DE69124459T2

DE69124459T2 - Zyklosporine

Info

Publication number: DE69124459T2
Application number: DE69124459T
Authority: DE
Inventors: Pietro Ch-4103 Bottmingen Bollinger; Soo Young London Nw3 4Ly Ko; Hans Ch-4059 Basle Kobel; Brigitte A-2340 Moedling Rosenwirth; Dieter Ch-8044 Zuerich Seebach; Rene P. Ch-4052 Basle Traber; Roland Ch-4125 Riehen Wenger
Original assignee: Sandoz AG; Sandoz Patent GmbH
Current assignee: Novartis AG
Priority date: 1990-11-02
Filing date: 1991-10-30
Publication date: 1997-07-10
Anticipated expiration: 2011-10-31
Also published as: IL99912A0; ATE148469T1; GR3022592T3; US5981479A; MX9101869A; JP2740775B2; AU8692391A; SA92120344B1; EP0484281A3; US6255100B1; MY134806A; DE69124459D1; AU649277B2; PL168609B1; KR920009390A; CS329791A3; EP0484281A2; ES2095926T3; US5767069A; HU212674B

Description

Die vorliegende Eriindimg betriffi neue Cyclosporine, deren Verwendung als Pharmazeutika und pharmazeutische Zusammensetzungen, die sie enthalten, ebenso wie Verfähren zu ihrer Herstellung.
Die Cyclosporine umfassen eine Klasse von strukturell unterscheidbaren, cyclischen, poly-N-methylierten Undecapeptiden, die pharmakologische, insbesondere immunsuppressive, entzundungshemmende und/oder antaparasitische Aklivitat besitzen. Das erste Cyclosporin, das isoliert wurde, war der natürlich vorkommende Pilzmetaboht Ciclosporin oder Cyclosporin, auch bekannt als Cyclosponn A und im Handel erhältlich unter der eingetragenen Marke Sandimmun oder Sandimmune Ciclosporin ist das Cyclosporin der Formel A
worin MeBmt den N-Methyl-(4R)-4-but-2E-en-1-yl-4-methyl-(L)-threonylrest der Formel B
bedeutet, worin -x-y- -CH=CH-(trans) ist.
Seit der ursprünglichen Entdeckung von Ciclosporin wurden eine Vielaahl von natürlich vorkommenden Cyclosporinen isoliert und identifiziert und viele weitere nicht natürliche Cyclosporine wurden hergestellt mit voll- oder halbsynthetischen Mitteln oder durch Anwendung von modifizierten Kulturechniken. Die Klasse, die von den Cyclosporinen gebildet wird, ist daher jetzt wichtig und schließt z.B. die natürlich vorkommenden Cyclosporine A bis Z ein [siehe Traber et al., 1, Helv. Chim. Acta, 60, 1247 bis 1255 (1977); Traber et al., 2, Helv. Chim. Acta, 65, 1655 bis 1667 (1982), Kobel et al., Europ. J. Applied Microbiology and Biotechnology, 14, 273 bis 240 (1982); und von Wartirg et al., Progress in Allergy, 38, 28 bis 45, 1986)], ebenso wie verschiedene nicht natürliche Cyclosporinderivate und kunstliche oder synthetische Cyclosporine einschließlich Dihydrocyclosporine [bei denen der Rest -x-y- des MeBmt-Restes (Formel B oben) gesattigt ist, was -x-y- = -CH&sub2;-CH&sub2;- ergibt]; derivatisierte Cyclosporine (Z.B. solchen, bei denen das 3'-O-Atom des Mebmt-Restes acyliert ist oder bei denen ein weiterer Substituent am α-Kohlenstoffätom des Sarcosylrestes an Position 3 eingeführt ist); Cyclosporine, in denen der MeBmt-Rest in isomerer Form vorhanden ist (z.B. bei denen die Konfiguration der Positionen 6' und 7' des MeBmt-Restes cis statt trans ist) und Cyclosporine, bei denen andere Aminosäuren an spezifischen Positionen innerhalb der Peptidsequenz emgearbeitet sind, z.B. unter Anwendung des Vollsyntheseverfahrens für die Herstellung von Cyclosporineil das von R Wenger entwickelt wurde - siehe z.B. Traber et al. 1, Traber et al. 2 und Kobel et al., siehe oben; US Patente Nr. 4 108 985, 4 220 641, 4 288 431, 4 554 351, 4 396 542 und 4 798 823; Europäische Patentanmeldungen Nr. 34 567, 56 782, 300 784, 300 785 und 414 632; Internationale Patentschrift WO 86/02080 und GB-Patentschriften Nr. 2 206 119 und 2 207 678; Wenger 1, Transpl. Proc., 15 Suppl. 1:2230 (1983); Wenger 2, Angew. Chem. Int. Ed. 24 77 (1985) und Wenger 3, Progress in the Chemistry of Organic Natural Prodiicts, 50, 123 (1986).
Die Klasse, die von den Cyclosporinen gebildet wird, ist daher tatsächlich shhr groß und scllließt z.B. [Thr]²-, [Val]²-, [Nva]²- und [Nva]²-[Nva]&sup5;-Ciclospofln (auch bekannt als Cyclosporine C, D, G bzw. M), [3-O- Acetyl-MeBmt]¹-Ciclosporin (auch bekannt als Cyclosporin-A-Acetat), [Dihydro-MeBmt]¹-[Val]²-Ciclosporin (auch bekannt als Dihydrocyclosporin D), [(D)Ser]&sup8;-Ciclosporin, [Melle]¹¹-Ciclosporin, [D)MeVal]¹¹-Ciclosporin (auch bekannt als Cylosporin H), [MeAla]&sup6;-Ciclosporin, [(D)Pro]³-Ciclosporin usw. ein.
Nach der ubhchen Nomenklatur für Gydosporine werden diese in der gesamten Beschreibung und den Ansprüchen unter Bezugnhnie auf die Struktur von Ciclosporin definiert (dh. Cyclosporin A). Dies erfolgt, indem zuerst die Reste in dem Molekül angegeben werden, die sich von denen, die in Ciclosporin vorhanden sind, unterscheiden und dann der Ausdruck "Ciclosporin" angewendet wird, um die verbleibenden Reste zu bezeichnen, die identisch nut denen sind die in Ciclosporin vorhanden sind. Gleichzeitig wird die Vorsilbe "Dihydro" angewendet, um Ciclosporine zu bezeichnen, bei denen der MeBmt-Rest hydriert ist (Dihydro-Mebmt), dh. bei denen - x-y- in Formel B -CH&sub2;-CH&sub2;- ist. Somit ist [Thr]²-Ciclosporin das Cyclosporin mit der in Formel A gezeigten Sequenz, wobei aber αAbu an Position 2 durch Thr ersetzt ist und [Dihydro-MeBmet]¹-[Val]²-Ciclosporin ist das Cyclosporin mit der in Formel A gezeigten Sequenz, worin der MeBmt-Rest an Position 1 hydriert ist und αAbu an Position 2 durch Val ersetzt ist.
Außerdem werden Aniinosäurereste geinaß üblicher Praxis abgekürzt, z.B. Ala, MeVal, αAbu etc., wobei zu verstehen ist, daß sie die (L)-Konfiguration haben, wenn nicht anders angegeben, z.B. im Fall von "(D)Ala". Abkürzungen von Resten, denen "Me" vorangeht, wie im Fall von "Meleu" bedeuten α-N-methylierte Reste. Einzelne Reste des Cyclosporininoleküls sind im Uhrzeigersinn, wie irn Stand der Technik, numeriert, beginnend nut dem Rest Mebmt oder Dihydro-Mebmt in Position 1. Die gleiche numerische Reihenfolge wird angewendet in der gesamten Beschreibung und den Ansprüchen.
Es ist nun wohlbekatint, daß Ciclosporin wirkt, indem es das Verhren der T-Zellaktivierung stört, indem es den Transkriptionsbeginn von IL-2 blockiert, obwohl der genaue Mechanismus bis jetzt nicht aufgeklärt wurde. Es wurde gezeigt. daß Ciclosporin einen Komplex mit einem 17kD-Cytosolprotein (Cyclophllin) bildet, daß bei vielen Zellarten auftritt und es wurde gezeigt, daß es identisch ist mit Peptidyl-prolyl-cis-trans-Isomerase, einem Enzym. das an der Proteinfältung beteiligt ist. Bis jetzt ist jedoch noch nicht klar, ob die Bindung an Cyclophilin direkt mit der immunsuppressiven Aktivitat der Cyclosporine in Beziehung steht oder ob stattdessen die Cyclophilinbindung selbst ein ausreichendes Kriterium für die immunsuppressive Aktivitat ist.
