (enthaltend Markierungsmittel, wie Enzyme, fluoreszierende Substanzen, lumineszierende Substanzen, usw.) u.ä. (siehe oben beschriebene Veröffentlichungen (1), (2) und (4)) markiert werden.
Das Markieren des Anti-Imunglobulin-Antikörpers mit diesen Markierungsmitteln kann auch mittels bekannter Methoden vor sich gehen. Beispielsweise ist bei Einsatz eines Radioisotopen als Markierungsmittel die Chloramin-T-Methode, die Enzymmethode unter Verwendung von Lactoperoxidase usw., die Bolton-Hunter-Methode usw. geeignet (Veröffentlichung (1), wie beschrieben). Wird ein Enzym als Markierungsmittel eingesetzt, dann kann das Markieren gemäß der Maleimido-Vernetzungsmethode (unter Verwendung von z.B. Succimidyl-6- maleimidohexanoat (EMCS)), gemäß der Glutaraldehyd-Vernetzungsmethode, der Perjodsäure-Vernetzungsmethode (Nakane- Methode), der Isocyanat-Vernetzungsmethode (unter Verwendung von z.B. Isocyanaten (2,4,Tolylendiisocyanat usw.) oder von Isothiocyanaten), oder gemäß der Benzochinon-Vernetzungsmethode (siehe Veröffentlichung (1) und (2) supra). durchgeführt werden.
Im Fall, daß die Stufe der Sekundärreaktion unabhängig von der Stufe der Primärreaktion durchgeführt wird, kann die Reaktion durch Kontaktieren des Trägers zum Binden des Antiphospholipid-Antikörpers, an welchem der erste Immunkomplex gebildet ist, mit einer Lösung, enthaltend den markierten Anti-Immunglobulin-Antikörper (in einer Pufferlösung usw.) während eines geeigneten Zeitraums (z.B. mehrmals 10 Minuten bis zu mehreren Stunden) bei einer solchen Temperatur, daß die Reaktion nicht gehemmt wird, (z.B. bis 50ºC) durchgeführt werden.
Wird die Sekundärreaktion gleichzeitig mit oder im Anschluß an die Stufe der Primärreaktion durchgeführt, ohne die Reaktionslösung zu isolieren, dann kann der markierte Anti- Immunglobulin-Antikörper während oder nach Abschluß der Primärreaktion in der Reaktionslösung vorliegen.

5.5. Stufe der BF-Trennung

Die Stufe der BF-Trennung im Verfahren der vorliegenden Erfindung ist eine Stufe der Abtrennung der Phase, welche den in der Stufe der Sekundärreaktion gebildeten Sandwich-Immunkomplex enthält, von der Phase, welche die nicht an den Träger gebundenen Substanzen enthält.
Wird das Verfahren der vorliegenden Erfindung mittels eines homogenen Verfahrens durchgeführt, dann ist diese Stufe nicht notwendig, aber im Fall eines heterogenen Verfahrens ist die BF-Trennung unbedingt erforderlich.
Wenn eine in der Reaktionslösung nicht lösliche Trägersubstanz eingesetzt wird, dann kann diese Stufe mittels herkömlicher Trenntechniken, wie Absaugen, Dekantieren, Filtrieren, Zentrifugieren usw. erfolgen.
Der Träger kann nach dem Arbeitsgang der Trennung, wie oben beschrieben, oder gleichzeitig mit diesem mit einer Pufferlösung gewaschen werden (PBS usw.)

5.6 Nachweisstufe

Die "Stufe des Nachweises" beim Verfahren der vorliegenden Erfindung betrifft eine Stufe zum Nachweis des Markierungsmittels des markierten Anti-Immunglobulin-Antikörpers, der in dem Sandwich-Immunkomplex enthalten ist, welcher in der oben beschriebenen Stufe der BF-Trennung abgetrennt worden ist, oder zum Nachweis des Markierungsmittels des markierten Anti-Immunglobulin-Antikörpers, welcher den Komplex nicht gebildet hat, im Fall des heterogenen Verfahrens. Das Nachweis kann quantitativ oder qualitativ sein.
Die Stufe des Nachweises kann mittels jeglicher bekannter Technik durchgeführt werden, vorausgesetzt, daß diese dem eingesetzten Markierungsmittel entspricht (siehe, Veröffentlichungen (1) bis (9) supra). Wenn z.B. das Radioisotop als Markierungsmittel eingesetzt wird, dann wird dessen Nachweis unter Einsatz eines Strahlungsintensitätsmessers durchgeführt und wenn das Enzym als Markierungsmittel eingesetzt wird, dann wird die Enzymaktivität auf herkömmliche Weise festgestellt, wie sie zur Bestimmung der Aktivität des eingesetzten Enzyms üblich ist.
Nachstehend wird die Bestimmung der Enzymaktivität bei Verwendung von Peroxidase als Markierungsmittel beschrieben.
Die Aktivität von Peroxidase kann mittels verschiedener Methoden zum Feststellen des Elektronentransfers bei der Zersetzung von Wasserstoffperoxid als Substrat zu Wasser ermittelt werden. Das heißt, daß für die Bestimmung bekannte Techniken angewendet werden können, z.B. die Bestimmung einer Änderung der Extinktion aufgrund der Oxidation eines Chromogens, die Bestimmung einer Anderung des Redoxpotentials mittels Elektroden usw. Die Methode unter Verwendung eines Chromogens ist die üblicherweise angewendete Methode. Als Chromogen können bekannte Verbindungen, wie z.B. Tetraalklybenzidine (3,3'-5,5'-Tetramethylbenzidin (TMBZ) usw.), o-Phenylendiamin (OPD), 2,2'-Azino-di-(3-ethyl)-benzothiazolinsulfonat (6) (ABTS), o-Dianisidin, Dicarboxidin, 3,31'- Diaminbenzidin usw. (siehe z.B. japanische Veröffentlichung Nr. 62-502653 (W086/04610) eingesetzt werden.
Die Bestimmung der Peroxidase-Aktivität unter Verwendung eines Chromogens kann durch Zugabe einer Lösung, welche Wasserstoffperoxid und ein Chromogen (vorzugsweise eine Lösung in einem Puffer (Citratpuffer, Tartratpuffer, PBS, usw.) enthält, zu einer der Phasen, die mittels BF-Trennung abgetrennt worden sind, durch Umsetzen derselben während eines geeigneten Zeitraums (z.B. einige Minuten bis zu einigen Stunden) bei normaler Temperatur (z.B. Raumtemperatur), unter Beenden der Reaktion durch Zugabe einer Lösung zur Beendigung der Enzymreaktion (Stoppreagenz: z.B. Schwefelsäure) und durch anschließendes Messen der Extinktion (im Fall von TMBZ, Extinktion bei 450 nm) erfolgen. Die quantitative Bestimmung des Antiphospholipid-Antikörpers in der Probelösung kann durch Vergleichen der Standardkurve (welche die Beziehung zwischen Extinktion und einer Konzentration des Antikörpers (oder Antikörpertiters) zeigt), welche unter Einsatz eines Standardreagenz, enthaltend eine bekannte Konzentration von Antiphospholipid-Antikörper, dem Serum oder Plasma eines Tiers der gleichen oder einer ähnlichen Art wie das, aus welchem die Probelösung gewonnen worden ist, dessen Fraktion oder das Protein in der Fraktion zugegeben worden ist, mit der gemessenen Extinktion erfolgen.

5.7 Differenzierender Nachweis

Der differenzierende Nachweis von Antiphospholipid-Antikörpern, die aufgrund des Antiphospholipid-Syndroms einerseits und aufgrund von Infektionskrankheiten andererseits vorliegen, welche in Gegenwart von Serum oder Plasma in hoher Konzentration, oder in Gegenwart von dessen Fraktion oder der aktiven Komponente Protein in der Fraktion in einer Konzentration, die der Konzentration von Serum oder Plasma entspricht, in der Reaktionslösung bestimmt werden, wird wie folgt durchgeführt.
Bei dem System, in welchem die Primärreaktion in Gegenwart von Serum, Plasma oder dessen Fraktion oder der aktiven Komponente Protein in der Fraktion in einer Konzentration, wie oben beschrieben, in der Reaktionslösung durchgeführt wird, und bei dem System, in welchem die Primärreaktion in Abwesenheit dieser Blutkomponenten durchgeführt wird, wird die Stufe der Antigen-Antikörper-Reaktion (Primärreaktion), jeweils wie oben beschrieben, durchgeführt. Wenn die Reaktivität des Antiphospholipid-Antikörpers mit dem an den Träger gebundenen Phospholipid in Abhängigkeit von der Gegenwart dieser Blutkomponenten nach vorliegender Erfindung potenziert wird, dann kann man daraus schließen, daß die Antiphospholipid-Antikörper aufgrund des Antiphospholipid- Syndroms vorliegen. Wenn die Reaktivität in Abhängigkeit von der Gegenwart dieser Blutkomponenten nach vorliegender Erfindung abnimmt, dann kann man wiederum daraus schließen, daß die Antiphospholipid-Antikörper aufgrund von Infektionskrankheiten vorliegen.

6. Ausstattung

6.1. Ausstattung (6)

Die Ausstattung, welche bei dem gemäß der Ausführungsform (4) der vorliegenden Erfindung angewandten Immunoassay-Verfahren eingesetzt wird, umfaßt als Bestandteile die Reaktanden von mindestens (A) bis (C), wie oben beschrieben.
Als konstituierender Reaktand (A) :"Träger zum Binden der Antiphospholipid-Antikörper", werden u.a. die in Abschnitt "3. Träger zum Binden des Antiphospholipid-Antikörpers" dargestellten Träger eingesetzt,d.h. der Träger, der unter Verwendung von 2 Komponenten , nämlich der gereinigten Serumalbumine und oberflächenaktiven Mittel behandelt worden ist, und der Träger, der mit 3 Komponenten, nämlich den gereinigten Serumalbuminen, dem oberflächenaktiven Mittel und dem Serum oder Plasma, das von einem Tier der gleichen oder einer ähnlichen Art stammt, wie das , von welchem die Probelösung abgeleitet worden ist, oder dessen Fraktion oder dem Protein in der Fraktion behandelt worden ist. Als konstituierender Reaktand (B): "markierter Anti-Immunglobulin-Antikörper", können solche Reaktanden eingesetzt werden, die in Abschnitt "5.4 Stufe der zweiten Antigen-Antikörper-Reaktion (Sekundärreaktion)" beschrieben worden sind. Der konstituierende Reaktand (C): "Eine Verdünnungsmittelprobe, die mit dem Serum oder Plasma, das von der gleichen oder einer ähnlichen Tierart abgeleitet worden ist wie die Probelösung", angereichert worden ist, ist eine Lösung, die dazu dient, eine zu analysierende Probelösung oder Standardlösung, falls notwendig, zu verdünnen; aus den gleichen dargestellten Gründen werden die Blutkomponenten der vorliegenden Erfindung zugegeben.
Außer den beschriebenen konstituierenden Reaktanden kann (können), falls notwendig und erwünscht, auch das Standardreagenz oder die Standardreagentien zum Nachweis des Markierungsmittels zur Ausstattung (6) gemäß der vorliegenden Erfindung zugegeben werden. Ein Beispiel für das Standardreagenz ist das Reagenz, welches den Antiphospholipid-Antikörper in einer bekannten Konzentration enthält, und zu welchem die Blutkomponenten der vorliegenden Erfindung, falls notwendig, zugegeben worden sind. Im allgemeinen ist das Standardreagenz eine Lösung, enthaltend die Antiphospholipid-Antikörper, die von Patienten mit dem Antiphospholipid-Syndrom isoliert worden sind, welches serienweise verdünnt ist, falls notwendig, und zu welchem die Blutkomponenten der vorliegenden Erfindung, falls notwendig, aus den in Abschnitt "5.2 Stufe der ersten Antigen-Antikörper-Reaktion (Primärreaktion)" genannten Gründen, zugegeben worden sind. Als Reaktanden zum Nachweis für das Markierungsmittel werden bevorzugt Reaktanden zum Bestimmen der Enzymaktivität zugegeben, falls notwendig, wenn die Ausstattung für das Verfahren der Enzym-Immunanalyse vorgesehen ist, d.h., wenn sie das Substrat der Enzymreaktion und den Indikator für die Reaktion (z.B. das Chromogen, wie in "5.6. Nachweisstufe ") umfaßt. Eine Lösung zum Beenden der Enzymreaktion (Stoppreagenz:z.B. eine Schwefelsäure enthaltende Lösung) kann ebenfalls zugegeben werden.

6.2 Ausstattung (7)

Die Ausstattung (7) für das im oben beschriebenen Verfahren (5) der vorliegenden Erfindung eingesetzte Immunoassay-Verfahren umfaßt die konstituierenden Reaktanden von mindestens (A') bis (C), wie oben dargestellt. Falls notwendig und erwünscht, können wie bei Ausstattung (6) ein Standardreagenz oder Standardreagentien zum Nachweis des Markierungsmittels zugegeben werden.
Das konstituierende Reagenz (A') ist unter den in Abschnitt "3.Träger zum Binden des Antiphospholipid-Antikörpers" genannten Reagentien dasjenige, welches mit dem oberflächenaktiven Mittel allein behandelt worden ist. Die weiteren konstituierenden Reagentien sind die gleichen, wie in Abschnitt 6.1 beschrieben.

