DE69127470T2

DE69127470T2 - Verstärkung der unterdrückungsregulation von autoimmunkrankheiten durch orale oder enterale verabreichung von autoantigenen

Info

Publication number: DE69127470T2
Application number: DE69127470T
Authority: DE
Inventors: David Allen Hafler; Samia J Khoury; Howard L Weiner
Original assignee: Autoimmune Inc
Current assignee: Autoimmune Inc
Priority date: 1990-03-02
Filing date: 1991-03-04
Publication date: 1998-02-19
Anticipated expiration: 2011-03-05
Also published as: DK0594607T3; WO1991012816A1; EP0782859A1; AU651097B2; HUT61896A; EP0594607A4; JPH05508621A; EP0594607A1; ES2107459T3; BR9106114A; CA2077340A1; HU210813A9; AU7578991A; IL97446A0; DE69127470D1; EP0594607B1; NO923395L; ATE157257T1; HU9202808D0; NO923395D0

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Verbesserung bei der Behandlung von Autoimmunkrankheiten und insbesondere T-Zell-vermittelten oder T-Zell-abhängigen Autoimmunerkrankungen. Insbesondere ist die vorliegende Erfindung auf die Verwendung von Synergisten zur Verstärkung der Aktivität oral oder enteral verabreichter Autoantigene gerichtet oder auf Krankheits-unterdrückende Fragmente oder Analoge davon, bei der prophylaktischen und therapeutischen Behandlung von Autoimmunerkrankungen.
Autoimmunerkrankungen sind durch eine abnormale Immunreaktion gekennzeichnet (die entweder Zeilen oder Antikörper involviert), die gegen normale autologe Gewebe gerichtet ist.
Eine Anzahl von Strategien wurde verwendet oder vorgeschlagen, um Autoimmunerkrankungen zu unterdrücken, insbesondere Arzneimittel, wie z.B. Cyclophosphamid, Cyclosporin A, Methotrexat und Imuran (Azothioprin). Auch Steroidverbindungen, wie z.B. Prednison und Methylprednisolon werden in vielen Fällen verwendet. Diese Arzneimittel weisen eine begrenzte Wirksamkeit über eine lange Zeitspanne betrachtet auf, sowohl gegen Zell- als auch Antikörper-vermittelte Autoimmunerkrankungen. Die Verwendung solcher Arzneimittel ist aufgrund ihrer toxischen Nebenwirkungen gegen andere Organsysteme begrenzt, und auch, da sie eine "globale" Immunsuppression bei einem Patienten induzieren, der länger mit diesen Arzneimitteln behandelt wird, z.B. wird die normale schützende Immunreaktion gegen pathogene Mikroorganismen herabreguliert, wodurch das Risiko von Infektionen, die durch diese Pathogene ausgelöst werden, vergrößert wird. Es ist ein weiterer Nachteil, daß ein verstärktes Risiko besteht, daß sich maligne Tumoren bei Patienten entwickeln können, die eine verlängerte globale Immunosuppression erhalten.
Andere Therapien wurden für die Behandlung von Autoimmunerkrankungen vorgeschlagen. Die internationale Patentanmedung WO 88/10120 offenbart, daß die orale oder enterale Verabreichung von basischem Myelinprotein (MBP) und Krankheitsinduzierenden und nicht-induzierenden Fragmenten und Analogen davon bei der Suppression von akuter, monophasischer, experimenteller, allergischer Encephalomyelitis (EAE) wirksam ist, einer induzierten T-Zell-vermittelten Autoimmunerkrankung, die gegen das basische Myelinprotein gerichtet ist (MBP), siehe auch J. Immunology, Bd. 140, S. 440-445 (1988). EAE ist ein bekanntes und breit verwendetes Tiermodell für die menschliche Krankheit Multiple Sklerose (MS). Die oben erwähnten Anmeldungen offenbaren auch, daß die orale oder enterale Verabreichung von Mycobacterium tuberculosis eine effektive Behandlung zur Unterdrückung von Adjuvans-Arthritis ist und extrapolieren die vorstehenden Ergebnisse auf die Behandlung anderer Autoimmunerkrankungen.
Die internationale Patentanmeldung WO 91/01333 offenbart die orale oder enterale Verabreichung von S-Antigen für die Behandlung von Autoimmun-Uveoretinitis.
Die internationale Patentanmeldung WO 91/08760, veröffentlicht nach Anmededatum der vorliegenden Anmeldung, offenbart die Aerosol-Verabreichung von Autoantigenen für die Behandlung von Zell- und Antikörper-vermittelten Autoimmunerkrankungen.
Nagler-Anderson et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 83: 7443-7446, 1986) beschreiben die orale Verabreichung von Collagen zur Unterdrückung einer Collagen-induzierten Arthritis in einem Mäusemodell.
Verschiedene Verfahren wurden verwendet, um eine Antigen-spezifische Suppression von EAE zu induzieren, wie z.B. eine Immunisierung mit MBP, emulgiert in inkomplettem Freund's Adjuvans (Lando, Z. et al. J. Immunol. 126:1526 (1981)), und die intravenöse Injektion von MBP-konjugierten Lymphoidzellen (Sriram, S. et al. Cell. Immunol. 75: 378 (1983)).
Traugott et al., J. Neurol. Sci. 56: 65-73 (1982) und Raine et al., Lab. Investigation 48: 275-84 (1983) offenbaren, daß die Behandlung eines Stamms von Meerschweinchen, der an chronischer wiederauftretender EAE leidet, bei parenteraler Verabreichung von MBP allein oder in inkomplettem Freund's Adjuvans (IFA) oder in Kombination mit Galactocerebrosid, einem Lipid-Hapten von Myelin, die klinischen EAE-Symptome unterdrückte.
Mc Kenna et al., Cell. Immun. 81: 391402 (1983), offenbaren, daß die Präinjektion von Ratten mit Meerschweinchen-MBP, gekoppelt mit syngenen Milz-Leucozyten oder mit syngenen roten Blutzellen die folgende Induktion von EAE (in Dosis-abhängiger Weise) supprimiert, wobei Meerschweinchen-MBP in Freund's komplettem Adjuvans verwendet wurde.
Basierend auf einem Abstract in englischer Sprache offenbaren Belik et al., Vopr. Med. Khim. 24: 372-377 (1978), (gemäß einer Zusammenfassung in englischer Sprache) die parenterale Verabreichung von "alkalischem Myelinproteinfragment" (AMPF) und "synthetischem encephalitogenen Peptid" (SEP) an Meerschweinchen mit EAE. Die Tiere wurden durch bovines AMPF oder durch SEP sensibilisiert, erholten sich aber nach AMPF-Verabreichung.
Braley-Mullen et al., Cell. Immun. 51: 408 (1980), und Nagler-Andeson et al., oben erwähnt, offenbaren beide die Unterdrückung von Symptomen von zwei anderen experimentellen Autoimmunerkrankungen, die durch Injektion von Tieren mit Autoantigen- Lymphocyten-Konjugaten induziert wurden. Braley-Mullen et al. berichten über die Suppression von experimenteller Autoimmunthyreoiditis bei Meerschweinchen durch Injektion von Thyroglobulin-Antigen in IFA. Nagler-Anderson et al. berichten über die Suppression von Collagen-induzierter Typ-II-Arthritis bei Mäusen durch intragastrische Verabreichung von löslichen, aber nicht denaturierten, Typ-II-Collagenen vor einer Immunisierung des Tiers mit Typ-II-Collagen in Adjuvans.
Newby, T.J. et al. (Local Immune Responses in the Gut, S. 1191, CRC Press, Boca Raton, FL, 1984; Immunol. 41: 617-621, 1980) berichten, daß die Verfütterung von bakteriellem LPS an Mäuse die Toleranz gegen eine Kontakt-Hypersensibilität verstärken kann, die durch oral verabreichtes Antigen (Pikrylchlorid) induziert wird. Jedoch hatte die gleichzeitige orale Verabreichung von LPS und Pikrylchlorid keine statistisch signifikante Wirkung auf die verzögerten Hypersensibilitäts-(DTH)-Reaktionen auf dieses Antigen.
Michalek et al. (J. Immunol. 128: 1992-1998, 1982) berichten, daß die verlängerte gastrische Intubation (d.h. enterale Verabreichung) von roten Blutzellen von Schafen (SRBC) gefolgt von systemischer Verabreichung von SRBC, zu einer verstärkten Milz- Immunreaktion bei LPS-nicht-reaktiven Mäusen führte und zu einer oralen Toleranz bei LPS-reaktiven Mäusen. Es wurde keine Co-Verabreichung von LPS vorgeschlagen.
Mowat, A.M. et al. Immunol. 58: 677-683, 1986, offenbaren, daß die simultane Verabreichung von LPS (intravenös) an normale Mäuse, die mit Ovalbumin gefüttert wurden, die Induktion einer oralen Toleranz verhinderte, jedoch die verzögerten Hypersensibilitäts- (DTH)-Reaktionen auf gefüttertes Ovalbumin nicht verhinderte.
Hamada, T. et al. (Autoimmunity 2: 275-284, 1989) berichten, daß die LPS-Behandlung von MBP-sensibilisierten Lymphoid-Zellen in vitro den adoptiven Transfer von EAE bei Lewis-Ratten verstärkte.
Aufgrund der fortschreitenden, zerstörerischen Natur von Autoimmunerkrankungen werden auf diesem Gebiet verbesserte Verfahren zur Behandlung von Autoimmunerkrankungen benötigt.
Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, pharmazeutische Formulierungen zur Behandlung von Säugern vorzusehen, die an einer Autoimmunerkrankung leiden.
Die vorliegende Erfindung ist auf eine verbesserte pharmazeutische Formulierung zur Behandlung oder Verhinderung T-Zell-vermittelter oder T-Zell-abhängiger Autoimmunkrankheit (AD) gerichtet, die folgendes umfaßt:
(a) ein AD-suppressives Mittel in oraler oder enteraler Dosierungsform, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus (i) Autoantigenen, die spezifisch für diese Autoimmunkrankheit sind, (ii) AD-suppressiven Fragmenten der Autoantigene und (iii) AD- suppressiven Analogen der Autoantigene oder Fragmente;
(b) mindestens eine Verbindung, die die Eigenschaft einer Verstärkung der AD-suppressiven Aktivität des Mittels aufweist, wobei die Verbindung, wenn sie in Kombination mit dem AD-suppressiven Mittel verabreicht wird, der Formulierung eine oder beide der folgenden Eigenschaften verleiht:
(i) die Eigenschaft der Induktion einer Produktion und/oder Sekretion von Interleukin-1 und
(ii) die Eigenschaft einer Verminderung der Expression von Klasse-II-Histokompatibilitätsmolekülen durch Darmepithel-Zellen; und
(c) einen physiologisch akzeptablen Träger oder Verdünnungsmittel.
Die Menge der verstärkenden Verbindung sollte wirksam sein, um das AD-supprimierende Mittel zu potenzieren und wirksam sein, um die supprimierende Aktivität des AD- Suppressionsmittels zu verstärken, wenn es in einer Menge verabreicht wird, die bereits wirksam ist, um AD-Symptome zu supprimieren.
Die Aktivitäts-verstärkende Verbindung (die hier oft als "Synergist" bezeichnet werden wird) muß nicht oral oder enteral verabreicht werden; jedoch wird die orale oder enterale Verabreichung bevorzugt. Außerdem kann jede mögliche Reihenfolge der Verabreichung des suppressiven Mittels und des Synergisten verwendet werden, obwohl die im wesentlichen gleichzeitige Verabreichung bevorzugt wird.