Es wurde nun gefünden, daß es Cyclosporine gibt, die stark an Cyclophilin binden, aber nicht immunsuppressiv sind. Es folgt daher, daß die Bindung an Cyclophilin em notwendiges, aber nicht hinreichendes Kriterium für die immunsupprimierende Aktivitat ist.
Die vorliegende Erfindung liefert Cyclosporine, die gegen eine HIV-1-Repiikation aktiv sind.
Das Humanimmunschwächevirus (HIV) infiziert bevorzugt T-Helfer-(T4)-Lymphozvten, obwohl es auch in vielen anderen Zellarten repliziert wird, insbesondere solchen mit monozylischer Abstammung. Es verursacht eine langsam fortschreitende Erkrankung des Immunsystems, die durch eine graduelle T4-Zellzerstörung gekennzeichnet ist, nämlich AIDS. Andere immunologische Abnormalitäten von AIDS sind ein Anstieg der zytotoxischen/Suppressor-(T8)-Lymphozyten, ein Defekt bei dem Antigenpräsentations/Erkennungsverfahren und die polyklonale Aktivierung von B-Zellen. Der Mechanismus der T4-Zellzerstörung ist noch nicht klar. Relativ wenige T4-Zellen scheinen infiziert zu sein, sodaß ein direkter zytopathsscher Effekt, der durch das Virus verursacht wird, nicht der einzige Grund für die T4-Zell-Abreicherung sein kann. Es wurde die Hypothese aufgestellt, daß die T4- Zellzerstörung durch ein Autoimmunverfahren verstärkt werden könnte, das durch HIV produzierende oder mit HIV-Protein beschichtete T4-Zellen ausgelöst wird. Diese kontinuierliche Antigenstimulierung kann zu einem Zustand der permanenten Aktivierung von T4-Zellen führen, was die HIV-Replikation in diesen Zellen verbessern würde und die T-zytotoxischen Klone vermehren würde. Nicht infizierte 14-Zellen können antigen gemacht werden, indem sie exogenes virales gp120 an ihre CD4-Moleküle binden und würden dadurch ein Ziel einer T-zytotoxischen Antwort.
U.S. Patent Nr. 4 814 323 offenbart, daß Ciclosporin eine Aktivität gegen AIDS hat und daß allgemein "Cyclosporine, die als Immunsuppressoren bekannt sind", für diese Indikation nützlich sein könnten. Es gibt keinen Hinweis. daß angenommen werden könnte. daß nichtimrnunsuppressive Cyclosporine diese Eigenschaft haben könnten.
Überraschenderweise wurde nun gefunden daß Cyclosporine, die an Cyclophilin binden, aber nicht immunsuppressiv sind, eine hemmende Wirkung auf die HIV-1-Replikation haben.
Ein Cyclosporin wird als an Cyclophilin bindend angesehen, wenn es an humanes rekombinantes Cyclophilin mindestens ein Fünftel so giit bindet, wie Ciclosporm in dem kompetitiven ELISA-Test, der von Quesniaux in Eur. J. Immunol. 1987, 17, 1359 bis 1365 beschrieben wird Bei diesem Test wird das zu testende Cyclosporin während der Inkubation des Cyclophilins mit beschichtetem BSA-Ciclosporin zugegeben und die Konzentration, die erforderlich ist, um eine 50%ige Hemmung der Kontrolireaktion ohne den Konkurrenten zu ergeben, wird berechnet (IC&sub5;&sub0;). Die Ergebnisse werden ausgedrückt als Bindungsverhaltnis (BR), das der Logarithmus zur Basis 10 des Verhaltuisses der IC&sub5;&sub0; der Testverbin dung zu der IC&sub5;&sub0; in einem gleichen Test mit Ciclosporin selbst ist. Somit bedeutet ein BR von 1,0, daß die Testverbindung Cyclophilin um einen Faktor von 10 schlechter bindet, als Ciclosporin und ein negativer Wert bedeutet, daß die Bindung stärker ist als bei Ciclosporin.
Die Cyclosporine, die gegen HIV aktiv sind, haben ein BR von weniger als 0,7 (da log&sub1;&sub0; 5 = ungefähr 0,7) bevorzugt ≤ 0.
Ein Cyclosporin wird als nicht immunsuppressiv angesehen, wenn es eine Aktivität in der gemischten Lymphozytenreaktion (MLR) von nicht mehr als 5%, bevorzugt nicht mehr als 2%, als Ciclosporin, hat. Die gemischte Lyniphozytenreaktion wird von T. Meo in "Immunological Methods", L. Lefkovits und B. Peris, Eds., Academic Press, N.Y., Seiten 227 bis 239 (1979) beschrieben. Milzzellen (0,5 × 10&sup6;) von Balb/c-Mäusen (weiblich, 8 bis 10 Wochen) werden 5 Tage lang mit 0,5 × 10&sup6; bestrahlten (2000 rad) oder mit Mitomycin C behandelten Milzzellen von CBA-Mäusen (weiblich, 8 bis 10 Wochen) gemeinsam inkubiert. Die bestrahlten allogenen Zellen induzieren eine proliferative Realetion bei den Balb/c-Miizzellen, die gemessen werden kann durch Einbau eines markierten Vorläufers in die DNA. Da die Stimulatorzellen bestrahlt werden (oder mit Mitomycin C behandelt werden) sprechen sie nicht auf die Balblc-Zellen mit Proliferation an, sondern behalten ihre Antigenizität.
Die für die Testverbindung in dem MLR geflindene IC&sub5;&sub0; wird verglichen nut der, die für Ciclosporin in einem parallelen Test gefünden wird.
Die Alitivität von Cyclosporinen als Inhibitoren der HIV-1-Replikation kann mit den folgenden Testsystemen gezeigt werden:

1. Hemmung der durch HIV-1-induzierten zytophatischen Wirkung bei MT4-Zellen

Das Testverfahren, das von Pauwels et al., J. Virol. Meth. 20/309 (1988) beschrieben wird, wird mit geringen Modifikationen verwendet. Die HTLV-I-transformierte T4-Zell-Linie, MT4, von der früher gezeigt würde, daß sie äußerst permissiv für die HIV-Infektion ist, wird als Zielzelle verwendet. Die Hemmung der durch HIV-1, Stamm HTLV-IIIB-induzierten zytopathischen Wirkung wird bestimmt, indem die Lebensfähigkeit sowohl von mit HIV infizierten als auch pseudoinfizierten Zellen gemessen wird Die leebensfähigkeit wird spektrophotometrisch bestimmt durch in-situ-Reduktion von 3-(4.5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT). Virusizifizierte und nichtinfizierte Kulturen ohne die Verbindung werden als Kontrollen eingeschlossen, ebenso wie nichtinfizierte Zellen, die mit der Verbindung behandelt wurden. Die Zellkonzentration wird so ausgewählt, daß die Anzahl von Zellen pro Milliliter um einen Falltor von 10 wählend 4 Tagen Inkubation in den pseudoinfizierten Kulturen ansteigt. Das Virus-Inoculum wird so eingestellt, daß bei 90% der Zielzellen nach 4 Tagen Inkubation der Zelltod verursacht wird. Der Virus wird auf eine lo4ach konzentrierte Zellsuspension 1 Stunde lang bei 37ºC adsorbiert. Dann werden die infizierten Zellen 1:10 verdünnt und zu Mikrotiterplatten, die die Testverbindung enthalten, zugegeben.