6.3 Ausstattung (14)

Die für das vorstehend in (12) beschriebene Imunoassay- Verfahren verwendete Ausstattung enthält als eines der konstituierenden Reagentien das Serum oder Plasma oder die genannte Fraktion oder das Protein in der Fraktion in geeigneter Konzentration, wie es im einzelnen in der genannten Erklärung der Primärreaktion beschrieben ist. Zum Binden des Antiphospholipid-Antikörpers kann jeder herkömmlicherweise eingesetzte Träger verwendet werden und natürlich auch der beschriebene Träger zum Binden des Antiphospholipid-Antikörpers nach vorliegender Erfindung. Weitere herkömmlicherweise eingesetzte konstituierende Reagentien können ebenfalls als solche eingesetzt werden.

Beispiele

Die vorliegende Erfindung wird nun anhand von Beispielen unter Bezugnahme auf diese und auf ein Bezugsbeispiel näher erläutert.

Bezugsbeispiel

Nachstehend werden herkömmliche Verfahren nach dem Stand der Technik und ein Beispiel für eine Analyse mittels dieser Verfahren erläutert.
Eine Ethanollösung von 50 µg/ml Cardiolipin aus einem Rinderherz (hergestellt von der Firma Sigma Co.Ltd.) wird in jede Vertiefung einer mit 96 Vertiefungen versehenen Mikrotiterplatte (Polystyrol; hergestellt von Titertech Co.Ltd.) in einer Menge von 50 µl pro Vertiefung eingefüllt. Unter vermindertem Druck wird das Ethanol in der Vertiefung aufgetrocknet. Nach dem Auftrocknen wird phosphat-gepufferte Salzlösung (PBS) (pH-Wert 7,4), enthaltend 10% eines Serums eines Rinderfötus (nachstehend kurz PBS-FBS genannt) in jede Vertiefung in einer Menge von 250 µl pro Vertiefung gegeben, um diese zu blockieren. Nach dem Blockieren bei Raumtemperatur während 1 Stunde werden alle Vertiefungen 3 mal mit 250 µl PBS, enthaltend 0,05% (V/V) Tween 20 (Warenzeichen, hergestellt von Kishida Chemical Co.Ltd.) (nachstehend als PBS-Tween abgekürzt) gewaschen. Anschließend werden 100 µl Probelösung (Serum), die mit PBS-FBS in angemessener Weise verdünnt worden ist, in jede Vertiefung gegeben. Die Reaktion wird bei Raumtemperatur während eines Zeitraums von 1 Stunde durchgeführt und dann wird die Vertiefung 5 mal mit 250 µl PBS-Tween gewaschen. Es werden jeweils 100 µl eines mit Meerrettich-Peroxidase markierten antimenschlichen IgG-Antikörpers in jede Vertiefung gegeben. Die Reaktion wird bei Raumtemperatur während 1 Stunde durchgeführt, und dann wird die Vertiefung 5 mal mit PBS-Tween gewaschen. Nachdem 100 µl Substratlösung (0,3 mM Lösung von 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin (TMBZ), enthaltend 0,003% Wasserstoffperoxid) in jede Vertiefung gegeben worden sind, wird die Enzymreaktion bei Raumtemperatur während eines Zeitraums von 15 Minuten durchgeführt. Die Reaktion wird durch Zugabe von 100 µl eines Stoppreagenz (2 N Schwefelsäurelösung) beendet, und dann wird die Extinktion bei 450 nm gemessen. Die Ergebnisse sind in Fig.1 (A) gezeigt. Der eingesetzte enzymmarkierte Antikörper wurde durch Markieren von monoklonalem antimenschlichem IgG-Antikörper der Maus (G-02, IgG-Klasse; hergestellt von Yamasa Shoyu Co.Ltd.) mit Meerrettichperoxidase gemäß der Penodsäure-Vernetzungsmethode hergestellt. Das im vorliegenden Fall als Probelösung eingesetzte Serum (nachstehend As-Serum genannt) ist ein Serum, das aus Patienten mit dem typischen Antiphospholipid-Syndrom (wiederholt Fehlgeburten in SLE) gewonnen worden ist; das im vorliegenden Fall als Probelösung eingesetzte Ya-Serum ist ein Serum (nachstehend Ya-Serum genannt), das aus Patienten mit tuberkulöser Meningitis ohne Symptome des Antiphospholipid-Syndroms gewonnen worden ist. Wie in Fig.1 (A) dargestellt, war es nicht möglich, den Antikörper im As-Serum (nachstehend As- Antikörper genannt) vom Antikörper im Ya-Serum (nachstehend Ya-Antikörper genannt) bei Anwendung des herkömmlichen Verfahrens mit Verwendung eines Serums von einem Rinderfötus (FBS) in der Primärreaktion zu unterscheiden.

Beispiel 1

Nachweis des für das Antiphospholipid-Syndrom spezifischen Antikörpers durch Zugabe von Seren gesunder Menschen

(1) Herstellung eines Trägers zum Binden des Antiphospholipid-Antikörpers

Der Träger zum Binden des Antiphospholipid-Antikörpers wurde durch die beiden folgenden Methoden hergestellt.

Methode (I)

Eine Ethanollösung von 50 ug/ml Cardiolipin aus einem Rinderherz (hergestellt von der Firma Sigma Co.Ltd.) wird in jede Vertiefung einer mit 96 Vertiefungen versehenen Mikrotiterplatte (Polystyrol; hergestellt von Titertech Co.Ltd.) in einer Menge von 50 µl pro Vertiefung eingefüllt. Unter vermindertem Druck wurde das Ethanol in der Vertiefung aufgetrocknet. Nach dem Auftrocknen wurde PBS (pH-Wert 7,4), enthaltend 1% (W/V) gereinigtes Rinder-Serumalbumin (hergestellt von Sigma Co., Ltd.; Nr. 7511, frei von Fettsäuren, nachstehend kurz pBSA genannt) (nachstehend als PBS-pBSA abgekürzt) in einer Menge von 250 µl pro Vertiefung in jede Vertiefung gegeben. Nach dem Behandeln mit PBS-pBSA bei 4ºC während eines Zeitraums von 1 Stunde wird die Vertiefung 3 mal mit 250 µl PBS, enthaltend 0,05% (V/V) Tween 20 (PBS-Tween) gewaschen, um den Träger zum Binden des Antiphospholipid-Antikörpers der vorliegenden Erfindung zu erhalten.

Methode (II)

Eine Ethanollösung von 500 µg/ml Cardiolipin aus einem Rinderherz (hergestellt von der Firma Sigma Co.Ltd.) wurde in ein Teströhrchen aus Glas gegeben. Nach dem Auftrocknen unter vermindertem Druck wurde PBS zugegeben und Cardiolipin darin suspendiert, zwecks Erhalt einer Cardiolipin-Suspension. Diese Cardiolipin-Suspension wurde in jede Vertiefung einer mit 96 Vertiefungen versehenen Mikrotiterplatte (Polystyrol; hergestellt von Titertech Co.Ltd.) in einer Menge von 50 µl pro Vertiefung eingefüllt. Nach dem Umsetzen bei 4ºC während einer Stunde wurde die Suspension abgesaugt. Anschließend wurde nach dem gleichen Schema wie bei Methode (I) vorgegangen, um den Träger zum Binden des Antiphospholipid-Antikörpers der vorliegenden Erfindung zu erhalten.

(2) Bestimmung des Antiphospholipid-Antikörpers

Es werden die gleichen Seren von Patienten (d.h. As-Serum und Ya-Serum) wie im Bezugsbeispiel mit PBS-pBSA, enthaltend 5% menschliches Serum von gesunden Personen, verdünnt. Jedes verdünnte Serum wird in jede der vorher in Methode (I) und (II) vorbereiteten Vertiefungen der mit cardiolipingebundenen Titerplatten in einer Menge von 100 µl pro Vertiefung eingefüllt, woraufhin bei 4ºC 1 Stunde lang umgesetzt wird. Die Vertiefung wird 5 mal mit 250 µl PBS- Tween gewaschen. Die anschließenden Arbeitsgänge werden wie im Bezugsbeispiel durchgeführt und die Extinktion wird gemessen (Verfahren der vorliegenden Erfindung). Unter Verwendung der durch Methode (1) hergestellten Platte wird das gleiche Verfahren durchgeführt, wie oben beschrieben, mit der Abänderung, daß die Primärreaktion durch Zugabe von pBSA zur Reaktionslösung durchgeführt wird und dann die Extinktion bestimmt wird (Vergleichsbeispiel). Die mittels der entsprechenden Methoden erhaltenen Ergebnisse sind durch Verdünnungskurven dargestellt. Fig.1 (B) zeigt die Ergebnisse des Vergleichsbeispiels, Fig.1(C) zeigt die Ergebnisse, die gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung unter Einsatz der durch Methode (I) hergestellten Platte erhalten worden sind, und Fig.2 zeigt die Ergebnisse, die gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung unter Verwendung der durch Methode (II) hergestellten Platte erhalten worden sind.
Wie aus Fig.1 (B) ersichtlich ist, wird die Bindungsfähigkeit des Anticardiolipin-Antikörpers (Ya-Antikörper) in Ya- Serum erheblich reduziert ( auf ca.20%), wenn ein gewisser Teil des im Handel erhältlichen gereinigten Serumalbumins (pBSA) vom Rind durch Rinderfötus-Serum (FBS) ersetzt wird, wie es im Primärreaktionssystem im Bezugsbeispiel eingesetzt wird. Auch in bezug auf den As-Antikörper wird das Verschwinden der Bindungsfähigkeit bei einer Probe mit hohem Verdünnungsgrad (nämlich einer 200-fachen oder noch stärkeren Verdünnung) in diesem Fall beobachtet. Durch weitere Zugabe von Serum (ca. 5%) von gesunden Menschen zum Basisanalysesystem, wie es im Vergleichsbeispiel eingesetzt wird, in welchem pBSA in der Primärreaktion zugegeben wird, wird nur der As-Antikörpertiter auf beinahe den gleichen Wert wiederhergestellt wie nach dem Verfahren des Standes der Technik (Bezugsbeispiel) unter Verwendung von FBS. Was den Ya-Antikörpertiter betrifft, wird festgestellt, daß er völlig verschwunden ist.
Durch Variieren der Konzentration von Seren von gesunden Menschen, die in der Primärreaktion zugegeben werden, wird die Reaktion wie oben beschrieben durchgeführt, um den Antikörpertiter des As-Serum zu bestimmen. Vor allem wenn das Serum von gesunden Menschen in einer Konzentration entsprechend einer Verdünnung von 1:40 oder mehr zugegeben wird, wird eine ausreichende Extinktion erhalten (Fig.3). Die analysierten Proben sind As-Seren von 24 Einheiten (24 U) und 12 Einheiten (12 U) (gemäß der standardisierten Einheit nach Harris et al).

Beispiel 2

Nachweis des für das Antiphospholipid-Syndrom spezifischen Antikörpers durch Zugabe der Fraktion von Seren von gesunden Menschen