Kurze Beschreibung der Figuren

Figur 1 ist eine Säulengrafik, die die Wirkung der Verfütterung von MBP-LPS auf die verzögerten Hypersensibilitäts-(DTH)-Reaktionen bei Ratten zeigt.
Figur 2 ist eine Säulengrafik, die die Wirkung der Verfütterung von MBP-Lipid A auf DTH-Reaktionen bei Ratten zeigt.
Figur 3 (A-C) ist eine Reihe von Säulengrafiken, die die Wirkung der Verfütterung von MBP + LPS auf chronisches EAE bei Meerschweinchen zeigt.
Die Behandlung von T-Zell-vermittelten oder T-Zell-abhängigen Autoimmunerkrankungen durch (a) die orale oder enterale Verabreichung eines AD-supprimierenden Mittels und (b) die Verabreichung von einer oder mehrerer Verbindungen, die die AD- supprimierende Aktivität des Mittels verstärken, wird beschrieben.
"Die Behandlung" bedeutet hier sowohl die prophylaktische Behandlung zur Verhinderung von Autoimmunerkrankungen (oder der Manifestation ihrer klinischen Symptome) wie auch die therapeutische Suppression oder Abschwächung der Symptome nach dem Ausbruch einer solchen Autoimmunerkrankung.
Die Bezeichnung "Säuger" umfaßt alle Lebensformen, die ein immunoregulatorisches System aufweisen und daher für Autoimmunerkrankungen anfällig sind.
Eine Autoimmunerkrankung ist eine Fehlfunktion des Immunsystems von Säugern, einschließlich Menschen, wobei das Immunsystem nicht mehr zwischen Fremdsubstanzen im Säuger und autologen Geweben oder Substanzen unterscheiden kann und daher autologe Gewebe und Substanzen behandelt, als wären sie fremd.
Ein "Autoantigen" ist jede Substanz, die in der Regel innerhalb eines Säugers gefunden wird, die, in einer abnormalen Situation, durch die Lymphocyten oder Antikörper des Saugers nicht mehr als Teil des Säugers selbst erkannt wird und daher vom immunoregulatorischen System angegriffen wird, als handle es sich um eine fremde Substanz. Die Bezeichnung umfaßt auch antigene Substanzen, die Bedingungen auslösen, die die Symptome einer Autoimmunerkrankung zeigen, wenn sie Säugern verabreicht werden.
Die Bezeichnung "AD-suppressives Fragment (Fragmente)" solcher Autoantigene umfaßt jedes Peptid oder Polypeptid oder andere Verbindung, die Teile der Aminosequenzen oder Bestandteile der Autoantigene umfassen und die Fähigkeit zur Suppression oder Verhinderung einer T-Zell-vermittelten oder T-Zell-abhängigen Autoimmunreaktion, nach oraler oder enteraler Verabreichung besitzen. Es sollte festgehalten werden, daß ein solches Fragment nicht auch die autoantigenen Eigenschaften des gesamten Autoantigens besitzen muß. Zum Beispiel wurde im Hinblick auf MBP entdeckt, das, wenn es parenteral mit einem Adjuvant verabreicht wird, EAE bei empfänglichen Säugern auslöst, daß bestimmte nicht-Krankheits-induzierende Fragmente von MBP dennoch eine AD-suppressive Aktivität besaßen, wie offenbart in der internationalen Patentanmeldung WO 88/101210.
Die Bezeichnung "Analog (Analoge)" solcher Autoantigene oder Fragmente umfaßt Verbindungen, die so strukturell mit diesen Autoantigenen oder ihren AD-suppressiven Fragmenten verwandt sind, daß sie dieselbe biologische Aktivität besitzen, d.h., die Fähigkeit zur Eliminierung oder Unterdrückung von T-Zell-vermittelter oder T-Zell-abhängiger Autoimmunreaktion nach oraler oder enteraler Verabreichung. Zum Beispiel umfaßt die Bezeichnung Peptide mit Aminosäuresequenzen, die sich von der Aminosäuresequenz des Autoantigens in einer oder mehreren Aminosäureresten unterscheiden (obwohl sie weiterhin die AD-suppressive Aktivität behalten), wie auch Verbindungen oder Zusammensetzungen, die die AD-suppressive Aktivität der Autoantigene in ihrer Fähigkeit zur Suppression oder Abschwächung der Symptome der Krankheit nachahmen. Ein Beispiel solcher Zusammensetzung ist Gewebe aus einem Organ, das das Ziel eines Angriffs einer Autoimmunerkrankung ist.
Ein "Autoimmunerkrankungs-supprimierendes Mittel" oder "AD-suppressives Mittel" ist eine Verbindung oder Zusammensetzung, die die klinische Manifestation einer bestimmten Autoimmunerkrankung verhindert oder verzögert, wenn sie einem Säuger oral oder enteral verabreicht wird. Die Bezeichnung umfaßt Autoantigene, die für eine bestimmte Autoimmun-Erkrankung spezifisch sind, wie auch AD-suppressive Fragmente oder Analoge davon, wie oben definiert.
"Synergisten", wie hier definiert, sind Substanzen, die die Suppression der klinischen Manifestation von Autoimmunerkrankungen verstärken oder unterstützen, wenn sie oral in Zusammenhang mit der Verabreichung von AD-suppressiven Mitteln verabreicht werden. "In Zusammenhang mit", wie im vorstehenden Satz gebraucht, (hier auch bezeichnet als "in Assoziation mit") bedeutet vor, im wesentlichen gleichzeitig mit oder nach der oralen oder enteralen Verabreichung des AD-suppressiven Mittels. Natürlich sollte die Verabreichung des Synergisten nicht in einem so großen zeitlichen Abstand auf die Verabreichung des AD-suppressiven Mittels folgen oder diesem vorausgehen, daß die Wirkungen der zuerst verabreichten Substanz bereits nachgelassen haben. Daher sollten die Synergisten innerhalb von 24 Std. zu dem AD-suppressiven Mittel verabreicht werden.
Beispiele für Synergisten zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung umfassen bakterielle Lipopolysaccharide aus einer großen Vielzahl gram-negativer Bakterien, wie z.B. verschiedene Untergruppen von E. coli oder Salmonella (LPS, Sigma Chemical Co. St. Louis, MO, Difco, Detroit, MI, BIOMOL Res. Labs, Plymouth Meeting, PA), Lipid A Glycarylcysteinyl-seryl-serin (P&sub3;CSS) kovalent verbunden sind, die erhalten werden können, wie offenbart in Deres, K. et al., Nature 342: 561-564, 1989) oder "Braun's", Lipoprotein aus E. coli, das erhalten werden kann, wie offenbart in Braun, V., Biochim. Biohys. Acta 435: 335-337, 1976, ohne darauf begrenzt zu sein. LPS wird bevorzugt und Lipid A wird besonders bevorzugt. Lipid A wird besonders zur Verwendung bei der vorliegenden Erfindung bevorzugt, da es weniger toxisch ist als das gesamte LPS- Molekül. LPS zur Verwendung bei der vorliegenden Erfindung kann auch aus gramnegativen Bakterien extrahiert werden und unter Verwendung der Verfahren von Galanes, C. et al. (Eur. J. Biochem. 9: 245, 1969) und Skelly, R. R. et al. (Infect. Immun. 23: 287, 1979) gereinigt werden.
