DE3403250C2

DE3403250C2 - Neue hochempfindliche enzymatische Testmethode

Info

Publication number: DE3403250C2
Application number: DE3403250A
Authority: DE
Inventors: Hideo Misaki
Original assignee: Asahi Chemical Industry Co Ltd; Asahi Kasei Kogyo KK
Current assignee: Asahi Kasei Corp
Priority date: 1983-01-28
Filing date: 1984-01-27
Publication date: 1994-03-03
Anticipated expiration: 2004-01-28
Also published as: FR2540137A1; US4693971A; JPH0220239B2; FR2540137B1; DE3403250A1; JPS59140900A

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur quantita tiven Bestimmung einer der folgenden Substanzen: L-Glycero-3-phosphat (G3P), Dihydroxyaceton-3-phosphat (DHAP), Nicotin-adenin-dinucleotid (NAD) oder reduziertem Nicotin adenin-dinucleotid (red NAD) durch enzymatische Reaktion, und betrifft insbesondere eine solche hochempfindliche Prüfmethode für diese in einer Untersuchungsprobe enthal tenen Substanzen.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß man die zu bestimmende Substanz in der Untersuchungs probe zur Reaktion bringt mit der entsprechenden Komponen te des nachstehenden Reaktionscyclus (I)

worin GPO Glycerophosphat-oxidase und GPDH Glycerophosphat dehydrogenase bedeuten und G3P, DHAP, NAD und red NAD die oben angegebene Bedeutung haben, daß man den Reaktions cyclus (I) dann ablaufen läßt und bestimmbare Veränderungen dabei meßtechnisch quantitativ ermittelt.

Es sind bisher schon enzymatische cyclisch ablaufende Be stimmungsmethoden, beispielsweise NAD-Cyclus, NADP-Cyclus oder CoA-Cyclus bekannt geworden. Bei einem bekannten Ver fahren dieser Art läßt man Alkohol-Dehydrogenase in Anwe senheit von NAD auf Ethanol als Substrat einwirken, wobei sich reduziertes NAD bildet, das durch Einwirkung von Äpfelsäure-Dehydrogenase auf ein Substrat Oxalacetat zu NAD oxidiert wird, womit der Cyclus NAD-red NAD vervoll ständigt ist (Japan. Biochem. Soc. ED. "Experimental Method in Biochemistry", Vol. 5, "Research Methods in Enzymology" S. 121-135, Tokyo Kagaku Dojin, Publ., Aug. 1975, Mori, A. Ed. "Manual for Assay Methods in Neuro-transmitter", S. 165-172, Ishiyaku Publ., Nov. 1979).

Eine weitere bekannte Methode verläuft wie folgt: Anstelle von Äpfelsäure-Dehydrogenase in der zuvor ange gebenen Reaktion wird red NAD-Oxidase verwendet, und da durch entsteht ein Reaktionscyclus, bei dem Sauerstoff und red NAD verbraucht und H₂O und NAD gebildet werden (Institute for Phys. and Chem. Sci. Ed.: "Present and Future of Life-Science", S. 30-32, K. K. Creative Life Sci. Res. Ass., Mar., 1981).

Zwecks Reduktion von NAD zu red NAD wird Hydroxysteroid mit Hydroxysteroid-Dehydrogenase behandelt, und das red NAD wird unter Bildung von Formazan durch Wirkung einer Trans ferase, wie beispielsweise Diaphorase, in Anwesenheit von Tetrazoliumsalz zu NAD umgewandelt, womit der Reaktions cyclus geschlossen ist (Japan. Pat. Ungeprüfte Publ. No. 56-144096). In einem weiteren bekannten Reaktions cyclus werden Glutathion und Dehydroascorbat mit Glutathion dehydroascorbat-oxido-reductase behandelt, wobei Dehydro ascorbat zu Ascorbat umgewandelt wird, und dieses wird durch Einwirkung von Ascorbat-oxidase unter Verbrauch von Sauerstoff und Bildung von H₂O und Dehydroascorbat umge setzt (Japan. Pat. Ungeprüfte Publ. No. 56-151498). Es ist auch schon in NAD-Cyclus bekannt, bei dem durch Ver wendung von red NAD-oxidase Sauerstoff verbraucht und Wasserstoffperoxid gebildet werden. (Japan. Pat. Ungeprüfte Publ. No. 56-78599).

Es wurde nun gefunden, daß sich ein Reaktionscyclus G3P- DHAP durchführen läßt, wenn dafür GPO, bei deren Einwir kung auf ein Substrat G3P Sauerstoff verbraucht und H₂O₂ sowie DHAP gebildet werden, und weiterhin GPDH, bei de ren Einwirkung auf ein Substrat DHAP red NAD verbraucht und NAD sowie G3P gebildet werden, verwendet werden. Diese Reagentien lassen sich mit geringem Aufwand be schaffen und stehen zu niedrigem Preis in guter Qualität zur Verfügung, und ein weiterer Vorteil dieses Reaktions cyclus besteht darin, daß er sich trotz vorhandenem oxida tiv aktivem H₂O₂ und reduktiv aktivem red NAD effektiv, mit gutem Umsatz, durchführen läßt.

Wie darüber hinaus gefunden wurde, reagiert bei diesem Reaktionscyclus jede der Cyclus-Komponenten G3P, DHAP, NAD, red NAD, wenn sie in einer Untersuchungsprobe ent halten ist, mit entsprechender übriger Cyclus-Komponente, so daß man, wenn man den Reaktionscyclus zum Ablauf bringt und dabei so arbeitet, daß beispielsweise mehr als 10 Cyclen je Minute ablaufen, und dann eine der bei dieser Reaktion eintretenden Veränderungen, die bestimmbar ist, meßtechnisch quantitativ erfaßt, die in der Untersuchungsprobe enthalte ne Komponente leicht und sensitiv mit hoher Genauigkeit be stimmen kann.

Man erhält so durch das erfindungsgemäße Verfahren eine Mög lichkeit, irgend eine der Substanzen G3P, DHAP, NAD oder red NAD, enthalten in einer Untersuchungsprobe, mittels einer neuen enzymatischen hochempfindlichen Methode zu be stimmen dadurch, daß man erfindungsgemäß die in der Probe enthaltene Substanz mit einer Komponente, mit der sich der Reaktionscyclus (I) dann konstituiert, zur Reaktion bringt und so die Cyclus-Reaktion (I) zum Ablaufen bringt, die, wie aus nachstehender Formel-Darstellung ersichtlich, die Bestandteile G3P, DHAP, GPO, GPDH, NAD, red NAD, O₂ und H₂O₂ aufweist.