Seren von gesunden Menschen werden durch Gelfiltration fraktioniert und jede Fraktion wird in der Primärreaktion zur Reaktionslösung gegeben. Als cardiolipin-gebundene Platte wird die in Beispiel 1 durch Methode (I) hergestellte Platte eingesetzt. Die Verfahren werden wie in Beispiel 1 durchgeführt, mit der Abänderung, daß die Seren von gesunden Menschen durch die mittels Gelfiltration erhaltene Fraktion des Serums ersetzt werden. Oann wird die Extinktion (450 nm) als Index für den Antikörpertiter gemessen. Die Fraktion des Serums von gesunden Menschen wird erhalten, indem man 3 ml Serum von gesunden Menschen mit einer Ultrogel ACA-34 -Säule (hergestellt von LKB Co.Ltd.) gelfiltriert, die zuvor ins Gleichgewicht eingestellt worden ist, und dann jeweils auf 2ml fraktioniert. Fig. 4 zeigt die Beziehung zwischen dem Muster der Gelfiltration mittels Ultrogel ACA-34 und der Extinktion (450 nm) von As-Serum und Ya-Serum als Index für den Antikörpertiter, der durch die beschriebenen Verfahren erhalten worden ist. Die Ergebnisse zeigen, daß die Komponente (nachstehend manchmal als aktive Komponente bezeichnet), welche die Bindungsfähigkeit des As-Antikörpers an den Träger verstärkt und die Bindungsfähigkeit des Ya-Antikörpers an den Träger aufhebt, in der zweiten Peak-Fraktion der 3 Absorptions-Peaks bei 280 nm in Fig.4 vorliegt. Die Fraktion enthält auch Serumalbumin. Solche Wirkungen sind jedoch in gereinigtem menschlichem Serumalbumin als solchem nicht festgestellt worden und dadurch ist bestätigt, daß die Wirkungen nicht auf dem Serumalbumin beruhen.
Außerdem werden Seren von gesunden Menschen mittels Gelfiltration nach HPLC unter Verwendung der G2000SW-Säule (0,75 x 30 cm)(hergestellt von Toso Co.Ltd.) fraktioniert. Die Fraktion, welche die aktive Komponente (aktiver Peak) enthält, erscheint in der Nähe der Serumalbuminfraktion und wird auf der Seite mit dem geringfügig niedrigeren Molekulargewicht eluiert (Fig.5).
Anschließend werden Seren von gesunden Menschen gegen 1 M Tris-Hydrochloridpuffer (pH 9,0) dialysiert, und das Dialysat wird durch ein Säule geleitet, die mit Protein A-Sepharose (hergestellt von Pharmacia) gefüllt ist, um den Abfluß (nicht-IgG-Fraktion) zu sammeln, und die Fraktion (IgG-Fraktion) wird mit 0,1 M Citratpuffer (pH 3,0) eluiert. Fig.6 zeigt das Eluierungsmuster. Daraufhin wird nach der Dialyse jeder sondierten Fraktion gegen PBS eine Menge entsprechend der Konzentration des 1:20 verdünnten Serums zu dem As-Serum (24 Einheiten) zugegeben. Unter Einsatz der durch Methode (I) hergestellten Platte wird die Extinktion (450 nm) als Index für den Antikörpertiter in einer ähnlichen Weise wie in Beispiel 1 bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 dargestellt. Tabelle 1
In der Tabelle zeigen die Werte die Extinktion bei 450 nm an und die Werte in Klammern zeigen die Ergebnisse, die in Abwesenheit der As-Serumprobe (Kontrollversuch) erhalten worden sind.
Wie in Tabelle 1 gezeigt, ist die aktive Komponente in der Nicht-IgG-Fraktion vorhanden.
Außerdem werden Seren von gesunden Menschen durch eine DEAE-Cellulose-Säule (hergestellt von Whatmann Co.Ltd., DE 52) geleitet. Die aktive Komponente erscheint im Abfluß und wird mit 0,014 M Phosphatpuffer (pH 7,4) eluiert (Fig.7). Wenn das Aussalzen mit Ammoniumsulfat durchgeführt wird, dann wird die aktive Komponente bei einer Konzentration entsprechend 30 bis 60% Sättigung ausgefällt (Fig.8).
Es wird davon ausgegangen, daß die Wirkung der Verstärkung der Bindungsfähigkeit des As-Antikörpers an den Träger durch die Wechselwirkung zwischen der genannten aktiven Komponente und den Cardiolipin-Micellen in der Festphase und die Wirkung der Aufhebung der Bindungsfähigkeit des Ya- Antikörpers an den Träger durch die Reaktion der aktiven Komponente und des Ya-Antikörpers in der Flüssigphase und durch Auswaschen des so gebildeten Komplexes erzielt wird.

Beispiel 3

Nachweis des für das Antiphospholipid-Syndrom spezifischen Antikörpers mittels eines antigengebundenen Trägers, der mit einem oberflächenaktiven Mittel behandelt worden ist.
Unter Einsatz des Trägers, der nur mit Tween 20 behandelt worden ist, zum Binden des Antiphospholipid-Antikörpers und bei Anwendung von im Prinzip der gleichen Methode wie in Beispiel 1, nämlich der Methode (I) und (II, mit der Abänderung, daß der Träger nur mit Tween 20 behandelt worden ist, werden die Wirkungen des Verfahrens nach vorliegender Erfindung untersucht.
Aus Rinderherz gewonnenes Cardiolipin wird in jede Vertiefung einer 96 Vertiefungen aufweisenden Mikrotiterplatte nach Methode (I) eingebracht. Die Vertiefung wird mit PBS- Tween gewaschen. Auf entsprechende Art und Weise wie in Beispiel 1 wird menschliches Serum von gesunden Menschen zur Reaktionslösung in der Primärreaktion zugegeben (Arbeitsgang I-1) oder nicht (Arbeitsgang I-2), um die Reaktion durchzuführen, und die anschließenden Maßnahmen werden wie in Beispiel 1 durchgeführt. Als Index für den Antikörpertiter wird die Extinktion (450 nm) gemessen. Ferner wird eine Vertiefung, in welche Cardiolipin eingebracht worden ist in ähnlicher Weise wie oben beschrieben mit PBS gewaschen, das kein Tween 20 enthält, und menschliches Serum von gesunden Menschen wird zur Reaktionslösung in der Primärreaktion zugegeben (Vergleich I-1) oder nicht zugegeben (Vergleich I-2), um die Reaktion stattfinden zu lassen. Die folgenden Vorgänge werden wie in Beispiel 1 durchgeführt. Als Index für den Antikörpertiter wird die Extinktion (450 nm) gemessen. Zum Waschen nach der Stufe der Pnmärreaktion und der Stufe der Sekundärreaktion wird in jeder Gruppe eine Waschflüssigkeit entsprechend der oben beschriebenen eingesetzt.
Ferner wird aus Rinderherz gewonnenes Cardiolipin in jede Vertiefung einer 96 Vertiefungen umfassenden Mikrotiterplatte entsprechender Weise wie in Methode (II) beschrieben, eingebracht, mit der Abänderung, daß in einem Teströhrchen getrocknetes Cardiolipin in PBS (pH 6,0), enthaltend 0,01% BSA, suspendiert wird. Die Vertiefung wird mit 0,05% PPBS-Tween gewaschen. In entsprechender Weise wie in Beispiel 1 wird menschliches Serum von gesunden Menschen zur Reaktionslösung in der Primärreaktion zugegeben (Durchgang II-1) oder nicht zugegeben (Durchgang II-2), um die Reaktion stattfinden zu lassen, und die folgenden Maßnahmen werden wie in Beispiel 1 durchgeführt. Als Index für den Antikörpertiter wird die Extinktion (450 nm) gemessen. Ferner wird eine Vertiefung, in welche Cardiolipin eingebracht worden ist, in entsprechender Weise wie oben beschrieben mit PBS gewaschen, das kein Tween 20 enthält, und menschliches Serum von gesunden Menschen wird zur Reaktionslösung in der Primärreaktion zugegeben (Vergleich II-1) oder nicht zugegeben (Vergleich II-2), um die Reaktion wie im Beispiel stattfinden zu lassen. Die folgenden Vorgänge werden wie in Beispiel 1 durchgeführt. Als Index für den Antikörpertiter wird die Extinktion (450 nm) gemessen. Zum Waschen nach der Stufe der Primärreaktion und der Stufe der Sekundärreaktion wird in jeder Gruppe PBS ohne Tween-20-Gehalt als Waschflüssigkeit eingesetzt.
In den genannten Durchgängen werden As-Serum und Ya-Serum als Probelösungen eingesetzt. Diese Seren sind so verdünnt, daß sie einen konstanten Antiphospholipid-Antikörpertiter aufweisen, wie von Harns, E.N. et al, anläßlich des Dritten Internationalen Symposiums zum Thema Antiphospholipid- Antikörper in Kingston (KAPS) vorgeschlagen wurde.
Die Ergebnisse dieser Arbeitsgänge sind in Tabelle 2 enthalten.
In der Tabelle zeigen die Werte die Extinktion bei 450 nm an und die Werte in Klammern sind Werte, die durch Messungen mittels des nicht an Cardiolipin gebundenen Trägers (Kontrollversuche) erhalten wurden. Tabelle 2
Wie in Tabelle 2 dargestellt, wird die Antigeneigenschaft von Cardiolipin durch die Waschbehandlung mit Tween 20 zum Ausdruck gebracht, so daß die Bindungsfähigkeit des As-Antikörpers von Cardiolipin in der Festphase verstärkt wird und gleichzeitig eine nicht-spezifische Adsorption von Immunglobulin an der Platte verhindert wird. Bezüglich des durch Methode (I) hergestellten Trägers zum Binden des Antiphospholipid-Antikörpers geht man davon aus, daß physikalisch an dem Träger adsorbiertes Cardiolipin einen Lipidtransfer auf Mizellen von Tween 20 auslöst. Die Bildung von "oberflächenaktives Mittel- Phospholipid-Mizellen" ist wesentlich für die Expression der dreidimensionalen Struktur mit Antigeneigenschaft des Cardiolipins auf der Oberfläche der Platte. Die Mizellen von Tween 20 als solche haben auch die Funktion des Verhinderns der nicht-spezifischen Adsorption von Immunglobulin. Das Binden der "oberflächenaktives Mittel -Phospholipid/Mizellen" an den Träger kann nicht nur durch Methode (I), sondern auch durch Methode (II) erfolgen. Die Methode (II) umfaßt zunächst das Bilden von Mizellen von Cardiolipin in einer Pufferlösung, dann das Inkubieren der Mizellen in einer Platte zwecks Adsorption von Cardiolipin auf der Oberfläche der Platte aus der Lipid-Doppelschicht der Mizellen und dann das Waschen mit Tween 20.

Beispiel 4

Wirkung des Aufrechterhaltens der Expression der Cardiolipin-Antigeneigenschaft durch Behandlung mit pBSA

Unter Verwendung der mit Cardiolipin behandelten Platte, die entsprechender Weise wie in der beschriebenen Methode (I) hergestellt worden ist, wird die Extinktion (450 nm) nach der Reaktion wie in Beispiel 1 als Index für den Titer des Anticardiolipin-Antikörpers gemessen, indem man die Konzentration von Tween 20 variiert, das zur Behandlung der Platte eingesetzt wird, für den Fall, wo die Platte mit pBSA (1%, 4ºC, 1 Stunde lang) (nach vorliegender Erfindung) behandelt worden ist, und für den Fall, wo die Platte nicht behandelt worden ist (Vergleichsbeispiel). Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 dargestellt.
Die Behandlung mit dem oberflächenaktiven Mittel erfolgt unter Verwendung von PBS (pH 7,4), enthaltend verschiedene Konzentrationen an Tween 20. Die untersuchten Proben sind As-Seren von 24 Einheiten (24 U) und 12 Einheiten (12 U)(gemäß der von Harns et al definierten Einheit). Tabelle 3
Wie aus Tabelle 3 ersichtlich ist, erfolgt die Expression der Antigeneigenschaft durch Tween 20 unabhängig davon, ob eine Behandlung mit pBSA stattgefunden hat oder nicht.
Die Expression der Cardiolipin-Antigeneigenschaft wird jedoch durch die Behandlung mit 1% pBSA bei 4ºC während einer Stunde erheblich beschleunigt. Das heißt, die Bildung der physikalisch dreidimensionalen Konformation mit Antigeneigenschaft nach dem Verdampfen der Ethanollösung von Cardiolipin bis zur Trockne in Methode (I) findet nicht nur aufgrund der Behandlung mit Tween 20, sondern auch durch die Behandlung mit pBSA statt. Ferner wird durch Behandlung mit sowohl Tween 20 als auch pBSA die Expression der Antigeneigenschaft beschleunigt und die Stabilität verbessert; ferner wird die sogenannte "fördernde Blockierwirkung" erzielt, wodurch die nicht-spezifische Adsorption des Antikörpers verhindert wird.

Beispiel 5

Wirkung der verschiedenen oberflächenaktiven Mittel

Beim Variieren der Art der zur Behandlung der Platte eingesetzten oberflächenaktiven Mittel wird die Extinktion (450 nm) als Index für den Antikörpertiter des As-Serums (24 U) in einer entsprechenden Weise wie in Beispiel 4 gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 dargestellt. Jedes oberflächenaktive Mittel wird in Form einer 0,05-prozentigen Lösung eingesetzt. Tabelle 4
Wie man aus Tabelle 4 ersehen kann, wird eine Wirkung ähnlich der mit Tween 20 Erzielten erreicht, obwohl die oberflächenaktiven Mittel eine unterschiedliche Kohlenstoffkettenlänge im hydrophoben Molekülteil im Vergleich zu der Kettenlänge von Tween 20 aufweisen.

Beispiel 6

Nachweis des für das Antiphospholipid-Syndrom spezifischen Antikörpers durch den mit menschlichem Serum, pBSA und einem oberflächenaktiven Mittel in Kombination behandelten Träger

Der Träger zum Binden des Antiphospholipid-Antikörpers nach vorliegender Erfindung wird in entsprechender Weise erhalten, wie in Beispiel 1, Methode (I) beschrieben, mit der Abänderung, daß die Platte, an welche Cardiolipin gebunden ist, mit PBS,enthaltend 5% menschliches Serum von gesunden Menschen und 1% (W/V) pBSA, anstatt mit PBS, welches nur 1 % pBSA enthält, wie in Beispiel 1, Methode (I) beschrieben, behandelt wird.
Bei Verwendung des genannten Trägers (vorliegende Erfindung) und des Trägers (Vergleichsbeispiel), der in Beispiel 1, Methode (I) erhalten worden ist, wird die Extinktion (450 nm) als Index für den Antikörpertiter des As-Serum in entsprechender Weise wie in Beispiel 1 gemessen, mit der Abänderung, daß 1% PBS-pBSA, welches kein menschlisches Serum von gesunden Menschen enthält, in der Reaktionslösung der Primärreaktion eingesetzt wird. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 dargestellt. Tabelle 5
Wie aus Tabelle 5 erkennbar, ist bei Verwendung des Trägers zum Binden des Antiphospholipid-Antikörpers, der mit menschlichem Serum von gesunden Menschen, mit pBSA und dem oberflächenaktiven Mittel in Kombination behandelt worden ist, die Wirkung ähnlich wie in dem Fall, wo menschliches Serum zugegeben worden ist, auch wenn in der Primärreaktion kein menschliches Serum zugegeben worden ist.