2. Zytotoxizität

Um das Anti-HIV-Potential bei zusatzlichen Zell-Linien auszuwerten und insbesondere bei einer monozytischen Zell-Linie (U937), wird zuerst die zelluläre Toxizität der Testverbindung für diese Zell-Linien bestimmt. Jurkat- und U937-Zellsuspensionen werden auf 1 × 10&sup5; Zellen/ml eingestellt und in Gegenwart verschiedener Konzentrationen der Testverbindung inkubiert. Nach 48 Stunden wird die Menge von Zellen/ml verglichen. indem mit MTT angefärbt wird. Die Zytotoxizität in MT4-Zellen kann auf gleiche Weise gemessen werden.

3. Hemmung der HIV-1-Replikation bei Jurcat- und U937-Zeilen

Die T4-Zell-Linie Jurkat und die monozytische Zell-Linie U937 werden infiziert, indem die Zellen 10-fach konzentriert in Viruslösung suspendiert werden. Die Absorption wird 2 Stunden bei 37ºC zugelassen. Die Zellen werden dann heruntergeschleudert, das Inoculum entfernt und die Zellen in ihrer ursprunglichen Konzentration in frischem Kulturmedium. das die Testverbindung enthalt, resuspendiert. So wird die Substanz nach der Adsorption zugegeben. An den Tagen 2, 5, 8, 12, 15 und 19 nach der Infektion werden Aliquots der infizierten Kulturen entnommen. Die Zellen werden abgeschleudert und die Überstande gesammelt. Die Konzentration an viralem p24-Antigen wird in den Überstanden bestimmt mit Hilfe eines im Handel erhaltlichen ELISA-Kits und dient als Parameter für die Virusproduktion. Nach jeder Entnahme von Miquots werden die Zellen gezählt und auf 2 × 10&sup5; Zellen/ml eingestellt, indem frisches Medium, das die Testverbindung in einer bestimmten Konzentration enthält, zugegeben wird.
Von den erfindungsgemäßen Verbindungen, d.h. nichtimmunsuppressiven, Cyclophilin-bindenden Cyclosporinen, die gegen HIV-1 aktiv sind (aktive Verbindungen), sind einige neu und andere bekannt; jedoch wurde die Anti-HIV-Aktivität der bekannten aktiven Verbindungen bisher nicht offenbart und in vielen Fällen wurde von den bekannten aktiven Verbindungen bisher nicht offenbart, daß sie irgendeine pharmazeutische Aktivität haben.
Es wurde geftuiden. daß viele der aktiven Verbindungen Strukiren haben, die sich von der von Ciclosporin insbesondere an den Positionen 4 und/oder 5 unterscheiden.
Eine Gruppe von aktiven Verbindungen sind Cyclosporine, bei denen die MeLeu-Gruppe an Position 4 durch eine andere N-methylierte Aminosäure ersetzt ist, z.B. γ-Hydroxy-MeLeu, MeIle, MeVal, MeThr oder MeAla. Außer MeIle und MeThr können auch die Allo-Formen Mealle und MeaThr verwendet werden. In der Allo-Form hat die Stereocherme an der β-Position die umgekehrte Konfiguration zu der natürlichen Aminosäure, sodaß die normale Form und die Allo-Form ein Paar von Diastereoisomeren bilden.
Eine weitere Gruppe von aktiven Verbindungen sind solche. bei denen Val an Position 5 durch eine N-Alkyl-, bevorzugt N-Methyl-Aminosäure ersetzt ist. Bevorzugt ist die Aminosäure, die N-alkyliert ist, Val oder Leu. Bevorzugt ist der Wasserstoff der Iminogruppe von [Val]&sup5; durch eine nichtverzweigte C&sub1;-C&sub6;-Alkylgruppe ersetzt, bevorzugt durch eine Methyl-. Ethyl- oder n-Propylgruppe, insbesondere eine Methylgruppe. Letztere bevorzugte Gruppe von aktiven Verbindungen ist neu.
Außerdem oder alternativ können sich bestimmte aktive Verbindungen von Ciclosporin an den Positionen 1, 2, 3 und/oder 6 unterscheiden. Eine bevorzugte Gruppe von aktiven Verbindungen wird von den Verbindungen der Formel I gebildet:
worin
W MeBmt, Dihydio-MeBmt oder 8'-Hydroxy-MeBmt ist;
X αAbu, Val, Thr, Nva oder O-Methyl-threonin (MeOThr) ist;
R Sar oder (D)-MeAla ist;
Y MeLeu, γ-Hvdroxy-MeLeu, MeIle, MeVal, MeThr, MeAla, MeaIle oder MeaThr ist;
Z Val, Leu, MeVal oder MeLeu ist und
Q MeLeu, γ-Hydroxy-MeLeu oder MeAla ist;
mit dem Vorbehall daß dann wenn Y MeLeu ist, daß dann entweder Z MeVal oder MeLeu ist oder W 8'-Hydroxy- MeBmt ist.
Die Gruppen W, X, Y, Z, Q und R haben, unabhangig, die folgenden bevorzugten Bedeutungen:
W ist bevorzugt W', wobei W' MeBmt oder Dihydro-MeBmt ist;
X ist bevorzugt X', wobei X'αAbu oder Nva ist, bevorzugter X", wobei X" αAbu ist;
R ist bevorzugt R', wobei R' Sar ist;
Y ist bevorzugt Y', wobei Y'γ-Hydroxy-MeLeu, MeVal, MeThr oder MeIle ist;
Z ist bevorzugt Z', wobei Z' Val oder MeVal ist und
Q ist bevorzugt Q', wobei Q' MeLeu ist.
Eine besonders bevorzugte Gruppe von aktiven Verbindungen sind die Verbindungen der Formel I, bei denen W W'ist, X X' ist.Y Y' ist, Z Z' ist, Q Q' istund R R' ist.
Besonders bevorzugte Verbindungen der Formel I sind:
a) [Dihydro-MeBmt]¹-[γ-Hydroxy-MeLeu]&sup4;-Ciclosporin
b) [MeVal]&sup4;-Ciclosporin
c) [MeIle]&sup4;-Ciclosporin
d) [MeThr]&sup4;-Ciclosporin