Man kann dann meßtechnisch die Größe von dabei erfolgenden Veränderungen, die erkennbar sind, bestimmen.

Beispielsweise sind für das erfindungsgemäße Verfahren Untersuchungsproben brauchbar, die irgend eine der Substan zen G3P, DHAP, NAD oder red NAD enthalten, oder auch aus denen eine solche Substanz freigesetzt oder gebildet wer den kann. Insbesondere für letztgenannte Untersuchungspro ben lassen sich zahlreiche enzymatische Reaktionen, bei denen die enzymatische Aktivität oder die Menge an Substrat bestimmbar sind, angeben. Beispiele dafür sind nachstehend veranschaulicht.

Folgende Beispiele zeigen enzymatische Reaktionssysteme, aus denen je G3P freigesetzt oder gebildet werden kann:

(1) Reaktionssystem für Bestimmung von Phosphatidyl glycerin in amniotischer Flüssigkeit bei der Prüfung der Respirationsfunktion des Fetus beim Geburtsvorgang:
Eine Phosphatidyl-glycerin (PG) enthaltende Probe, bei spielsweise amniotische Flüssigkeit wird mit Phospholipase C (EC 3.1.4.3) behandelt; dabei werden Diglycerid und G3P frei, und das G3P kann bestimmt werden:
(2) Bestimmungssystem für G3P, das frei wird aus einem enzymatischen Reaktionssystem, das ATP, Glycerin und Glycero kinase (GK) (EC 2.7.1.30) enthält. Dabei lassen sich ATP oder Glycerin bestimmen, oder es läßt sich die Glycero kinase-Aktivität ermittelt:
(3) Wenn in dem unter (2) angegebenen Reaktionssystem Glycerin aus einer enzymatischen Reaktion von PG und Phospholipase D (EC 3.1.4.4) verwendet wird, lassen sich PG oder die Phospholipase-Aktivität bestimmen:
(4) Wenn in einem wie unter (2) angegebenen Reaktionssystem Glycerin verwendet wird, das aus einer enzymatischen Reaktion von mono-, di- oder tri-Glycerid und Lipase (EC 3.1.1.3) stammt, läßt sich das Glycerid, beispielsweise als Trigly cerid, in Serum oder Lipase, wie zum Beispiel Pankreas-Lipase im Serum bestimmen:
(5) Wenn das in dem unter (2) zuvor angegebenen Reaktions system benötigte ATP aus einer enzymatischen Reaktion von Kreatinphosphat, ADP und Kreatinkinase (CK) (EC 2.7.3.2) stammt, läßt sich Kreatinphosphat bestimmen oder die Akti vität der Kreatinkinase (CK) ermitteln:
(6) Wenn in dem unter (2) zuvor angegebenen Reaktions system das ATP aus einer enzymatischen Reaktion von Phosphoenolpyruvat, ADP und Pyruvat-Kinase (PK) (EC 2.7.1.40) stammt, läßt sich das Phosphoenolpyruvat bestimmen oder die Aktivität der Pyruvat-Kinase ermitteln:
(7) Das zuvor unter (2) angegebene Reaktionssystem läßt sich als Reaktionssystem für ATP-Bestimmung einsetzen, wenn ATP aus einem enzymatischen Reaktionssystem mit Acetylphosphat, ADP und Acetat-Kinase (EC 2.7.2.1) stammt:
(8) Das oben unter (2) angegebene Reaktionssystem läßt sich als Reaktionssystem für ATP-Bestimmung benutzen, wenn ATP aus einem enzymatischen Reaktionssystem mit 4-Phospho-L-aspartat, ADP und Aspartat-Kinase (Asp K) (EC 2.7.2.4) stammt:
(9) Das oben unter (2) angegebene Reaktionssystem läßt sich als Reaktionssystem für ATP-Bestimmung benutzen, wenn ATP aus einem enzymatischen Reaktionssystem mit Argininphosphat, ADP und Arginin-Kinase (Arg K) (EC 2.7.3.3) stammt:
Enzymatische Reaktionssysteme, aus denen DHAP freigesetzt oder gebildet wird, sind beispielsweise die folgenden:
(10) Reaktionssystem zur Ermittlung von Keto-l-phosphat oder zur Bestimmung der Aldorase-Aktivität durch Messung von DHAP, das frei wird oder gebildet wird durch die enzy matische Reaktion von Ketose-l-phosphat (K-l-P) und Aldorase (EC 4.1.2.7):
(11) Ein Reaktionssystem zur Bestimmung von D-Glycero aldehyd-3-phosphat oder der Untersuchung auf Triosephosphat isomerase durch Bestimmung von DHAP, das freigesetzt oder gebildet wird durch enzymatische Reaktion von D-Glycero aldehyd-3-phosphat und Triphosphatisomerase (TPI) (EC 5.3.1.1) ist das folgende:
Weiterhin sind nachstehend enzymatische Reaktionssysteme veranschaulicht, in denen red NAD freigesetzt oder gebildet wird.
In diesen Reaktionssystemen sollte nach Beendigung der Reak tion verbleibendes nicht umgesetztes NAD zersetzt werden; da zu kann man unter alkalischen Bedingungen, wie beispiels weise bei einem pH-Wert von mehr als 12, bei 10°C 10 Minu ten lang erhitzen.
(12) Die Bestimmung von red NAD, das freigesetzt oder ge bildet wurde durch enzymatische Reaktion von Ethanol und NAD unter Einwirkung von Alkohol-Dehydrogenase (ADH) (EC 1.1.1.1), kann man in einem Reaktionssystem zur Er mittlung von Alkohol oder Prüfung der Alkoholdehydrogenase- Aktivität einsetzen:
(13) In einem Reaktionssystem zur Bestimmung von 3-α- Hydroxysteroid in Gallensäuren oder zur Ermittlung von 3-α-Hydroxysteorid-Dehydrogenase kann man dies vornehmen durch Messung des red NAD, das frei wird oder gebildet wird in dem enzymatischen Reaktionssystem, bei dem auf 3-α-Hydroxysteroid und NAD 3-α-Hydroxysteroid-Dehy-droge nase (HSDH) (EC 1.1.1.50) einwirkt:
(14) Ein Reaktionssystem für die Ermittlung von L-Laktat oder die Bestimmung der Laktat-Dehydrogenase-Aktivität durch Messung von red NAD, das freigesetzt oder gebildet wird bei der enzymatischen Reaktion von L-Laktat, NAD und Laktat- Dehydrogenase (LDH) (EC 1.1.1.27) ist das folgende:
(15) Als Reaktionssystem für die Ermittlung von Glucose und die Prüfung der Glucose-Dehydrogenase-Aktivität durch Bestimmung von red NAD, das frei wird oder gebildet wird bei der enzymatischen Reaktion von Glucose, NAD und Glucose- Dehydrogenase (GDH) (EC 1.1.1.47), dient die folgende Reaktion:
Nachfolgend sind enzymatische Reaktionssysteme beispiels weise veranschaulicht, die NAD freisetzen oder bilden. Bei diesen Reaktionssystemen sollte nicht umgesetztes red NAD nach Beendigung der Reaktion zersetzt werden: dazu kann man bei pH-Werten von unter pH 2 bei 50°C 3 Minuten lang erhitzen und dann neutralisieren, bevor die Bestimmung von NAD vorgenommen wird.
(16) Man kann in folgendem Reaktionssystem die Bestimmung von Prolin oder von D-Prolin-Reduktase vornehmen durch Messung von NAD, das frei oder gebildet wird bei der enzy matischen Reaktion von Prolin, red NAD und D-Prolin- Reduktase (PR) (EC 1.4.1.6):
(17) Im nachstehenden Reaktionssystem kann man L-Cystin bestimmen oder die Cystin-Reduktase-Aktivität ermitteln, wenn man das NAD mißt, das freigesetzt oder gebildet wird bei einer enzymatischen Reaktion von L-Cystin, red NAD und Cystin-Reduktase (CR) (EC 1.6.4.1):