Beispiel 7

Bestimmung von Seren von Patienten mit dem Antiphospholipid-Syndrom

Die Anticardiolipin-Antikörpertiter (Einheit (U)) in menschlichen Serumproben von gesunden Menschen und in Serumproben von Patienten mit SLE ( in der Gruppe der Geburten und Fehlgeburten) werden in entsprechender Weise bestimmt wie in Beispiel 1, und zwar unter Verwendung des Trägers zum Binden des Antiphospholipid-Antikörpers, der in Beispiel 1, Methode (I) hergestellt wurde. Die Ergebnisse sind in Fig.9 dargestellt.
Wie in Fig.9 dargestellt, erreicht der Anticardiolipin-Antikörpertiter in den Seren der Gruppe von Patienten mit SLE verglichen mit demjenigen der Gruppe der menschlichen Seren von gesunden Menschen einen bemerkenswert hohen Wert. In der Gruppe der wiederholt auftretenden Fehlgeburten ist der Antikörpertiter wesentlich höher als in der Gruppe der normalen Geburten.
In bezug auf 248 Seren, die von Patienten mit Autoimmunkrankheiten einschließlich Patienten mit SLE gewonnen worden sind, wurde der Anticardiolipin-Antikörpertiter sowohl durch ein herkömmliches Verfahren (wie im Bezugsbeispiel beschrieben) unter Verwendung von Serum eines Rinderfötus in der Primärreaktion als auch durch die Methode der vorliegenden Erfindung, wie oben beschrieben, bestimmt, um die Beziehung zwischen diesen beiden Verfahren zu untersuchen. Die Ergebnisse sind in Fig.10 dargestellt. In Fig.10 gibt die Ordinate den Antikörpertiter (Einheit) gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung an, und die Abszisse zeigt den Antikörpertiter (Einheit) nach einer herkömmlichen Methode, und die gestrichelte Linie zeigt den Schätzwert (durchschnittlicher Antikörpertiter in menschlichen Seren von gesunden Menschen + 3X Standardabweichung (1 Einheit)). Der Koeffizient der Beziehung zwischen den beiden Systemen ist 0,664. Nach dem Verfahren der vorliegenden Erfindung kann die quantitative Bestimmung unabhängig von anderen Faktoren mit großer Zuverlässigkeit durchgeführt werden. Das heißt, nach dem Verfahren der vorliegenden Erfindung ist die Selektion von positiv und negativ genauer. Der Grund dafür ist, daß die Antikörper, die aufgrund von Infektionskrankheiten vorliegen (nämlich Antikörper vom Ya-Typ), wie oben beschrieben, negativ dargestellt sind.
In bezug auf 4 menschliche Serumproben von Patienten mit SLE und 2 menschliche Serumproben von gesunden Menschen wird die Verdünnungskurve (welche die Beziehung zwischen der Verdünnung der Seren und dem Titer (Einheit) des Anticardiolipin-Antikörpers zeigt) mittels der oben beschriebenen Methode der vorliegenden Erfindung bestimmt. Die Ergebnisse sind in Fig.11 dargestellt. Wie aus Fig.11 ersichtlich ist, kann mit dem Verfahren der vorliegenden Erfindung eine sehr gute Linearität in bezug auf die Verdünnung erzielt werden, was bedeutet, daß die Genauigkeit der quantitativen Bestimmung für den Antikörpertiter sehr hoch ist.

Beispiel 8

Vergleich in bezug auf den Antiphospholipid-Antikörper zwischen Seren von Patienten mit Autoimunkrankheiten und Patienten mit Infektionskrankheiten

Unter Verwendung der Träger zum Binden des Antiphospholipid-Antikörpers, der durch Binden verschiedener Phospholipide in einer Weise, wie in Beispiel 1, Methode (I) beschrieben, hergestellt worden ist, wird die Extinktion (450 nm) in entsprechender Weise wie in Beispiel 1 als Index für den Antiphospholipid-Antikörpertiter in Seren von Patienten mit Autoimmunkrankheiten (SLE ) und von Patienten mit Infektionskrankheiten (tuberkulöse Meningitis und Syphilis) gemessen.
Der Antikörpertiter wird in bezug auf jede Serumprobe in Gegenwart oder Abwesenheit von 5% menschlichem Serum von gesunden Menschen untersucht. Die Ergebnisse sind in Fig.12 dargestellt. Das As-Serum beträgt 24 U (verdünnt zu einer Konzentration von 1:200) und die anderen Seren sind alle zu einer Konzentration von 1:100 verdünnt und werden für den Test zur Verfügung gestellt. In der Zeichnung ist jede Reaktivität des Antiphospholipid-Antikörpers in jeder Serumprobe gezeigt, wobei die Reihenfolge von oben nach unten verläuft, unter Verwendung von Cardiolipin (CL), Phosphatidylinosit (PI), Phosphatidylserin (PS), Phosphatidsäure (PA), Phosphatidylethanolamin (PE) und Phosphatidylcholin (PC) als Festphasenantigen (wobei CL, PI, PS und PA in den Bereich der vorliegenden Erfindung fallen und PE und PC Vergleichsbeispiele sind). In diesem Fall beträgt die Menge an eingesetztem Antigen 2,5 µg/50 µl pro Vertiefung.
Wie aus Fig.12 klar erkennbar ist, steigt die Reaktivität der aufgrund von Autoimmunkrankheiten gebildeten Antikörper (für Autoimunkrankheiten spezifische Antikörper) proportional in Abhängigkeit von der Zugabe des menschlichen Serums an, während die Reaktivität der aufgrund von Infektionskrankheiten gebildeten Antikörper in Abhängigkeit von der Zugabe des menschlichen Serums abnimmt. Die Ergebnisse zeigen, daß die aufgrund von Infektionskrankheiten und aufgrund von Autoimmunkrankheiten vorliegenden Antiphospholipid-Antikörper, die sich mittels herkömmlicher Verfahren nur schwer unterscheiden ließen, unabhängig voneinander bestimmt werden können.

Beispiel 9

Pufferwirkung

Unter Verwendung des Trägers zum Binden des Antiphospholipid-Antikörpers nach Beispiel 1, Methode (I), wird die Extinktion (450 nm) als Index für den Antikörpertiter des As-Serums in entsprechender Weise wie in Beispiel 1 gemessen, mit der Abänderung, daß HEPES-Puffer (10 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7,4), enthaltend 1% pBSA als Verdünnungsmittel für die Probelösung eingesetzt wird. Die Ergebnisse sind in Fig.13 dargestellt.
Wie aus Fig.13 ersichtlich ist, wird eine gute Eichkurve (welche die Beziehung zwischen dem Anticardiolipin-Antikörper (Einheit) und der Extinktion (450 nm) zeigt) erzielt, wenn die Reaktionslösung, enthaltend HEPES als Reaktionslösung (Verdünnungsmittel der Probelösung) in der Primärreaktion eingesetzt wird, was ein Hinweis darauf ist, daß die Verwendung des Puffers zur Bestimmung der Antiphospholipid-Antikörper, die aufgrund des Antiphospholipid-Syndroms vorliegen, zweckdienlich ist.

Beispiel 10

Reinigung der aktiven Komponente

Die aktive Komponente in der Fraktion des menschlichen Serums von gesunden Menschen, wie in Beispiel 2 erwähnt (nachstehend "Anticardiolipin-Cofaktor" genannt) wird wie folgt gereinigt.

(A) Reinigungsverfahren

(1) Ionenaustauschsäulen-Chromatographie von menschlichem Serum von gesunden Menschen mittels der DEAE-Cellulose (E- 52)-Säule

Um die aktive Komponente von menschlichem Serum von gesunden Menschen zu reinigen, wird eine Ionenaustauschsäulen- Chromatographie unter Einsatz der DEAE-Cellulosesäule (DE- 52, hergestellt von Whatmann Co.) durchgeführt. Dabei werden 150 ml DE-52-Ionenaustauscherharz, das zuvor in herkömmucher Weise aktiviert worden ist, in eine Säule aus Glas mit den Maßen 2,5 x 60 cm gefüllt und dann mit 14 mM Natriumphosphatpuffer (pH 7,4) in einen Gleichgewichtszustand gebracht.
Nachdem 100 ml menschliches Serum, das gegen 3 l des gleichen Puffers 2 Tage lang dialysiert worden ist, vom Kopf der Säule her zugeführt worden sind, wird die Eluierung mit 3 l des gleichen Phosphatpuffers durchgeführt. Das Eluat wird jeweils zu 10 ml mit einem Fraktionssammler fraktioniert. Durch Messen der Extinktion jeder Fraktion bei einer Wellenlänge von 280 nm wird das Eluierungsprofil des Proteins aufgezeichnet.
Ferner wird die Aktivität des Anticardiolipin-Cofaktors mit Methode (B), wie nachstehend beschrieben, bestimmt. Außerdem wird die Aktivität des Anticardiolipin-Antikörpers unabhängig von dem Cofaktor ebenfalls durch Methode (B) bestimmt, da die Aktivität auch in dem Fall auftrat, wo menschliches Serum von gesunden Menschen einer Ionenaustauschsäulen-Chromatographie mittels DEAE-Cellulose unterworfen wurde. Dabei wird jeweils die Fraktion mit der Cofaktoraktivität erhalten (Fig.14). Die erhaltenen aktiven Fraktionen werden mittels Ultrafiltration oder Aussalzen mit 80-prozentigem gesättigtem Ammoniumsulfat in herkömmlicher Weise auf ca. 100 ml konzentriert. Das Konzentrat wird einer Protein-A-Sepharose-Säulenchromatographie unterworfen.

(2) Protein-A-Sepharose -Säulenchromatographie der die Cofaktoraktivität aufweisenden Fraktion

Um menschliches IgG aus der Fraktion mit der Cofaktoraktivität zu entfernen, wird die Protein-A-Sepharose -Säulenchromatographie durchgeführt. Das bedeutet, es werden 20 ml Protein-A-Sepharose (hergestellt von Pharmacia) in eine Säule aus Glas mit den Abmessungen 1,5 x 20 cm gefüllt und mit 1,5 M Glycinpuffer (pH 8,9), enthaltend 3 M Natriumchlorid, in einen Gleichgewichtszustand gebracht. Nachdem 10 ml der zuvor erhaltenen aktiven Fraktion mit dem gleichen Volumen an Glycinpuffer verdünnt worden sind, wird die resultierende verdünnte Lösung vom Kopf der Säule her zugegeben. Das Eluieren wird mit 100 ml des gleichen Glycinpuffers durchgeführt. Das Eluat wird zu jeweils 10 ml mit einem Fraktionssammler fraktioniert. Von jeder der so erhaltenen Fraktionen wird die Extinktion des Proteins in entsprechender Weise wie bereits erwähnt, gemessen und die Peakfraktion der Extinktion wird so erhalten (Fig.15). Nachdem die gewonnene Fraktion über Nacht gegen 2 l 10 mM HEPES-Puffer (pH 7,4), enthaltend 150 mM Natriumchlorid, dialysiert worden ist, wird das Dialysat mittels einer Ultrafiltrationsvorrichtung auf 5 ml konzentriert . Das Konzentrat wird dann einer Affinitäts-Säulenchromatographie unterworfen, wie nachstehend beschrieben. Das adsorbierte IgG wird mit 100 mM Natriumcitratpuffer (pH 3,0) eluiert.

(3) Affinitätschromatographie mittels anti-menschlicher- IgG-Antikörper-konjugierter Sepharose -CL-4B-Säule

Um von Protein A nicht adsorbiertes IgG zu entfernen, wird die Affinitäts-Säulenchromatographie unter Verwendung eines Harzes, das durch Binden von anti-menschlichem IgG- Antikörper an Sepharose -CL-4B-Harz (hergestellt von Pharmacia) hergestellt worden ist, durchgeführt. Genauer gesagt wird das zuvor hergestellte Harz in eine Säule aus Glas mit den Abmessungen 2,0 x 5 cm eingefüllt, das mit 10 mM HEPES-Natriumpuffer (pH 7,4), enthaltend 150 mM Natriumchlorid, ins Gleichgewicht gebracht worden war. Anschließend wird 1 ml der in (2) erhaltenen Lösung vom Kopf der Säule her zugeführt. Das Konzentrat wird dann mit dem gleichen HEPES-Puffer gewaschen. Der Abfluß wird zu je 1 ml mit einem Fraktionssammler fraktioniert. Von jeder der so erhaltenen Fraktionen wird die Extinktion des Proteins in entsprechender Weise wie bereits erwähnt, gemessen und die Peakfraktionen der Extinktion werden so erhalten (Fig.16). Die erhaltenen Fraktionen werden gesammelt und einer Natriumdodecylsulfat (nachstehend abgekürzt als SDS)-Polyacrylamidgelelektrophorese unterworfen. Nachdem bestätigt worden ist, daß IgG aufgrund der Elektrophorese vollständig entfernt worden ist (Fig.17, fr.1N), wird die gesammelte Fraktion mittels einer Ultrafiltrationsvorrichtung auf 2 ml konzentriert. Das adsorbierte IgG wird mit 0,1 M Glycinhydrochloridpuffer (pH 2,5) eluiert.

