DE69024364T2

DE69024364T2 - Verstärkter chemilumineszenzassay

Info

Publication number: DE69024364T2
Application number: DE69024364T
Authority: DE
Inventors: Larry Kricka
Original assignee: British Technology Group Ltd
Current assignee: BTG International Ltd
Priority date: 1989-10-17
Filing date: 1990-10-16
Publication date: 1996-07-11
Anticipated expiration: 2010-10-17
Also published as: EP0496793A1; EP0496793B1; JP2977895B2; DE69024364D1; WO1991005872A1; US5306621A; JPH05501203A

Description

Hintergrund der Erfindung

1. Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft diagnostische Mittel, insbesondere zur Bestimmung der Enzymaktivität, unter Anwendung einer Chemolumineszenzreaktion (einer chemischen Reaktion, die zur Emission von Licht führt). Die spezielle Chemolumineszenzreaktion findet zwischen einem 2,3-Dihydro-1,4- phthalazindion (DPD), insbesondere Luminol oder Isoluminol, und einem Oxidationsmittel, insbesondere Wasserstoffperoxid, und einem Peroxidaseenzym statt, das die Oxidation des DPD's durch das Oxidationsmittel katalysiert. Die Oxidation ist begleitet von der Emission von Licht und bildet so ein Signal, durch das die Enzymaktivität bestimmt (nachgewiesen oder gemessen) werden kann.

2. Beschreibung des Standes der Technik

Enzyme werden außerordentlich weit verbreitet als Markierungen in Liganden/Binder-Assays (z.B. Immunoassays, DNA-Hybridisierungsassays) angewandt und die einer enzymkatalysierten Reaktion innewohnende Signalverstärkung verleiht dem Assay eine hohe Empfindlichkeit. Chemolumineszenzreaktionen sind sehr empfindlich und wurden erfolgreich angewandt zur Messung der Enzymaktivität mit einer Verbesserung der Nachweisgrenze für das Enzym gegenüber üblichen Enzymassays L.J. Kricka und T.P. Whitehead, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 5, 829-833, (1987).
Alkalische Phosphatase kann durch Chemolumineszenz gemessen werden unter Anwendung der Phosphatsubstrate, die angegeben sind in der EP-Veröffentlichung 254051A und von Bronstein et al., Journal of Bioluminescence and Chemiluminescence, 4, 99-111, (1989). Das Enzym spaltet das Phosphat von dem Adamantyl-1,2-dioxethanphosphat unter Bildung eines dephosphorylierten Zwischenproduktes, das sich unter Lichtemission zersetzt. Ein Biolumineszenzassay für dieses Enzym ist auch möglich unter Verwendung von Leuchtkäferluciferin-O-phosphat (PCT-Veröffentlichung WO 87/02667). Das Enzym spaltet die Phosphatgruppe ab und setzt das Leuchtkäferluciferin frei, das im Gegensatz zu Luciferinphosphat ein Substrat ist für die Biolumineszenzreaktion, die durch Leuchtkäferluciferase katalysiert wird: Luciferase D-Luciferin Oxyluciferin
Peroxidaseaktivität kann durch Chemolumineszenz gemessen werden unter Verwendung von Luminol als Substrat und die analytische Anwendung dieser Reaktion wird deutlich verbessert durch Zugabe bestimmter Verstärker, insbesondere bestimmter Phenole, US-PS 4 598 044 und GB-Anmeldung 2 205 945A, oder von Ammen (US-PS 4 729 950), alle von National Research Development Corporation.
Es war ein Problem, daß derartige Assays mit verstärkter Chemolumineszenz die Verwendung eines Peroxidaseenzyms erfordern und daher in erster Linie geeignet sind für Assays, bei denen der Ligand oder sein Bindungspartner mit Peroxidase markiert sind. Es wäre wünschenswert, ein Chemolumineszenzassay zur Verfügung zu haben, bei dem der Ligand oder der Bindungspartner mit einem unterschiedlichen Enzym, insbesondere alkalischer Phosphatase, markiert sein kann.
Weiterer Stand der Technik wird nach "Zusammenfassung der Erfindung" erwähnt, da der Zusammenhang sonst nicht klar wäre.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung beruht auf dem Gedanken der Verwendung eines phenolischen Verstärkers für das oben erwähnte bekannte Chemolumineszenzassay auf Peroxidasebasis, um das Assay für das Vorhandensein eines zweiten Enzyms empfindlich zu machen. Aufgrund dieser Idee hat es sich gezeigt, daß bestimmte Enzyme Reaktionen von bestimmten nicht-verstärkenden oder schwach-verstärkenden Verbindungen katalysieren und einen guten Verstärker bilden und es so ermöglichen, daß eine verstärkte Peroxidase-katalysierte Chemolumineszenzreaktion abläuft, und ferner, daß die Lichtemission von dieser Reaktion abhängt von dem Enzym, das bei der Verstärkerbildungsreaktion angewandt wird. Es hat sich ferner gezeigt, daß derartige Assays durchgeführt werden können als Einglasassays, wobei die nicht-verstärkende oder schwach-verstärkende Verbindung mit dem Enzym in Gegenwart der Reagentien umgesetzt wird, die zu der Chemolumineszenzreaktion führen.
Die nicht-verstärkende oder schwach-verstärkende Verbindung wird hier als "Pro-Verstärker" bezeichnet. Sie ist normalerweise ein Derivat des Verstärkers und kann durch Wirkung des Enzyms unter Bildung des Verstärkers gespalten werden. Vorzugsweise ist sie ein Phosphat und das zur Spaltung angewandte Enzym ist eine alkalische Phosphatase.
Es hat sich auch gezeigt, daß bestimmte "Anti-Verstärker" die Wirkung des Verstärkers auf das Chemolumineszenzassay hemmen. Zum Beispiel hemmt p-Nitrophenol die Verstärkungswirkung von p-Iodphenol. Das Einwirkenlassen einer nicht-anti-verstärkenden Verbindung, die günstigerweise gespalten wird durch ein Enzym zur Erzeugung des Anti-Verstärkers, ist ein anderer Weg, die Verstärkung des Assays von dem Enzym abhängig zu machen. So wird p-Nitrophenolphosphat durch alkalische Phosphatase gespalten unter Bildung von p-Nitrophenol, wodurch die Lichtemission eines DPD/Oxidans/Peroxidase phenolischer Verstärker-Chemolumineszenzreaktionsgemisches verringert wird. Der Nicht-Anti-Verstärker oder schwach-wirkende Anti-Verstärker, der üblicherweise ein Derivat des Anti-Verstärkers ist, wird hier als "Pro-Anti- Verstärker" bezeichnet. Der Ausdruck "Anti-Verstärker" ist gegenüber dem Ausdruck "Inhibitor" bevorzugt, da es für die Verbindung nur erforderlich ist, mindestens einen Teil der Verstärkung aufzuheben. Sie muß nicht, und sollte vorzugsweise nicht, die nicht-verstärkte Chemolumineszenzreaktion hemmen.
Folglich liefert die vorliegende Erfindung ein Verfahren für ein Chemolumineszenzassay, bei dem eine verstärkte Peroxidase-katalysierte Chemolumineszenzreaktion stattfindet, insbesondere zwischen einer Peroxidase, einem Oxidans und einem Dihydrophthalazindion (DPD) in Gegenwart eines Verstärkers und bei dem eine Substanz, die es ermöglicht, daß die Reaktion stattfindet, durch Lumineszenz nachgewiesen oder gemessen wird, das dadurch gekennzeichnet ist, daß der Verstärker gebildet wird durch die Enzym-katalysierte Reaktion eines Pro-Verstärkers oder ein Verstärker bereits vorhanden ist und ein Anti-Verstärker, der mindestens teilweise die Verstärkung hemmt, gebildet wird durch Enzym-katalysierte Reaktion eines Pro-Antiverstärkers, und daß das Enzym (in freier oder gebundener Form), das die Bildung entweder des Verstärkers oder des Anti-Verstärkers katalysiert, oder eine Substanz die von dem Enzym abhängt, bestimmt wird.
Die Erfindung umfaßt auch eine Analyseneinheit bzw. ein Kit zur Durchführung eines Assays, bei dem eine Chemolumineszenzreaktion zwischen einer Peroxidase, einem Oxidans und einem Dihydrophthalazindion (DPD) in Gegenwart eines Verstärkers stattfindet, wobei das Kit das DPD enthält, das dadurch gekennzeichnet ist, daß das Kit ferner entweder (a) einen Pro-Verstärker, aus dem ein Verstärker gebildet werden kann durch eine Enzym-katalysierte Reaktion, oder (b) (i) einen Verstärker und (ii) einen Pro-Anti-Verstärker, aus dem ein Anti-Verstärker, der zumindest teilweise die Verstärkung hemmt, durch eine Enzym-katalysierte Reaktion gebildet werden kann, enthält.