e) [γ-Hydroxy-MeLeu]&sup4;-Ciclosporin
f) [Nva]²-(γ-Hydroxy-MeLeu]4-Ciciosporin
h) [MeVal]&sup5;-Ciclosporin
i) [MeOThr]²-[(D)MeAla]³-[MeVal]&sup5;-Ciclosporin
j) [8'-Hydroxy-MeBmt]¹-Ciclosporin
Außerdem sind bestimmte Verbindungen, die nicht im Bereich von Formel I liegen, aktive Verbindungen. z.B. k) [MeAla]&sup6;-Ciclosporin und 1) (γ-Hydroxy-MeLeu]&sup9;-Ciclosporin.
Die Erlindung liefert auch neue aktive Verbindungen, die Verbindungen der Formel II sind:
worin W', X, R, Y und Z wie oben definiert sind, mit dem Vorbehalt, daß 1) wenn Y MeLeu oder MeAla ist, daß dann Z MeVal oder MeLeu ist und 2) wenn W' MeBmt ist, R Sar ist und Y γ-Hydroxy-Meleu ist, daß dann Z etwas anderes als Val ist.
Eine bevorzugte Gruppe von neuen aktiven Verbindungen besteht aus Verbindungen der Forrnel II, bei denen X X" ist, Y Y' ist und Z Z' ist, mit dem Vorbehalt, daß dann wenn W' Mebmt ist, Y' etwas anderes als γ- Hydroxy-MeLeu ist.
Besonders bevorzugte neue aktive Verbindungen sind die Verbindungen a), b), c), d), f) und h) oben. Es wurde gefunden, daß bestimmte von diesen Verbindungen, z.B. die Verbindungen b) und c), die immunsupprimierende Wirkung von Ciclosporin blockieren, indem sie die Bindung an Cyclophilin blockieren und damit als Ciclosporinantagonisten wirken.
Die aktiven Verbindungen können auf einer Vielzahl von Wegen erhalten werden, die klassifiziert werden können als:
1) Fermentation
2) Biotransformation
3) Derivatisierung
4) Teilsynthese
5) Vollsynthese
1) Bestimmte aktive Verbindungen werden hergestellt als Nebenprodudte der Fermentation ursprünglicher oder modifizierter Stämme von ciclosporinerzeugenden Organismen, wie Tolvdocladium inflatum Gams, ein Beispiel hierfür ist die Produktion von Verbindung c), die in Beispiel 1 unten beschrieben wird.
2) Andere aktive Verbindungen, einschließlich der bekannten Verbindungen j) und 1) sind Metabohten von Ciclosporin und können mit chromatographischen Methoden aus dem Urin von Menschen oder Tieren, die Ciclosporin erhielten, isoliert werden. Außerdem sind diese und andere metabolische Umwandlungen möglich unter Verwendung von Mikroorganismen. z.B. die Erzeugung der Verbindungen e) und g) durch Biotransformation von Cyclosporin A, wie in den Beispielen 2 und 3 beschrieben, oder der Verbindung f), durch Biotransformation von Cyclosporm G (Beispiel 4). Diese Beispiele zeigen ein neues Verfahren für die Herstellung von Cyclosporinen mit einem oder mehr γ-Hydroxy-Meleu-Resten, das die Stufen urufaßt, daß man einen neuen modifizierten Stamm von Sebekia benihana züchtet, ein Cyclosporin mit einem oder mehreren Meleu-Resten zugibt und das Produkt aus der Fermentationsbrühe isoliert.
3) Unter Derivatisierung wird verstanden, daß natürliche oder synthetische Cyclosporine in aktive Verbindungen umgewandelt werden können mit einer oder mehreren chemischen Reaktionen, bei denen eine oder mehrere Aminosäuren modifiziert werden. ohne die Peptidbindungen zu öffnen und neu zu bilden. Z.B. kann die Klasse der aktiven Verbindungen, bei denen Val an Position 5 N-alkyliert ist, erhalten werden, indem das entsprechende Cyclosporin mit Val an Position 5 mit Butyllitllium umgesetzt wird, gefolgt von der Reaktion mit einem Alkylierungsmittel. wie für Verbindung h) in Beispiel 5 und für Verbindung i) in Beispiel 6 ausgeführt.
Weiterhin kann beispielsweise Verbindiing a) durch Hydrierung von Verbindung e) (Beispiel 7) und Verbindung j), die auch ein Hauptmetabolit von Ciclosporin ist, aus der bekannten Verbindung Ciclosporinacetal wie in Beispiel 8 beschrieben, hergestellt werden.
4) Der Ausdruck Teilsynthese wird verwendet. um erne Reihe von chemischen Reaktionen zu bezeichnen. bei denen der Ring eines natürlichen Cyclosporins geöffiiet wird, eine oder mehrere Amiinosäuren entfernt werden. andere Aminosäuren zugefügt werden und der Ring wieder geschlossen wird.
5) Die Vollsynthese von Cyclosporinen kann durchgeführt werden, indem ein lineares Undecapeptid aufgebaut und cyclisiert vwird, wie von Wenger (siehe oben) beschrieben, siehe auch U.S. Patente 4 396 542 und 4 798 823. Im Prinzip kann jedes Cyclosporin durch Volisynthese hergestellt werden. obwohl andere Methoden, wenn sie verfügbar sind, geeigneter sein können als eine Vollsynthese. Volisynthesen können für die Herstellung von Verbindung d) (Beispiel 9) und die bekannte Metabolitverbindung 1) verwendet werden.
Verbindung k) ist eine bekannte Substanz, deren Eigenschaften von Quesniaux et al. (Mol. Immunol. 24, 1159, 1987) beschrieben werden und die auch mit einer Vollsynthese hergestellt werden kann. Z.B. wird eine vollständige Synthese dieser Verbindung in US-PS 4 914 188 beschrieben.