Die zuvor genannten enzymatischen Reaktionssysteme sind nur Beispiele, und die nach dem erfindungsgemäßen Verfah ren zu behandelnden Untersuchungsproben können auch aus Systemen stammen, denen ein oder mehrere weitere Reaktions systeme beigeordnet sind, in denen eine der Substanzen freigesetzt oder gebildet wird, die für die zuvor angege benen Reaktionssysteme benötigt werden.

Zu der Untersuchungsprobe, die eine der angegebenen Substan zen, auf die in diesen enzymatischen Reaktionssystemen ge prüft werden soll, enthält, werden diejenigen Reagentien zugegeben, die für den Ablauf der enzymatischen Reaktion notwendig sind. Ein solches Reaktionsgemisch kann eine Untersuchungsprobe sein, die eine der Substanzen G3P, DHAP, NAD oder red NAD enthält. Diese enzymatischen Reak tionssysteme können gesondert oder gemeinschaftlich mit dem Reaktionscyclus (I) zubereitet und durchgeführt werden.

Die Menge an Untersuchungsprobe kann zweckmäßig in der Größenordnung von 0,05-10 ml liegen, und die Reaktion läuft ab, wenn man die erforderlichen Reagentien, die man in eine schwach saure oder schwach alkalische Puffer lösung eingebracht hat, bei 30°C für eine Zeitspanne von generell mehr als einer Minute miteinander vermischt. Die Menge an zuzugebenden Reagentien ist nicht begrenzt; zweckmäßig ist es jedoch generell, einen Überschuß im Vergleich zu der Menge an zu untersuchender Substanz ein zusetzen.

Der beim erfindungsgemäßen Verfahren durchzuführende Reaktionscyclus ist durch das zuvor illustrierte Schema (I) veranschaulicht.

Bei der Reaktion gemäß dieses Reaktionscyclus (I) wird ein Mol G3P unter Verbrauch von einem Mol O₂, im allgemeinen gelöster Sauerstoff, und unter Freisetzen von einem Mol H₂O₂ durch die Wirkung von GPO zu einem Mol DHAP umgewandelt. (GPO: vergleiche in der US-PS 42 75 161). Dies ist das GPO-Reaktionssystem. Es wird dann weiterhin ein Mol DHAP durch die Wirkung von GPDH (EC 1.1.1.8) in Anwesenheit von einem Mol red NAD unter Bildung von einem Mol NAD zu G3P umgewandelt. Dies ist das GPDH-Reaktionssystem. Alsdann wird das so gebildete G3P mittels des GPO-Reak tionssystems zu DHAP umgewandelt, und in dieser Weise läuft der Reaktionscyclus ab. Dieser Reaktionscyclus läuft ab in Anwesenheit von sechs Komponenten, und zwar G3P, DHAP, GPO, GPDH, red NAD und O₂; es können jedoch G3P und DHAP wechselseitig eines aus dem anderen im Verlauf des Reak tionscyclus sich bilden, und darum kann eine jede dieser Substanzen vorteilhaft benutzt werden.

Weiterhin kann bei dem Reaktionscyclus (I) H₂O₂ mit red NAD zur Bildung von NAD umgesetzt werden; bei dieser Nebenreak tion, die durch Einwirkung von NAD-Peroxidase (EC 1.11.1.1) (J. Biol. Chem., 225: 557, 1957) erfolgt, werden ein Mol H₂O₂ und ein Mol red NAD verbraucht, und zwei Mole H₂O sowie ein Mol NAD werden gebildet, wie nachstehend als (II) ver anschaulicht.

In dem Reaktionscyclus (II) wird im Reaktionscyclus (I) gebildetes H₂O₂ von red NAD unter Bildung von NAD ver braucht, und so werden zwei Mole red NAD in einem Cyclus des Reaktionscyclus (II) verbraucht, wodurch die Mengen änderung an red NAD sich verdoppelt, so daß die Empfind lichkeit der Bestimmungsmethode entsprechend höher wird.

Alternativ kann man NAD mit Hilfe einer anderen Dehydrogenase (zweite Dehydrogenase) und deren Substrat zu red NAD um wandeln und so einen NAD-Reaktionscyclus schaffen, an dem NAD, die zweite Dehydrogenase und das Substrat für diese beteiligt sind. Man kann diesen NAD-Cyclus mit dem Reak tionscyclus (I) wie nachstehend im Schema (III) veran schaulicht koppeln

Beispielsweise lassen sich eine Komponente in der Unter suchungsprobe (dargestellt als ) und eine entsprechende Komponente, die damit den Reaktionscyclus (I) auszulösen vermag, (dargestellt als ), wie nachfolgend veran schaulicht illustrieren.