Stand der Technik

Die Nachweisgrenze für ein Enzym kann deutlich verbessert werden mit Hilfe einer gekoppelten Assayanordnung, bei der das zu messende Enzym ein Substrat zu einem Produkt umwandelt, das ein zweites Enzym aktiviert, das dann ein Substrat zu einem meßbaren Produkt umwandelt. Die erhöhte Empfindlichkeit dieser Art von Assay beruht auf der kumulativen Wirkung der aufeinander folgenden enzymatischen Verstärkungsstufen.
Die Veröffentlichung der GB-Patentanmeldung 2 192 889A und ihrer Trennanmeldung 2 156 518A (London Biotechnology Ltd.) beschreibt die Verwendung eines Prosthetogens. Das Enzym wirkt auf das Prosthetogen (eine inaktive Form eines Cofaktors einer prosthetischen Gruppe) unter Bildung eines Produktes, das schließlich nachgewiesen wird. Das Prosthetogen besitzt die Formel R-X, wobei R ein Pyrimidin-3'-phosphatrest und X eine abspaltbare Gruppe ist, die durch R an die Phosphatgruppe gebunden ist, z.B. Riboflavin. Das Erkennungssystem erzeugt das Enzym Ribonuklease A, die die R-X-Bindung spaltet, und eine Verbindung X-OH (Riboflavin) freisetzt. Das Riboflavin wird durch Riboflavinkinase veranlaßt, Flavinmononukleotid (FMN) zu bilden, das weitere Reaktionen zum Nachweis eingeht.
Die Veröffentlichung der Europäischen Patentanmeldung 27036A (C.H. Self) beschreibt eine gekoppelte Assayanordnung, bei der das Enzym einen Modulator für ein zweites Enzym erzeugt oder entfernt. Der Modulator kann ein Aktivator, Inhibitor, Substrat, Cofaktor, Coenzym oder ein Metallion sein.
Die Veröffentlichung der PCT-Anmeldung WO 81/00725 (P. Duffy und The Prince Charles Hospital Devolpment Centre Trust) beschreibt ein anderes kompliziertes System, das wie folgt beispielhaft dargestellt werden kann. Der nachzuweisende Ligand Digoxin tritt mit Enzym-konjugiertem Digoxin um den Anti-Digoxinantikörper in Konkurrenz. Das Enzym ist β-Galactosidase. Um das freie oder gebundene Konjugat nachzuweisen, wird die β-Galactosidase umgesetzt mit einem Phenyl-β-galactosidsubstrat, das Phenol bildet. Das Phenolprodukt wird verstärkt durch Umsetzung mit Tyrosinase zur Bildung von o-Chinon, das zu o-Katechin reduziert wird durch Oxidation von NADH zu NAD.
In der Veröffentlichung der Europäischen Patentanmeldung 49606A (C.H. Self) wird das Vertärkungssystem wie folgt erläutert. Kreatinkinase wird nachgewiesen durch ihre Reaktion mit Kreatinphosphat unter Bildung von ATP. Das als "Aktivator" beschriebene ATP wird angewandt, um die Reaktion von Fructose-6-phosphat zu Fructosediphosphat anzutreiben, katalysiert durch das Enzym Fructosephosphokinase mit Umwandlung von ATP zu ADP. Das ADP wird dann angewandt, um eine zweite enzymatische Reaktion anzutreiben, in der es zu ATP umgewandelt wird. Dieses als "Erleichterer" beschriebene ATP führt wieder zum Beginn des Zyklus zurück. Schließlich führt die zweite enzymatische Reaktion zu einem nachweisbaren Produkt. Der "Aktivator" ist definiert als eine Substanz, die erforderlich ist, damit eine enzymatische Reaktion stattfindet, wenn alle anderen für die enzymatische Reaktion erforderlichen Komponenten vorhanden sind.
P.D. Mize et al., Analytical Biochemistry, 179, 229-235, (1989), beschreibt die Verwendung eines maskierten Inhibitors von Carboxylesterase. Die Dephosphorylierung durch Einwirkung von alkalischer Phosphatase demaskiert den Inhibitor und erzeugt wieder die Enzymaktivität der Carboxylesterase.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 (siehe Beispiel 2) zeigt eine Standardkurve für das Assay von alkalischer Phosphatase nach dem erfindungsgemäßen Verfahren unter Anwendung eines Pro-Verstärkers, und
Fig. 2 (siehe Beispiel 3) zeigt eine Standardkurve für das Assay von alkalischer Phosphatase nach dem erfindungsgemäßen Verfahren unter Anwendung eines Verstärkers und eines Pro-Anti-Verstärkers.

Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen

Verstärkte Chemolumineszenzassays sind vollständig in den oben erwähnten Patentschriften beschrieben. Die Reagentien, Konzentrationen davon, Inkubationsbedingungen und andere Assaybedingungen die hier erwähnt sind, sind mutatis mutandis, auf die vorliegende Erfindung anwendbar und es wird hier auf diese Literaturstellen verwiesen.
Die Reaktion kann wie folgt bei Verwendung der bevorzugten Reagentien beschrieben werden:
Luminol + H&sub2;O&sub2; + HRP hν (Licht) + Oxidationsprodukte (HRP = Meerrettichperoxidase; PIP = p-Iodphenol-Verstärker).
Die Chemolumineszenzassays werden als "verstärkt" beschrieben, in dem Sinne, daß die Gesamtlichtemission der Reaktion und/oder das Verhältnis Signal/Hintergrund größer ist als es erhalten wird bei der gleichen Reaktion, die in Abwesenheit eines Verstärkers durchgeführt wird. Der Mechanismus der Verstärkung ist nicht vollständig klar, aber die oben erwähnten Veröffentlichungen nennen eine große Anzahl von Verstärkern. Besonders bevorzugt sind p-Iodphenol, p-Hydroxycinnaminsäure und p-Imidazol-1-ylphenol. Andere Beispiele sind p-Bromphenol, p-Phenylphenol, 2-Naphthol, 6-Brom-2-naphthol und 6-Hydroxybenzothiazol.
Bei der vorliegenden Erfindung wird ein Pro-Verstärker oder ein Pro-Anti-Verstärker verwendet. Es ist zu bemerken, daß es sich hierbei um relative Bezeichnungen handelt. Der Unterschied bei der Verstärkung zwischen dem Pro-Verstärker und dem Verstärker ist die unbedingte Notwendigkeit. Ein geringer Grad an Verstärkungswirkung des Pro-Verstärkers ist zulässig, solange der Kontrast der Verstärkung, die mit Pro-Verstärker und Verstärker erreicht wird, vernünftig groß ist. Ähnlich muß der Pro-Anti-Verstärker die Verstärkung nicht vollständig hemmen, solange der Unterschied in der Hemmung der Verstärkung, die erreicht wird bei Verwendung des Pro-Anti-Verstärkers und des Anti-Verstärkers, ausreichend groß ist. Normalerweise ist es bevorzugt, es so einzurichten, daß die Pro-Verbindung keine oder eine nicht nennenswerte oder nicht wesentliche Wirkung auf die Verstärkung bzw. Hemmung der Verstärkung ausübt. Die Pro-Verbindung ist vorzugsweise ein Phosphat, das durch alkalische Phosphatase gespalten wird, was es ermöglicht, daß dieses Enzym die Substanz wird, die direkt bestimmt wird. (Natürlich kann z.B. ein Ligand/Enyzm-Konjugat, ein damit konkurrierender Ligand oder ein Bindungspartner des Liganden dann indirekt bestimmt werden, wobei jede dieser Substanzen meßbar ist aufgrund ihrer Abhängigkeit von dem Enzym als Markierung bei dem Assayverfahren).
Um die beiden Hauptausführungsformen der Erfindung zu erläutern, wird der bevorzugte Pro-Verstärker, p-Iodphenolphosphat (PIPP), durch alkalische Phosphatase gespalten unter Bildung von p-Iodphenol, das ein wirksamer Verstärker für die Peroxidase-katalysierte DPD/Peroxid-Chemolumineszenzreaktion ist. PIPP wirkt nicht als Verstärker und liefert somit kein Chemolumineszenzsignal über den nicht-verstärkten Hintergrund hinaus. In Gegenwart einer begrenzenden Menge von alkalischer Phosphatase, hängt die Stärke der Lichtemission von der Enzymaktivität ab. Dieses Assay kann stufenweise durchgeführt werden, es wird jedoch vorzugsweise in einer Stufe durchgeführt, in der alle Assayreagentien (PIPP, Peroxidase, DPD und Peroxid) mit der Testprobe, enthaltend alkalische Phosphatase, vermischt werden.
Alternativ wird der bevorzugte Pro-Anti-Verstärker, p-Nitrophenylphosphat (PNPP), durch alkalische Phosphatase gespalten unter Bildung von p-Nitrophenol, das ein Inhibitor für die durch p-Iodphenol verstärkte Peroxidase-katalysierte DPD/Peroxid-Chemolumineszenzreaktion ist. PNPP wirkt als schwacher Inhibitor, vermutlich aufgrund der nicht-enzymatischen Hydrolyse zu p-Nitrophenol (R.B. McComb, G.N. Bowers und S. Posen, Alkaline Phosphatase, Plenum Press, New York, 1979, S. 234), aber das ist weniger, verglichen mit der Hemmung, die erzeugt wird durch das enzymatisch gebildete p-Nitrophenol. In Gegenwart einer begrenzenden Menge an alkalischer Phosphatase ist die Verringerung der Lichtemission (prozentuale Hemmung) umgekehrt proportional mit der Enzymaktivität.
Das Enzym, das auf die Pro-Verbindung wirkt, wird allgemein als das "erzeugende Enzym" für den Zweck der Beschreibung bezeichnet.
Obwohl die Erfindung von besonderem Interesse ist im Zusammenhang mit alkalischer Phosphatase als erzeugendes Enzym, was ein Enzym von besonderem Interesse für Enzymimmunoassays ist, kann sie auch angewandt werden im Zusammenhang mit einer Vielfalt von anderen Enzymen. Zum Beispiel kann ein substituierter Phenolverstärker aus seinem β-D-Galactopyranosid durch β-D-Galactosidase, seinem Glucopyranosid durch β-D-Glucosidase, seinem Sulfat durch eine Arylsulfatase oder seinem carboxylatester durch eine Carboxyesterase erzeugt werden. Komplexere Derivate, wie das Lacto-N-biosid, d.h. 2-Acetamido-2-deoxy-3-0-β-D-galactopyranosyl-β-D-glucopyranosid, das spaltbar ist durch Fucosyltransferase, und das N-Acetyl-β-D-glucosaminid, das spaltbar ist durch N-Acetylglucosaminidase ("NAG"), können ebenfalls angewandt werden.
Obwohl es nicht im Vordergrund steht, eine Peroxidase als erzeugendes Enzym zu verwenden, ist es möglich und liegt im Rahmen der Erfindung. Für die Chemolumineszenzreaktion ist eine übliches Peroxidase vorzugsweise basische Meerrettichperoxidase, wie vom Sigma VI-Typ vorgesehen. Ein Peroxidaseisoenzym, z.B. eine saure Meerrettichperoxidase wie vom Sigma VII-Typ, kann als erzeugendes Enzym angewandt werden.