Beispiel 1 [MeIle]&sup4;-Ciclosporin (Verbindung c)

Produzierender Stamm

Verbindung c) wird erhalten durch Fermentation des Pilzstamms Tolypocladium inflatum Cy E 4556, hinterlegt bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen nach den Bestimmungen des Budapester Vertrages am 24. Juli 1991 mit der Hinterlegungsnummer DSM 6627. Dieser Stamm ist eine Mutante des Stammes NRRL 8044 der Art Tolypocladium inflatum Gams und ist taxonomisch identisch mit dem Elternstan, der vollständig beschrieben wurde z.B. in dem Bntischen Patent 1 491 509.
Kultur 1. Agar Startkultur Agarschrägkulturen des Stamms DSM 6627 werden 14 Tage bei 27ºC auf dem folgenden Agarmedium gezüchtet:
Hefeextrakt (Gistex) 4 g
Malzextrakt (Wander) 20 g
Agar 20 g
Entmineralisiertes Wasser auf 1000 ml
Das Medium hat einen pH von 5,4 bis 5,6 und wird 20 Minuten bei 120ºC sterilisiert.
2. Vorkultur: Sporen aus dem Mycel von 4 Startkulturen werden in 40 ml einer 0,9%igen Salzlösung suspendiert. Eine Reihe von 500 ml Erlenmeyerkolben, die jeweils 100 ml Vorkulturmedium enthalten, werden jeweils mit 20 ml dieser Suspension beimpft. Die Zusammensetzung des Vorkulturrnediums ist wie folgt:
Casein (Amber EHC) 25 g
Maltose 75 g
KH&sub2;PO&sub4; 1 g
KCl 2,5 g
Entmineralisiertes Wasser auf 1000 ml
Der pH des Mediums wird auf 5,2 bis 5,5 mit HCl eingestellt, dann wird das Medium 20 Minuten bei 120ºC sterilisiert. Die Vorluilturen werden 24 Stunden bei 27ºC auf einem Rundsehüttler mit 200 Upm mit einer Auslenkluig von 50 mm fermentiert.
3. Zwischenkultur: Ein Stahifermenter mit 25 l, der 20 l Vorkulturmedium enthält, wird mit 200 mi Vorkultur geimpft. Die Zwischenkultur wird 5 Tage bei 27ºC fermentiert mit einer Rüirrate von 150 Upm und einer Luftströmungsrate von 0,5 l/min/l Medium bei einem Druck von 0,5 bar.
4. Haudtkultur: 1001 Vorkulturmedium werden mit 101 Zwischenkultur beimpft und in einem Stahlfermenter mit 120 l fermentiert. Zu diesem Medium werden 4 gil D-Threomn, das durch Futration sterilisiert wurde, zugegeben. Die Fermentation wird 14 Tage lang bei 27ºC durchgefiihrl wobei in den ersten ftiif Tagen eine Rtihrrate von 70 Upm und eine Luftströmungsrate von 0,4 liminil Medium bei einem Druck von 0,5 bar verwendet wird und die Rührrate dann auf 100 Upm und die Lultströmungsrate auf 0.5 l/min für den Rest der Fermentationsperiode erhöht wird.
Isolierung: Das Mycel wird vom Kulturmedium getrennt und in einer Turrax-Vorrichtung extrahiert, indem dreimal mit 10 1 Methanol/Wasser (9:1 bezogen auf Volumen) zerkleinert und gerührt wird. Das zerkleinerte Mycel wird von dem Lösungsmittel durch Saugfiltration getrennt und die vereinigten Filtrate werden durch Verdampfen im Vakuum bei einer Temperatur von 40ºC eingeengt, bis der Dampf hauptsächlich aus Wasser besteht. Die erhaltene Mischung wird viermal extrahiert unter Verwendung von 2 1 1,2-Dichlorethan bei jeder Extrakiion und die vereinigten 1,2-Dichlorethanlösungen werden durch Verdampfen im Vakuum bei einer Temperatur von 40ºC eingeengt.
Der Rest wird einer Silicagelsäulenchromatographie (10 kg Silicagel. Granulatgröße 0,02 bis 0,045 mm, "Grace") unter Verwendung von Ethylacetat/Wasser als Elutionsmittel (Fraktionen von 2,5 l) unterworfen. Die Fraktionen 20 bis 23, die [Melle]&sup4;-Ciclosporin enthalten, werden gepoolt und dann weiter durch Silicagelsäulenchromatographie (600 g Silicagel. Granulatgröße 0,04 bis 0,063 mm, "Merck") unter Verwendung von Chloroform/Methanol (98:2 bezogen auf Volumen) als Elutionsmittel (Fraktionsgröße 300 ml) aufgetrennt. Eine weitere Reinigung wird erreicht durch Silicagelsäulenchroniatographie (400 g Silicagel, Granulatgröße 0,04 bis 0,063 mm. "Merck") unter Verwendung von Methylenchlorid/Methanol (98:2 bezogen auf Volumen) als Elutionsmittel (Fraktionsgröße 200 ml), was reines [Melle]&sup4;-Ciclosporin als amorphes weißes Pulver liefert: Schmelzpunkt 155 bis 158ºC; [α]D20 = -235º (c =0.68 in CHCl&sub3;) und -193º (c =0,74 in CH&sub3;OH).
Das IR-Spektrum in CH&sub2;Cl&sub2; ist in Figur 1 gezeigt und das Protonen-NMR-Spelrrum CDCl&sub3; ist in Figur 2 gezeigt.

Beispiel 2 [γ-Hydroxy-MeLeu]&sup4;-Ciclosporin (Verbindung e)

Verbindung e) wird durch Biotransforrnation von Ciclosporin durch den Mikroorganismus Sebekia benihana erhalten. Der verwendete Originalstamm wird NRLL 11111 genannt und gehört zu der Art Sebekia benihana (Dietz und Li: Sebekia, a new genus of the family Actinoplanaceae, Abstrs. 82nd Aun. Meet. Amer. Soc. Microbiol.. 163. Atlanta, 1982). Dieser Stamm kann Novobiocin hydroxylieren. Der subkultivierte Stamm, der für die Herstellung von Verbindung e) und verwandten Verbindungen verwendet wird, wurde bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen (D-3300 Braunschweig) unter der Nummer DSM 6182 hinterlegt.
1. Agarstartkultur: Agarschrägkulturen des Stamms DSM 6182 werden 10 Tage lang bei 27ºC auf dem folgenden Agarmedium gezüchtet:
Glucose 10 g
Starke (löslich) 20 g
Hefeextrakt (Gistex) 5 g
Pepton (N-Z-Amin Typ A, Sheffield) 5 g
CaCO&sub3; 1 g
Agar (Bacto) 18 g
Entmineralisiertes Wasser auf 1 l
pH: neutralisiert auf 7 mit NaOH/R&sub2;SO&sub4;
Sterilisierung.. 120ºC/20 min
2. Vorkultur: Sporen und Mycel einer Startkultur werden in 10 mi einer 0,9%igen Salzlösung suspendiert. Eine Reihe von 200-ml-Erlenmeyerkolben. die jeweils 50 mi Vorkulturmedium enthalten werden jeweils mit 5 mi dieser Suspension beirnpft. Die Zusammensetzung des Vorkulturmediums ist wie folgt:
Glucose 7 g
Starke (löslich) 10 g
Hefeextrakt (Gistex) 4,5 g
Malzextrakt (flüssig, Wander) 10 g
Pepton (N-Z-Amin typ A, Sheffield) 2,5 g
CaCO&sub3; 1 g
Spurenlösung Nr. 235 1 ml
Entmineralisiertes Wasser auf 1 l
pH neutralisiert auf 7 mit NaOH/H&sub2;SO&sub4;
Sterilisation; 120ºC/20 min
Spurenlösung Nr. 235:
H&sub3;BO&sub3; 0,1 g
FeSO&sub4; 7H&sub2;O 5 g
KI 0,05 g
CoCl&sub2; 6 H&sub2;O 2 g
CuSO&sub4; 5 H&sub2;O 0,2 g
MnCl&sub2; 4 H&sub2;O 2 g
ZnSO&sub4; 7H&sub2;O 4 g
Entmineralisiertes Wasser auf 999 ml
H&sub2;SO&sub4; (97%) 1 ml
Die Vorkulturen werden 4 Tage lang bei 27ºC auf einem Rundschüttler mit 200 Upm mit einer Auslenkung von 50 mm fermentiert.
3. Zwischenkultur: Eine Reihe von 200-ml-Erlenmeyerkolben. die jeweils 50 ml Vorkulturmedium enthalten, werden jeweils mit 5 ml Vorkultur beimpft. Die Zwischenkultur wird 3 Tage bei 27ºC auf einem Rundschütder mit 200 Upm mit einer Auslenkung von 50 mm fermentiert.
4. Hauptkultur: Eine Reihe von 500-ml-Erlenmeyerkolben. die jeweils 50 ml des Hauptmediums (insgesamt 12 l) enthalten, werden jeweils mit 5 ml Zwischenkultur beimpft. Diese Kulturen werden 3 Tage bei 27ºC auf einem Rundschüttler mit 200 Upm mit einer Auslenkung von 50 mm fermentiert. Nach 24 Stunden wird Cyclosporin A (7.5 mg), solubilisiert in Methanol. zu jeder Hauptkultur zugegeben (= 150 mg/l).
Die Zusammensetzung des Hauptkulturmediums ist wie folgt:
Cerelose 10 g
Dextrin 10 g
Starke (löslich) 10 g
Hefeexlrakt (Gistex) 2,5 g
Soyamehl (Nurupan, Edelsoja) 12,5 g
K&sub2;HPO&sub4; 0,25 g
KH&sub2;PO&sub4; 0,12 g
MgSO&sub4; 7H&sub2;O 0,10 g
CaCl&sub2; 6 H&sub2;O 0,05 g
Spurenelementlösung AC-1 1 ml
Entmineralisiertes Wasser auf 11
pH: eingestellt auf 7,2 bis 7,5 (KOH/H&sub2;SO&sub4;)
Sterilisierung: 120ºC/20 min
Spurenelementlösung AC-1: Diese Lösung hat die gleiche Zusammensetzung wie die Lösung Nr. 235 unter Zugabe von: (NH&sub4;)&sub6;Mo&sub7;O&sub2;&sub4; 0,2 g.
5. Isolierung: Das Mycel wird von dem Kulturmedium getrennt und das entstehende Kulturflitrat (13 l) wird dreimal mit 1,2-Dichlorethan extrahiert, wobei für jede Extraktion 1,5 l verwendet werden. Die vereinigten 1,2- Dichlorethanlösungen werden im Vakuum bei einer Temperatur von 40ºC eingedenipft. Der rohe Rückstand wird einer Sephadex LH-20-Gelfiltration unter Verwendung von Methanol als Elutionsmittel unterworfen. Die Fraktionen. die die Cyclosporinverbindungen enthalten (525 mg) werden gepeoled und auf Silicagel (50 g, Granulatgröße 0,04 bis 0.063 mm, "Merck") unter Verwendung von Chloroform/Methanol als Elutionsmittel chromatographiert. Die wiederholte Chromatographie unter Verwendung des gleichen Systems liefert reines [γ-Hydroxy-MeLeu]&sup4;- Ciclosporin als amorphes weißes Pulver, Schmelzpunkt 150 bis 153º, [α]D20 -225º (c = 0,53 in CHCl&sub3;), -171º (c = 0,44 in CH&sub3;OH).