(4) Reinigung des Cofaktors mittels Cardiolipinliposomen

Mittels Affinitätsadsorption an Cardiolipinliposomen wird der Cofaktor in der gereinigten Fraktion (nachstehend Fr.1N genannt), die in (3) erhalten worden ist und aus welcher IgG vollständig entfernt worden ist, vollständig gereinigt. Genauer gesagt werden 2 ml Ethanollösung von 5mg/ml Cardiolipin in einen birnenförmigen 25 ml fassenden Kolben gefüllt und die Lösung wird unter vermindertem Druck sanft bis zur Trockne verdampft, wobei ein dünner Film an der Wandfläche des Kolbens gebildet wird. Nach Zugabe von 2 ml 10 mM HEPES-Puffer (pH 7,4), enthaltend 150 mM Natriumchlorid, wird die Mischung 15 Minuten lang mit einem Vortexrührer heftig gerührt, wobei Cardiolipinliposomen gebildet werden. Die so hergestellten Liposomen werden zur Lösung der gereinigten Fraktion, Fr.1N (1,2 mg/ml, im gleichen HEPES-Puffer), die in (3) erhalten worden ist, im gleichen Volumen zugegeben. Die Mischung wird bei Raumtemperatur 1 Stunde lang stehengelassen, um den Cofaktor aufgrund der Affinität an den Liposomen zu adsorbieren. Daraufhin werden die Liposomen durch Zentrifugieren bei 4ºC bei 15000 UpM während eines Zeitraums von 15 Minuten erhalten. Die Liposomen werden durch Zentrifugation 3 mal mit dem gleichen HEPES-Puffer gewaschen. Jeder Überstand wird gesammelt. Daß der Überstand frei ist von nicht an den Liposomen adsorbiertem Cofaktor, wird in herkömmlicher Weise mittels SDS-Polyacrylamid-Gelplattenelektrophorese bestätigt. Wenn der an den Liposomen nicht adsorbierte Cofaktor im Überstand vorliegt, werden ähnliche Vorgänge wiederholt und der Cofaktor wird an den Liposomen adsorbiert und so gewonnen. Die Liposomen, an welchen der Cofaktor somit adsorbiert ist, werden in 100 bis 500 µl des gleichen HEPES-Puffers suspendiert und die Suspension wird durch Tiefkühlung bei -20ºC gelagert. Unter Verwendung des Adsorbats aus Cofaktor und Liposomen, das durch die erwähnten Vorgänge erhalten worden ist, wird die SDS-Polyacrylamid-Gelplattenelektrophorese in herkömmlicher Weise durchgeführt. Somit werden (wird) Proteine (ein Protein) erhalten, das als Doppelmuster mit ca. 50000 Molekulargewicht erscheint, welche Muster sehr nahe beinander liegen (Fig.17, F-1). Gleichzeitig wird der Cofaktor in entsprechender Weise unter Verwendung von 2 mM Liposomen von Dipalmitoylphosphatidylcholin (DPPC): Cardiolipin (80:20 Mol%) und von 2 mM Liposomen von DPPC: Dipalmitoylphosphatidylethanolamin (DPPE) (80:20 Mol%) gereinigt. Als Ergebnis weisen die aus DPPC und Cardiolipin bestehenden Liposomen eine Wirkung auf, die ähnlich der Wirkung ist, die das Liposom aufweist, das nur aus Cardiolipin besteht (Fig.17, F-2). Die Komponente, die man für den Cofaktor hielt, ist jedoch nicht an dem aus DPPC und DPPE bestehenden Liposom adsorbiert worden (Fig.17-F-3).

(5) Isolierung des Cofaktors, der an den Liposomen adsorbiert ist, mittels HPLC.

Der mittels Affinitätsadsorption am Cardiolipinliposom gereinigte Cofaktor wird mittels HPLC unter Verwendung einer Umkehrphasen-Chromatographiesäule isoliert. Das bedeutet, daß eine Suspension des Adsorbats aus Cofaktor und Liposom bei 15000 UpM während eines Zeitraums von 15 Minuten zentrifugiert wird, um das Liposom abzutrennen. Dann wird 1% wäßrige SDS-Lösung zugegeben und die Mischung wird sorgfältig gerührt, um das Liposom ausreichend zu lösen. Die Lösung wird wiederum unter den gleichen Bedingungen zentrifugiert, um das unlösliche Material auszufällen. Der Überstand wird unter den folgenden Bedingungen unter Einsatz einer Umkehrphasen-Chromatographiesäule (Waters Microbonders Pair C-4-Säule (3,9 x 15 cm); hergestellt von Waters) einer HPLC unterworfen, während die Extinktion bei 215 nm mit einem daran befindlichen Extinktionsnachweisgerät aufgezeichnet wird. Der gereinigte Cofaktor wird somit erhalten (Fig.18).
Bedingungen für die HPLC zum Isolieren des Cofaktors aus dem Adsorbat aus Cofaktor und Cardiolipin-Liposom
Bedingungen für den Gradienten der Zuspeisungslösungen:

(6) Molekulargewicht und isoelektrischer Punkt des Anticardiolipin-Cofaktors

Um den isoelektrischen Punkt und das Molekulargewicht des Cofaktors zu untersuchen, wird eine ISODALT-Gelelektrophorese nach dem Verfahren von Anderson et al durchgeführt. Zunächst wird die Lösung Fr.1N, die in (3) erhalten worden ist, der Elektrophorese (Fig.19) unterworfen. Wie in Fig.19 dargestellt, erscheinen verschiedene Punkte. Die Ergebnisse der SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (Fig.17, F-1) in bezug auf den in (5) erhaltenen gereinigten Cofaktor zeigen, daß der Cofaktor, der am Cardiolipin- Liposom adsorbiert ist, den Punkten Nr. 10 und 12 in Fig.19 entspricht. Das heißt, daß der isoelektrische Punkt und das Molekulargewicht des Cofaktors aus Fig. 19 als 6,75 und 49600 (Nr.10) und als 6,60 und 50000 (Nr.12) identifiziert werden. Diese beiden Komponenten entsprechen Proteinen mit der gleichen Aminosäuresequenz, aber mit unterschiedlichen Zuckerketten, oder Proteinen, bei welchen einige der Aminosäuren an den funktionellen Gruppen irgendwie modifiziert sind, welche dann eine Unterart des Cofaktors darstellen.

(B) Verfahren zur Bestimmung der Anticardiolipin-Cofaktoraktivität und der vom Cofaktor unabhängigen Anticardiolipin-Antikörper-Aktivität

Die Anticardiolipin-Cofaktoraktivität und vom Cofaktor unabhängige Anticardiolipin-Antikörperaktivität, die in menschlichen Seren von gesunden Menschen vorliegen, werden durch folgendes Verfahren bestimmt.
Diese Aktivitäten werden in einer Weise bestimmt, die ähnlich der im Bezugsbeispiel dargestellten Methode ist.
Eine mit Cardiolipin beschichtete Mikroplatte mit 96 Vertiefungen wird mit 200 µl PBS-Puffer (pH 7,4), enthaltend 0,05% Tween 20 (nachstehend als Waschflüssigkeit bezeichnet), je Vertiefung gewaschen. Dieser Vorgang wird 3 mal wiederholt, um die Platte zu aktivieren. Eine zu untersuchende Probe wird zu je 50µl in jede Vertiefung pipettiert. Dann werden 50 µl As-Serum, das vorher mit 10 mM HEPES-Puffer (pH 7,4), enthaltend 150 nM Natriumchlorid und 1% pBSA( nachstehend als Verdünnungspuffer bezeichnet), um das 200-fache verdünnt worden ist, in die Vertiefung pipettiert, in welcher die Cofaktoraktivität zu bestimmen ist. Andererseits werden jeweils 50 µl des Verdünnungspuffers in die Vertiefung pipettiert, in welcher die cofaktor-unabhängige Anticardiolipin-Antikörper-Aktivität zu bestimmen ist. Man läßt die Platte 30 Minuten lang bei Raumtemperatur stehen. Die folgenden Maßnahmen sind die gleichen in den beiden Systemen. Das heißt, beide Vertiefungen werden 3 mal mit der Waschflüssigkeit gewaschen und jeweils 100 µl der Lösung des anti-menschlichen IgG-Antikörpers, der mit von Meerrettich abgeleiteter Peroxidase markiert ist, und die mit 10 mM HEPES-Puffer (pH 7,4), enthaltend 150 mM Natriumchlorid, 1% pBSA und 1 mM EDTA, verdünnt ist, werden in die Vertiefungen pipettiert. Man läßt die Platte 30 Minuten lang bei Raumtemperatur stehen. Nach weiterem 3-maligem Waschen mit der Waschflüssigkeit wird eine wäßrige Lösung (100 µl), enthaltend 0,3 mM TMBZ und 0,003 % Wasserstoffperoxid als Substratlösung zur Platte gegeben. Nach einer Reaktion von 10 Minuten wird die Extinktion bei 450 nm mit einem Plattenlesegerät gemessen.

Testbeispiel

Um die Eigenschaften des Anticardiolipin-Cofaktors zu untersuchen, wird der folgende Versuch durchgeführt.

(1) Herstellung des biotinylierten Anticardiolipin-Cofaktors

Nach einem modifizierten Verfahren von Kumagai und Okumura et al, wie es in der Literaturstelle MENEKI-JIKKEN SOSAHO (Maßnahmen für das imunologische Experiment) [veröffentlicht am 20. Februar, 1980 von der Association of Immunology, Japan (Kapitel III, Zell-Antigen, 15-59, Seite 2425)], wird 1mg des in Beispiel 10 (3) gereinigten Anticardiolipin-Cofaktors biotinyliert, um den Anticardiolipin-Cofaktor zu markieren.

(2) Bindefähigkeit des Anticardiolipin-Cofaktors an das Cardiolipin

Nachdem jeweils 2,5 µg/50 µl pro Vertiefung einer Ethanollösung von Cardiolipin in jede Vertiefung einer 96 Vertiefungen aufweisenden Mikrotiterplatte gegeben worden sind, erfolgt das Trocknen unter vermindertem Druck, woraufhin eine Stunde lang in 1% pBSA enthaltendem PBS umgesetzt wird. Anschließend wird die Platte dreimal mit PBS (200 µl), enthaltend 0,05% Tween 20, gewaschen. Dann werden bis 32 µg/ml des biotinylierten Anticardiolipin-Cofaktors (100µl), wie in Fig.20 angegeben, mit dieser cardiolipingebundenen Platte 30 Minuten lang bei Raumtemperatur umgesetzt. Nach 3-maligem Waschen wird mit Avidin markierte Peroxidase damit bei Raumtemperatur 30 Minuten lang umgesetzt. Nach weiterem 3-maligem Waschen wird eine wäßrige Lösung, enthaltend 100µl 0,3 mM TMBZ und 0,003% Wasserstoffperoxid zur Mischung gegeben. Nach dem Umsetzen bei Raumtemperatur während eines Zeitraums von 10 Minuten wird die Reaktion durch Zugabe von 100 µl 2N Schwefelsäure zur Reaktionslösung beendet. Durch das Messen der Extinktion der Reaktionslösung wird der Anticardiolipin-Cofaktor, der an das Festphasen-Cardiolipin gebunden ist, quantitativ bestimmt.
Wie in Fig.20 dargestellt, ist die Bindefähigkeit des biotinylierten Anticardiolipin-Cofaktors zum Festphasencardiolipin abhängig von der Konzentration desselben.

(3) Bindungsspezifität des biotinylierten Anticardiolipin- Cofaktors zu verschiedenen Phospholipiden

Unter Verwendung von mit Avidin markierter Peroxidase wird die Bindungsspezifität des biotinylierten Anticardiolipin- Cofaktors an die Phospholipide auf der Platte untersucht, an welche jeweils 2,5 µg/50µl pro Vertiefung verschiedener Phospholipide (nämlich Cardiolipin, Phosphatidylserin (PS), Phosphatidylinosit (PI), Dipalmitoylphosphatidinsäure (DPPA), Dipalmitoylphosphatidylcholin (DPPC) und Dipalmitoylphosphatidylethanolamin (DPPE)] gebunden worden sind. Wie in Fig.21 dargestellt, ist die Bindung des Anticardiolipin-Cofaktors spezifisch für die sauren Phospholipide (Cardiolipin, PS, PI und DPPA) mit negativer Ladung.