Bestimmte p-Nitrophenolderivate, die durch Enzyme gespalten werden können, sind als Substrate für enzymatische Reaktionen angewandt worden unter Bildung von p-Nitrophenol (einem Chromogen). Bestimmte Phenole sind Anti-Verstärker wie o-Methoxyphenol, p-Methoxyphenol und 4-Hydroxy-3-methoxycinnaminsäuren. Die Phosphate, Galactoside usw. dieser Verbindungen sind Pro-Anti-Verstärker, die durch Enzyme unter Bildung der Anti-Verstärker gespalten werden können. Es gibt daher verschiedene im Handel erhältliche Derivate zur Verwendung als Pro-Anti-Verstärker nach der Erfindung.
Während die erfolgreichsten Verstärker bisher phenolische Verbindungen (substituierte Phenole und Naphthole) waren, können auch Amine angewandt werden. Allgemein sind N-methylierte Amine geeignete Pro-Verstärker. Zum Beispiel kann N-Methyl-p-anisidin chemisch verändert werden, hauptsächlich demethyliert werden, durch ein saures peroxidaseisoenzym (das sich, wie oben erklärt, von üblichen Peroxidasen unterscheidet) oder durch Cytochrom P-450. Obwohl die Reaktion, durch die die Pro-Verbindung auf das Enzym einwirkt, üblicherweise eine Spaltung ist, können andere Reaktionsarten auch in Betracht gezogen werden, z.B. die Reaktion von Phenol mit einem Iodinaseenzym zu p-Iodphenol oder die Reaktion von N,N-Dimethylanilin unter Bildung von N,N',N,N'- Tetramethylbenzidin in Gegenwart eines wie oben erwähnten demethylierenden Enzyms.
N-Methyl-p-anisidin verstärkt die erwähnte Chemolumineszenzreaktion von DPD, Oxidans und Peroxidase nicht in nennenswertem Ausmaß. Es hat sich jetzt gezeigt, daß wenn N-Methyl-p-anisidin durch ein saures Meerrettichperoxidaseisoenzym zur Wirkung gebracht wird, das erhaltene Produkt, das p-Anisidin umfaßt, als Verstärker für diese Chemolumineszenzreaktion wirkt. Die Chemolumineszenzreaktion tritt nur schwach auf in Gegenwart eines sauren Peroxidaseisoenzyms. Ein derartiges saures Isoenzym kann jedoch als erzeugendes Enzym verwendet werden und somit als eine Markierung für einen entsprechenden Liganden, und da es die Reaktion des Pro-Verstärkers N-Methyl-p-anisidin zu einem Verstärker katalysiert, kann es durch ein erfindungsgemäßes Assay nachgewiesen werden.
Das erzeugende Enzym sollte in einer begrenzenden Konzentration, bezogen auf diejenige des Pro-Verstärkers oder Pro-Anti-Verstärkers, verwendet werden, so daß die Verstärkung der Lichtemission (oder Verringerung der Verstärkung) abhängt von der Bildung der Verstärkermoleküle durch enzymatische Katalyse. Offensichtlich würde, wenn das Enzym im Überschuß vorhanden wäre, die erforderliche Abhängigkeit nicht auftreten. Die Emission von Licht (oder ihre Verringerung) ist nicht notwendigerweise direkt proportional der Konzentration an Enzym bei allen Konzentrationen. Es kann erforderlich sein, Standardkurven für ein spezielles Enzym aufzustellen.
Die Verstärkung der HRP-katalysierten Luminol/Peroxid- Reaktion durch Phenole, Naphthole, Amine und Benzothiazole besitzt eine charakteristische Konzentrationsabhängigkeit. Eine geringe Menge an Verstärker führt zu einer großen Verstärkung der Lichtemission, aber bei höheren Konzentrationen an Verstärker nimmt die Verstärkungswirkung ab. Typische Beispiele für diese Konzentrationsabhängigkeit sind wie folgt angegeben worden: p-Iodphenol, G.H.G. Thorpe et al., Clinical Chemistry, 31, 1335-1341, (1985) und 6-Hydroxybenzothiazol, G.H.G. Thorpe et al., Analytical Biochemistry, 145, 96-100, (1985).
Das Enzym kann mit dem Pro-Verstärker oder dem Pro- Anti-Verstärker vorinkubiert werden, aber es ist bevorzugt, das Enzym zu den Reaktionspartnern für die Chemolumineszenzreaktion und dem Pro-Verstärker (oder Verstärker plus Pro- Anti-Verstärker) zuzugeben, so daß ein einstufiges Verfahren angewandt wird.
Die Lichtemission wird vorzugsweise nach einem Zeitraum von 10 bis 30 min abgelesen unter Anwendung eines Photomultiplierrohrs. Die Reaktion erzeugt jedoch ein Glühen, das photographiert werden kann, soweit erwünscht.
Die Phenol-verstärkte Chemolumineszenzreaktion, wie sie in der US-PS 4 598 044 und der GB-Anmeldung 2 205 945A beschrieben ist, wurde ursprünglich optimiert zum Nachweis von Peroxidase. Die auf dem Pro-Verstärker beruhenden Assays nach der Erfindung erfordern den Nachweis des Verstärkers und so wurde anfangs die Reaktion reoptimiert zum Nachweis des Verstärkers p-Iodphenol. Ein Matrixoptimierungsexperiment (Natriumluminol 1,25 mmol/l - 12,5 µmol/l, Peroxid 2,7 mmol/l - 27 µmol/l, Peroxidase 10 ng - 1 pg, pH 8,6) zeigte, daß ein Assaygemisch, enthaltend 42 µmol/l Luminol, 2 mmol/l Peroxid und 1 ng Peroxidase in 0,01 mol/l Tris-Puffer, pH 8,6, den besten Kompromiß zwischen Empfindlichkeit und dem dynamischen Bereich des Luminometers ergab. Unter diesen Bedingungen war das Assay für p-Iodphenol linear im Bereich von 4t Picomol - 4,5 Femtomol. Die Nachweisgrenze aufgrund eines Signals, das zweimal so hoch war wie bei der Blindprobe, betrug 1,2 Femtomol.
Bei einem "Einglasassay", bei dem die Probe der Pro- Verstärker und die verstärkten Chemolumineszenzreagentien gleichzeitig inkubiert wurden, wurde die Konzentration des PIPP-Substrats bei verschiedenen Konzentrationen (15,5 mmol/l - 33 mol/l) untersucht und ein Wert von 3,3 mmol/l (Endkonzentration
0,33 mmol/l) wurde als optimal angesehen aufgrund des Verhältnisses Signal zu Hintergrund (Geräusch). Die Antwort des Assays nahm die Form einer Kurve an, wie in Fig. 1 gezeigt. Die Nachweisgrenze, bezogen auf ein Signal, das zweimal so groß war wie bei der Blindprobe, betrug 100 Attomol.
Die Erfindung ist besonders anwendbar auf Sandwich- und Konkurrenz-ELISAs und zur Messung irgendeiner chemischen oder biologischen Substanz, die an einer spezifischen Bindungwechselwirkung teilnimmt, und die mit Hilfe einer Enzymmarkierung bestimmt werden kann.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung. Die Phosphate liegen überall in Form ihrer Dinatriumsalze vor und Luminol in Form des Natriumsalzes. Die Lichtemissionen sind überall willkürliche Einheiten.