(a) Für G3P als Komponente in der Untersuchungsprobe

In dem Reaktionscyclus (Ia), bei dem G3P die Substanz in der Probe ist, werden als Komponenten, durch die die Cyclus-Reaktion anläuft, GPO, GPDH, O₂ und red NAD ver wendet. GPO katalysiert eine Reaktion, in der G3P das Substrat ist, und bei der je ein Mol G3P und O₂ verbraucht werden, während je ein Mol H₂O₂ und DHAP gebildet werden. Weiterhin wirkt GPDH auf ein Substrat DHAP unter Verbrauch von je einem Mol DHAP und red NAD, wobei je ein Mol G3P und NAD gebildet werden; auf diese Weise schließt sich der G3P-DHAP-Reaktionscyclus. Bei der Reaktion kann O₂ in Form von in dem System gelöstem Sauerstoff zugege ben werden, und GPO, GPDH und red NAD sollten als Reagen tien für die Bestimmung in Überschußmengen beigegeben werden. Die Menge an G3P in der Untersuchungsprobe ist nicht begrenzt; natürlich wird man die Probe verdünnen, wenn die Konzentration hoch ist. Die Mengen an GPO und GPDH sind abhängig von der Menge an G3P in der Probe; sie liegen gewöhnlich höher als 0,1 Einheit pro Test, vorzugs weise bei 2-50 Einheiten für GPO und 0,5-40 Einheiten für GPDH. Die Menge an red NAD kann höher sein als das Pro dukt aus der Menge an G3P in der Probe und der Anzahl der Cyclen, und im allgemeinen verwendet man gegenüber der Menge an G3P einen Überschuß von beispielsweise dem 50fachen, vorzugsweise dem 100-1000fachen. Die Menge an erkenn baren Veränderungen nach Beendigung der Cyclus-Reaktion kann bestimmt werden als Menge an vebrauchtem Sauerstoff oder reduziertem NAD oder gebildetem H₂O₂. Wie zuvor für den Reaktionscyclus (II) gezeigt, kann man für sehr empfindliche Bestimmungsmethoden das dabei gebildete H₂O₂ bzw. verbrauch te red NAD bestimmen. In einer solchen mit dem Reaktions cyclus (I) gekoppelten Reaktion wird die NAD-Peroxidase in der Regel in einer Menge von mehr als 0,5 Einheiten je ein Test, vorzugsweise 1-20 Einheiten eingesetzt. Die Menge an erkennbarer Veränderung kann vorzugsweise bestimmt werden durch meßtechnische Erfassung des verbrauchten red NAD.

(b) Für DHAP als Komponente in der Untersuchungsprobe

Dieses Schema ist nachstehend in (Ib) veranschaulicht.

Als Komponente, mit der der Reaktionscyclus (Ib) in Gang ge setzt werden kann, können GPO, GPDH und O₂ und red NAD dienen.

Bei dieser Reaktion verläuft der Cyclus DHAP-G3P zunächst unter Verbrauch von je einem Mol DHAP und red NAD und unter Bildung von je einem Mol NAD und G3P, und dann durch Ver brauch von je einem Mol G3P und O₂ und Bildung von je einem Mol H₂O₂ und DHAP. O₂ kann aus gelöstem Sauerstoff genommen werden, und so genügt es, GPO, GPDH und red NAD einfach im Überschuß beizugeben. Die Menge an GPDH und GPO ist zweckmäßig größer als 0,1 Einheit, vorzugsweise setzt man 5-40 Ein heiten an GPDH und 1-50 Einheiten an GPO ein. Die Menge an red NAD, die benutzt wird, richtet sich nach dem Produkt aus Menge an DHAP in der Untersuchungsprobe und Anzahl der durchgeführten Reaktionscyclen und ist im allgemeinen eine Überschußmenge, verglichen mit der Menge an DHAP, beispiels weise ein 50facher Überschuß, vorteilhaft ein 100-1000facher Überschuß.

Die Menge an erkennbaren Veränderungen nach Beendigung der Cyclusreaktion kann man in Form von verbrauchtem Sauerstoff oder red NAD oder gebildetem H₂O₂ bestimmen. Besonders empfindliche Bestimmungen lassen sich durchführen, wenn man, wie zuvor veranschaulicht, NAD-Peroxidase benutzt.

(c) Für red NAD als Komponente in der Untersuchungsprobe

Die Cyclusreaktion kann wie nachstehend in (Ic) veranschau licht, durchgeführt werden.

Bei der Reaktion werden als den Reaktionscyclus (Ic) bil dende Komponenten DHAP, GPO, GPDH, zweite Dehydrogenase, Substrat für die zweite Dehydrogenase und O₂ verwendet. Es werden je ein Mol red NAD und DHAP verbraucht zur Bil dung von je einem Mol NAD und G3P durch die Wirkung von GPDH auf red NAD. Dann wirkt GPO auf G3P, wobei je ein Mol G3P und O₂ unter Bildung von je einem Mol H₂O₂ und DHAP verbraucht werden. So schließt sich der DHAP-G3P-Reak tionscyclus. Gleichzeitig wird NAD, das durch die Einwir kung von GPDH auf red NAD gebildet wurde, mit einer äquimo laren Verhältnismenge an Substrat für die zweite Dehydro genase durch die Wirkung der zweiten Dehydrogenase umgesetzt zu je einer einmolaren Verhältnismenge an red NAD und Oxida tionsprodukt.

Die so entstandene red NAD wird dabei in den DHAP-G3P- Reaktionscyclus geführt. O₂ kann aus in dem System gelöstem Sauerstoff genommen werden, und nur DHAP, GPO, GPDH, zwei te Dehydrogenase und Substrat für diese brauchen mengenmäßig im Überschuß zugesetzt zu werden.

Die Menge an erkennbaren Veränderungen kann bestimmt werden durch Messen der Menge an verbrauchtem O₂ oder reduziertem NAD oder gebildetem H₂O₂.

(d) Für NAD als Komponente in der Untersuchungsprobe

Die Cyclusreaktion wird nachstehend in (Id) veranschaulicht.

Als Komponente, mit der die Cyclusreaktion (Id) zum Anlau fen gebracht werden kann, werden DHAP, GPO, GPDH, O₂, zwei te Dehydrogenase und Substrat für die zweite Dehydrogenase verwendet. Bei der Reaktion wirkt die zweite Dehydrogenase auf NAD. Dabei werden je ein Mol NAD und Substrat für die zweite Dehydrogenase verbraucht und je ein Mol an Oxidations produkt und red NAD gebildet, und dann wird das red NAD dem DHAP-G3P-Reaktionscyclus zugeführt. GPDH wirkt auf das gebildete red NAD und eine äquimolare Verhältnismenge an DHAP ein, und dabei werden je ein Mol NAD und G3P gebildet. Weiterhin werden durch die Einwirkung von GPO je ein Mol an G3P und O₂ verbraucht und je ein Mol H₂O₂ und DHAP ge bildet. Bei der Reaktion kann O₂ aus in dem Gemisch gelöstem Sauerstoff zugeführt werden, und so genügt es, wenn man für die Bestimmung als Reagentien DHAP, GPO, GPDH, die zweite De hydrogenase und das Substrat dafür in Überschußmengen zusetzt. Die Menge an erkennbaren Veränderungen läßt sich bestimmen durch Messung des verbrauchten O₂ oder des gebildeten H₂O₂.