Es ist ein gemeinsames Merkmal der biologisch aktiven Materialien, die als Synergisten bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, daß sie die Erzeugung und/oder Sekretion von Interleukin-1 (IL-1) induzieren.
IL-1 ist ein Protein, das durch viele normale und transformierte Zellen erzeugt wird, und es wird im wesentlichen durch Makrophagen, Monocyten und Keratinocyten erzeugt. Mikrobielle Erzeugnisse, wie z.B. Endotoxine, Exotoxine, Hefezellwände und virale Hämagglutinine induzieren die IL-1-Erzeugung durch Monocyten. IL-1 weist ein breites Spektrum biologischer Aktivitäten auf Zellen des Immunsystems auf, wie auch auf Zellen außerhalb des Immunsystems, und wird als wesentlicher Entzündungsvermittler betrachtet.
Die Verabreichung von Synergisten in Assoziation mit der oralen oder enteralen Verabreichung eines AD-suppressiven Mittels verstärkt die Aktivität des Mittels bei der Unterdrückung der Symptome der Autoimmunerkrankung, für die das Mittel spezifisch ist, deutlich. Anders ausgedrückt, wird die Wirksamkeit der Behandlung der betreffenden Autoimmunerkrankung durch Co-Verabreichung des Synergisten verstärkt (im Vergleich mit der Wirksamkeit der Verwendung des AD-suppressiven Mittels allein).
Gemäß der vorliegenden Erfindung wandert das AD-suppressive Mittel nach seiner oralen oder enteralen Verabreichung (d.h., direkt in den Magen) in den Dünndarm, wo es in Kontakt mit den Peyers-Haufen-Zellen kommt, die Ansammlungen von Immunocyten sind, die unter der Intestinalwand lokalisiert sind. Diese Zeilen, wie auch intraes in Kontakt mit den Peyers-Haufen-Zellen kommt, die Ansammlungen von Immunocyten sind, die unter der Intestinalwand lokalisiert sind. Diese Zellen, wie auch intraepitheliale Lymphocyten (lokalisiert unter dem intestinalen Epithelium) stehen in Verbindung mit dem Immunsystem, einschließlich der Miiz und der Lymphknoten. Im Ergebnis wird die Toleranz gegen das AD-suppressive Mittel induziert und die gegen die eigenen Gewebe des Saugers gerichtete Immunreaktion wird abgeschwächt oder vollständig unterdrückt. Die so induzierte Toleranz ist für die Autoimmunerkrankung spezifisch: Es wurde keine Wirkung auf die Fähigkeit des behandelten Säugers zur Errichtung einer Reaktion gegen ein Pathogen bemerkt. Außerdem löste die orale oder enterale Verabreichung eines irrelevanten Antigens (d.h., eines, das nicht an der Autoimmunerkrankung beteiligt ist, wie z.B. Rinderserumalbumin) keine Wirkung auf die klinische Manifestation der Autoimmunerkrankung oder auf die Empfänglichkeit des Säugers gegen eine induzierbare Kondition (wie z.B. EAE oder AA) aus, die als Modell für eine Autoimmunerkrankung gelten.
Die durch die AD-suppressiven Mittel induzierte Toleranz ist Dosis-abhängig: In einem breiten oralen oder enteralen Dosierungsbereich steigt die Suppression (oder Abschwächung) klinischer oder histologischer Manifestationen der Krankheit mit ansteigender Dosis des aufgenommenen AD-suppressiven Mittels an.
Die Fähigkeit des Synergisten zur Verstärkung oral induzierter Toleranz durch ein Autoantigen ist ebenfalls Dosis-abhängig, d.h., sie steigt mit steigender Dosierung des Synergisten. Da jedoch die Verstärkung der oral induzierten Toleranz durch den Synergisten tatsächlich synergistisch ist, nimmt man an, daß die Verwendung des Synergisten die durch relativ hohe orale oder enterale Dosierungen der AD-suppressiven Mittel induzierte Toleranz noch weiter verbessert wird. Anders ausgedrückt, sollte die assoziierte Verwendung des Synergisten niedrigere Dosierungen eines zu verwendenden AD- suppressiven Mittels genügen, um denselben Grad der Suppression klinischer Symptome zu ermöglichen.
Die Aktivität des Synergisten bei der Verstärkung einer oral-induzierten Toleranz ist nicht spezifisch für das bestimmte AD-suppressive Mittel. Sowohl EAE- als auch DTH- Reaktionen wurden nach Co-Administration des spezifischen Autoantigens und der Synergisten herabreguliert. Daher kann die Fähigkeit des Synergisten zur Verstärkung einer oral-induzierten spezifischen Toleranz gegen ein Autoantigen auf jedes andere AD-suppressive Mittel extrapoliert werden, das von der vorliegenden Erfindung umfaßt wird. Dennoch hat die Verabreichung des Synergisten allein minimale oder keine Wirkung auf die Abschwachung entweder einer spezifischen Immunreaktion eines Säugers auf ein bestimmtes Autoantigen oder die Fähigkeit des Saugers zur Auslösung einer Immunreaktion gegen ein Exoantigen (d.h., eine echte fremde antigene Substanz). Die Verwendung des Synergisten birgt daher diesen wichtigen zweiteiligen Vorteil unter anderen: Verstärkung der Suppression der spezifischen Immunreaktion gegen ein Autoantigen und im wesentlichen keine Wirkung auf die Fähigkeit des so behandelten Subjekts zur Errichtung einer Immunreaktion gegen eindringende Pathogene.
Verschiedene Modellsysteme wurden zur Untersuchung von Autoimmunerkrankungen entwickelt. Die experimentelle allergische Enzephalomyelitis (EAE) wurde bei Mäusen und anderen Säugerarten als Modell für Multiple Sklerose (MS) untersucht. Die Erkrankung wird durch parenterale Verabreichung von MBP und einem Adjuvans induziert (wie z.B. Freund's komplettem Adjuvans). Diese Behandlung induziert sowohl eine monophasische als auch eine sich verschlechternde wiederkehrende Form der entmyelinisierenden Erkrankung (abhängig von der Art und den Details der Verabreichung). Die induzierte Erkrankung weist die Kennzeichen von MS auf. Die parenterale Verabreichung von Mycobacterium tuberculosis in Freund's komplettem Adjuvans-Öl in den dorsalen Wurzelschwanz von empfänglichen Saugern induziert eine Erkrankung mit den Kennzeichen menschlicher rheumatoider Arthritis. Zusätzlich induziert die Verabreichung von S-Antigen und einem Adjuvans an Lewis-Ratten eine Autoimmun-Uveoretinitis, während sich eine Diabetes spontan bei NOD-Mäusen und der BB-Ratte entwickelt. Verschiedene dieser Modellsysteme können verwendet werden, um die Wirksamkeit und die verbesserte Behandlung zu demonstrieren, die durch die vorliegende Erfindung bereitgestellt werden.