Beispiel 1

Synthese von p-Iodphenylphosphat (PIPP)

Unter Argon wurde p-Iodphenol (Aldrich, 12,0 mmol) in trockenem THF (25 ml), enthaltend Triethylamin (12,9 mmol), gelöst. Nach dem Kühlen in einem Eisbad wurde 2-Chlor-2-oxo- 1,3,2-dioxaphospholan (Fluka, Chemical Co. Hauppage, NY, USA, 13,0 mmol) mit Hilfe einer Spritze zugegeben. Die Suspension wurde auf Raumtemperatur erwärmt und 4 h gerührt. Das Lösungsmittel wurde in einem Rotationsverdampfer entfernt und die Paste mit wasserfreiem Diethylether (90 ml) behandelt. Beim Filtrieren unter Argon und Einengen des Filtrats erhielt man ein Öl, das sich anschließend verfestigte. Das rohe Phospholan wurde mit NaCN (14,0 mmol) in trockenem DMF (12 ml) durch Rühren der Komponenten bei Raumtemperatur während 24 h zur Ringöffnung gebracht. Nach Entfernung des Lösungsmittels im Vakuum und Verreiben des Rückstands mit wasserfreiem Ether, wurde der gummiartige 2-Cyanoethylphosphatdiester β-eliminiert zu dem Monoester durch Rühren mit 7M NH&sub4;OH (21 ml) während 24 h bei 45ºC. Die Lösung wurde zu einem feuchten Rückstand eingeengt, erneut in absolutem Ethanol gelöst und mit 25 %-igem Natriummethoxid in Methanol (Aldrich, 12,0 mmol) behandelt. Die azeotrope Entfernung von Wasser wurde erreicht durch mehrmalige Eindampfzyklen mit wasserfreiem Ethanol. Die Titelverbindung, als Dinatriumsalz, wurde dann mit Aceton ausgefällt und durch Filtration als weißer Feststoff (Hydrat) in guter Ausbeute isoliert.
¹H NMR (400 MHz, D&sub2;O, TMS als externer Bezug): δ 4,65 (2, HOD): δ 6,83 (d, 2H): δ 7,50 (d, 2H). IR (cm&supmin;¹) 1240 (P=O) 1120 und 1000 (P-O-C aromatisch), 1000 und 820 (p-substituierter Benzolring).

Beispiel 2

Assay für alkalische Phosphatase auf der Grundlage der Freisetzung des Verstärkers p-Iodphenyl (PIP) aus seinem Phosphat (PIPP) (Pro-Verstärker)

Eine 10 µl Probe, enthaltend alkalische Phosphatase (Rind, 1260 Einheiten/mg Protein, Sigma), wurde in ein Probenröhrchen gegeben, enthaltend 10 µl PIPP (0,1 mg/ml in 0,1 mol/l, pH 8,6 Tris-Puffer) und 100 µl Luminol/HRP/Peroxid-Reagens. Das Luminol/HRP/Peroxid-Reagens wurde wie folgt hergestellt: Natriumluminol (12,5 mg) wurde in 50 ml Tris- Puffer (0,1 mol/l, pH 8,6) gelöst. Ein 3 ml Anteil wurde mit 2 µl Wasserstoffperoxid (30 vol-%) vermischt und dieses Gemisch 1:30 in dem Tris-Puffer verdünnt. 100 µl HRP (Verdünnung 1:50000 einer 1 mg/ml Ausgangslösung in Tris-Puffer) und 1 ml der 1:30 Verdünnung von Luminolperoxid wurden unter Bildung eines Luminol/HRP/Peroxid-Assayreagens vermischt. Das Assaygemisch wurde bei Raumtemperatur 1 h inkubiert und die Lichtintensität in Intervallen gemessen unter Anwendung eines Luminometers (LB 9500, Berthold Laboratories, Nashua, NH). Eine "Blindprobe", d.h. Luminol, Peroxid, Peroxidase und PIPP, wurde ebenfalls gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 unten angegeben. Tabelle 1 Inkubationszeit (Minuten) Lichtemission Blindprobe Mit alkalischer Phosphatase
Unter Anwendung des obigen Verfahrens und verschiedener Verdünnungen der alkalischen Phosphatase wurde eine Standardkurve (Fig. 1) für das Assay von alkalischer Phosphatase erhalten, bei der die Lichtemission auf der Ordinate in willkürlichen Einheiten (Zählungen/10 s) aufgetragen ist gegen die Konzentration an alkalischer Phosphatase in Attomol.
Attomolmengen des Enzyms wurden nachgewiesen.
Das PIPP-Substrat war unter den Assaybedingungen stabil. Die Blindprobe, bei der PIPP vorhanden war, aber die alkalische Phosphatase weggelassen worden war, zeigte, daß die nichtenzymatische Hydrolyse minimal war.