Die in den Reaktionscyclen (Ic) und (Id) verwendete zweite Dehydrogenase kann ein Enzym sein, das eine Reaktion des Substrats für diese Dehydrogenase und NAD unter Bildung ei nes Oxidationsprodukts dieses Substrats und red NAD kataly siert, wie dies nachstehend illustriert ist.

(18) Dehydrogenase: D-Arabitol-Dehydrogenase (A Dase) (EC 1.1.1.11) und Substrat dafür: D-Arabitol:
(19) Laktat-Dehydrogenase (LDH) (EC 1.1.1.27) und L-Laktat:
(20) Malat-Dehydrogenase (decarboxylierend) (MDH) (EC 1.1.1.28) und L-Malat:
(21) Glucose-Dehydrogenase (GDH) (EC 1.1.1.47) und Glucose:
(22) 3-α-Hydroxysteroid-Dehydrogenase (α-HSDH) (EC 1.1.1.50) und 3-α-Steroid, wie Androsteron und Cholat:
(23) Format-Dehydrogenase (FDH) (EC 1.2.1.2) und Format:
(24) Galactose-Dehydrogenase (Gal DH) (EC 1.1.1.48) und D-Galactose:
(25) β-Hydroxysteroid-Dehydrogenase (β-HSDH) (EC 1.1.1.51) und 3-β-Hydroxysteroid:

In dem Reaktionscyclus (Id) wird durch die Wirkung der zweiten Dehydrogenase in Anwesenheit des für diese geeigneten Substrats das NAD in der Probe in red NAD umgewandelt; dies ist der NAD-Reaktionscyclus. Dann läuft mit dem so gebildeten red NAD der gleiche Reaktionscyclus wie zuvor in (Ic) angegeben ab.

Die Reagentien, die in den Cyclusreaktionen (Ic) und (Id) verwendet werden, können in Überschußmengen, verglichen mit der Menge an NAD oder red NAD eingesetzt werden. Weiterhin kann der NAD-Reaktionscyclus gekoppelt werden mit einer Ein wirkung von NAD-Peroxidase, wie für den Reaktionscyclus (II) veranschaulicht.

Dann wird irgend eine Substanz, die aus G3P, DHAP, NAD oder red NAD in der Probe freigesetzt oder gebildet wird, meß technisch ermittelt und die entsprechende Komponente oder Probe kann auf diese Weise aufgrund der vorgenannten Reak tionscyclen (Ia), (Ib), (Ic) oder (Id) bestimmt werden. Bei der Durchführung der Reaktion sieht man zweckmäßig mehr als 10 Reaktionscyclen vor und setzt die Reagentien zweck mäßig in einem molaren Überschuß gegenüber der Anzahl der Cyclen ein. Vorteilhaft ist es, wenn man Proben mit ge ringen Mengen an zu untersuchender Substanz oder verdünnte Proben verarbeitet. Das Reaktionsmedium kann eine Puffer lösung mit stabilem pH-Wert sein, der im allgemeinen auf schwach sauer bis schwach alkalisch eingestellt wird. Man kann beispielsweise Phosphatpuffer mit pH 6,5 bis 8,5, Tris-HCl-Puffer, Imidazol-HCl-Puffer, Dimethylglutarat-NaOH- Puffer oder PIPES-NaOH-Puffer benutzen. Die Reaktion läuft gewöhnlich bei 37°C über eine Zeitspanne von mehr als einer Minute.

Bei dem Reaktionscyclus (I) laufen gewöhnlich je Minute mehr als 50 Cyclen ab; gewisse Variationen ergeben sich aus der Menge an benutztem Enzym und dessen Km-Wert. Es ist vorteilhaft, die Menge an Enzym und Reagentien so auf einander abzustimmen, daß die Reaktion mit mehr als 80 Cyclen/Minute ablaufen kann.

Die bei der Reaktion auftretenden erkennbaren Verände rungen werden entsprechend dem Ablauf der Reaktion gemessen. Solche erkennbaren Veränderungen sind Substanzen, die beim Ablauf einer Cyclusreaktion verbraucht oder gebildet werden im molaren Verhältnis zu der Substanz G3P oder DHAP, die in einer Menge von je ein Mol bei einer Cyclusreaktion des Reaktionscyclus (I) verbraucht oder gebildet wird. Vor zugsweise wählt man als eine solche Substanz das verbrauch te O₂ oder red NAD bzw. das gebildete H₂O₂.

Die Menge an verbrauchtem O₂ läßt sich zweckmäßig bestim men, wenn man eine Sauerstoff-Elektrode benutzt und den Wert der elektro-chemischen Änderungen verfolgt.

Die Menge an verbrauchtem red NAD kann man ermitteln, wenn man die verbleibende Menge an red NAD bei Beendigung der Reaktion abzieht von der ursprünglich vorhandenen Menge an red NAD. Die Messung der Mengen an red NAD kann nach einer beliebigen dem Fachmann bekannten Methode vorge nommen werden. Beispielsweise kann man die spezifische Absorption für red NAD und die nicht-spezifische für NAD messen. Da das Maximum der spezifischen Absorption für NAD bei 260 nm liegt und red NAD ein solches bei 260 nm und 340 nm, mißt für die Bestimmung von red NAD die Absorption bei 320 bis 360 nm, zweckmäßig bei 340 nm. Eine weitere Bestimmungsmethode für red NAD ist die colorimetrische Untersuchung unter Verwendung eines Elektro nen-Transport-Chromogens, das einen Elektronen-Akzeptor für red NAD aufweist. Beispiele für solche Elektronen-Trans port-Chromogene sind Tetrazoliumsalze, wie beispielsweise

3-(p-Iodphenyl)-2-(p-nitrophenyl)-5-phenyl-2H-tetrazolium chlorid;
3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromid;
3,3′-(4,4′-Biphenylen)-bis (2,5-diphenyl-2H-tetrazolium chlorid);
3,3′-(3,3′-Dimethoxy-4,4′-biphenylen)-bis [2-(p-nitro phenyl)-5-phenyl-2H-tetrazoliumchlorid] (=Nitrotetrazolium: NTB);
3,3′-(3,3′-Dimethoxy-4,4′-biphenylen)-bis [2,5-bis (p-nitro phenyl)-2H-tetrazoliumchlorid; und
3,3′-(3,3′-Dimethoxy-4,4′-biphenylen)-bis (2,5-diphenyl-2H- tetrazoliumchlorid); und
2,6-Dichlorphenolindophenol.