Nicht begrenzende Beispiele der Autoimmunerkrankungen, die Zell-vermittelt sind, umfassen Multiple Sklerose, Rheumatoide Arthritis, Autoimmun-Uveoretinitis, Diabetes (insbesondere die juvenile Diabetes) und Autoimmunthyreoiditis. Eine nicht begrenzende Liste von Krankheitsmodellen und den spezifischen Autoantigenen, die bei der Behandlung dieser Erkrankungen wirksam sind, wenn sie in oraler oder enteraler Form verabreicht werden, sind in der Tabelle 1 unten aufgeführt. TABELLE 1
Für jede Autoimmunerkrankung können Gewebeextrakte wie auch die oben beschriebenen spezifischen Antigene verwendet werden.
Andere Autoimmunerkrankungen und ihre spezifischen Autoantigene und/oder Zielgewebe sind bei Schwartz, R.S. et al. in Fundamental Immunology, Zweite Ausgabe, Paul W.E. Hrsg., S. 819-859, Raven Press, NY, 1989, offenbart.
Autoantigene zur Verwendung bei der vorliegenden Erfindung können aus dem Gewebe isoliert werden, das das Ziel einer bestimmten Autoimmunerkrankung ist. Z.B. kann das basische Myelinprotein (MBP) zur Verwendung bei der Behandlung von MS unter Verwendung des Verfahrens von Diebler et al. (infra), wie dargestellt in Beispiel 1 unten, aus Säugern isoliert und gereinigt werden.
Wenn eine Krankheit mit den Symptomen einer Rheumatoiden Arthritis behandelt wirdv kann Kollagen durch das Verfahren von Trentham et al., J. Exp. Med. 146; 857, 1977, isoliert und gereinigt werden.
Zur Behandlung einer Autoimmun-Uveoretinitis kann gereinigtes S-Antigen wie beschrieben in der ebenfalls anhängigen internationalen Patentanmeldung WO 91101333 erhalten werden.
Fragmente und Analoge von Autoantigenen zur Verwendung bei der vorliegenden Erfindung können unter Verwendung von Festphasensyntheseverfahren synthetisiert werden, die im Stand der Technik bekannt sind, wie z.B. diejenigen von Merrifield, R.B. (Fed. Proc. Am. Soc. Ex. Biol. 21: 412, 1962 und J. Am. Chem. Soc. 85: 2149, 1963) und Mitchel, A.R. et al., (J. Am. Chem. Soc. 98: 7357, 1976) wie auch von Tam J. et al., (J. Am. Chem. Soc. 105: 6442, 1983). Analoge können durch Identifizierung einer äquivalenten Aminosauresequenz und Verwendung der oben offenbarten Peptidsyntheseverfahren konstruiert werden.
Analoge können, z.B. unter Verwendung der bekannten Aminosäuresequenz von GP- MBP bereitgestellt werden, wie offenbart in G. Hashim, in Myelin: Chemistry and Biology Alan R. lisa, N.Y., 1980, unter Verwendung der oben beschriebenen Verfahren und in Eyler, E.H., in Advances in Experimental Medicine and Biology 98: 259-281,1978. Zum Beispiel kann ein Peptid mit einer Sequenz, die der von Meerschweinchen-MBP (GP- MBP) in den Aminosäureresten 72-85 entspricht, wie offenbart von Hashim (supra), chemisch unter Verwendung der oben beschriebenen Verfahren mit einer Aminosäuresubstitution an der terminalen Asparaginstellung zu Glutamin synthetisiert werden. Das Peptid kann auf die Krankheits-unterdrückende Aktivität überprüft werden, wenn es in oraler oder enteraler Form verabreicht wird, unter Verwendung der in Beispiel 2 unten beschriebenen Verfahren.
Krankheits-suppressive Analoge und Fragmente können unter Verwendung von im Stand der Technik bekannten rekombinanten DNA-Verfahren hergestellt werden.
Die vorliegende Erfindung stellt auch pharmazeutische Formulierungen zur Behandlung von Säugern bereit, die an Autoimmunerkrankungen leiden, die eine Menge eines Synergisten umfassen (wie unten beschrieben), die wirksam ist zur Verstärkung der Autoimmunerkrankungs-suppressiven Wirkung des AD-suppressiven Mittels, einen pharmazeutisch akzeptablen Träger oder ein Verdünnungsmittel und ein AD-suppressives Mittel, das für die Autoimmunerkrankung spezifisch ist, in einer wirksamen Menge (einzeln oder zusammen mit der Menge des Synergisten) zur Behandlung oder Verhinderung der klinischen Symptome einer spezifischen Autoimmunerkrankung.
Jede Formulierung gemäß der vorliegenden Erfindung kann außerdem inerte Bestandteile umfassen, einschließlich pharmazeutisch akzeptabler Träger, Verdünnungsmitteln, Füllstoffen, Solubilisierungsmitteln oder Emulgatoren und Salzen, wie bekannt im Stand der Technik. Z.B. können Tabletten in Übereinstimmung mit konventionellen Verfahren unter Verwendung fester Träger, die im Stand der Technik bekannt sind, formuliert werden. Kapseln, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, können aus jedem pharmazeutisch akzeptablen Material bestehen, wie z.B. Gelatine oder Cellulosederivaten. Orale Zufuhrsysteme für eine verzögerte Freisetzung undloder enterische Beschichtungen für oral verabreichte Dosierungsformen sind auch umfaßt, wie z.B. diejenigen, die in den US-Patenten 4,704,295, erteilt am 3. November 1987, 4,556,552, erteilt am 3. Dezember 1985, 4,309,404, erteilt am 5. Januar 1982 und 4,309,406, erteilt am 5. Januar 1982, beschrieben sind.
Beispiele für feste Träger umfassen Stärke, Zucker, Bentonit, Siliziumdioxid und andere allgemein verwendete Träger. Weitere nicht begrenzende Beispiele für Träger und Verdünnungsmittel, die in den Formulierungen der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, umfassen Salzlösung, Sirup, Dextrose und Wasser.
Es wird erkannt werden, daß der Einheitsgehalt des aktiven Bestandteils oder der Bestandteile, die in einer individuellen Dosis jeder Dosierungsform enthalten sind, nicht selbst eine effektive Menge sein muß, da die notwendige effektive Menge durch Verabreichung einer Vielzahl von Dosierungseinheiten erreicht werden kann (wie z.B. Kapseln oder Tabletten oder Kombinationen davon).
Der Verabreichungsweg der Synergisten ist vorzugsweise oral oder enteral. Bevorzugte orale oder enterale pharmazeutische Formulierungen können z.B. eine Pille oder Kapsel umfassen, die ungefähr 1 mg bis ungefähr 300 mg von einem oder mehreren der Synergisten der vorliegenden Erfindung mit oder ohne einer effektiven Menge des AD- suppressiven Mittels, das für eine Autoimmunerkrankung spezifisch ist, enthalten.
Im allgemeinen wird das Autoantigen, das Fragment oder das Analog einem Säuger oral oder enteral in einer Menge von ungefähr 15 Mikrogramm pro kg Körpergewicht des Säugers bis ungefähr 15 mg pro kg Körpergewicht des Säugers pro Tag verabreicht und kann in einzelner Dosierungsform oder multipler Dosierungsform verabreicht werden. Vorzugsweise wird das Autoantigen, Fragment oder Analog in einer Menge zwischen ungefähr 300 Mikrogramm und ungefähr 12 mg pro kg Körpergewicht des Säugers pro Tag verabreicht.