Beispiel 3

Assay für alkalische Phosphatase auf der Grundlage der Freisetzung des Anti-Verstärkers p-Nitrophenol (PNP) aus seinem Phosphat (PNPP) (Pro-Anti-Verstärker)

In Vorversuchen wurde gezeigt, daß PNP in einer Konzentration von 280 Nanomol/l in dem Chemolumineszenzreaktionsgemisch über 90 % der Emission hemmte. Bei 1,4 µmol/l wurde eine 98 %-ige Hemmung erreicht.
10 µl Proben verschiedener Verdünnungen einer Ausgangsalkaliphosphatase (1 mg/ml in Tris-MgCl&sub2;-Puffer) wurden zu 100 µl des Luminol/HRP/Peroxid/PIP-Assayreagens, enthaltend PNPP (0,12 mg/ml), zugegeben, um eine PNPP-Konzentration von etwa 3,2 mmol/l zu erreichen und die Lichtemission wurde nach 2 min gemessen. Die Reaktionskinetika sind unten in Tabelle 2 angegeben. Es ist ersichtlich, daß die Verringerung der Lichtemission schnell eintrat und von der Konzentration an alkalischer Phosphatase abhing. Fig. 2 zeigt eine Standardkurve für das Assay von alkalischer Phosphatase, bei der die prozentuale Hemmung auf der Ordinate aufgetragen ist gegen die Konzentration an alkalischer Phosphatase in µg/ml auf der Abszisse.
Die prozentuale Hemmung wird bestimmt als (A - B) x 100/A, wobei
A = das Signal aus der verstärkten Reaktion ist, d.h. wie B, aber in Abwesenheit von alkalischer Phosphatase und
B = das Signal von der gehemmten Reaktion ist. Tabelle 2 Inkubationszeit (Minuten) Lichtemission Konzentration an Null (Vergleich) alkalischer 1 µg/ml Phosphatase 1 mg/ml

Beispiel 4

Assay für alkalische Phosphatase/Biotin-Konjugat

10 µl Proben von verschiedenen Verdünnungen eines alkalische Phosphatase/Biotin-Konjugats (750 Einheiten/ml, 6,2 mol Biotin/mol Protein, Sigma) wurden untersucht unter Verwendung von PIPP, wie in Beispiel 2 beschrieben. Die Ergebnisse sind unten in Tabelle 3 angegeben. Tabelle 3 Konzentration an alkalischer (Attomol) Lichtemission Beispiel 4 (Biotin-Konjugat) Beispiel 5 (PEG-Konjugat) Beispiel 6 (Anti-IgG-Konjugat) Beispiel 7 (Immobilisiert auf Agarose) weggelassen

Beispiel 5

Assay für alkalische Phosphatase/Polyethylenglykol-Konjugat 10 µl Proben verschiedener Verdünnungen eines alkalische Phosphatase/Polyethylenglykol-Konjugats (98 Einheiten/ml, Sigma) wurden bestimmt unter Verwendung von PIPP, wie in Beispiel 2 beschrieben. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 oben angegeben.

Beispiel 6

Assay für alkalische Phosphatase/Antikörper-Konjugat

10 µl Proben von Verdünnungen eines alkalische Phosphatase/Ziegenantihuman-IgG-Antikörper-Konjugats (0,53 mg/ml, Sigma) wurden untersucht unter Verwendung von PIPP, wie in Beispiel 2 beschrieben. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 oben angegeben.

Beispiel 7

Assay für alkalische Phosphatase, immobilisiert auf Agarose

10 µl Proben verschiedener Verdünnungen einer Suspension einer alkalischen Phosphatase/Agarose-Zubereitung (4900 Einheiten/ml, Sigma) wurden untersucht unter Verwendung von PIPP, wie in Beispiel 2 beschrieben. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 oben, angegeben.

Beispiel 8

Assay für alkalische Phosphatase unter Verwendung von Perborat als Oxidans bei der Chemolumineszenzreaktion

10 µl Proben verschiedener Verdünnungen von alkalischer Phosphatase wurden untersucht unter Verwendung von PIPP, wie in Beispiel 2 beschrieben, mit der Ausnahme, daß das Peroxid ersetzt wurde durch Natriumperborat (2 mol/l, Aldrich).
Tabelle 4 zeigt die Ergebnisse. Tabelle 4 Konzentration an alkalischer Phosphatase (Attomol) Lichtemission Beispiel 8 (Perborat) Beispiel 9 (Isoluminol)

Beispiel 9

Assay für alkalische Phosphatase unter Verwendung von Isoluminol als Oxidans bei der Chemolumineszenzreaktion

10 µl Proben verschiedener Verdünnungen von alkalischer Phosphatase wurden untersucht unter Verwendung von PIPP, wie in Beispiel 2 beschrieben, mit der Ausnahme, daß das DPD ersetzt wurde durch Isoluminol (Sigma). Das Assaygemisch wurde hergestellt durch Vermischen von 3 ml Isoluminol (240 mg/l in dem Tris-Puffer), 2 µl Wasserstoffperoxid (30 vol-%) und 30 µl der 1:50000 Verdünnung von Peroxidase. Diese Isoluminol-Lösung wurde nicht weiter verdünnt, da die erhaltenen Lichtmengen schon gering waren. (Das steht in Übereinstimmung mit dem bekannten Unterschied in der Lichtemission zwischen Isoluminol, verglichen mit Luminol).
Tabelle 4 oben zeigt die Ergebnisse.

Beispiel 10

Chemolumineszenzenzymimmunoassay für α-Fetoprotein

Das Hybritech-Tandem-Enzym-Immunoassay (EIA) für α-Fetoprotein (AFP) (Hybritech, San Diego, CA) wurde angewandt, um die AFP-Konzentration in einer Reihe von Standards- und Serumproben zu messen. Das Assay beruhte auf einem Anti-AFP- Antikörper, immobilisiert auf Polystyrolperlen und einem alkalische Phosphatase/Anti-AFP-Konjugat. Das EIA wurde durchgeführt, entsprechend den Anweisungen des Herstellers. Alle Assays wurden doppelt durchgeführt und das gebundene Konjugat durch Chemolumineszenz gemessen. Für das Chemolumineszenzassay wurden die Perlen bei Raumtemperatur in einem Prüfglas, enthaltend 20 µl PIPP und 200 µl Luminol/HRP/Peroxid (siehe Beispiel 2), 30 min bewegt und dann die Lichtintensität gemessen.
Tabelle 5 zeigt die Ergebnisse. Das Verhältnis Signal zu Hintergrund wurde berechnet als Verhältnis der Lichtemission in dem Assay und bei der gleichen Chemolumineszenzreaktion mit der Ausnahme, daß kein alkalisches Phosphatase-Konjugat vorhanden war. Tabelle 5 Konzentration an AFP (ng/ml) Verhältnis Signal zu Hintergrund