Ein vorteilhaftes Beispiel ist eine Kombination von wasser löslichem Tetrazoliumsalz und Diaphorase oder Phenazinmetho sulfat.

Ein solches Elektronen-Transport-Chromogen ist ein Elektro nen-Akzeptor für red NAD, und es bildet sich ein farbiges Formazan-Pigment. Das so gebildete Pigment läßt sich bei seinem Absorptionsmaximum, wie beispielsweise bei 500-550 nm colorimetrisch messen.

Eine weitere Bestimmungsmethode für red NAD ist eine fluorometrische Bestimmung. Dafür behandelt man red NAD in Anwesenheit eines Fluoreszenz-Reagens, wie beispiels weise Resazurin, mittels Diaphorase. Für die Bestimmung von red NAD in dem Reaktionscyclus (I) wird H₂O₂ vorteil haft zersetzt und durch Katalase entfernt. NAD-Peroxidase (EC 1.11.1.1) kann der Cyclusreaktion (I) beigegeben werden. Dadurch verdoppelt sich die Empfindlichkeit der Bestimmung, wie dies in dem zuvor illustrierten Reaktionssystem (II) veranschaulicht ist. Gebildetes H₂O₂ läßt sich durch Be nutzung einer Wasserstoffperoxid-Elektrode und Messung der elektro-chemischen Veränderungen bestimmen, oder man un tersucht ein mit einem Indikator und H₂O₂ gebildetes Reak tionsprodukt, das sich erkennen läßt. Beispiele für Indi katoren sind Reagentien, die sich spektrophotometrisch messen lassen, Farbstoffindikatoren, Fluoreszenzreagentien oder Lumineszenzreagentien.

Beim erfindungsgemäßen Verfahren handelt es sich um eine neue Bestimmungsmethode, bei der unter Benutzung des G3P-DHAP- Reaktionscyclus gearbeitet wird, wobei dieser mit mehr als 10 Cyclen je Minuten abläuft, und wobei ein Bestandteil in einer Untersuchungsprobe mit guter Genauigkeit und hoher Empfindlichkeit gemessen werden kann.

Beispiel 1

Reaktionsgemisch (1,0 ml):
50 mM Phosphatpuffer (pH 7,5)
10 mM Glycerin
10 mM MgCl₂
Glycerokinase (Toyo Jozo Co., aus Steptomyces gewonnen): 2 Einheiten/Test
GPO (Toyo Jozo Co., aus Aerococcus gewonnen): 20 Einheiten/Test
0,25 nM red NAD
GPDH (Handelsprodukt: Kaninchenmuskel): 8 Einheiten/Test

Das vorstehende Reaktionsgemisch (1,0 ml) wurde in eine Quarzzelle (1,0 ml) eingefüllt. Diese wurde in ein Spektro photometer in die darin befindliche auf eine konstante Tem peratur von 37°C eingestellte Zell-Halterung eingesetzt.

Es wurden Untersuchungsproben, die ATP (0, 10, 20, 30, 40 bzw. 50 µM) enthielten (20 µl), zugegeben, und es wurde bei 37°C bebrütet. Für die zwei Minuten, die zwischen 3 und 5 Minuten nach dem Anlaufen der Reaktion lagen, wurde die Ände rung der Absorption bei 340 nm gemessen. Die Ergebnisse sind in Fig. 1 (○-○) gezeigt. Die Bestimmung ist hochempfindlich.

Es wurde in dem zuvor angegebenen Reaktionsgemisch anstelle von Glycerin ATP in einer Menge von 5 mM eingesetzt, und es wurde eine Glycerin in Spurenmengen (0, 10, 20, 30, 40 bzw. 50 µM) enthaltende Lösung in der gleichen Weise wie zuvor beschrieben zugegeben, es wurde bebrütet und dann die Ab sorptionsänderungen meßtechnisch bestimmt. Die Ergebnisse sind ebenfalls in Fig. 1 (⚫-⚫) veranschaulicht, und man er kennt, daß sehr gute quantitativ übereinstimmende Ergebnisse erhalten werden.

Es wurde eine Kontrollmessung in der Weise durchgeführt, daß man Proben (20 µl), die ATP (0, 0,5, 1,0, 2,0, 4,0, 6,0 bzw. 10,0 mM) enthielten, einem Reaktionsgemisch (3 ml) zugab, das aus 50 mM Phosphatpuffer (pH 8,0), 10 mM Glyce rin, 10 mM MgCl₂, Glycerokinase (2 Einheiten/Test), GPO (5 Einheiten/Test), 1,5 mM 4-Aminoantipyrin, 1,5 mM Phenol, Peroxidase (5 Einheiten/Test) und 0,1% Triton X-100 bestand, 10 Minuten lang bei 37°C bebrütete, und bei 500 nm die colo rimetrische Messung durchführte. Das Ergebnis ist in Fig. 2 veranschaulicht.

Verglichen mit dem Ergebnis der nicht-cyclischen Reaktion für ATP, wie in Fig. 2 gezeigt, ergibt das erfindungsgemäße Verfahren bei der Durchführung der Cyclusreaktion mit schätzungsweise 35 Cyclen/Min. eine um das 2000fache empfindlichere Bestimmung, wenn man die Reaktion eine Stunde lang durchführt, im Vergleich zu der in Fig. 2 gezeigten Kontroll-Untersuchung.

Beispiel 2

Reaktionsgemisch (1,0 ml):
50 mM Phosphatpuffer (pH 7,5)
GPO (20 Einheiten/Test)
0,25 mM red NAD
GPDH (8 Einheiten/Test)

Das vorstehende Reaktionsgemisch (1,0 ml) wurde in eine Quarzzelle (1,0 ml) eingegeben und bei 37°C vorbebrütet. Dazu wurden Untersuchungsproben (20 µl) gegeben, die G3P (0, 10, 20, 30, 40 bzw. 50 µM) enthielten, gegeben. Die Änderungen deer Absorption bei 340 nm innerhalb der 2 Mi nuten-Zeitspanne, die zwischen 3 Minuten nach Beginn der Bebrütung bis 5 Minuten danach lag, wurden gemessen, und daraus wurde die Absorptionsänderung je Minute berechnet. Die Ergebnisse sind in Fig. 3 (○-○) veranschaulicht. Dann wurden anstelle der G3P enthaltenden Proben solche Proben eingesetzt, die DHAP (0, 10, 20, 30, 40 bzw. 50 µM) enthielten, eingesetzt, bebrütet und in der gleichen Weise wie zuvor angegeben bestimmt. Die Ergebnisse sind in Fig. 3 (⚫-⚫) gezeigt.