Der Synergist kann einem Säuger vorzugsweise oral oder enteral in einer Menge verabreicht werden, die weit im Bereich zwischen ungefähr 15 mg und ungefähr 15 mg pro kg Körpergewicht des Säugers pro Tag liegt und vorzugsweise zwischen ungefähr 300 mg und ungefähr 12 mg pro kg Körpergewicht pro Tag und kann außerdem in einer einzelnen oder vielfachen Dosierungsform verabreicht werden. Der Synergist kann oral oder enteral vor (innerhalb von 24 Std. und vorzugsweise innerhalb von 1 Std.) oder im wesentlichen gleichzeitig mit oder nach (innerhalb von 24 Stunden nach) der Verabreichung des Autoantigens oder des biologisch aktiven Fragments oder Analogs des für die besagte Krankheit spezifischen Autoantigens verabreicht werden. Wie der Fachmann verstehen wird, ist die exakte Dosierung und Häufigkeit der Verabreichung eine Funktion der Aktivität des AD-suppressiven Mittels und des Synergisten, wie auch des Alters, des Geschlechts, des Gewichts und des körperlichen Zustands des zu behandelnden Subjekts sowie der gleichzeitigen Verabreichung oder Abwesenheit anderer Behandlungen. Daher muß die Einstellung der verwendeten Dosierungen und die Verabreichungsordnung basierend auf diesen Faktoren bestimmt werden und muß unter Umständen experimentell festgelegt werden. Eine solche Bestimmung benötigt jedoch nichts anderes als Routineexperimente, wie offenbart von Higgins und Weiner für EAE in J. Immunol. 140: 440445, 1988.
Wie dargestellt in Beispiel 8 unten, verstärkt die subkutane Verabreichung von IL-1 die AD-suppressive Wirkung von oral verabreichtem MBP auf EAE. Dies ist eine sehr überraschende Feststellung, da für IL-1 festgestellt wurde daß es eine immunostimulatorische Wirkung auf T-Helferzellen ausübt, die Mediatoren für EAE, und da man daher annehmen würde, daß es die Krankheitssymptome verschlechtert. Obwohl die orale oder enterale Verabreichung des Synergisten (der die IL-1-Produktion und/oder -Sekretion induziert) bevorzugt wird, liegt dennoch die parenterale Verabreichung von IL-1 und vorzugsweise subkutane, an einen Säuger bei einer Konzentration im Bereich von ungefähr 0,2 mg bis ungefähr 60 mg pro kg Körpergewicht des Säugers, kombiniert mit der oralen oder enteralen Verabreichung eines AD-suppressiven Mittels (in den oben beschriebenen Dosierungen) ebenfalls im Umfang der vorliegenden Erfindung. IL-1 ist von verschiedenen kommerziellen Quellen erhältlich, wie z.B. Boehringer Mannheim (Indianapolis, IN), Amgen Biologicals (Thousand Oaks, CA) und ICN Biochemicals (Cleveland, OH).
Wenn das AD-suppressive Mittel und der Synergist oral eingeführt werden, können sie mit anderen Lebensmittelformen vermischt werden und in fester halbfester, Suspensions- oder Emulsions-Form aufgenommen werden; sie können auch mit pharmazeutisch akzeptablen Trägern, Geschmacksverstärkern und ähnlichen vermischt werden.
Wenn das AD-suppressive Mittel und der Synergist enteral verabreicht werden, können sie in fester, halbfester, Suspensions- oder Emulsionsform eingeführt werden und können mit einer großen Vielzahl bekannter pharmazeutisch akzeptabler Träger, einschließlich Wasser, Suspendiermittel und Emulgatoren, zusammengesetzt sein.
Das AD-suppressive Mittel und der Synergist können miteinander in derselben Dosierungsform verabreicht werden, durch Aufnahme getrennter Dosierungsformen coverabreicht werden oder aufeinanderfolgend in getrennten Dosierungsformen verabreicht werden.
Die Beispiele 2 bis 8 illustrieren die Verwendung eines Synergisten zusammen mit einem AD-suppressiven Mittel und die spezifische Toleranz-verstärkende Wirkung einer solchen gleichzeitigen Verwendung.
Gemäß den Beispielen 2 - 8 verstärkte die Verfütterung von bakteriellem Lipopolysacchand (LPS) oder des Lipid-A-Bestandteils von LPS (LPS besteht aus dem Lipid-A- Bestandteil und einem Polysaccharid-Bestandteil), das als Synergist verwendet wurde, die Schutzwirkung der Verfütterung von MBP auf EAE bei Lewis-Ratten. Die Induktion der Krankheit, die Schwere der Krankheit und der Krankheitsindex waren alle als Ergebnis der Verabreichung eines AD-suppressiven Mittels mit einem Synergisten reduziert, im Vergleich mit der oralen Verabreichung eines AD-suppressiven Mittels allein. Die Synergisten waren auch bei der Unterdrückung der Krankheitssymptome wirksam wenn sie mit dem Autoantigen während der aktiven Krankheitsphase verabreicht wurden, wie dargestellt in Beispiel 6, unter Verwendung eines chronischen EAE-Modells bei Meerschweinchen.
Die Verfütterung von MBP-plus-LPS oder MBP-plus-Lipid A führte auch zu einer signifikanten Abnahme der verzögerten Hypersensibilität (DTH)-Reaktionen der behandelten Tiere. EAE und DTH sollen beide CD4+ -T-Zell-vermittelte pHänomene sein.
Dementsprechend bestätigt die Abnahme von DTH die Wirkung der Synergisten. Sowohl bei EAE als auch bei DTH-Systemen hatten Lipid A oder LPS wenig oder keine Wirkung, wenn allein in Abwesenheit des Auto-Antigens, MBP, verabreicht wurde. Daher ist die Toleranz-verstärkende Wirkung des Synergisten Spezifisch.
Es wird angenommen, daß die Synergisten die suppressive Wirkung, die durch orale oder enterale Verabreichung von AD-suppressiven Mitteln bei der Behandlung anderer Autoimmunerkrankungen, wie z.B. Arthritis, Diabetes, wie auch den in Tabelle 1 oben beispielhaft dargestellten Autoimmunerkrankungen erhalten wird, verstärken oder unterstützen.
Zusätzlich löste oral verabreichtes MBP plus LPSU wie dargestellt in Beispiel 7 unten, eine verminderte Expression von Klasse-II-Histokompatibilitätsmolekülen im Vergleich zu Klasse-I-Histokompatibilitätsmolekülen bei M BP-gefütterten Ratten auf Darm-Epithelial- Zellen aus, die von behandelten Tieren isoliert wurden. Ohne an eine Theorie gebunden sein zu wollen, wird angenommen, daß durch die differentielle Verminderung der Klasse-II-Expression LPS eine Reduktion der Antigen-Präsentation an CD4+ -T-Zellen (T- Helferzellen) verursacht, die Induktorzellen sind. Da die orale MBP-Toleranzinduktion vermutlich über einen unterschiedlichen Mechanismus arbeitet, d.h., die Induktion von T-Suppressorzellen, wird eine synergistische Wirkung beobachtet, wenn LPS und MBP miteinander verabreicht werden.
Die vorliegende Erfindung wird unten weiter in den spezifischen Beispielen beschrieben.