Beispiel 3 [γ-Hydroxy-MeLeu]&sup4;-[γ-Hydroxy-MeLeu]&sup6;-Ciclosporin (Verbindung g)

Die polareren Nebenfraktionen, die aus der Reinigung von [γ-Hydroxy-MeLeu]&sup4;-Ciclosporin stammen, werden weiter aufgetrennt durch wiederholte Silicagelsäulenchromatographie (Granulatgröße 0,04 bis 0,063 mm) unter Verwendung von Aceton/Hexan 2:1 als Elutionsmittel und anschließende Chromatographie auf Silicagel unter Verwendung von Methyl-t-butylether/Methanol/Wasser 90:9:1 als Elutionsmittel. Die ersten Fraktionen enthalten [γ-Hydroxy-Leu]&sup4;-Ciclosporin, das weiter gereinigt wird, indem es mit Aktivkohle entfärbt wird, was die reine Verbindung als amorphes weißes liulver liefert, Schmelzpunkt 162 bis 164º, [α]D²&sup0; -211º (c = 0,50 in CHCl&sub3;), -157º (c = 0,52 in CH&sub3;OH).
Die spateren Fraktionen der obigen Silicagelsaulenchromatographie enthalten [γ-Hydroxy-MeLeu]&sup4;- [γ-Hydroxy-MeLeu]&sup6;-Ciclosporin und werden weiter gereinigt, indem sie mit Aktivkohle entflirbt werden, was die reine Titelverbindung als amorphes weißes Pulver liefert, Schmelzpunkt 157 bis 160º, [α]D²&sup0; -217º (c = 0,54 in CHCl&sub3;), -176º (c =0,42 in CH&sub3;OH).

Beispiel 4 [Nva]²-[γ-Hydroxy-MeLeu]&sup4;-Ciclospprin (Verbindung f)

Diese Verbindung wird hergestellt mit einem Verfahren analog der Herstellung von Verbindung e) ([γ-Hydroxy-MeLeu]4-Ciclosporin), aber unter Verwendung von Cyclosporin G ([Nva]²-Ciclosporin) als Ausgangsmaterial. Nach der Reinigung durch wiederholte Silicagelsäulenchromatographie unter Verwendung von Ethylacetat, das mit Wasser gesättigt ist, und Aceton/Hexan 2:1 als Elutionsmittel, wird die Titeherbindung als amorphes weißes Pulver erhalten, Schmelzpunkt 138 bis 141º, [α]D20 -213º (c = 0,69 in CHCl&sub3;), -168º (c = 0,70 in CH&sub3;OH).

Beispiel 5 [MeVal]&sup5;-Cidosporin (Verbindung h)

Qclosporin A (0,60 g = 0,5 mmol), gelöst in Tetrahydrofüran (20 ml) wird mit 0,63 ml einer 1,6 M Lösung von Butyllithium (1,0 mmol) in Hexan inkubiert. Die enstehende Lösung wird mit Dimethysulfat (0,1 ml; 1,5 mmol) bei -78ºC umgesetzt. Die Reaktionsmischung wird langsam auf Raumtemperatur erwarint und über Nacht gerührt.
Die Isolierung mit Blitzchromatographie (SiO&sub2;, 5% Methanoi/Ether) gefolgt von HPLC (Reverse phase) ergab das Titelprodukt. Die Verbindung wird gekennzeichnet durch ein 300 MHz ¹H NMR-Spekrum in CDCl&sub3;, das in Figur 3 gezeigt ist.

Beispiel 6 [MeoThr]²-[(D)MeAla]³-[MeVal]&sup5;-Ciciosoorin (Verbindung i)

Eine Mischung von 480 ml THF (absolut) und 6,96 g (49,2 mmol) Diisopropylanun wird auf -80ºC gekühlt und 33.5 ml einer 1,33 M Losung von Butyllithium in Hexan (= 44,5 mmol) wird langsam über eine Spritze zugegeben. Die Mischung wird 30 Minuten bei -80ºC gerülirt, dann wird eine Lösung von 8 g (6,6 mmol) Cyclosporin C ([Thr]²-Ciclosporin) in 120 ml absolutem THF über eine Spritze 2 bis 3 Minuten lang zugegeben. Die klare Lösung wird eine weitere Stunde bei -80ºC gerührt, dann werden langsam 2,06 ml Methyliodid zugegeben.
Die Mischung wird auf Raumtemperatur 2 Stunden lang erwärmen gelassen. dann werden 40 ml Wasser zugegeben und die Lösungsmittel auf einem Rotationsverdampfer bei 30ºC/iS mm Hg verdampft. Der Rückstand wird zwischen Wasser und Ether aufgetrennt und die Etheiphase viermal mit halbgesattigter Kochatzlösung gewaschen, über MgSO&sub4; getrocknet und eingedampft, was einen Rückstand von 8,1 g ergibt.
Der Rückstand wird auf 1200 g Kieselgel mit mit Wasser gesättigtem Ethylacetat chromatographiert, was ein rohes Produkt ergibl das nach einer weiteren Chromatographie auf 200 g Kieselgel mit 5% MeOH/CH&sub2;Cl&sub2; das reine Titelprodukt ergibt, [α]D20 = -195º (c = 1.0 in CHCl&sub3;).