(4) Abhängigkeit des Anticardiolipin-Cofaktors von der Bindung des Anticardiolipin-Antikörpers im Reaktionssystem

Gemäß dem ELISA-Test, der ähnlich dem beschriebenen Verfahren (2) durchgeführt wird, wird der Anticardiolipin-Cofaktor (2µg je Vertiefung) zum Reaktionssystem des Anticardiolipin-Antikörpers (As-Serum) zugegeben, der spezifisch beim Antiphospholipid-Syndrom vorliegt, wobei das Cardiolipin an die Festphase gebunden ist, um die Abhängigkeit des Anticardiolipin-Cofaktors von der Reaktion zwischen dem Anticardiolipin-Antikörper und dem Festphasen-Cardiolipin zu untersuchen. Wie in Fig.22 dargestellt, wird der Anticardiolipin-Antikörper in Abhängigkeit von dem zugegebenen Anticardiolipin-Cofaktor zugegeben.

(5) Artspezifität des Anticardiolipin-Cofaktors

Die Aktivität des Anticardiolipin-Cofaktors von verschiedenen Spezies (abgeleitet von Mensch oder Rind) wird mittels des ELISA-Tests, der ähnlich dem oben beschriebenen Verfahren(2) ist, ausgewertet. Bei Einsatz des vom Rind abgeleiteten Cofaktors werden die Reaktivitäten der Anticardiolipin-Antikörper, die aufgrund von Autoimmunkrankheiten (As-Serum) vorliegen, und der Antikörper, die aufgrund von Infektionskrankheiten (Ya-Serum) vorliegen jeweils verstärkt. Bei Einsatz des vom Menschen abgeleiteten Cofaktors hingegen wird die Reaktivität der Antikörper, die aufgrund von Autoimmunkrankheiten vorliegen (As-Antikörper), selektiv verstärkt (Fig.23).

Beispiel 11

Sammlung der Fraktion von menschlichen Seren, die von gesunden Menschen stammen

(1) Sammlung der Fraktion mittels DEAE-Cellulose-Säulenchromatographie

Menschliche Seren (1ml) von gesunden Menschen, die über Nacht gegen 14 mM Natriumphosphatpuffer (pH 7,4) (nachstehend PB 7,4 genannt) dialysiert worden sind, werden mittels der DEAE-Sepharose -Säule (10ml, 1,0 x 13 cm, DE-52, hergestellt von Whatmann Co.) chromatographiert, die zuvor mit PB 7,4 ins Gleichgewicht gebracht worden ist. Der Abfluß wird zu je 1 ml gewonnen. Unter Verwendung von 25ml je Fraktion werden sowohl die Aktivität in bezug auf die Verstärkung der Reaktivität zwischen dem Anticardiolipin-Antikörper, der spezifisch in Seren (As) von Patienten mit dem Antiphospholipid-Syndrom vorkommt, und dem Cardiolipin in der Festphase, als auch die Aktivität in bezug auf das Verhindern der Reaktivität zwischen dem Anticardiolipin-Antikörper, der in Seren (Sy) von Patienten mit Syphilis vorliegt, und Cardiolipin in der Festphase in einer Weise bestimmt, die ziemlich ähnlich der im Bezugsbeispiel und in Beispiel 10, Methode (B) beschriebenen Art und Weise ist.
Die Ergebnisse sind in Fig.24 dargestellt.

(2) Gewinnen der Fraktion mittels Heparin-Sepharose -Säulenchromatographie

Menschliche Seren (1ml) von gesunden Menschen, die über Nacht gegen 10 mM Natriumphosphatpuffer (pH 7,4), enthaltend 50 mM Natriumchlorid, dialysiert worden sind, werden an einer Heparin-Sepharose -Säule (6 ml, 1,0 x 8cm, hergestellt von Pharmacia) adsorbiert, die vorher mit dem gleichen Puffer ins Gleichgewicht gebracht worden ist. Nach sorgfältigem Waschen der Säule mit dem gleichen Puffer, wird das Eluieren bei einem Dichtegradienten einer Lösung entsprechend einer Natriumchloridkonzentration von 50 mM bis 1 M durchgeführt. Unter Verwendung von 15 µl jeder Fraktion wird sowohl die Aktivität in bezug auf die Verstärkung der Reaktivität zwischen dem Anticardiolipin- Antikörper, der vor allem in Seren (As) von Patienten mit dem Antiphospholipid-Syndrom vorkommt, und Cardiolipin in der Festphase, als auch die Aktivität in bezug auf das Verhindern der Reaktivität zwischen dem in Seren (Sy) von Patienten mit Syphilis vorliegenden Anticardiolipin-Antikörper und Cardiolipin in der Festphase, in einer Art und Weise bestimmt, die ähnlich der Methode ist, die im Bezugsbeispiel und in Beispiel 10, Methode (B) beschrieben worden ist.
Die Ergebnisse sind in Fig.25 dargestellt.

(3) Gewinnen der Fraktion mittels Cardiolipin-Polyacrylamidgel-Säulenchromatographie

i) Herstellung der Cardiolipin-Polyacrylamidgelsäule

Von Rinderherz stammendes Cardiolipin (5 µM), Cholesterin (5 µM) und Dicetylphosphat (0,5 µM) werden in einen birnenförmigen Kolben gefüllt und unter vermindertem Druck zu einem Film getrocknet. Ferner werden 500 µl Ethanol dazugegeben und der Kolben wird auf ca. 60ºC erwärmt, um das Lipid zu verteilen. Anschließend werden 5ml einer Lösung aus 15% Acrylamid und 5% N,N'-Methylenbisacrylamid zur Lösung gegeben. Die Mischung wird heftig mit einem Vortexmischer gerührt und 100 µl Ammoniumpersulfat (100mg/ml) und 2µl TEMED werden dann zugegeben, um eine Polymerisation zu bewirken. Das polymerisierte Gel wird homogenisiert. Das Homogenat wird in eine Säule (1,0 x 3cm) gefüllt und das Gel wird sorgfältig gewaschen und mit 10 mM Natriumphosphatpuffer (pH 7,4), enthaltend 50 mM Natriumchlorid, ins Gleichgewicht gebracht.

ii) Affinitätssäulenchromatographie

Nachdem 1 ml menschliches Serum von gesunden Menschen, das über Nacht gegen 10 mM Natriumphosphatpuffer (pH 7,4), enthaltend 50 mM Natriumchlorid, dialysiert worden ist, durch die Säule geleitet worden ist, wird die Säule sorgfältig mit dem gleichen Puffer gewaschen und die an der Säule adsorbierten Proteine werden mit 10 mM Natriumphosphatpuffer (pH 7,4), enthaltend 1,0 M Natriumchlorid, eluiert. Unter Verwendung von 15 µl jeder Fraktion wird sowohl die Aktivität in bezug auf die Verstärkung der Reaktivität zwischen dem Anticardiolipin-Antikörper, der vor allem in Seren (As) von Patienten mit dem Antiphospholipid-Syndrom vorkommt, und Cardiolipin in der Festphase, als auch die Aktivität in bezug auf das Verhindern der Reaktivität zwischen dem in Seren (Sy) von Patienten mit Syphilis vorliegenden Anticardiolipin-Antikörper und Cardiolipin in der Festphase, in einer Art und Weise bestimmt, die ähnlich der Methode ist, die im Bezugsbeispiel und in Beispiel 10, Methode (B) beschrieben worden ist.
Die Ergebnisse sind in Fig. 26 dargestellt.
Wie bereits erwähnt, konnte die Fraktion der vorliegenden Erfindung aus dem menschlichen Serum gesunder Menschen unter Einsatz der DEAE-Cellulose-Säulenchromatographie, der Heparin-Sepharose -Säulenchromatographie oder der Cardiolipin-Polyacrylamidgel-Säulenchromatographie erhalten werden.

Beispiel 12

Aktivität des Anticardiolipin-Cofaktors

Es wird die Expression der Aktivität (As^ -Aktivität) in bezug auf die Verstärkung der Reaktivität zwischen dem Anticardiolipin-Antikörper, der vor allem in Seren (As) von Patienten mit dem Antiphospholipid-Syndrom vorkommt, und Cardiolipin als auch die Aktivität (Sy-O Aktivität) in bezug auf das Verhindern der Reaktivität zwischen dem in Seren (Sy) von Patienten mit Syphilis vorliegenden Anticardiolipin-Antikörper und Cardiolipin untersucht.
Die Festphasen Cardiolipin-Platte wird mit PBS, enthaltend Tween 20, gewaschen. Anschließend wird die für Gruppen 3 und 4 in den in Tabelle 6 dargestellten Serengruppen eingesetzte Platte 30 Minuten lang mit dem Cofaktor (10 µg/ml), der in Beispiel 10 (3 )erhalten worden ist, behandelt. Die für die Kontrollgruppe eingesetzte Platte wird mit dem Puffer behandelt, der den Cofaktor nicht enthält. Nach der Behandlung wird die Platte 3 mal mit PBS, enthaltend Tween 20, gewaschen und anschließend mit As-Serum (verdünnt bis zu einer Konzentration von 1:400, 125 U/ml) und Sy-Serum (verdünnt bis zu einer Konzentration von 1:200) bei Raumtemperatur 30 Minuten lang in Gegenwart des Cofaktors (10 µg/ml) (Gruppen 2 und 4) oder in Abwesenheit des Cofaktors (Gruppen 1 und 3) umgesetzt. Die anschließenden Maßnahmen entsprechen denen, die im Bezugsbeispiel und in Beispiel 10 (B) beschrieben sind.
Wie in Tabelle 6 dargestellt, sollte zur Expression der As^ -Aktivität der Cofaktor bei der Vorbehandlung der Platte, im Reaktionssystem mit dem Antikörper oder sowohl bei der Vorbehandlung als auch im Reaktionssystem, wie beschrieben, vorliegen. Um die Sy-O Aktivität zu exprimieren kann der Cofaktor bei der Vorbehandlung der Platte vorliegen, sollte aber im Reaktionssystem mit dem Antikörper vorliegen. Tabelle 6

Beispiel 13

Der Einfluß des gereinigten Rinder-Serumalbumins auf die Aktivität (As^ - Aktivität) in bezug auf die Verstärkung der Reaktivität zwischen dem Anticardiolipin-Antikörper, der vor allem in Seren (As) von Patienten mit dem Antiphospholipid-Syndrom vorkommt, und Cardiolipin, als auch auf die Aktivität (Sy-O Aktivität) in bezug auf das Verhindern der Reaktivität zwischen dem in Seren (Sy) von Patienten mit Syphilis vorliegenden Anticardiolipin-Antikörper und Cardiolipin wird nach dem Verfahren untersucht, das dem im Bezugsbeispiel und in Beispiel 10, Methode (B) beschriebenen Verfahren entspricht.
Werden das in hohem Maße reine Rinderserumalbumin, das kein Lipid (pBSA) enthält, und der gereinigte Cofaktor [Cofaktor, der in Beispiel 10 (3) erhalten worden ist)] bei dieser Bestimmung eingesetzt, dann nimmt die Sy- Aktivität in Abhängigkeit von der Konzentration von pBSA in der Reaktionslösung (Fig.27) ab. Den Grund dafür sieht man darin, daß die Sy -Aktivitäts-Expressionsstelle im Cofaktormolekül durch das gereinigte Albumin (pBSA) blockiert wird. Daher ist es erwünscht, BSA in einer Konzentration von 0 bis 5%, vorzugsweise von 0 bis 1% einzusetzen.

Beispiel 14

Bestimmung der Aminosäuresequenz im Cofaktor

Der durch das in Beispiel 10 (3) beschriebene Verfahren erhaltene Cofaktor wird ferner einer Cardiolipin-Polyacrylgelsäulenchromatographie unterworfen, wie sie in Beispiel 11(3) eingesetzt wird, um den Cofaktor an dem Gel zu adsorbieren. Anschließend wird der Cofaktor mit 1 M Natriumchlorid eluiert, um den Cofaktor zu reinigen. Die N- terminierende Aminosäuresequenz des Cofaktors (die beiden Unterarten, die in Beispiel 10 (6) identifiziert worden sind, sind im Cofaktor enthalten) wird bestimmt. Das heißt es werden 30 µl (300 pmol) einer Probelösung an der PVDF- Membran (Polyvinylidendifluorid; Warenzeichen, IMOBILON, hergestellt von Millipore Co.) adsorbiert. Nach dem Waschen mit 60% Methanol, wird eine Analyse mit einem Dampfphasen-Proteinsequenzanalysator (Modell PSQ-1, hergestellt von Shimadzu Seisakusho Ltd.) durchgeführt. Durch die genannten Maßnahmen wird die Sequenz von 7 Aminosäuren vom N-Terminus des Cofaktors bestimmt.
Ergebnis: NH&sub2;-Gly-Arg-Thr-X-Pro-Lys-Pro
(Man nimmt an, daß X Cys oder His ist).