Beispiel 11

Assay für alkalische Phosphatase auf der Grundlage der Freisetzung des Verstärkers 2-Naphthol aus 2-Naphthylphosphat

10 µl Proben, enthaltend unterschiedliche Verdünnungen an alkalischer Phosphatase (Sigma), wurden in ein Assayröhrchen, enthaltend 10 µl 2-Naphthylphosphat (Aldrich, 0,1 mg/ml in 0,1 mol/l, pH 8,6 Tris-Puffer) und 100 µl Luminol/HRP/Peroxid-Reagens, gegeben. Das Assayröhrchen wurde bei Raumtemperatur 30 min inkubiert und die Lichtintensität unter Anwendung eines Luminometers gemessen (LB 9500, Berthold Laboratories, Nashua, New Hampshire, USA).
Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 angegeben. Es konnten attomolare Mengen des Enzyms nachgewiesen werden.
Bei hohen Konzentrationen an alkalischer Phosphatase wurde die Lichtemission verringert, und das steht in Übereinstimmung mit der bekannten Wirkung hoher Konzentrationen an Verstärker auf die Chemolumineszenzreaktion. Tabelle 6 Konzentration an alkalischer Phosphatase (Attomol) Lichtemission

Beispiel 12

Assay für β-D-Galactosidase auf der Grundlage der Freisetzung des Verstärkers 6-Brom-2-naphtol aus 6-Brom-2-naphthyl- β-D-galactopyranosid

10 µl Proben, enthaltend unterschiedliche Verdünnungen an β-D-Galactosidase (Sigma, 22 mg/ml, 900 U/mg Protein), wurden in ein Assayröhrchen, enthaltend 10 µl 6-Brom-2- naphthyl-β-D-galactopyranosid (Aldrich, gesättigte Lösung ca. 0,1 mg/ml in 0,1 mol/l, pH 8,6 Tris-Puffer) und 100 µl Luminol/HRP/Peroxid-Reagens, gegeben. Das Assayröhrchen wurde inkubiert und die Lichtintensität wie in Beispiel 11 gemessen, wobei die Ergebnisse in Tabelle 7 angegeben sind. Es konnten attomolare Mengen des Enzyms nachgewiesen werden.
Bei hohen Konzentrationen wurde die Lichtemission durch das Enzym verringert, und das steht in Übereinstimmung mit der bekannten Wirkung hoher Konzentrationen an Verstärker auf die Lumineszenzreaktion. Tabelle 7 Konzentration an β-Galactosidase (Attomol) Lichtemission

Beispiel 13

Assay für β-D-Glucosidase auf der Grundlage der Freisetzung des Verstärkers 6-Brom-2-naphtol aus 6-Brom-2-naphthylglucopyranosid

10 µl Proben, enthaltend unterschiedliche Verdünnungen an β-D-Glucosidase (Sigma, 4,8 Einheiten/mg), wurden in ein Assayröhrchen, enthaltend 10 µl 6-Brom-2-naphthylglucopyranosid (Aldrich, 10 ng/ml in 0,1 mol/l, pH 8,6 Tris- Puffer) und 100 µl Luminol/HRP/Peroxid-Reagens, gegeben. Das Assayröhrchen wurde inkubiert und die Lichtintensität wie in Beispiel 11 gemessen, wobei die Ergebnisse in Tabelle 8 angegeben sind. Tabelle 8 Konzentration an β-Glucosidase (Picomol) Lichtemission

Beispiel 14

Assay für Arylsulfatasen auf der Grundlage der Freisetzung des Verstärkers 2-Naphtol aus 2-Naphthylsulfat

100 µl Proben, enthaltend unterschiedliche Verdünnungen an Arylsulfatase (Sigma, 12 Einheiten/mg), wurden in ein Assayröhrchen, enthaltend 100 µl 2-Naphthylsulfat (Aldrich, 0,1 mg/ml in 10 mmol/l, pH 5 Acetat-Puffer), gegeben. Nach 30 min langer Inkubation wurden 10 µl des Gemisches entnommen und zu 100 µl Luminol/HRP/Peroxid-Reagens gegeben. Das Assayröhrchen wurde bei Raumtemperatur 30 min inkubiert und die Lichtintensität wie in Beispiel 11 gemessen, wobei die Ergebnisse in Tabelle 9 angegeben sind. Tabelle 9 Konzentration an Arylsulfatase (ng/ml) Lichtemission

Beispiel 15

Assay für Meerrettichperoxidase (saures Isoenzym) auf der Grundlage der Bildung eines Verstärkers aus N-Methyl- p-anisidin