Beispiel 7 [Dihydro-MeBmt]¹-[γ-Hydroxy-MeLeu]&sup4;-Ciclosporin (Verbindung a)

Zu einer Suspension von 200 mg vorhydriertem 10% Palladium/Kohle in 4 ml Ethanol werden 1,2 g [γ-Hydroxy-MeLeu]&sup4;-Ciclosporin (Verbindung e) in 10 ml Ethanol zugegeben und die Hydrierung bei Raumtemperatur durchgeflihrt, bis kein Wasserstoff mehr aufgenommen wird Nach der Entfernung des Katalysators durch Filtration wird die Losung eingedampft. was die Titelverbindung als amorphes weißes Pulver liefert, Schmelzpunkt 154 bis 156º, [α]D20 -225º (c = 0,87 in CHCl&sub3;), -169º (c =0,70 in CH&sub3;OH).

Beispiel 8 [8'-Hydroxy-MeBmt]¹-Ciclosporin (Verbindung j)

1. [C-Acetyl-ω-brom-MeBmt]¹-Ciclosporin: Eine Mischung von 25,0 g (20 mmol) [O-Acetyl-MeBmt]¹-Ciclosporin (Traber et al., Helv. Chim. Acta 1982, 65, 1653), 4,4 g (25 mmol) N-Bromsuccinimid und 400 mg Azobisisobutyronitril in 250 ml Tetrachlorkohlenstoff wird am Rückfluß 2,5 Stunden lang erwärmt. Das Lösungsmittel wird verdampft und durch Ether ersetzt, Feststoffe abffitriert, mit Wasser gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wird über Silicagel mit Ethylether/Ethylacetat (4:1) chromatographiert. was 10,7 g (40%) amorphes Produkt ergibt, das aus Ether/Hexan kristallisiert wird was 8,4 g Reinsubstanz liefert. Schmelzpunkt 207 bis 209ºC. Die späten Fraktionen des Chromatogramms enthielten zusätzliche 11,2 g des Produktes mit etwas schlechterer Qualität.
2. [O-Acetyl-ω-acetoxy-MeBmt]¹-Ciclosporin: Eine Mischung von 4,31 g (3,3 mmol) des Produkts von Stufe 1 (kontaminiert nach Schätzung mit 15 bis 20% Ausgangsmaterial) und 2,1 g (8 mmol) Tetraethylammoniumacetattetrahydrat in 30 ml Methylethylketon, die eine katalytische Menge Natriumiodid enthält, wird auf einem Ölbad 3 Stunden lang auf 105ºC erhitzt und über das Wochenende auf Raumtemperatur gehalten. Das Lösungsmittel wird mit Methyl-t-butylether verdürint und mit Wasser und Koclisalzlösung gewaschen. Die organische Phase wird über MgSO&sub4; getrocknet und eingedainpft, was 4,0 g rohes Produkt zurückläßt, das auf einer RP-18 Reverse-Phase-Säule (240 g) gereinigt wird, was 3.07 g des Titelprodukts liefert; Schmelzpunkt 191 bis 192ºC.
3. [ω-Hydroxy-MeBmt]¹-Ciclosporin: Eine Lösung von 1,72 g (1,3 mmol) des Prodükts von Stufe 2 in 75 ml Methanol und eine Lösung von 1.2 g Natrium in 50 ml Methanol werden vermischt und 2,5 Stunden bei Raumtemperatur gehalten. Dann wird die Lösung mit Essigäure angesäuert. Das Lösungsmittel wird bei vermindertem Druck eingedampft und der Rückstand in Methyl-t-butylether, aufeinanderfolgend mit Wasser, Kochsalzlösung und Natriumbicarbonatlösung gewaschen, über MgSO&sub4; getrocknet und eingedampft. Das rohe Produkt (1,6 g) wird von einer RP-1 8-Säule (240 g) mit Methanol/Wasser (75:15) eluiert, was 1,5 g reines Produkt ergibt. Eine Probe wird kristallisiert aus Ether/Hexan. was ein kristallines Produkt mit einem Schmelzpunkt von 181 bis 183ºC ergibt.

Beispiel 9 [MeThr]&sup4;-Ciclosporin (Verbindung d)

Die Vollsythese von Ciclosporin, wie in US-PS 4 396 542 und US-PS 4 798 823 beschrieben, wird durchgeführt unter Verwendung von Methr in Position 4 anstelle von Meleu. Das Produkt hat [α]D20 = -249,6º (c = 1,0 in CHCl&sub3;).

Beispiel 10 [MeVal]&sup4;-Ciclosporin (Verbindung b)

Die Vollsynthese von Ciclosporin, wie in US-PS 4 396 542 und US-PS 4 798 823 beschrieben, wird durchgeführt unter Verwendung von Meval in Position 4 anstelle von Meleu. Das Produkt hat [α]D20 = -226º (c 0,358 in CHCl&sub3;).

Beispiel 11 Immunsuppression und Cyclophilinbindung von aktiven Verbindungen im Vergleich zu Ciclosporin

Tabelle 1 gibt Beispiele an für (1) das Cyclophilinbindungsverhältnis (BR) von aktiven Verbindungen, gemessen in einem ELISA-Test und (2) die immunsuppressive Aktivität von aktiven Verbindungen vergliehen mit Ciclosporin, gemessen in einem MLR-Test und ausgedrückt als Prozentanteil der Aktivität bezogen auf Ciclosporin (immunsuppressives Verhältnis oder IR). Eine weitere Erklärung der Bedeutung dieser Werte und der Methoden zur Durchführung dieser Tests ist oben angegeben. Tabelle I

Beispiel 12 Anti-HIV-Aktivität und Zytotoxizität der aktiven Verbindungen

Beispiele der Aktivität von aktiven Verbindungen und von Ciclosporin als Inhibitoren der HIV-1- Replikation in MT4-Zellen und flir die Zytotoxizität von aktiven Verbindungen und Ciclosporin in MT4-Zellen sind in Tabelle II angegeben. Die Bedeutung dieser Zahlen und die geeigneten Methoden werden oben diskutiert. Tabelle II
Die aktiven Verbindungen sind indiziert sowom zur Verhütung von AIDS bei HIV-positiven Patienten ohne Symptome und zur Behandlung von Patienten, die unter AIDS leiden. Bei Patienten, bei denen AIDS aufgetreten ist, soute die Verabreichung der aktiven Verbindung die T4-Zell-Vcrminderung, die mit AIDS verbunden ist, rückggngig machen, eine Regression von mit AIDS in Beziehung stehenden Störungen induzieren. z.B. dem Kaposi-Sarkom, und die Wahrscheinlichkeit ncuer opportunistiseher Infektionen vermindern.
Somit liefert die Erfindung ein Verfahren zur Behandlung und zur Verhütung des erworbenen Immunschwächesyndroms und anderer Störungen, die durch das HIV-1-Virus bei einem Patienten, der mit dem Virus infiziert ist, induziert werden, das umfaßt, daß man dem Patienten eine wirksame Menge einer aktiven Verbindung der Erfindung verabreicht.
Die aktive Verbindung kann auf jedem üblichen Weg verabreicht werden, insesondere enteral, z.B. oral, z.B. in Form von Lösungen zum Trinken, Tabletten oder Kapseln, oder parenteral, z.B in Form von injizierbaren Lösimgen oder Suspensionen. Auf dem intravenösen Weg kann eine indizierte tägliche Dosis 1 bis 20 mg/kg, bevorzugt 3 bis 10 mg/kg sein und auf dem oralen Weg 1 bis 50 mg/kg, bevorzugt 7 bis 20 mg/kg.
Es wird angenommen, daß die Toxizität der aktiven Verbindungen ähnlich der von Ciclosporin ist. Da die aktiven Verbindungen nicht immunsuppressiv sind, werden bestimmte Nebenwirkungen von Ciclosporin, die mit der Immunsuppression in Verbindung stehen, vermieden. Andere Nebenwirkungen, die mit Ciclosporin verbunden sind, insbesondere bei langzeitiger Verwendung eine Nephrotoxizität, können jedoch auch mit den aktiven Verbindungen einhergehen.
Bevorzugte galenische Präparate für die aktiven Verbindungen schlicßen solche auf Basis von Mikroemulsionen ein; wie in der Britischen Patentanmeldung 2 222 770 beschrieben, was topische ebenso wie orale Formen einschließt; ebenso wie oral und injizierbare Formen, die aus festen Lösungen erhalten werden, die einen Fettsäuresaccharidmonoester, z.B. Saccharosemonolaurat, enthalten, wie in der Britischen Patentanineldung 2 209 671 beschrieben. Geeignete Einheitsdosierungsformen für die orale Verabreichung enthalten z.B. 25 bis 200 mg aktive Verbindung pro Dosierung.