Anwendung in der Industrie

Nach vorliegender Erfindung ist ein Verfahren zur differenzierenden und unabhängigen Bestimmung des Antiphospholipid-Antikörpers mit Ursprung im Antiphospholipid-Syndrom und des Antiphospholipid-Antikörpers mit Ursprung in Infektionskrankheiten, welche nach dem Stand der Technik nicht ausreichend genau voneinander unterschieden werden konnten, entwickelt worden, das sich gut reproduzieren läßt, indem ein Träger zum Binden eines Antiphospholipid- Antikörpers eingesetzt wird, der mit einem oberflächenaktiven Mittel allein, mit einer Kombination aus oberflächenaktivem Mittel und gereinigtem Serumalbumin oder damit weiter in Kombination mit den (der ) Blutkomponente(n) der vorliegenden Erfindung behandelt worden ist, und/oder indem die Blutkomponente(n) der vorliegenden Erfindung zur Reaktionslösung in der ersten Antigen-Antikörper-Reaktion (Primärreaktion) zugegeben werden. Durch Anwenden des Verfahrens der vorliegenden Erfindung ist es möglich, die Diagnose des Antiphospholipid-Syndroms mit hoher Genauigkeit zu stellen.
Außerdem weisen die Blutkomponente(n) der vorliegenden Erfindung die Aktivität in bezug auf die Verstärkung der Bindungsfähigkeit des vor allem bei Patienten mit dem Antiphospholipid-Syndrom vorliegenden Antikörpers an Phospholipide und in bezug auf die Verminderung der Bindungsfähigkeit des Antiphospholipid-Antikörpers, der aufgrund von Infektionskrankheiten vorliegt, zu Phospholipiden auf. Demgemäß kann durch Verwendung dieser Seren oder des Plasmas oder von deren Fraktion oder vom Protein in der Fraktion für das Immunoassay-Verfahren des Antikörpers, der spezifisch bei Patienten mit den Antiphospholipid-Syndrom vorliegt, die Diagnose des Antiphospholipid- Syndroms mit hoher Genauigkeit gestellt werden. Gleichzeitig lassen sich die entsprechenden Antiphospholipid-Antikörper beim Antiphospholipid-Syndrom und bei Infektionskrankheiten getrennt voneinander nachweisen.

Claims

1. Ein Immunoassay-Verfahren, welches die folgenden Verfahrensstufen umfaßt:

Eine erste Stufe der Antigen-Antikörper-Reaktion, welche das Kontaktieren eines zum Binden eines Antiphospholipid-Antikörpers geeigneten Trägers mit einer Probelösung unter Bildung eines Immunkomplexes aus dem Antiphospholipid-Antikörper in der genannten Probelösung und dem Phospholipid an dem Träger umfaßt;

eine zweite Stufe der Antigen-Antikörper-Reaktion, welche das Umsetzen des Immunkomplexes mit einem markierten Antummunglobulin-Antikörper umfaßt;

eine Stufe des Trennens einer Phase, enthaltend den Sandwich- Immunkomplex; und

eine Stufe des Nachweises eines Markierungsmittels in der Phase,

wobei der Träger zum Binden eines Antiphospholipid-Antikörpers ein Träger ist, der durch Behandeln eines Trägers mit

einem daran gebundenen Phospholipid mit

einem oberflächenaktiven Mittel;

einem gereinigten Serumalbumin mit vermindertem Lipidgehalt; und

einem Protein, oder Serum, einem Plasma oder einer Fraktion davon, enthaltend das Protein,

hergestellt worden ist,

wobei das Protein aus menschlichem Serum oder Plasma erhalten worden ist, die Funktion des Verstärkens der Bindung eines Antikörpers, der spezifisch beim Antiphospholipid-Syndrom vorliegt, mit einem Phospholipid aufweist, und eine Hemmwirkung in bezug auf das Binden der Antiphospholipid-Antikörper, die aufgrund von Infektionskrankheiten vorliegen, an das Phospholipid aufweist und die folgenden physikochemischen Eigenschaften hat:

(a) sein Molekulargewicht beträgt ca. 50000 ± 2000, wenn es mittels SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese bestimmt worden ist, und sein isoelektrischer Punkt liegt bei ca. 6,60 ± 0,4; und

(b) das Protein ist dazu in der Lage, sich mit dem Phospholipid zu verbinden; und

(c) die Sequenz der 7 Aminosäuren vom N-Terminus des Proteins ist wie folgt:

NH&sub2;-Gly-Arg-Thr-X-Pro-Lys-Pro,

wobei man davon ausgeht, daß X Cys oder His ist.

2. Das Immunoassay-Verfahren nach Anspruch 1, in welchem das genannte Phospholipid eine elektronenspendende funktionelle Gruppe an der Stelle aufweist, die sich benachbart zur Phosphodiesterbindung befindet.

3. Das Immunoassay-Verfahren nach Anspruch 1, in welchem das genannte Phospholipid ein Glycerophospholipid ist, dargestellt durch die allgemeine Formel (I):

in welcher R¹ und R² jeweils unabhängig voneinander eine Acylgruppe mit einer Alkylgruppe oder einer Alkenylgruppe in der Kohlenstoffkette, oder eine Alkylgruppe oder eine Alkenylgruppe bedeuten; R³ ein Wasserstoffatom oder eine Gruppe -(CH&sub2;)n-CHR&sup4;-R&sup5; bedeutet; wobei R&sup4; ein Wasserstoffatom, eine Hydroxygruppe, eine Carboxylgruppe, eine Formylgruppe, eine Mercaptogruppe oder ein Halogenatom darstellt;und R&sup5; eine Aminogruppe, eine Hydroxyalkylgruppe oder ein Substituent, dargestellt durch die Formel (II), ist

in welcher R¹ und R² die gleiche Bedeutung haben, wie oben erwähnt; oder R&sup4; und R&sup5; miteinander kombiniert sein können, wobei ein Zucker- oder Zucker-Alkoholrest gebildet wird; und n 0 oder eine ganze Zahl von 1 bis 3 ist.

4. Das Immunoassay-Verfahren nach Anspruch 1, in welchem das genannte Phospholipid Cardiolipin ist.

5. Das Immunoassay-Verfahren nach Anspruch 1, in welchem das genannte oberflächenaktive Mittel ein nichtionisches oberflächenaktives Mittel ist.

6. Das Immunoassay-Verfahren nach Anspruch 1, in welchem der genannte Träger in einer Reaktionslösung unlöslich ist.

7. Eine Ausstattung zur Verwendung bei dem Immunoassay-Verfahren nach Anspruch 1, welche einen Träger zum Binden eines Antiphospholipid-Antikörpers umfaßt, der durch Behandeln eines Trägers mit einem daran gebundenen Phospholipid mit

einem oberflächenaktiven Mittel;

einem gereinigten Serumalbumin mit vermindertem Lipidgehalt; und

einem Protein oder Serum, einem Plasma oder einer Fraktion davon, enthaltend das Protein, hergestellt worden ist, wobei das Protein aus menschlichem Serum oder Plasma erhalten worden ist, die Funktion des Verstärkens der Bindung eines Antikörpers, der spezifisch beim Antiphospholipid-Syndrom vorliegt, mit einem Phospholipid aufweist und eine Hemmwirkung in bezug auf das Binden der Antiphospholipid- Antikörper, die aufgrund von Infektionskrankheiten vorliegen, an das Phospholipid aufweist und die folgenden physikochemi schen Eigenschaften hat:

(c) die Sequenz der 7 Aminosäuren vom N-Terminus des Proteins ist wie folgt:

NH&sub2;-Gly-Arg-Thr-X-Pro-Lys-Pro,

wobei man davon ausgeht, daß X Cys oder His ist.

8. Die Ausstattung nach Anspruch 7, in welcher das genannte Phospholipid eine elektronenspendende funktionelle Gruppe an der Stelle aufweist, die sich benachbart zur Phosphodiester- Bindung befindet.

9. Die Ausstattung nach Anspruch 7, in welcher das genannte Phospholipid ein Glycerophospholipid, dargestellt durch die allgemeine Formel (I), ist:

in welcher R¹ und R² jeweils unabhängig voneinander eine Acylgruppe mit einer Alkylgruppe oder einer Alkenylgruppe in der Kohlenstoffkette, oder eine Alkylgruppe oder eine Alkenylgruppe bedeuten; R³ ein Wasserstoffatom oder eine Gruppe -(CH&sub2;)n-CHR&sup4;-R&sup5; bedeutet;wobei R&sup4; ein Wasserstoffatom, eine Hydroxygruppe, eine Carboxylgruppe, eine Formylgruppe, eine Mercaptogruppe oder ein Halogenatom darstellt; und R&sup5; eine Aminogruppe, eine Hydroxyalkylgruppe oder ein Substituent, dargestellt durch die Formel (II), ist

10. Die Ausstattung nach Anspruch 7, in welcher das genannte Phospholipid Cardiolipin ist.

11. Die Ausstattung nach Anspruch 7, in welcher das genannte oberflächenaktive Mittel ein nichtionisches oberflächenaktives Mittel ist.

12. Die Ausstattung nach Anspruch 7, in welcher der genannte Träger in einer Reaktionslösung unlöslich ist.

13. Ein Immunoassay-Verfahren, welches die folgenden Verfahrensstufen umfaßt:

Eine erste Stufe der Antigen-Antikörper-Reaktion, welche das Kontaktieren eines Trägers zum Binden eines Antiphospholipid-Antikörpers mit einer Probelösung unter Bildung eines Immunkomplexes aus dem Antiphospholipid-Antikörper in der genannten Probelösung und dem Phospholipid an dem Träger umfaßt;

eine zweite Stufe der Antigen-Antikörper-Reaktion, welche das Umsetzen des Immunkomplexes mit einem markierten Antummunglobulin-Antikörper unter Bildung eines Sandwich-Immunkomplexes, der aus dem Immunkomplex und dem markierten Antiimmunglobulin-Antikörper besteht, umfaßt;

eine Stufe des Trennens einer Phase, enthaltend den Sandwich- Immunkomplex; und

eine Stufe des Nachweises eines Markierungsmittels in der Phase,

in welchem Verfahren der Träger zum Binden eines Antiphospholipid-Antikörpers ein Träger ist, der durch Behandeln eines Trägers mit einem daran gebundenen Phospholipid mit einem oberflächenaktiven Mittel hergestellt worden ist; und die Antigen-Antikörper-Reaktion in der ersten Stufe in Gegenwart eines Proteins, eines Serums,eines Plasmas oder einer Fraktion davon, enthaltend das Protein durchgeführt wird, welches Protein aus menschlichem Serum oder Plasma erhalten worden ist, eine Funktion des Verstärkens der Bindung eines Antikörpers, der spezifisch beim Antiphospholipid-Syndrom vorliegt, mit einem Phospholipid aufweist, und eine Hemmwirkung in bezug auf das Binden der Antiphospholipid-Antikörper, die aufgrund von Infektionskrankheiten vorliegen, an das Phospholipid aufweist und die folgenden physikochemischen Eigenschaften hat:

(c) die Sequenz der 7 Aminosäuren vom N-Terminus des Proteins ist wie folgt:

NH&sub2;-Gly-Arg-Thr-X-Pro-Lys-Pro,

wobei man davon ausgeht, daß X Cys oder His ist.

14. Ein Immunoassay-Verfahren nach Anspruch 13, in welchem der genannte Träger zum Binden eines Antiphospholipid-Antikörpers ein Träger ist, der durch Behandeln eines Trägers mit einem daran gebundenen Phospholipid mit

einem oberflächenaktiven Mittel; und

einem gereinigten Serumalbumin mit vermindertem Lipidgehalt

hergestellt worden ist.

15. Ein Immunoassay-Verfahren nach Anspruch 13, in welchem der genannte Träger zum Binden eines Antiphospholipid-Antikörpers ein Träger ist, der durch Behandeln eines Trägers mit einem daran gebundenen Phospholipid mit

einem oberflächenaktiven Mittel; und

einem gereinigten Serumalbumin mit vermindertem Lipidgehalt; und

einem Protein oder Serum, einem Plasma oder einer Fraktion davon, enthaltend das Protein, hergestellt worden ist, wobei das Protein aus menschlichem Serum oder Plasma erhalten worden ist, die Funktion des Verstärkens der Bindung eines Antikörpers, der spezifisch beim Antiphospholipid-Syndrom vorliegt, mit einem Phospholipid aufweist und eine Hemmwirkung in bezug auf das Binden der Antiphospholipid-Antikörper, die aufgrund von Infektionskrankheiten vorliegen, an das Phospholipid aufweist und die folgenden physikochemischen Eigenschaften hat:

(c) die Sequenz der 7 Aminosäuren vom N-Terminus des Proteins ist wie folgt:

NH&sub2;-Gly-Arg-Thr-X-Pro-Lys-Pro,

wobei man davon ausgeht, daß X Cys oder His ist.