Die sauren Isoenzyme von Peroxidase (Typ VII und VIII), in Gegenwart von Peroxid oder molekularem Sauerstoff, katalysierten eine Reaktion des Pro-Verstärkers N-Methyl-p-anisidin zur Bildung von Produkten, die die Luminol/HRP(basisches Isoenzym)/Peroxid-Reaktion verstärkten. Eine 50 µl Probe, enthaltend Meerrettichperoxidaseisoenzym-Typ VII (117 Einheiten/mg Protein RZ = 3,7, Sigma) oder Meerrettichperoxidaseisoenzym-Typ VIII (100 Einheiten/mg Protein RZ = 3,4, Sigma) in 0,1 mol/l Phosphat-Puffer, pH 5,5, wurde 10 min bei Raumtemperatur mit 50 µl N-Methyl-p-anisidin (0,01 mg/ml) in dem gleichen Phosphat-Puffer inkubiert. Eine 10 µl Probe wurde dann entnommen und zu 100 µl des Natriumluminol/HRP/Peroxid-Reagens zugegeben. Das Gemisch wurde 5-30 min bei Raumtemperatur inkubiert und die Lichtintensität gemessen. Das Assay wurde auch durchgeführt unter Verwendung von Phosphat-Puffer, enthaltend Wasserstoffperoxid (50 mmol/l). Die Beziehung Dosis/Antwort, die erhalten wurde, ist für das saure HRP-Isoenzym, TYP VII, in Tabelle 10 unten angegeben. Tabelle 10 Lichtemission Signal/Blindprobe außerhalb des Skalenbereichs
Die Nachweisgrenze für das saure Isoenzym, Typ VII, betrug 5 pg = 5 x 10&supmin;¹² g = etwa 125 Attomol (Signal = Doppel der Blindprobe; angenommenes Molekulargewicht der Peroxidase = 40000).
Silicagelchromatographie (Analtech Inc. Newark, NJ) wurde angewandt, um die Reaktion von Lösungen von N-Methyl- p-anisidin und p-Anisidin mit saurer Meerrettichperoxidase, Typ VII, zu untersuchen. Die Platten wurden in Hexan zu Ethylacetat (88:12 Vol/Vol) entwickelt und unter UV-Licht untersucht. Die Dünnschichtchromatographie von Lösungen von N-Methyl-p-anisidin, die mit saurem Isoenzym Typ VII behandelt worden waren zeigte, daß der Pro-Verstärker in das gleiche Produkt umgewandelt worden war, das erhalten worden war, wenn p-Anisidin (das anfängliche N-Demethylierungsprodukt) ähnlich umgesetzt wurde. Nach einem weiteren TLC-Versuch hingen die erhaltenen Produkte mit der Verdünnung des Isoenzyms zusammen. So wurde eine Lösung von N-Methyl-p- anisidin (1,0 mg/ml) in Phosphat-Puffer (0,1 mol/l, pH 5,5) mit Verdünnungen von Peroxidase Typ VII inkubiert und dann das Reaktionsgemisch (25/µl) auf einer Phasenumkehr-TLC- Platte (Si-C&sub1;&sub8;, Baker Chemical Co., Phillipsburg, NJ) chromatographiert. Die Entwicklung wurde wie oben durchgeführt und die auf getrennten Komponenten sichtbar gemacht, indem sie 30 min Joddampf ausgesetzt wurden. Die Ergebnisse sind in Tabelle 11 unten angegeben. Das Symbol "+" bezeichnet das Auftreten eines Spots. Bei einigen Versuchen waren schwache Spots vorhanden, die anderen Produkten zugeschrieben wurden. Tabelle 11 Typ VII Verdünnung Spots, die Produkten des Pro-Verstärkers zugeschrieben wurden (Rf 0,52) Verstärker (Rf 0,24)
Es ist erwünscht, das N-Methyl-p-Anisidin zu reinigen und dies kann wie folgt durchgeführt werden.
N-Methyl-p-anisidin (500 mg) wurden in DMSO (250 µl) gelöst und dann mit Ethanol (5 ml) verdünnt. Diese Lösung wurde mit "Norit"-Aktivkohle (American Norit Co. Inc., Jacksonville, Florida) vermischt und 10 min unter Rückfluß erhitzt. Eiskaltes destilliertes Wasser (3 ml) wurde zu dem Filtrat zugegeben und das Gemisch über Nacht bei 4ºC stehengelassen. Der Niederschlag von N-Methyl-p-anisidin wurde abfiltriert.

Claims

1. Assay-Verfahren, bei dem eine verstärkte Peroxidase-katalysierte Chemolumineszenzreaktion stattfindet und bei dem eine Substanz, die es ermöglicht, daß diese Reaktion stattfindet, durch Lumineszenz nachgewiesen oder gemessen wird, dadurch gekennzeichnet, daß der Verstärker gebildet wird durch die Enzymkatalysierte Reaktion eines Pro-Verstärkers oder ein Verstärker bereits vorhanden ist und ein Anti-Verstärker, der mindestens teilweise die Verstärkung hemmt, gebildet wird durch Enzym-katalysierte Reaktion eines Pro-Anti-Verstärkers und daß das Enzym (in freier oder gebundener Form), das die Bildung entweder des Verstärkers oder des Anti-Verstärkers katalysiert, oder eine Substanz, die von dem Enzym abhängt, bestimmt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Chemolumineszenzreaktion zwischen einer Peroxidase, einem Oxidans und einem Dihydrophthalazindion (DPD) in Gegenwart eines Verstärkers stattfindet.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß ein Reaktionsgemisch aus der Peroxidase, dem Antioxidans, dem DPD und entweder dem Pro-Verstärker oder sowohl dem Verstärker als auch dem Pro-Anti-Verstärker gebildet wird und das die Bildung des Verstärkers oder Anti-Verstärkers katalysierende Enzym zu dem

Gemisch ohne vorherige Inkubation mit dem Pro-Verstärker zugegeben wird.

4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Pro-Verstärker spaltbar ist unter Bildung des Verstärkers.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Pro-Verstärker spaltbar ist unter Bildung eines p-Iodphenol-, p-Hydroxycinnaminsäure- oder p-Imidazol-1-ylphenol-Verstärkers.

6. Verfahren nach Anspruch 2, 3, 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, daß ein Phosphat-Pro-Verstärker durch alkalische Phosphatase gespalten wird, die untersucht wird.

7. Verfahren nach Anspruch 2, 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Peroxidase Meerrettichperoxidase, das Oxidans Wasserstoffperoxid und das DPD Luminol ist.

8. Kit zur Durchführung eines Assays, bei dem eine Chemolumineszenzreaktion zwischen einer Peroxidase, einem Oxidans und einem Dihydrophthalazindion (DPD) in Gegenwart eines Verstärkers stattfindet, wobei das Kit das DPD enthält, dadurch gekennzeichnet, daß das Kit ferner enthält entweder (a) einen Pro-Verstärker, aus dem ein Verstärker gebildet werden kann durch eine Enzym-katalysierte Reaktion, oder (b) (i) einen Verstärker und (ii) einen Pro-Anti-Verstärker, aus dem ein Anti- Verstärker, der zumindest teilweise die Verstärkung hemmt, durch eine Enzym-katalysierte Reaktion gebildet werden kann.

9. Kit nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß es ferner mindestens eine Komponente enthält, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus (1) einem Konjugat eines Liganden, der gebunden ist an ein die Bildung des Verstärkers oder Anti-Verstärkers katalysierendes Enzym, wobei das Konjugat zum Testen des Kits enthalten ist, (2) der Peroxidase, (3) dem Oxidans.

10. Kit nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, daß der Pro-Verstärker unter Bildung des Verstärkers gespalten werden kann.

11. Kit nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß der Pro-Verstärker gespalten werden kann zur Bildung eines p-Iodphenol-, p-Hydroxycinnaminsäure- oder p-Imidazol-1-ylphenol- Verstärkers.