Präparat Beispiel A:

Produkt von Beispiel 1 50,0 mg
Glycofurol 75 180,0 mg
Miglyol 812 90,0 mg
Cremophor RH40 180,0 mg
Alpha-Tocopherol 0,5 mg

Präparat Beispiel B:

Produkt von Beispiel 1 100,0 mg
Tetraglycol 20,0 mg
Captex 800 20,0 mg
Nikkol HCO-40 860,0 mg
Butlhydroxytoluol (BHT) 1,0 mg

Präparat Beispiel C:

Produkt von Beispiel 1 25,0 mg
Glycofürol 75 100,0 mg
Miglyol 812 35,0 mg
Cremophor RH40 90,0 mg
Butylhydroxyanisol (BHA) 0,2 mg

Präparat Beispiel D:

Produkt von Beispiel 1 10,0 mg
Tetraglycol 10,0 mg
Myritol 5,0 mg
Cremophor RH 40 75,0 mg
alpha-Tocopherol 0,1 mg
Die einzelnen Komponenten dieser Präparate, ebenso wie die Methoden zu ihrer Herstellung, sind vollstandig in der Britischen Patentanmeldung 2 222 770 beschrieben, deren Inhalt hier durch Bezugnahme eingeschlossen wird.

Claims

1. Verwendung eines Cyclosporins zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und Verhütung von AIDS und mit AIDS in Beziehung stehenden Störungen, dadurch gekennzeichnet, daß das Cyclosporin

(i) an menschliches Cyclophilin bindet mit einem Bindungsverhäitms (BR) von weniger als 0,7, wobei BR der Logarithmus zur Basis 10 des Verhältnisses der IC&sub5;&sub0; von Cyclosponn zu der IC&sub5;&sub0; von Ciclosporin, gemessen in einem kompetitiven ELISA-Test, ist und

(ii) eine Aktivität in der gemischten Lyniphozytenreaktion von nicht mehr als 5% von Ciclosporin hat.

2. Verbindung der Formel I

worin

W Mebmt, Dihydro-Mebmt oder 8'-Hydroxy-MeBmt ist;

X αAbu, Val, Thr. Nva oder MeOThr ist;

R Sar oder (D)-MeAla ist;

Y MeLeu, γ-Rydroxy-MeLeu, MeIle, MeVal, MeThr. MeAla, MeaIle oder MeaThr ist;

Z Val, Leu, MeVal oder MeLeu ist und

Q MeLeu; γ-Hydroxy-Meleu oder MeAla ist;

mit dem Vorbehalt, daß dann wenn Y MeLeu ist, daß dann entweder Z MeVal oder MeLeu ist oder W 8'-Hydroxy- MeBmt ist; zur Verwendung als Pharmazeutikum.

3. Verbindung nach Anspruch 2 mit der Formel I'

worin

W' MeBmt oder Dihydro-MeBmt ist;

X' αAbu oder Nva ist;

Y' γ-Hydroxy-MeLeu MeVal. MeThr oder MeIle ist und

Z' Val oder MeVal ist; zur Verwendung als Pharmazeutikum.

4. Verbindung ausgewählt aus der Gruppe umfässend:

[Dihydro-MeBmt]¹-[γ-Hydroxy-MeLeu]&sup4;-Ciclosporin

[MeVal]&sup4;-Ciclosporin

[MeIle]&sup4;-Ciclosporin

[MeThr]&sup4;-Ciclosporin

[γ-Hydroxy-MeLeu]&sup4;-Ciclosporin

[Nva]²-(γ-Hydroxy-MeLeu]&sup4;-Ciclosporin

[γ-Hydroxy-MeLeu]&sup4;-[γ-Hydroxy-MeLeu]&sup6;-Ciclosporin

[MeVal]&sup5;-Ciclosporin

[8'-Hydroxy-MeBmt]¹-Ciclosporin und

[γ-Hydroxy-MeLeu]&sup9;-Ciclosporin

zur Venvendung als Pharmazeutikumn.

5. Verwendung einer Verbindung nach Anspruch 2, 3 oder 4 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und Verhütung von AIDS und mit AIDS in Beziehung stehenden Störungen.

6. Verbindung der Formel II

worin

W' MeBmt oder Dihydro-MeBmt ist.

X αAbu, Val, Thr, Nva oder MeOThr ist;

R Sar oder (D)-MeAla ist:

Y MeLeu, γ-Hydroxy-MeLeu, MeIle, MeVal, MeThr, MeAla. MeaIle oder MeaThr ist und

Z Val, Leu, MeVal oder MeLeu ist:

mit dem Vorbehalt, daß dann, 1) wenn Y Meleu oder Meala ist, daß dann Z MeVal oder MeLeu ist und 2) wenn W' MeBmt ist, R Sar ist und Y γ-Hydroxy-Meleu ist. daß dann Z etwas anderes als Val ist.

7. Verbindung nach Anspruch 6 der Formel II'

worin

W' MeBmt oder Dihydro-MeBmt ist;

Y' γ-Hydroxy-MeLeu, MeVal. MeThr oder MeIle ist und

Z Val oder MeVal ist;

mit dem Vorbehalt, daß dann, wenn W' MeBmt ist, Y' etwas anderes als γ-Hydroxy-MeLeu ist.

8. Verbindung ausgewählt aus der folgenden Gruppe:

[Dihydro-MeBmt]¹-[γ-Hydroxy-MeLeu]&sup4;-Ciclosporin,

[MeVal]&sup4;-Ciclosporin,

[MeThrj&sup4;-Ciclosporin.

[Nva]²-[γ-Hydroxy-MeLeu]&sup4;-Ciclosporin.

[γ-Hydroxy-MeLeu]&sup4;-[γ-Hydroxy-MeLeu]&sup6;-Ciclosporin,

[MeVal]&sup5;-Ciclosporin und

[MeOThr]²-[(D)MeAla]³-[MeVal]&sup5;-Ciclosporin.

9. [MeIle]&sup4;-Ciclosporin.

10. Ein Verfahren zur Herstellung von [MeIle]&sup4;-Ciclosporin umfassend die Stufe, daß man den Pilzstamm DSM 6627 in einem Nährmedium züchtet und das Produkt aus der Fermentationsbrühe isoliert.

11. Reine Kultur des Pilzstamms DSM 6627.

12. Verfahren zur Herstellung von Cyclosporinen, die ein oder mehrere γ-Hydroxy-MeLeu-Reste haben, umfassend die Stufen. daß man den Pilzstinm DSM 6182 in einem Nährmedium züchtet, ein Cyclosporin zugibt, das ein oder mehrere Meleu-Reste hat, und das Produkt aus der Fermentationsbrühe isoliert.

13. Reine Kultur des Pilzstamms DSM 6182.