BEISPIEL 1

Die bei der Durchführung des Verfahrens der vorliegenden Erfindung verwendeten Autoantigene wurden unter Verwendung der unten angegebenen Verfahren und Techniken erhalten.
GP-MBP wurde durch das Verfahren von Diebler, G.E. et al. (Prep. Biochem. 2:139, 1972) aus Gehirngewebe von Meerschweinchen gereinigt und wurde von Pel Freeze erhalten (Rogers, Arkansas). Kurz gefaßt wurde das Gewebe des zentralen Nervensystems isoliert und in einer Chloroform-Methanol-Lösung homogenisiert, in Aceton extrahiert, gefiltert und in derselben Lösung resuspendiert. Die Lösung wurde in Aceton extrahiert, gefiltert, in Wasser resuspendiert, auf einen pH von 3 eingestellt und 1 Std. inkubiert. Die Lösung wurde dann zentrifugiert und mit 8 M Harnstoff extrahiert, CM-5 wurde hinzugefügt, der pH wurde auf 11 eingestellt, und die Lösung wurde zweimal gefiltert und in Harnstoff resuspendiert. Die Lösung wurde dann wieder gefiltert, zweimal in Wasser resuspendiert, gefiltert, in 0,121 N HCl resuspendiert, gefiltert, gegen 10 Volumen destilliertes Wasser dialysiert und vor der Verwendung lyophilisiert.

BEISPIEL 2:

Die Verfütterung von LPS verstarkt die Schutzwirkung der Verfütterung von MBP gegen EAE

Eine Reihe von Experimenten wurde bei Lewis-Ratten durchgeführt, wobei den Lewis- Ratten, die 6 bis 8 Wochen alt waren (Harlan-Sprague Dawley, Indianapolis, IN) MBP (1 mg in PBS) oder LPS (1 mg in PBS) allein oder als Kombination von MBP + LPS (1 mg und 1 mg) durch gastrische Intubation unter Verwendung einer rostfreien 18-Eich- Tierfütternadel verfüttert wurde (Thomas Scientific, Swedesboro, NJ). Die Ratten wurden 5 Mal (Gesamtdosierung: 5 mg) vor der Immunisierung gefüttert. LPS (Sigma Chemical Co. St. Louis, MO) stammte von dem E. coli-Stamm 0127:B8. Die Ratten wurden dann in jeden Fußballen mit 25 mg MBP in einem entsprechenden Volumen von komplettem Freund's Adjuvans (CFA), das 4 Mikrogramm Mycobacterium tuberculosis enthielt (Difco, Detroit, MI), zwei Tage nach der letzten Fütterung immunisiert und auf eine EAE- Erkrankung über die folgenden 2-3 Wochen überwacht. Die Erkrankung manifestierte sich durch Paralyse. Das 70-Punkte-Bewertungssystem war das folgende: 0 normal; 1 = hängender Schwanz; 2 = Paralyse des Hinterfußes; 3 = Inkontinenz; 4 = Tetraparalyse; und 5 = moribund. Der EAE-Krankheitsgrad variierte zwischen 2 und 5, abhangig vom Experiment. Die Schwere der Krankheit wurde auch als "Krankheitsindex" bewertet. Der Krankheitsindex wurde für jedes Tier kalkuliert und bestand aus der Dauer der Krankheit (in Tagen) mal der höchsten Krankheitsbewertung. Die Tiere wurden klinisch in einem Blindversuch bewertet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 unten dargestellt. TABELLE 2 Orales LPS verstärkt die oral induzierte Suppression von EAE durch MBP
a p < 0,06 gegen die Kontrolle
b p < 0,01 gegen die Kontrolle
c p < 0,01 gegen die Kontrolle
d p-Werte vergleichen LPS + MBP gegen MBP [p-Werte wurden durch den Student-t- Test bestimmt, mit Ausnahme der Inzidenz, wobei die Chi-Quadratprobe verwendet wurde.]
Die oben beschriebenen Experimente demonstrierten eine deutliche Verstärkung des Schutzes gegen die Krankheit bei Tieren, denen sowohl LPS als auch MBP verfüttert wurde, im Vergleich zu denjenigen, denen nur MBP verfüttert wurde. MBP + LPS verringerte die Inzidenz der Krankheit (12/29 Tiere gegen 22/22 bei den Kontrollen und 12/29 Tiere bei den MBP-gefütterten), die Dauer der Krankheit, den mittleren maximalen Krankheitsgrad und den Krankheitsindex. Zu bemerken ist, daß die Verfütterung von LPS allein eine geringere Wirkung auf die Empfänglichkeit der Tiere gegen EAE hatte als entweder MBP oder MBP + LPS. Die Ergebnisse zeigen deutlich eine superadditive oder synergistische Verstärkung der Krankheitsunterdrückung aufgrund der gemeinsamen Verwendung des AD-suppressiven Mittels (MBP) und eines Synergisten (LPS).

BEISPIEL 3:

Der Lipid-A-Bestandteil von LPS ist ebenso wirksam

LPS ist eine Struktur, die sowohl einen Lipidbestandteil als auch eine Polysaccharidkette enthält (Chiller, J. M. et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 70: 2129-2133, 1973). In durchgeführten Experimenten stellte sich heraus, daß das Lipid A ebensogut oder besser als LPS als Synergist beim Schutz gegen EAE wirkte. Ratten (9 - 10 pro Gruppe) wurde Lipid A (75 Mikrogramm pro Ratte, von Salmonella minnesota Re 595, erhalten von Sigma Chemical Co.), verfüttert, unter Befolgung desselben Protokolls, das für die LPS- Verfütterung in Beispiel 2 oben verwendet wurde. EAE wurde wie in Beispiel 2 oben beschrieben induziert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 unten dargestellt. TABELLE 3 Lipid A ist der aktive Teil des LPS-Moleküls
a p nicht signifikant
b P< 0,06
c p< 0,01
d p< 0,001
4 p-Werte von MBP gegen MBP+Lipid A
Wie sich aus den in Tabelle 3 oben dargestellten Ergebnissen ergibt verstärkte Lipid A bei einer Dosierung von 75 Mikrogramm, oral verabreicht mit MBP, deutlich den Schutz gegen EAE mit einer Abnahme des Krankheitsindex (DI) von 12,12 für die Kontrollen und 11,6 für MBP-gefütterte Ratten auf 0,06 für Ratten, die mit MBP und Lipid A gefüttert wurden (Tabelle 3). Zusätzlich zeigten MBP+Lipid A-gefütterte Ratten eine geringere lnzidenz der Krankheit (33% gegen 100% für alle anderen Gruppen), eine kürzere Krankheitsdauer und einen geringeren maximalen Grad, im Vergleich mit der Kontrolle, als bei MBP-gefütterten oder Lipid-A-gefütterten Tieren.