Wie man sieht, lassen sich Spurenmengen von G3P oder DHAP mit dieser Bestimmungsmethode messen.

Beispiel 3

Zu der Reaktionsmischung gemäß Beispiel 2 wurde NAD-Peroxidase (3 Einheiten/ml) (von Streptococcus; Dolin u. Mitarb., J. Biol. Chem., 225: 557, 1957) zugegeben und so ein Reaktions gemisch (1,0 ml) zubereitet.

Zu diesem Reaktionsgemisch (1,0 ml) wurden Proben (20 µl) hinzugefügt, die G3P (0, 5, 10, 15, 20 bzw. 25 µM) ent hielten, und es wurde bei 37°C bebrütet. Die Absorption innerhalb von 2 Minuten in der Zeitspanne zwischen 3 Minuten und 5 Minuten nach Beginn der Reaktion wurde bei 340 nm ge messen. Das Ergebnis ist in Fig. 4 veranschaulicht. Darin bedeuten die Werte ○-○ die Ergebnisse, die bei Mitbenutzung von NAD-Peroxidase gewonnen wurden, und die Werte ⚫-⚫ die Ergebnisse, die gewonnen wurden, wenn NAD-Peroxidase nicht zugesetzt war. Wie man aus Fig. 4 erkennen kann, können um das zweifache höher empfindliche Ergebnisse erhalten werden, wenn man NAD-Peroxidase mitbenutzt.

Beispiel 4

Reaktionsgemisch (1,0 ml):
50 mM Phosphatpuffer (pH 7,5)
10 mM Glycerin
10 mM MgCl₂
Glycerokinase (2 Einheiten/Test)
GPO (2,0 Einheiten/Test)
0,25 mM red NAD
GPDH (8 Einheiten/Test)

Das vorstehende Reaktionsgemisch (1,0 ml) wurde in einen auf konstanter Temperatur von 37°C gehaltenen Reaktions behälter eingefüllt, und die Temperatur des Reaktions gemisches wurde durch Vermischen mittels eines Magnetrührers gleichmäßig angepaßt.

Dazu wurden Proben gegeben, die ATP (0, 5, 10, 15, 20 bzw. 25 µM) enthielten, und es wurde mittels einer Sauerstoff- Elektrode vom Galvani-Typ der Sauerstoffverbrauch bei der Bebrütungsreaktion gemessen. Die Ergebnisse sind in Fig. 5 (○-○) [O₂-Verbrauch/Min (%)] veranschaulicht. Dann wurde G3P anstelle von ATP eingesetzt, und es wurden Proben (20 µl) bebrütet, die G3P (0, 5, 10, 15, 20 bzw. 25 µM) enthielten. Die Ergebnisse sind in Fig. 5 (⚫-⚫) veranschau licht. Man erkennt, daß sowohl ATP als auch G3P in einfa cher Weise mit guter Genauigkeit und hoher Empfindlichkeit bestimmt werden können.

Beispiel 5

Ein Reaktionsgemisch (1,0 ml) mit der in Beispiel 4 angege benen Zusammensetzung wurde verwendet, und es wurde die Menge an bei der Reaktion gebildetem H₂O₂ an einer Wasser stoffperoxid-Elektrode in Form der Änderungen des elektri schen Stroms (nA) je Minute bestimmt.

Die Ergebnisse sind in Fig. 6 veranschaulicht. Darin bedeu ten die Werte ○-○ die Kurve für die quantitative Bestimmung von H₂O₂ bei Untersuchung von ATP (0-25 µM) enthaltenden Proben (20 µl) und ⚫-⚫ die Werte bei Benutzung von G3P (0-25 µM) enthaltenden Proben (20 µl).
Wasserstoffperoxid-Elektrode: YSI Co., Model 25 Oxidations- Meter Clark 2510 Oxidase-Probe.

Beispiel 6

Reaktionsgemisch zur Bestimmung von Kreatininkinase

Reaktionsmischung I:
50 mM Phosphatpuffer (pH 7,5)
40 mM Kreatinphosphat
5 mM β-Mercaptoethanol
3 mM ADP
10 mM MgCl₂
Glycerokinase (eine Einheit/Test)

Reaktionsgemisch II:
GPO (15 Einheiten/Test)
0,3 mM red NAD
GPDH (8 Einheiten/Test)

Das Reaktionsgemisch I (0,2 ml) wurde in ein schmales Test röhrchen eingefüllt und bei 37°C vorbebrütet. Es wurde Kreatinkinase (10 µl) (Boehringer: Kaninchenmuskelfleisch, 0,01 Einheiten/ml) hinzugegeben, und dann wurde 10 Minuten lang bebrütet. Die Reaktion wurde durch 2 Minuten langes Erhitzen auf 100°C abgestoppt. Es wurde dann das Reaktions gemisch II (0,8 ml) (vorbebrütet bei 37°C) hinzugefügt, und danach wurde mit Hilfe einer Sauerstoff-Elektrode der nach dem Beginn der Reaktion erfolgende Sauerstoffverbrauch ge messen.

Beispiel 7

Reaktionsgemisch zur Bestimmung von Phosphatidyl- Glycerin

Reaktionsgemisch I:
20 mM Collidinpuffer (pH 8,0)
Phospholipase C (20 Einheiten/Test)
10 mM CaCl₂
0,1% Natriumdeoxycholat

Reaktionsgemisch II:
50 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,5)
GPO (15 Einheiten/Test)
Katalase (200 Einheiten/Test)
0,25 mM red NAD
GPDH (8 Einheiten/Test)

Amniotische Flüssigkeit (10 µ, 1-⅛ Verdünnungen) (worin Phosphatidylglycerin enthalten war) wurde dem Reaktionsge misch I (0,2 mL) beigegeben, und dann wurde 10 Minuten lang bei 37°C bebrütet.

Dazu wurde das Reaktionsgemisch II (0,8 ml) gegeben, und dann wurde die Absorptionsänderung je Minute bei 340 nm gemessen. Die Ergebnisse sind in Fig. 8 veranschaulicht.

Als Kontrolle wurde Reaktionsgemisch I, das keine Phospho lipase C enthielt, untersucht.