16. Das Immunoassay-Verfahren nach Anspruch 13, in welchem das genannte Phospholipid eine elektronenspendende funktionelle Gruppe an der Stelle aufweist, die sich benachbart zur Phosphodiesterbindung befindet

17. Das Immunoassay-Verfahren nach Anspruch 13, in welchem das genannte Phospholipid ein Glycerophospholipid, dargestellt durch die Formel (I) ist.

in welcher R¹ und R² jeweils unabhängig voneinander eine Acylgruppe mit einer Alkylgruppe oder einer Alkenylgruppe in der Kohlenstoffkette, oder eine Alkylgruppe oder eine Alkenylgruppe bedeuten; R³ ein Wasserstoffatom oder eine Gruppe -(CH&sub2;)n-CHR&sup4;-R&sup5; bedeutet; wobei R&sup4; ein Wasserstoffatom, eine Hydroxygruppe, eine Carboxylgruppe, eine Formylgruppe, eine Mercaptogruppe oder ein Halogenatom darstellt; und R&sup5; eine Aminogruppe, eine Hydroxyalkylgruppe oder ein Substituent, dargestellt durch die Formel (II), ist

18. Das Immunoassay-Verfahren nach Anspruch 13, in welchem das genannte Phospholipid Cardiolipin ist.

19. Das Immunoassay-Verfahren nach Anspruch 13, in welchem das genannte oberflächenaktive Mittel ein nichtionisches oberflächenaktives Mittel ist.

20. Das Immunoassay-Verfahren nach Anspruch 13, in welchem der genannte Träger in einer Reaktionslösung unlöslich ist.

21. Die Ausstattung zur Verwendung im Immunoassay-Verfahren nach Anspruch 13, welche umfaßt:

(A) einen Träger zum Binden eines Antiphospholipid-Antikörpers, der durch Behandeln eines Träger mit einem daran gebundenen Phospholipid mit einem oberflächenaktiven Mittel hergestellt worden ist;

(B) einen markierten Antiimunglobulin-Antikörper; und

(C) eine Verdünnungsmittelprobe, die mit einem Protein oder Serum, einem Plasma oder einer Fraktion davon, enthaltend das Protein, angereichert ist, wobei das Protein von menschlichem Serum oder Plasma abgeleitet worden ist, eine Funktion des Verstärkens der Bindung eines Antikörpers, der spezifisch beim Antiphospholipid-Syndrom vorliegt, mit einem Phospholipid aufweist und eine Hemmwirkung in bezug auf das Binden der Antiphospholipid-Antikörper, die aufgrund von Infektionskrankheiten vorliegen, an das Phospholipid aufweist und die folgenden physikochemischen Eigenschaften hat:

(c) die Sequenz der 7 Aminosäuren vom N-Terminus des Proteins ist wie folgt:

NH&sub2;-Gly-Arg-Thr-X-Pro-Lys-Pro,

wobei man davon ausgeht, daß X Cys oder His ist.

22. Die Ausstattung nach Anspruch 21, in welcher der genannte Träger zum Binden eines Antiphospholipid-Antikörpers ein Träger ist, der durch Behandeln eines Trägers mit einem daran

gebundenen Phospholipid mit

einem oberflächenaktiven Mittel; und

einem gereinigten Serumalbumin mit vermindertem Lipidgehalt

hergestellt worden ist.

23. Die Ausstattung nach Anspruch 21, in welcher der genannte Träger zum Binden eines Antiphospholipid-Antikörpers ein Träger ist, der durch Behandeln eines Trägers mit einem daran gebundenen Phospholipid mit

einem oberflächenaktiven Mittel;

einem gereinigten Serumalbumin mit vermindertem Lipidgehalt; und

einem Protein oder Serum, einem Plasma oder einer Fraktion davon, enthaltend das Protein,hergestellt worden ist, wobei das Protein aus menschlichem Serum oder Plasma erhalten worden ist, die Funktion des Verstärkens der Bindung eines Antikörpers, der spezifisch beim Antiphospholipid-Syndrom vorliegt, mit einem Phospholipid aufweist und eine Hemwirkung in bezug auf das Binden der Antiphospholipid- Antikörper, die aufgrund von Infektionskrankheiten vorliegen, an das Phospholipid aufweist und die folgenden physikochemischen Eigenschaften hat:

(c) die Sequenz der 7 Aminosäuren vom N-Terminus des Proteins ist wie folgt:

NH&sub2;-Gly-Arg-Thr-X-Pro-Lys-Pro,

wobei man davon ausgeht, daß X Cys oder His ist.

24. Die Ausstattung nach Anspruch 21, in welcher das genannte Phospholipid eine elektronenspendende funktionelle Gruppe an der Stelle aufweist, die sich benachbart zur Phosphodiesterbindung befindet.

25. Die Ausstattung nach Anspruch 21, in welcher das genannte Phospholipid ein Glycerophospholipid, dargestellt durch die Formel (I), ist:

26. Die Ausstattung nach Anspruch 21, in welcher das genannte Phospholipid Cardiolipin ist.

27. Die Ausstattung nach Anspruch 21, in welcher das genannte oberflächenaktive Mittel ein nichtionisches oberflächenaktives Mittel ist.

28. Die Ausstattung nach Anspruch 21, in welcher der genannte Träger in einer Reaktionslösung unlöslich ist.

29. Ein Verfahren zum differenzierenden Nachweis eines Antiphospholipid-Antikörpers, der vom Antiphospholipid-Syndrom abgeleitet ist, und eines Antiphospholipid-Antikörpers, der von Infektionskrankheiten abgeleitet ist, welches die folgenden Verfahrensstufen aufweist:

(1) Kontaktieren eines phospholipid-gebundenen, zum Binden eines Antiphospholipid-Antikörpers geeigneten Trägers mit einer Probelösung, wobei ein erster Immunkomplex gebildet wird, und

(2) Umsetzen des ersten Immunkomplexes mit einem markierten Antiimunglobulin-Antikörper unter Bildung eines Sandwich- Immunkomplexes, der aus dem ersten Immunkomplex und dem markierten Antiimmunglobulin-Antikörper besteht, und

(3) Trennen der Phase, welche den Sandwich-Immunkomplex enthält, von der Phase, welche die nicht an den Träger gebundene Substanz enthält; und

(4) Nachweis eines Markierungsmittels in einer dieser Phasen;

in welchem Verfahren der mit dem Phospholipid verbundene Träger zum Binden eines Antiphospholipid-Antikörpers mit der Probelösung sowohl in Gegenwart als auch in Abwesenheit eines Proteins oder Serums, eines Plasmas oder einer Fraktion davon, enthaltend das Protein, kontaktiert wird, welches Protein aus menschlichem Serum oder Plasma erhalten worden ist und die Funktion des Verstärkens der Bindung eines Antikörpers, der spezifisch beim Antiphospholipid-Syndrom vorliegt, mit einem Phospholipid aufweist und eine Hemmwirkung in bezug auf das Binden der Antiphospholipid-Antikörper, die aufgrund von Infektionskrankheiten vorliegen, an das Phospholipid aufweist und die folgenden physikochemischen Eigenschaften hat:

(c) die Sequenz der 7 Aminosäuren vom N-Terminus des Proteins ist wie folgt:

NH&sub2;-Gly-Arg-Thr-X-Pro-Lys-Pro,

wobei man davon ausgeht, daß X Cys oder His ist,

wobei der Antiphospholipid-Antikörper, der vom Antiphospholipid-Syndrom abgeleitet ist, und der Antiphospholipid-Antikörper, der von Infektionskrankheiten abgeleitet ist, differenziert nachgewiesen werden.

30. Das Verfahren nach Anspruch 29, in welchem der genannte Träger zum Binden eines Antiphospholipid-Antikörpers ein Träger ist, der durch Behandeln eines Trägers mit einem daran gebundenen Phospholipid mit einem oberflächenaktiven Mittel hergestellt worden ist.

31. Das Verfahren nach Anspruch 29, in welchem der genannte Träger zum Binden eines Antiphospholipid-Antikörpers ein Träger ist, der durch Behandeln eines Trägers mit einem daran gebundenen Phospholipid mit

einem oberflächenaktiven Mittel; und

einem gereinigten Serumalbumin mit vermindertem Lipidgehalt

hergestellt worden ist.

32. Das Verfahren nach Anspruch 29, in welchem der genannte Träger zum Binden eines Antiphospholipid-Antikörpers ein Träger ist, der durch Behandeln eines Trägers mit einem daran gebundenen Phospholipid mit

einem oberflächenaktiven Mittel;

einem gereinigten Serumalbumin mit vermindertem Lipidgehalt; und

einem Protein, oder Serum, einem Plasma oder einer Fraktion davon, enthaltend das Protein, hergestellt worden ist, wobei das Protein aus menschlichem Serum oder Plasma erhalten worden ist, die Funktion des Verstärkens der Bindung eines Antikörpers, der spezifisch beim Antiphospholipid-Syndrom vorliegt, mit einem Phospholipid aufweist und eine Hemmwirkung in bezug auf das Binden der Antiphospholipid-Antikörper, die aufgrund von Infektionskrankheiten vorliegen, an das Phospholipid aufweist, und die folgenden physikochemischen Eigenschaften hat:

(c) die Sequenz der 7 Aminosäuren vom N-Terminus des Proteins ist wie folgt:

NH&sub2;-Gly-Arg-Thr-X-Pro-Lys-Pro,

wobei man annimmt, daß X Cys oder His ist.

33. Das Verfahren nach Anspruch 29, in welchem das genannte Phospholipid eine elektronenspendende funktionelle Gruppe an der Stelle aufweist, die sich benachbart zur Phosphodiesterbindung befindet.

34. Das Verfahren nach Anspruch 29, in welchem das genannte Phospholipid ein Glycerophospholipid, dargestellt durch die Formel (I), ist:

35. Das Verfahren nach Anspruch 29, in welchem das genannte Phospholipid Cardiolipin ist.

36. Das Verfahren nach Anspruch 29, in welchem das genannte oberflächenaktive Mittel ein nichtionisches oberflächenaktives Mittel ist.

37. Das Verfahren nach Anspruch 29, in welchem der genannte Träger in einer Reaktionslösung unlöslich ist.

38. Eine Ausstattung zur Verwendung in dem Immunoassay-Verfahren nach Anspruch 29, welche umfaßt:

einen phosholipid-gebundenen Träger, und

ein Protein, das aus menschlichem Serum oder Plasma erhalten worden ist, die Funktion des Verstärkens der Bindung eines Antikörpers, der spezifisch beim Antiphospholipid-Syndrom vorliegt, mit einem Phospholipid aufweist und eine Hemmwirkung in bezug auf das Binden der Antiphospholipid-Antikörper, die aufgrund von Infektionskrankheiten vorliegen, an das Phospholipid aufweist und die folgenden physikochemischen Eigenschaften hat:

(c) die Sequenz der 7 Aminosäuren vom N-Terminus des Proteins ist wie folgt:

NH&sub2; -Gly-Arg-Thr-X-Pro-Lys-Pro,

wobei man davon ausgeht, daß X Cys oder His ist.

39. Die Ausstattung nach Anspruch 38, in welcher der genannte Träger zum Binden eines Antiphospholipid-Antikörpers ein Träger ist, der durch Behandeln eines Trägers mit einem daran gebundenen Phospholipid mit einem oberflächenaktive Mittel hergestellt worden ist.

40. Die Ausstattung nach Anspruch 38, in welcher der genannte Träger zum Binden eines Antiphospholipid-Antikörpers ein Träger ist, der durch Behandeln eines Trägers mit einem daran gebundenen Phospholipid mit

einem oberflächenaktiven Mittel; und

einem gereinigten Serumalbumin mit vermindertem Lipidgehalt

hergestellt worden ist.

41. Die Ausstattung nach Anspruch 38, in welcher der genannte Träger zum Binden eines Antiphospholipid-Antikörpers ein Träger ist, der durch Behandeln eines Trägers mit einem daran

gebundenen Phospholipid mit

einem oberflächenaktiven Mittel;

einem gereinigten Serumalbumin mit vermindertem Lipidgehalt; und

einem Protein, oder Serum, einem Plasma oder einer Fraktion davon, enthaltend das Protein, hergestellt worden ist, wobei das Protein aus menschlichem Serum oder Plasma erhalten worden ist, die Funktion des Verstärkens der Bindung eines Antikörpers, der spezifisch beim Antiphospholipid-Syndrom vorliegt, mit einem Phospholipid aufweist und eine Hemmwirkung auf das Binden der Antiphospholipid-Antikörper, die aufgrund von Infektionskrankheiten vorliegen, an das Phospholipid aufweist und die folgenden physikochemischen Eigenschaften hat:

(b) das Protein ist dazu in der Lage, sich mit dem Phdspholipid zu verbinden; und

(c) die Sequenz der 7 Aminosäuren vom N-Terminus des Proteins ist wie folgt:

NH&sub2;-Gly-Arg-Thr-X-Pro-Lys-Pro,

wobei man davon ausgeht, daß X Cys oder His ist.

42. Die Ausstattung nach Anspruch 38, in welcher das genannte Phospholipid eine elektronenspendende funktionelle Gruppe an der Stelle aufweist, die sich benachbart zur Phosphodiesterbindung befindet.

43. Die Ausstattung nach Anspruch 38, in welcher das genannte Phospholipid ein Glycerophosholipid, dargestellt durch die allgemeine Formel (I), ist:

44. Die Ausstattung nach Anspruch 38, in welcher das genannte Phospholipid Cardiolipin ist.

45. Die Ausstattung nach Anspruch 38, in welcher das genannte oberflächenaktive Mittel ein nichtionisches oberflächenaktives Mittel ist.

46. Die Ausstattung nach Anspruch 38, in welcher der genannte Träger in einer Reaktionslösung unlöslich ist.