BEISPIEL 4:

Verzögerte Hypersensibilitätsreaktionen

Die Experimente der Beispiele 2 und 3, wie oben dargestellt, überprüfen die Krankheitsexpression als Maß der Paralyse. Eine Reihe von Experimenten wurde durchgeführt, um zu bestimmen, ob andere Immunmessungen ebenso einen superadditiven Effekt im Ergebnis der Verwendung des Synergisten demonstrieren würde. Da man annimmt, daß EAE eine CD4+ -T-Zell-vermittelte Erkrankung ist und da diese Zelle die erste Zelle ist, die an verzögerten Hypersensibilitäts-(DTH)-Reaktionen beteiligt ist, wurden DTH-Reaktionen bei Tieren gemessen, die mit LPS behandelt wurden, um zu bestimmen, ob eine Suppression bemerkt werden konnte. Diese DTH-Reaktionen wurden in einer Standardweise durchgeführt, indem eine Ohrschwellung 48 Std. folgend auf die Iniektion von 50 Mikrolitern des Autoantigens (MBP, 200 Mikrogramm pro ml) in die Muschel von Rattenohren gemessen wurde, die nicht MBP-exponiert waren, sensibilisiert mit MBP 200 Mikrogramm pro ml und/oder gefüttert mit 1 mg MBP und/oder LPS (1 mg) vor der Antigen-Exposition. Als Kontrolle wurden 50 Mikroliter Mycobacterium tuberculosis (Mt) mit einer Konzentration von 200 Mikrogramm pro ml den MBP-sensibilisierten Ratten verabreicht. Die Messungen wurden durchgeführt wie in J. Immunol. 125: 483, 1980 und sind als mittlere Veränderung der Ohrschwellung in Zoll x 10&supmin;² ausgedrückt. Die Ergebnisse sind in den Figuren 1 und 2 dargestellt. In den Figuren 1 und 2 zeigt die Ordinate den mittleren Unterschied der Dicke der Rattenohren vor und 48 Std. nach der MBP-Injektion. Figur 1 zeigt die DTH-Ergebnisse bei mit LPS gefütterten Ratten und Figur 2 zeigt die DTH-Resultate bei mit Lipid A gefütterten Ratten.
Eine ausgeprägte und signifikante Abnahme (45%) der DTH-Reaktionen wurde bei Tieren gefunden, denen eine Kombination von MBP und Lipid A oder MBP und LPS gefüttert worden war. Weder LPS noch Lipid A allein hatten eine Wirkung auf die Inhibition der Ohrschwellung (Figuren 1 bzw. 2). Die Unterdrückung von DTH folgend auf eine Verabreichung von MBP und LPS oder Lipid A war antigenspezifisch, da die DTH- Reaktionen auf Mt nicht beeinflußt waren.

BEISPIEL 5:

Verabreichungsweg beeinflußt die Wirkung des Synergisten

Um den Wirkungsmechanismus der Synergisten der vorliegenden Erfindung zu untersuchen, wurde ein Experiment gemäß dem in Beispiel 2 oben dargestellten Protokoll durchgeführt, wobei der Synergist (LPS) (mit einer Dosierung von 1 mg) zur selben Zeit wie 1 mg MBP 5 Mal wie in Beispiel 2 oben entweder oral ("PO") oder subkutan ("SQ") verabreicht wurde. Die Kontrollen wurden einfach mit injiziertem MBP Antigen-exponiert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 unten dargestellt. TABELLE 4 LPS verstärkt die orale Toleranz besser, wenn es oral verabreicht wird, als auf einem anderen Weg
a p< 0,01
b p< 0,05
c NS
d p-Werte von MBP+LPS PO gegen MBP+LPS SQ
Orales LPS verminderte den Krankheitsindex von 23,04 bei Kontrollen und 8,0 bei MBP- gefütterten Ratten auf 0,26 bei MBP+LPS-gefütterten Ratten. Subkutanes LPS hob die auf MBP-Verfütterung folgende Toleranz hingegen auf, der Krankheitsindex betrug 16,5 im Vergleich mit 8 für MBP allein (Tabelle 4). DTH-Reaktionen auf MBP wurden bei diesen Ratten gemessen, und die Ergebnisse stimmen mit denjenigen für die klinische Krankheit überein. MBP mit oralem LPS supprimierte die DTH-Reaktion mehr als MBP allein (Daten nicht dargestellt). Bei den mit subkutaner Injektion von LPS und oralem MBP behandelten Ratten unterschied sich die mittlere Ohrschwellung nicht signifikant von derienigen der Kontrollratten (Daten nicht dargestellt).

BEISPIEL 6:

Verabreichung des Synergisten nach Induktion von EAE

Um die Wirkungen der Synergisten der vorliegenden Erfindung auf eine aktive, bestehende Autoimmunerkrankung zu überprüfen, wurde ein chronisches EAE-Modell geprüft. Stamm-13-Meerschweinchen (Associated Rabbit Industries, East Bridgewater, MA) wurden mit einer 1:1-Mischung aus Meerschweinchen-Myelin (erhalten von Pel- Freez, Rogers, AR) und steriler physiologischer Kochsalzlösung mit einem gleichen Volumen inkomplettem Freund's Adjuvans, das 4 Mikrogramm hitzegetöteter Mycobacterium tuberculosis enthielt (Difco, Detroit, MI) sensibilisiert. 0,4 ml wurden an verschiedenen Stellen in den Nackenbereich injiziert.
Den Tieren wurden 10 mg einer bovinen Myelinpräparation verfüttert (Biopure, Boston, MA) mit oder ohne 150 Mikrogramm Lipid A, wie in Beispiel 2 oben, 3 Mal pro Woche, folgend auf den ersten EAE-Ausbruch am Tag 32 nach der Immunisierung. Die Tiere wurden jeden Tag über 120 Tage auf die Inzidenz der Krankheit im Blindversuch untersucht. Die Krankheit war durch Paralyse der hinteren Extremitäten und Inkontinenz gekennzeichnet. Die Krankheit wurde entsprechend dem klinischen Krankheitsgrad wie folgt eingestuft: 0 = keine Abnormalität 1 = Schwäche, Schlaffheit, verminderte Aktivität; 2 = milde Paraparese; 3 = gemäßigte Paraparese; 4 = schwere Paraparese; 5 = Tod. Die klinische Krankheitsbewertung wurde festgelegt, indem die tatsächliche Punktbewertung mal der Anzahl der Beobachtungen genommen wurde, geteilt durch die gesamte potentielle maximale Risikobewertung (die maximale potentielle Risikobewertung nimmt an, daß jedes Tier eine 4 beim klinischen Krankheitsgrad ist) und Vervielfachung mal 100. Die Ergebnisse sind in Figur 3 dargestellt.
Figur 3C zeigt die Kontrolltiere. Die klinischen Bewertungen für diese Tiere (in Figuren 3A - 3C, wobei jede Saulengrafik die Ergebnisse von einem einzelnen Tier zeigt) lagen im Bereich zwischen 61 und 87 (Figur 3C, Durchschnitt 73). Die Verabreichung von oralem bovinem Myelin reduzierte die klinischen Punktbewertungen auf 19 - 72 (Figur 3B, Durchschnitt 53), während die orale Verabreichung von bovinem Myelin plus Lipid A die klinischen Bewertungen weiter auf 19 - 26 reduzierte (Figur 3A, Durchschnitt 22), was die Wirksamkeit der oral verabreichten Synergisten mit AD-suppressiven Mitteln zur Behandlung einer bestehenden Autoimmunerkrankung demonstrierte.

BEISPIEL 7

Darmepithelialzellen von Tieren. die mit MPB plus LPS gefüttert wurden, exprimieren unterschiedliche Mengen Klasse-I- und Klasse-II-Moleküle