Das Phosphatidylglycerin in amniotischer Flüssigkeit konnte mit guter Empfindlichkeit bestimmt werden. Der Wert für Phosphatidylglycerin in der bei diesem Versuch eingesetzten amniotischen Flüssigkeit wurde mit 6,10 mg/100 ml gemessen.

Das Reaktionsgemisch II kann, wenn darin Katalase weggelassen wird, zur Untersuchung von Phosphatidylglycerin durch Er mittlung von O₂ mittels Sauerstoff-Elektrode oder durch Be stimmung der gebildeten Menge an H₂O₂ mittels Wasserstoff peroxid-Elektrode eingesetzt werden.

Es wurde auch noch das folgende Reaktionsgemisch zur Bestim mung von Phosphatidylglycerin mit Hilfe einer Wasserstoff peroxid-Elektrode zubereitet!

50 mM Phosphatpuffer (pH 7,5)
Phospholipase D (10 Einheiten/Test)
10 mM MgCl₂
5 mM ATP
Glycerokinase (2 Einheiten/Test)
GPO (15 Einheiten/Test)
0,25 mM red NAD
GPDH (8 Einheiten/Test).

Beispiel 8

50 mM Tris-HCl-Puffer (pH 8,0)
0,75 mM red NAD
GPO (6 Einheiten/Test)
GPDH (5 Einheiten/Test)

Das vorstehende Reaktionsgemisch (0,5 ml) wurde in ein schma les Teströhrchen eingefüllt und bei 37°C vorbebrütet. Dazu wur de DL-G3P (Lösung (20 µl) (0, 2, 4, 8, 12, 16 bzw. 20 µM) gegeben, und es wurde exakt 5 Minuten lang bei 37°C bebrütet. Dann wurde zum Abbruch der Reaktion eine 5 mM N-Ethylmaleimid enthaltende 1%ige Natriumlaurylsulfatlösung (2,5 ml) hinzu gegeben. Es wurde die Absorption bei 340 nm gemessen und durch Vergleich mit Kontrolle korrigiert. Fig. 9 zeigt, daß gute quantitative linear angeordnete Bestimmungswerte erhalten wurden.

Als Kontrolle wurde anstelle von DL-G3P destilliertes Wasser (20 µl) zugegeben. Bei diesem Beispiel betrug die Anzahl der Reaktionscyclen 5400/Stunde.

In der beiliegenden Zeichnung bedeuten:

Fig. 1 die Kurve für die quantitative Bestimmung von ATP und Glycerin,

Fig. 2 die Kurve für die quantitative Bestimmung von ATP nach bekannter nicht-cyclischer Reaktion,

Fig. 3 die Kurve für die quantitative Bestimmung von G3P und DHAP,

Fig. 4 die Kurve für die quantitative Bestimmung von G3P bei Benutzung von NAD-Peroxidase,

Fig. 5 die Kurve für quantitative Bestimmung von ATP oder G3P bei Benutzung einer Sauerstoff-Elektrode,

Fig. 6 die Kurve für die quantitative Bestimmung von ATP oder G3P bei Benutzung einer Wasserstoff peroxid-Elektrode,

Fig. 7 die Kurve für die quantitative Bestimmung von Kreatinkinase,

Fig. 8 die Kurve für die quantitative Bestimmung von Phosphatidylglycerin,

Fig. 9 die Kurve für die quantitative Bestimmung von DL-G3P durch die Endopoint-Methode.

Claims

1. Verfahren zur quantitativen Bestimmung von in einer Untersuchungsprobe enthaltenem L-Glycero-3-phosphat (G3P), Dihydroxyaceton-3-phosphat (DHAP), Nicotin-adenin-dinucleo tid (NAD) oder reduziertem Nicotin-adenin-dinucleotid (red NAD) durch enzymatische Reaktion, dadurch gekennzeich net, daß man die zu bestimmende Substanz in der Untersu chungsprobe zur Reaktion bringt mit einer entsprechenden Komponente des nachstehenden Reaktionscyclus (I), der sich aus den Komponenten G3P, DHAP, Glycerophosphat-Oxidase (GPO), Glycerophosphat-Dehydrogenase (GPDH), NAD, red NAD, O₂ und H₂O₂ zusammensetzt, daß man den Reaktionscyclus ablaufen läßt und die Größe einer bestimmbaren Veränderung dabei meßtechnisch er mittelt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man in dem Reaktionscyclus (I) NAD-Peroxidase zur Reak tion bringt, durch die eine ein Mol H₂O₂ und ein Mol red NAD verbrauchende und zwei Mole H₂O sowie ein Mol NAD bildende Reaktion katalysiert wird, und daß man die Größe einer be stimmbaren Veränderung dabei meßtechnisch ermittelt.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Größe einer bestimmbaren Veränderung die Menge an verbrauchtem red NAD ermittelt.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man in dem Reaktionscyclus (I) gebildetes NAD mit einer zweiten Dehydrogenase und einem Substrat für diese Dehydrogenase umsetzt und diese Umsetzungsreaktion zwecks Zuführung des dabei gebildeten red NAD zu dem Reaktions cyclus mit letzterem koppelt.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Untersuchungsprobe einsetzt, in der G3P durch ein Phosphatidylglycerin und Phospholipase C ent haltendes enzymatisches Reaktionssystem gebildet wird.

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Untersuchungsprobe einsetzt, in der G3P durch ein Adenosintriphosphat (ATP), Glycerin und Glycero kinase enthaltendes enzymatisches Reaktionssystem gebildet wird.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß Glycerin verwendet wird, das aus einem Phosphatidylgly cerin und Phospholipase D enthaltendem enzymatischem Reaktionssystem stammt.

8. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß Glycerin verwendet wird, das aus einem Mono-, Di- oder Triglycerid und Lipase enthaltendem enzymatischem Reak tionssystem stammt.

9. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß ATP verwendet wird, das aus einem Kreatinphosphat, Ade nosindiphosphat (ADP) und Kreatinkinase enthaltendem enzymatischem Reaktionssystem stammt.

10. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß ATP verwendet wird, das aus einem Phosphoenolpyruvat, ADP und Pyruvatkinase enthaltendem enzymatischem Reak tionssystem stammt.

11. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als die Größe einer bestimmbaren Veränderung die Menge an verbrauchtem O₂ ermittelt wird.

12. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als die Größe einer bestimmbaren Veränderung die Menge an gebildetem H₂O₂ ermittelt wird.

13. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als die Größe einer bestimmbaren Veränderung die Menge an verbrauchtem red NAD ermittelt wird.