Bei diesen Experimenten wurden Darmepithelialzellen aus 6 bis 8 Wochen alten weiblichen Lewis-Ratten isoliert, denen man entweder MBP oder MBP plus LPS gefüttert hatte. Darmmucosa-Epithelialzellen wurden aus normalen Lewis-Ratten erhalten, wie beschrieben in Bland, P.W., et al. Immunol., 58:1, 1986. Der Dünndarm, umfassend das Duodenum und das proximale Jejunum wurden longitudinal geöffnet und extensiv in HBSS gewaschen (Hanks balanced salt solution) und bei Raumtemperatur 5 min in HBSS inkubiert, das 0,5 mM EDTA enthielt. Das behaarte Epithelium und Mucus wurde durch Reiben der Mucosa mit einem Gummispatel entfernt. Die resultierenden Klumpen wurden dann unter Verwendung einer Pasteur-Pipette in eine Einzelzellsuspension unterteilt. Die Zellen wurden dann in RPMI 1640 Medium gewaschen, das 10% FCS (fötales Kälberserum) enthielt und in einem Hamocytometer gezählt. Die Zellen wurden dann mit monoclonalen Antikörpern der Klasse I oder Klasse II-Determinanten gefärbt und auf einem Fluoreszenz-aktivierten Zellzähler (FACS) gezählt, wie beschrieben in Santos, L.M. B. et al., Cellular Immunol (In press).
Die verfütterten Mengen betrugen 1 Mikrogramm MBP oder 1 Mikrogramm MBP zusammen mit 1 Mikrogramm LPS. Die folgenden Prozentzahlen der Zellen exprimierten Klasse-II-Antigen: 53,8% der Epithelialzellen von Kontrollratten; 65,9% von MBP- gefütterten Ratten; und 16,9% von MBP-plus-LPS-gefütterten Ratten. Die folgenden Prozentzahlen der Zellen exprimierten Klasse-I-Antigen: Kontrollratten 86,7%; MBPgefütterte Ratten: 98,4%; MBP-plus-LPS-gefütterte Ratten: 61%. Diese Ergebnisse demonstrieren die unterschiedlichen Wirkungen auf die Klasse-II-Histokompatibilitäts- Antigenexpression epithelialer Zellen von MBP-plus-LPS-gefütterten Ratten. Diese Ergebnisse legen nahe, daß einer der möglichen Mechanismen, über den LPS wirkt, die differentielle Verminderung der Klasse-II-Expression umfaßt (im Vergleich zur Klasse-I- Expression) auf Epithelialzellen. So präsentieren diese Zellen Antigen nicht bevorzugt an CD4+ -Zellen, die Induktor- (oder Helfer-)Zeilen sind im Vergleich mit Suppressorzellen.

BEISPIEL 8:

Um die Wirkungsweise der Synergisten der vorliegenden Erfindung zu untersuchen, wurden Lewis-Ratten (5 pro Gruppe), bei denen EAE wie in Beispiel 2 oben induziert worden war, oral mit 1 mg GP-MBP allein, GP-MBP (1 mg) plus LPS (1 mg) (oral), IL-1 (200 Mikrogramm, intraperitoneal verabreicht) oder GP-MBP (1 mg) plus injiziert mit IL-1 (200 Mikrogramm intraperitoneal verabreicht) 2 - 3 Tage nach der letzten Fütterung behandelt und der Krankheitsindex wurde gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 unten dargestellt: TABELLE 5
Die in Tabelle 5 dargestellten Ergebnisse zeigen, daß die orale Verabreichung von 1 Milligramm GP-MBP den Krankheitsindex von 23 auf 19 reduzierte und daß der Einschluß von LPS mit GP-MBP weiter den Kran kheitsindex auf 17 verminderte. Die Injektion von 200 Mikrogramm IL-1 allein (intraperitoneal) verminderte den Krankheitsindex bei den behandelten Ratten auf 28. Jedoch verminderte die orale Verabreichung von 1 mg GP-MBP plus Injektion von 200 Mikrogramm IL-1 den Krankheitsindex auf 4.
Daher zeigen die obigen Resultate, daß das parenteral verabreichte IL-1 synergistisch mit der oralen MBP-Verabreichung zusammenwirken konnte.

Claims

1. Pharmazeutische Formulierung zur Behandlung oder Verhinderung von klinischen Symptomen einer T-Zell-vermittelten oder T-Zell-abhängigen Autoimmunkrankheit (AD), umfassend eine wirksame Menge von

(a) einem AD-suppressiven Mittel in einer oralen oder enteralen Dosierungsform, das ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend (i) Autoantigenen, die spezifisch für diese Autoimmunkrankheit sind, (ii) AD- suppressiven Fragmenten der Autoantigene und (iii) AD-suppressiven Analogen der Autoantigene oder Fragmente;

(b) mindestens einer Verbindung, die die Eigenschaft einer Verstärkung der AD-suppressiven Aktivität des Mittels aufweist, wobei die Verbindung, wenn sie in Kombination mit dem AD-suppressiven Mittel verabreicht wird, der Formulierung eine oder beide der folgenden Eigenschaften verleiht:

(i) die Eigenschaft der Induktion einer Produktion und/oder Sekretion von Interleukin-1 und

(ii) die Eigenschaft einer Verminderung der Expression von Klasse II Histokompatibilitätsmolekülen durch Darmepithel-Zellen; und

(c) einem physiologisch akzeptablen Träger oder Verdünnungsmittel, wobei die Formulierung eine kombinierte Präparation für die gleichzeitige, getrennte oder aufeinanderfolgende Verabreichung von Mittel (a) und Verbindung (b) darstellt.

2. Pharmazeutische Formulierung nach Anspruch 1, worin das Autoantigen ein basisches Myelinprotein ist.

3. Pharmazeutische Formulierung gemäß Anspruch 1, worin die Verbindung ein bakterielles Lipopolysaccharid ist.

4. Pharmazeutische Formulierung gemäß Anspruch 1, worin die Verbindung Lipid A ist.

5. Pharmazeutische Formulierung gemäß Anspruch 1, worin die Verbindung für die orale oder enterale Verabreichung geeignet ist.

6. Pharmazeutische Formulierung gemäß Anspruch 5, die geeignet ist zur gleichzeitigen Verabreichung des Mittels und der Verbindung.

7. Pharmazeutische Formulierung gemäß Anspruch 1, die eine Menge des Mittels enthält, die individuell wirksam ist, die klinischen Symptome der Krankheit zu unterdrücken oder zu verhindern.

8. Pharmazeutische Formulierung gemäß Anspruch 1, enthaltend eine Menge des Mittels und eine Menge der Verbindung, wobei die Mengen in Kombination wirksam sind, um die Symptome zu unterdrücken.

9. Eine orale oder enterale pharmazeutische Formulierung, umfassend eine effektive Menge von

(a) einem AD-suppressiven Mittel, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus (i) Autoantigenen, die für die Autoimmunkrankheiten spezifisch sind, (ii) AD- suppressiven Fragmenten der Autoantigene und (iii) AD- suppressiven Analogen der Autoantigene oder Fragmente;

(b) mindestens einer Verbindung, die die Fähigkeit zur Verstärkung der AD-suppressiven Aktivität des Mittels aufweist, wobei die Verbindung, wenn sie in Kombination mit dem AD-suppressiven Mittel verwendet wird, der Formulierung eine oder beide der folgenden Eigenschaften verleiht:

10. Verwendung von (a) einem AD-suppressiven Mittel, ausgewählt aus (i) Autoantigenen, die für die T-Zell vermittelten oder T-Zell abhängigen Immunkrankheiten spezifisch sind, (ii) AD-suppressiven Fragmenten der Autoantigene und (iii) AD-suppressiven Analogen der Autoantigene oder Fragmente;

(c) einem physiologisch akzeptablen Träger oder Verdünnungsmittel,

für die Herstellung einer pharmazeutischen Formulierung für orale oder enterale Verabreichung zur Behandlung oder Verhinderung der klinischen Symptome der T-Zell-vermittelten oder T-Zell-abhängigen Autoimmunkrankheiten.

11. Verwendung von mindestens einer Verbindung, die die Fähigkeit zur Verstärkung der AD-suppressiven Aktivität eines oral oder enteral verabreichten AD-suppressiven Mittels aufweist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus (i) Autoantigenen, die für die T-Zell-vermittelte oder T-Zellabhängige Autoimmunkrankheit spezifisch sind, (ii) AD- suppressiven Fragmenten der Autoantigene und (iii) AD- suppressiven Analogen der Autoantigene oder Fragmente zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung oder Verhinderung von klinischen Symptomen einer T-Zell-vermittelten oder T-Zell abhängigen Autoimmunkrankheit, worin die Verbindung, wenn sie in Kombination mit dem AD-suppressiven Mittel verwendet wird, der Formulierung eine oder beiden der folgenden Eigenschaften verleiht:

(ii) die Eigenschaft einer Verminderung der Expression von Klasse II Histokompatibilitätsmolekülen durch Darmepithel-Zellen

12. Verwendung gemäß Anspruch 11, worin das Medikament ein orales oder enterales Medikament ist.